特表 2015-500008 ＨＥＣ１活性のモジュレーターに応答性の癌のバイオマーカー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-500008(P2015-500008A)

(43)【公表日】2015年1月5日

(54)【発明の名称】ＨＥＣ１活性のモジュレーターに応答性の癌のバイオマーカー

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20141202BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 31/4439 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20141202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20141202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 31/497 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20141202BHJP

   A61K 31/4745 20060101ALI20141202BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20141202BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12Q1/68 Z

   G01N33/574 A

   A61K31/4439

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   A61K31/497

   A61K31/337

   A61K31/704

   A61K31/4745

   A61P43/00 121

   C12N15/00 A

【審査請求】有

【予備審査請求】有

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2014-543524(P2014-543524)

(86)(22)【出願日】2012年11月19日

(85)【翻訳文提出日】2014年7月17日

(86)【国際出願番号】US2012065923

(87)【国際公開番号】WO2013078145

(87)【国際公開日】20130530

(31)【優先権主張番号】61/562,177

(32)【優先日】2011年11月21日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】514127459

【氏名又は名称】タイヴェックス・セラピューティクス・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＩＶＥＸ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ユ‐リン

(72)【発明者】

【氏名】ラウ，ジョンソン

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024CA09

4B024HA08

4B024HA12

4B024HA14

4B024HA15

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ53

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC201

4C084ZC202

4C084ZC751

4C084ZC752

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA02

4C086BC82

4C086CB22

4C086EA10

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA10

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC75

(57)【要約】

Ｈｅｃ１阻害剤を用いた新生物性疾患の治療に関連するバイオマーカーおよび方法のために企図された組成物および方法に関する。Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）および／またはｐ５３（ＴＰ５３）の遺伝子状態および／または発現レベルは、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する感受性のバイオマーカーとして有用な可能性がある。さらに、Ｈｅｃ１阻害剤は、細胞毒性剤と併用された場合に相乗作用を示すことができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

新生物細胞のＨｅｃ１阻害剤に対する感受性を決定する方法であって、
患者から１の新生物細胞または複数の新生物細胞を含むサンプルを得る工程、
Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの検出可能な複合体を形成する工程であって、ここで、前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つは前記サンプルに由来する工程、
試験結果を得るために前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを決定するために前記検出可能な複合体を使用する工程、および、
前記試験結果を、非新生物細胞の前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを含む前記非新生物細胞の参照結果と比較し、それにより前記Ｈｅｃ１阻害剤に対する前記新生物細胞の感受性を予測する工程、を含む方法。

【請求項2】

Ｈｅｃ１阻害剤を用いた潜在的治療のために新生物性疾患を有する患者を評価する方法であって、
１の新生物細胞または複数の新生物細胞を含む患者サンプルを入手する工程、
Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの検出可能な複合体を形成する工程、
試験結果を得るために前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを決定するために前記検出可能な複合体を使用する工程、
前記試験結果を、非新生物参照細胞の前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを含む前記参照結果と比較し、それにより前記Ｈｅｃ１阻害剤に対する前記新生物細胞の感受性を予測する工程、および
前記患者を、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療を受ける治療群に含める工程、を含む方法。

【請求項3】

前記決定する工程は、Ｈｅｃ１の発現レベルを決定する工程を含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

対応する参照結果と比較して増加した発現レベルは、前記Ｈｅｃ１阻害剤に対する前記新生物細胞の感受性の指標である請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記決定する工程は、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの状態を決定する工程を含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

対応する参照結果と比較して前記Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの変異または欠失型は、前記Ｈｅｃ１阻害剤に対する前記新生物細胞の感受性の指標である請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

前記決定する工程は、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３をコードする核酸の定量を含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

前記決定する工程は、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３をコードする核酸のシークエンシングまたはハイブリダイゼーション、若しくは両方の組み合わせを含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項9】

前記決定する工程は、Ｈｅｃ１タンパク質、Ｒｂタンパク質およびｐ５３タンパク質の定量を含む請求項１または２に記載の方法。

【請求項10】

Ｈｅｃ１阻害剤を用いた潜在的治療のために新生物性疾患を有する患者を評価する方法であって、
患者サンプルから前記新生物性疾患の分子タイプを決定する工程、
Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの検出可能な複合体を形成する工程、
分子タイプについて前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを決定するために前記検出可能な複合体を使用する工程、
それにより評価結果を提供するために前記Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの前記発現レベルおよび状態の内の少なくとも１つを使用する工程、そして、
ここで、対応する参照結果に比較したＨｅｃ１の増加した発現レベルおよび／または対応する参照結果に比較したＲｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの変異型または欠失型の存在は、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた前記新生物性疾患の治療の適合性の予測である方法。

【請求項11】

前記新生物性疾患は、乳癌である請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記新生物性疾患は、肺癌である請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記新生物性疾患は、結腸癌である請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

前記新生物性疾患は、肝臓癌である請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に感受性である新生物細胞を治療する方法であって、前記新生物細胞を、Ｈｅｃ１阻害剤および第２化学療法剤と前記新生物細胞の増殖阻害に関する相乗結果を達成するために有効な用量で接触させる工程を含み、前記Ｈｅｃ１阻害剤は、チアゾール−２−イル−イソニコチンアミド化合物である方法。

【請求項16】

前記Ｈｅｃ１阻害剤は、Ｎ−（４−（４−イソプロポキシ−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１００９５１）、Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１００１）、２−フルオロ−Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１０１５）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルオキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１１００９１）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９５）、およびＮ−（４−（４−（５−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミドならびにそれらの塩の形態からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第２化学療法剤は、タキソール、ドキソルビシンおよびトポテカンからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

多剤耐性またはイマニチブを用いた治療に耐性である新生物細胞を治療する方法であって、前記新生物細胞をＨｅｃ１阻害剤および任意に第２化学療法剤に、前記新生物細胞の増殖阻害を達成するために有効な用量で接触させる工程を含む方法。

【請求項19】

前記Ｈｅｃ１阻害剤は、Ｎ−（４−（４−イソプロポキシ−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１００９５１）、Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１０１００１）、２−フルオロ−Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１０１０１５）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルオキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１１００９１）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１１００９５）、およびＮ−（４−（４−（５−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド並びに塩の形態からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１１年１１月２１日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６１／５６２，１７７号明細書に対する優先権を主張するものである。

【0002】

技術分野
本発明の分野は、分子標的治療薬、および特に細胞毒性剤と組み合わせたＨＥＣ１阻害剤に対する増殖性疾患の感受性を決定するためのバイオマーカーの同定および使用である。

【背景技術】

【0003】

合衆国内では、２０１２年に１６０万例を超える新規の癌診断および約５８万例の癌を原因とする死亡が発生すると予想されている。癌は現在、米国内の死亡の主要原因である心疾患に続いて２番目に多い一般的死因である。過去１０年間、様々な新規の癌療法が開発されてきたが、１９９９年〜２００６年に診断された全ての癌についての５年間相対生存率は６８％であり、肺癌の推定死亡率は男女各々２８％および２６％であり、女性における乳癌の推定死亡率は１５％および前立腺癌の推定死亡率は１１％である。そのような統計結果は、利用できる治療におけるさらなる前進の必要性が極めて高いことを反映している。

【0004】

オーダーメイド医療は、現代医療の試行錯誤の過程に革命的変化を起こし、患者の薬剤に対する応答をより効果的に予測するため、そして疾患の進行を容認する効果のない治療に費やされる時間を減少させるためにバイオマーカプロファイルを利用することによって患者の応答率を向上させてきた。少なくとも所定の場合には、そのようなアプローチは、治療の成功率を上げるために患者の治療レジメンのカスタマイズにおけるバイオマーカーの使用の潜在的利点を際立たせ、より標的化された、したがってより効率的な治療を可能にしてきた。

【0005】

例えば、米臨床腫瘍学会の第４７回年次会議（２０１１年６月）では、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ＣｅｎｔｅｒのＴｓｉｍｂｅｒｉｄｏｕらが１つの遺伝子異常を備える患者１７５例におけるＰＩＫ３ＣＡ、ｍＴＯＲ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ、多標的キナーゼ、ＫＩＴもしくはＥＧＦＲを標的とする治療レジメンで成功した研究を発表した。この試験は、適合した標的化療法を用いた場合の応答率が、適合しない療法を用いて治療された患者の応答率５％に比して２７％であることを示した。オーダーメイド医療において使用するために治療転帰における改善の少なくとも一部の成功をもたらすその他のマーカは、Ｄｕｆｆｙ ａｎｄ Ｃｒｏｗｎによって報告された（非特許文献１（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００８， ５４（１１）：１７７０−１７７９））。本明細書で考察するこれやその他全ての資料は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される。援用される参考文献における用語の定義もしくは使用が本明細書に提供したその用語の定義と矛盾する場合、または反対である場合、本明細書に提供したその用語の定義が適用され、参考文献内のその用語の定義は適用されない。

【0006】

不完全な染色体分離および無制御の有糸分裂増殖は、新生物性疾患の顕著な特徴である。しかし、利用可能な癌マーカーは増加しているにもかかわらず、紡錘体および動原体の調節もしくは有糸分裂チェックポイントの制御を標的とする薬剤に対する感受性を示すマーカーは依然として欠乏している。例えばＨｅｃ１は、癌において高度に発現し、細胞分裂中の正確な染色体分離を保証する紡錘体チェックポイントシグナル伝達における極めて重要な成分である。近年、数種の強力であり得るＨｅｃ１阻害剤が報告されている（例えば、特許文献１（Ｌａｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇの国際公開第２０１１／１１５９９８号パンフレット）、非特許文献２（Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｊ， Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２００９， ５２（６）：１７５７−１７６７）、非特許文献３（Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２００８ Ｏｃｔ １５， ６８（２０）：８３９３−９）を参照）。少なくとも一部の化合物は前途有望な結果を証明してきたが、そのような化合物を用いた治療成功の増加を示すであろういずれかのバイオマーカーに関する指針は存在しない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２０１１／１１５９９８号パンフレット

