知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ガルーダ セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2025-10-09
(54)【発明の名称】多能性細胞に由来する骨髄系統
(51)【国際特許分類】
C12N 5/077 20100101AFI20251002BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20251002BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20251002BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20251002BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20251002BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20251002BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20251002BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20251002BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20251002BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20251002BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20251002BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20251002BHJP
A61K 35/545 20150101ALN20251002BHJP
【ＦＩ】
C12N5/077
C12N5/10 ZNA
A61P35/00
A61P37/04
A61P37/06
A61P31/12
A61P19/00
A61P25/00
A61K35/28
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
A61K35/545
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2025520026
(86)(22)【出願日】2023-10-05
(85)【翻訳文提出日】2025-05-12
(86)【国際出願番号】 US2023076109
(87)【国際公開番号】W WO2024077157
(87)【国際公開日】2024-04-11
(31)【優先権主張番号】63/413,420
(32)【優先日】2022-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】525128397
【氏名又は名称】ガルーダ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】シャー， ドゥヴァニット
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB12
4B065BB19
4B065BB20
4B065BB34
4B065BC03
4B065BC06
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087DA32
4C087NA05
4C087ZA01
4C087ZA96
4C087ZB08
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB33
(57)【要約】
本開示は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から骨髄細胞系統を生成するための効率的なエクスビボプロセスを提供する。様々な実施形態では、本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、かつ／又は末梢血、骨髄、若しくは他の組織から単離された対応する系統に、より酷似している。いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示される方法によって生成された単離された細胞及び細胞組成物、並びに細胞療法のための方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
自然骨髄系統細胞集団又はその前駆細胞を調製するための方法であって、分化した多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団からＣＤ３４＋細胞を濃縮して、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、
前記ＣＤ３４＋濃縮細胞集団の内皮・造血転換を少なくとも２日間であるが１２日間以下誘導して、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む集団を調製することと、
前記造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む集団を前駆骨髄細胞集団又は骨髄細胞集団に分化させることと、を含む、方法。
【請求項2】
前記ＰＳＣ集団が、リンパ球、臍帯血細胞、末梢血単核細胞、ＣＤ３４＋細胞、又はヒト一次組織に由来するヒトｉＰＳＣ集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｉＰＳＣ集団が、末梢血から単離されたＣＤ３４＋濃縮細胞に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの遺伝子についてホモ接合性である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性である、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ遺伝子を欠失し、１つ以上のクラスＩＩ遺伝子を欠失し、かつ／又はＨＬＡ若しくはＭＨＣの発現能力若しくは提示能力を支配する１つ以上の遺伝子を欠失するように遺伝子編集される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ａの欠失を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及び／又はＨＬＡ－ＤＱＢ１の欠失を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇであり、任意選択的に更にＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性であるように遺伝子編集される、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＨＬＡ又はＭＨＣの発現能力又は提示能力を支配する１つ以上の遺伝子が、β２－ミクログロブリン及び／又はＣＩＩＴＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項12】
ｉＰＳＣが胚様体（ＥＢ）に分化し、前記ＥＢが解離し、ＣＤ３４＋細胞が回収される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ＣＤ３４＋濃縮及び内皮・造血転換が、ｉＰＳＣ分化の８日目～１５日目に誘導される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＣＤ３４濃縮集団が、Ｙ－２７６３２、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、及びＦＬＴ３のうちの１つ以上を含む培地中で培養される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記内皮・造血転換が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、ＨＳＣ集団を生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
ＣＤ３４＋細胞が、内皮・造血転換を受ける培養物から採取され、ＣＤ３４＋の浮遊細胞及び／又は接着細胞の採取を含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＨＳＣ集団が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記内皮・造血転換の誘導が、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記内皮・造血転換の誘導が、前記ＣＤ３４＋濃縮細胞に周期的伸張を適用することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記周期的伸張が、２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ周期的伸張である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記内皮・造血転換の誘導が、Ｐｉｅｚｏ１活性化を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記Ｐｉｅｚｏ１活性化が、前記ＣＤ３４＋濃縮細胞又はその画分を、任意選択的にＹｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、ｓｓＲＮＡ４０、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される１つ以上のＰｉｅｚｏ１アゴニストと接触させることによるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記内皮・造血転換の誘導が、Ｔｒｐｖ４活性化を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記Ｔｒｐｖ４活性化が、前記ＣＤ３４＋濃縮細胞を、任意選択的にＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４アルファ－ＰＤＤ、又はそれらの類似体若しくは誘導体から選択される１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記骨髄系統が、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、又はそれらの骨髄前駆体のうちの１つ以上から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＨＳＣ集団が、任意選択的に、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＩＬ－３を含み、かつ任意選択的に顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を含む培地中で前記ＨＳＣ集団を培養することによって、前骨髄球を含む集団に分化する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記前骨髄球を含む細胞集団が、任意選択的に、Ｇ－ＣＳＦ中で前記前骨髄球を含む細胞集団を培養することによって、好中球を含む細胞集団に分化する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記前骨髄球を含む細胞集団が、任意選択的に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及びマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）中で前記前骨髄球を含む細胞集団を培養することによって、単球又はマクロファージを含む細胞集団に分化する、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記前骨髄球を含む細胞集団が、任意選択的に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及びＴＮＦ－α中で、かつ任意選択的にＩＬ－４中で前記前骨髄球を含む細胞集団を培養することによって、樹状細胞を含む細胞集団に分化する、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
成熟樹状細胞が、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－γ、及びＰＧＥ－２を含む培地中で前記樹状細胞を含む細胞集団を培養することによって調製される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記骨髄系統細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法によって生成された骨髄系統細胞を含む細胞集団と、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。
【請求項33】
ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇであり、任意選択的に更にＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である骨髄系統を含む、組成物。
【請求項34】
前記骨髄系統が、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、及び骨髄前駆細胞のうちの１つ以上から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記骨髄前駆細胞が、（ＣＭＰ）、前骨髄球、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）のうちの１つ以上から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
細胞療法のための方法であって、請求項３２～３５に記載の組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項37】
前記ヒト対象が、リンパ球減少症、がん、免疫不全、自己免疫疾患、ウイルス感染症、骨格形成異常、及び骨髄不全症候群のうちの１つ以上を含む状態を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記対象が、任意選択的に血液悪性腫瘍又は固形腫瘍である、がんを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項39】
前記組成物が、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１から選択される１つ以上の遺伝子座で前記対象に適合する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２２年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６３／４１３，４２０号の利益及び優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２２年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６３／４１３，４２０号の利益及び優先権を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＸＭＬ形式で提出されており、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２３年９月２６日に作成された当該ＸＭＬコピーは、ＧＲＵ－０１５ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌという名前であり、３０，０３７バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＸＭＬ形式で提出されており、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２３年９月２６日に作成された当該ＸＭＬコピーは、ＧＲＵ－０１５ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌという名前であり、３０，０３７バイトのサイズである。
【背景技術】
【0003】
自然骨髄系統細胞は、組織維持に重要な役割を果たし、免疫応答の調整を助ける。しかしながら、それらの臨床使用は、通常の白血球除去生成物から単離することができる少数のそのような細胞によって妨げられる。したがって、大規模な既製の骨髄系統細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球、並びにそれらの前駆体）の開発は、とりわけ、炎症、自己免疫疾患、がん、抗菌疾患と闘うためのツールとして開発するための魅力的な免疫療法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
様々な態様及び実施形態では、本開示は、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球、並びにそれらの前駆体などの自然骨髄系統を含む、細胞療法のための造血系統を生成するための方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、遺伝子編集されたｉＰＳＣを含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からそのような造血系統を開発するための効率的なエクスビボプロセスを提供する。様々な実施形態では、本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、かつ／又は末梢血若しくは骨髄から単離された対応する系統により酷似している。本発明は、本明細書に開示される方法によって生成された単離された細胞及び細胞組成物、並びに細胞療法のための方法も提供する。
【0005】
一態様では、本開示は、自然免疫系の骨髄細胞を含む細胞集団を調製するための方法を提供する。本方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を濃縮して、それによって、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、を含む。内皮・造血転換（ＥＨＴ）が、ＣＤ３４＋濃縮集団において誘導され、それによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を調製し、任意選択的にＣＤ３４＋細胞の更なる濃縮が続く。結果として得られたＨＳＣ集団（又はその画分）は、自然免疫系の骨髄系統（例えば、貪食細胞又はそれらの前駆体）に分化することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、ＨＳＣ集団から好中球、単球／マクロファージ、並びに未成熟及び成熟骨髄樹状細胞（ＤＣ）（又はそれらの前駆体）をエクスビボで生成するための方法を提供する。
【0006】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞を再プログラミングすることによって調製される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、（限定されないが）線維芽細胞又はＰＢＭＣ（若しくはそれから単離された細胞）などの体細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。
【0007】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの対立遺伝子の欠失などのＨＬＡ適合を支援するように遺伝子編集される。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を欠失し、かつＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を欠失するように遺伝子編集することができる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩの複合体の発現を保持する。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの保持されたクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇであるように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは更に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である。
【0008】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣが調製され、培養系を使用して増殖される。増殖したｉＰＳＣは、胚様体（ＥＢ）を生成するための培養物から回収することができる。ｉＰＳＣの分化によって生成されるＥＢは、ｉＰＳＣの三次元凝集体であり、分化方法（複数可）に基づいて３つ（又は代替的に２つ若しくは１つ）の胚性生殖細胞層を含む。いくつかの実施形態では、このプロセスは、ＥＢからＣＤ３４＋濃縮細胞を採取することと、内皮・造血分化を誘導することと、を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、細胞が少なくとも約２０％のＣＤ３４＋又は少なくとも約３０％のＣＤ３４＋になるまで進行する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４濃縮及びＥＨＴは、ｉＰＳＣ分化の７日目～１４日目に誘導され得る。ｉＰＳＣの分化は、公知の技術によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、ｂＦＧＦ、Ｙ２７６３２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、及び／又はＩＧＦ－１の組み合わせなどであるがこれらに限定されない、因子を伴う。
【0010】
ＥＨＴの誘導は、任意の公知のプロセスを用いたものであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝的手段を使用して（例えば、刺激、阻害、及び／又は遺伝子組換えを介して）、内皮又は造血内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を通してＨＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、幹細胞集団を生成する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本方法は、機械的、遺伝的、生化学的、又は薬理学的手段によるものであり得る、ＰＳＣ、胚様体、ＣＤ３４＋濃縮細胞、ＥＣ、ＨＥＣ、又はＨＳＣにおけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３ベータ（Ｄｎｍｔ３ｂ）の発現又は活性を増加させることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストは、Ｙｏｄａ１である。様々な実施形態では、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化が、ＥＢから採取されたＣＤ３４＋細胞に適用される。いくつかの実施形態では、このプロセスは、例えばＰｉｅｚｏ１アゴニストを使用して、ｄｎｍｔ３ｂの発現を増加させることを伴わない。
【0012】
様々な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（例えば、浮遊細胞及び／又は接着細胞）が、ｉＰＳＣ分化の１２日目～１７日目などのｉＰＳＣ分化の１０日目～２０日目に内皮・造血転換を受ける培養物から採取される。自然骨髄系統、赤血球系統、及びリンパ系統を生じさせることができる造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３４の発現マーカー及び系統特異的マーカー（Ｌｉｎ－と呼ばれる）の不在に基づいて同定することができる。
【0013】
様々な実施形態では、ＨＳＣ集団又はその画分は、単球、マクロファージ、及び樹状細胞が生成され得る、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、及びプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）、並びにそれらの画分から選択することができる造血系統に分化する。
【0014】
いくつかの実施形態では、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変される。加えて、又は任意選択的に、貪食性ＣＡＲは、サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５など、又はインターフェロン）を発現して、（例えば）腫瘍を標的とする際にＣＡＲ発現細胞をより強力にするように操作され得る。非限定的な例では、細胞は、ＣＡＲを運ぶレトロウイルス若しくは非組み込みウイルスベクター、又は非ウイルスベクターなどであるが、これらに限定されないベクターによって効率的に形質導入され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原又はマーカーを標的とし得る。
【0015】
他の態様では、本発明は、骨髄系統又はその前駆体を含み、かつ本明細書に記載の方法によって生成され得る、細胞集団、又はその薬学的に許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、必要としている対象への投与時に、胸腺、脾臓、又は二次リンパ器官に生着することができる前駆骨髄系統細胞集団である。様々な実施形態では、細胞集団及び薬学的に許容されるビヒクルを含む細胞療法用の組成物が調製される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、細胞集団は更に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である。様々な実施形態では、組成物は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、及び骨髄前駆細胞のうちの１つ以上から選択される骨髄系統を含む。
