特表 2025-532610 ガイドされた切断による一本鎖核酸ラダーに関する方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-10-01

(54)【発明の名称】ガイドされた切断による一本鎖核酸ラダーに関する方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20250924BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20250924BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20250924BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20250924BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20250924BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20250924BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N9/14

C12N15/11 Z

C12M1/00 A

C12M1/42

C12N15/55

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025515885

(86)(22)【出願日】2023-09-14

(85)【翻訳文提出日】2025-05-12

(86)【国際出願番号】 US2023032740

(87)【国際公開番号】W WO2024059197

(87)【国際公開日】2024-03-21

(31)【優先権主張番号】63/406,513

(32)【優先日】2022-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524195857

【氏名又は名称】レヴィティ・ヘルス・サイエンシズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】ヤンホン・トン

(72)【発明者】

【氏名】ジシャン・ル

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA23

4B029BB20

4B029CC01

(57)【要約】

本開示は、切断された一本鎖核酸を用意するための方法、組成物、及びキットに関する。かかる核酸は、ラダー組成物を用意するために使用されうる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラダー組成物を調製するための方法であって、
一本鎖核酸を含む鋳型を用意する工程と、
前記鋳型をガイド付きオリゴヌクレオチド及び切断酵素の存在下でインキュベートする工程とを含み、
前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、前記鋳型の標的領域に結合するように構成されており、前記切断酵素が、前記ガイド付きオリゴヌクレオチドに結合して、前記標的領域内の位置を切断するように構成されており、それにより、複数の切断された一本鎖核酸を含む前記ラダー組成物を生成する、方法。

【請求項2】

前記鋳型が、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)を含み、前記ラダー組成物が、複数の切断されたssDNAを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記鋳型が、天然構築物、合成構築物、線状構築物、及び/又は環状構築物を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項4】

前記鋳型が、500、1000、2000、又はそれより多くの塩基を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項5】

前記標的領域が、制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、又はそれらの逆相補配列を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項6】

前記切断酵素によって切断される前記標的領域内の前記位置が、前記制限配列、前記認識配列、前記プロトスペーサー領域、又はそれらの前記逆相補配列の中の位置を含む、請求項5に記載の方法。

【請求項7】

前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)、一本鎖リボ核酸(ssRNA)、又は一本鎖DNA/RNAハイブリッド(ssDNA/RNA)を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項8】

前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、又はそれらの逆相補配列を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項9】

前記鋳型が、前記標的領域の近くにプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列若しくはその逆相補配列を含み、且つ/又は、前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、PAM配列若しくはその逆相補配列を含む、請求項1に記載の方法。

【請求項10】

前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、CRISPRリボ核酸(crRNA)領域及び/又はトランス作用性CRISPR RNA(tracrRNA)領域を更に含む、請求項9に記載の方法。

【請求項11】

前記ガイド付きオリゴヌクレオチドが、前記crRNA領域とtracrRNA領域との間に配置されたリンカーを更に含む、請求項10に記載の方法。

【請求項12】

前記切断酵素が、制限酵素、ニッキング酵素、プログラム可能エンドヌクレアーゼ、アルゴノートタンパク質、CRISPR関連(Cas)酵素、ヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ)、又はそれらのバリアントを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項13】

前記用意する工程が、前記インキュベートする工程の前に、
前記ガイド付きオリゴヌクレオチドを前記鋳型に供給することにより、結合した鋳型を用意する工程と、
前記結合した鋳型に前記切断酵素を更に供給する工程と
を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記用意する工程が、前記インキュベートする工程の前に、
予めアセンブルされた複合体を前記鋳型に供給する工程を含み、予めアセンブルされた前記複合体が、前記切断酵素に結合した前記ガイド付きオリゴヌクレオチドを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記用意する工程が、前記インキュベートする工程の前に、
前記ガイド付きオリゴヌクレオチド及び前記切断酵素を前記鋳型に供給する工程を含み、前記ガイド付きオリゴヌクレオチド及び前記切断酵素が、任意の順序で又は同時に供給されうる、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ラダー組成物における前記複数の切断された一本鎖核酸を含む集団のうちの少なくとも80%、90%、又はそれより多くが一本鎖である、請求項1に記載の方法。

【請求項17】

前記複数の切断された一本鎖核酸を含む集団のうちの少なくとも50%、60%、70%、80%、又はそれより多くが、500、600、700、800、900、1000、2000、又はそれより多くの塩基の長さを有する、請求項1に記載の方法。

【請求項18】

前記インキュベートする工程が、アルブミン、ブロッキング剤等の非存在下で実行される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ラダー組成物が、更に精製されることも希釈されることもない、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

複数の切断された一本鎖核酸を含む集団を含むラダー組成物であって、
前記集団のうちの少なくとも80%、90%、若しくはそれより多くが一本鎖であり、且つ/又は
前記集団のうちの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、若しくはそれより多くが、500、600、700、800、900、1000、2000、若しくはそれより多くの塩基の長さを有する、
ラダー組成物。

【請求項21】

前記集団が、複数の切断された一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)を含む、請求項20に記載のラダー組成物。

【請求項22】

前記組成物が、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法によって調製されている、請求項20又は21に記載のラダー組成物。

【請求項23】

請求項20から22のいずれか一項に記載のラダー組成物を含む第1のラダー組成物と、
アッセイにおいて前記第1のラダー組成物を使用することに関する説明書と
を備える、キット。

【請求項24】

請求項20から22のいずれか一項に記載のラダー組成物を含む第2のラダー組成物を更に備える、請求項23に記載のキットであって、
前記第1のラダー組成物及び第2のラダー組成物が異なっており、前記説明書が、前記アッセイにおいて前記第2のラダー組成物を使用することに関する説明書を更に含む、キット。

【請求項25】

前記第1のラダー組成物が、複数の第1の切断された一本鎖核酸を含む第1の集団を含み、前記第2のラダー組成物が、複数の第2の切断された一本鎖核酸を含む第2の集団を含み、前記第1の集団のうちの少なくとも90%が、前記第2の集団のうちの少なくとも90%とは異なる長さを有する(例えば、前記第1の集団のうちの少なくとも90%が、前記第2の集団のうちの少なくとも90%よりも長いか又は短い長さを有する)、請求項24に記載のキット。

【請求項26】

前記アッセイが電気泳動を含む、請求項23から25のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、2022年9月14日出願の米国仮特許出願第63/406,513号の利益を主張する。同米国仮特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0002】

本開示は、切断された一本鎖核酸を用意するための方法、組成物、及びキットに関する。かかる核酸は、ラダー組成物を用意するために使用されうる。

【背景技術】

【0003】

一本鎖デオキシリボ核酸(ssDNA)又は一本鎖リボ核酸(ssRNA)は、ゲノム編集、遺伝子合成、遺伝子療法、及び薬物送達を含むがこれらに限定されない種々のバイオテクノロジー用途で使用されている。一本鎖核酸分子の検出及びサイズ分析は、種々の技法、例えば、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動、キャピラリー電気泳動、マイクロ流体チップ等によって達成することができる。

【0004】

核酸に基づく分子量標準物質(又はラダー)は、核酸サンプルの質、サイズ、及び/又は量を推定するための有用なツールである。標準物質は通常、サンプルと同時に(例えば、サンプルと並行して)分画される。検出の後、サンプルのバンドと標準物質のバンドとの間で比較が行われる。標準物質のサイズ(例えば、ヌクレオチドすなわちnt単位)又は他の特徴が分かれば、未知の断片のサイズを推定することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第8,273,863号

【特許文献2】米国特許公開第2019/0203242号

【特許文献3】米国特許公開第2007/0178482号

【特許文献4】国際公開第WO2020/232286号

【特許文献5】米国特許第5,316,908号

【特許文献6】米国特許公開第2019/0002868号

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes第1部、第2章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Y.

【非特許文献2】Sambrook J、Fritsch E F、及びManiatis T、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor(1989)

【非特許文献3】Sambrook J及びRussell W、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor(2001)

【非特許文献4】Altschul SFら、J. Mol. Biol. 1990;215:403～10

【非特許文献5】Zhang Jら、Genome Res. 1997;7:649～56

【非特許文献6】Smith TFら、Adv. Appl. Math. 1981;2(4):482～9

【非特許文献7】Bushら、Molecules 2020年7月26日;25(15):3386

【非特許文献8】Guら、Biotechniques 2013年6月;54(6):337～43

【非特許文献9】Thermo Fisher Scientific社、「Production of Single-stranded Circular DNA Molecules from Supercoiled Double-stranded Plasmids in vitro」、2012、1頁(tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/76-circular-ssdna-from-supercoiled-double-stranded-plasmids-in-vitro.pdfにてアクセス可能)

【非特許文献10】nc2.neb.com/NEBcutter2/

【非特許文献11】nebcloner.neb.com/#!/redigest

【非特許文献12】www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

【非特許文献13】takarabio.com/learning-centers/gene-function/gene-editing/gene-editing-tools-and-information/how-to-design-sgrna-sequences、snapgene.com/guides/design-grna-for-crispr

【非特許文献14】idtdna.com/pages/community/blog/post/guide-rna-design-be-on-target!

【非特許文献15】Roberts、Nucl.Acids Res.1989;17(補遺):r347～r387

【非特許文献16】Doxzen KW及びDoudna JA、「DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute」、PLoS ONE 12(5):e0177097(14頁)

【非特許文献17】Makarova KSら、「Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems」、Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9:467～77

【非特許文献18】Wang JYら、「Structural biology of CRISPR-Cas immunity and genome editing enzymes」、Nat. Rev. Microbiol. 2022; doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4(16頁)

【非特許文献19】Cooney、Mol. Biotechnol. 1994;2(2):119～127

【非特許文献20】Parkerら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1977;74(3):851～855

【非特許文献21】Polyarushら、Chem. Natural Compounds 2003;39(6):592～594

【非特許文献22】Lanら、J. Nucleic Acids 2012; 2012:254630

【非特許文献23】Wangら、J. Nucleic Acids 2010; 2010:421803 (3頁)

【非特許文献24】Amillsら、Genet Anal. 1996;13:147～9

【非特許文献25】Abdel-Fattahら、Biotechnology. 2006;5:166～172

【非特許文献26】Changら、J. Biochem. Biophys. Methods 2008;70:1199～202

【非特許文献27】Wuら、Mol. Biol. Rep. 2011;38:2729～31

【非特許文献28】Swartjesら、Biochem. Soc. Trans. 2020年2月28日;48(1):207～219

【非特許文献29】Maら、Mol Cell. 2015年11月5日;60(3):398～407

【非特許文献30】Huntら、Front. Mol. Biosci. 2021年4月29日(doi.org/10.3389/fmolb.2021.670940にてアクセス可能)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本開示は、切断された一本鎖核酸を含む方法、組成物、及びキットに関する。特定の実施形態において、かかる核酸は、一本鎖DNA(ssDNA)、一本鎖RNA(ssRNA)、又は一本鎖DNA/RNAハイブリッド(ssDNA/RNA)を含有するラダーとして有用でありうる。

【0008】

特定の実施形態において、本明細書における方法は、ラダー組成物をもたらす量及び条件で一本鎖核酸(例えば、ssDNA、ssRNA、又はssDNA/RNA)を調製することを可能にする。例えば、二本鎖DNA(dsDNA)を調製する典型的な方法は、ssDNAラダーの調製には適していない。一例では、既知の長さのdsDNAの消化を使用してラダー断片を作り出すことがあり、このラダー断片の長さは制限酵素部位によって決まる。別の例では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、既定の長さを有するdsDNAを生成することがある。このようなプロセスは、例えば、生成されうる断片の長さによって制限され、長い断片(例えば、500塩基を超えるもの)は生成困難である。更に、このようなプロセスは、ラダーとしての使用の前に特定成分の除去を必要としうる。例えば、ssDNAラダーが必要であれば、一本鎖形態をもたらすために、且つ/又は望まれない相補配列を除去するために、生成されたdsDNA断片を変性させるか、又は別様に処理する必要がある。別の事例では、PCRに追加の試薬(例えば、ポリメラーゼ、塩類、他の賦形剤等)が必要であり、これらをラダーとしての使用の前に除去することが好ましい場合がある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

