【技術分野】

【0001】

【背景技術】

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【0010】

【先行技術文献】

【発明の概要】

本発明の目的は、食経験があり安全性が認められている微生物から効率的に得られる、新たな抗菌性物質を提供することである。また、特殊な培養培地を必要とせず、短期間の培養で十分な抗菌性物質を誘導する方法、すなわち安全性の高い抗菌性物質の工業的生産性に優れた製造方法を提供することである。

このような事情を鑑みて鋭意研究を重ねた結果、食経験があり安全性が認められているアスペルギルス糸状菌、すなわち麹菌を、一般的な組成の微生物用培地を用い、pHメーターと塩基性水溶液の自動滴定装置を組み合わせたpH制御装置を用いた塩基性一定制御培養を行うことにより、アスペルギルス・オリゼー(A. oryzae)から抗菌性物質が多く産生されることを見出した。さらにこのようにして得られた抗菌性物質が、公知の方法で得られたものと異なる、新たな抗菌性物質である可能性を見出し、本発明を完成させた。 すなわち本発明は、
（１）麹菌をpH ７〜１０に維持された液体培地で培養する工程を含む、抗菌性物質の製造方法。
（２）前記麹菌が、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)から選ばれる１種又は２種以上の菌株である、（１）に記載の製造方法。
（３）麹菌を液体培地で培養する際に、pHメーターによる連続モニタリングと、pH滴定装置を組み合わせ、培養液のpHをpH７〜１０に維持する工程を含む、（１）または（２）記載の製造方法。
（４）前記液体培地へのNaClの配合量が、０〜５重量％である、（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
に係るものである。

本発明によると、食経験があり安全性が認められているアスペルギルス糸状菌、すなわち麹菌を用いて、複雑な工程を経ることなく、短期間の培養で十分な抗菌物質を産生することができる。麹菌の培養に用いる培地としては一般的な組成の液体培地でよく、特殊な培養培地を必要としない。また、この方法を用いて得られた抗菌性物質は、公知の方法で得られたものとは異なる抗菌スペクトルを有する新たな抗菌性物質である可能性がある。

【発明を実施するための形態】

以下、本発明を詳細に説明し、本発明の理解に供する。
本発明の抗菌性物質の製造に用いる麹菌とは、発酵食品の製造に利用され、食経験を有するアスペルギルス属糸状菌を指す。
代表的なものとしては、醸造食品製造において食経験豊富なアスペルギルス属糸状菌として、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーエ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawacｈii)およびアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・グラウカス(Aspergillus glaucus)、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari)、アスペルギルス・ルチュエンシス(Aspergillus luchuensis) 、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus nigar)が挙げられる。アスペルギルス・フラバス（Aspergillus flavus）のような、アフラトキシンを産生する菌株は用いない。

本発明の実施において、培地は液体培地が好ましい。
培養に必要な培地は特殊なものである必要は無く、たとえば単純なYPD培地で構わない。或いは糖源や窒素源を変更することや、NaClを５．０%以下となるよう添加することも可能である。

麹菌の培養には、糖として、資化可能な任意の単糖類や二糖類、三糖以上の多糖類、デンプン、さらに、ショ糖製造時に副産物として生じるモラセス（廃糖蜜）の様な混合糖類などを利用でき、特に制限は無い。好ましくはグルコースとマルトースである。

窒素源としては、麹菌が資化可能な任意の窒素源を利用することができ、具体的には硝酸塩やアンモニウム塩などの無機窒素、オカラや豆乳、ホエー、小麦ふすま、畜肉、酵母などの残渣や酵素分解物などが利用できる。好ましくはペプトンやトリプトンである。

培養は振とう培養や通気撹拌培養によるバッチ培養、または連続培養や通電による電気培養法も利用できる。

本発明の抗菌物質は、麹菌を接種した後の培地を２４時間以上、中性〜塩基性に維持することで得られる。pH制御に用いる塩基の種類は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアの水溶液などが挙げられるが、特に制限することなく使用して製造できる。培養時にはpHモニタリング装置とpH滴定装置を組み合わせたpH制御装置を使用し、且つ通気撹拌培養による振とう培養を行うことが望ましい。

