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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2015-512247(P2015-512247A)
(43)【公表日】2015年4月27日
(54)【発明の名称】光線力学的療法に使用するための新規光免疫複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20150331BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20150331BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20150331BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20150331BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20150331BHJP
A61K 41/00 20060101ALI20150331BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20150331BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20150331BHJP
A61K 47/48 20060101ALI20150331BHJP
A61K 47/42 20060101ALI20150331BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C07K16/28
C12P21/08
C12P21/02 C
C07K19/00
A61K41/00
A61P35/00
A61K39/395 C
A61K47/48
A61K47/42
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
【全頁数】24
(21)【出願番号】特願2015-500780(P2015-500780)
(86)(22)【出願日】2012年3月21日
(85)【翻訳文提出日】2014年9月18日
(86)【国際出願番号】EP2012055022
(87)【国際公開番号】WO2013139391
(87)【国際公開日】20130926
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC,VN
(71)【出願人】
【識別番号】500253069
【氏名又は名称】フラウンホーファ−ゲゼルシャフト ツァー フォルデルング デア アンゲバンデン フォルシュンク エー． ファオ．
【氏名又は名称原語表記】ＦＲＡＵＮＨＯＦＥＲ−ＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ ＺＵＲ ＦＯＲＤＥＲＵＮＧ ＤＥＲ ＡＮＧＥＷＡＮＤＴＥＮ ＦＯＲＳＣＨＵＮＧ Ｅ． Ｖ．
(71)【出願人】
【識別番号】514237828
【氏名又は名称】ライニッシュ−ヴェストファリシェ テクニシェ ホッホシューレ アーヘン
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(74)【代理人】
【識別番号】100085279
【弁理士】
【氏名又は名称】西元 勝一
(72)【発明者】
【氏名】バース ステファン
(72)【発明者】
【氏名】ツール メーメット ケマル
(72)【発明者】
【氏名】ハサイン アハマド
【テーマコード（参考）】
4B024
4B064
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B024AA01
4B024BA44
4B024CA01
4B024CA11
4B024DA03
4B024EA04
4B024GA11
4B024HA01
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA03
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA11
4C084NA05
4C084ZB262
4C085AA21
4C085AA24
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045BA41
4H045BA70
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群より選択され、ＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合したタンパク質と共有結合した光増感剤を含み、該光増感剤が修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を介して該結合タンパク質と結合している化合物。【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群より選択され、ＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合したタンパク質と共有結合した光増感剤を含み、
該光増感剤が修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を介して該結合タンパク質と結合している化合物。
該光増感剤が修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を介して該結合タンパク質と結合している化合物。
【請求項2】
内部移行性且つ疾患特異的な細胞表面受容体を特異的に標的とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
前記チロシンキナーゼ成長因子受容体に結合するタンパク質がｓｃＦｖ抗体断片、特に配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされる配列番号１のｓｃＦｖ抗体断片である、請求項１または請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
配列番号４のポリヌクレオチド配列によりコードされる配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜請求項３に記載の化合物。
【請求項5】
前記光増感剤がＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの活性部位と結合している、請求項１〜請求項４に記載の化合物。
【請求項6】
前記光増感剤がポルフィリン、クロロフィル、および色素からなる群から選択される、請求項１〜請求項４に記載の化合物。
【請求項7】
抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群から選択される結合タンパク質を含み、該結合タンパク質が、ＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合し、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）と称される修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質と共有結合している化合物。
【請求項8】
前記結合タンパク質がｓｃＦｖ抗体断片、特に配列番号１および／または配列番号３のｓｃＦＶ抗体断片である、請求項７に記載の化合物。
【請求項9】
特に配列番号２および／または配列番号４を含む、請求項７に記載の化合物をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項10】
