特表 2025-534433 単一分子多分子トレース法およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2025-10-15

(54)【発明の名称】単一分子多分子トレース法およびシステム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20251007BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20251007BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20251007BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z ZNA

C12N15/09 Z

C12M1/00 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2025519164

(86)(22)【出願日】2023-09-29

(85)【翻訳文提出日】2025-05-23

(86)【国際出願番号】 EP2023077003

(87)【国際公開番号】W WO2024074412

(87)【国際公開日】2024-04-11

(31)【優先権主張番号】63/412,774

(32)【優先日】2022-10-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＨＵＮＤＥＲＢＯＬＴ

２．ＪＡＶＡ

３．ＳＷＩＦＴ

４．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】バラル，ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】ハラダ，タケシ

(72)【発明者】

【氏名】コマディナ，ジェイソン・デビッド

(72)【発明者】

【氏名】マニオン，ジョン・ティー

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029AA27

4B029BB20

4B029CC01

4B029DG10

4B029FA15

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR66

4B063QS39

4B063QX02

4B063QX04

(57)【要約】

拡張による配列決定方法およびナノポア中の代理ポリマーの配列決定に対する関連する改善が記載される。代理ポリマーは、鋳型核酸分子から形成される。代理ポリマーは、複数のユニットを含む。各ユニットは、レポーターコード部分を含む。レポーターコードは、異なるヌクレオチドに対応する。代理ポリマーは、ナノポアに固着し得る。本明細書に記載の実施形態は、これらの固着した代理ポリマーに対処する。代理ポリマーに対する複数のリードを可能にするために、プロセッシブコンセンサスの技術を適用することができる。代理ポリマーは、同じレポーターコードのいくつかが再び識別されるように、数単位前方に移動させられ、次いでより少ない単位後方に移動させられ得る。この方法は、同じレポーターコードの複数のリードを可能にする。代理ポリマーは、最終的に順方向にナノポアを通過する。定期的に、ナノポアに固着した代理ポリマーを取り除くために、より高い除去電圧が印加され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸分子を配列決定するための方法であって、
ナノポアにわたって第１のレベルの第１の数の電圧パルスを印加して、前記標的核酸分子から生成された化合物を、前記ナノポアを通って第１の方向に第１の距離だけ変位させるステップであって、
前記化合物は複数のユニットを含み、
前記複数のユニットの各ユニットは、複数の種類のレポーター要素のうちの１種類のレポーター要素を含み、
各種類のレポーター要素は、前記標的核酸分子内のヌクレオチドの同一性に対応し、
前記第１の数の電圧パルスを印加すると、前記複数のユニットの第１のサブセットが前記ナノポアを通過する、ステップと；
前記ナノポアにおいて、前記第１のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップと；
前記ナノポアにわたって第２のレベルの第２の数の電圧パルスを印加して、前記化合物を、前記ナノポアを通って第２の方向に第２の距離だけ変位させるステップであって、
前記第１の方向は前記第２の方向と反対であり、
前記第１の数の電圧パルスの前記電圧パルスは、前記第２の数の電圧パルスの前記電圧パルスと反対の極性を有し、
前記第２の距離は前記第１の距離未満であり、
前記第２の数は前記第１の数未満である、ステップと；
前記ナノポアにわたって第３のレベルの第３の数の電圧パルスを印加して、前記化合物を、前記ナノポアを通って前記第１の方向に第３の距離だけ変位させるステップであって、
前記第３の数の電圧パルスを印加すると、前記複数のユニットの第２のサブセットが前記ナノポアを通過し、
前記第２のサブセットおよび前記第１のサブセットは、同じユニットの一部を含み、
前記第２のサブセットは、前記第１のサブセットにないユニットを含み、
前記第３の距離は前記第２の距離よりも大きい、ステップと；
前記ナノポアにおいて、前記第２のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップであって、前記第４のレベルが、前記第１のレベル、前記第２のレベル、および前記第３のレベルよりも大きい、ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記化合物が、複数の化合物のうちの第１の化合物であり、
前記複数の化合物が、複数の標的核酸分子から生成され、
前記ナノポアが、複数のナノポアのうちの第１のナノポアであり、
前記複数の化合物の各化合物が、前記複数のナノポアのうちの１つのナノポア内にある請求項１または２に記載の方法であって、
前記第１のレベルの前記第１の数の電圧パルス、前記第２のレベルの前記第２の数の電圧パルス、および前記第３のレベルの前記第３の数の電圧パルスを前記複数のナノポアに印加するステップ
をさらに含む、方法。

【請求項4】

前記複数の標的核酸分子の複数の配列を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記複数の配列のサイズ分布が、３００ｎｔより大きいモードを有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のレベルの前記第１の数の電圧パルス、前記第２のレベルの前記第２の数の電圧パルス、および前記第３のレベルの前記第３の数の電圧パルスを前記複数のナノポアに印加するステップと；
前記複数の化合物の第１の部分が、前記複数のナノポアの第１の部分において、前記第１の数の電圧パルス、前記第２の数の電圧パルス、または前記第３の数の電圧パルスによって変位されていることを決定するステップと、
前記複数のナノポアの第２の部分の各ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、前記複数の化合物の第２の部分を前記複数のナノポアのそれぞれのナノポアから完全に排出するステップであって、
前記第４のレベルが、前記第１のレベル、前記第２のレベル、および前記第３のレベルよりも大きく、
前記複数のナノポアの前記第２の部分が、前記複数のナノポアの前記第１の部分のナノポアを含まない、ステップと
をさらに含む、請求項３または４に記載の方法。

【請求項7】

前記標的核酸分子の配列を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記標的核酸分子の前記配列を決定するステップが、前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットの両方における１つまたは複数のユニットについて、同じ種類のレポーター要素を検出することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップが、前記第３の数の電圧パルスの前記印加中に行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記複数のユニットの各ユニットが移動制御要素を含み、
前記第１の数の電圧パルスを印加すると、第１の数の移動制御要素が前記ナノポアを通過し、
前記第１の数の電圧パルスが、前記第１の数の移動制御要素に等しい、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ナノポアにわたって第４のレベルの電圧を印加して、前記化合物を、前記第１の数の電圧パルスの電圧パルスの間に前記ナノポアを通って前記第１の方向に第４の距離だけ変位させるステップであって、
前記第４のレベルの前記電圧が、前記第１の数の電圧パルスの前記電圧パルスと同じ極性であり、
前記第４のレベルが前記第１のレベル未満であり、
前記第４の距離だけ変位した後の前記化合物が、前記ナノポア内に移動制御要素を有する、ステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２のレベルが前記第１のレベルよりも大きい、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記複数のユニットの前記第１のサブセット中のレポーター要素がナノポア内にある場合に前記ナノポアにわたって印加される電圧を有する前記ナノポアについての信号値を測定するステップと；
前記信号値を使用して、前記第１のサブセット中のレポーター要素の種類を決定し、それによって前記標的核酸分子中のヌクレオチドの同一性を決定するステップと
をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記複数のユニットの前記第１のサブセットが３０個以上のユニットを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第３のレベルが前記第１のレベルに等しい、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記標的核酸分子が２００ｎｔよりも長い、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の数の電圧パルスが３０以上である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第１の数の電圧パルスが、前記第２の数の電圧パルスを５以上上回ることがある、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

実行されるとコンピュータシステムを制御して請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法を実施する複数の命令を記憶している非一時的コンピュータ可読媒体を備える、コンピュータ製品。

【請求項21】

請求項２０に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するための１つまたは複数のプロセッサと
を備える、システム。

【請求項22】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を備えるシステム。

【請求項23】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された１つまたは複数のプロセッサを備えるシステム。

【請求項24】

請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法の前記ステップをそれぞれ実施するモジュールを備えるシステム。

【発明の詳細な説明】

【関連出願】

【0001】

関連特許出願の相互参照
本特許出願は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる、２０２２年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６３／４１２，７７４号の優先権の利益を主張する。

【技術分野】

【0002】

本明細書に記載の実施形態は、ナノポアベースの配列決定法およびシステムに関する。特に、方法およびシステムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ ｅＸｐａｎｓｉｏｎ（ＳＢＸ（商標））を使用してコンセンサスリードを生成する方法を含む。

【背景技術】

【0003】

内径が１ナノメートルのオーダーの細孔サイズを有するナノポア膜デバイスは、素早いヌクレオチド配列決定において有望であることが示されている。電位が、伝導性流体に浸されたナノポアにわたって印加されると、ナノポアにわたるイオンの伝導に起因する小イオン電流が存在できる。電流のサイズは、細孔サイズ、およびナノポア内の分子のタイプに影響を受けやすい。分子は、特定のヌクレオチドに対応する特定のレポーターコードとなり得、したがって、核酸の特定の位置でのヌクレオチドの検出が可能となる。分子の抵抗を測定する方法として、ナノポアを有する回路内の電圧または他の信号を測定し（例えば、積分コンデンサで）、どの分子がナノポア内にあるかを検出することが可能である。

【0004】

ナノポアベースの配列決定チップは、ＤＮＡ配列決定に使用され得る。ナノポアベースの配列決定チップは、アレイとして構成された多数のセンサセルを組み込むことができる。例えば、１００万個のセルのアレイは、１０００行×１０００列のセルを含み得る。

【0005】

測定される信号は、製造のばらつきのために、チップごとに、および同じチップのセルごとに異なり得る。したがって、セル内の特定の核酸または他のポリマー中の正しいヌクレオチドであり得るかまたはそれに対応し得る正しい分子を決定することは困難であり得る。さらに、測定された信号における他の時間依存的非理想性が、不正確さをもたらし得る。そして、これらの回路は、例えば脂質二重層、ナノポア等の生化学回路要素を使用するため、電気的特性の変動性は、従来の半導体回路よりもはるかに高くなり得る。さらに、配列決定プロセスは本質的に確率的であり、したがって、ナノポアを使用しない配列決定装置を含む多種多様なシステムにわたって変動が起こり得る。