したがって、いくつかの非限定的な実施形態において、本明細書における方法は、十分な長さ(例えば、500塩基を超える長さ)及び/又は所望の立体構造(例えば、一本鎖立体構造)を持つ核酸を調製することを可能にする。

【0010】

また本開示は、既定又は所定のサイズ(例えば、長さ)を持つ一本鎖核酸を生成するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、切断酵素(例えば、制限酵素、ニッキング酵素、プログラム可能エンドヌクレアーゼ、アルゴノートタンパク質、Cas酵素、及び本明細書に記述する他の酵素)による、オリゴヌクレオチドによりガイドされた一本鎖鋳型の切断を用いうる。ガイド付きオリゴヌクレオチド(guided oligonucleotide)(又はガイド)は、ssDNA、ssRNA、又はssDNA/RNAでありうる。このようなガイドを使用すると、ガイドと鋳型との間に二本鎖構造を形成することができ、切断酵素を動員して二本鎖構造に結合させることができる。切断部位(例えば、制限部位、認識配列、プロトスペーサー領域、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列、又はそれらの逆相補配列)が鋳型に存在するならば、切断酵素を使用して当該切断部位を切断することができる。このようにして、本方法は、複数の切断された鋳型分子(例えば、複数の切断された一本鎖核酸)をもたらしうる。

【0011】

いくつかの実施形態において、ガイド付きオリゴヌクレオチドは、切断された鋳型分子をラダーとして使用するために当該ガイドの分離が必要ないように、十分に短い長さを有する。ガイド付きオリゴヌクレオチドの非限定的な長さとしては、約40、30、20、若しくは10ヌクレオチド(nt)未満、又は約10～40nt(例えば、約10～38nt、10～36nt、10～34nt、10～32nt、10～30nt、10～29nt、10～28nt、10～27nt、10～26nt、10～25nt、10～24nt、10～23nt、10～22nt、10～21nt、10～20nt、12～40nt、12～38nt、12～36nt、12～34nt、12～32nt、12～30nt、12～29nt、12～28nt、12～27nt、12～26nt、12～25nt、12～24nt、12～23nt、12～22nt、12～21nt、12～20nt、14～40nt、14～38nt、14～36nt、14～34nt、14～32nt、14～30nt、14～29nt、14～28nt、14～27nt、14～26nt、14～25nt、14～24nt、14～23nt、14～22nt、14～21nt、14～20nt、16～40nt、16～38nt、16～36nt、16～34nt、16～32nt、16～30nt、16～29nt、16～28nt、16～27nt、16～26nt、16～25nt、16～24nt、16～23nt、16～22nt、16～21nt、16～20nt、18～40nt、18～38nt、18～36nt、18～34nt、18～32nt、18～30nt、18～29nt、18～28nt、18～27nt、18～26nt、18～25nt、18～24nt、18～23nt、18～22nt、18～21nt、18～20nt、20～40nt、20～38nt、20～36nt、20～34nt、10～32nt、20～30nt、20～29nt、20～28nt、20～27nt、20～26nt、20～25nt、20～24nt、20～23nt、20～22nt、20～21nt等)が挙げられる。

【0012】

また本開示は、サイズ及び/又は質量が未知である核酸分子のサイズ(例えば、一本鎖ポリヌクレオチドのnt単位の鎖の長さ)及び/又は質量を推定するための標準物質として使用されうる核酸組成物(又はラダー)を提供する。したがって、本開示は、かかる組成物又はラダーを生産するための方法に関する。更なる詳細は以下のとおりである。

【0013】

定義
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、記述された値の±10%を意味する。本明細書で使用される場合、この用語は、記述された値、値の範囲、又は1つ若しくは複数の範囲の両端点を修飾する。

【0014】

本明細書で使用される場合、「切断」又は「切断する」という用語は、鋳型(例えば、鋳型の標的領域)における共有結合主鎖の破断を意味する。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的加水分解又は化学的加水分解を含むがこれらに限定されない種々の方法によって開始されうる。一本鎖切断と二本鎖切断との両方が可能であり、二本鎖切断は、2つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じうる。切断は、平滑末端、ジグザグ末端(若しくは付着末端)、又はニック末端の生成をもたらしうる。更に、切断は、DNA、RNA、及びDNA/RNAハイブリッドの配列又は領域において生じうる。すべてではないがいくつかの実施形態において、切断は、ガイド付きオリゴヌクレオチドにおける共有結合主鎖の破断と関連しうる。

【0015】

「相補性」又は「相補的」等の用語は、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ条件及び/又はインビボ条件下で、配列特異的な逆平行の様式において、ある核酸が別の核酸配列と従来のワトソン-クリック型又は他の非従来型のいずれかにより水素結合を形成できること、例えば、別の核酸とワトソン-クリック塩基対及び/若しくはG/U塩基対を形成できること、「アニール」できること、又は「ハイブリダイズ」できること(すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合できること)を指す。当該技術分野において公知であるように、標準的なワトソン-クリック塩基対形成は、アデニン(A)とチミジン(T)の対形成、アデニン(A)とウラシル(U)の対形成、及びグアニン(G)とシトシン(C)の対形成を含む。更に、当該技術分野では、2つのRNA分子同士のハイブリダイゼーション(例えば、dsRNA)において、グアニン(G)がウラシル(U)と塩基対を形成することも公知である。相補率とは、ある核酸分子における、第2の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン-クリック塩基対)を形成しうる残基のパーセンテージを示す(例えば、10個中5個、6個、7個、8個、9個、10個であれば、50%、60%、70%、80%、90%、及び100%の相補性である)。「完全に相補的」とは、ある核酸配列における連続した残基のすべてが、第2の核酸配列における同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」又は「十分な相補性」若しくは「十分に相補的」とは、ヌクレオチド数が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、若しくはそれより多くの領域にわたって少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、若しくは100%である相補性の程度を指すか、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。本開示の他の特長及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【0016】

ハイブリダイゼーションに関するストリンジェントな条件とは、標的領域との相補性を有する核酸が主として標的領域とハイブリダイズし、非標的領域とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存的であり、複数の要因に応じて変わる。概して、配列が長ければ長いほど、配列がその標的領域と特異的にハイブリダイズする温度が上昇する。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen(1993)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes第1部、第2章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Y.に詳細に記述されている。

【0017】

本明細書で使用される場合、核酸に関する「断片」という用語は、核酸のうち、参照配列より少なくともヌクレオチド1個分短い部分を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子の全長のうち少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、若しくは100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、1800、又はそれより多くのヌクレオチドを含みうる。別の例では、本明細書に記述する配列のいずれかと少なくとも約40%(例えば、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約87%、約98%、約99%、又は約100%)同一である少なくとも約5(例えば、約10、約20、約30、約40、約50、又は約100)のヌクレオチドの区域を含みうる、いずれの核酸断片も、本開示に従って利用されうる。更に別の例では、本明細書に記述する配列のいずれかと少なくとも約40%(約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約87%、約98%、約99%、又は約100%)同一である少なくとも約5(例えば、約7、約8、約10、約12、約14、約18、約20、約24、約28、約30、又はそれより多く)のヌクレオチドの区域を含みうる、いずれの核酸断片も、本開示に従って利用されうる。

【0018】

「ハイブリダイゼーション」とは、1つ又は複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対形成によってか、フーグスティーン結合によってか、又は何らかの他の配列特異的様式で生じうる。この複合体は、二重鎖構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらのいずれかの組み合わせを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、高温(例えば、90℃超)での変性及び/又は特定の冷却速度(例えば、ランピング速度)でのアニーリングのような、より広範なプロセスにおける一工程を構成しうる。所定の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、所定の配列の「相補配列」といわれる。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はよく知られており、Sambrook J、Fritsch E F、及びManiatis T、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor(1989)、特に同書の第11章及び表11.1、並びにSambrook J及びRussell W、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor(2001)に例示されている。温度及びイオン強度の条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。

【0019】

ハイブリダイゼーションでは、塩基間のミスマッチは起こりうるが、2つの核酸が相補的配列を含む必要がある。2つの核酸の間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野でよく知られている変数である核酸の長さ及び相補度によって決まる。2つのヌクレオチド配列の間の相補度が高ければ高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度(T_m)の値が大きくなる。相補性のある短い区域(例えば、35個以下、30個以下、25個以下、22個以下、20個以下、又は18個以下のヌクレオチドにかけての相補性)を有する核酸同士のハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置が重要になる(Sambrookら、上掲、11.7～11.8を参照されたい)。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約10ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小長は、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約22ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、及び少なくとも約30ヌクレオチドである。更に、当業者であれば理解するであろうが、温度及びハイブリダイゼーション溶液塩濃度は、相補領域の長さ及び相補度等の要因に従って、必要に応じて調整されうる。

【0020】

当該技術分野では、ポリヌクレオチドの配列が、特異的にハイブリダイズ可能又はハイブリダイズ可能になるために、その標的核酸の配列と100%相補的である必要はないと理解されている。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、1つ又は複数のセグメントにかけてハイブリダイズしうる(例えば、ループ構造又はヘアピン構造)。ポリヌクレオチドは、その標的となる標的核酸配列内の標的領域との少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列相補性を含みうる。例えば、アンチセンス化合物のヌクレオチド20個中18個が標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、90パーセントの相補性に相当する。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化していてもよく、相補的ヌクレオチドが介在していてもよく、また、残りの非相補的ヌクレオチドは、互いと連続している必要はなく、相補的ヌクレオチドと連続している必要もない。核酸における核酸配列の特定区域間の相補率は、当該技術分野で公知のBLASTプログラム(basic local alignment search tools)及びPowerBLASTプログラム(Altschul SFら、J. Mol. Biol. 1990;215:403～10、Zhang Jら、Genome Res. 1997;7:649～56)を使用してか、又は、Smith TFら、Adv. Appl. Math. 1981;2(4):482～9のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用したGapプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package、Unixバージョン8、Genetics Computer Group、University Research Park、Madison Wis.)を使用することにより、定型的に決定されうる。

【0021】

本明細書で使用される場合、「ラダー」又は「サイズ標準物質」は同義に使用されることがあり、概して、分子の概算サイズ及び/又は質量を特定するために使用される一組の標準物質を指す。ある特定の実施形態において、サイズの特定は、分子量がゲルマトリックスを介した移動速度に反比例するという原理を使用した電気泳動を含みうる。いくつかの実施形態において、ラダーは、電気泳動において使用される場合、未知の断片のサイズ又は質量を推定するための線形目盛又は対数目盛となりうる(マーカーの断片サイズが既知であることを条件とする)。

【0022】

「リンカー」とは、様々な部分又はセグメントに結合するのに有用である、あらゆる有用な多価(例えば、二価)の成分を意味する。例示的なリンカーとしては、核酸配列、化学的リンカー等が挙げられる。一例において、リンカーは、約3ヌクレオチド(nt)から100ntの長さを有しうる。例えば、リンカーは、約3nt～90nt、3nt～80nt、3nt～70nt、3nt～60nt、3nt～50nt、3nt～40nt、3nt～30nt、3nt～20nt、又は3nt～10ntの長さを有しうる。別の例において、リンカーは、3nt～5nt、5nt～10nt、10nt～15nt、15nt～20nt、20nt～25nt、25nt～30nt、30nt～35nt、35nt～40nt、40nt～50nt、50nt～60nt、60nt～70nt、70nt～80nt、80nt～90nt、又は90nt～100ntの長さを有しうる。

