特表 2015-505823 アミロイド結合剤としてのバクテリオファージのＰ３の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-505823(P2015-505823A)

(43)【公表日】2015年2月26日

(54)【発明の名称】アミロイド結合剤としてのバクテリオファージのＰ３の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20150130BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150130BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150130BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20150130BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20150130BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20150130BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150130BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150130BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150130BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150130BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150130BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150130BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20150130BHJP

   C07K 14/01 20060101ALI20150130BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20150130BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150130BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/02ZNA

   A61K39/395 N

   A61K49/00 A

   A61P25/28

   A61P43/00 111

   A61P25/16

   A61P35/00

   A61P21/02

   A61P25/00

   A61P25/14

   A61K35/76

   A61K48/00

   C07K19/00

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12P21/02 C

   C07K14/01

   C07K16/00

   C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

【全頁数】112

(21)【出願番号】特願2014-543617(P2014-543617)

(86)(22)【出願日】2012年11月28日

(85)【翻訳文提出日】2014年6月30日

(86)【国際出願番号】US2012066793

(87)【国際公開番号】WO2013082114

(87)【国際公開日】20130606

(31)【優先権主張番号】61/564,602

(32)【優先日】2011年11月29日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/708,709

(32)【優先日】2012年10月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/730,316

(32)【優先日】2012年11月27日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】514131179

【氏名又は名称】ニューロファージ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】クリシュナン， ラジャラマン

【テーマコード（参考）】

4B024

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024AA11

4B024BA61

4B024BA80

4B024CA07

4B024EA03

4B024EA04

4B064AG01

4B064AG26

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90Y

4B065AA98Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA13

4C084CA01

4C084NA14

4C084ZA022

4C084ZA052

4C084ZA152

4C084ZA162

4C084ZA942

4C084ZB212

4C084ZB262

4C084ZC212

4C085AA14

4C085CC08

4C085CC23

4C085EE01

4C085HH03

4C085KA04

4C085KA29

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA05

4C087ZA15

4C087ZA16

4C087ZA94

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZC21

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045DA75

4H045EA21

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、アミロイドの形成を低減し、及び／又はアミロイドタンパク質の脱凝集を促進するための剤及び医薬組成物に関する。組成物はまた、アミロイドを検出するために用いられ得る。本発明者は、ファージｇ３ｐがアミロイド線維に直接結合すること、及びファージにより仲介される脱凝集が、この最初の結合工程に依存することを見出した。ｇ３ｐが糸状ファージにより仲介されるアミロイド結合に関与するという本発明者の認識は、バクテリオファージの治療上の有効性についてのメカニズムを提供し、並びに治療及び診断の新規分類の基礎を提供する。
【選択図】図１７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミロイドに結合するポリペプチドを含む医薬組成物であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１個の遺伝子３タンパク質（ｇ３ｐ）又はそのアミロイド結合フラグメント、及び医薬的に許容される担体を含み、ここで、前記組成物がバクテリオファージを含まない、医薬組成物。

【請求項2】

前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、請求項１記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ポリペプチドがｇ３ｐの全Ｎ２ドメインを含む、請求項２記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ１ドメインのフラグメントを更に含む、請求項２または３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記ポリペプチドがｇ３ｐの全Ｎ１ドメインを更に含む、請求項２または３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記ポリペプチドがｇ３ｐを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドに共有結合又は非共有結合のいずれかで結合した担体を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記ポリペプチド中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、野生型ｇ３ｐの対応する部分のアミノ酸配列と同一である、請求項１〜７のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記ポリペプチド中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントが、変異体ｇ３ｐである、請求項１〜８のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項10】

ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、配列番号：１〜２０のいずれか１つの対応する部分と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は１００％同一である、請求項１〜９のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記ポリペプチドがｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインを含み、Ｎ２のヒンジ領域が、ヒンジＴｍが野生型Ｍ１３ファージのヒンジＴｍより低くなるよう、変異誘発され、前記ポリペプチドがＭ１３より高い親和性でアミロイドに結合する、請求項９又は１０記載の医薬組成物。

【請求項12】

アミロイドに結合する第１のドメインを含む融合タンパク質であって、第１のドメインが、少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント；及び第２のドメインを含む、融合タンパク質。

【請求項13】

前記第１のドメインがｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、請求項１２記載の融合タンパク質。

【請求項14】

前記第１のドメインが全Ｎ２ドメインを含む、請求項１２又は１３記載の融合タンパク質。

【請求項15】

前記第１のドメインがｇ３ｐのＮ１ドメインのフラグメントを更に含む、請求項１３又は１４記載の融合タンパク質。

【請求項16】

前記第１のドメインがｇ３ｐの全Ｎ１ドメインを更に含む、請求項１３又は１４記載の融合タンパク質。

【請求項17】

前記第１のドメイン中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントのアミノ酸配列が、野生型ｇ３ｐの対応する部分のアミノ酸配列と同一である、請求項１２〜１６のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項18】

前記融合タンパク質中に存在する少なくとも１個のｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントが変異体又は変種ｇ３ｐである、請求項１２〜１７のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項19】

前記第１のドメインが、アミロイドに結合する能力を保持し、配列番号：１〜２０のいずれか１つのアミノ酸配列の対応する部分で整列させたとき、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有するｇ３ｐの変異体又は変種、又はそのフラグメントを含む、請求項１８記載の融合タンパク質。

【請求項20】

前記第１のドメインが、ｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインフラグメントを含み、Ｎ１及びＮ２ドメインの少なくとも１つが、アミロイドに結合するフラグメントの能力を破壊しない変異を含み、Ｎ１及びＮ２ドメインフラグメントが、配列番号：１〜２０のいずれか１つの対応するアミノ酸で整列させたとき、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有する、請求項１８記載の融合タンパク質。

【請求項21】

前記第２のドメインが免疫グロブリン定常領域を含む、請求項１２〜２０のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項22】

前記免疫グロブリン定常領域がＦｃフラグメントである、請求項２１記載の融合タンパク質。

【請求項23】

前記Ｆｃフラグメントが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＭのＦｃフラグメントから選択される、請求項２２記載の融合タンパク質。

【請求項24】

配列番号：９、配列番号：１１、又は配列番号：１３に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２記載の融合タンパク質。

【請求項25】

配列番号：９、配列番号：１１、又は配列番号：１３と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４記載の融合タンパク質。

【請求項26】

請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。

【請求項27】

変異体又は変種ｇ３ｐを発現する単離糸状ファージを含む、医薬組成物。

【請求項28】

変異体又は変種ｇ３ｐのアミノ酸配列が、配列番号：１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一である、請求項２７記載の医薬組成物。

【請求項29】

５以上のコピーのｇ３ｐ、又は５以上のコピーの変異体又は変種ｇ３ｐを発現する単離糸状ファージを含む、医薬組成物。

【請求項30】

必要とする患者において、アミロイドの低減、アミロイド形成の阻害、アミロイド凝集の阻害、又は毒性オリゴマーの形成の除去及び／又は予防において使用するための、請求項１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項31】

早発型アルツハイマー病、後発型アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含むアルツハイマー病；パーキンソン病；ＳＡＡアミロイド症；シスタチンＣ；遺伝性アイスランド症候群；老衰；多発性骨髄腫；クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、又はＳＣＡ７）；ハンチントン病；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症；球脊髄性筋萎縮症；遺伝性脳アミロイド血管症；家族性アミロイドーシス；前頭側頭葉型認知症；イギリス型／デンマーク型認知症；及び家族性脳症から選択される疾患又は状態の処置において用いるための、請求項１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項32】

患者が、バイオマーカーがポジトロン放出断層撮影においてイメージング剤として用いられるとき、バイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、請求項３０又は３１記載の医薬組成物。

【請求項33】

疾患又は状態がパーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、請求項３０〜３２のいずれか１項記載の医薬組成物。

【請求項34】

疾患又は状態がアルツハイマー病である、請求項３３記載の医薬組成物。

【請求項35】

疾患又は状態がプリオン病である、請求項３１記載の医薬組成物。

【請求項36】

プリオン病が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択される、請求項３５記載の医薬組成物。

【請求項37】

必要とする患者におけるアミロイドの低減方法であって、患者に有効量の請求項１〜１１又は２６〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物、又は請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質を投与することを含む、方法。

【請求項38】

患者が、アミロイドの存在と関連する神経変性疾患の症状を示している、請求項３７記載の方法。

【請求項39】

患者が、バイオマーカーがポジトロン放出断層撮影においてイメージング剤として用いられるとき、バイオマーカーフロルベタピルに対して陽性である、請求項３７又は３８記載の方法。

【請求項40】

神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である、請求項３７〜３９のいずれか１項記載の方法。

【請求項41】

神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項４０記載の方法。

【請求項42】

患者が、プリオンにより仲介される疾患の症状を示している、請求項３７記載の方法。

【請求項43】

プリオンにより仲介される疾患が、クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病、致死性家族性不眠症、又はゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群から選択される、請求項４２記載の方法。

【請求項44】

アミロイドに結合するポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドがｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントを含み、ポリペプチドが配列番号：１に対してｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント中に１個以上の変異を含み、変異がＱ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａからなる群より非限定的に選択される、核酸。

【請求項45】

ポリペプチドが、ｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、請求項４４記載の核酸。

【請求項46】

請求項４４又は４５記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項47】

請求項４６記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項48】

アミロイドに結合するポリペプチドの製造方法であって、ポリペプチドがｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントを含み、ポリペプチドが配列番号：１に対してＮ２中に１個以上の変異を含み、変異がＱ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａからなる群より非限定的に選択され、請求項４６記載のベクター中の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させ、発現したタンパク質を単離する、を含む方法。

【請求項49】

ポリペプチドが、ｇ３ｐのＮ２ドメインのアミロイド結合フラグメントを含む、請求項４８記載の方法。

【請求項50】

請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項51】

請求項５０記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項52】

請求項５１記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項53】

請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質の製造方法であって、請求項５１記載のベクター中の核酸によりコードされる融合タンパク質を発現させ、発現した融合タンパク質を単離する、を含む方法。

【請求項54】

組成物中のポリペプチド又は融合タンパク質が更に検出可能な標識を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の医薬組成物、又は請求項１２〜２５のいずれか１項記載の融合タンパク質。

【請求項55】

標識が、^１８Ｆ、^１１Ｃ、又は^１２３Ｉから選択される放射性標識である、請求項５４記載の医薬組成物又は融合タンパク質。

【請求項56】

ａ）患者に請求項５４記載の医薬組成物又は融合タンパク質を投与し；
ｂ）標識を検出する
工程を含む、患者におけるアミロイドの検出方法。

【請求項57】

標識がポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）により検出される、請求項５６記載の方法。

【請求項58】

請求項５４又は５５記載の組成物を含む、イメージング剤。

【請求項59】

患者におけるアミロイドと関連する疾患又は異常の診断方法であって、
ａ）患者に請求項５８記載のイメージング剤を投与し；
ｂ）存在するアミロイドのいずれかに前記イメージング剤を結合させ；
ｃ）アミロイドに結合したイメージング剤を検出し；
ｄ）イメージング剤が検出された場合に、アミロイドと関連する疾患又は異常を診断する
工程を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、糸状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、及びｇ３ｐのアミロイド結合変異体及び変種を含む医薬組成物、及び疾患（例えば、全身性及び限局性アミロイド病、神経変性タウオパチーを含む神経変性疾患、及び伝達性海綿状脳症（プリオン関連疾患））と関連するアミロイド負荷を低減するための治療としてのかかる組成物の使用に関する。これらの疾患と関連するアミロイド負荷の蓄積を予防するためのこれらの組成物の使用、及びアミロイドを検出し、故にかかる疾患を診断するための診断としてのこれらの組成物の使用も包含される。

【背景技術】

【0002】

糸状バクテリオファージＭ１３、及び関連糸状ファージは、タンパク質ミスフォールディング病の動物モデルにおいて有用性を示し、それ故、タンパク質ミスフォールディング病に対する可能性のある薬効分類を表す。米国公開公報第２０１１／０１４２８０３号（本明細書において引用により全体として取り込まれる）を参照。特に、糸状バクテリオファージは、脳において既に形成されたアミロイドのクリアランスを仲介する能力を有することが発見された。例えば、国際公開公報第２００６０８３７９５号及び国際公開公報第２０１００６００７３号（本明細書において引用により全体として取り込まれる）を参照。

【0003】

アミロイド形成疾患は、脳における神経細胞の変性及びミスフォールディングし、凝集したタンパク質の存在により特徴付けられる。これらのミスフォールディングしたタンパク質及び凝集したタンパク質は異なる疾患において変わるが、大抵の場合、コンゴーレッド色素に結合するクロスβプリーツシート構造を有し、青リンゴ色の複屈折を示す。アミロイドの除去は、アミロイドにより特徴付けられる様々な疾患と関連する症状を低減するか、症状の進行を遅延させるか、又は症状を逆転させることが予測される。

【0004】

アミロイド形成疾患と関連する病理及び／又は症状を予防し、及び／又は逆転させる可能性のある治療アプローチは、例えば、アミロイド形成の阻害、アミロイドクリアランスの促進、及びアミロイド凝集の阻害を含む。例えば、Ａｇｕｚｚｉ ＆ Ｏ−Ｃｏｎｎｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ （２０１０） ９：２３７−４８を参照。毒性オリゴマーの形成の除去及び／又は予防はまた、アミロイド形成疾患の処置及び予防においても有益であり得る（同上）。

【0005】

ミスフォールディングしたタンパク質及び／又は凝集したタンパク質と関連することが知られている神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病、神経変性タウオパチー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１）、（ＳＣＡ３）、（ＳＣＡ６）、（ＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症を含む前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、イギリス型／デンマーク型認知症、及び家族性脳症を含む。他の疾患は、抹消におけるミスフォールディングしたタンパク質及び／又は凝集したタンパク質に関与する（いわゆる限局性アミロイドーシス）。例えば、Ｃｈｉｔｉ ＆ Ｄｏｂｓｏｎ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ （２００６） ７５：３３３−６６；及びＪｏｓｅｐｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （２０１１） １２２：１３７−１５３を参照。症状又はこれらの疾患の重症度を処置するか又は低減するために、アミロイド凝集物形成（すなわち、ミスフォールディングしたタンパク質及び／又は凝集したタンパク質）を予防し、及び／又は低減することが大いに必要である。

【0006】

近年、Ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、「全」認知症及びアルツハイマー病認知症の診断基準を公開した。ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ， （２０１１） ７（３）：２６３−９を参照。このガイドラインに基づき、「全」認知症は、行動又は認知症状が５つの検査（例えば、仕事又は通常の活動で機能する能力の障害、及び機能及び実行の前レベルからの減少）を満たすとき、診断される。検査は、問診と客観的認知評価との組み合わせを含む。本明細書に記載される通り、糸状バクテリオファージｇ３ｐタンパク質、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、及びｇ３ｐのアミロイド結合変異体及び変種がアミロイドにより結合するという発見により、「全」認知症及びアルツハイマー型認知症を含む、アミロイドの形成から生じる任意の疾患又は認知症を診断する補足方法が提供される。

【0007】

糸状バクテリオファージは、細菌細胞に感染し、環状１本鎖ＤＮＡゲノムを含有する、構造上関連するウイルスのグループである。これらは、増殖性感染中、宿主を殺傷しない（Ｒａｓｃｈｅｄ ａｎｄ Ｏｂｅｒｅｒ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ （１９８６） ５０：４０１−４２７）。糸状バクテリオファージの例は、Ｆｆファミリーのファージ（例えば、Ｍ１３、ｆ１、及びｆｄ）を含む。ｆｄのヌクレオチド配列は１９７８年から知られている（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９７８） ５（１２）：４４９５−４５０３）。Ｍ１３の全配列は１９８０年に公開されている（ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９８０） １１：１２９−１４８）。ファージｆ１は、１９８２年までに配列決定された（Ｈｉｌｌ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８２） ４４（１）：３２−４６）。ｆ１ゲノムは、ファージｆｄに満たない６４０７個のヌクレオチドを含む。それは、ｆｄ配列と１８６個のヌクレオチド（１個のヌクレオチド欠損を含む）で相違し、これによりファージｆ１とｆｄのタンパク質間で１２個のアミノ酸相違を生じる。ｆ１配列は、Ｍ１３のものと５２個のヌクレオチドで相違し、これにより対応するタンパク質間で５個のアミノ酸相違を生じる（同上）。Ｍ１３及びｆｄのＤＮＡ配列は１９２個（３％）のヌクレオチドで変わり、これらの相違の１２個のみが、対応するアミノ酸配列における変化（６．２５％）を生じる（ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ （１９８０） １１：１２９−１４８）。

【0008】

糸状ファージの構造は十分に確立されており、例えば、Ｍａｒｖｉｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． （１９９８） ８：１５０−１５８；Ｒａｓｃｈｅｄ ａｎｄ Ｏｂｅｒｅｒ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ （１９８６） ５０（４）：４０１−４２７において概説されている。糸状ファージは、遺伝子８によりコードされる、数千コピーの主要なカプシドタンパク質（ｇ８ｐ、ｐ８、又はｐＶＩＩＩ）を含む「コート」を有する。これは、ファージの特徴的糸状形を形成する集合ｇ８ｐ−ＤＮＡ複合体である。少量のコートタンパク質、すなわち、たった数（３〜５）コピーに存在するものは、フィラメントの末端に位置する。これらのｔｉｐタンパク質の１つであるｇ３ｐ（ｐ３又はｐＩＩＩとしても知られている）は、細菌宿主結合に必要であり、感染を開始する。

【0009】

Ｍ１３ファージは４０６個のアミノ酸の成熟型ｇ３ｐを有する。ＧｅｎＢａｎｋ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＰ＿５１０８９１．１は、１８残基のアミノ末端のシグナル配列を含む参照配列を提供する。公開された配列と比較してアミノ酸相違を有する変異が一般的である。Ｉファミリーの糸状ファージは、Ｆｆファミリーメンバーと異なるｇ３ｐを有するが、ファミリーｇ３ｐ間でさえ依然高度に保存されている（Ｓｔａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ （１９９２） ３４：１４１−５２）。

【0010】

ｇ３ｐの結晶構造は入手可能である（Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （１９９８） ７（６） ７１１−７２２）。タンパク質は、可動性のグリシンリッチなリンカー配列により区別される３個の折り畳みドメインを含む。相互作用してＮ１−Ｎ２複合体を形成する、２６２個のアミノ酸を含む２個のアミノ末端ドメインであるＮ１及びＮ２が存在する。カルボキシ末端（ＣＴ、Ｎ３とも呼ばれる）ドメインは、１４６個のアミノ酸であり、ｇ８ｐとの疎水性相互作用によりファージ粒子においてアンカーｇ３ｐを生じる（Ｍａｒｖｉｎ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ． ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９８） ８：１５０−１５８）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ， Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９９） ２８８（４）：６４９−５７のＮ１−Ｎ２ドメイン融合タンパク質２ｇ３ｐを用いて調製される、公的に入手可能なリボン構造が図１に提示される。

【0011】

大抵のタンパク質とは異なり、Ｎ１及びＮ２ドメインの潜在的な「ロックされた」形態からのアンフォールディングは、天然の生物学的活性を獲得するためにｇ３ｐに必要とされる（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００７） ３７３：４５２−４６１）。感染の最初の工程において、Ｎ２は、細菌のＦ−ｐｉｌｕｓにＮ２の外縁上の残基を介して結合する（Ｄｅｎｇ ＆ Ｐｅｒｈａｍ， ２００２）。Ｎ２によるこの最初の結合は、Ｎ１−Ｎ２複合体を「開口すること」によりｇ３ｐを「アンロック」し、これにより次にＮ１が共受容体ＴｏｌＡに結合することを可能にする。ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメントにおいて、Ｎ２がアンフォールドする開始アンロック工程のため、熱転移は融点（Ｔ_Ｍ）４８．１℃で生じる。プロセスの一部は、Ｇｌｎ２１２−Ｐｒｏ２１３ペプチド結合での異性化を含む。Ｐｒｏ２１３変換は、アンロックされた状態でｔｒａｎｓである。Ｎ１は、Ｔ_Ｍ６０．２℃で生じる第２の工程まで安定に折り畳まれたままである（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ， ２００７において概説される）。
Ｎ１−Ｎ２フラグメントにおける変異を用いて、種々の変異体の安定性及び感染性が研究された（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ， ２００７）。「３Ａ」と命名された１つの変種は、線毛結合を障害し、Ｎ２ドメインの安定性を低減した。この変異のため、Ｔ_Ｍは４２．６℃まで低減される。３Ａは、次の変異：Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａを有する。Ｎ２における別の変異体Ｇ１５３Ｄは、Ｎ２を不安定化し、Ｔ_Ｍを４４．４℃まで低減する。Ｑ１２９Ｈ変異体は、Ｎ２を安定化し、Ｔ_Ｍを５１．４℃まで増大する。ＩＹ変種は、ヒンジにおける変異Ｔ１０１Ｉ及びＤ２０９Ｙを含有し、Ｎ１−Ｎ２フラグメントの安定性を増大する（Ｔ_Ｍ＝５６．５℃）。ＩＨＹは、変異Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、及びＤ２０９Ｙを含有する（Ｔ_Ｍ＝６０．１℃）。ＩＩＨＹは、変異Ｔ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、及びＤ２０９Ｙを含有する（Ｔ_Ｍ＝６１．８℃）。Ｑ１２９Ｙ変異とＴ１３Ｉ変異の両方が安定化し、これらの変異の追加は更に融点Ｔ_Ｍを増大する。ファージ感染性は、ｇ３ｐ内のドメイン相互作用の強さと逆に変動した（Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ， ２００７）。Ｎ２ドメインの欠損（ファージｆｄ（ΔＮ２））は、ＴｏｌＡのＮ１結合に対するＮ２ドメインの阻害作用を取り除くことにより、感染性を増大した（同上）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１１／０１４２８０３号

