再表 2016-181567 １，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有する調製粉乳

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

【公報種別】再公表特許(A1)

(11)【国際公開番号】WO/0

(43)【国際公開日】2016年11月17日

【発行日】2017年5月25日

(54)【発明の名称】１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有する調製粉乳

(51)【国際特許分類】

   A23C 9/152 20060101AFI20170421BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20170421BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20170421BHJP

【ＦＩ】

   A23C9/152

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】17

【出願番号】特願2015-540767(P2015-540767)

(21)【国際出願番号】PCT/0/0

(22)【国際出願日】2015年5月8日

(11)【特許番号】特許第5820093号(P5820093)

(45)【特許公報発行日】2015年11月24日

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】390015004

【氏名又は名称】日本澱粉工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100080609

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 正孝

(72)【発明者】

【氏名】吉永 一浩

【テーマコード（参考）】

4B001

4B024

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B001AC20

4B001AC30

4B001BC99

4B001EC05

4B001EC99

4B024AA11

4B024CA01

4B024CA09

4B024CA11

4B024CA20

4B024HA12

4B063QA01

4B063QA05

4B063QA13

4B063QA18

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX01

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、 生体内有効成分１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含有する調製粉乳を提供する。
本発明は、１，５−ＡＧを７．７μｇ／ｇ〜３８５０μｇ／ｇで含有する調製粉乳である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

７．７μｇ／ｇ〜３８５０μｇ／ｇの量で１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールを含むことを特徴とする調製粉乳。

【請求項2】

１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトールが１，５−アンヒドロ−Ｄ−フルクトースを微生物的に還元し得られたものである請求項１に記載の調製粉乳。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳児用および妊婦・授乳者用の調製粉乳に添加しうる栄養成分でかつ神経突起形成促進作用、Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＰＳＧ−１）遺伝子発現の活性化作用およびＣｈｏｒｉｏｎｉｃ ｓｏｍａｔｏｍａｍｍｏｔｒｏｐｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅｓ １（ＣＳＨ−１）遺伝子発現の活性化作用を有する調製粉乳を提供することにある。