【0023】

「ニッキング酵素」又は「ニッキングエンドヌクレアーゼ」又は「ニッカーゼ」という用語は同義に使用されることがあり、概して、制限部位として知られる特異的な認識ヌクレオチド配列において二本鎖DNAの1本の鎖を切断する酵素を指す。このような酵素は、DNA二重鎖の1本の鎖のみを加水分解(切断)することにより、1本の鎖のみ(例えば、トップ鎖のみ又はボトム鎖のみ)において「ニック」又は切断されたDNA分子を生成する。

【0024】

「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」という用語は、本明細書では同義に使用され、DNA切断及び/又はRNA切断のための触媒活性を有する酵素を意味する。ヌクレアーゼの例としては、制限酵素、ニッキング酵素、プログラム可能エンドヌクレアーゼ、アルゴノートタンパク質、Cas酵素、又はそれらのバリアントが挙げられる。バリアントには、DNA切断及び/又はRNA切断のための触媒活性が増加しているか、減少しているか、又は保持されているが、この活性が消失してはいない、野生型のヌクレアーゼの変異体(例えば、保存的アミノ酸置換のような、1つ又は複数のアミノ酸における置換)が含まれうる。概して、本明細書では、鋳型に結合した(又はハイブリダイズした)ガイド付きオリゴヌクレオチドを含む複合体にヌクレアーゼを動員するのに有用な様々な部位及びモチーフ(例えば、二本鎖構造)を記述する。このような部位及びモチーフは、ヌクレアーゼによる切断に起因する1つ若しくは複数の切断位置を含むことができ、且つ/又はヌクレアーゼに結合するための1つ若しくは複数の位置を含むことができる。かかる動員部位又はモチーフの非限定的な例としては、制限部位(例えば、制限酵素又はニッキング酵素による結合及び/又は切断のため)、認識部位(例えば、アルゴノートタンパク質を含むプログラム可能エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼによる結合及び/又は切断のため)、プロトスペーサー領域(例えば、Cas酵素を含むプログラム可能エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼによる切断のため)、及び/又はプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列(例えば、Cas酵素を含むプログラム可能エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼによる結合のため)が挙げられる。

【0025】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、本明細書では同義に使用され、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドかを問わず、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖(例えば、センス又はアンチセンス)、二本鎖、又は多重鎖のリボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、又はそれらのハイブリッド、ゲノムDNA、cDNA、又はDNA/RNAハイブリッド、並びに、プリン塩基及びピリミジン塩基、又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、1つ又は複数の二重鎖、三重鎖、四重鎖、ヘアピン、及び/又はシュードノットの構造又はモチーフを含む領域のような、あらゆる有用な二次元又は三次元の構造又はモチーフを有しうる。Nが核酸配列において使用される場合、これは任意の核酸(例えば、G、C、A、T、又はU、及びそれらの修飾型)によって表されうる。

【0026】

核酸に関して使用される「修飾」という用語は、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、リン酸基、糖基、及び/又はヌクレオシド間結合(例えば、ホスホジエステル主鎖、結合性リン酸、又はホスホジエステル結合)に対する1つ又は複数の修飾を含む核酸配列を意味する。

【0027】

ヌクレオシド修飾は、ピリジン-4-オンリボヌクレオシド、5-アザ-ウリジン、2-チオ-5-アザ-ウリジン、2-チオウリジン、4-チオ-シュードウリジン、2-チオ-シュードウリジン、5-ヒドロキシウリジン、3-メチルウリジン、5-カルボキシメチル-ウリジン、1-カルボキシメチル-シュードウリジン、5-プロピニル-ウリジン、1-プロピニル-シュードウリジン、5-タウリノメチルウリジン、1-タウリノメチル-シュードウリジン、5-タウリノメチル-2-チオ-ウリジン、1-タウリノメチル-4-チオ-ウリジン、5-メチル-ウリジン、1-メチル-シュードウリジン、4-チオ-1-メチル-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-シュードウリジン、1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、2-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2-チオ-ジヒドロウリジン、2-チオ-ジヒドロシュードウリジン、2-メトキシウリジン、2-メトキシ-4-チオ-ウリジン、4-メトキシ-シュードウリジン、4-メトキシ-2-チオ-シュードウリジン、5-アザ-シチジン、シュードイソシチジン、3-メチル-シチジン、N4-アセチルシチジン、5-ホルミルシチジン、N4-メチルシチジン、5-ヒドロキシメチルシチジン、1-メチル-シュードイソシチジン、ピロロ-シチジン、ピロロ-シュードイソシチジン、2-チオ-シチジン、2-チオ-5-メチル-シチジン、4-チオ-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-シュードイソシチジン、4-チオ-1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、1-メチル-1-デアザ-シュードイソシチジン、ゼブラリン、5-アザ-ゼブラリン、5-メチル-ゼブラリン、5-アザ-2-チオ-ゼブラリン、2-チオ-ゼブラリン、2-メトキシ-シチジン、2-メトキシ-5-メチル-シチジン、4-メトキシ-シュードイソシチジン、4-メトキシ-1-メチル-シュードイソシチジン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-アデニン、7-デアザ-8-アザ-アデニン、7-デアザ-2-アミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2-アミノプリン、7-デアザ-2,6-ジアミノプリン、7-デアザ-8-アザ-2,6-ジアミノプリン、1-メチルアデノシン、N6-メチルアデノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2-メチルチオ-N6-(cis-ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6-グリシニルカルバモイルアデノシン、N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、2-メチルチオ-N6-トレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6-ジメチルアデノシン、7-メチルアデニン、2-メチルチオ-アデニン、及び2-メトキシ-アデニン、イノシン、1-メチル-イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7-デアザ-グアノシン、7-デアザ-8-アザ-グアノシン、6-チオ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-グアノシン、6-チオ-7-デアザ-8-アザ-グアノシン、7-メチル-グアノシン、6-チオ-7-メチル-グアノシン、7-メチルイノシン、6-メトキシ-グアノシン、1-メチルグアノシン、N2-メチルグアノシン、N2,N2-ジメチルグアノシン、8-オキソ-グアノシン、7-メチル-8-オキソ-グアノシン、1-メチル-6-チオ-グアノシン、N2-メチル-6-チオ-グアノシン、及びN2,N2-ジメチル-6-チオ-グアノシン、並びにそれらの組み合わせを含みうるが、これらに限定されない。

【0028】

糖修飾は、ロックド核酸(LNA:2'-ヒドロキシルがC_1～6アルキレン橋又はC_1～6ヘテロアルキレン橋によって同じリボース糖の4'-炭素に接続したもの)、リボース中の酸素の置換(例えば、S、Se、又はメチレン若しくはエチレン等のアルキレンによる置換)、二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニル又はシクロヘキセニルで置換するため)、リボースの環縮小(例えば、シクロブタン又はオキセタンの4員環を形成するため)、リボースの環拡大(例えば、追加の炭素又はヘテロ原子を有し、またホスホロアミダート主鎖を有する、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びモルホリノ等の6員環又は7員環を形成するため)、多環式形態(例えば、三環式)、及び「アンロックド」形態、例えばグリコール核酸(GNA)(例えば、R-GNA又はS-GNA:ホスホジエステル結合に結合したグリコールユニットによってリボースが置換されたもの)、トレオース核酸(TNA:リボースがa-L-トレオフラノシル-(3'→2')で置換されたもの)、及びペプチド核酸(PNA:2-アミノ-エチル-グリシン結合がリボース及びホスホジエステル主鎖を置換するもの)を含みうるが、これらに限定されない。糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置と逆の立体化学的配置を有する1つ又は複数の炭素を含むこともできる。したがって、ポリヌクレオチド分子には、糖として例えばアラビノースを含むヌクレオチドが含まれうる。

【0029】

主鎖修飾は、2'-デオキシ修飾又は2'-O-メチル修飾を含みうるが、これらに限定されない。リン酸基修飾は、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノホスファート、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、ホスホン酸アルキル若しくはホスホン酸アリール、ホスホトリエステル、ホスホロジチオアート、架橋ホスホロアミダート、架橋ホスホロチオアート、又は架橋ホスホン酸メチレンを含みうるが、これらに限定されない。

【0030】

同義に使用される「タンパク質」、「ペプチド」、又は「ポリペプチド」という用語は、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化又はリン酸化)にかかわらず、自然発生のポリペプチド若しくはペプチドの全部若しくは一部を構成するか、又は、コードアミノ酸、非コードアミノ酸、修飾されたアミノ酸(例えば、化学的及び/若しくは生物学的に修飾されたアミノ酸)、及び/若しくは修飾された主鎖を含みうる、非自然発生のポリペプチド若しくはペプチドを構成する、2つを超えるアミノ酸の鎖を意味する。

【0031】

「制限酵素」又は「制限エンドヌクレアーゼ」又は「レストリクターゼ」という用語は、同義に使用されることがあり、概して、分子中の制限部位として知られる特異的な認識部位又はその付近で二本鎖DNAを切断して断片にする酵素を指す。制限酵素は、より広範なエンドヌクレアーゼ群の酵素の一種である。DNAを切断するには、すべての制限酵素が、DNA二重らせんの糖-リン酸主鎖の各々(すなわち、各鎖)に1回、計2回の切断を行う。

【0032】

以下の図面は、本開示の特長及び利点の特定の実施形態を例示する。これらの実施形態は、いかようにも添付の特許請求の範囲を限定することを意図してはいない。図面中の同様の参照符号は同様の要素を示す。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】ラダー組成物を調製するための非限定的な方法の概略図である。図示のとおり、核酸(例えば、ssDNA)鋳型のガイドされた切断による非限定的な一本鎖ラダーの調製が提示されている。楕円は、環状又は線状のいずれでもよい一本鎖鋳型を表す。ガイド付きオリゴヌクレオチド(破線)は、(A)鋳型と予めアニーリングしてもよく、(B)切断酵素(灰色の三角)と予めアセンブルしてもよく、又は(C)切断酵素及び鋳型と直接混合してもよい。すべての場合において、ガイド付きオリゴヌクレオチド及び切断酵素は、鋳型の標的領域に結合することができ、また、異なるサイズの一本鎖核酸断片を生成するように鋳型を切断することもできる。かかる断片は次に、適宜、電気泳動によって分離及び検出されうる(例えば、ゲル画像又は電気泳動図として表示される)。ガイド付きオリゴヌクレオチドは、同一の配列でも異なる配列でもよい。

【図2】オリゴヌクレオチドによりガイドされた制限酵素切断によって調製されたssDNAラダーの図である。(A)M13mp18 ssDNA鋳型における制限酵素位置のマップ、及び(B)異なる組み合わせの制限酵素消化によるssDNAサイズの電気泳動図分析が示されている。x軸は断片の移動時間を示し、y軸は蛍光である。また、(C)結果についてLabChip(登録商標)Reviewerにより生成された模擬ゲル像も示されている。インタクトな環状ssDNAのサイズは7246ntである。酵素(-)は陰性対照として使用した。サンプルの位置合わせのために低量マーカー(lower marker)を使用した。

【図3】制限酵素に基づく鋳型(例えば、ssDNA鋳型)の切断に使用するための非限定的なガイド付きオリゴヌクレオチドの概略図である。(A)平滑末端をもたらすガイド付きオリゴヌクレオチドが示されている。このガイド付きオリゴヌクレオチドは、標的領域(N)に対して十分に相補的な配列である標的結合領域(イタリック体のN)、及び標的領域内の制限配列(XXXX)に対して十分に相補的な配列である制限配列(YYYY)を含みうる。また、(B)付着末端又はジグザグ末端をもたらすガイド付きオリゴヌクレオチドも示されている。このガイド付きオリゴヌクレオチドは、標的領域(N)に対して十分に相補的な配列である標的結合領域(イタリック体のN)、及び標的領域内の制限配列(XXXXXX)に対して十分に相補的な配列である制限配列(YYYYYY)を含みうる。可能性のある切断位置(破線の三角)は、あくまで非限定的な例として示されている。