【0006】

したがって、配列決定プロセスの精度および安定性を改善するために、改善された特性評価技術が望まれる。

【発明の概要】

【0007】

本明細書に記載の実施形態は、ナノポア内の核酸情報でコードされた代理ポリマーの配列決定方法および配列決定の改善を含む。代理ポリマー（本明細書では「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」ポリマーとも呼ばれる）は、配列データの個々の要素の線形分離を増加させながら、標的核酸の元の遺伝情報を保存するテンプレート指向合成によって形成される。代理ポリマーは、鋳型核酸分子から形成される。代理ポリマーは、複数のユニットを含む。各ユニットは、１つまたは複数のレポーターコード部分を含む。レポーターコードは、異なるヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）に対応する。レポーターコードは、ナノポアにおいて異なる電気信号を生成し、したがってヌクレオチド配列の識別を可能にする。各ユニットは、移動制御要素（ＴＣＥ）を含む。ナノポアを通過するために、ＴＣＥは、ナノポアを通ってユニットの残りを駆動するためのベースライン電圧と比較して、印加されるべきより高い電圧を必要とする。複数のリードを可能にするために、、代理ポリマーを、数回にわたってナノポアを通過して往復させることができる。代理ポリマーは、１つのリーダーセグメントを含み、これは、ナノポアから代理ポリマーを後退させるときにナノポアの片側の膜に固着し得る。本明細書に記載の実施形態は、これらの固着した代理ポリマーに対処する。

【0008】

代理ポリマーに対する複数のリードを可能にするために、プロセッシブコンセンサスの技術を適用することができる。代理ポリマーは、同じレポーターコードのいくつかが再び識別されるように、数単位前方（例えば、３０）に移動させられ、次いでより少ない単位後方（例えば、２５）に移動させられ得る。この方法は、同じレポーターコードの複数のリードを可能にする。代理ポリマーは、最終的に順方向にナノポアを通過する。定期的に、ナノポアに固着した代理ポリマーを取り除くために、より高い除去電圧が印加され得る。

【0009】

除去電圧は、より頻繁に印加されてもよいが、目標とする方法で印加されてもよい。代理ポリマーがナノポアに固着していると判定されないセル（すなわち、ウェル）は、除去電圧が印加される前に非アクティブ化され得る。技術により、任意の長さの分子を、それらの全長において１より大きい深度で配列決定することができる。

【0010】

上記を考慮して、本開示の一態様は、標的核酸分子を配列決定するための方法であって、ナノポアにわたって第１のレベルの第１の数の電圧パルスを印加して、標的核酸分子から生成された化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第１の距離だけ変位させるステップであって、化合物は複数のユニットを含み、複数のユニットの各ユニットは、複数の種類のレポーター要素のうちの１種類のレポーター要素を含み、各種類のレポーター要素は、標的核酸分子中のヌクレオチドの同一性に対応し、第１の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第１のサブセットがナノポアを通過する、ステップと；ナノポアにおいて、第１のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップと；ナノポアにわたって第２のレベルの第２の数の電圧パルスを印加して、化合物を、ナノポアを通って第２の方向に第２の距離だけ変位させるステップであって、第１の方向は第２の方向と反対であり、第１の数の電圧パルスの電圧パルスは、第２の数の電圧パルスの電圧パルスと反対の極性を有し、第２の距離は第１の距離未満であり、第２の数は第１の数未満である、ステップと；ナノポアにわたって第３のレベルの第３の数の電圧パルスを印加して、化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第３の距離だけ変位させるステップであって、第３の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第２のサブセットがナノポアを通過し、第２のサブセットおよび第１のサブセットは、同じユニットの一部を含み、第２のサブセットは、第１のサブセットにないユニットを含み、第３の距離は第２の距離よりも大きい、ステップと；ナノポアにおいて、第２のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップとを含む、方法である。

【0011】

いくつかの実施形態において、本方法は、ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、化合物をナノポアから完全に排出するステップであって、第４のレベルが、第１のレベル、第２のレベル、および第３のレベルよりも大きい、ステップをさらに含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、化合物は、複数の化合物のうちの第１の化合物であり、複数の化合物は、複数の標的核酸分子から生成され、ナノポアは、複数のナノポアのうちの第１のナノポアであり、複数の化合物の各化合物は、複数のナノポアのうちの１つのナノポア内にあり、本方法は、第１のレベルの第１の数の電圧パルス、第２のレベルの第２の数の電圧パルス、および第３のレベルの第３の数の電圧パルスを複数のナノポアに印加するステップをさらに含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、本方法は、複数の標的核酸分子の複数の配列を決定するステップをさらに含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、複数の配列のサイズ分布は、３００ｎｔより大きいモードを有する。

【0015】

いくつかの実施形態において、本方法は、第１のレベルの第１の数の電圧パルス、第２のレベルの第２の数の電圧パルス、および第３のレベルの第３の数の電圧パルスを複数のナノポアに印加するステップと；複数の化合物の第１の部分が、複数のナノポアの第１の部分において、第１の数の電圧パルス、第２の数の電圧パルス、または第３の数の電圧パルスによって変位されていることを決定するステップと、複数のナノポアの第２の部分の各ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、複数の化合物の第２の部分を複数のナノポアのそれぞれのナノポアから完全に排出するステップであって、第４のレベルが、第１のレベル、第２のレベル、および第３のレベルよりも大きく、複数のナノポアの第２の部分が、複数のナノポアの第１の部分のナノポアを含まない、ステップとをさらに含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、本方法は、標的核酸分子の配列を決定するステップをさらに含む。

【0017】

いくつかの実施形態において、標的核酸分子の配列を決定するステップは、第１のサブセットおよび第２のサブセットの両方における１つまたは複数のユニットについて、同じ種類のレポーター要素を検出することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、本方法は、化合物をナノポアから完全に排出するステップをさらに含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、化合物をナノポアから完全に排出するステップは、第３の数の電圧パルスの印加中に行われる。

【0020】

いくつかの実施形態において、複数のユニットの各ユニットは移動制御要素を含み、第１の数の電圧パルスを印加すると、第１の数の移動制御要素がナノポアを通過し、第１の数の電圧パルスは、第１の数の移動制御要素に等しい。

【0021】

いくつかの実施形態において、本方法は、ナノポアにわたって第４のレベルの電圧を印加して、化合物を、第１の数の電圧パルスの電圧パルスの間にナノポアを通って第１の方向に第４の距離だけ変位させるステップであって、第４のレベルの電圧が、第１の数の電圧パルスの電圧パルスと同じ極性であり、第４のレベルが第１のレベル未満であり、第４の距離だけ変位した後の化合物が、ナノポア内に移動制御要素を有する、ステップをさらに含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、第２のレベルは第１のレベルよりも大きい。

【0023】

いくつかの実施形態において、本方法は、複数のユニットの第１のサブセット中のレポーター要素がナノポア内にある場合にナノポアにわたって印加される電圧を有するナノポアについての信号値を測定するステップと；信号値を使用して、第１のサブセット中のレポーター要素の種類を決定し、それによって標的核酸分子中のヌクレオチドの同一性を決定するステップとをさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、複数のユニットの第１のサブセットは３０個以上のユニットを含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、第３のレベルは第１のレベルに等しい。

【0026】

いくつかの実施形態において、標的核酸分子は２００ｎｔよりも長い。

【0027】

いくつかの実施形態において、第１の数の電圧パルスは３０以上である。

【0028】

いくつかの実施形態において、第１の数の電圧パルスは、第２の数の電圧パルスを５以上上回ることがある。

【0029】

本開示の別の態様は、実行されるとコンピュータシステムを制御して前述の方法およびその実施形態を実施する複数の命令を記憶している非一時的コンピュータ可読媒体を備える、コンピュータ製品である。

【0030】

本開示の別の態様は、コンピュータ製品と、コンピュータ可読媒体に記憶された命令を実施するための１つまたは複数のプロセッサとを備えるシステムである。

【0031】

本開示のさらなる態様は、上記の方法のいずれかを実施するための手段を備えるシステム、上記の方法のいずれかを実施するように構成された１つまたは複数のプロセッサを備えるシステム、および上記の方法のいずれかのステップをそれぞれ実施するモジュールを備えるシステムである。

【0032】

以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって、本発明の実施形態の性質および利点をよりよく理解できるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本発明の実施形態による代理ポリマーの構成要素を示す図である。

【図2】本発明の実施形態によるＸＮＴＰ構造の詳細を示す図である。図２に示される分子構造は化学的に正しくない場合がある。図２は、例示を目的として提供されている。

【図3】本発明の実施形態による代理ポリマー合成のための固体基板への伸長オリゴマーの結合を示す図である。

【図4】本発明の実施形態による伸長オリゴマー、リーダー、および付近の構成要素の構造を示す図である。図４に示される分子構造は化学的に正しくない場合がある。図４は、例示を目的として提供されている。

【図5A】本発明の実施形態による典型的な拡張による配列決定波形を用いる単一分子－多分子トレース事象の一例を示す図である。

【図5B】本発明の実施形態によるポアを取り除かない分子を示す図である。

【図6】本発明の実施形態による同じ順方向電圧および逆方向電圧を伴う代理ポリマーを配列決定するための１つの戦略を示す図である。

【図7】本発明の実施形態による異なる順方向電圧および逆方向電圧を伴う代理ポリマーを配列決定するための戦略を示す図である。

【図8】本発明の実施形態による短縮された明期間持続時間を伴う代理ポリマーを配列決定するための戦略を示す図である。

【図9】本発明の実施形態による配列決定戦略による明期間および暗期間スケジュールを示す図である。

【図10】本発明の実施形態による逆ナノポアを使用して配列決定するための戦略を示す図である。

【図11】本発明の実施形態による、プロセッシブマルチパスリード生成のための電圧スケジュールを示す図である。

【図12】本発明の実施形態による組み立てられた捕捉生リードシリーズを示す図である。

【図13】本発明の実施形態によるナノポアから代理ポリマーを取り除くためのメタ期間を示す図である。

【図14】本発明の実施形態による組み立てられた捕捉生リードシリーズを示す図である。

【図15A】本発明の実施形態によるオープンチャネルＡＤＣにおける異なる濃度の酸化還元対の効果を示す図である。

【図15B】本発明の実施形態によるオープンチャネルＡＤＣにおける異なる濃度の酸化還元対の効果を示す図である。

【図16】本発明の実施形態による標的核酸分子を配列決定するための例示的なプロセスのフローチャートを示す図である。

【図17】本発明の実施形態による測定システムを示す図である。

【図18】本発明の実施形態によるシステムおよび方法によって使用可能な例示的なコンピュータシステムのブロック図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本明細書に記載の実施形態は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｂｙ ｅＸｐａｎｓｉｏｎ（ＳＢＸ（商標））プロトコルを含む、ナノポア配列決定ためのプロトコルを含む。プロトコルは、順方向には容易にポアに入るが、逆方向にはポアを通過するための高い障壁を有するという特性を有する分子の「リード」部分を含む。さらに、実施形態は、ナノポア内に代理ポリマー（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）分子を電気的に捕捉し、同じ代理ポリマー分子で複数のパスまたはリードを可能にするように制御された方法で分子を配置するように設計された、修正された明期間および暗期間印加電圧パターンを含む。さらに、実施形態は、より高い電圧パルスおよび／またはより長いサイクル時間を周期的な明／暗サイクルに印加して、最終的にポアから分子を取り除くことを含む。いくつかの実施形態は、各グローバルパルス印加期間に特定のポアからのみ分子を取り除くために、より高い電圧パルスの選択的印加を使用することを含む。利点としては、化合物分子トレース事象（すなわち、一連の明期間における同じ分子からのサブリード）の富化が挙げられる。他の利点としては、ポア占有率および生ベースコールスループットの増加が挙げられ得る。さらに、プロトコルは、シングルパスリードと比較して、より高い精度のマルチパスリードをもたらし得る。実施形態は、長い代理ポリマー分子のリードを永久的にカットオフすることなく、はるかに短い明期間で実行することを含み得る。これにより、短い明期間減衰時定数をもたらす実用的な実験条件が可能となり得る。

