特表 2015-516814 標的化されたＤＮＡの濃縮および配列決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-516814(P2015-516814A)

(43)【公表日】2015年6月18日

(54)【発明の名称】標的化されたＤＮＡの濃縮および配列決定

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150522BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150522BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 Z

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2015-509409(P2015-509409)

(86)(22)【出願日】2013年4月29日

(85)【翻訳文提出日】2014年12月12日

(86)【国際出願番号】EP2013058934

(87)【国際公開番号】WO2013164319

(87)【国際公開日】20131107

(31)【優先権主張番号】12166190.4

(32)【優先日】2012年4月30日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KM,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ヴェドラー， ホルガー

(72)【発明者】

【氏名】ヴェドラー， エリカ

(72)【発明者】

【氏名】ローファート， ディルク

(72)【発明者】

【氏名】オニール， ドミニク

【テーマコード（参考）】

4B024

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B024AA11

4B024AA20

4B024CA01

4B024CA09

4B024HA11

4B024HA19

4B024HA20

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR35

4B063QR48

4B063QR51

4B063QR55

4B063QS15

4B063QS34

(57)【要約】

本発明は、組成物中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の１つ以上の標的配列を濃縮するための方法であって、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む組成物を提供する工程、前記１つ以上のＤＮＡ分子に１つ以上の標的特異的リボ核酸（ＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせ、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させる工程、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、かかるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的である１つ以上の抗体で捕捉し、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを形成させる工程、１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを単離する工程、１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドの１つ以上のＤＮＡ分子を必要に応じて増幅する工程、および場合により、１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドの１つ以上のＤＮＡ分子または増幅産物を配列決定する工程などを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の１つ以上の標的配列を濃縮するための方法であって、前記方法は：
（ａ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む組成物を提供する工程、
（ｂ）前記１つ以上のＤＮＡ分子に１つ以上の標的特異的リボ核酸（ＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせ、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させる工程、
（ｃ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、かかるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的である１つ以上の抗体で捕捉し、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを形成させる工程、
（ｄ）前記１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを単離する工程、
（ｅ）前記１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドのうちの前記１つ以上のＤＮＡ分子を必要に応じて増幅する工程、および
（ｆ）前記ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドの前記ＤＮＡ分子または増幅産物を配列決定する工程
を含み、前記配列決定する工程が、好ましくは次世代配列決定によって行われるものである、方法。

【請求項2】

前記標的配列が、コード領域（エクソン）の群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記コード領域が、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記組成物中の前記ＤＮＡ分子が、次世代配列決定用のＤＮＡ断片ライブラリであり、場合により、前記ライブラリ中のＤＮＡ断片が、末端ユニバーサルアダプター配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記ＤＮＡ分子が、ＤＮＡ断片ライブラリから成り、
（ａ）前記ライブラリ中の前記ＤＮＡが、断片化され、サイズ選択され、続いて必要に応じて、二本鎖平滑末端断片を生じさせるようにまたはＡ−オーバーハングを有する末端を生じさせるようにそれぞれ末端修復されており、かつ
（ｂ）前記断片が、同一の隣接配列を有する断片ライブラリを生じさせるように二本鎖または部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドにライゲートされている、
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

ＲＮＡプローブが、未修飾かつ未標識である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＮＡプローブが、合成されたＲＮＡプローブ、転写されたＤＮＡプローブであるか、または生物学的試料から単離され、精製される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記抗体が固体表面に、好ましくは磁性粒子に結合される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。

【請求項9】

前記抗体が磁性粒子に結合される場合、前記単離する工程が、磁場を用いて行われ、そして単離された前記ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを洗浄することを場合により含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。

【請求項10】

前記ＤＮＡ分子が、単離された前記ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッド上で直接増幅される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記増幅する工程が、前記ユニバーサルアダプター配列を結合するプライマーを用いて行われる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。

【請求項12】

ＲＮＡが、配列決定前に酵素的に消化される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。

【請求項13】

ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子に特異的である抗体、およびさらに１つ以上の標的特異的ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブを含む、キットであって、前記抗体は、場合により磁性粒子に結合される、キット。

【請求項14】

前記ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブが、コード領域（エクソン）の群から選択される標的配列に特異的である、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記コード領域が、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択される、請求項１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子生物学、核酸配列決定ならびに特にＤＮＡ配列の濃縮および配列決定の分野にある。

【背景技術】

【0002】

長年をかけて、ゲノム解析分野における研究は、ほんの数個のヌクレオチドの配列決定から全ゲノムの配列決定へと進歩してきた。

【0003】

ハイ・スループット・シークエンサは、「次世代」（「ｎｅｘｔ−ｇｅｎ」もしくは「ｎｇｓ」）シークエンサともよばれ、または（第三世代に対して）「第二世代」シークエンサとよばれることもあり、何百万もの塩基またはＧｂｐを網羅する１０^５から数１０^６のＤＮＡリードを送達する技術である。それは、ゲノムの（再）配列決定、タンパク質のＤＮＡ結合部位の決定（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）、トランスクリプトームの配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）のために使用されている（最終段落を参照されたし）。

