再表 2020-96050 ジメトキシベンゼン化合物の類縁物質、該化合物の分析方法及び標準品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

【公報種別】再公表特許(A1)

(11)【国際公開番号】WO/0

(43)【国際公開日】2020年5月14日

【発行日】2021年10月7日

(54)【発明の名称】ジメトキシベンゼン化合物の類縁物質、該化合物の分析方法及び標準品

(51)【国際特許分類】

   C07D 487/04 20060101AFI20210910BHJP

   C07D 519/00 20060101ALI20210910BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210910BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210910BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20210910BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20210910BHJP

【ＦＩ】

   C07D487/04 143

   C07D519/00 311

   A61K31/519

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   G01N30/88 C

   G01N30/26 A

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】80

【出願番号】特願2020-555638(P2020-555638)

(21)【国際出願番号】PCT/0/0

(22)【国際出願日】2019年11月8日

(31)【優先権主張番号】PCT/JP2018/041744

(32)【優先日】2018年11月9日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2019-44236(P2019-44236)

(32)【優先日】2019年3月11日

(33)【優先権主張国】JP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】000207827

【氏名又は名称】大鵬薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金本 雄次

(72)【発明者】

【氏名】太田 玲奈

(72)【発明者】

【氏名】橋本 雅也

(72)【発明者】

【氏名】神田 康平

【テーマコード（参考）】

4C050

4C072

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C050AA01

4C050BB05

4C050CC08

4C050EE04

4C050FF02

4C050GG04

4C050HH04

4C072MM02

4C072UU01

4C086AA01

4C086AA10

4C086CB06

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC42

(57)【要約】

下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。（１）１，３−ビス（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパン−１−オン、（２）１−（（Ｓ）−３−（４−（（３−（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−オキソプロピル）アミノ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパ−２−エン−１−オン、（３）（Ｓ）−３−（（１−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−６−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパン酸、（４）（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルバルデヒド、（５）（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−ヒドロキシプロパン−１−オン

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【化1】

【請求項2】

前記式（１）又は（２）で表される、請求項１に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【請求項3】

（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの品質を管理するための標準品として使用される化合物であって、下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【化2】

【請求項4】

前記式（１）又は（２）で表される、請求項３に記載の化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【請求項5】

高速液体クロマトグラフィーによる測定において、下記式（１）で表される化合物、下記式（２）で表される化合物、及び（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンからなる群の化合物の相互の分離度が１．５以上である、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。

【化3】

【請求項6】

高速液体クロマトグラフィーによる測定において、下記式（１）で表される化合物、下記式（２）で表される化合物、下記式（３）で表される化合物、下記式（４）で表される化合物、下記式（５）で表される化合物、及び（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンからなる群の化合物の相互の分離度が１．５以上である、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。

【化4】

【請求項7】

リン酸塩を用いてｐＨを６．４以上６．８以下に調整した緩衝溶液を移動相に含む、請求項５又は６に記載の分析方法。

【請求項8】

移動相が有機相と水相との混液であり、移動相中の有機相の割合を一定の増加割合で経時的に上昇させる第１のグラジエント、第２のグラジエント及び第３のグラジエントを含む、請求項５から７のいずれか１項に記載の分析方法。

【請求項9】

第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜２．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜５分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から５〜１５分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１５質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の５〜１５質量％であり、 第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、 第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％である、請求項５から８のいずれか１項に記載の分析方法。

【請求項10】

オクタデシル基で置換されたシリカゲルカラムを用いる、請求項５から９のいずれか１項に記載の分析方法。

【請求項11】

水相総量に対して１５〜４０容量％のアセトニトリルを含む水相を用いる、請求項５から１０のいずれか１項に記載の分析方法。

【請求項12】

移動相クリーナーを用いる、請求項５から１１のいずれか１項に記載の分析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年１１月９日に国際出願された、国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０４１７４４明細書及び２０１９年３月１１日に出願された、日本国特許出願第２０１９−０４４２３６号 明細書（これらの開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。本発明は、ジメトキシベンゼン化合物の類縁物質、該化合物の分析方法及び標準品に関する。

【背景技術】

【0002】

恒常的に品質が適切に担保された医薬品を供給するためには、有効成分が医薬品中に適切に含まれているか、また含まれている不純物が一定量以下に管理さているかどうかを確認する必要がある。なかでも、医薬品中の不純物の管理は、医薬品の品質担保だけではなく、患者の安全性確保の観点からも非常に重要である。そのため，医薬品に含まれる類縁物質（不純物）の量を適切に評価できる分析法は、品質管理において他の分析法の設定よりも優先して設定されるものの一つである。

【0003】

優れた線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下「ＦＧＦＲ」とも言う）の阻害作用を有し、抗腫瘍活性を示す化合物として（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オン（以下、本明細書において「化合物Ａ」とも言う）が報告されている（特許文献１〜５）。化合物Ａの合成方法として、（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン（以下、本明細書において「化合物Ｂ」とも言う）及び塩化アクリロイルを使用した方法、及びＷａｔｅｒｓ社製「ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ」を使用して化合物Ａ等を分析した方法が開示されている（特許文献４）。また、種々の溶媒を用いることで化合物Ａを結晶として取得できること、及びこれらの結晶を溶解させてアジレントテクノロジー社「１２００シリーズ バイナリＬＣシステム」及び、Ｗａｔｅｒｓ社製「ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ」を使用して分析した方法も報告されている（特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１３／１０８８０９パンフレット

【特許文献2】国際公開ＷＯ２０１５／００８８４４パンフレット

【特許文献3】国際公開ＷＯ２０１５／００８８３９パンフレット

【特許文献4】国際公開ＷＯ２０１６／１５９３２７パンフレット

【特許文献5】国際公開ＷＯ２０１７／１５０７２５パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の課題の一つは、大量合成が可能であり、簡便で優れた操作性を有し、かつ、医薬品として要求される品質を満たす化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩の製造方法を提供することにある。

【0006】

また、当該製造方法によっても、生成回避が困難な類縁物質が存在し、医薬品として要求される品質を保持するための品質管理は必要である。よって、本発明の課題の一つは、医薬品として要求される品質を満たすかどうか判断するための品質管理に用いるこれらの類縁物質の標準品を提供することにある。

【0007】

さらに、本発明の課題の一つは、当該品質管理に用いるために、原薬及び製剤におけるこれらの類縁物質の含有量を適切に検出できる分析方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

そこで、さらに発明者は鋭意検討した結果、医薬品としての品質に適した大量製造可能な化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩の製造方法を見いだした。また、化合物Ａの品質を確認するための標準品として使用できる化合物Ａの類縁物質を見いだした。さらに、化合物Ａの品質を管理することができる高速液体クロマトグラフィーによる分析方法を見いだした。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１２］を包含する。

【0010】

［１］下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【0011】

【化1】

【0012】

［２］前記式（１）又は（２）で表される、［１］に記載の化合物若しくはその塩、又
はそれらの組み合わせ。

【0013】

［３］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの品質を管理するための標準品として使用される化合物であって、下記式（１）〜（５）のいずれか１つで表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【0014】

【化2】

【0015】

［４］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの品質を管理するための標準品として使用される化合物であって、下記式（１）又は（２）で表される化合物若しくはその塩、又はそれらの組み合わせ。

【0016】

【化3】

【0017】

［５］高速液体クロマトグラフィーによる測定において、下記式（１）で表される化合物、下記式（２）で表される化合物、及び（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンからなる群の化合物の相互の分離度が１．５以上である、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。

【0018】

【化4】

【0019】

［６］高速液体クロマトグラフィーによる測定において、下記式（１）で表される化合物、下記式（２）で表される化合物、下記式（３）で表される化合物、下記式（４）で表される化合物、下記式（５）で表される化合物、及び（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンからなる群の化合物の相互の分離度が１．５以上である、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの高速液体クロマトグラフィーによる分析方法。

【0020】

【化5】

【0021】

［７］リン酸塩を用いてｐＨを６．４以上６．８以下に調整した緩衝溶液を移動相に含む、［５］又は［６］に記載の分析方法。

【0022】

［８］移動相が有機相と水相との混液であり、移動相中の有機相の割合を一定の増加割合で経時的に上昇させる第１のグラジエント、第２のグラジエント及び第３のグラジエントを含む、［５］から［７］のいずれか１項に記載の分析方法。

【0023】

［９］第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜２．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜５分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から５〜１５分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１５質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の５〜１５質量％であり、
第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、
第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％である、［５］から［８］のいずれか１項に記載の分析方法。

【0024】

［１０］オクタデシル基で置換されたシリカゲルカラムを用いる、［５］から［９］のいずれか１項に記載の分析方法。

【0025】

［１１］水相総量に対して１５〜４０容量％のアセトニトリルを含む水相を用いる、［５］から［１０］のいずれか１項に記載の分析方法。

【0026】

［１２］移動相クリーナーを用いる、［５］から［１１］のいずれか１項に記載の分析方法。

【発明の効果】

【0027】

本発明によれば、化合物Ａの類縁物質を標準品として用いることで、化合物Ａの品質の管理を確実に行うことができる。また、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩について、医薬品として要求される品質管理を効率よく実施できる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】実施例１におけるクロマトグラムを示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明において、化合物Ａは（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンであり、その構造を以下に示す。

【0030】

【化6】

【0031】

化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、本発明においては、いずれも「化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩」に包含される。化合物Ａの薬学的に許容される塩としては、特に限定するものではなく、例えば塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸との付加塩、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、エチルアミン塩、アルギニン塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。本明細書において、「化合物Ａ」との記載は、化合物Ａの薬学的に許容される「塩」及び「溶媒和物」を含めることを意図し得る。

【0032】

また、本発明において、化合物Ｂは（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミンである。化合物Ｂの構造を以下に示す。

【0033】

【化7】

【0034】

化合物Ｂ又はその塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、本発明においては、いずれも「化合物Ｂ又はその塩」に包含される。化合物Ｂの塩としては、特に限定するものではないが、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、又は硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、又はベンゼンスルホン酸等のアルキル硫酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸との付加塩、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、エチルアミン塩、アルギニン塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。本明細書において、「化合物Ｂ」との記載は、化合物Ｂの「塩」及び「溶媒和物」を含めることを意図し得る。

【0035】

本発明において、化合物Ａへ誘導する際に用いられる化合物Ｂは、フリー体でも塩でもよく、好ましくは、無機酸、アルキル硫酸又は有機酸の付加塩であり、より好ましくは、アルキル硫酸の付加塩であり、さらに好ましくは、メタンスルホン酸の付加塩である。

【0036】

【化8】

【0037】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩は、一般式（Ｃ）で表される化合物のＰ１（Ｐ１はアミノ基の保護基を示す）を脱保護することによって得られる。一般式（Ｃ）で表される化合物は、国際公開ＷＯ２０１３／１０８８０９パンフレットに記載の方法により得ることができる。

【0038】

なお、化合物Ｂのフリー体は、水、水溶性の高い有機溶媒、及び脂溶性の高い有機溶媒のいずれにも溶解しやすい性質がある。一方、化合物Ｂの酸付加塩又は塩基付加塩は、有機溶媒への溶解性が低く、単離及び精製がしやすい傾向がある。

【0039】

Ｐ１が示すアミノ基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）等の酸性条件下で脱保護できる保護基が例示される。保護基であるＰ１の脱保護の方法は、当業者が適宜選択できる。Ｐ１がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等の酸性条件下で脱保護できる保護基である場合、酸性条件下での脱保護が好ましく、塩酸、メタンスルホン酸、ヨウ化水素，トリフルオロ酢酸等の酸を選択することができる。反応条件、操作性、及び製造機器への負担等の観点から、メタンスルホン酸が好ましい。酸の使用量としては、一般式（Ｃ）で表される化合物１モルに対して、好ましくは１〜１００モルが挙げられる。

【0040】

例えば、Ｐ１がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基等の酸性条件下で脱保護できる保護基の場合、化合物Ｂを酸付加塩として得ることができ、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へ誘導することができる。

【0041】

本発明において、アクリロイル化試薬を用いて化合物Ｂ又はその塩から化合物Ａ又はその塩を製造する。本発明のアクリロイル化試薬の１つの態様として、下記一般式（Ｉ−１−Ａ）又は下記一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物を使用することができる。

【0042】

【化9】

【0043】

（式中、Ｌ１及びＬ２は、同一又は異なって、脱離基を示す。）

【0044】

一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物では、脱離基Ｌ２がカルボニルのβ位に結合している。一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物では、脱離基Ｌ２がカルボニルのα位に結合している。いずれも塩基性条件化でアクリロイル基へと誘導でき、ひいては、化合物Ａにおけるアクリルアミド構造を構築できる。

