特表 2015-512380 ＲＳＶに対するワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-512380(P2015-512380A)

(43)【公表日】2015年4月27日

(54)【発明の名称】ＲＳＶに対するワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/155 20060101AFI20150331BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150331BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150331BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150331BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150331BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150331BHJP

   C12N 7/02 20060101ALI20150331BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20150331BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20150331BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20150331BHJP

   C07K 14/115 20060101ALN20150331BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/155

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12N7/02

   A61P31/14

   A61P37/04

   A61P11/00

   C07K14/115

【審査請求】有

【予備審査請求】有

【全頁数】66

(21)【出願番号】特願2015-500925(P2015-500925)

(86)(22)【出願日】2013年3月21日

(85)【翻訳文提出日】2014年9月19日

(86)【国際出願番号】EP2013055935

(87)【国際公開番号】WO2013139911

(87)【国際公開日】20130926

(31)【優先権主張番号】61/614,429

(32)【優先日】2012年3月22日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】12160682.6

(32)【優先日】2012年3月22日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】301055549

【氏名又は名称】クルセル ホランド ベー ヴェー

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100181272

【弁理士】

【氏名又は名称】神 紘一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100173657

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬沼 宗一郎

(72)【発明者】

【氏名】カタリナ ラドシェヴィッチ

(72)【発明者】

【氏名】ジェローム エイチエイチヴイ カスターズ

(72)【発明者】

【氏名】ジョルト ヴェリンガ

(72)【発明者】

【氏名】マイラ エヌ ウィドジョジョアトモドジョ

【テーマコード（参考）】

4B024

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024BA31

4B024CA01

4B024CA11

4B024EA02

4B024GA11

4B024HA01

4B024HA08

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4C085AA03

4C085BA57

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG03

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンであって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその免疫学的に活性な部分をコードする核酸を含む、血清型（２６）の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチンを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンであって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチン。

【請求項2】

前記組換えアデノウイルスが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする前記核酸が、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている、請求項１または２に記載のワクチン。

【請求項4】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項5】

前記組換えヒトアデノウイルスが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失、Ｅ３領域中の欠失、またはＥ１およびＥ３の両方の領域中の欠失を有している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項6】

前記組換えアデノウイルスが、その５’末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項7】

ＲＳＶに対して被験体にワクチン接種するための方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンを被験体に投与することを含む方法。

【請求項8】

前記ワクチンが筋肉内投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンが、前記被験体に二回以上投与される、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型３５の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチンを前記被験体に投与することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記被験体への前記ワクチンの単回投与からなる、請求項７または８に記載の方法。

【請求項12】

前記被験体にＲＳＶ Ｆタンパク質を投与することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

被験体におけるＲＳＶの感染および／または複製を軽減するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む組成物の筋肉内注射によって前記被験体に投与することを含む方法。

【請求項14】

ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む、単離された宿主細胞。

【請求項15】

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを製造するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを準備するステップと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させるステップと、前記組換えアデノウイルスを単離および精製するステップと、前記組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に製剤化するステップとを含む方法。

【請求項16】

ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離された組換え核酸。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医療分野に関する。より具体的には、本発明はＲＳＶに対するワクチンに関する。

【背景技術】

【0002】

１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ：ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）が発見されると、このウイルスは直ぐに、ヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で、毎年６４００万件のＲＳＶ感染が発生し、その結果１６０，０００人が死亡している（ＷＨＯ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｕｐｄａｔｅ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に未熟児、高齢および免疫無防備状態の個体である。２年未満の小児では、ＲＳＶは、最もよく見られる呼吸器病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークとなるのは２〜４ヶ月齢である。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶに感染したことが報告されている。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果をもたないことに起因する。高齢者における、ＲＳＶ疾患の負担、死亡率、および罹患率のレベルは、非パンデミックなインフルエンザＡ型感染症を原因とするものに次ぐものである。

【0003】

ＲＳＶは、肺炎ウイルス亜科に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む、種々のタンパク質をコードする。融合タンパク質前駆体（Ｆ０）がタンパク質分解により切断されると、ジスルフィド架橋を介して連結された２つのポリペプチドＦ１およびＦ２が生じる。Ｆ１タンパク質の融合媒介部分に対する抗体は、細胞のウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用がある。中和抗体の標的であることに加えて、ＲＳＶ Ｆは、細胞障害性Ｔ細胞エピトープを含有する（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２１７７−２１８２）。

【0004】

ＲＳＶ感染に対する治療選択肢には、ＲＳＶのＦタンパク質に対するモノクローナル抗体が挙げられる。そのようなモノクローナル抗体には高いコストが伴うこと、また病院環境での投与が要求されることにより、リスクのある集団に予防のために大規模に使用することは不可能である。したがって、ＲＳＶワクチンの必要性があり、このワクチンは小児集団にも高齢者にも使用できることが好ましい。

【0005】

５０年間の研究にもかかわらず、ＲＳＶに対するワクチンはまだ認可されたものがない。ワクチン開発の主要な障害の１つは、ホルマリン不活化（ＦＩ：ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＲＳＶワクチンによる、１９６０年代の臨床試験において、疾患のワクチン増強があったことが受け継がれていることである。ＦＩ−ＲＳＶワクチン接種を受けた小児は、自然感染から防御されず、感染した小児は、ワクチン接種を受けなかった小児よりも、２人の死亡を含む重篤な病気を経験した。この現象は「疾患の増強」と呼ばれる。

【0006】

ＦＩ−ＲＳＶワクチンによる試験以来、ＲＳＶワクチンを作製するための種々のアプローチが追求されてきた。試みには、ＲＳＶの古典的生弱毒化低温継代株または温度感受性突然変異株、（キメラ）タンパク質サブユニットワクチン、ペプチドワクチン、および組換えウイルスベクターから発現されるＲＳＶタンパク質が含まれる。これらのワクチンの一部は、有望な前臨床データを示したが、安全性の懸念または有効性の欠如により、ヒト使用に対して認可されたワクチンはない。

【0007】

アデノウイルスベクターは、ＲＳＶ感染に付随する疾患を含む、種々の疾患に対するワクチンの調製のために使用されている。以下の段落に、記載されたことのある、アデノウイルスベースのＲＳＶ候補ワクチンの例を提供する。

【0008】

１つのアプローチでは、ＲＳＶ．Ｆは、複製能のあるアデノウイルス４、５、および７型の非必須なＥ３領域に挿入された。コットンラットにおける免疫処置である、１０^７ｐｆｕの鼻腔内（ｉ．ｎ．）適用は、中程度に免疫原性であり、下気道に対しては、ＲＳＶチャレンジに対して防御的であったが、上気道ＲＳＶチャレンジに対しては防御的でなかった（Ｃｏｎｎｏｒｓ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｖａｃｃｉｎｅ １０：４７５−４８４；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．，Ｐｒｉｎｃｅ，Ｇ．Ａ．，Ｃａｍａｒｇｏ，Ｅ．，Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．Ｈ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０：Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＡＩＤＳ（Ｅｄｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｆ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．ａｎｄ Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ａ．）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，ｐｐ７９−８４）。その後のチンパンジーの経口免疫処置では、免疫原性が低かった（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，１９９２，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．６６：７６９−７７５）。

【0009】

他の研究では、（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：５４６０−７１；米国特許出願公開第２０１１／００１４２２０号明細書）、膜貫通の短縮型（ｒＡｄ−Ｆ０ΔＴＭ）または完全長型（ｒＡｄ−Ｆ０）のＲＳＶ−Ｂ１株Ｆタンパク質をコードする核酸を担持する、組換え型の複製能がない２つのアデノウイルス５ベクターを操作して作製し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内経路で投与した。動物を１０^７ｐｆｕで初回免疫（ｉ．ｎ．）し、２８日後に同じ用量で追加免疫（ｉ．ｎ．）した。抗ＲＳＶ−Ｂ１抗体は，ＲＳＶ−Ｌｏｎｇ株およびＲＳＶ−Ａ２株を中和し、それらと交差反応するが、これらのベクターによる免疫処置は、ＲＳＶ Ｂ１チャレンジ複製に対して部分的にのみ防御した。ｒＡｄ−Ｆ０ΔＴＭによる（部分的）防御は、ｒＡｄ−Ｆ０よりもわずかに高かった。

【0010】

別の研究では、野生型ＲＳＶ Ｆ（ＦＧ−Ａｄ−Ｆ）を発現する複製能欠損（Ａｄ５ベースの）ＦＧ−Ａｄアデノウイルスによる１０^１１個のウイルス粒子によって、ＢＡＬＢ／ｃマウスをｉ．ｎ．免疫処置すると、肺ウイルス力価が、対照群に比較して、１．５ｌｏｇ１０だけ低下することが観察された（Ｆｕ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３８１：５２８−５３２）。

【0011】

さらに別の研究では、ＲＳＶ Ａ２のＦタンパク質のコドン最適化された可溶性Ｆ１断片（アミノ酸１５５〜５２４）を発現する組換え型Ａｄ５ベースの複製能欠損アデノベクターを鼻腔内に適用すると（１０^８ＰＦＵ）、対照マウスに比較して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺におけるＲＳＶチャレンジ複製を軽減させることができるが、筋肉内（ｉ．ｍ．）経路により免疫処置されたマウスでは、チャレンジに対する何らの防御も示されないことが観察された（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：３８０１−３８０８）。

【0012】

他の研究では、コドン最適化された完全長ＲＳＶ Ｆ（ＡｄＶ−Ｆ）またはＲＳＦ Ｆ遺伝子の可溶性形態（ＡｄＶ−Ｆｓｏｌ）を担持するＡｄ５ベースのアデノウイルスを使用して、１×１０^１０ＯＰＵの用量でＢＡＬＢ／ｃマウスを２回免疫処置した（光学粒子単位：１×１０^１０ＯＰＵの用量は、２×１０^８ＧＴＵ（遺伝子形質導入単位）に相当する）。これらのベクターは、ｉ．ｎ免疫処置後には、肺におけるウイルス負荷を強力に低減したが、皮下適用（ｓ．ｃ．）またはｉ．ｍ．適用の後では、部分的にのみ低減した（Ｋｏｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：１２６０１−１２６１０；米国特許出願公開第２０１０／０１１１９８９号明細書）。

【0013】

さらに他の研究では、ＲＳＶ Ａ２株の配列決定されたＦタンパク質ｃＤＮＡを発現する組換え型Ａｄ５ベースの複製能欠損アデノベクターを筋肉内に適用すると（１０^１０粒子単位）、対照マウスに比較して、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺におけるＲＳＶチャレンジ複製を部分的にのみ軽減することができることが観察された（Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：３７５−３８６）。

【0014】

多くの症例において有効性が十分でないことは別として、小児用法についての臨床評価におけるＲＳＶワクチンおよび前臨床評価におけるそのワクチンの大部分は、鼻腔内ワクチンである。鼻腔内法の最も重要な利点は、局所呼吸器免疫の直接刺激およびそれに伴う疾患増強の欠如である。実際、一般に、例えばアデノウイルスベースのＲＳＶ候補ワクチンの効力は、筋肉内投与と比較した場合、鼻腔内投与が優れているように見える。しかしながら、鼻腔内ワクチン接種も、６ヶ月未満の幼児において、安全性に懸念が生じている。鼻腔内ワクチンの最もよく見られる有害反応は、すべての年齢において、鼻汁または鼻閉である。新生児は鼻呼吸が必須であり、したがって、鼻を通して呼吸しなければならない。したがって、生まれてから最初の２、３ヶ月における鼻閉は、保育を妨害する可能性があり、まれな症例では、重篤な呼吸障害の原因となることもある。