【背景技術】

【0002】

１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）は哺乳類ではグリコーゲンから１，５−アンヒドロ−Ｄ−フルクトース（１，５−ＡＦ）を中間体として合成されていると考えられており、正常なヒトの血液中には常に１０〜２０μｇ／ｍＬ程度の１，５−ＡＧが含まれている。その血中１，５−ＡＧ量は、健康なヒトでは一定に保たれていることが分かっている。また、糖尿病などで血中グルコース値が高くなると、相関的に血中の１，５−ＡＧ量が下がること、また、この血中１，５−ＡＧ量は直近の血糖値の推移を反映することから、臨床の場で血中１，５−ＡＧ量は血糖コントロールの指標に用いられている。
また１，５−ＡＦの微生物変換（特開２００９−２１５２３１号公報参照）や１，５−ＡＦへの化学的な水素添加（１，５−Ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ；ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｃｈｉｒａｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２）８７３−８９０参照）により１，５−ＡＧが合成できることが報告されている。また、高純度の１，５−ＡＧを調製する方法として結晶化方法も提案されている（特開２００８−５４５３１号公報参照）。また、生理機能としては１，５−ＡＧが膵臓細胞を用いた試験系でインスリン分泌を促進すること（１，５−ａｎｈｙｄｏｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６２３（２００３）ｐ８２−８７参照）、２型糖尿病モデルマウスを用いた試験系では１，５−ＡＧが抗炎症作用を示し糖尿病患者に有効な糖である可能性が見出されている（１，５−ａｎｈｙｄｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２３（２０１０）１０５−１１９参照）。さらに、２型糖尿病モデルを用いた試験では抗糖尿病作用などが報告されている（ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ １，５−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｉｔｏｌ ａｓ ａ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｊ Ａｒｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２３（２０１３）６１１−７参照）。このように１，５−ＡＧはヒトに対して健康的な機能が期待される物質である。
１，５−ＡＧは哺乳類やさまざまな食品中に存在する成分である。牛乳では１ｍＬあたり０．６μｇ、大豆では１ｇあたり２２μｇが含まれると報告されている（リアーゼによるグリコーゲン分解と１，５−アンヒドログルシトール．生化学 ６９（１９９７）１３６１−１３７２参照）。
発明者は自然界の１，５−ＡＧを定量している中でヒト母乳と牛乳では１，５−ＡＧ含有量が大きく異なることを発見した。すなわち、母乳中に含まれる１，５−ＡＧの量は２．６〜１２．３μｇ／ｍＬ程であるのに対し、牛乳中の１，５−ＡＧ量は０．６μｇ／ｍＬと報告（リアーゼによるグリコーゲン分解と１，５−アンヒドログルシトール．生化学 ６９（１９９７）１３６１−１３７２参照）されていることから、母乳中には牛乳中の１０倍程度の１，５−ＡＧが含まれることが判明した。また、市販の乳児用の調製粉乳（４製品）から処方に従って調整したミルクについても母乳と同様の操作で１，５−ＡＧを定量した。その結果、いずれの粉ミルクも１，５−ＡＧ含有量は１μｇ／ｍＬ以下であった。
新生児は母乳で育てられるのが良いが、母乳の分泌が悪い場合や育児環境の問題などで次善の策として調製粉乳を利用する母親も少なくない。日本では完全な調製粉乳による育児が１０％、母乳と調製粉乳の混合育児が６０％で完全な母乳育児は３０％程度に留まるといわれている。
乳の成分は、その動物種に応じた組成があり、当然、ヒトと牛では異なる。調製粉乳は主に牛乳を原料として製造されるが、その成分はヒト乳とは異なるため、ヒト乳の組成になるべく近づけるような努力がこれまで調製粉乳メーカーではなされてきており、今もなおその組成の改善の努力が続いている。
乳の成分としては蛋白質、脂質、糖などが主要な成分であるが、特に蛋白質と脂肪はヒト乳と牛乳でその成分が大きく異なる。蛋白質の含量は牛乳では３．３％であるのに対して、ヒト乳では１．０〜１．２６％と少ない。また、その成分も異なる。カゼインでは、ヒト乳カゼインの約５０〜６０％はβ−カゼインである。κ−カゼインとα−カゼインも含まれる。一方で牛乳カゼインではαｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン及びκ−カゼインから構成されている。牛乳では全蛋白質の約７９％がカゼインであるのに対して、人乳では１２％程度である。
人乳脂肪も牛乳脂肪もその９７〜９８％はトリアシルグルセロールであるが、構成する脂肪酸組成には大きな違いがあり、主要な脂肪酸であるオレイン酸、リノール酸、リノレン酸の含量が異なる。このような脂肪酸の差をより少なくするために食用油脂を添加する場合がある。ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は調製乳の原料として添加される成分であるが、神経細胞の細胞膜を柔らかくし、樹状突起を増やしたり、軸索の成長を促して脳・神経系の健全を保つことから、調製乳の機能性付与を期待して添加されている。ラクトフェリンはヒト乳に含まれ、特に初乳に多いことが明らかになっている。
妊娠時や授乳期は栄養が不足しがちになる。その不足を補う手段として大人用の粉ミルクも販売されている。
１，５−ＡＧの生体内での存在意義については全く明らかにされていないが栄養源をすべて乳に頼る新生児にとっては牛乳と母乳では１，５−ＡＧの摂取量が、人工乳育児の新生児よりも母乳育児の新生児の方が約１０倍量多いことになる。糖尿病における新しい“ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ １−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（１，５−Ａｎｈｙｄｒｏｇｌｕｃｉｔｏｌ）”について、“小児科２４（１９８３）４０５−４１０”には出生後２−３週の乳児は生後２−３か月の乳幼児と比較すると血中１，５−ＡＧ量が低いことが示されている。母乳で育つと１，５−ＡＧを十分に摂取できるが、人工乳で育つ新生時は明らかに母乳成分の１，５−ＡＧが不足することになる。また、母体内の胎児は胎盤を通して栄養成分を母体から供給を受けて育つ。母体の体内、特に血中１，５−ＡＧ量が減少した場合、胎児が得られる１，５−ＡＧも減少することとなる。
１，５−ＡＧは正常なヒトでは血中濃度が２０〜４０μｇ／ｍＬに一定に保持されている。食品として通常よりも過剰な１，５−ＡＧを摂取しても一時的に血中濃度が１００倍程度に上昇するものの２４時間程度でほぼ元の値に戻る。このことから１，５−ＡＧ濃度は２０〜４０μｇ／ｍＬ程度で存在することに意味があると考えられる。

【発明の概要】

【0003】

本発明の目的は、１，５−ＡＧを含有する調製粉乳を提供することにある。
本発明の他の目的は、乳児の１，５−ＡＧ摂取量の低下により危惧される、神経形成、血管形成あるいは知能の発達の遅れやアレルギーの亢進などの抑制に作用する１，５−ＡＧを含有する調製粉乳を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、神経突起形成促進作用、ＰＳＧ−１遺伝子発現の活性化作用、ＣＳＨ−１遺伝子発現の活性化作用が強い１，５−ＡＧを含有する調製粉乳を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は以下の説明から明らかとなろう。
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、
１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−ＡＧ）を７．７μｇ／ｇ〜３８５０μｇ／ｇの量で含有することを特徴とする調製粉乳により達成される。