【0016】
他の態様では、本発明は、細胞療法のための方法であって、本明細書に記載の細胞集団又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液（悪性及び非悪性）疾患、骨髄疾患、免疫疾患、及び感染症を治療するために使用される。様々な実施形態では、ヒト対象は、リンパ球減少症、がん、免疫不全、自己免疫疾患のうちの１つ以上を含む状態を有する。
【0017】
本開示の他の態様及び実施形態が、以下の詳細な開示及び実施例から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が多能性に影響を及ぼさないことを示す。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現するためのアデノウイルスベクターを用いたｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。ＥＴＶ２過剰発現は、ＴＲＡ－１－６０幹細胞性マーカーの発現によって示されるように、ｉＰＳＣ幹細胞性に影響を及ぼさない。
【図2】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が造血内皮細胞の収率を増加させることを示す。造血内皮細胞（ＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋として記載される）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化は、ＥＴＶ２－ＯＥが造血内皮細胞の形成を増強することを実証する。
【図3】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）がｉＰＳＣ分化中にＣＤ３４＋細胞形成を増強することを示す。ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化は、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増強することを実証する。
【図4A】Ｐｉｅｚｏ１活性化により誘導されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様にプロＴ細胞分化を受けることを示す。骨髄（ＢＭ）ＨＳＣ及びＰｉｅｚｏ１活性化により誘導されたｉＰＳＣ－ＨＳＣのＣＤ３４＋ＣＤ７＋プロＴ細胞に対する分化効率のＦＡＣＳプロットである。
【図4B】Ｐｉｅｚｏ１活性化により誘導されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様にプロＴ細胞分化を受けることを示す。（１）ＢＭ－ＨＳＣ及び（２）ｉＰＳＣ－ＨＳＣ（Ｐｉｅｚｏ１活性化）により誘導されたＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞（％）の定量である。３つの実験の平均を示す。
【図5A】Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化され得ることを示す。ＢＭ－ＨＳＣ及びＰｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣから分化したＴ細胞の活性化効率（ＣＤ３＋ＣＤ６９＋発現）のＦＡＣＳプロットである。
【図5B】Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化され得ることを示す。（１）ＢＭ－ＨＳＣ及び（２）ｉＰＳＣ－ＨＳＣ（Ｐｉｅｚｏ１活性化）により誘導されたＣＤ３＋ＣＤ６９＋細胞（％）の定量である。３つの実験の平均を示す。
【図6】ｉＰＳＣ由来のＨＳＣ（この実施例ではＰｉｅｚｏ１活性化による）が機能性Ｔ細胞に分化することができることを示す。ＩＦＮγ発現は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後のＴ細胞活性化の結果である。Ｐｉｅｚｏ１活性化時にもたられたｉＰＳＣ由来のＨＳＣから分化したＴ細胞におけるＩＦＮγ発現は、機能性細胞（例えば、Ｔ細胞、骨髄細胞など）に更に分化するＨＳＣの能力を増強する。３つの実験の平均を示す。
【図7A】ＣＤ１５＋及びＣＤ１１ｂ、好中球マーカーの存在によって、同定されたように、分化したｉＰＳＣ（Ｄ８＋７）に由来するＨＳＣが好中球に分化することができ、好中球への分化の点でＤ８－ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞よりも優れていることを示す。
【図7B】ＣＤ１５＋及びＣＤ１１ｂ、好中球からのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の放出によって同定されたように、分化したｉＰＳＣ（Ｄ８＋７）に由来するＨＳＣが好中球に分化することができ、好中球への分化の点でＤ８－ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞よりも優れていることを示す。
【図8】分化したｉＰＳＣ（Ｄ８＋７）に由来するＨＳＣから分化した好中球が貪食活性を有することを示す。
【図9A】ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によって行われたＨＬＡ編集（例えば、トリプルノックアウト）細胞の表現型分析を示す。ＨＬＡ編集細胞が野生型細胞（すなわち、ｇＨＳＣ）と同様の程度に全体的なＨＬＡクラスＩ発現について陽性である、細胞表面におけるＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）の全体的な発現を示す。
【図9B】ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によって行われたＨＬＡ編集（例えば、トリプルノックアウト）細胞の表現型分析を示す。ＨＬＡ－ＡがＨＬＡ編集クローンにおいて発現されない、免疫蛍光を介したＨＬＡ－Ａの細胞発現を示す。
【図10】外胚葉分化がＮＥＳＴＩＮ－４８８及びＰＡＸ６－５９４染色によって示され、中胚葉分化がＧＡＴＡ－４８８染色によって示され、内胚葉分化がＣＸＣＲ４－４８８及びＦＯＸ２Ａ－５９４染色によって示される、免疫蛍光によって例証されるように、ＨＬＡ編集クローンがその多能性を保存する（３系統分化を維持する）ことを示す。
【図11】ＨＬＡ編集ＨＳＣの免疫適合性を示す。ＨＬＡ編集ＨＳＣ及び対照ＨＳＣ（ＷＴ、Ｂ２Ｍ ＫＯ、及びＨＬＡクラスＩＩヌル）を、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃに適合するが不適合ＨＬＡ－Ａを有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養し、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性をアネキシンＶ染色アッセイによって測定した。
【図12】ＨＬＡ編集ＨＳＣのインビボ生着能を示す。等しい割合のｍＣｈｅｒｒｙ ＨＬＡ編集ＨＳＣ及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）をマウスへの競合的移植のために混合し、骨髄（ＢＭ）及び末梢血試料をＦＡＣＳによって評価して、試料中に存在する各細胞型の相対量を比較した。
【図13A】ＨＬＡ－Ａの欠失がクラスＩペプチド提示に影響を及ぼさないことを示す。イムノペプチドーム分析の概略図を示す。
【図13B】ＨＬＡ－Ａの欠失がクラスＩペプチド提示に影響を及ぼさないことを示す。イムノペプチドーム分析の結果を示し、これは、ＷＴ及びＨＬＡ編集細胞のクラスＩ分子によって提示されるペプチド及び代表的なタンパク質の数にほとんど差がないことを明らかにする。
【図14A】ＨＬＡ－ＤＰ及びＤＱの欠失がクラスＩＩペプチドの提示に影響を及ぼさないことを示す。イムノペプチドーム分析スキームを示す。
【図14B】ＨＬＡ－ＤＰ及びＤＱの欠失がクラスＩＩペプチドの提示に影響を及ぼさないことを示す。ＨＬＡ－ＤＰ及びＨＬＡ－ＤＱの欠失にもかかわらず、細胞がＨＬＡクラスＩＩを通して広範囲のペプチドを提示する能力を保存することを示す。
【図15】抗原媒介免疫応答のインビボ試験である遅延型過敏症アッセイ（ＤＴＨ）（それぞれ、感作段階及び除去段階）の概略図である。
【図16A】免疫不全マウスにおけるＤＴＨ反応によって実証されるように、ＨＬＡ編集ＨＳＣが機能的免疫系を再構築することを示す。移植マウスに行った遅延型過敏症アッセイを示し、これは、異なるタイプの免疫細胞のクロストークを伴うアッセイである。マウスをヒツジ赤血球（抗原）の皮下注射によって感作した。機能的免疫系が、マイクロキャリパーで測定される左足の腫脹をもたらす。図１６Ａで見ることができるように、非移植マウスは、免疫不全であるため、左足の腫脹を示さなかった。逆に、臍帯血ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスは、組織の腫脹を示し、左足の直径を倍増した。
【図17A】ＷＴ及びＨＬＡ編集ＨＳＣが単球／マクロファージ系統に分化することができ、これはまた、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋マーカーによって同定されたように、クラスＩ分子及びクラスＩＩ分子の両方の全体的な発現を保存することを示す。
【図17B】ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋にゲート設定した細胞上のＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの分析を示す。
【図18A】ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失が他のＨＬＡクラスＩＩ分子の発現に影響を及ぼさないことを示す。ＨＬＡ編集ｉＰＳＣのマクロファージへの分化を示す概略図である。
【図18B】ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失が他のＨＬＡクラスＩＩ分子の発現に影響を及ぼさないことを示す。ＤＰＢ１分子及びＤＱＢ１分子の特異的欠失を確認する免疫蛍光実験である。
【図18C】ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失が他のＨＬＡクラスＩＩ分子の発現に影響を及ぼさないことを示す。同じ細胞がクラスＩＩ ＤＲＢ１発現を保存することを示す。
【0019】
「ｇＨＳＣ」という用語は、本開示のｉＰＳＣ由来の造血幹細胞を指すために本明細書で使用される。
【0020】
「野生型」（ＷＴ）、「未編集」、「非ＨＬＡ編集」という用語は、本開示の非遺伝子編集細胞を指すために本明細書で同義的に使用される。
【0021】
ＥＢ３４＋細胞は、胚体由来のＣＤ３４＋細胞を指す。これらは、造血内皮細胞を含む。
【発明を実施するための形態】
【0022】
様々な態様及び実施形態では、本開示は、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球、並びにそれらの前駆体などの自然骨髄系統を含む、細胞療法のための造血系統を生成するための方法を提供する。前駆体としては、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、前骨髄球、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）が挙げられる。様々な実施形態では、本発明は、遺伝子編集されたｉＰＳＣを含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からそのような造血系統を開発するための効率的なエクスビボプロセスを提供する。様々な実施形態では、本開示に従って生成された細胞は、機能的であり、かつ／又は末梢血若しくは骨髄から単離された対応する系統により酷似している。本発明は、本明細書に開示される方法によって生成された単離された細胞及び細胞組成物、並びに細胞療法のための方法も提供する。
【0023】
本開示の態様及び実施形態によれば、本質的に無制限の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を産生するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の能力は、免疫細胞の自然骨髄系統又はその遺伝子改変バージョン（例えば、ＣＡＲ発現細胞）を生じさせる治療用系統を含むが、これらに限定されない、造血細胞の無限の供給をもたらすために活用される。治療における自然免疫系の骨髄系統の使用は、それらの利用可能性の制限、細胞数、拡張可能性の制限、及び組織適合性の問題によって制限されている。更に、一次細胞と比較して、ｈｉＰＳＣは、インビトロでより容易に遺伝子改変を受け、それによって、細胞標的特異性、細胞数を改善する機会を提供するとともに、例えば、ＨＬＡ適合問題を回避することができる。加えて、完全に操作されたｈｉＰＳＣクローンは、一次細胞と比較して、安定かつ安全な供給源として機能することができる（Ｎｉａｎｉａｓ ａｎｄ Ｔｈｅｍｅｌｉ，２０１９）。更に、ｈｉＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）とは異なり、非胚性起源であるため、倫理的懸念もなく、品質が一貫している。したがって、本開示によるｈｉＰＳＣの使用は、単球、マクロファージ、樹状細胞（未成熟及び成熟樹状細胞）、好中球、並びにそれらの前駆体などの治療用造血系統を生成するために、一次細胞と比べていくつかの利点をもたらす。
【0024】
一態様では、本開示は、自然免疫系の骨髄細胞を含む細胞集団を調製するための方法を提供する。本方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を濃縮して、それによって、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、を含む。内皮・造血転換（ＥＨＴ）が、ＣＤ３４＋濃縮集団において誘導され、それによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を調製し、任意選択的にＣＤ３４＋細胞の更なる濃縮が続く。結果として得られたＨＳＣ集団（又はその画分）は、自然免疫系の骨髄系統（例えば、貪食細胞又はそれらの前駆体）に分化することができる。
【0025】
いくつかの態様及び実施形態では、本開示は、ＨＳＣ集団から好中球、単球／マクロファージ、並びに未成熟及び成熟骨髄ＤＣ（又はそれらの前駆体）を生成するための方法を提供する。
【0026】
従来、造血系統は、８日目までｉＰＳＣを胚様体に分化させて、ＣＤ３４＋細胞を採取することによって調製される。ＣＤ３４は、造血内皮細胞、造血幹細胞、及び造血前駆細胞のマーカーとして一般的に使用される。本開示の態様及び実施形態によれば、ｉＰＳＣ胚様体に由来し得るＣＤ３４＋細胞集団の内皮・造血転換（ＥＨＴ）を誘導することが、優れた造血系統のエクスビボ生成に使用することができることが発見されている。
【0027】
いくつかの実施形態では、骨髄系統は、好中球などの顆粒球である。すなわち、好中球を含む細胞集団は、ＨＳＣから分化する。好中球は、好酸球及び好塩基球に加えて顆粒球のサブセットである。免疫系が攻撃された場合、好中球が最初にその場に現れる。好中球前駆細胞及び成熟好中球は、それぞれ、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球／後骨髄球、並びに好中球帯及び分葉好中球の従来の形態学的分類を少なくとも部分的に反映する、ｐｒｏＮｅｕ、ｐｒｅＮｅｕ、未成熟Ｎｅｕ、及び成熟Ｎｅｕと称される。
【0028】
ＨＳＣ由来の好中球を培養条件下で生成し、細胞表面分子の発現に基づいて同定することができる。例えば、異なる前駆細胞段階は、ＣＤ１１７及びＣＤ４９ｄの発現によって定義することができる。ＣＤ１１７ｍｉｄＣＤ４９ｄｈｉｇｈ細胞は、それぞれ、骨髄芽球（ｐｒｏＮｅｕ１）及び前骨髄球（ｐｒｏＮｅｕ２／ｐｒｅＮｅｕ）を表すＳＳＣｌｏｗＣＤ３４＋細胞及びＳＳＣｈｉｇｈＣＤ３４－細胞に層別化することができる。これらの細胞はＣＤ１１７－ＣＤ４９ｄｍｉｄに進展し、骨髄球／後骨髄球（未成熟Ｎｅｕ）を定義するＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０１＋になる。ＣＤ１１７－ＣＤ４９ｄｌｏｗ細胞はＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０１＋であり、追加的に、好中球帯／及び分葉好中球（成熟Ｎｅｕ）に類似したＣＤ１６を発現し得る。加えて、これらのＨＳＣ由来の細胞は、インビボでヒト骨髄細胞の成熟マーカーでもあるＣＤ３５を漸進的に発現する。細胞の亜集団（（ｉ）ＣＤ１１７ｍｉｄＣＤ４９ｄｈｉｇｈＳＳＣｌｏｗＣＤ３４＋、（ｉｉ）ＣＤ１１７ｍｉｄＣＤ４９ｄｈｉｇｈＳＳＣｈｉｇｈＣＤ３４－、（ｉｉｉ）ＣＤ１１７－ＣＤ４９ｄｍｉｄ、及び（ｉｖ）ＣＤ１１７－ＣＤ４９ｄｌｏｗ）は、それぞれ、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球／後骨髄球、及び好中球に形質的に類似している。
【0029】
幹細胞因子（ＳＣＦ）及びＩＬ－３の存在下でＨＳＣを含む細胞集団を培養することによって、前骨髄球をＨＳＣから分化させることができる。様々な実施形態では、ＨＳＣ細胞集団は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）の存在下で更に培養される。Ｇ－ＣＳＦの存在下で培養することによって、前骨髄球を好中球に分化させることができる。
【0030】
いくつかの態様及び実施形態では、骨髄系統は、単球又はマクロファージである。単球、マクロファージ、及び樹状細胞は、自然免疫の単核貪食細胞系の一部であり、単球がマクロファージ及び樹状細胞の異なる亜集団の前駆体である。これらは、脳、皮膚、肝臓、肺、腎臓、及び心臓を含む多くの臓器内の常在集団として、血液中のみならず、全身にも存在する。これらは、病原体の制御及び免疫応答の開始の両方に不可欠であり、組織機能の支援にも不可欠である。
【0031】
Ｇ－ＣＳＦ及びＭ－ＣＳＦの存在下で由来する前骨髄球を培養することによって、ＨＳＣ集団をＣＤ１４＋単球に分化させることができ、これにより、古典的な単球への骨髄前駆細胞の分化が引き起こされる。ＣＤ４５発現が、そのような分化の尺度である。単球の増殖を促進するためにＧＭ－ＣＳＦも添加される。古典的な単球集団はＣＤ１４を特徴とし、任意選択的にＣＤ１１ｂによって分類される。ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＦＬＴ－３リガンドなどであるが、これらに限定されない追加のサイトカイン／成長因子が、単球の頑強な生成のためにＧＭ－ＣＳＦを補完し得る。
【0032】
単球識別子として使用することができる表現型マーカーとしては、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１５、ＣＤｗ１７、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６８、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９８、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１９、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤｗ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１４７、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２ ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１８０、ＣＤ２０６、ＣＤ１３１ａ１、ＣＤ２１３ ２、ＣＤｗ２１０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、及びＣＤ２８６が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６－単球、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球、又はＣＤ１４－ＣＤ１６＋単球を含む。様々な実施形態では、好中球は、侵入病原体に対する防御を提供するために自然免疫系の重要な要素であるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を放出する。好中球の炎症性メディエーター（例えば、ケモカイン、サイトカイン、補体タンパク質、又はＨＯＣｌなどの酸化剤）への曝露も、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）の放出を引き起こす。したがって、いくつかの実施形態では、ＭＰＯは、好中球活性化を測定するためのマーカーとして使用される。
【0033】
いくつかの実施形態では、単球がマクロファージに分化する。マクロファージ分化のために、ＣＤ１４＋細胞がヒトＭ－ＣＳＦの存在下で培養される。単球をマクロファージに分化させるためのプロトコルは、当業者に周知である。
【0034】
いくつかの実施形態では、細胞が樹状細胞（ＤＣ）に分化する。ＤＣ分化のために、ＣＤ１４＋細胞がＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４で補完される。いくつかの実施形態では、細胞が超低付着培養条件下で播種され、それを樹状細胞に更に分化させる。樹状細胞の成熟は、培地にＬＰＳ及び／又はＴＮＦαを補充することによって達成することができる。補充することができる他の因子としては、ＩＬ－１β、ＩＮＦ－γ、及びＰＧＥ－２が挙げられる。単球をＤＣに分化させるためのプロトコルは、当業者に周知である。本開示に従って、様々なタイプのマクロファージ集団をエクスビボで生成することができる。
【0035】
マクロファージは、全身の様々な組織及び器官に分布しており、高度の不均一性及び多様性を示す。マクロファージ表面に発現するいくつかの特異的マーカーは、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＳＲＡ－１、及びＣＤ１６９（２）などの異なるサブセットを同定するために使用されている。ＣＤ１６９＋マクロファージは、人体の複数の組織及び器官にわたって分布している特有のマクロファージのサブセットである。
【0036】
単球前駆体に由来するマクロファージは、局所組織環境に応じて特異的分化を受ける。それらは、損傷された細胞、活性化されたリンパ球、又は微生物産物などの組織内の環境要因に応答して、異なる機能的表現型に分化する。Ｍ１マクロファージ表現型は、高レベルの炎症促進性サイトカインの産生、病原体に対する耐性を媒介する能力、強力な殺菌特性、反応性窒素及び酸素中間体の高産生、並びにＴｈ１応答の促進を特徴とする。対照的に、Ｍ２マクロファージは、寄生虫制御、組織再構築、免疫調節、腫瘍促進、及び効率的な貪食活性への関与を特徴とする。Ｍ２マクロファージは、それらの異なる遺伝子発現プロファイルに基づいて、サブセット、具体的には、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、及びＭ２ｄに更に分けることができる。
【0037】
一般に発現されるＭ１マクロファージマーカーには、ＣＤ６４、ＩＤＯ、ＳＯＣＳ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＦＩＴファミリーメンバー、又はＩＳＧファミリーメンバーが含まれるが、これらに限定されず、その一方で、一般に発現されるヒトＭ２マクロファージマーカーには、多機能酵素トランスグルタミナーゼ２（ＴＧＭ２）ＭＲＣ１、ＣＤ２３、ＣＣＬ２２、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、及び／又はＣＤ２０９が含まれるが、これらに限定されない。
【0038】
マクロファージは、Ｔ細胞受容体＋マクロファージ及びＣＤ１６９＋マクロファージも含む。これらのマクロファージは、ＴＣＲ共受容体ＣＤ３、並びにＴＣＲαβ及びＴＣＲγδサブタイプを発現する。ＴＮＦは、マクロファージにおけるＴＣＲαβ発現の重要な調節因子のうちの１つである。ＴＣＲγδマクロファージは、細菌曝露に対する宿主防御に関与している。両方のＴＣＲ＋マクロファージのサブセットは、ＺＡＰ７０、ＬＡＴ、Ｆｙｎ、及びＬｃｋなどのＴ細胞シグナル伝達に必要であることが示されている分子を発現する。更に、それらは高い貪食能を示し、ケモカインＣＣＬ２を分泌する。
【0039】
ＣＤ１６９＋マクロファージは、主に二次リンパ器官に位置するが、免疫活性化時に再分布する。ＣＤ１６９＋マクロファージは、Ｂ細胞に抗原提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することができる。ＣＤ１６９＋マクロファージは、アポトーシス細胞クリアランスによって誘導される免疫寛容に関与し、抗腫瘍及び抗ウイルスの役割を果たす。
【0040】
いくつかの実施形態では、骨髄系統は、樹状細胞（ＤＣ）系統である。ＤＣは、恒常性の不均衡を検出し、Ｔ細胞に提示するための抗原を処理し、自然免疫応答と適応性免疫応答との間の関連性を確立する。更に、ＤＣは、進行中の免疫応答を改変し、かつナチュラルキラー細胞及び自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）などの他の免疫細胞との相互作用によって影響を及ぼされるサイトカイン及び成長因子を分泌することができる。
【0041】
ＤＣは、「成熟」及び「未成熟」の２つの異なる機能状態で存在する。これらは多くの特徴によって区別されるが、二次リンパ器官における抗原特異的ナイーブＴ細胞を活性化する能力が、成熟ＤＣの特徴である。ＤＣ成熟は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）又は損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の認識によって検出される、組織恒常性障害によって誘発される。
【0042】
