特表-19123688IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2015.5.11 β版

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再表2019-123688α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物、α−グルコシダーゼ阻害剤、糖分解酵素活性阻害用食品組成物、糖分解酵素活性阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法、及び、α−グルコシダーゼ阻害活性の有効成分の定量分析方法
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
【公報種別】再公表特許(A1)
(11)【国際公開番号】WO/0
(43)【国際公開日】2019年6月27日
【発行日】2020年12月24日
(54)【発明の名称】α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物、α−グルコシダーゼ阻害剤、糖分解酵素活性阻害用食品組成物、糖分解酵素活性阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法、及び、α−グルコシダーゼ阻害活性の有効成分の定量分析方法
(51)【国際特許分類】
   A23L 33/20 20160101AFI20201127BHJP
   A61K 36/07 20060101ALI20201127BHJP
   A61P 3/10 20060101ALI20201127BHJP
   A61P 43/00 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/58 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/575 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/201 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/215 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/235 20060101ALI20201127BHJP
   A61K 31/231 20060101ALI20201127BHJP
【FI】
   A23L33/20
   A61K36/07
   A61P3/10
   A61P43/00 111
   A61K31/58
   A61K31/575
   A61K31/201
   A61K31/215
   A61K31/235
   A61K31/231
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】25
【出願番号】特願2019-560015(P2019-560015)
(21)【国際出願番号】PCT/0/0
(22)【国際出願日】2018年6月15日
(31)【優先権主張番号】PCT/JP2017/046247
(32)【優先日】2017年12月22日
(33)【優先権主張国】JP
(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
(71)【出願人】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(71)【出願人】
【識別番号】515116777
【氏名又は名称】農事組合法人ドリームマッシュ
(74)【代理人】
【識別番号】100080160
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 憲一郎
(72)【発明者】
【氏名】清水 邦義
(72)【発明者】
【氏名】広松 謙伸
【テーマコード(参考)】
4B018
4C086
4C088
4C206
【Fターム(参考)】
4B018MD07
4B018MD14
4B018MD82
4B018ME03
4B018MF01
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA11
4C086DA12
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA52
4C086NA14
4C086ZC20
4C086ZC35
4C088AA02
4C088AC17
4C088BA10
4C088BA31
4C088CA06
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZC20
4C088ZC35
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA07
4C206DB07
4C206DB31
4C206DB43
4C206DB48
4C206MA03
4C206MA04
4C206NA14
4C206ZC20
4C206ZC35
(57)【要約】
本発明では、新たな機能性を有する、ヌメリスギタケ由来の食品組成物等を提供することを目的とする。
本発明の解決手段は、ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。本発明によれば、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する、ヌメリスギタケ由来の食品組成物等を提供することが可能になる。なお、本発明の食品組成物等は、本願の発明者らが発見したヌメリスギタケの新たな属性に基づいて、新規の用途を提供するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【請求項2】
