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特表2025-533908多能性幹細胞由来の巨核球及び血小板

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-10-09

(54)【発明の名称】多能性幹細胞由来の巨核球及び血小板

(51)【国際特許分類】

C12N 5/078 20100101AFI20251002BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20251002BHJP

A61P 7/04 20060101ALI20251002BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20251002BHJP

A61K 35/19 20150101ALI20251002BHJP

【ＦＩ】

C12N5/078 ZNA

C12N5/10

A61P7/04

A61P7/00

A61K35/19

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025520027

(86)(22)【出願日】2023-10-05

(85)【翻訳文提出日】2025-05-07

(86)【国際出願番号】 US2023076102

(87)【国際公開番号】W WO2024077153

(87)【国際公開日】2024-04-11

(31)【優先権主張番号】63/413,337

(32)【優先日】2022-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】525128397

【氏名又は名称】ガルーダセラピューティクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】シャー，ドゥヴァニット

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065BA30

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB38

4C087NA14

4C087ZA53

(57)【要約】

本開示は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から巨核球及び／又は血小板を生成するための効率的なエクスビボプロセスを提供する。様々な実施形態において本開示に従って生成される細胞及び血小板は、機能的であり、かつ／又は末梢血、骨髄、若しくは他の組織から単離された対応する系統により密接に類似している。いくつかの態様における本発明は、本明細書に開示される方法によって産生される単離された細胞／血小板及び組成物、並びに治療のための方法を提供する。
【選択図】図１２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

巨核球を含む細胞集団を調製するための方法であって、
分化した多能性幹細胞（ＰＳＣ）の集団からＣＤ３４＋細胞を濃縮して、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、
前記ＣＤ３４＋濃縮集団の内皮・造血転換（ＥＨＴ）を誘導して、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む集団を調製し、任意選択的に、内皮・造血転換を受ける細胞を採取することと、
前記ＨＳＣ集団を巨核球に分化させ、任意選択的に、血小板を形成することと、を含む、方法。

【請求項2】

ＥＨＴが、少なくとも２日かつ１２日以下にわたって誘導される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団が、非接着細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＰＳＣ集団が、リンパ球、臍帯血細胞、末梢血単核細胞、ＣＤ３４＋細胞、又はヒト一次組織に由来するヒトｉＰＳＣ集団である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ｉＰＳＣ集団が、末梢血から単離されたＣＤ３４＋濃縮細胞に由来する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの遺伝子についてホモ接合性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記ｉＰＳＣが、１つ以上のＨＬＡクラスＩ遺伝子を欠失し、１つ以上のクラスＩＩ遺伝子を欠失し、かつ／又はＨＬＡ若しくはＭＨＣの発現能力若しくは提示能力を支配する１つ以上の遺伝子を欠失するように遺伝子編集されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ａの欠失を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－ＤＰＢ１及び／又はＨＬＡ－ＤＱＢ１の欠失を含む、請求項９又は１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ｉＰＳＣが、ＨＬＡ－Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、ＨＬＡ－ＤＰＢ１^ｎｅｇ、並びにＨＬＡ－ＤＱＢ１^ｎｅｇであり、任意選択的に、ＨＬＡ－ＤＲＢ１についてホモ接合性である、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＨＬＡ又はＭＨＣの発現能力又は提示能力を支配する１つ以上の遺伝子が、β２－ミクログロブリン及び／又はＣＩＩＴＡである、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

ＣＤ３４＋濃縮及び内皮・造血転換が、ｉＰＳＣ分化の８日目～１５日目に誘導される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記内皮・造血転換が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、ＨＳＣ集団を生成する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋の浮遊細胞及び／又は接着細胞の採取を含む、内皮・造血転換を受ける培養物から採取される、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団が、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項18】

前記内皮・造血転換の誘導が、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記内皮・造血転換の誘導が、前記ＣＤ３４濃縮細胞に周期的伸張を適用することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記周期的伸張が、２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ周期的伸張である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記内皮・造血転換の誘導が、Ｐｉｅｚｏ１活性化を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｐｉｅｚｏ１活性化が、前記ＣＤ３４＋濃縮細胞又はその画分を、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、又はそれらの類似体若しくは誘導体、あるいは一本鎖ＲＮＡアゴニストから任意選択的に選択される１つ以上のＰｉｅｚｏ１アゴニストと接触させることによるものである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｐｉｅｚｏ１アゴニストの有効量が、０．１～５００μＭの範囲内、又は０．１～１００μＭの範囲内である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記内皮・造血転換の誘導が、Ｔｒｐｖ４活性化を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｔｒｐｖ４活性化が、前記ＣＤ３４＋濃縮細胞を、ＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４α－ＰＤＤ、又はそれらの類似体若しくは誘導体から任意選択的に選択される１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団を巨核球に分化させるステップが、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と培養することを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団を巨核球に分化させる前記ステップが、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１、及びＰＤＧＦ－ＢＢから選択される１つ以上の追加のサイトカイン又は成長因子と培養することを更に含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記巨核球を増殖させるステップを更に含み、任意選択的に、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、任意選択的に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－６、ＩＬ－９、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）から選択される１つ以上の追加のサイトカイン又は成長因子と培養することである、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

任意選択的に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－６、及びＩＬ－９のうちの１つ以上と培養することによって、前記巨核球の成熟を促進するステップを更に含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記巨核球の成熟を促進する前記ステップが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及び／又はＩＬ－８の存在下で培養することを含まない、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前血小板及び血小板が、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１）の存在下での培養によって前記巨核球から形成される、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

巨核球又は前血小板が、前記細胞に流体力学的せん断応力を受けさせるバイオリアクター内で培養される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記血小板が、トロンビンによって活性化可能である、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項34】

請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法によって調製される血小板と、担体と、を含む、組成物。

【請求項35】

５０ｍＬの体積当たり少なくとも約１０^９個の血小板、又は少なくとも約１０^１０個の血小板、又は少なくとも約１０^１１個の血小板、又は少なくとも約１０^１２個の血小板を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項36】

血小板輸血を必要とする対象を治療する方法であって、請求項３４又は３５に記載の血小板組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項37】

前記対象が、血小板減少症を有する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記対象が、橈尺骨癒合症を伴う無巨核球性血小板減少症、ＡＮＫＲＤ２６関連血小板減少症、常染色体優性血小板減少症、先天性無巨核球性血小板減少症、ＣＹＣＳ関連血小板減少症、ＦＹＢ関連血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、又はＸ連鎖性血小板減少症を有する、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記対象が、出血を経験している、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、２０２２年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６３／４１３，３３７号の利益及び優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＸＭＬ形式で提出されており、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２３年９月２６日に作成された当該ＸＭＬコピーは、ＧＲＵ－０１３ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌという名称であり、サイズが３０，０４８バイトである。

【背景技術】

【0003】

生理学的止血、血栓形成、及び創傷治癒において主要な役割を果たすだけでなく、血小板は、宿主の炎症並びに感染及び傷害に対する免疫応答にも大きく寄与することができる。造血疾患を有するか、又は積極的な化学療法を受けている多くの患者は、献血／血小板献血を通して得られる血小板濃縮物を使用する血小板輸血を必要とする。しかしながら、例えば、血液製剤、特に血小板の需要が頻繁に供給を上回るにつれて、献血産業が継続的な危機に直面しているため、ボランティア献血者から得られる輸血用の血小板は、限られた資源である。したがって、造血幹細胞（ＨＳＣ）由来のものなどの大規模な市販の巨核球及び／又は血小板の開発は、再生医療における魅力的なツールである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、様々な態様及び実施形態では、巨核球・赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、ＣＦＵ－Ｍｅ（多能性造血幹細胞又は血球芽細胞）、巨核芽球、前巨核球、及び巨核球などの巨核球系統、並びにそれらに由来する前血小板、前駆血小板、又は血小板を含む、細胞療法のための造血系統を生成するための方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、遺伝子編集されたｉＰＳＣを含む、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から巨核球及び／又は血小板を開発するための効率的なエクスビボプロセスを提供する。様々な実施形態において本開示に従って生成される巨核球及び／又は前血小板、前駆血小板、若しくは血小板は、機能的であり、かつ／あるいは骨髄若しくは血液から単離された対応する天然系統、又は血液から単離された対応する天然血小板により密接に類似している。本発明はまた、本明細書に開示される方法によって産生される単離された細胞及び組成物、並びに治療のための方法を提供する。

【0005】

他の態様及び実施形態では、本開示は、集団のかなりの部分と免疫適合性であるように遺伝子編集されているｉＰＳＣに由来するＨＳＣを提供する。これらのＨＳＣ集団は、より効率的なエクスビボ血小板産生のために使用することができるか、あるいは他の態様では、定期的輸血の必要性を低減又は排除する必要がある患者に、ＨＳＣ、又は巨核球、血小板、若しくはそれらの前駆細胞を送達するために使用することができる。

【0006】

一態様では、本開示は、巨核球を含む細胞集団を調製するための方法を提供する。本開示の巨核球は、機能的な血小板を更に生成することが可能である。本開示の方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を濃縮して、それによって、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、を含む。内皮・造血転換（ＥＨＴ）が、ＣＤ３４＋濃縮集団において誘導され、それによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む集団を調製する。結果として得られる細胞集団（又はその画分）を巨核球に分化させ、任意選択的に血小板を産生するために使用することができる。

【0007】

様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞を再プログラミングすることによって調製される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、レシピエント（本明細書に記載される治療を必要とする対象）に対して自家又は同種異系である（例えば、１つ以上の遺伝子座においてＨＬＡ適合である）。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ適合を支援するように遺伝子編集することができる。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を欠失し、かつＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を欠失するように遺伝子編集することができる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩの複合体の発現を保持する。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの保持されたクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１^ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１^ｎｅｇであるように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１について更にホモ接合性である。

【0008】

様々な実施形態では、ｉＰＳＣが調製され、培養系を使用して増殖される。増殖したｉＰＳＣは、培養物から回収し、胚様体（ＥＢ）を生成するために使用することができる。ｉＰＳＣの分化によって生成されるＥＢは、ｉＰＳＣの三次元凝集体であり、分化方法（複数可）に基づいて３つ（又は代替的に２つ若しくは１つ）の胚性生殖細胞層を含む。いくつかの実施形態では、各態様によるプロセスは、多能性幹細胞（例えば、ＥＢ）からＣＤ３４＋細胞を生成し、内皮・造血転換を誘導することを含むことができる。ＨＳＣは、機械的、生化学的、代謝的、及び／又は局所的刺激、並びに細胞外基質、ニッチ因子、細胞外因性因子などの因子、細胞内因性特性の誘導を含み、かつ薬理学的及び／又は遺伝的手段を含む、様々な刺激又は因子を使用して、細胞集団から生成することができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、細胞が少なくとも約２０％のＣＤ３４＋又は少なくとも約３０％のＣＤ３４＋になるまで進行する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４濃縮及びＥＨＴは、ｉＰＳＣ分化の７日目～１４日目に誘導され得る。ｉＰＳＣの分化は、公知の技術によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、ｂＦＧＦ、Ｙ２７６３２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、及び／又はＩＧＦ－１の組み合わせなどであるがこれらに限定されない、因子を伴う。

【0010】

ＥＨＴの誘導は、任意の公知のプロセスを用いたものであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝的手段を使用して（例えば、刺激、阻害、及び／又は遺伝子組換えを介して）、内皮又は造血内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を通してＨＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、幹細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、培養物中で約５日～約７日間誘導される。実施形態では、ＥＨＴは、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含む培地を使用して行われる。培地は、任意選択的に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化剤、Ｗｎｔ経路活性化剤、又はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、チアゾビビン若しくはＹ２７６３２）のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ及び／若しくはＨＳＰＣ集団又はその画分は、Ｙｏｄａ１などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用とは無関係に分化される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニスト（例えば、Ｙｏｄａ１）の使用は、任意選択的である。

【0011】

様々な実施形態では、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化が、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＣＤ３４＋濃縮細胞）に適用される。ある特定の実施形態では、薬理学的Ｐｉｅｚｏ１活性化は、ｉＰＳＣ、胚様体、ＥＣ、造血内皮細胞（ＨＥＣ）、ＨＳＣ、造血前駆細胞、並びに血小板の生成に関与する巨核球系統を含む造血系統（複数可）に更に適用され得る。ある特定の実施形態では、Ｐｉｅｚｏ１活性化は、少なくとも、ｉＰＳＣから生成されるＥＢ及び／又はＥＢから単離されるＣＤ３４＋細胞に適用され、これは、様々な実施形態によれば、ＥＨＴを誘導するための他の方法と比較して、巨核球の優れた生成を可能にする。