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】非特許文献１：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００８， ５４（１１）：１７７０−１７７９

【非特許文献2】Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｊ， Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２００９， ５２（６）：１７５７−１７６７

【非特許文献3】Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２００８ Ｏｃｔ １５， ６８（２０）：８３９３−９

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

そこで、Ｈｅｃ１活性のモジュレーターに応答性の癌のバイオマーカーが依然必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

発明の概要
本発明の主題は、新生物性疾患の治療に関連するバイオマーカーおよび方法に関し、前記疾患は、Ｈｅｃ１阻害剤を用いて治療される。より詳細には、本発明者らは今では、様々な疾患状態を治療するための予測バイオマーカーとしてＨｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）および／またはｐ５３（ＴＰ５３）の状態および／または発現レベルを使用できることを見いだしているが、ここで、前記疾患はＨｅｃ１阻害剤を用いて治療され、前記状態は野生型対変異型の遺伝子型および／または欠損性および／または不在性遺伝子発現に関する。

【0011】

このため、本発明の主題の一実施形態では、バイオマーカープロファイルの同定は、増殖性疾患、例えば癌のＨｅｃ１阻害剤またはさもなければＨｅｃ１を標的とする化合物に対する感受性を決定するために使用される。このため、被験者における増殖性疾患および／または新生物性細胞のＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する感受性を決定する方法であって、前記被験者由来のサンプル中でのＨｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）およびｐ５３（ＴＰ５３）の内の１つ以上の状態および／または発現レベルを決定する工程を含む方法が企図されている。そのような決定は、試験結果を提供する検出可能な複合体を形成する工程を含むことができる。一部の実施形態では、前記試験結果は、Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）およびｐ５３（ＴＰ５３）の内の１つ以上の状態および／または発現レベルに関連する参照結果と比較することができる。

【0012】

本発明の概念のまた別の実施形態では、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療のために増殖性もしくは新生物性疾患に罹患している被験者を選択する、および／または患者を評価する方法であって、前記被験者由来のサンプル中でのＨｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）およびｐ５３（ＴＰ５３）の内の１つ以上の状態および／または発現レベルを決定する工程を含む方法が企図されている。そのような決定は、検出可能な複合体を形成する工程を含むことができ、試験結果を提供できる。一部の実施形態では、前記試験結果は、感受性を決定するために、参照細胞から得られたＨｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）およびｐ５３（ＴＰ５３）の内の１つ以上の状態および／または発現レベルに関連する参照結果と比較することができる。そのような感受性を使用して、評価もしくは選択結果を提供できる。

【0013】

本発明の概念の一部の実施形態では、Ｈｅｃ１の発現レベルを決定できる。そのような実施形態では、発現レベルの増加は、Ｈｅｃ１阻害剤に対する新生物性もしくは増殖性細胞の感受性を示すことがある。本発明の概念の他の実施形態では、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの状態を決定できる。そのような実施形態では、Ｒｂおよび／またはｐ５３の欠失、または変異Ｒｂおよび／またはｐ５３の存在がＨｅｃ１阻害剤に対する新生物性もしくは増殖性細胞の感受性を示す場合がある。Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３の状態および／または発現は、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３をコードする核酸の定量によって、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３をコードする核酸のシーケンシングによって、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３をコードする核酸のハイブリダイゼーションによって、またはこれらの組み合わせによって特徴付けることができる。若しくは、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３の状態および／または発現は、Ｈｅｃ１タンパク質、Ｒｂタンパク質およびｐ５３タンパク質の定量および／または配列特性解析によって特徴付けることができる。本発明の概念の一部の実施形態では、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３に関連する核酸およびタンパク質の両方を特徴付けることができる。

【0014】

本発明の主題のさらにまた別の実施形態では、新生物性疾患に罹患している患者をＨｅｃ１阻害剤で治療するための方法であって、前記被験者に由来するサンプルから前記新生物性疾患の分子タイプを決定する工程、および前記分子タイプについてＨｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３の内の少なくとも１つの発現レベルを決定する工程を含む方法が企図されている。そのような決定は、検出可能な複合体を形成する工程を含むことができ、評価結果を提供できる。そのような実施形態では、対応する参照値もしくは結果に比較したＨｅｃ１発現レベルの増加および／または、Ｒｂおよび／またはｐ５３の欠失もしくは変異型の存在を、患者の新生物性疾患のＨｅｃ１阻害剤との適合性の指標とすることができる。そのような実施形態の新生物性疾患には、乳癌、肺癌、結腸癌および肝臓癌が含まれるがそれらに限定されない。

【0015】

本発明の主題のまた別の実施形態は、Ｈｅｃ１阻害剤に感受性である新生物細胞を治療するための方法であって、前記新生物細胞をＨｅｃ１阻害剤および第２化学療法剤／細胞毒性剤と接触させる工程による方法である。そのような方法は、そのような新生物細胞の増殖阻害への相乗作用的結果を達成するのに有効な用量を利用することができる。適切なＨｅｃ１阻害剤には、Ｎ−（４−（４−イソプロポキシ−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１００９５１）、Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１００１）、２−フルオロ−Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１０１５）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルオキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１１００９１）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９５）、およびＮ−（４−（４−（５−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミドが含まれるがそれらに限定されない。そのようなＨｅｃ１阻害剤は、遊離塩基の形態または塩の形態にあってよい。そのような実施形態は、細胞毒性剤および／または化学療法剤、例えばタキソール、ドキソルビシンおよびトポテカンを利用でき、任意の適切な細胞毒性剤および／または化学療法剤の使用が企図されている。

【0016】

本発明の主題のさらにまた別の実施形態は、多剤耐性（もしくはイマニチブ治療に対する耐性）である新生物細胞を治療するための方法であって、前記新生物細胞をＨｅｃ１阻害剤と増殖阻害を達成するために有効な用量で接触させる工程による方法である。本発明の概念の一部の実施形態では、Ｈｅｃ１阻害剤は、第２化学療法剤または細胞毒性剤と組み合わせて使用できる。適切なＨｅｃ１阻害剤には、Ｎ−（４−（４−イソプロポキシ−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１００９５１）、Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１００１）、２−フルオロ−Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１０１５）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルオキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（Ｈｅｃ１１００９１）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９５）、およびＮ−（４−（４−（５−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミドが含まれるがそれらに限定されない。そのようなＨｅｃ１阻害剤は、遊離塩基の形態または塩の形態にあってよい。そのような実施形態は、細胞毒性剤および／または化学療法剤、例えばタキソール、ドキソルビシンおよびトポテカンを利用でき、任意の適切な細胞毒性剤および／または化学療法剤の使用が企図されている。

【0017】

本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、その中で同様の数字が同様の成分を表す添付の図面とともに、好ましい実施形態についての下記の説明からより明白になるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】Ｈｅｃ１阻害性化合物のＧＩ５０とＨｅｃ１発現との関係を示す図である。図１Ａは、非同期的に維持した細胞系由来の全タンパク質中のＨｅｃ１タンパク質の発現レベルを示している。Ｈｅｃ１タンパク質の発現レベルを定量し、ＨｅＬａの発現レベルと比較して％で表示し、Ｈｅｃ１阻害剤に対して高感受性（ＧＩ５０＜５０ｎＭ）、中感受性（５０ｎｍ＜ＧＩ５０＜１００ｎｍ）、低感受性（１００ｎｍ＜ＧＩ５０＜１μＭ）または耐性（ＧＩ５０＞１０μＭ）であると分類した。

【図1B】Ｈｅｃ１阻害性化合物のＧＩ５０とＨｅｃ１発現との関係を示す図である。図１Ｂは、全ＲＮＡ中のＨｅｃ１ ＲＮＡ発現レベルを示している。Ｈｅｃ１ ＲＮＡ発現を定量し、ＨｅＬａの発現レベルに比較して％で表示し、相関のためにタンパク質発現と対照してグラフ表示した。

【図1C】Ｈｅｃ１阻害性化合物のＧＩ５０とＨｅｃ１発現との関係を示す図である。図１Ｃは、様々なＨｅｃ１阻害剤に対する応答において感受性（ＧＩ５０＜３００μＭ）もしくは耐性（ＧＩ５０＞３００μＭ）であると分類した癌細胞系におけるＨｅｃ１タンパク質の発現についての集積データを示している。

【図1D】Ｈｅｃ１阻害性化合物のＧＩ５０とＨｅｃ１発現との関係を示す図である。図１Ｄ−１および図１Ｄ−２は、Ｈｅｃ１タンパク質の発現レベルに対してプロットした４種のＨｅｃ１化合物アナログ（１００９５１、１０１００１、１０１０１５および１１００９５）を利用した細胞系スクリーニングアッセイから収集したＧＩ５０のｌｏｇ１０を示している。有意性は、両側Ｔ検定で決定した（試験した全薬剤についてのＰ値は、４．３×１０^−１７であった）。

【図1E】Ｈｅｃ１阻害性化合物のＧＩ５０とＨｅｃ１発現との関係を示す図である。図１Ｅは、全ＲＮＡに比したＨｅｃ１ ＲＮＡ発現レベル（％）と全タンパク質に比したＨｅｃ１タンパク質の発現レベル（％）との相関を示している。

【図2A】様々な癌細胞系ならびにヒト患者サンプル由来の肺癌および乳癌のサブタイプにおけるＨｅｃ１発現を示す図である。図２Ａおよび図２Ｂは、発現強度の対数として表示したヒト肺癌腫瘍についてのＧＥＯデータベースＧＳＥ８８９４およびＧＳＥ１４８１４各々から入手したＨｅｃ１（ＮＤＣ８０）発現データを示している。結果は、扁平上皮細胞癌における高度のＨｅｃ１発現を示している。