前記有効成分は、ヌメリスギタケのメタノール抽出物である、請求項1記載のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【請求項3】
前記有効成分は、ヌメリスギタケの菌糸体由来成分である、請求項1又は2記載のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【請求項4】
前記有効成分は、構造式が(1)式で表されるエルゴステロール、(2)式で表されるエルゴステロールペルオキシド、(3)式で表されるジ−2−エチルへキシルフタレート(Di-(2-ethylhexyl)phthalate)、(4)式で表される5α、14β―エルゴスタ−7,22−ジエン−3−オン−11―アセテート(5α, 14β-Ergosta-7, 22-dien-3-one, 11-acetate)、(5)式で表される5α―エルゴスタ−7,22−ジエン−3β、11α―ジオールジアセテート(5α-Ergosta-7, 22-diene-3β, 11α-diol, diacetate)、(6)式で表されるトリリノレイン又は(7)式で表される4−ヒドロキシ−2−ウンデセン酸(4-Hydroxy-2-Undecenoic acid)である、請求項1から3のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【化1】
【請求項5】
構造式が(6)式で表されるトリリノレインを有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【化2】
【請求項6】
構造式が(1)式で表されるエルゴステロール、(2)式で表されるエルゴステロールペルオキシド、(3)式で表されるジ−2−エチルへキシルフタレート(Di-(2-ethylhexyl)phthalate)、(4)式で表される5α、14β−エルゴスタ−7,22−ジエン−3−オン−11−アセテート(5α,14β-Ergosta-7,22-dien-3-one,11-acetate)、(5)式で表される5α−エルゴスタ−7,22−ジエン−3β、11α−ジオールジアセテート(5α-Ergosta-7,22-diene-3β, 11α-diol, diacetate)又は(7)式で表される4−ヒドロキシ−2−ウンデセン酸(4-Hydroxy-2-Undecenoic acid)を有効成分としてさらに含有する、請求項5記載のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物。
【化3】
【請求項7】
ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項8】
ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とする糖分解酵素活性阻害用食品組成物。
【請求項9】
ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とする糖分解酵素活性阻害剤。
【請求項10】
ヌメリスギタケから有効成分を抽出する抽出ステップを含む、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項11】
前記抽出ステップにおいて、溶媒としてメタノールを用いる、請求項10記載のα−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法。
【請求項12】
トリアコンチル基が化学結合したシリカ系逆相カラムに、ヌメリスギタケ由来の試料を注入するステップを含む、α−グルコシダーゼ阻害活性の有効成分の定量分析方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物、α−グルコシダーゼ阻害剤、糖分解酵素活性阻害用食品組成物、糖分解酵素活性阻害剤、及び、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病は、血液中のグルコース濃度が正常より高い状態、つまり、高血糖状態になる病気である。正常であれば、食事の後に血糖値が上昇しても、インスリンの作用により、血糖値は低下する。しかし、糖尿病では、インスリン分泌量の低下やインスリン感受性の低下により、食事により上昇した血糖値を下げることができなくなる。
【0003】
これまで、食物繊維による血糖値上昇抑制効果については多く報告されており、その効果の発現が、食物繊維の種類や量によって異なることが示唆されている。また、水溶性食物繊維において、血糖値上昇抑制効果が強く見られることが報告されている。食物繊維は人間が有する消化酵素では消化できない。そのため、食べ物が消化器系を通過する時間を短くし、排便量を多くし、吸収量を減らすことが知られている。
【0004】
キノコは子実体に水溶性および不溶性食物繊維を多く有しているため、血糖値の上昇抑制が期待されている。食物繊維は糖質代謝における重要な役割があり、先行研究により、糖質代謝疾患の一つである糖尿病の発生と、食物繊維の摂取量との関連性が示されている(非特許文献1)。
【0005】
ヌメリスギタケ(学名:Pholiota adiposa (Fr.) kummer)は、モエギタケ科スギタケ属に属する食用キノコの1種である。このヌメリスギタケ種の新品種として、図1に示す福岡O−Nが2003年に品種登録されている。福岡O−Nは、天然物では春と秋しか採れない珍しさと、その美味しさから幻のキノコと言われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Trowell H. Dietary fibre, ischaemic heart disease and diabetes mellitus. Proceedings of the Nutrition Society. 32:151-157.1973.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、食用キノコの食物繊維による血糖値上昇抑制効果が多く報告されている一方で、ヌメリスギタケの生理活性については未解明な部分が多い。