請求項１に記載の化合物をコードする、配列番号５のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド。
【請求項11】
Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を、抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群から選択される結合タンパク質と融合するステップを含み、該結合タンパク質が、ＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合する、請求項７に記載の化合物を製造する方法。
【請求項12】
真核生物発現ベクターｐＭＳ−ＳＮＡＰのＳｉｆＩおよびＮｏｔＩによる消化部位にｓｃＦｖ−４２５配列が挿入されて、Ｎ末端結合リガンド（ｓｃＦｖ−４２５）およびＣ末端ＳＮＡＰタグ配列を与える、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰ融合タンパク質が、ヒト胎児腎臓細胞株、特にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）で発現する、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰ融合タンパク質がアフィニティークロマトグラフィー、特にＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより無細胞上清から精製される、請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
請求項７の化合物と結合した、以下の式のポルフィリン誘導体。
【化1】
【請求項16】
クロリンｅ６などのポルフィリン光増感剤のカルボキシ基の少なくとも一部を、活性化エステルへと、またはカップリング剤により、反応させ、続いてＯ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、またはコエンザイムＡ（ＣｏＡ）と反応させる、請求項１５に記載の化合物の製造方法。
【請求項17】
Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、またはコエンザイムＡ（ＣｏＡ）が、ＰＥＧ−２４−ＮＨ２などのリンカー分子と結合しており、および／または、前記活性化エステルが、ＮＨＳなどのスクシンイミドから形成されるか、または前記カップリング剤がＥＤＣ、ＥＤＡＣ、およびＤＣＣなどのカルボジイミドからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
請求項１〜請求項８の少なくとも１項に記載の化合物と、光免疫療法と関連した薬学的効果を改善または可能にする薬学的に許容可能なアジュバントと、を含む医薬。
【請求項19】
光免疫療法により癌を治療するための、請求項１〜請求項８の少なくとも１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、癌治療に対する有望で低侵襲な方法である。改良された光増感剤および臨床応用プロトコルの導入に続き、ＦＤＡに認可されたいくつかのＰＤＴ薬が利用可能となり、種々の前臨床段階および臨床開発段階にあるものもある１。光感作性薬剤は、無害な光により活性化された場合、細胞障害性を示すことにより直接的に、または有毒なフリーラジカルもしくは活性酸素種（ＲＯＳ）のｉｎ ｓｉｔｕでの産生を開始することにより間接的に、その効果を発揮する。これらの処理により細胞に損傷が生じ、最終的にアポトーシスまたはネクローシスによる細胞死が誘導される２。細胞の損傷部位は、光増感剤の種類、インキュベーション期間、および送達方法に依存している。疎水性光増感剤は細胞膜を損傷する傾向があるが、カチオン性光増感剤はミトコンドリアなどの膜小胞内に蓄積して局所的損傷を引き起こす３。
【0002】
ＰＤＴにおける最大の課題の一つは、標的特異性がないことである。光増感剤は、光による活性化の後、癌組織だけでなく正常組織にも損傷を与え、これにより長期の皮膚光過敏がもたらされる場合がある４。ＰＤＴの特異性を高めるため、光増感剤を癌特異的なモノクローナル抗体または一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と結合して、光増感剤を直接的に癌組織に送達するいわゆる光免疫複合体が得られている。この方法は、光免疫療法（ＰＩＴ）として知られている５。抗体−光増感剤複合体の最適な理論混合比での産生を保証する確実な方法が存在しないため、標準的なカップリング反応は光増感剤と抗体の結合には適していない６。さらに、光増感剤の化学的特性（例えば、疎水性、ならびに荷電基の数および位置）により、抗体の薬物動態特性および生体内分布が変化する場合があり、最終的に非特異的結合および内部移行反応が引き起こされる。ランダム結合によって光増感剤励起状態の自己消光が引き起こされて光線力学的活性が減少する場合もある５。したがって、これらの制限を克服するためには、より制御された結合反応が必要とされる。
【0003】
ＰＤＴの主な欠点の一つは、活性化光増感剤の非選択的効果であり、これにより癌細胞だけでなく正常細胞にも損傷が与えられる傾向がある。抗体を用いた標的療法は癌治療に大きな変化をもたらし、癌細胞抗原に結合するいくつかの抗体が画期的新薬となっている。治療用抗体の有効性は、追加的なエフェクター分子（例えば、放射性核種、薬剤、または毒素）との共有結合により改善されることがあり７、これにより選択的送達が実現され、従来低分子薬剤に付随していた全身毒性が低減されるはずである８。同様の原理は光増感剤にも適用され得る。エフェクター分子は一般に、システイン残基の還元スルフヒドリル基またはリジン側鎖中のアミノ基のいずれかを用いて抗体に結合される。しかし、いずれの方法によっても、様々な部位にエフェクターが結合した複合体化抗体の混合物を含む不均一な産物が生じ、各抗体に結合したエフェクターの数が変動するため、様々なモル比、ならびに全く異なる薬物動態、有効性、および安全性プロファイルがもたらされる。
【0004】
Ｈａｍｂｌｅｔｔら９は、不均一な抗体−薬剤複合体の毒性、薬物動態特性、および治療有効性を、２分子、４分子、または８分子のモノメチル−オーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を複合体化した分子を含む、３つの抗体画分に精製することにより検討した。ＭＭＡＥ基を８個有する画分は、他の画分と比較して耐性に乏しく素早く除去され、有効性が最も低かった。このことから、抗体−薬剤複合体に対する主要な設計パラメータは、抗体に結合した薬剤分子の数であることが示唆される。しかし、同じ数の薬剤分子を有する精製抗体であっても、多数の異なった結合部位により、複雑な混合物を構成する。例えば、典型的な抗体には約４０個のリジン残基が存在するため、１００万種類以上の異なった複合体化抗体が生じる可能性がある。同様に、１〜８個のシステイン残基が存在し、典型的に約１００の異なった複合体化変種が生じる。抗体−薬剤複合体の各バージョンは、典型的には固有の予測不可能な薬物動態プロファイルを示す９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
癌細胞は、無害な光を当てた場合に毒性作用を誘導する光感作性薬剤により死滅し得るが、これにより周囲の正常細胞にも深刻な損傷が与えられる。光線力学的療法の特異性は、光感作性薬剤を癌関連細胞表面抗原と特異的に結合する抗体および抗体断片と結合させることにより増大させることが可能である。しかし、標準的な結合反応では不均一な産物が産生され、その標的特異性と分光学的特性が損なわれることがある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明では、ＳＮＡＰタグ融合体の使用を改良された結合方法として調べるためのモデルとして、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）と結合する抗体断片（ｓｃＦｖ−４２５）を用いた。ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質により、Ｏ（６）−ベンジルグアニン修飾クロリンｅ６などの光増感剤の特異的結合が可能となり、ＥＧＦＲ＋癌細胞に特異的に送達されて顕著な癌細胞特異的細胞毒性をもたらす、均一な産物が生じた。光線力学的療法の発展に対する本発明の結果の影響について説明する。