【0015】

５０種を超える、相異なるヒトアデノウイルスの血清型が同定されている。これらの中で、歴史的には、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）が、遺伝子担体としての使用について最も広範囲に研究されている。しかしながら、異なる血清型の組換えアデノウイルスベクターを用いると、免疫応答の誘導および防御に関して異なる結果が得られる可能性がある。例えば、国際公開第２０１２／０２１７３０号パンフレットでは、Ｆタンパク質をコードするサルアデノウイルスベクター血清型７およびヒトアデノウイルスベクター血清型５が、血清型２８のヒトアデノウイルスベクターよりも、ＲＳＶに対して優れた防御を提供することが記載されている。加えて、ヒトまたは非ヒトアデノウイルス血清型に基づくベクターについて、免疫原性の差異が観察された（Ａｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８１：４６５４−４６６３；Ｃｏｌｌｏｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４，１１５ｒａ２）。Ａｂｂｉｎｋらは、試験したまれな血清型のヒトｒＡｄベクターがすべて、抗Ａｄ５免疫のない状態で、ｒＡｄ５ベクターよりも効力が低かったと結論している。さらに、最近では、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）糖タンパク質（ｇｐ）導入遺伝子を含むｒＡｄ５が非ヒト霊長類を１００％防御する一方、ＥＢＯＶ ｇｐ導入遺伝子を含むｒＡｄ３５およびｒＡｄ２６は部分的に防御するのみであり、エボラウイルスチャレンジに対する完全な防御を得るためには、これらのベクターによる異種初回免疫−追加免疫法が必要とされることが記載されている（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：４２２２−４２３３）。したがって、別のアデノウイルス血清型からのデータにのみに基づいて、組換えアデノウイルスワクチンの効力を予測することは、経験的に可能ではない。

【0016】

さらに、ＲＳＶワクチンの場合、ワクチン候補が、鼻腔および肺でのＲＳＶの複製を予防するのに十分効果的であり、かつ同時に安全であるか、すなわち、疾患の増強をもたらさないか否かを判定するために、コットンラットなどの適切な疾患モデルでの実験が必要となる。好ましくは、そのような候補ワクチンは、筋肉内投与においても、そのようなモデルで高度に効果的であるべきである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0017】

したがって、疾患の増強をもたらさない、ＲＳＶに対する効果的なワクチンおよびワクチン接種法の必要性が依然として存在する。本発明は、ＲＳＶに対するそのようなワクチンおよび安全で効果的にワクチン接種するための方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0018】

驚くべきことに、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、血清型２６の組換えアデノウイルス（Ａｄ２６）は、確立されたコットンラットモデルにおいて、ＲＳＶに対する極めて有効なワクチンであり、またＲＳＶ ＦをコードするＡｄ５について以前に記載されたデータに比較して、効力が改善していることが、本発明者らにより見出された。ＲＳＶ ＦをコードするＡｄ２６の単回投与でも、筋肉内投与でも、チャレンジＲＳＶ複製を完全に防御するのに十分であることが実証される。

【0019】

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンであって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチンを提供する。

【0020】

特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む。

【0021】

特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。

【0022】

特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号２の核酸配列を含む。

【0023】

特定の実施形態では、組換えヒトアデノウイルスは、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失、Ｅ３領域中の欠失、またはＥ１およびＥ３の両方の領域中の欠失を有している。

【0024】

特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、その５’末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを有する。

【0025】

本発明はさらに、ＲＳＶに対して被験体にワクチン接種するための方法であって、本発明によるワクチンを被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0026】

特定の実施形態では、ワクチンは筋肉内投与される。

【0027】

特定の実施形態では、本発明によるワクチンは、被験体に二回以上投与される。

【0028】

特定の実施形態では、ＲＳＶに対して被験体にワクチン接種するための方法は、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型３５の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチンを被験体に投与することをさらに含む。

【0029】

特定の実施形態では、ＲＳＶに対して被験体にワクチン接種する方法は、ＲＳＶ Ｆタンパク質（好ましくは、医薬組成物、したがってタンパク質ワクチンとして製剤化される）を被験体に投与することをさらに含む。

【0030】

特定の実施形態では、ワクチン接種するための方法は、被験体へのワクチンの単回投与からなる。

【0031】

本発明はまた、被験体の、例えば鼻腔および肺におけるＲＳＶの感染および／または複製を低減するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む組成物の筋肉内注射によって被験体に投与することを含む方法を提供する。これは、被験体のＲＳＶ感染から生じる悪影響を軽減し、したがって、ワクチンの投与により、そのような悪影響から被験体を防御することに寄与することになる。特定の実施形態では、ＲＳＶ感染の悪影響は、基本的に予防することができる、すなわち、臨床的に重要でないほど低レベルに軽減することができる。組換えアデノウイルスは、上記の実施形態を含む、本発明によるワクチンの形態にすることができる。

【0032】

本発明はまた、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む、単離された宿主細胞を提供する。

【0033】

本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを製造するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを準備するステップと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させるステップと、この組換えアデノウイルスを単離および精製するステップと、この組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に製剤化するステップとを含む方法をさらに提供する。この態様の組換えヒトアデノウイルスは、上記の実施形態に記載されるアデノウイルスのいずれであってもよい。

【0034】

本発明はまた、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離された組換え核酸を提供する。このアデノウイルスは、上記の実施形態に記載されるアデノウイルスのいずれであってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1A】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６（Ａ）およびｒＡｄ３５（Ｂ）をベースとするベクターにより免疫処置したときの、免疫処置後２および８週目における、マウスのＦのａａ１〜２５２にオーバーラップするＦペプチドおよびＦのａａ２４１〜５７４にオーバーラップするＦペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。

【図1B】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６（Ａ）およびｒＡｄ３５（Ｂ）をベースとするベクターにより免疫処置したときの、免疫処置後２および８週目における、マウスのＦのａａ１〜２５２にオーバーラップするＦペプチドおよびＦのａａ２４１〜５７４にオーバーラップするＦペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。

【図2】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより免疫処置したときの、免疫処置後２および８週目における、マウスのＲＳＶに対する抗体応答を示す。

【図3】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、１０^１０ｖｐのｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより免疫処置したときの、免疫処置後８週目における、マウスのＲＳＶに対するＩｇＧ２ａ対ＩｇＧ１抗体応答比の結果を示す。

【図4】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６（Ａ）およびｒＡｄ３５（Ｂ）をベースとするベクターにより免疫処置したときの、免疫処置後２および８週目における、マウスのＲＳＶ Ｌｏｎｇに対するウイルス中和能を示す。

【図5A】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置したときの、初回免疫処置後６および１２週目における、マウスの（Ａ）Ｆのａａ１〜２５２にオーバーラップするＦペプチドおよび（Ｂ）Ｆのａａ２４１〜５７４にオーバーラップするＦペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。

【図5B】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置したときの、初回免疫処置後６および１２週目における、マウスの（Ａ）Ｆのａａ１〜２５２にオーバーラップするＦペプチドおよび（Ｂ）Ｆのａａ２４１〜５７４にオーバーラップするＦペプチドに対する細胞性免疫応答を示す。

【図6】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置したときの、初回免疫処置後の種々の時点における、マウスのＲＳＶに対する抗体応答を示す。

【図7】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置したときの、初回免疫処置後の種々の時点における、マウスのＲＳＶ Ｌｏｎｇに対するウイルス中和能を示す。

【図8】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置したときの、初回免疫処置後の種々の時点における、マウスのＲＳＶ Ｂ１に対するウイルス中和能を示す。

【図9】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置した後の、チャレンジ後５日目における、コットンラットのＡ）ＲＳＶ肺力価およびＢ）ＲＳＶ鼻力価を示す。

【図10】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置した後の、初回免疫処置後Ａ）２８日目およびＢ）４９日目における、ウイルス中和力価の誘導を示す。

【図11】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより初回免疫−追加免疫処置した後の、屠殺日におけるコットンラット肺の病理組織検査を示す。

【図12】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターによる、異なる経路で投与された単回免疫処置後の、チャレンジ後５日目における、コットンラットのＡ）ＲＳＶ肺力価およびＢ）ＲＳＶ鼻力価を示す。

【図13】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターによる、異なる経路で投与された単回免疫処置後の、初回免疫処置後２８および４９日目における、ウイルス中和力価の誘導を示す。

【図14】屠殺日におけるＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５をベースとするベクターにより単回投与免疫処置（ｉ．ｍ．）した後の、屠殺日におけるコットンラット肺の病理組織検査を示す。

【図15】ＲＳＶ Ｆをコードする配列を含む、Ａｄ３５およびＡｄ２６のゲノムの左端を含むプラスミドのマップ：Ａ．ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ、およびＢ．ｐＡｄＡｐｔ２６．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔを示す。

【図16】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目または２８日目に単回投与免疫処置した後の、チャレンジ後５日目における、コットンラットのＡ）ＲＳＶ肺力価およびＢ）ＲＳＶ鼻力価を示す。チャレンジは４９日目であった。

【図17】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６により単回投与免疫処置した後の、図１６について記載された免疫処置後４９日目におけるウイルス中和力価の誘導を示す。

【図18】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６により単回投与免疫処置した後の、免疫処置後の期間におけるウイルス中和力価の誘導を示す。

【図19】Ａｄ−ＲＳＶ Ｆまたは導入遺伝子なし（Ａｄ−ｅ）の１０^１０で免疫処置したコットンラットからの血清による、ＲＳＶ ＬｏｎｇおよびＲＳＶ Ｂｗａｓｈに対する、４９日後のＶＮＡ力価を示す。ＰＢ：初回免疫−追加免疫。

【図20】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目に単回投与免疫処置した後の、ＲＳＶ Ａ２またはＲＳＶ Ｂ１５／９７によるチャレンジ後５日目における、コットンラットのＲＳＶ肺力価を示す。

【図21】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目に単回投与免疫処置した後の、ＲＳＶ Ａ２またはＲＳＶ Ｂ１５／９７によるチャレンジ後５日目における、コットンラットのＲＳＶ鼻力価を示す。

【図22】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目に単回投与免疫処置した後の、初回免疫後の種々の時点におけるコットンラット血清中のＶＮＡ力価を示す。

【図23】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目に単回投与免疫処置した後の、標準用量（１０^５）または高用量（５×１０^５）のＲＳＶ Ａ２によるチャレンジ後５日目における、コットンラットのＲＳＶ肺力価を示す。

【図24】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより０日目に単回投与免疫処置した後の、標準用量（１０^５）または高用量（５×１０^５）のＲＳＶ Ａ２によるチャレンジを伴うチャレンジ後５日目における、コットンラットのＲＳＶ鼻力価を示す。

【図25】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより単回投与免疫処置または初回免疫−追加免疫処置を０および２８日目に行った後の、チャレンジ後５日目におけるコットンラットのＲＳＶ肺力価を示す。チャレンジは免疫処置後２１０日目に実施した。

【図26】単回投与および初回免疫−追加免疫処置後の、免疫処置後１４０日目におけるコットンラット血清中のＶＮＡ力価を示す。

【図27】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより単回免疫処置または初回免疫−追加免疫処置を行った後の、チャレンジ後２日目における、屠殺したコットンラットの肺の病理組織検査を示す。ドットは中央値を示し、ウィスカーは２５および７５パーセンタイルを示す。

【図28】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含する、種々の用量のｒＡｄ２６ベースのベクターにより単回免疫処置または初回免疫−追加免疫処置を行った後の、チャレンジ後６日目における、屠殺したコットンラットの肺の病理組織検査を示す。ドットは中央値を示し、ウィスカーは２５および７５パーセンタイルを示す。

【図29】ＲＳＶ Ｆ遺伝子を包含するｒＡｄ２６（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）による免疫処置およびその後のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはアジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質（ｐｏｓｔ−Ｆ）による追加免疫後のウイルス中和力価の誘導を示す。

【図30】Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置およびその後のＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる追加免疫またはアジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質（ｐｏｓｔ−Ｆ）による追加免疫後のＩｇＧ２ａ抗体およびＩｇＧ１抗体の誘導ならびにそれらの比を示す。