【0045】

脱離基であるＬ１としては、ハロゲン原子等が挙げられ、好ましくは塩素原子である。

【0046】

脱離基であるＬ２としては、ハロゲン原子、−ＯＳＯ２ＣｎＦｎ＋２（ｎは１〜４の整数を示す）、メシレート基（−ＯＭｓ；Ｍｓはメシル基を示す）、トシレート基（−ＯＴｓ；Ｔｓはｐ−トシル基を示す）、ノシレート基（−ＯＮｓ；Ｎｓはｐ−ノシル基を示す）、−ＯＳＯ２Ｐｈ基（Ｐｈはフェニル基を示す）、フェノキシ基（−ＯＰｈ）等が挙げられ、好ましくはハロゲン原子であり、より好ましくは、塩素原子である。

【0047】

なお、ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。

【0048】

一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物としては、３−クロロプロピオニルクロリド、３−ブロモプロピオニルクロリドが挙げられる。

【0049】

一般式（Ｉ−２−Ａ）としては、２−クロロプロピオニルクロリド、２−ブロモプロピオニルクロリドが挙げられる。

【0050】

本発明のアクリロイル化試薬の別の態様として、下記一般式（Ｉ−１−Ｂ）、下記一般式（Ｉ−１−Ｃ）、下記一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は下記一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物を使用することができる。下記一般式（Ｉ−１−Ｂ）、下記一般式（Ｉ−１−Ｃ）、下記一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は下記一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物は、酸無水物である。

【0051】

【化10】

【0052】

（式中、Ｌ２は同一又は異なって脱離基を示す。）

【0053】

Ｌ２としては、上記の脱離基が挙げられ、好ましくはハロゲン原子であり、より好ましくは塩素原子である。

【0054】

一般式（Ｉ−１−Ｂ）で表される化合物としては、３−クロロプロピオン酸無水物、３−ブロモプロピオン酸無水物、３−クロロプロピオン酸３−ブロモプロピオン酸無水物等が挙げられ、好ましくは３−クロロプロピオン酸無水物である。

【0055】

一般式（Ｉ−１−Ｃ）で表される化合物としては、アクリル酸３−クロロプロピオン酸無水物、アクリル酸３−ブロモプロピオン酸無水物等が挙げられ、好ましくはアクリル酸３−クロロプロピオン酸無水物である。

【0056】

一般式（Ｉ−２−Ｂ）で表される化合物としては、２−クロロプロピオン酸無水物、２−ブロモプロピオン酸無水物、２−クロロプロピオン酸２−ブロモプロピオン酸無水物等が挙げられ、好ましくは２−クロロプロピオン酸無水物である。

【0057】

一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物としては、アクリル酸２−クロロプロピオン酸無水物、アクリル酸２−ブロモプロピオン酸無水物等が挙げられ、好ましくはアクリル酸２−クロロプロピオン酸無水物である。

【0058】

本発明において、アクリロイル化試薬としては、上記一般式（Ｉ−１−Ａ）又は一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物が好ましく、より好ましくは一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物であり、さらに好ましくは、３−クロロプロピオニルクロリドである。

【0059】

本発明において、上記一般式（Ｉ−１−Ａ）、一般式（Ｉ−１−Ｂ）、一般式（Ｉ−１−Ｃ）、一般式（Ｉ−２−Ａ）、一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物であるアクリロイル化試薬は、化合物Ｂ又はその塩１モル当量に対して、１．０〜１．３モル当量であり、より好ましくは１．０５〜１．３モル当量であり、さらに好ましくは、１．１〜１．２モル当量であり、特に好ましくは、１．１当量である。また、水酸化物イオンを含む塩基を使用した際には、当該アクリロイル化試薬は、化合物Ｂ又はその塩１モル当量に対して、１．０モル当量以上用いることができる。好ましくは１．０〜３．０モル当量であり、より好ましくは１．１〜２．０モル当量であり、特に好ましくは１．１当量又は１．８当量である。本発明の方法においては、化合物Ｂ又はその塩１分子あたり、１個の基 −Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｌ^２を付加させることを意図している。従って、本明細書において、例えば、化合物Ｂ又はその塩１モル当量に対して一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物、一般式（Ｉ−１−Ｃ）で表される化合物又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物１．０モル当量使用するとは、化合物Ｂ又はその塩１モルに対し、これらのアクリロイル化試薬（１分子あたり基 −Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｌ^２を１個有するアクリロイル化試薬）を１．０モル用いることを意味する。また、例えば、化合物Ｂ又はその塩１モル当量に対して一般式（Ｉ−１−Ｂ）で表される化合物又は一般式（Ｉ−２−Ｂ）で表される化合物１．０モル当量使用するとは、化合物Ｂ又はその塩１モルに対し、これらのアクリロイル化試薬（１分子あたり基 −Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｌ^２を２個有するアクリロイル化試薬）を０．５モル用いることを意味する。また、これらのアクリロイル化試薬を組み合わせて用いる場合は、上記計算の組合せとなる。

【0060】

また、本明細書において、そうでないことが明らかでない限り、当量とは、モル当量を意味する。

【0061】

本発明において、アクリロイル化試薬として、上記一般式（Ｉ−１−Ａ）、一般式（Ｉ−１−Ｂ）、一般式（Ｉ−１−Ｃ）、一般式（Ｉ−２−Ａ）、一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物を使用することができる。そのため、一般式（Ｉ−１−Ａ）又は一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物を用いた場合、以下の２段階によって反応が進行し、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩を製造することができる。

【0062】

【化11】

【0063】

（式中、Ｌ１、Ｌ２は前記に同じ。）

【0064】

化合物Ｂ又はその塩から化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へと誘導される際に、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩が中間体として得られる。本発明においては、これらの中間体を単離せずに、中間体からＬ２を脱離させて化合物Ａに誘導することもできる。

【0065】

例えば、一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物として３−クロロプロピオニルクロリドを用いた場合、一般式（Ａ−１）で表される化合物は、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−クロロプロパン−１−オン（以下、「Ａ−１−３ＣＰ化合物」とも言う）となる。

【0066】

【化12】

【0067】

また、一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物として２−クロロプロピオニルクロリドを用いた場合、中間体としての一般式（Ａ−２）で表される化合物は、１−（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−クロロプロパン−１−オン（以下、「Ａ−１−２ＣＰ化合物」とも言う）となる。

【0068】

【化13】

【0069】

化合物Ｂ又はその塩、及び一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩は、化合物Ｂから化合物Ａを誘導する際に、反応が進行したかどうかを確認するために用いることができる。さらに、これらの化合物又はその塩は、不純物として化合物Ａの原薬及び／又は製剤に含まれうるため、不純物の存在を確認するために用いることもできる。

【0070】

化合物Ａを医薬品として用いる場合、不純物として医薬品の原薬及び／又は製剤に含まれうる化合物の量は、医薬品規制調和国際会議におけるガイドライン（ＩＣＨ−Ｑ３）に指針が示されている。

【0071】

化合物Ｂ又はその塩から化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩を誘導する際に、塩化アクリロイルを用いた場合、（Ｓ）−Ｎ−（１―（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４―ｄ］ピリミジン−４−イル）アクリルアミド（以下、「ジアミド化合物」ともいう）が、製造した化合物Ａ（化合物Ａの原薬）に含まれる場合がある。

【0072】

【化14】

【0073】

本発明者は、当該ジアミド化合物を除去又は生成を抑制するために、塩化アクリロイルの使用量を抑える方法を試みたところ、化合物Ｂが残存し収率の低下を伴うことが明らかとなった。また、ｐＨを調整してジアミドを分解させる方法を試みたところ、工程数が増加し、効率よく化合物Ａを大量製造することはできず、さらに化合物Ａも分解されて収率の低下を伴うことが明らかとなった。さらに、晶析条件を検討したが、ジアミド化合物を効率よく除去することは困難であった。そのため、塩化アクリロイルを使用する化合物Ａの製造方法は、上記の観点から医薬品としての品質を保持しつつ、大量製造することが困難であると考えられる。

【0074】

アクリロイル化試薬として上記一般式（Ｉ−１−Ａ）、一般式（Ｉ−１−Ｂ）、一般式（Ｉ−１−Ｃ）、一般式（Ｉ−２−Ａ）、一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物を使用して、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩へ誘導する際も、副生成物として以下のように、一般式（Ａ−１−ｄｉａｍｉｄｅ）又は一般式（Ａ−２−ｄｉａｍｉｄｅ）で表される化合物を経由してジアミド化合物へ誘導される可能性がある。

【0075】

【化15】

【0076】

（式中、Ｌ１、Ｌ２は前記に同じ。）

【0077】

ジアミド、一般式（Ａ−１−ｄｉａｍｉｄｅ）、又は一般式（Ａ−２−ｄｉａｍｉｄｅ）で表される化合物は、化合物Ａもしくは薬学的に許容される塩、一般式（Ａ−１）もしくはその塩、又は一般式（Ａ−１）もしくはその塩に含まれる不純物の存在を確認するために用いることができる。

【0078】

例えば、一般式（Ｉ−１−Ａ）、一般式（Ｉ−１−Ｂ）、一般式（Ｉ−１−Ｃ）、一般式（Ｉ−２−Ａ）、一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物おけるＬ１及びＬ２が塩素原子の場合、一般式（Ａ−１−ｄｉａｍｉｄｅ）は、（Ｓ）―３−クロロ−Ｎ−（１−（１−（３−クロロプロパノイル）ピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）プロパンアミド（以下、「３ＣＰジアミド」とも言う）である。

【0079】

【化16】

【0080】

また、一般式（Ｉ−１−Ａ）、一般式（Ｉ−１−Ｂ）、一般式（Ｉ−１−Ｃ）、一般式（Ｉ−２−Ａ）、一般式（Ｉ−２−Ｂ）、又は一般式（Ｉ−２−Ｃ）で表される化合物おけるＬ１及びＬ２が塩素原子の場合、一般式（Ａ−２−ｄｉａｍｉｄｅ）は、２−クロロ−Ｎ−（１−（（３Ｓ）−１−（２−クロロプロパノイル）ピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）プロパンアミド（以下、「２ＣＰジアミド」とも言う）である。

【0081】

【化17】

【0082】

本発明において、化合物Ｂから一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩を中間体として誘導する際に、塩基（例えば、少なくとも化合物Ｂと等量の塩基）の存在下で行うこともできる。さらに、これらの中間体から化合物Ａに誘導する際に、塩基（例えば、少なくとも中間体と等量の塩基）の存在下で行うことができる。また、両工程を塩基の存在下で行う場合、各工程の塩基はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。

【0083】

化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩へ誘導する際に用いられる塩基としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の有機アミン塩基；水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化セシウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カリウム、酢酸カルシウム、酢酸セシウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸セシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素セシウム、リン酸リチウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸カルシウム、リン酸セシウム等の無機塩基等が挙げられ、好ましくは有機アミン塩基又は無機塩基であり、より好ましくは水酸化物イオンを含む塩基であり、さらに好ましくはアルカリ金属イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン）及び水酸化物イオンを含む塩基であり、さらに好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。塩基は１種又は２以上を使用することができる。

【0084】

また、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物からＬ２を脱離させて化合物Ａに誘導する際の塩基としては、同じく上記の塩基が挙げられ、好ましくは無機塩基であり、より好ましくは水酸化物イオンを含む塩基であり、さらに好ましくはアルカリ金属イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン）及び水酸化物イオンを含む塩基であり、さらに好ましくは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。

【0085】

上記で示される塩基は、１価の塩基、２価の塩基、又は３価の塩基に大別される。１価の塩基とは、１分子でプロトンを１個受け入れることができる塩基であり、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。２価の塩基とは、１分子でプロトンを２個受け入れることができる塩基であり、炭酸ナトリウム等が挙げられる。３価の塩基としては、１分子でプロトンを３個受け入れることができる塩基であり、リン酸カリウム等が挙げられる。

【0086】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩へ誘導する際に１価の塩基を用いた場合、塩基の量としては、化合物Ｂ又はその塩１当量に対して、化合物Ｂの酸付加塩と中和される当量を差し引いて、化合物Ｂのフリー体の０．５〜１０当量が好ましく、１〜１０当量がより好ましく、１〜５当量がより好ましく、１〜３当量がより好ましく、１〜２当量がより好ましく、１．１当量又は１．９当量が特に好ましい。また、１価の塩基を用いた場合、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩からＬ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩に誘導する際の塩基の量としては、化合物Ｂ又はその塩１当量に対して、化合物Ｂのフリー体の１〜１０当量が好ましく、１〜５当量がより好ましく、３〜４当量がより好ましく、３．４当量又は３．６当量が特に好ましい。同様に、２価の塩基及び３価の塩基についても、価数を考慮して上記に従った至適当量が計算できる。