【0004】

製造業者および技術としては、３６または１５０ｂｐの６００ギガ塩基（Ｇｂ）までのリードを生成するＳｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ、４００〜１０００ｂｐの７００Ｍｂｐまでのリードを生成するＲｏｃｈｅ／４５４、３５〜７５ｂｐの１日当たり２０Ｇｂ超のリードを生成するＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ、２５〜４５ｂｐの２１〜３５Ｇｂのリードを生成するＨｅｌｉｃｏｓ、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（サービス会社）である。

【0005】

これらの技術は、配列情報の解析を別のレベルに至らせる。実験の再考は、非常に重要である。

【0006】

例えば、すべての公知癌遺伝子の解析を望む場合（癌に関するおおよそ３０００の遺伝子が公知である［Ｍ．Ｅ．Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｓ：ａ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ ３５（１）．Ｐｐ．Ｄ７２１−Ｄ７２６］）、少量の関連配列情報のために莫大な量のＤＮＡを配列決定しなければならないだろう。

【0007】

生成される大量のデータのため、最初に有用な配列情報が生成されるように実験を計画することが非常に重要になる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｍ．Ｅ．Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅｓ：ａ ｇｅｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ｐｒｏｊｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００７）３５（１）．Ｐｐ．Ｄ７２１〜Ｄ７２６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、本発明の目的は、対象となるＤＮＡ配列（標的配列）のみを濃縮するための方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、（複合）試料中に存在するすべてのＤＮＡを配列決定する必要なく標的配列の配列を特異的に決定するための方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0010】

定義
本明細書における「組成物」は、少なくとも１つ以上のデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ分子）を含む水溶液である。好ましくは、組成物は、複合溶液、すなわち、対象となるＤＮＡ配列（標的配列）と対象とならないさらなるＤＮＡ配列（望ましくない配列）とを含む溶液である。当業者には明らかであるように、望ましくない配列は、通常、標的配列よりはるかに豊富であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５桁以上の差がある。

【0011】

本明細書における「リボ核酸」は、１’から５’までの番号が付与された炭素を有するリボース糖を各ヌクレオチド中に含有する。塩基、一般に、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）が、１’位に結合している。アデニンおよびグアニンは、プリン、シトシンであり、ウラシルは、ピリミジンである。リン酸基は、１つのリボースの３’位および次のリボースの５’位に結合している。リン酸基は、生理的ｐＨで各々負電荷を有し、それがＲＮＡを荷電分子（ポリアニオン）にする。これらの塩基は、シトシンとグアニン間、アデニンとウラシル間、およびグアニンとウラシル間で水素結合を形成し得る。しかし、他の相互作用、例えば、バルジの中で互いに結合しているアデニン塩基の群、またはグアニン−アデニン塩基対を有するＧＮＲＡテトラループも可能である。ＲＮＡをＤＮＡと区別するＲＮＡの重要な構造的特徴は、リボース糖の２’位におけるヒドロキシル基の存在である。この官能基の存在により、らせんは、ＤＮＡにおいて最も一般的に観察されるＢ型ではなくＡ型幾何形状をとることになる。これは、結果として非常に深く狭い主溝と、浅く広い副溝をもたらす。２’−ヒドロキシル基の存在の第二の帰結は、ＲＮＡ分子のコンフォメーション的に柔軟である（すなわち、二重らせんの形成に関与しない）領域内で、それが隣接ホスホジエステル結合を化学的に攻撃して主鎖を切断できることである。

【0012】

他の天然に存在する修飾ヌクレオシドは１００近くあり、それらのうち、プソイドウリジンと２’−Ｏ−メチルリボースを有するヌクレオシドとが最も一般的である。

【0013】

本明細書において、「ＲＮＡ／ＤＮＡ」ハイブリッド分子は、ＲＮＡ鎖が逆相補的な様式でＤＮＡ鎖とハイブリダイズする場合である；図１１を参照されたし。

【0014】

かかるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子に特異的である抗体は、抗ＲＮＡ／ＤＮＡ（ハイブリッド）抗体ともよばれる。かかる抗体がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに結合すると、結果として生じたハイブリッドは、ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドとよばれる。

【0015】

発明の詳細な説明
本明細書に記載する方法は、非標識ＲＮＡプローブを使用して対象となるゲノム領域（標的領域）を選択的に濃縮する点がこれまでの方法と異なる。かかる標的化濃縮は、後続の配列決定工程に特に有用である。なぜなら、標的配列のみが解析に付され、それによってＤＮＡバラストの数桁の有意な低減が助長されるからである。

【0016】

本明細書に記載する方法は、実施例のセクションにおいて説明するＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍの強化であるが、高価な標識ＲＮＡプローブ（ＲＮＡベイト）を使用しないで済む。さらに、本発明の方法は、Ｄｉｇｅｎｅ特許、米国特許第６，２２８，５７８号Ｂ１明細書に記載されているＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド捕捉技術の用途を、標的配列のみを配列決定などのために特異的に濃縮する必要がある複雑な生物体のゲノムＤＮＡへと拡大する。したがって、本発明は、対象となる任意のＤＮＡ領域の選択的濃縮および／または配列決定に適している。これらは、任意の遺伝子パネル、例えば、代謝または調節遺伝子および癌遺伝子からのコード領域（エクソン）であり得る。

