【技術分野】

【0001】

【0002】

【背景技術】

【0003】

【0004】

【0005】

【発明の概要】

ＤＭは、もともと３０年以上前に同定されたという事実にもかかわらず、ＤＭの包括的な配列解析が行われたという文献による証拠がない。したがって、改良された診断方法、特にＤＭの存在に関連付けることができる腫瘍性組織の遺伝子解析のための改良された方法が、依然として必要とされている。

本発明の主題は、通常、腫瘍に関連した高度に増幅された腫瘍遺伝子を含む、損傷していないＤＭを完全に再構築するために、全ゲノムのペアエンド配列解析が、高信頼度の切断点および関連した高いコピー数の同定を介して、遺伝子の再構成の迅速で包括的な同定をできる方法および計算システムに向けられる。 本発明の主題の特に好ましい一態様では、ゲノムデータを解析する方法は、腫瘍のゲノム配列と整合された正常ゲノム配列との間の相対コピー数を決定するステップ、および腫瘍のゲノム配列および整合された正常ゲノム配列における推定切断点を同定するさらなるステップを含む。別のステップでは、推定切断点は、好ましくは腫瘍のゲノム配列の分裂を使用し、セグメントを基準データベースと比較して精緻化されて、腫瘍のゲノム配列の切断点の位置および方向を同定し、別のステップでは、リード支援閾値（例えば、ユーザが決定する）を使用して、切断点を重要な切断点として確認する。一層さらなるステップでは、相対コピー数、重要な切断点、および方向を使用して、循環ソリューション（これは二重微小染色体を示し得る）を有するゲノム再構成を決定する。 特に好ましい態様では、相対コピー数を決定するステップは、動的ウィンドウイングを使用して実行され、かつ／または推定切断点を同定するステップは、不一致のペアリードを使用して実行される。本発明の主題に限定しないが、ゲノム構成は、切断点グラフを生成し、切断点グラフを解くことによって決定されて、循環ソリューションに到達することが概して好ましい。 さらに企図された態様では、腫瘍のゲノム配列は固形腫瘍に由来するが、腫瘍のゲノム配列は、体液（例えば、血液、血清、血漿、吸引液など）中に存在する遺伝物質から取り出される。例えば、固体腫瘍は、多形性膠芽腫または非小細胞肺癌であってもよい。 異なる視点から見ると、ゲノムデータを解析する企図された方法は、切断点に対するリード支援閾値（好ましくはユーザが画定する）に達すると、腫瘍のゲノム配列のコピー数を腫瘍のゲノム配列内の切断点に関連付けるステップ、および腫瘍のゲノム配列の方向を決定するステップを含んでもよい。このような方法は、腫瘍のゲノム配列のコピー数、切断点の位置および方向を使用して、ゲノム構成を決定するステップをさらに含む。必ずしもそうではないが、通常、ゲノム構成を決定するステップは、腫瘍のゲノム配列のコピー数、ゲノム内の切断点の位置、および腫瘍のゲノム配列の方向を使用して、切断点グラフを生成することによって実行され、切断点グラフにおいて、コピー数は縁部として表され、切断点の位置は頂点として表される。 本発明の主題の別の態様では、固体腫瘍のゲノムデータを解析する方法は、固体腫瘍を腫瘍ゲノムの少なくとも一部が体液内に存在する腫瘍と同定するステップ、ならびに患者から体液を獲得し、腫瘍ゲノムの少なくとも一部を取り出す別のステップを含み、次いでこれを使用して、上述および詳述におけるようにゲノムデータを解析する。最も定型的には、腫瘍ゲノムの一部は、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を含み得る二重微小染色体として存在する。したがって、企図された方法はまた、腫瘍ゲノムの取り出された少なくとも一部内の腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を同定するステップも含んでもよい。この事象では、方法はまた、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子を目標とする、薬剤処方計画を使用して患者を治療するまたは治療の助言をするステップも含む。 本発明の主題のさらに別の態様では、固体腫瘍（は、例えば多形性膠芽腫または非小細胞肺癌である）のゲノムデータを解析する方法は、患者から体液（例えば、血液、血清、血漿など）を獲得し、体液から腫瘍ゲノムの少なくとも一部を取り出すステップ、および腫瘍遺伝子（例えば、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｙｃ、もしくはＭＤＭ２の野生型または突然変異型）を包囲する領域が、増幅された二重微小を示すクラスタ型の切断点を示すかどうかを判定するさらなるステップを含む。判定は、好ましくは上述および詳述におけるように実行される。 したがって、発明者らはまた、患者から生体試料を獲得し、その試料から核酸を取り出すステップ、ならびにゲノム試料のコピー数およびゲノム試料内の切断点に対して核酸を解析するさらなるステップを含む、腫瘍性疾患（例えば、胃癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、白血病、または乳癌）をデノボ診断する方法も企図する。一層さらなるステップでは、ゲノム配列のコピー数は、切断点に対するリード支援閾値に達するとゲノム配列内の切断点に関連付けられ、ゲノム配列の方向が決定される。さらに別のステップでは、ゲノム構成は、ゲノム配列のコピー数、切断点の位置、および方向を使用して決定され、そのように同定されたゲノム構成を使用して、腫瘍性疾患に対する可能性を決定する。本発明の主題の少なくとも一部の態様では、ゲノム構成は、二重微小、および／または腫瘍遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子を含むと同定される。 本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同じ番号が同じ構成要素を表す添付図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳述からより明らかになろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】本発明の主題による、推定構造変異の最初の同定を描く例示的グラフである。