【0087】

本発明において、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩から、Ｌ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へ誘導する際に１価の塩基を用いた場合、塩基の量としては、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩１当量に対して、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物の酸付加塩と中和される当量を差し引いて、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物のフリー体の１〜５当量とすることができる。また、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物を単離せずに行う場合、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物のフリー体の理論収量（即ち、化合物Ｂのフリー体の量）の１〜１０当量とすることができる。同様に、２価の塩基及び３価の塩基についても、価数を考慮して上記に従った至適当量が計算できる。

【0088】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩へ誘導する際に採用される溶媒としては、化合物Ｂとアクリロイル化試薬の結合の妨げとなるものでなければ特に制限はなく、アセトニトリル、水、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，４−ジオキサン又はこれらの混合溶媒があげられ、好ましくはアセトニトリル、水又はこれらの混合溶媒である。溶媒の容量としては、特に制限はなく、好ましくは化合物Ｂ又はその塩の１重量に対して１〜５０倍容量（ｖ／ｗ）であり、より好ましくは２〜３０倍容量（ｖ／ｗ）であり、さらに好ましくは１０〜２０倍容量（ｖ／ｗ）であり、特に好ましくは１２倍容量（ｖ／ｗ）又は１４倍容量（ｖ／ｗ）である。混合溶媒を用いる際の各溶媒の比率は、特に制限されない。例えばアセトニトリル及び水の混合溶媒を用いる場合、各溶媒の比率は特に制限はないが、好ましくはアセトニトリルの１容量に対して水が０．１〜２倍容量（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは０．１〜１倍容量（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは０．５〜１倍容量（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは０．５倍容量（ｖ／ｖ）又は１倍容量（ｖ／ｖ）である。

【0089】

一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩から、Ｌ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へ誘導する際に採用される溶媒としては、上記と同様の溶媒が挙げられる。さらに、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩を単離せずに行う場合にも、上記と同様の溶媒が挙げられる。

【0090】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩へ誘導する際に採用される溶媒の温度としては、溶媒の融点から沸点の間であり、化合物Ｂが安定に存在できる範囲であれば、特に制限はないが、好ましくは０〜５０℃であり、より好ましくは２５〜３５℃である。

【0091】

一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩から、Ｌ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へ誘導する際に採用される温度としては、上記と同様の温度が挙げられる。

【0092】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩への誘導できる方法として、下記一般式（Ｉ−１−Ｄ）又は下記一般式（Ｉ−２−Ｄ）で表されるカルボン酸を用いることができる。

【0093】

【化18】

【0094】

（式中、Ｌ１、Ｌ２は前記に同じ。）

【0095】

この場合、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩への誘導できる工程は以下の通り示される。

【0096】

【化19】

【0097】

（式中、Ｌ１、Ｌ２は前記に同じ。）

【0098】

当該工程は化合物Ｂと一般式（Ｉ−１−Ｄ）又は一般式（Ｉ−２−Ｄ）のカルボン酸との縮合であるため、縮合剤を使用することができる。縮合剤としては、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ＥＤＣ（ＷＳＣＩ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＡＴＵ（（２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３，−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）、ＨＢＴＵ（Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート）、ＣＤＩ（カルボニルジイミダゾール）、ＤＭＴ−ＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−（１，３，５）トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム クロリド）等が挙げられる。

【0099】

また、当該工程においては、カルボン酸を活性化エステルに誘導するため、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＯＡｔ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）、ＨＯＳｕ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）等を添加することができる。

【0100】

さらに、当該工程においては、上記で挙げられた塩基を適宜使用することができる。

【0101】

本発明において、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩への誘導、及び一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩からＬ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩への誘導の際に採用される反応の確認方法としては、高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣとも言う。）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等の各クロマトグラフィーが挙げられる。ＨＰＬＣを用いた場合、化合物Ｂのピーク面積が、全ピーク面積の１％以下となれば、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩への誘導の工程が完了したものと判断できる。また、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物のピーク面積が、全ピーク面積の１％以下となれば、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩からＬ２を脱離させて化合物Ａへの誘導は完了したものと判断できる。ＨＰＬＣの測定条件は、化合物Ａ、化合物Ｂ及び一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物が検出できれば、特に制限されるものではない。

【0102】

また、化合物Ｂ又はその塩から一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩への誘導の際に反応の確認でＨＰＬＣを用いた場合、一般式（Ａ−１−ｄｉａｍｉｄｅ）で表される不純物及び３ＣＰジアミド、又は一般式（Ａ−２−ｄｉａｍｉｄｅ）で表される不純物及び２ＣＰジアミドのピーク面積が、全ピーク面積の２％以下であれば、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩にジアミド化合物が含まれる可能性が小さい。

【0103】

本発明において、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩を単離する場合、これらの化合物を再結晶等の方法により精製してもよく、精製せずに次工程に用いてもよい。また、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩から、Ｌ２を脱離させて化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩への誘導が完了された後に、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩は精製することができる。精製方法としては、本発明は大量製造に用いるとの観点から、カラムクロマトグラフィーによる精製は行わず、晶析によるものを採用することが好ましい。

【0104】

本発明において、反応溶媒に溶解した化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩を晶析する際には、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩の溶解度が低い溶媒を添加する方法が挙げられる。当該添加する溶媒としては、水等が挙げられる。また、当該添加する溶媒の量としては、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩が析出されれば特に制限はなく、好ましくは反応溶媒の０．５〜５倍容量（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１〜３倍容量（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは１〜２倍容量（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは１．１倍容量（ｖ／ｖ）又は１．８倍容量（ｖ／ｖ）である。また、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩を単離せずに化合物Ｂ又はその塩から化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へと誘導する場合、当該添加する溶媒の量としては、化合物Ｂ又はその塩の重量の５〜５０倍容量（ｖ／ｗ）であり、好ましくは１０〜４０倍容量（ｖ／ｗ）であり、より好ましくは１５〜３０倍容量（ｖ／ｗ）であり、特に好ましくは１５倍容量（ｖ／ｗ）又は２２倍容量（ｖ／ｗ）である。

【0105】

また、本発明において、晶析を実施する際の温度としては、上記の溶媒添加後に化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩が析出されれば特に制限はなく、好ましくは０〜４０℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。

【0106】

さらに、本発明において、晶析に要する時間としては、１時間以上が挙げられ、好ましくは２〜７２時間である。

【0107】

本発明において、化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩は、晶析及び濾取により固体として単離することができる。化合物Ａ又はその薬学的に許容できる塩は医薬品として使用されるため、効率よく大量製造するためには、濾取にかかる時間が短い方がよい。濾過性の良不良は、濾過時間、濾過速度等の絶対値では判断できないため、工程条件を比較することによって相対的に決定される。そのため、濾過面積、濾取に用いる濾紙、吸引時の圧は揃えて比較が行われる。析出した粒子が大きく濾紙の目詰まりが起きないこと、濾過される溶媒量が少ないこと等は、濾過性が優れていると判断できる要因となる。

【0108】

本発明において、一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩を単離せずに、化合物Ｂ又はその塩から化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩へと誘導する場合、塩化アクリロイルよりも一般式（Ｉ−１−Ａ）又は一般式（Ｉ−２−Ａ）を用いる方が、化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩の濾取における濾過性がよい。これは、化合物Ａ又はその塩を製造する際には予想しえなかったことである。本発明において、濾過性の観点から用いることができる一般式（Ｉ−１−Ａ）又は一般式（Ｉ−２−Ａ）で表される化合物は、塩化アクリロイルを用いた場合に比べて濾過性が改善されていれば特に限定されないが、好ましくは一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物であり、より好ましくは３−クロロプロピオニルクロリドである。

【0109】

このようにして得られた一般式（Ａ−１）又は一般式（Ａ−２）で表される化合物又はその塩、及び化合物Ａ又はその薬学的に許容される塩は、各種の定量分析、定性分析によって分析することができる。

【0110】

本発明において、１つの実施形態として、化合物Ｂ又はその塩１当量を、１．０〜１．３当量の一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法を採用することができる。

【0111】

好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、Ｌ１及びＬ２が、同一又は異なって、ハロゲン原子からなる群から選ばれる一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0112】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0113】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、有機アミン塩基及び無機塩基からなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0114】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、有機アミン塩基及び水酸化物イオンを含む塩基からなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0115】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて１．０〜１０当量の、有機アミン塩基及び水酸化物イオンを含む塩基からなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0116】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、有機アミン塩基及びアルカリ金属イオンと水酸化物イオンとを含む塩基からなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0117】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、ジイソプロピルエチルアミン、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０〜１．３当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0118】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、ジイソプロピルエチルアミン、水酸化ナトリウム、及び水酸化カリウムからなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．０５〜１．２当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0119】

特に好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて１．１当量の、水酸化ナトリウムの存在下で、３−クロロプロピオニルクロリド１．１当量と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0120】

本発明において、別の１つの実施形態として、化合物Ｂ又はその塩を、水酸化物イオンを含む塩基の存在下で、一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法を採用することができる。

【0121】

好ましくは、化合物Ｂ又はその塩を、水酸化物イオンを含む塩基の存在下で、Ｌ１及びＬ２が、同一又は異なって、ハロゲン原子である、一般式（Ｉ−１−Ａ）で表される化合物と反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0122】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩を、水酸化物イオンを含む塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0123】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、水酸化物イオンを含む塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0124】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、アルカリ金属イオンと水酸化物イオンとを含む塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0125】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて０．５〜１０当量の、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0126】

より好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて１．０〜５当量の、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0127】

特に好ましくは、化合物Ｂ又はその塩１当量を、化合物Ｂ又はその塩の酸付加塩と中和される当量を差し引いて３．５当量の、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群より選択される少なくとも１以上の塩基の存在下で、１．８当量の３−クロロプロピオニルクロリドと反応させる工程を含む、一般式（Ａ−１）で表される化合物又はその塩の製造方法である。

【0128】

上記の製造方法に従い製造した化合物Ａには、様々な不純物が含まれる可能性がある。特に、化合物Ｂから３−クロロプロピオニルクロリドを使って化合物Ａを製造した際に、以下の類縁物質が含まれうる。

【0129】

【表1】

【0130】

【表2】

【0131】

【表3】

【0132】

類縁物質１は、上記のジアミド化合物である。

【0133】

類縁物質２は、上記のＡ−１−３ＣＰ化合物である。

【0134】

類縁物質３は、上記の化合物Ｂである。

【0135】

類縁物質４は、（Ｓ）−３−（（１−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−６−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパン酸（以下、「ＣＥ化合物」とも言う）である。

【0136】

類縁物質５は、（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−ヒドロキシプロパン−１−オン（以下、「ＯＨ化合物」とも言う）である。これは、Ａ−１−３ＣＰ化合物の塩素基が水酸基に置換されたものである。

【0137】

類縁物質６は、（Ｓ）−８−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−１０−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−３，４−ジヒドロピラゾロ［４，３−ｅ］ピリミド［１，２−ｃ］ピリミジン−２（８Ｈ）−オン（以下、「ＣＤＡ１化合物」とも言う）である。これは、類縁物質１に記載されたピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンの４位のアクリルアミドと５位の窒素が環を形成した化合物である。

【0138】

類縁物質７は、（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルバルデヒド（以下、「ＣＨＯ化合物」とも言う）である。これは、化合物Ａのアクリロイル基がホルミル基に置換されたものである。

【0139】

類縁物質８は、１，３−ビス（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパン−１−オン（以下、「ＭＡ化合物」とも言う）である。これは、化合物Ａのアクリロイル基に化合物Ｂのピロリジン部分が結合したものである。

【0140】

類縁物質９は、１−（（Ｓ）−３−（４−（（３−（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−オキソプロピル）アミノ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパ−２−エン−１−オン（以下、「Ｄｉｍｅｒ化合物」とも言う）である。これは、化合物Ａのアクリロイル基に化合物Ｂのアミノ基の窒素が結合したものである。

【0141】

類縁物質１０は、（Ｓ）−１−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−５−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（以下、「ＵＫ化合物」とも言う）である。これは、化合物Ａのピリミジン部分が開環したものである。

【0142】

上記類縁物質の塩等も本発明に包含される。類縁物質又はその塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）であっても、無溶媒和物であってもよく、本発明においては、いずれも「化合物又はその塩」に包含される。化合物の塩としては、特に限定するものではないが、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、又は硫酸等の無機酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、又はベンゼンスルホン酸等のアルキル硫酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸等の有機酸との付加塩、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩、エチルアミン塩、アルギニン塩等の有機塩基との塩等が挙げられる。本明細書において、「類縁物質１」、「類縁物質２」、・・・「類縁物質１０」との記載は、当該類縁物質の「塩」及び「溶媒和物」を含めることを意図し得る。