【特許文献2】国際公開第２００６０８３７９５号

【特許文献3】国際公開第２０１００６００７３号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明は、糸状ファージのアミロイドへの結合を、ファージが細菌に感染するプロセスに類似の方法で仲介するという発見に一部基づく。米国特許第７，８６７，４８７号は、患者において報告されたアミロイドを脱凝集する際のファージの治療上の有効性の基礎となるメカニズムが、ファージの長さ、薄さ、構造が、ファージがアミロイド線維に沿って組織化することを可能にし得るということを仮定した。加えて、主要なコートタンパク質であるｇ８ｐ中に存在する高いアルファヘリカル含量が、アミロイドのベータシート構造と干渉し得ることが提案された。このメカニズムは、ナノモル量のファージが、マイクロタイター量のβ−アミロイドを脱凝集させることができるという患者の報告と一致し、ファージ（すなわち、ｇ８ｐ）の高コピー成分が作用を仲介することを示唆する。これは、糸状ファージと類似の構造を有するタバコモザイクウイルスが脱凝集を引き起こし得るという、米国特許第２０１１０１８２９４８号における報告とも一致する。従って、この従前の研究は、インタクトな構造（多数のアルファらせん体を有する長いフィラメント）が治療的作用に重要であるか、又は特定のコートタンパク質が重要であるなら、それはファージコート（例えば、ｇ８ｐ）上に高度に表されたタンパク質であることのいずれかを示唆した。この従前の研究のうち、インタクトなファージと対立したバクテリオファージの単離成分が、アミロイドに結合し、及び／又は脱凝集を引き起こし得るという示唆を提供したものはない。更に、糸状バクテリオファージの少量のコートタンパク質は、アミロイドに結合し、脱凝集させる能力において機能したという示唆も存在しない。

【0014】

しかしながら、この開示は、作用の代替（必ずしも相互排他的でない）メカニズムの証拠を提供する。本発明者は、ファージｇ３ｐがアミロイド線維に直接結合すること、及びファージにより仲介される脱凝集が、この最初の結合工程に依存することを見出した。ｇ３ｐが糸状ファージにより仲介されるアミロイド結合に関与するという本発明者の認識は、バクテリオファージの治療上の有効性についてのメカニズムを提供し、並びに治療及び診断の新規分類の基礎を提供する。

【0015】

本発明の更なる目的及び利点は、一部は以下の記載で説明され、一部は記載から明らかであるか、又は本発明の実施により獲得され得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求の範囲において具体的に指摘された要素及び組み合わせにより実現され、達成される。

【0016】

前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載共に例示及び説明のみであり、請求の本発明の制限ではないことは理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、ｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメイン、及びヒンジのリボン構造を表す。

【図2A】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。

【図2B】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。

【図2C】図２Ａ〜２Ｃは、異なる供給源由来のｇ３ｐのアライメントを表す。図２Ａは、共通配列（配列番号：４）を含む、ファージＭ１３（配列番号：１）、Ｆｄ（配列番号：２）、及びＦ１（配列番号：３）由来のｇ３ｐのアライメントである。図２Ｂは、Ｉ２−２とＩｋｅ（配列番号：７）間の共通配列に沿った、ファージＩ２−２（配列番号：５）及びＩｋｅ（配列番号：６）由来のｇ３ｐのアライメントを示す。図２Ｃは、ファージＩｆ（配列番号：８）由来のｇ３ｐのアミノ酸配列を表す。

【図3】図３Ａは、ファージ結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）調査を表す。Ａβ原線維への結合を、Ａβモノマーへの結合と、バイオセンサーチップを横切って流した１０^１４ファージ／ｍＬを用いて比較した。図３Ｂは、図３Ａに示すＳＰＲデータから計算したＫ_ａ、Ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄを示す。

【図4】図４Ａ及び４Ｂは、結合研究を提示する。図４Ａは、増加モル量のｆＡβ４２を用いた２種のファージ用量（１０^１１／ｍＬ及び１０^１２／ｍＬ）についての直接結合アッセイを示す。図４Ｂは、結合競合研究であり、Ｍ１３結合のＫ_Ｄを決定する代替方法を提供する。コンストラクト１を用いた。

【図5】図５は、アミロイド線維結合競合アッセイにおいて加熱変性（四角−９０℃、１０分間）対天然の構造（丸）Ｍ１３（コンストラクト１）を用いた結合競合結果を示す。

【図6】図６は、２種の濃度のＭ１３ファージ（コンストラクト１）の存在下又は不存下でインキュベーションしたｆＡβ４２を用いたチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す。

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、ＴｈＴ脱凝集アッセイにおいて個々のアッセイパラメーターを変動する作用を示す。図７Ａは、２種の塩濃度（０．１５Ｍ及び１．５Ｍ）の存在下での脱凝集パーセンテージを示す。図７Ｂは、２種の温度（４℃及び３７℃）で残存するｆＡβのパーセンテージを示す。コンストラクト１を用いた。

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、ｆＡβ４２を用いたＭ１３アミロイド結合アッセイを表す。図８Ａにおいて、Ｍ１３結合は、温度１８℃〜５８℃、３時間のインキュベーションを用いて報告する。図８Ｂは、３７℃対５０℃でのインキュベーションについての結合速度論を示す。

【図9】図９Ａ〜９Ｃは、ファージとアミロイドの相互作用に対するｇ３ｐのタンパク分解性除去の作用を示す。タンパク質分解酵素ＡｒｇＣを用いて、ｇ３ｐをＭ１３ファージから取り出した（Ｍ１３Δｇ３ｐ）。図９Ａは、天然（ＡｒｇＣ処置ファージと同じだが、タンパク質分解酵素処置なしで処置した）ファージと比較した、Ｍ１３Δｇ３ｐファージを用いたＡβ結合競合研究の結果を示す。図９Ｂは、天然ファージと比較したＭ１３Δｇ３ｐファージの感染性に対するＡｒｇＣ処置の作用を示す。図９Ｃは、脱凝集アッセイにおいて、ＡｒｇＣ処置ファージを天然ファージに比較する。

【図10A】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント（本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「コンストラクト３」としても言及される）、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）、及びＭ１３をｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手として用いた、結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。

【図10B】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｇ３ｐのＮ１−Ｎ２フラグメント（本明細書において、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）；「コンストラクト３」としても言及される）、Ｍ１３Δｇ３ｐ（ＡｒｇＣ処置）、及びＭ１３をｆＡβ４２への標識Ｍ１３結合の競合相手として用いた、結合競合アッセイの結果を示す。図１０Ｂは、競合アッセイの繰り返しを示す。

【図11】図１１は、ファージｆｄ、ＩＩＨＹ、ＡＡＡ、及びＭ１３について競合データを示す。ファージｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、５０℃、１．５時間で予め活性化し、次に、活性化及び非活性化Ｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、３７℃、４５分間のインキュベーション中にＡβへの結合について標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。

【図12】図１２Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の模式図を示す。図１２Ｂは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）についてのイオン交換プロファイルを示す。図１２Ｃは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いたゲル濾過アッセイの結果を示す。図１２Ｄは、ｇ３ｐ及びｇ８ｐ対照を伴った、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のウエスタンブロットを示す。Ｍ１３ファージを、レーン１及び２においてポジティブコントロールとして泳動し、ｇ８ｐとｇ３ｐの両方を検出するポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。精製ｒｓ−ｇ３ｐを、レーン３及び４において泳動し、同じポリクローナル抗Ｍ１３抗体で検出した。

【図13】図１３は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）を用いたＳＰＲデータを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）は、ｆＡβ４２にＫ_Ｄ約１６０ｎＭで強く結合するが、モノマーと結合しない。

【図14】図１４は、所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いたＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭ Ａβ４２モノマーを、５種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の存在下又は不存下、３７℃で３日間インキュベーションした。３日目の終わりに、形成された線維の量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ＩＣ_５０は約２０ｎＭであり、これは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ４２線維の形成を強く阻害することを示している。図はまた、結合が用量依存性であることを示す。

【図15】図１５Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）の存在下又は不存下でのｆＡβ４２のインキュベーションの透過電子ミクロ組織検査（ＴＥＭ）結果を示す。図１５Ｂは、３７℃で７日間インキュベーションしたＡβ４２及び２μＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）を用いたＴｈＴ蛍光アッセイの結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はｆＡβ４２の形成を阻害する。

【図16】図１６は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）がα−シヌクレイン線維の形成を強く阻害することを示す。２５μＭα−シヌクレインを、３００ｒｐｍ、４日間、３７℃での撹拌により構築した（バー１を参照）。グラフ上の第２のバーは、３７℃で３日間振盪したα−シヌクレインモノマー及び１×１０^−１３５量体Ｍ１３ファージを表す。バー２に示される結果は、５量体Ｍ１３がα−シヌクレイン線維の構築を阻害することを示す。グラフ上の第３のバーは、α−シヌクレインモノマー及び８３ｎＭ ｒｓｇ３ｐモノマーを表す。バー３に示される結果は、モノマーが、５量体Ｍ１３よりα−シヌクレイン線維形成の阻害においてほとんど有効でないことを示す。バー４は、時間０でのα−シヌクレインモノマーを示すネガティブコントロールである。バー５において、α−シヌクレイン線維のないｇ３ｐモノマーは、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合し、線維への結合から染料を隔離するかどうかを決定するために示される。バー５に示される結果は、ｇ３ｐがｐＴＡＡに結合しないことを示した。

【図17】図１７は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）、Ｍ１３（コンストラクト２）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４）、及びＩｇＧ４−Ｆｃネガティブコントロールについての競合結合データを示す。

【図18】図１８は、Ｍ１３（コンストラクト２；四角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；三角形）、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４；上下逆の三角形）、及び組み換えＩｇＧ４−Ｆｃネガティブコントロール（菱形）を比較した競合結合データを示す。

【図19】図１９は、５種類の濃度のＡβ４２線維＋又は−２種の濃度のＭ１３（コンストラクト２）、８００ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）、及び３種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ融合タンパク質（コンストラクト４）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。

【図20】図２０は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；「モノマー」）及びストレプトアビジン結合ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「ＳＡ［ｇ３ｐＮ１Ｎ２］_{ｎ＝２−４}」；「ＳＡ−ｇ３ｐ」；「テトラマー」）についての競合結合データを示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）及びＳＡ−ｇ３ｐを、３７℃での３時間のインキュベーション中のＡβへの結合について、標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。

【図21】図２１は、５種類の濃度のｆＡβ４２＋又は−２種の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３；「モノマー」）、及び２種の濃度のＳＡ−ｇ３ｐ（「テトラマー」）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。

【図22】図２２Ａ及び２２Ｂは、時間０でのｆＡβ４２のＴＥＭ（図２２Ａ）、及びＳＡ−ｇ３ｐとのインキュベーションの３日後（図２２Ｂ）のＴＥＭを示す。

【図23】図２３は、１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト４」のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。「コンストラクト４」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト１」のＮ１Ｎ２領域に由来する（配列番号：１０）。

【図24】図２４は、別のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト５」のアミノ酸配列（配列番号：１１）を示す。「コンストラクト５」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域に由来する（配列番号：１２）。

【図25】図２５は、１つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃコンストラクト「コンストラクト６」のアミノ酸配列（配列番号：１３）を示す。「コンストラクト６」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域に由来する。

【図26】図２６は、ｆｄ（配列番号：１４）、ｆ１（配列番号：１５）、Ｍ１３（配列番号：１６）、Ｉｋｅ（配列番号：１７）、Ｉ２−２（配列番号：１８）、及びＩｆ１（配列番号：１９）由来のＮ２のアミノ酸配列アライメントを示す。アスタリスク「^＊」は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。コロン「：」は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５より高い値を示す非常に類似する特性の群間の保存を示す。ピリオド「．」は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５以下の値を示す若干類似する特性の群間の保存を示す。

【図27A】図２７Ａは、コンストラクト５の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。

【図27B】図２７Ａは、コンストラクト５の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。

【図27C】図２７Ａは、コンストラクト５の図を示す。図２７Ｂは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のＤＮＡ配列（配列番号：２３）を示す。図２７Ｃは、コンストラクト５のｇ３ｐ部分のアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。

【図28】図２８は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減する能力について２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト５）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の両方が、アルツハイマー病マウスの海馬においてアミロイドβのレベルを有意に低減した。

【図29】図２９は、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、アミロイドβを低減する能力について、２つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧ融合タンパク質を試験する実験の結果を示す。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト５）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の両方が、アルツハイマー病マウスの大脳皮質においてアミロイドβのレベルを有意に低減することができた。

【図30】図３０は、Ａβ４２のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）でのアセンブリー阻害を示す。図３０Ａは、ＳＤＳを用いないで作った「天然」アガロースゲルを示す。試料を、ＳＤＳを含まず、ボイルしていないＴＥＡバッファー中で泳動した。結果は、コンストラクト６がｆＡβ４２のアセンブリーを阻害できることを示す。図３０Ｂは、所定の試料中に存在するアミロイドを測定するために用いたＴｈＴ蛍光アッセイを示す。１０μＭ Ａβ４２モノマーを、２種類の濃度のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の存在下又は不存下、３７℃で１日間インキュベーションした。１日目の終わりに形成された線維の量を、結合したＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定した。ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図はまた、コンストラクト６での線維形成の阻害が用量依存であることを示す。

【図31A】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。

【図31B】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。

【図31C】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。

【図31D】図３１は、Ａβ４２アセンブリーがｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）により阻害されることを示す代表的円二色性データを表す。円二色性は、評価されるべきＡβ線維のα−らせん体及びβ−シート含量を測定する。図３１Ａは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２についての楕円率対波長を示す。図３１Ｂは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのＡβ４２＋コンストラクト３についての楕円率対波長を示す。図３１Ｃは、２４時間〜４８時間に形成された線維量を、結合ＴｈＴ蛍光を定量化することにより測定する、代表的ＴｈＴアッセイを示す。コンストラクト３は、Ａβ４２線維の形成を強力に阻害する。図３１Ｄは、Ｔ＝０、Ｔ＝２４時間、及びＴ＝４８時間でのコンストラクト３についての楕円率対波長を示す。総合すると、これらのデータは、Ａβ４２アセンブリーを阻害するコンストラクト３の能力を確認する。

【図32】図３２は、Ｍ１３（コンストラクト２）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）が、Ｎ２ａ細胞のオリゴマーにより誘導される毒性をブロックすることを示す代表的なデータを示す。例えば、Ｓｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８（１３）： １１６１２−１１６２２、及びＳｔｉｎｅ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｅｒｉｋ Ｄ． Ｒｏｂｅｒｓｏｎ （ｅｄ．） Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ６７０： １３−３２を参照。処置前４８時間の血清飢餓状態により、Ｎ２ａ細胞を分化させた。Ａβ４２オリゴマー（２μＭ）を、Ｎ２ａ細胞に添加する前に、コンストラクト２及びコンストラクト６と、３７℃で３時間プレインキュベーションした。時間ゼロ（「ＴＯ」）複合体はプレインキュベーションしなかった。インキュベーション２４時間後、アデニル酸キナーゼ（「ＡＫ」）放出をモニターした。培地中へのＡＫ放出は細胞死／溶解を示す。Ａβ４２オリゴマーをＳｔｉｎｅ ｅｔ．ａｌ．， ２０１１により記載される通り作成した。結果は、Ｍ１３及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃは、毒性オリゴマーの強力な阻害剤であることを示す。

【図33】図３３は、６種類の濃度のＡβ４２線維＋又は−１×１０^１２／ｍｌ Ｍ１３（コンストラクト２）；８０ｎｍ及び８００ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃコンストラクト（コンストラクト５）；及び８０ｎｍ及び８００ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）を比較するフィルタートラップアッセイを示す。Ａβ４２線維を、コンストラクト２、５、及び６と３７℃で３日間インキュベーションし、その後濾過遅延した。フィルターを、フィルターにトラップされたＡβ４２線維を認識するｍＡｂ６Ｅ１０（１：１５０００）により調べた。８００ｎＭコンストラクト５又はコンストラクト６は、分子モル濃度５×１０^１４／ｍｌコンストラクト２と同等である。結果は、コンストラクト２、５、及び６がβ−アミロイド線維を強力に脱凝集させることを示す。

【図34】図３４Ａ及び３４Ｂは、ｆｔａｕとのプレインキュベーションの３時間後、ｆＡβ４２に結合したＭ１３（コンストラクト２）の量を測定するために用いた代表的アッセイを示す。コンストラクト２に結合した、５μＭ Ａβ４２モノマーを、４種類の濃度のｆｔａｕの存在下又は不存下、３７℃で３時間インキュベーションした。ｆＡｂｅｔａ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成するが、ｆｔａｕ：Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８はペレット形成せず、ペレット形成した物質からの蛍光の消失の測定は、ｆｔａｕがｆＡｂｅｔａ結合と競合することを示す。故に、３時間後、形成されたＭ１３−ｆＡβの量を、ペレット形成結合競合反応におけるＡｌｅｘａ４８８蛍光を定量化することにより測定した。結果は、ｆｔａｕが、ｆＡβ４２結合に対してＭ１３−Ａｌｅｘａ４８８（コンストラクト２）と競合できることを示す。

【図35】図３５は、ｆｔａｕに結合するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト４）の能力を試験する１つの代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。結果は、コンストラクト４がｆｔａｕと強力に結合することを示す。

【図36A】図３６は、ｆｔａｕを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す。タウ線維を、４０μＭ タウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、調製した。種々の濃度のコンストラクト６及び予め調製したｆｔａｕを、酢酸バッファー中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆｔａｕを脱凝集させるコンストラクト６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させるコンストラクト６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａ及び３６Ｂはまた、コンストラクト６によるｆｔａｕの脱凝集が用量依存性であることを示す。

【図36B】図３６は、ｆｔａｕを脱凝集させるｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す。タウ線維を、４０μＭ タウの微小管結合反復領域（「ＭＴＢＲ」）を５０ｍＭスーパーオキシドジスムターゼ（「Ｓｏｄ」）に希釈することにより、調製した。種々の濃度のコンストラクト６及び予め調製したｆｔａｕを、酢酸バッファー中、ｐＨ７．０、３７℃、７２時間インキュベーションした。ＴｈＴ蛍光を、５倍を超えるＴｈＴの存在下で記録した。図３６Ａは、ｆｔａｕを脱凝集させるコンストラクト６の能力を示す代表的ＴｈＴアッセイの結果を示す。図３６Ｂは、タウを脱凝集させるコンストラクト６の能力を確認する別の代表的な実験を示す。図３６Ａ及び３６Ｂはまた、コンストラクト６によるｆｔａｕの脱凝集が用量依存性であることを示す。

【図37A】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。

【図37B】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。

【図37C】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。

【図37D】図３７は、経時的な、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）によるＡβ凝集の阻害を示す代表的な実験を示す。Ａβ４２をＤＭＳＯに溶解し、ＮａＮ３を含有するＰＢＳに希釈した。Ａβ４２を、３７℃＋又は−種々の濃度のコンストラクト３及びコンストラクト６で凝集した。Ａβ４２の凝集をＴｈＴ蛍光により測定した。図３７Ａは、試料のＳＤＳ ＰＡＧＥを示す。図３７Ｂは、１つの代表的な実験の結果を示す。図３７Ｃは、別の代表的な実験由来の結果を示す。図３７Ｄは結果を概説する。

【図38A】図３８Ａ及び図３８Ｂは、ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻害するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。コンストラクト６及びＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性及び不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。コンストラクト６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。

【図38B】図３８Ａ及び図３８Ｂは、ＰｒＰのＰｒＰ−Ｓｃへの変換を阻害するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。コンストラクト６及びＩｇＧ細胞溶解物を、超遠心分離の対象にし、可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）ＰｒＰ種を分離させた。ＰｒＰ種を、抗ＰｒＰモノクローナル抗体（６Ｄ１１）で生化学的に視覚化した。ＩｇＧの存在下、可溶性及び不溶性分画の両方にＰｒＰを分配する。コンストラクト６の存在下、可溶性ＰｒＰ中に限定される。データはｎ＝４を表す。

【図39A】図３９Ａ及び図３９Ｂは、プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰ^Ｓｃの蓄積及び凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、コンストラクト６及びＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断及びＰＫ切断Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの有意な低減を、増加濃度のコンストラクト６で処理した細胞において明確に観察する。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌコンストラクト６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌコンストラクト６での処理は、ＰｒＰ^Ｓｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの顕著な変化を、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞において観察しなかった。図３９Ｂについて、Ｘ線フィルムを続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次に、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロッとした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰ^Ｓｃ／ＰｒＰｃとして表した。データはｎ＝４を表す。

【図39B】図３９Ａ及び図３９Ｂは、プリオン病の細胞培養モデルにおける、ＰｒＰ^Ｓｃの蓄積及び凝集を低減するｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の能力を示す実験の結果を示す。図３９Ａは、コンストラクト６及びＩｇＧでの処置後、生化学的に溶解された未切断及びＰＫ切断Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞溶解物を示す。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの有意な低減を、増加濃度のコンストラクト６で処理した細胞において明確に観察する。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの約５０％低減を、〜０．０８μｇ／ｍｌコンストラクト６の処置で達成する。１０μｇ／ｍｌコンストラクト６での処理は、ＰｒＰ^Ｓｃを５．７２５％、ｐ＜０．０００１まで低減する。ＰｒＰ^Ｓｃレベルの顕著な変化を、１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧで処理したＮ２Ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞において観察しなかった。図３９Ｂについて、Ｘ線フィルムを続いてデジタル化し、１００％であると見なされる同一の継代由来のＩｇＧ処理Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞における効果に対して最初に正規化した。次に、ＰＫ切断ブロット由来の濃度測定データを、等しくブロッとした未切断の溶解物に対して分析し、パーセント変化ＰｒＰ^Ｓｃ／ＰｒＰｃとして表した。データはｎ＝４を表す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、アミロイド結合及びアミロイド凝集の脱凝集の仲介における遺伝子３タンパク質（「ｇ３ｐ」、「ｐ３」又は「ｐＩＩＩ」としても知られている）の役割の発明者の認識に一部基づく。本発明はまた、アミロイドへの結合に必要なｇ３ｐの最小配列の発明者による同定に基づく。