【図面の簡単な説明】

【0004】

図１は、１，５−ＡＧの胎盤細胞でのＰＳＧ−１遺伝子の発現作用を示すものである。
図２は、１，５−ＡＧの胎盤細胞でのＣＳＨ−１遺伝子の発現作用を示すものである。
図３は、１，５−ＡＧの腸管細胞でのＰＳＧ−１遺伝子の発現作用を示すものである。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本発明者の研究によれば、後の実施例１〜４の実験で明らかとなるとおり、１，５−ＡＧが不足することでＰＳＧ−１遺伝子、ＣＳＨ−１遺伝子の発現低下が認められた。糖尿病などが原因で妊婦の血中１，５−ＡＧが低下した場合は、母体のＰＳＧ−１やＣＳＨ−１の遺伝子発現が抑制され、母体の免疫バランスの悪化や胎児へのエネルギー供給の低下、また、母体から胎盤を通じて胎児に供給される１，５−ＡＧ量が低下することで胎児のＰＳＧ−１やＣＳＨ−１が低下し神経形成や血管形成が遅れ、胎児の正常な発育の後退が危惧される。
また乳幼児においては栄養摂取を母乳あるいは調製粉乳のみに頼ることから調製粉乳のみで育てられると１，５−ＡＧ摂取量の低下により、神経発達の遅れやＰＳＧ−１遺伝子の発現減少により免疫バランスの異常が起こり、アレルギーの亢進や知能の発達の遅れが危惧される。
本発明の調製粉乳は、それ故、上記の如き弊害や危惧の除去に有効であり、１，５−ＡＧを７．７μｇ／ｇ〜３８５０μｇ／ｇの範囲、好ましくは２０μｇ／ｇ〜４００μｇ／ｇの範囲、さらに好ましくは１００μｇ／ｇ〜２００μｇ／ｇの範囲で含有する。
上記範囲の上限値（３８５０）は下限値（７．７）の５００倍に相当する。殆ど母乳のみの育児ではたまに必要となる粉乳として下限値７．７μｇ／ｇで１，５−ＡＧを含む調製粉乳を用いることができ、また殆ど育児を粉乳のみに頼る場合でも上限値３８５０μｇ／ｇで１，５−ＡＧを含む調製粉乳で十分である。１，５−ＡＧは摂取量が一時的に多くなっても体外に排出され易いので問題はない。
調製粉乳は原料乳に各種添加物が混合され、均質化、殺菌、濃縮、乾燥、篩別の工程を経て製造されている、１，５−ＡＧの添加方法としては原料乳に溶液状の１，５−ＡＧや粉末１，５−ＡＧを添加することが可能である。また、乾燥後の粉体に１，５−ＡＧの粉末を混合することでも可能である。１，５−ＡＧの添加方法はこれに限られるものではない。調製乳に混合するのに用いる１，５−ＡＧとしては結晶１，５−ＡＧや溶液状１，５−ＡＧでもよく、１，５−ＡＧ製剤の固形分中の１，５−ＡＧ純度は９０％（Ｗ／Ｗ）以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上が良い。１，５−ＡＧ純度が低いと含まれる不純物自体の変色や栄養成分の変化などのリスクが高まる。特に不純物として１，５−ＡＧの原料である１，５−アンヒドロ−Ｄ−フルクトース（以下１，５−ＡＦ）が多く含まれる場合は調製粉乳中のたんぱく質との反応が認められる。
添加する１，５−ＡＧはグルコースからの化学合成法や１，５−ＡＦの化学的な水素添加法などその製造方法があり、その製法は限定されるものではないが、好ましくは化学的な製造工程がない次の方法が良い。１，５−ＡＦを微生物的に発酵し、精製、濃縮、結晶化し製造したもので、食品製造に適しており、高純度のものが良い。

【実施例】

【0006】

以下実施例により本発明をさらに詳細に且つ具体的に説明する。
実施例１（母乳中の１，５−ＡＧ含有量の測定）
鹿児島市内の産科で出産した方１０名から出産後、約１週間（初乳）および約１か月経過後に採取直後の母乳の提供を受け、高速液体クラマトグラフィーおよび高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて母乳中の１，５−ＡＧを測定した。測定は以下の方法で行った。
採取母乳は１．５ｍＬ容の遠心チューブに入れ、測定まで−２５℃の冷凍庫で保管した。測定前にその母乳を解凍した。３００μＬの母乳にアセトニトリル３００μＬを加えて混合した後に１０，０００ｇで１０分間、遠心分離し上澄を回収した。それを高速液体クロマトグラフ（分離カラム；ＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ＮＨ_２，カラム温度；３０℃，溶離液；アセトニトリル：水＝７０：３０、流速 １．０ｍＬ／ｍｉｎ）に１００μＬを供し、分離カラムから溶出した液のうち１，５−ＡＧが溶出する画分をすべて回収した。その回収画分を遠心エバポレーターに供し、８０℃で乾固したのち、水１００μＬに溶解した。この試料を高性能陰イオン交換クロマトグラム（ダイオネックスＩＣＳ５０００＋ＤＣ、分離カラム；Ｃａｒｂｏｐａｃ ＭＡ１，溶離液；４００ｍＭ ＮａＯＨ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ）に供し、１，５−ＡＧを定量した。
その結果、表１に示すようにヒト母乳中に１，５−ＡＧが含まれることが解った。また、その量は２．６から１２．３μｇ／ｍＬであり、平均で６．０μｇ／ｍＬであった。

