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特表2015-519906部位特異的標識法およびそれによって生成される分子

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-519906(P2015-519906A)

(43)【公表日】2015年7月16日

(54)【発明の名称】部位特異的標識法およびそれによって生成される分子

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20150619BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20150619BHJP

C12N 9/12 20060101ALI20150619BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20150619BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20150619BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20150619BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20150619BHJP

C12P 21/08 20060101ALI20150619BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20150619BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20150619BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20150619BHJP

A61P 31/00 20060101ALI20150619BHJP

A61K 45/00 20060101ALN20150619BHJP

A61K 38/00 20060101ALN20150619BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 A

C07K16/00ZNA

C12N9/12

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/00 101

C12P21/08

A61K39/395 L

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61P29/00

A61P35/00

A61P31/00

A61K45/00

A61K37/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】318

(21)【出願番号】特願2015-516079(P2015-516079)

(86)(22)【出願日】2013年5月31日

(85)【翻訳文提出日】2015年2月3日

(86)【国際出願番号】US2013043684

(87)【国際公開番号】WO2013184514

(87)【国際公開日】20131212

(31)【優先権主張番号】61/655,143

(32)【優先日】2012年6月4日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/777,430

(32)【優先日】2013年3月12日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】503261524

【氏名又は名称】アイアールエム・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＩＲＭ，ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木康仁

(72)【発明者】

【氏名】ガイアースタンガー，バーナードフーベルト

(72)【発明者】

【氏名】グルンワルド，ジャン

(72)【発明者】

【氏名】バースラヤ，バドリー

【テーマコード（参考）】

4B024

4B050

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024BA44

4B024CA01

4B024GA11

4B024HA01

4B050CC07

4B050KK11

4B050KK13

4B050KK18

4B050LL01

4B050LL05

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA21

4B064CB30

4B064CC01

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA58X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA60

4C084AA02

4C084AA17

4C084BA44

4C084DA27

4C084NA05

4C084ZA042

4C084ZB112

4C084ZB262

4C084ZB332

4C084ZB352

4C084ZB372

4C084ZC202

4C084ZC412

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA21

4C085AA25

4C085AA26

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB41

4C085BB43

4C085BB50

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA62

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA70

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、対象とする抗体の１つまたは複数の特定部位に組み込まれたペプチド配列（「ペプチドタグ」）の翻訳後修飾を触媒する４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を使用して、抗体を部位特異的に標識する方法を提供する。酵素標識によって、抗体に組み込まれたペプチドタグ内の特異的セリン残基の定量的および不可逆的共有結合修飾が可能となり、したがって、所望の抗体コンジュゲートが創製される。

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【特許請求の範囲】

【請求項1】

４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、抗体またはその断片の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片。

【請求項2】

前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体または相同体型である、請求項１に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項3】

ペプチドタグが、
ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、
ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、
ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＣＬＮ（配列番号３）、
ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＣＬＮ（配列番号４）、
ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＬＬＮ（配列番号５）、
ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＳＬＮ（配列番号６）、
ＧＳＱＤＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）、
ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号８）、
ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、
ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、
ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１）、
ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳ（配列番号１２）、
ＧＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１３）、
ＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１４）、
ＧＤＳＬＤＭ（配列番号１５）、
ＬＤＳＶＲＭＭＡＬＡＡＲ（配列番号１６）、
ＬＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＲ（配列番号１７）、
ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、
ＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）、
ＤＶＬＤＳＬＥＦＩ（配列番号２０）、
ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳ（配列番号２１）、および
ＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１３２）
からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項4】

ペプチドタグが、抗体またはその断片のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域の構造的ループ内に設置されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項5】

前記ペプチドタグが、抗体またはその断片のＣＨ１領域の構造的ループ内に設置されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項6】

前記ペプチドタグが、表１に列挙されている任意の２個のアミノ酸の間に挿入されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項7】

ペプチドタグが、親抗体またはその断片のＶＨまたはＶＬドメインのアミノ酸残基２および３の間に、または軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間に、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６２および１６３の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、もしくは１９５および１９６の間に、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間、もしくは４４５および４４６の間、もしくは４４６および４４７の間に挿入されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項8】

ペプチドタグが、親抗体またはその断片の軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間に、ＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６２および１６３の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、もしくは１９５および１９６の間に、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間に挿入されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項9】

ペプチドタグが、Ｖ_Ｈドメインのアミノ酸残基６２〜６４もしくは６２〜６５の間に、またはＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３３〜１３８の間に、またはＣＨ１ドメインの１８９〜１９５の間に、またはＣＨ１ドメインの１９０〜１９７の間にグラフトされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項10】

前記抗体が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号６３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８７、または配列番号３８８を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項11】

前記抗体が、配列番号３２、配列番号６３、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８１、または配列番号３８４を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項12】

４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素がＳｆｐであり、ペプチドタグが、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＣＬＮ（配列番号３）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＣＬＮ（配列番号４）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＬＬＮ（配列番号５）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＳＬＮ（配列番号６）、ＧＳＱＤＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）、ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳ（配列番号１２）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１３）、ＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１４）、ＬＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＲ（配列番号１７）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）、ＤＳＬＥＦＩＡＳ（配列番号１１１６）、またはＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１３２）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項13】

４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素がＳｆｐであり、ペプチドタグが、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、またはＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項14】

４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素がＡｃｐＳであり、ペプチドタグが、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳ（配列番号１２）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１３）、ＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１４）、ＧＤＳＬＤＭ（配列番号１５）、ＬＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＲ（配列番号１７）、またはＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１３２）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項15】

ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択されるアイソタイプである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項16】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのサブタイプである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項17】

ヒトもしくはヒト化抗体またはその断片である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項18】

抗ＨＥＲ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体断片である、請求項１７に記載の修飾抗体またはその断片。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の修飾抗体または断片と末端基とを含む免疫コンジュゲート。

【請求項20】

前記末端基が、修飾抗体または抗体断片に、式（Ｉ−ｂ）による構造を有するリンカー：

【化208】

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［式中、
Ｌ_１は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーであり、
＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合している場所を示す］によって結合しており、
末端基が、薬物部分、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、多糖、アセチル基、または表面である、請求項１９に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項21】

Ｌ_１が、−Ａ_１Ｘ^２−または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_２が、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３が、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４が、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【化209-1】

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【化209-2】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
Ａ_２が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＲ^４−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、

【化210】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_３が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、

【化211】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_４が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【化212】

[この文献は図面を表示できません]

【化213】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニルおよびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【化214】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択される、請求項２０に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項22】

【化215】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_１が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
Ａ_２が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【化216】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_３が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【化217】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_４が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２が、独立に、結合、

【化218】

[この文献は図面を表示できません]

【化219】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４が、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５が、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６が、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７が、独立に、Ｈ、フェニルおよびピリジンから選択され、
Ｒ^８が、独立に、

【化220】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９が、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎが、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍが、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択される、請求項２０または２１に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項23】

式（Ｉ−ｂ）のリンカーが、式（Ｉ−ｃ）による構造を有するリンカー：

【化221】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項２０から２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項24】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は、

【化222】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２が結合であり、Ｌ_３が結合であり、Ｌ_４が−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項25】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は、

【化223】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２が結合であり、Ｌ_３が結合であり、Ｌ_４が−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項26】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は

【化224】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２が−Ａ_２−であり、この際、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、
Ｌ_３が−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は

【化225】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_４が

【化226】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項２１または２２の免疫コンジュゲート。

【請求項27】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２が結合−であり、Ｌ_３が−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４が結合である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項28】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｒ^４は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
Ｌ_２が結合であり、Ｌ_３が−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４が結合である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項29】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２が結合であり、Ｌ_３が結合であり、Ｌ_４が−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項30】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２が結合であり、Ｌ_３が結合であり、Ｌ_４が−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項31】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２が−Ａ_２−であり、この際、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、
Ｌ_３が−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は、

【化227】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_４が、

【化228】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項32】

Ｌ_１が−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２が結合−であり、Ｌ_３が−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４が結合である、請求項２１または２２に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項33】

【請求項34】

末端基が、抗炎症薬、抗癌薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、および麻酔薬から選択される部分である、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項35】

末端基が、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害薬、ＨＳＰ９０阻害薬、ＩＡＰ阻害薬、ｍＴｏｒ阻害薬、微小管安定薬、微小管不安定化薬、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害薬、ＤＰＰＩＶ阻害薬、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害薬、タンパク質合成阻害薬、ＣＤＫ２阻害薬、ＣＤＫ９阻害薬、Ｅｇ５阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＤＮＡ損傷薬、ＤＮＡアルキル化薬、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ小溝結合薬、プロテアソーム阻害薬、ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬、およびＤＨＦＲ阻害薬から選択される、請求項３４に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項36】

末端基が、フルオロフォア、クロモフォア、量子ドット、磁性プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬、または造影試薬から選択される、請求項１９から３３のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項37】

アフィニティープローブがビオチンである、請求項１９から３３のいずれかに記載の免疫コンジュゲート。

【請求項38】

前記修飾抗体またはその断片が１つまたは複数の直交性コンジュゲーション部位をさらに含む、請求項１９から３７のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項39】

各直交性コンジュゲーション部位が、独立に、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、リシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、ホルミルグリシン、非天然アミノ酸、ピロリシン、およびピロリン−カルボキシリシンから選択される、請求項３８に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項40】

有効量の請求項１９から３９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または添加剤とを含む医薬組成物。

【請求項41】

医薬として使用するための、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体もしくはその断片、または請求項１９から３９のいずれかに記載の免疫コンジュゲート。

【請求項42】

癌、炎症性疾患、または感染症を治療する際に使用するための、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体もしくはその断片、または請求項１９から３９のいずれかに記載の免疫コンジュゲート。

【請求項43】

癌を治療する際に使用するための、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体もしくはその断片、または請求項１９から３９のいずれかに記載の免疫コンジュゲート。

【請求項44】

癌を治療する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、有効量の請求項１９から３９のいずれか一項に記載の免疫コンジュゲートまたは請求項４０に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項45】

前記哺乳動物がヒトである、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の修飾抗体またはその断片をコードする核酸。

【請求項47】

請求項４６に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項48】

抗癌薬とさらにコンジュゲートしている、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体またはその抗体断片。

【請求項49】

請求項１９から３９に記載の免疫コンジュゲートを生成する方法であって、適切な条件下で、請求項１から１８のいずれか一項に記載の修飾抗体または抗体断片、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、およびＣｏＡに連結している末端基またはＣｏＡ類似体に連結している末端基をインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片および末端基を含む免疫コンジュゲートの形成を促進することを含む方法。

【請求項50】

請求項１９から３９に記載の免疫コンジュゲートを生成する方法であって、
ｉ）適切な条件下で、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびＣｏＡまたはＣｏＡ類似体と共にインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を抗体または抗体断片に結合させるステップであって、４’−ホスホパンテテインおよび４’−ホスホパンテテイン類似体が官能基を含むステップと、
ｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を、末端基に連結していてもよい反応性基と反応させ、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片および末端基を含む免疫コンジュゲートを形成するステップと
を含む方法。

【請求項51】

請求項１９から３９に記載の免疫コンジュゲートを生成する方法であって
ｉ）適切な条件下で、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびＣｏＡまたはＣｏＡ類似体と共にインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を抗体または抗体断片に結合させるステップであって、４’−ホスホパンテテインおよび４’−ホスホパンテテイン類似体が保護官能基を含むステップと、
ｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体の保護官能基を脱保護するステップと、
ｉｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体の脱保護官能基を、末端基に連結していてもよい反応性基と反応させ、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片および末端基を含む免疫コンジュゲートを形成するステップと
を含む方法。

【請求項52】

前記適切な条件が、４℃〜３７℃の温度およびｐＨ６．５〜ｐＨ９．０を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記修飾抗体または抗体断片中のペプチドタグのセリン残基が、式（Ｄ−ａ）、式（Ｅ−ａ）、式（Ｆ−ａ）、または式（Ｇ−ａ）の構造を有する４’−ホスホパンテテイン基：

【化229】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｌ_１は、−Ａ_１Ｘ^２−または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【化230-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化230-2】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
Ａ_２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＲ^４−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、

【化231】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、

【化232】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【化233】

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【化234】

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、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニル、およびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【化235】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｒ^１は、チオール、マレイミド、ハロアセトアミド、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、オキサノボルナジエン、アジド、ジアリールテトラジン、ノルボルネン、モノアリールテトラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、アルデヒド、またはケトンである］とコンジュゲートしている、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片を含む免疫コンジュゲート。

【請求項54】

４’−ホスホパンテテイン基が、

【化236】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項５３に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項55】

コンジュゲートセリンが、

【化237】

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から選択される構造を有する、請求項５３に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項56】

コンジュゲートセリンが、

【化238】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項５５に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項57】

前記修飾抗体または抗体断片中のペプチドタグのセリン残基が、修飾４’−ホスホパンテテイン基とコンジュゲートしており、

【化239-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化239-2】

[この文献は図面を表示できません]

【化240-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化240-2】

[この文献は図面を表示できません]

【化241】

[この文献は図面を表示できません]

【化242】

[この文献は図面を表示できません]

【化243】

[この文献は図面を表示できません]

【化244】

[この文献は図面を表示できません]

【化245】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
ＴＧは、薬物部分、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、多糖、アセチル基、または表面である］から選択される構造を有する、請求項１から１８のいずれかに記載の修飾抗体または抗体断片を含む免疫コンジュゲート。

【請求項58】

コンジュゲートセリンが、

【化246】

[この文献は図面を表示できません]

である、請求項５７に記載の免疫コンジュゲート。

【請求項59】

Ｘ_２が、

【化247】

[この文献は図面を表示できません]

または−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である、請求項５８に記載の免疫コンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットでＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。２０１３年５月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５５１４２＿ＳＬ＿２．ｔｘｔとの名称を有し、そのサイズは１，８００，６９１バイトである。