【0019】

従って、ある種の実施態様において、本発明は、ｇ３ｐに由来する最小共通アミロイド結合配列を含む分子、特にポリペプチドを提供する。これらの実施態様の１つの態様において、分子は可溶性である。これらの実施態様の別の態様において、分子は、アミロイドの凝集（例えば、アミロイドプラーク）を脱凝集させ、及び／又は予防する。これらの実施態様の別の態様において、分子は融合タンパク質である。これらの実施態様のより具体的な態様において、分子は、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列を更に含む融合タンパク質である。これらの実施態様のなおより具体的な態様において、分子は、免疫グロブリンＧ（例えば、ＩｇＧ）又は免疫グロブリンＭ（例えば、ＩｇＭ）鎖のアミノ酸配列を更に含む融合タンパク質である。これらの実施態様のなお別の態様において、分子はｇ３ｐのＮ２ドメインを含む。これらの実施態様のより具体的な態様において、分子はｇ３ｐのＮ１−Ｎ２ドメインを含む。これらの実施態様のなお別の態様において、分子は全長ｇ３ｐを含む。なお別の態様において、分子は、前述のいずれかのフラグメント、変異体、又は変種であるポリペプチドである。

【0020】

他の態様において、本発明は、ＴｏｌＡに結合する分子（例えば、ＴｏｌＡ阻害分子、特にポリペプチド）であって、最小共通アミロイド結合配列を含む分子を提供する。本発明のＴｏｌＡ結合分子及び／又はＴｏｌＡ阻害剤は、アミロイドに結合し、脱重合し、アミロイドの凝集を予防し、脱凝集させる。ＴｏｌＡ結合分子及び／又はＴｏｌＡ阻害分子は融合タンパク質を含む。ある種の実施態様において、ＴｏｌＡ結合分子及び／又はＴｏｌＡ阻害分子は、コリシン又はコリシンのアミロイド結合フラグメントである。ある種の実施態様において、コリシンはグループＡのコリシンである。例えば、Ｃａｓｃａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． （２００７） ７１（１）： １５８−２２９を参照。本発明のＴｏｌＡ結合分子及びＴｏｌＡ阻害分子は、疾患（例えば、全身性及び限局性アミロイド病、神経変性タウオパチーを含む神経変性疾患、及び伝達性海綿状脳症（プリオン関連疾患））と関連するアミロイド負荷を低減するための有用な治療である。これらの疾患と関連するアミロイド負荷の蓄積を防ぐためのこれらの組成物の使用、及びアミロイドを検出し、故にかかる疾患を診断するための診断としてのこれらの組成物の使用も包含される。

【0021】

別の実施態様において、本発明は、野生型ファージと比較してｇ３ｐを過剰発現し、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、ｇ３ｐのアミロイド結合変異体又は変種形態、又はｇ３ｐを含むアミロイド結合融合タンパク質を発現するよう修飾された糸状バクテリオファージを提供する。

【0022】

本発明は、物質の組成物、及び／又は前述の分子又はバクテリオファージのいずれかの医薬組成物、並びにアミロイドの凝集に結合し、脱凝集させ、予防するためのその使用、及びアミロイド沈着を検出するためのその使用、及びアミロイドにより特徴付けられる疾患及び異常を診断するためのその使用を提供する。

【0023】

定義
用語「ｇ３ｐ」は、単独、又は用語（例えば、「ｇ３ｐ−由来」）において用いられるとき、任意の野生型又は組み換え糸状ファージｇ３ｐタンパク質（ｇ３ｐのフラグメント、変種、及び変異体を含む）に言及する。用語は、任意の具体的な糸状バクテリオファージｇ３ｐに限定すると解されるべきではない。例示のため、用語「ｇ３ｐ」は、配列番号：１、及び図２に示される関連タンパク質を含む。

【0024】

用語「糸状バクテリオファージ」は、野生型糸状バクテリオファージ、及び組み換え糸状バクテリオファージの両方を含む。本出願において、「糸状バクテリオファージ」はまた、「バクテリオファージ」、「ファージ」、又は「Ｍ１３」として言及され得る。

【0025】

本明細書において用いられる用語「野生型糸状バクテリオファージ」は、天然で見出される糸状ファージ、任意のヌクレオチド又はアミノ酸配列データベースにおいて「野生型」として示された糸状ファージ、市販され、かつ「野生型」として特徴付けられる糸状バクテリオファージ、及び継代を通じて前述のいずれかに関連する非組み換え変異を獲得した糸状バクテリオファージに言及する。

【0026】

用語「ドメイン」は、例えば、ポリペプチド鎖の１つの部分からなる独立して折り畳まれた構造を含む、いくつかの独特の物理的特徴又は役割を有するポリペプチド（タンパク質を含む）の領域を意味する。ドメインは、ポリペプチドの独特の物理的特性である配列を含有し得るか、又はその結合特徴を保持する（すなわち、第２のドメインに結合することができる）、物理的特性のフラグメントを含有し得る。ドメインは別のドメインと関連し得る。言い換えると、第１のドメインは、第２のドメインに天然で結合し得る。例えば、ｇ３ｐＮ２ドメインはＦ−ｐｉｌｉを結合し、ｇ３ｐＮ１ドメインはＴｏｌＡを結合する。

【0027】

本明細書において用いられる、用語「アミロイド」、「アミロイド原線維」、及び「アミロイド線維」は、いくつかの異なるタンパク質のいずれかの凝集により形成され、線維軸に垂直に積み重なったβシートの規則正しい配列からなる３次構造の属名である（Ｓｕｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） ２７３：７２９−３９）。１つの典型的なアミロイドは、アルツハイマー病において形成されたアミロイド−βの凝集体であり、ベータ−アミロイドペプチド「βＡ」からなり、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）から切断された３９〜４３個のアミノ酸内部フラグメントである。短い形態（例えば、Ａβ４０）、及び長い形態（例えば、より線維素生成ＡβアイソフォームであるＡβ４２）が存在する。他の典型的なアミロイドタンパク質は、誤って折り畳まれたα−シヌクレイン（パーキンソン病と関連する）、ハンチンチン（ハンチントン病と関連する）、タウ（アルツハイマー病と関連する）、及びプリオンタンパク質の異常構造ＰｒＰ^Ｓｃを含む。更なる例が明細書を通じて提供され、当業者に知られている（例えば、Ａｇｕｚｚｉ （２０１０）， ａｎｄ Ｅｉｃｈｎｅｒ ａｎｄ Ｒａｄｆｏｒｄ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ （２０１１） ４３：８−１８を参照）。従って、タンパク質又はペプチドが特定されない限り、用語「アミロイド」、「アミロイド原線維」、又は「アミロイド線維」の使用は、任意の具体的なタンパク質又は疾患に限定すると解されるべきではない。

【0028】

用語「ベータアミロイドペプチド」は、「β−アミロイドペプチド」、「βＡＰ」、「βＡ」、及び「Ａβ」と同義である。これらの用語の全てが、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）に由来するアミロイド形成ペプチドに言及する。

【0029】

ファージ、タンパク質、融合タンパク質、融合タンパク質ドメイン、又は「アミロイド原線維を結合する」か、又は「アミロイド結合している」前述のものの変異体、フラグメント、又は変種は、アミロイド結合アッセイにおいてポジティブなものである。アミロイド結合は、直接的結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））を用いてインビトロで検出され得る（この場合、それは一般的にアミロイドと少なくとも１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、又は１０^−１１ＭのＫｄで結合する）。或は、アミロイド結合は、本実施例に記載されるｆＡβ４２結合アッセイを用いて検出され得る。ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、変種、及び変異体はまた、任意のタンパク質ミスフォールディング病のトランスジェニックマウスモデルに注射されたとき、アミロイドへの共局在化によっても同定され得る。

【0030】

「脱凝集すること」又は「脱凝集を仲介すること」として記載される本発明の生成物又は組成物のいずれかは、既に形成された凝集体を低減する。脱凝集はフィルタートラップアッセイにより測定され得る（Ｗａｎｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ （１９９９） ３０９：３７５−８６）。フィルタートラップアッセイは、本明細書に記載され、これを用いて、凝集体が検出され、本発明の組成物により仲介される脱凝集がモニタリングされ得る。脱凝集は、増加濃度の脱凝集化剤の存在下での染色の低下により示される、フィルター上のアミロイド保持の低減として検出される。

【0031】

本明細書で用いられる、「アミロイドを低減する」組成物は、次の１つ又は複数を行う：アミロイド形成を阻害する、アミロイド脱凝集を引き起こす、アミロイドクリアランスを促進する、アミロイド凝集を阻害する、毒性アミロイドオリゴマーの形成をブロックするか及び／又は予防する、及び／又は毒性アミロイドオリゴマーのクリアランスを促進する。

【0032】

「神経細胞のアミロイド損傷からの保護」としての本発明の生成物又は組成物のいずれかは、新たなアミロイドの蓄積を予防し、及び／又は毒性アミロイドオリゴマーの形成を予防する。「神経細胞のアミロイド損傷からの保護」として記載される本発明の生成物又は組成物は、予防的に摂取され得る。生成物又は組成物が神経細胞をアミロイド損傷から保護するかどうかは、本明細書に記載される神経細胞培養物細胞毒性アッセイにより測定され得る。

【0033】

本明細書で用いられる「ＰｒＰタンパク質」、「ＰｒＰ」、及び「プリオン」は、適当な条件下で、タンパク質ミスフォールディング病に関与する凝集体の形成を誘導することができるポリペプチドに言及する。例えば、正常な細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰ^ｃ）は、かかる条件下で、疾患（例えば、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、又は狂牛病、猫海綿状脳症、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、及び致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）（これらに限定されない））に関与する、対応するスクレイピーアイソフォーム（ＰｒＰ^Ｓｃ）に変換される。

【0034】

本明細書でバクテリオファージ、タンパク質、ポリペプチド、又はアミノ酸配列（例えば、ｇ３ｐ変種、又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントの変種）と組み合わせて用いられる、用語「変種」は、参照物質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸相違（置換、挿入、又は欠損）を含有する対応する物質に言及する。ある種の実施態様において、「変種」は、参照配列と比較して、高いアミノ酸配列相同性、及び／又は保存的アミノ酸置換、欠損、及び／又は挿入を有する。いくつかの実施態様において、変種は、参照配列と比較して、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸相違を有する。「保存的置換」は、ｇ３ｐタンパク質又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントの化学的、物理的、及び／又は機能的特性を実質的に変えない、第１のアミノ酸の第２のアミノ酸による置換に言及する（例えば、ｇ３ｐタンパク質又はアミロイド結合フラグメントは、同一の電荷、構造、極性、疎水性／親水性を保持し、及び／又は機能（例えば、アミロイドを認識し、結合し、及び／又は低減する能力）を保存する）。かかる保存的アミノ酸修飾は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなど）に基づく。種々の前述の特徴を考慮した典型的な保存的置換は、当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。

【0035】

用語「変異体」（例えば、「変異体ｇ３ｐ」又は「変異体アミロイド結合フラグメント」）は、治療上又は診断上の有効性を調節するために、１個又は複数のアミノ酸で変異誘発されているタンパク質に言及する。ある種の実施態様において、変異体は、アミロイドと相互作用することが知られているアミノで置換、欠損、及び／又は挿入を含有する。他の実施態様において、変異体は、野生型ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント中に存在する保存アミノ酸であるアミノでの置換、欠損、及び／又は挿入を含有する。いくつかの実施態様において、変異体は、参照配列と比較して、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸相違を有する。いくつかの実施態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。用語「変種」及び「変異体」は、「変種」が典型的には天然の非組み換え体であり、他方「変異体」は典型的には組換え体であることを除き、本明細書において互換的に用いられる。

【0036】

本明細書において用いられる、用語「高度にストリンジェンシー」は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者により容易に決定される条件を含む。一般に、かかる条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ ｅｄ． Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １．１０１−１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）において定義され、ニトロセルロースフィルター用プレ洗浄溶液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＨ８．０））の使用、５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃のハイブリダイゼーション条件（又は５０％ホルムアミド中、４２℃での他の類似のハイブリダイゼーション溶液（例えば、スタークス溶液））、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄を含む。当業者は、温度及び洗浄溶液の塩濃度が、要因（例えば、プローブの長さ）に従い必要に応じて調節され得ることを理解するだろう。

【0037】

本明細書において用いられる、用語「中程度にストリンジェンシー」は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者により容易に決定され得る条件を含む。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ ｅｄ． Ｖｏｌ． １， ｐｐ． １．１０１−１０４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）により説明され、ニトロセルロースフィルター用プレ洗浄溶液（５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））の使用、５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、４２℃でのハイブリダイゼーション条件（又は５０％ホルムアミド中、４２℃での他の類似のハイブリダイゼーション溶液（例えば、スタークス溶液））、及び６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を含む。

【0038】

用語「高い配列相同性」は、既知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム）を用いて測定された、参照配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を意味する。

【0039】

「融合タンパク質」は、少なくとも２つのポリペプチドドメインを含む天然に存在しないタンパク質である。

【0040】

「ｇ３ｐ融合タンパク質」は、第２のドメインに結合したｇ３ｐタンパク質を含む。

【0041】

「Ｎ１−Ｎ２融合タンパク質」（「Ｎ１Ｎ２融合タンパク質」とも呼ばれる）は、第２のドメインに結合したｇ３ｐタンパク質の、Ｎ１及びＮ２ドメイン（又はいずれかの変異体、フラグメント、又は変種）を含むが、Ｎ３／ＣＴドメインを含まない。Ｎ１Ｎ２融合タンパク質は、ヒンジ領域を含んでも、含まなくてもよい。

【0042】

「Ｎ２融合タンパク質」は、第２のドメインに結合したｇ３ｐタンパク質の、Ｎ２ドメイン（又はＮ２の変異体、フラグメント、又は変種）を含むが、Ｎ１又はＮ３／ＣＴドメインのいずれかを含まない。Ｎ２融合タンパク質は、ヒンジ領域を含んでも、含まなくてもよい。

【0043】

本明細書で用いられる「コンストラクト１」は、野生型Ｍ１３（Ｇｅｎｂａｎｋファイル：ＮＣ＿００３２８７．２、バージョンＧＩ：５６７１８４６３を参照）からもたされる。コンストラクト１において、野生型Ｍ１３と比較して、Ｓｅｒ３７８（ＡＧＣ）はＧｌｙ（ＧＧＣ）に変更され、Ｉｌｅ８７（ＡＴＴ）はＡｓｎ（ＡＡＣ））に変更される。コンストラクト１は、配列番号：１０のアミノ酸を含む。

【0044】

「コンストラクト２」は、野生型Ｍ１３単離物（ＧｅｎＢａｎｋ ＪＸ４１２９１４．１）である。コンストラクト２は、配列番号：１２のアミノ酸を含む。

【0045】

「コンストラクト３」は、配列番号：２０のアミノ酸を含むｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインを含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメント（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２））である。

【0046】

「コンストラクト４」は、配列番号：９のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ）である。「コンストラクト４」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト１」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。

【0047】

「コンストラクト５」は、配列番号：１１のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ４Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ）である。「コンストラクト５」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。

【0048】

「コンストラクト６」は、配列番号：１３のアミノ酸を含む組み換え可溶性ｇ３ｐフラグメントＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ）である。「コンストラクト６」のＮ１Ｎ２領域は、「コンストラクト２」のＮ１Ｎ２領域からもたらされる。

【0049】

ｇ３ｐの供給源
糸状バクテリオファージは、グラム陰性細菌（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ））に感染する関連ウイルスの群である。例えば、Ｒａｓｃｈｅｄ ａｎｄ Ｏｂｅｒｅｒ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ （１９８６） Ｄｅｃ：４０１−４２７を参照。糸状バクテリオファージの例は、Ｆｆファミリーのファージ（すなわち、少なくともＭ１３、ｆ１、及びｆｄ）、及びＩファミリーのファージ（すなわち、少なくともＩ２２、Ｉｋｅ、Ｉｆ１）を含むが、これらに限定されない。

【0050】

全ての天然に存在する糸状バクテリオファージは、ｇ３ｐを、１個のファージ当たり３〜５コピー中に存在する少量のコートタンパク質として含有する。従って、本発明の１つの態様において、単離ｇ３ｐは、任意の天然に存在する糸状バクテリオファージから得られる。ｇ３ｐの組み換え形態も産生され得る。組み換えｇ３ｐは、任意の天然に存在する糸状バクテリオファージ由来の野生型ｇ３ｐに対応し得る。従って、組み換え単離ｇ３ｐも本発明により包含される。

【0051】

ファージＭ１３由来のｇ３ｐの１つの例は、配列番号：１に表される。特に明確に特定しない限り、記載される任意のｇ３ｐ変異は、以下に明確かつ注釈付きの形で配列番号：１に関連して示される。

【化1】

【表1】

配列番号：１は、取り除かれた１８個のアミノ酸シグナルペプチドを有するＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ−５１０８９１．１であり、従って、アミノ酸番号は成熟型ｇ３ｐについてである。シグナルペプチドは一般に任意の発現ベクターに含まれ、シグナルペプチドを含む未成熟型ｇ３ｐは、文脈が特に排除されることを明確にしない限り、本発明の種々の実施態様の範囲内に含まれる。配列番号：１は、ただ参照配列として提供される。それは決して本発明を制限することを意図しない。

【0052】

複数の供給源由来のｇ３ｐの配列が知られている。Ｆｆファミリーのバクテリオファージについての典型的なｇ３ｐアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ６９１６９（ファージｆ１）、Ｐ０３６６１（ファージｆｄ）、及びＰ６９１６８（ファージｍ１３）において見出されるものを含む。Ｉファミリーのバクテリオファージについての典型的なｇ３ｐアミノ酸配列は、Ｐ１５４１５（ファージＩ２２）、Ｐ０３６６３（ファージＩｋｅ）、及びＯ８０２９７（ファージＩｆ１）を含む。いくつかのｇ３ｐ配列のアライメントは図２に示される。

【0053】

本発明において有用なＧ３ｐはまた、ｇ３ｐのフラグメント、変異体、及び／又は変異体を含む。変異体又は変種は、全長ｇ３ｐに関連して、又はｇ３ｐのフラグメントに関連して記載され得る。アミロイドに結合する能力を保持する変異体及び／又は変種を含む任意の全長又はフラグメントｇ３ｐは、アミロイドを脱凝集させる能力にも関わらず、本発明の範囲内である。かかるｇ３ｐを「含む」任意のタンパク質もまた本発明により包含される。同様に、かかるｇ３ｐを「含む」、「からなる」、「本質的にからなる」、又は「有する」タンパク質もまた包含される。

【0054】

ｇ３ｐのアミロイド結合及びアミロイド凝集フラグメント
言及される通り、ｇ３ｐは、Ｎ１−Ｎ２複合体を形成するために相互作用する２個のアミノ末端ドメインＮ１及びＮ２、及び１個のカルボキシ末端ドメインＮ３（「ＣＴ」とも呼ばれる）を有する。Ｆｆファージなら、Ｎ１ドメインは成熟型ｇ３ｐの残基１〜６７を含み、Ｎ２ドメインは成熟型ｇ３ｐの残基８７〜２１７を含む。残基８７〜１２３は、Ｎ１とＮ２の間での会合及び閉合を可能にするヒンジを形成する。時に、ヒンジはＮ２の一部と考えられ、一方他の例では別個のエレメントとして処理される。Ｎ１及びＮ２はまた、可動性グリシンリッチなリンカー配列により結合される。Ｎ１において、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６の間、及びＣｙｓ４６とＣｙｓ５３の間の２つのジスルフィド架橋が存在する。Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１の間のＮ２における単一のジスルフィド架橋が存在する。Ｎ３／ＣＴドメインは残基２５７〜４０６を含む（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ， １９９９； Ｍａｒｖｉｎ， １９９８）。カルボキシ末端ドメインにおいて、Ｃｙｓ３５４とＣｙｓ３７１の間のジスルフィド架橋が存在する（Ｍａｒｖｉｎ， １９９８）。ｇ３ｐにおいてドメイン間ジスルフィド架橋は存在しない。

【0055】

ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントの非限定的な例は、ヒンジ（例えば、少なくとも配列番号：１の残基８７〜２１７）を有するか、又はヒンジ（例えば、少なくとも配列番号：１の残基１２４〜２１７）を有しないＮ２ドメイン、及び介在性リンカー配列（例えば、配列番号：１の残基６８〜８６あり又はなしのいずれか）を有するか又は有しない、又はヒンジを有するか又は有しないＮ１−Ｎ２ドメイン（例えば、少なくとも配列番号：１の残基１〜６７及び８７〜２１７）を含む。前述の例のいずれかにおいて、Ｎ２又はＮ１Ｎ２フラグメントは、野生型糸状バクテリオファージにおいて見出されるＮ２又はＮ１Ｎ２、又は組み換えＮ２又はＮ１Ｎ２であり得る。前述の例のいずれかにおいて、Ｎ２又はＮ１Ｎ２フラグメントは、野生型糸状バクテリオファージ配列の変異体又は変種であり得る。

【0056】

ｇ３ｐの有用なアミロイド結合フラグメントは、アミロイドを脱凝集させるフラグメントの能力にも関わらず、アミロイドに結合する能力を保持するＮ２及びＮ１Ｎ２フラグメントを含むｇ３ｐの任意のフラグメントを含む。かかるアミロイド結合フラグメント（又はその変異体又は変種）を「含む」任意のタンパク質は本発明により包含される。同様に、ｇ３ｐフラグメント又は変種を「含む」、「からなる」、「本質的にからなる」、又は「有する」タンパク質もまた包含される。

【0057】

Ｎ２及びＮ２ポリペプチド変異体及び変種
ｆｄ、ｆ１、Ｍ１３、Ｉｋｅ、Ｉ２−２、及びＩｆ１由来のＮ２の１次構造アライメントは、図２６として示される。ｆｄのアミノ酸は配列番号：１４に、ｆ１は配列番号：１５に、Ｍ１３は配列番号：１６に、Ｉｋｅは配列番号：１７に、Ｉ２−２は配列番号：１８に、Ｉｆ１は配列番号：１９に示される。この図及びアライメントをガイドとして用いて、本発明の１つの実施態様は、任意のアミロイド結合フラグメントを含む、Ｎ２ポリペプチド、Ｎ２ポリペプチド変異体、及びＮ２ポリペプチド変種を包含する（配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９のアミノ酸を含む）。