【図4】CRISPRに基づく鋳型(例えば、ssDNA鋳型)の切断に使用するための非限定的なガイド付きオリゴヌクレオチドの概略図である。標的領域は、鋳型内のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の逆相補配列の下流(例えば、約20nt下流)にありうる。ここで、この逆相補配列はCCN(5'から3')の配列を有し、そのためPAMはNGG(5'から3')である。(A)標的領域(N)に対して十分に相補的な配列である標的結合領域(イタリック体のN)と、CRISPRリボ核酸(crRNA)領域と、リンカーと、トランス作用性CRISPR RNA(tracrRNA)領域とを含む、シングルガイドRNAが示されている。また、(B)第1の部分(標的配列領域に対して十分に相補的な配列である標的結合領域であり、この標的結合領域はcrRNA領域に結合している)と第2の部分(tracrRNA領域)とを有するガイド付きRNAを含む、2部ガイド付きRNAも示されている。第1の部分及び第2の部分は、crRNA領域とtracrRNA領域の一部分との間のハイブリダイゼーション(破線)によって二本鎖構造を形成しうる。可能性のある切断位置(破線の三角)は、あくまで非限定的な例として示されている。

【図5】非限定的な制限部位を付したM13mp18のマップである。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本開示は、サイズ標準ラダー又は質量標準ラダーを生産するための方法、及びかかるラダーを含む組成物を包含する。いくつかの非限定的な実施形態において、本組成物は、一本鎖核酸サイズ標準物質を含みうる。本明細書に記述するとおり、ラダーは、一本鎖鋳型のガイドされた切断を使用することにより調製されうる。あらゆる有用な鋳型を用いることができ、例えば、一本鎖鋳型は天然資源由来でもよく、又は天然資源由来の合成構築物若しくはエンジニアリングされた構築物(例えば、1000ヌクレオチドを有するインサート等の1つ又は複数のインサートを含むエンジニアリングされたM13 DNA)でもよい。更に、鋳型は線状構築物でも環状構築物でもよい。いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は線状又は環状のいずれでもよく、サイズに制限はない。

【0035】

図1は、ラダー組成物を調製するための非限定的な方法を提示する。かかる方法は、鋳型(楕円)をガイド付きオリゴヌクレオチド(破線)及び切断酵素(三角)の存在下でインキュベートする工程を含み、それにより、複数の切断された一本鎖核酸を含むラダー組成物を生成することができる。

【0036】

鋳型は、一本鎖核酸(例えば、ssDNA、ssRNA、又はssDNA/RNA)でありうる。ひいては、ラダー組成物は、複数の切断された鋳型(例えば、切断されたssDNA、ssRNA、又はssDNA/RNA)を含みうる。更に、鋳型内の標的領域は、制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列、又はそれらの逆相補配列を含みうる。かかる部位は、ガイド付きオリゴヌクレオチド(又はガイド)に結合すると、切断酵素によって切断される標的領域内の位置となりうる。

【0037】

ガイド付きオリゴヌクレオチドは、鋳型の標的領域に結合するように構成されうる。一例において、ガイド付きオリゴヌクレオチド(又はガイド)は、鋳型内の標的領域に結合する(又はハイブリダイズする)ように構成された標的結合領域を含みうる。いくつかの実施形態において、ガイドは、制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、PAM配列、又はそれらの逆相補配列を含む。鋳型及びガイドは、互いに結合する(又はハイブリダイズする)ように設計されうる。例えば、鋳型が制限配列を含む場合、ガイドは、鋳型とガイドとの間のハイブリダイゼーションを確実にするための制限配列の逆相補配列を含むことができ、これにより、ハイブリダイズされた二本鎖構造が形成される。かかる二本鎖構造は、次に、切断酵素を動員し、鋳型の標的領域内の位置の切断を容易にしうる。かかる部位の非限定的な例については本明細書に記述する。

【0038】

特定の実施形態において、鋳型は、複数の標的領域を含むことができ、ガイドは、鋳型内の各標的領域に結合する(又はハイブリダイズする)ように設計することができる。このように、本方法は、第1のガイドが鋳型内の第1の標的領域に結合するように構成されており、第2のガイドが鋳型内の第2の標的領域に結合するように構成されているような、複数のガイドの使用を含みうる。切断酵素の存在下で、単一の鋳型は、鋳型に結合することができるn個のガイドによって決定される回数であるn回切断されうる(例えば、nは、1、2、3、4、5、又はそれより大きい数でありうる)。

【0039】

切断酵素は、ガイドに結合して標的領域内の位置を切断することにより、複数の切断された一本鎖核酸を含むラダー組成物を生成するように構成されうる。切断酵素の非限定的な例については本明細書に記述する。

【0040】

鋳型、ガイド、及び切断酵素は、あらゆる有用な様式で用意することができる。例えば、これらの成分を連続的若しくは同時に用意してもよく、又は複合体をもたらすように導入してもよい。図1Aから分かるように、ガイドをまず鋳型に供給することにより、結合した鋳型を含む複合体を用意することができる。次に、1つ又は複数の切断酵素を結合した鋳型に供給することにより、切断された核酸を生成することができる。このような切断産物は適宜、分離及び/又は検出されうる。

【0041】

他の複合体を形成することもできる。図1Bから分かるように、ガイドをまず切断酵素に供給することにより、酵素に結合したガイドを含む予めアセンブルされた複合体を用意することができる。次に、鋳型を供給することにより、鋳型に由来する切断された核酸を生成することができる。更に他の実施形態において、成分は別々に供給される。図1Cから分かるように、ガイド、切断酵素、及び鋳型を反応混合物に別々に加えることにより、切断された核酸を生成することができる。

【0042】

ガイド及び切断酵素は、鋳型のガイドされた切断をもたらすものであればいかなる組み合わせでもよい。一例において、ガイドはssDNAを含むことができ、切断酵素は制限酵素、ニッキング酵素、又はアルゴノートタンパク質を含むことができる。更に別の事例において、ガイドはssRNAを含むことができ、切断酵素はCas酵素を含むことができる。更に他の実施形態において、ssDNAを優先的に切断する最初の酵素を修飾することで、ssRNAも切断するようにしてもよく、その逆も同様である。更に、1つ又は複数の方法(例えば、本明細書に記述するいずれか)から得られた切断断片を一体に混合して最終的なラダー調製物としてもよい。

【0043】

いくつかの実施形態において、ssDNAサイズ標準物質は、ssDNA鋳型のガイドされた切断によって生成される(例えば、図1を参照されたい)。例えば、ガイドは、標的ssDNA鋳型と予めアニーリングしてもよく(例えば、図1Aを参照されたい)、標的ssDNA鋳型を供給する前に切断酵素と予めアセンブルしてもよく(例えば、図1Bのとおり)、又は切断酵素及びssDNA鋳型と直接混合してもよい(例えば、図1Cのとおり)。ここで、ガイド及び切断酵素は、ssDNA鋳型の標的領域に結合することにより、酵素にssDNA鋳型を切断させて異なるサイズのssDNA断片を生成するように構成されうる。サイズは、ガイドが鋳型に結合又はハイブリダイズする場所によって決まり、これにより、切断酵素のための切断位置が生じる。断片は適宜、電気泳動によって分離及び/又は検出されうる(例えば、ゲル画像又は電気泳動図として図1に表示されている)。非限定的なライブラリ調製物の特性評価を図2及び本明細書の実施例1に提示する。

【0044】

特定の切断酵素を含む方法についても記述する。いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、短い一本鎖ガイド付きオリゴヌクレオチドと共に制限酵素又はニッキング酵素によって切断されうる。制限酵素は短いDNA配列(又は制限部位)を認識し、これらの配列に内在又は隣接する特異的部位で二本鎖DNAを切断する。230種を超える異なるDNA配列を認識する約3,000種の制限酵素が発見されている。制限酵素は、細菌、ウイルス、古細菌、及び真核生物に存在している。ニッキング酵素は二重鎖DNAの一方の鎖のみを切断し、他方の鎖をインタクトに保つ。200種を超えるニッキング酵素が研究されており、その一部は市販されており、研究及び市販製品において定型的に使用されている。本明細書における方法では、あらゆる有用な制限酵素及びニッキング酵素を使用することができ、かかる酵素の非限定的な例については本明細書に記述する。

【0045】

いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、ガイドとしてのssDNAと共に、制限酵素又はニッキング酵素によって切断されうる。非限定的な例を実施例1に示す。この方法では、ガイドは、制限酵素/ニッキング酵素の結合及び切断に必要とされる最小のサイズ(又は長さ)を有することができる。制限酵素又はニッキング酵素と共に使用するためのガイドの非限定的な長さは、約10nt～30ntである。ガイドは、鋳型における標的領域の逆相補鎖として設計されうる。ひいては、ガイドを鋳型とアニーリングして(例えば、変性及びアニーリングのプロセスにより)短い二本鎖領域を形成することができ、これは制限酵素/ニッキング酵素によって認識及び切断されうる。非限定的な変性及びアニーリングの条件は、本明細書に記述するいずれか、例えば、高温での変性(例えば、約85℃以上で約2分以上等のあらゆる有用な時間にわたる変性、70℃で2分間の加熱の直後、分析前に氷上で約5分間の冷却を含む)、及び/又は高温でのアニーリングと37℃以下の温度への冷却のプロセス(例えば、約90℃で4分間、次に70℃で10分間アニーリングし、最後に0.1℃/秒で20分にわたり37℃にランプダウンすること)を含みうる。

【0046】

1つ又は複数のガイド(例えば、短いssDNAオリゴヌクレオチド)が、鋳型と同時に、又は順次の様式でアニーリングされうる。1つ又は複数の対応する制限酵素/ニッキング酵素が、同時に、又は順次の様式で、切断のために適用されうる。あらゆる市販又は既報の制限酵素又はニッキング酵素(天然資源又はエンジニアリングされたもの)をラダー調製のために使用することができる。切断後、熱又は化学的キレート化の使用により(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)の添加により)、制限酵素/ニッキング酵素を失活させてもよい。

【0047】

図3は、制限酵素と共に使用するための非限定的なガイド及び鋳型の概略図を提示する。図3Aから分かるように、ガイドは、標的結合領域(イタリック体)を含むことができ、標的結合領域は、制限配列(YYYY、二本鎖制限部位の一本の鎖に対応する)を更に含む。更に、標的結合領域は、鋳型の標的領域に結合する(又はハイブリダイズする)ように構成される。切断位置は、2本の鎖の間の切断が平滑末端をもたらしうるように制限部位内に位置しうる。図3Bから分かるように、切断後に付着末端又はジグザグ末端がもたらされる場合もある。

【0048】

他の態様において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、ガイドとしてのssDNAと共に、DNAガイド付きプログラム可能エンドヌクレアーゼによって切断されうる。例えば、原核生物アルゴノート(pAgo)タンパク質は、外来遺伝要素に対する細胞防御に関与するプログラム可能エンドヌクレアーゼである。この方法では、天然資源由来のアルゴノートタンパク質又はエンジニアリングされたタンパク質をラダー調製のために使用することができる。サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)のpAgo(TtAgo)は、標的DNAに結合するために短い一本鎖DNA(ssDNA)ガイドを使用しうる。アルゴノートタンパク質と共に使用する場合、ガイドは、標的結合領域及び認識配列を含むことができる。アルゴノートタンパク質と共に使用される非限定的な認識配列については本明細書に記述する。1つ又は複数のガイドが、ガイドされた切断のために、同時又は順次に、プログラム可能エンドヌクレアーゼタンパク質、バッファー、及び他の成分と併せて使用されうる。切断は、熱失活又は化学的失活によって(例えば、EDTAの添加によって)停止させることができる。