【0008】
そこで、本発明では、新たな機能性を有する、ヌメリスギタケ由来の食品組成物等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の第1の観点は、ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0010】
本発明の第2の観点は、第1の観点のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物であって、前記有効成分は、ヌメリスギタケのメタノール抽出物である、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0011】
本発明の第3の観点は、第1又は第2の観点のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物であって、前記有効成分は、ヌメリスギタケの菌糸体由来成分である、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0012】
本発明の第4の観点は、第1から第3のいずれかの観点のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物であって、前記有効成分は、構造式が(1)式で表されるエルゴステロール、(2)式で表されるエルゴステロールペルオキシド、(3)式で表されるジ−2−エチルへキシルフタレート(Di-(2-ethylhexyl)phthalate)、(4)式で表される5α、14β−エルゴスタ−7,22−ジエン−3−オン−11−アセテート(5α, 14β-Ergosta-7, 22-dien-3-one, 11-acetate)、(5)式で表される5α−エルゴスタ−7,22−ジエン−3β、11α−ジオールジアセテート(5α-Ergosta-7, 22-diene-3β, 11α-diol, diacetate)又は(6)式で表されるトリリノレイン(1,2,3-Tri(cis,cis-9,12-octadecadienoyl) Glycerol、2,3-Bis[[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoyl]oxy]propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)である、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0013】
本発明の第5の観点は、構造式が(6)式で表されるトリリノレインを有効成分として含有するα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0014】
本発明の第6の観点は、第5の観点のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物であって、構造式が(1)式で表されるエルゴステロール、(2)式で表されるエルゴステロールペルオキシド、(3)式で表されるジ−2−エチルへキシルフタレート(Di-(2-ethylhexyl)phthalate)、(4)式で表される5α、14β―エルゴスタ−7,22−ジエン−3−オン−11―アセテート(5α,14β-Ergosta-7,22-dien-3-one,11-acetate)又は(5)式で表される5α―エルゴスタ−7,22−ジエン−3β、11α―ジオールジアセテート(5α-Ergosta-7,22-diene-3β, 11α-diol, diacetate)を有効成分としてさらに含有する、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物である。
【0015】
本発明の第7の観点は、ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とするα−グルコシダーゼ阻害剤である。
【0016】
本発明の第8の観点は、ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とする糖分解酵素活性阻害用食品組成物である。
【0017】
本発明の第9の観点は、ヌメリスギタケ由来成分を有効成分とする糖分解酵素活性阻害剤である。
【0018】
本発明の第10の観点は、ヌメリスギタケから有効成分を抽出する抽出ステップを含む、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法である。
【0019】
本発明の第11の観点は、第10の観点のα−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法であって、前記抽出ステップにおいて、溶媒としてメタノールを用いる、α−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法である。
【0020】
本発明の第12の観点は、トリアコンチル基が化学結合したシリカ系逆相カラムに、ヌメリスギタケ由来の試料を注入するステップを含む、α−グルコシダーゼ阻害活性の有効成分の定量分析方法である。
【0021】
本発明の第13の観点は、α−グルコシダーゼ阻害用又は糖分解酵素活性阻害用の機能性食品である。
【0022】
本発明の第14の観点は、第1から第11の観点のα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物、α−グルコシダーゼ阻害剤、糖分解酵素活性阻害用食品組成物、糖分解酵素活性阻害剤又はα−グルコシダーゼ阻害剤の製造方法を用いた、α−グルコシダーゼ阻害又は糖分解酵素活性阻害による、健康増進方法である。