【0058】

他の実施態様において、Ｎ２ポリペプチドは、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９のいずれか１つのアミノ酸配列で並べたとき、アミロイドに結合する能力を保持し、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有するＮ２ポリペプチド変異体又は変種である。図２６において、アスタリスク「^＊」は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示す。コロン「：」は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５より高い値を示す非常に類似する特性の群間での保存を示す。ピリオド「．」は、Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおいて０．５以下の値を示す若干類似の特性の群間での保存を示す。これらの実施態様のいくつかの態様において、Ｎ２ポリペプチド変異体又は変種は、「^＊」で示される任意の位置でアミノ酸相違を含まない。より具体的な態様において、Ｎ２ポリペプチド変異体又は変種は、図２６において、「^＊」で示される任意の位置でアミノ酸相違を含まず、「：」で示される各位置での配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９の少なくとも１つとして同一のアミノ酸を含む。なおより具体的な態様において、Ｎ２ポリペプチド変異体又は変種は、図２６において、「^＊」で示される任意の位置でアミノ酸相違を含まないが、「：」で示される各位置及び「．」で示される各位置で配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９の少なくとも１つとして同一のアミノ酸を含む。

【0059】

他の実施態様において、Ｎ２ポリペプチド変種は、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９に類似のパーセントアミノ酸を特定することにより記載される（但し、Ｎ２ポリペプチド変種がアミロイドに結合する）。これらの実施態様において、Ｎ２ポリペプチドは、配列番号：１４、１５、１６、１７、１８、又は１９に示される参照配列のアミノ酸に渡り少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。

【0060】

他の実施態様において、Ｎ２ポリペプチドは、配列番号：１のＮ２領域に類似のパーセントアミノ酸を特定することにより記載される（但し、Ｎ２ポリペプチド変種はアミロイドに結合する）。これらの実施態様において、Ｎ２ポリペプチド変種は、配列番号：１のＮ２領域に渡り、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。

【0061】

なお他の実施態様において、Ｎ２ポリペプチドは２次又は３次構造により記載される。ｆｄ−Ｎ２及びＩｆ１−Ｎ２ドメインは、エシェリキア・コリ中のＦ−線毛上の同一部位に結合する表面の相同部分を使用することが知られている（例えば、９９０でのＬｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４０５：９８９−１００３ （２０１１））。Ｆ−線毛へのＮ２結合を仲介するアミノ酸残基及び２次及び３次構造はまた、アミロイドへのＮ２結合も仲介する。従って、Ｎ２のＦ−線毛結合の基準であるアミノ酸残基及び２次及び３次構造はまた、Ｎ２−アミロイド結合の基準である。Ｎ２−Ｆ−線毛結合の領域において２次及び３次構造を維持することを必要とされるアミノ酸を含むＮ２ポリペプチド変種は、本発明の範囲内である。

【0062】

Ｎ１Ｎ２及びＮ１Ｎ２ポリペプチド変異体及び変種
ｆｄ、ｆ１、及びＭ１３の１次構造アライメントは図２Ａとして、Ｉｋｅ、Ｉ２−２、及びＩｆ１は図２Ｂとして示される。このアライメントをガイドとして用いて、本発明の１つの実施態様は、図２の配列に関連して同定される通り、ｆｄ、ｆ１、及びＭ１３間、又はＩ２−２、Ｉｄｅ、及びＩｆ１間で保存されるアミノ酸配列を含む、Ｎ１Ｎ２ポリペプチド、ポリペプチド変異体、又はポリペプチド変種を包含する。他の実施態様において、Ｎ１Ｎ２ポリペプチドは、アミロイドに結合する能力を保持し、配列番号：１、２、３、５、又は６のいずれか１つのアミノ酸配列で整列させたとき、わずか７５、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のアミノ酸相違を含むアミノ酸配列を有するＮ１Ｎ２ポリペプチド変異体又は変種である。

【0063】

他の実施態様において、Ｎ１Ｎ２ポリペプチド、変異体又は変種は、配列番号：１のＮ１Ｎ２領域に類似のパーセントアミノ酸を特定することにより記載される（但し、Ｎ１Ｎ２ポリペプチド変種はアミロイドに結合する）。これらの実施態様において、Ｎ１Ｎ２ポリペプチド変種は、配列番号：１のＮ１及びＮ２領域に渡り少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。

【0064】

融合タンパク質
１つの態様において、本発明は融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、ＴｏｌＡ結合分子、又はＴｏｌＡ阻害剤を含む。変異体又は変種ｇ３ｐ、又はｇ３ｐフラグメントを含む融合タンパク質は完全に包含される。融合タンパク質は、通常関連しない少なくとも１個の追加のタンパク質又はタンパク質ドメインに結びつき、融合し、共役結合し、結合し、又は関連する。１つの実施態様において、融合タンパク質は、第２のドメインに結合したｇ３ｐタンパク質を含むｇ３ｐ融合タンパク質である。別の実施態様において、融合タンパク質は、第２のドメインに結合したｇ３ｐタンパク質のアミロイド結合フラグメントである。別の実施態様において、融合タンパク質はＮ１Ｎ２融合タンパク質であり、ｇ３ｐタンパク質のＮ１及びＮ２ドメインを含むが、ＣＴドメインを含まない。なお別の実施態様において、融合タンパク質はＮ２融合タンパク質であり、ｇ３ｐタンパク質のＮ２ドメインを含むが、Ｎ１又はＣＴドメインを含まない。示される通り、本発明のいくつかの態様は、変異体又は変種ｇ３ｐタンパク質又はそのアミロイド結合フラグメント、及びアミロイド線維に結合する変異体又は変種Ｎ１Ｎ２又はＮ２ドメインに関する。従って、これらの変異体又は変種形態を含む融合タンパク質はまた本発明の一部である。

【0065】

ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメント、及び融合パートナーポリペプチドは、ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに直接又は短いペプチドリンカーを解して結合した融合パートナーポリペプチドを有する連続アミノ酸配列の一部であり得る。かかる場合において、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、及び融合パートナーポリペプチドは、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、及び融合パートナーポリペプチドの両方をコードするコード配列からシグナルポリペプチドとして翻訳され得る。

【0066】

いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域を第２のドメインとして含む。対象のタンパク質、又はそのフラグメントに結合した免疫グロブリン定常領域を含む融合タンパク質が記載されている（例えば、米国特許第５，４８０，９８１号及び第５，８０８，０２９号；Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ． １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：２９３６； Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８； Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ． １９９０， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ＵＳＡ ９：３４７； Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ． １９９０， Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７； Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９０， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１０：２２２１； Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４； Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ． １９９０， Ｃｅｌｌ ６１：１３０３； Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：７２１； Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：５６１； Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｃｅｌｌ ６６：１１３３； Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０５３５； Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８８３； Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：１４８３； Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３０６０； Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９３５４； Ｃｈａｌｕｐｎｙ ｅｔ ａｌ． １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０３６０； Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ， １９９１， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１５， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． １４４８； Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． １５４：５５９０を参照）。これらの分子は、通常、結合した対象分子と関連する生物学的活性、並びにエフェクター機能、又は免疫グロブリン定常領域と関連する他の所望の特徴（例えば、生物学的安定性、細胞分泌）の両方を有する。

【0067】

いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、免疫グロブリン定常領域のＦｃフラグメントを含む。Ｆｃ発現カセットは商業的に購入され得る。Ｆｃフラグメントは、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、及び免疫グロブリンのヒンジ領域からなることができる。Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のＦｃフラグメントであり得る。１つの特定の実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントである。別の実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＧ４のＦｃフラグメントである。なお別の実施態様において、免疫グロブリン定常領域の一部は、ＩｇＭのＦｃフラグメントである。

【0068】

従って、１つの実施態様において、組み換え可溶性ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントは、標準的分子生物技術を用いて、免疫グロブリンＦｃドメインに融合される。組み換え可溶性ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントは、変異誘発されるか、又は変更され得る。例えば、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ１Ｎ２ドメイン又はＮ２ドメイン）は、ＩｇＧＦｃ融合発現ベクターにクローン化され得る。典型的なＩｇＧＦｃ融合ベクターは、例えば、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手可能なｐＦＵＳＥ−Ｆｃベクターの１つを含む。いくつかの実施態様において、得られた２価（例えば、ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ＩｇＧＦｃ又はｇ３ｐ（Ｎ２）−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質）は、依然２価であるので、組み換え可溶性ｇ３ｐより高いアミロイド結合に対する活性を有する。

【0069】

他の実施態様において、融合タンパク質は、ｇ３ｐ、又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントに結合した非Ｆｃタンパク質を含む。

【0070】

他の実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも２個のｇ３ｐポリペプチド又はそのアミロイド結合フラグメントを含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、３個以上のｇ３ｐポリペプチド、又はそのアミロイド結合フラグメントを含む。他の実施態様において、融合タンパク質は、５個のｇ３ｐポリペプチド、又はそのアミロイド結合フラグメントを含む。かかるダイマー及び多量体融合タンパク質は、１個より多いｇ３ｐ、又はそのアミロイド結合フラグメントを含むので、より高い親和性相互作用をもたらす。

【0071】

他の実施態様において、融合タンパク質はアルブミンを含む。例えば、Ｆｌｅｅｒについて米国特許第６，６８６，１７９号を参照。

【0072】

全ての例において、融合タンパク質中のｇ３ｐ又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメントは、その変異体及び変種を包含する。

【0073】

一般に、融合タンパク質は、対応する非結合ｇ３ｐ又はそのｇ３ｐフラグメントと少なくとも同等に有効に、アミロイドに結合する。適用可能なとき、融合タンパク質は、アミロイドの脱凝集の仲介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイドの凝集の阻害、及び／又は毒性オリゴマーの形成の除去又は予防において、少なくとも対応する非結合ｇ３ｐ又はそのフラグメントと同等に有効である。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の仲介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、及び／又は毒性オリゴマー形成の除去又は予防において、配列番号：１を含む組み換え可溶性ｇ３ｐと少なくとも同等に有効である。なお他の実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の仲介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、及び／又は毒性オリゴマーの形成の除去又は予防において、少なくともファージＭ１３と同等に有効である。なお他の実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイドの脱凝集の仲介、アミロイドクリアランスの促進、アミロイド凝集の阻害、及び／又は毒性オリゴマーの形成の除去又は予防において、ファージＭ１３より有効である。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、タンパク質ミスフォールディング病におけるアミロイドの低減において、少なくともファージＭ１３と同等に有効である。なお他の実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、タンパク質ミスフォールディング病におけるアミロイドの低減において、ファージＭ１３より有効である。なお他の実施態様において、融合タンパク質は、アミロイドに結合し、アミロイド形成の予防において、少なくともファージＭ１３と同等又はより有効である。

【0074】

融合タンパク質は、当該技術分野において周知の技術を用いて合成され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、細胞中で組み換え的に合成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．を参照）。或は、本発明の融合タンパク質は、既知の合成方法（例えば、固相合成）を用いて合成され得る。合成技術は当該技術分野において周知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， １９７３， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， （Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．） ｐｐ． ３３５−６１； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ １９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９； Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． １９８５， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔｌ． １０：３９４； Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ． １９７６， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｄ ｅｄ．） ２：１０５； Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９７６， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （３ｄ ｅｄ．） ２：２５７；米国特許第３，９４１，７６３号を参照）。或は、最終コンストラクトは、組み換え的に産生された（しかし、非組み換え技術（例えば、ライゲーション化学）を用いて単純に産生され得る）融合タンパク質と同じ機能を本質的に共有し得る。融合タンパク質の成分は、ｇ３ｐ発現及びｇ３ｐ変異について記載されたのと同じ一般的な方法論を用いて、調製され得る。

【0075】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメント（又はその変異体又は変種形態）は、（単独、又は別のタンパク質への融合、又は担体分子の取り込みに加えて）マーカー配列（例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するペプチド）に融合され得る。マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）において提供されるタグ）（とりわけ、多くが市販されている）であり得る。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８９） ８６：８２１−８２４に記載される通り、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の通常の精製のため提供される。精製に有用な別のペプチドタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグは、インフルエンザＨＡタンパク質からもたらされるエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８４） Ｃｅｌｌ ３７：７６７）。

【0076】

ｇ３ｐを過剰発現するファージ
別の態様において、本発明は、ファージにより発現されるｇ３ｐのコピー数を、野生型糸状バクテリオファージにおいて典型的に見出される３〜５コピーより多くまで増大するよう修飾されたバクテリオファージに関する。１つの実施態様において、増大した数のｇ３ｐを発現するファージは、天然に存在する変種から選択され得る。別の実施態様において、組み換え技術を用いて、ｇ３ｐのコピー数が増大される。

【0077】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ、又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（その変異体又は変種を含む）をコードする野生型配列を用いて、別のバクテリオファージコートタンパク質をコードする遺伝子の１つが置換され得る。置換されたバクテリオファージ遺伝子に依存して、ｇ３ｐ数は、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、５００、１０００、又はほぼ３０００コピーまで増大され得る（例えば、遺伝子８コード配列を置換するため用いられるか、又は遺伝子８コード配列の末端に融合される遺伝子３コード配列の場合）。

【0078】

追加コピーのｇ３ｐを発現するファージを産生するために、ｇ３ｐコード配列（又はその変異体又は変種形態）は、明細書中の他の箇所で記載される通り、クローン化される。次に、必要ならヘルパーファージと共に、ｇ３ｐコード配列（又はその変異体又は変種形態）を用いて、別のファージ遺伝子が置換され、発現され得る。

【0079】

或は、いくつかの実施態様において、ｇ３ｐコード配列（又はその変異体又は変種形態）は、介在性「スペーサー」配列あり又はなしのいずれかで、別のファージ遺伝子のコード配列にインフレームで融合される。別のタンパク質又はペプチドが「融合される」ファージタンパク質の調製方法は、ファージディスプレー技術分野において周知であり、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントは、例えば、抗原又は抗体鎖と同じ方法で、「ディスプレー」され得る（Ｅ．ｇ． Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９０） ２４９：３８６−９０； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９０） ２４９：４０４−０６）。ｇ３ｐのフラグメントのみの発現が所望されるとき、フラグメント（又はその変異体又は変種形態）のコード配列は、ｇ３ｐ中に存在する天然のＳｅｒ／Ｇｌｙリンカー配列の１つがリンカーとして作用するように、他の遺伝子に結合され得る。いくつかの実施態様において、Ｎ２又はＮ１Ｎ２ドメイン（又はその変異体又は変種形態）のコード配列のみが、他の遺伝子にインフレームで融合される。

【0080】

変異体Ｇ３Ｐ及びアミロイド結合フラグメント
別の態様において、本発明は、変異体ｇ３ｐタンパク質、及びその変異体アミロイド結合フラグメントに関する。融合タンパク質及び変異体ｇ３ｐタンパク質及びアミロイド結合フラグメントを含むファージもまた、本発明の一部である。変異体ｇ３ｐ及びその変異体アミロイド結合フラグメントは、本出願に記載される医薬組成物の治療上の有効性に寄与する特性のため、産生されるか、又は選択され得る。例えば、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントは、組み換え的に変異誘発されるか、又はＭ１３のｇ３ｐに関連する以下の特性の１つ以上を有するよう選択される：アミロイド結合の親和性の増大、ヒンジＴＭの低減、親和性の増大（結合活性が、ｇ３ｐが１個より多いアミロイド結合部位を含む全ての利用可能なアミロイド結合の和を記載するために用いられる点で、結合活性は親和性と区別される）、アミロイド凝集体を脱凝集させる能力の増大、又はアミロイド原線維の凝集を防ぐ能力の増大。或は、又は加えて、変異体ｇ３ｐ又はその変異体アミロイドフラグメントは、本明細書中の他の箇所に記載される他の有用な特性を取り込み得る。

【0081】

変異体ｇ３ｐタンパク質は、ファージの変異誘発により、又は組み換え技術（例えば、ＰＣＲに基づく部位指定変異誘発又はランダム変異誘発）により産生され得る。

【0082】

いくつかの実施態様において、高い親和性を有する変異体は、Ｍ１３を変異誘発し、次に、ストリンジェントな洗浄条件で結合したアミロイド親和性カラム上のファージを選択することにより、産生される。結合、洗浄、溶出、及び選択されたファージの拡大の十分な繰り返しにより、アミロイドへの高い親和性結合を有するファージが濃縮される。ファージ集団の増大した親和性が、アミロイドパニングを用いて達成されると、高い親和性を有する個々のクローンが選択され、分析される。この方法で、ファージ変異体は、ランダム変異誘発に従い高い親和性結合に対して選択される。

【0083】

Ｇ３ｐ、又はその任意のアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ１Ｎ２ドメイン又はＮ２ドメイン）はまた、組み換え技術を用いて変異誘発され得る。例えば、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ１Ｎ２又はＮ２）を有する、本明細書に記載されるベクターが、ＰＣＲに基づく変異誘発ストラテジーを用いて変異誘発され得る。次に、コード化された変異体タンパク質が発現され、変異体のアミロイド結合及び親和性が、記載の通り評価される。

【0084】

ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントはまた、変異体ｇ３ｐからもたらされ得る。例えば、ｇ３ｐを変異誘発すること、及び／又は所望の特性を有する変異体ｇ３ｐについて選択し、そこから所望のアミロイド結合フラグメントを得ること（例えば、タンパク質分解及び続く精製による）。

【0085】

アミロイド結合の親和性を増大し、結合の温度感受性の変化のため、変異体ｇ３ｐを生じるファージのスクリーニングを用いて、ファージのｇ３ｐの更なる特徴についてファージが同定され得る。特性（例えば、結合の温度感受性）についてのスクリーニングは、温度依存性の方法で行われる結合、洗浄、又は溶出工程の１つ又は複数を含むアミロイド親和性カラムを利用することができる。

【0086】

いくつかの実施態様において、変異体ｇ３ｐ又はｇ３ｐアミロイド結合フラグメントは、対応する未変異ｇ３ｐ又はＭ１３由来のｇ３ｐフラグメントの結合より、少なくとも３、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、又は１０００高い親和性でアミロイドに結合する。他の実施態様において、変異体ｇ３ｐ又はｇ３ｐアミロイド結合フラグメントは、対応する未変異ｇ３ｐ又はＭ１３由来のアミロイド結合ｇ３ｐフラグメントの結合との強さの少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％であるアミロイド結合を保持する。いくつかの実施態様において、対応する未変異形態より低いアミロイド結合親和性を示す変異体ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントはまた、対応する未変異形態と比較して改良された、別の所望の生物学的（例えば、アミロイドを脱凝集させるより高い能力；アミロイド原線維の凝集を予防するより高い能力）、又は医薬的（例えば、より高い代謝安定性、好ましい薬物動態特性、より高い溶解性）特性も有する。アミロイド結合は、実施例に記載される通り、表面プラズモン共鳴により、又は競合的ＥＬＩＳＡにおいて評価され得る。

【0087】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐの変種及び／又は変異体を、Ｍ１３ｇ３ｐへのハイブリダイゼーションを用いてＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより同定して、高度にストリンジェンシー又は中程度のストリンジェンシーな条件下のいずれかで、Ｍ１３ｇ３ｐにハイブリダイゼーションする関連ＤＮＡが選択され得る。

【0088】

いくつかの実施態様において、変異体ｇ３ｐは、少なくとも１個のアミノ酸残基で、成熟型Ｍ１３ｇ３ｐタンパク質（配列番号：１）と異なるが、依然アミロイドに結合する、組み換え的に産生されるｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントである。いくつかの実施態様において、個々の点変異は、成熟型タンパク質の特定の残基でのＭ１３ｇ３ｐのアミノ酸を用意し、該残基でアミノ酸を置換することにより、特定される。例えば、「Ｆ１９４Ａ」は、成熟型Ｍ１３配列の位置１９４のフェニルアラニンがアラニンに変更されていることを意味する。他の実施態様において、変異体ｇ３ｐは、配列番号：１に類似のパーセントアミノ酸を特定することにより記載される（但し、変異体ｇ３ｐはアミロイド原線維に結合する）。これらの実施態様において、変異体ｇ３ｐは、配列番号：１の全長に渡り、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。これらの実施態様において、ｇ３ｐの変異体アミロイド結合フラグメントに関して、変異体アミロイド結合フラグメントは、配列番号：１の対応するフラグメントの全長に渡り、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。

【0089】

実際に、任意の特定のポリペプチドが、少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるかどうかは、通常、既知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム）を用いて決定され得る。特定の配列が、本発明による参照配列と例えば９５％同一であることを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又は他の配列アライメントプログラムを用いるとき、パラメーター（もちろん、同一性のパーセンテージはクエリー配列に相同な参照アミノ酸配列の部分の全長に渡り計算される）が設定される。

【0090】

種々の態様のいくつかの実施態様において、変異体ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、又はＦｆとＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐ間で保存されるアミノ酸残基での変異を含まない。他の実施態様において、変異体ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、又はＦｆとＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐ間で保存される１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。なお他の実施態様において、変異体ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、又はＦｆとＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐ間で保存されていない０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。なお別の実施態様において、変異体ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメントは、Ｉ２２、Ｉｋｅ、及びＩｆ１の１個又は複数間で保存されていない０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。なお他の実施態様において、変異体ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメントは、Ｆｆファミリー、Ｉ−ファミリー、又はＦｆとＩ−ファミリーの両方のｇ３ｐ間で保存されていない１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基での最大変異を含む。いくつかの実施態様において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異は、Ｎ１ドメイン内に位置する。いくつかの実施態様において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異は、Ｎ２ドメイン内に位置する。いくつかの実施態様において、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異は、Ｎ２ドメイン内に位置するが、ヒンジ領域内に位置しない。