【図31】Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置およびその後のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはアジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質（ｐｏｓｔ−Ｆ）による追加免疫後の脾細胞によるＩＦＮ−ｇの産生を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

アデノウイルスに対する「組換え」という用語は、本明細書で使用する場合、アデノウイルスが人為的に修飾されたことを意味し、例えば、アデノウイルスは、その中に積極的にクローニングされた改変末端を有し、かつ／または異種遺伝子を含む、すなわち、天然の野生型アデノウイルスではない。

【0037】

本明細書の配列は、当技術分野の慣例どおり、５’から３’の方向で提供される。

【0038】

「アデノウイルスカプシドタンパク質」とは、特定のアデノウイルスの血清型および／またはトロピズムの決定に関与する、アデノウイルスのカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的には、ファイバータンパク質、ペントンタンパク質、および／またはヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（「またはそれに基づいた」）アデノウイルスは、典型的には、その特定の血清型のファイバータンパク質、ペントンタンパク質、および／またはヘキソンタンパク質を含み、好ましくは、その特定の血清型のファイバータンパク質、ペントンタンパク質、およびヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、典型的には、組換えアデノウイルスのゲノムによりコードされる。特定の血清型の組換えアデノウイルスは、任意選択で、他のアデノウイルス血清型に由来する他のタンパク質を含み、かつ／またはコードすることがある。したがって、非限定例として、Ａｄ２６のヘキソン、ペントン、およびファイバーを含む組換えアデノウイルスは、Ａｄ２６に基づく組換えアデノウイルスとみなされる。

【0039】

組換えアデノウイルスは、本明細書で使用する場合、少なくとも配列において野生型から誘導されることによって、アデノウイルス「に基づいて」いる。これは、出発物質として野生型ゲノムまたはその一部を使用して、分子クローニングにより達成することができる。また、ＤＮＡ合成により新たにゲノム（の一部）を生成するために、野生型アデノウイルスゲノムの公知配列を使用することが可能であり、これは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野でビジネスをしているサービス企業によりルーチン的な手法を使用して実施され得る（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）。

【0040】

数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードすることができることは、当業者に理解されている。当業者が、ポリペプチドが発現されることになる、任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、そこに記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、ルーチン的な手法を使用して行うことができることも理解されている。したがって、特に明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重形であって、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでもよい。

【0041】

好ましい実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸は、ヒト細胞などの哺乳類細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は公知であり、以前に記載されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。ＲＳＶ Ｆタンパク質の特定のコドン最適化配列の一例は、欧州特許第２１０２３４５Ｂ１号明細書の配列番号２に記載されている。

【0042】

一実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ａ２株に由来し、配列番号１のアミノ酸配列を有する。特に好ましい実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号２の核酸配列を含む。この実施形態は安定な発現をもたらし、この実施形態によるワクチンは、１回の筋肉内投与の後でも鼻腔および肺におけるＲＳＶ複製を防御することを本発明者らは見出した。

【0043】

本明細書で使用する「断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端および／または内部が欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、ＲＳＶ Ｆタンパク質の配列、例えばＲＳＶ Ｆタンパク質の完全長配列の中の対応する位置と同一であるペプチドを指す。免疫応答を誘導するためには，さらに一般的には、ワクチン接種の目的のためには、タンパク質は、完全長である必要も、その野生型の機能をすべて有する必要もなく、タンパク質の断片でも同等に有用である。実際、Ｆ１またはＦ ｓｏｌｕｂｌｅのようなＲＳＶ Ｆタンパク質の断片は、完全長Ｆのように免疫応答を誘導するのに効果的であることが示されている（Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：５４６０−７１、Ｋｏｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：１２６０１−１２６１０）。アミノ酸２５５〜２７８または４１２〜５２４に対応するＦタンパク質断片を能動免疫処置に組み込むと、中和抗体およびＲＳＶチャレンジに対する一部の防御が誘導される（Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｖｉｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，２６１−２７５；Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ ２５，６２１１−６２２３）。

【0044】

本発明による断片は、免疫学的に活性な断片であり、典型的には、ＲＳＶ Ｆタンパク質の少なくとも１５個のアミノ酸、または少なくとも３０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、それは、ＲＳＶ Ｆタンパク質の少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または５５０個のアミノ酸を含む。

【0045】

当業者はまた、例えばルーチン的な分子生物学手順を使用して、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加等よりタンパク質に変化を施すことができることを認識している。一般に、保存的なアミノ酸置換は、ポリペプチドの機能または免疫原性を喪失させることなく施すことができるものである。これは、当業者に周知のルーチン的な手順に従って、容易にチェックすることができる。

【0046】

「ワクチン」という用語は、特定の病原体または疾患に対して被験体に治療レベルの免疫を誘導するのに効果的な活性成分を含有する薬剤または組成物を指す。本発明では、ワクチンは、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその抗原性断片をコードする有効量の組換えアデノウイルスを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院が必要となる重篤な下気道疾患を予防し、被験体のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。したがって、本発明はまた、重篤な下気道疾患の予防もしくは軽減、入院の回避もしくは縮小（例えば、短縮）ならびに／または被験体におけるＲＳＶを原因とする肺炎もしくは細気管支炎の頻度および／もしくは重症度の低減のための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む組成物の筋肉内注射によって被験体に投与することを含む方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも、含まなくてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染病原体に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであってもよい。

【0047】

本発明のベクターは、組換えアデノウイルスであり、組換えアデノウイルスベクターとも呼ばれる。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。

【0048】

特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能、例えば、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須なＥ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、このベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能および非必須なＥ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「複合的に欠損している」ことがあり、これは、アデノウイルスベクターが、アデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つまたは複数の必須遺伝子機能を欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１欠損またはＥ１、Ｅ３欠損のアデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していることがある。

【0049】

アデノウイルスベクター、その構築のための方法、およびそれを増殖させるための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、および同第６，１１３，９１３号明細書、およびＴｈｏｍａｓ Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ ６７ ａｎｄ ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）、ならびに本明細書に記述された他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築には、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｄ ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ（１９９２），ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、および本明細書に記述された他の参考文献に記載されるものなど、標準分子生物学手法の使用が含まれる。

【0050】

本発明によれば、アデノウイルスは血清型２６のヒトアデノウイルスである。この血清型に基づく本発明によるワクチンおよびＡｄ３５に基づくワクチンは、驚くべきことに、従来技術で記載されるＡｄ５に基づくワクチンよりも効力があるように見える。というのは、Ａｄ５に基づくワクチンは、単回筋肉内投与後のＲＳＶチャレンジ複製に対する防御が完全ではなかったからである（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：３８０１−３８０８；Ｋｏｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２００９，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８３：１２６０１−１２６１０；Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ８：３７５）。本発明の血清型はさらに、一般に、ヒト母集団において、血清有病率が低く、かつ／または既存の中和抗体価が低い。種々の導入遺伝子を含む、この血清型およびＡｄ３５の組換えアデノウイルスベクターは、臨床試験で評価され、これまで、優れた安全性プロフィールを有することが示されている。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＥＦ １５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見られる。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、およびＶｏｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣ＿００００１９および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見られる。

【0051】

本発明による組換えアデノウイルスは、複製能があっても、複製能が欠損していてもよい。

【0052】

特定の実施形態では、アデノウイルスは、例えばゲノムのＥ１領域に欠失があるために、複製能が欠損している。当業者には公知であるように、アデノウイルスゲノムから必須領域が欠失している場合には、これらの領域によってコードされる機能は、トランスで、好ましくはプロデューサー細胞により提供されなければならない、すなわち、Ｅ１、Ｅ２、および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失している場合には、それらはプロデューサー細胞中に、例えば、そのゲノムに組み込まれて、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在しなければならない。アデノウイルスはまた、Ｅ３領域中に欠失がある場合もあるが、この領域は複製に必ずしも必要ではなく、したがって、このような欠失は補完する必要がない。

【0053】

使用することができるプロデューサー細胞（時として、当技術分野および本明細書において、「パッケージング細胞」または「補完細胞」または「宿主細胞」とも呼ばれる）は、所望のアデノウイルスを増殖させることができる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス中の欠損を補完するプロデューサー細胞中で行われる。このようなプロデューサー細胞は、好ましくは、そのゲノム中に少なくともアデノウイルスＥ１配列を有しており、それによってＥ１領域に欠失がある組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１を補完する任意のプロデューサー細胞、例えば、Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照のこと）、Ｅ１で形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照のこと）、Ｅ１で形質転換されたＡ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照のこと）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２１３−２１９）、２９３等を使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。

【0054】

Ａｄ３５（亜群Ｂ）またはＡｄ２６（亜群Ｄ）など、亜群ＣでないＥ１欠損アデノウイルスについては、これらの亜群ＣでないアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などの亜群ＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する、例えば２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞など、周知の補完細胞中でそのようなアデノウイルスが増殖できるようになる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照のこと）。特定の実施形態では、使用することができるアデノウイルスは、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中の欠失を有し、かつＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する、血清型３５のヒトアデノウイルスである。特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物中のアデノウイルスは、ＲＳＶ Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中の欠失を有し、かつＡｄ５のＥ４ ｏｒｆ６領域を有する、血清型２６のヒトアデノウイルスである。

【0055】

代替実施形態では、アデノウイルスベクター中に異種Ｅ４ｏｒｆ６領域（例えば、Ａｄ５の）を配置する必要はないが、その代わり、Ｅ１欠損の亜群Ｃでないベクターを、Ｅ１および適合性のあるＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株、例えば、Ａｄ５由来のＥ１およびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載する、Ｂｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ，１９９６，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：６４９７−５０１；それぞれ、このような細胞株を使用する、Ｅ１欠失の非亜群Ｃアデノウイルスベクターの生成について記載する、Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７１：８９４６−５１およびＮａｎ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：３２６−３６を参照のこと）。

【0056】

あるいは、増殖させることになる血清型に由来するＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照のこと）。

【0057】

Ｅ１領域中に欠失がある、Ａｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスについては、アデノウイルス中にＥ１Ｂ ５５Ｋ翻訳領域の３’末端、例えば、ｐＩＸ開始コドンの直ぐ上流にある２４３ｂｐ断片など、ｐＩＸ翻訳領域またはこれを含む断片の直ぐ上流にある１６６ｂｐ（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位により５’末端にマークされている）を保持することが好ましい。というのは、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に一部存在しているため、これがアデノウイルスの安定性を増大させるからである（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／００１０３２号パンフレットを参照のこと）。

【0058】

本発明のアデノウイルス中の「異種核酸」（本明細書において「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、アデノウイルス中に天然には存在しない核酸である。それは、例えば、標準分子生物学手法によりアデノウイルスに導入される。本発明では、異種核酸はＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする。それは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域にクローニングすることができる。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に機能的に連結されている。これは、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に配置することによって行うことができる。さらなる調節配列を加えることもできる。多くのプロモーターを導入遺伝子の発現に使用することができ、それらは当業者に公知である。真核細胞で発現を得るのに適したプロモーターの非限定例としては、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーター由来のｎｔ．−７３５〜＋９５を含む、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）が挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を、導入遺伝子の後に存在させることもできる。

【0059】

特定の実施形態では、本発明の組換えＡｄ２６ベクターは、５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。そのようなベクターは、オリジナル５’末端配列（一般にＣＡＴＣＡＴＣＡ）を有するベクターに比較して、製造工程において複製が改善され、その結果、均一性が改善したアデノウイルスのバッチが得られるため、これらの実施形態は有利になる（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｒｕｃｅｌｌ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂ．Ｖ．の名のもとに２０１２年３月１２日に出願された「改変末端を有する組換えアデノウイルスのバッチ」と題する特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５４８４６および米国特許第１３／７９４，３１８号明細書も参照のこと）。したがって、本発明はまた、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその一部をコードする組換えアデノウイルスのバッチであって、このアデノウイルスがヒトアデノウイルス血清型２６であり、かつこのバッチ中のアデノウイルスの基本的にすべて（例えば、少なくとも９０％）が末端ヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを有するゲノムを含む、組換えアデノウイルスのバッチを提供する。