【表-1】

実施例２（間葉系幹細胞を用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ解析）
１，５−ＡＧのヒトにおける機能を明らかにするために間葉系幹細胞を用いたＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を行った。培地に１，５−ＡＧの最終濃度が１μｇ／ｍＬ以下あるいは４０μｇ／ｍＬになるように１，５−ＡＧを添加し、間葉系幹細胞を１０日間培養したのち、トータルＲＮＡを回収してＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を行い、１，５−ＡＧ量の違いにより発現変動する遺伝子を網羅的に解析した。同様の試験を３回実施し、得られた結果を総合して解析した。試験は具体的に以下の方法で実施した。
・被検物質
結晶１，５−ＡＧを４０ｍｇ／ｍＬとなるように純水に溶解し、分画分子量３，０００の遠心限外濾過膜でろ過し微量の高分子を除去した。
１，５−ＡＧ溶解に用いた水と同じ純水を、分画分子量３，０００の遠心限外ろ過膜でろ過し試料とした。
・細胞
骨髄由来間葉系細胞（理研細胞バンク、リソースＮｏ．ＭＳＣ−Ｒ４６）
・試薬
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＥＭＥＭ）、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７４０３４）、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ （ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７９６５４
・培地
間葉系幹細胞の前培養には１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、３ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）添加ＤＭＥＭ（以下増殖培地と称する）を用いた。本試験には１０％ ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ（以下試験培地と称する）を用いた。ＦＧＦ−２は間葉系幹細胞の未分化状態を維持する機能があり、前培養中はＦＧＦ−２添加培地を用いて細胞の未分化状態を維持した。本試験の際は、サンプルによる分化誘導効果を解析するために、ＦＧＦ−２を添加しない培地を用いた。
・ヒト間葉系幹細胞の前培養
ヒト間葉系幹細胞は、増殖培地を用いてＴ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）内で培養した。培地交換は２日おきに行い、８０％ コンフルエントに達した時点で０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、細胞を回収して本試験に用いた。
・サンプル調整
サンプルは、終濃度４０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧとなるよう試験培地に添加した。具体的には、４０ｍｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ水溶液を、試験培地に１／１０００量添加して終濃度４０μｇ／ｍＬとし、フィルター滅菌して調整した。比較対象には、１，５−ＡＧ水溶液の調整と同条件で処理した水を、試験培地に１／１０００量添加し、フィルター滅菌したものを用いた。
・本試験細胞培養およびサンプル処理
間葉系幹細胞を、試験培地を用いて１８，０００ｃｅｌｌｓ／１ｍＬ／ｗｅｌｌとなるよう調整し、１２ウェルプレートに播種してＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃）内で２４時間培養した。培養後、１，５−ＡＧ添加試験培地および比較対象試験培地に交換し、ＣＯ_２インキュベーターで培養した。サンプル添加後４日目、以降３日おきに、新しい１，５−ＡＧ添加あるいは比較対象培地（１ｍＬ）に交換して培養を続け、最長で２２日間培養した。サンプル添加後１日目、以降３日おきに位相差顕微鏡で細胞形態を観察した。サンプル添加後７、１０、１３日目にトータルＲＮＡを抽出した。それぞれｎ＝３で行った。
・トータルＲＮＡ抽出
細胞からのトータルＲＮＡの回収はＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉキットを用いて行った。
・ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０ Ａｒｒａｙを用いて行った。トータルＲＮＡは、サンプル添加後１０日目の細胞から抽出したＲＮＡのうち、最も純度が高く、収量の多いものを用い、１，５−ＡＧ添加区と比較対象区を各ｎ＝１で行った。
（結果）
間葉系の胚細胞の培地に１，５−ＡＧを４０μｇ／ｍＬとなるように添加した培地と水を添加した培地の１，５−ＡＧ量を測定した結果、１，５−ＡＧ添加培地は３９μｇ／ｍＬであり、未添加区は１μｇ／ｍＬ以下であった。３９μｇ／ｍＬはヒトの血中濃度の正常高値と同程度であり、１，５−ＡＧ値が正常値のヒトの細胞培養モデル系が確立できた。
Ｇｅｎｅｃｈｉｐ解析の結果、１，５−ＡＧが４０μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬ以下へ減少することにより、発現減少する遺伝子として最も上位にＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＩＬ６ＳＴ）遺伝子が認められた。次いで機能が未知の遺伝子で６遺伝子続き、その次にＰｒｅｇｎａｎｃｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｅｔａ−１−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １をコードする遺伝子（ＰＳＧ−１遺伝子）が認められた。ＩＬ６ＳＴはサイトカインの受容体や神経成長に関係するＣｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒの受容体である。ＰＳＧ−１遺伝子がコードする蛋白質は妊娠特異的な蛋白質で妊娠すると母体の胎盤から大量に分泌される。妊娠時にこの蛋白質の分泌が少ないと胎児の奇形リスクが高くなると言われている。また、この蛋白質の構造は免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。このファミリーは神経系や免疫系に細胞接着の役割を果たしたり、神経突起の形成を促進したりする機能が報告されている。ＰＳＧ−１は妊娠関連の遺伝子であるが、そのほかにＣＳＨ−１も発現低下していた。