【0012】

様々な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（例えば、浮遊細胞及び／又は接着細胞）が、１２日目～１７日目などのｉＰＳＣ分化の１０日目～２０日目に内皮・造血転換を受ける培養物から採取される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、非接着細胞を含む。様々な実施形態では、ＨＳＣ又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、更に増殖される。

【0013】

巨核球及び／又は血小板を生じるＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣは、ＣＤ３４の発現マーカー及び系統特異的マーカー（Ｌｉｎ－と称される）の非存在に基づいて同定することができる。いくつかの実施形態では、造血系統への分化のための幹細胞集団は、少なくとも約８０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９５％のＣＤ３４^＋である。

【0014】

様々な実施形態では、ＨＳＣ及び／若しくはＨＳＰＣ集団又はその画分は、エクスビボで巨核球に分化され、それから血小板を生成することができる。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団を巨核球に分化させるステップは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）と培養することを含む。培養物は、ＩＬ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＳＤＦ－１、及びＰＤＧＦ－ＢＢから選択されるものなどの１つ以上の追加のサイトカイン又は成長因子を更に含み得る。ＴＰＯを含むサイトカイン及び成長因子を選択して、巨核球を更に増殖させることができる。いくつかの実施形態では、巨核球を増殖させるためのそのような追加のサイトカイン又は成長因子は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－６、ＩＬ－９、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）から選択され得る。

【0016】

成熟巨核球は、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）の存在下での培養などによって、当該技術分野で公知であるように前血小板及び血小板を形成することができる。いくつかの実施形態では、巨核球又は前血小板は、細胞に流体力学的せん断応力を受けさせるバイオリアクター内で培養される。例えば、血小板は、静的２Ｄ、無血清、サイトカイン依存性条件で産生することができる。代替的に、血小板は、三次元（３Ｄ）微小環境で産生することができる。様々な実施形態では、血小板は、ＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋である表現型を有するであろう。回収された血小板は、トロンビンによって活性化可能である。血小板は、回収し、輸血療法の前にガンマ線照射を受けることができる。

【0017】

本開示の組成物（例えば、本開示に従って調製される血小板を含む）は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。そのような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加剤を含有することができる。細胞又は血小板組成物は、埋込型デバイス（例えば、足場）内、又はバッグ内、又はバイアル、チューブ、若しくは容器内に適切な体積で提供され、使用まで凍結保存され得る。様々な実施形態では、本組成物は、５０又は１００ｍＬの体積当たり少なくとも約１０^９個の血小板、又は少なくとも約１０^１０個の血小板、又は少なくとも約１０^１１個の血小板、又は少なくとも約１０^１２個の血小板を含む。

【0018】

他の態様では、本発明は、血小板（本明細書に記載されるように調製される）又はその薬学的に許容される組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、血小板療法のための方法を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＡＣＴＮ１関連血小板減少症、橈尺骨癒合症を伴う無巨核球性血小板減少症、ＡＮＫＲＤ２６関連血小板減少症、常染色体優性血小板減少症、先天性無巨核球性血小板減少症、ＣＹＣＳ関連血小板減少症、ＦＹＢ関連血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、又はＸ連鎖性血小板減少症などの血小板減少症を有する対象を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、血小板は、出血を経験している対象に投与される。

【0019】

本開示の他の態様及び実施形態が、以下の詳細な開示及び実施例から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が多能性に影響を及ぼさないことを示す。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現するためのアデノウイルスベクターを用いたｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。ＥＴＶ２過剰発現は、ＴＲＡ－１－６０幹細胞性マーカーの発現によって示されるように、ｉＰＳＣ幹細胞性に影響を及ぼさない。

【図2】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）が造血内皮細胞の収率を増加させることを示す。造血内皮細胞（ＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋として記載される）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化は、ＥＴＶ２－ＯＥが造血内皮細胞の形成を増強することを実証する。

【図3】ＥＴＶ２過剰発現（ＯＥ）がｉＰＳＣ分化中にＣＤ３４＋細胞形成を増強することを示す。ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化は、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増強することを実証する。

【図4】巨核球系統へのＨＳＣの関与を示す、巨核球分化のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5】ｉＰＳＣ由来のＨＳＣに由来する巨核球細胞がエクスビボで増殖が可能であることを示す。

【図6】導出された巨核球がＢＭＣＤ３４＋由来の巨核球に表現型的に類似し、血小板を放出することができることを示す、ｉＰＳＣ由来のＨＳＣの血小板分化の免疫蛍光分析を示す。

【図7】ｉＰＳＣ由来のＨＳＣから産生される血小板が、活性化されると凝固し、血栓形成を促進することができることを示す、これらの血小板による血栓形成を示す。

【図8A】ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によって実施されるＨＬＡ編集（例えば、トリプルノックアウト）細胞の表現型分析を示す。ＨＬＡ編集細胞が野生型細胞と同様の程度に全体的なＨＬＡクラスＩ発現について陽性である、細胞表面上のＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃ）の全体的な発現を示す。

【図8B】ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によって実施されるＨＬＡ編集（例えば、トリプルノックアウト）細胞の表現型分析を示す。ＨＬＡ－ＡがＨＬＡ編集クローンにおいて発現されない、免疫蛍光を介したＨＬＡ－Ａの細胞発現を示す。

【図9】外胚葉分化がＮＥＳＴＩＮ－４８８及びＰＡＸ６－５９４染色によって示され、中胚葉分化がＧＡＴＡ－４８８染色によって示され、内胚葉分化がＣＸＣＲ４－４８８及びＦＯＸ２Ａ－５９４染色によって示される、免疫蛍光によって例証されるように、ＨＬＡ編集クローンがその多能性を保持する（３系統分化を維持する）ことを示す。

【図10】ＨＬＡ編集ＨＳＣの免疫適合性を示す。ＨＬＡ編集ＨＳＣ及び対照ＨＳＣ（ＷＴ、Ｂ２ＭＫＯ、及びＨＬＡクラスＩＩヌル）を、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃに適合するが不適合ＨＬＡ－Ａを有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養し、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性をアネキシンＶ染色アッセイによって測定した。

【図11】ＨＬＡ編集ＨＳＣのインビボ生着能を示す。等しい割合のｍＣｈｅｒｒｙＨＬＡ編集ＨＳＣ及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）をマウスへの競合的移植のために混合し、骨髄（ＢＭ）及び末梢血試料をＦＡＣＳによって評価して、試料中に存在する各細胞型の相対量を比較した。

【図12】ＨＬＡ編集ＨＳＣが巨核球（ＭＫ）に分化することができ、これらが血小板に更に分化することができることを示す。左側の画像は、１０００倍の倍率での光学顕微鏡検査によるＨＳＣ中の血小板の割合の増加を示す。右側のグラフは、分化したｉＰＳＣ（例えば、ＥＢ）から単離された骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４＋細胞集団から分化したものと比較して、ＨＬＡ編集ＨＳＣから分化した血小板の割合の統計的に有意な増加を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

「ｇＨＳＣ」という用語は、本開示のｉＰＳＣ由来の造血幹細胞を指すために本明細書で使用される。

【0022】

「野生型」（ＷＴ）、「未編集」、「非ＨＬＡ編集」という用語は、本開示の非遺伝子編集細胞を指すために本明細書で同義的に使用される。

【0023】

ＥＢ３４＋細胞は、胚体由来のＣＤ３４＋細胞を指す。これらは、造血内皮細胞を含む。

【0024】

【0025】

【0026】

本開示の態様及び実施形態によれば、本質的に無制限の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を産生するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の能力は、順に前血小板及び血小板を放出する巨核球を生じる治療用系統を含むがこれらに限定されない、造血細胞の無限の供給を生成するために活用される。ボランティア献血者が限られた資源であるため、治療における血小板の使用は制限されている。ドナー由来の血小板を室温で貯蔵しなければならないため、それらの保存可能期間は約５日に制限され、それらは、貯蔵中に細菌の増殖を起こしやすく、ドナー由来のバッチ間の一貫性に欠ける。更に、血小板輸血は、しばしば、アレルギー反応及び発熱性非溶血反応を含むレシピエントへのいくつかのリスクに関連する。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，ＲｉｃｈａｒｄＭ．，ｅｔａｌ．”Ｐｌａｔｅｌｅｔｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ：ａｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅｇｕｉｄｅｌｉｎｅｆｒｏｍｔｈｅＡＡＢＢ．”ＡｎｎａｌｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ１６２，ｎｏ．３（２０１５）：２０５－２１３を参照されたい。更に、一次細胞と比較して、ｈｉＰＳＣは、インビトロでより容易に遺伝子組換えを受け、それによって、細胞／血小板数を改善する機会を提供するとともに、例えば、ＨＬＡ適合問題を回避することができる。加えて、完全に操作されたｈｉＰＳＣクローンは、一次細胞と比較して、安定かつ安全な供給源として機能することができる。更に、ｈｉＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）とは異なり、非胚性起源であるため、倫理的懸念もなく、品質が一貫している。したがって、本開示によるｈｉＰＳＣの使用は、巨核球及び血小板（その前駆細胞を含む）を含む巨核球系統などの治療用造血系統を生成するために、一次細胞と比べていくつかの利点をもたらす。

【0027】

一態様では、本開示は、巨核球を含む細胞集団を調製するための方法を提供する。本開示の巨核球は、機能的な血小板を更に生成することが可能である。本開示の方法は、胚様体に分化した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）集団などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）集団を調製することと、ＣＤ３４＋細胞を濃縮して、それによって、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製することと、を含む。内皮・造血転換（ＥＨＴ）が、ＣＤ３４＋濃縮集団において誘導され、それによって、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血幹前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む集団を調製する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団から濃縮される。様々な実施形態では、ＥＨＴは、少なくとも２日間かつ最大１２日間誘導される。結果として得られる細胞集団（又はその画分）は、巨核球に分化させ、任意選択的に血小板を産生するために使用することができる。

【0028】

従来、造血系統は、８日目までｉＰＳＣを胚様体に分化させて、ＣＤ３４＋細胞を採取することによって調製される。ＣＤ３４は、造血内皮細胞、造血幹細胞、及び造血前駆細胞のマーカーとして一般的に使用される。本開示の態様及び実施形態によれば、ｉＰＳＣ胚様体に由来し得るＣＤ３４＋細胞集団の内皮・造血転換（ＥＨＴ）を誘導することは、機能的な血小板を生成することが更に可能である、巨核球系統などの優れた造血幹細胞及び造血系統のエクスビボ生成に使用することができることが発見されている。

【0029】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＥＢ解離から回収される）は、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストとしては、Ｙｏｄａ１、Ｊｅｄｉ１、及びＪｅｄｉ２、又はそれらの類似体が挙げられる。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｔｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストは、ＧＳＫ１０１６７９０Ａである。ＥＨＴを誘導するための他の様式を（代替的に、又は加えて）使用することができ、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＥＨＴを誘導した後、細胞（ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む集団）は、巨核球系統、例えば、血小板を生成又は分泌することが可能である巨核球を含む細胞集団に分化される。

【0030】

様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、体細胞を再プログラミングすることによって調製される。「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」という用語は、胚様多能性状態に戻って再プログラミングされている皮膚又は血液細胞などの体細胞に由来する細胞を指す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、（限定されないが）線維芽細胞又はＰＢＭＣ（若しくはそれから単離された細胞）などの体細胞から生成される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、リンパ球、顆粒球／マクロファージ系統制限前駆細胞（ＧＭＰ）、臍帯血細胞、ＰＢＭＣ、ＣＤ３４＋細胞、又は他のヒト一次組織に由来する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞に由来する。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、レシピエント（本明細書に記載される治療を必要とする対象）に対して自家又は同種異系である（例えば、１つ以上の遺伝子座においてＨＬＡ適合である）。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ適合を支援するように遺伝子編集すること（β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＣＩＩＴＡなどを含むがこれらに限定されない、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／若しくはＨＬＡクラスＩＩの対立遺伝子又はそれらのマスター調節因子の欠失など）、又は他の機能を欠失若しくは発現するように遺伝子編集することができる。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうちの１つ以上を欠失し、かつＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を欠失するように遺伝子編集することができる。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ及び少なくとも１つのＨＬＡクラスＩＩの複合体の発現を保持する。ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、少なくとも１つの保持されたクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子座についてホモ接合性である。