【0023】
【化1】
【発明の効果】
【0024】
本発明の各観点によれば、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する、ヌメリスギタケ由来の食品組成物等を提供することが可能になる。
【0025】
なお、本願発明者らは、図13(c)及び図14(c)に示される通り、ヌメリスギタケが一般的なキノコの特徴である食物繊維が豊富で吸収されにくいという消極的な属性だけでなく、α−グルコシダーゼ阻害活性という積極的な属性をも有することを見出した。また、図12に示される通り、他のキノコと比較して、ヌメリスギタケ由来成分が非常に強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有することは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。本発明の食品組成物等は、本願発明者らが発見したヌメリスギタケの新たな属性に基づいて、新規の用途を提供するものである。
【0026】
特に、ヌメリスギタケのメタノール抽出物において強いα−グルコシダーゼ阻害活性がみられた。なお、ヌメリスギタケのような天然物の抽出物には、多種多様な化学物質が含まれている。そのため、本発明における優れたα−グルコシダーゼ阻害活性に寄与する成分は、本願の出願時において図10に示す一部の成分を特定することが出来たが、全成分は特定されておらず、また、更なる特定のためには多くの時間を要する見込みである。
【0027】
本発明の第2又は第11の観点によれば、ヌメリスギタケからα−グルコシダーゼ阻害の有効成分を抽出することが容易になる。
【0028】
本発明の第3の観点によれば、子実体を育てる時間をかけることなく、同等以上の有効性を期待できるα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物を提供することが可能になる。
【0029】
本発明の第4から第6の観点によれば、高い阻害率を有するα−グルコシダーゼ阻害用食品組成物を提供することが可能になる。
【0030】
本発明の第12の観点によれば、ヌメリスギタケに含まれる有効成分である化合物(6)の定量分析が容易になる。
【図面の簡単な説明】
【0031】
図1】ヌメリスギタケの抽出物の抽出及び分画の手順を示す図である。
図2】80%メタノール水溶液画分、ヘキサン抽出物、ヘキサン可溶部のα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図3】酢酸エチル可溶部のα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図4】水層残渣(Pass画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図5】水層残渣(100%水画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図6】水層残渣(20%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図7】水層残渣(50%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図8】水層残渣(100%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図9】水層残渣(アセトン画分)の分取HPLCクロマトグラムとα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す図である。
図10】ヌメリスギタケから単離された化合物の構造式を示す図である。
図11】表5の条件におけるヌメリスギタケ抽出物のクロマトグラフである。
図12】8種のキノコのα−グルコシダーゼ阻害率を示す図である。
図13】ヌメリスギタケを摂取によるヒトの血糖値の経時変化を示す図である。
図14】血糖値上昇曲線下面積値(AUC)を示す図である。
図15】ヌメリスギタケの菌糸体のα−グルコシダーゼ阻害率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、図面を参照して、本発明の実施例について述べる。なお。本発明の実施の形態は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0033】
抗糖尿病薬として、α−グルコシダーゼ阻害活性を有する血糖値上昇抑制剤が知られている。通常の消化において、炭水化物は分解されて、単糖として小腸から吸収される。小腸膜に結合しているα−グルコシダーゼは、二糖やオリゴ糖を、小腸で吸収しやすい単糖に分解する酵素である。このα−グルコシダーゼの働きを阻害することで、炭水化物の消化速度を低下させ、血糖値の上昇を抑制することができる。以下、ヌメリスギタケの抽出物が有するα−グルコシダーゼ阻害活性について検討した内容について述べる。
【0034】
1.1 抽出方法
まず、乾燥ヌメリスギタケ粉末5kgにメタノールを25mL加え抽出を行い、メタノール抽出物259gを得た。
【0035】
1.2 抽出物の分画手順
図1は、ヌメリスギタケの抽出物の抽出及び分画の手順を示す図である。得られたメタノール抽出物を80%メタノール水溶液(300mL)に溶解させ、可溶部と不溶部に分けた。次に、80%メタノール水溶液不溶部は、ヘキサンで洗浄し、ヘキサン可溶部とヘキサン不溶部に分けた。続いて、80%メタノール水溶液可溶部にヘキサン(300mL×2)を加え、液−液分配により極性成分および非極性成分の抽出を行い、主に極性成分が含まれる80%メタノール水溶液画分と、主に非極性成分が含まれるヘキサン抽出物に分けた。80%メタノール水溶液画分を回収後、メタノールを留去した。その後、超純水150 mLを加えて定容後、酢酸エチル(150mL×2)を加えて抽出を行い、酢酸エチル可溶部(7.3g)および水層残渣を得た。水層残渣は、さらに分画を行い、Pass画分、100%水画分、20%メタノール画分、50%メタノール画分、100%メタノール画分及びアセトン画分を得た。