【0007】
本発明は、抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群から選択される結合構造と共有結合した光増感剤を含み、該結合構造がＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合し、該光増感剤が修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質であるＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を介して内部移行性を有する受容体に結合するタンパク質（internalizing receptor binding protein）と結合している化合物を提供する。
【0008】
本発明のある態様では、上皮成長因子受容体結合タンパク質はｓｃＦＶ抗体断片、特に配列番号２のポリヌクレオチド配列によりコードされる配列番号１のｓｃＦＶ抗体断片である。
【0009】
本発明の別の態様では、本発明の化合物は、配列番号４のポリヌクレオチド配列によりコードされる配列番号３のアミノ酸を含むか、またはこれを有する。
【0010】
本発明の化合物の別の態様では、光増感剤は、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの活性部位と結合している。
【0011】
本発明の化合物において、光増感剤は、ポルフィリン、クロロフィル、および光増感能を有する色素からなる群から選択される。
【0012】
光増感剤を欠く化合物もまた本発明の対象である。該化合物は、抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群から選択される結合タンパク質を含み、該結合タンパク質がＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合し、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）と称される修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質と共有結合している。
【0013】
具体的には、結合タンパク質はｓｃＦｖ抗体断片、特に配列番号１および／または配列番号３のｓｃＦＶ抗体断片である。この化合物は、配列番号２および／または配列番号４の配列を有するポリヌクレオチドによりコードされることがある。特定の態様ではＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体と結合する。
【0014】
特定の態様の化合物は、配列番号５のヌクレオチド配列のポリヌクレオチドにコードされる。
【0015】
本発明の他の対象は、Ｏ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）を、抗体またはその誘導体もしくはその断片、ｓｃＦｖなどの合成ペプチド、ミモトープからなる群から選択される結合タンパク質と融合するステップを含み、該結合タンパク質がＣＤ抗原、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、ホルモン受容体、成長因子受容体、特にＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体、と結合する、本発明の化合物の製造方法である。具体的には、ｓｃＦｖ−４２５のＤＮＡ配列を、Ｎ末端結合リガンド（ｓｃＦｖ−４２５）およびＣ末端ＳＮＡＰタグ配列を与える、真核生物発現ベクターｐＭＳ−ＳＮＡＰのＳｉｆＩおよびＮｏｔＩによる消化部位に挿入する。
【0016】
具体的には、Ｈｉｓ６タグもまたタンパク質に融合される。融合タンパク質はヒト細胞、特にＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）などの胎児腎臓細胞株で発現させて、例えばＮｉ−ＮＴＡ修飾樹脂などのタグに対する親和性樹脂を用いて精製することが可能である。
【0017】
本発明の他の対象は、以下の式のポルフィリン誘導体である。
【0018】
【化1】
クロリンｅ６（Ｃ３４Ｈ３６Ｎ４Ｏ６）
【0019】
ここで、クロリンｅ６などのポルフィリン光増感剤のカルボキシ基の少なくとも一部は、活性化エステルに、またはカップリング剤により、反応し、続いてＯ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、またはコエンザイムＡ（ＣｏＡ）と反応する。
【0020】
本発明の方法において、Ｏ６−ベンジルグアニン、Ｏ２−ベンジルシトシン、またはコエンザイムＡ（ＣｏＡ）が、ＰＥＧ−２４−ＮＨ２などのリンカー分子と結合し、および／または、活性化エステルがＮＨＳなどのスクシンイミドにより、もしくはＥＤＣ、ＥＤＡＣ、およびＤＣＣなどのカルボジイミドからなる群から選択されるカップリング剤により形成される。
【0021】
本発明の他の対象はまた、本発明の化合物および光免疫療法と関連した薬学的効果を改善または可能にする薬学的に許容可能なアジュバントを含む医薬である。
【0022】
本発明はまた、光免疫療法により癌を治療するための本発明の化合物の使用を提供する。
【0023】
当業者は、本明細書の内容を超える新規事項を導入することなく、用語「〜を含む」が「〜からなる」と置換可能であることを理解している。
【0024】
以下に本発明の化合物の効果を、具体例により実証しより詳細に説明する。チロシンキナーゼ成長因子受容体のＥｒｂＢファミリーの４つのメンバーの１つである上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ１、ＨＥＲ１）は、約３０％の上皮癌において過剰発現しており、そのため癌免疫療法の魅力的な標的となっている１０。組み換え抗ＥＧＦＲ抗体断片ｓｃＦｖ−４２５は、ＥＧＦＲと癌細胞表面上で結合し効率的に受容体内部移行（receptor internalization）を誘導する１１。ｓｃＦｖ−４２５は、ＰＩＴの特異性および有効性を改善するための新しい複合体化方法の開発のためのモデルとして使用される。これらの目的を達成するため、当初、光学活性分子で抗体を部位特的に標識するために開発されたＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴｍ）と呼ばれる２０ｋＤの修飾ヒトＤＮＡ修復タンパク質に基づく、ＳＮＡＰタグ技術が用いられてきた１１。ＳＮＡＰタグにより、受容基であるＯ（６）−ベンジルグアニン（ＢＧ）で修飾された任意の基質に対する効率的な共有結合が可能となる。ＳＮＡＰタグは、求核置換反応により活性部位に置換ベンジル基を転移して遊離グアニンを放出することにより、パラ置換されたＢＧ誘導体と反応する１１。
【0025】