【0031】

様々な実施形態では、ＨＳＣ及び巨核球系統細胞は、（ｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ＋、（ｉｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ＋ＤＲ＋ＤＱ－、（ｉｉｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ＋Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ－、（ｉｖ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ＋、（ｖ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ＋ＤＲ＋ＤＱ－、（ｖｉ）ＨＬＡ－Ａ－Ｂ－Ｃ＋ＤＰ－ＤＲ＋ＤＱ－のうちの１つであるように遺伝子編集されているｉＰＳＣに由来する。保持されたＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲ）については、細胞は、ホモ接合性であり得るか、又は遺伝子の単一コピーのみを保持することができる。例えば、修飾細胞は、少なくとも（ａ）ＨＬＡ－Ｃ＋及びＨＬＡ－ＤＲ＋として同定され、任意選択的に、（ｂ）ＨＬＡ－Ｂ－、（ｃ）ＨＬＡ－ＤＰ－、及び（ｄ）ＨＬＡ－ＤＱ－のうちの１つ以上として同定される。例示的な実施形態では、修飾細胞は、ＨＬＡ－Ｂ＋、ＨＬＡ－ＤＰ－、及びＨＬＡ－ＤＱ－である。

【0032】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの両方についてホモ接合性、並びにＨＬＡ－ＤＰＢ１^ｎｅｇ及びＨＬＡ－ＤＱＢ１^ｎｅｇであるように遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１について更にホモ接合性である。

【0033】

本明細書で使用される場合、特定のＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩの分子に関する「ｎｅｇ」、（－）、又は「陰性」という用語は、遺伝子の両方のコピーが細胞株又は集団で破壊されており、したがって、細胞株又は集団が遺伝子の著しい機能的発現を示さないことを示す。そのような細胞は、完全若しくは部分的な遺伝子欠失若しくは破壊によって、又は代替的にｓｉＲＮＡなどの他の技術によって生成することができる。本明細書で使用される場合、標的遺伝子の遺伝子組換え（すなわち、遺伝子編集）の文脈での「欠失」という用語は、対応する遺伝子産物（すなわち、対応するポリペプチド）の機能的発現の解消を指す。そのような遺伝子編集としては、コード配列の完全若しくは部分的な遺伝子欠失若しくは破壊、又は重要なシス作用性発現制御配列の欠失が挙げられる。

【0034】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、長さが１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、又はそれ以上のヌクレオチドであるｇＲＮＡを使用して遺伝子編集される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５’末端若しくはその付近における（例えば、５’末端の１～１０個、１～５個、若しくは１～２個のヌクレオチド内の）修飾、及び／又は３’末端若しくはその付近における（例えば、３’末端の１～１０個、１～５個、若しくは１～２個のヌクレオチド内の）修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する耐性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子を含む（すなわち、「二重ｇＲＮＡ」）。二重ｇＲＮＡは、「ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ」（又は「ｃｒＲＮＡ」）及び「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という２つの別個のＲＮＡ分子を含み、当業者に周知である。

【0035】

一般的に、本開示の様々な実施形態に従って適用することができる、様々な遺伝子編集技術が公知である。遺伝子編集技術としては、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＤＮＡ結合ドメインのうちの１つ以上及びＦｏｋｌエンドヌクレアーゼの切断ドメインを含む融合タンパク質を使用して、細胞内のＤＮＡの所望の領域に二本鎖切断を生成することができる（例えば、全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、当該技術分野で公知のＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を使用して行われる。例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，６９７，３５９、ＵＳ８，９０６，６１６、及びＵＳ８，９９９，６４１を参照されたい。様々な実施形態では、遺伝子編集は、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９など）を採用するか、又はＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ１２ａなど）を採用する。ＩＩ型及びＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ依存性である。（標的外編集を制限又は回避しながら）所望の遺伝子編集を導くためのｇＲＮＡの設計が、当該技術分野で公知である。例えば、ＭｏｈｒＳＥ，ｅｔａｌ．，ＣＲＩＳＰＲｇｕｉｄｅＲＮＡｄｅｓｉｇｎｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＦＥＢＳＪ．２０１６Ｓｅｐ；２８３（１７）：３２３２－３２３８を参照されたい。なおも他の実施形態では、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９又はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１（Ｃｐｆ１若しくはＣａｓ１２ａ）に対する（低い一次配列相同性であるが）相同性を有する非正準ＩＩ型又はＶ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを採用することができる。多数のそのような非正準Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、当該技術分野で公知である。ＮｉｄｈｉＳ，ｅｔａｌ．ＮｏｖｅｌＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ：ＡｎＵｐｄａｔｅｄＲｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅＣｕｒｒｅｎｔＡｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａｎｄＦｕｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ．２０２１Ａｐｒ；２２（７）：３３２７．なおも他の実施形態では、遺伝子編集は、二本鎖切断を起こすことなく変異を組み込むために、塩基編集又はプライム編集を採用する。例えば、ＡｎｔｏｎｉｏｕＰ，ｅｔａｌ．，ＢａｓｅａｎｄＰｒｉｍｅＥｄｉｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒＢｌｏｏｄＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｆｒｏｎｔ．ＧｅｎｏｍｅＥｄ．，２８Ｊａｎｕａｒｙ２０２１、ＭａｔｓｕｏｋａｓＩＧ，ＰｒｉｍｅＥｄｉｔｉｎｇ：ＧｅｎｏｍｅＥｄｉｔｉｎｇｆｏｒＲａｒｅＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓＷｉｔｈｏｕｔＤｏｕｂｌｅ－ＳｔｒａｎｄＢｒｅａｋｓｏｒＤｏｎｏｒＤＮＡ，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，０９Ｊｕｎｅ２０２０を参照されたい。デッドＣａｓ（ｄＣａｓ）をガイドＲＮＡ依存性系として使用して、ＤＮＡ修飾酵素を所望の標的に標的化するためのｄＣａｓ系（例えば、Ｃａｓ融合タンパク質）の使用を含む、様々な他の遺伝子編集プロセスが公知である。ＢｒｅｚｇｉｎＳ，ＤｅａｄＣａｓＳｙｓｔｅｍｓ：Ｔｙｐｅｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ．２０１９Ｄｅｃ；２０（２３）：６０４１．

【0036】

二本鎖ＤＮＡ切断を生成することなく正確なゲノム改変を導入することができる塩基エディタもまた、細胞（例えば、ｉＰＳＣ）における遺伝子編集（例えば、遺伝子療法ベクターの設計）に使用することができる。塩基エディタは、本質的に、ＤＳＢを作製することができず、核酸塩基デアミナーゼ酵素、場合によっては、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤に融合される、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）などの触媒不活性化ヌクレアーゼを含む。現在、Ｃ＞Ｔ及びＡ＞Ｇ転換を触媒する、シチジン塩基エディタ（ＣＢＥ）及びアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）という塩基エディタの２つの主要なカテゴリがある。塩基エディタは、例えば、ＨＤＡｄ５／３５＋＋ベクターを介して送達され、プロモーター及びエンハンサーを効率的に編集して、遺伝子を活性化又は不活性化することができる。例示的な方法は、米国特許第９，８４０，６９９号、同第１０，１６７，４５７号、同第１０，１１３，１６３号、同第１１，３０６，３２４号、同第１１，２６８，０８２号、同第１１，３１９，５３２号、及び同第１１，１５５，８０３号に記載されている。また、ＷＯ２０２０／１９１１５３に記載されているように、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにコンジュゲートされた（例えば、それと融合された）逆転写酵素、及びガイドＲＮＡにコンジュゲートされた（例えば、それと融合された）ＤＮＡ合成テンプレートとして有用なポリヌクレオチドを含む、プライムエディタも企図される。

【0037】

ゲノム編集用途に使用することができる例示的なベクターとしては、プラスミド、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／３５、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ４８、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、コロナウイルス、オルトミキソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミキソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）などの陰性鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどの陽性鎖ＲＮＡウイルス、並びにヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、カナリア痘、ワクシニア、又は改変ワクシニアウイルスを含む、二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。目的の核酸分子を含むベクターは、形質導入、トランスフェクション、感染、及びエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知である任意の方法を介して、細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、内皮細胞、造血内皮細胞、ＨＳＣ（ＳＴ－ＨＳＣ又はＬＴ－ＨＳＣ）に送達され得る。これらのベクターのうちのいずれかは、転位性要素（ピギーバックトランスポゾン又はスリーピングビューティトランスポゾンなど）を含み得る。トランスポゾンは、ＤＮＡの特異的配列を脊椎動物のゲノムに挿入する。目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する類似の切除部位のトランスポザーゼ触媒切断によって、哺乳動物細胞のゲノムに組み込むことができる。

【0038】

増加した効率のために、いくつかの実施形態では、Ｃａｓ及びｇＲＮＡを細胞内に送達される前に組み合わせることができる。Ｃａｓ－ｇＲＮＡ複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として知られている。いくつかの方法が、細胞へのＲＮＰの直接送達のために開発されている。例えば、ＲＮＰは、リポフェクション又はエレクトロポレーションによって培養中の細胞に送達することができる。ヌクレオフェクションプロトコルを使用するエレクトロポレーションを採用することができ、この手順は、ＲＮＰが迅速に細胞の核に進入することを可能にするため、即時にゲノムを切断し始めることができる。例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＺｈａｎｇＳ，ＳｈｅｎＪ，ＬｉＤ，ＣｈｅｎｇＹ．ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｉｎｔｈｅｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＣａｓ９ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０２１Ｊａｎ１；１１（２）：６１４－６４８を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡは、ＲＮＰとしてドナーｉＰＳＣ及び／又はＨＳＣにエレクトロポレーションされる。

【0039】

一般的に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、Ｃａｓヌクレアーゼが切断するために必要とされ、一般的に、切断部位の下流に３～４個のヌクレオチドが見出される。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ系による切断のために標的化されるＤＮＡ領域に続く、短いＤＮＡ配列（通常、長さが２～６塩基対）である。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプ又は多形体を標的化するＰＡＭ配列、ｓｇＲＮＡ、又は塩基編集ツールは、４つのＧ、４つのＣ、ＧＣ反復、又はそれらの組み合わせを含まない。

【0040】

いくつかの実施形態では、独自のＨＬＡハプロタイプに特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、本明細書に記載されるｇＲＮＡを使用して、ドナー特異的ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子（例えば）の各々を標的化する単一ｇＲＮＡを設計することによって開発することができる。遺伝子ノックアウトを実施するために、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質を、編集するための適切な部位に標的化する。次に、Ｃａｓ９タンパク質は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を実施することができ、ＤＮＡは、フレームシフト変異をもたらすインデルを生成し、結果として生じるタンパク質の機能を終了させる非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構を通して修復する。しかしながら、標的外遺伝子組換えが起こり、そうでなければインタクトな遺伝子の機能を改変し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ある程度の不適合の存在下でさえも、望ましくない標的外位置にＤＳＢを生成し得る。この標的外活性は、点変異及びゲノム構造変動などのゲノム不安定性事象を生じ得る。様々な実施形態では、ＨＬＡ－Ａを標的化するｓｇＲＮＡは、２９９４２５３２－２９９４２６２６として定義される染色体６の領域を標的化することができる。様々な実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱＢ１を標的化するｓｇＲＮＡは、３２６６５０６７－３２６６４７９８として定義される染色体６の領域を標的化することができる。様々な実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰＢ１を標的化するｓｇＲＮＡは、３３０８０６７２－３３０８０９３５として定義される染色体６の領域を標的化することができる。

【0041】

ｇＲＮＡを使用して、クローンｉＰＳＣを開発することができる。そのようなｉＰＳＣ株は、例えば、本明細書に記載される配列決定を使用して、（ｉ）標的上編集、（ｉｉ）標的外編集、及び（ｉｉｉ）転座編集について評価することができる。具体的には、そのようなアッセイは、目的の領域を標的化及び濃縮するように設計されたプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ、続いて、次世代配列決定（例えば、Ａｍｐｌｉｃｏｎ配列決定、ＡＭＰ－ｓｅｑ）によって実施することができる。標的上パネル及び転座パネルは、意図された編集領域を増幅し、意図されていないＤＳＢ切断部位融合から生じる染色体転座を含まない、予期される編集を有するｉＰＳＣクローンの選択を可能にすることができる。標的外パネルは、配列決定を介して同定される任意の潜在的標的外領域を濃縮することができ、無視できる標的外変異を有するｉＰＳＣクローンの選択を可能にする。一緒に、これらのアッセイは、潜在的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９関連ゲノム完全性の問題を除外しながら、所望の編集を有するクローンを選択するためのｉＰＳＣクローンのスクリーニングを可能にする。