【0002】

本発明は、部位特異的標識プロセスおよびそれによって生成される分子に関する。

【背景技術】

【0003】

コンジュゲーションは、タンパク質療法、抗体薬物コンジュゲート（antibody drug conjugate；ＡＤＣ）、ワクチン、組織選択的標的化ビヒクル、分子診断法、およびタンパク質核酸コンジュゲートなど、生物学的に活性なタンパク質の特性を最適化するために幅広く使用されている。伝統的なコンジュゲーション方法では、リシンをベースとした共有結合的ライゲーションを利用するが、このことによって、タンパク質の表面上にはリシンが多くあるので、均一性を達成することが困難になっている。

【0004】

タンパク質の部位特異的標識は、例えば、標識をタンパク質に共有結合させるためにヒトＯ^６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキル−トランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、ビオチンリガーゼ、トランスグルタミナーゼ、ソルターゼ、クチナーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用する翻訳後酵素反応によって達成することができる。

【0005】

ヒトＯ^６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキル−トランスフェラーゼを使用する翻訳後酵素反応では、ＡＧＴを、対象とする標的タンパク質に融合させ、続いて、ＡＧＴのための自殺基質である標識されたＯ^６−ベンジルグアニンを付加する（Keppleretら、Nat. Biotechnol. 21:86〜89、2003）。この手法は、ＳＮＡＰ−ｔａｇ（商標）と呼ばれる技術の基礎となっており、１８０アミノ酸タグを利用する（Tiratら、International Journal of Biological Macromolecules、39:66〜76、2006）。しかしながら、この手法を使用するタンパク質の標識は、Ｃ末端またはＮ末端でしか起こらない。

【0006】

ビオチンライゲーションでは、酵素ビオチンタンパク質リガーゼ（ＢＰＬ）は、ビオチンをある特定のカルボキシラーゼまたはデカルボキシラーゼのビオチンキャリヤードメインに結合させる。ＢＰＬは２ステップで、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）依存性反応である、ビオチンのカルボキシル基と、ビオチンキャリヤードメイン内の高度保存Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ（配列番号１０１７）認識設置モチーフ内に設置されている特異的リシン残基のε−アミノ基との間でのアミド結合の翻訳後形成を触媒する（Tiratら、International Journal of Biological Macromolecules、39:66〜76、2006）。この手法は、Ｃ末端に、Ｎ末端に、またはさらには標的タンパク質内に融合タグを創製するために使用することができ、ＢｉｏＥａｓｅ（商標）（７２アミノ酸タグ）およびＡｖｉＴａｇ（商標）（ビオチンリガーゼ、ＢｉｒＡ、および１５残基アクセプターペプチドタグ（ＡＰ）を使用）と呼ばれる技術のための基礎となっている。

【0007】

トランスグルタミナーゼは、アンモニアの喪失を伴うグルタミン（Ｇｌｎ）およびリシン（Ｌｙｓ）の側鎖間での安定なイソペプチド結合の形成を触媒し、インビトロでタンパク質中のグルタミン側鎖をフルオロフォアで標識するために使用されている（Satoら、Biochemistry 35:13072〜13080、1996）。また、細菌およびヒト組織トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧａｓｅおよびＴＧ２）が、種々のＩｇＧの翻訳後修飾を、ＩｇＧ重鎖内に設置されているＬｙｓまたはＧｌｎ側鎖を介して触媒するために使用されている（Mindtら、Bioconjugate Chem. 19:271〜278、2008; Jegerら、Angew. Chem. Int. 49:9995〜9997、2010）。

【0008】

ソルターゼは、タンパク質のＣ末端およびＮ末端部位特異的修飾のために使用されており、その場合、ソルターゼＡは、ペプチド転移反応を触媒する（Antosら、JACS、131:10800〜10801、2009）。

【0009】

クチナーゼは、加水分解に対して耐性のあるホスホナートリガンドと共に部位特異的共有付加物を形成する２２ｋＤａセリンエステラーゼである。クチナーゼは、抗体のＣ末端およびＮ末端部位特異的修飾、続く、表面上での固定化のために使用されている（Kwonら、Anal. Chem. 76:5713〜5720、2004; Hodnelandら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、99:5048〜5052、2002）。

【0010】

アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）およびペプチジルキャリヤータンパク質（ＰＣＰ）の４’−ホスホパンテテイニル化は、それぞれポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）および非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）による代謝産物合成の活性化に必要な必須翻訳後修飾に関係している（Fischbachら、Chem. Rev. 106(8):3468〜3496、2006）。ＡＣＰおよびＰＣＰのアポ型からホロ型への変換は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）の４’−ホスホ−パンテテイニル部分をタンパク質ドメインの不変セリン残基に結合させる４’−ホスホパンテテイン（ｐｐａｎ）トランスフェラーゼによって触媒される（Lambalotら、Chem. Biol. 3(11):923〜936、1996）。キャリヤータンパク質の同等に小さなサイズと、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが官能化ＣｏＡ類似体を基質として許容する能力とによって、研究者らはキャリヤータンパク質を、標的タンパク質を様々な小分子プローブで標識するための融合タグとして使用している（例えば、La Clairら、Chem. Biol. 11(2):195〜201、2004; Yinら、J. Am. Chem. Soc. 126(25):7754〜7755、2004を参照されたい）。キャリヤータンパク質タグのサイズをさらに縮小する努力において、Walshおよび共同研究者らは、ファージディスプレイを使用して、細菌４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＳｆｐ（サーファクチン産生（surfactin production）を担う遺伝子座位として以前に同定された）およびＡｃｐＳによって有効な基質として認識される８〜１２残基ペプチドを同定した（Yinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(44):15815〜15820, 2005; Zhouら、ACS Chem. Biol. 2(5):337〜346、2007; Zhouら、J. Am. Chem. Soc. 130(30):9925〜9930、2008）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞傷害性薬を局所送達するために癌の治療において使用されている（例えば、Lambert、Curr. Opinion In Pharmacology 5:543〜549、2005を参照されたい）。ＡＤＣは、薬物部分の標的化送達を可能とし、その際、最小限の毒性で最大の有効性を達成することができる。さらに多くのＡＤＣが有望な臨床結果を示しているので、様々な薬剤とのコンジュゲーションを可能にする、特に、癌療法において使用するために規定の薬物対抗体比を有する均一な免疫コンジュゲートを生成することができる部位特異的コンジュゲーションを可能にする反応性基を提供する安定な操作された抗体を開発する必要性が高まっている。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、かつ抗体または抗体断片の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片を提供する。本発明はさらに、そのような修飾抗体または抗体断片と、末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供する。本発明はまた、そのような修飾抗体、抗体断片、および免疫コンジュゲートを作製する方法、さらには、そのような組成物を使用する方法を提供する。

【0013】

一部の実施形態では、本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、かつ抗体または抗体断片の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含み、その際、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがＳｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体もしくは相同体型である、修飾抗体またはその断片を提供する。一部の実施形態では、ペプチドタグは、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＣＬＮ（配列番号３）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＣＬＮ（配列番号４）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＬＬＮ（配列番号５）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＳＬＮ（配列番号６）、ＧＳＱＤＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）、ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳ（配列番号１２）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１３）、ＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１４）、ＧＤＳＬＤＭ（配列番号１５）、ＬＤＳＶＲＭＭＡＬＡＡＲ（配列番号１６）、ＬＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＲ（配列番号１７）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）、ＤＶＬＤＳＬＥＦＩ（配列番号２０）、ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳ（配列番号２１）およびＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１３２）からなる群から選択される。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0014】

一部の実施形態では、本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、かつ抗体またはその断片のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片を提供する。一部の実施形態では、ペプチドタグは、表１に列挙されている任意の２個のアミノ酸の間に挿入されている。一部の実施形態では、本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、かつ抗体またはその断片のＣＨ１領域の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含む修飾抗体または抗体断片を提供する。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0015】

一部の実施形態では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインのアミノ酸残基２および３の間に、またはＶ_Ｈドメインのアミノ酸残基６３および６４の間に、またはＶ_Ｈドメインの６４および６５の間に、またはＣＨ１ドメインの１３８および１３９の間に、またはＣＨ１ドメインの１９７および１９８の間に、またはＣＨ３ドメインの３５９および３６０の間に、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間に、またはＣＨ３ドメインの４４７の後に挿入されている。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0016】

一部の実施形態では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶＨまたはＶＬドメインのアミノ酸残基２および３の間に、または軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間に、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６２および１６３の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、もしくは１９５および１９６の間に、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間、もしくは４４５および４４６の間、もしくは４４６および４４７の間に挿入されている。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0017】

一部の実施形態では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片の軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間に、ＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６２および１６３の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、もしくは１９５および１９６の間に、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間に挿入されている。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0018】

一部の実施形態では、ペプチドタグは、Ｖ_Ｈドメインのアミノ酸残基６２〜６４もしくは６２〜６５の間に、またはＣＨ１ドメインのアミノ酸残基１３３〜１３８の間に、またはＣＨ１ドメインの１８９〜１９５の間に、またはＣＨ１ドメインの１９０〜１９７の間にグラフトされている。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0019】

一部の実施形態では、本発明は、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、および／または配列番号１４１を含む修飾抗体または抗体断片を提供する。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0020】

一部の実施形態では、本発明は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号６３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８７、または配列番号３８８を含む修飾抗体または抗体断片を提供する。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0021】

一部の実施形態では、本発明は、配列番号３２、配列番号６３、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６５、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７１、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８１、または配列番号３８４を含む修飾抗体または抗体断片を提供する。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0022】

一実施形態では、本発明は、Ｓｆｐの基質であり、かつ抗体または抗体断片の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含み、その際、そのペプチドタグが、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＣＬＮ（配列番号３）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＣＬＮ（配列番号４）、ＧＤＳＬＳＷＬＶＲＬＬＮ（配列番号５）、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＳＬＮ（配列番号６）、ＧＳＱＤＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号７）、ＶＬＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳ（配列番号１２）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１３）、ＤＳＬＤＭＬＥＷ（配列番号１４）、ＬＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＲ（配列番号１７）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）、またはＤＳＬＥＦＩＡＳ（配列番号１１１６）である修飾抗体またはその断片を提供する。別の実施形態では、ペプチドタグは、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）、またはＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬ（配列番号１１３２）である。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0023】

一部の実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＡから選択されるアイソタイプである。一部の他の実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのサブタイプである。一部の実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片は、ヒトもしくはヒト化抗体または抗体断片である。具体的な実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片は、抗ＨＥＲ２抗体または抗ＨＥＲ２抗体断片である。本発明はさらに、そのような修飾抗体またはその断片を含む免疫コンジュゲートを提供する。

【0024】

本発明は、本明細書に記載の修飾抗体または抗体断片をコードする核酸、およびそのような核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0025】

本発明は、修飾抗体またはその断片と、末端基とを含み、その際、修飾抗体または抗体断片が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であり、かつ抗体または抗体断片の構造的ループ内に設置されている少なくとも１個のペプチドタグを含む免疫コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、この修飾抗体または抗体断片は、１個または複数の直交性コンジュゲーション部位をさらに含む。具体的な実施形態では、各直交性コンジュゲーション部位は、独立に、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、リシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、ホルミルグリシン、非天然アミノ酸、ピロリシン、およびピロリン−カルボキシリシンから選択される。

【0026】

本明細書において提供する別の態様は、修飾抗体または抗体断片と、修飾抗体または抗体断片中のペプチドタグに結合している末端基（ＴＧ）とを、式（Ｉ−ｂ）による構造を有するリンカー：

【0027】

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｌ_１は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー；酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーであり、
＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合している場所を示す］によって結合しており、
末端基は、薬物部分、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬（imaging reagent）、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、多糖、アセチル基、または表面である
、免疫コンジュゲートである。

【0028】

そのような免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、
Ｌ_１は、−Ａ_１Ｘ^２−または−Ｘ^２−であり、Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0029】

【化2-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化2-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0030】

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

【0031】

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

【0032】

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

【0033】

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

【0034】

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択される。

【0035】

そのような免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は、−Ａ_１Ｘ^２−または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0036】

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
Ａ_２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【0037】

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【0038】

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【0039】

【化11】

[この文献は図面を表示できません]

【0040】

【化12】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニルおよびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【0041】

【化13】

[この文献は図面を表示できません]

【0042】

そのような上述の免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、式（Ｉ−ｂ）のリンカーは、式（Ｉ−ｃ）による構造を有するリンカー：

【0043】

【化14】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0044】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は、−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は、

【0045】

【化15】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２は、結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は、−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−である。

【0046】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は、

【0047】

【化16】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−である。

【0048】

そのような免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は

【0049】

【化17】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_２は−Ａ_２−であり、この際、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、
Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は

【0050】

【化18】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_４は

【0051】

【化19】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0052】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２は結合−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４は結合である。

【0053】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｒ^４は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨであり、
Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４は結合である。

【0054】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−である。

【0055】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−である。

【0056】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２は−Ａ_２−であり、この際、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、
Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は、

【0057】

【化20】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ｌ_４は、

【0058】

【化21】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0059】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、
Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、
Ｌ_２は結合−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４は結合である。

【0060】

【0061】

そのような上述の免疫コンジュゲートの他の実施形態では、末端基は、抗炎症薬、抗癌薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、および麻酔薬から選択される薬物部分である。そのような免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害薬、ＨＳＰ９０阻害薬、ＩＡＰ阻害薬、ｍＴｏｒ阻害薬、微小管安定薬、微小管不安定化薬、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害薬、ＤＰＰＩＶ阻害薬、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害薬、タンパク質合成阻害薬、ＣＤＫ２阻害薬、ＣＤＫ９阻害薬、Ｅｇ５阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＤＮＡ損傷薬、ＤＮＡアルキル化薬、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ小溝結合薬、プロテアソーム阻害薬、ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬、およびＤＨＦＲ阻害薬から選択される。そのような免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、分光学的プローブは、フルオロフォア、クロモフォア、量子ドット、磁性プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬、または造影試薬（contrast reagent）から選択される。そのような免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、アフィニティープローブはビオチンである。

【0062】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式Ｂの構造を有する補酵素Ａ類似体：

【0063】

【化22】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］
が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、末端基を、式（Ｉ−ｂ）による構造を有するリンカー：