【0035】

さらに、実施形態は、特定のＵＭＩ（分子バーコード）分子ファミリーからの代理ポリマーにより多くの時間を費やし、他のＵＭＩ分子ファミリーからの代理ポリマーにより少ない時間を費やすことを動的に選択する能力を含み得る。ＵＭＩは、試料調製段階中に試料核酸に添加され得る。特定の試料由来のすべての核酸断片は、同じＵＭＩを有する。異なる試料は異なるＵＭＩを有する。ＵＭＩは、各核酸分子の試料を識別しながら、配列決定のために異なる試料を一緒にプールすることを可能にする。配列決定の間に、特定のＵＭＩファミリー（すなわち、試料）由来の配列がさらなる配列決定を必要とし得ることが決定され得る。例えば、ある特定のベースコールの信頼性は、同じ位置に対する異なるベースコールの数が比較的多いために低くなり得る。これらの試料由来の断片は、本明細書に記載の方法を使用して余分に配列決定され得る。

【0036】

Ｉ．拡張による配列決定
実施形態は、ナノポアを使用した拡張による配列決定（ＳＢＸ）に適用され得る。拡張による配列決定は、２０２０年５月１４日に出願された国際公開第２０２０／２３６５２６号パンフレット「Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｏｄｅｓ，ａｎｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｍｅａｎｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」および２００８年６月１９日に出願された米国特許第７，９３９，２５９号明細書「Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」に記載されており、これらの両方の全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0037】

拡張による配列決定プロトコルは、「ＸＮＴＰ」と呼ばれる高度に修飾された非天然ヌクレオチド類似体の重合に基づいている。一般的に、ＳＢＸは、生化学的重合を使用して、ＤＮＡ鋳型の配列を「Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ」と呼ばれる測定可能なポリマー上に転写する。転写された配列は、約１０ｎｍ離れた高シグナル対ノイズレポーターにおいてＸｐａｎｄｏｍｅｒ骨格に沿ってコードされ、高シグナル対ノイズ、高分化応答のために設計される。これらの違いは、天然ＤＮＡと比較して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの配列リード効率および精度の著しい性能向上をもたらす。

【0038】

Ａ．代理ポリマー構造
図１は、代理ポリマー（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ）の構成要素を示す。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、標的ＤＮＡ配列の順序に対応する順序付けられたＸＮＴＰの配列を含む。図１は縮尺通りではない。ＸＮＴＰは、鋳型依存性酵素重合と適合性の拡張可能な５’三リン酸修飾非天然ヌクレオチド類似体である。ＸＮＴＰは、２つの異なる機能領域、すなわち、５’α－ホスフェートを核酸塩基に結合させる選択的に切断可能なホスホルアミデート結合、およびホスホルアミデート結合の切断による制御された拡張を可能にする位置でヌクレオシドトリホスホルアミデート内に結合される対称的に合成されたレポーターテザー（ＳＳＲＴ）を有する。ＳＳＲＴは、選択的に切断可能なホスホルアミデート結合によって分離されたリンカーを含む。各リンカーは、レポーターコードの一端に結合する。

【0039】

セクション１０２は、プライマー指向性Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を示す。ＸＮＴＰ １０４は、ＸＮＴＰ基質および鋳型依存性重合の娘鎖産物に特徴的な「拘束された構成」で示されている。重合ＸＮＴＰの拘束された構成は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された構成（ＸＮＴＰ １０８）の前駆体である。セクション１０６は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを拡張するための切断を示す。拘束された構成から拡張された構成への移行は、娘鎖の一次骨格内のホスホルアミデートのＰ－－Ｎ結合の切断時に起こる。

【0040】

アセンブリ中、モノマーＸＮＴＰ基質（ＸＡＴＰ、ＸＣＴＰ、ＸＧＴＰ、およびＸＴＴＰ）は、ガイドとして一本鎖鋳型を使用する鋳型指向性重合のプロセスによって新生娘鎖の伸長可能末端上で重合される。一般的に、このプロセスは、プライマーから開始され、５’から３’方向に進行する。一般的に、ＤＮＡポリメラーゼ１１０または他のポリメラーゼを使用して娘鎖を形成し、鋳型鎖の相補的コピーが得られるように条件を選択する。娘鎖が合成された後、カップリングされたＳＳＲＴは、娘鎖をさらに形成する拘束されたＸｐａｎｄｏｍｅｒを形成する。娘鎖中のＳＳＲＴは、ＸＮＴＰ基質の「拘束された構成」を有する。ＳＳＲＴの拘束された構成は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ産物に見られるように、拡張された構成の前駆体である。

【0041】

この例では、合成および拡張が完了すると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ中の各モノマーＸＮＴＰ単位１１２は、それがコードする塩基型に対応するレポーターコード「レベル」を有する２つのレポーターコード１１６ａおよび１１６ｂと、移動制御要素（ＴＣＥ）１２０とを含む。ＴＣＥは、立体障害、電気反発、および／またはナノポアとの優先的相互作用の組み合わせを通して、ナノポアを通るＸｐａｎｄｏｍｅｒの移動速度を制御する。ポア開口部に配置された際のイオン電流の駆動力に対するＴＣＥの抵抗、およびその結果の、停止を克服し移動を再開するために必要な印加電圧（すなわち、電圧パルス）の増加は、ＴＣＥの種々の特性（およびいくつかの実施形態において、レポーターコードおよびＳＳＲＴの他の要素）、例えば、かさ、長さ、および／または電荷密度を調整することによってカスタマイズすることができる。

【0042】

分枝鎖１２４は、ＴＣＥを終端させ、レポーターコード１１６ａおよび１１６ｂに連結する分枝構造である。エンハンサー１２８ａおよび１２８ｂは、ポリメラーゼ取り込みを補助し得る。ヌクレオチド１３２はエンハンサー１２８ｂに結合しており、切断可能なリンカー１３６を含み得る。切断可能なリンカー１３６は、光切断可能なリンカーであり得る。切断可能なリンカー１３６は、切断されて、セクション１０６に示される拡張をもたらし得る。

【0043】

図２は、ＸＮＴＰ ２００の構造の詳細を示す。図２において、ＸＮＴＰは、２つのレポーターコード２０４ａおよび２０４ｂ、ならびに移動制御要素（ＴＣＥ）２０８を含む。異なるレポーターコードは、異なる測定可能なレベルでナノポアを通るイオン流を遮断するようなサイズである。レポーターコードおよび他の特徴は、特定のホスホラミダイトの配列を選択することによって設計され得る。

【0044】

特定の実施形態において、ＴＣＥは、分枝構造（すなわち、「分枝鎖」）で終端する適切なモノマー構成要素を使用してホスホラミダイト法を使用する固相合成によって産生されるポリマーである。分枝ホスホラミダイトには、対称分枝鎖と非対称分枝鎖の両方が含まれる。一実施形態において、ＴＣＥ分枝鎖２１０は対称分枝ＣＥＤホスホラミダイトであり、分枝鎖の各アームはレポーターコードに連結されている。例示的な対称化学分枝鎖には、１，２，３－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）プロパン、１，３－ビス－（５－Ｏ－ホスホジエステル－ペンチルアミド）－２－Ｏ－ホスホジエステル－プロパン、および１，４，７－Ｏ－トリス－（ホスホジエステル）－ヘプタンが含まれる。

【0045】

ＵＶ発色団２１２は、ＴＣＥ ２０８の末端に結合され得る。ＵＶ発色団２１２は、可視化または定量化を可能にし得る。スペーサー２１６ａおよび２１６ｂは、それぞれレポーターコード２０４ａおよび２０４ｂに結合している。スペーサー２１６ａおよび２１６ｂは、ポア内を横断する長さを調節し得るポリエチレングリコール（ＰＥＧ）単位であり得る。エンハンサー２２０ａおよび２２０ｂは、スペーサー２１６ａおよび２１６ｂに結合され得る。エンハンサー２２０ａおよび２２０ｂは、ポリメラーゼ組み込みを促進する正に帯電したスペルミンであり得る。ヌクレオチド２２４は、エンハンサー２２０ａおよび２２０ｂに結合され得る。ヌクレオチド２２４は、トリホスホルアミデートジエステルを含み得る。ＸＮＴＰ ２００の構造要素は、ナノポア内の測定を改善するために調整され得る。

【0046】

図３は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成を準備するための固体基板３０８への伸長オリゴマー３０４の結合を示す。固体基板３０８は、マレイミドに架橋され得る。段階３１２は、固体基板３０８に結合していない伸長オリゴマー３０４を示す。段階３１６でのクリックケミストリーの後、伸長オリゴマー３０４は固体基板３０８に結合している。伸長オリゴマー３０４は、リーダー部分３２０に結合され得る。リーダー部分３２０は、光切断可能なリンカー３２４に結合され得る。

【0047】

図４は、伸長オリゴ４０４、「リーダー」（Ｌ）、およびその付近の構成要素の構造４００を示す。伸長オリゴは、２’Ｏ－メチル伸長オリゴであり得る。伸長オリゴ４０４に隣接しているのはポリ－Ｃ１２スペーサー（Ｚ）４０８であり、これにポリ－Ｃ２スペーサー（Ｌ）４１２が続く。光切断は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ合成の直後および任意のｘｐａｎｄｏｍｅｒをシーケンサーにローディングする前に起こるので、光切断可能なスペーサー（ＰＣ）４１６および上のセグメント（すなわち、アジド（Ｒ）４２０およびスペーサー（Ｄ）４２４）は、本明細書に記載の配列決定プロトコルのＸｐａｎｄｏｍｅｒの一部ではない。アジドＲ ４２０は５’－アジドであり得る。スペーサーＤ ４２４は、ポリＰＥＧ６スペーサーであり得る。構造４００の短縮配列は、Ｒ（Ｄ）_１０（ＰＣ）（Ｌ）_２５（Ｚ）_６（ＴＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＣＧＧＡ）であり得、末端の配列は伸長オリゴ４０４を表す。膜の上の流体チャネルへのｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子の流れの後のいくつかのＸｐａｎｄｏｍｅｒ配列決定操作の間、疎水性ポリＣ１２スペーサーは膜相に分配され、膜の表面に沿った準２Ｄ拡散／移動を開始し得る。３Ｄ拡散／移動および流体流はまた、ポアに向かうＸｐａｎｄｏｍｅｒの大量輸送において役割を果たし得る。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ捕捉は、膜にわたる「正」の印加バイアスの印加中に、高度に負に帯電したポリＣ２スペーサーセグメント（Ｌ）がナノポアのバレル内に静電的に引き込まれるときに起こると考えられる。なお、逆ポアの場合、ポアのバレルの底部は、シス側の二重層膜からわずかに突出していることに留意されたい。