【0036】
さらに、酢酸エチル可溶部については、次の手順に従って下記表1に示す溶媒を用いたシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーにより、Fr.1からFr.25に分画した。はじめにn-ヘキサンと酢酸エチル(90:10)を用いてFr.1を得た。Fr.2およびFr.3は、n-ヘキサンと酢酸エチル(80:20)を用いた。Fr.4は、n-ヘキサンと酢酸エチル(75:25)を用いた。Fr.5は、n-ヘキサンと酢酸エチル(70:30)を用いた。Fr.6は、n-ヘキサンと酢酸エチル(60:40)を用いた。Fr.7およびFr.8は、n-ヘキサンと酢酸エチル(50:50)を用いた。Fr.9は、n-ヘキサンと酢酸エチル(40:60)を用いた。Fr.10は、n-ヘキサンと酢酸エチル(30:70)を用いた。Fr.11およびFr.12は、n-ヘキサンと酢酸エチル(20:80)を用いた。Fr.13は、n-ヘキサンと酢酸エチル(10:90)を用いた。Fr.14からは溶媒条件を、酢酸エチルとメタノールに変更し、分画を行なった。Fr.14は酢酸エチルとメタノール(100:0)を用いた。Fr.15は酢酸エチルとメタノール(90:10)を用いた。Fr.16は酢酸エチルとメタノール(80:20)を用いた。Fr.17およびFr.18は酢酸エチルとメタノール(70:30)を用いた。Fr.19およびFr.20は酢酸エチルとメタノール(60:40)を用いた。Fr.21は酢酸エチルとメタノール(50:50)を用いた。Fr.22は酢酸エチルとメタノール(40:60)を用いた。Fr.23は酢酸エチルとメタノール(30:70)を用いた。Fr.24およびFr.25は酢酸エチルとメタノール(20:80)を用いた。分画には、全量が5Lの溶媒を分画に供した。
【0037】
【表1】
【0038】
また、Pass画分、100%水画分、20%メタノール画分、50%メタノール画分、100%メタノール画分及びアセトン画分については、下記表2の条件の分取クロマトグラフィーにより、それぞれ複数の画分(Fr.)に分画した。
【0039】
【表2】
【0040】
1.3 α−グルコシダーゼ阻害活性試験の手順
上記1.2で分画した各画分について、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を次の手順で行った。まず、反応チューブに酵素、スクロースおよび試料を各100μLずつ混合した(合計300μL)。その後、ボルテックスにより撹拌後、菌培養インキュベーター内のシェイカー上にセットし、37℃で30分間、撹拌・反応させた。ブロックインキュベーターを100℃にセットし、反応チューブを10分間加熱し、加熱後、室温に戻るまで空冷を行なった。その後、 反応チューブを遠心分離(4℃、15分、1500rpm)し、上清中のグルコース濃度をバイオセンサにより測定した。ポジティブコントロールには臨床薬であるデオキシジノリマイシン(DNJ)を用いた。
【0041】
1.4 バイオセンサを用いたグルコース測定
グルコース濃度の測定は次の手順で行った。バイオセンサの移動相には、リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(15g)、塩化カリウム(3.7g)および超純水(500mL)を混合したものを用い、水酸化ナトリウムでpH調整を行った。その後、アジ化ナトリウムを用いてpH7に調整後、超純水を加えて1000mLに定容した。グルコースの標準溶液は移動相を用いて、1.25g/L、2.5g/L、5.0g/Lのグルコース溶液を調整した。そして、コントロールおよび試料を測定後、結果の平均値から、α−グルコシダーゼ阻害活性の算出を行った。
【0042】
2.1 α−グルコシダーゼ阻害活性試験結果
はじめに、乾燥ヌメリスギタケより抽出したメタノール抽出物200μg/mLの阻害活性試験を行ったところ、阻害率は93.8%であり、非常に高い阻害活性を有することが明らかになった。
【0043】
次に、ヘキサン不溶部400μg/mLの阻害活性試験を行ったところ、阻害率は20.0%であった。なお、NMR及びGC-MS解析により、ヘキサン不溶部の主成分はトレハロースであることが判明した。
【0044】
次に、80%メタノール水溶液画分、ヘキサン抽出物、ヘキサン可溶部のα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を図2に示す。臨床薬であるDNJでは最終濃度300 μg/mLで、80%程度の阻害率が得られた。80%メタノール水溶液画分(最終濃度50 μg/mL)、ヘキサン抽出物(最終濃度25 μg/mL、50 μg/mL)は、DNJよりも低濃度において、DNJより強い阻害活性が見られた。
【0045】
次に、酢酸エチル可溶部のα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を図3に示す。酢酸エチル可溶部では、Fr. 2、Fr. 3、Fr. 4、Fr. 5、Fr. 7、Fr. 8、Fr. 9、Fr. 10、Fr. 11、Fr. 12(最終濃度50 μg/mL)、Fr. 6、Fr. 13(最終濃度25 μg/mL、50 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0046】