【0060】

本発明によれば、ＲＳＶのＦタンパク質は、好ましくは、Ａ２株、Ｌｏｎｇ株、またはＢ株などのヒトＲＳＶ株に由来する、天然または組換えのＲＳＶの任意の株に由来するものであってよい。さらなる実施形態では、この配列は、複数のＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列であってよい。本発明の一例では、ＲＳＶ株はＲＳＶ−Ａ２株である。

【0061】

本発明によれば、ＲＳＶのＦタンパク質は、ＲＳＶのＦタンパク質の完全長であっても、その断片であってもよい。本発明の一実施形態では、ＲＳＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸など、ＲＳＶ（Ｆ０）のＦタンパク質の完全長をコードする。本発明の一例では、ＲＳＶのＦタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。あるいは、ＲＳＶのＦタンパク質をコードする配列は、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８０％、好ましくは約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％同一である任意の配列であってよい。他の実施形態では、例えば、国際公開第２０１２／０２１７３０号パンフレットの配列番号２、４、５、または６に示されるものなど、コドン最適化された配列を使用することができる。

【0062】

本発明の別の実施形態では、このヌクレオチド配列は、ＲＳＶのＦタンパク質の断片を代替的にコードしてもよい。この断片は、アミノ末端の欠失およびカルボキシ末端の欠失のいずれかまたはその両方から生じるものであってよい。欠失の程度は、例えば組換えアデノウイルスが高収率で得られるように、当業者が決定することができる。この断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片、すなわち、被験体に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択されることになる。これは、当業者にはすべてルーチン的である、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏの方法を使用して容易に決定することができる。本発明の一実施形態では、この断片は、ＲＳＶの膜貫通コード領域短縮のＦタンパク質である（Ｆ０ΔＴＭ、例えば米国特許第２０１１００１４２２０号明細書を参照のこと）。Ｆタンパク質の断片はまた、Ｆタンパク質のＦ１ドメインであっても、Ｆ２ドメインであってもよい。Ｆの断片はまた、中和エピトープおよびＴ細胞エピトープを含有する断片であってもよい（Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｖｉｒｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，２６１−２７５；Ｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ ２５，６２１１−６２２３）。

【0063】

本開示で使用する、数値に対する「約」という用語は、値±１０％を意味する。

【0064】

特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを製造するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを準備するステップと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させるステップと、この組換えアデノウイルスを単離および精製するステップと、この組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に取り込むステップとを含む方法を提供する。

【0065】

組換えアデノウイルスは、周知の方法に従って、調製し宿主細胞中で増殖させることができるが、これにはアデノウイルスを感染させた宿主細胞の細胞培養が必要となる。細胞培養は、付着細胞、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞の培養および懸濁培養を含む、いかなるタイプの細胞培養であってもよい。

【0066】

大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチまたはフェドバッチ工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、また適切にもなっている（例えば、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレットを参照のこと、これらは、大量の組換えアデノウイルスを取得および精製するために適切な方法を記載している）。

【0067】

プロデューサー細胞を培養して、細胞数およびウイルス数、ならびに／またはウイルス力価を増加させる。細胞が代謝および／または増殖および／または分裂および／または本発明による目的ウイルスの産生を行うことが可能になるように、細胞培養を行う。これは、当業者にそれ自体周知の方法により達成することができ、例えば、これに限定されないが、適切な培地中に細胞のための栄養素を供給することを含む。適切な培地は当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコールに従って注文生産することが可能である。培養は、バッチ、フェドバッチ、連続系等を使用して、例えば、ディッシュ、ローラーボトル、またはバイオリアクター中で行うことができる。細胞培養に適した条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），ａｎｄ Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０−４７１−３４８８９−９を参照のこと）。

【0068】

典型的には、アデノウイルスを、培養物中で適切なプロデューサー細胞に曝露し、それによってウイルスの取り込みを可能にする。通常、最適な撹拌は、約５０〜３００ｒｐｍの間、典型的には１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは、２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７の間であり、最適温度は３０〜３９℃の間、例えば３４〜３７℃であり、また最適ＭＯＩは５〜１０００の間、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自然に感染し、プロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させることで、細胞感染には十分である。一般には、アデノウイルスのシードストックを培養物に添加して感染を開始させ、続いてプロデューサー細胞中でアデノウイルスを増殖させる。これはすべて、当業者にはルーチン的である。

【0069】

アデノウイルスが感染した後、ウイルスは細胞内部で複製し、それによって増幅する。これは本明細書においてアデノウイルスの増殖と呼ばれるプロセスである。アデノウイルスが感染すると、最終的に感染細胞の溶解が起こる。したがって、アデノウイルスのこの細胞溶解特性により、ウイルス製造の２つの異なる方式が可能になる。第１の方式は、細胞溶解前に、細胞を溶解させる外部因子を使用してウイルスを回収するものである。第２の方式は、生成したウイルスによって（ほとんど）完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収するものである（例えば、外部因子によって宿主細胞を溶解させることなくアデノウイルスを回収することについて記載している、米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照のこと）。アデノウイルスの回収を目的として、外部因子を使用して細胞を積極的に溶解させることが好ましい。

【0070】

積極的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に公知であり、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５に論じられている。この点に関し有用な方法としては、例えば、凍結融解、固体剪断、高張性および／または低張性溶解、液体剪断、超音波処理、高圧押出、界面活性剤による溶解、上記の組合せ等がある。本発明の一実施形態では、細胞は少なくとも１つの界面活性剤を使用して溶解する。溶解のために界面活性剤を使用することには、それが簡単な方法であり、かつ容易にスケールアップ可能であるという利点がある。

【0071】

使用することができる界面活性剤およびそれらの使用方法は、当業者に一般に公知である。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３に論じられている。界面活性剤としては、アニオン性、カチオン性、両性イオン性、および非イオン性の界面活性剤が挙げられる。界面活性剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変化させることができる。一実施形態では、使用される界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

【0072】

混入している、すなわち大抵はプロデューサー細胞に由来する核酸を除去するために、ヌクレアーゼを使用することができる。本発明で使用するのに適した例示的なヌクレアーゼとしては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、または当技術分野内で一般に使用される他の任意のＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより迅速に核酸を加水分解し、それによって細胞溶解物の粘性を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から商業的に入手することができる。ヌクレアーゼの使用濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。代替的にまたはヌクレアーゼ処理に加えて、アデノウイルスの精製中に、ドミフェン臭化物などの選択的な沈澱剤を使用して、アデノウイルス調製物から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿除去することも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；Ｇｏｅｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照のこと）。

【0073】

プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収するための方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範囲にわたって記載されている。

【0074】

特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスをさらに精製する。アデノウイルスの精製は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０５／０８０５５６号パンフレットに記載されているように、清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、またはクロマトグラフィーによる分離を含むいくつかのステップで実施することができる。清澄化は、細胞溶解物から細胞片および他の不純物を除去する濾過ステップにより行うことができる。限外濾過は、ウイルス溶液を濃縮するために使用される。限外濾過器を使用するダイアフィルトレーションまたは緩衝液交換は、塩、糖等を除去および交換するための方法である。当業者は、各精製ステップの最適条件を見つける方法を知っている。また、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２２５８８号パンフレットは、アデノウイルスベクターの製造および精製のための方法について記載している。この方法は、宿主細胞の増殖、アデノウイルスによる宿主細胞の感染、宿主細胞の回収および溶解、粗溶解物の濃縮、粗溶解物の緩衝液交換、ヌクレアーゼによる溶解物の処理、ならびにクロマトグラフィーを使用するウイルスのさらなる精製を含む。

【0075】

好ましくは、精製には、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが使用される。クロマトグラフィーステップを含む、多くのプロセスがアデノウイルスのさらなる精製のために記載されている。当業者はこれらのプロセスを認識しており、クロマトグラフィーステップを使用するまさにそのやり方を変更して、プロセスを最適化することができる。例えば、アニオンイオン交換クロマトグラフィーステップによりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットおよびＫｏｎｚ ｅｔ ａｌ，２００５，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：１３４６−１３５３を参照されたい。多くの他のアデノウイルス精製法が記載されており、それらは当業者が入手可能な範囲内である。アデノウイルスを製造および精製するためのさらなる方法は、例えば、（国際公開第００／３２７５４号パンフレット；国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット；米国特許第５，８３７，５２０号明細書；米国特許第６，２６１，８２３号明細書；国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット；Ｋｏｎｚ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４３４：１３−２３；Ａｌｔａｒａｓ ｅｔ ａｌ，２００５，Ａｄｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｅｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９９：１９３−２６０）に開示されており、これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる。

【0076】

ヒトへの投与に対して、本発明は、ｒＡｄおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を使用することができる。本発明との関連において、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、その使用される投与量および濃度において、投与されている被験体に何ら望ましくない作用も有害な作用も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照のこと）。精製されたｒＡｄを製剤化して、無菌溶液として投与することが好ましいが、凍結乾燥調製物を利用することも可能である。無菌溶液は、濾過滅菌または当技術分野でそれ自体公知の他の方法により調製される。次いで、その溶液を凍結乾燥するか、または医薬品投与容器に充填する。溶液のｐＨは、一般には、ｐＨ３．０〜９．５の範囲、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ｒＡｄは、典型的には、適切な薬学的に許容可能な緩衝剤を含む溶液中にあり、ｒＡｄのその溶液は塩を含有することもある。任意選択で、アルブミンなどの安定化剤を存在させることもある。特定の実施形態では、界面活性剤を添加する。特定の実施形態では、ｒＡｄは注射可能な調製物に製剤化することができる。これらの製剤は、有効量のｒＡｄを含有し、無菌の溶液、懸濁液、または凍結乾燥形態のいずれかであって、任意選択で安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与のためにエアゾル化することができる（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照のこと）。

【0077】

例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｌｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍａｒｃｈ ２００２，ｐ．４３−４８）にも使用される緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に適した別の有用な製剤用緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、スクロース １０％ｗ／ｖ、ポリソルベート８０ ０．０２％ｗ／ｖである。言うまでもなく、他の多くの緩衝液を使用することができ、精製された（アデノ）ウイルス調製物の保存および医薬投与に適した製剤のいくつかの例は、例えば、欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際特許出願である国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見つけることができる。

【0078】

特定の実施形態では、アデノウイルスを含む組成物は１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。アジュバントは、適用された抗原決定基への免疫応答をさらに増強することが、当技術分野では公知であり、アデノウイルスおよび適切なアジュバントを含む医薬組成物が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレットに開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激薬」という用語は、本明細書において互換的に使用され、免疫系の刺激の原因となる、１つまたは複数の物質として定義される。本発明との関連において、アジュバントは本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を増強するために使用される。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照のこと）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照のこと）；細菌または微生物の派生物（この例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等がある）、が挙げられる。また、例えば、Ｃ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：３８１７−２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントとしてアルミニウムを、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、またはそれらの組合せの形態で、用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有濃度で含む。

【0079】

他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。

【0080】

本発明によるワクチンと組み合わせて、さらなる活性成分を投与することも、本発明によれば可能である。そのようなさらなる活性成分は、例えば、他のＲＳＶ抗原またはそれらをコードする核酸を含むベクターを含むことができる。そのようなベクターは、非アデノウイルス性であってもアデノウイルス性であってもよく、後者は任意の血清型であってよい。他のＲＳＶ抗原の例には、ＲＳＶ Ｇタンパク質またはその免疫学的に活性な部分が含まれる。例えば、Ｇ糖タンパク質の可溶性コアドメイン（アミノ酸１３０〜２３０）を発現する、鼻腔内に適用される組換え複製欠損Ａｄ５ベースのアデノベクターｒＡｄ／３ｘＧは、マウスモデルにおいて防御的であり（Ｙｕ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２：２３５０−２３５７）、筋肉内に適用された場合には、それは防御的でないが、ＲＳＶ Ｇが防御応答の誘導に適した抗原であることはこれらのデータから明らかである。さらなる活性成分はまた、例えばウイルス、細菌、寄生生物などの他の病原体に由来する非ＲＳＶ抗原を含むことができる。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分の配合剤を投与することによって行われてもよい。特定の実施形態では、さらなる非アデノウイルス抗原を（ＲＳＶ．Ｆに加えて）、本発明のベクターにコードすることができる。特定の実施形態では、したがって、２つ以上のタンパク質を単一アデノウイルスから発現させることが望ましい場合があり、そのような場合には、より多くのコード配列を、例えば、単一発現カセットから単一転写物を形成させように連結してもよく、またはアデノウイルスゲノムの異なる部分にクローニングして、２つの別個の発現カセット中に存在させてもよい。