【0048】

Ｂ．操作
「明期間」の間、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子は、ベースラインとＴＣＥ印加電圧パルスの両方の組み合わせにより、ナノポアを捕捉し、ナノポアを通り抜け始める。ベースライン電圧は、各ＸＮＴＰ位置でタグコードを読み取るのに十分であり、短い高電圧ＴＣＥパルスは、ＴＣＥに関連するエネルギー障壁を克服するように設計される。理想的には、各ＴＣＥパルスは、単一のＴＣＥ障壁を超えて移動し、したがってＸｐａｎｄｏｍｅｒを１つの「塩基」位置の量だけ順方向にポア内をさらに移動させる。

【0049】

典型的な操作中、印加される電圧パターンは、各明期間中に一定数のＴＣＥパルスが存在するように設計され、これにより、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、ＴＣＥパルスの数に対応するいくつかの塩基だけ、またはＸｐａｎｄｏｍｅｒが完全に移動し、膜の下の流体「トランス」チャンバに放出されるまで、「順」方向に移動させられる。

【0050】

典型的な操作中、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子は、単一明期間の終了前に完全に移動しない場合がある。これは、明期間の後期に捕捉され、明期間に残っているＴＣＥパルスが存在するよりも多くの塩基位置を有するＸｐａｎｄｏｍｅｒ長を有する分子に起因して起こり得る。分子は、様々な理由で順方向に移動しようと試みている間に固着する可能性がある。分子がその点を通過することを不可能にする、または非常に困難にする欠陥（例えば、切断事象の失敗）を有する塩基位置が存在し得る。そのような状況では、および他の理由で、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、明期間のＴＣＥパルス数にかかわらず、明期間中に完全に移動することができない場合がある。そのような状況では、欠陥位置に達するまで、リードの開始におけるいくつかの塩基位置が配列決定され、予想信号レベルを生成することが観察され得る。その場合、欠陥の直前に位置する最後のタグコードレベルは、明期間の残りの期間にわたって観察され得る。ポアが永久的に詰まったままにならないように、固着した分子を逆方向に強く駆動することによってそれらを排出するために、大きな負電圧が暗期間のしばらくの間にわたって印加され得る。

【0051】

図５Ａは、典型的な拡張による配列決定波形を用いる単一分子－多分子トレース（ＳＭ３Ｔ）事象の一例を示す。グラフは、ｘ軸上に秒単位の時間を示す。グラフは、ｙ軸上に電圧読み取り値を示す。電圧の代わりに、電圧等価物（例えば、ＡＤＣカウント）または電流を含む他の電気的測定値が使用され得る。暗期間５０４および５０８は、ポアが空である、通常の暗期間である。明期間５１２は、それぞれ分子１および分子２の信号５１６ａおよび５１６ｂを示す。

【0052】

信号５２０は、明期間の間の分子３を示す。この事象は、分子３がポアに固着し、数サイクルにわたって消失しないことを示す（暗期間５２４、５２８、５３２ならびに明期間における信号５３６、５４０、および５４４）。最終的に、信号５４８ａから信号５４８ｂへの変化（分子３が消失するとき）によって示されるように、分子は暗サイクルで消失する。この事象は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのリーダーセグメントの特性に起因する可能性があり、リーダーが逆方向に移動することが困難になる。

【0053】

図５Ｂは、図５Ａのトレースの背後にある可能な機序を示す。図５５２は明期間を示す。移動方向は下向きである。非切断位置５５６は、次のパルス後にポアに当たる。通常のタグコードレベルが予想される。図５５８は暗期間を示す。移動方向は、ここでは上向きである。リーダー５６０はポアを逆方向（上向き）に移動することが困難である。最終的に、リーダー５６０はポアを通過する。

【0054】

Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子は、リーダーに順方向および逆方向で異なる挙動をさせるＸｐａｎｄｏｍｅｒのリーダー部分の特性で設計され得る。明期間（順方向）の間、リーダーは、適度に印加された電圧下で比較的高い捕捉率でシス側からポア内に捕捉されることを可能にする特性を有し得る。捕捉後、但し依然として同じ明期間中に、ＴＣＥパルスは分子をポアに通して着実に処理させるので、リーダーはポアの下側（膜のトランス側）から突出し得る。

【0055】

暗期間（逆方向）の間、暗期間が始まる際に分子がまだポア内にある場合、分子は負の印加電圧下で逆方向に移動し始めるはずである。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ分子がその位置をほぼ完全に逆にすると（すなわち、ほぼ完全に後退している）、リーダーはバレルのトランス側に留まり得る。この点で、リーダーの所望の特性は、リーダーがトランス側からバレル内に入るための高いエネルギー障壁を有し、したがって、バレルを通ってトランスからシス方向（順方向）に移動することに対する高い抵抗を有することである。

【0056】

ＩＩ．配列決定のための戦略
非対称リーダー挙動（ポアを通る方向に関する）を活用するための戦略を本明細書で説明する。これらの戦略は、ポアに固着するＸｐａｎｄｏｍｅｒの数を減らすことによって精度を高め得る。

【0057】

Ａ．同じ電圧での完全な順方向および完全な逆方向
図６は、同じ順方向電圧および逆方向電圧を伴うＸｐａｎｄｏｍｅｒを配列決定するための１つの戦略を示す。図６は、ナノポアの下に膜を有するナノポアを示す。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一端にブロッカー６０４（例えばストレプトアビジン）を有し、他端にリーダー６０８を有する。リーダーは、ポアを縫うように（図の下向き方向に）進む。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは下向きに移動し、明期間（例えば、図６１２）の間、分子の終わりおよび／または明期間の終わりまで配列決定される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを下向きに移動させるために電圧が印加される。電圧は、レポーター要素を読み取ることができるようにＸｐａｎｄｏｍｅｒを下向きに移動させるためのベースライン電圧を含む。ＸｐａｎｄｏｍｅｒをＴＣＥ要素に通過させるために、より高い電圧が印加される。ブロッカー６０４は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒがポアから出るのを防ぐ。

【0058】

暗期間（例えば、図６１６）の間、印加電圧は逆にされ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは上向きに移動する。暗期間には明期間と同じ電圧が印加されるが、電圧は逆極性を有する。リーダー６０８は、反対方向に膜および／またはポアを通過することが困難であり得る。

【0059】

ＳＭ３Ｔ持続時間の分布は指数関数的であり得る。この分布は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒがナノポアに固着することを反映して、多くのより短い長さを示し得る。持続時間のモードは１に等しくなければならない。

【0060】

Ｂ．増加した逆電圧での完全な順方向および完全な逆方向
図７は、異なる順方向電圧および逆方向電圧を伴うＸｐａｎｄｏｍｅｒを配列決定するための戦略を示す。ナノポアおよびＸｐａｎｄｏｍｅｒは、図６と同様に構成される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一端にブロッカー７０４を有し、他端にリーダー７０８を有する。図７１２の明期間は、図６１２の明期間と同じであり得る。暗期間の間、リーダーは固着し、ナノポアを通過できない場合がある。この状況に対処するために、いくつかの周期的な暗サイクル（例えば、図７１６の暗期間）の間、逆電圧が増加される。例えば、１０サイクルごとに１回または２０サイクルごとに１回は、固着したリーダーを除去するために増加した逆電圧を含み得る。この増加した電圧は、「除去電圧」と呼ばれ得る。

【0061】

ＳＭ３Ｔ持続時間の分布の形状は、図６の分布から変更され得る。より少ないＸｐａｎｄｏｍｅｒがナノポアに固着するので、分布はより長い長さを示す。モードは１に等しくなくてもよい。

【0062】

Ｃ．限られた明期間持続時間
図８は、短縮された明期間持続時間を伴うＸｐａｎｄｏｍｅｒを配列決定するための戦略を示す。図８は、ナノポアの下に膜を有するナノポアを示す。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一端にリーダー８０４を有し、他端にブロッカーを有さない。リーダー８０４は、ポアを縫うように（図の下向き方向に）進む。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは下向きに移動し、明期間（例えば、図８０８）の間に配列決定される。明期間は、ある特定のサイズのＸｐａｎｄｏｍｅｒがナノポアを順方向に通って出て行くのを防ぐ目的で短縮される。より短いＸｐａｎｄｏｍｅｒは、完全に通り抜けて脱出し得る。各明期間は、一定の所定数のＴＣＥ電圧パルスを含み得る。一定数の明期間が適用され得る。次いで、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの方向を逆にするために暗期間（例えば、図８１２）が適用される。図８１２の暗期間は、図６１６の暗期間と同じであり得る。

【0063】

ＳＭ３Ｔ持続時間の分布の形状は、図６の分布から変更され得る。モードは１に等しくなくてもよい。この分布は、＋／－数塩基のモードでほとんどのリードに対するリード長分布を崩壊させ得る。

【0064】

図９は、配列決定戦略による明期間および暗期間スケジュールを示す。上のグラフは、ナノポアにわたって印加される電圧の極性を示す。明期間の間、極性は１として示される。暗期間の間、極性は－１として示される。上のグラフは電圧の大きさを示しておらず、極性のみを示している。下のグラフは、ポア内の分子の位置を示している。１の位置は、リーダーに最も近いＸｐａｎｄｏｍｅｒのユニットに対応する。高い位置番号（例えば、２００）は、リーダーから遠く離れており、この例では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの反対端により近いＸｐａｎｄｏｍｅｒのユニットに対応する。

【0065】

図９に示されるように、明期間９０４は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９０８の通常の配列決定を含み得る。配列決定は、明期間持続時間または完全な移動および脱出によって制限され得る。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９０８および図９のすべてのＸｐａｎｄｏｍｅｒは、分子の末端にブロッカーを有さない。

【0066】

Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９１２は、明期間９１６の後期にナノポアに入り得る。明期間が終了した後、さらに多くの塩基（例えば、レポーター要素）が残存していてもよい。暗期間では、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９１２はナノポアから完全に出る。