【0064】

【化23】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示す］
によってペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体または抗体断片を末端基で標識するステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0065】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0066】

【化24-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化24-2】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される。

【0067】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）ｉ）式（Ｄ）の化合物：

【0068】

【化25】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、式（Ｄ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基

【0069】

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は、官能基である］
をペプチドタグに結合させ、かつ
ｉｉ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ａ）の化合物
Ｘ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ａ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエン（oxanobornadiene）であるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−；であるか、
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｂ）による構造を有するリンカー：

【0070】

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ａ_１、Ｘ_２、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0071】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）ｉ）式（Ｅ）の化合物：

【0072】

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、式（Ｅ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基

【0073】

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は、官能基である］
をペプチドタグに結合させ、かつ
ｉｉ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｃ）の化合物
Ｘ−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｃ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｄ）による構造を有するリンカー：

【0074】

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ａ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0075】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）ｉ）式（Ｆ）の化合物：

【0076】

【化31】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、式（Ｆ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基

【0077】

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は、官能基である］
をペプチドタグに結合させ、かつ
ｉｉ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｅ）の化合物
Ｘ−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｅ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｆ）による構造を有するリンカー：

【0078】

【化33】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ｌ_２、Ａ_３、Ｘ_２、Ｌ_４、Ｒ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0079】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）ｉ）式（Ｇ）の化合物：

【0080】

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、式（Ｇ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基

【0081】

【化35】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は、官能基である］
をペプチドタグに結合させ、かつ
ｉｉ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｇ）の化合物
Ｘ−ＴＧ
式（ＩＩ−ｇ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｈ）による構造を有するリンカー：

【0082】

【化36】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、Ｘ_２、Ｒ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0083】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｈ）の化合物：

【0084】

【化37】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｈ−ａ）の保護ホスホペンタチエニル基：

【0085】

【化38】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１−ＰＧは、保護官能基Ｒ_１である］
をペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと、
（ｃ）保護ホスホペンタチエニル基を脱保護して、ペプチドタグに結合している式（Ｄ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基：

【0086】

【化39】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は官能基である］を得るステップと、
（ｄ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ａ）の化合物
Ｘ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ａ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］
と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｂ）による構造を有するリンカー：

【0087】

【化40】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ａ_１、Ｘ_２、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_２、ＰＧおよびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させるステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0088】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｊ）の化合物：

【0089】

【化41】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｊ−ａ）の保護ホスホペンタチエニル基：

【0090】

【化42】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１−ＰＧは、保護官能基Ｒ_１である］
をペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと、
（ｃ）保護ホスホペンタチエニル基を脱保護して、ペプチドタグに結合している式（Ｅ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基：

【0091】

【化43】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は官能基である］を得るステップと、
（ｄ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｃ）の化合物
Ｘ−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｃ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］
と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｄ）による構造を有するリンカー：

【0092】

【化44】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ａ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｒ_２、ＰＧ、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させるステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0093】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｋ）の化合物：

【0094】

【化45】

[この文献は図面を表示できません]

【0095】

【化46】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１−ＰＧは、保護官能基Ｒ_１である］
をペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと、
（ｃ）保護ホスホペンタチエニル基を脱保護して、ペプチドタグに結合している式（Ｆ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基：

【0096】

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は官能基である］を得るステップと、
（ｄ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｅ）の化合物
Ｘ−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｅ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］
と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｆ）による構造を有するリンカー：

【0097】

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ｌ_２、Ａ_３、Ｘ_２、Ｌ_４、Ｒ_２、ＰＧ、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させるステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0098】

本明細書において提供する別の態様は、
（ａ）ペプチドタグを含み、そのペプチドタグが、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｌ）の化合物：

【0099】

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｌ−ａ）の保護ホスホペンタチエニル基：

【0100】

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１−ＰＧは、保護官能基Ｒ_１である］
をペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を末端基（ＴＧ）で標識するステップと、
（ｃ）保護ホスホペンタチエニル基を脱保護して、ペプチドタグに結合している式（Ｇ−ａ）の活性化ホスホペンタチエニル基：

【0101】

【化51】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_１は官能基である］を得るステップと、
（ｄ）活性化ホスホペンタチエニル基の官能基Ｒ_１を式（ＩＩ−ｇ）の化合物
Ｘ−ＴＧ
式（ＩＩ−ｇ）
［式中、Ｘは、官能基Ｒ_１と反応する基であり、この際、
Ｘがチオールである場合、Ｒ_１は、チオール、マレイミド、もしくはハロアセトアミドであるか、または
Ｘがアジドである場合、Ｒ_１は、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、もしくはオキサノボルナジエンであるか、または
Ｘがトリアリールホスフィンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがオキサノボルナジエンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルキンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがアルケンである場合、Ｒ_１はアジドであるか、または
Ｘがシクロオクテンである場合、Ｒ_１は、ジアリールテトラジンであるか、または
Ｘがジアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、シクロオクテンであるか、または
Ｘがモノアリールテトラジンである場合、Ｒ_１は、ノルボルネンであるか、または
Ｘがノルボルネンである場合、Ｒ_１は、モノアリールテトラジンであるか、または
Ｘがアルデヒドである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがケトンである場合、Ｒ_１は、ヒドロキシルアミンもしくはヒドラジンもしくはＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−であるか、または
Ｘがヒドロキシルアミンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがヒドラジンである場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
ＸがＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−である場合、Ｒ_１は、アルデヒドもしくはケトンであるか、または
Ｘがハロアセトアミドである場合、Ｒ_１は、チオールであるか、または
Ｘがマレイミドである場合、Ｒ_１は、チオールである］
と反応させ、それによって、末端基を、式（ＩＩ−ｈ）による構造を有するリンカー：

【0102】

【化52】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、＊は、ホスホパンテテイニル部分がペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、Ｘ_２、Ｒ_２、ＰＧ、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］によってペプチドタグに結合させるステップと
を含むプロセスによる免疫コンジュゲートの調製である。

【0103】

上記の調製方法のある特定の実施形態では、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0104】

【化53-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化53-2】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＲ^４−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、

【0105】

【化54】

[この文献は図面を表示できません]

【0106】

【化55】

[この文献は図面を表示できません]

【0107】

【化56】

[この文献は図面を表示できません]

【0108】

【化57】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニル、およびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【0109】

【化58】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
ＴＧは、薬物部分、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、および多糖から選択される。

【0110】

上記の調製方法の他の実施形態では、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0111】

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

【0112】

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

【0113】

【化61】

[この文献は図面を表示できません]

【0114】

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

【0115】

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

【0116】

【化64】

[この文献は図面を表示できません]

【0117】

上記の調製方法の他の実施形態では、
Ｌ_１は、結合、−Ａ_１−、−Ａ_１Ｘ^２−、または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0118】

【化65-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化65-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0119】

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

【0120】

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【0121】

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

【0122】

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

【0123】

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

【0124】

本明細書において提供する別の態様は、修飾抗体またはその抗体断片中のペプチドタグのセリン残基が、式（Ｄ−ａ）、式（Ｅ−ａ）、式（Ｆ−ａ）、または式（Ｇ−ａ）の構造を有する４’−ホスホパンテテイン基：

【0125】

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

【0126】

【化72】

[この文献は図面を表示できません]

【0127】

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

【0128】

【化74】

[この文献は図面を表示できません]

【0129】

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

【0130】

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

【0131】

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
Ｒ^１は、チオール、マレイミド、ハロアセトアミド、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、オキサノボルナジエン、アジド、ジアリールテトラジン、ノルボルネン、モノアリールテトラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ＮＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、アルデヒド、またはケトンである］
とコンジュゲートしている本明細書において提供する修飾抗体または抗体断片を含むコンジュゲート抗体またはその抗体断片である。

【0132】

そのようなコンジュゲート抗体またはその抗体断片のある特定の実施形態では、４’−ホスホパンテテイン基は、

【0133】

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0134】

そのようなコンジュゲート抗体またはその抗体断片のある特定の実施形態では、コンジュゲートセリンは、

【0135】

【化79】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される構造を有する。

【0136】

そのようなコンジュゲート抗体またはその抗体断片の他の実施形態では、コンジュゲートセリンは、

【0137】

【化80】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0138】

本明細書において提供する別の態様は、ペプチドタグのセリン残基が、修飾４’−ホスホパンテテイン基とコンジュゲートしており、そのコンジュゲートセリンが、

【0139】

【化81-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化81-2】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１は、−Ａ_１Ｘ^２−または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0140】

【化82-1】

[この文献は図面を表示できません]

【化82-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0141】

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

【0142】

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

【0143】

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

【0144】

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニル、およびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【0145】

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
ＴＧは、薬物部分、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、イメージング試薬、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、多糖、アセチル基、または表面である］
から選択される構造を有する本明細書において提供する修飾抗体またはその抗体断片を含むコンジュゲート抗体またはその抗体断片である。

【0146】

そのようなコンジュゲート抗体またはその抗体断片のある特定の実施形態では、コンジュゲートセリンは、

【0147】

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

である。そのようなコンジュゲート抗体またはその抗体断片では、Ｘ_２は、

【0148】

【化89】

[この文献は図面を表示できません]

または−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−である。

【0149】

本発明はまた、有効量の本発明の免疫コンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または添加剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0150】

本発明は、癌などの疾患を治療する方法を提供し、この方法は、それを必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の免疫コンジュゲートを投与することを含む。一部の実施形態では、本発明は、医薬として使用するための免疫コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症（例えば、細菌、真菌、ウイルス）、遺伝的障害、心臓血管疾患、および／または代謝性疾患を治療するための医薬の製造における免疫コンジュゲートの使用を提供する。

【0151】

本発明は、本明細書に記載の免疫コンジュゲートを生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、４’−ホスホパンテテインによって一緒に連結している抗体または抗体断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートの形成を促進する適切な条件下で、本発明の修飾抗体または抗体断片、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、およびＣｏＡに連結した末端基をインキュベートすることを含む。具体的な実施形態では、適切な条件は、４℃〜３７℃の温度およびｐＨ６．５〜ｐＨ９．０を含む。

【0152】

本明細書に記載の免疫コンジュゲートを生成するそのような方法の別の実施形態では、この方法は、適切な条件下で、本発明の修飾抗体または抗体断片、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、およびＣｏＡに連結している末端基またはＣｏＡ類似体に連結している末端基をインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートの形成を促進することを含む。具体的な実施形態では、適切な条件は、４℃〜３７℃の温度およびｐＨ６．５〜ｐＨ９．０を含む。

【0153】

本明細書に記載の免疫コンジュゲートを生成するそのような方法の別の実施形態では、この方法は、
ｉ）適切な条件下で、本発明の修飾抗体または抗体断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびＣｏＡまたはＣｏＡ類似体と共にインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を抗体または抗体断片に結合させるステップであって、４’−ホスホパンテテインおよび４’−ホスホパンテテイン類似体は官能基を含むステップと、
ｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を、末端基に連結していてもよい反応性基と反応させ、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを形成するステップと
を含む。

【0154】

具体的な実施形態では、適切な条件は、４℃〜３７℃の温度およびｐＨ６．５〜ｐＨ９．０を含む。

【0155】

本明細書に記載の免疫コンジュゲートを生成するそのような方法の別の実施形態では、この方法は、
ｉ）適切な条件下で、本発明の修飾抗体または抗体断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびＣｏＡまたはＣｏＡ類似体と共にインキュベートし、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を抗体または抗体断片に結合させるステップであって、４’−ホスホパンテテインおよび４’−ホスホパンテテイン類似体は保護官能基を含むステップと、
ｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体の保護官能基を脱保護するステップと、
ｉｉｉ）４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体の脱保護官能基を、末端基に連結していてもよい反応性基と反応させ、それによって、４’−ホスホパンテテインまたは４’−ホスホパンテテイン類似体を含むリンカーによって一緒に連結している抗体または抗体断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを形成するステップと
を含む。

【0156】

具体的な実施形態では、適切な条件は、４℃〜３７℃の温度およびｐＨ６．５〜ｐＨ９．０を含む。

【0157】

定義
用語「アルケニル」または「アルケン」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する分枝または直鎖炭化水素を指す。二重結合のまわりに配置されている原子は、シス（Ｚ）またはトランス（Ｅ）配置である。本明細書で使用する場合、用語「Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_５アルケニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_７アルケニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_８アルケニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_４アルケン」、「Ｃ_２〜Ｃ_５アルケン」、「Ｃ_２〜Ｃ_６アルケン」、「Ｃ_２〜Ｃ_７アルケン」、および「Ｃ_２〜Ｃ_８アルケン」は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有し、少なくとも２個、多くて４、５、６、７、または８個の炭素原子をそれぞれ含有する分枝または直鎖炭化水素を指す。アルケニル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、エテニル、エタン、プロペニル、プロペン、アリル（２−プロペニル）、２−プロペン、ブテニル、ペンテニル、ペンテン、ヘキセニル、ヘプテニル、ヘプテン、オクテニル、ノネニル、ノネン、デセニル、デセンなどが含まれる。別段に指定していなければ、アルケニル基は一般に、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニルである。

【0158】

用語「アルキニル」または「アルキン」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する分枝または直鎖炭化水素ラジカルを指す。本明細書で使用する場合、用語「Ｃ_２〜Ｃ_４アルキニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_５アルキニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル」、「Ｃ_２〜Ｃ_７アルキニル」、および「Ｃ_２〜Ｃ_８アルキニル」は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有し、少なくとも２個、多くて４、５、６、７、または８個の炭素原子をそれぞれ含有する分枝または直鎖炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなどが含まれる。別段に指定していなければ、アルキニル基は一般に、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニルである。