【0017】

類似の方法が国際公開第２０１１／０９７５２８号に開示されており、この方法は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが相補鎖から形成されるようにＲＮＡ試料をＤＮＡプローブと接触させること、ハイブリッドを試料から分離すること、およびハイブリッド中のＤＮＡプローブを検出し、それによって相補的ＲＮＡを間接的に検出することを含む。ＤＮＡプローブは、増幅のための隣接シグネチャー配列（プライマー結合部位）、および検出のためのバーコード配列を含む。

【0018】

国際公開第２０１１／０９７５２８号の方法には、本方法と比較して幾つかの欠点がある。公知の方法では、ＲＮＡがＤＮＡプローブによって間接的に検出される。この場合のアッセイの信頼性は、ＲＮＡを直接決定する方法に比べて低い。さらに、ＤＮＡプローブは、かなり複雑であり、検出されることとなるＲＮＡに相補的な小さな配列部分と、相当長い隣接配列とを含む。したがって、これらのプローブは、設計が面倒であるばかりでなく、長い隣接配列によりＲＮＡに意図せずに結合することもあり、その結果、偽陽性シグナルが生成されることもある。

【0019】

本発明は、組成物中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の１つ以上の標的配列を濃縮および／または配列決定するための方法であって、（ａ）１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む組成物を提供する工程、（ｂ）前記１つ以上のＤＮＡ分子に１つ以上の標的特異的リボ核酸（ＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブをハイブリダイズさせ、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成させる工程、（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、かかるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的である１つ以上の抗体で捕捉し、それによって１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを形成させる工程、（ｄ）１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドを単離する工程、（ｅ）ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドのＤＮＡ分子を必要に応じて増幅する工程、および（ｆ）場合により、ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドのＤＮＡ分子または増幅産物を配列決定する工程を含む方法に関する。配列決定は、好ましくは次世代配列決定によって行われる。

【0020】

要するに、試料中に存在する対象となる１つ以上のＤＮＡ分子に特異的であるＲＮＡプローブ（すなわち、標的特異的ＲＮＡプローブ）をＤＮＡにハイブリダイズさせる（図１１を参照されたし）。ＲＮＡプローブをＤＮＡ分子に効率的にハイブリダイズさせるために、ＤＮＡ分子を変性させて一本鎖ＤＮＡを生じさせる必要があり得る。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異的に結合し、それによって前記ハイブリッドを捕捉する、抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体を提供する。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む抗体は、その後、適当な手段、例えば、プロテインＡを使用する遊離抗体のＦｃ結合により、または固体表面に結合した抗体を使用することによって単離することができる。この方法は、場合により抗体に結合した単離ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド（ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッド）を洗浄することを含み得る。その後、ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドのＤＮＡ分子を増幅および／または配列決定することができる。その方法は、以下で詳述する。

【0021】

上で概説したように、標的配列は、好ましくはコード領域（エクソン）の群から選択される。さらに、コード領域は、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択されることが好ましい。

【0022】

好ましくは、組成物中のＤＮＡ分子は、次世代配列決定用のＤＮＡ断片ライブラリであり、場合により、前記ライブラリ中のＤＮＡ断片は、末端ユニバーサルアダプター配列を含む。

【0023】

ＤＮＡ断片ライブラリを全ＤＮＡから作成してもよいし、またはゲノムＤＮＡから作成してもよい。ＤＮＡを単離し、断片化し、サイズ選択する。必要に応じて、３’および／または５’オーバーハングを修復して、平滑末端、またはＡ−オーバーハングを好ましくは３’末端に有する断片を生じさせる。ライブラリ内のすべてのＤＮＡ断片を同じ配列モチーフで隣接させて、ユニバーサル末端アダプター配列をもたらすように、ＤＮＡ断片の各末端にアダプター配列をライゲーションする。好ましくは、ＤＮＡ断片には、２つの異なるユニバーサル末端アダプター配列が隣接する。そうすると、末端アダプター配列を使用してＤＮＡ断片ライブラリを増幅することができる。

【0024】

したがって、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ断片ライブラリであって、（ａ）ライブラリ中のＤＮＡが、断片化され、サイズ選択され、続いて必要に応じて、二本鎖平滑末端断片またはＡ−オーバーハングを有する末端を生じさせるようにそれぞれ末端修復されており、および（ｂ）断片が、同一の隣接配列を有する断片ライブラリを生じさせるように二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドにライゲーションされている、ＤＮＡ断片ライブラリから成ることが好ましい。

【0025】

本方法は、標的特異的ＲＮＡプローブを使用する。現行法には、それが標識ＲＮＡプローブ、例えばビオチン化ＲＮＡベイトを必要とする、および／または非特異的ＲＮＡプローブを使用するという欠点がある。標識プローブは、高価であり、生産が煩雑である。対照的に、本明細書に記載する方法では使用するＲＮＡプローブを修飾する必要も、標識する必要もない。結果として、このＲＮＡプローブは、生産が容易であり、費用効率が高い。それ故、ＲＮＡプローブは、未修飾かつ非標識であるほうが好ましい。非特異的ＲＮＡプローブは、望ましくないＤＮＡ配列の濃縮、すなわち、配列決定工程などの後続の工程に対してバラスト増加をもたらす。