【0091】

部位指定変異誘発は、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２、又はＮ２ドメインの安定性に重要であると知られている残基を標的にし得る。例えば、Ｄ９４及びＴ９５；Ｅ１１５；Ｎ１２２；Ｌ１２５；Ｅ１２６及びＥ１２７；Ｅ１２７及びＥ１２８；Ｑ１２９；Ｑ１４５；Ｔ１５４及びＴ１５６；Ｑ１５７；Ｔ１５９及びＤ１６０；Ｋ１６３及びＴ１６４；Ｙ１６６；及びＥ１９６及びＤ１９７でのアラニン置換変異は、Ｆ−ｐｉｌｉへのファージ結合に有意に影響しないことが既に示されている（Ｄｅｎｇ ＆ Ｐｅｒｈａｍ， ２００２）。従って、これらの位置は変異に寛容であり、これらの位置での変異は、本発明のｇ３ｐ及びｇ３ｐアミロイド結合フラグメントにおいて、アミロイド結合能を増強するか、又はそれに対して中立の作用を有し得る。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、Ｄ９４、Ｔ９５、Ｅ１１５、Ｎ１２２、Ｌ１２５、Ｅ１２６、Ｅ１２７、Ｅ１２８、Ｑ１２９、Ｑ１４５、Ｔ１５４、Ｔ１５６、Ｑ１５７、Ｔ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６３、Ｔ１６４、Ｙ１６６、Ｅ１９６、又はＤ１９７（配列番号：１に関する）の１つ又は複数で変異誘発されたｇ３ｐ又はｇ３ｐアミロイド結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様において、Ｄ９４、Ｔ９５、Ｅ１１５、Ｎ１２２、Ｌ１２５、Ｅ１２６、Ｅ１２７、Ｅ１２８、Ｑ１２９、Ｑ１４５、Ｔ１５４、Ｔ１５６、Ｑ１５７、Ｔ１５９、Ｄ１６０、Ｋ１６３、Ｔ１６４、Ｙ１６６、Ｅ１９６、又はＤ１９７の１つ又は複数での変異は、アラニンに対する変異に限らない。

【0092】

Ｆ１９４；Ｆ１９０及びＨ１９１；Ｋ１８４、Ｒ１８６、及びＤ１８７；Ｒ１４２及びＲ１４４でのアラニン置換変異は、Ｆ−ｐｉｌｉへの結合を低減することが既に知られている（Ｄｅｎｇ ＆ Ｐｅｒｈａｍ， ２００２）。従って、いくつかの実施態様において、変異は、１つ又は複数の以下の残基：Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、又はＦ１９４（配列番号：１に関連した番号）を含まない変異から選択される。しかしながら、Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、又はＦ１９４の非アラニン残基での置換は、アミロイド結合を増大し得る。従って、１つの実施態様において、変異は、Ｒ１４２、Ｒ１４４、Ｗ１８１、Ｋ１８４、Ｒ１８６、Ｄ１８７、Ｆ１９０、Ｈ１９１、又はＦ１９４の１つ又は複数での非アラニン変異である。１つの実施態様において、変異はＦ１９４での非アラニン変異である。別の実施態様において、変異はＦ１９０及びＨ１９１での非アラニン変異である。別の実施態様において、変異は、Ｋ１８４、Ｒ１８６、及びＤ１８７での非アラニン変異である。別の実施態様において、変異はＷ１８１での非アラニン変異である。別の実施態様において、変異は、Ｒ１４２及びＲ１４４での非アラニン変異である。ある種の実施態様において、変異は、１つ、いくつか、又は全てのＴ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、Ｇ１５３Ｄ、Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、Ｆ１９４Ａ、及びＤ２０９Ｙに限らない。

【0093】

いくつかの実施態様において、変異は、Ｆ−ｐｉｌｉに結合するｇ３ｐの部分であるＮ２ドメインの表面上に位置する１個又は複数の残基においてである。１つの実施態様において、変異は、Ｎ２ドメインの外縁上に位置する１個又は複数の残基においてである。他の実施態様において、変異は、ｇ３ｐの部分であり、ＴｏｌＡに結合するＮ１ドメインの表面上に位置する１個又は複数の残基においてである。１つの実施態様において、変異は、Ｎ１ドメインの外縁上に位置する１個又は複数の残基においてである。別の実施態様において、変異は、ｇ３ｐ上の１つ又は複数の溶媒によりアクセス可能な残基においてである。なお別の実施態様において、変異（複数を含む）は、Ｐｒｏ２１３でのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ平衡を５０、６０、７０、８０、９０、又は９５％より高いｔｒａｎｓにシフトする。従って、いくつかの実施態様において、ｇ３ｐは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも９５％ｔｒａｎｓである、Ｐｒｏ２１３でのｃｉｓ／ｔｒａｎｓ平衡を有する変異体ｇ３ｐである。

【0094】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ変異体又はそのアミロイド結合フラグメントは、構造的に保存された残基での変異を含まない。構造的に保存された残基の例は、可能性のある配列挿入に関わらず、ＦｆとＩ−ファミリーメンバーの両方においてドメイン構造をもたらす際に関与する残基を含む。

【0095】

いくつかの実施態様において、生じた任意の変異はアミロイド結合を保存する。他の実施態様において、変異はプロリン残基を置換しない。

【0096】

いくつかの実施態様において、生じた任意の変異は、アミロイド結合を保存し、システイン残基を置換しない。いくつかの実施態様において、変異は、全て、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ又は全４つのｇ３ｐ内に見られるジスルフィド架橋を保存する。従って、１つの実施態様において、任意の変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６との間、及びＣｙｓ４６とＣｙｓ５３との間のＮ１における２つのジスルフィド架橋を保存する。別の実施態様において、任意の変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６の間、及びＣｙｓ４６とＣｙｓ５３の間のＮ１におけるジスルフィド架橋のいずれか（しかし、両方ではない）を保存する。１つの実施態様において、Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１の間のジスルフィド架橋は保存される。いくつかの実施態様において、それぞれのジスルフィド架橋Ｃｙｓ７及びＣｙｓ３６、Ｃｙｓ４６及びＣｙｓ５３、及びＣｙｓ１８８及びＣｙｓ２０１は保存される。１つの実施態様において、変異は、Ｃｙｓ３５４とＣｙｓ３７１の間のジスルフィド架橋を保存する。いくつかの実施態様において、変異は、Ｃｙｓ７とＣｙｓ３６の間、Ｃｙｓ４６とＣｙｓ５３の間、Ｃｙｓ１８８とＣｙｓ２０１の間、及びＣｙｓ３５４とＣｙｓ３７１の間のジスルフィド架橋を保存する。

【0097】

いくつかの実施態様において、生じた任意の変異は、アミロイド結合を保存し、Ｎ１Ｎ２の融点（Ｔ_Ｍ）を低減する。Ｔ_Ｍは、実施例に記載の方法のいずれかを用いて測定され得る。Ｎ１Ｎ２のＴ_Ｍを低減する変異体は、Ａβへの良好な結合を発揮し、Ａβアセンブリーをより広範囲に阻害し、脱凝集アッセイにおいてＭ１３のｇ３ｐと少なくとも同等に有効であることが予測される。従って、これらの変異体を含むかかる変異体、並びに融合タンパク質及びファージは、１つ又は複数のタンパク質ミスフォールディング病の処置において、それぞれＭ１３中の対応する配列、その融合タンパク質、及びインタクトなＭ１３と少なくとも同等に治療上有効であることが予測される。

【0098】

変異体はまた、ターゲティング配列を含むよう設計され得る。かかるターゲティング配列は、Ｎ１Ｎ２間又はＮ２間で可動性リンカー領域及びＮ２融合タンパク質中の別のドメインに挿入され得る。ターゲティング核局在化配列（ＮＬＳ）は、ハンチントン病において有益であり得る。エンドソームのターゲティングは、パーキンソン病において有益であり得る。

【0099】

細胞中の特定の領域のターゲティングに加え、ターゲティング配列を用いて、異なる種類のアミロイドが標的にされ得る。核形成配列は、親和性を増大し、変異体タンパク質を特定のアミロイドに向け得る。それ自体の上で沈殿するよう疎水性であるペプチド配列を含む他の変異体が調製され得る。例えば、複数のＡＶＶＡＩ配列を、ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメント（例えば、Ｎ２及びＮ１Ｎ２）及び／又はその融合タンパク質に加えて、増強した複数の結合配列を有する化学タンパク質を生じることができる。アミロイドに結合し、ｇ３ｐ、Ｎ２、及びＮ１Ｎ２及び／又はその融合タンパク質を含む変異体又は化学タンパク質に取り込まれ得るペプチドのいくつかの例は、Ｓａｔｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００６） ４５：５５０３−１６に記載されるＧｘＦｘＧｘＦ（配列番号：２１）フレームワークに基づくペプチド阻害剤、及びＴｊｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９６） ２７１：８５４５−４８に記載されるＫＬＶＦＦ（配列番号：２２）ペプチドである。他のターゲティング部分が知られており、本発明において用いられ得る。例えば、Ｓｃｉａｒｒｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （２００６） ４１３：２７３−３１２を参照。

【0100】

アミロイド結合ディスプレービークル及び担体
本発明の別の態様において、Ｎ１Ｎ２ドメイン及びＮ２ドメイン、並びに分子、ポリペプチド、及びそれを含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されない、ｇ３ｐ及びそのアミロイド結合フラグメント（前述のもののいずれかの変異体及び変種）は、アミロイド結合を保存するが、更なる特性をもたらす分子スキャフォールドをもたらす他の有機又は無機担体と組み合わされ得る。

【0101】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、又はｇ３ｐ融合タンパク質、及び担体は、非組み換え手段（例えば、ペプチド結合以外の化学結合）を通して共有結合される。任意の適当な化学クロスリンカーが用いられ得る。他の分子（例えば、担体）にポリペプチドを共有結合する任意の既知の方法も用いられ得る。いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、又はｇ３ｐ融合タンパク質、及び担体は、少なくとも１個のアミノ酸又は化学的部分を含むリンカーを通じて融合され得る。

【0102】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、又はｇ３ｐ融合タンパク質、及び担体は、共有結合される。いくつかのかかる実施態様において、それらは、例えば、結合ペアを用いて結合され得る。典型的な結合ペアは、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、抗体とその抗原などを含むが、これらに限定されない。

【0103】

担体の例は、ウイルス粒子（ファージを含む（下記を参照））（ここで、ウイルスに由来しないｇ３ｐタンパク質又はそのアミロイド結合フラグメントは、ウイルス構造の一部として取り込まれる）、ポリマー（天然、合成、又は混合されたもののいずれか）、ポリマーコート構造（例えば、ビーズ（表面が誘導体化されたビーズを含む））、ポリアミノ酸、核酸、及びリポソームを含むが、これらに限定されない。担体は、ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントに直接的又は間接的のいずれかであり得る。担体に依存して、中間の結合を用いて、担体とアミロイド結合ドメインとの間の適当なスペーシングがもたらされ得る。

【0104】

ポリアミノ酸は担体タンパク質であり得る。かかるポリアミノ酸は、血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）、追加抗体又はその一部（例えば、Ｆｃ領域）、フェチュインＡ、フェチュインＢ、ロイシンジッパー核因子赤血球誘導体−２（ＮＦＥ２）、神経網膜ロイシンジッパー、テトラネクチン、又は他のポリアミノ酸（例えば、リジン）から選択され得る。ポリアミノ酸の付着位置は、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか、又はその間の他の場所であり、化学リンカー部分によりｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントに付着され得る。

【0105】

いくつかの実施態様において、担体は、オリゴマー形成ドメインを有する分子を含む。オリゴマー形成は、多原子価、増大した結合強度、及び異なるドメインの組み合わさった機能を含む、タンパク質又はそのフラグメントの機能の１つが結合であるとき、機能的利点を提供する。これらの特性は、天然のタンパク質で見られ、タンパク質操作により誘導され得る。従って、本発明はまた、オリゴマー形成ドメイン（例えば、ダイマー形成ドメイン）を含む、ｇ３ｐ及びアミロイド結合フラグメント（その変異体及び変種を含む）（例えば、Ｎ１Ｎ２ドメイン及びＮ２ドメイン）を提供する。適当なオリゴマー形成ドメインは、アルファらせん状コイルドコイルドメインを含むコイルドコイルドメイン；コラーゲンドメイン；コラーゲン様ドメイン、及びダイマー免疫グロブリンドメインを含む。本発明の適当なコイルドコイルポリペプチド融合パートナーは、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマーの基質タンパク質のコイルドコイルドメイン；アンジオポエチンコイルドコイルドメイン；及びロイシンジッパードメインを含む。コラーゲン又はコラーゲン様オリゴマー形成ドメインを用いるとき、それらは、例えば、コラーゲンに見られるもの、マンノース結合レクチン、肺界面活性剤タンパク質Ａ及びＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャー受容体、及びエミリンを含み得る。これらのうちいくつかのドメインが、融合タンパク質として取り込まれ得る一方、多くの実施態様において、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメントに、例えば共有結合を介して非組み換え的に結合される。

【0106】

加えて、本発明は、ポリマーに結合した、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント、又はｇ３ｐ融合タンパク質を提供する。本発明において用いられるポリマーは、治療上の生成物又は組成物の製造のため、医薬的に許容される。

【0107】

ポリマーは、典型的には、ポリペプチド機能的又は抗原性ドメインに対する作用を考慮しながら、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントに付着される。一般に、化学的な誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の適当な条件下で行われ得る。ポリマーを活性化部分に結合させるために用いられ得る活性化基は、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジジリン、オキシラン、及び５−ピリジルを含む。

【0108】

適当な臨床上許容される水可溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、又はポリオキシエチル化グルコース、コロン酸、又は他の炭水化物ポリマー、フィコール、又はデキストラン、及びその混合物を含むが、これらに限定されない。

【0109】

本発明のＰＥＧ部分は、分岐又は直鎖ポリマーであり得る。実施態様において、本発明は、モノ−又ポリ−（例えば、２〜４）ＰＥＧ部分を含む化学的に誘導されたポリペプチドを考慮する。ペグ化は、当該技術分野で知られたペグ化反応のいずれかにより行われ得る。ペグ化タンパク質産物の製造方法は、一般的に、当該技術分野において知られている。最適な反応条件は、既知のパラメーター及び所望の結果に依存して、個別の基準に基づき決定される。

【0110】

当業者に利用可能な多数のＰＥＧ接着方法が存在する（例えば、欧州特許第０４０１３８４号；Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， （１９９２） ２０：１０２８−１０３５；Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ３：４−１０ （１９９２）；欧州特許第０１５４３１６号；欧州特許第０４０１３８４号；国際公開公報第９２／１６２２１号；国際公開公報第９５／３４３２６号；及びペグ化に関連する本明細書に引用される他の刊行物）。

【0111】

ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメント（並びにその変異体及び変種、及び化合物、ポリペプチド、及び前述のいずれかを含む融合タンパク質）がＰＥＧ化されるとき、ＰＥＧは、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメントを化学的に誘導体化することにより接着され得る。他の実施態様において、ＰＥＧ分子による修飾に適したアミノ酸残基は、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメントに組み換え的に導入され得る。

【0112】

ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われ得る。従って、本発明のタンパク質産物はペグ化タンパク質を含み、ここで、ＰＥＧ基はアシル又はアルキル基を介して接着される。かかる産物は、モノ−ペグ化又はポリ−ペグ化（例えば、２〜６又は２〜５個のＰＥＧ基を含有するもの）され得る。適当な活性化ＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にＰＥＧエステル化される。

【0113】

アルキル化によるペグ化は、一般に、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をポリペプチドと還元剤の存在下で反応させることを含む。還元アルキル化反応のため、選択されたポリマー（複数を含む）は、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。典型的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそのアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照）。

【0114】

いくつかの実施態様において、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメントは、ファージの一部として発現され、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメントは、ファージ粒子から単離することにより調製される。しかしながら、一般に、組み換え技術を用いて、ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（その変異体及び変種を含む）が調製される。一般に、得られたタンパク質は、担体と組み合わせる前に単離される。

【0115】

いくつかの実施態様において、ディスプレービークルはファージである。これらの実施態様において、ｇ３ｐタンパク質、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、及び他のアミロイド結合フラグメント（前述のもの全ての変異体及び変種を含む）をコードする遺伝子は、バクテリオファージゲノムに取り込まれ、ファージの一部として発現される。例えば、１つの実施態様において、Ｍ１３ファージのｇ３ｐより高いアミロイド結合親和性を有する変異体ｇ３ｐタンパク質を用いて、Ｍ１３ファージの野生型ｇ３ｐが置き換えられる。従って、得られたファージは、野生型Ｍ１３に関連して改良された結合を有する。しかしながら、記載のｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメントのいずれかは、ファージに導入され得る。これらの実施態様において、野生型遺伝子３は、本発明のｇ３ｐにより全体として置換され得る。或は、増大したコピー数のｇ３ｐを有するファージについて考察される通り、組み換え分子は、ファージコートタンパク質（野生型ｇ３ｐを含む）をコードする遺伝子に融合され、ファージディスプレーライブラリーにおける抗原と抗体鎖に類似する方法で、ファージ上にディスプレーされ得る。任意の糸状バクテリオファージは、Ｍ１３、ｆｄ、ｆ１、Ｉ２２、Ｉｋｅ、又はＩｆ１を含むが、これらに限定されない、本発明のｇ３ｐを発現するように修飾され得る。いくつかの実施態様において、ヘルパーファージは、修飾ファージと結合して用いられ得る。

【0116】

組み換え技術
一般的に、ｇ３ｐタンパク質又はそのアミロイド結合フラグメント（並びにその変異体及び変種、及び前述のいずれかを含む化合物、ポリペプチド、及び融合タンパク質）をコードするＤＮＡは、通常の組み換えＤＮＡ技術（例えば、ｇ３ｐ遺伝子のクローニング、直接的ＤＮＡ合成、又は例えばＭ１３配列をプローブとして用いて対応するＤＮＡをライブラリーから単離すること）を用いて調製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ．を参照）。

【0117】

組み換え産生のため、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントをコードする核酸配列は、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要エレメント、又はＲＮＡウイルスベクターの場合、複製及び翻訳に必要なエレメントを含有する適当な発現ベクターに挿入される。コード核酸は、適切なリーディングフレームでベクターに挿入される。

【0118】

従って、本発明は、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメント（その変異体及び変種を含む）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ｇ３ｐ又はｇ３ｐ融合分子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。かかるベクターは、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。

【0119】

いくつかの実施態様において、ＣＨＯまたはＣＨＯ由来細胞中でのポリペプチドの発現に最適化されたベクターが選択される。典型的なかかるベクターは、例えばＲｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． （２００４） ２０：８８０−８８９に記載される。

【0120】

いくつかの実施態様において、ベクターは、ヒトを含む動物におけるｇ３ｐ、そのアミロイド結合フラグメント、及び／又はｇ３ｐ融合分子のインビボ発現のため選択される。いくつかのかかる実施態様において、ポリペプチドの発現は、組織特異的方法で機能するプロモーターの制御下である。

【0121】

発現ベクターは、ポリペプチドを発現する、適当な標的細胞にトランスフェクション又はコトランスフェクションされる。非限定的な典型的トランスフェクションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）に記載される。核酸は、当該技術分野において知られた方法により、所望の宿主細胞に一過性又は安定的にトランスフェクションされ得る。様々な宿主−発現ベクター系を用いて、原核生物細胞又は真核生物細胞のいずれかを含む、本明細書に記載のタンパク質が発現され得る。これらは、適当なコード配列を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフォーメーションされた微生物（例えば、細菌（例えば、エシェリキア・コリ）；適当なコード配列を含有する組み換え酵母又は真菌発現ベクターでトランスフォーメーションされた酵母又は糸状菌；適当なコード配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）でインフェクションされた昆虫細胞系；適当なコード配列を含有する、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス）でインフェクションされた植物細胞、又は組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）でトランスフォーメーションされた植物細胞；又は哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）を含む動物細胞系を含むが、これらに限定されない。タンパク質はまた、ウキクサにおいて組み換え的に産生され得る。例えば、米国特許第８，０２２，２７０号を参照。

【0122】

トランスフォーメーションに用いられるベクターは、通常、形質転換体を同定するために用いられる選択可能なマーカーを含有する。細菌系において、これは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン又はカナマイシン）を含み得る。培養哺乳動物細胞において用いるための選択可能なマーカーは、薬物（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキサートに対する耐性を確かにする遺伝子を含む。選択可能なマーカーは、増殖可能な選択可能なマーカーであり得る。１つの増殖可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。別の増殖可能な選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲｒ ｃＤＮＡ（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， （１９８３） ８０：２４９５）である。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｓｔｏｎｅｈａｍ， ＭＡ）により概説され、選択可能なマーカーの選択は、十分に当業者の範囲内である。

【0123】

発現系の発現エレメントは、その強さ及び特異性において変動する。用いられる宿主／ベクター系に依存して、恒常的及び誘導可能なプロモーターを含む、多数の適当な転写及び翻訳エレメントのいずれかが、発現ベクター中で用いられ得る。例えば、細菌系にクローニングされるとき、誘導可能なプロモーター（例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などが用いられ得る；昆虫細胞系にクローニングされるとき、プロモーター（例えば、バキュロウイルス多面体プロモーター）が用いられ得る；植物細胞系にクローニングされるとき、植物細胞のゲノムからもたらされるプロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット用プロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質用プロモーター）、又は植物ウイルスからもたらされるプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が用いられ得る；哺乳動物細胞系にクローニングされるとき、哺乳動物細胞のゲノムからもたらされるプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳動物ウイルスからもたらされるプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が用いられ得る；複数コピーの発現産物を含有する細胞株を作成するとき、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−、及びＥＢＶ−に基づくベクターが適当な選択可能なマーカーと共に用いられ得る。