【0067】

図９において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９１２は、明期間のパルス数よりも多くのユニット（例えば、ＴＣＥ）を有する。暗期間９２０の間、リーダーがポアに到達することを確実にするために高電圧が印加される。その後、より低い電圧が印加される。特定のＸｐａｎｄｏｍｅｒは、ナノポアを完全には通り抜けない。明期間の持続時間は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのより多くがナノポアを通過するように増加され得る。しかしながら、明期間が長すぎると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが一方向にのみナノポアを通り抜け得る。さらに、異なるサイズのＸｐａｎｄｏｍｅｒが試料中に存在し得る。ある特定の明期間持続時間は、一方向にのみナノポアを通り抜けるより短いＸｐａｎｄｏｍｅｒをもたらし得るが、より長いＸｐａｎｄｏｍｅｒにおいてすべてのＸＮＴＰを配列決定するのに十分ではない。

【0068】

Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９２４は、明期間９２８の早期にポアに到達し得る。分子は、明期間にパルスが残っているよりも多くの塩基を有し得る。したがって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ ９２４は完全には通り抜けない。明期間にパルスが存在するのとほぼ正確に同数の塩基が読み取られる。

【0069】

Ｄ．逆ナノポア
図１０は、逆ナノポアを使用して配列決定するための戦略を示す。ＨＴＰでＳＢＴに対して歴史的に行われてきたように、シス側からポアが挿入される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、一端にリーダーを含み、他端にブロッカー（例えば、ブロッカー１００４）を含む。リーダーは、ナノポアの前に膜に入る。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒをナノポアから逆転させながら、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを配列決定する。

【0070】

ステップ１００８において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが捕捉される。高電圧（例えば、ＴＣＥ電圧）がより長い期間（例えば、８μｓの代わりに０．１～１０ミリ秒）印加される。ブロッカーを有する捕捉された分子１０１２は、ブロッカーによってさらなる移動が停止されるように端部まで移動する。また、ステップ１００８には、捕捉された、ブロッカーを有さない分子１０１６も示されている。分子１０１６は、断片化された分子を含み得る。ブロッカーを有さない分子は、ナノポアを迅速に通過し得る。

【0071】

ステップ１０２０において、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ １０１２は逆方向に移動させられ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ １０１２はナノポアから後退する。ＴＣＥ電圧は逆方向に印加される。配列決定情報は、分子が後退しているときに得られる。捕捉されたすべての分子は、分子の末端（または非切断位置）に配置されると予想される。分子が逆方向にパルスされ、分子が後退しているときにデータが取得される。明期間は、試料中の最も長い予想分子と同じ長さであり得る。例えば、ｃｔＤＮＡアッセイの場合、最も長い予想分子は３５０ｂｐであり得、３５０パルスまたは１ｍｓのパルス間持続時間の３５０ｍｓに対応する。

【0072】

ステップ１０３０において、次の捕捉ステップの前に任意の再充電が実行され得る。暗期間が適用されてもよい。ステップ１および２からの累積電圧が平衡していない場合、暗電圧が電極を再充電するのに役立ち得る。この期間中、データは取得されない。フェーズドアレイモードが実行されている場合、この暗期間はステップ１００８および１０２０の持続時間であり、チップ（位相）の他の半分がそれらの２つのステップを完了することを可能にする。

【0073】

リーダーは、玄関（すなわち、膜）側から始めて、ポアを通過するときに容易に移動しないように修飾され得る。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、玄関側から入るときに適度によく捕捉される必要があり得る。高電圧は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを捕捉するのに役立ち得る。膜は、他の戦略（例えば、８μｓのパルス持続時間）よりも長い時間、高電圧に対して打たれ強くあり得る。ブロックはＸｐａｎｄｏｍｅｒの末端に付加されてもよい。

【0074】

この戦略の利点は、断片化された分子の一部をフィルタにかけて除くことを含み得る。さらに、リード開始は同期されてもよい。さらに、ポア挿入はシス側からであってもよい。例えば、ウェルにナノポア溶液が充填され得る。次いで、ウェルを膜で覆うことができ、ナノポアがシス側から挿入され得る。

【0075】

ＩＩＩ．プロセッシブコンセンサス戦略
戦略は、ナノポア内で同じＸＮＴＰを複数回読み取ること、および固着したＸｐａｎｄｏｍｅｒを取り除くために電圧を印加することを含み得る。これらの戦略は、ポアに固着するＸｐａｎｄｏｍｅｒの数を減少させることによっておよび／またはナノポアを通したＸＮＴＰの読み取りを繰り返すことによって精度を高め得る。

【0076】

Ａ．すべてのセルに印加されるクリア／再充電電圧
分子を配列決定するための戦略は、各パスの開始から終了までずっと分子を読み取ることを伴わなくてもよい。分子全体が完全な読み取りのためにナノポアを通過するのではなく、分子の一部がサブリードのためにナノポアを通過し得る。さらに、分子は、多くの短い重複パスおよび前進的な方法を行うために、前方、次いで後方に移動し得る。明期間および暗期間の持続時間は、他の戦略と比較して短縮され得る。高電圧ＴＣＥパルス数は、ＸｐａｎｄｏｍｅｒのＴＣＥ数未満であり得る。明期間におけるＴＣＥパルス数は、暗期間における逆ＴＣＥパルス数よりも多くなるだろう。

【0077】

一例として、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さ分布は、３５０ｂｐ付近にピークを有し得る。明期間は、３０個のＴＣＥパルスの持続時間を含み得る。暗期間持続時間は、合計時間が明期間持続時間に等しくてもよいが、逆方向に２５個のＴＣＥパルスを含む印加電圧パターンを有する。明期間および暗期間の持続時間を等しくすることにより、電極上の電荷のバランスをとり、電極を再生および／またはリセットすることが可能になる。プロトコルは、時折固着したＸｐａｎｄｏｍｅｒを定期的に除去するための「除去電圧」を含む追加の期間を含み得る。

【0078】

図１１は、プロセッシブマルチパスリード生成のための電圧スケジュールを示す。グラフは、上部電極および下部電極の電圧パルスを示す。破線は、各それぞれの電極の０極性の電圧を示す。破線より上の電圧は、正極性を有する。破線より下の電圧は、負極性を有する。明期間の間、上部電極は正極性のパルスを有し、下部電極は負極性のパルスを有する。明期間１１０４、１１０８、および１１１２が示されている。暗期間の間、上部電極は負極性のパルスを有し、下部電極は正極性のパルスを有する。暗期間１１１６および１１２０が示されている。暗期間は、明期間よりも５個少ないパルスを有するものとして示されている。

【0079】

明期間の間、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、図示のように下向き方向に移動する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、明期間の間に配列決定される。各パルスはリードに対応するはずである。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの捕捉は、明期間の間にいつでも起こり得る。暗期間の間、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは逆（上向き）方向に移動する。逆方向の間は、配列決定は実行されない。リーダーが玄関に戻ると、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒが固着し得る。除去電圧を含むメタ期間は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを除去し得る。メタ期間は、図１１には示されていない。

【0080】

十分なサイクル数の後、分子（例えば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ １１２４）が順方向にポアを出る。

【0081】

図１２は、図１１で使用されたものと同様のプロトコルから得られた組み立てられた捕捉生リードシリーズの図である。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さは、長さが１１６ｂｐである標的核酸分子に対応する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを３０パルスの順方向サイクルおよび２５パルスの逆方向サイクルで移動させた。合計で２０サイクルを使用して、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの全長をカバーした。各サイクルのリードをセクション１２０４に示す。各サイクルは重複するリードを含むため、個々のヌクレオチドは数回配列決定される。捕捉されたコンセンサスリードは、リード１２０８において示される。捕捉されたコンセンサスリードの下に、ヌクレオチドが配列決定された回数が示されている。例えば、ＡＡＧＣＴの最初のサブシーケンスは、２回配列決定される。ＴＣＴＧＧＴで始まる中央部分は、６回配列決定される。明期間の順方向パルスの数が暗期間の逆方向パルスの数よりも多いサイクルへの変更の前に、初期の順方向および逆方向サイクルが同じ数のパルスを有するように設定されるならば、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの始まりを複数回配列決定することができる。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒがナノポアを完全に出るまで順方向および逆方向パルスを継続することによって、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの末端を複数回配列決定することができる。

【0082】

一例として、各半サイクルは、１ｍｓのパルス間隔で３０ｍｓであり得る。全サイクルは６０ｍｓかかり得る。分子に費やされる総時間は１２００ｍｓであり得る。合計５７７個の生塩基が、合計１．２秒の総時間または０．６秒の明時間で読み取られ得る。両端の２０塩基を除いて、１１６ｂｐ分子は６倍のカバレッジ深度で配列決定される。

【0083】

図１３は、ナノポアからＸｐａｎｄｏｍｅｒを取り除くためのメタ期間を示す。メタ期間自体は、いくつかのＡＣ期間ならびに明および暗のクリアサイクルを含み得る。ＡＣ期間は、１秒または２秒よりも短いことを除いて、配列決定で典型的に使用されるものと同様であり得る。セグメント１３０４および１３０８によって示されるパルスは、明および暗のクリアサイクルである。他のパルスは、明期間および暗期間の間、通常の電圧（すなわち、非メタ期間の間のＴＣＥ電圧パルスと同じ）を有する。明のパルス数は、リーダーが固着していなければ、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを取り除く数に設定され得る。例えば、明期間におけるパルス数は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの長さ分布におけるＴＣＥユニットの中央数に等しくてもよい。暗期間は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを逆位置に戻すのに十分であり得る。

【0084】

特別な明期間および暗期間は、各メタ期間に１回、２回、またはそれ以上実施され得る。特別な明期間および暗期間は、より高い印加電圧を有してもよく、および／またはより長い持続時間であってもよい。図１３において、特別な期間は、１つの明期間と１つの暗期間の通常のサイクルの３倍の持続時間である。メタ期間全体は、１０ＡＣ期間長である。メタ期間は、１０、１５、または２０ＡＣ期間ごとに適用され得る。図１３では、特別な期間は３倍であり、メタ期間は１０ＡＣ期間長である。

【0085】

通常の明期間（例えば、明期間１３１２ａおよび１３１２ｂ）は、１秒または２秒よりもはるかに短いＡＣ修正期間を有し得る。明期間のパルス数は、入力されたｘｍｅｒ断片長分布の中央値に等しくてもよい。通常の暗期間（例えば、期間１３１６ａおよび期間１３１６ｂ）は、分子を迅速に逆転させてリーダー位置に戻すための期間に最初に高電圧を有し得る。