培養中の培地のpH制御値は麹菌の菌株毎に最適化を図るが、好ましくはpH７〜pH１０、より好ましくはpH７．５〜pH９．５、さらに好ましくはpH８．０〜pH９．５である。

麹菌の培養時間は、抗菌性物質が産生されるのに必要な時間とし、通常２４時間から１２０時間である。
培養後の培養液は抗菌性物質を含有する。抗菌性物質を含む培養液はそのまま使用または保存しても良いし、好ましくは菌体を除去後、必要に応じて精製し、得られた抗菌性物質を含む組成物を凍結または粉末化して保存する。

抗菌製剤の製造には、賦形剤等の目的で食品用として利用可能な原料を用いることができる。また、抗菌性物質を含む組成物を精製せずに用いることも可能であり、目的に応じて精製してから利用することもできる。

本発明においては製造工程中、または工程後に、例えば乳酸菌抽出物や酵母抽出物などの未加工粗製物や分解物、グリシンやキチン・キトサン、ポリリジンなどの保存料や日持ち向上剤、EDTAやクエン酸などのキレート物質、プロテアーゼやアミラーゼ、ホスファターゼなどの分解酵素を添加することにより、剤としての安定性や抗菌スペクトルの拡大、抗菌物質構造や組成物の改良、収量向上、味質の改善を図ってもよい。

本願方法により得られた抗菌性物質又は抗菌性物質を含む組成物は、安全性が高いため、食品であれば、特に制限なく使用できる。例えば、野菜、果物などの食品、調味料などの食品素材、惣菜などの調理食品などに利用できる。また、食品だけでなく医薬品、医薬部外品、化粧品、畜産・漁業での飼料、微生物由来農薬、植物の免疫強化などの多様な分野で使用することが可能である。本発明品は、公知の抗菌剤の使用方法が利用できる。例えば、食品であれば、本発明品を食品に均一に混合する、本発明品を適宜濃度調整し、食品に噴霧するなどがある。