ＤＣ識別子には、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１ｃ＋、並びにＨＬＡ－ＤＲ＋が含まれるが、これらに限定されない。ＬＰＳ刺激後、ＤＣは成熟過程を経てＣＤ８０及びＣＤ４０などの共刺激分子を上方制御する一方で、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＰＤＬ１は影響を受けないままである。ＤＣ識別子として使用することができる他の表現型マーカーとしては、ＣＤ８３、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１４１、ＣＤ２０７、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１２３、ＣＤ８５、ＣＤ１８０、ＣＤ１８７、ＣＤ２０５、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、並びに部分的にＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、及びＣＤ２０９が挙げられるが、これらに限定されない。
【0043】
ＤＣは、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）（ｆｃｅｒ１／ＩＬＴ３／ＩＬＴ７／ＤＲ６）、骨髄／従来型ＤＣ１（ｃＤＣ１）（ＣＤ１４１／ＣＬＥＣ９Ａ／ＸＣＲ１／ＣＡＤＭ１／ＢＴＬＡ）、並びに骨髄／従来型ＤＣ２（ｃＤＣ２）（ＣＤ１ｃ／ＣＤ１７２ａ／ＦｃεＲ１／ＳＩＲＰＡ）及びＬＣ（ランゲリン／ＣＤ１ａ）などの様々なサブタイプに更に分類することができる。
【0044】
様々な実施形態では、顆粒球又は貪食細胞又はそれらの前駆細胞は、（例えば、ＥＢ解離から回収された）ＣＤ３４＋細胞を、（本明細書に記載されるように）Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触させることによって生成される。様々な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含み、かつ任意選択的にＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化剤、Ｗｎｔ経路活性化剤、又はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、チアゾビン又はＹ２７６３２）のうちの１つ以上を含む培地で更に培養される。それから生成されたＨＳＣは、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、及びＦＬＴ－３Ｌなどであるが、これらに限定されない成長因子及びサイトカインの存在下で培養することができる。細胞を（既に記載されているように）Ｍ－ＣＳＦ及び／又はＧ－ＣＳＦの存在下で培養して骨髄系統に分化させることができ、（記載されているように）任意選択的にＩＬ－４及びＴＮＦ－αを補充することができる。
【0045】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＥＢ解離から回収される）は、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストとしては、Ｙｏｄａ１、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ４０）、Ｊｅｄｉ１、及びＪｅｄｉ２、又はそれらの類似体が挙げられる。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｔｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストは、ＧＳＫ１０１６７９０Ａである。機械感受性受容体アゴニストのアゴニストの有無にかかわらず、ＥＨＴを誘導するための方法を使用することができ、この方法は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＥＨＴを誘導した後、細胞（ＨＳＣ又はその子孫）は、免疫細胞の自然骨髄系統、すなわち、貪食細胞系統に分化する。
【0046】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞を再プログラミングすることによって調製される。「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、胚様多能性状態に戻って再プログラミングされている皮膚又は血液細胞などの体細胞に由来する細胞を指す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、（限定されないが）線維芽細胞又はＰＢＭＣ（若しくはそれから単離された細胞）などの体細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、リンパ球、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、臍帯血細胞、ＰＢＭＣ、ＣＤ３４＋細胞、又は他のヒト一次組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、レシピエント（本明細書に記載される治療を必要とする対象）に対して自家又は同種異系である（例えば、１つ以上の遺伝子座においてＨＬＡ適合である）。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ適合を支援するように遺伝子編集すること（β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡなどを含むがこれらに限定されない、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＨＬＡクラスＩＩの対立遺伝子又はそれらのマスター調節因子の欠失など）、又は他の機能を欠失若しくは発現するように遺伝子編集することができる。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を欠失し、かつＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を欠失するように遺伝子編集することができる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩの複合体の発現を保持する。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの保持されたクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子座についてホモ接合性である。
【0047】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、（ｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ＋、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ＋ＤＲ＋ＤＱ－、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ－、（ｉｖ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ＋、（ｖ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ＋ＤＲ＋ＤＱ－、（ｖｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ－のうちの１つであるように遺伝子編集される。保持されたＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲ）については、細胞は、ホモ接合性であり得るか、又は遺伝子の単一コピーのみを保持することができる。例えば、修飾細胞は、少なくとも（ａ）ＨＬＡ－Ｃ＋及びＨＬＡ－ＤＲ＋として同定され、任意選択的に、（ｂ）ＨＬＡ－Ｂ－、（ｃ）ＨＬＡ－ＤＰ－、及び（ｄ）ＨＬＡ－ＤＱ－のうちの１つ以上として同定される。例示的な実施形態では、修飾細胞は、ＨＬＡ－Ｂ＋、ＨＬＡ－ＤＰ－、及びＨＬＡ－ＤＱ－である。
【0048】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇであるように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは更に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である。
【0049】
本明細書で使用される場合、特定のＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩの分子に関する「ｎｅｇ」、（－）、又は「陰性」という用語は、遺伝子の両方のコピーが細胞株又は集団で破壊されており、したがって、細胞株又は集団が遺伝子の著しい機能的発現を示さないことを示す。そのような細胞は、完全若しくは部分的な遺伝子欠失若しくは破壊によって、又は代替的にｓｉＲＮＡなどの他の技術によって生成することができる。本明細書で使用される場合、標的遺伝子の遺伝子組換え（すなわち、遺伝子編集）の文脈での「欠失」という用語は、対応する遺伝子産物（すなわち、対応するポリペプチド）の機能的発現の解消を指す。そのような遺伝子編集としては、コード配列の完全若しくは部分的な遺伝子欠失若しくは破壊、又は重要なシス作用性発現制御配列の欠失が挙げられる。
【0050】
体細胞は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｋｌｆ４から選択される再プログラミング因子の発現によって再プログラミングされ得る。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｋｌｆ４である。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、及びｋｌｆ４である。ｉＰＳＣを調製するための方法は、例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，６７６，１６５号、米国特許第９，５８０，６８９号、及び米国特許第９，３７６，６６４号に記載されている。様々な実施形態では、再プログラミング因子は、レンチウイルス、センダイ、又は麻疹ウイルス系などの周知のウイルスベクター系を使用して発現される。代替的に、再プログラミング因子は、再プログラミング因子をコードするｍＲＮＡ（複数可）を体細胞に導入することによって発現させることができる。なおも更に、ｉＰＳＣは、再プログラミング因子を発現する非統合性エピソームプラスミドを導入することによって、すなわち、無導入遺伝子及び無ウイルスｉＰＳＣの生成のために、生成され得る。限られた複製能力を有し、したがって、いくつかの細胞世代にわたって失われる、公知のエピソームプラスミドを採用することができる。
【0051】
いくつかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、遺伝子編集される。遺伝子編集としては、例えば、ＨＬＡ遺伝子の修飾（例えば、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＨＬＡクラスＩＩの遺伝子の欠失）、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の欠失、ＣＩＩＴＡの欠失、顆粒球若しくは貪食細胞受容体遺伝子の欠失若しくは付加、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子の付加が挙げられ得るが、これらに限定されない。例示的なＣＡＲ細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）は、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ４７、及びＣＤ２０のうちの１つ以上などの腫瘍抗原を標的とすることができる。
【0052】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、長さが１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、又はそれ以上のヌクレオチドであるｇＲＮＡを使用して遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’末端若しくはその付近における（例えば、５’末端の１～１０個、１～５個、若しくは１～２個のヌクレオチド内の）修飾、及び／又は３’末端若しくはその付近における（例えば、３’末端の１～１０個、１～５個、若しくは１～２個のヌクレオチド内の）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「二重ｇＲＮＡ」）。二重ｇＲＮＡは、「ｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ」（又は「ｃｒＲＮＡ」）及び「ｔｒａｃｒ ＲＮＡ」という２つの別個のＲＮＡ分子を含み、当業者に周知である。
【0053】
一般的に、本開示の様々な実施形態に従って適用することができる、様々な遺伝子編集技術が公知である。遺伝子編集技術としては、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＤＮＡ結合ドメインのうちの１つ以上及びＦｏｋｌエンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質を使用して、細胞内のＤＮＡの所望の領域に二本鎖切断を生成することができる（例えば、全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、当該技術分野で公知のＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を使用して行われる。例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，３５９、ＵＳ８，９０６，６１６、及びＵＳ８，９９９，６４１を参照されたい。様々な実施形態では、遺伝子編集は、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）を採用するか、又はＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ１２ａなど）を採用する。ＩＩ型及びＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ依存性である。（標的外編集を制限又は回避しながら）所望の遺伝子編集を導くためのｇＲＮＡの設計が、当該技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｈｒ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＦＥＢＳ Ｊ．２０１６ Ｓｅｐ；２８３（１７）：３２３２－３２３８を参照されたい。なおも他の実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９又はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１（Ｃｐｆ１若しくはＣａｓ１２ａ）に対する（低い一次配列相同性であるが）相同性を有する非正準ＩＩ型又はＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを採用することができる。多数のそのような非正準Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、当該技術分野で公知である。Ｎｉｄｈｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｎ Ｕｐｄａｔｅｄ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０２１ Ａｐｒ；２２（７）：３３２７。なおも他の実施形態では、遺伝子編集は、二本鎖切断を起こすことなく変異を組み込むために、塩基編集又はプライム編集を採用する。例えば、Ａｎｔｏｎｉｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄ．，２８ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２１、Ｍａｔｓｕｏｋａｓ ＩＧ，Ｐｒｉｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ：Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｒａｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄ Ｂｒｅａｋｓ ｏｒ Ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，０９ Ｊｕｎｅ ２０２０を参照されたい。デッドＣａｓ（ｄＣａｓ）をガイドＲＮＡ依存性系として使用して、ＤＮＡ修飾酵素を所望の標的に標的化するためのｄＣａｓ系（例えば、Ｃａｓ融合タンパク質）の使用を含む、様々な他の遺伝子編集プロセスが公知である。Ｂｒｅｚｇｉｎ Ｓ，Ｄｅａｄ Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｔｙｐｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１９ Ｄｅｃ；２０（２３）：６０４１。
【0054】
二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく正確なゲノム改変を導入することができる塩基エディタもまた、細胞（例えば、ｉＰＳＣ）における遺伝子編集（例えば、遺伝子療法ベクターの設計）に使用することができる。塩基エディタは、本質的に、ＤＳＢを作製することができず、核酸塩基デアミナーゼ酵素、場合によっては、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤に融合される、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）などの触媒不活性化ヌクレアーゼを含む。現在、Ｃ＞Ｔ及びＡ＞Ｇ転換を触媒する、シチジン塩基エディタ（ＣＢＥ）及びアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）という塩基エディタの２つの主要なカテゴリがある。塩基エディタは、例えば、ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターを介して送達され、プロモーター及びエンハンサーを効率的に編集して、遺伝子を活性化又は不活性化することができる。例示的な方法は、米国特許第９，８４０，６９９号、同第１０，１６７，４５７号、同第１０，１１３，１６３号、同第１１，３０６，３２４号、同第１１，２６８，０８２号、同第１１，３１９，５３２号、及び同第１１，１５５，８０３号に記載されている。また、ＷＯ２０２０／１９１１５３に記載されているように、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにコンジュゲートされた（例えば、それと融合された）逆転写酵素、及びガイドＲＮＡにコンジュゲートされた（例えば、それと融合された）ＤＮＡ合成テンプレートとして有用なポリヌクレオチドを含む、プライムエディタも企図される。
【0055】
ゲノム編集用途に使用することができる例示的なベクターとしては、プラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／３５、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、コロナウイルス、オルトミキソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）などの陰性鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどの陽性鎖ＲＮＡウイルス、並びにヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、カナリア痘、ワクシニア、又は改変ワクシニアウイルスを含む、二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。目的の核酸分子を含むベクターは、形質導入、トランスフェクション、感染、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知である任意の方法を介して、細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、内皮細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ又はＬＴ－ＨＳＣ）に送達され得る。これらのベクターのうちのいずれかは、転位性要素（ピギーバックトランスポゾン又はスリーピングビューティトランスポゾンなど）を含み得る。トランスポゾンは、ＤＮＡの特異的配列を脊椎動物のゲノムに挿入する。目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する類似の切除部位のトランスポザーゼ触媒切断によって、哺乳動物細胞のゲノムに組み込むことができる。
【0056】
増加した効率のために、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ及びｇＲＮＡを細胞内に送達される前に組み合わせることができる。Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として知られている。いくつかの方法が、細胞へのＲＮＰの直接送達のために開発されている。例えば、ＲＮＰは、リポフェクション又はエレクトロポレーションによって培養中の細胞に送達することができる。ヌクレオフェクションプロトコルを使用するエレクトロポレーションを採用することができ、この手順は、ＲＮＰが迅速に細胞の核に進入することを可能にするため、即時にゲノムを切断し始めることができる。例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇ Ｓ，Ｓｈｅｎ Ｊ，Ｌｉ Ｄ，Ｃｈｅｎｇ Ｙ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０２１ Ｊａｎ １；１１（２）：６１４－６４８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、ＲＮＰとしてドナーｉＰＳＣ及び／又はＨＳＣにエレクトロポレーションされる。
【0057】
一般的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、Ｃａｓヌクレアーゼが切断するために必要とされ、一般的に、切断部位の下流に３～４個のヌクレオチドが見出される。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ系による切断のために標的化されるＤＮＡ領域に続く、短いＤＮＡ配列（通常、長さが２～６塩基対）である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプ又は多形体を標的化するＰＡＭ配列、ｓｇＲＮＡ、又は塩基編集ツールは、４つのＧ、４つのＣ、ＧＣ反復、又はそれらの組み合わせを含まない。
【0058】
いくつかの実施形態では、独自のＨＬＡハプロタイプに特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本明細書に記載されるｇＲＮＡを使用して、ドナー特異的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子（例えば）の各々を標的化する単一ｇＲＮＡを設計することによって開発することができる。遺伝子ノックアウトを実施するために、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を、編集するための適切な部位に標的化する。次に、Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を実施することができ、ＤＮＡは、フレームシフト変異をもたらすインデルを生成し、結果として生じるタンパク質の機能を終了させる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構を通して修復する。しかしながら、標的外遺伝子組換えが起こり、そうでなければインタクトな遺伝子の機能を改変し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ある程度の不適合の存在下でさえも、望ましくない標的外位置にＤＳＢを生成し得る。この標的外活性は、点変異及びゲノム構造変動などのゲノム不安定性事象を生じ得る。様々な実施形態では、ＨＬＡ－Ａを標的化するｓｇＲＮＡは、２９９４２５３２－２９９４２６２６として定義される染色体６の領域を標的化することができる。様々な実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱＢ１を標的化するｓｇＲＮＡは、３２６６５０６７－３２６６４７９８として定義される染色体６の領域を標的化することができる。様々な実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰＢ１を標的化するｓｇＲＮＡは、３３０８０６７２－３３０８０９３５として定義される染色体６の領域を標的化することができる。
【0059】
ｇＲＮＡを使用して、クローンｉＰＳＣを開発することができる。そのようなｉＰＳＣ株は、例えば、本明細書に記載される配列決定を使用して、（ｉ）標的上編集、（ｉｉ）標的外編集、及び（ｉｉｉ）転座編集について評価することができる。具体的には、そのようなアッセイは、目的の領域を標的化及び濃縮するように設計されたプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ、続いて、次世代配列決定（例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｎ配列決定、ＡＭＰ－ｓｅｑ）によって実施することができる。標的上パネル及び転座パネルは、意図された編集領域を増幅し、意図されていないＤＳＢ切断部位融合から生じる染色体転座を含まない、予期される編集を有するｉＰＳＣクローンの選択を可能にすることができる。標的外パネルは、配列決定を介して同定される任意の潜在的標的外領域を濃縮することができ、無視できる標的外変異を有するｉＰＳＣクローンの選択を可能にする。一緒に、これらのアッセイは、潜在的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連ゲノム完全性の問題を除外しながら、所望の編集を有するクローンを選択するためのｉＰＳＣクローンのスクリーニングを可能にする。