【0159】

用語「アルキル」は、本明細書で使用する場合、飽和の分枝または直鎖炭化水素を指す。本明細書で使用する場合、用語「Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル」、「Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル」、「Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル」、「Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル」、「Ｃ_１〜Ｃ_７アルキル」、または「Ｃ_１〜Ｃ_８アルキル」は、少なくとも１個、多くて３、４、５、６、７、または８個の炭素原子をそれぞれ含有する飽和の分枝または直鎖炭化水素を指す。アルキル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが含まれる。別段に指定していなければ、アルキル基は一般に、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルである。

【0160】

用語「アルコキシ」は、本明細書で使用する場合、基−ＯＲ_ａを指し、この際、Ｒ_ａは、本明細書において定義するとおりのアルキル基である。本明細書で使用する場合、用語「Ｃ_１〜Ｃ_３アルコキシ」、「Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ」、「Ｃ_１〜Ｃ_５アルコキシ」、「Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ」、「Ｃ_１〜Ｃ_７アルコキシ」、および「Ｃ_１〜Ｃ_８アルコキシ」は、アルキル部分が少なくとも１個、多くて３、４、５、６、７、または８個の炭素原子を含有するアルコキシ基を指す。アルコキシ基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシなどが含まれる。

【0161】

用語「アリール」は、本明細書で使用する場合、合計６〜１４環員を有し、系中の少なくとも１個の環が芳香族である単環式、二環式、および三環式環系を指す。アリール基にはまたは、１個または複数の非芳香族炭化水素環に縮合した１個または複数の芳香環が含まれる。アリール基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、フェニル（Ｐｈ）、ナフチル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、アントラセニルなどが含まれる。アリール基は、１個または複数の置換基を含有してよく、したがって、「置換されていてもよい」。別段の指定がない限り、アリール基は、４個までの置換基を有し得る。

【0162】

用語「シクロアルキル」は、本明細書で使用する場合、飽和単環式、融合二環式、融合三環式、または架橋多環式環アセンブリを指す。本明細書で使用する場合、用語「Ｃ_３〜Ｃ_５シクロアルキル」、「Ｃ_３〜Ｃ_６シクロアルキル」、「Ｃ_３〜Ｃ_７シクロアルキル」、「Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキル」、「Ｃ_３〜Ｃ_９シクロアルキル」、および「Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキル」は、少なくとも３個、多くて５、６、７、８、９、または１０個の炭素原子を含有する飽和単環式、縮合二環式、縮合三環式、または架橋多環式環アセンブリを指す。シクロアルキル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、デカヒドロナフタレニルなどが含まれる。別段に指定していなければ、シクロアルキル基は一般に、Ｃ_３〜Ｃ_８シクロアルキルである。

【0163】

用語「シクロアルケニル」または「シクロアルケン」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する単環式、縮合二環式、縮合三環式、または架橋多環式環アセンブリを指す。二重結合のまわりに配置された原子は、シス（Ｚ）またはトランス（Ｅ）配置のいずれかである。単環式シクロアルケンは、１個または２個のアリール環に縮合していてよい。シクロアルケニル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロノネニル、シクロデセニルなどが含まれる。別段に指定していなければ、シクロアルケニル基は一般に、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルケニルである。

【0164】

用語「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する単環式、縮合二環式、縮合三環式、または架橋多環式環アセンブリを指す。単環式シクロアルキンは、１個または２個のアリール環に縮合していてよい。シクロアルキニル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、シクロプロピニル、シクロブチニル、シクロペンチニル、シクロヘキシニル、シクロヘプチニル、シクロオクチニル、シクロノニニル、シクロデシニルなどが含まれる。別段に指定していなければ、シクロアルキニル基は一般に、Ｃ_６〜Ｃ_８シクロアルキニルである。

【0165】

用語「ヘテロアリール」は、本明細書で使用する場合、窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員ヘテロ芳香族単環式環、窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を環員として有し、環のうちの少なくとも１個が芳香族である８〜１０員縮合二環式環、または窒素、酸素、および硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子を有し、環のうちの少なくとも１個が芳香族である１２〜１４員縮合三環式環を指す。そのような縮合二環式および三環式環系は、１個または複数のアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル環に縮合していてよい。ヘテロアリール基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、２−または３−フリル；１−、２−、４−、または５−イミダゾリル；３−、４−、または５−イソチアゾリル；３−、４−、または５−イソオキサゾリル；２−、４−、または５−オキサゾリル；４−または５−１，２，３−オキサジアゾリル；２−または３−ピラジニル；１−、３−、４−、または５−ピラゾリル；３−、４−、５−または６−ピリダジニル；２−、３−、または４−ピリジル；２−、４−、５−または６−ピリミジニル；１−、２−または３−ピロリル；１−または５−テトラゾリル；２−または５−１，３，４−チアジアゾリル；２−、４−、または５−チアゾリル；２−または３−チエニル；２−、４−または６−１，３，５−トリアジニル；１−、３−または５−１，２，４−トリアゾリル；１−、４−または５−１，２，３−トリアゾリル；１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−アクリジニル；１−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、または１０−ベンゾ［ｇ］イソキノリン；２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾオキサゾリル；１−、２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾイミダゾリル；２−、４−、５−、６−、または７−ベンゾチアゾリル；２−、３−、４−、５−、６−、７−ベンゾ［ｂ］チエニル；２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−ベンゾ［ｂ］オキセピン；２−、４−、５−、６−、７−、または８−ベンゾオキサジニル；１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８、または９−カルバゾリル；３−、４−、５−、６−、７−、または８−シンノリニル；２−、４−、または５−４Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］チアゾリル；２−、３−、５−、または６−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル；２−、３−、６−、または７−イミダゾ［１，２−ｂ］［１，２，４］トリアジニル；１−、３−、４−、５−、６−、または７−インダゾリル；１−、２−、３−、５−、６−、７−、または８−インドリジニル；１−、２−、３−、４−、５−、６−、または７−インドリル；１−、２−、３−、４−、５−、６−、または７−イソインドリル；１−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−イソキノリイル；２−、３−、４−、５−、６−、または７−ナフチリジニル；１−、２−、４−、５−、６−、７−、８−、または９−ペリミジニル；１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェナントリジニル；１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェナトロリニル；１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、または９−フェナジニル；１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェノチアジニル；１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−、または１０−フェノキサジニル；１−、４−、５−、６−、７−、または８−フタラジニル；２−、４−、６−、または７−プテリジニル；２−、６−、７−、または８−プリニル；２−、３−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、または１１−７Ｈ−ピラジノ［２，３−ｃ］カルバゾリル；２−、３−、５−、６−、または７−フロ［３，２−ｂ］−ピラニル；１−、３−、または５−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］−オキサゾリル；２−、３−、５−、または８−ピラジノ［２，３−ｄ］ピリダジニル；１−、２−、３−、４−、５−、または８−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］−ｏ−オキサジニル；１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、または９−キノリジニル；２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−キノリニル；２−、３−、４−、５−、６−、７−、または８−キナゾリニル；２−、３−、４−、または５−チエノ［２，３−ｂ］フラニル、および１−、３−、６−、７−、８−、または９−フロ［３，４−ｃ］シンノリニルが含まれる。

【0166】

用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用する場合、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、または硫黄（Ｓ）原子を指す。

【0167】

用語「ヘテロシクロアルキル」は、本明細書で使用する場合、炭化水素環構造の環炭素のうちの１〜４個が−Ｏ−、−ＮＲ−、および−Ｓ−から独立に選択される１〜４個の基によって置き換えられていて、この際、Ｒが水素、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、またはアミノ保護基である飽和３〜８員単環式炭化水素環構造、飽和６〜９員縮合二環式炭化水素環構造、または飽和１０〜１４員縮合三環式炭化水素環構造を指す。ヘテロシクロアルキル基の非限定的な例には、本明細書で使用する場合、アジリジニル、アジリジン−１−イル、アジリジン−２−イル、アジリジン−３−イル、オキシラニル、オキシラン−２−イル、オキシラン−３−イル、チイラニル、チイラン−２−イル、チイラン−３−イル、アゼタジニル、アゼタジン−１−イル、アゼタジン−２−イル、アゼタジン−３−イル、オキセタニル、オキセタン−２−イル、オキセタン−３−イル、オキセタン−４−イル、チエタニル、チエタン−２−イル、チエタン−３−イル、チエタン−４−イル、ピロリジニル、ピロリジン−１−イル、ピロリジン−２−イル、ピロリジン−３−イル、ピロリジン−４−イル、ピロリジン−５−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−４−イル、テトラヒドロフラン−５−イル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、テトラヒドロチエン−４−イル、テトラヒドロチエン−５−イル、ピペリジニル、ピペリジン−１−イル、ピペリジン−２−イル、ピペリジン−３−イル、ピペリジン−４−イル、ピペリジン−５−イル、ピペリジン−６−イル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピラン−２−イル、テトラヒドロピラン−３−イル、テトラヒドロピラン−４−イル、テトラヒドロピラン−５−イル、テトラヒドロピラン−６−イル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラン−２−イル、テトラヒドロチオピラン−３−イル、テトラヒドロチオピラン−４−イル、テトラヒドロチオピラン−５−イル、テトラヒドロチオピラン−６−イル、ピペラジニル、ピペラジン−１−イル、ピペラジン−２−イル、ピペラジン−３−イル、ピペラジン−４−イル、ピペラジン−５−イル、ピペラジン−６−イル、モルホリニル、モルホリン−２−イル、モルホリン−３−イル、モルホリン−４−イル、モルホリン−５−イル、モルホリン−６−イル、チオモルホリニル、チオモルホリン−２−イル、チオモルホリン−３−イル、チオモルホリン−４−イル、チオモルホリン−５−イル、チオモルホリン−６−イル、オキサチアニル、オキサチアン−２−イル、オキサチアン−３−イル、オキサチアン−５−イル、オキサチアン−６−イル、ジチアニル、ジチアン−２−イル、ジチアン−３−イル、ジチアン−５−イル、ジチアン−６−イル、アゼパニル、アゼパン−１−イル、アゼパン−２−イル、アゼパン−３−イル、アゼパン−４−イル、アゼパン−５−イル、アゼパン−６−イル、アゼパン−７−イル、オキセパニル、オキセパン−２−イル、オキセパン−３−イル、オキセパン−４−イル、オキセパン−５−イル、オキセパン−６−イル、オキセパン−７−イル、チエパニル、チエパン−２−イル、チエパン−３−イル、チエパン−４−イル、チエパン−５−イル、チエパン−６−イル、チエパン−７−イル、ジオキソラニル、ジオキソラン−２−イル、ジオキソラン−４−イル、ジオキソラン−５−イル、チオキサニル、チオキサン−２−イル、チオキサン−３−イル、チオキサン−４−イル、チオキサン−５−イル、ジチオラニル、ジチオラン−２−イル、ジチオラン−４−イル、ジチオラン−５−イル、ピロリニル、ピロリン−１−イル、ピロリン−２−イル、ピロリン−３−イル、ピロリン−４−イル、ピロリン−５−イル、イミダゾリニル、イミダゾリン−１−イル、イミダゾリン−３−イル、イミダゾリン−４−イル、イミダゾリン−５−イル、イミダゾリジニル、イミダゾリジン−１−イル、イミダゾリジン−２−イル、イミダゾリジン−３−イル、イミダゾリジン−４−イル、イミダゾリジン−４−イル、ピラゾリニル、ピラゾリン−１−イル、ピラゾリン−３−イル、ピラゾリン−４−イル、ピラゾリン−５−イル、ピラゾリジニル、ピラゾリジン−１−イル、ピラゾリジン−２−イル、ピラゾリジン−３−イル、ピラゾリジン−４−イル、ピラゾリジン−５−イル、ヘキサヒドロ−１，４−ジアゼピニル、ジヒドロフラニルジヒドロピラニル、１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、ピロリジニル−２−オン、ピペリジニル−３−オンピペリジニル−２−オン、ピペリジニル−４−オン、および２Ｈ−ピロリルが含まれる。

【0168】

用語「置換されていてもよい」は、本明細書で使用する場合、言及している基が、非置換の基の１個または複数の水素原子の代わりに１個または複数の追加の基（複数可）で置換されていても、置換されていなくてもよいことを意味する。存在してよいそのような基の個数は、１個から非置換の基上の水素原子の個数までの範囲である。任意選択の置換基は、別段の指定がない限り、個々に、かつ独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、メルカプチル、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、ペルハロアルキル、ペルフルオロアルキル、ならびに一置換および二置換アミノ基を含めたアミノ、ならびにそれらの保護誘導体から選択される。任意選択の置換基の非限定的な例には、ハロ（特にＦ、ＣｌおよびＢｒ）、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｒ、−ＮＯ_２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、−ＳＲ−、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｓ）Ｒ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ、−ＮＲＣＯ_２Ｒ、−ＮＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＲＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＲＮＲＣ（＝Ｏ）Ｒ、−ＮＲＮＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＲＮＲＣＯ_２Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＨＲ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＨＳ（＝Ｏ）_２、−ＮＨＳ（＝Ｏ）_２Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）_２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ）_２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ）Ｒ、−Ｃ（ＮＯＲ）Ｒ、−Ｓ（＝Ｏ）_３Ｒ、−ＮＲＳＯ_２Ｎ（Ｒ）_２、−ＮＲＳＯ_２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｒ、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ）_２、−Ｐ（＝Ｏ）_２Ｒ、−ＰＯ（Ｒ）_２、−ＯＰＯ（Ｒ）_２、−（ＣＨ_２）_０−２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｒで置換されていてもよいフェニル（Ｐｈ）、Ｒで置換されていてもよい−Ｏ（Ｐｈ）、Ｒで置換されていてもよい−（ＣＨ_２）_１〜２（Ｐｈ）、Ｒで置換されていてもよい−ＣＨ＝ＣＨ（Ｐｈ）、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロ置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、ハロ置換Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシが包含され、この際、各Ｒは独立に、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_６アルキニル、Ｃ_１〜Ｃ_６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、Ｃ_３〜８シクロアルキル、Ｃ_３〜８ヘテロシクロアルキル、ハロ置換のＣ_１〜Ｃ_６アルキル、ハロ置換のＣ_１〜Ｃ_６アルコキシから選択され、かつ同じ原子か、または隣接する接続原子上の２個のＲ基は、一緒になって、追加のＮ、Ｏ、またはＳを環員として含有してもよい５〜６員環を形成していてよい。アルキル、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキル基に適した置換基にはさらに、＝ＣＨＲ、＝Ｏ（オキソ）、および＝Ｎ−Ｒが含まれ得る。アリールまたはヘテロアリール基に好ましい置換基は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、−ＮＲ’_２、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’_２、−ＳＲ’、および−ＳＯ_２Ｒ’から選択され、この際、各Ｒ’は、ＨまたはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである。アルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基に好ましい置換基は、オキソ（＝Ｏ）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、−ＮＲ’_２、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４ハロアルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４アルコキシ−Ｃ_１〜Ｃ_４アルキル、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＲ’_２、−ＳＲ’、および−ＳＯ_２Ｒ’から選択され、この際、各Ｒ’は、ＨまたはＣ_１〜Ｃ_４アルキルである。