【図2B】様々な癌細胞系ならびにヒト患者サンプル由来の肺癌および乳癌のサブタイプにおけるＨｅｃ１発現を示す図である。図２Ａおよび図２Ｂは、発現強度の対数として表示したヒト肺癌腫瘍についてのＧＥＯデータベースＧＳＥ８８９４およびＧＳＥ１４８１４各々から入手したＨｅｃ１（ＮＤＣ８０）発現データを示している。結果は、扁平上皮細胞癌における高度のＨｅｃ１発現を示している。

【図2C】様々な癌細胞系ならびにヒト患者サンプル由来の肺癌および乳癌のサブタイプにおけるＨｅｃ１発現を示す図である。図２Ｃは、発現強度の対数として表示した乳癌腫瘍サンプルについてのＧＥＯデータベースＧＳＥ２０６８５から得られたＨｅｃ１（ＮＤＣ８０）発現データを示している。結果は、Ｉ型における高度のＨｅｃ１発現を示している。

【図3A】ＲｂのｓｉＲＮＡノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物に対する癌細胞感受性に及ぼす作用を示している。図３Ａは、コントロールｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ標的化Ｒｂ（ｓｉＲｂ）のいずれかを用いてトランスフェクトした野生型Ｒｂ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のトランスフェクションによるノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物１０１００１に対する（ＧＩ５０に関する）感受性に及ぼす作用を示している。トランスフェクト細胞におけるＲｂ ＲＮＡ発現も示されている。

【図3B】ＲｂのｓｉＲＮＡノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物に対する癌細胞感受性に及ぼす作用を示している。図３Ｂは、非薬剤処理細胞に比較した増殖阻害率として表示した、Ｒｂに向けた２つのＳｉＲＮＡの１つを用いてトランスフェクトし、図３Ａにおけるように処理した野生型Ｒｂ（２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｋ５６２、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６）または変異Ｒｂ（ＨｅＬａ）を備える選択された細胞系の細胞感受性を示している。Ｒｂに対して試験したトランスフェクト細胞由来の細胞溶解物の免疫ブロットは、対応する阻害グラフの下方に示した。

【図4A】ｐ５３のｓｉＲＮＡノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物に対する癌細胞感受性に及ぼす作用を示している。図４Ａは、コントロールｓｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ標的化ｐ５３（ｓｉｐ５３）のいずれかを用いてトランスフェクトした野生型ｐ５３細胞（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６）のトランスフェクションによるノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物１０１００１に対する（ＧＩ５０に関する）感受性に及ぼす作用を示している。細胞感受性は、ＧＩ５０（ｎＭ）で表示した。トランスフェクト細胞由来のｐ５３ ＲＮＡの発現も示した。

【図4B】ｐ５３のｓｉＲＮＡノックダウンがＨｅｃ１阻害性化合物に対する癌細胞感受性に及ぼす作用を示している。図４Ｂは、非薬剤処理細胞に比較した増殖阻害率として表示した、ｐ５３に向けた２つの相違するＳｉＲＮＡの１つを用いてトランスフェクトし、図４Ａにおけるように処理した野生型ｐ５３（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＺＲ−７５−１、Ｕ２ＯＳ）もしくは変異変異ｐ５３（ＨｅＬａ）を備える選択された細胞系の細胞感受性を示している。ｐ５３に対して試験したトランスフェクト細胞由来の細胞溶解物の免疫ブロットは、対応する阻害グラフの下方に示した。

【図5A】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）の間のＨｅｃ１阻害剤によるｐ７３のリン酸化の誘導、アポトーシスマーカーの活性化および抗アポトーシスマーカーのダウンレギュレーションにおける差を示す図である。コントロールとしてアクチンも示した。図５Ａは、Ｈｅｃ１阻害性化合物（２００ｎＭ）が様々な時点に選択したＨｅｃ１阻害性化合物を２００ｎＭ用いて処理した薬剤応答性ＨｅＬａ細胞および非薬剤応答性Ａ５４９細胞におけるリン酸化ｐ７３（Ｐ−ｐ７３）発現に及ぼす作用を示している免疫ブロットを示す図である。

【図5B】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）の間のＨｅｃ１阻害剤によるｐ７３のリン酸化の誘導、アポトーシスマーカーの活性化および抗アポトーシスマーカーのダウンレギュレーションにおける差を示す図である。コントロールとしてアクチンも示した。図５Ｂは、Ｈｅｃ１阻害性化合物（１μＭ）が薬剤応答性ＨｅＬａ細胞におけるアポトーシスマーカーであるカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよび抗アポトーシスマーカーであるＭｃｌ−１、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２の発現に及ぼす作用を示す免疫ブロットを示している。

【図5C】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）の間のＨｅｃ１阻害剤によるｐ７３のリン酸化の誘導、アポトーシスマーカーの活性化および抗アポトーシスマーカーのダウンレギュレーションにおける差を示す図である。コントロールとしてアクチンも示した。図５Ｃは、選択的Ｈｅｃ１阻害性化合物およびタキソールが非薬剤応答性Ａ５４９細胞におけるアポトーシスマーカーであるカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよび抗アポトーシスマーカーであるＭｃｌ−１、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２の発現に及ぼす作用を示す免疫ブロットを示している。

【図5D】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）の間のＨｅｃ１阻害剤によるｐ７３のリン酸化の誘導、アポトーシスマーカーの活性化および抗アポトーシスマーカーのダウンレギュレーションにおける差を示す図である。コントロールとしてアクチンも示した。図５Ｄは、Ｈｅｃ１阻害性化合物１０１００１が薬剤応答性ＨｅＬａ細胞および非薬剤応答性Ａ５４９細胞におけるアポトーシスマーカーであるカスパーゼ３、ＰＡＲＰおよび抗アポトーシスマーカーであるＭｃｌ−１、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−２の発現に及ぼす作用を示す免疫ブロットを示している。

【図6A】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）におけるＨｅｃ１阻害剤によるＨｅｃ１およびＮｅｋ２タンパク質発現の示差的細胞周期調節およびＮｅｋ２タンパク質の示差的ダウンレギュレーションを示す図である。図６Ａは、様々な時点における同期化薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＴ１１６）および非薬剤応答性細胞（Ａ５４９）由来のＨｅｃ１およびＮｅｋ２の免疫ブロットを示している。ローディングコントロールとしてアクチンを含めた。

【図6B】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）におけるＨｅｃ１阻害剤によるＨｅｃ１およびＮｅｋ２タンパク質発現の示差的細胞周期調節およびＮｅｋ２タンパク質の示差的ダウンレギュレーションを示す図である。図６Ｂは、ＤＭＳＯコントロールおよび様々な濃度でＨｅｃ１阻害性化合物を用いて処理した薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６）および非薬剤応答性細胞（Ａ５４９）由来のＮｅｋ２の免疫ブロットを示している。

【図6C】薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＜１０μＭ）および非薬剤応答性細胞（ＧＩ５０＞１０μＭ）におけるＨｅｃ１阻害剤によるＨｅｃ１およびＮｅｋ２タンパク質発現の示差的細胞周期調節およびＮｅｋ２タンパク質の示差的ダウンレギュレーションを示す図である。図６Ｃは、様々な期間にわたってＤＭＳＯコントロールまたはＨｅｃ１阻害性化合物のいずれかを用いて処理したＨｅＬａ細胞についてのサイクリンＢ１およびサイクリンＤ１の免疫ブロットを示している。ローディングコントロールとしてアクチンを含めた。

【発明を実施するための最良の形態】

【0019】

図面に規定した実施形態は例示的なものであり、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定することは企図されていない。さらに、図面および本発明の個々の特徴は、下記の詳細な説明に照らせばより明白になる。

【0020】

詳細な説明
Ｈｅｃ１／Ｎｅｋ２経路を選択的および／または特異的に標的とすることができる低分子に関する最近の発見に基づいて、本発明者らは、ヒトの様々な癌において過剰発現する動原体成分であるＨｅｃ１を標的とする様々な改良されたＨｅｃ１阻害剤を開発してきた。これらの化合物に導かれて、本発明者らは、癌細胞におけるＨｅｃ１阻害剤薬剤感受性においてＨｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３が果たす役割を調査した。

【0021】

細胞は規則正しい細胞周期調節に依存して、有糸分裂の最初から終わりまで適正に機能する。癌細胞において観察される無秩序な有糸分裂過程は、例えば異常紡錘体形成および染色体分離などの過程を含んでいる。Ｈｅｃ１は、急速に分裂する細胞内で最も豊富に発現するが、最終的に分化した細胞内では発現しない。Ｈｅｃ１は、脳腫瘍、肝臓癌、乳癌および肺腫瘍細胞内ではゲノム規模のプロファイルでアップレギュレートされ、子宮頸癌、結腸直腸癌、乳癌および肺癌細胞系ならびに結腸直腸癌および胃癌組織内では過剰発現することが証明されている。そこで急速に分化した細胞、形質転換細胞系および癌性組織内でのＨｅｃ１の示差的発現は、Ｈｅｃ１がヒトの癌の標的化療法における優れた候補薬である可能性を示唆している。同様に、癌療法の標的としてのＨｅｃ１の可能性は、Ｈｅｃ１発現とＩＣ５０とを相関付ける統計的分析によって支持することができる。