【0060】
いくつかの実施形態では、再プログラミング及び編集されたｉＰＳＣのゲノムの安定性及び完全性を更に確実にするために、遺伝子及びゲノムアッセイを実施して、例えば、転座及び変異事象を受けず、エピソームベクターを組み込まなかったクローンを選択することができる。例えば、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）が、再プログラミング後にＣＤ３４＋細胞及びｉＰＳＣクローンで実施され、ゲノムが、編集から生じる差異について比較される。これらの分析は、どのｉＰＳＣクローンゲノムがＣＤ３４＋出発物質と異なるかという評価を提供し、再プログラミング中に変異を生じなかったｉＰＳＣクローンの情報に基づく選択を可能にする。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアッセイなどの系を使用する核型分析が、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｒａｍｍｅ ＡＰ，ｅｔ ａｌ，“Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｄａｔａｓｅｔ ｏｆ ｔｗｏ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｄｏｎｏｒｓ，”Ｄａｔａ Ｂｒｉｅｆ．２０２１ Ｍａｙ １５；３７：１０７１４０に記載されているように、再プログラミング中にインデル及び転座を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアッセイは、Ｇバンディング核型分析と同様の分解能で染色体異常の可視化を可能にする。検出することができる構造異常のサイズは、染色体獲得については＞２Ｍｂ、染色体損失については＞１Ｍｂである。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアレイは、低解像度ＤＮＡコピー数分析による均衡の保たれた全ゲノムカバレッジのために機能化され、アレイは、１４，０００個のＯＭＩＭ標的を含む３６，０００個全てのＲｅｆＳｅｑ遺伝子をカバーする。アッセイは、異数性、超微視的異常、及びモザイク事象の検出を可能にする。
【0062】
いくつかの実施形態では、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析が、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｗｉｅｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｋｌａｕｓ Ｊ．Ｂｕｓａｍ，Ｐｅｄｒａｍ Ｇｅｒａｍｉ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｃｏｌｙｅｒ，“Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ Ｔｕｍｏｒｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１９，ｐｐ．３６４－３７３，ＩＳＢＮ ９７８０３２３３７４５７６、及びＨｕｓｓｅｉｎ ＳＭ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ，”Ｎａｔｕｒｅ．２０１１ Ｍａｒ ３；４７１（７３３６）：５８－６２に記載されているように、再プログラミング中にコピー数異常（ＣＮＡ）を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。ａＣＧＨは、試料ＤＮＡを参照ＤＮＡと比較することによってＣＮＡについてゲノム全体を分析する技術である。
【0063】
いくつかの実施形態では、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネル分析が、再プログラミング中に血液学的悪性変異を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。例えば、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネルは、骨髄性白血病、リンパ腫、及び／又は他の血液悪性腫瘍関連遺伝子に焦点を当て、より広範な方法よりも小さく管理可能なデータセットを生成することができる。標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネル分析は、血液悪性腫瘍に関連する領域を増幅するための高度に多重化されたＰＣＲの使用、続いて、次世代配列決定を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、エピソームベクターを組み込まず、エピソームベクタークリアランスのために十分に継代したｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。本明細書で考察されるように、ＣＤ３４＋細胞のｉＰＳＣ再プログラミングは、再プログラミング因子をコードするエピソームベクターを送達することによって達成することができる。しかしながら、エピソームベクターは、稀ではあるが、発達過程、恒常性などを破壊し得る細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる。したがって、ｄｄＰＣＲ法を使用して、ｉＰＳＣ培養物中の残留エピソームベクターを検出し、エピソームベクターを組み込まなかったｉＰＳＣクローンの選択を可能にすることができる。
【0065】
いくつかの実施形態では、選択されたクローンが編集に関連するゲノム異常を含まないことを評価した後、クローンを増殖中に生じ得る自発的変異について追加的に検査することができる。例えば、事前編集された再プログラミングされたクローンについて記載されるように、例えば、血液悪性腫瘍遺伝子、インデル、転座、数の異常に影響を及ぼす変異である。自発的変異の分析としては、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、ＫＡＲＹＯＳＴＡＴ分析、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネルＡＭＰ－Ｓｅｑ分析、及び／又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられ得る。
【0066】
様々な実施形態では、ｉＰＳＣが調製され、培養系を使用して増殖される。増殖したｉＰＳＣは、胚様体（ＥＢ）を生成するための培養物から回収することができる。ｉＰＳＣの分化によって生成されるＥＢは、ｉＰＳＣの三次元凝集体であり、分化方法（複数可）に基づいて３つ（又は代替的に２つ若しくは１つ）の胚性生殖細胞層を含む。ＥＢの調製は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１９／０１７７６９５に記載されている。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣの分化によって調製されるＥＢは、例えば、Ａｂｅｃａｓｉｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ３Ｄ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃａｌｉｎｇ－ｕｐ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４６（２０１７）８１－９３に記載されているように、バイオリアクター内で増殖される。ＥＢを使用して、任意の所望の細胞型を生成することができる。ＥＢの増殖又は分化のための３Ｄ懸濁液培養を含む他の方法が、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２０／０８６８８９に記載されている。
【0067】
いくつかの実施形態では、各態様によるプロセスは、多能性幹細胞（例えば、ＥＢ）からＣＤ３４＋濃縮細胞を生成し、内皮・造血転換を誘導することを含むことができる。ＬＴ－ＨＳＣの比較的高い頻度を含むＨＳＣは、機械的、生化学的、代謝的、及び／又は局所的刺激、並びに細胞外基質、ニッチ因子、細胞外因性因子などの因子、細胞内因性特性の誘導を含み、かつ薬理学的及び／又は遺伝的手段を含む、様々な刺激又は因子を使用して、細胞集団から生成することができる。
【0068】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＨＴの誘導の前に、多能性幹細胞から造血能を有する内皮細胞を調製することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＴＡ２／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２／ＴＡＬ１、又はＥＲ７１／ＧＡＴＡ２／ＳＣＬの複合過剰発現は、ＰＳＣ源からの造血能を有する内皮細胞の形成につながり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣにおけるＥ２６形質転換特異的バリアント２（ＥＴＶ２）転写因子の過剰発現を含む。ＥＴＶ２は、ＥＴＶ２の構成的又は誘導性発現のために、及び無導入遺伝子造血性ＥＣの産生のために、コード化非統合性エピソームプラスミドの導入によって発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＥＴＶ２は、ｉＰＳＣに導入されたｍＲＮＡから発現される。ｍＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションを含む任意の利用可能な方法を使用して導入することができる。ＥＴＶ２を発現する細胞の分化は、ＶＥＧＦ－Ａの付加を含むことができる。Ｗａｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｂｕｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＥＴＶ２ ｗｉｔｈ ｍＲＮＡ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．Ｖｏｌ．６（２０２０）を参照されたい。このようにして生成された細胞は、本開示の実施形態に従って、ＣＤ３４＋細胞を産生し、ＥＨＴを誘導するために使用され得る。
【0069】
ＣＤ３４＋濃縮後、次いで、ＨＳＣが、機械的、生化学的、薬理学的、及び／若しくは遺伝的刺激又は修飾を使用して内皮細胞から生成される。
【0070】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、細胞が少なくとも約１０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約２０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約２５％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約３０％のＣＤ３４＋になるまで進行する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４濃縮及びＥＨＴは、例えば、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、又は１４日目などのｉＰＳＣ分化の７日目～１４日目に誘導され得る。ｉＰＳＣの分化は、公知の技術によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、ｂＦＧＦ、Ｙ２７６３２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、及び／又はＩＧＦ－１の組み合わせなどであるがこれらに限定されない、因子を伴う。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、無フィーダー、無血清、及び／又はＧＭＰ適合性材料を使用して分化される。無血清培養物は、一般的に、サイトカイン／成長因子／小分子のカクテルを含む。
【0071】
単球系統分化は、本質的に、Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｒｏｂｕｓｔ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｓｅｒｕｍ－ａｎｄ Ｆｅｅｄｅｒ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ．２０１３ Ａｐｒ ３；８（４）：ｅ５９２４３に開示されるように５つの連続ステップで行うことができるか、又はそれに改善（サイトカイン若しくはステップのうちの１つを置き換える又は省略して機能性単球の分化を加速するなどであるが、これに限定されない）を加えて行うことができる。
【0072】
非限定的な例では、単離された単球は、Ｍ－ＣＳＦを補充した無血清で培養することができる。次いで、Ｍ１マクロファージ分極の場合はＬＰＳ＋ＩＦＮ－γ、又はＭ２ａマクロファージ分極の場合はＩＬ－４を添加することによって、細胞を刺激することができる。Ｍ１マクロファージは、高レベルのＣＤ８０及びＣＣＲ７マーカー、並びに低レベルのＣＤ２０６及びＣＤ２０９によって同定することができる。対照的に、Ｍ２ａマクロファージは、任意選択的にＣＤ８０及びＣＣＲ７について陰性又は低いＣＤ２０６及びＣＤ２０９によって同定することができる。マクロファージの機能性は、蛍光標識Ｅ．ｃｏｌｉを使用した貪食アッセイなどであるが、これに限定される周知の技法を用いて実証することができる。
【0073】
代替的に、いくつかの実施形態では、ＳＴＯマウス線維芽細胞のフィーダー層などのフィーダー細胞を使用して、骨髄細胞（例えば、貪食細胞又はそれらの前駆体）を増殖させることができる。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、血清含有培地中で、ＳＴＯマウス線維芽細胞又は血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は臍帯血由来の間葉系幹細胞又はリンパ球由来のがん細胞株細胞のフィーダー層である、ＯＰ９などのマウス骨髄由来のフィーダー細胞と共培養される。培養物は、成長因子及びサイトカインを含有して、胚様体又は単層系の分化を支援することができる。フィーダー細胞共培養系を使用して、単球又はマクロファージ、樹状細胞、好中球、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、巨核球、及び赤血球を含む、いくつかの造血系統に更に分化させることができる多能性ＨＳＰＣを生成することができる。Ｎｅｔｓｒｉｔｈｏｎｇ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１１ Ａｒｔ．４８１（２０２０）を参照されたい。代替的に、特異的なシグナルとともに定義された条件を使用する段階的プロセスを使用することができる。例えば、ヒトＰＳＣにおけるＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、及びＭＹＢの発現は、多分化能を有するＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋前駆細胞への直接分化に有利に働く。更に、ＨＯＸＢ４、ＣＤＸ４、ＳＣＬ／ＴＡＬ１、又はＲＵＮＸ１ａなどの因子の発現は、ヒトＰＳＣにおける造血プログラムを支援する。Ｄｏｕｌａｔｏｖ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｒｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｅａｇｅ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｏｃｔ ３；１３（４）を参照されたい。
【0074】
ＥＨＴの誘導は、任意の公知のプロセスを用いたものであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝的手段を使用して（例えば、刺激、阻害、及び／又は遺伝子組換えを介して）、内皮又は造血内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を通してＨＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、幹細胞集団を生成する。実施形態では、ＥＨＴは、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含む培地を使用して行われる。培地は、任意選択的に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化剤、Ｗｎｔ経路活性化剤、又はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、チアゾビビン若しくはＹ２７６３２）のうちの１つ以上を含み得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、本方法は、機械的、遺伝的、生化学的、又は薬理学的手段によるものであり得る、ＰＳＣ、胚様体、ＣＤ３４＋濃縮細胞、ＥＣ、ＨＥＣ、又はＨＳＣにおけるｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞におけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３β（Ｄｎｍｔ３ｂ）及び／又はＧＴＰａｓｅ ＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性又は発現を増加させることを含む。参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９／２３６９４３及びＷＯ２０２１／１１９０６１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、細胞は、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストは、Ｙｏｄａ１である。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｔｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストは、ＧＳＫ１０１６７９０Ａである。Ｙｏｄａｌ（２－［５－［［（２，６－ジクロロフェニル）メチル］チオ］－ｌ，３，４－チアジアゾール－２－イル］－ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルＰｉｅｚｏｌのために開発された小分子アゴニストである。Ｓｙｅｄａ Ｒ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ Ｐｉｅｚｏｌ．ｅＬｉｆｅ（２０１５）．
【0077】
Ｙｏｄａｌの誘導体を、様々な実施形態で採用することができる。例えば、２，６－ジクロロフェニルコアを含む誘導体が、いくつかの実施形態で採用される。例示的なアゴニストが、Ｅｖａｎｓ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｙｏｄａ１ ａｎａｌｏｇｕｅ（Ｄｏｏｋｕ１）ｗｈｉｃｈ ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ Ｙｏｄａ１－ｅｖｏｋｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｅｚｏ１ ａｎｄ ａｏｒｔｉｃ ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７５（１７４４－１７５９）：２０１８に開示されている。なおも他のＰｉｅｚｏ１アゴニストとしては、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、ｓｓＲＮＡ４０、並びにそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｌｅｖｅｒ－ｌｉｋｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｏ－ｇａｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｉｅｚｏ１ ｃｈａｎｎｅｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１８）９：１３００、Ｓｕｇｉｓａｗａ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｓｅｎｓｉｎｇ ｂｙ Ｇｕｔ Ｐｉｅｚｏ１ Ｉｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １８２，Ｉｓｓｕｅ ３，２０２０，Ｐａｇｅｓ ６０９－６２４を参照されたい。これらのＰｉｅｚｏ１アゴニストは、市販されている。様々な実施形態では、Ｐｉｅｚｏ１アゴニスト又は誘導体の有効量は、約１μＭ～約５００μＭ、若しくは約５μＭ～約２００μＭ、若しくは約５μＭ～約１００μＭ、又はいくつかの実施形態では、約２５μＭ～約１５０μＭ、若しくは約２５μＭ～約１００μＭ、若しくは約２５μＭ～約５０μＭの範囲である。
【0078】
様々な実施形態では、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化が、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＣＤ３４濃縮細胞）に適用される。ある特定の実施形態では、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化は、更に、ｉＰＳＣ、胚様体、ＥＣ、造血内皮細胞（ＨＥＣ）、ＨＳＣ、造血前駆細胞、並びに造血系統（複数可）に適用され得る。ある特定の実施形態では、Ｐｉｅｚｏ１活性化は、少なくとも、ｉＰＳＣから生成されたＥＢ、ＥＢから単離されたＣＤ３４＋細胞、及び／又はそれらの組み合わせに適用される。
【0079】
代替的に、又は加えて、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現は、細胞において、例えば、ＣＤ３４濃縮細胞において直接増加させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、Ｄｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を細胞に送達することによって、又はＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入することによって、又は非統合性エピソームを細胞に導入することに限定されない、無導入遺伝子方法によって増加させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、限定されるものではないが、プロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させ、かつ／又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすためなどに、細胞におけるＤｎｍｔ３ｂ発現要素に遺伝子組換えを導入するために採用される。
【0080】
いくつかの実施形態では、本方法は、単独で、あるいはＤｎｍｔ３ｂ及び／又は周期的ひずみ若しくはＰｉｅｚｏｌ活性化時に上方若しくは下方制御される他の遺伝子と組み合わせて、細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡ転写物を細胞に導入することができ、エピソームを細胞に導入することを含むがこれに限定されない、無導入遺伝子アプローチを採用することもできるか、又は代替的にＧｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を導入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、細胞におけるＧｉｍａｐ６発現要素に遺伝子組換え（プロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるため、又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすための１つ以上の組換えなど）を導入するために採用される。
【0081】
細胞へのｍＲＮＡ送達を採用する本開示の実施形態では、公知の化学修飾を使用して、細胞における自然免疫応答を回避することができる。例えば、正準ヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を誘起することができる。この応答は、翻訳阻止、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死をもたらし得る。ある特定の非正準ヌクレオチドを含むＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避することができ、高効率でタンパク質に翻訳することができる。特に自然免疫応答を回避するためのヌクレオチド修飾に関して、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ９，１８１，３１９を参照されたい。
【0082】
いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、導入遺伝子を細胞に導入することによって増加され、これは、所望のレベルの過剰発現を指示することができる（様々なプロモーター強度又は発現制御エレメントの他の選択を伴う）。当該技術分野で公知である様々なウイルスベクター又はトランスフェクション試薬（脂質ナノ粒子を含む）を使用して、導入遺伝子を導入することができる。いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、無導入遺伝子方法（例えば、エピソーム送達）によって増加される。いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／若しくはＧｉｍａｐ６又は本明細書に開示される他の遺伝子の発現又は活性は、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、又はＲＮＡの安定性を増加させるための１つ以上の修飾を導入するために、遺伝子編集技術を使用して増加される。