【図2】図１の推定構造変異における切断点の精緻化された解析を描く例示的グラフである。

【図3】本発明の主題による、例示的切断点グラフである。

【図4】体細胞の切断点に対するリード支援の例示的ヒストグラムである。

【図5】高いコピー数および高度に支援された切断点を描く例示的ゲノムブラウザ表示を示す図である。

【図6】図５に示したデータの詳細図、および切断点グラフに対する循環ソリューションを示す図である。

【図7】染色体７ならびに１２の高いコピー数および高度に支援された切断点を描く例示的ゲノムブラウザ表示を示す図である。

【図8】図７に示した選択されたデータの詳細図、および切断点グラフに対する循環ソリューションを示す図である。

【図9】本発明の主題による、ゲノム解析のための構成およびシステムを例示的に描く概略図である。

【図10】第１の腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する循環ソリューションを例示的に示す図である。

【図11】第２の腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する循環ソリューションを例示的に示す図である。

【図12】さらなる腫瘍試料における再構成パターンおよび対応する循環ソリューションを例示的に示す図である。

【発明を実施するための形態】

発明者らは、ゲノム解析を実行して、高信頼度の切断点および関連した高いコピー数を同定することにより、また再構成構想における循環ソリューションに達するデータの解析により、全ゲノム配列データから１つまたは複数のＤＭを同定できることを発見した。

その目的のために、発明者らは、全ゲノム配列データの高信頼度の切断点、断片の方向、および解析を同定できるアルゴリズムを開発し使用した。これは、多くの場合、高度に増幅された腫瘍遺伝子を含む、損傷していないＤＭを最終的に完全に再構築することができる。例えば、発明者らは、損傷していないＤＭの完全な再構築のために、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（癌ゲノムアトラス）（Ｎａｔｕｒｅ２００８年１０月、４５５（７２１６）、１０６１〜１０６８）により２つの多形性膠芽腫（ＧＢＭ）の試料配列を使用した。加えて、発明者らはまた、ＧＢＭ腫瘍細胞は腫瘍遺伝子ＤＭを血流に流すことを示す、同じ患者の血液試料内のＤＭの証拠も発見した。特に好ましいアルゴリズムは、ＢＡＭＢＡＭを含み、これは米国特許第２０１２／００６６００１号および米国特許第２０１２／００５９６７０号に記載されており、どちらも本明細書に参照によって組み込まれる。本明細書に提示された方法および計算システムは、全ゲノムのペアエンド配列を介して、遺伝子の再構成の迅速で包括的な同定を可能にする。より具体的には、発明者らは、全ゲノム配列データを解析するために以下に記載されたシステムおよび方法を利用して、完全に再構築されたＤＭを示す結果に達した。

以下の検討を通して、サーバ、サービス、インターフェイス、ポータル、プラットフォーム、またはコンピューティングデバイスから形成された他のシステムに関して、多くの参照がなされる。こうした用語の使用は、コンピュータ可読の有形の持続性媒体上に記憶されたソフトウェア命令を実行するように構成された、少なくとも１つのプロセッサを有する、１つまたは複数のコンピューティングデバイスを表すと考えられることを理解されたい。例えば、サーバは、ウェブサーバ、データベースサーバ、または記載した役割、義務、または機能を果たす方法で他のタイプのコンピュータサーバとして作動する、１つまたは複数のコンピュータを含むことができる。

本発明の主題の例示的一態様では、コピー数が決定され、構造変異は以下のように推測される。

腫瘍と整合された正常との間の相対コピー数の計算 腫瘍相対コピー数に対する正常な相対コピー数は、腫瘍の配列データセットまたは正常な配列データセットのいずれかにおけるリード包括度により、ウィンドウのゲノム幅を拡大および縮小する動的ウィンドウイング手法を使用して計算される。プロセスは、ゼロ幅のウィンドウで初期化される。腫瘍の配列データおよび整合された正常な配列データの両方から一定の品質の閾値（例えば、リードマッピング品質）を超えるそれぞれのリードは、それぞれ腫瘍カウントＮ_{ｔｕｍｏｒ}および正常カウントＮ_{ｎｏｒｍａｌ}に計算される。最初のリードの開始位置および停止位置は、最初のウィンドウ幅を画定し、より多くのリードが収集されるにつれて、ウィンドウの幅は、処理されたすべてのリードの最小開始位置および最大停止位置を含むために拡大する。

相対コピー数計算は、次の条件、すなわち、腫瘍のデータセットまたは整合された正常なデータセットのいずれかからのリードカウントが、ユーザが確定した上限および１００のリードに固定される下限の両方を超えることを満たすときになされる。このことが起きると、ウィンドウのサイズおよび位置、生のリードカウントＮ_{ｔｕｍｏｒ}、Ｎ_{ｎｏｒｍａｌ}、ならびに相対コピー数計算Ｎ_{ｔｕｍｏｒ}／Ｎ_{ｎｏｒｍａｌ}が記録される。次いですべての値は、次の収集および計算のためにリセットされる。局所リード包括度によるＮ_{ｎｏｒｍａｌ}ウィンドウのサイズを調整することにより、この方法は、低包括度の領域内に大きいウィンドウを生成して信号対ノイズ非を向上させる一方で、高度に増幅された領域はより小さいウィンドウを生成し、単位複製配列境界の解像度を高める。