【0124】

植物発現ベクターが用いられる場合、本発明の発現産物の直線形態又は非環状形態をコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかによりもたらされ得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡ及び１９Ｓ ＲＮＡプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９８４） ３１０：５１１−５１４）、又はＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８７） ６：３０７−３１１）が用いられ得るか、或は、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． （１９８４） ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８４） ２２４：８３８−８４３）、又はヒートショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． （１９８６） ６：５５９−５６５）が用いられ得る。これらのコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、指定ＤＮＡトランスフォーメーション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて植物細胞に導入され得る。かかる技術の概説のため、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ １９８８， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ， ｐｐ． ４２１−４６３；及びＧｒｉｅｒｓｏｎ ＆ Ｃｏｒｅｙ １９８８， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２ｄ Ｅｄ．， Ｂｌａｃｋｉｅ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈ． ７−９を参照。

【0125】

本発明のタンパク質を産生するために用いられ得る１つの昆虫発現系において、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて、外来遺伝子が発現させる。ウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において成長する。コード配列は、ウイルスの非本質的領域（例えば、多面体遺伝子）にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、多面体プロモーター）の制御下に置かれる。コード配列の十分な挿入は、多面体遺伝子の不活性化、及び非閉鎖組み換えウイルス（すなわち、多面体遺伝子によりコードされるタンパク質コートを欠くウイルス）の産生を導く。次に、これらの組み換えウイルスを用いて、スポドプテラ・フルギペルダ細胞（ここで、挿入遺伝子が発現する）を感染させる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８３） ４６：５８４；米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。この発現系の更なる例は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． １９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにおいて見られ得る。

【0126】

哺乳動物宿主細胞において、多数の、ウイルスに基づく発現系が用いられ得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合において、コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーター及び３分子リーダー配列）にライゲーションされ得る。この融合遺伝子は、インビトロ又はインビボ組み換えによりアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非本質的領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）における挿入は、生存可能で、感染宿主においてペプチドを発現する能力がある組み換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） （１９８４） ８１：３６５５を参照）。或は、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが用いられ得る（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） （１９８２） ７９：７４１５； Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８４） ４９：８５７； Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） （１９８２） ７９：４９２７を参照）。他のウイルス発現系は、アデノ随伴ウイルス及びレンチウイルスを含む。

【0127】

ＤＮＡコンストラクトを含有する宿主細胞は、適当な成長培地中で成長される。本明細書で用いられる、用語「適当な成長培地」は、細胞の成長に必要な栄養分を含有する培地を意味する。本発明の組み換え的に産生されたタンパク質は、当該技術分野において通常の技術を用いて細胞培地から単離され得る。

【0128】

インビトロアッセイ
いくつかの実施態様において、アミロイドの脱凝集は、チオフラビンＴ蛍光（ＴｈＴ）アッセイを用いてモニタリングされ得る。

【0129】

いくつかの実施態様において、脱凝集は、本発明の組成物の存在下又は非存下での界面活性剤可溶化をモニタリングすることにより調べられる。例えば、凝集したα−シヌクレインは、本発明の組成物を用いて処理され得る。凝集したα−シヌクレインを脱凝集する組成物は、未処理の線維と比較して、α−シヌクレイン線維を界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）中でより速く可溶化させる。アミロイド線維の可溶性形態へのこの変換は、標識（例えば、Ｃｙ５）α−シヌクレインモノマーの一部を凝集中に取り込むことにより、モニタリングされ得る。

【0130】

いくつかの実施態様において、毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防は、神経細胞の細胞培養物の細胞毒性アッセイにより調べられる。このアッセイにおいて、分化したＮ２ａ神経芽細胞腫細胞又は同等物は、Ａβ４２オリゴマーと共培養される。オリゴマーは膜に結合し、膜摂動及び細胞溶解性酵素の培地への漏出を引き起こす。高濃度のオリゴマーとの長期インキュベーションは細胞を殺傷する。オリゴマーは、細胞とインキュベーションする前に、ファージ又はｇ３ｐと予め処置されるとき、オリゴマーは少なくともわずかに毒性であり、時に無毒性である。この中和作用は、アデニル酸キナーゼの放出、膜摂動後に神経細胞により放出される１つの典型的な細胞質酵素を測定することにより定量化され得る。

【0131】

いくつかの実施態様において、本発明の組成物は、タンパク質ミスフォールディング環状増幅（ＰＭＣＡ）アッセイにおいて、可溶性プリオンタンパク質のタンパク分解酵素Ｋ抵抗性コンフォーマーへの変換を阻害する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， （２０１０） ３２７：１１３２−３５）。このアッセイにおいて、組み換えＰｒＰは、脂質ＰＯＰＧ及びＲＮＡと、本発明の組成物の存在下又は不存下で混合される。次に、物質は、３０秒間の超音波処理、続いて２９．５分間のインキュベーションの複数（例えば、４８）サイクルの対象にされる。次に、反応混合物の分画を用いて、別の基質チューブに播種し、サイクルを繰り返した。それぞれのラウンドを、ＰｒＰ由来の感染の指標である、タンパク分解酵素Ｋ抵抗性物質の存在について調べた。本発明の組成物の存在下でのタンパク分解酵素Ｋ抵抗性物質の低減は、組成物がＰＫ抵抗性コンフォーマーの形成を阻害することを示す。

【0132】

上で示される通り、ある種のプリオンタンパク質（例えば、酵母プリオンタンパク質ＮＭ）のアミロイド形態はまた、フィルタートラップアッセイにおいても検出され得る。従って、プリオンタンパク質に依存して、いくつかの実施態様において、本発明の組成物のプリオンタンパク質凝集体を脱凝集させ能力は、フィルタートラップアッセイにおいて試験され得る。

【0133】

インビボ機能アッセイ
インビトロアッセイにおいて示され得る、活性（例えば、アミロイドの増大した結合親和性、又はＴ_Ｍの低下）に加え、本発明の組成物はまた、いくつかのインビボアッセイの１つにおいて、アミロイドを低減し得る。インビボでのアミロイド低減を測定する１つの方法は、処置前及び後のイメージング剤フロルベタピル（Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）でのポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて、β−アミロイドの数及び／又は分布を比較する。もちろん、更なるバイオマーカーが同定されるなら、それらを用いて、アミロイドの低減を測定し得る。

【0134】

組成物がインビボでアミロイドを低減するかどうかを決定する別の方法は、ｈＡＰＰマウスモデルを用いる（Ｒｏｃｋｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． （２００１） ６６（４）：５７３−８２）。これらのマウスは、高レベルのβ−アミロイドを若年齢（３〜４ヶ月）で生じる。組成物のアミロイドを低減する能力は、マウスに本発明の組成物を注射し、次に、マウス中のアミロイドレベルを非注射対照と比較することにより、決定され得る。組成物をｈＡＰＰマウスの半球のみに注射することも可能であり、これにより同一マウス中の注射半球と非注射半球との間のアミロイドレベルの比較が可能になる。

【0135】

別の例では、本発明の組成物は、米国特許第２０１１／０１４２８０３号、 Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６） ２７４：９９−１０２， ｏｒ Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （２００８） １１５：５−３８に記載されるアルツハイマー病（ＴｇＡＤ）のトランスジェニックマウスモデルにおいて試験される。簡単に言うと、野生型、並びにトランスジェニックマウスが検証される。脱凝集剤として作用する本発明の組成物の可能性を評価するために、組成物は、トランスジェニックマウスに頭蓋内注射される（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＡＰＰＳＷＥ（２５７６）、１０ヶ月齢）。例えば、ファージを含む組成物について、糸状ファージ溶液（１０^１４ファージ／ｍｌ）２．５μｌを、１つの半球に１０分かけて注射し（ブレグマ−２．８ｍｍ、側面２．５ｍｍ、腹部２．５ｍｍ）、反対側に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を対照として適用した。次に、処置マウスを異なる時間で屠殺し、脳を一晩４％パラホルムアルデヒドにおいて前固定し、ミクロトームを用いて切断した。チオフラビン−Ｓ（ＴｈＳ）染色は、アミロイド負荷を評価するために行われる。切片は、メイヤーヘマトキシリンで染色し、核自動蛍光をクエンチし、その後、洗浄ＴｈＳ溶液（１％）を３分間適用した。分化を１％酢酸を用いて２０分間行い、洗浄後、切片を乾燥させ、抗フェード開始培地で開始させた。アミロイド負荷は、ＬＥＩＣＡ Ｑｗｉｎプログラムを用いて計算される。或は、アミロイド負荷は、抗アミロイド抗体で評価され得る。

【0136】

糸状ファージを含む放射活性（例えば、Ｉ^１２５）又は蛍光標識組成物の体内分布を測定し、組成物がインビボでアミロイドに結合することが示され得る。例えば、組成物がファージを含むとき、糸状ファージは、放射性又は蛍光標識され得る。ＢＡＬＢ／ｃマウスは２群に分けられる。次に、各マウスに、ファージ（１．２５×１０^１２ファージ）１００μｌを１時間かけて鼻腔内投与する。第１群のマウスは、４％パラホルムアルデヒドを用いた噴門内投与の１時間後に屠殺される。第２の群は、処置の３時間後に屠殺され、第３の群は２４時間後に屠殺される。灌流後、脳並びに抹消器官が取り出され、標識が測定される。或は、非標識組成物又はファージは、同様の方法だが、脳部分をアミロイドを認識する染料と組成物又はファージを認識する染料での共染色を用いて、結合について評価され得る。

【0137】

糸状ファージの鼻腔内投与をまた用いて、本発明により提供される、ファージを含む組成物（例えば、変異体ｇ３ｐを含むファージ、又はｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又は野生型ファージに関して増大した数のｇ３ｐを有するファージ）が完全に評価される。例えば、ファージは、アルツハイマー病のマウスモデルであるＳＷＥ／ＡＰＰ２５７６トランスジェニックマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、１０ヶ月齢）に投与される。２０マイクロタイターのファージ溶液（５×１０^１２／ｍｌ）は、２週間毎に４〜１２ヶ月間適用され、認知機能が評価される。処置期間後、新規対象認知試験を行い、記憶の改善に対するファージ処置の影響が調べられる。1日目、マウスは２０分間、２つの新規対象に曝される。翌日、１つの対象は置き換えられ、新たなアイテムを探すマウスの好奇心が調べられる。認知の指標は、各マウスについて、新規対象にかけられた時間を、両方の対象付近でかけられた時間で割ることにより、計算される。従って、０．５より高い値は、昔を認知し、調査のため新規対象周辺でより時間をかけたことの指標である。

【0138】

タンパク質ミスフォールディング病の他のトランスジェニックモデルをまた用いて、本発明の組成物がアミロイドを低減することが示され得る。非限定的な例は、「Ｄライン」α−シヌクレインマウス（パーキンソン病のモデル、Ｍａｓｌｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０００） ２８７：１２６５−１２６９）；Ｔｇ２５７６マウス（アルツハイマー病のモデル、Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６） ２７４：９９−１０２、及びＤｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （２００８） １１５：５−３８ ａｔ ９）；種々のパーキンソン病研究用Ｊａｘ（商標）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ）；及びパーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病を含む、ＪＳＷ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅから入手可能なマウス及びラットモデルを含む。

【0139】

ファージ（ここで、ｇ３ｐが付与される）は、これらのアッセイにおいて不活性化されると予測され、一方野生型ファージは、アミロイドに共局在化し、アミロイド負荷を低減し、アミロイド形成を予防し、及び／又は毒性オリゴマーを除去し、認知機能の改善を生じる。従って、本発明により提供される、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントは、これらのネガティブ及びポジティブコントロールに対するインビボ活性について試験され得る。

【0140】

医薬組成物
別の態様において、本発明は、本発明の上述の剤のいずれかを含む医薬的に許容される組成物を提供する（すなわち、（ａ）ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種；（ｂ）化合物、ポリペプチド、ｇ３ｐを含む融合タンパク質、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種；（ｃ）野生型ファージと比較して、増大した数のコピーのｇ３ｐを生じる糸状バクテリオファージ；（ｄ）ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、その変異体又は変種、又はｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種を含む化合物、ポリペプチド、及び融合タンパク質を生じるアミロイド結合ディスプレービークル；又は（ｅ）ｇ３ｐの変種、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（ディスプレーされたｇ３ｐタンパク質の一部としてではない）、かかる結合フラグメントの変異体又は変種、又は融合タンパク質、又はｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種を含む他の異種性ポリペプチを生じる修飾糸状ファージ）。

【0141】

「医薬組成物」は、生理的に適当な担体、及び／又は賦形剤と共に、治療上有効量の本明細書に記載される組成物に言及する。医薬組成物は、生物に有意な刺激を引き起こさない。互換的に用いられ得る、語句「生理的に許容される担体」及び「医薬的に許容される担体」は、生物に有意な刺激を引き起こさず、投与される組成物の生物学的活性及び特性を抑制しない担体又は希釈剤に言及する。

【0142】

用語「賦形剤」は、有効成分の投与を更に促進するために医薬組成物に加えられる不活性な物質に言及する。非限定な例は、例えば、食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、及び例えば、ポリソルベート２０を含む、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、及び界面活性剤の類いを含む。

【0143】

本発明に従い使用するための医薬組成物は、通常の方法で、有効成分の組成物中への処理を促進し、医薬的に用いられ得る、賦形剤及び助剤を含む１つ又は複数の生理的に許容される担体を用いて、製剤化され得る。適切な製剤化は、選択される投与経路及びデリバリーされる組成物の性質に依存する（例えば、タンパク質対ファージ）。

【0144】

本発明の医薬組成物に適した投与経路は、例えば、経粘膜、特に経鼻デリバリー；筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含む非経腸デリバリー；経口；又は直腸デリバリーを含む。

【0145】

いくつかの実施態様において、医薬組成物は、全身性の方法よりむしろ局所で投与される（例えば、医薬組成物の患者の脳への直接注射を介して）。いくつかの実施態様において、注射技術は、血管脳関門を回避する任意の技術である（例えば、直接的髄内、くも膜下腔内、又は脳室内注射による）。

【0146】

注射のため、本発明の有効成分は、水溶液、好ましくは、生理的に適合するバッファー（例えば、ハンクス溶液、リンガー溶液、又は生理食塩緩衝液）中に製剤化され得る。経粘膜投与のため、透過されるべき関門に適した浸透性が、製剤化中で用いられる。かかる浸透性は、一般に、当該技術分野において知られている。

【0147】

いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、鼻腔内投与を介して投与される。鼻腔内デリバリーは、ウイルス及び高分子の脳脊髄液（ＣＳＦ）又はＣＮＳへの直接的移行を可能にすることが報告されている（Ｍａｔｈｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９８； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ， １９９７； Ｄｒａｇｈｉａ ｅｔ ａｌ， １９９５）。

【0148】

鼻腔内経路による投与のため、組成物は、通常、適当な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン、又は二酸化炭素）を用いて、圧縮パック又は噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態でデリバリーされる。圧縮エアロゾルの場合、投与単位は、定量をデリバリーするためのバルブを用意することにより、決定され得る。化合物の粉末混合物、及び適当な粉末基剤（ラクトース又はスターチ）を含有する、ディスペンサーにおいて使用するための例えばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジが製剤化され得る。

【0149】

医薬組成物の成分として本明細書に記載される種々のタンパク質はまた、嗅覚受容体神経細胞をデリバリーのポイントとして用いて、脳へデリバリーされ得る。例えば、これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターが、嗅覚受容体神経細胞を介してデリバリーされ得る（Ｄｒａｇｈｉａ ｅｔ ａｌ， １９９５）。

【0150】

本明細書に記載される組成物は、例えば、ボーラス注射又は持続点滴による非経腸投与のために製剤化され得る。非経腸投与用の医薬組成物は、水溶性形態の組成物の水溶液を含む。或は、有効成分の懸濁液は、油性又は水ベース注射懸濁液として調製され得る。適当な親油性溶媒又はビークルは、脂肪油（例えば、ゴマ油）、又は合成脂肪酸エステル（例えば、エチルオレート、トリグリセリド、又はリポソーム）を含む。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上昇させる物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストラン）を含有し得る。場合により、懸濁液はまた、有効成分の溶解性を増大して、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする、適当な安定剤又は剤（例えば、界面活性剤（例えば、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ２０））を含有し得る。タンパク質ベースの剤（例えば、アルブミン）を用いて、Ｍ１３のデリバリー表面（すなわち、ＩＶバック、カテーテル、針など）への吸着が予防され得る。

【0151】

経口投与のため、組成物は、有効な化合物を、当該技術分野で周知の医薬的に許容される担体と組み合わせることにより容易に製剤化され得る。

【0152】

製剤は、単位投与形態（例えば、場合により加えられた保存剤と共に、バイアル、アンプル剤中、又はマルチドーズ容器中）で提示され得る。組成物は、油性又は水性ビークル中の懸濁液、溶液、又は乳液であり得、調合剤（例えば、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤）を含有し得る。１回用量形態は、液体又は固体形態であり得る。１回用量形態は、改変することなく患者に直接投与され得るか、又は投与前に希釈されるか、又は再構築され得る。ある種の実施態様において、１回用量形態は、ボーラス形態（例えば、１回注射用量、複数の錠剤、カプセル剤、ピルなどを含む経口用量を含む１回経口用量）で投与され得る。代替の実施態様において、１回用量形態は、例えば、注入により、又は移植ポンプ（例えば、ＩＣＶポンプ）を介して経時的に投与され得る。後者の実施態様において、１回用量形態は、示された数の糸状バクテリオファージを予め充填した注入バック又はポンプリザーバーであり得る。或は、注入バック又はポンプリザーバーは、患者に投与される直前に、１回用量の糸状バクテリオファージを注入バック又はポンプリザーバー溶液と混合することにより、調製され得る。

【0153】

本発明の別の態様は、本発明の医薬組成物の調製方法を含む。薬物の製剤化技術は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，」 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（本明細書において、引用により全体として取り込まれる）において見られる。

【0154】

本発明の前後関係における使用に適した医薬組成物は、有効成分が、意図される目的を達成するのに有効な量で含有される組成物を含む。

【0155】

治療上又は診断上有効な量の決定は、特に、本明細書において提供される詳細な開示に照らし、当業者の能力の十分に範囲内である。

【0156】

投薬量及び間隔は、具体的な脳疾患、異常、又は状態を処置又は診断するのに十分である（最小有効濃度、ＭＥＣ）、ファージディスプレービークルの脳レベルを提供するために、個々に調節され得る。ＭＥＣは、各調製について変動するが、インビトロデータから推定され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は、個々の特徴に依存する。

【0157】

投薬間隔はまた、ＭＥＣ値を用いて決定され得る。調製物は、１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％の時間、ＭＥＣより上の脳レベルを維持する、投薬計画を用いて投与されるべきである。

【0158】

処置されるべき状態の重症度及び応答性に依存して、用量は、数日から数週間に渡る処置コースで、又は治癒が引き起こされるか、又は疾患状態の縮小が達成されるまで、１回又は多数の投与であり得る。

【0159】

投与されるべき組成物の量は、当然、処置又は診断される対象、苦痛の重症度、医師の判断などに依存する。

【0160】

本発明の組成物は、所望なら、パック又はディスペンサーデバイス中（例えば、ＦＤＡ承認キット）で提示され、それは、有効成分を含有する１つ以上の単位用量形態を含有し得る。パックは、例えば、金属又はプラスチックはく（例えば、ブリスターパック）を含む。パック又はディスペンサーデバイスには、投与の指示書が付随され得る。パック又はディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形態で、容器と関連した注意として提供され得る（かかる注意は、組成物形態、又はヒト、又は獣医投与の形態の、機関による承認についてである）。かかる注意は、例えば、処方薬用、又は承認された製品挿入物である、米国の食品医薬品局により承認されたラベルであり得る。適合可能な医薬担体中に製剤化された本発明の調製物を含む組成物はまた、上でさらに詳述されるように、調製され、適当な容器内に入れられ、指定された状態の処置についてラベルされ得る。

【0161】

前述及び後述の記載の両方が、請求の本発明の例示及び説明のみであり、制限でないことは理解されるべきである。

【0162】

治療上の使用
示される通り、糸状バクテリオファージＭ１３、及び関連糸状ファージは、タンパク質ミスフォールディング病の動物モデルにおける有用性を有する。米国特許公報第２０１１／０１４２８０３号（本明細書において引用により全体として取り込まれる）を参照。特に、糸状バクテリオファージが、脳において既に形成されたアミロイドを脱凝集させる能力を有することが発見された。アミロイドの除去は、脳中の誤って折り畳まれた及び／又は凝集タンパク質により特徴付けられる様々な疾患と関連する症状を低減するか、その進行を遅延させるか、又は逆転さえすると予測される。例えば、国際公開公報第２００６０８３７９５号及び国際公開公報第２０１００６００７３号（本明細書において引用により全体として取り込まれる）を参照。

【0163】

更に、Ｍ１３は、少なくとも４種の異なるアミロイド線維：アミロイド−β１〜４２線維（ｆＡβ４２）、α−シヌクレイン線維（ｆαｓｙｎ）、酵母プリオンＮＭ線維（ｆＮＭ）、及びタウ線維（ｆｔａｕ）を脱凝集することが示された。

【0164】

従って、本発明の別の態様は、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、又はｆｔａｕのいずれかに関与する疾患を含むが、これらに限定されない、タンパク質ミスフォールディング病の処置における、本発明の組成物（例えば、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメント（前述のすべての変異体又は変種を含む）、又は上記のいずれかを含むｇ３ｐ融合タンパク質、ディスプレービークル、又はファージを含むもの）のいずれかの使用に関する。

【0165】

処置の前後関係において、用語「患者」、「対象」、及び「レシピエント」は、互換的に用いられ、ヒト並びに他の動物を含む。いくつかの実施態様において、患者は、タンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカーについて陽性であるヒトである。１つの実施態様において、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像診断により検出されるβ−アミロイド沈着を示す。