実施例３（胎盤栄養細胞でのＰＳＧ−１、ＣＳＨ−１発現）
次に胎盤栄養膜細胞を用いて、１，５−ＡＧがこれら２種の遺伝子（ＰＳＧ−１、ＣＳＨ−１）発現に与える影響を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。まず、予備検討として、３濃度（１μｇ／ｍＬ 以下、４０μｇ／ｍＬおよび１６０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ）、サンプル処理時間３条件（３、２４、および７２時間）における、ＰＳＧ−１の発現量を解析した。試験は具体的に以下の方法で実施した。
・細胞
ヒト胎盤絨毛栄養膜細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
・培地
Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ （ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
基本培地５００ｍＬに、培地付属のウシ胎児血清 （ＦＢＳ） ２５ｍＬ、ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５ｍＬ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５ｍＬを加えて調整した。
・試薬
０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２７７７−４４）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ （日水製薬株式会社Ｃａｔ．Ｎｏ．０５９１３）、ＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ （ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２１５０１１）、ＳＹＢＥＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＲＲ０４１Ｌ）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｐｒｉｍｅｒｓ）（ＦＡＳＭＡＣ）
・方法
ヒト胎盤絨毛栄養膜細胞の継代培養
ヒト胎盤絨毛栄養膜細胞は、Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、培地と略す）を用いて、Ｔ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）で培養した。培地交換は２日おきに行い、８０％コンフルエントに達した時点で細胞を回収し、継代数２の細胞を本試験に用いた。具体的には、細胞をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．２５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、培地を加えてトリプシンを中和した。次に、遠心（１８０ｇ，５分）して上清を除き、新たな培地を加えて細胞を撹拌し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントし、培地を用いて目的濃度（４．０ｘ１０^３個／１００μＬ）に調整した。
・サンプル調整
サンプルは、終濃度４０μｇ／ｍＬおよび１６０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧとなるよう培地に添加した。１μｇ／ｍＬ以下は１，５−ＡＧを未添加とした。具体的には、４０ｍｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ水溶液を、試験培地に１／１０００量あるいは１／２５０量添加して、終濃度４０μｇ／ｍＬあるいは１６０μｇ／ｍＬとし、フィルター滅菌して試験に用いた。試験群には、１，５−ＡＧ水溶液の調整と同条件で処理した水を、試験培地に１／１０００量添加し、フィルター滅菌して試験に用いた。
・本試験細胞培養およびサンプル処理
培地を用いて細胞を４×１０^３ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルとなるよう調整し、９６ウェルプレートに播種してＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）内で２４時間培養した。培養後、１，５−ＡＧ含有培地および比較対象培地に交換し、ＣＯ_２インキュベーターで培養した。サンプル添加後、３時間、２４時間、７２時間培養し、位相差顕微鏡で細胞形態を観察した後、トータルＲＮＡを抽出した。それぞれｎ＝４で行った。なお、参考として、３日ごとに１，５−ＡＧ含有培地および比較対象培地に交換し、最長１０日間培養した細胞の形態観察も行った。
・トータルＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ化
細胞からのトータルＲＮＡの回収およびｃＤＮＡ化はＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ＲＴ−ＰＣＲキットの手順に従って行った。
・リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ を用いたインターカレーター法で行った。具体的にはＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ専用プレートに下記表−２に記載の組成の反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。