【0042】

いくつかの実施形態では、再プログラミング及び編集されたｉＰＳＣのゲノムの安定性及び完全性を更に確実にするために、遺伝子及びゲノムアッセイを実施して、例えば、転座及び変異事象を受けず、エピソームベクターを組み込まなかったクローンを選択することができる。例えば、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）が、再プログラミング後にＣＤ３４＋細胞及びｉＰＳＣクローンで実施され、ゲノムが、編集から生じる差異について比較される。これらの分析は、どのｉＰＳＣクローンゲノムがＣＤ３４＋出発物質と異なるかという評価を提供し、再プログラミング中に変異を生じなかったｉＰＳＣクローンの情報に基づく選択を可能にする。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアッセイなどの系を使用する核型分析が、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＲａｍｍｅＡＰ，ｅｔａｌ，“Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｄａｔａｓｅｔｏｆｔｗｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｆｒｏｍｒｅｌａｔｅｄｈｕｍａｎｄｏｎｏｒｓ，”ＤａｔａＢｒｉｅｆ．２０２１Ｍａｙ１５；３７：１０７１４０に記載されているように、再プログラミング中にインデル及び転座を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアッセイは、Ｇバンディング核型分析と同様の分解能で染色体異常の可視化を可能にする。検出することができる構造異常のサイズは、染色体獲得については＞２Ｍｂ、染色体損失については＞１Ｍｂである。ＫＡＲＹＯＳＴＡＴアレイは、低解像度ＤＮＡコピー数分析による均衡の保たれた全ゲノムカバレッジのために機能化され、アレイは、１４，０００個のＯＭＩＭ標的を含む３６，０００個全てのＲｅｆＳｅｑ遺伝子をカバーする。アッセイは、異数性、超微視的異常、及びモザイク事象の検出を可能にする。

【0044】

いくつかの実施形態では、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析が、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｗｉｅｓｎｅｒｅｔａｌ．“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：ＫｌａｕｓＪ．Ｂｕｓａｍ，ＰｅｄｒａｍＧｅｒａｍｉ，ＲｉｃｈａｒｄＡ．Ｓｃｏｌｙｅｒ，“ＰａｔｈｏｌｏｇｙｏｆＭｅｌａｎｏｃｙｔｉｃＴｕｍｏｒｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１９，ｐｐ．３６４－３７３，ＩＳＢＮ９７８０３２３３７４５７６、及びＨｕｓｓｅｉｎＳＭ，ｅｔａｌ．“Ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｖａｒｉａｔｉｏｎａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｔｏｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ，”Ｎａｔｕｒｅ．２０１１Ｍａｒ３；４７１（７３３６）：５８－６２に記載されているように、再プログラミング中にコピー数異常（ＣＮＡ）を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。ａＣＧＨは、試料ＤＮＡを参照ＤＮＡと比較することによってＣＮＡについてゲノム全体を分析する技術である。

【0045】

いくつかの実施形態では、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネル分析が、再プログラミング中に血液学的悪性変異を生じなかったｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。例えば、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネルは、骨髄性白血病、リンパ腫、及び／又は他の血液悪性腫瘍関連遺伝子に焦点を当て、より広範な方法よりも小さく管理可能なデータセットを生成することができる。標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネル分析は、血液悪性腫瘍に関連する領域を増幅するための高度に多重化されたＰＣＲの使用、続いて、次世代配列決定を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が、エピソームベクターを組み込まず、エピソームベクタークリアランスのために十分に継代したｉＰＳＣクローンを選択するために使用される。本明細書で考察されるように、ＣＤ３４＋細胞のｉＰＳＣ再プログラミングは、再プログラミング因子をコードするエピソームベクターを送達することによって達成することができる。しかしながら、エピソームベクターは、稀ではあるが、発達過程、恒常性などを破壊し得る細胞ゲノムに無作為に組み込むことができる。したがって、ｄｄＰＣＲ法を使用して、ｉＰＳＣ培養物中の残留エピソームベクターを検出し、エピソームベクターを組み込まなかったｉＰＳＣクローンの選択を可能にすることができる。

【0047】

いくつかの実施形態では、選択されたクローンが編集に関連するゲノム異常を含まないことを評価した後、クローンを増殖中に生じ得る自発的変異について追加的に検査することができる。例えば、事前編集された再プログラミングされたクローンについて記載されるように、例えば、血液悪性腫瘍遺伝子、インデル、転座、数の異常に影響を及ぼす変異である。自発的変異の分析としては、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、ＫＡＲＹＯＳＴＡＴ分析、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）分析、標的ヘム悪性腫瘍ＮＧＳパネルＡＭＰ－Ｓｅｑ分析、及び／又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が挙げられ得る。

【0048】

体細胞は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｋｌｆ４から選択される再プログラミング因子の発現によって再プログラミングされ得る。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、及びｋｌｆ４である。いくつかの実施形態では、再プログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ｃ－Ｍｙｃ、及びｋｌｆ４である。ｉＰＳＣを調製するための方法は、例えば、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第１０，６７６，１６５号、米国特許第９，５８０，６８９号、及び米国特許第９，３７６，６６４号に記載されている。様々な実施形態では、再プログラミング因子は、レンチウイルス、センダイ、又は麻疹ウイルス系などの周知のウイルスベクター系を使用して発現される。代替的に、再プログラミング因子は、再プログラミング因子をコードするｍＲＮＡ（複数可）を体細胞に導入することによって発現させることができる。なおも更に、ｉＰＳＣは、再プログラミング因子を発現する非統合性エピソームプラスミドを導入することによって、すなわち、無導入遺伝子及び無ウイルスｉＰＳＣの生成のために、生成され得る。限られた複製能力を有し、したがって、いくつかの細胞世代にわたって失われる、公知のエピソームプラスミドを採用することができる。

【0049】

いくつかの実施形態では、ヒト多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、遺伝子編集される。遺伝子編集としては、ＨＬＡ遺伝子の修飾（例えば、１つ以上のＨＬＡクラスＩ及び／又はＨＬＡクラスＩＩの遺伝子の欠失）、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の欠失、ＣＩＩＴＡの欠失、受容体遺伝子の欠失又は付加が挙げられ得るが、これらに限定されない。代替的に、１つ以上のＨＬＡノックアウト及びＴＣＲノックアウトを有する操作されたｉＰＳＣを、ＧＭＰグレード条件下で無フィーダー及び無血清分化のためにバイオリアクター内に配置して、完全に機能的な巨核球及び結果として得られる血小板を生成することができる。

【0050】

様々な実施形態では、ｉＰＳＣが調製され、培養系を使用して増殖される。増殖したｉＰＳＣは、胚様体（ＥＢ）を生成するための培養物から回収することができる。ｉＰＳＣの分化によって生成されるＥＢは、ｉＰＳＣの三次元凝集体であり、分化方法（複数可）に基づいて３つ（又は代替的に２つ若しくは１つ）の胚性生殖細胞層を含む。ＥＢの調製は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１９／０１７７６９５に記載されている。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣの分化によって調製されるＥＢは、例えば、ＡｂｅｃａｓｉｓＢ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆ３Ｄｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌａｇｇｒｅｇａｔｅｓｉｎｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｔｅｎｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｃａｌｉｎｇ－ｕｐａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｊ．ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４６（２０１７）８１－９３に記載されているように、バイオリアクター内で増殖される。ＥＢを使用して、任意の所望の細胞型を生成することができる。ＥＢの増殖又は分化のための３Ｄ懸濁液培養を含む他の方法が、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０２０／０８６８８９に記載されている。

【0051】

いくつかの実施形態では、各態様によるプロセスは、多能性幹細胞（例えば、ＥＢ）からＣＤ３４＋細胞を生成し、内皮・造血転換を誘導することを含むことができる。ＬＴ－ＨＳＣの比較的高い頻度を含むＨＳＣは、機械的、生化学的、代謝的、及び／又は局所的刺激、並びに細胞外基質、ニッチ因子、細胞外因性因子などの因子、細胞内因性特性の誘導を含み、かつ薬理学的及び／又は遺伝的手段を含む、様々な刺激又は因子を使用して、細胞集団から生成することができる。

【0052】

いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＨＴの誘導の前に、多能性幹細胞から造血能を有する内皮細胞を調製することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＴＡ２／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２／ＴＡＬ１、又はＥＲ７１／ＧＡＴＡ２／ＳＣＬの複合過剰発現は、ＰＳＣ源からの造血能を有する内皮細胞の形成につながり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ｉＰＳＣにおけるＥ２６形質転換特異的バリアント２（ＥＴＶ２）転写因子の過剰発現を含む。ＥＴＶ２は、ＥＴＶ２の構成的又は誘導性発現のために、及び無導入遺伝子造血性ＥＣの産生のために、コード化非統合性エピソームプラスミドの導入によって発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＥＴＶ２は、ｉＰＳＣに導入されたｍＲＮＡから発現される。ｍＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションを含む任意の利用可能な方法を使用して導入することができる。ＥＴＶ２を発現する細胞の分化は、ＶＥＧＦ－Ａの付加を含むことができる。ＷａｎｇＫ，ｅｔａｌ．，ＲｏｂｕｓｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｖｉａｔｅｍｐｏｒａｌｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＥＴＶ２ｗｉｔｈｍＲＮＡ．Ｓｃｉ．Ａｄｖ．Ｖｏｌ．６（２０２０）を参照されたい。このようにして生成された細胞は、本開示の実施形態に従って、ＣＤ３４＋細胞を産生し、ＥＨＴを誘導するために使用され得る。

【0053】

ＣＤ３４＋濃縮後、次いで、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣが、機械的、生化学的、薬理学的、及び／若しくは遺伝的刺激又は修飾を使用して内皮細胞から生成される。

【0054】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、細胞が少なくとも約１０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約２０％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約２５％のＣＤ３４＋、又は少なくとも約３０％のＣＤ３４＋になるまで進行する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４濃縮及びＥＨＴは、例えば、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、又は１４日目などのｉＰＳＣ分化の７日目～１４日目に誘導され得る。ｉＰＳＣの分化は、公知の技術によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ分化は、ｂＦＧＦ、Ｙ２７６３２、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、及び／又はＩＧＦ－１の組み合わせなどであるがこれらに限定されない、因子を伴う。いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、無フィーダー、無血清、及び／又はＧＭＰ適合性材料を使用して分化される。無血清培養物は、一般的に、サイトカイン／成長因子／小分子のカクテルを含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣは、血清含有培地中で、ＳＴＯマウス線維芽細胞又は血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又は臍帯血由来の間葉系幹細胞又はリンパ球由来のがん細胞株細胞のフィーダー層である、ＯＰ９などのマウス骨髄由来のフィーダー細胞と共培養される。培養物は、成長因子及びサイトカインを含有して、胚様体又は単層系の分化を支援することができる。フィーダー細胞共培養系を使用して、単球又はマクロファージ、樹状細胞、好中球、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、巨核球、及び赤血球を含む、いくつかの造血系統に更に分化させることができる多能性ＨＳＰＣを生成することができる。ＮｅｔｓｒｉｔｈｏｎｇＲ．ｅｔａｌ．，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ＆ＴｈｅｒａｐｙＶｏｌ．１１Ａｒｔ．４８１（２０２０）を参照されたい。代替的に、特異的なシグナルとともに定義された条件を使用する段階的プロセスを使用することができる。例えば、ヒトＰＳＣにおけるＨＯＸＡ９、ＥＲＧ、ＲＯＲＡ、ＳＯＸ４、及びＭＹＢの発現は、多分化能を有するＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋前駆細胞への直接分化に有利に働く。更に、ＨＯＸＢ４、ＣＤＸ４、ＳＣＬ／ＴＡＬ１、又はＲＵＮＸ１ａなどの因子の発現は、ヒトＰＳＣにおける造血プログラムを支援する。ＤｏｕｌａｔｏｖＳ．ｅｔａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｖｉａｒｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｎｅａｇｅ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ．２０１３Ｏｃｔ３；１３（４）を参照されたい。