【0169】

用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、および非天然アミノ酸、さらには、天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物質を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、さらには、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタマート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣物質は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。

【0170】

用語「非天然アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、同じか、異なるかに関わらず、いずれの生体からの非修飾または修飾遺伝子を使用しても、いずれの生体においても生合成で産生され得ないアミノ酸構造を表すことが意図されている。加えて、そのような「非天然アミノ酸」は、タンパク質への組み込みには、修飾ｔＲＮＡおよび修飾ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を必要とすることは理解される。これらの「選択された」直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対は、非天然アミノ酸に特異的であり、Schultzらによって開発されたとおりの選択プロセス（例えば、Liuら、Annu. Rev. Biochem. 79:413〜444, 2010を参照されたい）または同様の手順によって生成される。用語「非天然アミノ酸」には、天然に存在する第２２番目のタンパク新生アミノ酸ピロリシン（Ｐｙｌ）、さらには、その脱メチル化類似体ピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ）は含まれない。それというのも、タンパク質への両方の残基の組み込みは、非修飾の天然に存在するピロリシル−ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼ対によって媒介されるためである（例えば、Ouら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108:10437〜10442、2011を参照されたい）。

【0171】

用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、対応する抗原に非共有で、可逆的に、かつ特異的に結合することが可能な免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含むテトラマーである。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣ_Ｌからなる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存されている領域に散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置されている３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的相補系の第１成分（Ｃｌｑ）を含めた宿主組織または因子との結合を媒介することができる。

【0172】

用語「抗体」には、これらだけに限定されないが、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれる。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）であってよい。

【0173】

軽鎖および重鎖は両方とも、構造的相同性および機能的相同性の領域に区分される。用語「定常」および「可変」は、機能について使用されている。この点について、軽（Ｖ_Ｌ）鎖および重（Ｖ_Ｈ）鎖部分の両方の可変ドメインが、抗原認識および特異性を決定していることは分かるであろう。逆に、軽鎖（Ｃ_Ｌ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、相補性結合などの重要な生物学的特性をもたらしている。慣例では、抗原結合部位または抗体のアミノ末端からより遠位になるほど、定常領域ドメインのナンバリングは大きくなる。Ｎ末端は可変領域であり、Ｃ末端は定常領域であり、ＣＨ３およびＣ_Ｌドメインは実際に、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。

【0174】

用語「抗体断片」は、本明細書で使用する場合、抗体の抗原結合断片または抗体の非抗原結合断片（例えば、Ｆｃ）を指す。用語「抗原結合断片」は、本明細書で使用する場合、抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）を保持している抗体の１つまたは複数の部分を指す。結合断片の例には、これらだけに限定されないが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）_２断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２個のＦａｂ断片を含む二価断片；Ｖ_ＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片；Ｖ_ＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら、Nature 341:544〜546、1989）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、または抗体の他のエピトープ結合断片が含まれる。

【0175】

さらに、Ｆｖ断片、Ｖ_Ｌ、およびＶ_Ｈの２個のドメインは別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、組換え法を使用して、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ領域対が一価分子を形成している単一タンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、一緒にすることができる（単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）として公知；例えば、Birdら、Science 242:423〜426、1988;およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879〜5883、1988を参照されたい）。そのような単鎖抗体はまた、用語「抗原結合断片」の範囲内に内包されることが意図されている。これらの抗原結合断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、断片は、無損傷抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。

【0176】

抗原結合断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、HollingerおよびHudson、Nature Biotechnology 23:1126〜1136、2005を参照されたい）。抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとする骨格にグラフトすることができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載している米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）。

【0177】

抗原結合断片は、相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成しているタンデムＦｖセグメント（Ｖ_Ｈ−ＣＨ１−Ｖ_Ｈ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子に組み込むことができる（Zapataら、Protein Eng. 8:1057〜1062、1995；および米国特許第５，６４１，８７０号）。

【0178】

用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用する場合、実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝源に由来する抗体および抗体断片を含めたポリペプチドを指す。この用語にはまた、単一分子組成の抗体分子の製剤も含まれる。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについての単一結合特異性およびアフィニティーを示す。

【0179】

用語「ヒト抗体」には、本明細書で使用する場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれる。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系配列もしくはヒト生殖細胞系配列の変異バージョン、または例えば、Knappikら、J. Mol. Biol. 296:57〜86、2000に記載されているとおりのヒトフレームワーク配列分析に由来するコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体に由来する。

【0180】

本発明のヒト抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでよい（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異、あるいは安定性または製造を促進するための保存的置換）。

【0181】

用語「ヒト化」抗体は、本明細書で使用する場合、ヒトにおける免疫原性は低いが、非ヒト抗体の反応性を保持している抗体を指す。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、かつ抗体の残りの部分をそのヒト対応部分で置き換えることによって、達成することができる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6851〜6855 (1984); MorrisonおよびOi、Adv. Immunol.、44:65〜92 (1988); Verhoeyenら、Science、239:1534〜1536 (1988); Padlan、Molec. Immun.、28:489〜498 (1991);Padlan、Molec. Immun.、31(3):169〜217 (1994)を参照されたい。

【0182】

用語「認識する」は、本明細書で使用する場合、エピトープが直鎖または配座異性であるかに関わらず、そのエピトープを見出し、それと相互作用（例えば、結合）する抗体またはその抗原結合性断片を指す。用語「エピトープ」は、本発明の抗体または抗原結合性断片が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸、またはタンパク質の三次折りたたみにより近接して並ぶ不連続アミノ酸の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒に曝露しても保持されるのに対して、三次元折りたたみにより形成されるエピトープは典型的には、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは典型的には、独特の空間立体構造内に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸を含む。エピトープの空間立体構造を決定する方法には当技術分野の技法、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴が含まれる（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology、Vol. 66、G. E. Morris編(1996)を参照されたい）。

【0183】

用語「アフィニティー」は、本明細書で使用する場合、単一抗原部位における抗体と抗原との相互作用の強度を指す。各抗原部位内において、抗体の可変領域「アーム」は、弱い非共有結合力を介して、抗原と多数の部位において相互作用し；相互作用が強いほど、アフィニティーは強い。

【0184】

用語「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、１種の抗原に特異的に結合する単離抗体は、交差反応性を他の抗原に対して有することがある。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または薬品を実質的に含まなくてよい。

【0185】

用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾されたバリアントは、同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を、またはアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重によって、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンが指定されるどの位置でも、コードされるポリペプチドを変更することなく、コドンを、記載した対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変形は、「サイレントバリエーション（silent variations）」であり、保存的に修飾された変形の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載のいずれの核酸配列も、可能性のあるすべての核酸のサイレントバリエーションを記載している。当業者であれば、核酸中の各コドン（ただし、通常はメチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常はトリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧは除外する）を、機能的に同一の分子が得られるように修飾することができることは分かるであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが、記載した各配列において暗に示されている。

【0186】

ポリペプチド配列については、「保存的に修飾されたバリアント」には、化学的に同様のアミノ酸でのアミノ酸の置換が結果として生じるポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、または付加が含まれる。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存的置換の表は、当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、多形バリアント、種間相同体、および本発明の対立遺伝子に対する追加であって、それらを排除するものではない。次の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。一部の実施形態では、用語「保存的配列修飾」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意な影響を及ぼさないか、またはそれを変更しないアミノ酸修飾を指すために使用されている。

【0187】

用語「最適化」は、本明細書で使用する場合、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生体、一般に真核細胞、例えば、酵母細胞、ピチア（Pichia）細胞、真菌細胞、トリコデルマ（Trichoderma）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用して、アミノ酸配列をコードするように変更されていることを指す。最適化ヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている出発ヌクレオチド配列によって本来コードされるアミノ酸配列を完全に、または可能な限り多く、保持するように操作されている。

【0188】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「パーセント同一」または「パーセント同一性」は、同じである２種以上の配列または部分配列を指す。下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限一致するように比較し、アラインさせた場合に、２つの配列が同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの指定パーセンテージ（すなわち、指定の領域にわたって、または指定されていない場合には、配列全体にわたって６０％同一性、任意選択により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一性）を有する場合に、その２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）長である領域にわたって、またはより好ましくは、１００〜５００または１０００以上のヌクレオチド（または２０、５０、２００以上のアミノ酸）長である領域にわたって存在する。

【0189】

配列比較では典型的には、１つの配列が基準配列として機能し、その基準配列に対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験および基準配列をコンピュータに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができるか、または代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムが、プロプラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0190】

「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される数の連続した位置のうちの任意の１つのセグメントに対する基準を含み、この際、配列を、２つの配列を最適にアラインさせた後に、同一数の連続した位置の基準配列と比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv. Appl. Math. 2:482c (1970)の局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似度検索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または手動アラインメントおよび目視検査（Brentら、Current Protocols in Molecular Biology, 2003を参照されたい）により、行うことができる。

【0191】

パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389〜3402、1977；およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403〜410、1990にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインさせた場合に、一部の正の値の閾値スコアＴにマッチまたは適合するクエリー配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（high scoring sequence pairs；ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシード配列として機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが上昇し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチ残基のリワードスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリックスが使用される。累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Ｘだけ減少した時に；１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアが０以下になった時に；またはいずれかの配列の末端に到達した時に、各方向でのワードヒットの延長は止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列では）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff、(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）は、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。

【0192】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析も行う（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5787、1993を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間での一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を基準核酸と比較して、最小合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満であると、核酸は基準配列に類似するとみなされる。

【0193】

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれていて、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを用いるE. MeyersおよびW. Miller、Comput. Appl. Biosci. 4:11〜17、1988）のアルゴリズムを使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列の間でのパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれていて、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用するNeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:444〜453、1970）のアルゴリズムを使用して決定することができる。

【0194】

上述の配列同一性のパーセンテージ以外に、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという別の指標は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載するとおり、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合には、ポリペプチドは典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子またはそれらの補体が、下記に記載するとおりのストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の指標は、同じプライマーを使用して、配列を増幅することができることである。

【0195】

用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用されており、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または一本鎖型もしくは二本鎖型のそれらのポリマーを指す。この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様に代謝される合成、天然に存在する、および天然に存在しない既知のヌクレオチド類似体または修飾主鎖残基もしくは連結を含有する核酸を内包する。そのような類似体の例には、限定ではないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル−メチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。

【0196】

別段に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、変質コドン置換体）および相補的配列、さらには明示された配列を暗に内包する。具体的には、下記で詳述するとおり、変質コドン置換体は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzerら、(1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsukaら、(1985) J. Biol. Chem. 260:2605〜2608;およびRossoliniら、(1994) Mol. Cell. Probes 8:91〜98）。

【0197】

核酸の文脈における用語「作動可能に連結している」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係性を指す。典型的には、これは、転写調節配列と転写配列との機能的関係性を指す。例えば、適切な宿主細胞または他の発現系においてコード配列の転写を刺激またはモジュレートするならば、プロモーターまたはエンハンサー配列は、コード配列に実施可能に連結している。一般に、転写配列に実施可能に連結しているプロモーター転写調節配列は、転写配列に物理的に連続している、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、物理的に連続していること、または転写を増強するコード配列に近接して設置されていることを必要としない。

【0198】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、１個または複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣物質であるアミノ酸ポリマー、さらには、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。別段に示さない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾されたバリアントも暗に内包する。

【0199】

用語「免疫コンジュゲート」または「抗体コンジュゲート」は、本明細書で使用する場合、抗体またはその抗体断片と、化学療法薬、毒素、免疫治療薬、イメージングプローブ、分光学的プローブなどの別の薬剤との連結を指す。連結は、共有結合、または静電力を介するような非共有相互作用であってよい。免疫コンジュゲートを形成するために、当技術分野で公知の様々なリンカーを使用することができる。加えて、免疫コンジュゲートを、免疫コンジュゲートをコードするポリヌクレオチドから発現され得る融合タンパク質の形態で提供することができる。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」は、別々のタンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含む）を本来はコードする２つ以上の遺伝子または遺伝子断片をつなぐことによって創製されるタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳の結果として、本来のタンパク質それぞれに由来する機能特性を有する単一のタンパク質が生じる。

【0200】

用語「対象」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。示されている場合を除いて、用語「患者」または「対象」は、本明細書では互換的に使用される。

【0201】

用語「細胞毒」または「細胞傷害性薬」は、本明細書で使用する場合、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性疾患を低減、阻害、または破壊するように作用し得る任意の薬剤を指す。

【0202】

用語「抗癌薬」は、本明細書で使用する場合、これらだけに限定されないが、細胞傷害性薬、化学療法薬、放射線療法および放射線治療薬、標的化抗癌薬、ならびに免疫治療薬を含めた、癌などの細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を指す。