【0049】

更に他の態様において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、ガイドとしてのssRNAと共に、Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated、すなわちCRISPR-associated)酵素によって切断されうる。CRISPR-Casシステムは、可動遺伝要素に対する適応免疫をもたらすことが示されている。Cas9酵素による二本鎖DNA切断は、タイプIIのCRISPR-Cas免疫系の特徴である。Cas9-ガイドRNA複合体は、DNA中の20bp配列を認識し、部位特異的な二本鎖切断を発生させる。更に、ssDNA切断は、独特な様態の基質結合及び触媒ドメイン構成を要するCas9酵素ファミリーの内因性作用である。DNAを切断するCas酵素(例えば、Cas9、Cas12a、又は本明細書における他のもの等)は、ゲノム編集のための大きな関心対象である。これらのDNAヌクレアーゼの特異性はガイドによって決定されるため、標的指向化の適応性が高い。プログラム可能なDNA切断のこの一般的方法に加えて、これらのヌクレアーゼは、様々な用途のために利用されうる様々な生化学的特徴を有する。

【0050】

いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、ガイドとしてのssRNAと共に、CRISPR-Cas酵素によって切断されうる。この方法では、例えば、天然資源由来のCas9及びCas12aタンパク質又はエンジニアリングされたタンパク質だがこれらに限定されない、DNAを切断するCas酵素をラダー調製のために使用することができる。RNAガイドの設計は、標的領域(鋳型内)の特定の配列及びCas酵素からの対応する要件に基づく。1つ又は複数のssRNAガイドが、ガイドされた切断のために、同時又は順次に、CRISPR-Cas酵素、バッファー等と併せて使用されうる。CRISPR-Cas酵素による切断は、熱失活又は化学的失活によって(例えば、EDTAの添加によって)停止させることができる。

【0051】

図4は、Cas酵素と共に使用するための非限定的なガイド及び鋳型の概略図を提示する。図4Aから分かるように、ガイドは、標的結合領域(イタリック体)、CRISPRリボ核酸(crRNA)領域、適宜のリンカー、及びトランス作用性CRISPR RNA(tracrRNA)領域を含むことができる。PAMモチーフ内の配列は、対応するCas酵素に関連する。更に、標的結合領域は、鋳型の標的領域に結合する(又はハイブリダイズする)ように構成される。切断位置は、標的領域及び標的結合領域の中に位置しうる。いくつかの実施形態において、Cas酵素は、ニッカーゼ活性をもたらすように修飾されうる。

【0052】

特定の実施形態において、ラダーは、本明細書に記述する1つ又は複数の方法から調製されうる。かかる方法を使用して、切断された核酸の集団を別々に調製することができ、その後、かかる集団を最終産物として一体に混合することができる。1つの非限定的な実施形態において、ssDNA鋳型はM13mp18である(約7.2キロベース(kb)を有する一本鎖の環状DNA。例えば、図5を参照されたい)。かかる鋳型は、以下の線状サイズ標準物質を生成するために使用されうる:
・ 7.2kbを有する少なくとも1つの切断された核酸を含む集団(例えば、1つの制限酵素(例えば、HindIII)での切断によって、環状である最初の鋳型を線形化することによる)、
・ 2.1kbを有する第1の切断された核酸と、5.1kbを有する第2の切断された核酸とを含む集団(例えば、2つの制限酵素(例えば、HindIII及びPacI)での切断による)、
・ 3.2kbを有する第1の切断された核酸と、4kbを有する第2の切断された核酸とを含む集団(例えば、2つの制限酵素(例えば、HindIII及びAfeI)での切断による)、及び/又は
・ 1.0kbを有する第1の切断された核酸と、6.2kbを有する第1の切断された核酸とを含む集団(例えば、CRISPR-Cas酵素による切断による)。
いくつかの実施形態において、ラダー組成物は、上記断片を混合して、約1.0kb、2.1kb、3.2kb、4kb、5.1kb、6.2kb、及び7.2kbのサイズ標準物質を生成することによって調製されうる。他の実施形態において、ラダー組成物は、上記断片を混合して、約1.1kb、2.1kb、3.2kb、4kb、5.1kb、6.2kb、及び7.2kbのサイズ標準物質を生成することによって調製されうる。

【0053】

いくつかの実施形態において、本明細書における方法によって調製されたサイズ標準物質(例えば、ssDNAサイズ標準物質)は、例であって限定ではないがアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動プラットフォーム、キャピラリー電気泳動、マイクロ流体チップ、高速液体クロマトグラフィー、質量分析等において分離及び検出されうる。

【0054】

いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、高効率のラダー組成物の調製を可能にする。機構によって制限されることを望むものではないが、本件方法は、少ない数の試薬(例えば、短いガイド付きオリゴヌクレオチド及び切断酵素)を用い、反応事象(例えば、結合及び切断事象)の数が少ない。効果的な結合及び切断を容易にするプロセス条件を選択することにより、コスト又はプロセスの点で効率的にラダーを生産することができる。更に、本明細書に記述するとおり、生産されたラダー調製物は、使用前に精製及び/又は希釈を必要としない故に、後処理作業がなくなる可能性がある。

【0055】

いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、増加したサイズの核酸を有するラダー組成物の調製を可能にする。例えば、ラダーとして使用するための核酸を調製するためにPCRを使用することができるが、比較的長い核酸は、PCRを使用して調製するのが困難である。本明細書における方法を使用すると、500ベース以上の長さを有する核酸を調製することができる。更なる非限定的な長さは、約500ベース(0.5キロベースすなわちkb)超、1000ベース(1kb)超、2000ベース(2kb)超、3000ベース(3kb)超、4000ベース(4kb)超、5000ベース(5kb)超、6000ベース(6kb)超、7000ベース(7kb)超、又は8000ベース(8kb)超を含みうる。他の実施形態において、長さは、約0.5～3kb、0.5～5kb、0.5～10kb、0.5～20kb、0.5～50kb、0.5～100kb、0.5～200kb、0.5～500kb、0.5～750kb、1～3kb、1～5kb、1～10kb、1～20kb、1～50kb、1～100kb、1～200kb、1～500kb、1～750kb、2～3kb、2～5kb、2～10kb、2～20kb、2～50kb、2～100kb、2～200kb、2～500kb、2～750kb、3～5kb、3～10kb、3～20kb、3～50kb、3～100kb、3～200kb、3～500kb、3～750kb、5～10kb、5～20kb、5～50kb、5～100kb、5～200kb、5～500kb、5～750kb、10～20kb、10～50kb、10～100kb、10～200kb、10～500kb、又は10～750kbを含みうる。

【0056】

他の実施形態において、本明細書における方法は、高い純度を有するラダー組成物の調製を可能にする。例であって限定ではないが、本明細書における方法は、切断された一本鎖核酸を生成するために一本鎖鋳型を用いうる。純度の高い鋳型から出発することにより、更なる精製工程を必要とする高い純度を持つ切断された核酸を得ることができる。本明細書における方法は、生成されるラダー組成物の純度を低減させる成分を避けるように適合させることもできる。例えば、PCR又は他の増幅反応を避け、増幅を促進するための試薬(例えば、ポリメラーゼ、追加の塩類、追加のバッファー、及びバッファー成分等)を避けることができる。別の例において、過剰な又は追加の成分(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、変性剤等)を避けるように、鋳型の切断を適合させることができる。

【0057】

純度は、あらゆる有用な様式で決定することができる。1つの非限定的な事例において、純度は、一本鎖断片の均質性(例えば、断片サイズ又は断片配列によって評価される均質性)に基づきうる。特定の実施形態において、均質性は、酵素切断反応の効率によって決まりうる。別の事例では、ラダー組成物中のバッファーの純度が評価されうる。例えば、最終的なラダー組成物中のバッファーは、長期貯蔵(例えば、一本鎖核酸を損傷することがなく、また望ましくない二本鎖構造の存在や望ましくない断片サイズ等により核酸の他の特性に影響を及ぼすこともない、1か月間、3か月間、6か月間、1年間、又はより長期間の貯蔵)のために有用であるものとして特定されうる。しかし、いくつかの事例では、二本鎖構造がバッファー中で形成されてよく、ラダー組成物が使用前に変性されてよい。例であって限定ではないが、ラダー及び試験サンプルは、例えば、電気泳動の前のように、分析前に変性プロセス(例えば、本明細書に記述するいずれか)に曝露されうる。別の例において、最終的なラダー組成物中のバッファーは、1つ又は複数の下流プロセス(例えば、アッセイ、精製プロセス、分離プロセス等、例えば電気泳動)を妨害しないものとして特定されうる。

【0058】

純度を決定する方法は、分光光度計、電気泳動分析器、ssDNAアッセイ等の使用を含むがこれらに限定されない、あらゆる有用な方法論を含みうる。非限定的な例としては、様々な吸光度測定値(例えば、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MAのNanoDrop(商標)分光光度計等による、260nmでの吸光度(A260)、280nmでの吸光度(A280)、又はA260及びA280の比)の分析、ssDNAの量(例えば、Thermo Fisher Scientific社のQubit(商標)ssDNAアッセイキットによるもの等)、dsDNAの量(例えば、Qubit(商標)dsDNA HSアッセイキットによるもの等)、及び電気泳動の使用による(例えば、PerkinElmer社、Waltham、MAのLabChip(登録商標)等による)断片分析が挙げられる。

【0059】

いくつかの実施形態において、切断中の条件は、切断後精製の必要なく下流の電気泳動方法と適合するように最適化されうる。かかる条件の1つは、ウシ血清アルブミン(BSA)又は組換えアルブミン(rAlbumin)等のブロッキング剤の存在を含みうる。典型的には、BSA又はrAlbuminは、制限酵素又はニッキング酵素による切断中に使用されるバッファー中の標準成分である。使用の際、アルブミン含有成分は、反応混合物中のタンパク質を安定化するために、且つ/又は反応管若しくはピペットの表面への反応産物若しくは試薬(例えば、プライマー、タンパク質等)の付着を防止するために使用されうる。かかるバッファーが使用される場合、切断された産物(例えば、ssDNAラダーとして)は、アガロースゲル分析又はPAGEゲル分析のために直接使用されうる。ただし、電気泳動分析を実行する前に(例えば、BSA濃度の限界を0.05mg/mLまでとするLabChip(登録商標)プラットフォームにおいて)、かかる産物を希釈又は精製する必要がありうる。本明細書における方法を用いることにより、このようなブロッキング剤を切断中に避けることができる。

【0060】

ラダー生産のための切断反応において、鋳型(例えば、ssDNA)及び酵素は典型的に十分な量で供給され、そのため、表面結合に起因する損失性能のリスクが最小限に抑えられる。したがって、いくつかの実施形態において、BSA若しくはrAlbuminを除去するように、又はそれらの量を最小限に抑えるように、切断バッファーを改変してよい。その結果、酵素切断から得られた断片(例えば、切断されたssDNA断片)を精製及び/又は希釈の必要なく電気泳動に適用することができる。

【0061】

別の例において、二本鎖(ds)核酸の存在が望ましくない場合があるため、本件方法は、かかるds核酸の過剰な存在をなくす。ガイド付きオリゴヌクレオチドが鋳型に結合した際に二本鎖構造が存在する場合、かかる構造は、生成されるラダーにわずかな影響を及ぼすように設計されうる。例えば、ガイドの長さがラダー組成物中で提供される切断された核酸よりも10、20、30、40nt、又は更に短くなりうるように、短縮されたガイド付きオリゴヌクレオチド(又はガイド)が用いられうる。

【0062】

更に別の例において、本明細書における方法は、主として一本鎖及び切断された核酸を有するラダー組成物の調製を可能にする。本明細書に記述するとおり、本明細書における方法は、切断された一本鎖核酸をもたらすために二本鎖構造の連続的形成(例えば、PCRの場合)を避けることができる。したがって、得られる切断された核酸は一本鎖とみなされうる。一本鎖性(single-strandedness)の程度は、あらゆる有用な様式で、例えば、260nmでの吸光度を測定すること(深色性は、二本鎖構造の変性に応じて吸光度の増加をもたらす)、二本鎖構造に結合しうるインターカレート色素を使用すること等によって決定することができる。一本鎖性の程度は、切断された一本鎖核酸の集団について決定することができ、集団のうち少なくとも80%、90%、又はそれより多くが一本鎖でありうる。