【表-2】

ＰＣＲ反応は９５℃・３０ｓｅｃ−（９５℃・１０ｓｅｃ−６０℃・３０ｓｅｃ）ｘ４５ｃｙｃｌｅｓ−９５℃・１５ｓｅｃ−５５℃・１５ｓｅｃ−９５℃・１５ｓｅｃの条件で行い、ＰＣＲ反応終了後にＰＣＲ産物の解離曲線を求めた。相対発現量はΔΔＣｔ法により、コントロールの発現量を１．０となるよう算出した。内部標準遺伝子としてＧｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を用いた。
・ＰＳＧ−１遺伝子発現解析
ＰＳＧ−１遺伝子発現解析の結果を図１に示す。１，５−ＡＧ添加区で、サンプル処理時間に比例してＰＳＧ−１遺伝子発現レベルが上昇し、サンプル処理７２時間目では、４０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ添加区で対無添加１．５４倍、１６０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ添加区で対無添加１．６２倍となり、無添加区との間で有意差が検出された（Ｐ＜０．０５）。したがって、１，５−ＡＧは、胎盤栄養膜細胞で、ＰＳＧ−１遺伝子の発現を促進する効果を持つことが示された。
また、４０μｇ／ｍＬの １，５−ＡＧ添加区と１６０μｇ／ｍＬ の１，５−ＡＧ添加区の間では、ＰＳＧ−１発現レベルに大きな差が見られなかった。したがって、本試験系では、４０μｇ／ｍＬの１，５−ＡＧの存在は、ＰＳＧ−１遺伝子発現を促進するのに十分であると考えられた。ヒトでは通常一日あたり５−１０ｍｇ程度の１，５−ＡＧを食品から摂取していると推測されている（非特許文献 血中１，５−アンヒドログルシトール値の変化に対する臨床研究 臨床検査 ３８：４８５−４８８、１９９４）。また、体内で生合成される１，５−ＡＧもある。血中１，５−ＡＧは２０から４０μｇ／ｍＬ程度に維持されているが、一時的に１，５−ＡＧを例えば、食品から摂取する量の１０００倍程度、２０ｇを摂取した場合には一時的に血中１，５−ＡＧ量は高くなるものの、すぐに１，５−ＡＧは尿中に排泄され２４時間程度で血中１，５−ＡＧレベルはもとに戻る。この結果から、血中に必要な１，５−ＡＧ量は２０から４０μｇ／ｍＬ程度であり、それ以上の１，５−ＡＧは必要ないために排泄していると考えられる。胎盤細胞のデータでも４０μｇ／ｍＬ以上ではＰＳＧ−１の発現量の変化がないため４０μｇ／ｍＬ程度で充分であり、不足するとＰＳＧ−１の発現に影響する。
同時にサンプル処理７２時間目の細胞から抽出したＲＮＡを用いて、ＣＳＨ−１遺伝子発現解析を行った。
・ＣＳＨ−１遺伝子発現解析
ＣＳＨ−１遺伝子発現解析の結果を図２に示す。１，５−ＡＧ無添加区は４０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ添加区の１／１．８０倍、１６０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ添加区で対無添加０．９２倍となり、４０μｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ添加区と比較して、無添加区は有意に発現抑制した（Ｐ＜０．０５）。したがって、１，５−ＡＧは、胎盤栄養膜細胞で、ＣＳＨ−１遺伝子の発現を促進する効果を持つことが示された。ＣＳＨ−１遺伝子は胎盤栄養膜細胞で発現し、成長ホルモン様ペプチドをコードし、母体の代謝を調節して胎児への栄養供給を促進するとともに胎児の血管新生の制御にも関与している。
実施例４（腸管細胞でのＰＳＧ−１発現）
ＰＳＧ−１は妊娠時に胎盤細胞で大量に発現される遺伝子である。妊娠に関係ない腸管細胞でのＰＳＧ−１発現に対する１，５−ＡＧの影響を調べた。
・サンプル調整
１，５−ＡＧを５濃度（１．６、８、４０、２００、１０００μｇ／ｍＬ）で試験を行った。具体的には、まず、１００ｍｇ／ｍＬの１，５−ＡＧ水溶液を、水を用いて希釈し、０．１６、０．８、４、２０、１００ｍｇ／ｍＬとなるよう１００倍濃度溶液を調整した。これら１００倍濃度溶液を、培地に１／１００量添加し、終濃度１．６、８、４０μｇ／ｍＬとし、フィルター滅菌して試験に用いた。陰性対照として、水を培地に１／１００量添加し、フィルター滅菌して試験に用いた。
・細胞培養およびサンプル処理
Ｃａｃｏ−２細胞を、培地を用いて１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／０．３ｍＬ／ｗｅｌｌとなるよう調整し、４８ウェルプレートに播種してＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃）内で１４日間培養した（一日おきに培地交換）。培養後、腸上皮様細胞に分化したのを確認した後、サンプル含有試験培地およびコントロール含有試験培地に交換し、ＣＯ_２インキュベーターで３日間培養し、細胞からトータルＲＮＡを抽出してＰＳＧ−１遺伝子発現量を解析した。各ｎ＝５で行った。
・トータルＲＮＡ抽出
ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡキットを用いて抽出した。具体的には、培養後、培地を除去して、各ウェルにＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡキットに付属のｂｕｆｆｅｒ ＦＣＷ（１５０μＬ）を添加し、直ちに除去して細胞を洗浄した。次に、各ウェルにＦａｓｔＬａｎｅ Ｃｅｌｌ ｃＤＮＡキットに付属のｂｕｆｆｅｒ ＦＣＰ（６０μＬ）を添加し、室温で５分間インキュベートしてｔｏｔａｌ ＲＮＡを溶出させた後、９６ウェルプレートに回収した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡは−８０℃で保存した。
・ｃＤＮＡ化