ペアエンドのクラスタリングを使用する構造変異の領域の推測 推定の染色体内および染色体間の再構成を同定するために、ＢＡＭＢＡＭは、一方は腫瘍試料から、他方は整合された正常な試料から、１対の座標分類されたＢＡＭファイル内に記憶された不一致のペアリードを検索する。この場合、不一致のペアにおけるそれぞれのリードは、参照配列の異なる領域にマッピングする。染色体内の不一致の対は、異常に大きい挿入サイズ（すなわち、ペアリードを分離する基準上のゲノム距離は、ユーザが画定した閾値を超える）を有する対、または誤った方向（すなわち逆位）にマッピングする対である。染色体間の不一致の対は、異なる染色体にマッピングするペアリードによって画定される。このプロセスの概要は図１に示されている。図１は、構造変異呼出しの概要を概略的に示す。推定の構造変異の最初の同定は、不一致にマッピングされたリードの対を使用してＢＡＭＢＡＭによって同定される。この場合、どちらのリードも参照ゲノムに完全にマッピングするが、異常な非参照の手法ではそうしない。次いでＢＡＭＢＡによって見出された推定の切断点は、切断点付近のあらゆる利用可能な分離リードを使用して、ｂｒｉｄｇｅｔと呼ばれるプログラムによって精緻化される。

腫瘍データセットおよび正常なデータセットの両方からのすべての不一致のペアエンドリードは、それらのゲノム位置に従って集められて、切断点であると考えられるおおよそのゲノム領域を画定する。凝集プロセスは、推定の切断点の両側に他のリードが重複し、同一方向を有するリードと一緒に分類するが、腫瘍データセットおよび正常なデータセットからきたリードの数の軌道を保つことを含む。クラスタ内の重複する不一致の対の数が、ユーザが確定した閾値を超えるとき、再構成を説明する切断点は、出力内に画定され記録される。

切断点は、切断点が腫瘍データセットからのリードにより著しく支援される場合は、「体細胞」に分類される。整合された正常なデータセットから「体細胞」の切断点に対する最低量のリード支援は、一部のレベルの腫瘍ＤＮＡが整合された正常な試料内に存在する場合に適応を許容される。これは、固体腫瘍のＤＮＡ内に存在する高度に増幅された領域が、血流内に低いが検出可能なレベルで流れる場合に起きることがある。あるいは、血液癌の場合、整合された正常な試料（特に皮膚）内に高レベルの腫瘍遺伝子移入があることが予想される。整合された正常なデータセット内に許容される体細胞の切断点に対する支援の量を、整合された正常な試料内に予想される腫瘍「汚染」の量によって調節できる。「生殖細胞系列」の切断点は、腫瘍データセットおよび整合された正常なデータセットの両方において著しい支援を有する、または整合された正常なデータセットのみに支援を有する切断点である。これらの再構成は当面の問題に関係しないので、これらはこの解析に考慮されない。また、これらの切断点の多くは、配列機器、試料調整（全ゲノム増幅など）、または利用された短いリードマッピングアルゴリズムにおける系統的バイアスによって誘発される、人為的な結果に起因するスプリアスであると考えられる。

分離リードを使用する構造変異の精緻化 ＢＡＭＢＡＭにより最初に見出された切断点は、切断点の実際の接合部が参照（または体細胞の再構成の場合は、整合された正常なデータセット）内に存在しない配列を表すので、本質的に切断点の実際の接合部が実質的に重複しない、完全にマッピングされたリードを使用すると言う点で近似である。切断点の位置を精緻化するために、ｂｒｉｄｇｅｔと呼ばれるプログラムが開発された。

ｂｒｉｄｇｅｔは、完全にマッピングされたメイトにより、推定の切断点付近に固定されるすべてのアラインされていないリードに対してＢＡＭＢＡＭおよび検索によって見出された近似の切断点を与えられる。これらのマッピングされていないリードのそれぞれは、再構成の切断点の接合部に重複する「分離リード」である可能性を有する。切断点の両側を包囲する局所化されたゲノム配列は、独自のタイル（現在はタイルのサイズは１６ｂｐである）のセットに分割され、参照ゲノムにおけるタイル配列のタイルデータベースおよびそれらの位置が構築される。類似のタイルデータベースは、リードを同じサイズのタイルに分割し、リード内のそれらの位置を指摘することにより、アラインされていないリードのそれぞれに対して構築される。参照タイルデータベースとアラインされていないタイルデータベースを比較して、参照においてそれぞれのアラインされていないタイルのゲノム位置が決定される。これらの位置の「デュアルスパニングセット」は、切断点の各側に１つずつの、参照リードおよびアラインされていないリードの両方において隣接するタイルの最大セットを決定することによって計算される。