【0143】

上記類縁物質若しくはその塩の組み合わせも本発明に包含される。組み合わせは、２以上の上記類縁物質又はその塩が含まれている。組み合わせ中のすべてが上記類縁物質のいずれか２つ以上である場合、一部が上記類縁物質のいずれか１つ以上であり残りが上記類縁物質のいずれか１つ以上の塩である場合、すべてが上記類縁物質のいずれか２つ以上の塩である場合のいずれもが包含される。組み合わせ中に、上記類縁物質のいずれか１つ及び当該類縁物質の塩を含んでもよい。

【0144】

本発明において、標準品とは医薬品の製剤及び／又は原薬を定量的又は定性的に評価する際に基準となるものを言う。本発明におけるこれらの類縁物質又はその塩は、化合物Ａを含む製剤及び／又は原薬の安定性試験、その製造工程の工程検査（工検）等において、ＨＰＬＣの測定で各類縁物質の保持時間等を確認して品質を管理するための標準品として用いることができる。

【0145】

なお、品質を管理するために用いることができる類縁物質は、原料及び／又は中間体である化合物、原薬の製造の際の副生成物となる化合物、及び原薬から製剤を製造する際に生じる化合物等が挙げられるが、実際に製造される原薬及び／又は製剤に含まれうる化合物であれば特に制限はない。原薬の製造面では、このような類縁物質は、実際に原薬に含まれる化合物だけでなく、原薬の精製過程で除去された化合物も含まれる。

【0146】

従って、本発明においては、前記類縁物質を化合物Ａの原薬、化合物Ａ又はその塩を含む医薬組成物（例えば、製剤）の品質管理（例えば、類縁物質の含有量の管理（調整））に用いることができる。さらに、本発明によれば、前記類縁物質を、化合物Ａを含む試料の不純物検出の際に標準品として用いることもできる。また、本発明によれば、化合物Ａを含む試料から当該類縁物質を単離することを特徴とする、前記類縁物質の製造方法を提供することもできる。また、本発明は、化合物Ａの分析方法を提供することもできる。本発明において、化合物Ａの分析とは、化合物Ａを含む試料中に、化合物Ａだけでなく、その類縁物質が含まれているか否かを分析し、類縁物質が検出された場合、その含有量を測定することを意味する。

【0147】

本発明において用いられるＨＰＬＣは、通常市販されているものを用いることができる。ＨＰＬＣは、少なくとも分離用カラム及び検出器を備える。

【0148】

本発明において、ＨＰＬＣの測定によるピークの分離度Ｒｓは、クロマトグラム上のピーク相互の保持時間とそれぞれのピーク幅との関係を示すものであり、次式を用いて計算される。

【0149】

Ｒｓ＝１．１８×（ｔＲ２―ｔＲ１）／（Ｗ０．５ｈ１＋Ｗ０．５ｈ２）
ｔＲ１、ｔＲ２：分離度測定に用いる二つの物質の保持時間。ただし，ｔＲ１＜ｔＲ２
Ｗ０．５ｈ１、Ｗ０．５ｈ２：それぞれのピークの高さの中点におけるピーク幅
ただし，ｔＲ１、ｔＲ２，Ｗ０．５ｈ１、Ｗ０．５ｈ２は同じ単位を用いる。

【0150】

日本薬局方において、分離度が１．５以上であれば完全にピークが分離した状態であるとされている。本発明においても分離度１．５以上を指標とすることができる。

【0151】

本発明において、ＨＰＬＣに用いられる測定条件は、類縁物質１〜１０からなる群より選択される１の類縁物質と化合物Ａの分離度が１．５以上であれば特に制限はないが、好ましくは、類縁物質８（ＭＡ化合物）、類縁物質９（Ｄｉｍｅｒ化合物）、及び化合物Ａの相互の分離度が１．５以上である。より好ましくは、類縁物質８（ＭＡ化合物）、類縁物質９（Ｄｉｍｅｒ化合物）、類縁物質４（ＣＥ化合物）、類縁物質５（ＯＨ化合物）、類縁物質７（ＣＨＯ化合物）、及び化合物Ａの相互の分離度が１．５以上である。さらに好ましくは、類縁物質３（化合物Ｂ）、類縁物質４（ＣＥ化合物）、類縁物質５（ＯＨ化合物）、類縁物質６（ＣＤＡ１化合物）、類縁物質７（ＣＨＯ化合物）、類縁物質２（Ａ−１−３ＣＰ化合物）、類縁物質８（ＭＡ化合物）、類縁物質９（Ｄｉｍｅｒ化合物）、及び化合物Ａの相互の分離度が１．５以上である。

【0152】

本発明において、ＨＰＬＣに用いられる測定条件は、移動相のグラジエント、シリカゲルカラム、測定サンプルの注入量、移動相クリーナーの有無、測定波長、カラム温度、移動相の流速、ＨＰＬＣ装置のミキサー容量等を適宜設定することができる。

【0153】

ＨＰＬＣには、有機相を移動相にして化合物の極性に応じて分離させる順相カラムと、水相を移動相にして化合物を分離させる逆相カラムが知られている。化合物Ａの物性の観点から、本発明においては逆相カラムを用いた逆相クロマトグラフィーが好ましい。

【0154】

一般に、ＨＰＬＣ測定において、測定サンプルを移動相へ注入（導入）し、かつ、検出器における検出を開始する時点を測定開始の時点とする。以下、本発明において、測定開始の時点を基準にＨＰＬＣ測定中の時点を定義する場合がある。

【0155】

本発明において使用できるＨＰＬＣの分離用カラムは、シリカゲルカラム、表面をオクタデシルシリル基で修飾されたシリカゲルカラム（ＯＤＳカラム又はＣ１８カラム）、表面をオクチル基で修飾されたシリカゲルカラム（Ｃ８カラム）、表面をシアノプロピル基で修飾されたシリカゲルカラム（ＣＮカラム）、表面をフェネチル基で修飾されたシリカゲルカラム（Ｐｈカラム）、表面をアミノプロピル基で修飾されたシリカゲルカラム（ＮＨカラム）、表面をジヒドロキシプロピル基で修飾されたシリカゲルカラム（Ｄｉｏｌカラム）、各種ポリマーで充填されたカラム（ポリマーカラム）、イオン交換樹脂で充填されたカラム（イオン交換カラム）等から選択されるが、本発明においてはＯＤＳカラムが好ましい。

【0156】

ＯＤＳカラムとしては、シリカゲルの粒径、細孔径、オクタデシルシリル基の結合方法、オクタデシルシリル基の置換度等が異なる種々のものを使用することができる。本発明においては、高純度シリカゲルが使用され、オクタデシル化後に残存したシラノールを低分子のシリル化剤で処理したＯＤＳカラム（エンドキャッピングされたＯＤＳカラム）が好ましい。

【0157】

ＯＤＳカラムとしては、シリカゲルの粒径、細孔径、オクタデシルシリル基の結合方法、オクタデシルシリル基の置換度等が異なる種々のものを使用することができる。シリカゲルの平均粒径は、例えば、３μｍがより好ましい。シリカゲルの平均粒径は、レーザー回折法等により測定することができる。

【0158】

シリカゲルの平均細孔径は、例えば、１０〜１２ｎｍがより好ましい。シリカゲルの平均細孔径は、ガス吸着法等により測定することができる。

【0159】

シリカゲルにおけるオクタデシルシリル基の結合様式としては、例えば、モノメリック様式、ポリメリック様式等が好ましい。

【0160】

オクタデシルシリル基の置換度は、種々の方法により測定することができる。シリカゲルの炭素量は、例えば、１４％以上が好ましい。

【0161】

シリカゲルの炭素量は、例えば、２０％以下が好ましい。シリカゲルの炭素量は、種々の方法により測定することができる。

【0162】

本発明におけるＨＰＬＣの移動相は、有機相及び水相の混液が用いられる。

【0163】

ＨＰＬＣの移動相において用いられる有機相は有機溶媒を主体とする液体媒体である。前記有機溶媒としては、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、クロロホルム、塩化メチレン等の非極性溶媒、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の非プロトン性極性溶媒、酢酸、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル等を用いることができる。これらの有機溶媒は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて（例えば、混合溶媒として）用いることができる。本発明における有機相に含まれる有機溶媒としては、メタノール、又はアセトニトリルが好ましく、アセトニトリルがより好ましい。

【0164】

また、有機相には２０容量％以下の水が含まれていてもよい。好ましくは、水は有機相全体の１０容量％以下であり、より好ましくは５容量％以下であり、特に好ましくは１％容量以下である。

【0165】

ＨＰＬＣの移動相において用いられる水相は水を主体とする液体媒体である。水相に含まれる液体の全量を水とすることができる。また、水相には、５０容量％以下の有機溶媒が含まれていてもよい。この場合に用いられる有機溶媒は、水と均一に混合できれば特に制限はなく、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ギ酸、酢酸、メタノール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられ、好ましくは、アセトニトリル、又はメタノールであり、より好ましくは、アセトニトリルである。そして、水相に含まれる有機溶媒は、水相全体の５０容量％以下であり、好ましくは、有機溶媒は水相全体の３０容量％以下であり、より好ましくは５〜３０容量％である。

【0166】

ＨＰＬＣの移動相におけるｐＨは、前記の類縁物質が検出可能であり、その含有量が算出できれば特に制限はないが、好ましくは６．９〜７．１を除くｐＨであり、より好ましくは６．１〜６．８、及び７．２〜７．５であり、より好ましくは６．４〜６．８であり、特に好ましくは６．６である。ＨＰＬＣの移動相におけるｐＨは、下記の緩衝剤の添加により調整することができる。

【0167】

ＨＰＬＣの移動相には、測定の際にｐＨの影響を小さくし再現性を向上させるとの観点から、緩衝剤を添加することができる。例えば、酢酸又はその塩、クエン酸又はその塩、酒石酸又はその塩、リン酸又はその塩を緩衝剤として添加することができる。酢酸又はその塩としては、酢酸、酢酸ナトリウムが挙げられる。クエン酸又はその塩としては、クエン酸、クエン酸一ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムが挙げられる。酒石酸又はその塩には、酒石酸、酒石酸ナトリウム、リン酸又はその塩としては、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムが挙げられる。本発明における緩衝剤としては、測定物質の持つ性質、測定の際に得られるピークの形状、及び測定の再現性の観点から、リン酸、及びリン酸塩が好ましく、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムがより好ましく、リン酸二水素カリウムが特に好ましい。これらの緩衝剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【0168】

緩衝剤は水相及び有機相のいずれにも添加することができる。好ましくは、緩衝剤は水相に添加される。

【0169】

本発明に用いることができる緩衝剤の濃度は、ＨＰＬＣの測定中に緩衝剤が析出しない濃度であれば適宜調整することができる。好ましくは、緩衝剤の濃度は５〜１０ｍＭである。

【0170】

一般に、ＨＰＬＣの測定においては、移動相における有機相と水相との混液組成を変動させることにより、対象とする類縁物質を適切に分離させることができる。その際に、移動相混液の割合を一定にするか（イソクラティック：ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、又は組成を連続的に変化させて（グラジエント：ｇｒａｄｉｅｎｔ）、前記の類縁物質を測定することができる。

【0171】

通常、逆相クロマトグラフィーにおいて、移動相における有機相と水相との混液組成の変動は、縦軸を移動相全体における有機相の割合（％）、横軸を測定時間（分）とした二次元のグラフが用いられる。すなわち、イソクラティックであれば、傾きは０の一次関数で表され、グラジエントグラジエント有機相の割合を一定の増加割合で経時的に上昇させるグラジエントであれば、傾きが正の一次関数で表され、有機相の割合を一定の減少割合で経時的に低下させるグラジエントであれば、傾きが負の一次関数で表される。これらを組み合わせることにより、各ピークの分離度を維持しつつ、極性の低い類縁物質も効率的に溶出されて短い保持時間にて測定することができる。上記一次関数の「傾き」である移動相中の有機相の増加割合は、例えば単位時間あたりの有機相の増加割合により表すことができ、以下のように計算できる。

【0172】

単位時間あたりの有機相の増加割合＝（（グラジエントの終了時点の移動相中の有機相の割合）―（グラジエントの開始時点の移動相中の有機相の割合））÷（グラジエントの開始時点と終了時点との間の時間の長さ）

【0173】

例えば、測定開始の時点（０分）で有機相の割合が移動相の１０容量％であったものを、連続的に有機相の割合を増加させて測定開始から１０分後の時点で有機相の割合が移動相の３０容量％となったとき、単位時間あたりの有機相の増加割合は２容量％／分と表される。