【0056】

ｉＰＳＣの（例えば、ＥＢへの）分化は、ＣＨＩＲ９９０２１などのＷＮＴアゴニストを採用し得る。ＷＮＴアゴニストは、ＷＮＴシグナル伝達を模倣するか、又は増加させる分子である。ＷＮＴアゴニストの非限定的な例としては、小分子ＣＨＩＲ－９９０２１（ＣＡＳ２５２９１７－０６－９）、２－アミノ－４，６－二置換ピリミジン、例えば、ＢＭＬ２８４（ＣＡＳ８５３２２０－５２－７）、ＳＫＬ２００１（ＣＡＳ９０９０８９－１３－０）、ＷＡＹ２６２６１１（ＣＡＳ１１２３２３１－０７－１）、ＷＡＹ３１６６０６（ＣＡＳ９１５７５９－４５－４）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ２８０７４４－０９－４）、ＩＱ１（ＣＡＳ３３１００１－６２－８）、ＱＳ１１（ＣＡＳ９４４３２８－８８－５）、デオキシコール酸（ＣＡＳ８３－４４－３）、ＢＩＯ（ＣＡＳ６６７４６３－６２－９）、ケンパウロン（ＣＡＳ１４２２７３－２０－９）、又は（ヘテロ）アリールピリミジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＷＮＴアゴニストは、アゴニスト抗体若しくはその機能的断片、又は抗体様ポリペプチドである。

【0057】

ｉＰＳＣの（例えば、ＥＢへの）分化は、ＲＯＣＫ阻害剤を採用し得る。ｉＰＳＣの確立及び分化に使用される例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル、ＡＲ１２２－８６、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメント、Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）ウレア、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、及び（Ｒ）－（＋）－トランス－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、Ｈ－１００、並びに参照によりその全体で本明細書に組み込まれる米国特許第８，０４４，２０１号に開示されているＲＯＣＫ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

ＥＨＴの誘導は、任意の公知のプロセスを用いたものであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ＬＴ－ＨＳＣを含む造血幹細胞（ＨＳＣ）集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、機械的、生化学的、薬理学的及び／又は遺伝的手段を使用して（例えば、刺激、阻害、及び／又は遺伝子組換えを介して）、内皮又は造血内皮細胞（ＨＥＣ）前駆体を通してＨＳＣを生成する。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、長期造血幹細胞（ＬＴ－ＨＳＣ）、短期造血幹細胞（ＳＴ－ＨＳＣ）、及び造血幹前駆細胞のうちの１つ以上を含む、幹細胞集団を生成する。様々な実施形態では、ＥＨＴは、培養物中で、約４日間～約８日間（例えば、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、又は約８日間）など、２日間～１２日間誘導することができる。いくつかの実施形態では、ＥＨＴは、培養物中で約５日～約７日間誘導される。実施形態では、ＥＨＴは、ＴＰＯ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ－６、ＩＬ７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＩＬ１５から選択される１つ以上の成長因子及びサイトカインを含む培地を使用して行われる。培地は、任意選択的に、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ活性化剤、Ｗｎｔ経路活性化剤、又はＲＯＣＫ阻害剤（例えば、チアゾビビン若しくはＹ２７６３２）のうちの１つ以上を含み得る。

【0059】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣ及び／若しくはＨＳＰＣ集団又はその画分は、Ｙｏｄａ１などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用とは無関係に分化される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニスト（例えば、Ｙｏｄａ１）の使用は、任意選択的である。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４＋濃縮集団を調製するために、分化した多能性幹細胞集団から濃縮される。ｙｏｄａ１、ｊｅｄｉ１、ｊｅｄｉ２、又はｓｓＲＮＡ４０などの機械感受性受容体又は機械感受性チャネルのアゴニストの使用が任意選択的である、ＣＤ３４＋濃縮細胞集団の内皮・造血転換が、少なくとも２日であるが１２日以下にわたって誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋濃縮細胞集団の内皮・造血転換は、少なくとも２日間、更に約４時間、又は約８時間、又は約１２時間、又は約１６時間、又は約２０時間、又は約２４時間、又は約２日間、又は約３日間、又は約４日間、又は約５日間、又は約６日間、又は約７日間、又は約８日間、又は約９日間、又は約１０日間誘導される。全ＥＨＴ分化は、１２日以下にわたって進行する。

【0060】

いくつかの実施形態では、本方法は、機械的、遺伝的、生化学的、又は薬理学的手段によるものであり得る、ＰＳＣ、胚様体、ＣＤ３４＋濃縮細胞、ＥＣ、ＨＥＣ、又はＨＳＣにおけるｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞におけるＤＮＡ（シトシン－５－）－メチルトランスフェラーゼ３β（Ｄｎｍｔ３ｂ）及び／又はＧＴＰａｓｅＩＭＡＰファミリーメンバー６（Ｇｉｍａｐ６）の活性又は発現を増加させることを含む。参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９／２３６９４３及びＷＯ２０２１／１１９０６１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＥＨＴの誘導は、ｄｎｍｔ３ｂの発現又は活性を増加させることを含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現を増加させる機械感受性受容体又は機械感受性チャネルの有効量のアゴニストと接触される。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｐｉｅｚｏｌである。例示的なＰｉｅｚｏｌアゴニストは、ｙｏｄａ１である。いくつかの実施形態では、機械感受性受容体は、Ｔｒｐｖ４である。例示的なＴｒｐｖ４アゴニストは、ＧＳＫ１０１６７９０Ａである。Ｙｏｄａ１（２－［５－［［（２，６－ジクロロフェニル）メチル］チオ］－ｌ，３，４－チアジアゾール－２－イル］－ピラジン）は、機械感受性イオンチャネルＰｉｅｚｏｌのために開発された小分子アゴニストである。ＳｙｅｄａＲ，ＣｈｅｍｉｃａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌＰｉｅｚｏｌ．ｅＬｉｆｅ（２０１５）．

【0062】

Ｙｏｄａｌの誘導体を、様々な実施形態で採用することができる。例えば、２，６－ジクロロフェニルコアを含む誘導体が、いくつかの実施形態で採用される。例示的なアゴニストが、ＥｖａｎｓＥＬ，ｅｔａｌ．，Ｙｏｄａ１ａｎａｌｏｇｕｅ（Ｄｏｏｋｕ１）ｗｈｉｃｈａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓＹｏｄａ１－ｅｖｏｋｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＰｉｅｚｏ１ａｎｄａｏｒｔｉｃｒｅｌａｘａｔｉｏｎ，ＢｒｉｔｉｓｈＪ．ｏｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１７５（１７４４－１７５９）：２０１８に開示されている。なおも他のＰｉｅｚｏ１アゴニストとしては、Ｊｅｄｉ１、Ｊｅｄｉ２、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ４０）、並びにそれらの誘導体及び類似体が挙げられる。参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＷａｎｇＹ．，ｅｔａｌ．，Ａｌｅｖｅｒ－ｌｉｋｅｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｆｏｒｌｏｎｇ－ｄｉｓｔａｎｃｅｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｎｄｍｅｃｈａｎｏ－ｇａｔｉｎｇｏｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅＰｉｅｚｏ１ｃｈａｎｎｅｌ．ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１８）９：１３００、Ｓｕｇｉｓａｗａ，ｅｔａｌ．，ＲＮＡＳｅｎｓｉｎｇｂｙＧｕｔＰｉｅｚｏ１ＩｓＥｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒＳｙｓｔｅｍｉｃＳｅｒｏｔｏｎｉｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１８２，Ｉｓｓｕｅ３，２０２０，Ｐａｇｅｓ６０９－６２４を参照されたい。これらのＰｉｅｚｏ１アゴニストは、市販されている。様々な実施形態では、Ｐｉｅｚｏ１アゴニスト又は誘導体の有効量は、約１μＭ～約５００μＭ、若しくは約５μＭ～約２００μＭ、若しくは約５μＭ～約１００μＭ、又はいくつかの実施形態では、約２５μＭ～約１５０μＭ、若しくは約２５μＭ～約１００μＭ、若しくは約２５μＭ～約５０μＭの範囲である。代替的に、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ４０）、並びにそれらの誘導体及び類似体を、Ｐｉｅｚｏ１活性化に使用することができる。

【0063】

【0064】

代替的に、又は加えて、Ｄｎｍｔ３ｂの活性又は発現は、細胞において、例えば、ＣＤ３４＋濃縮細胞において直接増加させることができる。例えば、Ｄｎｍｔ３ｂのｍＲＮＡ発現は、Ｄｎｍｔ３ｂをコードする転写産物を細胞に送達することによって、又はＤｎｍｔ３ｂをコードする導入遺伝子を導入することによって、又は非統合性エピソームを細胞に導入することに限定されない、無導入遺伝子方法によって増加させることができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、限定されるものではないが、プロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させ、かつ／又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすためなどに、細胞におけるＤｎｍｔ３ｂ発現要素に遺伝子組換えを導入するために採用される。

【0065】

いくつかの実施形態では、本方法は、単独で、あるいはＤｎｍｔ３ｂ及び／又は周期的ひずみ若しくはＰｉｅｚｏｌ活性化時に上方若しくは下方制御される他の遺伝子と組み合わせて、細胞におけるＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることを含む。Ｇｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させるために、Ｇｉｍａｐ６をコードするｍＲＮＡ転写物を細胞に導入することができ、エピソームを細胞に導入することを含むがこれに限定されない、無導入遺伝子アプローチを採用することもできるか、又は代替的にＧｉｍａｐ６をコードする導入遺伝子を導入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、細胞におけるＧｉｍａｐ６発現要素に遺伝子組換え（プロモーター強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるため、又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすための１つ以上の組換えなど）を導入するために採用される。

【0066】

細胞へのｍＲＮＡ送達を採用する本開示の実施形態では、公知の化学修飾を使用して、細胞における先天性免疫応答を回避することができる。例えば、正準ヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、細胞において強力な免疫応答を誘起することができる。この応答は、翻訳阻止、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死をもたらし得る。ある特定の非正準ヌクレオチドを含むＲＮＡは、先天性免疫系による検出を回避することができ、高効率でタンパク質に翻訳することができる。特に先天性免疫応答を回避するためのヌクレオチド修飾に関して、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ９，１８１，３１９を参照されたい。

【0067】

いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、導入遺伝子を細胞に導入することによって増加され、これは、所望のレベルの過剰発現を指示することができる（様々なプロモーター強度又は発現制御エレメントの他の選択を伴う）。当該技術分野で公知である様々なウイルスベクター又はトランスフェクション試薬（脂質ナノ粒子を含む）を使用して、導入遺伝子を導入することができる。いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の発現は、無導入遺伝子方法（例えば、エピソーム送達）によって増加される。いくつかの実施形態では、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／若しくはＧｉｍａｐ６又は本明細書に開示される他の遺伝子の発現又は活性は、例えば、プロモーターの強度、リボソーム結合、又はＲＮＡの安定性を増加させるための１つ以上の修飾を導入するために、遺伝子編集技術を使用して増加される。

【0068】

いくつかの実施形態では、本方法は、周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を細胞に適用することを含む。様々な実施形態では、周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を受けた細胞は、ＣＤ３４＋濃縮細胞、ｉＰＳＣ、ＥＣ、及びＨＥＣのうちの１つ以上から選択される。例えば、細胞集団が、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０９６２１５に記載されているように、周期的ひずみ生物力学的伸張を提供するバイオリアクターに導入される。周期的ひずみ生物力学的伸張は、Ｄｎｍｔ３ｂ及び／又はＧｉｍａｐ６の活性又は発現を増加させることができる。これらの実施形態では、機械的手段は、細胞に、又はその上で培養された細胞（例えば、ＥＣ若しくはＨＥＣ）を有する細胞培養表面に伸張力を印加する。例えば、可撓性の生体適合性及び／又は生体模倣表面に取り付けられた伸張力を提供するためのコンピュータ制御真空ポンプシステム又は他の手段（例えば、ＦｌｅｘＣｅｌｌ（商標）テンションシステム、サイトストレッチャーシステム）を使用して、定義及び制御された周期的ひずみ条件下で細胞にエクスビボで周期的２Ｄ、３Ｄ、又は４Ｄ伸張を適用することができる。例えば、適用された周期的伸張は、数時間又は数日（例えば、約７日間）で約１％～約２０％の周期的ひずみ（例えば、約６％の周期的ひずみ）であり得る。様々な実施形態では、周期的ひずみは、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１４４時間、又は少なくとも約１６８時間適用される。

【0069】

代替的に、又は加えて、ＥＨＴは、Ｔｒｐｖ４活性化によって刺激される。Ｔｒｐｖ４活性化は、細胞（例えば、ＣＤ３４＋濃縮細胞、ＥＣ、又はＨＥＣ）を、ＧＳＫ１０１６７９０Ａ、４α－ＰＤＤ、又はそれらの類似体及び／若しくは誘導体から任意選択的に選択される１つ以上のＴｒｐｖ４アゴニストと接触させることによるものであり得る。