【0203】

用語「末端基（ＴＧ）」は、本明細書で使用する場合、本発明の抗体または抗体断片とコンジュゲートする化学的部分または表面を指す。例えば、末端基は、抗癌薬、抗炎症薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、麻酔薬から選択される薬物部分であってよい。ある特定の実施形態では、薬物部分は、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害薬、ＨＳＰ９０阻害薬、ＩＡＰ阻害薬、ｍＴｏｒ阻害薬、微小管安定薬、微小管不安定化薬、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害薬、ＤＰＰＩＶ阻害薬、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害薬、タンパク質合成阻害薬、キナーゼ阻害薬、ＣＤＫ２阻害薬、ＣＤＫ９阻害薬、プロテアソーム阻害薬、ＲＮポリメラーゼ阻害薬、Ｅｇ５阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＤＮＡ損傷薬、ＤＮＡアルキル化薬、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ小溝結合薬、およびＤＨＦＲ阻害薬から選択される。適切な例には、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのオーリスタチン；ガンマ−カリチアマイシンなどのカリチアマイシン；ならびにＤＭ１およびＤＭ４などのマイタンシノイドが含まれる。これらのそれぞれを、本発明の抗体および方法と適合性のリンカーと結合させるための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Singhら、Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols、vol. 525、445〜457 (2009)を参照されたい。加えて、末端基は、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、スピン標識、赤外プローブ、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、表面、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、または多糖であってよい。末端基が表面である実施形態では、そのような固体支持体には、これらだけに限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれる。

【0204】

「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず、新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を指す。

【0205】

用語「抗腫瘍活性」は、腫瘍細胞の増殖速度、生存力、または転移活性を低減することを意味する。抗腫瘍活性を示す可能な方法は、療法の間に起きる異常な細胞の成長速度の下落または腫瘍サイズ安定性もしくは縮小を示すことである。そのような活性は、これらだけに限定されないが、異種移植モデル、同種移植モデル、ＭＭＴＶモデル、および抗腫瘍活性を調査するために当技術分野で公知の他の公知のモデルを含めた認められているインビトロまたはインビボ腫瘍モデルを使用して評価することができる。

【0206】

用語「悪性疾患」は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書で使用する場合、用語「癌」には、調節解除されているか、または制御から逸脱した細胞成長によって特徴付けられる悪性疾患が含まれる。例示的な癌には、癌腫、肉腫、白血病、およびリンパ腫が含まれる。

【0207】

用語「癌」には、原発性悪性腫瘍（例えば、その細胞が、元の腫瘍の部位以外の対象の身体部位へと移動していないもの）および続発性悪性腫瘍（例えば、元の腫瘍の部位とは異なる二次的部位へと腫瘍細胞が転移、遊走することから生じるもの）が含まれる。

【0208】

ペプチドタグを抗体に挿入する文脈における用語「挿入」は、ペプチドタグを抗体の２個の特定の残基間に組み込むことを意味する。抗体残基の総数は、挿入されたタグ残基の数だけ増加する。

【0209】

ペプチドタグを抗体に組み込む文脈における用語「グラフトすること」は、変異誘発によって抗体にペプチドタグを組み込むことを指す。例えば、非ＣＤＲループ内の短いアミノ酸残基ストレッチを、ペプチド配列によって置換する。この場合、抗体の残基の総数は変わらないままである。一部の実施形態では、用語「グラフトすること」はまた、ペプチドタグ残基の置換および挿入の組合せを内包する。例えば、ペプチドタグの一部を、構造的ループ残基の置換によって組み込む一方で、残りの部分は、非ＣＤＲループの特定の残基間に挿入する。ＩｇＧ抗体の残基の総数は、タグ残基の数未満の数だけ増加する。

【図面の簡単な説明】

【0210】

【図1】ＡＤＣの４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）媒介性生成の模式図である。

【図2-1】翻訳後４’−ホスホパンテテイニル化によって部位特異的抗体標識用のペプチドタグを含有するＩｇＧ１構築物の設計である。（Ａ）ＩｇＧ１構築物は、Ｖ_Ｈ、ＣＨ１、およびＣＨ３ドメインにペプチドタグ（下線付き）を含有する。（Ｂ）ＩｇＧ１構築物は、ＣＨ３、Ｖ_Ｌ、およびＣ_Ｌドメインにペプチドタグ（下線付き）を含有する。成功裏にクローニングされた設計構築物は、左側の欄にプラス（＋）の印でマーキングされている。不成功のクローニングは、マイナス（−）の印で示されている。成功裏にクローニングされた構築物は、非エクスプレッサー（−）およびエクスプレッサー（＋）（中央の欄）として分類されている。ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質（アセチルＣｏＡ基質を配列番号２８、１０５、１１８、１２０、１２３、および１２６のために使用した）が存在する状態で、何らかの検出可能なＳｆｐ触媒産物形成を示さないエクスプレッサーは、右の欄にマイナス（−）印でマーキングされている。個々のＭＣ−ＭＭＡＦＡＤＣの非常に低いが、検出可能な形成は、プラス（＋）の印で示されている。有意により効率的ではあるが、非定量的なＭＣ−ＭＭＡＦＡＤＣ形成は、二重のプラス（＋＋）の印で示されている。定量的に生成された、２個の末端基（ＴＧ）を有するＭＣ−ＭＭＡＦは、三重のプラス（＋＋＋）の等級で分類されている（ＨＰＬＣ分析による）。図２（Ａ）および図２（Ｂ）に開示されている残基位置は、各配列についてのＥｕナンバリングシステムによる対応する配列番号の指示「残基」である。図２（Ａ）は、それぞれすべて、出現順に、配列番号１１３０の残基１〜６８、配列番号９４の残基１〜８０、配列番号９５の残基１〜７９、配列番号９６の残基１〜８０、配列番号１１３０の残基１〜７２、配列番号９９の残基１〜８０、配列番号９７の残基１〜７９、配列番号９８の残基１〜７７、配列番号１１３０の残基１２２〜１９８、配列番号１００の残基１〜７７、配列番号１０２の残基１〜７７、配列番号１０１の残基１〜７７、配列番号１０５の残基１〜７７、配列番号１０７の残基１〜７７、配列番号１１３０の残基１２２〜１９０、配列番号１０８の残基１〜７６、配列番号１０３の残基１〜７５、配列番号１０６の残基１〜７４、配列番号１１３０の残基１６４〜２３１、配列番号１１８の残基４３〜１１５、配列番号１１０の残基４３〜１１５、配列番号１１３の残基４３〜１１４、配列番号１１３０の残基１６４〜２４０、配列番号１１９の残基４３〜１１９、配列番号１０９の残基４３〜１１９、配列番号１１２の残基４３〜１１９、配列番号１１１の残基４３〜１１９、配列番号１１４の残基４３〜１１９、配列番号１１５の残基４３〜１１９、配列番号１１６の残基４３〜１１９、配列番号１１７の残基４３〜１１９、配列番号１１３０の残基３２４〜４００、配列番号１２３の残基２０３〜２７９、および配列番号１２０の残基２０３〜２７９を開示している。図２（Ｂ）は、それぞれすべて、出現順に、配列番号１１３０の残基３２４〜３８８、配列番号１２２の残基２０３〜２７８、配列番号１２１の残基２０３〜２７９、配列番号１１３０の残基３７３〜４４９、配列番号１２４の残基２５２〜３２８、配列番号１２５の残基２５２〜３２８、配列番号１３５の残基２５２〜３２８、配列番号１３７の残基２５２〜３２８、配列番号１３８の残基２５２〜３２８、配列番号１１３０の残基３７３〜４４４、配列番号１３４の残基２５２〜３２８、配列番号１１３０の残基３９０〜４４９、配列番号１２７の残基２６９〜３４０、配列番号１２６の残基２６９〜３３５、配列番号１２９の残基２６９〜３３９、配列番号１３１の残基２６９〜３３７、配列番号１３０の残基２６９〜３３８、配列番号１３２の残基２６９〜３４０、配列番号１３６の残基２６９〜３４０、配列番号１１３０の残基３８３〜４４９、配列番号１４０の残基２６２〜３４１、配列番号１３９の残基２６２〜３４０、配列番号１４１の残基２６２〜３４０、配列番号１１３１の残基１〜６８、配列番号２６の残基１〜８０、配列番号２７の残基１〜７９、配列番号１１３１の残基７６〜１５２、配列番号３０の残基７６〜１６０、配列番号１１３１の残基１５０〜２１４、配列番号２９の残基４２〜１１７、および配列番号２８の残基４２〜１１８を開示している。

【図2-2】（図２−１の続き）

【図2-3】（図２−２の続き）

【図2-4】（図２−３の続き）

【図2-5】（図２−４の続き）

【図2-6】（図２−５の続き）

【図3】（Ａ）Ｉｇγ１重鎖のＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域の配列（配列番号９３）である。（Ｂ）Ｉｇκ軽鎖のＣ_Ｌドメインの配列（配列番号２４）。下線付きのアミノ酸は構造的ループである。アミノ酸位置は、Edelmanら、Proc. Natl. Acad. USA 63:78〜85(1969)に記載されているとおりのＥｕナンバリングシステムによってナンバリングされている。Ｘ’_１、Ｘ’_２、Ｘ’_３、Ｘ’_４、Ｘ’_５、およびＸ’_６は、ＩｇＧ１サブクラスおよびκアイソタイプ内のアロタイプ位置に存在する残基を示している（Jefferisら、MAbs. 1:332〜338(2009)による）。

【図4-1】（Ａ）トラスツズマブを伴う４種のヒトＩｇγサブクラスのＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびヒンジ領域の配列アラインメント（それぞれ出現順に、配列番号１１０９〜１１１３）である。（Ｂ）トラスツズマブを伴うＣ_Ｌドメインの配列アラインメント（それぞれ出現順に、配列番号１１１４〜１１１５）である。下線付きの残基は構造的ループに属する（図３も参照されたい）。四角で囲まれた残基は、Jefferisら、MAbs. 1:332〜338(2009)によって、アロタイプの位置を示している。単純にするために、ＩｇＧ１サブクラスおよびκアイソタイプ内のアロタイプ位置のみが示されている。ヒトＩｇγサブクラスおよびヒトκアイソタイプのタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（エントリー番号Ｐ０１８５７、Ｐ０１８５９、Ｐ０１８６０、Ｐ０１８６１、およびＰ０１８３４）に由来する。

【図4-2】（図４−１の続き）

【図4-3】（図４−２の続き）

【図5-A】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ａ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）のほぼ定量的な形成が確認される。

【図5-B】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｂ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）のほぼ定量的な形成が確認される。

【図5-C】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｃ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ３（配列番号１１１９）のほぼ定量的な形成が確認される。

【図5-D】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｄ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３（配列番号１１２０）の定量的形成が確認される。

【図5-E】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｅ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬ−Ｎ３８９（配列番号１１２１）のほぼ定量的な形成が確認される。

【図5-F】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｆ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１１２２）の定量的形成が確認される。

【図5-G】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｇ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲートｍＡｂ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１２３）のほぼ定量的な形成が確認される。

【図5-H】Ｓｆｐ触媒ＡＤＣ形成のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｈ）ＨＰＬＣトレースによって、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｉ２−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ３（配列番号１１２４）の部分的形成が例証される。

【図6-1】分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）による３種のトラスツズマブ免疫コンジュゲートの特徴付けによって、モノマーの非凝集ＡＤＣの形成を例証する。（Ａ）免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３（配列番号１１２０）のＡｎＳＥＣ分析。（Ｂ）免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１１２２）のＡｎＳＥＣ分析。

【図6-2】分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）による３種のトラスツズマブ免疫コンジュゲートの特徴付けによって、モノマーの非凝集ＡＤＣの形成を例証する。（Ｃ）免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬ−Ｎ３８９（配列番号１１２１）のＡｎＳＥＣ分析。

【図7】特定の位置にペプチドタグを組み込むことでのトラスツズマブの標識の失敗のＨＰＬＣ特徴付けである。ＨＰＬＣトレースは、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｓ１９０Ｄ−Ｓ１９１−Ｓ１９２Ｌ−Ｌ１９３Ｅ−Ｇ１９４Ｆ−Ｔ１９５Ｉ−Ｑ１９６Ａ−Ｔ１９７Ｓ−Ｙ１９８Ｋ−Ｉ１９９Ｌ（配列番号１１４）とＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦとのコンジュゲーションがないことを表示している。

【図8-A】ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦでの混合グラフト／挿入構築物の標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ａ）ＨＰＬＣトレースは、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｓ６３−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−Ｖ６４Ｌ−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｋ６５（配列番号１１２５）の部分的形成を表示している。

【図8-B】ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦでの混合グラフト／挿入構築物の標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｂ）ＨＰＬＣトレースは、免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｓ７６Ｄ−Ｓ７７−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−Ｌ７８−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ７９（配列番号１１２６）の形成がないことを表示している。

【図9-A】ＩｇＧへのフルオロフォア結合のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ａ）ＨＰＬＣトレースによって、抗体−フルオロフォアコンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｐ１８９Ｇ−Ｓ１９０Ｄ−Ｓ１９１−ｐｐａｎ−マレイミドエチルアミド−ＴＭＲ−Ｓ１９２Ｌ−Ｌ１９３Ｓ−Ｇ１９４Ｗ−Ｔ１９５Ｌ（配列番号１１２７）のほぼ定量的な形成が確認される。２８０および５５５ｎｍでモニタリングされたＨＰＬＣトレース間の広範な重複は、ほぼ定量的なフルオロフォアコンジュゲーションを表示している。

【図9-B】ＩｇＧへのフルオロフォア結合のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｂ）ＨＰＬＣトレースによって、抗体−フルオロフォアコンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−マレイミドエチルアミド−ＴＭＲ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１２８）のほぼ定量的な形成が確認される。２８０および５５５ｎｍでモニタリングされたＨＰＬＣトレース間の広範な重複は、ほぼ定量的なフルオロフォアコンジュゲーションを表示している。

【図10-A】加水分解マレイミド−またはブロモアセチルチオエーテル−連結細胞毒での抗体標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ａ）ＨＰＬＣトレースによって、マレイミド−開環ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）とのほぼ定量的なコンジュゲーションが確認される。

【図10-B】加水分解マレイミド−またはブロモアセチルチオエーテル−連結細胞毒での抗体標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｂ）ＨＰＬＣトレースによって、ＣｏＡ−Ａｃ−Ａｈｘ−ＭＭＡＦと抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）とのほぼ定量的なコンジュゲーションが確認される。