【0083】
いくつかの実施形態では、このプロセスは、例えばＰｉｅｚｏ１アゴニストを使用して、ｄｎｍｔ３ｂの発現を増加させることを伴わない。
【0084】
いくつかの実施形態では、本方法は、周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を細胞に適用することを含む。様々な実施形態では、周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を受けた細胞は、ＣＤ３４濃縮細胞、ｉＰＳＣ、ＥＣ、及びＨＥＣのうちの１つ以上から選択される。例えば、細胞集団が、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０９６２１５に記載されているように、周期的ひずみ生物力学的伸張を提供するバイオリアクターに導入される。周期的ひずみ生物力学的伸張は、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることができる。これらの実施形態では、機械的手段は、細胞に、又はその上で培養された細胞（例えば、ＥＣ若しくはＨＥＣ）を有する細胞培養表面に伸張力を印加する。例えば、可撓性の生体適合性及び／又は生体模倣表面に取り付けられた伸張力を提供するためのコンピュータ制御真空ポンプシステム又は他の手段（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）テンションシステム、サイトストレッチャーシステム）を使用して、定義及び制御された周期的ひずみ条件下で細胞にエクスビボで周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を適用することができる。例えば、適用された周期的伸張は、数時間又は数日（例えば、約７日間）で約１％～約２０％の周期的ひずみ（例えば、約６％の周期的ひずみ）であり得る。様々な実施形態では、周期的ひずみは、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１４４時間、又は少なくとも約１６８時間適用される。様々な実施形態では、周期的伸張は用いられない。
【0085】
代替的に、又は加えて、ＥＨＴは、Ｔｒｐｖ４活性化によって刺激される。Ｔｒｐｖ４活性化は、細胞（例えば、ＣＤ３４濃縮細胞、ＥＣ、又はＨＥＣ）を、任意選択的にＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４アルファ－ＰＤＤ、又はそれらの類似体及び／若しくは誘導体から選択される１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものであり得る。
【0086】
細胞集団が、ある特定の表現型を有するものとして本明細書に記載される場合、表現型は、細胞集団の少なくとも２５％、少なくとも４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％などの細胞集団のかなりの部分を表すことが理解される。更に、様々なステップでは、細胞集団が、所望の表現型の少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％を含むように、細胞集団を所望の表現型の細胞について濃縮し、かつ／又は望ましくない表現型の細胞を枯渇させることができる。そのような陽性及び陰性選択方法は、当該技術分野で公知である。例えば、蛍光活性化細胞選別機、又は細胞をある特定の細胞表面抗原と結合する磁気ビーズを使用して、細胞表面抗原（本明細書に記載されるものを含む）に基づいて、細胞を選別することができる。陰性選択カラムを使用して、望ましくない細胞表面マーカーを発現する細胞を除去することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ＥＨＴを受ける前及び／又は後に）ＣＤ３４＋細胞について濃縮される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進し、それによって、幹細胞の増殖した集団を産生する条件下で培養される。
【0087】
様々な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（例えば、浮遊細胞及び／又は接着細胞）が、ｉＰＳＣ分化の１２日目～１７日目などのｉＰＳＣ分化の１０日目～２０日目に内皮・造血転換を受ける培養物から採取される。
【0088】
様々な実施形態では、ＨＳＣ又はＣＤ３４濃縮細胞は、更に増殖される。例えば、ＨＳＣ又はＣＤ３４濃縮細胞は、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，１６８，４２８、ＵＳ９，０２８，８１１、ＵＳ１０，２７２，１１０、及びＵＳ１０，２７８，９９０に開示されている方法に従って増殖させることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ又はＣＤ３４濃縮細胞のエクスビボ増殖は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はＰＧＥ２誘導体を採用する。本開示のいくつかの実施形態では、ＨＳＣは、少なくとも約０．０１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．０５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約１％のＬＴ－ＨＳＣを含む。
【0089】
自然骨髄系統、赤血球系統、及びリンパ系統を生じさせる造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＣＤ３４の発現マーカー及び系統特異的マーカー（Ｌｉｎ－と呼ばれる）の不在に基づいて同定することができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣを含む幹細胞の集団は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＵＳ９，８３４，７５４に記載されているように濃縮される。例えば、このプロセスは、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ３８、及びＣＤ４３のうちの１つ以上の発現に基づいて細胞集団を選別することを含むことができる。ＣＤ３４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３８－、及びＣＤ４３－のうちの１つ以上である画分を、更なる分化のために選択することができる。いくつかの実施形態では、造血系統への分化のための幹細胞集団は、少なくとも約８０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約９０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約９５％のＣＤ３４＋である。
【0090】
いくつかの実施形態では、幹細胞集団、又はＣＤ３４濃縮細胞若しくはその画分、あるいは誘導体集団は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０３０８５４０に記載されているように増殖される。例えば、細胞は、例えば、ＳＲ１又はＳＲ１誘導体を含むアリール炭化水素受容体拮抗剤に細胞を曝露することによって増殖される。また、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１６；１８（１）：１４４－５５、及びＢｏｉｔａｎｏ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｙｌ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ Ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１０ Ｓｅｐ １０；３２９（５９９７）：１３４５－１３４８を参照されたい。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進する化合物は、例えば、ＵＭ１７１又はＵＭ７２９を含むピリミドインドール誘導体を含む（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０／０３０８５４０を参照されたい）。
【0092】
いくつかの実施形態では、幹細胞集団又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、ＷＯ２０２０／２０５９６９（参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ペリオスチン及び／若しくは血小板由来成長因子受容体α（ｐｄｇｆｒａ）を発現する細胞について更に濃縮されるか、又はペリオスチン及び／若しくはｐｄｇｆｒａを発現するように修飾される。そのような発現は、コード化転写産物を細胞に送達することによる、又はコード化導入遺伝子を導入することによる、又は非統合性エピソームを細胞に導入することに限定されない、無導入遺伝子方法によるものであり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、プロモーター活性若しくは強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすためなどに、細胞における発現要素に遺伝子組換えを導入するために採用される。
【0093】
なおも他の実施形態では、幹細胞集団又はＣＤ３４濃縮細胞は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ１の阻害剤で培養される。代替的に、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において部分的若しくは完全に欠失若しくは不活性化されるか、又は一過性にサイレンシングされる。ＥＺＨ１の阻害は、骨髄前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋）をリンパ系統に指向することができる。参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０４８８２８を参照されたい。なおも他の実施形態では、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において過剰発現される。
【0094】
様々な実施形態では、ＨＳＣ集団又はその画分は、単球、マクロファージ、及び樹状細胞が生成され得る、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、及びプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）、並びにそれらの画分から選択することができる造血系統に分化する。
【0095】
ｉＰＳＣの（例えば、ＥＢへの）分化は、ＣＨＩＲ９９０２１などのＷＮＴアゴニストを採用し得る。ＷＮＴアゴニストは、ＷＮＴシグナル伝達を模倣するか、又は増加させる分子である。ＷＮＴアゴニストの非限定的な例としては、小分子ＣＨＩＲ－９９０２１（ＣＡＳ ２５２９１７－０６－９）、２－アミノ－４，６－二置換ピリミジン、例えば、ＢＭＬ ２８４（ＣＡＳ ８５３２２０－５２－７）、ＳＫＬ ２００１（ＣＡＳ ９０９０８９－１３－０）、ＷＡＹ ２６２６１１（ＣＡＳ １１２３２３１－０７－１）、ＷＡＹ ３１６６０６（ＣＡＳ ９１５７５９－４５－４）、ＳＢ ２１６７６３（ＣＡＳ ２８０７４４－０９－４）、ＩＱ １（ＣＡＳ ３３１００１－６２－８）、ＱＳ １１（ＣＡＳ ９４４３２８－８８－５）、デオキシコール酸（ＣＡＳ ８３－４４－３）、ＢＩＯ（ＣＡＳ ６６７４６３－６２－９）、ケンパウロン（ＣＡＳ １４２２７３－２０－９）、又は（ヘテロ）アリールピリミジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、アゴニスト抗体若しくはその機能的断片、又は抗体様ポリペプチドである。
【0096】
ｉＰＳＣの（例えば、ＥＢへの）分化は、ＲＯＣＫ阻害剤を採用し得る。ｉＰＳＣの確立及び分化に使用される例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２－８６、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメント、Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）ウレア、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、及び（Ｒ）－（＋）－トランス－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、Ｈ－１００、並びに参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許第８，０４４，２０１号に開示されているＲＯＣＫ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0097】
いくつかの実施形態では、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、又はプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）が、エクスビボでＮｏｔｃｈリガンド（一部若しくは全て）、ＳＨＨ、細胞外マトリックス成分（複数可）、及び／又はそれらの組み合わせで培養されて、それらの細胞を分化させる。更に、公知のプロセスによれば、異種ＯＰ９－ＤＬ１、又はＳＴＯマウス線維芽細胞若しくは血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）若しくは臍帯血由来の間葉系幹細胞若しくはリンパ球由来のがん細胞株細胞のフィーダー層が、しばしば、造血細胞の自然骨髄細胞、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞への分化のために採用され、任意選択的に細胞の他の系統への分化に採用され得る。ＯＰ９－ＤＬ１共培養系は、Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様－１（ＤＬＬ１）で形質導入された骨髄間質細胞株（ＯＰ９）を使用して、幹細胞源からのＴ細胞発生を支援する。ＯＰ９－ＤＬ１系は、臨床用途のための細胞の潜在能力を制限する。臨床使用のためにｈｉＰＳＣから貪食細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）を生成することができる無フィーダー細胞系に対する必要性が存在し、いくつかの実施形態では、本発明は、この目的を満たす。非限定的な例では、ｎｏｔｃｈリガンドを利用して成熟貪食細胞を生成するために、ｉＰＳＣ増殖が６日間行われ、約８日間の胚様体形成が続く。細胞が約５日間更に培養されて、ＨＳＣが由来するＣＤ３４＋造血内皮細胞の発生を可能にする。次いで、ＨＣＳが、（既に記載されているように）単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球などの骨髄細胞への分化のために、Ｎｏｔｃｈリガンドを含むことができる特定の培地中で培養される。
【0098】
いくつかの実施形態では、胚体造血内皮（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｈｅｍｏｇｅｎｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）の共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、又はプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）への分化を開始するために、サイトカイン及び／又は成長因子の存在が所望され、これらには、幹細胞因子、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５、並びに任意選択的にＢＭＰ活性化剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、貪食細胞前駆細胞又は貪食細胞前駆体の単球、マクロファージ、又は樹状細胞への分化を開始するために、多能性幹細胞由来の貪食細胞前駆細胞又は貪食細胞前駆体が、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含む組成物と接触し、培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化剤、及びＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない。
【0099】
本明細書で使用される場合の「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、造血幹細胞又は前駆Ｔ細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することが可能なリガンドを指す。Ｎｏｔｃｈ受容体としては、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｎｏｔｃｈ－２、Ｎｏｔｃｈ－３、及びＮｏｔｃｈ－４が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、アミノ末端に２０～２２個のアミノ酸を含み、細胞外表面に３～８個のＥＧＦ反復を含む、ＤＳＬドメイン（Ｄ－Ｄｅｌｔａ、Ｓ－Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＬ－Ｌａｇ２）を有する。様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈは、デルタ様－１（ＤＬＬ１）、デルタ様－４（ＤＬＬ４）、ＤｅｌｔａＭａｘ（参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４１７６５及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３０９７７に開示される）、又はその機能的部分、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、Ｊａｇｇｅｄ２（ＪＡＧ２）、デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）、及びＸ－デルタ２のうちの少なくとも１つを含む。入ってくるリンパ球前駆細胞にインビボで胸腺間質細胞によって送達される重要なシグナルは、皮質胸腺上皮細胞によって発現されるＤＬ４によって媒介される。
【0100】
本明細書で使用される場合の「Ｎｏｔｃｈリガンド」はまた、インタクトな（完全長）、部分的な（切断型）、又は修飾された（保存的変異などの１つ以上の変異を含む）ｎｏｔｃｈリガンド、並びに完全長Ｎｏｔｃｈリガンドの少なくとも１つの活性又は機能を保持する任意の種に由来するＮｏｔｃｈリガンド又はその断片を含む。また、ｎｏｔｃｈリガンドを模倣するペプチドも含まれる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、「正準ｎｏｔｃｈリガンド」又は「非正準ｎｏｔｃｈリガンド」であり得る。正準ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、Ｎ末端（ＮＴ）ドメイン、続いて、Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＬＡＧ－２（ＤＳＬ）ドメイン、及び複数のタンデム配列された上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復を含む、細胞外ドメインによって特徴付けられる。ＤＳＬドメインは、隣接するＮＴドメイン、並びにデルタ及びＯＳＭ－１１様タンパク質（ＤＯＳ）モチーフを含む最初の２つのＥＧＦ反復とともに、典型的には、正準リガンドがＮｏｔｃｈに結合するために必要とされる。いくつかの正準リガンドの細胞内ドメインは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達とは無関係な役割を果たす、カルボキシ末端ＰＳＤ－９５／Ｄｌｇ／ＺＯ－１－リガンド（ＰＤＺＬ）モチーフを含む。
【0101】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関与することができる抗Ｎｏｔｃｈ（アゴニスト）抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体（ヒト又はヒト化抗体を含む）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することが可能な他の抗体断片若しくは抗原結合分子である。
【0102】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、デルタファミリーＮｏｔｃｈリガンドである。いくつかの実施形態におけるデルタファミリーリガンドは、デルタ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３５２２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、デルタ様１（ＤＬＬ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６１８及びＮＰ＿００５６０９、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８０９０３、１４８３２４、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、デルタ－４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、及び／又はデルタ様４（ＤＬＬ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ ０１９４５４、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である。Ｎｏｔｃｈリガンドは、市販されているか、又は例えば、組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。
【0103】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＤＬＬ１又はＤＬＬ４ Ｎｏｔｃｈリガンドと少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％同一（例えば、約１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。Ｎｏｔｃｈリガンドの機能的誘導体（その断片又は部分を含む）は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、それを活性化することが可能であろう。Ｎｏｔｃｈ受容体への結合は、インビトロ結合アッセイ及び受容体活性化／細胞シグナル伝達アッセイを含む、当該技術分野で公知である様々な方法によって決定され得る。
【0104】
様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、可溶性であり、磁気濃縮又は集中プロセスを可能にするために任意選択的に常磁性である微粒子又はナノ粒子上に任意選択的に固定化される。なおも他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、任意選択的にＶＣＡＭ－１などの他の接着分子を用いて、２Ｄ又は３Ｄ培養表面上に固定化される。参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０／０３９９５９９を参照されたい。他の実施形態では、ビーズ又は粒子は、ポリマー（例えば、ポリスチレン若しくはＰＬＧＡ）、金、デキストラン鉄であるか、又は脂質及び／若しくはタンパク質から形成される粒子などの生物学的物質で構築される。様々な実施形態では、粒子は、約０．０１μｍ（１０ｎｍ）～約５００μｍ（例えば、約１μｍ～約７μｍ）の直径又は最大寸法を有する。なおも他の実施形態では、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１３１５８２に記載されているように、共役リガンドを有するポリマー足場を採用することができる。例えば、足場は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギン酸塩又はアルギン酸塩誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リジン）、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、及びそれらの任意の組み合わせから構築することができる。いくつかの実施形態では、足場は、約１ｐｍ～１００ｐｍの直径を有する細孔を含む。
【0105】
いくつかの実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端は、選択された支持体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、これは、例えば、ビオチン分子を通して支持体に酵素的にコンジュゲートすることができるＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端に配列を付加することを含むことができる。別の実施形態では、支持体にコンジュゲートされているプロテインＡ又はプロテインＧに結合することによって、Ｆｃセグメントを固定化することができるように、Ｎｏｔｃｈリガンド－Ｆｃ融合物が調製される。当然ながら、公知のタンパク質コンジュゲーション方法のうちのいずれかを採用することができる。
【0106】
いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、以下のうちの１つ以上（又は全て）などの１つ以上の親和性増強変異を有するＤＬＬ４である：ｈＤＬＬ４に関して、Ｇ２８Ｓ、Ｆ１０７Ｌ、Ｉ１４３Ｆ、Ｈ１９４Ｙ、Ｌ２０６Ｐ、Ｎ２５７Ｐ、Ｔ２７１Ｌ、Ｆ２８０Ｙ、Ｓ３０１Ｒ、及びＱ３０５Ｐ。Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｍａｔｕｒｅｄ ＤＬＬ４ ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ ｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０２２）を参照されたい。
【0107】
したがって、様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、２Ｄ又は３Ｄ培養系において固定化し、官能化し、かつ／又は埋め込むことができる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、フィブロネクチン、レトロネクチン、及びラミニンから選択される１つ以上などの細胞外基質の成分とともに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外基質の成分は、３Ｄ培養条件を提供する不活性材料に埋め込まれる。例示的な材料としては、セルロース、アルギン酸塩、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外基質の成分、又はそれらの組み合わせは、分化及び／又は増殖を助長する局所的パターン及び／又はテクスチャ（例えば、粗度）を細胞に提供する培養条件と接触している。
【0108】
様々な実施形態では、ＨＳＣ／ＨＳＰＣ集団は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）中で培養される。Ｈａｇｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１９）を参照されたい。ＡＴＯには、無血清条件下でＮｏｔｃｈリガンド発現間質細胞株でのＨＳＣ（又はＨＳＣの凝集体）の培養が含まれる。人工胸腺オルガノイドは、３Ｄ系であり、造血前駆体のナイーブＣＤ３＋ＣＤ８＋及びＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞又は骨髄系統細胞への分化を誘導する。いくつかの実施形態では、人工胸腺オルガノイドは、ＤＬＬ４及びＢＭＰ２、又はその機能的断片を含む。
【0109】
いくつかの態様及び実施形態では、本発明は、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、又はプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）を得るための培養プラットフォームを提供する。培養プラットフォームは、細胞（例えば、ＥＢ由来のＣＤ３４＋細胞）を、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストとしては、Ｙｏｄａ１、ｓｓＲＮＡ４０、Ｊｅｄｉ１、及びＪｅｄｉ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｔｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストは、ＧＳＫ１０１６７９０Ａである。培地は、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含み得る。培地は、任意選択的に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化剤、Ｗｎｔ経路活性化剤、又はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、チアゾビビン若しくはＹ２７６３２）のうちの１つ以上を含み得る。その後、細胞が、所望の骨髄細胞又はその前駆体（例えば、既に記載されている、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球、又はそれらの前駆体）への分化に好適な１つ以上の成長因子／サイトカイン／アゴニスト又は阻害剤の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、培地は、ＨＳＣの、貪食細胞前駆細胞（例えば、共通骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、リンパ球プライム多能性前駆細胞（ＬＭＰＰ）、顆粒球マクロファージＤＣ前駆細胞（ＧＭＤＰ）、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球／赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、顆粒球及びマクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、顆粒球－マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、及びプラズマシトイドＤＣ（ｐＤＣ）への分化に好適である。例えば、分化培養の開始時に、ＩＬ－３、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、及びＦＬＴ－３Ｌが添加され、次の段階で、培地に、ＩＬ－３を除く前述のサイトカインが補充される。代替的に、細胞が、最初にＳＣＦ、ＦＬｔ－３Ｌ、ＴＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６で培養され、次いで、ＩＧＦ－１、ＳＩＳ３、ＩＬ－７、及びＩＬ－２１、又は顆粒球－マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球－コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、及びマクロファージ炎症性タンパク質－１アルファ（ＭＩＰ－Ｉアルファ）のうちの１つ以上で培養される。
【0110】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣ集団又はその画分は、Ｙｏｄａ１などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用とは無関係に、骨髄系統細胞又はその前駆細胞又は誘導体に分化する。いくつかの実施形態では、Ｙｏｄａ１などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用は、任意選択的である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製するために、分化した多能性幹細胞集団から濃縮される。Ｙｏｄａ１、ｊｅｄｉ１、ｊｅｄｉ２、ｓｓＲＮＡ４０などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用が任意選択的である、ＣＤ３４＋濃縮細胞集団の内皮・造血転換が、少なくとも２日であるが１２日以下にわたって誘導される。ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣが、前駆骨髄系統細胞集団又は骨髄系統細胞集団に分化する。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋濃縮細胞集団の内皮・造血転換は、少なくとも２日間、更に合計少なくとも約４時間、又は約８時間、又は約１２時間、又は約１６時間、又は約２０時間、又は約２４時間、又は約２日間、又は約３日間、又は約４日間、又は約５日間、又は約６日間、又は約７日間、又は約８日間、又は約９日間、又は約１０日間であるが、１２日間以下誘導される。例示的な実施形態では、ＥＨＴは、４ 約４日間～約１０日間、又は約５～約８日間（例えば、５～７日間の範囲）誘導される。
【0112】
いくつかの実施形態では、細胞は、ｉＰＳＣ、胚様体、ｈＣＤ３４＋細胞、又は骨髄前駆体の遺伝子編集に基づいて、又は標的細胞集団におけるｍＲＮＡ発現を介して、ＣＡＲを発現する。加えて、又は任意選択的に、細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５など、又はインターフェロン）を発現して、腫瘍を標的とする際にＣＡＲをより強力にするように操作され得る。
【0113】
非限定的な例では、細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球、又はそれらの前駆体）は、第一、第二、第三、第四、又は第五世代ＣＡＲを運ぶ、レトロウイルス若しくは非組み込みウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組み込み欠損レトロレンチウイルス、ポックスウイルス）又は非ウイルスベクター（例えば、プラスミドベクター、人工染色体）又はエピソーム若しくはエピソームハイブリッドベクター）などであるが、これらに限定されないベクターによって効率的に形質導入され得る（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．３（４）：３８８－３９８（２０１３）、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７：１２７－１３３（２０１４）、Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｅｈ．８（４）：３３７－３５０（２０１５）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：５４２６－５４３５（２００７）、Ｇａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：９０８０－９０８８（２００５）、Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７０－７５（２００２）、Ｋｅｒｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：２１４３－２１５０（２００４）、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００９）、Ｈｏｌｌｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：１６９－１８０（２００９））を参照されたい。これらの前述の参考文献は各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原又はマーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ２０など）を標的とし得る。ＣＡＲ発現は、通例のプロトコルに従って、異なる貪食細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）又はそのサブセットにわたって実証することができる。ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ．ＣＤ１９－マクロファージ細胞、ＣＡＲ．ＣＤ３８－マクロファージ細胞、ＣＡＲ．ＣＤ３３－マクロファージ細胞、ＣＡＲ．ＣＤ４７－マクロファージ細胞、ＣＡＲ．ＣＤ２０－マクロファージ細胞など）は、改変されていないマクロファージ細胞と比較して、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ２０細胞株及び患者（例えば、Ｂ細胞前駆体ＡＬＬを有する）から得られた一次芽球に対してより高い腫瘍活性（例えば、抗白血病活性）を提示し得る。
【0114】
ＣＡＲは、腫瘍細胞を認識し、それに結合し、かつそれを殺傷する細胞の能力を増強するように設計されている。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍細胞を認識する貪食細胞（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び好中球）の能力を増強する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、貪食細胞の抗腫瘍活性を増強する。いくつかの実施形態では、限定されないが、ＣＡＲは、以下の腫瘍又は腫瘍抗原を標的とするＧタンパク質結合型受容体８７（ＧＰＲ８７）ＣＡＲ及び溶質担体ファミリー７メンバー１１（ＳＬＣ７Ａ１１（ｘＣＴ））ＣＡＲ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＢＣＭＡ）ＣＡＲ、ＣＤ３０ ＣＡＲ、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２２－ＣＡＲ、ＣＤ３３ ＣＡＲ、ＣＤ１３３－ＣＡＲ、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ（又はＮＫＧ２Ｄ外部ドメインを含むＣＡＲ若しくは受容体）、メソテリン－ＣＡＲ、ＣＤ７０ ＣＡＲ、ＮＫｐ３０ ＣＡＲ、ＣＤ７３ ＣＡＲ、又はＣＡＲ－貪食細胞（例えば、ＣＡＲ－単球、ＣＡＲ－マクロファージ、ＣＡＲ－樹状細胞、又はＣＡＲ－好中球）である：
（ｉ）ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－卵巣がん、乳がん、膠芽腫、結腸がん、骨肉腫、及び髄芽腫；
（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）－非小細胞肺がん、上皮がん、及び神経膠腫；
（ｉｉｉ）メソテリン－中皮腫、卵巣がん、及び膵臓腺がん；
（ｉｖ）前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）－前立腺がん；
（ｖ）がん胎児性抗原（ＣＥＡ）－膵臓腺がん、乳がん、及び結腸直腸がん；
（ｖｉ）グリピカン－３－肝細胞がん；
（ｖｉｉ）表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）－膠芽腫；
（ｖｉｉｉ）ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）－神経芽腫及び黒色腫；
（ｉｘ）炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）－腎細胞がん；
（ｘ）インターロイキン－１３Ｒａ２－神経膠腫；
（ｘｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）－悪性胸膜中皮腫；
（ｘｉｉ）Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）－神経芽腫、黒色腫、及び卵巣；
（ｘｉｉｉ）がん抗原１２５（ＣＡ１２５）－卵巣上皮がん；
（ｘｉｖ）表面抗原分類１３３（ＣＤ１３３）－膠芽腫及び胆管がん、腺がん；
（ｘｖ）がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）－黒色腫及び卵巣がん；
（ｘｖｉ）ムチン１－精嚢がん；
（ｘｖｉｉ）葉酸受容体－ａ（ＦＲ－ａ）－卵巣がん；
（ｘｖｉｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、若しくはＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＴβＲ Ｉ－ＩＩ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲ（α／β）、又はＦＧＦＲ１～４のうちの１つ以上から選択される成長因子受容体。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２２ Ｏｃｔ ３１、又はＰｏｏｒｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｅｗ ｒｏａｄｓ；ｏｌｄ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ ７，２０２１、Ｚｈａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｉｓｌａｎｄ（ＦＬ）：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
（ｉ）ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）－卵巣がん、乳がん、膠芽腫、結腸がん、骨肉腫、及び髄芽腫；
（ｉｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）－非小細胞肺がん、上皮がん、及び神経膠腫；
（ｉｉｉ）メソテリン－中皮腫、卵巣がん、及び膵臓腺がん；
（ｉｖ）前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）－前立腺がん；
（ｖ）がん胎児性抗原（ＣＥＡ）－膵臓腺がん、乳がん、及び結腸直腸がん；
（ｖｉ）グリピカン－３－肝細胞がん；
（ｖｉｉ）表皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）－膠芽腫；
（ｖｉｉｉ）ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）－神経芽腫及び黒色腫；
（ｉｘ）炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）－腎細胞がん；
（ｘ）インターロイキン－１３Ｒａ２－神経膠腫；
（ｘｉ）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）－悪性胸膜中皮腫；
（ｘｉｉ）Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）－神経芽腫、黒色腫、及び卵巣；
（ｘｉｉｉ）がん抗原１２５（ＣＡ１２５）－卵巣上皮がん；
（ｘｉｖ）表面抗原分類１３３（ＣＤ１３３）－膠芽腫及び胆管がん、腺がん；
（ｘｖ）がん／精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）－黒色腫及び卵巣がん；
（ｘｖｉ）ムチン１－精嚢がん；
（ｘｖｉｉ）葉酸受容体－ａ（ＦＲ－ａ）－卵巣がん；
（ｘｖｉｉｉ）ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、若しくはＥｒｂＢ４、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＴβＲ Ｉ－ＩＩ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＰＤＧＦＲ（α／β）、又はＦＧＦＲ１～４のうちの１つ以上から選択される成長因子受容体。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｏｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２２ Ｏｃｔ ３１、又はＰｏｏｒｉａ ｅｔ ａｌ，Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｅｗ ｒｏａｄｓ；ｏｌｄ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ ７，２０２１、Ｚｈａｎｇ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｎ：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｔｒｅａｓｕｒｅ Ｉｓｌａｎｄ（ＦＬ）：ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
【0115】
したがって、本発明のいくつかの態様及び実施形態では、遺伝子改変貪食細胞集団又はその前駆体若しくは子孫は、細胞表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、特に成長因子受容体に特異的に結合するＣＡＲを発現させるように操作される。最も典型的には、ＣＡＲは、Ｆｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃイプシロンＲＩガンマ）からの細胞内ドメインを含む。しかしながら、更なる企図される実施形態では、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ゼータ）細胞内ドメインを、単独で、又は第二若しくは第三世代ＣＡＲ構築物（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及び／若しくはＩＣＯＳ）からの追加の成分と組み合わせて含む場合もある。
【0116】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、貪食細胞（例えば、単球、マクロファージ、又は樹状細胞）における抗貪食シグナル伝達を阻害する少なくとも１つのドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は細胞内ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲを含まない同じタイプの細胞と比較して、例えばＣＤ４７及び／又はＳＩＲＰアルファ活性を阻害することによって、貪食細胞（例えば、単球、マクロファージ、又は樹状細胞）のエフェクター活性を改善する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４７に結合してＳＩＲＰアルファ活性（例えば、ＣＤ４７シンク）を阻害することによって、優性陰性受容体として機能する。
【0117】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ改変マクロファージ、単球、樹状細胞、又は好中球は、改変されていないマクロファージ、単球、又は樹状細胞と比較して１つ以上の炎症性サイトカインの産生の増加を呈する。１つ以上の炎症性サイトカインは、ＴＮＦアルファ、ＩＬ－６、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－８、ＩＬ－２、ＩＬ－２３、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＬ－２、ＩＬ－８、ＩＬ３３、ＣＣＬ３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ１０、又はＣＣＬ２のうちの１つ以上から選択することができる。
【0118】
他の態様では、本発明は、骨髄系統又はその前駆体を含み、かつ本明細書に記載の方法によって生成され得る、細胞集団、又はその薬学的に許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、必要としている対象への投与時に、胸腺、脾臓、又は二次リンパ器官に生着することができる前駆骨髄系統細胞集団である。様々な実施形態では、細胞集団及び薬学的に許容されるビヒクルを含む細胞療法用の組成物が調製される。薬学的組成物は、少なくとも約１０２個の細胞、又は少なくとも約１０３個、又は少なくとも約１０４個、又は少なくとも約１０５個、又は少なくとも約１０６個、又は少なくとも約１０７個、又は少なくとも約１０８個の細胞、又は少なくとも約１０９個の細胞、又は少なくとも約１０１０個の細胞、又は少なくとも約１０１１個の細胞、又は少なくとも約１０１２個の細胞、又は少なくとも約１０１３個の細胞、又は少なくとも約１０１４個の細胞を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、薬学的組成物は対象に投与され、組成物は、対象の体重１キログラム当たり約１００，０００～約４００，０００細胞（例えば、約２００，０００細胞／ｋｇ）の細胞を含み得る。他の実施形態では、細胞は、レシピエントの体重１キログラム当たり約１０５～約５×１０５細胞（例えば、約２．５×１０５細胞／ｋｇ）、又は１キログラム当たり約１０６～約５×１０６細胞（例えば、約２．５５×１０６細胞／ｋｇ）、又は１キログラム当たり約５×１０６～約１０７細胞（例えば、約５×１０６細胞／ｋｇ）、又は１キログラム当たり約１０７～約１０８細胞（例えば、約５×１０７細胞／ｋｇ）、又は１キログラム当たり約１０８～約１０９細胞（例えば、約５×１０８細胞／ｋｇ）、又は１キログラム当たり約１０９～約１０１０細胞、又は１キログラム当たり約１０１０～約１０１１細胞、又は１キログラム当たり約１０１１～約１０１２細胞、又は１キログラム当たり約１０１２～約１０１３細胞、又は１キログラム当たり約１０１３～約１０１４細胞で投与される。
【0119】
いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＨＬＡ－Ａｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１ｎｅｇである。いくつかの実施形態では、細胞集団は更に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である。様々な実施形態では、組成物は、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、前骨髄球、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ／樹状細胞（ＤＣ）前駆細胞（ＭＤＰ）、共通ＤＣ前駆細胞（ＣＤＰ）、従来型（又は古典型）骨髄樹状細胞（ｃＤＣ）、共通単球前駆細胞（ｃＭｏＰ）、及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）のうちの１つ以上から選択される骨髄系統を含む。
【0120】
開示された方法で使用するための薬学的組成物はまた、特定の標的障害の治療のための追加の治療剤を含有し得る。例えば、薬学的組成物はまた、サイトカイン及び成長因子（インターロイキン、インターフェロン、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＩＧＦ、ＳＴＡＴなど）を含み得る。そのような追加の因子及び／又は薬剤は、本明細書に開示される治療アプローチの利点を生じる、すなわち、低減した全身毒性を有する改善された治療効果を提供するために、薬学的組成物に含まれ得る。
【0121】
貪食細胞又はＣＡＲ－貪食細胞（例えば、ＣＡＲ－単球、ＣＡＲ－マクロファージ、ＣＡＲ－樹状細胞、又はＣＡＲ－好中球）は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、及び投与することができる。この関連での考慮すべき因子には、治療される特定の疾患又は障害、治療される特定の哺乳動物（例えば、ヒト）、個々の患者の臨床状態、疾患又は障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が含まれる。投与される細胞の治療有効量は、そのような考慮によって支配される。