ｃＤＮＡ化はＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ を用いて行った。具体的には、抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ（２μＬ）を、ｇＤＮＡ Ｗｉｐｅｏｕｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、ＲＮａｓｅｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ １０μＬと混合して４２℃で５分間インキュベートした後に氷上へ移し、次にこの反応液に、逆転写反応マスターミックス（Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １μＬ Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘ １μＬ）を６μＬ添加し、４２℃、３０分間インキュベートして逆転写した。次に９５℃、３分間処理して逆転写酵素を失活させた。この反応液を合成ｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに用いた。解析に用いるまで−２０℃で保存した。
・リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ を用いたインターカレーター法で行った。具体的には合成ｃＤＮＡ １μＬ、ｄｓＨ２Ｏ ２．６μＬ、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａｑ ４μＬ、Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（５μＭ）０．２μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（５μＭ）０．２μＬ、計８μＬの系で行った。ＰＣＲ反応は９５℃・３０ｓｅｃ−（９５℃・１０ｓｅｃ−６０℃・３０ｓｅｃ）ｘ４０ｃｙｃｌｅｓ−９５℃・１５ｓｅｃ−５５℃・１５ｓｅｃ−９５℃・１５ｓｅｃの条件で行った。相対発現量はΔΔＣｔ法により算出した。内部標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。プライマーは下記の配列を用いた。
ＰＳＧ１−ｆｏｒ： ５’−ＡＧＣＴＧＣＣＣＡＴＣＣＣＣＴＡＣＡＴ−３’
ＰＳＧ１−ｒｅｖ： ５’−ＧＧＣＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＡＧＣＣＡ−３’
ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒ： ５’−ＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＣＣ−３’
ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖ： ５’−ＣＣＡＧＧＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣ−３’
・ＰＳＧ−１産生促進試験
細胞からトータルＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によってＰＳＧ−１遺伝子の発現解析を行った。遺伝子発現解析の結果を図３に示す。ＰＳＧ−１遺伝子発現量平均値は、１，５−ＡＧ添加区で、無添加区と比較して増加する傾向が見られ、８μｇ／ｍＬ試験区で１．３１倍、４０μｇ／ｍＬ試験区で１．３４倍となった。
実施例５（神経突起形成促進効果）
間葉系の胚細胞の試験で神経形成に関係する受容体の発現促進が認められた。また、ＰＳＧ−１は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そのファミリーの中には神経形成促進作用を有するものが存在する。そこで１，５−ＡＧの神経突起形成への影響について調べた。神経突起形成の評価に一般的に用いられているＰＣ１２細胞を用いた試験系で評価した。
・細胞
ＰＣ１２細胞（Ｌｏｔ Ｎｏ．４８、Ｌｏｔ Ｎｏ．５１）（理研細胞バンク、資料１）
・培地
増殖培地
１０％ ＦＢＳ、１０％ ＨＳ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加ＤＭＥＭ培地
試験培地
０．１％ ＦＢＳ、０．１％ ＨＳ、１ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦ、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ添加ＤＭＥＭ培地
・試薬
ＤＭＥＭ培地（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０８４５６−６５）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１７１０１２）、ウマ血清（ＨＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６０５０）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２６２５３−８４）、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５３００−０６２）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（日水製薬株式会社，Ｃａｔ．Ｎｏ．０５９１３）、ＤＰＢＳ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａ．Ｎｏ．１４０４０−１３３）、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２５３００）、Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１５００１）
・方法
ＰＣ１２の継代培養