【0081】

アデノウイルス組成物は、被験体、例えばヒト被験体に投与することができる。１回の投与の間に被験体に与えられるアデノウイルスの総用量は、当業者に公知であるように、変動し得るものであり、一般には、１×１０^７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０^１２ｖｐの間、好ましくは１×１０^８ｖｐ〜１×１０^１１ｖｐの間、例えば３×１０^８〜５×１０^１０ｖｐの間、例えば１０^９〜３×１０^１０ｖｐの間である。

【0082】

アデノウイルス組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、注射、例えば皮内、筋肉内等、または皮下投与、経皮投与、または粘膜投与、例えば鼻腔内、口腔内等によるものなど、非経口投与が挙げられる。鼻腔内投与は、一般に、ＲＳＶに対するワクチンの好ましい経路と見なされている。生鼻腔内法の最も重要な利点は、局所呼吸器免疫の直接刺激および付随する疾患増強の欠如である。小児用法のために臨床評価中の唯一のワクチンは、現時点では、生鼻腔内ワクチンである（Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｍｕｒｐｈｙ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）．於：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４：Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ（Ｅｄ．Ｃａｎｅ，Ｐ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ２３３−２７７）。鼻腔内投与は、本発明によれば同様に適切な好ましい経路である。しかしながら、本発明によれば、ワクチンを筋肉内投与することが特に好ましい。というのは、驚くべきことに、他のアデノウイルス血清型に基づく、以前に報告された筋肉内ＲＳＶワクチンと異なり、本発明によるワクチンを筋肉内投与すると、コットンラットの鼻および肺におけるＲＳＶ複製が防止されることが見出されたからである。筋肉内投与の利点は、それが簡単でかつ確立されており、６ヶ月未満の幼児における鼻腔内適用に関する安全性の懸念を伴わないことである。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により、例えば、腕の三角筋または腿の外側股筋に投与される。当業者は、組成物、例えばワクチンを、ワクチン中の抗原に対して免疫応答を誘導するように投与するための種々の実行可能な手段を知っている。

【0083】

本明細書で使用する被験体は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、被験体はヒト被験体である。被験体は、例えば約１ヶ月齢〜１００歳、例えば約２ヶ月齢〜約８０歳、例えば約１ヶ月齢〜約３歳、約３歳〜約５０歳、約５０歳〜約７５歳など、いかなる年齢であってもよい。

【0084】

また、本発明の１つまたは複数のアデノウイルスワクチンを１回または複数回追加免疫投与することも可能である。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に被験体に組成物を投与した後（このような場合には、「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年の間、好ましくは２週〜４ヶ月の間の時期に同じ被験体に投与することになる。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば、異なる血清型の１つもしくは複数のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を、初回ワクチン接種の後に、被験体に投与することも可能である。例えば、本発明による組換えアデノウイルスベクターを初回免疫として被験体に投与し、かつＲＳＶ Ｆタンパク質を含む組成物により追加免疫を行うことが可能である。

【0085】

特定の実施形態では、投与は初回免疫および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。これに関する特定の実施形態では、初回免疫投与は、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸を含むｒＡｄ３５（「ｒＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆ」）によるものであり、追加免疫投与は、本発明によるＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含むｒＡｄ２６（「ｒＡｄ２６−ＲＳＶ．Ｆ」）によるものである。これに関する他の実施形態では、初回免疫投与はｒＡｄ２６−ＲＳＶ．Ｆによるものであり、追加免疫投与はｒＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆによるものである。他の実施形態では、初回免疫投与および追加免疫投与は両方とも、ｒＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによるものである。特定の実施形態では、初回免疫投与はｒＡｄ２６−ＲＳＶ．Ｆによるものであり、追加免疫投与はＲＳＶ Ｆタンパク質によるものである。これらのすべての実施形態において、同じまたは他のベクターもしくはタンパク質による、さらなる追加免疫投与を行うことが可能である。ＲＳＶ Ｆタンパク質による追加免疫が特に有益となり得る実施形態には、例えば、５０歳以上のリスク群（例えば、ＣＯＰＤまたは喘息に罹患）の高齢被験体、または例えば６０歳以上または６５歳以上の健常被験体が含まれる。

【0086】

特定の実施形態では、投与は、本発明による組換えアデノウイルスの単回投与を含み、さらなる（追加免疫）投与は行わない。そのような実施形態は、初回免疫−追加免疫レジメンに比較して、単回投与レジメンで複雑さおよび費用が軽減されることを考慮すると、有利である。本明細書の実施例のコットンラットモデルにおいて、追加免疫投与を行わなくても、本発明の組換えアデノウイルスベクターを単回投与した後に、防御が完全になされることがすでに観察されている。

【0087】

本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、本発明を何ら限定するものではない。実施例は、本発明を単に明確にするためのものである。

【実施例】

【0088】

実施例１．アデノウイルスベクターの調製
Ａｄ３５およびＡｄ２６のＥ１領域へのＲＳＶ Ｆ遺伝子のクローニング：
Ａ２株の天然ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードするＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣＯ８３３０１．１）は、ヒト発現のために最適化された遺伝子であり、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成された。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ’３）を、ＡＴＧ開始コドンの直前に含め、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ ＴＡＡ’３）をＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔコード配列の末端に付加した。ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミドおよびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミドに挿入した。得られたプラスミドのｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔおよびｐＡｄＡｐｔ２６．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔを、図１５に示す。Ｆタンパク質のアミノ酸配列およびそのアミノ酸配列をコードするコドン最適化配列をそれぞれ、配列番号１および２として表１に示す。

【0089】

細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：１９０９−１９１７）を、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。

【0090】

アデノウイルスの生成、感染、および継代：
アデノウイルスはすべて、以前に記載されたように、単一相同組換えによりＰＥＲ．Ｃ６細胞中に生成し、産生させた。（ｒＡｄ３５については：Ｈａｖｅｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；ｒＡｄ２６については：Ａｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４６５４−４６６３）。手短に言えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に、製造業者（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、Ａｄベクタープラスミドをトランスフェクトした。ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ導入遺伝子発現カセットを担持するＡｄ３５ベクターのレスキューについては、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔプラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用し、一方、ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ導入遺伝子発現カセットを担持するＡｄ２６ベクターについては、ｐＡｄＡｐｔ２６．ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔプラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用した。細胞を、完全なＣＰＥの１日後に回収し、凍結融解し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。次に、ウイルスをプラーク精製し、多重ウェル２４組織培養プレートの単一ウェル上で培養したＰＥＲ．Ｃ６中で増幅した。さらなる増幅を、Ｔ２５組織培養フラスコおよびＴ１７５組織培養フラスコを使用して培養したＰＥＲ．Ｃ６中で実施した。Ｔ１７５粗溶解物のうちの３〜５ｍｌを使用して、７０％コンフルエント層のＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有する２０×Ｔ１７５三層組織培養フラスコに接種した。ウイルスを、２段階ＣｓＣｌ精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−８５℃に保存した。

【0091】

実施例２．組換えアデノウイルス血清型２６および３５を使用する、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＳＶ Ｆに対する免疫の誘導
これは、組換えアデノウイルス血清型（Ａｄ２６）および組換えアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）がＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＲＳＶの糖タンパク質Ｆ抗原に対する免疫を誘導する能力を検討する実験である。

【0092】

この試験では、５匹マウスの実験群に動物を分配した。完全長のＲＳＶ Ｆ遺伝子を担持するＡｄ２６もしくはＡｄ３５（Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦもしくはＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆ）または導入遺伝子を担持しないＡｄ２６もしくはＡｄ３５（Ａｄ２６ｅもしくはＡｄ３５ｅ）の単回投与で動物を免疫処置した。１０^１０〜１０^８ウイルス粒子（ｖｐ）の範囲にある、ｒＡｄの３つの１０倍段階希釈を、筋肉内投与した。対照として、空のベクターＡｄ２６ｅを３匹の動物からなる１群に投与し、空のベクターＡｄ３５ｅを１群に投与した。

【0093】

脾臓中のＦタンパク質特異的なＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の相対数を決定するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、基本的に、Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１７（１１）：１６８７−９４）に記載されるように行った。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける脾細胞の刺激については、ＲＳＶ Ｆ（Ａ２）タンパク質の全体配列にかかって、１１個のアミノ酸がオーバーラップする１５アミノ酸長のペプチドからなる２つのペプチドプールを使用した。１０^６細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の数を算出する。

【0094】

抗体価を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。このために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、２５μｇ／ｍｌのＲＳＶ Ｌｏｎｇ全体不活化抗原（Ｖｉｒｉｏｎ Ｓｅｒｉｏｎ、カタログ番号ＢＡ１１３ＶＳ）でコーティングした。希釈した血清試料をプレートに添加し、ＲＳＶに対するＩｇＧ抗体を、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｅ０４１３）を使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯ）−コンジュゲートストレプトアビジン（ＳＡ）による検出を使用して測定した。力価は、５０倍希釈ナイーブ血清に由来する１．５×ＯＤシグナルをカットオフとして使用して、一次補間により算出した。マウス血清における、ＲＳＶ特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の力価を、ＰＯ標識抗マウスＩｇＧ１およびＰＯ標識抗マウスＩｇＧ２ａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、カタログ番号１０７０−０５および１０８０−０５）を使用して測定した。これらの抗体はサブクラスを定量するために使用した。

【0095】

抗体のウイルス中和活性（ＶＮＡ）は、マイクロ中和アッセイにより測定し、基本的に、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ． １９９９ Ｊｕｌ；１８０（１）：３５−４０）によって記載されるように行った。ＲＳＶ感受性ＶＥＲＯ細胞を、感染１日前に９６ウェル細胞培養プレートに播種した。感染日に、段階希釈した血清および対照を、１２００ｐｆｕのＲＳＶ（ＬｏｎｇまたはＢ１）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、ウイルス／抗体混合物を、ＶＥＲＯ細胞単層を含有する９６ウェルプレートに移した。３日後に、単層を８０％氷冷アセトンで固定し、ＲＳＶ抗原を抗Ｆモノクローナル抗体により測定した。中和力価は、ウイルスのみの対照ウェルからのＯＤ４５０を５０％減少させる血清稀釈度（ｌｏｇ_２）（ＩＣ_５０）として表す。

【0096】

初回免疫後２週目および８週目に、動物を屠殺し、細胞性応答および体液性応答を上記に記載するようにモニターした。

【0097】

図１は、Ａｄ２６−ＲＳＶ．Ｆ（図１Ａ）およびＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆ（図１Ｂ）のすべての用量が良好な細胞性免疫応答を誘導するのに効果的であり、またこの応答が時間を通して安定であったことを示す。Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５−ＲＳＶ．ＦのいずれかによるＴ細胞応答に対して、ベクター用量による有意差は観察されなかった。

【0098】

図２は、上記と同じ実験における抗体価を示す。両方のベクターとも、極めて明確な時間および用量依存的なＥＬＩＳＡ力価の増加を誘導した（図２）。抗Ｆ力価は、２週目から８週目にかけて明らかに増加し、１０^１０用量の場合には有意であった。８週目には、Ａｄ２６−ＲＳＶ．Ｆベクター間またはＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆベクター間の力価に差はなかった。