【0086】

Ｂ．特定のセルに印加されるクリア／再充電電圧
図１１～図１３で説明されたプロセッシブコンセンサスのプロトコルは修正され得る。メタ期間およびクリア／再充電電圧は、固着したＸｐａｎｄｏｍｅｒを有するセルにのみ印加され得る。期間は、１０または２０ＡＣ期間ごとではなく、１、２、３、４、または５ＡＣ期間ごとに適用され得る。

【0087】

各メタ期間（すなわち、クリア期間）の前の暗期間の終わりまでに、アレイ内のすべてのアクティブセルについて、クリア期間が各セルによって経験されるべきかどうか、またはグローバルクリア期間のアサート中にセルが一時的に非アクティブ化されるべきかどうかの決定が行われる。クリア期間に備えて、非アクティブ化マスクが更新され得る。

【0088】

明および暗のクリア期間の間、非アクティブ化マスクが適用され、高い正および負の電圧がグローバルチップラインに印加される。多くのまたはほとんどのセルは、明もしくは暗のクリア期間のいずれか、またはその両方において除去電圧を経験しないように、一時的に非アクティブ化され、したがって電気的に絶縁され得る。

【0089】

一実施形態において、ナノポアシーケンサーチップ上のすべてのセルの非アクティブ化マスクを更新するために約１ｍｓが経過し得る。マスク更新時間の後に、明および／または暗のクリア期間が続き得る。クリア期間自体は、１ミリ秒～数十ミリ秒のどこかで継続し得る。クリア期間後、第２の非アクティブ化マスク更新でセルを再アクティブ化するために、さらに約１ｍｓの持続時間が割り当てられ得る。

【0090】

Ｃ．プロセッシブコンセンサスの利点
すべてのセルに適用されるプロセッシブコンセンサスと特定のセルに適用されるプロセッシブコンセンサスの両方が、標的分子の全長を横断するために必要とされるものよりもはるかに短い個々の明期間を含み得る。さらに、連続した明期間において生成されたサブリードは、末端において重複し得る。これにより、任意の長さの分子を、それらの全長において１より大きい深度で配列決定することができるプロトコルがもたらされる。この方法は、明期間の長さを特定の入力ＤＮＡ断片長分布に合わせて調整する必要がある、図９で説明した戦略に対する改善である。ある特定の長さ以上の分子は、明期間と暗期間のサイクルの後に分子がなくならないので、複数回の通過を受けるであろう。したがって、分子上の最大リード長は、明期間におけるＴＣＥパルス数に等しくてもよい。したがって、その臨界長よりも長い分子の末端は配列決定されないであろう。

【0091】

Ｄ．重複の低減
いくつかの実施形態において、配列が読み取られる回数を減らすことが望まれ得る。例えば、分子は、単一深度カバレッジでまたはそれよりわずかに大きく（例えば、１～２の間の平均深度）読み取られ得る。これを達成するために、順方向の明期間のＴＣＥパルスと比較して逆方向のＴＣＥパルスがほとんどないように暗期間を設定することができる。

【0092】

図１４は、逆ＴＣＥパルスの数を減らした場合の捕捉された生リードの例示的な分子１４０４および例示的な分子１４０８を示す。リード１４１２およびリード１４１６は、一連の捕捉された生リードを示す。リード１４２０およびリード１４２４は、「単一パス限界」で読み取られた捕捉されたコンセンサスを示す。図１４に示されるいずれの例においても、逆ＴＣＥパルスの数は５である。例示的な分子１４０４では、順方向ＴＣＥパルス数は６０である。例示的な分子１４０８では、順方向ＴＣＥパルス数は６５である。ほとんどのヌクレオチドはシングルパスで読み取られ、「シングルパス限界」を達成する。逆方向パルスに対応するヌクレオチドは、２つのパスで読み取られるものである。順方向ＴＣＥパルス数を増加させること、および／または逆方向ＴＣＥパルス数を減少させることにより、単一深度のみで読み取られるヌクレオチドの割合が増加する。

【0093】

プロッシブコンセンサス電圧パターンに基づいて１よりわずかに大きい深度カバレッジを目標とすることにより、単一明期間において分子全体を単純に配列決定するよりも短い明期間持続時間が得られる。

【0094】

Ｅ．より短い明期間
短いＡＣ変調期間（すなわち、明期間）は、電気化学的利点および回路関連の利点をもたらす。例えば、ウエットアナログ回路を用いて配列決定が実行される方法のために、膜／ポアにわたる電圧は明期間の間に減衰する。暗期間は、ウェルの体積中の電気化学電池とウェルの底部の静電作用電極コンデンサの両方を「再充電」するために使用される。この明期間の減衰率は、作用電極コンデンサのサイズによって部分的に支配され、また、ウェル内の電気化学的に活性な酸化還元種の濃度および体積によっても部分的に支配される。配列決定中に使用される電気化学的に活性な酸化還元種の濃度を低下させることにはいくつかの実用的な利点があるが、そうすることにより、明期間減衰時定数が短くなる。より短い明期間減衰時定数に対処する１つの方法は、単に明期間自体の持続時間を短縮することである。プロセッシブコンセンサスは、明期間におけるＴＣＥパルス数よりも長い長さを有するＸｐａｎｄｏｍｅｒ分子のリードを永久的にカットオフすることなく、明期間持続時間を実質的に短縮することを可能にする。

【0095】

図１５Ａおよび図１５Ｂは、オープンチャネルＡＤＣにおける異なる濃度の酸化還元対の効果を示す。グラフは、ｘ軸上に秒単位の時間、ならびに明期間の開始時および終了時におけるオープンチャネルＡＤＣを示す。図１５Ａは、酸化還元剤の濃度が高い。図１５Ｂは、図１５Ａよりも８倍低い酸化還元剤の濃度を有する。図１５Ａの場合、開始時と終了時のオープンチャネルＡＤＣの差は１０．８％である。図１５Ｂの場合、開始時と終了時のオープンチャネルＡＤＣの間の差は６０．２％である。図１５Ａおよび図１５Ｂは、濃度が低いほど、明期間減衰時定数が短くなることを示す。

【0096】

Ｆ．例示的な方法
図１６は、標的核酸分子を配列決定するための例示的なプロセス１６００のフローチャートである。いくつかの実装においては、図１６の１つまたは複数のプロセスブロックは、検出器１７０２および論理システム１７０３を含むシステム１７００によって実行され得る。標的核酸分子は、１００～１５０ｎｔ、１５０～２００ｎｔ、２００～３００ｎｔ、３００～４００ｎｔ、または５００ｎｔ超の長さであり得る。

【0097】

ブロック１６１０において、第１のレベルの第１の数の電圧パルスがナノポアにわたって印加されて、化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第１の距離だけ変位させ得る。化合物は、標的核酸分子から生成され得る。化合物は、本明細書ならびにその両方の全内容があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／２３６５２６号パンフレットおよび米国特許第７，９３９，２５９号明細書に記載されるように、代理ポリマーまたはＸｐａｎｄｏｍｅｒであり得る。第１の数の電圧パルスを印加する前に、第１の化合物はナノポアによって捕捉され得る。化合物は複数のユニットを含み得る。ユニットは、図１に示されるユニットと同様であり得る。複数のユニットの各ユニットは、複数の種類のレポーター要素（レポーターコードとも呼ばれる）のうちの１種類のレポーター要素を含み得る。各種類のレポーター要素は、標的核酸分子内のヌクレオチドの同一性に対応し得る。

【0098】

第１の方向は、化合物が最初に捕捉されたときに化合物がナノポアを通過したのと同じ方向であり得る。例えば、化合物は、リーダー部分を有し得る。リーダー部分は、ナノポア内に捕捉され得る。第１の方向は、リーダーがナノポアからさらに遠ざかる方向であり得る。

【0099】

第１の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第１のサブセットがナノポアを通過し得る。第１の数の電圧パルスは、明期間における電圧パルスであり得る。電圧パルスの数は、ナノポアを通過する複数のユニット内のユニットの数に対応し得る。複数のユニットの各ユニットは移動制御要素を含み得る。第１の数の電圧パルスを印加すると、第１の数の移動制御要素がナノポアを通過し得る。第１の数の電圧パルスは、第１の数の移動制御要素に等しくてもよい。

【0100】

複数のユニットの第１のサブセットは、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、または１００個超のユニットを含み得る。第１の数の電圧パルスは、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、または１００個超のパルスを含み得る。

【0101】

ナノポアにわたるベースラインレベルの電圧が印加されて、第１の数の電圧パルスのパルスの間に配列決定のためにナノポアを通ってユニットが移動し得る。このより低レベルの電圧は、ナノポアを通ってユニットを移動させ得るが、ナノポアを通って移動制御要素を移動させるのに十分ではない場合がある。ベースラインレベルの電圧がナノポアにわたって印加されて、ナノポアを通って第１の方向にある距離だけ化合物を変位させ得る。ベースラインレベルの電圧は、第１の数の電圧パルスの電圧パルスと同じ極性であり得る。ベースラインレベルは、第１のレベル未満であり得る。距離を変位した後の化合物は、ナノポア内に移動制御要素を有し得る。

【0102】

したがって、一例では、ブロック１６１０において、以下の動作が行われ得る：ナノポアにわたって第１のレベルの第１の数の電圧パルスを印加して、化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第１の距離だけ変位させ、化合物は複数のユニットを含み、複数のユニットの各ユニットは複数の種類のレポーター要素のうちの１種類のレポーター要素を含み、第１の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第１のサブセットがナノポアを通過する。

【0103】

ブロック１６２０において、第１のサブセット中のレポーター要素の種類が検出され得る。複数のユニットの第１のサブセット中のレポーター要素がナノポア内にある場合にナノポアにわたって印加される電圧を有するナノポアについての信号値が測定され得る。第１のサブセット中のレポーター要素の種類は、信号値を使用して決定される。レポーター要素の種類とヌクレオチドの対応の結果として、標的核酸分子内のヌクレオチドの同一性も決定される。

【0104】

したがって、一例では、ブロック１６２０において、以下の動作が行われ得る：ナノポアにおいて、第１のサブセット中のレポーター要素の種類を検出する。

【0105】

ブロック１６３０において、第２のレベルの第２の数の電圧パルスがナノポアにわたって印加されて、化合物を、ナノポアを通って第２の方向に第２の距離だけ変位させ得る。第２の数の電圧パルスは、暗期間における電圧パルスであり得る。第１の方向は、第２の方向と反対である。第１の数の電圧パルスの電圧パルスは、第２の数の電圧パルスの電圧パルスと反対の極性を有する。第２の距離は第１の距離未満であり得る。第２の数は第１の数未満であり得る。