また、Fr. 14、Fr. 15、Fr. 16、Fr. 17、Fr. 18、Fr. 20、Fr. 21、Fr. 23、Fr. 24、Fr. 25(最終濃度50 μg/mL)、Fr. 19、Fr. 22(最終濃度25 μg/mL、50 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0047】
次に、図4(a)に水層残渣(Pass画分)の分取HPLCクロマトグラム、図4(b)にα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、9〜14分の間にピークが検出された。そこで、各分画物について、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を行なったが、水層残渣(Pass画分)には阻害活性は見られなかった。
【0048】
次に、図5(a)に水層残渣(100%水画分)の分取HPLCクロマトグラム、図5(b)にα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、9〜14分の間にピークが検出された。そこで、各分画物について、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を行なったところ、水層残渣(100%水画分)のFr. 3(最終濃度25 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。この活性成分はUV吸収を持たない化合物であると推察される。
【0049】
次に、図6(a)に水層残渣(20%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラム、図6(b)にα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、9〜16分の間にピークが検出された。そこで、各分画物について、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を行なったところ、水層残渣(20%メタノール画分)のFr. 1、Fr. 4、Fr. 5、Fr. 6、Fr. 7(最終濃度25 μg/mL)、Fr. 2、Fr. 3(最終濃度5μg/mL、25μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0050】
次に、図7(a)に水層残渣(50%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラム、図7(b)にα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、7〜30分の間にピークが検出された。そこで、各分画物について、α−グルコシダーゼ阻害活性試験を行なったところ、水層残渣(50%メタノール画分)のFr. 1、Fr. 2(最終濃度5 μg/mL、25 μg/mL)、Fr. 3、Fr. 4、Fr. 5、Fr. 6、Fr. 7、Fr. 8、Fr. 9、Fr. 10(最終濃度25 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0051】
次に、図8(a)に水層残渣(100%メタノール画分)の分取HPLCクロマトグラム、α−グルコシダーゼ阻害活性試験結果図8(b)にを示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、7〜50分の間にいくつかのピークが検出された。そこで、水層残渣(100%メタノール画分)のFr. 1(最終濃度5 μg/mL、25 μg/mL)、Fr. 2、Fr. 3、Fr. 9、Fr. 10(最終濃度25 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0052】
最後に、図9(a)に水層残渣(アセトン画分)の分取HPLCクロマトグラム、図9(b)にα−グルコシダーゼ阻害活性試験結果を示す。分取HPLCの検出波長(254 nm)において、6〜70分の間にいくつかのピークが検出された。そこで、水層残渣(アセトン画分)のFr. 1、 Fr. 2、Fr. 9、Fr. 10(最終濃度50 μg/mL)は、DNJより低濃度において、DNJと同等または、より強い阻害活性が見られた。
【0053】
さらに、水層残渣(アセトン画分)からシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返すことにより、構造式が図10の(1)式で表されるエルゴステロール、及び、(2)式で表されるエルゴステロールペルオキシドを単離した。
【0054】
また、水層残渣(100%メタノール画分)から、構造式が図10の(3)式で表されるジ−2−エチルへキシルフタレート(Di-(2-ethylhexyl)phthalate)、(4)式で表される5α、14β−エルゴスタ−7,22−ジエン−3−オン−11−アセテート(5α,14β-Ergosta-7,22-dien-3-one, 11-acetate)、(5)式で表される5α−エルゴスタ−7,22−ジエン−3β、11α−ジオールジアセテート(5α-Ergosta-7,22-diene-3β,11α-diol, diacetate)、(6)式で表されるトリリノレイン(1,2,3-Tri(cis,cis-9,12-octadecadienoyl) Glycerol、2,3-Bis[[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoyl]oxy]propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate、以下「化合物(6)」とも表記)を単離した。
【0055】
下記の表3は、上記の単離化合物の25μg/mL及び50μg/mLにおけるα−グルコシダーゼ阻害率を示す表である。(3)式で表されるDi-(2-ethylhexyl)phthalateと(6)式で表されるトリリノレインが特に高い阻害活性を示した。