本発明によれば、ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を設計および合成した。ＢＧ修飾クロリンｅ６（Ｃｅ６）光増感剤をＥＧＦＲ＋癌細胞に送達した。コンストラクトには、光増感剤とタンパク質の距離を増大するためのリンカー領域および２４個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖も含まれる。ＢＧ修飾Ｃｅ６を、抗体の結合活性および内部移行活性に有害な影響を及ぼすことなく、特異的かつ共有結合的にｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質と結合した。Ｃｅ６を４系統のＥＧＦＲ＋癌細胞株（Ａ４３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＳｉＨａ）に特異的に送達し、顕著な癌細胞特異的細胞毒性がもたらされた。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】ＳＮＡＰタグ融合タンパク質のコンストラクト、発現、および結合。（ａ）組み換えＳＮＡＰタグ融合タンパク質のためのバイシストロニック真核生物発現カセットの模式図。ｐＭＳ−ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰベクターは、ＣＭＶプロモーターの転写制御下に結合リガンド（ｓｃＦＶ−４２５）、およびインフレームで連結されたＳＮＡＰタグをコードする。免疫グロブリンκリーダー配列（Ｉｇ−κ−Ｌ）によりタンパク質の分泌が容易になり、ＴＧＡ終止コドンがＣ末端のＨｉｓ６タグの直下に位置している。コントロールベクターのための発現カセットは、ＰＭＳ−ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰと同様であるが、結合リガンドとしてｓｃＦＶ−４２５の代わりにｓｃＦＶ−Ｋｉ４を含む。（ｂ）ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰタンパク質の精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にクーマシーブリリアントブルーで染色した。（ｃ）ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰをＢＧ−Ｖｉｓｔａ ｇｒｅｅｎとインキュベートし、ＵＶ光でタンパク質を可視化した。Ｍ：タンパク質マーカー、１：２５０ｍＭイミダゾールで溶出した３μｌのｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ、２：２５０ｍＭイミダゾールで溶出した１．５μｌのｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ、３：４０ｍＭイミダゾールで溶出した１０μｌのｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ、４：１０ｍＭイミダゾールで溶出したタンパク質、５：通過画分、６：ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上清。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰおよびｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰの結合解析は、（ｄ）ＥＧＦＲ＋Ａ４３１細胞および（ｅ）ＥＧＦＲ−Ｌ５４０細胞を用いて、フローサイトメトリーにより評価した。灰色で塗りつぶされた曲線は未処理細胞を表す。細胞を０．５μｇ／ｍｌの精製融合タンパク質であるｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ（薄灰色の曲線）およびＫｉ４−ＳＮＡＰ（黒色の曲線）とインキュベートした。二次抗体として、Ｐｅｎｔａ Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８複合体（１／５００希釈）（キアゲン社）を用いた。抗−Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８検出抗体の非特異的染色を排除するために、Ｈｉｓタグ融合タンパク質を除いたものをコントロールとした（黒い点線の曲線）。
【図2】ベンジルグアニン（ＢＧ）による修飾の前後におけるＣｅ６光増感剤の質量分析による解析。（ａ）Ｃｅ６、ＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２、およびＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６のＥＳＩ質量スペクトル。一番上の図はＣｅ６（５９７．２１５Ｄａ）を表し、真ん中の図はＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２（１３９８．７６１Ｄａ）を表し、一番下の図はＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６（１９７９．００４Ｄａ）を表す。（ｂ）ＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６のｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰとの結合。Ｍ：タンパク質マーカー、１：１．５倍モル過剰量のＢＧ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎとインキュベートしたｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ、２：３倍モル過剰過剰量のブロモテニルプテリジン（ＢＴＰ）で阻害し、ＢＧ−Ｃｅ６と２時間インキュベートし、最後にＢＧ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎと混合したｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ、３：１．５倍モル過剰量のＢＧ−Ｃｅ６と２時間インキュベートした後、１．５倍モル過剰量のＢＧ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎとインキュベートしたｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ。結合したタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで可視化した。（ｃ）異なった色素のスペクトルをＭａｅｓｔｒｏソフトウエアを用いて分解し、相当するゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【図3】ＥＧＦＲ＋細胞を特異的に認識するｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎおよびｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の結合活性。フローサイトメトリー分析は、４×１０５個の細胞を各融合タンパク質とともにＰＢＳ中、３７℃で２０分間インキュベーションした後に行った。（ａ）ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎ（薄灰色の曲線）を、Ａ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳｉＨａ細胞、Ｌ５４０細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について試験した（灰色で塗りつぶされた曲線）。コントロールとして、ｓｃＦｖ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰをＢＧ−ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎで標識し（黒色の曲線）、その結合活性をＡ４３１細胞、Ｌ５４０細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について試験した（灰色で塗りつぶされた曲線）。（ｂ）ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の結合能を、Ａ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＳｉＨａ細胞、Ｌ５４０細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について試験した（灰色で塗りつぶされた曲線）。コントロールとして、ＢＧ−Ｃｅ６で標識したｓｃＦｖ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ（黒色の曲線）を、Ａ４３１細胞、Ｌ５４０細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について試験した（灰色で塗りつぶされた曲線）。