【0174】

本発明において、移動相の組成及びその変化の有無は、前記の類縁物質を測定することができれば特に制限はない。本発明の好ましい態様においては、移動相中の有機相の割合を経時的に上昇させるグラジエントを、３つ含む。以下、３つのグラジエントを、測定開始時点に近い順に、第１のグラジエント、第２のグラジエント及び第３のグラジエントと呼ぶ場合がある。

【0175】

以下、本発明の好ましい態様の１つにおける第１のグラジエント、第２のグラジエント及び第３のグラジエントについて説明する。

【0176】

第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜２．０容量％／分である。好ましくは０．７〜１．５容量％／分であり、より好ましくは、０．７〜１．３容量％／分であり、さらに好ましくは１．０容量％／分である。

【0177】

第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜５分後であり、好ましくは０〜２分後であり、より好ましくは０〜１分後であり、さらに好ましくは測定開始時点（測定開始時点から０分後）である。

【0178】

第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントグラジエントの開始時点から５〜１５分後であり、好ましくは７〜１２分後であり、より好ましくは１０分後である。

【0179】

第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１５質量％であり、より好ましくは０〜１０質量％であり、さらに好ましくは０〜５質量％であり、特に好ましくは０質量％である。

【0180】

第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の５〜１５質量％であり、さらに好ましくは７〜１２質量％であり、特に好ましくは１０質量％である。

【0181】

第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分である。好ましくは０．３〜１．８容量％／分であり、より好ましくは、０．７〜１．８容量％／分であり、さらに好ましくは１．３〜１．４容量％／分である。別の実施形態において、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、好ましくは０．５容量％／分である。

【0182】

第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、好ましくは０〜５分後であり、より好ましくは第１のグラジエントの終了時点（第１のグラジエントの終了時点から０分後）である。

【0183】

第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、好ましくは１２〜１８分後であり、より好ましくは１５分後である。別の実施形態において、第２のグラジエントの終了時点は、好ましくは２０分後である。

【0184】

第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一である。

【0185】

第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、より好ましくは２０〜４０質量％であり、さらに好ましくは２８〜３８質量％であり、特に好ましくは３０質量％である。別の実施形態において、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、好ましくは２０質量％である。

【0186】

第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分である。好ましくは１．０〜２．０容量％／分であり、より好ましくは、１．０〜１．５容量％／分であり、さらに好ましくは１．３〜１．４容量％／分である。別の実施形態において、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、好ましくは５．０容量％／分である。

【0187】

第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、好ましくは０〜５分後であり、より好ましくは第２のグラジエントの終了時点（第２のグラジエントの終了時点から０分後）である。

【0188】

第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、好ましくは１３〜１８分後であり、より好ましくは１５分後である。別の実施形態において、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から好ましくは１０分後である。

【0189】

第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一である。

【0190】

第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％であり、より好ましくは４５〜７０質量％であり、さらに好ましくは４５〜５５質量％であり、特に好ましくは５０質量％である。別の実施形態において、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、好ましくは７０質量％である。

【0191】

測定開始の時点と第１のグラジエントの開始時点は、一致しても一致しなくてもよい。測定開始の時点と第１のグラジエントの開始時点が一致しない場合、その間はイソクラティックとすることができる。

【0192】

第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点との間に移動相がイソクラティックである期間を設ける場合、その長さは０分より大きく５分以下、好ましくは０分より大きく２分以下、より好ましくは０分より大きく１分以下である。

【0193】

第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点は、一致しても一致しなくてもよい。第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点が一致しない場合、その間はイソクラティックとすることができる。

【0194】

第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点との間に移動相がイソクラティックである期間を設ける場合、その長さは０分より大きく１０分以下、好ましくは０分より大きく５分以下である。

【0195】

第２のグラジエントの終了時点と第３のグラジエントの開始時点は、一致しても一致しなくてもよい。第２のグラジエントの終了時点と第３のグラジエントの開始時点が一致しない場合、その間はイソクラティックとすることができる。

【0196】

第２のグラジエントの終了時点と第３のグラジエントの開始時点との間に移動相がイソクラティックである期間を設ける場合、その長さは０分より大きく１０分以下、好ましくは０分より大きく５分以下である。

【0197】

測定開始の時点と第１のグラジエントの開始時点、第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点、及び第２のグラジエントの終了時点と第３のグラジエントの開始時点が一致してもよい。

【0198】

このような態様において、第１のグラジエント、第２のグラジエント及び第３のグラジエントは以下のようにすることができる。

【0199】

第１のグラジエントの終了時点は、測定開始の時点から５〜１５分後であり、好ましくは７〜１２分後であり、より好ましくは１０分後である。

【0200】

第２のグラジエントの終了時点は、測定開始の時点から２０〜３５分後であり、好ましくは２２〜２８分後であり、より好ましくは２５分後である。別の実施形態において、第２のグラジエントの終了時点は、好ましくは３０分後である。

【0201】

第のグラジエントの終了時点は、測定開始の時点から３５〜５０分後であり、好ましくは３８〜４８分後であり、より好ましくは４０分後である。

【0202】

このような場合においても、測定開始の時点と第１のグラジエントの開始時点との間、第１のグラジエントの終了時点と第２のグラジエントの開始時点との間、及び第２のグラジエントの終了時点と第３のグラジエントの開始時点との間からなる群から選択される１以上に、移動相がイソクラティックである期間を設けることは妨げられない。

【0203】

本発明における、第１のグラジエント、第２のグラジエント、及び第３のグラジエントは、有機相の増加割合が全て同一であっても、一部が同一であっても、相互に異なっていてもよい。本発明の好ましい態様の１つでは、は第２のグラジエントと第３のグラジエントとの有機相の増加割合が同一である。有機相の増加割合が同一のグラジエントは、間に移動相がイソクラティックである期間を設けない場合、２つ（又は３つ）のグラジエントが合わせて１つのグラジエントを形成すると換言することができる。

【0204】

本発明において、ＨＰＬＣ測定の好ましい態様グラジエントは、上記の通り第１から第３のグラジエントを含む。好ましくは第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜２．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜５分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から５〜１５分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１５質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の５〜１５質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％である。

【0205】

より好ましくは、第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜１．５容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜２分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から７〜１２分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１０質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の７〜１２質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％である。

【0206】

より好ましくは、第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜１．３容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜１分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から１０分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜５質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１０質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜２．０容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１５〜４５質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜６．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜１０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０〜２０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７５質量％である。

【0207】

より好ましくは、第１のグラジエントの有機相の増加割合は１．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は測定開始の時点（測定開始の時点から０分後）であり、第１のグラジエントの終了時点は測定開始の時点から１０分後であり、第１のグラジエントの開始時点の有機相の割合は０質量％であり、第１のグラジエントの終了時点の有機相の割合は１０質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜１．８容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜５分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１２〜１８分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の２０〜４０質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜２．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜５分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１３〜１８分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の４５〜７０質量％である。

【0208】

別の実施形態において、より好ましくは、第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜１．５容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜２分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から７〜１２分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜１０質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の７〜１２質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．３〜１．８容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０〜５分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１２〜１８分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の２０〜４０質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜２．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０〜５分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１３〜１８分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜７０質量％である。

【0209】

別の実施形態において、より好ましくは、第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜１．３容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０〜１分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から１０分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０〜５質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１０質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．７〜１．８容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から１５分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の２８〜３８質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０〜１．５容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１５分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の４５〜５５質量％である。

【0210】

特に好ましくは、第１のグラジエントの有機相の増加割合は１．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は測定開始の時点（測定開始の時点から０分後）であり、第１のグラジエントの終了時点は測定開始の時点から１０分後であり、第１のグラジエントの開始時点の有機相の割合は０質量％であり、第１のグラジエントの終了時点の有機相の割合は１０質量％であり、第２のグラジエントの有機相の増加割合は１．３〜１．４容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は第１のグラジエントの終了時点から０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は第２のグラジエントの開始時点から１５分後であり、第２のグラジエントの開始時点の有機相の割合は第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点の有機相の割合は３０質量％であり、第３のグラジエントの有機相の増加割合は１．３〜１．４容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は第２のグラジエントの終了時点から０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は第３のグラジエントの開始時点から１５後であり、第３のグラジエントの開始時点の有機相の割合は第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点の有機相の割合は５０質量％である。

【0211】

別の実施形態において、本発明におけるＨＰＬＣ測定の好ましい態様グラジエントは、上記の通り第１から第３のグラジエントを含む。好ましくは第１のグラジエントにおける有機相の増加割合は、１．０容量％／分であり、第１のグラジエントの開始時点は、測定開始時点から０分後であり、第１のグラジエントの終了時点は、第１のグラジエントの開始時点から１０分後であり、第１のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、移動相全体の０質量％であり、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の１０質量％であり、第２のグラジエントにおける有機相の増加割合は、０．５容量％／分であり、第２のグラジエントの開始時点は、第１のグラジエントの終了時点から０分後であり、第２のグラジエントの終了時点は、第２のグラジエントの開始時点から２０分後であり、第２のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第１のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、移動相全体の２０質量％であり、第３のグラジエントにおける有機相の増加割合は、５．０容量％／分であり、第３のグラジエントの開始時点は、第２のグラジエントの終了時点から０分後であり、第３のグラジエントの終了時点は、第３のグラジエントの開始時点から１０分後であり、第３のグラジエントの開始時点における有機相の割合は、第２のグラジエントの終了時点における有機相の割合と同一であり、第３のグラジエントの終了時点における有機相の割合は、有機相の割合は、移動相全体の７０質量％である。

【0212】

第３のグラジエントの終了後、必要に応じて移動相がイソクラティックである期間を設けた後、移動相中の有機相の割合を経時的に減少させるグラジエントを設けることができる。

【0213】

移動相中の有機相の割合を経時的に減少させるグラジエントは、１分以下、好ましくは０．５分以下、より好ましくは０．１分以下で行うことができる。

【0214】

移動相中の有機相の割合を経時的に減少させるグラジエントにより、有機相の割合を、移動相全体の０〜１５質量％、好ましくは０〜１０質量％であり、より好ましくは０〜５質量％であり、さらに好ましくは０質量％へと低下させることができる。

【0215】

また、本発明におけるＨＰＬＣには、適宜移動相クリーナーを用いることもできる。当該クリーナーは、カートリッジに活性炭が用いられており，移動相中の不純物及びゴミを除去することができる。それに伴い、クロマトグラムのベースラインノイズが軽減されるため、化合物Ａ由来の少量の類縁物質であっても適切に検出及び定量することができる．

【0216】

本発明において、ＨＰＬＣによる測定開始の時点に移動相に注入される溶液量は、測定可能な量であれば特に制限はないが、好ましくは２μＬ以上であり、より好ましくは４〜２２μＬであり、特に好ましくは、８μＬ〜２２μＬである。

【実施例】

【0217】

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。本発明は実施例により十分に説明されているが、当業者により種々の変更及び修飾が可能であろうことは理解される。したがって、そのような変更及び修飾が本発明の範囲を逸脱するものでない限り、それらは本発明に包含される。

【0218】

実施例で用いた各種試薬は、特に記載の無い限り市販品を使用した。

【0219】

なお、製造例における収率は、以下のように算出した。
収率（％）＝（（目的物の収量）／（目的物の理論収量））×１００

【0220】

製造例におけるＬＣＭＳスペクトルはＷａｔｅｒｓ製ＡＣＱＵＩＴＹ ＳＱＤ（四重極型）を用いて下記条件にて測定した。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ製ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ，１．７μｍ
ＭＳ検出：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＵＶ検出：２５４及び２８０ｎｍ
カラム流速：０．５ｍＬ／分
移動相：水／アセトニトリル（０．１％ギ酸）
インジェクション量：１μＬ

【0221】

また、製造例における各工程におけるＨＰＬＣの条件は以下の通りである。

【0222】

［条件１］
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、３μｍ）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２８７ｎｍ）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
分析時間：２５分（面積測定範囲 １５分）
移動相：Ａ液 １０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエントプログラム

【0223】

【表4】

【0224】

［条件２］
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、３μｍ）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２８７ｎｍ）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
分析時間：３０ 分（面積測定範囲 １５分）
移動相：Ａ液 １０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエントプログラム

【0225】

【表5】

【0226】

［条件３］
カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８ （４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ，３μｍ）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２２０ｎｍ）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
流速：１．０ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
分析時間：７８分（面積測定範囲 ５８分）
移動相：Ａ液 １０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸水溶液
Ｂ液 アセトニトリル
グラジエントプログラム

【0227】

【表6】

【0228】

［製造例１］（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩の合成
トルエン（２１６５ｇ）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルボキシレート（５００ｇ）、１−エチニル−３，５−ジメトキシベンゼン（２０７．５ｇ；特許文献１）、及びトリエチルアミン（１７６．３５ｇ）を溶解し、反応系内を窒素置換した。溶解した混合物にヨウ化銅（８８５ｍｇ）、ビス（トリフェニルホスフィンパラジウム ジクロリド（３．２６４ｇ）、及びトリフェニルホスフィン（１．２１９５ｇ）を投入し、窒素置換下で、内温７５℃で１８時間撹拌した。その後、反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件１）し、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルボキシレートのピーク面積が、全ピーク面積の１．０％以下であることを確認した。