【0026】

１つの態様において、ＲＮＡプローブは、合成されたＲＮＡプローブであってよい。別の態様では、ＲＮＡプローブを生物学的試料から単離し、精製してもよい。好ましくは、先ずＲＮＡプローブを、一方の末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成し、その後、ｉｎ ｉｖｔｒｏ転写を行う（すなわち、転写されたＤＮＡプローブ）。

【0027】

ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド捕捉技術は、Ｄｉｇｅｎｅ特許、米国特許第６，２２８，５７８号Ｂ１明細書に記載されている。本明細書において、抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体は、好ましくはモノクローナルまたはポリクローナル抗体の群から選択される。抗体はモノクローナルであることが特に好ましい。

【0028】

ＤＮＡ／ＲＮＡ特異的抗体は、好ましくは単純な分離のために固相（例えば、磁性ビーズ）にカップリングされるか、または溶解状態であってもよく、ＩｇＧ抗体を結合する固相にカップリングされたプロテインＧに結合させることによって分離される。すなわち、本明細書に記載する方法で使用する抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体を好ましくは固体表面に結合させる。当業者には理解されるように、抗体の配向は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを効率的に結合するのに重要である。抗体を固体表面に共有結合でカップリングさせることができる。固体表面は、球の形状、例えば、円形または楕円形であってもよい。円形または楕円形固体表面の直径は、０．０５μｍ〜１００μｍ、好ましくは０．２μｍ〜２０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜１０μｍであり得る。抗体を粒子、好ましくは磁性粒子に結合させることが特に好ましい。

【0029】

抗体を粒子に結合させる場合、単離工程は、好ましくは遠心分離によって、または磁場を使用してそれぞれ行われる。

【0030】

本明細書に開示する方法は、ＤＮＡ分子の増幅が後続の方法工程、例えば、解析、定量、検出および／または配列決定に必要であるかどうかに依存して、ＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドのＤＮＡ分子を増幅する工程を含み得る。なぜなら、例えば、ＤＮＡ分子の濃度が低すぎるからである。

【0031】

様々な増幅法が公知である。好ましい実施形態において、増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）およびリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）の群から選択される。

【0032】

増幅法は、非等温法であるか、または等温法である。非等温増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０）の群から選択することができる。等温増幅法は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）（Ｖｉｎｃｅｎｔら（２００４）ＥＭＢＯ ｒｅｐ ５（８）：７９５−８００）、熱安定性ＨＤＡ（ｔＨＤＡ）（Ａｎら（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（３２）：２８９５２−２８９５８）、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇら（２００６）ＰｌｏＳ Ｂｉｏｌ ４（７）：１１１５−１１２０）の群から選択することができる。

【0033】

本発明の文脈において「等温増幅反応」とは、温度が反応中に有意に変化しないことを意味する。好ましい実施形態において、等温増幅反応の温度は、増幅が起こる主要酵素的反応工程中に１０℃より大きく逸脱せず、好ましくは５℃以下、さらにいっそう好ましくは２℃以下しか逸脱しない。

【0034】

核酸の等温増幅法に依存して、異なる酵素が増幅反応に必要とされる。核酸の公知等温増幅法は、上述のものであり、この場合、等温条件下で核酸を増幅するための少なくとも１つの中温性酵素は、ヘリカーゼ、中温性ポリメラーゼ、鎖置換活性を有する中温性ポリメラーゼ、組換えタンパク質から成る群より選択される。

【0035】

「ヘリカーゼ」は、当業者には公知である。それは、核酸ホスホジエステル主鎖に沿った方向に移動して、ＮＴＰまたはｄＮＴＰの加水分解に由来するエネルギーを使用して２本のアニールされた核酸鎖（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）を分離するタンパク質である。定義されたヘリカーゼモチーフの存在に基づき、ヘリカーゼ活性を所与のタンパク質のものであると考えることが可能である。当業者は、ヘリカーゼ活性を有する適当な酵素を、本発明による方法において使用するために選択することができる。好ましい実施形態において、ヘリカーゼは、異なるファミリーからのヘリカーゼ：スーパーファミリーＩヘリカーゼ（例えば、ｄｄａ、ｐｃｒＡ、Ｆ−プラスミドｔｒａｌタンパク質ヘリカーゼ、ｕｖｒＤ）、スーパーファミリーＩＩヘリカーゼ（例えば、ｒｅｃＱ、ＮＳ３−ヘリカーゼ）、スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐヘリカーゼ）、ＤｎａＢ様スーパーファミリーからのヘリカーゼ（例えば、Ｔ７ファージヘリカーゼ）またはＲｈｏ様スーパーファミリーからのヘリカーゼを含む群から選択される。

【0036】

増幅法は、必要な酵素に加えてバッファー、ｄＮＴＰまたはＮＴＰを含むことになる。

【0037】

本明細書において用いる場合、用語「ｄＮＴＰ」は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を指す。かかるｄＮＴＰの非限定的な例としては、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰであり、これらは、例えば蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む、標識された誘導体の形態で存在することもある。修飾ヌクレオチド塩基を有するｄＮＴＰも包含され、この場合ヌクレオチド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサンチノシン（ｘａｎｔｈｉｎｏｓｉｎｅ）、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンである。