【図11-A】切断可能なリンカーを介して接続させた細胞毒での抗体標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ａ）ＨＰＬＣトレースによって、ＣｏＡ−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦと抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）とのほぼ定量的なコンジュゲーションが確認される。

【図11-B】切断可能なリンカーを介して接続させた細胞毒での抗体標識のＨＰＬＣ特徴付けである。（Ｂ）ＨＰＬＣトレースによって、ＣｏＡ−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦと抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）とのほぼ定量的なコンジュゲーションが確認される。

【図12】ｐＨの関数とした４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）触媒ＡＤＣ形成の最適化を示す。棒グラフ表示は、ｐＨの関数として、２の薬物対抗体比（ＤＡＲ）で生成したＡＤＣの量を示している。データは、５．０〜１０．０のｐＨ範囲でのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）または抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）のいずれかとの反応のＨＰＬＣ分析（２８０ｎｍ）に基づく。

【図13-A】２．５μＭ抗体、５０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（３７℃、１６時間）中のＳｆｐ酵素濃度の関数とした、コンジュゲーション反応の最適化を示す。（Ａ）脱重畳質量スペクトルは主に、０．１μＭのＳｆｐ濃度での非コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）を表示している。

【図13-B】２．５μＭ抗体、５０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（３７℃、１６時間）中のＳｆｐ酵素濃度の関数とした、コンジュゲーション反応の最適化を示す。（Ｂ）脱重畳質量スペクトルは、０．２５μＭのＳｆｐ濃度での抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）のほぼ定量的なＡＤＣ形成を表示している。

【図13-C】２．５μＭ抗体、５０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含有する５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）（３７℃、１６時間）中のＳｆｐ酵素濃度の関数とした、コンジュゲーション反応の最適化を示す。（Ｃ）脱重畳質量スペクトルは、０．５μＭのＳｆｐ濃度での抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）のほぼ定量的なＡＤＣ形成を表示している。

【図14-A】ｐＨ８．０でＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質濃度の関数とした、酵素的コンジュゲーション反応の最適化を示す。（Ａ）ＨＰＬＣトレースは、２．５μＭ（一番上のトレース）、７．５μＭ（中央のトレース）、または２５μＭ（一番下のトレース）のＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦを含有する２．５μＭ抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）との３つのコンジュゲーション反応を表している。４．９分の保持時間でのピークは、未標識の抗体（ＤＡＲ＝０）に対応し、５．３分でのピークは、一標識抗体（ＤＡＲ＝１）に対応し、５．７分でのピークは、二標識抗体（ＤＡＲ＝２）に対応する。

【図14-B】ｐＨ８．０でＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質濃度の関数とした、酵素的コンジュゲーション反応の最適化を示す。（Ｂ）棒グラフ表示は、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質濃度の関数として、２のＤＡＲを有する生成ＡＤＣの量を示している。一連の滴定タイトレーションを、０．２５μＭ（黒色の棒）または１．０μＭ（白色の棒）のいずれかのＳｆｐ酵素濃度で行った。

【図15】ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅゲル染色液を使用する示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によって測定したとおりのペプチドタグ付きＡＤＣの熱安定性を示す。（Ａ）免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）の熱安定性の決定。摂氏６８．５度および８１．５度の２つの遷移温度がＤＳＦによって観察される（２回の計測の平均）。（Ｂ）免疫コンジュゲート抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）の熱安定性の決定。摂氏６６．３度および８１．０度の２つの遷移温度がＤＳＦによって観察される（１回の測定）。（Ｃ）ペプチドタグ付きＡＤＣと比較するための基準として使用された未修飾トラスツズマブＩｇＧ１（抗ｈＨＥＲ２）の熱安定性の決定。摂氏６９．７度および８１．１度の２つの遷移温度がＤＳＦによって観察される（２回の測定の平均）。

【図16】２種のペプチドタグ付きトラスツズマブ免疫コンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）研究を示す。両方のＡＤＣの血漿力価を、個々の免疫コンジュゲートをプレートに吸収させたヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン３〜４）で捕捉し、続いて、抗ヒトＩｇＧおよび抗ＭＭＡＦ抗体で検出することによって決定した。（Ａ）ＥＬＩＳＡによる抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）および未修飾トラスツズマブ（抗ｈＨＥＲ２）抗体の血漿力価の比較。免疫コンジュゲートの血漿力価は、４日以内の迅速な減衰を示す。（Ｂ）ＥＬＩＳＡによる抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）および未修飾トラスツズマブ（抗ｈＨＥＲ２）抗体の血漿力価の比較。免疫コンジュゲートの血漿力価は、１４日間以内は、未修飾の抗ｈＨＥＲ２抗体の対象力価と密に平行する。

【図17】ＨＥＲ２発現性ＭＤＡ−２３１細胞系を使用しての、ペプチドタグ付き免疫コンジュゲートのインビトロ細胞殺滅アッセイを示す。プロットは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用しての細胞生存性測定に基づく。図は、それぞれ配列番号１１１７、１１１８、１１０８、および１１０７の「抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０」、「抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９」、「抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０」、および「抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９」を開示している。

【図18】ＩｇＧ抗体熱安定性に対する、ペプチドタグ挿入部位の影響を示すプロットである。ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅゲル染色液を使用する示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によれば、第１の遷移温度（Ｔｍ１）は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（アミノ酸残基２２８〜３４０）にペプチドタグ挿入を含有する抗体では有意に低下する。それとは逆に、Ｆａｂ領域のＣＨ１ドメインへのペプチドタグ挿入は抗体骨格を、Ｔｍ１値が一般に、６９．７℃のＴｍ１を有する未修飾トラスツズマブＩｇＧ１よりも摂氏３度以下低いかなりわずかな程度で不安定化する。

【図19-A】４のＤＡＲを有するＡＤＣの酵素による生成を示す。（Ａ）４のＤＡＲを有するＡＤＣは、ｙｂｂＲタグおよびＳ６タグなどの複数のペプチドタグを抗体に組み込むことによって生成することができる。

【図19-B】４のＤＡＲを有するＡＤＣの酵素による生成を示す。（Ｂ）ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと、Ｖ_ＨドメインにＳ６タグおよびＣＨ３ドメインにｙｂｂＲタグを含有するトラスツズマブＩｇＧ（抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３−Ｅ３８８−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１４２））とのＳｆｐ触媒コンジュゲーションのＨＰＬＣ分析。１μＭＳｆｐ酵素が存在する状態で、２．５μＭ抗体および５０μＭＣｏＡ基質を室温でインキュベーションすることで、４のＤＡＲを有するＡＤＣのほぼ定量的な形成につながる（ｔ_Ｒ＝６．１分、下方のトレース）。上方のトレースは、対応する脱共役抗体（ＤＡＲ＝０、ｔ_Ｒ＝５．２分）を表している。

【図20-1】高ＡＵＣＩｇＧ値および低ＡＵＣＩｇＧ値を示すペプチドタグ付きトラスツズマブ免疫コンジュゲートの薬物動態プロファイルである。配列番号２４８（Ａ）、配列番号３３（Ｂ）、配列番号２５１（Ｃ）、配列番号２１８（Ｄ）、配列番号２０２（Ｅ）、および配列番号２４４（Ｆ）に対応する６種のペプチドタグ付きＡＤＣのそれぞれを、１ｍｇ／ｋｇの単回用量で、３匹のマウスに静脈内投与した。３４０時間にわたって血漿試料を収集した後に、ヒトＨＥＲ２の固定化細胞外ドメインを使用することによって、トラスツズマブＡＤＣ分子を捕捉した。次いで、抗ＭＭＡＦまたは抗ｈＩｇＧ抗体のいずれかに基づく２つのＥＬＩＳＡフォーマットによって、血漿力価を決定した。第１のフォーマットが、「無損傷」ＡＤＣの濃度についての読み出しを提供する一方で、後者のフォーマットは、コンジュゲートトラスツズマブ分子および非コンジュゲートトラスツズマブ分子の両方を含む、全ＩｇＧの濃度に比例したシグナルを生成する。Ａ〜Ｃは、高いＡＵＣＩｇＧ値を示すペプチドタグ付きＭＭＡＦＡＤＣのＰＫ曲線を例示しているのに対して、Ｄ〜Ｆは、非常に低いＡＵＣＩｇＧ値を示す免疫コンジュゲートの例を示している。すべての場合に、抗ＭＭＡＦおよび抗ｈＩｇＧ力価は互いに密に平行し、その際、ＰＫ研究の時間経過の間に、ＭＭＡＦペイロードの無視できる脱コンジュゲーションを示す。

【図20-2】（図２０−１の続き）

【図20-3】（図２０−２の続き）

【図21】８６ペプチドタグ付きＡＤＣの抗ＭＭＡＦおよび抗ｈＩｇＧ力価間の相関を示す。このプロットによれば、全ＩｇＧおよび「無損傷」ＡＤＣの濃度読み出しは、互いに密に一致し、そのことによって、ＭＭＡＦペイロードおよびペプチドタグ付き抗体との間の高度に安定なｐｐａｎ−ＭＣ連結が示唆されている。インビボでのＭＭＡＦ薬物の無視できる脱コンジュゲーションの他に、この高度に直線的な相関は、共有結合によるペイロードの結合が、免疫コンジュゲートの薬物動態プロファイルに負の影響を及ぼさないことも示している。

【図22】オキシムライゲーションによって末端基（ＴＧ）を後で結合させるための、カルボニル官能化ＣｏＡ類似体でのＡ１タグ付き抗体の翻訳後修飾を伴う２ステップ法を示す。第１のステップでは、細胞培地中で、Ａ１タグ付き抗体をケトン−またはアルデヒド−官能化ＣｏＡ類似体で部位特異的に標識する。タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーの後に、ｐｐａｎ部分のカルボニル基をアミノオキシ誘導体化ＴＧと反応させる。

【図23】ヒト腫瘍細胞系を移植された免疫不全ヌードマウスにおけるｙｂｂＲタグ付きトラスツズマブＡＤＣ抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１１２２）のインビボ有効性研究を示す。異種移植片腫瘍モデルを、ＨＥＲ２依存性乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６を皮下投与したｎｕ／ｎｕマウスで行った。腫瘍を約２００ｍｍ^３のサイズまで成長させた後に、ｙｂｂＲタグ付きＡＤＣ３ｍｇ／ｋｇ（▲）、５ｍｇ／ｋｇ（●）の単回用量、またはビヒクルのみ（■）を、１処置群あたり９匹のマウスに静脈内注射した。垂直の矢印は、ＡＤＣ投与時点を示している。腫瘍成長を毎週モニタリングすることで、両方の用量レベルが結果として腫瘍の退縮をもたらしたことが明らかとなり、このことによって、ペプチドタグ付きＡＤＣのインビボ有効性が実証された。

【発明を実施するための形態】

【0211】

本発明は、対象とする抗体の１つまたは複数の特定部位に組み込まれたペプチド配列（「ペプチドタグ」）の翻訳後修飾を触媒する４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質（「ＰＰＴアーゼ」）を使用して、抗体を部位特異的に標識する方法を提供する。周囲反応条件下での酵素標識によって、抗体に組み込まれたペプチドタグ内の特異的セリン残基の定量的および不可逆的共有結合修飾が可能となり、したがって、所望の抗体コンジュゲートが創製される。

【0212】

ＰＰＴアーゼに広い基質認容性があるので、本発明による部位特異的抗体標識は、抗癌薬、フルオロフォア、ペプチド、糖、洗浄薬、ポリエチレングリコール、免疫賦活薬、放射性イメージングプローブ、プロドラッグ、および他の分子などの様々な化学的にアクセス可能な標識試薬で達成することができる。さらに、ＰＰＴアーゼを使用して、ペプチドタグ付き抗体を、ポリスチレンナノ粒子および金表面などの固体支持体上に固定化することができる（例えば、機能性酵素を固定化する方法については、Wongら、Org. Biomol. Chem. 8: 782〜787, 2010; Wongら、Nanoscale 4:659〜666, 2012を参照されたい）。

【0213】

したがって、本発明は、癌療法において使用するための規定の薬物対抗体比を有する均一な免疫コンジュゲートを調製する方法、およびそれによって調製された免疫コンジュゲート、さらにはこれらの免疫コンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。本発明の方法は、当技術分野で公知の他のコンジュゲーション方法と組み合わせて使用することができる。

【0214】

１．抗体の操作
部位特異的標識
本発明による「構造的ループ」または「非ＣＤＲ−ループ」は、下記のように理解されたい：抗体は、免疫グロブリンフォールドを伴うドメインから作製されている。本質的に、逆平行βシートはループによって接続されて、圧縮された逆平行βバレルを形成している。可変領域では、ドメインのループのうちの一部が、抗体の特異性、すなわち、抗原への結合に本質的に寄与する。これらのループは、「ＣＤＲ−ループ」と呼ばれる。抗体ドメインの他のループはすべて、分子構造および／またはエフェクター機能にむしろ寄与している。これらのループは本明細書では、「構造的ループ」または「非ＣＤＲ−ループ」と定義される。

【0215】

本発明の抗体（例えば、１個または複数の天然に存在しないアミノ酸を含有してもよい親抗体または天然抗体）は、Edelmanら、Proc. Natl. Acad. USA 63:78〜85(1969)において示されているとおりのＥｕナンバリングシステムによってナンバリングされている。ヒトＩｇＧ１定常領域を、本出願を通じて代表として使用している。しかしながら、本発明はヒトＩｇＧ１に限定されることなく；対応するアミノ酸位置を、配列アラインメントによって容易に演繹することができる。例えば、図３（Ａ）は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を示しており、この際、構造的ループは下線を付されており、これらの下線を付された構造的ループは、図４（Ａ）の配列アラインメントにおいて示されているとおりＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４について容易に同定することができる。図３（Ｂ）は、軽鎖定常領域を示しており、この際、構造的ループは下線を付されている。軽鎖定常領域では、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は同一である。次の表１に、それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の構造的ループにおけるアミノ酸位置を列挙する。