【図4】共焦点顕微鏡で分析した融合タンパク質の内部移行。０．５μｇのｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６と（ａ）４℃で３０分間、または（ｂ）３７℃で６０分間インキュベートした、ＥＧＦＲ＋細胞株であるＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、およびＳｉＨａ細胞、ならびにＥＧＦＲ−細胞株であるＬ５４０細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞について、共焦点画像を得た。（１）Ｃｅ６蛍光シグナル、（２）透過光、（３）蛍光シグナルと透過光のオーバーレイ。
【図5】光線力学的療法の効果の評価。細胞増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイは、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６を用いて行った。ｓｃＦＶ−４２５−ＢＧ−Ｃｅ６の細胞毒性は、Ａ４３１細胞株（■）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株（▲）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（◆）、ＳｉＨａ細胞株（●）、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞株（▼）に対して、（ａ）照射細胞または（ｂ）未照射細胞についてのＸＴＴ解析を用いて測定した。ｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６のＡ４３１細胞株（ｘ）に対する細胞毒性をコントロールとして試験した。同じ細胞を種々の濃度のＢＧ−Ｃｅ６で処置し、細胞生存率を（ｃ）光活性化して分析、および（ｄ）光活性化せずに分析した。（ｅ）アポトーシスは、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅ−３／７ Ａｓｓａｙを、５０ｎＭのＢＧ−Ｃｅ６、２００ｎＭのｓｃＦＶ−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６、および２００ｎＭのｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６で用いて評価した。（ｆ）ジクロロフルオレセイン誘導体であるカルボキシ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを用いて検出した、光増感されたＡ４３１細胞の照射による活性酸素種の発生。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本発明を、光増感剤としてＣｅ６を用い、結合としてＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ成長因子受容体を用いて、より詳細にさらに例示的に説明する。
【0028】
光線力学的療法（ＰＤＴ）は、非毒性光増感剤および無害な可視光を酸素と組み合わせて用いて、悪性細胞をアポトーシスおよび／またはネクローシスにより死滅させる細胞毒性活性酸素種を産生させる、低侵襲な治療である１２。多くの異なった光増感剤が開発されてきたが、Ｃｅ６はＰＤＴ研究において詳細に評価されてきており物理的特性および化学的特性において有利であるため、モデルとして選択されてきた。Ｃｅ６の吸収極大は、光量子効率と細胞透過との良好なバランスが得られる６６４ｎｍであり１３、カルボキシ基が存在することによりさらに機能付与が可能である５。
【0029】
本発明のＳＮＡＰタグ技術により抗体上に固有の結合部位が提供され、均一な複合体製剤の産生が可能になる。ＥＧＦＲと特異的に結合するｓｃＦＶ抗体のコード配列がｈＡＧＴカセットと遺伝子融合されている本発明のコンストラクトは、抗体にＳＮＡＰタグを与えることにより、ＢＧ修飾基質、とくにＣｅ６との部位特異的結合を可能にする。この結合方法は、抗体がＳＮＡＰタグを有し基質がＢＧ基で修飾されている限り、任意の抗体と光増感剤の組み合わせに適用可能である。
【0030】
結合反応は効率的であり、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６およびｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の均一サンプルの調製が可能となる。癌細胞を特異的に死滅させる能力についてこれらの調製物を試験した。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６が、上皮癌、乳癌、および頸部癌を示す４系統のヒト癌細胞株（Ａ４３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、およびＳｉＨａ）において、光照射後にＥＧＦＲ＋細胞を選択的に死滅させることが分かった。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の光毒性は、ＥＧＦＲおよび光の存在に依存しており、受容体を最も多く発現する（１〜１．３×１０６個の受容体／細胞）Ａ４３１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞において最も顕著であった１４、１５。他の細胞株はより少ないＥＧＦＲを発現し（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において１．３×１０５個の受容体／細胞、およびＳｉＨａ細胞において２×１０４〜２×１０５個の受容体／細胞）１５、１６、これに付随して、融合タンパク質が治療的に無効果であるポイントまでではないが、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の毒性は減少した。このことは、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６が、発現レベルの最も高いＥＧＦＲ＋細胞のみならず、広い範囲のＥＧＦＲ＋細胞を標的にすることができることを意味する。ＥＧＦＲ−細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）がｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６に暴露された場合には、毒性は観察されなかった。
【0031】
ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰは注射後にマウス腎臓に直接蓄積し、次に膀胱で検出されることが以前に示されており、腎臓濾過によるクリアランスが示唆される１０。迅速なクリアランスにもかかわらず、癌細胞におけるｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰの蓄積および滞留は、注射１０時間後に非常に高い癌細胞対バックグラウンド比をもたらすのに明らかに十分である。