【0229】

内温を５０℃まで冷却し、混合物に酢酸エチル（２２５５ｇ）、ＳＣＡＶＥＮＧＥＲ ＳＨ ＳＩＬＣＡ（２５０ｇ）、及び精製白鷺活性炭（５０ｇ）を投入し、２１時間撹拌した。混合物からヌッチェによる吸引ろ過により、ＳＣＡＶＥＮＧＥＲ ＳＨ ＳＩＬＣＡ及び精製白鷺活性炭を除去した。残渣を酢酸エチル４Ｌで洗浄し、ろ液と混合した。得られたろ液を減圧下で溶媒留去し、６Ｌ留去時、アセトニトリル２．５Ｌ投入した。さらに減圧下で溶媒留去し、２．４Ｌ留去後、アセトニトリル２．５Ｌを投入した。さらに減圧下で溶媒留去し、２．６Ｌ留去後、全量をｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−ヨード−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルボキシレートに対して５倍容量（ｖ／ｗ）となるようアセトニトリルを投入した。

【0230】

得られた混合物に精製水（５００ｇ）、メタンスルホン酸（２３４．５ｇ）を投入し、内温６０℃以上で２時間撹拌した。混合物にアセトニトリル８Ｌを５分間掛け投入し、（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩を晶析させた。混合物を内温５２℃から３時間かけ、２５℃へ冷却しその後１１時間撹拌した。混合物からヌッチェによる吸引ろ過により（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩湿結晶を得た。湿結晶をアセトニトリル２Ｌで洗浄後、６０℃下減圧乾燥により、淡黄白結晶として標題化合物（５７１．５６ｇ、収率８８．４％）得た。

【0231】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ８．３５８（ｓ，１Ｈ），６．７４１（ｄ，２．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５３９（ｔ，２．２Ｈｚ，１Ｈ），５．７１５−５．６６２（ｍ，１Ｈ），３．９５５−３．８６０（ｍ，２Ｈ），３．８２８（ｓ，６Ｈ），３．７９９−３．６４５（ｍ，２Ｈ），２．８３８（ｓ，６Ｈ），２．７６６−２．６６６（ｍ，１Ｈ），２．５３６−２．４７１（ｍ，１Ｈ）

【0232】

［製造例２］（Ｓ）−Ｎ−（１―（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４―ｄ］ピリミジン−４−イル）アクリルアミドの合成
化合物Ａ（３４８ｍｇ、特許文献１）、ＤＭＦ（６ｍＬ）を反応容器に入れ、６０％鉱油含有水素化ナトリウム（４９ｍｇ）を投入した。その後、３−クロロプロピオニルクロリド（１２０μＬ）を滴下し、室温で３０分間撹拌した。反応液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、酢酸エチルで抽出し、有機層の溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ；クロロホルム／メタノール）にて精製し、標題化合物（４９ｍｇ）を得た。

【0233】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．８４（１Ｈ，ｓ），８．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，ＮＨ），７．３７（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１７．０，１０．２，５．１Ｈｚ），６．８６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，０．７Ｈｚ），６．７４−６．４８（１Ｈ，ｍ），６．６０−６．４２（１Ｈ，ｍ），６．５６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．４，２．２Ｈｚ），６．４６−６．３９（１Ｈ，ｍ），５．９６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１０．４，４．２，１．２Ｈｚ），５．７７−５．６９（１Ｈ，ｍ），５．６８−５．５６（１Ｈ，ｍ），４．２０−４．０１（２Ｈ，ｍ），４．１５−３．７０（２Ｈ，ｍ），３．８４（６Ｈ，ｓ），２．７５−２．４３（２Ｈ，ｍ）；ｍ／ｚ ４７３［Ｍ＋Ｈ］＋

【0234】

［製造例３］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−クロロプロパン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（１．０ｇ）、ジメチルスルホキシド（２５ｍＬ）を反応容器に入れ、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（３．６ｍＬ）を加えた。そこに、３−クロロプロパンカルボン酸（２９７ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ水和物（６９４ｍｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。さらに、３−クロロプロパンカルボン酸（６７ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ水和物（２７２ｍｇ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応液を炭酸水素ナトリウム水溶液に加え、酢酸エチルで抽出し、有機層の溶媒を留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ；クロロホルム／メタノール）にて精製し、標題化合物（７１３ｍｇ）を得た。

【0235】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．２６（１Ｈ，ｓ），７．９８（１Ｈ，ｂｒｓ），６．９０（２Ｈ，ｍ），６．７８（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６０（１Ｈ，ｍ），５．５５−５．３８（１Ｈ，ｍ），４．０５−３．７６（２Ｈ，ｍ），３．８５−３．７４（２Ｈ，ｍ），３．８０−３．４９（２Ｈ，ｍ），３．７７（６Ｈ，ｓ），２．７９（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝２５．８，６．８Ｈｚ），２．４９−２．２８（２Ｈ，ｍ）；ｍ／ｚ ４５５，４５７［Ｍ＋Ｈ］＋

【0236】

［製造例４］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（１０ｇ）、水（５６ｍＬ）、及びアセトニトリル（５０ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定の水酸化ナトリウム水溶液（１４ｍＬ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２．５１ｇ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で２時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。このとき、ＨＰＬＣでは、ジアミド化合物及び３ＣＰジアミド化合物は検出されなかった。その後、さらに５規定の水酸化ナトリウム水溶液（４ｍＬ）を加え、２０〜３０℃の間で２時間撹拌した。その後、さらに５規定の水酸化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）を加え、２０〜３０℃の間で２時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、Ａ−１−３ＣＰ化合物のピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。反応終了後、水（１５０ｍＬ）を加え、不溶物を濾取し、水（５０ｍＬ）、及びアセトニトリル（５０ｍＬ）で洗浄し、濾取したものを６０℃で減圧乾燥することにより、標題化合物（５．６０ｇ、収率７４．５％）を得た。

【0237】

得られた標題化合物をＨＰＬＣにて分析したところ、ジアミド化合物は検出されなかった。

【0238】

［製造例５］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（２５．０ｇ）、水（６９ｍＬ）、及びアセトニトリル（１５８ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定の水酸化ナトリウム水溶液（３５ｍＬ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（６．２７ｇ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）で希釈した溶液を１０分間掛けて加え、滴下後３０℃で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件３）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。このとき、ＨＰＬＣでは、ジアミド化合物及び３ＣＰジアミド化合物は検出されなかった。その後、さらに５規定の水酸化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を加え、３０℃で４時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件３）し、Ａ−１−３ＣＰ化合物のピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。反応終了後、水（５５０ｍＬ）を２時間掛けて加えた。滴下後、内温２５℃とし、１．５時間撹拌した。不溶物を濾取し、水（１２５ｍＬ）で洗浄し、濾取したものを６０℃で減圧乾燥することにより、標題化合物（１６．０２ｇ、収率８５．３％）を得た。

【0239】

得られた標題化合物をＨＰＬＣにて分析したところ、ジアミド化合物は検出されなかった。

【0240】

［製造例６］水酸化ナトリウム３．１当量を用いた（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（３．０ｇ）、水（９．１５ｍＬ）、及びアセトニトリル（１８．９６ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定の水酸化ナトリウム水溶液（３．３４ｍＬ）を加え、内温３０℃とした。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（０．７５３ｇ）をアセトニトリル（６ｍＬ）で希釈した溶液を１０分間掛けて加えた。滴下後、３０℃で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定し（条件３）、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。このとき、ＨＰＬＣでは、ジアミド化合物及び３ＣＰジアミド化合物は検出されなかった。その後、さらに５規定の水酸化ナトリウム水溶液（３．５６ｍＬ）を加え、３０℃で４時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件３）し、Ａ−１−３ＣＰ化合物のピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であることを確認した。反応終了後、水（６６ｍＬ）を３０分間掛けて加え、内温２５℃とし、１時間撹拌した。不溶物を濾取し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、濾取したものを６０℃で減圧乾燥することにより、標題化合物（１．８７４ｇ、収率８３．１％）を得た。

【0241】

得られた標題化合物をＨＰＬＣにて分析したところ、ジアミド化合物は検出されなかった。

【0242】

［製造例７］Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いた（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（３．０ｇ）、水（１２．４８ｍＬ）、及びアセトニトリル（１８．９６ｍＬ）を反応容器に入れ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．２６ｇ）を加え、内温３０℃とした。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（０．７５３ｇ）をアセトニトリル（６ｍＬ）で希釈した溶液を１０分間掛けて加え、滴下後３０℃で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件３）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であることを確認した。このとき、ＨＰＬＣでは、ジアミド化合物及び３ＣＰジアミド化合物は検出されなかった。その後、さらに５規定の水酸化ナトリウム水溶液（６．４７ｍＬ）を加え、３０℃で４時間３０分撹拌した。反応終了後、水（６６ｍＬ）を３０分間掛けて加え、内温２５℃とし、１時間３０分撹拌した。不溶物を濾取し、水（１５ｍＬ）で洗浄し、濾取したものを６０℃で減圧乾燥することにより、標題化合物（１．８９７ｇ、収率８４．２％）を得た。

【0243】

得られた標題化合物をＨＰＬＣにて分析したところ、ジアミド化合物は検出されなかった。

【0244】

［製造例８］水酸化カリウムを用いた（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定水酸化カリウム（２８０．７ｍｇ相当）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であることを確認した。このとき、ＨＰＬＣでは、ジアミド化合物及び３ＣＰジアミド化合物は検出されなかった。

【0245】

これにより、製造例８の方法は、ジアミド化合物等の類縁物質の生成が抑制できることから、化合物Ａの高い品質を維持する観点で優れ、医薬品の大量製造に適していることが示唆された。

【0246】

［製造例９］水酸化ナトリウムを用いた（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定水酸化ナトリウム（１．０ｍＬ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であることを確認した。このとき、３ＣＰジアミド化合物は０．３１％あった。

【0247】

これにより、製造例９の方法は、３ＣＰジアミド化合物から誘導されるジアミド化合物の生成が抑制されうることから、化合物Ａの品質を維持する観点で優れ、医薬品の大量製造に適していることが示唆された。

【0248】

［製造例１０］塩化アクリロイルを用いた（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−２−プロペン−１−オンの合成
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５．０ｇ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（５０ｍＬ）、及びリン酸カリウム（３．４３ｇ）を反応容器へ入れ、内温１０℃以下とした。そこに塩化アクリロイル（１．２１９ｇ）を加え、３時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であり、ジアミド化合物のピーク面積は２％以上であることを確認した。

【0249】

その後、水（２５ｇ）、リン酸（８８０ｍｇ）を加え、２０〜３０℃で３時間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、ジアミド化合物のピーク面積は全ピーク面積の２％未満であることを確認した。

【0250】

その後２０％水酸化カリウム水溶液を用い、反応液ｐＨを７〜８へ調整した。その後エタノール（４０ｍＬ）を投入し、内温５０〜６０へ加熱し、溶解させた。内温５０℃で化合物Ａの結晶ＩＩ（２５．２ｍｇ；特許文献８）を加え、３時間撹拌した。その後、水（１７６．３ｍＬ）を３時間掛け、滴下した。内温を５０℃から２５℃へ１５時間掛け、冷却した。このとき、溶液と不溶物を含む溶液全体は３７５ｍＬであり、このうち不溶物を濾取し、水（３０ｍＬ）で洗浄し、濾取したものを６０℃で減圧乾燥することにより、標題化合物（２．９３６ｇ、収率７８．２％）を得た。

【0251】

得られた標題化合物をＨＰＬＣにて分析したところ、ジアミド化合物は検出されなかった。

【0252】

しかし、溶液と不溶物を含む溶液全体３７５ｍＬから、濾過面積１２．５６ｃｍ２のヌッチェを用いて不溶物の濾取を行ったところ、１７１６秒を要し、濾過速度は０．２ｍＬ／秒であった。これは、実施例と同スケールで濾取に要した時間を比較したところ、実施例に比べて約２０分の１の濾過速度であった。

【0253】

これにより、製造例１０の方法は、化合物Ａの濾取に時間がかかることが示唆されたため、当該条件は大量製造のための方法としては不十分である可能性が示された。

【0254】

［製造例１１］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（２．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（２．５ｍＬ）を反応容器に入れ、５規定水酸化ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えた。そこに、塩化アクリロイル（１６２．９ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、氷冷下３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．９４％であり、ジアミド化合物は３．０２％であった。