【0022】

Ｈｅｃ１は、細胞周期のＧ２−Ｍ期において重要な役割を果たす網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）と関連している。より詳細には、Ｇ２−Ｍ期には、Ｒｂは動原体機能に不可欠であることが証明されたタンパク質であるタンパク質ホスファターゼ１αと相互作用する。細胞周期のＧ１−Ｓ期におけるＲｂのリン酸化は、Ｇ２−Ｍ期におけるサイクリンの誘導および分解により調整される。Ｒｂはさらに、染色体分離を直接的に調節し、Ｇ２−Ｍ期にＨｅｃ１と相互作用する。機能的Ｒｂが欠乏する細胞は、有糸分裂を適正に完了することができず、そのような細胞の有糸分裂は高倍数性を生じさせる。これらの関係は、ＲｂがＨｅｃ１と関係する有糸分裂段階において役割を有する可能性があることを示唆している。

【0023】

Ｐ５３は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質および細胞代謝産物との特異的で複雑な相互作用に関係する様々な構造ドメインを含む多機能タンパク質である。ｐ５３遺伝子は、癌においては変異することが多く、主としてミスセンス変異を伴い、結果として単一アミノ酸残基置換を生じさせる。そのような変異ｐ５３タンパク質は、様々な構造グループに分類されている。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン内で発生する「ホットスポット」変異を備えるｐ５３タンパク質は、ＤＮＡ接触変異体もしくは立体配座変異体であると特徴付けることができる。変異ｐ５３は、腫瘍進行（進行性および遠隔性転移を含む）を通して高度に発現することが多いが、これは機能獲得（ＧＯＦ）特性を有する可能性を暗示している。そのようなＧＯＦ特性により、変異ｐ５３が野生型ｐ５３と相互作用するクロマチン部位とは異なるクロマチン上の部位と、例えば多剤耐性１遺伝子もしくはカスパーゼ３などの遺伝子を各々アップレギュレートもしくは抑制できる様々な転写因子との相互作用が可能となる。野生型ｐ５３の不活性化は、シスプラチン、カルボプラチンおよびタキソールを含む複数の化学療法剤に対する感受性を強化することも証明されている。

【0024】

上記の考察および他の要素に基づいて、本発明者らは、現在、Ｈｅｃ１阻害剤に対する細胞の感受性をＨｅｃ１（ＨＥＣ）、Ｒｂ（ＲＢ１）および／またはｐ５３（ＴＰ５３）の状態および／または発現レベルによって正確に確実に予測できることを見いだした。これにより有益にも、Ｈｅｃ１阻害剤療法で効果のある癌患者の早期の同定が可能であり、ひいてはまだ初期段階にある間に前記患者らの疾患のより効果的な治療を導くことができる。

【0025】

より詳細には、本発明者らは、Ｈｅｃ１発現レベルがＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する新生物細胞の感受性と正に相関すること、およびＲｂおよび／またはｐ５３の欠失、異常調節または機能不全もＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する新生物細胞の感受性と正に相関することを見いだした。このため、当然のことながら、そのような相関が新生物細胞および組織に対するＨｅｃ１阻害剤を用いた治療の成功だけではなく、所定の癌のタイプがＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に対して優先的感受性である、または耐性であるとの予測を可能にする。

【0026】

例えば、以下でより詳細に示すように、Ｈｅｃ１の相当に高発現を備える所定の新生物細胞系および新生物細胞（例えば、Ｈｅｐ３Ｂ／肝細胞癌、ＨｅＬａ／子宮頸癌、Ｔ４７Ｄ／転移性、胸膜性、浸潤性、腺管癌）は、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に対して高度に感受性であるが、実質的にＨｅｃ１発現が低い、または全く示さない他の細胞系（例えば、ＭＯＬＴ−４／急性リンパ芽球性白血病、Ｎ８７／胃癌）は、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に対して有意に低感受性（または耐性）である可能性がある。

【0027】

そのような示差的感受性は、癌の単一のタイプもしくはカテゴリーの分類および／または治療においても有用であり得る。例えば、乳癌の分子サブタイプは、Ｉ〜ＶＩ型に分類されるが、ＩおよびＩＶ型だけが有意なレベルのＨｅｃ１発現を示すので、Ｈｅｃ１阻害剤治療に感受性である可能性が高い。同様に、患者における癌の特定のタイプもしくはカテゴリーの同定は、Ｈｅｃ１阻害剤に対する可能性の高い感受性を示すことができ、治療を最適化するために利用できる。

【0028】

そこで、本発明の概念の一実施形態は、増殖性疾患に罹患している被験者をＨｅｃ１阻害剤を用いた（場合により細胞毒性剤を併用して）治療のために選択する方法であって、そのような選択はＨｅｃ１発現および／または状態の事前の決定に基づく方法である。本発明の主題の１つの特に好ましい態様では、Ｈｅｃ１の発現および／または状態は、野生型Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）遺伝子の発現レベルの定量、変異Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）遺伝子の存在、またはＨｅｃ１（ＨＥＣ）遺伝子の非存在、（健常コントロールに比較した）欠損または欠失の決定によって決定される。同様に当然のことながら、そのような定量は、被験者から得られたサンプル中のＨｅｃ１の発現および／または翻訳後修飾のレベルの決定をさらに含んでよい。例えば、そのような決定は、被験者における野生型Ｈｅｃ１の発現レベルを決定する工程およびそれを健常コントロール被験者における野生型Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）遺伝子の発現レベルと比較する工程によって実施することができる。代替的に、または追加的に、コントロール被験者が特定の療法、最も典型的にはＨｅｃ１阻害剤を用いた療法に応答性である腫瘍応答性または非応答性を表してもよい。コントロールが前記療法に応答性の腫瘍を表す場合、前記個人における前記コントロールに比較して高い野生型Ｈｅｃ１（ＨＥＣ）遺伝子の発現は、前記療法に対する応答性が高いと予測できる。これとは反対に、コントロールが前記療法に耐性の腫瘍を表す場合、前記個人における前記コントロールに比較して低レベルのＨｅｃ１の発現は、前記療法に対する耐性が高いと予測できる。

【0029】

本発明の主題のまた別の実施形態では（および特に、必ずではないが、コントロールに比較してＨｅｃ１（ＨＥＣ）発現レベルが高い被験者においては）、患者がＨｅｃ１阻害剤を用いた治療のために選択される方法であって、前記患者がＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に適合する増殖性疾患に罹患しており、そのような患者の選択が（少なくとも一部には）Ｒｂ状態を特徴付ける、または決定することに依存する方法が企図されている。Ｒｂ状態は、前記被験者由来のサンプル中での野生型Ｒｂ（ＲＢ１）遺伝子の存在、変異Ｒｂ（ＲＢ１）遺伝子の存在、Ｒｂ（ＲＢ１）遺伝子の非存在、欠損もしくは欠失、および／またはＲｂの発現および／または翻訳後修飾のレベルを決定する工程によって特徴付けることができる。上述のように当然のことながら、Ｒｂの発現の減少もしくは欠乏、またはＲｂ（ＲＢ１）の異常調節および／または機能不全を有することは、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する新生物細胞の応答性の指標となる可能性がある。そこで、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療の患者集団は、不十分な／変異した／欠失したＲｂ（ＲＢ１）状態を示す患者に基づいて選択できる。

【0030】

同様に、およびさらに本発明の概念のまた別の実施形態では、（場合により細胞毒性剤を併用する）Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療のために増殖性疾患を罹患している被験者を選択する方法であって、前記被験者における増殖性疾患のＨｅｃ１阻害剤を用いた治療に対する感受性を決定する工程であって、前記感受性がｐ５３状態を特徴付ける、または決定することによって決定される工程を含む方法が企図されている。例えば、そのような方法は、前記被験者由来のサンプル中における野生型ｐ５３（ＴＰ５３）遺伝子、変異ｐ５３（ＴＰ５３）遺伝子の同定および／または定量、またはｐ５３（ＴＰ５３）遺伝子の非存在、欠損もしくは欠失および／またはｐ５３の発現および／または翻訳後修飾のレベルによりｐ５３状態を決定する工程を含むことができる。そこで、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療の患者集団は、不十分な／変異した／欠失したｐ５３（ＴＰ５３）状態を示す患者に基づいて選択できる。

【0031】

当然のことながら、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３遺伝子の状態および発現は、個別指標としての有用性を超えて、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療の患者集団を選択するための基礎として組み合わせて使用できる。例えば、Ｈｅｃ１遺伝子型、Ｈｅｃ１発現、Ｒｂ遺伝子型、Ｒｂ発現、ｐ５３遺伝子型および／またはｐ５３発現は、Ｈｅｃ１阻害性化合物に対する新生物性疾患もしくは細胞系の感受性の指標として個別に、または組み合わせて利用できる。

【0032】

当然のことながら、遺伝子および遺伝子産物、例えば、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよびｐ５３に関連する遺伝子および遺伝子産物の検出、定量および／または特性解析は、遺伝子もしくは遺伝子産物の標識化もしくはタグ付けおよび／または検出可能複合体の形成を含むことができる。そのような標識化は、直接的もしくは間接的であってよい。例えば、遺伝子もしくは遺伝子産物（例えば、ＲＮＡもしくはタンパク質）は、例えば、検出可能複合体を形成すると特徴付け可能な前記遺伝子および遺伝子産物に検出可能成分を付着させることによってそれを検出可能にするようその組成を修飾することによって直接的に標識化できる。同様に、遺伝子もしくは遺伝子産物は、検出可能複合体を形成する検出可能成分を有する結合パートナー（例えば、相補的核酸配列、相補的核酸アナログ配列、アプタマーもしくは抗体）と相互作用させることによって間接的に標識化できる。または、遺伝子もしくは遺伝子産物（例えば、患者サンプル由来）は、検出可能成分を有する遺伝子アナログもしくは結合パートナー（例えば、相補的核酸配列、相補的核酸アナログ配列、アプタマーもしくは抗体）由来の検出可能成分を有する遺伝子産物アナログをディスプレイさせる、およびそれにより検出可能複合体の形成を調節する能力によって標識することができる。適切な検出可能成分には、蛍光分子、燐光分子、発光分子、酵素、金属、ビオチンおよび／またはビオチンアナログ、量子ドット、微粒子、放射性核種、核酸および／または核酸アナログ、同位体質量標識、スピン標識、正もしくは負の電荷またはこれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。