【0166】

用語「処置すること」は、疾患の１つ以上の臨床症状を示す患者において、疾患の進行を低減すること、遅延させること、又は逆転させることを意味する。「処置すること」はまた、疾患の１つ以上の臨床症状を示す患者において疾患の症状を低減すること、遅延させること、又は逆転させることを意味することも意図される。１つの実施態様において、患者は、フロルベタピルを用いたＰＥＴ画像診断により検出されるβ−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数が処置により低減される。１つの実施態様において、患者は、本発明のｇ３ｐ組成物により検出されるβ−アミロイド沈着を示し、β−アミロイド沈着の数は、処置により低減され、又は維持される。別の実施態様において、患者は、ＰＥＴ画像診断により検出されるある種のアミロイド沈着を示し、患者の認知機能は、処置により改善される。認知機能の改善は、ＭｃＫｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ （２０１１） Ｍａｙ；７（３）：２６３−９の方法及び検査によりアッセイされる。

【0167】

「予防」は、処置と異なり、任意の臨床症状の発症前の組成物の個体への投与に言及する。本発明のｇ３ｐ及び／又はＴｏｌＡ組成物のいずれかを用いた予防が包含される。予防は、疾患の増大したリスクがあることが知られた個体、又は１種以上の遺伝子マーカーに基づき、疾患を必ず発症する個体において関連し得る。多くの遺伝子マーカーが、種々のタンパク質ミスフォールディング病について同定されている。例えば、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）におけるスウェーデン型変異、インディアナ型変異、又はロンドン型変異の１つ以上を有する個体は、早発型アルツハイマー病を発症する増大したリスクにあり、故に予防の候補者である。同様に、ハンチンチン遺伝子においてトリヌクレオチドＣＡＧリピート（特に、３６以上のリピート）を有する個体は、最終的に、ハンチントン病を発症し、故に予防の候補者である。

【0168】

いくつかの実施態様において、タンパク質又はフラグメントは、治療として直接用いられる。これらの実施態様において、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメント（前述のいずれかの変異体又は変種を含む）は、医薬組成物又は製剤に直接取り込まれる。他の実施態様において、ｇ３ｐ、Ｎ１Ｎ２ドメイン、Ｎ２ドメイン、又は他のアミロイド結合フラグメント（前述のいずれかの変異体又は変種を含む）は、融合タンパク質又はディスプレービークル（例えば、ファージ）の一部であり、これらの実施態様において、それは、本発明の医薬組成物又は製剤に取り込まれる融合タンパク質又はディスプレービークルである。他の実施態様において、組成物は、アミロイドのレベルの低減又は維持において、野生型Ｍ１３ファージのｇ３ｐより有効である、ｇ３ｐ又はそのアミロイド結合フラグメントを含むファージを含む。いくつかの実施態様において、アミロイドレベルの低減又は維持においてＭ１３より有効であるファージは、５コピーより多いｇ３ｐを発現する。

【0169】

用語「タンパク質ミスフォールディング」は、タンパク質（アミロイド形成ペプチド）（例えば、β−アミロイド、血清アミロイドＡ、システインＣ、ＩｇＧカッパー軽鎖、又はプリオンタンパク質（これらに限定されない））を凝集させることによるアミロイドタンパク質の形成により特徴付けられる疾患に言及する。誤って折り畳まれた及び／又は凝集されたアミロイドタンパク質と関連することが知られている疾患は、早発型アルツハイマー病、後発型アルツハイマー病、及び発症前アルツハイマー病を含むアルツハイマー病、パーキンソン病、ＳＡＡアミロイド症、シスタチンＣ、遺伝性アイスランド症候群、老衰、多発性骨髄腫、クールー病、クロイツフェルト・ヤコブ疾患（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、スクレイピー、及びウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含むがこれらに限定されないプリオン病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１）、（ＳＣＡ３）、（ＳＣＡ６）、（ＳＣＡ７）、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、球脊髄性筋萎縮症、遺伝性脳アミロイド血管症、家族性アミロイドーシス、前頭側頭葉型認知症、イギリス型／デンマーク型認知症、及び家族性脳症を含む。本発明のｇ３ｐ組成物を用いて、「タンパク質ミスフォールディング」疾患が処置され得る。

【0170】

これらの誤って折り畳まれた及び／又は凝集されたアミロイドタンパク質疾患の多くは、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる。ＣＮＳにおいて生じる疾患のいくつかの例は、パーキンソン病；アルツハイマー病；以下の臨床的症候群：行動の変体ＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、進行性非能弁的失語（ＰＮＦＡ）及び語義痴呆（ＳＤ）を有する患者を含む前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）；前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）；及びハンチントン病である。本発明のｇ３ｐ組成物を用いて、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる、誤って折り畳まれた及び／又は凝集されたアミロイドタンパク質により特徴付けられる疾患が処理され得る。

【0171】

タンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集は、ＣＮＳ外でも生じ得る。アミロイドーシスＡ（ＡＡ）（前駆体タンパク質が血清急性期アポリポタンパク質である、ＳＡＡ）、及び多発性骨髄腫（前駆体タンパク質免疫グロブリン軽鎖及び／又は重鎖）は、ＣＮＳ外で生じる２つの広く知られたタンパク質ミスフォールディング及び／又は凝集タンパク質疾患である。他の例は、β_２−ミクログロブリンにより形成されるアミロイドに関与する疾患、トランスサイレチン（家族性アミロイド性多発性神経障害［ＦＡＰ］、家族性アミロイド性心筋症［ＦＡＣ］、及び老人性全身性アミロイドーシス［ＳＳＡ］）、（アポ）血清ＡＡ、アポリポタンパク質ＡＩ、ＡＩＩ、及びＡＩＶ、ゲルゾリン（家族性アミロイド性多発性神経障害のフィンランド型）、リゾチーム、フィブリノーゲン、シスタチンＣ（脳アミロイド血管症、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アイスランド型）、（プロ）カルシトニン、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰアミロイドーシス）、心房性ナトリウム利尿因子、プロラクチン、インスリン、ラクタドヘリン、ケラト−エピセリン、ラクトフェリン、歯性エナメル芽細胞関連タンパク質、及びセメノゲリンＩを含む。本発明のｇ３ｐ組成物を用いて、ＣＮＳ外で生じるタンパク質のミスフォールディング及び／又は凝集に関与する疾患が処置され得る。

【0172】

神経変性疾患はまた、タウ損傷に関与し得る（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２４：１１２１−１５９）。タウタンパク質は、中枢性及び抹消性神経系神経細胞の両方の軸において発現される微小管関連タンパク質である。神経変性タウオパチー（時に、タウオパチーとして言及される）が包含される。タウオパチーの例は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症／パーキンソニズム−認知症合併症、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ボクサー痴呆、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、染色体１７に結びついたパーキソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハラーホルデン・スパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、及び神経原線維変化型認知症（Ｔａｎｇｌｅ ｏｎｌｙ ｄｅｍｅｎｔｉａ）を含む。これらの疾患のいくつかはまた、原線維アミロイドβペプチドの沈着も含む。例えば、アルツハイマー病は、アミロイドβ沈着及びタウ損傷の両方を示す。同様に、プリオンにより介在される疾患（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオンタンパク質脳アミロイド血管症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病）はまた、タウ損傷を有し得る。従って、疾患が「タウオパチー」であるとの徴候は、疾患を他の神経変性疾患分類又はグループ分けから除外すると解釈されるべきではなく、単に便宜的に提供される。本発明のｇ３ｐ組成物を用いて、神経変性疾患、並びにタウ損傷に関与する疾患が処置され得る。

【0173】

１つの実施態様において、医薬組成物又は製剤は、患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物又は製剤を投与することを含む、アミロイドの存在と関連する症状を示すか、又はタンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカー（例えば、フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ））に対して陽性である患者におけるアミロイドの低減方法において使用するためのものである。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0174】

１つの実施態様において、医薬組成物又は製剤は、患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物又は製剤を投与することを含む、アミロイドの存在と関連する症状を示すか、又はタンパク質ミスフォールディング病と関連するバイオマーカー（例えば、フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ））に対して陽性である患者においてアミロイドレベルの維持方法において使用するためのものである。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0175】

１つの実施態様において、医薬組成物又は製剤は、アミロイドを有する患者に有効量の本明細書に記載の医薬組成物又は製剤を投与することを含む、患者におけるアミロイドの脱凝集方法において使用するためのものである。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0176】

１つの実施態様において、医薬組成物又は製剤は、必要とする患者の脳に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を直接注射し、これにより、脳におけるβ−アミロイド沈着の低減を引き起こすことを含む、脳におけるβ−アミロイド沈着の脱凝集を引き起こす方法において使用するためのものである。

【0177】

１つの実施態様において、医薬組成物又は製剤は、脳におけるアミロイド形成の低減方法において使用するためのものである。脳におけるアミロイド形成の低減は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0178】

１つの実施態様において、本発明の医薬組成物又は製剤は、脳におけるアミロイドクリアランスの促進方法において使用するためのものである。アミロイドクリアランスの促進は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0179】

１つの実施態様において、本発明の医薬組成物又は製剤は、脳におけるアミロイド凝集の阻害方法において使用するためのものである。脳におけるアミロイド凝集の阻害は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0180】

１つの実施態様において、本発明の医薬組成物又は製剤は、脳における毒性アミロイドオリゴマーの排除方法において使用するためのものである。脳における毒性アミロイドオリゴマーの排除は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0181】

１つの実施態様において、本発明の医薬組成物又は製剤は、脳における毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防方法において使用するためのものである。脳における毒性アミロイドオリゴマーの形成の予防は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。

【0182】

１つの実施態様において、本発明の医薬組成物又は製剤は、神経細胞をアミロイド損傷から保護する方法において使用するためのものである。神経細胞のアミロイド損傷からの保護は、タンパク質−ミスフォールディング又は神経変性疾患の症状又は重症度を予防、処置、又は低減し得る。１つの実施態様において、投与経路は、くも膜下腔内注射、直接脳室内注射、実質内注射、又は鼻腔内デリバリーから選択される。１つの実施態様において、神経細胞のアミロイド損傷からの保護において使用するための本発明の医薬組成物又は製剤は、予防的に付与される。

【0183】

いくつかの実施態様において、患者は、タンパク質ミスフォールディング及び／又は凝集疾患と関連するバイオマーカーに対して陽性である。１つの実施態様において、バイオマーカーはフロルベタピル（ＡＶ４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）である。

【0184】

いくつかの実施態様において、患者は、アミロイドの存在と関連する神経変性疾患の症状を示している。種々の実施態様において、アミロイドは、ｆＡβ４２、ｆαｓｙｎ、ｆＮＭ、又はｆｔａｕのいずれかである。

【0185】

ある種の実施態様において、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、又はハンチントン病である。１つの実施態様において、神経変性疾患はアルツハイマー病である。１つの実施態様において、神経変性疾患はアルツハイマー病であり、患者は、イメージング剤フロルベタピル（ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）により検出されるβ−アミロイドを示す。

【0186】

いくつかの実施態様において、患者は、プリオンにより仲介される疾患の症状を示している。

【0187】

ある種の実施態様において、プリオンにより仲介される疾患は、クロイツフェルト・ヤコブ疾、クールー病、致死性家族性不眠症、又はゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病から選択される。

【0188】

いくつかの実施態様において、患者は、アルツハイマー病以外の神経変性タウオパチーの症状を示している。ある種の実施態様において、処置されるべき疾患は、嗜銀顆粒性認知症、皮質基底核変性症、ボクサー痴呆、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、染色体１７に結びついたパーキソニズムを伴う前頭側頭型認知症を含む前頭側頭型認知症、ハラーホルデン・スパッツ病、筋緊張性ジストロフィー、ニーマン・ピック病Ｃ型、神経原線維変化を伴う非グアム型運動ニューロン疾患、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、進行性皮質下グリオーシス、進行性核上性麻痺、亜急性硬化性汎脳炎、及び神経原線維変化型認知症から選択される。

【0189】

診断
本発明の別の態様において、ｇ３ｐ融合タンパク質を含む本明細書に記載のｇ３ｐ及びＴｏｌＡ組成物は、本明細書に記載の種々の疾患と関連する診断上の適用において用いられる。例えば、本発明の組成物の結合は、インビボ又はインビトロのいずれかでイメージング剤として用いられるとき、記載のタンパク質ミスフォールディング病の１つの診断の一部であり得る。

【0190】

診断剤（本明細書において診断用組成物として言及される）は、包含され、上述の本発明の剤のいずれかを含み得る（すなわち、（ａ）ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種；（ｂ）ｇ３ｐを含む化合物、ポリペプチド及び融合タンパク質、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種；（ｃ）野生型ファージと比較して増大した数のコピーのｇ３ｐを生じる糸状バクテリオファージ；（ｄ）ｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、その変異体又は変種、又はｇ３ｐを含む化合物、ポリペプチド及び融合タンパク質、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種を生じるアミロイド結合ディスプレービークル；又は（ｅ）ｇ３ｐの変種、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント（ディスプレーされたｇ３ｐタンパク質の一部としてではない）、かかる結合フラグメント又は融合タンパク質の変異体又は変種、又はｇ３ｐ、ｇ３ｐのアミロイド結合フラグメント、又はその変異体又は変種を含む他の異種性ポリペプチドを生じる修飾糸状ファージ）。診断剤は、検出可能な標識を更に含むか、又はそうでなければインビボで検出され得る。

【0191】

いくつかの実施態様において、本発明の組成物（例えば、可溶性ｇ３ｐ又はアミロイド結合フラグメント（その変異体及び変種を含む）、又はｇ３ｐ融合タンパク質を含むもの）は、アミロイドイメージング剤として用いられる。イメージング剤は、アミロイドを検出することができ、アミロイドと関連する疾患を診断することができる。本発明の組成物は、線維の種類に関わらずアミロイドを結合するので、全て単一のイメージング剤を用いて任意のアミロイド凝集体（Ａβ、タウ、α−シヌクレインなど）を画像化することができるという点で有利である。現時点で、ＣＮＳにおけるタウ又はアルファシヌクレイン凝集体に許容されるイメージング剤／方法は存在しない。β−アミロイドに対するイメージング剤が存在する一方、認知機能と画像結果との相関の改良をもたらし得、及び／又は疾患の悪化対安定性を良好に推測する更なる剤が依然必要である。概説については、Ｒｅｓｎｉｃｋ ＆ Ｓｏｊｋｏｖａ， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ． （２０１１） ３（１）：３を参照。

【0192】

本発明の診断用組成物は、β−アミロイドに特異的なイメージング剤（例えば、Ｆ１８−ＡＶ−４５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）と組み合わせてイメージング剤として用いられ得る。現在、非β−アミロイド凝集体に対して既知のイメージング剤は存在しないので、β−アミロイド特異的イメージング剤と一緒の本発明の診断用組成物の使用は、分別検出に基づく非β−アミロイド凝集体の検出となる。従って、１つの実施態様において、本発明の診断用組成物を、β−アミロイドイメージング剤と組み合わせてイメージング剤として用いて、非β−アミロイド凝集体が検出される。

【0193】

別の実施態様において、本発明の診断用組成物をイメージング剤として用いて、脳を含むＣＮＳにおいてβ−アミロイドが検出される。

【0194】

本発明の診断用組成物は、一般に、イメージング剤として用いられたとき、１つ以上の検出可能な標識に結合するアミロイド結合成分を必要とする。種々の標識は、タンパク質標識の標準的技術を用いて、診断用組成物のアミロイド結合成分に結合され得る。標識の例は、蛍光標識、及び放射性標識を含む。用いられ得る広範な放射性標識が存在するが、一般的に、標識は、^１８Ｆ、^１１Ｃ、及び^１２３Ｉを含むが、これらに限定されない放射性標識から選択される。これら及び他のラジオアイソトープは、周知の化学を用いてタンパク質に結合され得る。１つの実施態様において、標識は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて検出される。しかしながら、ラジオアイソトープの検出に適した他の任意の技術をまた用いて、放射性トレーサが検出され得る。

【0195】

本発明の診断用組成物は、治療用組成物について記載されたのと同じ経路を用いて投与され得る。１つの実施態様において、くも膜下腔内投与が、診断用組成物の投与経路として用いられる。別の実施態様において、静脈内投与が、診断用組成物の投与経路として用いられる。

【実施例】

【0196】

実施例
抗凝集剤としての糸状ファージの証明された治療上の有効性は、作用の任意の具体的なメカニズムに付随しないが、メカニズムを理解することは、より高い治療上の有効性を伴ったファージ設計を可能にする。加えて、それは、更なる抗凝集剤を調製するための基礎として作用する。

【0197】

既に示された通り、Ｍ１３は、少なくとも４種類の異なるアミロイド線維：アミロイド−β１〜４２線維（ｆＡβ４２）、α−シヌクレイン線維（ｆαｓｙｎ）、酵母プリオンＮＭ線維（ｆＮＭ）、及びタウ線維（ｆｔａｕ）に結合し、脱凝集させることが示された。これらのアミロイド線維を作り出す４個のタンパク質は、１次アミノ酸配列と関連しないが、全４種が基準のアミロイド折り畳みに誤って折り畳まれる（Ｅｉｃｈｎｅｒ ＆ Ｒａｄｆｏｒｄ， ２０１１）。Ｍ１３のこれらのタンパク質それぞれの脱凝集に結合し、仲介する能力は、Ｍ１３が構造上のモチーフ（例えば、クロスベータシート構造）又は構造上の特性（例えば、疎水性グローブ）（これら両方が、全アミロイド線維の特徴を定義している）を認識することを示す。

【0198】

しかしながら、アミロイド脱凝集は、全てのファージの一般的な性質ではない。例えば、構造上異なる正二十面体ファージＴ７は、ｆＡβ４２と３日間３７℃でインキュベーションされたときでさえ、ｆＡβ４２の脱凝集を仲介しない。バクテリオファージＴ７は、７０％を超える共インキュベーションされたアミロイド線維を解離する濃度でさえ、任意の解離活性を示さない。対照的に、Ｍ１３と比較してｇ８ｐ中に負に電荷したアミノ酸を有するバクテリオファージｆｄ（それ故、ｇ８ｐのコピー数を付与されたＭ１３より、２８００個のより負の電荷／ファージを示す）は、Ｍ１３同様、ｆＡβ４２に結合し、脱凝集した。アミロイド脱凝集がタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、エシェリキア・コリ線維、及びＴ４のテールチューブ（これら全てがらせん状シリンダー形及び繰り返し単位を有する（米国特許第２０１１／０１８２９４８号を参照））により仲介され得るとの知見に基づき、これらの初期研究は、それがアミロイド線維−解離活性に決定的なファージの形であることを示唆した。

【0199】

しかしながら、以下の実施例は、報告された糸状ファージ及び糸状ファージの抗凝集特性についての代替（しかしながら、相互排他的ではない）メカニズムを記載する。これらの実施例、及びそれらがサポートする作用のメカニズムに基づき、アミロイドの改良された結合を有する修飾ファージは、新規アミロイド結合剤と共に提供される。

【0200】

実施例１：Ｍ１３ファージはＡβ原線維に優先的に結合する
Ｍ１３のＡβ原線維対Ａβモノマーへの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により示した。

【0201】

Ｍ１３ファージはＡβ原線維に優先的に結合し、Ａβモノマーに結合しない。固定化ｆＡβを有するバイオセンサーチップに渡り流した１０^１４ファージ／ｍＬを用いた表面プラズモン共鳴研究を図３に報告する。図３は、Ｍ１３結合Ｋ_Ｄが約４ｎＭであり、モノクローナル抗体による結合と比較可能であることを示す。この高親和性相互作用は、特異的結合プロセスがファージとアミロイド線維間で生じることを示す。

【0202】

実施例２：Ｍ１３のＡｂ原線維への結合は用量依存性である
ｆＡβ４２へのＭ１３結合も用量依存性である。図４Ａにおいて、２つのファージ用量の増加モル量のｆＡβ４２との結合を比較した。このＭ１３−アミロイド線維結合アッセイにおいて、Ｍ１３−Ａｌｅｘａ４８８をＡβ（ｆＡβ）と２〜３時間混合して、複合体を形成させ、次に、複合体を７５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿させた。ペレット中の蛍光は、アミロイドへのＭ１３結合に比例した。このアッセイは、ファージのｆＡβへの結合の定量的測定、及び結合に対する他の剤のファージと競合する能力の評価系を提供する。図４Ｂは、Ｍ１３結合競合のＫ_Ｄが、表面プラズモン共鳴を用いて結合について観察したものと同様であることを示す。

【0203】

実施例３：Ｍ１３のＡβ原線維への結合は天然構造を必要とする
Ｍ１３ファージを９０℃で１０分間加熱したとき、結合に対して競合するその能力は、本質的に無効になる。図５は、アミロイド線維競合結合アッセイにおいて加熱処理（四角）対天然構造（丸）Ｍ１３を用いた結合競合結果を示す。

【0204】

実施例４：温度はＭ１３−アミロイド相互作用と相関する
Ｍ１３はアミロイド線維を強力に脱凝集する。図６は、ｆＡβを用いたチオフラビンＴ（ＴｈＴ）蛍光アッセイを示す。Ｍ１３の存在下で、ｆＡβ４２は脱凝集する。

【0205】

図７Ａは、ＴｈＴ蛍光中の塩濃度の１０倍（０．１５〜１．５Ｍ）変化が、脱凝集するｆＡβの存在下でたった２〜３倍の差となることを示す。これは、疎水性相互作用が観察した脱凝集のほとんどに関与することを示す。

【0206】

塩濃度の比較的わずかな作用と対照的に、図７Ｂは、４℃から３７℃の温度変化が、脱凝集において８〜１０倍の差となることを示す。

【0207】

これらの結果は、Ｍ１３脱凝集が、温度が高いほどより活性であり、アッセイにおける塩の作用と比較的関係しない（疎水性相互作用を示唆する）タンパク質に依存することを示す。ファージｇ３ｐはこの説明と合致する。そのＮ１及びＮ２ドメインは、「開合して」、Ｎ２が細菌のＦ−線毛に結合する可動性グリシンリッチなリンカーにより結合される。次に、Ｎ１は、感染プロセスの一部として、細菌の共受容体への結合のため利用可能である。脱凝集アッセイにおいて温度を上昇させることは、ｇ３ｐのＮ２及びＮ１ドメインを「開合する」と予測される。