【0122】
他の態様では、本発明は、細胞療法のための方法であって、本明細書に記載の細胞集団又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液（悪性及び非悪性）疾患、骨髄疾患、免疫疾患、及び感染症を治療するために使用される。様々な実施形態では、ヒト対象は、リンパ球減少症、がん、免疫不全、自己免疫疾患のうちの１つ以上を含む状態を有する。疾患の例としては、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、いくつかの形態の若年性特発性関節炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマトーデス、いくつかの形態の甲状腺炎、いくつかの形態のブドウ膜炎、白斑、多発血管炎性肉芽腫症（ウェゲナー肉芽腫症）を含むが、これらに限定されない様々な自己免疫疾患が挙げられる。治療することができる血液悪性腫瘍としては、急性及び慢性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、並びに骨髄異形成症候群が挙げられるが、これらに限定されない。治療することができる感染症としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、アデノウイルス、及びＢＫポリオーマウイルス関連障害が挙げられるが、これらに限定されない。他の状態としては、骨格形成異常、ヘモグロビン異常症、貧血（鉄欠乏性貧血、悪性貧血、再生不良性貧血、鎌状赤血球貧血、ビタミン欠乏性貧血、及び溶血性貧血を含むが、これらに限定されない）、骨髄不全症候群、並びにある特定の遺伝性障害（例えば、免疫系に影響を及ぼす遺伝性障害）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、血液悪性腫瘍（白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない）、又は固形腫瘍（脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頸部、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、若しくは食道の腫瘍を含むが、これらに限定されない）などのがんを有する。
【0123】
いくつかの実施形態では、対象は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性障害、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、再生不良性貧血、純赤血球無形成症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、血球貪食性リンパ組織球症、先天性代謝異常、重症先天性好中球減少症、シュワックマン・ダイアモンド症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、及び白血球接着不全症から選択される状態を有する。
【0124】
本明細書に記載のＨＬＡ編集細胞を採用する実施形態では、組成物は、１つ以上の保持されたＨＬＡ遺伝子座で対象に適合し得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１ハプロタイプに適合する。
【0125】
本開示の細胞組成物（例えば、本開示に従って調製される）は、薬学的に許容される賦形剤又は担体を更に含み得る。そのような賦形剤又は担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加剤を含有することができる。緩衝液は、その化学組成がｐＨの著しい変化を伴わずに酸又は塩基を中和する溶液又は液体を指す。本発明によって想定される緩衝液の例としては、生理／生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。本組成物は、静脈内注入又は他の投与経路に好適なビヒクルを含み得、本組成物は、好適な抗凍結剤を含み得る。例示的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％ＤＭＳＯ）である。他の担体は、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はジメチルアセトアミドを含み得、それらの混合物又は組み合わせを含む。細胞組成物は、埋込型デバイス（例えば、足場）内、又はバッグ内、又はバイアル、チューブ、若しくは容器内に適切な体積で提供され、使用まで凍結保存され得る。
【0126】
細胞とともに、細胞毒性薬、免疫抑制剤、及び／又はサイトカイン若しくは成長因子（例えば、幹細胞因子、トロンボポエチン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）－α若しくはβ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、成長因子のアンジオポエチン（Ａｎｇ）ファミリー、インスリン様成長因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、ＴＮＦ－α若しくはβ、ＶＥＧＦ、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、６、７、８、１０、１２、１５など）、及びインターフェロン（例えば、ＩＮＦ－アルファ又はガンマ））などの他の化合物を投与してもよい。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用した同時投与、及びいずれかの順序での連続投与が含まれ、好ましくは、両方の（かつ全ての）活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮する期間がある。
【0127】
本発明の貪食細胞と同時投与され得るホルモン、成長因子、及びサイトカイン抗体などの薬剤としては、分子、例えば、レニン；成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節される正常なＴ細胞の発現及び分泌）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミューラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン若しくは成長因子受容体；プロテインＡ若しくはＤ；リウマトイド因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、若しくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ４、ＮＴ－５、若しくはＮＴ－６）、又は神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－ベータ；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；線維芽細胞成長因子受容体２（ＦＧＦＲ２）、上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ（ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、ＴＧＦ－ベータ４、若しくはＴＧＦ－ベータ５を含む）；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（ＢＭＰ１、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ－受容体２を含む）；インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト、アルファｖベータ６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮアルファ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、又は１つ以上の腫瘍関連抗原若しくは細胞表面受容体に結合する抗体；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、－ベータ、及び－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１２／２３ ｐ４０、ＩＬ－１７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１８、ＩＬ－８、ＩＬ－４、ＩＬ－３、及びＩＬ－５；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、若しくはＨＥＲ４受容体；エンドグリン、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－ｋｉｔ、１ＧＦ１Ｒ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２）、並びに上記のポリペプチドのうちのいずれかの断片が挙げられる。
【0128】
投与され得る抗体又はその断片の例としては、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ、Ａｍｊｅｖｉｔａ）、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、バジリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）、ベリムマブ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）、ベズロトキシマブ（Ｚｉｎｐｌａｖａ）、カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ）、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ、Ｚｉｎｂｒｙｔａ）、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ、Ｘｇｅｖａ）、エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｓｉｍｐｏｎｉ Ａｒｉａ）、インフレクトラ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、イピリムムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）、イキセキズマブ（Ｔａｌｔｚ）、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ）、オララツマブ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ）、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、セクキヌマブ（Ｃｏｓｅｎｔｙｘ）、ラニビズマブ、アブシキシマブ、ラキシバクマブ、カプラシズマブ、インフリキシマブ、ベバシズマブ、ダビガトラン、イダルシズマブ、若しくはウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ）、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。更に、抗体は、抗エストロゲン受容体抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗ｐ５３抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗カテプシンＤ抗体、抗Ｂｃｌ－２抗体、抗Ｅ－カドヘリン抗体、抗ＣＡ１２５抗体、抗ＣＡ１５－３抗体、抗ＣＡ１９－９抗体、抗ｃ－ｅｒｂＢ－２抗体、抗Ｐ－糖タンパク質抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗網膜芽細胞腫タンパク質抗体、抗ｒａｓ腫瘍性タンパク質抗体、抗ルイスＸ抗体、抗Ｋｉ－６７抗体、抗ＰＣＮＡ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ５抗体、抗ＣＤ７抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ９／ｐ２４抗体、抗ＣＤ１抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３５抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＣＤ４１抗体、抗ＬＣＡ／ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ９５／Ｆａｓ抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１００抗体、抗Ｓ－１００抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ユビキチン抗体、抗ｃ－ｍｙｃ抗体、抗サイトケラチン抗体、抗ラムダ軽鎖抗体、抗メラノソーム抗体、抗前立腺特異抗原抗体、抗タウ抗原抗体、抗フィブリン抗体、抗ケラチン抗体、及び抗Ｔｎ抗原抗体から選択され得る。
【0129】
同時投与は、治療剤の投与のタイミングが、追加の治療剤と薬学的組成物中の活性成分（複数可）の薬理学的活性が時間的に重複し、それによって、併用治療効果を発揮するようなものである場合、治療剤が同時に投与されることを必要としない。概して、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び時間スケジュールで投与される。
【0130】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲ療法の前に、患者は、フルダラビン又はシクロホスファミドなどの化学療法剤を用いたリンパ枯渇化学療法（又は他の既知のプロセス）を受ける。
【0131】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、関連する数値の±１０％を意味する。
【0132】
本開示のある特定の態様及び実施形態が、以下の実施例を参照して更に説明される。
【実施例】
【0133】
実施例１－ＥＴＶ２過剰発現は、ｉＰＳＣ分化中に造血内皮細胞の収率を増加させ、ＣＤ３４＋細胞形成を増強するが、多能性には影響を及ぼさない。
方法
当該技術分野で公知であり、本質的に、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているエピソーム再プログラミングによって、ｉＰＳＣをｈＣＤ３４＋細胞から開発した。胚様体及び造血内皮分化を、本質的に、Ｒ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５，４３２－４３８，（２０１７）、Ｃ．Ｍ．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５５４－５６１，（２０１４）、Ｊ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているように実施した。
方法
当該技術分野で公知であり、本質的に、Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているエピソーム再プログラミングによって、ｉＰＳＣをｈＣＤ３４＋細胞から開発した。胚様体及び造血内皮分化を、本質的に、Ｒ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５４５，４３２－４３８，（２０１７）、Ｃ．Ｍ．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５５４－５６１，（２０１４）、Ｊ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｅｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているように実施した。
【0134】
簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣを解離し、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、アスコルビン酸、ヒトホロ－トランスフェリン、モノチオグリセロール、ＢＭＰ４、及びＹ－２７６３２を補充した培地中に再懸濁させた。次に、細胞をＥＢ形成のために１０ｃｍ皿（ＥＺＳＰＨＥＲＥ又は低付着プレート）に播種した。１日目に、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を含有する培地に置き換えた。４日目に、細胞培地を、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを補充した培地に置き換えた。６日目に、細胞培地を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、及びＥＰＯを補充した培地に置き換えた。細胞を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９５％湿度のインキュベーター内で維持した。ＣＤ３４＋細胞を採取するために、ＥＢを８日目に解離し、７０μｍストレーナーを通して細胞を濾過し、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４磁性ビーズ染色によって単離した。
【0135】
結果
ＥＦ１Ａプロモーターの制御下でＥＴＶ２及びＧＦＰ配列の両方を含むアデノウイルスベクターを使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形質導入した。形質導入後、ｉＰＳＣ培養物の約４５％がＧＦＰ陽性であることを観察し、ＥＴＶ２過剰発現（ＥＴＶ２－ＯＥ）を確認した。幹細胞性マーカー発現ＴＲＡ－１－６０によって示されるように、ｉＰＳＣ細胞におけるＥＴＶ２－ＯＥがｉＰＳＣの多能特性を保持することが更に観察された（図１）。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現するためのアデノウイルスベクターを用いたｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。
ＥＦ１Ａプロモーターの制御下でＥＴＶ２及びＧＦＰ配列の両方を含むアデノウイルスベクターを使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形質導入した。形質導入後、ｉＰＳＣ培養物の約４５％がＧＦＰ陽性であることを観察し、ＥＴＶ２過剰発現（ＥＴＶ２－ＯＥ）を確認した。幹細胞性マーカー発現ＴＲＡ－１－６０によって示されるように、ｉＰＳＣ細胞におけるＥＴＶ２－ＯＥがｉＰＳＣの多能特性を保持することが更に観察された（図１）。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現するためのアデノウイルスベクターを用いたｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。
【0136】
次に、ＥＴＶ２－ＯＥ－ｉＰＳＣを（ＥＴＶ２がないＧＦＰ配列を持つベクターで形質導入された対照ｉＰＳＣとともに）、胚様体に分化させ、その後、造血内皮細胞に分化させた（Ｓｔｒｕｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。結果は、ＥＴＶ２の過剰発現が、ＣＤ２３５ａ－集団内のＣＤ３４＋及びＣＤ３１＋マーカーの発現によって実証される、造血内皮細胞の形成を増進することを示唆する（図２）。具体的には、図２は、造血内皮細胞（ここではＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋として定義される）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化が、ＥＴＶ２－ＯＥが対照と比較して造血内皮細胞の形成を増強することを実証することを示す。
【0137】
更に、結果は、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞の形成を増強することを示唆する（図３）。図３は、ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化が、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増強することを実証することを示す。
【0138】
全体的に、これらのデータは、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２過剰発現が、それらの多能特性に影響を及ぼさず、造血内皮及び造血分化を受けるそれらの能力を促進することを示す。
【0139】
実施例２－Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが、骨髄由来のＨＳＣと同様に系統分化を受ける。
方法
ＥＨＴを分析するために、ＥＢ由来のＣＤ３４＋細胞を、Ｙ－２７６３２、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、及びＦＬＴ３を含有する培地中に懸濁させた。（目視検査によって）細胞がウェルの底部に約４～１８時間接着した後、Ｙｏｄａ１を培養物に添加した。４～７日後、分析のために細胞を収集した。
方法
ＥＨＴを分析するために、ＥＢ由来のＣＤ３４＋細胞を、Ｙ－２７６３２、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、及びＦＬＴ３を含有する培地中に懸濁させた。（目視検査によって）細胞がウェルの底部に約４～１８時間接着した後、Ｙｏｄａ１を培養物に添加した。４～７日後、分析のために細胞を収集した。
【0140】
ｉＰＳＣを、８日間胚様体に分化させた。８日目に、ｉＰＳＣ由来の胚様体からのＣＤ３４＋細胞を採取し、更に５～７日間培養して、内皮・造血（ＥＨＴ）転換を誘導した。次いで、更なる造血系統分化のために、ＣＤ３４＋細胞を５日目～７日目にＥＨＴ培養物から採取した。
【0141】
結果
図４Ａ及び図４Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化により誘導されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様にプロＴ細胞分化を受けることを示す。更に、図５Ａ及び図５Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化され得ることを示す。図６は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激時のＩＮＦγ発現によって実証されるように、Ｐｉｅｚｏ１活性化によって生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが機能性Ｔ細胞に分化することができることを示す。まとめると、これらの結果は、ＨＳＣ形成中のＰｉｅｚｏ１活性化がエクスビボで造血系統に更に分化するＨＳＣの能力を増強することを示す。
図４Ａ及び図４Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化により誘導されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが骨髄（ＢＭ）－ＨＳＣと同様にプロＴ細胞分化を受けることを示す。更に、図５Ａ及び図５Ｂは、Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣがＴ細胞分化を受け、ＢＭ－ＨＳＣと同様にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化され得ることを示す。図６は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる刺激時のＩＮＦγ発現によって実証されるように、Ｐｉｅｚｏ１活性化によって生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが機能性Ｔ細胞に分化することができることを示す。まとめると、これらの結果は、ＨＳＣ形成中のＰｉｅｚｏ１活性化がエクスビボで造血系統に更に分化するＨＳＣの能力を増強することを示す。
【0142】
図７Ａ及び図７Ｂは、ＣＤ１５＋及びＣＤ１１ｂ、好中球マーカーの存在（図７Ａ）によって、又は好中球からのミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の放出（図７Ｂ）によって同定されたように、分化したｉＰＳＣ（Ｄ８＋７ ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞、＋若しくは－Ｙｏｄａ１又は「Ｙ」）に由来するＨＳＣが好中球に分化することができることを示す。好中球への分化の点で、Ｄ８＋７ ｉＰＳＣ ＣＤ３４＋細胞はＤ８－ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞よりも優れている。
【0143】
図８Ａ及び図８Ｂは、分化したｉＰＳＣ（Ｄ８＋７ ｉＰＳＣ－ＣＤ３４、＋又は－Ｙｏｄａ１）に由来するＨＳＣから分化した好中球が、骨髄由来のＣＤ３４＋細胞から分化した好中球と同様の貪食活性を有することを示す。
【0144】
実施例３－ＨＬＡノックアウトＨＳＣにおける標的外編集の評価
不要な編集をチェックし、かつ主要な編集事象、例えば、欠失（複数可）が染色体６の他の領域内で生じないことを確実にするために、トリプルノックアウト（ＨＬＡ編集）ＨＳＣクローンのＨＬＡタイピングを実施した。ｇＲＮＡ標的外活性の程度を評価し、かつ非標的ＨＬＡ遺伝子に影響を及ぼす低いリスクを表すｇＲＮＡを選択するために、配列決定方法及び分析を実施した。
不要な編集をチェックし、かつ主要な編集事象、例えば、欠失（複数可）が染色体６の他の領域内で生じないことを確実にするために、トリプルノックアウト（ＨＬＡ編集）ＨＳＣクローンのＨＬＡタイピングを実施した。ｇＲＮＡ標的外活性の程度を評価し、かつ非標的ＨＬＡ遺伝子に影響を及ぼす低いリスクを表すｇＲＮＡを選択するために、配列決定方法及び分析を実施した。
【0145】