【0038】

本明細書において用いる場合、用語「ＮＴＰ」は、リボヌクレオシド三リン酸を指す。かかるＮＴＰの非限定的な例は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰであり、これらは、例えば蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識を含む、標識された誘導体の形態で存在することもある。

【0039】

好ましくは、増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法である。

【0040】

ＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の１０〜１００「サイクル」の変性および合成から成り得る。好ましい実施形態において、サーモサイクリング増幅反応で変性を行う温度は、約９０℃〜９５℃より高く、さらに好ましくは９２℃〜９４℃である。好ましいサーモサイクリング増幅法としては、約１０〜約１００サイクル、さらに好ましくは約２５〜約５０サイクル、および約９０℃〜９５℃より高く、さらに好ましくは９２℃〜９４℃のピーク温度を含むポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。好ましい実施形態では、（ａ）標的配列の末端について、それにハイブリダイズすることになるオリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる十分な詳細が分かっている、および（ｂ）少量の標的配列が連鎖反応を開始させるために利用可能であるとすれば、通常は好熱性原核生物に由来するＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ反応を行って、関与する反応工程の数に対して指数関数的量で、少なくとも１つの標的核酸配列を生産する。ここで、ポリメラーゼは、好ましくは、プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼである。酵素は、好ましくは熱安定性である。

【0041】

増幅用のプライマーは、例えばホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはそれらの自動化実施形態などの、任意の適切な方法を用いて調製することができる。１つのかかる自動化実施形態では、ジエチルホスホロアミダイト（ｄｉｅｔｈｙｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）を出発材料として使用し、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって記載されているようにそれを合成することができる。修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は、米国特許第４，４５８，００６号明細書に記載されており、それは参照により本明細書中に援用されている。生物学的供給源（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離されたプライマーを使用することも可能である。

【0042】

好ましいプライマーは、約１５〜１００、さらに好ましくは約２０〜５０、最も好ましくは約２０〜４０塩基の長さを有する。

【0043】

本方法のさらなる利点は、ＤＮＡ分子をＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドから事前に単離することなく増幅工程を行うことができる点である。抗体および固体表面は、両方とも、増幅工程に干渉しなかった。したがって、ＤＮＡを増幅する前にＤＮＡ分子を放出するためにハイブリッドを変性する必要がない。すなわち、単離されたＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッド上でＤＮＡ分子を直接増幅することができる。

【0044】

増幅工程は、好ましくは、ユニバーサルアダプター配列を結合するプライマーを用いて行われる。プライマーを調製するための手順は、上に概説されている。

【0045】

本発明は、好ましくは、１つ以上のＲＮＡ／ＤＮＡ／抗体ハイブリッドの１つ以上のＤＮＡ分子、または所望もしくは必要に応じて、増幅産物の配列決定工程を含む。現行法には、特定の配列決定法に限定されないという利点がある。しかし、次世代配列決定法が好ましい。

【0046】

ＤＮＡ配列決定技術は、基礎研究から臨床診断にわたる多種多様な分野において大きな重要性をもつ。かかる技術から入手できる結果は、様々な程度の特異性の情報を含むことができる。例えば、有用な情報は、特定のポリヌクレオチドが配列の点で参照ポリヌクレオチドと異なるかどうかの決定、試料中の特定のポリヌクレオチド配列の存在の確認、部分配列情報、例えばポリヌクレオチド内の１つ以上のヌクレオチドの正体の決定、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの正体および順序の決定などから成り得る。

【0047】

配列決定工程は、好ましくは次世代配列決定によって行われる。製造業者および技術としては、３６または１５０ｂｐの６００ギガ塩基（Ｇｂ）までを生成するＳｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ、４００〜１０００ｂｐの７００Ｍｂｐまでのリードを生成するＲｏｃｈｅ／４５４、３５〜７５ｂｐの１日当たり２０Ｇｂ超のリードを生成するＡＢＩ／ＳＯＬｉＤ（商標）、２５〜４５ｂｐの２１〜３５Ｇｂのリードを生成するＨｅｌｉｃｏｓ、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（サービス会社）である。他の製造業者としては、ＰａｃＢｉｏ ＲＳを商品化しているＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅが挙げられる。

【0048】

合成技術によるＳｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定は、可逆的ダイターミネーターに基づく。ＤＮＡ分子を先ずスライド上のプライマーに結合させ、そして局所クローンコロニーが形成されるように増幅する（ブリッジ増幅）。４タイプの可逆的ターミネーター塩基（ＲＴ−塩基）を付加させ、組み込まれていないヌクレオチドを洗い流す。パイロシークエンシングとは異なり、ＤＮＡを１度に１ヌクレオチドしか伸長することができない。蛍光標識ヌクレオチドの画像をカメラで撮影し、その後、末端３’ブロッカーと共に色素をＤＮＡから化学的に除去し、次のサイクルが可能になる（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００．１８（６）：６３０−６３４）。