以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。 ＜pH制御を行わない培養＞
＜比較例１＞
(１)麹菌の調製
麹菌としては、A. oryzae (株式会社樋口松之助商店製、No.１００株、酒造用「白峯」)を用いた。単離・純粋培養した菌を、ポテトデキストロース寒天斜面培地（日水製薬株式会社製）７mLに割線後、３０℃で７２時間培養し、適宜寒天培地毎切り出して下記液体培養に供試した。
(２)液体培地の調製
培養は全て液体培地にて実施した。酵母エキス(日本製薬株式会社製)１重量％、ハイポリペプトン（日本製薬株式会社製）２重量％、グルコース（和光純薬工業株式会社製、特級）２重量％となるように超純水に溶解したものを基本組成のYPD培地とした。これらを１２１℃２０分間オートクレーブ処理して滅菌した後、培養に使用した。
（３）麹菌の培養〜培養液凍結乾燥粉末の取得
麹菌の培養は坂口フラスコを用いて実施した。滅菌済みの５００mL坂口フラスコに前記のとおり調製した各培地１００mLを移し、PDA培地から切り出したA. oryzae 白峯の胞子を植菌。２８℃で７２時間振とう培養した。培養終了後、培養液を金属メッシュのザル(目開き１mm)で粗ろ過したのち、ろ紙(ADVANTEC社製「７C」)でろ過して菌糸を取り除いた。取得したろ液のpHが、以降の抗菌性評価に影響を及ぼさないpH７±1になるよう水酸化ナトリウム水溶液で調整した。ろ液を１０，０００rpmで１０分間遠心分離した後、上清を回収してφ０．８μmフィルター(ADVANTEC社製)で処理したのち、φ０．２２μm(ろ過できなければφ０．４５μm)フィルターでデブリや胞子を除去した。凍結乾燥は「FreeZone-２．５」(LABCONCO社製)を用い、麹菌培養液の凍結乾燥粉末を得た。得られた凍結乾燥粉末を比較例１の組成物とした。 ＜比較例２＞
YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を０．５重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例２の組成物とした。 ＜比較例３＞
YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を１．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例３の組成物としとした。 ＜比較例４＞
YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を３．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例４の組成物とした。 ＜比較例５＞
YPD培地に加えて塩化ナトリウム（和光純薬工業株式会社製、特級）を５．０重量％配合した培地を使用する以外は、比較例１と同様に行い、得られた凍結乾燥粉末を比較例５の組成物とした。 （４）抗菌性試験
グラム陰性菌としてEscherichia coli DH5α(大腸菌)、グラム陽性菌としてBacillus subtilis (納豆菌)を被検菌として用いた。これらの各被検菌を、液体LB培地を用いて３７℃にて一晩前培養してPBS緩衝液に希釈し、２%の希釈被検菌体液を調製した。
試料として、比較例１〜５の組成物をそれぞれ液体LB培地(Difco社製『LB Broth, Miller (Luria-Bertani)』)に溶解し、フィルターろ過(φ０．４５um)した後、２４ウェルのマルチプレート（住友ベークライト社製、ウェル底面未処理）に９００uLずつ分注した。比較例１〜５の組成物をLB培地に溶解する濃度は、１％、３％、５％とした。対照区については、LB培地９００μL分注した。
前述の被検菌体液を各ウェルに９０uLずつ、最終菌体濃度０．２％となるよう分注したのち、１００uLを濁度測定のため抜き取り、プレートをシールした。振とう培養装置（TAITEC社製、Invitro shaker)で３７℃、６５０rpmにて２４時間振とう培養した。培養後、各ウェルの培養液について波長６００nmで測定した濁度による増殖抑制を比較した。
培養後の濁度が対照区よりも低いものを抗菌活性（＋）とし、同じか高いものを抗菌活性（−）とした。 比較例１〜５の結果
比較例１〜５の試料のLB培地への溶解濃度が１％、３％の場合は、比較例１〜５のいずれも、グラム陰性(大腸菌)、グラム陽性(納豆菌)ともに抗菌活性は（−）であった。試料の溶解濃度が５％の場合の結果を表１（A. oryzae由来培養上清物の抗菌力（抗菌試験での試料添加濃度５％））に示す。 表１に示す通り、試料添加濃度５％で抗菌活性試験をしたとき、A. oryzae 白峯をpH制御無しで培養した上清の凍結乾燥物（比較例１〜５）は、１％塩化ナトリウム添加で培養した比較例３を除き、抗菌性を示さなかった。比較例３については、グラム陰性菌であるE.coliに対してのみ増殖を抑制する抗菌性を示した。全体として、この培養法における抗菌性物質の産生量は低いか、抗菌性物質の抗菌活性が低いことがわかった。また、抗菌性物質の誘導に対する塩化ナトリウムの影響は少ないと推察された。 ＜pH一定制御培養＞
＜実施例１＞
実施例１については、以下の方法により調製した。
(１)麹菌の調製