【0099】

Ｆ特異的ＩｇＧのサブクラス分布（ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａ）を、Ｔｈ１対Ｔｈ２応答のバランスを評価するために測定した。歪んだＴｈ２／Ｔｈ１応答は、ホルマリン不活化ＲＳＶで見られるように、ＲＳＶ疾患のワクチン増強を発現させる素因を動物に与える。図３に示すように、Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆの両方について、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は１以上である。これにより、アデノベクターＡｄ２６−ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆは、Ｔｈ２タイプの応答よりもＴｈ１タイプの応答を示すことが強く示される。

【0100】

図４は、抗体価に使用したものと同じ血清のウイルス中和力価（ＶＮＡ）を示す。Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦおよびｒＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置により、中和抗体価が誘導された。ＶＮＡ力価は、１０^１０ｖｐを投与されたマウスにおいて、初回免疫後２週目から８週目の間に顕著に増加した。８週目では、１０^１０ｖｐを投与されたマウスにおいて、Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦベクターとＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆベクターとの間に力価の差はなかった。

【0101】

これらの免疫処置実験から、ＲＳＶ．Ｆ導入遺伝子を包含するＡｄ３５ベクターおよびＡｄ２６ベクターは、ＲＳＶ．Ｆに対して強力な細胞性応答および体液性応答を誘導することが明らかである。

【0102】

実施例３．ＲＳＶ．Ｆをコードする組換えアデノウイルスベクターを使用する異種初回免疫−追加免疫後のＲＳＶ．Ｆに対する免疫
この試験は、２つの異なる血清型に由来するアデノウイルスベクターに基づく初回免疫−追加免疫レジメンがＲＳＶ．Ｆに対する免疫を誘導する能力を検討するように計画した。

【0103】

この試験には、８匹マウスの実験群に分配されたＢＡＬＢ／ｃマウスが含まれた。ＲＳＶ Ａ２に基づく／由来するＲＳＶ．Ｆ遺伝子の野生型配列を担持する（Ａｄ−ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆ）か、または導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅまたはＡｄ３５ｅ）１０^１０ｖｐによる筋肉内注射によって、動物を免疫処置した。動物の１群は、ある週にＡｄ２６−ＲＳＶ．Ｆにより初回免疫し、４週目にＡｄ３５ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５ｅにより追加免疫した。動物の別の群は、Ａｄ３５−ＲＳＶ．Ｆにより初回免疫し、４週目にＡｄ２６−ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ２６ｅにより追加免疫した。動物の対照群は、Ａｄ３５ｅにより初回免疫し、４週目にＡｄ２６ｅにより追加免疫した。初回免疫後６週目および１２週目の各時点で、８匹の動物を屠殺し、細胞性応答および体液性応答を、当業者に周知され、上記に記載される免疫学的アッセイによりモニターした。

【0104】

図５は、初回免疫処置後６および１２週目の細胞性応答を示す。初回免疫後６週目（および追加免疫後２週目）に、Ｔ細胞応答に対するＡｄ２６−ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆの両方による顕著な追加免疫効果が測定され、Ｔ細胞応答の大きさは、初回免疫−追加免疫における、Ａｄ２６−ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置の順序には依存しなかった。初回免疫後１２週目（および追加免疫後８週目）に、Ａｄ２６−ＲＳＶ．Ｆで初回免疫されたマウスは、ｒＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆで初回免疫された動物に匹敵して、初回免疫のみおよび初回免疫−追加免疫された動物のいずれにおいても、Ｆ特異的Ｔ細胞のレベルを高く維持していた。全体として、Ｆ特異的リンパ球（ＳＦＵ）の数は、ｒＡｄ２６−ＲＳＶ．ＦまたはｒＡｄ３５−ＲＳＶ．Ｆ（初回免疫／または初回免疫−追加免疫）のいずれかで免疫処置されたすべての動物において、少なくとも１２週間高くかつ安定であった。

【0105】

図６は、アデノウイルスベクターによる初回免疫−追加免疫ワクチン接種後の種々の時点における体液性応答を示す。Ａｄ３５．ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆは、同等によく抗原刺激し、Ｂ細胞応答に対する、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはｒＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆのいずれかによる顕著な追加免疫効果が誘導されることが示された。さらに、異種初回免疫−追加免疫におけるＢ細胞応答の大きさは、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置の順序には依存せず、追加免疫後、ＥＬＩＳＡ力価は１２週間安定していた。

【0106】

図７は、初回免疫−追加免疫処置後の種々の時点におけるウイルス中和抗体価を示す。Ａｄ３５．ＲＳＶ．ＦベクターおよびＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターは両方とも、ＥＬＩＳＡ力価について観察されるように、同等によく抗原刺激した。また、異種初回免疫−追加免疫後のＶＮＡ力価の増加は、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置の順序に依存しなかった。ＶＮＡ力価に対する、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆのいずれかによる追加免疫効果は、いずれの時点でも顕著であり、６週目ですでに最大であった。Ａｄ．ＲＳＶ．Ｆによる初回免疫のみを受けた群は、６週目に比較して、１２週目でＶＮＡ力価が増大していた。アデノウイルスベクター構築物におけるＲＳＶ Ｆ配列は、ＲＳＶ Ａ２分離株に由来するものである。本出願に記載する中和アッセイは、ＲＳＶ亜群Ａに属するＲＳＶ Ｌｏｎｇ株に基づくものであり、Ｆ（Ａ２）により誘導された抗体は、異なるＲＳＶ Ａ株亜型を交差中和可能であることが実証される。

【0107】

ＲＳＶ Ｆタンパク質はＲＳＶ分離株中によく保存されているので、Ａｄ−ＲＳＶ．Ｆベクターにより免疫処置された動物に由来する血清が、原型のＲＳＶ Ｂ株分離株であるＲＳＶ Ｂ１を交差中和することができるか否かを試験した。図８に示すように、免疫処置されたマウスの血清は、Ｂ１株も交差中和することができた。ＲＳＶ Ｂ１を交差中和する能力は、初回免疫のみの群で使用されたベクターにも、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦベクターおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆベクターによる初回免疫−追加免疫処置の順序にも依存しなかった。

【0108】

まとめると、これらのデータから、初回免疫−追加免疫レジメンでは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置を逐次的に行うと、強力な体液性応答および細胞性応答が誘導されること、またこの体液性免疫応答にはＲＳＶ ＡおよびＢ亜型の両方の分離株を中和する能力が含まれることがわかる。

【0109】

実施例４．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクターを使用する、ＲＳＶ感染に対する防御の誘導
この実験は、２つの異なる血清型に由来するアデノウイルスに基づく初回免疫−追加免疫レジメンが、コットンラットにおいて、ＲＳＶチャレンジ複製に対する防御を誘導する能力を検討するために行った。コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）は、ＲＳＶによる上気道および下気道の感染を両方とも受けやすく、マウス系統よりも少なくとも５０倍許容性があることが見出されていた（Ｎｉｅｗｉｅｓｋ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．３６（４）：３５７−７２）。さらに、コットンラットは、ＲＳＶ候補ワクチン、抗ウイルス薬、および抗体の効力および安全性を評価する主要なモデルになっている。コットンラットモデルにおいて作成された前臨床データにより、２つの抗体製剤（ＲｅｓｐｉＧａｍ（登録商標）およびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標））の開発が、非ヒト霊長類における中間試験を必要とすることなく、臨床試験に進んだ。

【0110】

この試験では、８匹コットンラットの実験群それぞれにコットンラットを登録した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆ）か、または導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅまたはＡｄ３５ｅ）アデノウイルスベクターを１０^９ウイルス粒子（ｖｐ）または１０^１０ｖｐ筋肉内注射することにより、動物を免疫処置した。２８日後に、同じベクター（同種初回免疫−追加免疫）または他のアデノウイルス血清型（異種初回免疫−追加免疫）のいずれかによって、同じｖｐ用量で動物を追加免疫し；対照群は、１用量（１０^１０）のみを適用したこと以外は準じて、Ａｄ−ｅベクターにより免疫処置した。対照群は６匹の動物からなった。ＲＳＶウイルスによる一次感染が、二次チャレンジ複製を防御することが知られているので、ＲＳＶ Ａ２（１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ））を鼻腔内に感染させた動物を、チャレンジ複製に対する防御の陽性対照として使用した（Ｐｒｉｎｃｅ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）。さらに、ホルマリン不活化ＲＳＶ（ＦＩ−ＲＳＶ）を、組織病理学的疾患のワクチン増強に対する対照とした。２回目の免疫処置（追加免疫）の３週間後に、コットンラットに、プラーク精製された１×１０^５ｐｆｕのＲＳＶ Ａ２を鼻腔内チャレンジした。対照として、コットンラットの１群では、免疫処置は行わないが、チャレンジウイルスは投与し、別の対照群では、免疫処置もチャレンジも行わなかった。ＲＳＶチャレンジウイルスの力価がピークに達する時点である感染後５日目に（Ｐｒｉｎｃｅ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）、コットンラットを屠殺し、肺および鼻のＲＳＶ力価をウイルスプラーク力価測定により決定した（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．１９７８，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９３，７１１−７９１）。

【0111】

図９は、肺および鼻において高いＲＳＶウイルス力価、それぞれ５．３＋／−０．１３ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／グラムおよび５．４＋／−０．３５ ｌｏｇ_１０ｐｆｕが、非免疫処置対照および導入遺伝子のないアデノウイルスベクターを投与された動物で観察されたことを示す。これに対して、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターおよび／またはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆベクターによる初回免疫−追加免疫処置を受けた動物からの肺および鼻の組織には、用量にもレジメンにも依存することなく、チャレンジウイルスを検出することができなかった。

【0112】

これらのデータから、Ａｄ３５ベースのベクターおよびＡｄ２６ベースのベクターが、コットンラットモデルにおいて、ＲＳＶチャレンジ複製に対して完全な防御を与えることが明確に実証される。これは驚くべきことである。というのは、ＲＳＶ ＦをコードするＡｄ５ベースのアデノウイルスベクターは、筋肉内投与後に動物モデルにおいて完全な防御を誘導することができないことが知られているからである。

【0113】

実験の過程において、血液試料を、免疫処置前（０日目）、追加免疫処置前（２８日目）、チャレンジ日（４９日目）、および屠殺日（５４日目）に採取した。Ｐｒｉｎｃｅ（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．１９７８，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９３，７１１−７９１）により記載されるように、全身性ＲＳＶ特異的中和抗体の誘導に関する、プラークアッセイベースの中和アッセイ（ＶＮＡ）で、血清を試験した。中和力価は、ウイルスのみの対照ウェルからのものと比較して、プラークを５０％減少させる血清希釈度（ｌｏｇ_２）として表す。

【0114】

図１０は、対照動物が２８日目および４９日目にウイルス中和抗体を有していないこと、一方Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦベクターまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆベクターにより動物が初回免疫された後、高いＶＮＡ力価が誘導されることを示す。ＶＮＡ力価の穏やかな増加が追加免疫処置後に観察される。ＲＳＶ Ａ２ウイルスによる一次感染では、時間につれて徐々に増加するかなり穏やかなＶＮＡ力価がもたらされた。

【0115】

Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦワクチンまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦワクチンがＲＳＶ Ａ２によるチャレンジ後に、疾患を悪化させる可能性があるか否かを評価するために、肺の組織病理学的分析を感染後５日目に実施した。肺を摘出し、ホルマリンで潅流し、切片化し、組織学的検査のためにヘマトキシリン‐エオジンで染色した。組織病理学スコアは、Ｐｒｉｎｃｅ（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）により公開された基準に従って、盲検化して評価し、以下のパラメーター：細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、および肺胞炎ついてスコア化した。図１１は、この実験の肺病理のスコアリングを示す。ＲＳＶチャレンジの後、ＦＩ−ＲＳＶで免疫処置された動物は、ｍｏｃｋで免疫処置されチャレンジされた動物に比較して、検査したすべての組織病理学的パラメーターに関して、組織病理の亢進を示した。これは以前に公開された研究（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）に基づくと予測されることであった。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆで免疫処置された動物の組織病理学的スコアは、ｒＡｄ−ｅまたはｍｏｃｋで免疫処置された動物と比較して、同様であったが、ｒＡｄ−ＲＳＶ．Ｆで免疫処置された動物の血管周囲炎はわずかに低いように見えた。したがって、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦワクチンおよびＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆワクチンは、ＦＩ−ＲＳＶワクチンと異なり、疾患の増強をもたらさなかった。