参照座標内のデュアルスパニングセットの最小および最大ゲノム位置は、切断点の位置ならびに接合部の両側の方向（または鎖の数）を正確に決定する。情報が切断点の左右の境界を説明して、再構成された配列は完全に画定される、すなわち、左側は（例えば、染色体＝ｃｈｒ１、位置＝１０００ｂｐ、鎖＝フォワード）によって画定され、右側は（例えば、染色体＝ｃｈｒ５、位置＝５００，０００ｂｐ、鎖＝リバース）によって画定される。切断点の配列相同性（すなわち、切断点の両方の境界で同一であることが観察されたが、２つの配列の接合部でアラインされたリード内に１度だけ観察された「ＣＡ」などの短い配列）も、これらのデュアルスパニングセットから決定される。

アラインされていないリードのそれぞれに対して、デュアルスパニングセットは、切断点の潜在的位置を決定する。アラインされていないリードはそれぞれ、切断点に対して（切断点、反復配列などの付近の配列エラーに起因して）わずかに異なる位置を決定し得るので、デュアルスパニングセットから決定されるすべての切断点位置を使用して可能な接合配列を生成する。すべてのマッピングされていないリードは、これらの可能な接合配列のそれぞれに新たにアラインされ、それらのアライメントにおける全体の改善は、リードが元の配列にどの程度良好にアラインされたかを測定される。アライメントスコアにおいて最大の向上を得た接合配列は、真の再構成に対して最良の候補として評価される。この最良の接合配列が、アライメントスコアにおいてごくわずかな改善を得る場合は、この接合配列は、これは真の再構成を表す見込みがないとして廃棄される。この場合、分離リード確認がないことは、ＢＡＭＢＡＭによって見出された元の構造再構成がスプリアスである証拠であると決定されてもよい。図２は、構造再構成が起きるゲノム内の位置を正確に同定する例示的方法を概略的に示す。タイル（またはｋｍｅｒ）は、潜在的分離リードおよび参照ゲノムの両方に対して決定される。デュアルスパニングセット（この図の一番下にある太い赤と紫のボックスに相当する）を決定し、これにより、再構成された配列を構築する方法が完全に定義される。デュアルスパニングセットは、分離リード内の配列エラーまたはＳＮＰに対して頑健である。

一旦構造変異が上述のように分離リードを使用して精緻化されると、１つまたは複数の切断点は、高度に増幅された領域に密接に関連して決定される。より具体的には、所与の切断点の支援は、切断点が接合する領域のコピー数に正比例する。したがって、高レベルのリード支援を有する切断点を要求することにより、腫瘍内の高度に増幅された領域の一部である切断点に焦点を合わせる代わりに、コピーニュートラル再構成の一部であるか、または低いコピー増幅および削除を引き起こす切断点をフィルターにかけることができる。特にリード支援閾値は、腫瘍ゲノムのコピーニュートラル領域が予期されるリード支援を有する切断点を取り除くように、選択される。

次いで単位複製配列を、切断点グラフをたどることによって再構築できる。例えば、また最近出版された方法（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１年１０月１２日）と同様に、発明者らは、腫瘍ゲノムの増幅されたセグメントを表す縁部のセット、および互いに縁部を接合する方向頂点のセットを説明することにより、切断点グラフを構築した。ここでは、縁部は、相対コピー数に見られる腫瘍ゲノムの増幅されたセグメントと定義されるが、頂点は、上述の手法で見出される高度に支援された切断点である。増幅されたセグメントが切断点によって遮断される場合、そのセグメントは、遮断する切断点の位置で２つの縁部に分離される。

セグメントがゲノム位置に従って構成され、発明者らは、最初に増幅されたセグメントの最左位置で開始することにより、再構成された腫瘍配列を表し、右に向けられた頂点に遭遇するまで右に進む、縁部の構成を決定した。経路は、頂点をそれが接合されているセグメントに続け、出る頂点によって指定された方向（左または右）に移動することにより継続する。切断点グラフのソリューションは、すべての縁部および頂点を通る経路が少なくとも１回横断したときに作成される。簡単な例の切断点グラフおよびそのソリューションは図３に示され、再構成された配列を再構築するために切断点グラフをたどることを実証する。セグメント「ａ」で開始し、出る切断点１に続いて右に進み、セグメント「ｂ」の左側に入る。引き続き右に進み、出る切断点２に続いて、セグメント「ｃ」の右側に入る。この切断点は左を指し、セグメント「ｃ」が再構成された配列内で逆方向に見出されることを示す。最後の切断点３は、セグメント「ａ」の左側に戻り、コピー数におけるすべての追加コピーを構成する。したがって、見出された最後のソリューションは「ａｂ〜ｃ」である。

このような緩い制約を考えれば、切断点グラフの満足のいく多くのソリューションが可能であり得ることが明らかである。しかし、グラフを通る光路（複数可）が、観察された相対コピー数に最も密接に一致する経路である。ソリューションが所与のセグメントを横断する回数は、そのセグメントのコピー数の見積を生成する。各ソリューションに対して観察された相対コピー数に対するセグメントの横断カウントの標準偏差（ＲＭＳＤ）が計算され、次いで最小のＲＭＳＤの値をもつソリューション（複数可）が最適であるとしてラベル付けされる。