【0049】

ＳＯＬｉＤ（商標）（「オリゴヌクレオチドライゲーションによる配列決定および検出（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」）法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；国際公開第０６／０８４１３２号Ａ２）は、ユニバーサルアダプター配列によるテンプレート核酸のＰＣＲ増幅断片の磁性ビーズへの結合、そしてアダプター配列にハイブリダイズしたプライマーへの標識プローブのライゲーションによる断片配列のその後の検出に基づく。読み出しのために、１組の４種の蛍光標識２塩基プローブを使用する。読み出し後、プローブ部分を切断し、ライゲーション、検出および切断の新たなサイクルを行う。２塩基プローブを使用するため、各テンプレート配列につき２ラウンドの配列決定を行わなければならない。

【0050】

ＰａｃＢｉｏ ＲＳは、ゼロモード導波管の特性に基づく一分子リアルタイム配列決定（ＳＭＲＴ）プラットホームである。単一ＤＮＡポリメラーゼ酵素を、テンプレートとしての単一ＤＮＡ分子と共に、ＺＭＷの底部に固着させる。ＺＭＷは、ＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれるＤＮＡの１つのヌクレオチドだけを観察するのに足る小さい照明観察体積を作り出す構造である。４つのＤＮＡヌクレオチド各々を４つの異なる蛍光色素のうちの１つに結合させる。ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれると、蛍光タグは切断され、ＺＭＷの観察エリア外に拡散し、そこでは、その蛍光はもはや観察不能である。検出器がヌクレオチド組み込みの蛍光シグナルを検出し、色素の対応する蛍光に従って塩基コール（ｂａｓｅ ｃａｌｌ）がなされる。

【0051】

現行法には、特定の配列決定法に限定されないという利点がある。配列決定工程を次世代配列決定によって行う場合、適用する方法を、上で説明したものの群から選択することが好ましい。

【0052】

増幅産物を配列決定工程前にさらに検出および／または定量してもよい。

【0053】

増幅産物を検出可能なプローブ、例えば蛍光標識プローブを組み込むことによって検出工程を行ってもよい。本発明によるプローブは、特異的核酸配列に実質的に相補的である、オリゴヌクレオチド、核酸またはそれらの断片である。適当なハイブリダイゼーションプローブとしては、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒプローブ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、分子ビーコンプローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマー、Ｓｕｎｒｉｓｅプライマー、ＬＵＸプライマーおよびＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒプライマーが挙げられる。

【0054】

あるいは、リアルタイムＰＣＲにおいてレポーターとして二本鎖ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）を使用することによって検出工程を行ってもよい。ＤＮＡ結合色素は、ＰＣＲにおけるすべての二本鎖ＤＮＡに結合し、色素の蛍光を生じさせる。したがって、ＰＣＲ中のＤＮＡ産物の増加は、蛍光強度の増加をもたらし、またＤＮＡ産物の増加をサイクルごとに測定するので、ＤＮＡ濃度を定量することができる。

【0055】

定量工程は、前に説明した技法を用いる定量的リアルタイムＰＣＲに基づいてもよい。

【0056】

本発明は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子に特異的である抗体（該抗体は、場合により磁性粒子に結合している）を含み、かつ１つ以上の標的特異的ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブをさらに含むキットにも関する。

【0057】

キットの構成要素は、上に開示した方法のためのものと同じである。例えば、ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは、コード領域（エクソン）の群から選択される標的配列に対して特異的である。コード領域は、好ましくは、代謝遺伝子、調節遺伝子および癌遺伝子の群から選択される。ＲＮＡプローブは、合成されたＲＮＡプローブであってもよい。あるいは、ＲＮＡプローブを生物学的試料から単離し、精製してもよい。好ましくは、ＲＮＡプローブを先ず一方の末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドとして合成し、その後、ｉｎ ｉｖｔｒｏ転写を行う。例えば、本明細書において用いる抗ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド抗体を好ましくは固体表面に結合させる。当業者には理解されるように、抗体の配向は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを効率的に結合するのに重要である。抗体を固体表面に共有結合でカップリングさせることができる。固体表面は、球の形状、例えば、円形または楕円形であってもよい。円形または楕円形固体表面の直径は、０．０５μｍ〜１００μｍ、好ましくは０．２μｍ〜２０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜１０μｍであり得る。抗体を磁性粒子に結合させることが特に好ましい。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１は、次世代配列決定のための標的濃縮技術の系統的概要である。

【図2】図２は、一本鎖のアダプターをライゲーションしたＤＮＡ断片とＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーションを示す。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子は、磁性粒子に結合し、その後、磁気分離によって単離される。分離されたＤＮＡ断片を配列決定前にＰＣＲによって濃縮することができる。Ａ．標的化ＤＮＡ断片とビオチン化ＲＮＡベイトのハイブリダイゼーション、およびストレプトアビジンで被覆された磁性ビーズでの精製。Ｂ．標的化ＤＮＡ断片と非標識かつ未修飾のＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション、および抗体で被覆された磁性ビーズでの標的化ハイブリッド分子の単離。