【0116】

すべてのワクチン接種法は、ＲＳＶチャレンジ複製に対して完全な防御をもたらし、強力なウイルス中和抗体を誘導し、しかも病理の増強は観察されなかった。

【0117】

実施例５．単回免疫処置後における、種々の投与経路を使用するｒＡｄベクターの防御効果
この試験は、ＲＳＶ．ＦをコードするＡｄ２６ベクターまたはＡｄ３５ベクターにより誘導される防御効果に対する投与経路の影響を検討するものである。ワクチンは、筋肉内または鼻腔内に投与した。

【0118】

導入遺伝子としてＲＳＶ Ｆを担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆ）か、または導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６−ｅまたはＡｄ３５−ｅ）Ａｄ２６またはＡｄ３５の１×１０^９または１×１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）により０日目に単回免疫処置を受けたコットンラットを、４９日目に１０^５ＲＳＶ ｐｆｕでチャレンジし、５４日目に屠殺した。

【0119】

図１２は、肺および鼻のチャレンジウイルスを測定した実験結果を示す。免疫処置されなかったか、または導入遺伝子を含まないアデノウイルスで免疫処置されたラットからの肺および鼻に、それぞれ４．９＋／−０．２２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／グラムおよび５．４＋／−０．１６ ｌｏｇ_１０ｐｆｕの高いＲＳＶウイルス力価を検出した。これに対して、Ａｄ３５ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ２６−ＲＳＶ．Ｆのいずれかを投与された動物からの肺および鼻では、投与経路および用量に依存することなく、チャレンジウイルスの複製はなかった。

【0120】

これらのデータから、驚くべきことに、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＡｄ２６ベースのベクターおよびＡｄ３５ベースのベクターのそれぞれが、ベクターの投与経路に依存することなく、コットンラットチャレンジ実験において、完全な防御を与えることが実証される。このことは、他の血清型に基づいた、公開されたアデノウイルスベースのＲＳＶワクチンの中で、筋肉内ワクチン接種後に完全な防御が実証されたものはないので、予測されることではなかった。

【0121】

この実験期間中、免疫処置前（０日目）、免疫処置後４週目（２８日目）、およびチャレンジ日（４９日目）に血液試料を採取した。この血清を、ＲＳＶ特異的抗体の誘導に関する中和テストで試験した（図１３）。免疫処置前には、ウイルス中和抗体はいずれのコットンラットにも検出されなかった。すべてのアデノウイルスベクター免疫処置法により、投与経路に依存することなく、高いＶＮＡ力価が明らかに誘導され、時間を通して安定に存在した。これらのデータから、驚くべきことに、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＡｄ２６ベースのベクターおよびＡｄ３５ベースのベクターのそれぞれが、ベクターの投与経路に依存することなく、コットンラット免疫処置実験において、ウイルス中和抗体の高い力価を与えることが実証される。

【0122】

Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦワクチンまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆワクチンの単回免疫処置により、ＲＳＶ Ａ２によるチャレンジ後に、ワクチンが疾患を増強させる可能性があるか否かを評価するために、肺の組織病理学的分析を感染後５日目に実施した（図１４）。上記の初回免疫−追加免疫処置実験で観察されたように、ｒＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはｒＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆによる単回免疫処置では、ｒＡｄ−ｅまたはｍｏｃｋで免疫処置された動物に比較して、ｒＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはｒＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆで免疫処置された動物に同様の免疫病理学的スコアがもたらされた。明らかに、ＦＩ−ＲＳＶで初回免疫された動物とは対照的に、疾患の悪化は観察されなかった。ｒＡｄベクターで免疫処置された動物の組織病理学的スコアは、ｍｏｃｋ感染動物と同等であった。

【0123】

結論として、すべての単回投与ワクチン接種法が、ＲＳＶチャレンジ複製に対する完全な防御をもたらし、強力なウイルス中和抗体を誘導し、しかも病理の増強を示さなかった。

【0124】

実施例６．ＲＳＶ Ｆの断片などの変種を含むベクター、または代替プロモーターを含むベクターが、同様の免疫原性を示す
上記の実施例は、野生型ＲＳＶ Ｆを発現するベクターによって行われたものである。他のＦの短縮形態または修飾形態をｒＡｄ３５中に構築し、アデノウイルスベクター中にＲＳＶ Ｆの断片がある実施形態を提供する。これらのＦの短縮形態または修飾形態には、細胞質ドメインおよび細胞膜貫通領域が欠損している（すなわち、外部ドメイン断片のみが残存している）ＲＳＶ−Ｆの短縮形態、ならびに細胞質ドメインおよび細胞膜貫通領域の短縮と、外部ドメイン中のさらなる内部欠失と、三量体形成ドメインの付加とを含むＲＳＶ−Ｆの断片形態が含まれる。これらのベクターは、完全長のＦタンパク質を含むｒＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆを超えて応答を改善することはなかった。

【0125】

加えて、野生型ＲＳＶ Ｆの発現を駆動する種々の代替プロモーターを含む他のｒＡｄ３５ベクターを構築した。

【0126】

ＲＳＶ．Ｆの修飾形態およびプロモーター変種の免疫原性をマウスモデルで比較し、野生型Ｆを発現するＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆと比較した。これらのＦ変種またはプロモーター変種を包含するすべてのＡｄ３５ベクターは、Ａｄ３５．ＲＳＶ．Ｆと同じ桁の大きさの応答を示した。

【0127】

実施例７．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、ＲＳＶ感染に対する短期間防御
この実験は、コットンラットモデルにおいて、ＲＳＶ−Ｆタンパク質を発現するアデノウイルスベクターによる防御が迅速に開始する可能性を判定するものである。この目的のために、完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）か、導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅ）アデノウイルスベクターを１０^７、１０^８、または１０^９ウイルス粒子（ｖｐ）で単回ｉ．ｍ．注射することにより、０日目または２１日目に、コットンラットを免疫処置した。ＲＳＶウイルスによる一次感染が、二次的なチャレンジ複製を防御することが知られているので、ＲＳＶ Ａ２（１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ））を鼻腔内に感染させた動物を、チャレンジ複製に対する防御の陽性対照として使用した（Ｐｒｉｎｃｅ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）。免疫処置後４９日目、７週目、または４週目に、コットンラットに、プラーク精製された１×１０^５ｐｆｕのＲＳＶ Ａを鼻腔内チャレンジした。ＲＳＶチャレンジウイルスの力価がピークに達する時点である感染後５日目に（Ｐｒｉｎｃｅ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）、コットンラットを屠殺し、肺および鼻のＲＳＶ力価をウイルスプラーク力価測定により決定した（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．１９７８，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９３，７１１−７９１）。図１６Ａおよび図１６Ｂは、肺および鼻において高いＲＳＶウイルス力価、それぞれ４．８＋／−０．１１ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／グラムおよび５．１＋／−０．３２ ｌｏｇ_１０ｐｆｕ／グラムが、導入遺伝子のないアデノウイルスベクターを投与された動物で観察されたことを示す。これに対して、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターによる免疫処置を受けた動物からの肺および鼻では、免疫処置とチャレンジとの間の時間に依存することなく、チャレンジウイルスを検出することができなかった。この実験から、ＲＳＶ−Ｆを発現するＡｄ２６による、チャレンジウイルス複製に対する防御が迅速に開始されることが明確に示される。免疫処置されたコットンラットから、０日目、２８日目、およびチャレンジ日（４９日目）に血液試料を採取した。この血清を、ＲＳＶ特異的抗体の誘導に関する中和テストで試験した（図１７）。アデノウイルスベクターによる免疫処置は、用量依存的なＶＮＡ力価を誘導した。図１８は、対照動物が２８日目および４９日目にウイルス中和抗体を有していないこと、一方、１０^７〜１０^９Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ ｖｐによる免疫処置後２８日目または４９日目に、動物に高いＶＮＡ力価が誘導されることを示す。ＲＳＶ Ａ２ウイルスによる一次感染では、時間につれて徐々に増加するかなり穏やかなＶＮＡ力価がもたらされた。この実験から、ＲＳＶ−Ｆを発現するＡｄ２６による、チャレンジウイルス複製に対する防御が迅速に開始されることが明確に示される。

【0128】

実施例８．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、ＲＳＶ亜群Ａおよび亜群Ｂ感染に対する防御
ＲＳＶ株は、２つの亜群、すなわちＡ亜群およびＢ亜群に分けることができる。この亜群分類は、高度に可変なＧ糖タンパク質の抗原性の差に基づいている。Ｆタンパク質の配列は、高度に保存されているが、同様に、同じＡ亜群およびＢ亜群に分類することができる。実施例３では、Ａｄ−ＲＳＶ．Ｆベクターで免疫処置されたマウスの血清が、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＢ１株も交差中和できることが記載された。図１９は、Ａｄ２６．ＲＳＶ−Ｆ_Ａ２で免疫処置されたコットンラットに由来するコットンラット血清が、免疫処置後４９日目に、ＲＳＶ−Ａ Ｌｏｎｇ（亜群Ａ）およびＢｗａｓｈ（亜群Ｂ、ＡＴＣＣ＃１５４０）に対して高いＶＮＡ力価を示すことを明確に示す。次いで、亜群ＡまたはＢチャレンジのいずれかに対するｉｎ ｖｉｖｏ防御を、１０^６〜１０^８ｖｐの範囲の低用量アデノウイルスを使用して、コットンラットで測定した。この目的のために、コットンラットを、８匹コットンラットの実験群それぞれに分配した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）か、または導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅ）アデノウイルスベクターを１０^６、１０^７、または１０^８ウイルス粒子（ｖｐ）で筋肉内注射することにより、０日目に動物を免疫処置した。４９日目に、１０＾５ ｐｆｕのＲＳＶ−Ａ２（ＲＳＶ−Ａ株）またはＲＳＶ−Ｂ １５／９７（ＲＳＶ−Ｂ株）のいずれかで、動物にｉ．ｎ．チャレンジした。図２０は、肺および鼻において高いＲＳＶウイルス力価が、導入遺伝子を含まないアデノウイルスベクターを投与された動物で観察されたことを示す。これに対して、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置を受けた動物からの肺および鼻組織には、まったく検出されないかまたは限定的にしかチャレンジウイルスを検出することができなかった。ＲＳＶ−Ａ２またはＲＳＶ−Ｂ １５／９７のいずれかでチャレンジされた場合の防御に関して、ほんのわずかな差しか観察されなかった。１０^８および１０^７ｖｐ用量を使用した場合、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ_Ａ２は、肺チャレンジ複製に対して完全な防御を示し、１０^６ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ_Ａ２においては、例外的に限定的な防御突破が見られた。同様の傾向は、鼻チャレンジウイルス複製に対する防御にも見られたが、対照群よりも低いけれども、部分的な防御突破が、１０^６および１０^７ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ_Ａ２において、すべての動物について観察された（図２１）。実験期間中、血液試料をチャレンジ日（４９日目）に採取した。この血清を、ＲＳＶ特異的抗体の誘導に関する中和テストで試験した（図２２）。この実施例から、１０^６〜１０^８ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶの低用量において、アデノウイルスベクターが、ＲＳＶ Ａ２に対して用量応答的なＶＮＡ力価を示すことが実証される。免疫処置前には、ウイルス中和抗体はいずれのコットンラットにも検出されなかった。