【0208】

高温（９０℃、１０分、図５を参照）でのＭ１３の不活性化は結合を抑止する一方、Ｍ１３−アミロイド結合アッセイにおけるインキュベーション温度の上昇は、結合に対してポジティブな作用を有する。図８Ａは、温度を１８℃から５８℃に上昇させることが、最大約５０℃（この温度ポイントで結合が減少し始める）のヒンジアンフォールディングＴ_Ｍまで次第に良好な結合となることを示す。この最適な結合温度は、４８．１℃である、ｇ３ｐにおけるＮ１−Ｎ２アンフォールディングの温度（いわゆる、融点、又はＴ_Ｍ）と一致する。５０℃対３７℃へのインキュベーション温度の上昇もまた、Ｍ１３のｆＡβ４２へのより急速な結合をもたらす。図８Ｂ。

【0209】

実施例５：ｇ３ｐはＭ１３−β−アミロイド相互作用に必要である
ｇ３ｐがＭ１３−β−アミロイド相互作用に必要であるかどうかを直接試験するために、ｇ３ｐを、Ａβ結合に対する再度折り畳まれたファージと比較したＡｒｇＣ（Ｍ１３Δｇ３ｐ）及びＭ１３Δｇ３ｐファージでのタンパク分解処理によりファージから取り除いた。バチルスのタンパク質分解酵素であるＡｒｇＣでの処理は、ｇ３ｐサブユニットをファージから選択的に取り除く。結果を図９Ａに示す。再度折り畳まれたＭ１３は、競合結合アッセイにおいて野生型Ｍ１３と低減したレベルにも関わらず依然競合する。しかしながら、１５倍のＭ１３Δｇ３ｐでさえ、仮に野生型Ｍ１３としても、不十分に競合した。この野生型Ｍ１３と競合しない能力は、Ｍ１３Δｇ３ｐファージにおける感染性の消失と一致する。図９Ｂ。ＡｒｇＣ処理はまた、脱凝集活性の消失を引き起こした。図９Ｃ。

【0210】

ｇ３ｐが、感染における役割と同じ方法で結合を仲介するなら、感染に重要であるＮ１及びＮ２ドメインは、結合に対してＭ１３と競合する。これを試験するため、組み換え可溶性Ｎ１Ｎ２（「ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）」；「コンストラクト３」）を調製し、競合アッセイにおいて試験した。図１０Ａ及び１０Ｂに示す通り、Ｍ１３は、ｆＡβ４２への結合に対して標識Ｍ１３と競合するが、Ｍ１３Δｇ３ｐは競合しない。対照的に、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はＭ１３と競合できず、このことは、ｇ３ｐのＮ１及びＮ２ドメインがβ−アミロイド結合に十分であることを示す。同様の結果を、競合アッセイの繰り返しにおいて得た。図１０Ｂ。

【0211】

実施例６：ｇ３ｐヒンジアンフォールディング変異はアミロイド結合を調節する
ｇ３ｐのＮ１とＮ２ドメイン間のヒンジを開合する能力に影響する変異は、これらの変異を生じるファージの、Ａβへの結合に対して野生型Ｍ１３と競合する能力に作用する。Ｅｃｋｅｒｔ ＆ Ｓｃｈｍｉｄ， ２００７は、この仮説を試験するために用いたいくつかの変種ファージを記載している。変異体「ＡＡＡ」（「３Ａ」としても知られる）は、線毛結合を損ない、Ｎ２ドメインの安定性を低減する。ＡＡＡは、ｇ３ｐにおける以下の変異：Ｗ１８１Ａ、Ｆ１９０Ａ、及びＦ１９４Ａを有する。ＩＩＨＹは、変異Ｔ１３Ｉ、Ｔ１０１Ｉ、Ｑ１２９Ｈ、及びＤ２０９Ｙを含有し、そしてそれはＮ２ドメインを安定化し、Ｔ_Ｍを増大する。

【0212】

結合競合を、Ｎ１及びＮ２ドメイン中のＭ１３ｇ３ｐと同一のアミノ酸配列を有するファージｆｄについて評価した（図２）；ＩＩＨＹはＭ１３、及びＡＡＡより高いヒンジＴｍを有する。ファージｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、５０℃１．５時間で予め活性化し、次に活性化及び非活性化Ｆｄ、ＡＡＡ、及びＩＩＨＹを、標識Ｍ１３と競合する能力について比較した。図１１は結果を示す。野生型ｆｄは、加熱により活性化したとき、良好な競合相手であった。対照的に、加熱は、より高いヒンジＴｍを有するＩＩＨＹに対する作用をほとんど有しない。Ｍ１３と比較して低減したＮ２ドメイン安定性を有するＡＡＡは、加熱事前処理あり又はなしで良好な競合相手であった。

【0213】

これらのデータは、Ｍ１３のβ−アミロイドとの相互作用が、Ｍ１３が細菌に感染するものと同様のメカニズムを介するものであるとの結論を支持する。第１に、これらは、疎水性相互作用がＭ１３−β−アミロイド相互作用に重要であることを示す。第２に、Ｍ１３結合及び脱凝集活性化の温度依存性は、Ｎ１−Ｎ２ヒンジアンフォールディングＴｍを反映する。第３に、ｇ３ｐの選択的タンパク質分解は、Ｍ１３−β−アミロイド相互作用を無効にする。

【0214】

実施例７：ｇ３ｐフラグメントはアミロイドに選択的かつ強力に結合するが、モノマーに結合しない
ｇ３ｐフラグメントがアミロイドに結合する能力を保持するかどうかを評価するために、Ｎ１及びＮ２を含むｇ３ｐフラグメントを調製し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、Ａβ原線維対Ａβモノマーを結合する能力について評価した。結果は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ原線維に優先的に結合し、Ａβモノマーに結合しないことを示す。４μＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を用いた表面プラズモン共鳴研究を図１３に報告し、そしてそれは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）結合のＫ_Ｄが約１６０ｎＭであることを示す。この高い親和性相互作用は、特異的結合プロセスが、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）とアミロイド線維との間で生じることを示す。

【0215】

更なるコンストラクトをＳＰＲにより評価した。以下の表は結果を概説する。

【表2】

【0216】

実施例８：ｇ３ｐフラグメントはＡβ４２線維を強力に脱凝集する
ｇ３ｐフラグメントがアミロイド線維を脱凝集するかどうかを試験するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を、予め形成させたｆＡβ４２原線維を脱凝集する能力について、ＴｈＴ蛍光アッセイにおいて試験した。結果は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がｆＡβ４２を強力に脱凝集することを示す。図１４Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がｆＡβ４２を用量に依存した方法で脱凝集するという、この実験の結果を示す。図１４Ｂは、約２０ｎＭであるＩＣ_５０を示す。

【0217】

別の実験において、Ａβ４２を、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）あり又はなし、濃度２μＭで７日間３７℃でインキュベーションし、Ａβ４２線維の強度を透過型電子顕微鏡により評価した。図１５Ａは、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）がＡβ４２線維を脱凝集するという、この実験の結果を示す。図１５Ｂは、これらの同一試料に対するＴｈＴアッセイの結果を示す。Ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）は、このＴｈＴアッセイにおいて予め形成させたＡβ４２線維を脱凝集した。

【0218】

実施例９：ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）はα−シヌクレイン及びＡβアセンブリーを阻害し、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃはアセンブリーを阻害し、Ａβの凝集を阻害する
ｇ３ｐが、α−シヌクレイン線維アセンブリーを阻害し得るかどうか、及び原子価（すなわち、ｇ３ｐのコピー数）が役割を果たすかどうかを決定するために、５量体ｇ３ｐ（５コピーのｇ３ｐ）及びモノマーｇ３ｐ（１コピーのｇ３ｐ）のα−シヌクレイン活性を阻害する能力を試験するアッセイを行った。結果は、ｇ３ｐがα−シヌクレイン線維アセンブリーを阻害し、５量体ｇ３ｐがこの活性でモノマーｇ３ｐより有効であることを示す。図１６を参照。

【0219】

ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（コンストラクト３）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）の、Ａβ４２のアセンブリーを阻害する能力も評価した。図３０及び図３１に示す通り、コンストラクト３及びコンストラクト６は、ｆＡβ４２のアセンブリーを用量に依存した方法で阻害する能力がある。図３７に示すとおり、コンストラクト３及びコンストラクト６は、ｆＡβ４２凝集を阻害する能力がある。

【0220】

実施例１０：ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合タンパク質はＡβに結合し、脱凝集する
ｇ３ｐ原子価がアミロイドへのｇ３ｐ結合の能力において役割を果たすかどうかを評価するために、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合」）について２価であるＩｇ融合タンパク質を作成し、Ａβ線維に結合する能力について５価のＭ１３と比較した。図１７に示す通り、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合は、Ｍ１３と同様の親和性かつｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）のみより強力にＡβに結合し、このことは、ｇ３ｐの原子価が重要であり得ることを示している。同様の結果を競合アッセイの繰り返しで得た。図１８。図１８において、四角形は、コンストラクト２（Ｍ１３）を表し；三角形はコンストラクト３（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２））を表し；上下逆の三角形はコンストラクト４（ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合）を表し；菱形はｒ−ＩｇＧ４Ｆｃネガティブコントロールを表す。

【0221】

原子価が脱凝集においても役割を果たすかどうかを評価するため、２価ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合（「コンストラクト４」）を、フィルタートラップアッセイにおいて５価のＭ１３と比較した。図１９。結果は、２価ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合と５価Ｍ１３の両方がβ−アミロイド線維を強力に脱凝集させることを示す。また、原子価が脱凝集の効力に重要であり得ることが示唆され、４０ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−Ｉｇ融合に類似したレベルで、１．７ｎＭ５価Ｍ１３の凝集体を低減する能力により示される。図１９。

【0222】

同様のアッセイにおいて、１×１０^１２／ｍｌ Ｍ１３（コンストラクト２）；８０ｎｍ及び８００ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト５）；及び８０ｎｍ及び８００ｎＭ ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）を、フィルタートラップアッセイにおいてＡβ４２線維を脱凝集させる能力についてアッセイした。コンストラクト２、５、及び６は、β−アミロイド線維を強力に脱凝集させる。図３３。

【0223】

実施例１１：テトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］タンパク質は、ｆＡβに結合し、脱凝集させる
アミロイドに結合し、脱凝集させるｇ３ｐの能力に対する原子価の役割を更に評価するため、ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）に結合したテトラマーストレプトアビジンを、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）をビオチン−Ｌｙｓ−ＮＴＡとＮｉＳＯ_４の存在下で合わせることにより調製した。ＭＷＣＯ ３ＫＤａメンブレンを用いて、過剰のリガンドを取り除いた。ストレプトアビジンを加え、過剰のｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ビオチンをＭＷＣＯ １００ ＫＤａメンブレンを用いて取り除いた。得られたｇ３ｐコンストラクト、ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、４つのｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）部分を有する。ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］を、結合アッセイにおいて、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）（「コンストラクト３」）と比較した。図２０。テトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）より強力にｆＡβに結合し、これは、原子価が結合の効力に重要であることを更に示す。図２０。しかしながら、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）でさえ治療上許容されるレベルでｆＡβに結合する。

【0224】

原子価が脱凝集においても役割を果たすかどうかを評価するために、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）を、フィルタートラップアッセイにおいてテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］と比較した。図２１。結果は、モノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）とテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］の両方がｆＡβ線維を強力に脱凝集させることを示す。また、原子価が脱凝集の効力に重要であることが示され、２．５μＭモノマーｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）によるＡβの低減した脱凝集と比較して、ｆＡβ凝集体最大２００ｎｇを無効にする３６０ｎＭテトラマーストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］の優れた能力により示される。例えば、図２１、列４に比較した列２。

【0225】

ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］によるＡβの脱凝集を、ＴＥＭにより評価した。ストレプトアビジン−［ビオチン−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）］は、インキュベーションの３日後、ｆＡβ４２を完全に脱凝集した。図２２。

【0226】

実施例１２：Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質はアルツハイマー病のマウスモデルにおいてＡβを有意に低減する
アルツハイマー病の研究のための周知のマウスモデル（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６） ２７４：９９−１０２； Ｄｕｙｃｋａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ （２００８） １１５：５−３８）を用いて、オスＴｇ２５７６マウスを５００日より長く加齢させ、Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合（７．８μｇ／注射でのコンストラクト５、及び８．２μｇ／注射でのコンストラクト６）又はネガティブコントロールとしての食塩水の２種の異なる調製物を海馬に両側性に注射（２μＬ／注射）し、７日目に屠殺した。脳組織を回収し、薄切し、抗アミロイドベータモノクローナル抗体（８２Ｅ１； ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅのカタログ番号ＭＢＳ４９０００５−ＩＪ１０３２３）を用いて、プラーク負荷定量について染色した。図２８に示す通り、両Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質は、食塩水で処置したマウスと比較して、海馬において測定したプラーク負荷を有意に低減した。図２９に示す通り、両Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質は、食塩水で処置したマウスと比較して、大脳皮質において測定したプラーク負荷を有意に低減した。

【0227】

実施例１３：Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質はＡβオリゴマーにより誘導される細胞毒性を阻害する
Ａβオリゴマーは、神経細胞において、ある種の毒性酵素の放出を引き起こす。酵素をアッセイして、化合物がＡβオリゴマーにより誘導される細胞毒性を阻害し得るかどうかを決定することができる。図３２は、Ｍ１３（コンストラクト２）及びｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（コンストラクト６）は、Ｎ２ａ細胞に対するオリゴマーにより誘導される毒性を阻害することを示す代表的なデータを示す。それ故、ｇ３ｐフラグメントは、Ａβオリゴマーにより誘導される細胞毒性の強力な阻害剤である。

【0228】

実施例１４：Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質はタウに結合し、脱凝集させる
ｇ３ｐフラグメントがタウに結合するかどうかを評価するために、Ｎ１及びＮ２を含むｇ３ｐフラグメント−Ｉｇ融合タンパク質を調製し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によりｆｔａｕを結合する能力について評価した。図３５は、ｒｓ−ｇ３ｐ（Ｎ１Ｎ２）−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ（コンストラクト４）がｆｔａｕに強力に結合することを示す１つの代表的ＳＰＲアッセイの結果を示す。

【0229】

ｇ３ｐフラグメントがタウを脱凝集させ得るかどうかを試験するために、Ｎ１及びＮ２を含むｇ３ｐフラグメント−Ｉｇ融合タンパク質を、予め形成したｆｔａｕを低下させる能力についてＴｈＴ蛍光アッセイにおいて試験した。結果は、Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質がｆｔａｕを強力に脱凝集させることを示す。図３６Ａ及び図３６Ｂを参照。

【0230】

実施例１５：Ｎ１Ｎ２−Ｉｇ融合タンパク質はプリオン病の細胞培養モデル（Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ）においてＰｒＰ^Ｓｃ蓄積、凝集及びＰｒＰ^Ｓｃ形成を阻害する
プリオン病は、正常の細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰ^ｃ）のタンパク質分解酵素抵抗性病理形態ＰｒＰ^Ｓｃへの変換により特徴付けられる。ＰｒＰ^Ｓｃは、タンパク質分解酵素抵抗性に基づきＰｒＰ^ｃと区別される：タンパク質分解酵素は、ＰｒＰ^Ｓｃを部分的に低減して、分子量１９〜２１ｋＤａの未グリコシル化形態を有するタンパク質分解酵素抵抗性Ｃ末端コアフラグメント（ＰｒＰｒｅｓ）を形成した。ＰｒＰ^Ｓｃの阻害、逆転、及び低減は、いくつかの神経変性疾患の処置への価値ある治療上のアプローチを構成する。

【0231】

Ｎ１及びＮ２を含むｇ３ｐフラグメント−Ｉｇ融合タンパク質（コンストラクト６）が、プリオン疾患のインビトロモデルにおける病理学的プリオン配座異性体（ＰｒＰ^Ｓｃ）の形成と干渉するかどうかを決定するため、及び脱凝集、又はコンストラクト６の存在下又は不存下でのＮ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞におけるＰｒＰの溶解性の変化を検証するために、細胞を、２４時間、１μｇ／ｍｌコンストラクト６又はＩｇＧの不存下又は存在下で培養し、溶解バッファー中に回収した。総タンパク質１００μｇを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｏｐｔｉｍａ ＴＬ超遠心機中、ＴＬＡ１００．１ローターにて、４℃で９０分間５５，０００ｒｐｍで超遠心した。可溶化ペレット、及び上清試料２５μｌを、抗体ＰｒＰ抗体６Ｄ１１ ｍＡｂでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び下流分析の対象にした。増大した界面活性剤不溶性は、ＰｒＰ^Ｓｃ又はＰｒＰ変異体によるタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）抵抗性の獲得に先行し、それ故、コンストラクト６のＰｒＰ溶解性を変える能力を評価した。コンストラクト６により処理した細胞は、ＩｇＧで処理したＮ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞と比較して、有意に低減した量の凝集／不溶性ＰｒＰを示した。図３８Ａ及び図３８Ｂを参照。

【0232】

図３８Ａ及び３８Ｂについて、Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞を、既に記載された（Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． （２００６） ２３：２６３５−２６４７）通り作成した。簡単に言うと、マウス適応２２Ｌプリオン株に感染した末期のＣＤ−１マウスの脳を、冷リン酸緩衝食塩水及び５％デキストロース中、無菌条件下での超音波処理（１０％波長／容量）によりホモジェナイゼーションした。注入のため、脳ホモジェネートを、更に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中２％まで希釈し、サブコンフルエントの６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ａｃｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）に１０−ｃｍ^２ウェル当たり１ｍＬで加えた。５時間後、通常のＭＥＭ１ｍＬを加え、細胞を感染脳ホモジェネートの存在下で更に１２時間インキュベーションした。細胞を洗浄し、標準ＭＥＭ成長培地を加えた。細胞をコンフルエントまで成長させ、１：２希釈に分け、２５−ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。１つのフラスコにおいて成長させた細胞を、４日毎に１：２に分けて、継代し、一方別のフラスコで成長した細胞を回収し、ホモジェネートして、ＰｒＰ^Ｓｃのレベルをモニターした。従前の研究に基づき、摂取により誘導したＰｒＰ^Ｓｃの存在を１代及び２代のみで検出し、４代（Ｐ４）細胞を、全ての続く研究に用いた。細胞を、（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、１ｍＭ Ｎａ_３Ｖ０_４、１ｍＭ ＮａＦ、２．５ｍＭ Ｎａ_４Ｐ_２Ｏ_７、１ｍＭ β−グリセロリン酸、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭ ペプスタチンＡ、ＰＫ切断用１ｍＭ ＰＭＳＦ又はなし）からなるホモジェナイゼーションバッファー中、５分間、４℃で溶解し、可溶性物質を１０，０００ｇ、１０分間、４℃での遠心分離により取り除いた。細胞の分画のため、タンパク質１００μｇを、５５，０００ｒｐｍで９０分間遠心し、その後、ペレットを開始容量に再構成させた。２０％両ペレット及び上清を分離し、生化学的に特徴付けた。

【0233】

コンストラクト６が、脱凝集又は物理化学的特性を変化させることにより、ＰｒＰ^Ｓｃの増殖を容量依存的に変更するかどうかに取り組むために、Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ細胞を、２４時間、増加濃度のコンストラクト６又はＩｇＧの不存下又は存在下で培養し、溶解バッファー中に回収した。ＰＫ処理あり又はなしの溶解細胞アリコートを、抗ＰｒＰ抗体６Ｄ１１及び６Ｈ４ｍＡｂでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び下流分析の対象にした。対照ＩｇＧ及びコンストラクト６由来の生化学的に溶解したＰＫ切断及び未切断溶解物におけるＰｒＰ免疫反応性を評価した。処理は、Ｎ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ＋１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．３３３μｇ／ｍｌ、０．１１１μｇ／ｍｌ、０．０３７μｇ／ｍｌ、０．０１２μｇ／ｍｌ、及び０．００４μｇ／ｍｌコンストラクト６、又はＮ２ａ２２Ｌ^Ｓｃ＋１μｇ／ｍｌ ｍＩｇＧを含む。

【0234】

結果は、１μｇ／ｍｌ ＩｇＧと比較して、コンストラクト６の存在下でのＰｒＰ^Ｓｃの有意な用量依存性低減を示し、これは、５０％未満のＰｒＰ^Ｓｃが０．０８μｇ／ｍｌコンストラクト６の存在下で生じることを示す。図３９Ａ及び図３９Ｂを参照。実験を繰り返し、これらの結果を確認した。

【0235】

ＰｒＰのタンパク質分解酵素Ｋ（ＰＫ）抵抗性配座異性体を評価するために、従前の方法（Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ （２００４） ８４：４５４−４６３， Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．， ２００６）に従い、溶解細胞アリコートをＰＫ（ｌμｇ／μｇ）１：５０希釈、３７℃、３０分間処理した。インキュベーション後、ＰＭＳＦを４ｍｍに加えることにより、切断を停止させた。

【0236】

タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。試料を、試料バッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ＳＤＳ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、５０％グリセロール、０．０２％クーマシーブルーＧ２５０）中に希釈し、５分間煮沸した。処理した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより減圧下で分離した。

【0237】

抗ＰｒＰモノクローナル抗体６Ｄ１１（Ｓａｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ． （２００９） ３４（２）： ２６７−２７８を参照）及び６Ｈ４（Ｃｏｒｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２００８） ３３７：１０６−１２０を参照）、並びに抗アクチンを用いて、試料を特徴付けた。抗原−抗体複合体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて検出し、ＥＣＬシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて、製造元の指示に従い視覚化した。タンパク質バンドの定量を、フィルム（Ｉｍａｇｅ Ｊ、ＮＩＨ）の濃度測定分析により行った

【0238】

まとめると、図３８Ａ及び３８Ｂ、及び図３９Ａ及び３９Ｂに示す結果は、ｇ３ｐフラグメントＩｇ融合タンパク質の、インビトロでのＰｒＰ^Ｓｃ形成を直接阻害する能力を示す。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図37D】

【図38A】

【図38B】

【図39A】

【図39B】

【配列表】

2015505823000001.app

【国際調査報告】