【図3】図３は、ヒトゲノム（ｈ１９）へのマッピング前およびその後の配列リードの百分率を示す。百分率は、品質評価前に成功リード数に正規化される。

【図4】図４は、対象領域（ＲＯＩ）および設計領域（ＲＯＤ）の説明である。ＲＯＩは、濃縮のための標的化領域（例えば、エクソン−イントロン境界を含むエクソン配列Ｅ１〜Ｅ５）を表す。ＲＯＤは、プローブによって網羅される領域（ａ〜ｅ）を表す。したがって、ＲＯＤは、配列データが期待される領域を記載する。適当なプローブで網羅され得なかった対象領域内のギャップを、ｆおよびｇとラベルする。

【図5】図５は、濃縮技術の感度を示す。少なくとも１つの配列によって網羅されるＲＯＩおよびＲＯＤの百分率。百分率は、ＲＯＩおよびＲＯＤのサイズにそれぞれ関係づけられる。

【図6】図６は、濃縮技術の特異性を示す。ＲＯＤおよびＲＯＩにマッチする配列決定された塩基の百分率。百分率は、ヒトゲノムにマッピングした配列決定された塩基の数に関係づけられる。

【図7】図７は、配列データによって網羅されないＲＯＤおよびＲＯＩの百分率を示す。

【図8】図８は、ＲＯＩ内の配列網羅率（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）のボックスプロットである。中央値は、調査した４ライブラリすべてについて２４０２〜２８６７である。上位四分位数（ｑ３）および下位四分位数（ｑ１）間の差を下方レーンに示す。

【図9】図９は、ＲＯＩの累積配列網羅率を示す。４曲線すべてが同様の形を有する。ＲＯＩのおおよそ９３％が、少なくとも１倍で（＝感度）網羅される。１００倍の網羅率ではライブラリに依存してＲＯＩの８７％〜９０％（Ｑ７：９０．４７％、Ｑ８：８８．１３％、Ｑ９：８８．３３％、Ｑ１０：８６．９７％）、および１０００倍の網羅率ではＲＯＩの少なくとも６０％が、配列データによって網羅される。

【図10】図１０は、ＯＲＩの正規化された配列網羅率を示す。これは、ＲＯＩ中の配列網羅率についての均一性または配列の偏りを記載し、予想配列網羅率に関して実験設計の重要な情報を提供する。Ｑ９についての計算例：標的領域の少なくとも８５％を少なくとも３０倍で網羅すべきである場合（ｘ値＝０．１；ｙ値＝８５％）、標的領域を平均で３００倍より高く網羅しなければならず（ｘ値＝１＝平均配列網羅率）、または標的領域の６５％を少なくとも１５０倍で網羅しなければならない（ｘ値＝０．５）。さらに、これらの曲線により、様々な読み取り数での配列決定実行の比較、ならびに異なる試料調製物の比較も可能になる。ｙ軸との高い交点および曲線の滑らかな傾きは、効率的な試料調製物を示す。

【図11】図１１は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド構造を示す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

次世代配列決定技術により、大規模並列配列決定により莫大な量の配列情報の生成が可能となる。しかし、殆どの配列決定プラットホームは、ヒトのような複雑なゲノムを単回の試行で費用効率よく配列決定する能力をまだ持っていない。一方、多くのタスクには、１つ以上の試料の標的化領域の配列決定がかなり必要である。

【0060】

このために、幾つかの標的ＤＮＡ濃縮プロトコルが次世代配列決定（図１）の前に開発された。

【0061】

いわゆる「ＳｕｒｅＳｌｅｃｔ」プロトコルは、ＲＮＡベイトであって、各ベイト配列上に親和性タグ（すなわち、ビオチンまたはハプテン）をハイブリダイゼーションのためにおよびその親和性タグに結合する分子または粒子（例えば、ハプテンまたはその抗原結合断片に結合するストレプトアビジン、アビジンまたは抗体で被覆された磁性ビーズ）のその後の分離のために有するＲＮＡベイトを必要とするが、本明細書に開示する方法は、親和性タグを用いないＤＮＡライブラリ断片の未修飾一本鎖ＲＮＡプローブへの液相（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）ハイブリダイゼーション、続いてのＤＮＡ／ＲＮＡ特異的抗体による標的化ＤＮＡ断片の単離に基づく。ＤＮＡ／ＲＮＡ特異的抗体を単純な分離のために固相（例えば、磁性ビーズ）にカップリングさせるか、またはＤＮＡ／ＲＮＡ特異的抗体は溶解状態であってもよく、固相にカップリングされたプロテインＧ特異的二次抗体に結合させることによって分離される。

【0062】

本発明の原理を図２Ｂに示す。

【0063】

最初に、断片ライブラリを構築する。ＤＮＡを断片化し、サイズ選択し、続いて、二本鎖平滑末端断片を生じさせるように、または「Ａ」オーバーハングを有する末端を生じさせるようにそれぞれ末端修復する。かかる断片を二本鎖アダプターオリゴヌクレオチドにライゲーションして、同一の隣接配列を有する断片ライブラリを生成する。任意で、ＰＣＲにより、標的化ＤＮＡ濃縮後と同様に濃縮前にもアダプター末端にマッチするプライマーを使用してライブラリを増幅することが可能である。