【0129】

Ａｄ３５．ＲＳＶ．Ｆが１０^８ｖｐの用量において、鼻チャレンジ実験で一部防御突破を示したので、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆは、Ａｄ３５．ＲＳＶ．Ｆよりもいくぶん優れていることが判明した。

【0130】

実施例９．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、ＲＳＶ−Ａ２の高チャレンジ用量に対する防御
この実施例では、１×１０^５ｐｆｕ ＲＳＶ−Ａ２の標準用量に比較して、５×１０^５ｐｆｕの高チャレンジ用量に対する防御について判定する。この試験では、８匹コットンラットの実験群それぞれにコットンラットを登録した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）か、または導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅ）アデノウイルスベクターを、１０^７または１０^８ウイルス粒子（ｖｐ）で単回筋肉内注射することにより、０日目に動物を免疫処置した。ＲＳＶ Ａ２（１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ））により鼻腔内感染させた動物を、チャレンジ複製に対する防御の陽性対照として使用した。コットンラットを感染後５日目に屠殺し、肺および鼻のＲＳＶ力価をウイルスプラーク力価測定により決定した。図２３は、標準チャレンジ用量に比較して、より高いチャレンジ用量により、導入遺伝子を含まないアデノウイルスベクターを投与された動物において、より高い肺ウイルス負荷が誘導されることを示す。１０^７または１０^８ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターによる免疫処置を受けた動物では、肺において、高ＲＳＶチャレンジ力価および標準ＲＳＶチャレンジ力価に対する防御が完全であった。図２４は、１０^８ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターにより免疫処置を受けた動物では、鼻において、高ＲＳＶチャレンジ力価および標準ＲＳＶチャレンジ力価に対する防御が完全であったが、一方、１０^７ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターにより免疫処置を受けた動物では、高ＲＳＶチャレンジ力価および標準ＲＳＶチャレンジ力価に対する防御が部分的であったことを示す。

【0131】

実施例１０．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、ＲＳＶ−Ａ２およびＲＳＶ−Ｂ１５／９７に対する長期間防御
この実施例では、コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、ＲＳＶ−Ａ２およびＲＳＶ−Ｂ１５／９７に対する防御の持続性を判定する。この試験では、６匹コットンラットの実験群それぞれにコットンラットを登録した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）か、導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅまたはＡｄ３５ｅ）アデノウイルスベクターを１０^８ウイルス粒子（ｖｐ）または１０^１０ｖｐで筋肉内注射することにより、動物を免疫処置した。２８日後に、同じベクター（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）（同種初回免疫−追加免疫）またはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆアデノウイルスベクター（異種初回免疫−追加免疫）のいずれかによって、同じｖｐ用量で動物を追加免疫し；対照群は、１用量（１０^１０）のみを適用したこと以外は準じて、Ａｄ−ｅベクターにより免疫処置した。一部の群は追加免疫処置を受けなかった。対照群は６匹の動物からなった。ＲＳＶ Ａ２およびＢ１５／９７（１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ））により鼻腔内感染させた動物を、チャレンジ複製に対する防御の陽性対照として使用した。チャレンジは初回免疫処置後２１０日目に行った。

【0132】

図２５は、肺および鼻において高いＲＳＶウイルス力価が、導入遺伝子を含まないアデノウイルスベクターを投与された動物で観察されたことを示す。これに対して、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆおよび／またはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置を受けた動物からの肺組織には、チャレンジウイルスを検出することができなかった。Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆおよび／またはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置を受けた動物からの鼻孔組織には、ＲＳＶ−Ａ２チャレンジウイルスを検出することができなかった。ＲＳＶ−Ｂ１５／９７によるチャレンジでは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆで初回免疫され、その後に１０^１０ｖｐのＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆで追加免疫された動物を除いて、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆおよび／またはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆによる免疫処置を受けた動物の鼻孔組織には、ウイルス複製が限定的に誘導された。図２６は、免疫処置後１４０日目のウイルス中和抗体力価を示す。１０^８および１０^１０ｖｐの用量により、アデノウイルスベクターで初回免疫処置のみまたは初回免疫−追加免疫処置された場合、免疫処置後少なくとも４．５ヶ月間、ＶＮＡ力価の用量応答性が持続することが示された。さらに、観察された力価は、一次ｉ．ｎ．免疫処置により生成した中和力価よりも高かった。ＶＮＡ力価に対する、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆのいずれかによる明確な追加免疫効果が観察された。

【0133】

結論として、この実施例では、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＡｄ３５．ＲＳＶ．Ｆの単回投与または２回投与による免疫処置後の、ＶＮＡ力価の長期間持続性、ならびに同種ウイルスチャレンジに対する、肺および鼻における長期間の完全防御と、異種ウイルスチャレンジに対する、肺における長期間の完全防御および鼻における部分防御が示される。

【0134】

実施例１１．コットンラットモデルにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えアデノウイルスベクター免疫処置後の、免疫病理のワクチン増強の非存在
Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦワクチンがＲＳＶ Ａ２によるチャレンジの後に、疾患を悪化させる可能性があるか否かを評価するために、肺の組織病理学的分析を感染後２および６日目に実施した。チャレンジ後２日で、即時応答（肺性好中球の浸潤を含む）がピークに達しているが、リンパ球浸潤などの亜急性変化は感染後６日目にピークに達している（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９８６，５７：７２１−７２８）。この試験では、１２匹コットンラットの実験群それぞれにコットンラットを登録した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）か、導入遺伝子を担持しない（Ａｄ２６ｅ）アデノウイルスベクターを１０^８ウイルス粒子（ｖｐ）または１０^１０ｖｐで筋肉内注射することにより、動物を免疫処置した。一部の群は、同じベクター（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）（同種初回免疫−追加免疫）により、同じｖｐ用量で２８日後に追加免疫し；対照群は、１用量（１０^１０）のみを適用したこと以外は準じて、Ａｄ−ｅベクターにより免疫処置した。対照群は１２匹の動物からなった。ＲＳＶ Ａ２（１０^４プラーク形成単位（ｐｆｕ））により鼻腔内感染させた動物を、チャレンジ複製に対する防御の陽性対照として使用した。ＦＩ−ＲＳＶで免疫処置された動物は、疾患増強の対照として使用した。肺を摘出し、ホルマリンで潅流し、切片化し、組織学的検査のためにヘマトキシリン‐エオジンで染色した。組織病理学スコアは、Ｐｒｉｎｃｅ（Ｐｒｉｎｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ １９９９，７９：１３８５−１３９２）により公開された基準に従って、盲検化して評価し、以下のパラメーター：細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、および肺胞炎についてスコア化した。この実験の肺病理のスコアリングは、図２７に２日目、図２８に６日目のものを示す。ＲＳＶチャレンジ後、ＦＩ−ＲＳＶで免疫処置された動物では、ｍｏｃｋで免疫処置されチャレンジされた動物に比較して、２日目および６日目に、検査したすべての組織病理学パラメーターが上昇していることが示された。これは、以前に公開された試験に基づくと、予測されることであった。Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆベクターで免疫処置されたすべての群の組織病理学スコアは、２日目では、ｍｏｃｋで免疫処置された動物と同じであり、チャレンジ後６日目では、ｍｏｃｋで免疫処置されチャレンジされたものよりも（Ａｄ２６．ｅ）、常に低いスコアになった。したがって、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆワクチンは、ＦＩ−ＲＳＶワクチンと異なり、疾患の増強をもたらさなかった。

【0135】

実施例１２．Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ初回免疫が組換えＦタンパク質により追加免疫されると、マウスモデルにおいてＴｈ１に歪んだ応答がもたらされる
この実施例では、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ初回免疫に対する免疫応答が、アジュバント組換えＲＳＶ Ｆタンパク質による追加免疫によって増強され得るか否かを検討した。この目的のために、マウスを、７匹マウスの実験群それぞれに分配した。完全長のＲＳＶ Ｆ（Ａ２）遺伝子を担持する、１０^１０ウイルス粒子（ｖｐ）アデノウイルスベクター（Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ）またはＰＢＳを筋肉内注射することにより、０日目に動物を免疫処置した。２８日目に、同じ用量の同じベクター、またはアジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質（完全長；融合後構造：ｐｏｓｔ−Ｆ）（２用量：５μｇおよび０．５μｇ）のいずれかで、動物をｉ．ｍ．追加免疫した。図２９は、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ_Ａ２で免疫処置され、アジュバントＲＳＶ Ｆで追加免疫されたマウスからの血清が、免疫処置後１２週目に、ＲＳＶ−Ａ Ｌｏｎｇ（亜群Ａ）に対して高いＶＮＡ力価を示すことを明確に示す。図３０は、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ_Ａ２で免疫処置され、アジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質で追加免疫されたマウスの血清のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比を示す。高い比は、Ｔｈ１バランス応答を表し、一方低い比は、Ｔｈ２に歪んだ応答を示す。明らかに、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆで免疫処置された動物では、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦまたはＲＳＶ Ｆタンパク質のいずれかで追加免疫されると、高いＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比がもたらされるが、ＦＩ−ＲＳＶまたはＲＳＶ Ｆタンパク質で免疫処置された対照マウス（アデノウイルスベクターとの関連においてではない）では、低い比が誘導される。チャレンジの際の疾患の増強を回避し、強力なＴ細胞記憶を誘導するために、ＲＳＶワクチンでは、Ｔｈ１に歪んだ応答が強く所望されるので、Ａｄ２６．ＲＳＶ．Ｆ初回免疫を適用する場合、タンパク質免疫処置によるＴｈ２に歪んだ応答を、Ｔｈ１応答の方に向けることができる。図３１は、Ａｄ２６．ＲＳＶＦ_Ａ２で免疫処置され、アジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質で追加免疫されたマウスに由来する脾臓の細胞性応答を示す。アジュバントＲＳＶ Ｆタンパク質で追加免疫すると、細胞性応答も同様に強力に亢進されることが明確に観察することができる。

【0136】

表１．配列
配列番号１： ＲＳＶ融合タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＣＯ８３３０１．１）アミノ酸配列：

【化1】

配列番号２： ＲＳＶ融合タンパク質をコードする、コドン最適化ＲＳＶ．Ｆ（Ａ２）ｎａｔ遺伝子

【化2】

【図17】

【図19】

【図26】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図18】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

2015512380000001.app

【手続補正書】

【提出日】2014年1月28日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンであって、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチン。

【請求項2】

前記組換えアデノウイルスが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、請求項１に記載のワクチン。

【請求項3】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする前記核酸が、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている、請求項１または２に記載のワクチン。

【請求項4】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする前記核酸が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項5】

前記組換えヒトアデノウイルスが、アデノウイルスゲノムのＥ１領域中の欠失、Ｅ３領域中の欠失、またはＥ１およびＥ３の両方の領域中の欠失を有している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項6】

前記組換えアデノウイルスが、その５’末端に配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含むゲノムを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。

【請求項7】

ＲＳＶに対して被験体にワクチン接種するための方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンを被験体に投与することを含む方法。

【請求項8】

前記ワクチンが筋肉内投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチンが、前記被験体に二回以上投与される、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型３５の組換えヒトアデノウイルスを含むワクチンを前記被験体に投与することをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記被験体への前記ワクチンの単回投与からなる、請求項７または８に記載の方法。

【請求項12】

前記被験体にＲＳＶ Ｆタンパク質を投与することをさらに含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

被験体におけるＲＳＶの感染および／または複製を軽減するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む組成物の筋肉内注射によって前記被験体に投与することを含む方法。

【請求項14】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む、単離された宿主細胞。

【請求項15】

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを製造するための方法であって、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを準備するステップと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養物中で増殖させるステップと、前記組換えアデノウイルスを単離および精製するステップと、前記組換えアデノウイルスを薬学的に許容される組成物中に製剤化するステップとを含む方法。

【請求項16】

ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸を含む、血清型２６の組換えヒトアデノウイルスのゲノムを形成する単離された組換え核酸。

【国際調査報告】