比較例１の（１）と同様に、A. oryzae (株式会社樋口松之助商店製、No.１００株、酒造用「白峯」)を用いた。単離・純粋培養した菌を、ポテトデキストロース寒天斜面培地（日水製薬株式会社製）７ｍＬに割線後、３０℃で７２時間培養し、適宜寒天培地毎切り出して下記液体培養に供試した。
(２)液体培地の調製
比較例１の（２）と同様の方法により調製した培地を用いた。なお、YPDに加える塩化ナトリウム濃度は０．５％（５ｇ/L）とした。
（３）麹菌の培養〜抗菌性物質の取得
実施例１において、pHの一定制御培養をジャーファーメンターにて実施した。滅菌済みの２Lジャーファーメンターに調製した液体培地１Lを移し、PDA培地から切り出した胞子を植菌した。培養中はpHメーターによる連続モニタリングとpH滴定装置を組み合わせ、１規定水酸化ナトリウムを用いてpH７．５〜８．５に入るように制御、温度２８℃、通気量０．８L/min、撹拌速度４００rpmにて７２時間培養した。また、発泡が激しいため、途中から滅菌済みの「消泡剤CKB」（ディスフォーム社製）を８０μL添加した。培養液について、比較例１と同様の方法により処理を行い、得られた凍結乾燥粉末を実施例１の組成物とした。 ＜比較例６＞
実施例１の麹菌の培養において、pHを一定制御ではなく、１２時間おき（計６回）に１規定水酸化ナトリウム溶液でpH８．０に調整した以外は、実施例１と同様に行って、麹菌培養液の凍結乾燥粉末を取得し、比較例６の組成物とした。 実施例１と比較例６の組成物について、前述の（４）抗菌性試験に準じて、抗菌性試験を行った。
抗菌性試験の結果を表２（pHをアルカリ域で制御したA.oryzae培養上清の抗菌力）に示す。
表２に示すとおり、この抗菌試験系においては、比較例６の組成物は抗菌活性をほとんど示さなかった。一方、実施例１の組成物は、グラム陰性菌に対しては添加濃度３％以上において、グラム陽性菌に対しては添加濃度１％以上において、抗菌活性を示した。
このことから、培養液のpH調整方法としては、断続的にアルカリ性に制御するのに比べ、常にアルカリ性を保つように制御をする方が、抗菌性物質が多く産生される、あるいは産生される抗菌性物質の抗菌活性が高いことがわかる。
また、pH一定制御した実施例１においては、グラム陰性菌よりグラム陽性菌に対して、より強い抗菌活性を示した。一方、pH調整を行わない培養を行った比較例３においては、グラム陽性菌よりグラム陰性菌に対してより強い抗菌活性を示している。
これらのことから、pH一定制御で得られた実施例１の組成物に含まれる抗菌性物質は、pH無調整で得られる抗菌性物質とは異なる抗菌性物質である可能性が示唆された。 ＜有機酸分析＞
乳酸や酢酸などは抗菌性を有する有機酸として知られているため、実施例１の抗菌活性が、それらの有機酸によるものであるかを確認するために試験を行った。
実施例１、比較例６のサンプル５％添加後の被検菌培地中の乳酸と酢酸の濃度を、pH緩衝化ポストカラム電気伝導度検出法によるHPLC分析により測定した。カラムはShim-pack SCR-１０２H ×２を用いた。
結果を表３（pHをアルカリ域で制御したA.oryzae培養上清の有機酸量）に示す。
今回測定された有機酸量は、pH７付近における各々のMICを下回る１００分の１以下の濃度であることから、有機酸の抗菌性は無視できる。すなわち、抗菌性試験で見られた抗菌活性は、これらの有機酸によるものではないと考えられる。 ＜アルカリ処理と抗菌性＞
実施例１の組成物における抗菌性が、アルカリにより菌体から溶出した成分である可能性を考え、確認を行った。
pH７（中性）一定制御で、A. oryzae 「白峯」を７２時間培養した。得られた培養液を、水酸化ナトリウムでpH９に調整して４つに分け、それぞれ室温で４日、５０℃で３０分、９０℃で３０分、１１０℃で３０分置いた後、塩酸でpH７．０に調整した。これらについて、培養液凍結乾燥粉末を取得し、前述の（４）抗菌性試験に準じて抗菌活性を測定したところ、４ついずれも抗菌活性は認められなかった。
この結果から、実施例１の組成物中の抗菌性物質は、菌体がアルカリで処理されて溶出された物質ではなく、アルカリ一定条件下での培養において産生された物質であることが裏付けられた。 ＜酵素処理と抗菌性＞
糸状菌の菌糸の細胞壁成分であるキチンや、キチンをアルカリ処理することで得られるキトサンには抗菌活性があるという知見があるため、実施例１の抗菌活性が、それらによるものであるかを確認するために試験を行った。
pH６一定制御で、A. oryzae 「白峯」を７２時間培養した。得られた培養液１００gに、糸状菌細胞壁溶解酵素Yatalase（タカラバイオ社製）を５０mg添加し、３７℃で８時間反応させた。加熱失活後、pH７．０に調整し、その培養液凍結乾燥粉末について、前述の（４）抗菌性試験に準じて抗菌活性を測定したところ、抗菌活性は認められなかった。
この結果から、実施例１の組成物中の抗菌性物質は、糸状菌の細胞壁が溶解して生じたキチンやキトサンではなく、アルカリ一定条件下での培養において産生された物質であることが裏付けられた。 本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、種々の条件変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

【産業上の利用可能性】

【0047】