【0033】

なお、これに関連して、Ｈｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３核酸およびタンパク質産物の遺伝子型の決定および定量の公知の方法は全て、本明細書で使用するのに適切であると見なされる。特に適切な方法には、ＤＮＡシーケンシング、コピー数の決定、ハプロタイプの決定、ＲＮＡシーケンシング、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サザンおよび／またはノーザンハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、液相ハイブリダイゼーション／定量、アンペロメトリックおよび／または蛍光定量、免疫測定、および／または遺伝子および／または遺伝子産物を特徴付けるために適合する任意の方法が含まれる（がそれらに限定されない）。代替的に、または追加的に、細胞学的もしくは組織病理学的分析がＨｅｃ１、Ｒｂおよび／またはｐ５３の特定状態の指標である場合、別個の定量的分析を完全に除くことができる。

【0034】

Ｈｅｃ１阻害剤を用いた治療に関して、全ての公知のＨｅｃ１阻害剤が本明細書で使用するのに適合し、および好ましいＨｅｃ１阻害剤には国際公開第２０１１／１１５９９８号パンフレットおよび同時係属の米国仮特許出願第６４／５６４，７７３号明細書に記載されたＨｅｃ１阻害剤が含まれる。このため、および特に他の企図された化合物のうち、特に好ましいＨｅｃ１阻害剤には、Ｎ−（４−（４−イソプロポキシ−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１００９５１）、Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１００１）、２−フルオロ−Ｎ−（４−（４−（４−メトキシフェノキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１０１０１５）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルオキシ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９１）、Ｎ−（４−（４−（５−（２−メトキシエトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９５）、およびＮ−（４−（４−（５−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）ピラジン−２−イルチオ）−２，６−ジメチルフェニル）チアゾール−２−イル）イソニコチンアミド（１１００９６）が含まれる。

【0035】

さらに、前記Ｈｅｃ１阻害剤は、１つ以上の細胞毒性剤と、例えば抗新生物性代謝産物、トポイソメラーゼＩもしくはＩＩ阻害剤および／または微小管活性剤と共投与できると企図されている。そのような公知の作用物質は全て、本明細書で使用するのに適合すると見なされる。そのような作用物質の用量に関連して、そのような作用物質は、現在公知の用量で、またはそのような公知の用量よりいくらか低い用量で投与することができる。

【0036】

驚くべきことに、企図されたＨｅｃ１阻害剤が１つ以上の細胞毒性剤と共投与された場合、以下でより詳細に記載するように、選択された化合物との相乗活性が観察される。極めて有益には、相乗性応答は、Ｈｅｃ１阻害剤とタキソール、ドキソルビシンおよびトポテカンとの併用で見られる。本発明の主題に限定しなくても、相乗作用は細胞および／または組織中において観察することができ、このとき前記細胞および／または組織は１００ｎＭ以下の濃度でＨｅｃ１阻害剤に対して感受性であることが企図されている（表９〜表１１）。

【0037】

同等に注目すべき、企図されたＨｅｃ１阻害剤は、薬剤耐性であると考えられる様々な細胞系に対して有意な活性も示すので、さもなければ難治性の細胞および組織を治療するための追加の論拠を提供する（表８）。さらに、本発明者らは、本明細書で企図されたＨｅｃ１阻害剤が応答性細胞においては活性を示してアポトーシス応答を誘発し（ＧＩ５０＜１μＭ）、非応答性細胞においてはアポトーシス応答の誘導を誘発しない（ＧＩ５０＞１μＭ）ことも観察した（図５）。

【実施例】

【0038】

材料および方法
細胞培養：
Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、Ｋ５６２、ＨＣＴ１１６癌細胞系は、Ｄｒ． Ｙ．Ｓ． Ｌｅｅ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、台湾国新台北市）より提供された。Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５−１細胞系は、ＢＣＲＣ（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、台湾国）から入手した。細胞系は、最初は推奨された培地中で維持し、５％ＣＯ_２を含有する３７℃の空気中で１０％ウシ胎仔血清、低グルコース（１ｇ／Ｌ）ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培地を含有する培地中で維持するように適応させた。

【0039】

薬剤感受性：
細胞系は、１０％のＦＢＳとともに低グルコースＤＭＥを含有する９６ウエルプレート内に適切な播種数で播種した２４時間後に、規定薬を用いた処理によって薬剤感受性についてスクリーニングした。この薬剤をプレートの３連ウエルで加え、細胞を薬剤処理培地中で９６時間にわたりインキュベートし、その後細胞生存性をＭＴＳアッセイによってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州５３７１１、マディソン）を用いて決定した。ＭＴＳアッセイは、製造業者の取扱説明書にしたがって実施した。光学密度は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ３４０分光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社、バーモント州０５４０４、ウィヌースキ）を用いて測定し、次に光学示度をＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、ワシントン州９８０５２−７３２９、レドモンド）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５線形回帰ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州９２０３７、ラ・ホーヤ）で処理して濃度反応曲線を決定し、相対ＧＩ５０を計算した。ＧＩ５０値は、５０％の増殖阻害を誘発する濃度を意味する。細胞上での試験薬の増殖阻害率（％）は、［１−（試験値）／（コントロール値）］×１００で計算した。これらの数値を使用して濃度反応曲線をプロットし、次に線形回帰ソフトウエアを用いて分析した。

【0040】

相乗作用：
選択した薬剤についてのＧＩ５０を決定し、それを用いてＨｅｃ１阻害剤を用いた相乗作用アッセイに使用するための濃度比を計算した。細胞は、１０％のＦＢＳとともに低グルコースＤＭＥを含有する９６ウエルプレート内に適切な播種数で播種した２４時間後、薬剤を用いて処理した。Ｈｅｃ１阻害剤および選択薬をプレートに３連ウエルで、決定したＧＩ５０濃度比で加え、細胞を薬剤処理培地内で９６時間にわたりインキュベートし、その後に細胞生存性を決定した。細胞生存性は、ＭＴＳアッセイによってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水性非放射性細胞増殖アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国ウィスコンシン州５３７１１、マディソン）を使用して製造業者の取扱説明書にしたがい実施した。光学密度は、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ３４０分光光度計（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ社、バーモント州０５４０４、ウィヌースキ）を用いて測定し、次にＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、ワシントン州９８０５２−７３２９、レドモンド）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５線形回帰ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州９２０３７、ラ・ホーヤ）で処理して濃度反応曲線を決定し、相対ＧＩ５０を計算した。相乗作用は、式ＣＩ（組み合わせ指数）＝（ＣＡ、Ｘ／ＩＣｘ、Ａ）＋（ＣＢ、Ｘ／ＩＣｘ、Ｂ）（式中、ＣＡ、ＸおよびＣＢ、Ｘはｘ％の薬剤作用を達成するために組み合わせて使用された薬剤Ａおよび薬剤Ｂの濃度である）を用いて組み合わせ指数値を計算し決定した。ＩＣｘ、ＡおよびＩＣｘ，Ｂは、単一作用物質が同一作用を達成するための濃度である。

【0041】

遺伝子サイレンシング：
細胞は適切な細胞数で９６ウエルプレートのウエル内にプレーティングし、ｓｉＰｏｒｔ ＮｅｏＦｘトランスフェクション法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州９２００８、カールズバッド）によって製造業者の取扱説明書にしたがいトランスフェクトし、２４時間維持し、薬剤を用いて処理した。細胞は４８時間にわたり薬剤処理培地中でインキュベートし、ＭＴＳアッセイによって分析した。コントロールｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州９２００８、カールズバッド、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国マサチューセッツ州デンバー；およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州９５０６０、サンタクルーズ）、Ｒｂ ｓｉＲＮＡ（＃１：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カリフォルニア州９２００８、カールズバッド；＃２：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州９５０６０、サンタクルーズ）およびｐ５３ ｓｉＲＮＡ（＃１：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州０１９２３、デンバー、＃２：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州０１９２３、デンバー）を使用した。細胞は、播種２４時間後に薬剤を用いて処理し、４８時間にわたり前記薬剤とともにインキュベートし、ＭＴＳアッセイを実施した。ＭＴＳアッセイは、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州５３７１１、マディソン）の取扱説明書にしたがって実施した。

【0042】

免疫ブロット：
細胞溶解液は、ラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．２５％のＤＯＣ、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＮａＶＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン）または２．５Ｘサンプルバッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％のＳＤＳ、２．５％のＢＭＥ、７．５％のグリセロール、ブロモフェノールブルー）中での細胞のインキュベーションにより処理した。組織サンプルをＲＩＰＡバッファ中に浸漬し、ホモジナイザを用いて破砕させ、遠心して透明化した。サンプルを次にＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、免疫ブロット膜上にブロッティングし、３％のＢＳＡ−ＴＢＳＴ中の一次抗体とともにインキュベートした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ共役二次抗体を強化化学ルミネセンス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州０１８２１、ビルリカ）によるタンパク質検出に使用した。ウェスタンブロッティングのために以下の抗体を使用した。抗Ｒｂモノクローナル抗体１Ｆ８（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州０２１３９−１５１７、ケンブリッジ）、抗ｐ５３モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国カリフォルニア州９５０６０、サンタクルーズ）、抗β−アクチンモノクローナル抗体ＡＣ−１５（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国ミズーリ州セントルイス）。