例
発明者らは、の方法を、どちらも癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトによって配列された、ＴＣＧＡ−０６−０６４８およびＴＣＧＡ−０６−０１５２に指定された２つの多形性膠芽腫（ＧＢＭ）試料に適用した。これらの試料から腫瘍配列データベースおよび整合された正常（血液）配列データベースを、腫瘍相対コピー数に対する正常な相対コピー数の見積を生成し、切断点を同定し、分離リード解析を実行する方法に記載したように処理した。両方の試料の腫瘍ゲノムおよび正常ゲノムを、ほぼ３０ｘの平均包括度に配列した。

合計３，６９６の切断点をＢＡＭＢＡＭによって同定し、そのうちの１３２の切断点がｂｒｉｄｇｅｔによって見出されて、推定切断点を直接スパニングする分離リードを有した。図４は、試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８内に見出された、すべての体細胞の切断点に対するリード支援のヒストグラムを示す。最小リード支援閾値を１００に設定することにより、ｂｒｉｄｇｅｔによって支援された１６の体細胞の切断点を除いたすべてを取り除いた。興味深いことに、これらの高度に支援された１６の切断点のすべては、図５に示したように、染色体１２のクラスタ領域内の高度に増幅されたセグメントの境界に近く、ゲノムブラウザは、試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８に対する相対コピー数（灰色の「全コピー数」）および高度に支援された切断点（切断点支援が１００のリードを超える「染色体間再構成」および「染色体内再構成」）を表示する。合計１６の増幅されたセグメントが見出され、１つのセグメントが、ＧＢＭ腫瘍発生に関与する公知の腫瘍遺伝子ＭＤＭ２を含む。事実、増幅されたセグメントのすべての境界を、増幅に出入するように正確に向けられた単一の切断点に関連付けることができる。これは、高度に支援された切断点および増幅が関連しており、実際に腫瘍ゲノム内の増幅されたセグメントの再構成された構造を表してもよいことを示唆している。

図６は、一部のセグメントが互いに近づき過ぎて図５のブラウザグラフ内に見えないように、それらのセグメントのサイズおよび位置を誇張した、これらの同じデータの図である。図６は、ＭＤＭ２を含む増幅された二重微小染色体の存在を示唆する、ＴＣＧＡ−０６−０６４８切断点グラフの循環ソリューションを示す。切断点リード支援は、腫瘍リードカウント／血液リードカウントとして一覧にされており、例えば、１３６５／９は、１，３６５個のリードが腫瘍内の切断点を支援し、９個の支援リードが血液内に見出されることを意味する。ソリューションは、セグメントの新しい構成におけるセグメントの順番および方向を一覧にし、マイナス記号は、逆方向のセグメントを示すために使用されている。増幅されたセグメントのコピー数は、平均腫瘍細胞内に存在する各セグメントのコピーが少なくとも４０個あることを示唆する。この図は、切断点グラフの視覚表示であり、切断点グラフをたどることにより、単一の最適なソリューションが見出される。このソリューションの興味深い態様は、それが循環であることであり、最後のセグメントの最終横断は開始位置に戻る、すなわち、最初の頂点は最終頂点でもある。循環ソリューションは、すべてのセグメントを丁度１回通過するが、コピー数は、腫瘍ゲノム内にそれぞれのセグメントのコピーがほぼ４０個あることを示唆する。それらの追加コピーを説明するために、１つがさらに３９のパスに対してセグメントをループスルーしなければならない。これらの追加のコピーは、多くの異なる構成内に存在することができ、２つの極致によって実証される。すなわち、（１）４０個のコピーを複製して、この正確な順番および方向でこれらのセグメントの切り目のない縦列整列を形成した、または（２）単一の自己複製二重微小染色体が形成され、その平均腫瘍細胞は４０個のコピーを蓄積した。喪失される、または異なる濃度で存在する増幅されたセグメントがないように、後者の選択肢は、再構成された配列（すなわち、最初の単位複製配列の境界頂点）内のほぼ同じ位置で起きるために、４０個の連続する縦列複製を必要としないので、明らかに後者の選択肢がより経済的である。したがって、データは、ＭＤＭ２を含む腫瘍遺伝子ＤＭがこのＧＢＭ腫瘍試料内に存在することを示唆する。

また腫瘍配列データベースおよび血液配列データベースの両方における切断点のすべてを高度に支援するためのリード支援も図６に示されている。まず、切断点は腫瘍内に非常に高度な支援を有し、一部の切断点は２，０００個を超える分離リードによって支援されることに留意されたい。これは、再構成が単位複製配列を画定するので期待されるべきであり、単位複製配列は非常に高いコピー数で存在する。さらに興味深いことは、すべての切断点も、患者の血液中の支援の量も驚くべき高さを示すことである。ＤＭの傾向が有糸分裂の連続段階後に喪失すると考えると、ＤＭは生殖細胞系列内に元来存在し、数十年間維持され、腫瘍発生中に増幅を受けたに過ぎないとは信じ難い。これは、ＤＭが選択的優位性を非癌性細胞に提供する傾向が低いことを考えると特に当てはまる。より経済的なソリューションは、この腫瘍遺伝子ＤＭが、体細胞に由来するものではなく、腫瘍発生前または腫瘍発生中のある時点で構築され増幅されたことである。このＤＭが出現する腫瘍細胞に提供した選択的優位性は、より少ない成長の優位性を有したＤＭのコピーを超えて、明白な成長の優位性を有するＤＭのより多いコピーを蓄積する細胞をもたらし、このＤＭの一部であると考えられる領域に見られる、均一な高いコピー数をもつ腫瘍細胞集団をもたらす。ＭＤＭ２が腫瘍遺伝子ＤＭ内にしばしば見出されるという事実は、この仮説（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９９３年２月、１５（２）、２８３〜９０）に対してさらに支持する働きをする。