【0063】

更に他の実施形態において、本開示は、ssDNAサイズ標準物質の調製に関する、特に大サイズのラダー(例えば、0.5kb、1kb、2kb、又はそれより大きいもの)に関する現在の限界を解消するために用いられうる。そのような大サイズのラダーは、比較的長い核酸断片を分析する用途において有用でありうる。用途としては、例えば、遺伝子療法、mRNAに基づくワクチン、又は他の治療策を挙げることができる。特定の実施形態において、ラダー組成物は、以下の特徴のうちの1つ又は複数を含みうる:
・ 出発鋳型は一本鎖核酸(例えば、ssDNA)の天然資源でありうる。非限定的な実施形態において、鋳型は、低コストで大量に商業的に利用可能でありうる。
・ 所望のサイズの切断された核酸が配列特異的切断によって生成されうる。理論上、必要とされる標準サイズに制限はない。
・ 切断された核酸は、例えば、二本鎖鋳型又は二本鎖切断産物から1本の鎖を除去するための更なる精製の必要なしに、直接使用されうる。このような手法は、生産プロセスを単純化し、生産コストを低減させることができる。
・ 本明細書における切断方法は、サーモサイクリングを必要としうるPCRと比較すると、切断温度を単一の温度で実行することができるため、大型容器でスケールアップすることができる。熱ランピング及びPCR試薬を避けることにより、生産プロセスを単純化することができる。

【0064】

本明細書における方法のいずれについても、利点としては、市販の切断酵素の利用可能性によって制限されない、使用者又は意図された用途による切断されたラダーのサイズの制御を挙げることができる。

【0065】

いくつかの実施形態において、本開示は、PCR、二本鎖産物を生成しうる等温増幅、又はDNAザイム切断とは無関係な、一本鎖核酸(例えば、ssDNA)ラダー組成物に関する方法を包含する。特定の実施形態において、かかる方法は大量生産を可能にしうる。

【0066】

他の実施形態において、ラダー組成物は、第1の切断された一本鎖核酸の第1の集団を含みうる。この集団は、いかなる特徴を有するものでもよい。一例において、この集団は、特定の長さを有する核酸を含みうる。いくつかの実施形態において、集団のうちの少なくとも50%、60%、70%、80%、又はそれより多くが、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれを超えるkbの長さ、又は約0.5～750kb(例えば、0.5～3kb、0.5～5kb、0.5～10kb、0.5～20kb、0.5～50kb、0.5～100kb、0.5～200kb、0.5～500kb、1～3kb、1～5kb、1～10kb、1～20kb、1～50kb、1～100kb、1～200kb、1～500kb、1～750kb、2～3kb、2～5kb、2～10kb、2～20kb、2～50kb、2～100kb、2～200kb、2～500kb、2～750kb、3～5kb、3～10kb、3～20kb、3～50kb、3～100kb、3～200kb、3～500kb、3～750kb、5～10kb、5～20kb、5～50kb、5～100kb、5～200kb、5～500kb、5～750kb、10～20kb、10～50kb、10～100kb、10～200kb、10～500kb、若しくは10～750kb)の長さを有する。他の実施形態において、単一の集団が、複数の第1の切断された一本鎖核酸と、複数の第2の切断された一本鎖核酸とを有してよく、その際、第1の切断された一本鎖核酸は第1の長さを有し、第2の切断された一本鎖核酸は第2の長さを有する。第1の長さ及び第2の長さは異なってよい。

【0067】

いくつかの実施形態において、ラダー組成物は第1の集団及び第2の集団を含むことができ、各集団は複数の切断された一本鎖核酸を含む。他の実施形態において、ラダー組成物は複数の集団を含み、各集団はそれぞれの複数の切断された一本鎖核酸を含むことができる。

【0068】

更に、いくつかの実施形態において、各集団は別の集団と異なりうる。集団間の差異は、例えば、サイズ、質量、及び/又は配列の差異を含みうる。このような集団間の差異は、各集団のうちの特定のパーセンテージが特定の特徴を有することによって特徴付けられうる。例であって限定ではないが、第1の集団のうちの少なくとも90%が、第2の集団のうちの少なくとも90%より長い長さを有しうる。

【0069】

他の実施形態において、各集団は、共通の特徴を含みうる。例であって限定ではないが、集団(例えば、又は複数の集団における各集団)のうちの少なくとも80%、90%、又はそれより多くが一本鎖でありうる。別の例において、集団(例えば、又は複数の集団における各集団)のうちの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、又はそれより多くが、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、若しくはそれを超えるkbの長さ、又は約0.5～750kb(例えば、本明細書に記述するいずれかの範囲)の長さを有する。

【0070】

複数の集団が存在する場合、各集団は、共通の特徴(例えば、約0.5～750kbの長さ)を有しうる。しかし、各集団はそれでも異なる特徴を有しうる(例えば、第1の集団が長さ約0.5kbを有し、第2の集団が長さ約1kbを有し、第3の集団が長さ約2kbを有する等)。当業者であれば、かかるラダー組成物及び組成物中の集団の望ましい特徴がどのように決定されうるか、並びに本明細書における方法がかかる組成物を調製するためにどのように設計されうるかを理解するであろう。

【0071】

ラダー組成物は、米国特許第8,273,863号、米国特許公開第2019/0203242号又は米国特許公開第2007/0178482号、国際公開第WO2020/232286号、Bushら、Molecules 2020年7月26日;25(15):3386、及び/又はGuら、Biotechniques 2013年6月;54(6):337～43に記述されているような、他の更なる特徴を含むことができ、これらの各々は、全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。

【0072】

鋳型
あらゆる有用な鋳型を用いることができる。いくつかの実施形態において、鋳型は、天然源(例えば、バクテリオファージ、ウイルス核酸、アデノ随伴ウイルス核酸等)から得ることができる。鋳型(例えば、ssDNA鋳型)の非限定的な例としては、M13mp18等のM13バクテリオファージ(約7.2kbを有する一本鎖環状DNA)、ΦX174ビリオンDNA等のΦX174バクテリオファージから単離された一本鎖ウイルスDNA(約5.4kbを有する一本鎖環状DNA)、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)血清型1、2、4、若しくは7～11等の一本鎖線状AAV DNA(約4.7～4.8kbを有する一本鎖線状DNA)が挙げられる。このような鋳型は、あらゆる有用なバクテリオファージ又はウイルスから得ることができ、このような鋳型は、DNA及び/又はRNAを含みうる。

【0073】

いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、天然資源から得られた核酸配列の遺伝子エンジニアリングされた形態でありうる。他の実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、合成構築物を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、例えば、インビトロでの二本鎖プラスミドからのssDNAの産生を含むがこれに限定されない、インビトロプロセスから調製されうる。インビトロプロセスの非限定的な例は、例えば、Thermo Fisher Scientific社、「Production of Single-stranded Circular DNA Molecules from Supercoiled Double-stranded Plasmids in vitro」、2012、1頁(tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/76-circular-ssdna-from-supercoiled-double-stranded-plasmids-in-vitro.pdfにてアクセス可能)において提示されており、これは全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。他の実施形態において、鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、天然資源若しくは合成構築物のいずれか又はインビトロプロセスからインビトロで増幅された産物でありうる。増幅方法は、ローリングサークル増幅(RCA)でありうるが、これに限定されない。

【0075】

ガイド付きオリゴヌクレオチド
ガイド付きオリゴヌクレオチド(又はガイド)は、DNA、RNA、又はその両方から形成された一本鎖構造でありうる。特定の実施形態において、ガイドは合成構築物である。鋳型における所望の標的領域及び既知の標的領域に基づいて、鋳型内の標的領域に結合する(又はハイブリダイズする)ように構成された標的結合領域を含むようにガイドを設計することができる。更に、ガイドは、切断酵素の一部分に結合する(又はハイブリダイズする)領域を含むことができる。ガイドに結合した鋳型に結合すると、切断酵素は、鋳型(例えば、鋳型の標的領域内)を切断することができる。このようにして、鋳型の切断がガイドによって誘導される。

【0076】

ガイドの標的結合領域は、1つ又は複数の制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、PAM配列、又はそれらの逆相補配列を含みうる。これらの制限配列、認識配列、プロトスペーサー領域、PAM配列、又はそれらの逆相補配列の各々が、一本鎖構造でありうる。このような配列が鋳型に結合すると、二本鎖構造が形成され、このような二本鎖構造は、切断可能な酵素が結合する部位又はモチーフを形成する。したがって、ガイドは、記述するいずれかの制限モチーフ、本明細書に記述するいずれかの認識モチーフ、又はこれらのいずれかの逆相補配列の鎖を含みうる。

【0077】

したがって、本明細書におけるいずれかの部位又はモチーフに由来する一本鎖配列が、ガイド内に設けられうる。例えば、切断酵素が制限酵素である場合、ガイドは、対応する制限モチーフに由来する制限配列を含みうる。ガイドの制限配列が鋳型の標的領域に結合すると、二本鎖制限モチーフが形成されうる。すると、かかるモチーフが所望の制限酵素に結合しうる。

【0078】

当業者であれば、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイドを開発することができるであろう。例であって限定ではないが、以下の設計検討が行われうる。

【0079】

工程1:鋳型及び鋳型内の標的領域の配列に基づいて制限酵素/ニッキング酵素を特定する。ssDNA鋳型の場合、市販又は無料のソフトウェア(例えば、nc2.neb.com/NEBcutter2/で提供されているNEB cutter 2.0)を使用して、制限酵素の位置を特定することができる。配列マップの非限定的な例を図5に提示する。

【0080】

工程2:適切な酵素又は酵素群(例えば、複数の酵素)を選択する。制限酵素/ニッキング酵素(例えば、以下又は図5に記述するもの)の選択にあたり検討すべき要素としては、以下のうちの1つ又は複数が挙げられる:
・ 切断産物サイズが要件(例えば、サイズ要件)を満たすこと。
・ 酵素のコスト。例であって限定ではないが、M13mp18の単回の切断のために1つの酵素のみを選択するならば、HindIIIは他の酵素より大幅に安価であるため、HindIIIを選択することができる。及び/又は、
・ 複数の酵素を使用して切断を同時に行うならば、切断バッファーは、そのような異なる酵素に適合すべきである。バッファー適合性を決定するためのソフトウェアの非限定的な例としては、例えば、nebcloner.neb.com/#!/redigestが挙げられる。

【0081】

工程3:制限酵素/ニッキング酵素の選択に基づいてガイドを設計する。ガイドの設計にあたり検討すべき要素としては、以下のうちの1つ又は複数が挙げられる:
・ 標的の制限部位/ニッキング部位に結合する(補完又はハイブリダイズする)ことができる配列(標的結合領域のためのもの)を含めること。
・ 追加の配列、例えば、制限部位/ニッキング部位の片側に追加された6ntを含めること(例えば、www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragmentsを参照されたい)。かかる追加の配列は、鋳型の標的領域に結合する(補完又はハイブリダイズする)ように構成されたものでありうる。及び/又は、
・ 製造コストを低減させうる標準的な脱塩オリゴヌクレオチドの使用を検討すること。

【0082】

ガイドの非限定的な例を実施例1のTable 1(表1)に提示する(制限配列は太字で強調されている)。

【0083】

他の切断酵素のためのガイドは、標的結合領域及び他の制限配列(例えば、ニッキング酵素と共に使用するため)、認識配列(例えば、アルゴノートタンパク質と共に使用するため)、プロトスペーサー領域(例えば、Cas酵素と共に使用するため)、PAM配列(例えば、Cas酵素と共に使用するため)、又はそれらの逆相補配列を含むように設計されうる。