【0043】

リアルタイム定量ＰＣＲ：
全ＲＮＡは、Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡ ｍｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国カリフォルニア州９２６１４、アービン）を用いて単離した。逆転写および定量リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７５００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国カリフォルニア州９２００８、カールズバッド）上でＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ＥｘＴａｑ ｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ−Ｂｉｏ社、日本国滋賀県）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用し実施した。ＧＡＰＤＨに使用したプライマー配列は、５’−ＧＧＴＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＣＡ−３’（フォワード）、５’−ＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ−３’（リバース）であった。Ｒｂに使用したプライマー配列は、５’−ＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣ−３’（フォワード）、５’−ＡＡＧＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＴＧＡＧ−３’（リバース）であった。ｐ５３に使用したプライマー配列は、５’−ＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＴＡ−３’（フォワード）、５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧ−３’（リバース）であった。

【0044】

臨床サンプル中の遺伝子発現：
ＨＥＣ遺伝子発現データは、ＧＳＥデータベースから入手し、分析し、ｂａｓｅ２における遺伝子発現強度の対数として表示した。

【0045】

下記の考察は、本発明の主題の多くの典型的な実施形態を提供する。各実施形態は本発明の要素の単一の組み合わせを表すが、本発明の主題は、開示した要素のあらゆる可能性のある組み合わせを含むと見なされる。一実施形態が要素Ａ、ＢおよびＣを含み、第二実施形態が要素ＢおよびＤを含む場合は、本発明の主題は、さらに明示的に開示されない場合でさえ、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤの他の残りの組み合わせも含むと見なされる。さらに、文脈上別の解釈が求められる場合を除き、本明細書に規定の全ての範囲はそれらの終点を含むと解釈すべきであり、限度が設定されていない範囲は工業的実際的数値のみ含むと解釈すべきである。同様に、数値の全リストは、文脈上別の解釈が求められる場合を除き、中間の数値を含むと見なすべきである。

【0046】

Ｈｅｃ１発現とＨｅｃ１阻害剤に対する細胞感受性との相関：
様々な癌細胞系をＨｅｃ１阻害剤に対する感受性について特性解析した結果を表１に示した。すぐに分かるように、そのような細胞はＨｅｃ１阻害剤に対する感受性が相違する。このとき、指示した細胞系をＨｅｃ１阻害剤（１０１００１）で処理し、それらの増殖活性および代謝活性について分析した。表１は、スクリーニングした細胞系をＧＩ５０の昇順で列挙し、Ｈｅｃ１阻害剤に対する感受性にしたがって分類している。

【0047】

【表1】

【0048】

Ｈｅｃ１阻害剤耐性細胞系における薬剤耐性について考えられる機序を特性解析するために、Ｈｅｃ１阻害剤１０１００１感受性および耐性細胞系中でのＨｅｃ１タンパク質およびＲＮＡの発現レベルを決定した。類似の試験を実施して、第２Ｈｅｃ１阻害剤１１００９５に対して感受性（ＧＩ５０＜３００ｎＭ）および耐性（ＧＩ５０＞３００ｎＭ）であると同定された細胞系内でのＨｅｃ１タンパク質の発現レベルを特徴付けた。非同期的に維持した細胞系を溶解させ、それらの全タンパク質をＨｅｃ１の発現レベルについて免疫ブロットした。Ｈｅｃ１タンパク質の発現レベルを定量し、ＨｅＬａの発現レベルに比較して％で表示した（図１Ａ）。同様に、非同期的に維持した細胞系を収集し、それらの全ＲＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲによってＨｅＬａと比較したＨｅｃ１の発現レベルについて分析した（図１Ｂ）。Ｈｅｃ１阻害剤１０１００１耐性細胞系（ＧＩ５０＞１０μＭ）Ａ５４９およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１は低Ｈｅｃ１発現レベルを有すると言及されたが、高感受性の細胞系（ＧＩ５０＜５０ｎＭ）９例中７例は、最低ＧＩ５０を備える細胞系Ｋ５６２より高いＨｅｃ１レベルを有していた。同様に、Ｈｅｃ１阻害剤１１００９５に感受性の細胞系は、耐性細胞系（図１Ｃ）と比較してＨｅｃ１タンパク質の発現レベルの統計的有意な（ｐ値＜０．０００１）上昇を示した。図１Ｄ−１および図１Ｄ−２は、４種の相違するＨｅｃ１阻害剤を用いた試験の同様の結果を示している。４種のＨｅｃ１化合物アナログ（１００９５１、１０１００１、１０１０１５および１１００９５）からの細胞系スクリーニングアッセイから収集したＧＩ５０データの対数を、定量化Ｈｅｃ１タンパク質の発現レベルに対してプロットし、両側ｔ検定によりｐ値における有意性を決定した。Ｐ値は４．３２９１４×１０^−１７で、これはＨｅｃ１発現レベルがＨｅｃ１阻害剤についての臨床試験のための設計におけるバイオマーカーとして効果的に使用できることを強力に暗示していた。全体として、Ｈｅｃ１の発現は、細胞感受性とＨｅｃ１阻害剤との正の相関を示した。ＨｅＬａ細胞における追加の試験は、Ｈｅｃ１タンパク質とＲＮＡ発現との関係（各々全タンパク質および全ＲＮＡの関数として）が、図１Ｅに示したように、ほぼ線形であることを証明した。これは、有益にも、Ｈｅｃ１タンパク質の発現またはＨｅｃ１ ＲＮＡ発現のいずれかをＨｅｃ１阻害剤のための臨床試験の設計におけるバイオマーカーとして効果的に利用できることを示唆している。

【0049】

臨床的癌サンプルのタイプおよびサブタイプにおけるＨｅｃ１発現：
ゲノム規模の発現プロファイルは、Ｈｅｃ１が乳癌、肺、肝臓および脳細胞内ではアップレギュレートされること、およびＨｅｃ１発現が腫瘍の悪性度および予後と相関することを証明している。臨床的癌患者組織サンプルを収集し、Ｈｅｃ１発現レベルについて分析した。データは、所定の癌のタイプおよびサブタイプにおける有意に高いＨｅｃ１発現レベルを明らかにしている。図２Ａおよび図２Ｂは、腺癌および扁平上皮細胞癌を表す肺癌腫瘍サンプルについてのＧＥＯデータベースＧＳＥ８８９４（図２Ａ）およびＧＳＥ１４８１４（図２Ｂ）から入手し、分析し、正常組織に比較した発現強度のｂａｓｅ２の対数として表示したＨＥＣ（ＮＤＣ８０）発現データを描出している。どちらのデータベースにおいても、ＨＥＣ（ＮＤＣ８０）遺伝子の平均発現は、扁平上皮細胞癌細胞内で上昇する。Ｈｅｃ１発現の類似の上昇は、結腸癌細胞内で見いだされた（図示していない）。同様に、ＨＥＣ（ＮＤＣ８０）発現データは、様々な分子サブタイプの乳癌腫瘍サンプルについてのＧＥＯデータベースＧＳＥ２０６８５から入手し、分析し、正常組織に比較した発現強度のｂａｓｅ２の対数として表示した。ＨＥＣは、その遺伝子発現プロファイルに示されたように、乳癌分子サブタイプＩ内では過剰発現する（図２Ｃ）。患者から単離した乳癌腫瘍サンプル内のＨｅｃ１タンパク質の発現も特徴付けし、乳癌の分子サブタイプと同様に、表２に要約した。分子サブタイプＩおよびＩＶは、上昇したＨｅｃ１タンパク質の発現を示す。様々に分類した乳癌分子サブタイプの特性も表１に列挙したが、この表は、スクリーニングした細胞系における網膜芽細胞腫（Ｒｂ）およびｐ５３の遺伝子およびタンパク質の状態をＧＩ５０の昇順で列挙している。これらの結果は、腫瘍もしくは腫瘍細胞系のタイプおよび／または分子サブタイプがＨｅｃ１阻害剤についての臨床試験中の適正な患者選択のための臨床的指標となることを強力に指示している。

【0050】

【表2】

【0051】

Ｒｂおよびｐ５３の状態とＨｅｃ１阻害剤に対する細胞感受性との相関：
Ｈｅｃ１は、網膜芽細胞腫タンパク質Ｒｂと相互作用することで見いだされた。これは、現在の薬剤スクリーニングシステム内の癌細胞系のＲｂ状態（表１）とＨｅｃ１阻害剤に対する感受性との関係が存在する可能性を示唆している。驚くべきことに、本細胞系内のＲｂおよびｐ５３の状態のパターンは、Ｒｂの変異型および／またはｐ５３の変異型の存在の要件を示すことができる。表３に示したように、単一バイオマーカーとしての変異／異常Ｒｂは、変異／異常ｐ５３より有意性が低く、Ｐ値は各々０．３および＜０．００５である。

【0052】

【表3】

【0053】

類似の結果を表４に示した。単一バイオマーカーとしての変異体ＲｂはＰ値＞０．６を有するが、変異ｐ５３のＰ値は＜０．００７である。

【0054】

【表4】

【0055】

Ｈｅｃ１阻害剤に対する細胞感受性においてこれらの腫瘍抑制剤が果たす役割をさらに解明するために、ｓｉＲＮＡを使用して選択細胞系におけるＲｂおよびｐ５３の発現を選択的にノックダウンもしくは低下させ、Ｈｅｃ１阻害剤に対するそれらの感受性に及ぼす作用を特性解析した。驚くべきことに、Ｒｂのノックダウンは野生型Ｒｂを有する数種の癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｋ５６２、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＴ１１６）においてはＨｅｃ１阻害剤感受性の増加を誘導したが、変異Ｒｂを備える細胞系（ＨｅＬａ）には作用を示さなかった（図３Ａ〜３Ｂ）。図３Ａは、Ｒｂ（ｓｉＲｂ）に向けられたｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトし、Ｈｅｃ１阻害剤１０１００１を用いて処理した野生型Ｒｂ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存性試験の結果を示している。細胞感受性はＧＩ５０（μＭ）で表示した。リアルタイムＰＣＲによるトランスフェクト細胞由来のＲｂ ＲＮＡの定量の結果も示したが、これはｓｉＲＮＡ処理細胞におけるＲｂ ＲＮＡの有意な低下を示している。図３Ｂは、野生型Ｒｂ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｋ５６２、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６）または変異Ｒｂ（ＨｅＬａ）を備え図３Ａと同様に処理した、選択した細胞系のｓｉＲｂトランスフェクションの結果を示している。細胞感受性は、非薬剤処理細胞に比較した増殖阻害率として表示した。トランスフェクト細胞由来の細胞溶解液を収集し、免疫ブロッティングによってＲｂタンパク質について分析した；ブロットは対応する阻害グラフの下方に示した。アクチンをローディングコントロールとして含めた。