【0032】
ｓｃＦＶ／ＳＮＡＰタグ融合タンパク質の発現、精製、および機能分析ＥＧＦＲ特異的ｓｃＦＶ−４２５抗体断片１０、および異なった抗原（ＣＤ３０）と結合するコントロール断片（ｓｃＦＶ−Ｋｉ４）１７をコードする配列をｐＭＳ−ＳＮＡＰバイシストロニックベクターに導入して、（図１ａ）に示すように完全なｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰカセットおよびｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰカセットを作製した。これらのコンストラクトをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質導入により導入して、安定的に形質転換された細胞をゼオシン選択および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）活性のモニタリングにより同定した。融合タンパク質を（Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを用いた）アフィニティークロマトグラフィーにより培養上清から分離して最終純度約９０％とし、最終収量は上清中のタンパク質が１８ｍｇ／Ｌであった（図１ｂ）。
【0033】
ＳＮＡＰタグの活性は、各融合タンパク質において、未処理の培養上清、通過画分、およびクロマトグラフィーステップからの溶出液を、ＢＧ修飾ＶｉｓｔａＧｒｅｅｎと混合することにより確認した（図１ｃ）。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰタンパク質の結合活性は、ＥＧＦＲ発現標的細胞株（Ａ４３１）を１系統と、この抗原を欠くがＣＤ３０を発現するコントロール細胞株（Ｌ５４０）と、を１系統用いたフローサイトメトリーにより確認した。結合は、二次抗体である抗Ｈｉｓ５ Ａｌｅｘａ４８８抗体を用いて検出した。フローサイトメトリーのデータにより、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰはＥＧＦＲ＋標的細胞に特異的に迅速かつ効果的に結合する（図１ｄ）が、ｓｃＦＶ−Ｋｉ４／ＳＮＡＰはＣＤ３０＋Ｌ５４０細胞にのみ結合する（図１ｅ）ことが確認された。
【0034】
光増感剤クロリンｅ６のベンジルグアニンによる修飾光増感剤クロリンｅ６（Ｃｅ６）を、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ヒドロキシスルホスクシンイミドのナトリウム塩（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）、およびＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２リンカーを用いて修飾することに成功した。Ｃｅ６のカルボキシ基をＢＧ基に修飾し、反応効率をＨＰＬＣにより決定した（データ示さず）。高純度のＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６は質量分析により確認した。Ｃｅ６、ＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２、およびＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６の正確な質量は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＱＴＯＦＩＩ質量分析器で検出し、連結されたＣｅ６とＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２について計算された理論質量と同じ質量を精製ＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６が有することを確認した（図２ａ）。
【0035】
ＢＧ修飾蛍光色素分子団およびＣｅ６によるタンパク質標識化ＳＮＡＰタグの機能性をＢＧ修飾蛍光色素とカップリングすることにより調査し、室温で２時間インキュベーション後の標識化効率が８５〜９０％であることが明らかになった（データ示さず）。反応は、ＢＧ修飾Ｃｅ６を用いて繰り返した。光増感剤は融合タンパク質中の活性ＳＮＡＰタグとのみ反応し、反応は、１．５倍モル過剰量のＢＧ−Ｖｉｓｔａ Ｇｒｅｅｎとの後インキュベーションによって示されるように、ブロモテニルプテリジン（ＢＴＰ）で不可逆的に阻害することができた。ＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏイメージングシステムを用いた分析では、予め阻害された融合タンパク質と関連した蛍光は示されなかった（図２ｂ、ｃ）。
【0036】
フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡標識化ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ融合タンパク質の活性を決定するために、ＢＧ−Ｖｉｓｔａ ＧｒｅｅｎまたはＢＧ−Ｃｅ６のいずれかで標識化したタンパク質を用いてフローサイトメトリー分析を行った。全ての標識化タンパク質は、氷上で３０分間のインキュベーション後、相当する標的細胞株（Ａ４３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＳｉＨａ）上で強い蛍光シグナルを示したが、コントロール細胞（Ｌ５４０およびＣＨＯ−Ｋ１）上では示さなかった。予想通り、標識化ｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰはＬ５４０上で強い蛍光シグナルを示したが、Ａ４３１細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞上では示さなかった（図３）。
【0037】
共焦点顕微鏡では、ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６とインキュベートしたＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、およびＳｉＨａ細胞上で特異的で均一な強い膜染色が見られた（図４ａ）。標識化融合タンパク質は、３７℃で３０分間インキュベートした後のＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、およびＳｉＨａ細胞に、特異的に且つ効率的に吸収されたが、４℃でのインキュベーションでは吸収されなかった（図４ｂ）。一方、ＥＧＦＲ−細胞株であるＬ５４０およびＣＨＯ−Ｋ１をｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６と同じ条件下でインキュベートした場合、シグナルは検出されなかった（図４ａ、ｂ）。
【0038】
ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の光細胞毒性ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６および複合体化していないＢＧ−Ｃｅ６の濃度依存的細胞毒性効果を、４系統のＥＧＦＲ＋細胞株およびネガティブコントロールとしてＣＨＯ−Ｋ１を用いて、ＸＴＴに基づいた比色細胞増殖アッセイにより評価した。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６で処理したＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞、およびＳｉＨａ細胞の生存率は、光活性化に続く２４時間のインキュベーション後、濃度依存的に著しく減少した。ＩＣ５０値は、４８ｎＭ（Ａ４３１）、２２０ｎＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、３８ｎＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、および２１８ｎＭ（ＳｉＨａ）であった。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は８００ｎＭの複合体化融合タンパク質に暴露した場合であっても影響されないままであり、コントロールコンストラクトであるｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６はＡ４３１細胞およびＣＨＯ−Ｋ１細胞のいずれにおいてもほとんど影響を及ぼさなかった。対照的に、複合体化していないＣｅ６はすべての細胞株に対して有毒であり、ＩＣ５０値は、１６ｎＭ（Ａ４３１）、２２ｎＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、２２ｎＭ（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、２６ｎＭ（ＳｉＨａ）、および１８ｎＭ（ＣＨＯ−Ｋ１）であった。これらのデータを（図５ａ、ｃ）に示す。
【0039】
光活性化ステップを含まない平行実験を行うことにより確認されたように、複合体化型Ｃｅ６および非複合体化型Ｃｅ６はいずれも光活性化後にのみ有毒であった。いずれの細胞株においても、生存率の顕著な減少は見られなかった（図５ｂ、ｄ）。
【0040】
ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６がアポトーシス経路を誘発することにより標的細胞において選択的にプログラム細胞死を誘導するか否かを調べるため、カスパーゼ３およびカスパーゼ７の活性を、光活性化の２４時間後のＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、ＳｉＨａ細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞において解析した。ｓｃＦＶ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６（２００ｎＭ）および非複合体化Ｃｅ６（５０ｎＭ）はいずれも、カスパーゼ３およびカスパーゼ７のレベルを上昇させたが、２００ｎＭのｓｃＦＶ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６で処理したＡ４３１細胞においては顕著な上昇は見られなかった（図５ｅ）。
【0041】
光活性化されたＡ４３１細胞におけるＲＯＳの産生を、６−カルボキシ−２０，７０−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタートジ−（アセトキシ−メチル）エステル（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）の酸化および脱アセチル化により産生されるＤＣＦの４８５／５３５ｎｍ蛍光を測定することにより調べた。２００ｎＭの複合体化Ｃｅ６および５０ｎＭの非複合体化Ｃｅ６の存在下で、光活性化に続いてＲＯＳが爆発的に合成されるが、非照射細胞においてはＲＯＳレベルの増加は非常に小さく、光増感剤で処理していない細胞において観察されるバックグラウンドレベルをほとんど上回らないことが分かった（図５ｆ）。
【実施例】
【0042】
方法細胞培養
ＥＧＦＲ＋細胞であるＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、およびＳｉＨａ細胞、ならびにＥＧＦＲ−細胞であるＬ５４０細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含む全ての細胞株は、ヒト由来であった。Ａ４３１細胞、Ｌ５４０細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、およびＳｉＨａ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で培養した。全ての細胞は、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で培養した。全ての培地および添加物は、インビトロジェン社（ドイツ、ダルムシュタット）から入手した。
【0043】
タンパク質の発現および精製各ｓｃＦｖの配列を、Ｎ末端の結合リガンド（ｓｃＦｖ−４２５またはｓｃＦｖ−Ｋｉ４）およびＣ末端のＯ６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＳＮＡＰタグ）配列を与える発現カセット中に挿入した。ＴＧＡ終止コドンはＨｉｓ６タグ配列の直下に作成した。Ｈｉｓ６タグ標識された融合タンパク質は、無細胞上清からＮｉ−ＮＴＡ金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。より多くの容量は、Aｋｔａ ＦＬＰＣシステム上で、４×緩衝液（２００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）で平衡化後に５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）を用いて精製した。結合したＨｉｓタグ標識化タンパク質は、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）中に溶出した。溶出後、タンパク質を１ｍＭ ジチオエリスリイトール（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ社、ドイツ、カールスルーエ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して４℃で一晩透析した。エクトイン凍結保存材を５０ｍＭの最終濃度になるよう添加し、アリコートを−２０℃で保存した。
【0044】
Ｃｅ６のベンジルグアニンによる修飾ジメチルホルムアミド中で２ｍｇのＣｅ６を５倍モル過剰量のＥＤＣおよびｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（シグマアッルドリッチ社、ミズーリ州、セントルイス）と室温で３０分間混合することにより、Ｃｅ６（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ユタ州、ローガン）のカルボキシ基をベンジルグアニンで修飾した。次に活性化混合物を４倍モル過剰量のベンジルグアニンリンカーであるＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２（Ｃｏｖａｌｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スイス、ヴィッタースヴィル）と暗所にて室温で一晩混合した。修飾Ｃｅ６は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣシステム、および２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）のＷａｔｅｒ ＸＢｒｉｄｇｅ（登録商標） ＯＳＴＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社、マサチューセッツ、ミルフォード）を用いたＨＰＬＣにより、流速１ｍＬ／分で精製した。分離は、１００％の０．１Ｍ ＴＥＡＡから１００％のアセトニトリルまで２０分の勾配で行い、２８０ｎｍおよび４１０ｎｍでモニタリングした。Ｃｅ６、ＢＧ−ＰＥＧ２４−ＮＨ２、およびＢＧ−ＰＥＧ２４−Ｃｅ６の質量は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＱＴＯＦＩＩ質量分析器を、エレクトロスプレーイオン源であるＡｄｖｉｏｎ Ｎａｎｏｍａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ社、米国、ニューヨーク州、イサカ）を用い、７μｌのサンプル容量、１．４ｋＶで確認した。正確な質量は、ＭａｘＥｎｔ３（登録商標）アルゴリズム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）を４００〜２０００Ｄａの範囲で用いた３００〜２５００ｍ／ｚの範囲における質量スペクトルから得た。