【0084】

特に、Cas酵素と共に使用するためのガイドは、一本鎖ガイド又は二本鎖ガイド(2部ガイド)を含みうる。典型的には、Cas酵素は、tracrRNA領域及びcrRNA領域という2つのRNA領域によって標的へと動員される。合成ガイドを使用することで、連続した単一の核酸においてこれら2つの領域を用意することができる。したがって、いくつかの実施形態において、一本鎖ガイドは、標的結合領域、crRNA領域、及びtracrRNA領域を含む。適宜、リンカーがcrRNA領域とtracrRNA領域との間に存在してもよい。他の実施形態において、ガイドは二本鎖ガイドであり、標的結合領域及びcRNA領域を有する第1の鎖と、tracrRNA領域を有する第2の鎖とを含む。第1の鎖及び第2の鎖は、一体となって二本鎖構造を形成しうる。

【0085】

当業者であれば、Cas酵素を使用することにより、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイドを開発することができるであろう。例であって限定ではないが、以下の設計検討が行われうる(これは手作業で実施してもよく、又は無料若しくは市販のソリューションを含むソフトウェアを使用して実施してもよい)。

【0086】

工程1:ssDNA鋳型における逆相補配列PAM配列の候補配列を特定する。PAM配列は通常「NGG」であり、他のPAM配列については本明細書に記述する。これはCRISPR酵素に応じた他のフォーマットでもよい。鋳型(例えば、ssDNA鋳型)は、PAM配列「NGG」の逆相補配列である「CCN」(5'から3')を含みうる。

【0087】

工程2:所望の切断産物サイズに基づいて鋳型内の候補PAMの位置を選択する。

【0088】

工程3:選択されたPAM配列に基づいてガイドを設計する。いくつかの実施形態において、標的領域は、鋳型内の5'-CCN配列の20ntほど下流である。ガイドを設計することについての非限定的な例は、例えば、takarabio.com/learning-centers/gene-function/gene-editing/gene-editing-tools-and-information/how-to-design-sgrna-sequences、snapgene.com/guides/design-grna-for-crispr、又はidtdna.com/pages/community/blog/post/guide-rna-design-be-on-target!に提示されており、これら各々の開示内容は、全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。

【0089】

ガイド設計の非限定的な例を図4に示す。図4Aから分かるように、ガイドはシングルガイドRNAを含むことができ、シングルガイドRNAは以下(5'末端から3'末端)を含みうる:
・ ssDNA鋳型内の標的領域(例えば、適宜約20ntでありうる標的領域)に対する相補配列を含む標的結合領域、
・ crRNA配列、
・ crRNA及びtracrRNAを連結するリンカー配列(例えば、本明細書に記述するいずれかのリンカー)、並びに
・ tracrRNA配列。

【0090】

図4Bは、第1の部分及び第2の部分を含む2部ガイドを示す。第1の部分は、以下を有する核酸(例えば、RNA)を含みうる:
・ ssDNA鋳型内の標的領域(例えば、適宜約20ntでありうる標的領域)に対する相補配列を含む標的結合領域、及び
・ crRNA配列。
第2の部分は、tracrRNA配列を有する核酸(例えば、RNA)を含みうる。tracrRNA配列の一部分は、縦の破線によって示されているように、crRNA配列に対して相補的でありうる。ガイド(例えば、RNAの5'末端及び/又は3'末端にあるもの)には、例えば、2'OMe塩基、ホスホノチオアート又はホスホロチオアート結合修飾等だがこれらに限定されない、1つ又は複数のヌクレオチド修飾が含まれうる。更なる修飾されたヌクレオチドについては本明細書に記述する。

【0091】

切断酵素
あらゆる有用な切断酵素を用いることができる。切断酵素は、1つ又は複数の制限酵素、ニッキング酵素、プログラム可能エンドヌクレアーゼ、アルゴノートタンパク質、Cas酵素、あらゆる有用なヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ)、又はそれらのバリアントを含みうる。

【0092】

一実施形態において、切断酵素は制限酵素であり、平滑末端制限エンドヌクレアーゼ及び/又は付着末端制限エンドヌクレアーゼを含みうる。かかる酵素は、制限配列を有するガイド付きオリゴヌクレオチドと共に使用されうる。いくつかの実施形態において、制限配列は、約4nt～10ntの長さを有する。非限定的な制限配列の例としては、5'-AAGCTT-3'(例えば、HindIIIのため)、5'-TTAATTAA-3'(例えば、PacIのため)、5'-AGCGCT-3'(例えば、AfeIのため)、又はそれらの逆相補配列が挙げられる。当業者であれば、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイド付きオリゴヌクレオチドを開発するだけでなく、特定の制限酵素の制限部位及び対応する制限配列を決定することもできるであろう。

【0093】

制限酵素の非限定的な例は、Acc65I、AccI、AfeI、AleI、AlwNI、AvaII、BaeGI、BamHI、BglI、BglII、BmrI、BsaHI、BseRI、BsmBI、BsmI、BspHI、BsrFI、BsrGI、Bsu36I、BtsI、CspCI、DraIII、DrdI、Eco53KI、EcoRI、Esp3I、FspI、HincII、HindIII、KasI、KpnI、MscI、NarI、NgoMIV、NaeI、PacI、PstI、PvuI、SacI、SalI、SbfI、SfoI、SmaI、SnaBI、SphI、SwaI、TspMI、PluTI、XbaI、XmaI等のうちの1つ又は複数を含みうる。

【0094】

更に他の酵素は、AluI、AvaI、BamHI、BanII、BglII、ClaI、DraI、Eco47 III、EcoRI、EcoRV、FspI、HindIII、HpaI、HpaII、KpnI、MscI、MseI、NcoI、NdeI、NotI、NruI、PstI、PvuI、PvuII、RsaI、ScaI、SmaI、SspI、SstI、StuI、ThaI、XbaI、又はXhoIを含む。更に他の酵素は、AatII、AbsI(x)、AcuI、AflII、AgeI、AhdI、AjuI(x)、ApaI、ApaLI、AscI、AsiSI、AvrII、BbsI、BcgI、BciVI、BclI、BlpI、BmgBI、BmtI、BplI(x)、BsaI、BsgI、BsiWI、BspEI、BspQI、BssHII、BssSI、BstAPI、BstBI、BstEII、BstXI、BstZ17I、EagI、EcoNI、EcoO109I、EcoRV、FseI、FspAI(x)、HpaI、KflI(x)、MauBI(x)、MfeI、MluI、MreI(x)、MteI(x)、NcoI、NheI、NmeAIII、NotI、NruI、NsiI、PaeR7I、PaqCI、PasI(x)、PflFI、PflMI、PfoI(x)、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PspOMI、PspXI、PsrI(x)、RsrII、SacII、SanDI、SapI、ScaI、SexAI、SfiI、SgrAI、SgrDI(x)、SpeI、SrfI(x)、StuI、StyI、Tth111I、XcmI、XhoI、ZraI等を含む。当業者であれば、このような酵素の制限部位及び対応する制限配列を特定する方法、並びに当該部位を使用して鋳型の標的領域及び/又はガイド付きオリゴヌクレオチドにおける切断位置とする方法を理解するであろう。

【0095】

本明細書に記述する制限酵素、及び本開示において同様に使用できる他の制限酵素は、例えば、Thermo Fisher Scientific社(Waltham、MA)又はNew England Biolabs社(Ipswich、MA)から市販されている。例えば、本明細書には特定の制限エンドヌクレアーゼを記しているが、イソ制限酵素、すなわち、同じ認識部位を有するが切断の仕方が異なる酵素を代わりに用いてもよく、同じ結果が達成されることは認識されよう。制限酵素及びその切断部位の他の例については、全体として参照することにより本明細書に組み込まれているRoberts、Nucl.Acids Res.1989;17(補遺):r347～r387も参照されたい。

【0096】

切断酵素はニッキング酵素(例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼ)でありうる。かかるニッキング酵素は、二本鎖構造の1本の鎖のみを切断するために使用できる。例えば、ガイド付きオリゴヌクレオチドは、鋳型の標的領域に結合することにより、ガイドに基づく切断を調整するように構成されうる。しかし、ニッキング酵素による切断は、鋳型鎖のみに起こりうる。かかる酵素は、制限配列を有するガイド付きオリゴヌクレオチドと共に使用されうる。いくつかの実施形態において、制限配列は、約4nt～12ntの長さを有する。非限定的な制限配列の例としては、5'-NNNNNGACTC-3'(例えば、Nt.BstNBIのため)又は5'-GCAGTGNN-3'(例えば、Nb.BtsIのため)が挙げられ、ここでNは任意の核酸(例えば、G、C、A、T、若しくはU、又はそれらの修飾型)でありうる。当業者であれば、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイド付きオリゴヌクレオチドを開発するだけでなく、特定のニッキング酵素(例えば、トップ鎖特異的又はボトム鎖特異的な切断酵素)の制限部位及び対応する制限配列を決定することもできるであろう。

【0097】

ニッキング酵素の非限定的な例としては、Nb.BbvCI、Nb.Bpu10I、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、Nb.BtsI、Nb.Mva1269I、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.Bpu10I、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII等が挙げられる。他の実施形態において、ニッキング酵素は、ボトム鎖又はトップ鎖をニッキングするように修飾されている制限酵素(例えば、本明細書に記述するいずれか)でありうる。

【0098】

切断酵素は、プログラム可能エンドヌクレアーゼでありうる。一実施形態において、プログラム可能エンドヌクレアーゼは、使用者が定義した核酸配列(例えば、鋳型又はガイド付きオリゴヌクレオチドにおける核酸配列)を認識する酵素であり、その認識部位は、制限酵素の平均的な制限部位より大幅に大きいことが可能である(例えば、プログラム可能エンドヌクレアーゼの認識部位は、約15塩基対(bp)から25bpを含むことができる)。いくつかの実施形態において、認識配列は、約15nt～25ntの長さを有する。RNAガイド付きのCRISPRに基づくシステム及びDNAガイド付き原核生物アルゴノート等のプログラム可能エンドヌクレアーゼは、原核生物界の至る所で見出され、活性及び特異性を著しく異にしうる。

【0099】

いくつかの実施形態において、切断酵素はアルゴノートタンパク質でありうる。特定の実施形態において、アルゴノートタンパク質は、DNAガイド又はRNAガイドによるプログラム可能な鋳型切断のために使用されうる。かかる酵素は、認識配列又はその逆相補配列を有するガイド付きオリゴヌクレオチド(例えば、ガイド付きDNA)と共に使用されうる。非限定的な認識配列の例としては、5'-TTACCGCTAATGGTGTG-3'(配列番号1)又は5'-TNNNNNNNNNNXNNNNN-3'が挙げられ、ここで、XはG、C、T、又はUであり、Nは任意の核酸(例えば、G、C、A、T、若しくはU、又はそれらの修飾型)であり、適宜、GC含量は約10%～70%又は20%～60%である。ガイド付きオリゴヌクレオチドは認識配列を含むことができ、鋳型は認識配列に結合する(又はハイブリダイズする)ように構成することができる。いくつかの実施形態において、鋳型における切断位置は、例えば、ガイド付きオリゴヌクレオチドの塩基10と塩基11との間に対応する標的領域内に位置しうる。当業者であれば、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイド付きオリゴヌクレオチドを開発するだけでなく、特定のアルゴノートタンパク質の制限部位及び対応する制限配列を決定することもできるであろう。RNAガイドによるプログラム可能な鋳型切断に関する方法及び組成物は、Doxzen KW及びDoudna JA、「DNA recognition by an RNA-guided bacterial Argonaute」、PLoS ONE 12(5):e0177097(14頁)に記述されており、これは全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。