他のＧＢＭ腫瘍試料の類似結果、ＴＤＧＡ−０６−０１５２は、本明細書に記載された方法によって処理された。腫瘍遺伝子ＣＤＫ４およびＭＤＭ２を含む染色体１２上の高度に増幅された領域、ならびにＥＧＦＲ腫瘍遺伝子を含む染色体７の領域のブラウザショットが、図７に示されている。ここでは、染色体（ａ）１２および（ｂ）７上の試料ＴＣＧＡ−０６−０１５２に対する、増幅されたセグメントおよび高度に支援された構造変異（リード支援は１００個を超える）のゲノムブラウザグラフが示されている。染色体１２上の増幅された小領域を染色体７上の増幅された領域に接合する紫の染色体間の切断点に留意されたい。これは、これらの領域のＥＧＦＲＡ図を含み、図８に示されている。ここでは、ＧＢＭ試料ＴＣＧＡ−０６−０１５２に対する切断点グラフの循環ソリューションが、腫瘍内に増幅された２つの分離した腫瘍遺伝子ＤＭの存在を示唆することを示す。ＭＤＭ２＋ＣＤＫ４の二重微小のソリューションは、一部のセグメントを複数回横断するが、追加横断のすべては、認められた相対コピー数内に構成される。２０個の切断点のうちの１１個は、患者の血液試料内の不一致のリードの証拠を示す。全体で、２つの染色体上の２９個のセグメントが増幅され、一部のセグメントは他よりはるかに高い相対コピー数を表示した。２０個の高度に支援された切断が見出され、前述のように試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８を伴い、すべての切断を相対コピー数内の切れ目に独自に関連付けることができる。切断点グラフを解くことにより、２つの独立した循環ソリューションが見出された。ソリューション（１）は、染色体１２上の２つの染色体内の切断点を使用し、腫瘍遺伝子ＣＤＫ４の１つのコピーおよび腫瘍遺伝子ＭＤＭ２の２つのコピーを含む。ソリューション（２）は、染色体７および１２上の増幅された領域をスパニングする２つの染色体間の切断点、および染色体１２上の２つの染色体内の切断点を包含し、腫瘍遺伝子ＥＧＦＲを含む。これらの２つのソリューションは、２つのＤＭがこの試料内に形成され増幅されたことを示唆し、その両方は、異なる腫瘍遺伝子を含み、成長する腫瘍細胞に著しい選択的優位性を提供する傾向がある。

ソリューション（１）は、試料ＴＣＧＡ−０６−０６４８内に観察されたより、増幅されたセグメントを通るはるかに多くの複雑な経路についても説明する。ソリューションにおいて高度に支援された切断点のすべてを包含するために、一部のセグメントを複数回横断しなければならなかった。２９個のセグメントのうちの１１個を２回横断し、１つの小さいセグメントを３回横断した。これらの横断によって予想されるはずであるコピー数の増加は、相対コピー数において観察され、平均腫瘍細胞は、このＤＭの約３５個のコピーを含む。２回横断されるセグメントは、およそ７０個のコピー数を有する。３回横断されたセグメントは、２回横断されたセグメントに比較してコピー数が増加したように見えるが（約８５対約７５）、小さいサイズのこのセグメントは、正確な相対コピー数を計算することが困難である。

前述のように、患者ＴＣＧＡ−０６−０１５２の血液試料中に腫瘍切断点の証拠は存在するが、ＴＣＧＡ−０６−０６４８の血液試料内に観察されるより低い程度である。２０個の切断点のうちの１１個は、低レベルのリード支援を有するが、９個の切断点は、血液中にリード支援がない。このことが起こる場合の理由は多数ある。例えば、血液データはより低い包括度で配列されることがあり、あらゆる所与の体細胞の切断点を横切る配列の機会がより低くなる。あるいは、理由は生物学の性質にあることがあり、それによって一部の機構は、ＴＣＧＡ−０６−０１５２の腫瘍を誘導して、ＤＭを血流の中にＴＣＧＡ−０６−０６４８より低い率で流し、血液中に観察されるＤＭの濃度が低減した。

次いで、ＤＭ特有の切断点の血液中に腫瘍の不一致のリードが存在することは、これらのＧＢＭが媒介するＤＭが、血液脳関門を横切り、患者の血流に入ることを示唆する。最も興味深いことは、血液中のＧＢＭが媒介するＤＭの数は、ＤＭ特有の切断点が患者の血液のみから由来する平均包括度で配列するデータを使用して検出可能であるということである。並べる証拠は腫瘍遺伝子ＤＭの存在を強く示唆するが、増幅された腫瘍遺伝子のＦＩＳＨ（蛍光インサイチュー・ハイブリダイゼーション）解析は、この仮説を確認するために腫瘍試料および整合された正常試料の両方で実行されなければならないはずである。