【0056】
【表3】
【0057】
また、水層残渣(100%メタノール画分及びアセトン画分)から、構造式が図10の(7)式で表される4−ヒドロキシ−2−ウンデセン酸(4-Hydroxy-2-Undecenoic acid、以下「化合物(7)」と表記)を単離した。
【0058】
下記の表4は、α−グルコシダーゼ活性の50%阻害濃度(IC50)を示す表である。化合物(6)と化合物(7)が特に高いα−グルコシダーゼ阻害活性を有することが明らかになった。
【0059】
【表4】
【0060】
上述の通り、ヌメリスギタケには、臨床薬であるDNJよりも強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有する成分が含有されていることが明らかになった。したがって、ヌメリスギタケ又はその抽出物を含む食品組成物を摂取することにより、血糖値の上昇抑制が期待できる。
【0061】
続いて、下記の表5の条件において、ヌメリスギタケ抽出物のクロマトグラフィーを行った。下記のYMC(登録商標)カラムは、トリアコンチル基が化学結合したシリカ系逆相カラムであり、YMC社から購入したものである。
【0062】
【表5】
【0063】
上記条件で得られたクロマトグラフを図11に示す。図11の(a)はヌメリスギタケから単離した化合物(6)、(b)はヌメリスギタケのヘキサン抽出物、(c)はヘキサン抽出物と化合物(6)の混合物の溶液をそれぞれ上記カラムに充填し、溶出した溶離液を蒸発光散乱検出(ELSD)で測定して得られたクロマトグラフである。図11中の矢印の位置には、(a)と(c)ではピークがあるが、化合物(6)が含まれていない(b)ではピークが見られなかった。よって、表5の条件を用いれば、ヌメリスギタケ抽出物から化合物(6)を単離するためにクロマトグラフィーを何度も繰り返すことなく、化合物(6)の定量分析を行うことが可能になる。
【0064】
なお、ヌメリスギタケから有効成分を抽出して食品組成物を製造する場合の抽出溶媒としては、メタノールの他に、エタノール、ヘキサン、イソプロパノール、アセトン等の溶媒を用いても良い。
【0065】
図12は、8種のキノコのα−グルコシダーゼ阻害率を示す図であり、左から順に、比較対照として用いた1−デオキシノジリマイシン(以下、「DNJ」という。)、ヌメリスギタケ、ぶなしめじ、ひらたけ、ゆきれいたけ、しいたけ、スギタケ、まいたけ、エリンギのα−グルコシダーゼ阻害率を示している。DNJの試料濃度は300μg/mLであり、キノコの試料濃度は50μg/mLである。ヌメリスギタケは、他のキノコに比べ極めて強いα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、そのうえ、α−グルコシダーゼ阻害剤として用いられているDNJよりも強いα−グルコシダーゼ阻害活性を示すことが明らかになった。
【0066】
また、一般に経口血糖降下薬として用いられているアルカボースのα−グルコシダーゼ阻害濃度(IC50)は、406μg/mLである。これに対し、ヌメリスギタケのIC50は、41μg/mLであり、ヌメリスギタケのα−グルコシダーゼ阻害活性は、アルカボースの9.9倍と非常に強いことが明らかになった。
【0067】
なお、現在までにヌメリスギタケについての研究例は少なく、ヌメリスギタケ由来成分が非常に強いα−グルコシダーゼ阻害活性を有することは、本発明の発明者らによって初めて明らかにされたことである。
【0068】
図13は、ヌメリスギタケを摂取によるヒトの血糖値の経時変化を示す図である。図13(a)及び(b)は、被験者に試験品又はプラセボ品を米飯と共に摂取させた場合の血糖値上昇曲線であり、(a)は、生鮮25g相当のヌメリスギタケの乾燥粉末1.85gを用いた場合、(b)は、生鮮50g相当のヌメリスギタケの乾燥粉末3.7gを用いた場合を示している。図13(c)は、生鮮50gのヌメリスギタケ又はエリンギを加熱し、お吸い物として摂取させた場合の血糖値上昇曲線である。なお、被験者数は、ヌメリスギタケ14名、エリンギ14名である。また、血糖値の測定は、被験者の指先から採血し、食前、30分後、60分後、120分後に行った。
【0069】
図14は、図13の各血糖値上昇曲線に対応する血糖値上昇曲線下面積値(AUC)を示す図である。
【0070】
図13及び図14に示される通り、ヌメリスギタケが、食後血糖値の上昇を有意に抑制することが明らかになった。また、食後血糖値の上昇を抑制力は、エリンギよりもヌメリスギタケが高いことが明らかになった。一般にキノコに多く含まれる食物繊維が食後血糖値に影響していると考えられるが、食物繊維の含有比率は、ヌメリスギタケ乾燥物が38%、エリンギ乾燥物が37.8%と同程度である。そのため、ヌメリスギタケによる食後血糖値の上昇抑制には、食物繊維だけでなく、ヌメリスギタケ特有の有効成分が関与していると思われる。
【0071】
図15は、ヌメリスギタケの菌糸体のα−グルコシダーゼ阻害率を示す図である。図15に示される通り、ヌメリスギタケの菌糸体も、高いα−グルコシダーゼ阻害活性を示すことが明らかになった。つまり、α−グルコシダーゼ阻害活性の有効成分は、ヌメリスギタケの子実体だけでなく、菌糸体にも含まれていると考えられる。また、ヌメリスギタケ菌糸体のα−グルコシダーゼ阻害活性は、α−グルコシダーゼ阻害剤として用いられているDNJよりも高い阻害活性を示した。
【0072】
菌糸体は、栽培期間を要する子実体に比べて、培養により短期間で得られる。したがって、ヌメリスギタケの菌糸体を用いれば、α−グルコシダーゼ阻害用食品組成物をより容易に提供することが可能になる。

図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
図9
図10
図11
図12
図13
図14
図15
【国際調査報告】