【0100】

アルゴノートタンパク質の非限定的な例としては、アルゴノートRISC触媒成分2(Ago2)、原核生物アルゴノート(pAgo)、サーマス・サーモフィラスアルゴノート(TtAgo)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)アルゴノート(MjAgo)、又はパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)アルゴノート(PfAgo)が挙げられる。

【0101】

他の実施形態において、切断酵素はCas酵素でありうる。特定の実施形態において、Cas酵素は、RNAガイドによるプログラム可能な鋳型切断のために使用されうる。かかる酵素は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列又はその逆相補配列を有するガイド付きオリゴヌクレオチド(例えば、ガイド付きRNA)と共に使用されうる。非限定的なPAM配列の例としては、5'-NGG、及び逆相補配列としての5'-CCNが挙げられる。PAM配列の更に他の例としては、5'-NGCG、5'-NGAG、5'-NGNG、5'-NAGN、5'-NG、5'-GAA、5'-GAT、5'-NNGRRT、5'-NNGRR(N)、5'-TTTV、5'-TYCV、5'-TATV、5'-NNNNRYAC、5'-NNNNGATT、5'-NNAGAAW、5'-NAAAAC、及びこれらのいずれかの逆相補配列が挙げられる。これらの配列のいずれについても、各Nは独立して、G、C、A、T、又はU、及びそれらの修飾型でありうる。

【0102】

ガイド付きオリゴヌクレオチドにおいて、PAM配列は、切断位置の約2nt～6nt下流に位置しうる。PAM配列の逆相補配列は、鋳型における標的領域の約2nt～6nt上流に位置しうる。当業者であれば、鋳型への結合及び鋳型の切断を容易にするガイド付きオリゴヌクレオチドを開発するだけでなく、特定のCas酵素のためのPAM配列及びこれらの配列の位置を決定することができるであろう。

【0103】

Cas酵素の非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(別称Csn1及びCsx12)、Cas10、Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12f(Cas14)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j(CasΦ)、Cas12k(C2c5)、Cas13a(C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、それらのホモログ、又はそれらの修飾型が挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9タンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースにおいてアクセッション番号Q99ZW2で確認することができる。いくつかの実施形態において、未修飾のCas酵素は、Cas9のように、DNA切断活性を有する。いくつかの実施形態において、Cas酵素はCas9であり、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号Q99ZW2)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号G3ECR1)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号A0A111NJ61)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号J7RUA5)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号A1IQ68)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号Q0P897)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号Q13CC2)、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号Q2RX87)、アクチノミセス・ネスルンディ(Actinomyces naeslundii)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号J3F2B0)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)亜種ノビシダ(novicida)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号A0Q5Y3)、又はコリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)由来(例えば、UniProtKBアクセッション番号Q6NKI3)のCas9でありうる。いくつかの実施形態において、Cas酵素は、標的領域内及び/又は標的領域の相補配列内のような標的領域の位置における一方又は両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態において、Cas酵素は、標的領域の最初又は最後のヌクレオチドから約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、又はそれより多くの塩基対における一方又は両方の鎖の切断を誘導する。

【0104】

ヌクレアーゼは、Cas9のホモログ又はオルソログでありうる。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、標的領域の位置における1本又は2本の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、DNA鎖切断活性を欠いている。いくつかの実施形態において、第1の調節エレメントは、ポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、第2の調節エレメントは、ポリメラーゼIIプロモーターである。

【0105】

あらゆる有用なCas酵素又は複合体を用いることができる。例示的なCas酵素又は複合体は、クラス1又はクラス2のCRISPR/Casシステム、及びタイプI、タイプII、タイプIII、タイプIV、タイプV、又はタイプVIのCRISPR/Casシステムに関与するものを含み、crRNA干渉中に単一のCasタンパク質を必要とするもの(例えば、クラス1システムのもの等)、Cas9(旧称Csn1又はCsx12、例えば、タイプII-Aシステム及びタイプII-Cシステムを含めたタイプIIシステムのもの等)、Cas12(例えば、タイプVシステムのもの等)、Cas13(例えば、タイプVIシステムのもの等)、抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体(Cascade、RAMPタンパク質を含む)、crRNA干渉中に複数のCasタンパク質を必要とするもの(例えば、クラス2システムのもの等)、Cas3、Cas7、Cas6、Cas5、Cas11、及び/又はCas8(例えば、タイプI-EシステムのようなタイプIシステムのもの)、Csm(例えば、タイプIII-Aシステムのもの)、Cmr(例えば、タイプIII-Bシステムのもの)、Cas7、Cas5、Cas11、Cas10、及び/又はCas6(例えば、タイプIIIシステムのもの)、Cas7、Cas5、Cas11、Cas8、DinG(又はCysH)、及び/又はCas6(例えば、タイプIVシステムのもの)、並びにそれらのサブアセンブリ又はサブコンポーネント及びかかるCas酵素又は複合体を含むアセンブリを含むが、これらに限定されない。更なるCas酵素及び複合体は、Makarova KSら、「Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems」、Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9:467～77、及びWang JYら、「Structural biology of CRISPR-Cas immunity and genome editing enzymes」、Nat. Rev. Microbiol. 2022; doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4(16頁)に記述されており、これらの各々は、全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。

【0106】

いくつかの実施形態において、Cas酵素は、対応する野生型酵素と比較して、二本鎖構造の両鎖を切断する能力を欠いているバリアントである。例えば、S.ピオゲネス由来のCas9のRuvC I触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換(D10A)は、両鎖を切断するヌクレアーゼから一本鎖を切断するニッカーゼへとCas9を変換する。Cas9をニッカーゼにする変異の他の例は、H840A、N854A、及び/又はN863Aを含むが、これらに限定されない。

【0107】

更なる切断酵素及び切断条件は、米国特許第5,316,908号又は米国特許第8,273,863号、米国特許公開第2019/0203242号、米国特許公開第2007/0178482号、又は米国特許公開第2019/0002868号、国際公開第WO2020/232286号、Bushら、Molecules 2020年7月26日;25(15):3386、Guら、Biotechniques 2013年6月;54(6):337～43、Cooney、Mol. Biotechnol. 1994;2(2):119～127、Parkerら、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 1977;74(3):851～855、Polyarushら、Chem. Natural Compounds 2003;39(6):592～594、Lanら、J. Nucleic Acids 2012; 2012:254630、Wangら、J. Nucleic Acids 2010; 2010:421803 (3頁)、Amillsら、Genet Anal. 1996;13:147～9、Abdel-Fattahら、Biotechnology. 2006;5:166～172、Changら、J. Biochem. Biophys. Methods 2008;70:1199～202、Wangら、J. Nucleic Acids 2010; 2010:421803、Wuら、Mol. Biol. Rep. 2011;38:2729～31、Swartjesら、Biochem. Soc. Trans. 2020年2月28日;48(1):207～219、Maら、Mol Cell. 2015年11月5日;60(3):398～407、Huntら、Front. Mol. Biosci. 2021年4月29日(doi.org/10.3389/fmolb.2021.670940にてアクセス可能)、Makarovaら、Nat. Rev. Microbiol. 2011; 9:467～77、Wangら、Nat. Rev. Microbiol. 2022; doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4 (16頁)、及び/又はThermo Fisher Scientific社、「Production of Single-stranded Circular DNA Molecules from Supercoiled Double-stranded Plasmids in vitro」、2012、1頁(tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/76-circular-ssdna-from-supercoiled-double-stranded-plasmids-in-vitro.pdfにてアクセス可能)に記述されているような、あらゆる有用な特徴を含むことができ、これらの各々は、全体として参照することにより本明細書に組み込まれている。

【0108】

キット
また本開示は、一本鎖核酸ラダー(例えば、ssDNAラダー)のキットを提供する。かかるキットには、特定のサイズを有する1つ又は複数の標準物質を含む、一本鎖核酸(例えば、ssDNA)のサイズ標準物質が含まれうる。

【0109】

本キットは、本明細書に記述するいずれかの方法を実践するための説明書を含んでもよい。本開示のキットにおいて供給される説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書における説明書である。本明細書で提供するキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージは、容器、ボトル、バイアル、及び可撓性パッケージを含むが、これらに限定されない。キットは、解説情報のような追加の構成要素を含みうる。

【実施例】

【0110】

(実施例1)
DNAオリゴヌクレオチドによりガイドされた制限酵素による切断に基づくssDNAラダーの調製
LabChip(登録商標)GX Touch(商標)計器(型番CLS137031、PerkinElmer社、Waltham、MA)のマイクロ流体チップシステムを本実施例において使用した。ここでガイド付きオリゴヌクレオチド(ガイド)として使用したオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies社(Coralville、IA)によって合成された。ガイドの配列をTable 1(表1)に提示する。表中、制限配列は太字で強調されている。M13mp18一本鎖DNA、制限酵素、及びバッファーはNew England Biolabs社(Ipswich、MA)から購入した。

【0111】

【表1】

【0112】

1μgのM13mp18 DNA及び1μMの短いガイド付きオリゴヌクレオチドを含む1xNEB rCutSmart(商標)バッファーをまず90℃で4分間、次に70℃で10分間アニーリングし、最後に50μLの体積で20分にわたり0.1℃/秒で37℃までランプダウンした。次に、これらのアニーリング産物に20ユニット(20U)のHindIII及び12.5UのPacI又はAfeIを加え、Table 2(表2)に従い異なる実験条件での切断のために37℃で90分間インキュベートした。切断後、反応産物を95℃で5分間インキュベートして失活させた。制限酵素消化産物を2x AMPure XPビーズプロトコール(品番A63880、Beckman Coulter社、Brea、CA)により更に精製した。精製されたサンプルを等体積の1xサンプルバッファー(LabChip(登録商標)RNA Pico試薬、品番CLS960012、PerkinElmer社)と混合し、70℃で2分間加熱してから、直ちに氷上で更に5分間冷却した後、LabChip(登録商標)GX Touch(商標)計器でLabChip(登録商標)RNA Pico試薬を使用して分析した。

【0113】

【表2】

【0114】

結果を図2に示す。特に、図2Aには、HindIIIは6281、PacIは4135、AfeIは3040と、制限酵素の制限部位の位置を示している。異なる組み合わせの制限酵素による予想された切断パターンをTable 2(表2)に示してある。

【0115】

図2Bは電気泳動図の結果を示し、図2CはLabChip(登録商標)Reviewerソフトウェアからの対応するゲル画像出力を示す。以下の所見が示されている:
・ 酵素(-)の条件:酵素切断なしではインタクトな環状ssDNAが70秒あたりでわずかに視認できる。これが本実験設定の陰性対照である。
・ HindIII+PacI切断の条件:サイズ1(2.1kb)及びサイズ2(5.1kb)が、それぞれ50秒あたり及び66秒あたりで明らかに視認できる。
・ HindIII+AfeI切断の条件:サイズ3(3.2kb)及びサイズ4(4.0kb)が、それぞれ58秒あたり及び62秒あたりで明らかに視認できる。
・ HindIII+PacI+AfeI切断の条件:サイズ5(1.1kb)、サイズ1(2.1kb)、及びサイズ4(4.0kb)が、それぞれ44秒あたり、50秒あたり、及び62秒あたりで明らかに視認できる。

【0116】

要約すると、電気泳動結果は、制限酵素の位置に基づく切断パターンの予想に沿っている。これらの結果は、オリゴヌクレオチドによりガイドされた制限酵素による切断に基づくssDNAラダー組成物の調製のための非限定的な方法を立証する。

【0117】

他の実施形態
本発明について、その詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は本発明の範囲を例示することを意図したものであり、限定することを意図したものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。以下の特許請求の範囲には、他の態様、利点、及び改変が含まれる。本明細書で引用されるすべての参考文献(上述のものを含む)、科学論文、特許公報、及び他の文書は、それらの開示の内容について参照することにより本明細書に組み込まれている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】