別の視点から見ると、ゲノムの不安定性および構造再構成は癌ゲノムの独特な特質であることを理解されたい。次世代配列技術で、腫瘍発生および進行を通して起きる構造再構成を測定する発明者らの能力は、著しく向上したが、これらの事象のより良好な理解に役立つために再構成の発見、解析、および可視化方法の急務が発生した。

これらの課題に対処するために、発明者らの配列解析の供給経路は、個々の腫瘍の変異、小さいインデル、コピー数の変化、対立遺伝子特有の増幅および欠失、ゲノム再構成の発見を簡素化する。例えば、１つの代表的な解析では、再構成は、利用可能な場合は、切断点の近くに見出されるマッピングされていない推定分離リードを使用して、切断点の精度のために精緻化される。次いで結果が、好ましくは、高レベルの処理結果ならびに結果が由来する生データの両方の解析および可視化を提供する、相互作用するウェブベースのゲノムブラウザで表示され、これは図９に概略的に示されている。

体細胞の再構成を同定するために試料の整合された正常配列を使用して、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトから１７の全ゲノム多形性膠芽腫（ＧＢＭ）腫瘍試料において機密性の高い、小規模および大規模の体細胞の事象を発見するために配列解析の供給経路を使用した。これらの試料内で同定された多くの興味深い構造異常のなかで、発明者らは、図１０Ａ／Ｂおよび１１Ａ／Ｂに見られるように、循環二重微小染色体をベースレベルの精度で構築するために組み合わせることができた、異常増幅の領域内に複雑な再構成パターンをもつ２つの腫瘍を発見した。二重微小に特有の切断点の証拠は、血液の配列データ内に見出され、患者特有のＰＣＲベースの分析が、脳腫瘍の進行を監視する際に、代理として使用する体細胞の再構成の存在の量を測るために開発できる可能性を高めた。

また４つのＧＢＭ腫瘍は、それによりＥＧＦＲのエクソン２−６が削除される、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異遺伝子の存在を示すＥＧＦＲの増幅および再構成を示すことが分かった。ＥＧＦＲｖＩＩＩに関連した切断点のリード支援を近隣の正常にマッピングされたリードの量と比較することは、腫瘍内のＥＧＦＲコピーの総数のごく一部として存在する、ＥＧＦＲｖＩＩＩ突然変異が野生型ＥＧＦＲの増幅後に出現することを示唆する。例示的結果は、図１２Ａ／Ｂに示されている。

したがって、相対コピー数を切断点と統合する能力は、癌細胞のゲノム技術を理解する新しい方法を提供することを理解されたい。より詳細には、発明者らは、腫瘍の高度に増幅された領域の場合に、観察されたコピー数および高度に支援された切断点のどちらも、単純な切断点グラフを解くことにより完全に説明することができ、これは腫瘍ゲノム内の高度に増幅されたセグメントの順番および方向を説明することを実証した。

本明細書で論じたＧＢＭ試料では、増幅されたセグメントの切断点グラフの最適なソリューションは循環である。これらの循環ソリューションは、観察された増幅された領域が二重微小を呼ばれる循環染色体を形成することがあることを示唆する。それぞれの二重微小上の腫瘍遺伝子およびそれらの高度に増幅された状態の存在は、二重微小が強靭な腫瘍遺伝子の可能性を有し、選択的優位性を腫瘍細胞に与え、それらの形成が両方のＧＢＭ腫瘍の腫瘍形成において重要事象であったことを示唆する。

両方の腫瘍の進行に非常に大きな影響力を有した傾向がある、１対のこれらの腫瘍ゲノムの再構築と同様に重要なことは、ＤＭに特有の切断点のほぼすべてが、当該患者の血液中に検出可能なリード支援も有するという事実である。この発見は、ＧＢＭが媒介するＤＭが、一部の機構により血流に入ることを示唆し、これは、ＧＢＭ腫瘍を特徴付ける腫瘍遺伝子ＤＭを、予め腫瘍配列を必要とせず、血液試料を使用して検出し監視し得ることを示唆するので、特に重要である。

これらの腫瘍遺伝子ＤＭに対する１つの可能な移送機構は、微小胞を介することであり、微小胞は、様々な細胞成分を含むことができる、ほとんどの細胞型から放出された細胞膜の細胞外断片である。研究は、腫瘍細胞が、診断および監視のために使用される可能性を有する、核酸およびタンパク質を含む、複数の細胞内粒子を含有する大量の微小胞を放出することを示した。初めにｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび血管新生タンパク質が、ＧＢＭ腫瘍をもつ患者から取った血清内に同定された（Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００８年１２月、１０（１２）、１４７０〜１４７６）。最近になって、Ｂａｌａｊら（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ２０１１年、２、１８０）は、増幅された腫瘍遺伝子配列、特にｃ−Ｍｙｃをもつ一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含有する微小胞を取り出した。

血流内のＤＭを検出する能力は、非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲおよび急性骨髄性白血病におけるｃ−Ｍｙｃなどの公知の腫瘍遺伝子を含有する、高度に増幅されたＤＭを一般に特徴とする他の癌に拡げるべきである。事実、この方法でＤＭを検出する能力を、血流がより利用しやすい場合に腫瘍型に対して改善し得る。さらに、一般にＤＭベースの機構を介して増幅された遺伝子を特に目標とする薬品は、血流のみから収集された証拠に基づいて処方されてもよく、痛みおよびＧＢＭ腫瘍の場合は危険な腫瘍生検標本を回避する。

ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｙｃ、ＭＤＭ２などの公知の腫瘍遺伝子を包囲する領域が、増幅された二重微小を示すクラスタ型の切断点を示すかどうかを確実に判定するために、血液試料の全ゲノム配列データを包含する配列ベースの分析を想定することができる。こうした領域を横切る不一致のリードを組み合わせることにより、血流内のＤＭの濃度が低いときでも、これらの領域を同定する能力を向上させるべきである。微小胞がＤＭを実際に移動させる場合は、微小胞を高める技法は、血液試料から低レベルの腫瘍遺伝子ＤＭを検出する能力をさらに向上させる。

したがって、に基づいて、本明細書に提示された分子診断ツールを、腫瘍性疾患の診断および／または確認に疾患の予備知識を持たずに利用できることを理解されたい。最も好ましくは、生体試料は血液または血液の血清／血漿分画であるが、生検材料または吸引液を含んでもよい。一層さらに、このような診断方法は、すべてのタイプの腫瘍性疾患、特に癌（例えば、様々な癌、リンパ腫、および肉腫）に適切であり得ることが企図される。

それ故に、発明者らは特に、１つまたは複数の再構成の型の遺伝子情報の使用および／または同定を企図し、最も好ましくは、遺伝子情報を全血（またはそれを処理した断片）から直接獲得することを企図する。最も典型的には、再構成の型は、特に環状分子がゲノム材料（通常、３Ｍｂ以下のサイズを有する）から形成される、ゲノム再構成を含む。特に企図された使用および方法では、環状に再構成されたゲノム材料は、腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子の少なくとも一部を含む。しかし、最も典型的には、環状に再構成されたゲノム材料は、腫瘍遺伝子および／もしくは腫瘍抑制遺伝子の完全な機能または少なくとも完全に発現可能な形を含む。したがって、哺乳類の試料は、様々な治療法、診断法、または予後方法において解析できる（好ましくは、二重微小を検出する簡単な血液検査を使用し、特に腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子を含む二重微小。それ故に、また担癌の固体が血流内に二重微小を有する（特に腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子を含む二重微小）という観察を前提として、新しいまたは今まで未確認の腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子は、担癌の固体から（または細胞培養もしくは動物モデルからさえ）取り出された二重微小の解析から発見されることがあることを認識されたい。

さらなる観察に基づいて、ゲノム情報に対する二重微小の数値的比率を、疾患、特に腫瘍性疾患の徴候に対する閾値として利用してもよいことも、発明者らは企図する。したがって、二重微小の解析は、癌の危険性または転移を予測するために、先行指標として使用されてもよい。当然のことながら、二重微小は、このような解析に必ずしも腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子を含む必要がないことに留意されたい。

さらに、二重微小内の腫瘍遺伝子のタイプは、特定のタイプの疾患、特に腫瘍性疾患に関連付けられてもよいことが企図される。したがって、全血からのゲノム再構成の解析、ならびに二重微小内の腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子の同定／数量化は、特定の腫瘍のタイプ、進行、および／または危険性に有益な情報を提供し得る。したがって、多数の全血ベースの試験（例えば、非分離、濾過など）は、疾患の診断または予測における腫瘍遺伝子の検出に特に有益であると考えられる。例えば、特定の切断点および特定の腫瘍タイプに特有の再構成を確立すると、特にこのような再構成（およびＤＭ）の存在および／または量を同定する役に立つプライマーを設計できる。同様に、治療効果または薬物効果は、二重微小の解析、特に腫瘍遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子を含む二重微小の解析を使用する方法で決定されてもよい。試験のこのような方法は、ある種の化学療法および／または放射線治療において特に有益であることがあり、これは二本鎖切断（またはその修復阻害）に基づく。

二重微小は、全血から大量に取り出すことができるという観察に基づいて、発明者らは、二重微小をタンパク質、リポタンパク質、脂質、および／または小胞構造、特に微小胞に関連付けてもよいことも企図する。したがって、二重微小が微小胞内でカプセル化される場合、微小胞からの表面エピトープは、それから微小胞が生じる細胞を代表することを理解されたい。それ故に、腫瘍起源（例えば、組織型）を、微小胞膜成分の解析に基づいて同定することができる。

すでに記載されたものに加えて、より多くの修正形態が、本明細書の発明概念から逸脱することなく可能であることが、当業者には明らかであるべきである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神以外に限定されない。さらに、本明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、すべての用語は、文脈と一致する可能な最も広い範囲の方法で解釈されるべきである。特に、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、非排他的手法で要素、構成要素、もしくはステップを指すように解釈されるべきであり、言及された要素、構成要素、もしくはステップは、存在してもよく、または利用されてもよく、または明確に言及されていない他の要素、構成要素、もしくはステップと組み合わせられてもよいことを示す。本明細書の主張が、Ａ、Ｂ、Ｃ…およびＮからなる群から選択されたものの少なくとも１つを指す場合、その文はＡプラスＮではない、またはＢプラスＮではないなどの群から唯一の要素を必要とすると解釈されるべきである。