【0106】

第１の数の電圧パルスは、第２の数の電圧パルスを１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～４０、４０～５０、または５０超だけ上回ることがある。いくつかの実施形態において、第１の数の電圧パルスは、第２の数の電圧パルスに等しくてもよい。その後のパルスサイクルは等しくなくてもよいため、パルスは最終的にナノポアを通して化合物を前進させる。

【0107】

したがって、一例では、ブロック１６３０において、以下の動作が行われ得る：ナノポアにわたって第２のレベルの第２の数の電圧パルスを印加して、化合物を、ナノポアを通って第２の方向に第２の距離だけ変位させる。

【0108】

ブロック１６４０において、第３のレベルの第３の数の電圧パルスがナノポアにわたって印加されて、化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第３の距離だけ変位させ得る。第３の数の電圧パルスは、別の明期間における電圧パルスであり得る。第３の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第２のサブセットがナノポアを通過する。第２のサブセットおよび第１のサブセットは、同じユニットの一部を含み得る。第２のサブセットは、第１のサブセットにないユニットを含み得る。第３の距離は第２の距離よりも大きくなり得る。第３のレベルは、第１のレベルに等しくてもよい。第３の数の電圧パルスは、第１の数の電圧パルスと同じであっても異なっていてもよい。

【0109】

したがって、一例では、ブロック１６４０において、以下の動作が行われ得る：ナノポアにわたって第３のレベルの第３の数の電圧パルスを印加して、化合物を、ナノポアを通って第１の方向に第３の距離だけ変位させ、第３の数の電圧パルスを印加すると、複数のユニットの第２のサブセットがナノポアを通過する。

【0110】

ブロック１６５０において、第２のサブセット中のレポーター要素の種類が検出され得る。標的核酸分子の配列が決定され得る。配列は、検出されたレポーター要素の種類の順序から決定され得る。第１のサブセットおよび第２のサブセットの両方における１つまたは複数のユニットについて、同じ種類のレポーター要素が検出され得る。例えば、同じレポーター要素が、プロセッシブコンセンサスを伴う技術において記載されるように検出され得る。いくつかの実施形態において、ある特定のユニット中のレポーター要素は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを超えて検出され得る。ユニットにおけるレポーター要素の種類は、最も頻繁に検出される種類であると決定され得る。

【0111】

したがって、一例では、ブロック１６５０において、以下の動作が行われ得る：ナノポアにおいて、第２のサブセット中のレポーター要素の種類を検出する。

【0112】

実施形態において、プロセス１６００は、化合物をナノポアから完全に排出するステップをさらに含み得る。化合物は、第１の数の電圧パルスの電圧パルスと同じ極性を有するいくつかの電圧パルスの間にナノポアから出て行き得る。例えば、化合物は、明期間の間にナノポアから出て行き得る。化合物は、第３の数の電圧パルスの印加中にナノポアから完全に出て行き得る。

【0113】

追加の数の交互の極性の電圧パルスが印加されてもよい。例えば、第４の数の電圧パルスは、化合物を第２の方向に変位させ得る。次いで、第５の数の電圧パルスが、化合物を第１の方向に変位させ得る。電圧パルスのこれらのサイクルは、化合物がナノポアから出て行くまで継続し得る。

【0114】

いくつかの実施形態において、第４のレベルの除去電圧がナノポアにわたって印加されて、化合物をナノポアから完全に追い出し得る。第４のレベルは、第１のレベル、第２のレベル、および第３のレベルよりも大きくてもよい。いくつかの実施形態において、除去電圧は、第１の数、第２の数、および第３の数のパルスの持続時間よりも長い持続時間にわたって印加され得る。

【0115】

いくつかの実施形態において、いくつかのナノポア（例えば、アレイで）が使用されて、いくつかの核酸分子を配列決定し得る。化合物は、複数の化合物のうちの第１の化合物であり得る。複数の化合物は、複数の標的核酸分子から生成され得る。ナノポアは、複数のナノポアのうちの第１のナノポアであり得る。複数の化合物の各化合物は、複数のナノポアのうちの１つのナノポア内にあり得る。第１のレベルの第１の数の電圧パルス、第２のレベルの第２の数の電圧パルス、および第３のレベルの第３の数の電圧パルスが複数のナノポアに印加され得る。パルスは、第１の化合物と同じ順序で印加され得る。複数の化合物の各化合物中のレポーター要素が検出され得る。複数の核酸分子の複数の配列が決定され得る。複数の配列のサイズ分布は、３００ｎｔより大きいモードを有し得る。モードは、２００～３００ｎｔ、３００～４００ｎｔ、４００～５００ｎｔ、または５００ｎｔ超であり得る。

【0116】

いくつかの実施形態において、セクションＩＩＩ．Ｂに記載のプロセスと同様に、除去電圧はある特定のナノポアに印加され得、他のナノポアに印加され得ない。第１の数の電圧パルス、第２のレベルの第２の数の電圧パルス、および第３のレベルの第３の数の電圧パルスが複数のナノポアに印加され得る。複数の化合物の第１の部分が、複数のナノポアの第１の部分において、第１の数の電圧パルス、第２の数の電圧パルス、または第３の数の電圧パルスによって変位されていることが決定され得る。複数の化合物の第１の部分は、ナノポアに固着していなくてもよい。第４のレベルの除去電圧が、複数のナノポアの第２の部分の各ナノポアにわたって印加され得る。印加された除去電圧は、複数の化合物の第２の部分を複数のナノポアのそれぞれのナノポアから完全に追い出し得る。第４のレベルは、第１のレベル、第２のレベル、および第３のレベルよりも大きくてもよい。いくつかの実施形態において、除去電圧は、電圧パルスのいずれかの持続時間よりも長い持続時間にわたって印加され得る。複数のナノポアの第２の部分は、複数のナノポアの第１の部分のナノポアを含まなくてもよい。

【0117】

いくつかの実施形態において、複数の化合物の第１の部分は、複数のナノポアの第１の部分において、第１の数の電圧パルス、第２の数の電圧パルス、または第３の数の電圧パルスによって変位されていないことが決定され得る。複数の化合物の第１の部分は、ナノポアに固着していてもよい。第４のレベルの除去電圧が、複数のナノポアの第１の部分の各ナノポアにわたって印加され得る。

【0118】

あるレポーター要素から次のレポーター要素に移動するときに測定された電気信号に特徴的な変化がない場合、化合物が固着していると決定され得る。あるレポーター要素から次のレポーター要素に移動するとき、測定された電気信号に特徴的な変化がある。特定のレポーター要素において固着すると、移動電圧パルスを印加した後に予想される電気信号の変化はない。固着した化合物と、移動しているが連続した種類のレポーター要素を有する化合物とを区別するために、十分に高いサンプリングレートが使用される。

【0119】

プロセス１６００は、本明細書においておよび／または本明細書の他の箇所に記載された１つまたは複数の他のプロセスに関連して記載された任意の単一の実装または実装の任意の組み合わせなどの追加の実装を含んでもよい。

【0120】

図１６は、プロセス１６００の例示的なブロックを示しているが、いくつかの実装では、プロセス１６００は、図１６に示されたものよりも追加のブロック、より少ないブロック、異なるブロック、または異なる配置のブロックを含んでもよい。追加的または代替的に、プロセス１６００のブロックのうちの２つ以上が並列に実行されてもよい。

【0121】

ＩＶ．例示的なシステム
図１７は、本発明の実施形態による測定システム１７００を示している。図示のシステムは、試料ホルダ１７０１内のＸｐａｎｄｏｍｅｒなどの試料１７０５を含み、試料１７０５をアッセイ１７０８と接触させて、物理的特性１７１５の信号を提供することができる。アッセイ１７０８は、ナノポアによる拡張による配列決定を含み得る。試料ホルダの例は、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒを含むウェルプレートとすることができる。試料からの物理的特性１７１５（例えば、電圧、電流、または他の電気的特性）は、検出器１７０２によって検出される。検出器１７０２は、データ信号を構成するデータ点を取得するために、間隔（例えば、周期的な間隔）を置いて測定を行うことができる。一実施形態において、アナログ－デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号を複数回デジタル形式に変換する。検出器１７０２は、電圧または電流測定装置であり得る。試料ホルダ１７０１および検出器１７０２は、アッセイ装置を形成することができる。データ信号１７２５は、検出器１７０２から論理システム１７０３に送信される。データ信号１７２５は、ローカルメモリ１７３５、外部メモリ１７０４、または記憶装置１７４５に記憶され得る。

【0122】

論理システム１７０３は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサ等であってもよく、またはそれらを含んでもよい。それはまた、ディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイ等）およびユーザ入力装置（例えば、マウス、キーボード、ボタン等）を含んでもよく、またはそれらと結合されてもよい。論理システム１７０３および他の構成要素は、スタンドアロンまたはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよく、または検出器１７０２および／または試料ホルダ１７０１を含む装置（例えば、配列決定装置）に直接取り付けられるかまたは組み込まれてもよい。論理システム１７０３はまた、プロセッサ１７２０内で実施するソフトウェアを含み得る。論理システム１７０３は、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するようにシステム１７００を制御するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム１７０３は、配列決定または他の物理的操作が実行されるように、試料ホルダ１７０１を含むシステムにコマンドを提供することができる。そのような物理的操作は、例えば試薬が特定の順序で添加および除去されて、特定の順序で実行され得る。そのような物理的操作は、試料を取得してアッセイを実施するために使用され得るように、例えばロボットアームを含むロボットシステムによって実施され得る。

【0123】

本明細書で言及されるコンピュータシステムのいずれも、任意の適切な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、図１８においてコンピュータシステム１０内に示されている。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムはコンピュータ装置の構成要素であってよい。他の実施形態において、コンピュータシステムは、各々が内部コンポーネントを有するサブシステムである複数のコンピュータ装置を含むことができる。コンピュータシステムは、デスクトップおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話機、他のモバイルデバイス、ならびにクラウドベースのシステムを含むことができる。

【0124】

図１８に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶装置７９、ディスプレイアダプタ８２に結合されたモニタ７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）などの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器および入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｏｌｔ、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ）などの当該技術分野において知られている任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、イーサネット、Ｗｉ－Ｆｉ、など）を、コンピュータシステム１０をインターネットなどのワイドエリアネットワーク、マウス入力装置、またはスキャナに接続するために使用することができる。システムバス７５を介した相互接続は、サブシステム間の情報交換を可能にするだけでなく、中央プロセッサ７３が各々のサブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶デバイス７９（例えば、ハードドライブなどの固定ディスクまたは光ディスク）からの複数の命令の実施を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶装置７９は、コンピュータ可読媒体を具現化し得る。別のサブシステムは、カメラ、マイクロフォン、加速度計などのデータ収集装置８５である。本明細書において言及されたあらゆるデータを、ある構成要素から別の構成要素へと出力すること、およびユーザへと出力することが可能である。