【0070】

細胞集団が、ある特定の表現型を有するものとして本明細書に記載される場合、表現型は、細胞集団の少なくとも２５％、少なくとも４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％などの細胞集団のかなりの部分を表すことが理解される。更に、様々なステップでは、細胞集団が、所望の表現型の少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％を含むように、細胞集団を所望の表現型の細胞について濃縮し、かつ／又は望ましくない表現型の細胞を枯渇させることができる。そのような陽性及び陰性選択方法は、当該技術分野で公知である。例えば、蛍光活性化細胞選別機、又は細胞をある特定の細胞表面抗原と結合する磁気ビーズを使用して、細胞表面抗原（本明細書に記載されるものを含む）に基づいて、細胞を選別することができる。陰性選択カラムを使用して、望ましくない細胞表面マーカーを発現する細胞を除去することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、（ＥＨＴを受ける前及び／又は後に）ＣＤ３４＋細胞について濃縮される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進し、それによって、幹細胞の増殖した集団を産生する条件下で培養される。

【0071】

様々な実施形態では、ＣＤ３４＋細胞（例えば、浮遊細胞及び／又は接着細胞）が、１２日目～１７日目などのｉＰＳＣ分化の１０日目～２０日目に内皮・造血転換を受ける培養物から採取される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、非接着細胞を含む。

【0072】

様々な実施形態では、ＨＳＣ又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、更に増殖される。例えば、ＨＳＣ又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，１６８，４２８、ＵＳ９，０２８，８１１、ＵＳ１０，２７２，１１０、及びＵＳ１０，２７８，９９０に開示されている方法に従って増殖させることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ又はＣＤ３４＋濃縮細胞のエクスビボ増殖は、プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ２）又はＰＧＥ_２誘導体を採用する。本開示のいくつかの実施形態では、ＨＳＣは、少なくとも約０．０１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．０５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．１％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約０．５％のＬＴ－ＨＳＣ、又は少なくとも約１％のＬＴ－ＨＳＣを含む。

【0073】

巨核球及び／又は血小板を生じるＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣは、ＣＤ３４の発現マーカー及び系統特異的マーカー（Ｌｉｎ－と称される）の非存在に基づいて同定することができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣ及び／又はＨＳＰＣを含む幹細胞の集団は、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＵＳ９，８３４，７５４に記載されているように濃縮される。例えば、このプロセスは、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ３８、及びＣＤ４３のうちの１つ以上の発現に基づいて細胞集団を選別することを含むことができる。ＣＤ３４^＋、ＣＤ９０^－、ＣＤ３８^－、及びＣＤ４３^－のうちの１つ以上である画分を、更なる分化のために選択することができる。いくつかの実施形態では、造血系統への分化のための幹細胞集団は、少なくとも約８０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９０％のＣＤ３４^＋、又は少なくとも約９５％のＣＤ３４^＋である。

【0074】

いくつかの実施形態では、幹細胞集団、又はＣＤ３４＋濃縮細胞若しくはその画分、あるいは誘導体集団は、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０３０８５４０に記載されているように増殖される。例えば、細胞は、例えば、ＳＲ１又はＳＲ１誘導体を含むアリール炭化水素受容体拮抗剤に細胞を曝露することによって増殖される。また、Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２０１６；１８（１）：１４４－５５、及びＢｏｉｔａｎｏＡ．，ｅｔａｌ．，ＡｒｙｌＨｙｄｒｏｃａｒｂｏｎＲｅｃｅｐｔｏｒＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｓＰｒｏｍｏｔｅｔｈｅＥｘｐａｎｓｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１０Ｓｅｐ１０；３２９（５９９７）：１３４５－１３４８を参照されたい。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３４^＋細胞の増殖を促進する化合物は、例えば、ＵＭ１７１又はＵＭ７２９を含むピリミドインドール誘導体を含む（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０／０３０８５４０を参照されたい）。

【0076】

いくつかの実施形態では、幹細胞集団又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、ＷＯ２０２０／２０５９６９（参照によりその全体で本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ペリオスチン及び／若しくは血小板由来成長因子受容体α（ｐｄｇｆｒａ）を発現する細胞について更に濃縮されるか、又はペリオスチン及び／若しくはｐｄｇｆｒａを発現するように修飾される。そのような発現は、コード化転写産物を細胞に送達することによる、又はコード化導入遺伝子を導入することによる、又は非統合性エピソームを細胞に導入することに限定されない、無導入遺伝子方法によるものであり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は、プロモーター活性若しくは強度、リボソーム結合、ＲＮＡ安定性を増加させるか、又はＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすためなどに、細胞における発現要素に遺伝子組換えを導入するために採用される。

【0077】

なおも他の実施形態では、幹細胞集団又はＣＤ３４＋濃縮細胞は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ１の阻害剤と培養される。代替的に、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において部分的若しくは完全に欠失若しくは不活性化されるか、又は一過性にサイレンシングされる。ＥＺＨ１の阻害は、骨髄前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋）をリンパ系統に指向することができる。参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／０４８８２８を参照されたい。なおも他の実施形態では、ＥＺＨ１は、幹細胞集団において過剰発現される。

【0078】

【0079】

いくつかの実施形態では、ＨＳＣ及び／若しくはＨＳＰＣ又はそれらの子孫を含む集団は、細胞を分化させるために、エクスビボで、部分的若しくは完全なＮｏｔｃｈリガンド、ＳＨＨ、細胞外基質成分（複数可）、及び／又はそれらの組み合わせと培養することができる。更に、公知のプロセスによれば、異種ＯＰ９－ＤＬ１、又はＳＴＯマウス線維芽細胞若しくは血液由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）若しくは臍帯血由来の間葉系幹細胞若しくはリンパ球由来のがん細胞株細胞のフィーダー層が、しばしば、造血細胞の分化のために採用される。ＯＰ９－ＤＬ１共培養系は、Ｎｏｔｃｈリガンドデルタ様－１（ＤＬＬ１）で形質導入された骨髄間質細胞株（ＯＰ９）を使用して、幹細胞源からのＴ細胞発生を支援する。ＯＰ９－ＤＬ１系は、臨床用途のための細胞の潜在能力を制限する。臨床用途のためにｈｉＰＳＣから造血細胞を生成することができる無フィーダー細胞系の必要性があり、いくつかの実施形態では、本発明は、この目的を満たす。非限定的な例では、巨核球を生成するために、ｉＰＳＣ増殖が６日間実施され、その後に約８日かかる胚様体形成が続く。細胞は、約５日間更に培養されて、ＨＳＣが由来するＣＤ３４＋造血内皮細胞の発生を可能にする。次いで、ＨＣＳは、巨核球への分化及び／又は更に血小板への分化のために特異的な培地で培養される。

【0080】

本明細書で使用される場合の「Ｎｏｔｃｈリガンド」という用語は、造血幹細胞又は前駆Ｔ細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することが可能なリガンドを指す。Ｎｏｔｃｈ受容体としては、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｎｏｔｃｈ－２、Ｎｏｔｃｈ－３、及びＮｏｔｃｈ－４が挙げられる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、アミノ末端に２０～２２個のアミノ酸を含み、細胞外表面に３～８個のＥＧＦ反復を含む、ＤＳＬドメイン（Ｄ－Ｄｅｌｔａ、Ｓ－Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＬ－Ｌａｇ２）を有する。様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈは、デルタ様－１（ＤＬＬ１）、デルタ様－４（ＤＬＬ４）、ＳＦＩＰ３、Ｄｅｌｔａ^Ｍａｘ（参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４１７６５及びＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０３０９７７に開示される）、Ｊａｇｇｅｄ１（ＪＡＧ１）、Ｊａｇｇｅｄ２（ＪＡＧ２）、デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）、及びＸ－デルタ２、又はそれらの機能的部分のうちの少なくとも１つを含む。

【0081】

本明細書で使用される場合の「Ｎｏｔｃｈリガンド」はまた、インタクトな（完全長）、部分的な（切断型）、又は修飾された（保存的変異などの１つ以上の変異を含む）ｎｏｔｃｈリガンド、並びに完全長Ｎｏｔｃｈリガンドの少なくとも１つの活性又は機能を保持する任意の種に由来するＮｏｔｃｈリガンド又はその断片を含む。また、ｎｏｔｃｈリガンドを模倣するペプチドも含まれる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、「正準ｎｏｔｃｈリガンド」又は「非正準ｎｏｔｃｈリガンド」であり得る。正準ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、Ｎ末端（ＮＴ）ドメイン、続いて、Ｄｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／ＬＡＧ－２（ＤＳＬ）ドメイン、及び複数のタンデム配列された上皮成長因子（ＥＧＦ）様反復を含む、細胞外ドメインによって特徴付けられる。ＤＳＬドメインは、隣接するＮＴドメイン、並びにデルタ及びＯＳＭ－１１様タンパク質（ＤＯＳ）モチーフを含む最初の２つのＥＧＦ反復とともに、典型的には、正準リガンドがＮｏｔｃｈに結合するために必要とされる。いくつかの正準リガンドの細胞内ドメインは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達とは無関係な役割を果たす、カルボキシ末端ＰＳＤ－９５／Ｄｌｇ／ＺＯ－１－リガンド（ＰＤＺＬ）モチーフを含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、結合し、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関与することができる抗Ｎｏｔｃｈ（アゴニスト）抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体（ヒト又はヒト化抗体を含む）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ナノボディ、又はＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することが可能な他の抗体断片若しくは抗原結合分子である。

【0083】

いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、デルタファミリーＮｏｔｃｈリガンドである。いくつかの実施形態におけるデルタファミリーリガンドは、デルタ－１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ００３５２２、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、デルタ様１（ＤＬＬ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５６１８及びＮＰ＿００５６０９、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ８０９０３、１４８３２４、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、デルタ－４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）、及び／又はデルタ様４（ＤＬＬ４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ０１９４５４、Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）である。Ｎｏｔｃｈリガンドは、市販されているか、又は例えば、組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。

【0084】

いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒトＤＬＬ１又はＤＬＬ４Ｎｏｔｃｈリガンドと少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％同一（例えば、約１００％同一）であるアミノ酸配列を含む。Ｎｏｔｃｈリガンドの機能的誘導体（その断片又は部分を含む）は、Ｎｏｔｃｈ受容体に結合し、それを活性化することが可能であろう。Ｎｏｔｃｈ受容体への結合は、インビトロ結合アッセイ及び受容体活性化／細胞シグナル伝達アッセイを含む、当該技術分野で公知である様々な方法によって決定され得る。

【0085】

いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、以下のうちの１つ以上（又は全て）などの１つ以上の親和性増強変異を有するＤＬＬ４である：ｈＤＬＬ４に関して、Ｇ２８Ｓ、Ｆ１０７Ｌ、Ｉ１４３Ｆ、Ｈ１９４Ｙ、Ｌ２０６Ｐ、Ｎ２５７Ｐ、Ｔ２７１Ｌ、Ｆ２８０Ｙ、Ｓ３０１Ｒ、及びＱ３０５Ｐ。Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｐｅｒｅｚ，ｅｔａｌ．，Ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｍａｔｕｒｅｄＤＬＬ４ｌｉｇａｎｄｓａｓｂｒｏａｄ－ｓｐｅｃｔｒｕｍｍｏｄｕｌａｔｏｒｓｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ（２０２２）を参照されたい。

【0086】

様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、可溶性であり、磁気濃縮又は集中プロセスを可能にするために任意選択的に常磁性である微粒子又はナノ粒子上に任意選択的に固定化される。なおも他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、任意選択的にＶＣＡＭ－１などの他の接着分子を用いて、２Ｄ又は３Ｄ培養表面上に固定化される。参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０２０／０３９９５９９を参照されたい。他の実施形態では、ビーズ又は粒子は、ポリマー（例えば、ポリスチレン若しくはＰＬＧＡ）、金、デキストラン鉄であるか、又は脂質及び／若しくはタンパク質から形成される粒子などの生物学的物質で構築される。様々な実施形態では、粒子は、約０．０１μｍ（１０ｎｍ）～約５００μｍ（例えば、約１μｍ～約７μｍ）の直径又は最大寸法を有する。なおも他の実施形態では、参照によりその全体で本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１３１５８２に記載されているように、共役リガンドを有するポリマー足場を採用することができる。例えば、足場は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、アルギン酸塩又はアルギン酸塩誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アガロース、ヒアルロン酸、ポリ（リジン）、ポリヒドロキシ酪酸塩、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（アリルアミン）、ポリ（アクリレート）、ポリ（４－アミノメチルスチレン）、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、ポリ（無水物）、ポリ（ビニルピロリドン）、及びそれらの任意の組み合わせから構築することができる。いくつかの実施形態では、足場は、約１ｐｍ～１００ｐｍの直径を有する細孔を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、ＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端は、選択された支持体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、これは、例えば、ビオチン分子を通して支持体に酵素的にコンジュゲートすることができるＮｏｔｃｈリガンドのＣ末端に配列を付加することを含むことができる。別の実施形態では、支持体にコンジュゲートされているプロテインＡ又はプロテインＧに結合することによって、Ｆｃセグメントを固定化することができるように、Ｎｏｔｃｈリガンド－Ｆｃ融合物が調製される。当然ながら、公知のタンパク質コンジュゲーション方法のうちのいずれかを採用することができる。