【0255】

これにより、製造例１１の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示された。

【0256】

［製造例１２］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（２．５ｍＬ）を反応容器に入れ、リン酸カリウム（３４３．８ｍｇ）を加えた。そこに、塩化アクリロイル（９７．８ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、氷冷下６０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１７．７９％であり、ジアミド化合物は２０．８５％であった。

【0257】

これにより、製造例１２の方法は、化合物Ａの大量製造のための方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0258】

［製造例１３］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（２．５ｍＬ）を反応容器に入れ、リン酸カリウム（３４３．８ｍｇ）を加えた。そこに、塩化アクリロイル（１４６．６ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、氷冷下６０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であることを確認したが、ジアミド化合物は４４．２３％であった。

【0259】

これにより、製造例１３の方法は、化合物Ａの大量製造のための方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0260】

［製造例１４］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（２．５ｍＬ）を反応容器に入れ、ジイソプロピルエチルアミン（４０６．２ｍｇ）を加えた。そこに、塩化アクリロイル（１７１ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、氷冷下６０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の０．１％未満であったが、ジアミド化合物は２．０４％であった。このとき、様々な再結晶を検討したが、化合物Ａに含まれるジアミド化合物の含有量を０．１％未満にすることができなかった。

【0261】

これにより、製造例１４の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示された。

【0262】

［製造例１５］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、炭酸カリウム（６２０．６ｍｇ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であったが、３ＣＰジアミド化合物は３．４１％であった。

【0263】

これにより、製造例１５の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0264】

［製造例１６］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、リン酸カリウム（３４３．１ｍｇ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であったが、３ＣＰジアミド化合物は６．５８％であった。

【0265】

これにより、製造例１６の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0266】

［製造例１７］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、トリエチルアミン（３１８．０ｍｇ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（１７１．０ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であったが、３ＣＰジアミド化合物は１．６８％であり、他の多くの種類の類縁物質も検出された。

【0267】

これにより、製造例１７の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0268】

［製造例１８］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、ピリジン（３５５１．６ｍｇ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）したところ、化合物Ｂのピーク面積が４３．７２％であり、反応が十分に進行しなかった。

【0269】

これにより、製造例１８の方法は、化合物Ａの大量製造のための方法としては不十分である可能性が示された。

【0270】

［製造例１９］
（Ｓ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１−（ピロリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−アミン・２メタンスルホン酸塩（５００ｍｇ）、水（３．５ｍＬ）、及びアセトニトリル（３．５ｍＬ）を反応容器に入れ、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５０３．８ｍｇ）を加えた。そこに、３−クロロプロピオニルクロリド（２０５．２ｍｇ）をアセトニトリル（１ｍＬ）で希釈した溶液を加え、２０〜３０℃の間で３０分間撹拌した。反応液を一部分取しこれをＨＰＬＣにて測定（条件２）し、化合物Ｂのピーク面積が全ピーク面積の１．０％未満であったが、３ＣＰジアミド化合物は４．６６％であった。

【0271】

これにより、製造例１９の方法は、産物の品質の観点で医薬品の製造方法としては不十分である可能性が示唆された。

【0272】

以下に、化合物Ｂの２メタンスルホン酸塩から、Ｌ２が塩素原子である一般式（Ａ−１）で表される化合物の製造結果を下記表にまとめた。

【0273】

【表7】

【0274】

なお、塩基当量の（酸付加塩差引後）と記載してあるのは、化合物Ｂの２メタンスルホン酸塩の酸付加されているメタンスルホン酸の中和に要した塩基の当量数を差し引いた値である。また、「Ｎ．Ｄ．」は検出限界以下であること、「Ｎ．Ａ．」は測定していないことをそれぞれ示す。

【0275】

この結果より、化合物Ｂを１当量に対して、３−クロロプロピオニルクロリドの当量を１．１当量とすることで、化合物Ａにジアミドが混入する可能性が小さいことが分かった。さらに、塩基として水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを用いた場合、化合物Ｂを１当量に対して、３−クロロプロピオニルクロリドの当量を１．８当量としても、化合物Ａにジアミドが混入する可能性が小さいことが分かった。

【0276】

［試験例１］分離度の確認
特許文献４の実施例１に記載の方法により、製造例４、５、及び６で得られた化合物Ａを結晶化した。この際に濾取した濾液を質量スペクトル及びＨＰＬＣで分析することにより、ＣＥ化合物（保持時間１８．３分）、ＯＨ化合物（保持時間２３．１分）、ＣＤＡ１化合物（保持時間２４．７分）、ＣＨＯ化合物（保持時間２７．３分）、ジアミド化合物（保持時間４７．９分）、ＵＫ化合物（保持時間４８．５分）、ＭＡ化合物（保持時間５５．９分）、Ｄｉｍｅｒ化合物（保持時間５８．６分）を検出した。また、ＣＤＡ１化合物及びジアミド化合物は、別途合成したこれらの化合物とそれぞれＨＰＬＣ分析における保持時間が一致した。なお、当該ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。

【0277】

検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ，長さ１５ｃｍのステンレス管に３μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８、ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：１０μＬ
流速：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：水１０００ｍＬにリン酸０．６８５ｍＬを加えた後に４５％水酸化カリウム溶液を加えることでｐＨ６．８に調整したリン酸塩緩衝液９５０ｍＬに、アセトニトリル５０ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0278】

【表8】

【0279】

これにより、化合物Aの製造中間体である化合物Ｂ、及びＡ−１−３ＣＰ化合物以外にも、ＣＥ化合物、ＯＨ化合物、ＣＤＡ１化合物、ＣＨＯ化合物、ジアミド化合物、ＵＫ化合物、ＭＡ化合物、Ｄｉｍｅｒ化合物は、化合物Ａの原薬及び／又は製剤に含まれうる類縁物質であることが示された。併せて、これらの化合物は、化合物Ａの品質を維持するための標準品として使用できる可能性が示された。

【0280】

［製造実施例１］（Ｓ）−１−（３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−ヒドロキシプロパン−１−オン（ＯＨ化合物）の合成
製造例１で得られた化合物Ｂ・２メタンスルホン酸塩（１．００４ｇ）をＤＭＳＯ（２５ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３．６１０ｍＬ）を室温下で加えた。得られた溶液中に３−ヒドロキシプロパン酸（３０％水溶液、１．５０ｍＬ）及びＤＭＴ−ＭＭ・１水和物（１．０６７ｇ）を室温で加え、１時間撹拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮を行って得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（バイオタージ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ、５０ｇ及び ＳＮＡＰ Ｉｓｏｌｕｔｅ Ｆｌａｓｈ−ＮＨ，１１０ｇ、溶出液：クロロホルム／メタノール）で精製し、表題化合物を得た。

【0281】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ３．４ Ｈｚ），７．９７（１Ｈ， ｂｒｓ），６．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），６．７６（１Ｈ，ｂｒｓ），６．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），５．４５（１Ｈ，ｍ），４．５２（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝ ５．４，１７．６ Ｈｚ），４．０５−３．８０（１Ｈ，ｍ），３．８０−３．６２（４Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６２−３．４７（１Ｈ，ｍ），２．５２−２．２７（５Ｈ，ｍ）．ｍ／ｚ ４７３．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0282】

［製造実施例２］（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−カルバルデヒド（ＣＨＯ化合物）の合成
製造例１で得られた化合物Ｂ・２メタンスルホン酸塩（５２０．４ｍｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１．８７０ｍＬ）を室温で加えた。得られた溶液にギ酸（４２．３５μＬ）及びＤＭＴ−ＭＭ・１水和物（４１２．８ｍｇ）を室温で加え、２０分間撹拌した。反応液に炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮を行って得られた残渣に酢酸エチルを加えて、表題化合物を溶液から沈殿させた。生じた固体を濾取し、酢酸エチルで洗浄後、６５℃で減圧乾燥して、ＣＨＯ化合物（２３９．０ｍｇ）を得た。

【0283】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．３７（１Ｈ，ｓ），８．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ９．５ Ｈｚ），６．７６−６．７２（２Ｈ，ｍ），６．５６−６．５２（１Ｈ，ｍ），５．９２（２Ｈ，ｂｒｓ），５．６２−５．４５（１Ｈ，ｍ），４．０９−３．９７（２Ｈ，ｍ），３．９４−３．６３（２Ｈ，ｍ），３．８２（６Ｈ，ｓ），２．７１−２．４１（２Ｈ，ｍ）．
ｍ／ｚ ３９３．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0284】

［製造実施例３］１，３−ビス（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパン−１−オン（ＭＡ化合物）の合成
製造例１で得られた化合物Ｂ・２メタンスルホン酸塩（１００．４ｍｇ）に、５０％ アセトニトリル水溶液（４ｍＬ）を加えて溶解させ、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３６０．７ｍｇ）を室温で加えた。得られた懸濁液に、特許文献１に記載の化合物Ａ（７５．４ｍｇ）及びＤＢＵ（２６．９μＬ）を加え、８０℃で１１時間撹拌後、加熱を止めて、室温に戻るまでさらに撹拌した。析出した固体を濾取し、５０％ アセトニトリル水溶液で洗浄後、６５℃で減圧乾燥して、表題化合物の粗精製物を得た。得られた粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（バイオタージ ＳＮＡＰ Ｉｓｏｌｕｔｅ Ｆｌａｓｈ−ＮＨ，２５ｇ、溶出液：酢酸エチル／メタノール）で精製し、ＭＡ化合物（１０９．１ｍｇ）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．４２−８．２９（２Ｈ，ｍ），６．８１−６．６４（２Ｈ，ｍ），６．５２（２Ｈ，ｓ），６．１８−５．９０（４Ｈ，ｍ），５．６１−５．４１（１Ｈ，ｍ），４．０８−３．５９（４Ｈ，ｍ），３．８１（１２Ｈ，ｓ），３．１７（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝ ９．０，２３．６ Ｈｚ），３．０８−２．７８（５Ｈ，ｍ），２．７１−２．３０（６Ｈ，ｍ）． ｍ／ｚ ７８３．５ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0285】

［製造実施例４］（Ｓ）−３−（（１−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−６−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパン酸（ＣＥ化合物）の合成
特許文献１に記載の化合物Ａ（５０２．０ｍｇ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、氷冷下で６０％水素化ナトリウム（流動パラフィンに分散させた粉末、６０．３ｍｇ）加えて１０分間撹拌した。３−ブロモプロパン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２２０．２μL）を氷冷下加えて１５分間撹拌後、室温に昇温して２０時間撹拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（バイオタージ ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ、５０ ｇ、溶出液：酢酸エチル／メタノール）で精製し、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−３−（（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アミノ）プロパノエート（表題化合物のｔｅｒｔ−ブチルエステル保護体、５１０．０ｍｇ）を得た。

【0286】

上記で得られたｔｅｒｔ−ブチルエステル保護体（５１０．０ｍｇ）をギ酸（８ ｍＬ）に溶解し、室温で２０時間、続いて５０℃で３時間撹拌を行った。反応液を減圧濃縮して得られた残渣にメタノールを加え表題化合物を溶液から析出させた。析出固体を濾取し、少量のメタノールで洗浄後、６５℃で減圧乾燥し、ＣＥ化合物（３４２．３ｍｇ）を得た。

【0287】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ７．３ Ｈｚ），６．８４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４ Ｈｚ），６．８４−６．７５（１Ｈ，ｍ），６．５３−６．３６（３Ｈ，ｍ），５．７４−５．６６（１Ｈ，ｍ），５．５５−５．４０（１Ｈ，ｍ），４．１０−３．８５（５Ｈ，ｍ），３．８２−３．６８（１Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），２．７９−２．７２（２Ｈ，ｍ），２．６４−２．３２（２Ｈ，ｍ）. ｍ／ｚ ４９１．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0288】

［製造実施例５］１−（（Ｓ）−３−（４−（（３−（（Ｓ）−３−（４−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）−３−オキソプロピル）アミノ）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル）ピロリジン−１−イル）プロパ−２−エン−１−オン（Ｄｉｍｅｒ化合物）の合成
製造例１で得られた化合物Ｂの２メシル酸塩（２．７５１ｇ）を５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液に滴下した。得られた懸濁液をクロロホルムで抽出し、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮を行い、製造例４で得られた化合物Ｂの脱塩体（１．７５３ｇ）を得た。

【0289】

上記で得られた脱塩体（２６８．２ｍｇ）と製造実施例１０４で得られたＣＥ化合物（３０１．０ｍｇ）をＤＭＳＯ（１５ｍＬ）と水（１．５ｍＬ）の混合溶媒に溶解させ、ＤＭＴ−ＭＭ・１水和物（２７４．４ｍｇ）を加え、室温で２時間、続いて５０℃で１時間撹拌した。ＤＭＴ−ＭＭ・１水和物（３８．５ ｍｇ）を追加し、５０℃でさらに１時間撹拌後、室温に冷却した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し手得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ，１１０ｇ、溶出液：クロロホルム／メタノール）で精製し、Ｄｉｍｅｒ化合物（３６０．７ｍｇ）を得た。