【0064】

本発明の性能の評価のために、ＡｇｉｌｅｎｔからのｅＡｒｒａｙインターネットポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｅａｒｒａｙ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｅｒｒａｙ／）を使用して６０遺伝子（表１）のエクソン濃縮のためのＲＮＡプローブを設計し、合成した。

【0065】

ゲノム内の標的化領域の９１．８３％を網羅する、各々が１２０のヌクレオチドを有する合計５９４２のＲＮＡベイトを合成した。

【0066】

「ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ」プロトコルを使用する標的化ＤＮＡ濃縮と抗体捕捉に基づく本発明のプロトコルでの標的化ＤＮＡ濃縮とを比較するために、ビオチン化ＲＮＡベイトを使用した。ビオチン化は、「ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ」プロトコルで使用するストレプトアビジンビーズへの結合に必要であったが、本発明で使用するＤＮＡ／ＲＮＡ抗体またはビーズに干渉しない。

【0067】

本発明の濃縮プロトコルは、次の工程を含む：（ｉ）ＤＮＡ断片ライブラリの変性、（ｉｉ）ＲＮＡベイトを用いる液相ハイブリダイゼーション、（ｉｉｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの抗体で被覆された磁性ビーズへの結合、（ｉｖ）標的化ＤＮＡ断片の磁気分離、（ｖ）非特異的に結合したＤＮＡを除去するための反復洗浄工程、（ｖｉ）濃縮ＤＮＡの増幅のためのＰＣＲ、配列特異的リンカー配列の導入、および任意選択のライブラリのバーコード化。

【0068】

ＰＣＲ前に、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの変性および抗体で被覆されたビーズの除去の必要はない。ビーズも抗体もＰＣＲを阻害しない。

【0069】

以下で、「ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ」プロトコルによる濃縮後に２反復ＤＮＡライブラリ（ライブラリＱ７およびＱ８）から生じた配列決定結果を、本発明の抗体ベースハイブリッド捕捉プロトコルによる２反復濃縮ライブラリ（ライブラリＱ９およびＱ１０）から得たデータと比較する。配列決定のために、それらのライブラリを配列決定前に異なる指標コードで標識し、ＩｌｌｕｍｉｎａからのＨｉＳｅｑ ２０００シークエンサの１レーンにローディングした。配列決定を、対にした末端配列決定（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）として２×１００ｂｐの所望の読み取り長で行った。ソフトウェアパッケージ「Ｇａｌａｘｙ」を使用して配列を解析した。配列データをプログラムＢＷＡでヒトゲノムｒｅｌｅａｓｅ ＧＲＣｈ３７．ｐ５（ｈｇ１９）にマッピングした。

【0070】

表３は、ＨｉＳｅｑ ２０００で生成された４ライブラリの生データの要約である。４ライブラリすべてについて、同等の質を有する同様の量の生データを得た（トリミング後の平均リード長およびトリミング後の平均ＰＨＲＥＤクオリティを参照されたし）。

【0071】

【表1】

【0072】

品質トリミング後、対になった読み取りをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７．ｐ５（ＧＣＡ＿０００００１４０５．６）＝ｈｇ１９）にマッピングし、その後、設計領域（ＲＯＤ）と対象領域（ＲＯＩ）両方の中のそれらの位置について解析した（図４）。

【0073】

以下のパラメータを調査した：感度（標的化領域の何個のヌクレオチドが配列データで網羅されたか？）（図５）；特異性（何個の読み取りまたはヌクレオチドが標的化領域にマッチしたか？）（図６）；残存ギャップの数およびサイズ（図７）；配列網羅率の均一性（図８）。

【0074】

図９および１０中のプロットは、４ライブラリすべてについての感度および配列網羅率の要約である。示されているデータから、両方の濃縮技術、ＡｇｉｌｅｎｔからのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔと本発明のハイブリッド捕捉技術が、感度、特異性、ギャップの数およびサイズ、ならびに配列網羅率の均一性の点で非常に類似して動作するという結論に至った。したがって、本発明の抗体ベースハイブリッド捕捉技術は、ビオチン−ストレプトアビジンベースＲＮＡ／ＤＮＡ捕捉と比較される適当な代替技術であるが、高価な標識ＲＮＡベイトを生じさせる必要がない。

【0075】

表１．エクソン濃縮のための標的遺伝子。合計で１００９の標的化領域をプローブ設計のために画定した。対象領域の合計サイズは、３９８９０８ｂｐである。

【0076】

【表2】

【0077】

表２．ＲＮＡプローブの概要。初めにゲノムリピート領域にオーバーラップする最大２０の塩基を有するプローブを設計した。適当なプローブのない領域については、隣接するリピート領域へのオーバーラップを可能にする４０の塩基を用いて２回目の設計を行った。その後、プローブを、プローブの中で、６０％までのＧＣ含有率を有する「正常」プローブと、増加されたＧＣ含有率（６０％超）を有するプローブと、単一プローブによって網羅される領域（オーファン）とで分けた。「正常」プローブは、２倍の網羅率で対象領域を網羅し、「高」ＧＣ含有率プローブとオーファンの両方は、対象領域を４倍で網羅した。

【0078】

【表3】

【図8】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】