【0045】
タンパク質の標識化精製ＳＮＡＰタグ融合タンパク質は、ＢＧ修飾色素（ｃｏｖａｌｙｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、スイス、ヴィッタースヴィル）またはＢＧ修飾Ｃｅ６と、暗所で１．５〜３倍モル過剰量の色素と室温で２時間インキュベーションすることにより複合体化した。残存する色素をｚｅｂａ ｓｐｉｎ脱塩カラム７Ｋ ＭＷＣＯ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、イリノイ州、ロックフォード）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより除去した。結合効率は、相当する色素の吸光係数および融合タンパク質の理論上の吸光係数を用いて測光的に決定した。標識化タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後に、ＵＶトランスイルミネーターＧｅｌ Ｄｏｃ ＸＲゲルドキュメンテーション（バイオラッドラボラトリー社、ドイツ、ミュンヘン）または青色および黄色のフィルターセットを用いたＣＲｉ Ｍａｅｓｔｒｏイメージングシステム（ＣＲｉ社、米国、マサチューセッツ、ウォバーン）のいずれかで可視化した。
【0046】
フローサイトメトリー標識化融合タンパク質および未標識融合タンパク質の結合効果は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社、ドイツ、ハイデルベルク）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いたフローサイトメトリーにより決定した。ＥＧＦＲ＋細胞株であるＡ４３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ４６８、およびＳｉＨａを用いてｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰの結合効果を試験し、ＥＧＦＲ−細胞株であるＬ５４０およびＣＨＯ−Ｋ１をネガティブコントロールとして用いた。コントロール融合タンパク質であるｓｃＦｖ−Ｋｉ４−ＳＮＡＰは抗原であるＣＤ３０を認識するため、Ｌ５４０細胞に結合するが他の細胞株には結合しないはずである。約４×１０５細胞を、０．５μｇの標識化タンパク質を含む２００μＬのＰＢＳ中で、氷上、２０分間インキュベーションした。その後、細胞を１．８ｍＬのＰＢＳを用いて通常の細胞洗浄器で２回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。
【0047】
共焦点顕微鏡画像はＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、ドイツ、ウェッツラー）で可視化した。細胞はフローサイトメトリー用に記載した ように調製した。結合効率は、細胞を標識化融合タンパク質と氷上で３０分間インキュベートすることにより決定した。内部移行は、細胞を標識化融合タンパク質と３７℃で３０分間インキュベートすることによりモニタリングした。
【0048】
ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６の光毒性上記のようにインキュベートしたＡ４３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞、ＳｉＨａ細胞、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞のアリコート（２×１０４個）をＰＢＳ中で２回洗浄した後、Ｃｅ６、ｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６、またはＫｉ４−ｓｃＦｖ/ＳＮＡＰ−Ｃｅ６のいずれかの濃度を増加させて処理して３７℃で３時間インキュベートした。コントロールのインキュベート物は、光増感剤の代わりに５００μｇ／ｍＬのゼオシンとともにインキュベートした。その後、７ｍｍの水キュベットおよびオレンジフィルターＯＧ５９０、５８０〜１４００ｎｍの範囲のスペクトルでＨｙｄｒｏｓｕｎタイプ５０５（Ｈｙｄｒｏｓｕｎ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ社、ドイツ、ミュールハイム）を用いて２４Ｊ／ｃｍ２の広帯域の可視／近赤外光を細胞に照射し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃でさらに２４時間インキュベートした。
【0049】
細胞生存率は、ＸＴＴ細胞増殖キットＩＩ（ロシュ社、ドイツ、マンハイム）を用いて、光活性化の２４時間後に測定した。細胞を２，３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５スルホニル）−５［（フェニル−アミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム塩酸塩試薬（１ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートし、３７℃で２時間インキュベートした。生存癌細胞によるＸＴＴのホルマザンへの還元は、吸収波長４５０ｎｍおよび参照波長６３０ｎｍにおいて、ＥＬＩＳＡプレートリーダーＥｌｉｓａｒｅａｄｅｒ ＥＬｘ８０８（Ｂｉｏ−ＴＥＫ社、ドイツ、バート・フリードリヒスハル）を用いて比色分析によりモニタリングした。
【0050】
細胞溶解物におけるカスパーゼ３／７活性は、Ａｐｏ−ＯＮＥ Ｃａｓｐａｓｅ−３／７アッセイ（プロメガ社、ドイツ、マンハイム）を用いて光活性化の２４時間後に測定した。すなわち、１００μｌのＡｐｏ−ＯＮＥ試薬を細胞に添加して６時間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーＥｌｉｓａｒｅａｄｅｒ ＥＬｘ８０８（Ｂｉｏ−ＴＥＫ社、ドイツ、バート・フリードリヒスハル）を用いて、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５３５ｎｍで蛍光を測定した。ＲＯＳ濃度は、Ｈ２ＤＣＦＤＡ（インビトロジェン社、ドイツ、ダルムシュタット）の４８５／５３５ｎｍ蛍光比を測定することにより決定した。すなわち、２×１０４個の細胞を５０ｎＭのＣｅ６または２００ｎＭのｓｃＦｖ−４２５−ＳＮＡＰ−Ｃｅ６と１０μＭのＨ２ＤＣＦＤＡの存在下で、１％ＦＣＳを含むＰＢＳ中で３０分間インキュベーションした。２．５％ＦＣＳを含む温ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６０培地中で２時間インキュベートして上記のように照射した。蛍光測定は照射直後に行った。空のプローブ（細胞および培地）の測定値はバックグラウンドとして使用し、すべてのサンプルの測定値から差し引いた。
【0051】
データ分析統計学的分析および曲線近似はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州、サンディエゴ）を用いて行った。データは平均±ＭＥＳで示す。スチューデントｔ−検定および二元分散分析を用いて、独立実験の有意性を評価した。基準ｐ＜０．０５を用いて統計的有意性を決定した。
【0052】
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【配列表】
【国際調査報告】