完全長Ｐ５配列決定アダプターを末端調製ＤＳＢにライゲーションすることによって、固定及び透過性細胞でインサイチュ切断標識を使用することによって、配列決定を実施した。ゲノムＤＮＡを抽出し、断片化し、末端調製し、化学的に修飾された半機能的Ｐ７アダプターを使用してライゲーションした。結果として得られるＤＮＡライブラリは、機能的ＤＳＢ標識断片（Ｐ５：Ｐ７）及び非機能的ゲノムＤＮＡ断片（Ｐ７：Ｐ７）の混合物を含有した。ＤＮＡライブラリの後続のＤＮＡ配列決定は、全ての無関係な非機能的ＤＮＡを排除して、ＤＮＡ標識断片を濃縮した。ライブラリ調製物がＰＣＲフリーであるため、得られた各配列決定リードは、細胞からの単一の標識ＤＳＢ末端と同等であった。これは、ＤＮＡ切断の読み出しを生成し、エラー訂正を必要とすることなく配列決定することによってゲノムＤＳＢの直接検出と定量化を可能にし、標的外変異の明確なリストのマッピングを可能にした。
【0146】
以下の表１は、野生型細胞に対する２つの代表的なクローンにおける編集方略の結果を要約する。
【表1】
【0147】
表２は、示されたＨＬＡ遺伝子の発現をノックアウトするために使用することができる実験で使用されるｇＲＮＡの非限定的な例を提供する。
【表2】
【0148】
結果は、編集方略が、他のＨＬＡ遺伝子に影響を及ぼすことなく、又は他の場所で主要な欠失を導入することなく、ＨＬＡ－Ａ、ＤＰＢ１、及びＤＱＢ１遺伝子を選択的に標的化することに成功したことを示す。
【0149】
これらの結果は、ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によるＨＬＡ編集クローンの表現型分析によって確認された。図９Ａ及び図９Ｂに示されるように、ＨＬＡ編集細胞は、野生型細胞のＨＬＡクラスＩ分子の全体的な発現と同等である、ＨＬＡクラスＩ分子の全体的な発現について検査で陽性であった。免疫蛍光を介したＨＬＡ－Ａの特異的発現は、ＨＬＡ－ＡがＨＬＡ編集細胞において発現されなかったことを確認し、遺伝子編集方略がＨＬＡ－Ａ遺伝子のみを欠失することに成功したという所見を裏付けた。具体的には、図９Ａは、ＨＬＡ編集細胞が全て、野生型（ＷＴ）（すなわち、非ＨＬＡ編集）細胞と同程度にＨＬＡのようなクラスＩについて陽性であったことを示す。この結果は、ＨＬＡ－Ａの欠失にもかかわらず、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのような他のクラスＩ分子が発現され、遺伝子編集方略の影響を受けなかったことを示す。
【0150】
ＨＬＡ－Ａ遺伝子が欠失したことを確認するために、ＨＬＡ－Ａの特異的発現を免疫蛍光で分析した。図９Ｂで見ることができるように、ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ編集クローンにおいて発現されず、遺伝子編集方略がＨＬＡ－Ａ遺伝子のみを特異的に欠失することに効率的であったことを示す。ＨＬＡ－Ａの欠失を伴う全体的なクラスＩ発現のそのような保存は、ＮＫ細胞媒介性拒絶反応を回避しながら、患者適合を促進するであろう。
【0151】
実施例４－ＨＬＡ編集ＨＳＣの多能性及び免疫適合性の評価
多能性を保存するＨＬＡ編集細胞の能力を評価した。図１０に示されるように、ＨＬＡ編集ｉＰＳＣクローンの免疫蛍光評価は、それらが３系統分化を維持したことを示し、外胚葉分化がＮＥＳＴＩＮ－４８８及びＰＡＸ６－５９４染色によって示され、中胚葉分化がＧＡＴＡ－４８８染色によって示され、内胚葉分化がＣＸＣＲ４－４８８及びＦＯＸ２Ａ－５９４染色によって示される。
多能性を保存するＨＬＡ編集細胞の能力を評価した。図１０に示されるように、ＨＬＡ編集ｉＰＳＣクローンの免疫蛍光評価は、それらが３系統分化を維持したことを示し、外胚葉分化がＮＥＳＴＩＮ－４８８及びＰＡＸ６－５９４染色によって示され、中胚葉分化がＧＡＴＡ－４８８染色によって示され、内胚葉分化がＣＸＣＲ４－４８８及びＦＯＸ２Ａ－５９４染色によって示される。
【0152】
ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面上で発現され、ＨＬＡクラスＩ分子がドナーとレシピエントとの間で不適合である場合、細胞が認識され、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって殺傷され得る。加えて、ＨＬＡ不適合は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）につながり得る。逆に、Ｂ２Ｍ ＫＯを介したＨＬＡ－Ｉ分子の完全な欠失は、細胞をＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の標的にするであろう。ＨＬＡ－Ａの欠失を伴う全体的なクラスＩ発現の保存は、ＮＫ細胞媒介性拒絶反応を回避しながら、患者適合を促進することができる。したがって、ＨＬＡ編集ＨＳＣの免疫適合性を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共培養によって試験して、免疫細胞がＨＬＡ編集及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）の移植片を拒絶するかどうかを評価した。
【0153】
野生型（ｇＨＳＣ）及びＨＬＡ編集ＨＳＣを、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃマーカーに適合するが不適合ＨＬＡ－Ａを有するＰＢＭＣと共培養した。ＨＬＡクラスＩ分子の発現を欠くＢ２Ｍ ＫＯ ＨＳＣ及びクラスＩＩ分子の発現を欠くＣＩＩＴＡ ＫＯ ＨＳＣを、それぞれ、ＨＬＡヌル及び不適合ＨＬＡについてＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性の程度を比較するために対照として使用した。図１１は、アネキシンＶ染色によって測定される共培養におけるＰＢＭＣ媒介性細胞毒性アッセイの結果を示す。結果は、ＨＬＡ編集ＨＳＣにおけるＨＬＡ－Ａの欠失が、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性から細胞を保護する一方で、ＷＴ、Ｂ２Ｍ ＫＯ、及びＣＩＩＴＡ ＫＯが、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性の影響を受けやすかったことを示す。同じＰＢＭＣドナーからの選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＨＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性からＨＬＡ編集及びＢ２Ｍ ＫＯ ＨＳＣを保護した。逆に、選別されたＮＫ細胞と共培養したＨＳＣは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性からＷＴ及びＨＬＡ編集細胞のみを保護した。
【0154】
要約すると、免疫適合性結果は、ＰＢＭＣ試料中に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞が不適合ＨＬＡ分子（ＷＴ及びＣＩＩＴＡ ＫＯ）を有する細胞を殺傷することに関与した一方で、ＰＢＭＣ中に存在するＮＫ細胞がＨＬＡヌル細胞（Ｂ２Ｍ ＫＯ）を殺傷することに関与したことを示す。しかしながら、ＨＬＡ編集ＨＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性から保護され（不適合ＨＬＡ－Ａがノックアウトされていたため）、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性から保護される（ＨＬＡクラスＩ分子発現が大部分は保存されたため）。
【0155】
実施例５－ＨＬＡ編集ＨＳＣのインビボ生着能の評価
ＨＬＡ編集ＨＳＣの生着能を評価するために、インビボで生着する細胞の能力を、ＷＴ ＨＳＣに対する競合的移植によって評価した。等しい割合のｍＣｈｅｒｒｙ ＨＬＡ編集ＨＳＣ及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）を混合し、マウスに移植し、骨髄（ＢＭ）及び末梢血試料を回収し、ＦＡＣＳによって評価して、試料中に存在する各細胞型の相対量を比較した。図１２に示されるように、ＨＬＡ編集ＨＳＣ及びＷＴ ＨＳＣの両方が、ＢＭ及び末梢血試料におけるほぼ等しい生着に寄与した。これらの結果は、ＨＬＡ編集ＨＳＣ（本開示に従って調製される）が、それらの生着及び再構築能においてＷＴ ＨＳＣと同等であることを確認する。したがって、ＷＴ（未編集、親）ＨＳＣの特性は、Ｔ細胞系統を生成するために本開示のＨＬＡ編集ＨＳＣの特性と一致することが予期される。
ＨＬＡ編集ＨＳＣの生着能を評価するために、インビボで生着する細胞の能力を、ＷＴ ＨＳＣに対する競合的移植によって評価した。等しい割合のｍＣｈｅｒｒｙ ＨＬＡ編集ＨＳＣ及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）を混合し、マウスに移植し、骨髄（ＢＭ）及び末梢血試料を回収し、ＦＡＣＳによって評価して、試料中に存在する各細胞型の相対量を比較した。図１２に示されるように、ＨＬＡ編集ＨＳＣ及びＷＴ ＨＳＣの両方が、ＢＭ及び末梢血試料におけるほぼ等しい生着に寄与した。これらの結果は、ＨＬＡ編集ＨＳＣ（本開示に従って調製される）が、それらの生着及び再構築能においてＷＴ ＨＳＣと同等であることを確認する。したがって、ＷＴ（未編集、親）ＨＳＣの特性は、Ｔ細胞系統を生成するために本開示のＨＬＡ編集ＨＳＣの特性と一致することが予期される。
【0156】
実施例６－ＨＬＡ編集ＨＳＣのＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞への分化
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＨＬＡ－ＩＩ分子を介して抗原をヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、更に抗原特異的ＣＴＬに発展する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を促進する。同様に、ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面に発現し、細胞内のタンパク質のペプチド断片をＣＤ８＋ＣＴＬに提示する。ＣＴＬは、細胞表面に発現するＨＬＡ－Ｉ－ペプチド複合体の認識時に、標的（感染）細胞の細胞傷害性殺傷を誘導する。したがって、ＨＬＡ－Ａの欠失が編集ＨＳＣのクラスＩペプチドの提示に影響を及ぼすかを決定するための研究を行った。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、イムノペプチドーム分析は、ＨＬＡ－Ａの欠失が全体的なクラスＩペプチドの提示に影響を及ぼさないことを示す。ＨＬＡ－Ａ編集細胞は、野生型（ＨＬＡが編集されていない）ＨＳＣと比較して同等のペプチド及びタンパク質提示を示した。更に、図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失は、ＨＳＣから分化したマクロファージによる全体的なクラスＩＩペプチド提示に影響を及ぼさない。まとめると、これらのデータは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＰ分子の欠失にもかかわらず、細胞（及びそれらの誘導系統）が広範囲のクラスＩ及びクラスＩＩのペプチドを提示する能力を保存することを示唆する。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＨＬＡ－ＩＩ分子を介して抗原をヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、更に抗原特異的ＣＴＬに発展する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の生成を促進する。同様に、ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面に発現し、細胞内のタンパク質のペプチド断片をＣＤ８＋ＣＴＬに提示する。ＣＴＬは、細胞表面に発現するＨＬＡ－Ｉ－ペプチド複合体の認識時に、標的（感染）細胞の細胞傷害性殺傷を誘導する。したがって、ＨＬＡ－Ａの欠失が編集ＨＳＣのクラスＩペプチドの提示に影響を及ぼすかを決定するための研究を行った。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、イムノペプチドーム分析は、ＨＬＡ－Ａの欠失が全体的なクラスＩペプチドの提示に影響を及ぼさないことを示す。ＨＬＡ－Ａ編集細胞は、野生型（ＨＬＡが編集されていない）ＨＳＣと比較して同等のペプチド及びタンパク質提示を示した。更に、図１４Ａ及び図１４Ｂに示されるように、ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失は、ＨＳＣから分化したマクロファージによる全体的なクラスＩＩペプチド提示に影響を及ぼさない。まとめると、これらのデータは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＰ分子の欠失にもかかわらず、細胞（及びそれらの誘導系統）が広範囲のクラスＩ及びクラスＩＩのペプチドを提示する能力を保存することを示唆する。
【0157】
実施例７－抗原媒介性免疫応答のインビボ試験。
図１５は、抗原提示の感作段階及び誘発段階を示す、遅延型過敏症反応の概略図である。簡潔に述べると、抗原注入時に、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処理し、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＡＰＣ表面に提示する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチド－ＭＨＣを認識する。抗原曝露時に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が活性化され、サイトカインが組織腫脹を誘導するマクロファージ及び他の免疫細胞を動員する。
図１５は、抗原提示の感作段階及び誘発段階を示す、遅延型過敏症反応の概略図である。簡潔に述べると、抗原注入時に、抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって処理し、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＡＰＣ表面に提示する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチド－ＭＨＣを認識する。抗原曝露時に、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞が活性化され、サイトカインが組織腫脹を誘導するマクロファージ及び他の免疫細胞を動員する。
【0158】
遅延型過敏症アッセイを移植マウスに行った。具体的には、マウスを抗原としてヒツジ赤血球の皮下注射によって感作した。マウスが機能的免疫系を有する場合、ＡＰＣが抗原を処理し、ペプチド抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。次に、マウスの左足に同じ抗原を皮下注射によって投与した。この時点で、Ｔ細胞が活性化され、組織腫脹を引き起こす抗原注射部位でマクロファージ及び他の免疫細胞を動員するサイトカインを分泌する。このアッセイでは、機能的免疫系が、マイクロキャリパーで測定された左足の腫脹をもたらした。
【0159】
図１６Ａ及び図１６Ｂで見ることができるように、対照（移植されていない）マウスは、免疫不全であるため、左足の腫脹を示さなかった。逆に、臍帯血ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスは、組織の腫脹を示し、左足の直径を倍増した。同様の免疫系応答が、ＷＴ（非編集ＨＳＣ）を移植したマウス及びＨＬＡ編集ＨＳＣを移植したマウスの両方で見られた。
【0160】
実施例８：ＨＬＡ編集ＨＳＣの造血系統、前単球／マクロファージ細胞への分化
ＨＬＡ欠失が異なるタイプの免疫細胞に分化するＨＳＣの能力に影響を及ぼすかを決定するための実験を行った。本質的に実施例２に記載されるプロセスを使用して、ＨＬＡ編集ＨＳＣを前単球／マクロファージ細胞に分化させた。ＨＬＡ編集ＨＳＣが、それらのＣＤ１１ｂ＋－ＣＤ１４＋発現によって測定されたように、ＷＴ（非ＨＬＡ編集）ＨＳＣと同等の単球／マクロファージ系統に分化することができたと決定された（図１７Ａ）。更に、ＣＤ１１ｂ＋－ＣＤ１４＋にゲート設定した集団は同等のＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ発現を示し（図１７Ｂ）、ＨＬＡ編集ＨＳＣがクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子の両方の全体的な発現を保存することも示した。
ＨＬＡ欠失が異なるタイプの免疫細胞に分化するＨＳＣの能力に影響を及ぼすかを決定するための実験を行った。本質的に実施例２に記載されるプロセスを使用して、ＨＬＡ編集ＨＳＣを前単球／マクロファージ細胞に分化させた。ＨＬＡ編集ＨＳＣが、それらのＣＤ１１ｂ＋－ＣＤ１４＋発現によって測定されたように、ＷＴ（非ＨＬＡ編集）ＨＳＣと同等の単球／マクロファージ系統に分化することができたと決定された（図１７Ａ）。更に、ＣＤ１１ｂ＋－ＣＤ１４＋にゲート設定した集団は同等のＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ発現を示し（図１７Ｂ）、ＨＬＡ編集ＨＳＣがクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子の両方の全体的な発現を保存することも示した。
【0161】
編集ＨＳＣによって支援されるＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１における他のクラスＩＩ分子の全体的な発現を、ＨＳＣから分化したマクロファージにおける発現を評価することによって評価した。本研究の設計を図１８Ａに概略的に示す。ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の欠失が他のＨＬＡクラスＩＩ分子の発現に影響を及ぼさなかったことが見出された（図１８Ｂ）。例えば、ＨＬＡ－ＤＲは、ＷＴ及びＨＬＡ編集細胞の両方で同等に発現する（図１８Ｃ）。図１８Ｂ及び図１８Ｃでは、ＣＩＩＴＡ－ＫＯは陽性対照である。
【0162】
参考文献
１．Ｎｉａｎｉａｓ，Ａ．＆ Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ｉＰＳＣ）－－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ １４，２６１－２６８（２０１９）．
２．Ｂｒａｕｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．，Ｘｈｉｋｕ，Ｓ．＆ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖｅｒｉｔａｓ Ｅｓｔ？Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７，８８９－９０１（２０１６）．
３．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｍａｒｋｓ ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２）．
４．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．，Ａｗｏｎｇ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．＆ Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５５４－５６１（２０１４）．
５．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｗ．，Ｌａｉ，Ｙ．－Ｓ．，Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．＆ Ｔｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．Ｂｒｏａｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，（２０１４）．
６．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，１１４－１２６（２０１３）．
７．Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，９２８－９３３（２０１３）．
８．Ｖｉｚｃａｒｄｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｍａｔｕｒｅ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，３１－３６（２０１３）．
９．Ｍｏｎｔｅｌ－Ｈａｇｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇａｎｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２４，３７６－３８９．ｅ８（２０１９）．
１０．Ｇｕｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，２１－３３（２０２０）．
１１．Ｎａｇａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣ Ｃｌｏｎｅｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６，１２６－１３５（２０２０）．
１２．Ｉｒｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣｓ ｆｏｒ ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １２，４３０（２０２１）．
１．Ｎｉａｎｉａｓ，Ａ．＆ Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ｉＰＳＣ）－－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ １４，２６１－２６８（２０１９）．
２．Ｂｒａｕｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．，Ｘｈｉｋｕ，Ｓ．＆ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｉｓ：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｖｅｒｉｔａｓ Ｅｓｔ？Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７，８８９－９０１（２０１６）．
３．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｍａｒｋｓ ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２，１７２２－１７３５（２０１２）．
４．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．，Ａｗｏｎｇ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．＆ Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２，５５４－５６１（２０１４）．
５．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｗ．，Ｌａｉ，Ｙ．－Ｓ．，Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．＆ Ｔｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．Ｂｒｏａｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，（２０１４）．
６．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｏ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，１１４－１２６（２０１３）．
７．Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，９２８－９３３（２０１３）．
８．Ｖｉｚｃａｒｄｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｍａｔｕｒｅ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２，３１－３６（２０１３）．
９．Ｍｏｎｔｅｌ－Ｈａｇｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇａｎｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２４，３７６－３８９．ｅ８（２０１９）．
１０．Ｇｕｏ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｇｕｉｄｉｎｇ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，２１－３３（２０２０）．
１１．Ｎａｇａｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣ Ｃｌｏｎｅｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １６，１２６－１３５（２０２０）．
１２．Ｉｒｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ａｎｄ ｓｃａｌａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｉＰＳＣｓ ｆｏｒ ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １２，４３０（２０２１）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【配列表】
【国際調査報告】