【0056】

ｐ５３のサイレンシングは、図４Ａ〜４Ｂに示したように、野生型ｐ５３を有する細胞（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＺＲ−７５−１、Ｕ２０Ｓ）においては同様に感作作用を誘導したが、驚くべきことに変異ｐ５３を有する細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅＬａ）には全く作用を及ぼさなかった。図４Ａは、ｐ５３に向けられたｓｉＲＮＡ（ｓｉｐ５３）を用いてトランスフェクトし、次にＨｅｃ１阻害性化合物１０１００１を用いて処理した野生型ｐ５３細胞（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６）および変異体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の結果を示している。細胞を生存性について分析し、細胞感受性をＧＩ５０（ｎＭ）で表示した。トランスフェクト細胞由来のＲＮＡは、定量的リアルタイムＰＣＲによってｐ５３ ＲＮＡのレベルについても分析した。ｓｉｐ５３処理細胞の増加した感受性は、野生型ｐ５３を用いて処理したｓｉｐ５３細胞の減少したＧＩ５０によって証明されたが、これは変異ｐ５３を備える細胞では観察されなかった。同様に、図４Ｂは、野生型ｐ５３（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＺＲ−７５−１、Ｕ２ＯＳ）または変異ｐ５３（ＨｅＬａ）を備える選択された細胞系のｐ５３に向けられたｓｉＲＮＡを用いてのトランスフェクションおよび図４Ａにおけるように処理した結果を示している。細胞感受性は、非薬剤処理細胞に比較した増殖阻害率として表示した。ｐ５３についてのトランスフェクト細胞由来の細胞溶解物の免疫ブロットの結果、対応するブロットは、対応する阻害グラフの下方に示した。総合すると、これらの結果は、損傷したＲｂおよびｐ５３を備える癌細胞は、未知の経路を通してＨｅｃ１阻害剤に対してより感受性であることを示唆しており、これは臨床的Ｈｅｃ１阻害剤療法の患者選択の指針に有用な追加のバイオマーカーを提供できる。

【0057】

このため当然のことながら、本発明の主題によると、Ｈｅｃ１阻害剤に対する感受性について感受性の細胞系および臨床患者を選択するための３種のバイオマーカーが提示されている。Ｈｅｃ１、変異Ｒｂおよび／または変異ｐ５３の発現の増加は、Ｈｅｃ１阻害剤に感受性である可能性が高い腫瘍および細胞系の指標である。これらの因子は、個別的に、または任意の組み合わせで予測的である。驚くべきことに、全３種のバイオマーカーについての組み合わせたＰ値は、＜０．０００１である（表３）。これらはＨｅｃ１阻害剤療法により応答性であり得る患者を選択する臨床試験の設計の選択指針を提供する。

【0058】

現行の細胞毒性剤と比較したＨｅｃ１阻害剤の有効性：
Ｈｅｃ１阻害剤に対する腫瘍由来細胞の感受性および癌治療において現在使用されている一連の細胞毒性剤を（ＧＩ５０に関して）表５〜７に示した。表５は、Ｈｅｃ１阻害剤１０１００１と数種の細胞毒性剤（パクリタキセル、ドキソルビシン、トポテカンおよびソラフェニブ）に対する多数の乳癌由来細胞系のＧＩ５０を要約している。表６は、多数の肝癌細胞由来細胞系についての同様のデータを示している。同様に、表７は、Ｈｅｃ１阻害剤１０１００１ならびにパクリタキセル、ドキソルビシンおよびトポテカンに対する他の癌由来細胞系のＧＩ５０を要約している。ほとんどの場合、Ｈｅｃ１阻害剤は、選択細胞系において選択細胞毒性剤より強力であった（つまり、低いＧＩ５０を有していた）。驚くべきことに、Ｈｅｃ１阻害剤は、表８に示したように、タキソール耐性細胞系であるＭｅｘ−ＳＡ／Ｄｘ５およびＮＣＩ／ＡＤＲ−Ｒｅｓならびにグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）耐性細胞系であるＫ５６２Ｒを含む数種の薬剤耐性細胞系にも効果的であった。これらの結果は、細胞毒性剤、例えばタキソール、ドキソルビシン、トポテカンおよびグリベックなどの代替薬としての、または併用した場合のＨｅｃ１阻害剤の使用についての根拠を提供する。

【0059】

【表5】

【0060】

【表6】

【0061】

【表7】

【0062】

【表8】

【0063】

Ｈｅｃ１阻害剤と細胞毒性剤との相乗作用：
併用療法は、癌患者のより効果的な治療にとって前途有望なアプローチである。他の現行の抗癌剤が達しなかった経路を標的とすることができる薬剤は、現行の治療レジメンに組み込むことのできるいっそう優れた臨床的可能性を有している。上述のように、単剤試験の結果は、Ｈｅｃ１阻害剤がそのような併用療法において有効である可能性を強力に示唆している。Ｈｅｃ１阻害剤についての可能性のある臨床併用治療アプローチを調査するために、Ｈｅｃ１阻害剤と癌療法において使用される現在利用可能な数種の細胞毒性剤との相乗作用を特性解析した。スクリーニングのために使用されたＨｅｃ１阻害剤応答性癌細胞をＨｅｃ１阻害剤と適切な濃度比にある選択抗癌剤の組み合わせで処理し、細胞生存性について評価した。併用指数（ＣＩ）は、相加（ＣＩ＝約１）、相乗（ＣＩ＜１）または拮抗（ＣＩ＞１）作用を提示するために、上述したように得たＧＩ５０から計算した。表９は、細胞毒性剤と組み合わせてＨｅｃ１阻害剤１１０００１を用いて処理した多数の癌由来細胞系上での相乗作用試験の結果を要約している。表１０は、Ｈｅｃ１阻害剤１１００９５を用いて実施した類似の試験の結果を要約している。同様に、表１１は、白血病、子宮頸癌、乳癌および肝癌細胞系についてのＨｅｃ１阻害剤１００９５１（０９５１）、１０１００１（１００１）、１０１０１５（１０１５）および１１００９５（００９５）ならびに細胞毒性剤について得られた併用指数（ＣＩ）を要約している。Ｈｅｃ１阻害剤（つまり、ＣＩ＜１）の有意な相乗作用は、試験した細胞系の多数において、タキソール、ドキソルビシンおよびトポテカンを用いて確認した。これは、Ｈｅｃ１阻害剤が、現行の細胞毒性剤レジメンに加えられると、新生物性疾患の治療または癌細胞系の増殖阻害のために追加の治療様式を提供できることを示唆している。

【0064】

Ｈｅｃ１阻害剤誘導性細胞死の機序：
Ｐ５３は、Ｇ１およびＧ２期における細胞周期の重要な調節因子として公知であり、異常増殖性シグナルおよびストレスに応答してアポトーシスを制御する。本発明者らが見いだした大部分のＨｅｃ１阻害剤感受性細胞系は変異ｐ５３を有するので、ｐ５３非依存性アポトーシス経路がＨｅｃ１阻害剤誘導性細胞死に関係すると推測することができた。Ｐ７３は、ｐ５３欠損細胞内でアポトーシスを媒介してＰ５３機能に置換するＰ５３ファミリーのメンバーである。このためＰ７３は、Ｈｅｃ１阻害剤誘導性細胞死をもたらすアポトーシスを媒介する分子の潜在的候補である。これを調査するために、薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ）および薬剤耐性細胞（Ａ５４９）、変異ｐ５３タンパク質を有する、を様々な期間にわたってＨｅｃ１阻害剤１１００９５で処理した。リン酸化ｐ７３についての免疫ブロットの結果は、Ｈｅｃ１阻害剤が処理細胞においてｐ７３の時間依存性リン酸化を誘導し、薬剤処理の４８時間後にピークに達することを証明している（図５Ａ）。そのようなリン酸化は、Ｈｅｃ１阻害剤が、少なくとも一部にはｐ７３活性を調節することによって細胞死を誘導するように作用できることを示唆している。

【0065】

同様に、ＨｅＬａ（図５Ｂ）細胞を、２４もしくは４８時間にわたり選択Ｈｅｃ１阻害剤１１００９１（９１）、１１００９３（９３）、１１００９５（９５）を１μＭで用いて処理し、溶解液をアポトーシスマーカーであるカスパーゼ３およびＰＡＲＰならびに抗アポトーシスマーカーであるＭｃｌ−１、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−２について免疫ブロットした。アクチンをローディングコントロールとして示した。Ａ５４９細胞は、同様にＨｅｃ１阻害剤の１００９５１（０９５１）、１０１００１（１００１）、１０１０１５（１０１５）、１１００７８（００７８）および１１００７９（００７９）を用いて処理し、結果は図５Ｃにまとめた。

【0066】

【表9】

【0067】

異なるＨｅｃ１阻害剤を利用した類似の試験は図５Ｄに示し、同図は、ＨｅＬａおよびＡ５４９細胞系のＨｅｃ１阻害剤１０１００１を用いた処理の結果を例示している。Ｈｅｃ１阻害剤処理は薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ）におけるアポトーシス性カスパーゼの活性化をもたらした（図５Ｂ、図５Ｄ）。耐性細胞系（Ａ５４９）の類似の処理は、類似の応答を示さなかった（図５Ｃ、図５Ｄ）。これは、変異ｐ５３細胞（ＨｅＬａ）において、Ｈｅｃ１阻害剤が薬剤誘導性細胞死をもたらすｐ７３依存性アポトーシスを誘発するｐ７３活性化を誘導できることを示唆している。