【0088】

したがって、様々な実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、２Ｄ又は３Ｄ培養系において固定化し、官能化し、かつ／又は埋め込むことができる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、フィブロネクチン、レトロネクチン、及びラミニンから選択される１つ以上などの細胞外基質の成分とともに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド及び／又は細胞外基質の成分は、３Ｄ培養条件を提供する不活性材料に埋め込まれる。例示的な材料としては、セルロース、アルギン酸塩、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｎｏｔｃｈリガンド、細胞外基質の成分、又はそれらの組み合わせは、分化及び／又は増殖を助長する局所的パターン及び／又はテクスチャ（例えば、粗度）を細胞に提供する培養条件と接触している。

【0089】

【0090】

いくつかの実施形態では、未成熟の巨核球が生成され、これらを、ＣＤ３４－ＣＤ４１＋ＣＤ６１＋ＣＤ４２ｂ－として同定することができる。幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－６、及びＩＬ－９から選択されるサイトカイン及び成長因子のうちの１つ以上と培養することによって、巨核球の成熟を促進することができる。いくつかの実施形態では、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及び／又はＩＬ－８は、除外される。巨核球成熟は、細胞質体積の増加、α及び高密度顆粒の数の増加、高密度管状網の形成、並びに／又は顆粒放出のための開放細管系の形成を伴う。いくつかの実施形態では、成熟巨核球は、顆粒を含有する。いくつかの実施形態では、成熟巨核球は、顆粒を含有しない。

【0091】

巨核球倍数性は、血小板産生と相関することができる。例えば、インビボでは、より高い倍数性の巨核球を有する骨髄が、より大きいとともに、より不均一である血小板を産生する。いくつかの実施形態では、本開示に従って産生される成熟巨核球は、少なくとも８Ｎの倍数性を含む。いくつかの実施形態では、成熟巨核球は、少なくとも約８Ｎ、約１６Ｎ、約３２Ｎ、又は約６４Ｎの平均倍数性を含む。

【0092】

【0093】

本開示の組成物（例えば、本開示に従って調製される血小板を含む）は、薬学的に許容される担体を更に含み得る。そのような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、及び他の好適な添加剤を含有することができる。緩衝液は、その化学組成がｐＨの著しい変化を伴わずに酸又は塩基を中和する溶液又は液体を指す。本発明によって想定される緩衝液の例としては、生理／生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ）、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。本組成物は、静脈内注入又は他の投与経路に好適なビヒクルを含み得、本組成物は、好適な抗凍結剤を含み得る。例示的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％ＤＭＳＯ）である。他の担体は、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はジメチルアセトアミドを含み得、それらの混合物又は組み合わせを含む。細胞又は血小板組成物は、埋込型デバイス（例えば、足場）内、又はバッグ内、又はバイアル、チューブ、若しくは容器内に適切な体積で提供され、使用まで凍結保存され得る。

【0094】

様々な実施形態では、本組成物は、５０又は１００ｍＬの体積当たり少なくとも約１０^９個の血小板、又は少なくとも約１０^１０個の血小板、又は少なくとも約１０^１１個の血小板、又は少なくとも約１０^１２個の血小板を含む。

【0095】

開示された方法で使用するための薬学的組成物はまた、特定の標的障害の治療のための追加の治療剤を含有し得る。例えば、薬学的組成物はまた、サイトカイン及び成長因子（インターロイキン、インターフェロン、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＩＧＦ、ＳＴＡＴなど）を含み得る。そのような追加の因子及び／又は薬剤は、本明細書に開示される治療アプローチの利点を生じる、すなわち、低減した全身毒性を有する改善された治療効果を提供するために、薬学的組成物に含まれ得る。

【0096】

他の態様では、血小板は、多血小板血漿（ＰＲＰ）治療を必要とする対象からのＰＲＰを濃縮するために使用される。ここで、インタクトな血小板又はそこから抽出された溶解物の組み合わせを使用して、ドナー由来のＰＲＰなどの他の血小板濃縮血漿源を濃縮することができる。任意選択的に、それは、患者におけるＰＲＰベースの治療用途を補完する、成長因子、サイトカイン、又は他の供給源からの他の薬剤を含み得る。

【0097】

【0098】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、関連する数値の±１０％を意味する。

【0099】

本開示のある特定の態様及び実施形態が、以下の実施例を参照して更に説明される。

【実施例】

【0100】

実施例１－ＥＴＶ２過剰発現は、ｉＰＳＣ分化中に造血内皮細胞の収率を増加させ、ＣＤ３４＋細胞形成を増強するが、多能性には影響を及ぼさない。
方法
当該技術分野で公知であり、本質的に、Ｙｕ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｅｅｏｆｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているエピソーム再プログラミングによって、ｉＰＳＣをｈＣＤ３４＋細胞から開発した。胚様体及び造血内皮分化を、本質的に、Ｒ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ，ｅｔａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍａｎｄｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ５４５，４３２－４３８，（２０１７）、Ｃ．Ｍ．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，ｅｔａｌ，Ｗｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅａｎｄｐｒｉｍｉｔｉｖｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３２，５５４－５６１，（２０１４）、Ｊ．Ｙｕ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８，１９１７－１９２０，（２００７）、及びＪ．Ｙｕ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍａｎｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｅｅｏｆｖｅｃｔｏｒａｎｄｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３２４，７９７－８０１，（２００９）に記載されているように実施した。

【0101】

簡潔に述べると、ｈｉＰＳＣを解離し、Ｌ－グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、アスコルビン酸、ヒトホロ－トランスフェリン、モノチオグリセロール、ＢＭＰ４、及びＹ－２７６３２を補充した培地中に再懸濁させた。次に、細胞をＥＢ形成のために１０ｃｍ皿（ＥＺＳＰＨＥＲＥ又は低付着プレート）に播種した。１日目に、ｂＦＧＦ及びＢＭＰ４を培地に添加した。２日目に、培地を、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ｂＦＧＦ、及びＢＭＰ４を含有する培地に置き換えた。４日目に、細胞培地を、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを補充した培地に置き換えた。６日目に、細胞培地を、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＧＦ－１、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、及びＥＰＯを補充した培地に置き換えた。細胞を、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２、及び９５％湿度のインキュベーター内で維持した。ＣＤ３４＋細胞を採取するために、ＥＢを８日目に解離し、７０μｍストレーナーを通して細胞を濾過し、ＣＤ３４＋細胞をＣＤ３４磁性ビーズ染色によって単離した。

【0102】

結果
ＥＦ１Ａプロモーターの制御下でＥＴＶ２及びＧＦＰ配列の両方を含むアデノウイルスベクターを使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を形質導入した。形質導入後、ｉＰＳＣ培養物の約４５％がＧＦＰ陽性であることを観察し、ＥＴＶ２過剰発現（ＥＴＶ２－ＯＥ）を確認した。幹細胞性マーカー発現ＴＲＡ－１－６０によって示されるように、ｉＰＳＣ細胞におけるＥＴＶ２－ＯＥがｉＰＳＣの多能特性を保持することが更に観察された（図１）。図１は、ＥＴＶ２及びＧＦＰ配列を過剰発現するためのアデノウイルスベクターを用いたｉＰＳＣの形質導入効率を表すＦＡＣＳプロットを示す。

【0103】

次に、ＥＴＶ２－ＯＥ－ｉＰＳＣを（ＥＴＶ２がないＧＦＰ配列を持つベクターで形質導入された対照ｉＰＳＣとともに）、胚様体に分化させ、その後、造血内皮細胞に分化させた（Ｓｔｒｕｇｅｏｎｅｔａｌ．，２０１４）。結果は、ＥＴＶ２の過剰発現が、ＣＤ２３５ａ^－集団内のＣＤ３４^＋及びＣＤ３１^＋マーカーの発現によって実証される、造血内皮細胞の形成を増進することを示唆する（図２）。具体的には、図２は、造血内皮細胞（ここではＣＤ２３５ａ－ＣＤ３４＋ＣＤ３１＋として定義される）の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化が、ＥＴＶ２－ＯＥが対照と比較して造血内皮細胞の形成を増強することを実証することを示す。

【0104】

更に、結果は、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４^＋細胞の形成を増強することを示唆する（図３）。図３は、ＣＤ３４＋細胞の代表的なフローサイトメトリー分析及び相対定量化が、ＥＴＶ２－ＯＥがＣＤ３４＋細胞形成を増強することを実証することを示す。

【0105】

全体的に、これらのデータは、ｉＰＳＣにおけるＥＴＶ２過剰発現が、それらの多能特性に影響を及ぼさず、造血内皮及び造血分化を受けるそれらの能力を促進することを示す。

【0106】

実施例２－Ｐｉｅｚｏ１活性化により生成されたｉＰＳＣ由来のＨＳＣが、骨髄由来のＨＳＣと同様にＴ細胞分化を受ける。
方法
ＥＨＴを分析するために、ＥＢ由来のＣＤ３４＋細胞を、Ｙ－２７６３２、ＴＰＯ、ＩＬ－３、ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、及びＦＬＴ３を含有する培地中に懸濁させた。（目視検査によって）細胞がウェルの底部に約４～１８時間接着した後、いくつかの実験のためにＹｏｄａ１を培養物に添加した。４～７日後、分析のために細胞を収集した。

【0107】

ｉＰＳＣを、８日間胚様体に分化させた。８日目に、ｉＰＳＣ由来の胚様体からのＣＤ３４＋細胞を採取し、更に５～７日間培養して、内皮・造血（ＥＨＴ）転換（Ｙｏｄａ１の有無にかかわらず）を誘導した。次いで、更なる造血系統分化のために、ＣＤ３４＋細胞を５日目～７日目にＥＨＴ培養物から採取した。

【0108】

結果
図４は、巨核球系統への細胞の関与を示す、巨核球分化のＦＡＣＳ分析を示す。ｉＰＳＣ（Ｄ８＋７ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋、Ｙｏｄａ１「Ｙ」の有無にかかわらず）から分化したＣＤ３４＋細胞においてＥＨＴを誘導することによって産生されるＨＳＣ集団は、巨核球への分化を支援することの観点から、分化したｉＰＳＣ（Ｄ８ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋）及び骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４＋細胞から単離されるＣＤ３４＋細胞よりも性能が優れている。図５は、Ｄ８＋７ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋に由来する巨核球細胞（Ｙの有無にかかわらず）が、エクスビボでの増殖が可能であり、Ｄ８ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞から分化し、ＢＭＣＤ３４＋細胞から分化した巨核球に類似する巨核球よりも性能が優れていることを示す。

【0109】

図６は、Ｄ８＋７ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋由来の巨核球がＢＭＣＤ３４＋由来の巨核球に表現型的に類似し、血小板を放出することができることを示す、Ｄ８＋７ｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞に由来する巨核球（Ｙの有無にかかわらず）、及び骨髄からのＣＤ３４＋細胞の血小板分化の免疫蛍光分析を示す。

【0110】

図７は、Ｄ８＋７ｉＰＳＣ－ＣＤ３４（＋Ｙ）由来の血小板が、活性化されると凝固し、血栓形成を促進することができることを示す、これらの血小板からの血栓形成を示す。

【0111】

実施例３－ＨＬＡノックアウトＨＳＣにおける標的外編集の評価
不要な編集をチェックし、かつ主要な編集事象、例えば、欠失（複数可）が染色体６の他の領域内で生じないことを確実にするために、トリプルノックアウト（ＨＬＡ編集）ＨＳＣクローンのＨＬＡタイピングを実施した。ｇＲＮＡ標的外活性の程度を評価し、かつ非標的ＨＬＡ遺伝子に影響を及ぼす低いリスクを表すｇＲＮＡを選択するために、配列決定方法及び分析を実施した。