ＰＣ１２細胞は、増殖培地を用いて、Ｔ−７５フラスコに起眠し、ＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）で培養した。培地交換は２日おきに行い、８０％コンフルエントに達した時点で細胞を回収し、継代数２の細胞を本試験に用いた。具体的には、細胞をＤ−ＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎを用いて細胞を剥離し、増殖培地を加えてトリプシンを中和した。次に、遠心（１８０ｇ，５分）して上清を除き、増殖培地を加えて細胞を撹拌し、血球計算盤を用いて細胞数をカウントし、増殖培地を用いて目的濃度（２．０ｘ１０^３個／１００μＬ）に調整した。
・サンプル調整
１，５−ＡＧ ５濃度（１．６、８、４０、２００、１０００μｇ／ｍＬ）で試験を行った。具体的には、まず、１００ｍｇ／ｍＬ １，５−ＡＧ水溶液を、水で希釈し、０．１６、０．８、４、２０、１００ｍｇ／ｍＬとなるよう１００倍濃度溶液を調整した。これら１００倍濃度溶液を、試験培地に１／１００量添加し、終濃度１．６、８、４０、２００、１０００μｇ／ｍＬとし、フィルター滅菌して試験に用いた。陰性対照として、水を、培地に１／１００量添加し、フィルター滅菌して試験に用いた。陽性対照として、１００ｎｇ／ｍＬ Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）含有試験培地を用いた。
・本試験細胞培養およびサンプル処理
増殖培地を用いて、細胞を２．０ｘ１０^３個／１００μＬ／ウェルとなるよう調整し、コラーゲンコートした９６ウェルプレートに播種してＣＯ_２インキュベーター（５％ ＣＯ_２、３７℃、湿潤）内で２４時間培養した。培養後、サンプル含有試験培地（１００μＬ）に交換し、ＣＯ_２インキュベーターで９６時間培養した。培養終了時に位相差顕微鏡で、各ウェル１枚ずつ細胞像を撮影し、神経突起伸長率測定に用いるとともに、Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて核および細胞質を蛍光染色し、生細胞数および神経突起伸長量を測定した。各ｎ＝５で実施した。
・Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いた生細胞数および神経突起伸長量の定量
培養終了後、Ｎｅｕｒｉｔｅ Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて、生細胞数および神経突起伸長量の定量を行った。具体的には、培地を除去した後、染色液（Ｋｉｔ付属のＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ＩｎｄｉｃａｔｏｒおよびＣｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔａｉｎをｃａｌｃｉｕｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ含有ＰＢＳで１０００希釈して調製）を、各ウェルに１００μＬ添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、染色液を除去し、ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ溶液（Ｋｉｔ付属のｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｙｅ をｃａｌｃｉｕｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ含有ＰＢＳで１００希釈して調製）を、各ウェルに１００μＬ添加し、マイクロプレートリーダーで蛍光強度を測定した（生細胞数測定：励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５１５ｎｍ、神経突起伸長量測定：励起波長５５５ｎｍ、蛍光波長５６５ｎｍ）。
・神経突起伸長率の定量
上記で撮影した画像に基づき、細胞画像から総細胞数、細胞長と同程度以上の神経突起伸長を示す細胞数、細胞長の２倍以上の長さの神経突起を示す細胞数を測定した。測定値より神経突起伸長を示す細胞の割合（％）を算出した。
・神経突起伸長率定量
まず、ＮＧＦ添加区では、１倍以上の突起伸長を示した細胞の割合が６８．８％、２倍以上の突起伸長を示した細胞の割合が５４．５％となり、明瞭な神経突起伸長促進効果が認められた。次に１，５−ＡＧ添加区では、１倍以上の突起伸長を示した細胞は、無添加区が全細胞中の１２．６％であったのに対し、１，５−ＡＧ ４０μｇ／ｍＬおよび２００μｇ／ｍＬ試験区では、それぞれ１５．８％および１８．７％であった。２倍以上の突起伸長を示した細胞は、無添加区は５．７％であったのに対して、それぞれ１０．３％および１０．４％と約２倍となり、１，５−ＡＧが神経突起形成促進に関与することが分かった。
・蛍光定量
生細胞数は、全試験区で、陰性対照（無添加）区と同程度であり、１，５−ＡＧは、ＰＣ１２細胞の増殖性に影響しないと考えられた。次に、細胞あたりの神経突起伸長量については、まず、ＮＧＦ添加区では対無添加区１８３．１％と有意な増加が認められた。次に、１，５−ＡＧ添加区においては、８μｇ／ｍＬおよび４０μｇ／ｍＬでは無添加区１１３．４％および１１３．３％と高くなった。
本試験の結果、４０μｇ／ｍＬ濃度を中心とする１，５−ＡＧ添加区において、神経突起伸長率および伸長量が増加した。
実施例６
市販の調製粉乳に結晶１，５−ＡＧを乳鉢ですりつぶした後に混合し、１，５−ＡＧ含有調製粉乳を得た。得られた粉乳の１，５−ＡＧを測定したところそれぞれ７．７、３８．５、７７、１５４、７７０、３８５０μｇ／ｇであった。
発明の効果
本発明によれば、粉ミルクまたは母乳と共に粉ミルクを併用する乳幼児に、粉ミルクからも母乳と同様に１，５−ＡＧの摂取を可能とした調製粉乳が提供される。また、妊婦や授乳者用の粉ミルクにも１，５−ＡＧを添加することで胎児や乳児へ必要な１，５−ＡＧを供給できる。本発明の調製粉乳の摂取により、生体内で種々の有用な作用例えば神経形成や血管形成等に有用な１，５−ＡＧを含む母乳を摂取したときと同様に摂取することができる。
［配列表］

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】