【0068】

【表10】

【0069】

Ｈｅｃ１阻害剤に対する示差的応答の機序：
Ｈｅｃ１およびＮｅｋ２は細胞周期調節され、Ｇ２／Ｍ期中にそれらの最高発現レベルに達することが見いだされている。一部の細胞系はＨｅｃ１阻害剤処理に低感受性であるので、そのようなＨｅｃ１／Ｎｅｋ２経路の示差的調節は、Ｈｅｃ１阻害剤に対する示差的細胞応答における因子である可能性がある。

【0070】

【表11】

【0071】

この可能性を調査するために、薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＨＣＴ１１６）および耐性細胞（Ａ５４９）を飢餓によって同期化し、１（Ｇ１）、２７（Ｇ２７）、３２（Ｇ３２）および４８（Ｇ４８）時間後にＨｅｃ１およびＮｅｋ２の発現を特性解析した。Ｈｅｃ１とＮｅｋ２との示差的発現パターンは明白であり、Ｈｅｃ１／Ｎｅｋ２経路の調節における差を示している（図６Ａ）。細胞を４８時間にわたって指示した濃度でＨｅｃ１化合物１１００９５を用いて処理し、Ｎｅｋ２発現を免疫ブロッティングによって特性解析した（図６Ｂ）。Ｈｅｃ１阻害剤処理は感受性細胞系におけるＮｅｋ２の分解をもたらした。しかしこの作用は、耐性細胞系（Ａ５４９）では見られない（図６Ｂ）。これは、Ｈｅｃ１阻害剤感受性およびＨｅｃ１阻害剤耐性細胞系がＨｅｃ／Ｎｅｋ２経路を様々に調節（または利用）できることを示唆している。さらに、薬剤応答性細胞（ＨｅＬａ）を様々な期間にわたりＨｅｃ１阻害剤１１００９５（０９５）を用いて処理し、サイクリンＢ１およびサイクリンＤ１含量を免疫ブロッティングによって特性解析した（図６Ｃ）。サイクリンＢ１およびサイクリンＤ１のレベルは、Ｈｅｃ１阻害剤を用いて処理した薬剤応答性細胞ではダウンレギュレートされた。これは、様々な細胞状況を備える細胞系が、選択細胞がＨｅｃ１化合物誘導性細胞死を免れ得るようにする示差的細胞周期経路を有することを示唆している。特徴的な調節経路もしくは細胞周期経路の同定（例えば、Ｈｅｃ１／Ｎｅｋ２経路および／またはサイクリンＢ１およびサイクリンＤ１の調節の特性解析）は、Ｈｅｃ１阻害剤に感受性である新生物性疾患および／または細胞系を同定できる。

【0072】

Ｈｅｃ１発現は、腫瘍の悪性度および予後と相関することも証明されている。例えば、Ｈｅｃ１は、不良な治療転帰の乳癌予後予測因子の一部であり、単変量分析における有意な予後予測因子はサイクリンＢ１、ＢＵＢ１、ＨＥＣおよび１１−遺伝子特徴であった。これは、乳癌患者における強力なＨｅｃ１小分子阻害剤の使用が重要であることを際立たせている。癌の型およびサブタイプは、上昇したＨｅｃ１遺伝子発現を備える癌のタイプおよびサブタイプが（上記の乳癌分子サブタイプＩおよびＩＶによって示されるように）Ｈｅｃ１阻害剤により感受性である可能性があるので、Ｈｅｃ１阻害剤療法により応答性である可能性が高い患者を選択するための選択指針を提供できる。

【0073】

機能的には、Ｈｅｃ１は、多数の癌において過剰発現し腫瘍表現型をもたらす有糸分裂動原体の１成分である。細胞周期中のＨｅｃ１発現は正常細胞および形質変換細胞のどちらにおいても緊密に調節されるが、Ｈｅｃ１の動原体動員は癌細胞系において増加する。公知のように、網膜芽細胞腫遺伝子（Ｒｂ）のサイレンシングは、Ｈｅｃ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を増加させた。ＲｂのノックダウンおよびＲＢ／Ｅ２Ｆ標的遺伝子のダウンレギュレーションは、乳癌細胞系であるＭＣＦ７、Ｔ４７ＤおよびＺＲ−７５−１における治療用量のＤＮＡ損傷剤に対する感受性を増加させることも公知である。このためＲＢ欠損癌細胞における増加したＨｅｃ１発現に起因する増加した異数性および染色体不安定性は、変異Ｒｂ遺伝子型を備える癌細胞におけるＨｅｃ１阻害剤に対する感受性の観察された増加に寄与する可能性がある。Ｒｂおよび／または関連遺伝子の遺伝子型決定は、Ｈｅｃ１阻害剤療法に応答性である可能性が高い患者および／または細胞系を選択するための臨床試験の設計の選択指針を提供できる。

【0074】

薬剤スクリーニングした細胞系のＲＢおよびｐ５３発現プロファイルならびにＨｅｃ１阻害剤ＧＩ５０は、変異ＲＢまたは変異ｐ５３がＨｅｃ１阻害剤感受性における増強因子であることを示唆しているが、それがｐ５３の固有の欠乏または細胞を感作する変異体の機能獲得であることは明白ではない。例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞はｐ５３タンパク質を発現しないが、それでもＨｅｃ１阻害剤に対して非応答性であることが見いだされた（即ち、ＧＩ５０＞１０μＭ）。野生型ｐ５３は、異常な増殖から細胞を保護する腫瘍抑制因子である。初期の試験は変異ｐ５３形を備える細胞を誤って同定し、ｐ５３を癌遺伝子であると誤って説明したが、後の研究は、変異ｐ５３タンパク質の広大な過剰産が癌の特徴であり、腫瘍進行とともに悪化することを証明した。このような場合における変異ｐ５３の過剰発現は、高度の腫瘍原性細胞を生じさせた。同様に、ヒトホットスポット変異ｐ５３のマウス同等物の発現は、異数性、異常中心体増幅および不可逆性染色体転座が付随するゲノム不安定性の増加を伴う腫瘍を生成した。これは、変異ｐ５３型自体がＨｅｃ１阻害剤の阻害性機序において積極的役割を有する可能性があることを示唆している。ｐ５３および／または関連遺伝子の遺伝子型決定は、Ｈｅｃ１阻害剤療法に応答性である可能性が高い患者および／または細胞系を選択するための臨床試験の設計の選択指針を提供できる。

【0075】

上述のように、変異ｐ５３の存在には、機能獲得（ＧＯＦ）作用である腫瘍進行が関連している。変異ｐ５３の多数のＧＯＦ作用は、それがｐ５３ファミリーのタンパク質、例えばｐ６３およびｐ７３に結合する、および／またはそれらを不活性化する能力と関連している。Ｐ７３は、ｐ５３欠損細胞においてｐ５３ゲノム維持機能を替わって行うことができる。上述のように、感受性細胞系を同定するためのＨｅｃ１阻害剤を用いたスクリーニングは、大多数の感受性細胞系が変異ｐ５３を有することを証明した。これは、Ｈｅｃ１剤誘導性細胞死が１つ以上のｐ５３非依存性経路を介して発生する可能性を示唆している。変異ｐ５３細胞が、損傷したｐ７３／ｐ６３媒介性アポトーシスを有することは公知である。変異ｐ５３腫瘍細胞中では、ｐ７３およびｐ６３はそれらの標的遺伝子を動員することができない。変異ｐ５３、ｐ７３および／またはｐ６３のタンパク質複合体の存在は、癌細胞の化学感受性にマイナスの影響を与える可能性がある。本発明者らは、Ｈｅｃ１阻害剤構成における薬剤誘導性細胞死がｐ７３依存性アポトーシスを通して発生する可能性があると推測している。これに関連して、本発明者らは、Ｈｅｃ１阻害剤誘導性細胞死における１つの機序は、ｐ７３の活性化を促進してｐ７３依存性アポトーシスをもたらす変異ｐ５３とｐ７３との１つ以上の相互作用の崩壊を含む可能性があるとさらに推測している。興味深いことに、Ｈｅｃ１阻害剤を用いた細胞の処理は、アポトーシス性カスパーゼマーカーおよびｐ７３のリン酸化の両方を誘導したが、これはｐ７３依存性アポトーシス経路の活性化を強力に示唆している。しかし、ｐ５３の複雑な機能は様々な細胞状況において相違する可能性があり、Ｈｅｃ１、Ｈｅｃ１阻害剤およびｐ５３の関係は依然として充分には解明されていない。参考として本明細書で援用される国際公開第２０１１／１１５９９８号パンフレットには、また別の化合物、組成物および実験が提供されている。

【0076】

当然のことながら、本明細書に記載の本発明の概念から逸脱せずに本明細書に記載した以外のより多数の修飾が可能であることは、当業者には明白である。このため本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神を除いて制限されるべきではない。さらに本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際、全ての用語は状況に一致する最も広範囲の考えられる方法で解釈すべきであり、特に、用語「含む」および「含んでいる」は、本明細書で言及した要素、成分もしくは工程が明示的には言及されない他の要素、成分または工程とともに存在してよい、または利用できる、または結合できることを示す非排他的方法で要素、成分または工程を意味すると解釈すべきである。本明細書がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つについて言及する場合は、本文は、Ａ＋Ｂ、またはＢ＋Ｃなどではない前記群からの唯一の要素を要求していると解釈すべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D-1】

【図1D-2】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

2015500008000001.app

【国際調査報告】