【0112】

完全長Ｐ５配列決定アダプターを末端調製ＤＳＢにライゲーションすることによって、固定及び透過性細胞でインサイチュ切断標識を使用することによって、配列決定を実施した。ゲノムＤＮＡを抽出し、断片化し、末端調製し、化学的に修飾された半機能的Ｐ７アダプターを使用してライゲーションした。結果として得られるＤＮＡライブラリは、機能的ＤＳＢ標識断片（Ｐ５：Ｐ７）及び非機能的ゲノムＤＮＡ断片（Ｐ７：Ｐ７）の混合物を含有した。ＤＮＡライブラリの後続のＤＮＡ配列決定は、全ての無関係な非機能的ＤＮＡを排除して、ＤＮＡ標識断片を濃縮した。ライブラリ調製物がＰＣＲフリーであるため、得られた各配列決定リードは、細胞からの単一の標識ＤＳＢ末端と同等であった。これは、ＤＮＡ切断の読み出しを生成し、エラー訂正を必要とすることなく配列決定することによってゲノムＤＳＢの直接検出と定量化を可能にし、標的外変異の明確なリストのマッピングを可能にした。

【0113】

以下の表１は、野生型細胞に対する２つの代表的なクローンにおける編集方略の結果を要約する。

【表1】

【0114】

表２は、示されたＨＬＡ遺伝子の発現をノックアウトするために使用することができる実験で使用されるｇＲＮＡの非限定的な例を提供する。

【表2】

【0115】

結果は、編集方略が、他のＨＬＡ遺伝子に影響を及ぼすことなく、又は他の場所で主要な欠失を導入することなく、ＨＬＡ－Ａ、ＤＰＢ１、及びＤＱＢ１遺伝子を選択的に標的化することに成功したことを示す。

【0116】

これらの結果は、ＦＡＣＳ及び免疫蛍光によるＨＬＡ編集クローンの表現型分析によって確認された。図８Ａ及びＢに示されるように、ＨＬＡ編集細胞は、野生型細胞のＨＬＡクラスＩ分子の全体的な発現と同等である、ＨＬＡクラスＩ分子の全体的な発現について検査で陽性であった。免疫蛍光を介したＨＬＡ－Ａの特異的発現は、ＨＬＡ－ＡがＨＬＡ編集細胞において発現されなかったことを確認し、遺伝子編集方略がＨＬＡ－Ａ遺伝子のみを欠失することに成功したという所見を裏付けた。具体的には、図８Ａは、ＨＬＡ編集細胞が全て、野生型（ＷＴ）（すなわち、非ＨＬＡ編集）細胞と同程度にＨＬＡのようなクラスＩについて陽性であったことを示す。この結果は、ＨＬＡ－Ａの欠失にもかかわらず、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのような他のクラスＩ分子が発現され、遺伝子編集方略の影響を受けなかったことを示す。

【0117】

ＨＬＡ－Ａ遺伝子が欠失したことを確認するために、ＨＬＡ－Ａの特異的発現を免疫蛍光で分析した。図８Ｂで見ることができるように、ＨＬＡ－Ａは、ＨＬＡ編集クローンにおいて発現されず、遺伝子編集方略がＨＬＡ－Ａ遺伝子のみを特異的に欠失することに効率的であったことを示す。ＨＬＡ－Ａの欠失を伴う全体的なクラスＩ発現のそのような保存は、ＮＫ細胞媒介性拒絶反応を回避しながら、患者適合を促進するであろう。

【0118】

実施例４－ＨＬＡ編集ＨＳＣの多能性及び免疫適合性の評価
多能性を保存するＨＬＡ編集細胞の能力を評価した。図９に示されるように、ＨＬＡ編集ｉＰＳＣクローンの免疫蛍光評価は、それらが３系統分化を維持したことを示し、外胚葉分化がＮＥＳＴＩＮ－４８８及びＰＡＸ６－５９４染色によって示され、中胚葉分化がＧＡＴＡ－４８８染色によって示され、内胚葉分化がＣＸＣＲ４－４８８及びＦＯＸ２Ａ－５９４染色によって示される。

【0119】

ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面上で発現され、ＨＬＡクラスＩ分子がドナーとレシピエントとの間で不適合である場合、細胞が認識され、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって殺傷され得る。加えて、ＨＬＡ不適合は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）につながり得る。逆に、Ｂ２ＭＫＯを介したＨＬＡ－Ｉ分子の完全な欠失は、細胞をＮＫ細胞媒介性細胞傷害性の標的にするであろう。ＨＬＡ－Ａの欠失を伴う全体的なクラスＩ発現の保存は、ＮＫ細胞媒介性拒絶反応を回避しながら、患者適合を促進することができる。したがって、ＨＬＡ編集ＨＳＣの免疫適合性を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共培養によって試験して、免疫細胞がＨＬＡ編集及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）の移植片を拒絶するかどうかを評価した。

【0120】

野生型（ｇＨＳＣ）及びＨＬＡ編集ＨＳＣを、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃマーカーに適合するが不適合ＨＬＡ－Ａを有するＰＢＭＣと共培養した。ＨＬＡクラスＩ分子の発現を欠くＢ２ＭＫＯＨＳＣ及びクラスＩＩ分子の発現を欠くＣＩＩＴＡＫＯＨＳＣを、それぞれ、ＨＬＡヌル及び不適合ＨＬＡについてＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性の程度を比較するために対照として使用した。図１０は、アネキシンＶ染色によって測定される共培養におけるＰＢＭＣ媒介性細胞毒性アッセイの結果を示す。結果は、ＨＬＡ編集ＨＳＣにおけるＨＬＡ－Ａの欠失が、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性から細胞を保護する一方で、ＷＴ、Ｂ２ＭＫＯ、及びＣＩＩＴＡＫＯが、ＰＢＭＣ媒介性細胞傷害性の影響を受けやすかったことを示す。同じＰＢＭＣドナーからの選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したＨＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞傷害性からＨＬＡ編集及びＢ２ＭＫＯＨＳＣを保護した。逆に、選別されたＮＫ細胞と共培養したＨＳＣは、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性からＷＴ及びＨＬＡ編集細胞のみを保護した。

【0121】

要約すると、免疫適合性結果は、ＰＢＭＣ試料中に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞が不適合ＨＬＡ分子（ＷＴ）及びＣＩＩＴＡＫＯを有する細胞を殺傷することに関与した一方で、ＰＢＭＣ中に存在するＮＫ細胞がＨＬＡヌル細胞（Ｂ２ＭＫＯ）を殺傷することに関与したことを示す。しかしながら、ＨＬＡ編集ＨＳＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性から保護され（不適合ＨＬＡ－Ａがノックアウトされていたため）、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害性から保護される（ＨＬＡクラスＩ分子発現が大部分は保存されたため）。

【0122】

実施例５－ＨＬＡ編集ＨＳＣのインビボ生着能の評価
ＨＬＡ編集ＨＳＣの生着能を評価するために、インビボで生着する細胞の能力を、ＷＴＨＳＣに対する競合的移植によって評価した。等しい割合のｍＣｈｅｒｒｙＨＬＡ編集ＨＳＣ及び野生型ＨＳＣ（ｇＨＳＣ）を混合し、マウスに移植し、骨髄（ＢＭ）及び末梢血試料を回収し、ＦＡＣＳによって評価して、試料中に存在する各細胞型の相対量を比較した。図１１に示されるように、ＨＬＡ編集ＨＳＣ及びＷＴＨＳＣの両方が、ＢＭ及び末梢血試料におけるほぼ等しい生着に寄与した。これらの結果は、ＨＬＡ編集ＨＳＣ（本開示に従って調製される）が、それらの生着及び再構築能においてＷＴＨＳＣと同等であることを確認する。したがって、ＷＴ（未編集、親）ＨＳＣの特性は、Ｔ細胞系統を生成するために本開示のＨＬＡ編集ＨＳＣの特性と一致することが予期される。

【0123】

実施例６：前巨核球／前血小板へのＨＬＡ編集ＨＳＣの分化
ＨＬＡ編集ＨＳＣは、巨核球（ＭＫ）に分化し、更に血小板に分化することができることが決定された。分化を骨髄（ＢＭ）由来のＣＤ３４＋細胞及びｉＰＳＣ－ＣＤ３４＋細胞に対して比較した。図１２に示されるように、ＨＬＡ編集ＨＳＣは、ＢＭＣＤ３４＋及びｉＰＳＣ－３４＋細胞集団と比較して、血小板含有量の統計的に有意な増加を示した。したがって、ＨＬＡ編集ＨＳＣは、血小板への分化を更に支援することができる巨核球（ＭＫ）に分化することができる。

【0124】

参考文献
１．Ｎｉａｎｉａｓ，Ａ．＆Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．ＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌ（ｉＰＳＣ）－ＤｅｒｉｖｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｏｒＡｄｏｐｔｉｖｅＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓａｎｄＣｈａｌｌｅｎｇｅｓ．ＣｕｒｒＨｅｍａｔｏｌＭａｌｉｇＲｅｐ１４，２６１－２６８（２０１９）．
２．Ｂｒａｕｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｊ．，Ｘｈｉｋｕ，Ｓ．＆Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．ＴＣｅｌｌＧｅｎｅｓｉｓ：ＩｎＶｉｔｒｏＶｅｒｉｔａｓＥｓｔ？ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ３７，８８９－９０１（２０１６）．
３．Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．ｅｔａｌ．ＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＰｏｔｅｎｔｉａｌＭａｒｋｓｔｈｅＥｍｅｒｇｅｎｃｅｏｆＤｅｆｉｎｉｔｉｖｅＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓｉｎＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＣｕｌｔｕｒｅｓ．ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ２，１７２２－１７３５（２０１２）．
４．Ｓｔｕｒｇｅｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｉｔａｄｉ，Ａ．，Ａｗｏｎｇ，Ｇ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｍ．＆Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．ＷｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇＣｏｎｔｒｏｌｓｔｈｅＳｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｅｆｉｎｉｔｉｖｅａｎｄＰｒｉｍｉｔｉｖｅＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓＦｒｏｍＨｕｍａｎＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３２，５５４－５６１（２０１４）．
５．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．－Ｗ．，Ｌａｉ，Ｙ．－Ｓ．，Ｌａｍｂ，Ｌ．Ｓ．＆Ｔｏｗｎｅｓ，Ｔ．Ｍ．ＢｒｏａｄＴ－ＣｅｌｌＲｅｃｅｐｔｏｒＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅｉｎＴ－ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＨｕｍａｎＩｎｄｕｃｅｄＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔＳｔｅｍＣｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ９，（２０１４）．
６．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｊｕｖｅｎａｔｅｄＡｎｔｉｇｅｎ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＴＣｅｌｌｓｂｙＲｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇｔｏＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙａｎｄＲｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１２，１１４－１２６（２０１３）．
７．Ｔｈｅｍｅｌｉ，Ｍ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄｈｕｍａｎＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３１，９２８－９３３（２０１３）．
８．Ｖｉｚｃａｒｄｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．ＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎＴｕｍｏｒＡｎｔｉｇｅｎ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＴＣｅｌｌｓｆｒｏｍｉＰＳＣｓＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＭａｔｕｒｅＣＤ８＋ＴＣｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ１２，３１－３６（２０１３）．
９．Ｍｏｎｔｅｌ－Ｈａｇｅｎ，Ａ．ｅｔａｌ．Ｏｒｇａｎｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＴｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ２４，３７６－３８９．ｅ８（２０１９）．
１０．Ｇｕｏ，Ｒ．ｅｔａｌ．ＧｕｉｄｉｎｇＴｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｓｉｓｆｒｏｍｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｄｅｆｉｎｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ３０，２１－３３（２０２０）．
１１．Ｎａｇａｎｏ，Ｓ．ｅｔａｌ．ＨｉｇｈＦｒｅｑｕｅｎｃｙＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＴＣｅｌｌ－ＤｅｒｉｖｅｄｉＰＳＣＣｌｏｎｅｓＣａｐａｂｌｅｏｆＧｅｎｅｒａｔｉｎｇＰｏｔｅｎｔＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＣｅｌｌｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ＣｌｉｎｉｃａｌＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１６，１２６－１３５（２０２０）．
１２．Ｉｒｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔａｌ．ＡｃｌｉｎｉｃａｌｌｙａｐｐｌｉｃａｂｌｅａｎｄｓｃａｌａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｔｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｅＴ－ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｉＰＳＣｓｆｏｒｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆＴ－ｃｅｌｌｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．ＮａｔｕｒｅＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１２，４３０（２０２１）．

【図1】