【0125】

コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１により、内部インターフェースにより、または、ある構成要素から別の構成要素に接続および取り外され得る、リムーバブル記憶装置を介して、ともに接続された、複数の同じ構成要素またはサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態において、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワークを介して通信することができる。そのような場合、あるコンピュータをクライアントと見なし、別のコンピュータをサーバと見なすことができ、各々が同じコンピュータシステムの一部であってよい。クライアントおよびサーバは、それぞれ、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含むことができる。

【0126】

実施形態の態様は、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路またはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュラまたは統合された様式の一般にプログラム可能なプロセッサを伴う、コンピュータソフトウェアを使用して、制御ロジックの形態で実装され得る。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一の回路基板上に位置し、もしくはネットワーク化された複数の処理ユニット、および専用のハードウェアを含むことができる。本明細書で提供される開示および教示に基づいて、当業者は、ハードウェアおよびハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して本発明の実施形態を実施するための他の様式および／または方法を知り、理解するであろう。

【0127】

本出願で説明されるソフトウェアの構成要素または関数はいずれも、例えばＪａｖａ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ－Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または例えば、従来のもしくはオブジェクト指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用して、プロセッサによって実施されるソフトウェアコードとして実装され得る。ソフトウェアコードは、一連の命令またはコマンドとして、記憶および／または送信のためにコンピュータ可読媒体上に記憶され得る。好適な非一時的コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハ－ドドライブもしくはフロッピ－ディスクなどの磁気的媒体、または、コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタルバ－サタイルディスク）またはブルーレイディスク等の光学的媒体、フラッシュメモリなどを含むことができる。コンピュータ可読媒体は、そのような記憶装置または送信装置の任意の組み合わせであり得る。

【0128】

そのようなプログラムはまた、インターネットを含む様々なプロトコルに準拠する有線、光、および／または無線ネットワークを介した送信に適合されたキャリア信号を使用して符号化および送信され得る。そのため、コンピュータ可読媒体は、そのようなプログラムを用いて符号化されたデータ信号を使用して作成され得る。プログラムコードで符号化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のある装置と一緒にパッケージ化されるか、または（例えば、インターネットダウンロードを介して）他の装置とは別に提供され得る。任意のそのようなコンピュータ可読媒体は、個々のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、または完全なコンピュータシステム）上にまたは内部に位置してもよく、また、システムまたはネットワーク内部の異なるコンピュータ製品上にまたは内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、本明細書に記載の結果のいずれかをユーザに提供するためのモニタ、プリンタ、または他の適切なディスプレイを含み得る。

【0129】

本明細書に記載のいずれも方法も、ステップを実施するように構成され得る１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムで完全に、または部分的に実施され得る。したがって、実施形態は、本明細書に記載のいずれかの方法のステップを実施するように構成され、おそらくはそれぞれのステップまたはそれぞれのステップ群を実施する異なる構成要素を備えているコンピュータシステムを対象とすることができる。本明細書における方法のステップは、番号付けされたステップとして提示されているが、同時に、または異なる時に、または異なる順序で実行され得る。さらに、これらのステップの一部は、他の方法からの他のステップの一部とともに使用され得る。また、ステップのすべてまたは一部は、任意であり得る。さらに、これらの方法のいずれかのステップのいずれかは、これらのステップを実行するためのシステムのモジュ－ル、ユニット、回路、または他の手段を用いて実行され得る。

【0130】

特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の精神および範囲から逸脱することなく、任意の適切な方法で組み合わせられ得る。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各々の個々の態様、またはこれらの個々の態様の特定の組み合わせに関する特定の実施形態を対象とし得る。

【0131】

本開示の例示的な実施形態の上記の説明は、例示および説明を目的として提示されている。これらは、網羅的であることも、本開示を記載された正確な形態に限定することも意図しておらず、上記の教示に照らして多数の変更および変形が可能である。

【0132】

「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」という記載は、そのようでないと具体的に示されない限り、「１つまたは複数」を意味するように意図される。「または」の使用は、そのようでないと具体的に示されない限り、「排他的論理和」でなく、「包含的論理和」を意味するように意図される。「第１の」構成要素への言及は、第２の構成要素が提供されることを必ずしも必要としない。さらに、「第１の」または「第２の」構成要素への言及は、明示的に述べられない限り、言及された構成要素を特定の位置に限定しない。「基づく」という用語は、「少なくとも部分的に基づく」を意味するように意図される。

【0133】

本明細書において言及されたすべての特許、特許出願、刊行物、および説明文は、全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる。いずれも先行技術であると認められるものではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2025-06-12

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的核酸分子を配列決定するための方法であって、
ナノポアにわたって第１のレベルの第１の数の電圧パルスを印加して、前記標的核酸分子から生成された化合物を、前記ナノポアを通って第１の方向に第１の距離だけ変位させるステップであって、
前記化合物は複数のユニットを含み、
前記複数のユニットの各ユニットは、複数の種類のレポーター要素のうちの１種類のレポーター要素を含み、
各種類のレポーター要素は、前記標的核酸分子内のヌクレオチドの同一性に対応し、
前記第１の数の電圧パルスを印加すると、前記複数のユニットの第１のサブセットが前記ナノポアを通過する、ステップと；
前記ナノポアにおいて、前記第１のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップと；
前記ナノポアにわたって第２のレベルの第２の数の電圧パルスを印加して、前記化合物を、前記ナノポアを通って第２の方向に第２の距離だけ変位させるステップであって、
前記第１の方向は前記第２の方向と反対であり、
前記第１の数の電圧パルスの前記電圧パルスは、前記第２の数の電圧パルスの前記電圧パルスと反対の極性を有し、
前記第２の距離は前記第１の距離未満であり、
前記第２の数は前記第１の数未満である、ステップと；
前記ナノポアにわたって第３のレベルの第３の数の電圧パルスを印加して、前記化合物を、前記ナノポアを通って前記第１の方向に第３の距離だけ変位させるステップであって、
前記第３の数の電圧パルスを印加すると、前記複数のユニットの第２のサブセットが前記ナノポアを通過し、
前記第２のサブセットおよび前記第１のサブセットは、同じユニットの一部を含み、
前記第２のサブセットは、前記第１のサブセットにないユニットを含み、
前記第３の距離は前記第２の距離よりも大きい、ステップと；
前記ナノポアにおいて、前記第２のサブセット中のレポーター要素の種類を検出するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップであって、前記第４のレベルが、前記第１のレベル、前記第２のレベル、および前記第３のレベルよりも大きい、ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記化合物が、複数の化合物のうちの第１の化合物であり、
前記複数の化合物が、複数の標的核酸分子から生成され、
前記ナノポアが、複数のナノポアのうちの第１のナノポアであり、
前記複数の化合物の各化合物が、前記複数のナノポアのうちの１つのナノポア内にある請求項１に記載の方法であって、
前記第１のレベルの前記第１の数の電圧パルス、前記第２のレベルの前記第２の数の電圧パルス、および前記第３のレベルの前記第３の数の電圧パルスを前記複数のナノポアに印加するステップ
をさらに含む、方法。

【請求項4】

前記複数の標的核酸分子の複数の配列を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記複数の配列のサイズ分布が、３００ｎｔより大きいモードを有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のレベルの前記第１の数の電圧パルス、前記第２のレベルの前記第２の数の電圧パルス、および前記第３のレベルの前記第３の数の電圧パルスを前記複数のナノポアに印加するステップと；
前記複数の化合物の第１の部分が、前記複数のナノポアの第１の部分において、前記第１の数の電圧パルス、前記第２の数の電圧パルス、または前記第３の数の電圧パルスによって変位されていることを決定するステップと、
前記複数のナノポアの第２の部分の各ナノポアにわたって第４のレベルの除去電圧を印加して、前記複数の化合物の第２の部分を前記複数のナノポアのそれぞれのナノポアから完全に排出するステップであって、
前記第４のレベルが、前記第１のレベル、前記第２のレベル、および前記第３のレベルよりも大きく、
前記複数のナノポアの前記第２の部分が、前記複数のナノポアの前記第１の部分のナノポアを含まない、ステップと
をさらに含む、請求項３に記載の方法。

【請求項7】

前記標的核酸分子の配列を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記標的核酸分子の前記配列を決定するステップが、前記第１のサブセットおよび前記第２のサブセットの両方における１つまたは複数のユニットについて、同じ種類のレポーター要素を検出することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記化合物を前記ナノポアから完全に排出するステップが、前記第３の数の電圧パルスの前記印加中に行われる、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記複数のユニットの各ユニットが移動制御要素を含み、
前記第１の数の電圧パルスを印加すると、第１の数の移動制御要素が前記ナノポアを通過し、
前記第１の数の電圧パルスが、前記第１の数の移動制御要素に等しい、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ナノポアにわたって第４のレベルの電圧を印加して、前記化合物を、前記第１の数の電圧パルスの電圧パルスの間に前記ナノポアを通って前記第１の方向に第４の距離だけ変位させるステップであって、
前記第４のレベルの前記電圧が、前記第１の数の電圧パルスの前記電圧パルスと同じ極性であり、
前記第４のレベルが前記第１のレベル未満であり、
前記第４の距離だけ変位した後の前記化合物が、前記ナノポア内に移動制御要素を有する、ステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第２のレベルが前記第１のレベルよりも大きい、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記複数のユニットの前記第１のサブセット中のレポーター要素がナノポア内にある場合に前記ナノポアにわたって印加される電圧を有する前記ナノポアについての信号値を測定するステップと；
前記信号値を使用して、前記第１のサブセット中のレポーター要素の種類を決定し、それによって前記標的核酸分子中のヌクレオチドの同一性を決定するステップと
をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記複数のユニットの前記第１のサブセットが３０個以上のユニットを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第３のレベルが前記第１のレベルに等しい、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記標的核酸分子が２００ｎｔよりも長い、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の数の電圧パルスが３０以上である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第１の数の電圧パルスが、前記第２の数の電圧パルスを５以上上回ることがある、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

実行されるとコンピュータシステムを制御して請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を実施する複数の命令を記憶している非一時的コンピュータ可読媒体を備える、コンピュータ製品。

【請求項21】

請求項２０に記載のコンピュータ製品と、
前記コンピュータ可読媒体上に記憶された命令を実行するための１つまたは複数のプロセッサと
を備える、システム。

【請求項22】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を備えるシステム。

【請求項23】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された１つまたは複数のプロセッサを備えるシステム。

【請求項24】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法の前記ステップをそれぞれ実施するモジュールを備えるシステム。

【国際調査報告】