【0290】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．３８−８．２７（２Ｈ，ｍ），７．３０−７．１３（１Ｈ，ｍ），７．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ ２．２，７．８ Ｈｚ），７．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．２ Ｈｚ），６．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），６．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ ２．２，５．１ Ｈｚ），６．５６−６．４７（２Ｈ，ｍ），６．４５−６．３６（２Ｈ，ｍ），６．００−５．８７（２Ｈ，ｍ），５．７４−５．６５（１Ｈ，ｍ），５．５８−５．４３（２Ｈ，ｍ），４．１７−３．５６（１０Ｈ，ｍ），３．８６−３．７５（１２Ｈ，ｍ），２．７５−２．３１（６Ｈ，ｍ）． ｍ／ｚ ８３７．６ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0291】

［製造実施例６］（Ｓ）−８−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−１０−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−３，４−ジヒドロピラゾロ［４，３−ｅ］ピリミド［１，２−ｃ］ピリミジン−２（８Ｈ）−オン（ＣＤＡ１化合物）の合成
特許文献１に記載の化合物Ａ（５００．１ｍｇ）をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶解し、４−ジメチルアミノピリジン（３５８．９ｍｇ）とアクリル酸クロリド（２３４．０μＬ）を加え、室温で２時間撹拌を行った。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ，５０ｇ、溶出液：クロロホルム／メタノール）で精製し、ＣＤＡ１化合物（２３２．８ ｍｇ）を得た。

【0292】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６） δ ８．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．０ Ｈｚ），６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），６．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝ １０．２，１７．０，３７．１ Ｈｚ），６．５８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），６．１６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝ ２．４，６．３，１７．０ Ｈｚ），５．６９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝ ２．４，１０．２，１６．１ Ｈｚ），５．５６−５．４２（１Ｈ，ｍ），４．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ７．３ Ｈｚ），４．１４−３．９２（１Ｈ，ｍ），３．９６−３．７３（１Ｈ，ｍ），３．８６−３．５７（１Ｈ，ｍ），３．７８（６Ｈ，ｓ），２．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ ７．３ Ｈｚ），２．５６−２．２３（２Ｈ，ｍ）． ｍ／ｚ ４７３．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0293】

［製造実施例７］（Ｓ）−Ｎ−（１―（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−イル）アクリルアミド（ジアミド化合物）の合成
特許文献１に記載の化合物Ａ（３．０００ｇ）をＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解し、室温で撹拌下、６０％水素化ナトリウム（流動パラフィンに分散させた粉末、４４０．０ ｍｇ）加えて５分間撹拌した。３−クロロプロパン酸クロリド（１．４０ｍＬ）を加え、室温で２０分間撹拌した。得られたゲル状の反応液にゲル状態が解消されるまで飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出を行った。抽出液を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮を行って得られた残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＳＮＡＰ Ｕｌｔｒａ ＨＰ−Ｓｐｈｅｒｅ，１００ｇ、溶出液：酢酸エチル／メタノール）で精製し、ジアミド化合物（３７４．３ｍｇ）を得た。

【0294】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ８．８４（１Ｈ，ｓ），８．７２（１Ｈ，ｓ），７．４３−７．３１（１Ｈ，ｍ），６．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），６．７５−６．３４（３Ｈ，ｍ），６．５６（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝ ２．４ Ｈｚ），５．９６（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝ １．２，４．１，１０．５ Ｈｚ），５．７７−５．６９（１Ｈ，ｍ），５．６７−５．５６（１Ｈ，ｍ），４．４８−３．７４（４Ｈ，ｍ），３．８４（６Ｈ，ｓ），２．７５−２．４２（２Ｈ，ｍ）． ｍ／ｚ ４７３．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0295】

［製造実施例８］（Ｓ）−１−（１−アクリロイルピロリジン−３−イル）−５−アミノ−３−（（３，５−ジメトキシフェニル）エチニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（ＵＫ化合物）の抽出
特許文献４の実施例１に記載の方法により、製造例４、５、又は６で得られた化合物Ａを結晶化して濾取した際の濾液（４０ｍＬ）にクロロホルム（４０ｍＬ）を加えて２回抽出を行った。抽出液を合わせて減圧濃縮を行い、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ，ＳＮＡＰ Ｉｓｏｌｕｔｅ Ｆｌａｓｈ−ＮＨ，１１ｇ、溶出液：酢酸エチル／メタノール）及びシリカゲル分取薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１．０５７４４、展開溶媒：クロロホルム／メタノール）で精製を行い、ＵＫ化合物（２．５ｍｇ）を得た。

【0296】

１Ｈ−ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ６．７５−６．７１（２Ｈ，ｍ），６．５３−６．４３（２Ｈ，ｍ），６．４２−６．３５（１Ｈ，ｍ），５．７８−５．７０（１Ｈ，ｍ），４．８０−４．６０（１Ｈ，ｍ），４．７３（２Ｈ，ｓ），４．０７−３．８６（２Ｈ，ｍ），３．８６−３．６０（２Ｈ，ｍ），３．８０（６Ｈ，ｓ），２．７８−２．２７（２Ｈ，ｍ）． ｍ／ｚ ３９２．３ ［Ｍ＋Ｈ］＋．

【0297】

［実施例１］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析

【0298】

以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、ＨＰＬＣの測定に用いた化合物Ａの溶液は、製造例４、５、又は６で得られた化合物Ａ（２０ｍｇ：製剤を用いてもよい）に水／アセトニトリル混液（１：１）５０ｍＬを加えて溶解させた後、ＣＥ化合物、ＯＨ化合物、ＭＡ化合物、Ｄｉｍｅｒ化合物及びＣＨＯ化合物をそれぞれ１ｍｇずつ量り，水／アセトニトリル混液（１：１）５０ｍＬに溶かした溶液２ｍＬを添加し，水／アセトニトリル混液（１：１）をさらに加えて、正確に１００ｍＬとすることにより調製した。

【0299】

［条件（実施例１）］
検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレス管に3μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰ、ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：１０μＬ
流速：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：リン酸二水素カリウム２．０４ｇを水１５００ｍＬに溶かし，水酸化カリウム試液，８ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後、アセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0300】

【表9】

【0301】

測定結果を図１に示す。本測定方法により、化合物Ａの保持時間が約１８．９分に確認された。また、ＣＥ化合物の保持時間が約８．７分，ＯＨ化合物の保持時間が約１２．６分、ＭＡ化合物の保持時間が約２４．１分、Ｄｉｍｅｒ化合物の保持時間が約２７．３分、ＣＨＯ化合物の保持時間が約１５．２分に確認された。

【0302】

さらに、これらの類縁物質と化合物Ａの各ピーク間の分離度を評価した結果を表１０に記載した。

【0303】

【表10】

【0304】

表中の「分離度」には、分離度を比較した保持時間の遅い方の化合物欄に、対象ピーク間の分離度を記載した。例えば、ＯＨ化合物の「分離度」の欄には、保持時間の遅いＯＨ化合物と保持時間の早いＣＥ化合物との分離度を記載し、ＣＨＯ化合物の「分離度」の欄には、保持時間の遅いＣＨＯ化合物と保持時間の早いＯＨ化合物との分離度を記載した。

【0305】

これより，いずれのピークにおいても分離度が１．５以上であり、ピーク間が完全分離していることを確認した．そのため、実施例１に記載のＨＰＬＣの条件は、化合物Ａの品質の管理することができることを確認した。

【0306】

［実施例２］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析
以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、ＨＰＬＣの測定に用いた化合物Ａの溶液は、実施例１と同様である。

【0307】

［条件（実施例２）］
検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ，長さ１５ｃｍのステンレス管に3μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填する（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰ，ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
流速：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：リン酸二水素カリウム２．０４ｇを水１５００ｍＬに溶かし，水酸化カリウム試液，８ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後、アセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0308】

【表11】

【0309】

本測定方法により、化合物Ａの保持時間が約１８．７分に確認された．他の類縁物質は、実施例１と同様の保持時間を示した．これにより，化合物Ａを含むいずれの各類縁物質をそれぞれ分離できる測定条件であることを確認した。

【0310】

［実施例３］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析
以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、ＨＰＬＣの測定に用いた化合物Ａの溶液は、実施例１と同様である。

【0311】

［条件（実施例３）］
検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレス管に３μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰ、ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
流量：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：リン酸二水素カリウム２．０４ｇを水１５００ｍＬに溶かし、水酸化カリウム試液、８ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後。アセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0312】

【表12】

【0313】

本測定方法により、化合物Ａの保持時間が約１８．１分に確認された．また，ＣＥ化合物の保持時間が約８．５分，ＯＨ化合物の保持時間が約１２．３分，ＭＡ化合物の保持時間が約２２．６分，Ｄｉｍｅｒ化合物の保持時間が約２５．４分，ＣＨＯ化合物の保持時間が約１４．７分に確認された．これにより，化合物Ａを含むいずれの各類縁物質をそれぞれ分離できる測定条件であることを確認した。

【0314】

［実施例４］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析
以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、ＨＰＬＣの測定に用いた化合物Ａの溶液は、実施例１と同様である。

【0315】

［条件（実施例４）］
検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ，長さ１５ｃｍのステンレス管に３μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰ，ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
流量：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：リン酸二水素カリウム２．０４ｇを水１５００ｍＬに溶かし、水酸化カリウム試液，８ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後、アセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0316】

【表13】

【0317】

本測定方法により、化合物Ａの保持時間が約１８．１分に確認された．また，ＣＥ化合物の保持時間が約８．５分，ＯＨ化合物の保持時間が約１２．３分，ＭＡ化合物の保持時間が約２２．６分，Ｄｉｍｅｒ化合物の保持時間が約２５．４分，ＣＨＯ化合物の保持時間が約１４．７分に確認された。これにより，化合物Ａを含むいずれの各類縁物質をそれぞれ分離できる測定条件であることを確認した。
［実施例５］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析
以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、以下に記載のＨＰＬＣの測定条件以外は、実施例４と同様である。

【0318】

［条件（実施例５）］
移動相Ａ： リン酸二水素カリウム２．７２ｇを水１８００ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウム試液，０．２ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後、この液１５００ｍＬにアセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0319】

【表14】

【0320】

本測定方法により、化合物Ａの保持時間が約１９．９分に確認された．また，ＣＥ化合物の保持時間が約８．３分，ＯＨ化合物の保持時間が約１２．２分，ＭＡ化合物の保持時間が約３０．２分，Ｄｉｍｅｒ化合物の保持時間が約３５．１分，ＣＨＯ化合物の保持時間が約１４．９分に確認された。これにより，化合物Ａを含むいずれの各類縁物質をそれぞれ分離できる測定条件であることを確認した。

【0321】

［実施例６］液体クロマトグラフィーによる化合物Ａの分析

【0322】

以下に示した試験条件によりＨＰＬＣの測定を行った。なお、ＨＰＬＣの測定に用いた化合物Ａの溶液は、実施例１と同様である．

【0323】

［条件（実施例６）］
検出器：紫外吸光光度計（波長：２２０ｎｍ）
カラム：内径４．６ｍｍ，長さ１５ｃｍのステンレス管に３μｍの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充填した（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８ＨＰ，ＧＬサイエンス社製）
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
流量：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：リン酸二水素カリウム２．０４ｇを水１５００ｍＬに溶かし、水酸化カリウム試液、８ ｍｏｌ／Ｌを加えてｐＨ６．６に調整した後，アセトニトリル５００ｍＬを加えた。
移動相Ｂ：アセトニトリル
移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。

【0324】

【表15】

【0325】

これにより、化合物Ａの保持時間が約１９．８分に確認された。また，各種類縁物質同士の分離は良好であった．これにより，化合物Ａを含むいずれの各類縁物質をそれぞれ分離できる測定条件であることを確認した。

【0326】

［試験例２］分離度の確認
実施例１のｐＨ６．８の条件下、他の条件は変更せずにｐＨを６．３、６．６、７．０、７．３に変更して、化合物Ｂの挙動を確認した。結果を表１６に示す。

【0327】

【表16】

【0328】

分離度を比較した保持時間の遅い方の化合物欄に，対象ピーク間の分離度を記載した。なお、「−」で記載した箇所は、ＣＥ化合物と化合物Ｂのピークが重なり，分離度が算出されなかった。これにより、仮に化合物Ｂが化合物Ａの原薬又は製剤に含まれていた際には、ｐＨ７．０以外は、化合物Ａを測定するＨＰＬＣ条件として許容されるものであった。

【図1】

【国際調査報告】