【0216】

【表1-1】

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【表1-2】

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【表1-3】

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【0217】

図３、さらには配列番号２４および９３は、Ｉｇκ軽鎖定常領域およびＩｇγ−１重鎖定常領域の配列をそれぞれ表している。配列番号２４および９３中のＸ’_１、Ｘ’_２、Ｘ’_３、Ｘ’_４、Ｘ’_５、およびＸ’_６は、ＩｇＧ１サブクラスおよびκアイソタイプ内のアロタイプ位置に存在する残基を示している（Jefferisら、MAbs. 1:332〜338(2009)による）。Ｘ’_１は、ＡｒｇまたはＬｙｓであってよく、Ｘ’_２は、ＡｓｐまたはＧｌｕであってよく、Ｘ’_３は、ＬｅｕまたはＭｅｔであってよく、Ｘ’_４は、ＡｌａまたはＧｌｙであってよく、Ｘ’_５は、ＶａｌまたはＡｌａであってよく、Ｘ’_６は、ＬｅｕまたはＶａｌであってよい。

【0218】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体定常領域の高い配列相同性により、本発明の所見は、いずれの特定の抗体にも限定されない。加えて、本発明の所見は、ＰＰＴアーゼの使用に限定されない。本明細書において同定する抗体構造的ループ内での位置はまた、酵素ビオチンタンパク質リガーゼ（ＢＰＬ）、トランスグルタミナーゼ、およびホルミルグリシン形成酵素などの他の酵素的コンジュゲーション手法のための基質である他のペプチドタグを組み込むために使用することができる。

【0219】

一態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、それ自体が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含み、前記ペプチドタグは、修飾抗体またはその断片の構造的ループ、またはＣ−もしくはＮ末端内に設置されている。本発明はまた、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片を提供し、この際、前記ペプチドタグは、抗体またはその断片の構造的ループ、またはＣ−もしくはＮ末端内に設置されている。具体的な実施形態では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。一態様では、ペプチドタグを、前記抗体またはその断片の構造的ループの２個のアミノ酸の間に挿入する。別の態様では、ペプチドタグを、前記抗体またはその断片の構造的ループ、Ｃ−、またはＮ末端にグラフトし、この際、ペプチドタグは、親抗体またはその断片の１個または複数のアミノ酸に置き換わる。一態様では、構造的ループは、前記抗体またはその断片のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域に設置されている構造的ループを指す。修飾抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグをその構造的ループ中に含有してよい。一態様では、修飾抗体または抗体断片は、２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグをその構造的ループ中に含有する。別の態様では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一態様では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。別の態様では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、またはそれらの変異体に対する相同タンパク質である。一実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、好熱生物に由来する。一部の実施形態では、親抗体（ペプチドタグが組み込まれていない抗体）は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。一部の実施形態では、親抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の他の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0220】

「４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質」は、本明細書で使用する場合、記載されている構造が、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよびＣｏＡまたは末端基が結合しているＣｏＡ類似体と接触させた場合に、本明細書のスキームＩａに図示されているとおり４’−ホスホパンテテイン（ｐｐａｎ）または修飾ｐｐａｎ基のためのアクセプターとして役立ち得ることを意味する。

【0221】

一態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣ_Ｌ領域を含み、前記ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣ_Ｌ領域はさらに、それ自体が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含む。本発明はまた、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣ_Ｌ領域を含む修飾抗体またはその断片を提供し、この際、前記ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣ_Ｌ領域は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグをさらに含む。一部の実施形態では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドタグを、前記抗体またはその断片の構造的ループの２個のアミノ酸の間に挿入する。一部の実施形態では、ペプチドタグを、前記抗体またはその断片の構造的ループにグラフトする。修飾抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、その構造的ループ中に１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有してよい。一部の実施形態では、修飾抗体または断片は、その構造的ループ中に２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有する。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、またはそれらの変異体に対する相同タンパク質である。一実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、好熱生物に由来する。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。具体的な実施形態では、親抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0222】

本明細書で使用する場合、活性を「保持している」とは、記載されている酵素が、枯草菌（B. subtilis）Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼである基準物質に対して少なくとも約１０％の活性を維持していることを意味する（例えば、Quadriら、Biochemistry 37: 1585〜1595(1998)を参照されたい）。例えば、異なる４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼまたはその酵素の変異体型は、同一反応条件下で、すなわち、同じＣｏＡ基質、同じペプチドタグ付き抗体、同一の緩衝液条件、同一の基質および酵素濃度、同じ温度、ならびに同じ反応期間を使用して、Ｓｆｐと比較して、少なくとも約１０％の４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持している。

【0223】

一態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、それ自体が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含み、前記ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶ_Ｈドメインの２位および３位の間、Ｖ_Ｈドメインの６３位および６４位の間、Ｖ_Ｈドメインの６４位および６５位の間、ＣＨ１ドメインの１３８位および１３９位の間、ＣＨ１ドメインの１９７位および１９８位の間、ＣＨ３ドメインの３５９位および３６０位の間、ＣＨ３ドメインの３８８位および３８９位の間、ＣＨ３ドメインのＣ末端（Ｌｙｓ４４７の後）、および／またはＶ_Ｌドメインの２位および３位の間に挿入されている。別の態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、それ自体が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含み、ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶＨもしくはＶＬドメインのアミノ酸残基２および３の間、または軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間、もしくは４４５および４４６の間、もしくは４４６および４４７の間に挿入されている。一部の実施形態では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片の軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６５および１６６の間、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間に挿入されている。

【0224】

一態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、および／または配列番号１４１を含む。別の態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体または抗体断片は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号６３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８７、または配列番号３８８を含む。一部の実施形態では、修飾抗体または抗体断片は、配列番号３２、配列番号６３、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６８、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７４、または配列番号３８４を含む。

【0225】

本明細書に記載の免疫コンジュゲートに関して、一態様では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。修飾抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、その構造的ループ中に１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有してよい。一実施形態では、修飾抗体または抗体断片は、その構造的ループ中に２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有する。別の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。具体的な実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼはＳｆｐであり、ペプチドタグは、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、およびＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）から選択される。一実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ１抗体である。別の具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0226】

別の態様では、本発明は、修飾抗体またはその断片と末端基とを含む免疫コンジュゲートを提供し、この際、前記修飾抗体またはその断片は、それ自体が４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含み、前記ペプチドタグは、抗体またはその断片の構造的ループ、またはＣ−もしくはＮ末端にグラフトされている。具体的な実施形態では、前記ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶ_Ｈドメインのアミノ酸位置６２〜６４（アミノ酸６２および６３での変異、ならびにアミノ酸６３および６４の間への残りのペプチドタグの挿入）に、Ｖ_Ｈドメインのアミノ酸位置６２から６５（アミノ酸６２〜６４での変異、ならびにアミノ酸６４および６５の間への残りのペプチドタグの挿入）に；ＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１３３〜１３９（アミノ酸１３３〜１３８の変異、ならびにアミノ酸１３８〜１３９間への残りのペプチドタグの挿入）に、ＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１８９〜１９５に、および／またはＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１９０〜１９８（アミノ酸１９０〜１９７の変異、ならびに１９７および１９８の間への残りのペプチドタグの挿入）にグラフトされている。一実施形態では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。修飾抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、その構造的ループ中に１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有してよい。一実施形態では、修飾抗体または抗体断片は、その構造的ループ中に２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有する。別の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。具体的な実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼはＳｆｐであり、ペプチドタグは、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、およびＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）から選択される。一実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。具体的な実施形態では、親抗体はＩｇＧ１抗体である。別の具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0227】

別の態様では、本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片を提供し、この際、前記ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶ_Ｈドメインの２位および３位の間、Ｖ_Ｈドメインの６３位および６４位の間、Ｖ_Ｈドメインの６４位および６５位の間、ＣＨ１ドメインの１３８位および１３９位の間、ＣＨ１ドメインの１９７位および１９８位の間、ＣＨ３ドメインの３５９位および３６０位の間、ＣＨ３ドメインの３８８位および３８９位の間、ＣＨ３ドメインのＣ末端（Ｌｙｓ４４７の後）、および／またはＶ_Ｌドメインの２位および３位の間に挿入されている。別の態様では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶＨもしくはＶＬドメインのアミノ酸残基２および３の間、または軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６４および１６５の間、もしくは１６５および１６６の間、もしくは１９４および１９５の間、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間、もしくは４４５および４４６の間、もしくは４４６および４４７の間に挿入されている。一部の実施形態では、ペプチドタグは、親抗体またはその断片の軽鎖のアミノ酸残基１１０および１１１の間、またはＣＨ１ドメインの１１９および１２０の間、もしくは１２０および１２１の間、もしくは１３５および１３６の間、もしくは１３６および１３７の間、もしくは１３８および１３９の間、もしくは１６５および１６６の間、またはＣＨ３ドメインの３８８および３８９の間に挿入されている。

【0228】

別の態様では、本発明は、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、および／または配列番号１４１を含む修飾抗体またはその断片を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号６３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３９、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７８、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２７７、配列番号３４８、配列番号３４９、配列番号３５６、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７３、配列番号３７４、配列番号３８０、配列番号３８４、配列番号３８６、配列番号３８７、または配列番号３８８を含む修飾抗体またはその断片を提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号３２、配列番号６３、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３２、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５９、配列番号２６８、配列番号３５８、配列番号３５９、配列番号３６４、配列番号３６５、配列番号３６７、配列番号３７４、または配列番号３８４を含む修飾抗体またはその断片を提供する。

【0229】

一態様では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、その構造的ループ中に１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有してよい。一部の実施形態では、抗体または断片は、その構造的ループ中に２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有する。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。具体的な実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐであり、ペプチドタグは、
ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、およびＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）から選択される。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。具体的な実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0230】

別の態様では、本発明は、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質であるペプチドタグを含む修飾抗体またはその断片を提供し、この際、前記ペプチドタグは、抗体またはその断片の構造的ループ、またはＣ−もしくはＮ末端にグラフトされている。一部の実施形態では、前記ペプチドタグは、親抗体またはその断片のＶ_Ｈドメインのアミノ酸位置６２〜６４（アミノ酸６２および６３での変異、ならびにアミノ酸６３および６４の間への残りのペプチドタグの挿入）に、Ｖ_Ｈドメインのアミノ酸位置６２から６５（アミノ酸６２〜６４での変異、ならびにアミノ酸６４および６５の間への残りのペプチドタグの挿入）に；ＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１３３〜１３９（アミノ酸１３３〜１３８の変異、ならびにアミノ酸１３８〜１３９間へのペプチドタグの挿入）に、ＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１８９〜１９５に、および／またはＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１９０〜１９８（アミノ酸１９０〜１９７の変異、ならびに１９７および１９８の間への残りのペプチドタグの挿入）にグラフトされている。一実施形態では、前記ペプチドタグは、表２に記載されているものから選択される１個または複数のペプチドである。修飾抗体重鎖および／または軽鎖（またはその断片）は、その構造的ループ中に１、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有してよい。一実施形態では、修飾抗体または抗体断片は、その構造的ループ中に２、４、６、８個、またはそれ以上のタンパク質タグを含有する。別の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ、ヒトＰＰＴアーゼ、または４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を保持しているそれらの変異体型である。一実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、ヒト（Homo sapiens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、大腸菌（Escherichia coli）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・テルモセルム（Clostridium thermocellum）、さらには、任意の他の哺乳動物、細菌、または真菌ゲノムに由来する。一部の実施形態では、前記４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼはＳｆｐであり、ペプチドタグは、ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ（配列番号１）、ＧＤＳＬＳＷＬ（配列番号２）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９）、ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ（配列番号１０）、ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ（配列番号１８）、およびＤＳＬＥＦＩＡＳＫ（配列番号１９）から選択される。一実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＡ抗体である。具体的な実施形態では、親抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、親抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。

【0231】

ある特定の態様では、本明細書で提供する修飾抗体は、１つまたは複数の直交性コンジュゲーション部位を含有するように操作されている。そのような直交性コンジュゲーション部位は、これらだけに限定されないが、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、ヒト４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの基質、リシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、非天然アミノ酸、ピロリシンおよびピロリン−カルボキシ−リシンを含む。直交性コンジュゲーション部位はまた、酵素的に、または化学的に修飾され得るペプチド配列、例えば、テトラシステインタグ、ＬＰＸＴＧ−ソルターゼペプチド（配列番号１０５７）（Ｘは任意のアミノ酸である）、ビオチンアクセプターペプチド、ＣＸＰＸＲ−アルデヒドタグ（配列番号１０５８）（Ｘは任意のアミノ酸である）、またはＨｉｓタグであってよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法を、これらだけに限定されないが、システイン、リシン、ヒスチジン、チロシン、ホルミル−グリシン、ピロリシン、ピロリン−カルボキシリシン、および非天然アミノ酸を介しての化学選択的コンジュゲーションを含めた当技術分野で公知の他のコンジュゲーション方法と組み合わせて使用して、そのような操作された抗体を標識する。

【0232】

ある特定の態様では、酵素ＳｆｐおよびＡｃｐＳを、抗体のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域に設置されたＳシリーズのペプチド（例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６およびＳ７）およびＡシリーズのペプチド（例えば、Ａ１、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４およびＡ−６）（表２も参照されたい）を含有するように操作された抗体上に、同じか、または２種の異なる標識を直交的部位特異的に標識するために使用する。

【0233】

他の態様では、酵素ＳｆｐおよびＡｃｐＳを、抗体のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域に設置されたｙｂｂＲシリーズのペプチド（例えば、ｙｂｂＲ１１、ｙｂｂＲ１２、およびｙｂｂＲ１３）およびＡシリーズのペプチド（例えば、Ａ１、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４およびＡ−６）を含有するように操作された抗体上に、２種の異なる標識を直交的部位特異的に標識するために使用する。

【0234】

他の態様では、酵素ＳｆｐまたはＡｃｐＳを、抗体のＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣ_Ｌ領域に設置されたｙｂｂＲシリーズのペプチド（例えば、ｙｂｂＲ１１、ｙｂｂＲ１２、およびｙｂｂＲ１３）およびＡシリーズのペプチド（例えば、Ａ１、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、およびＡ−６）を含有するように操作された抗体上での直交性部位特異的標識のために、他のコンジュゲーション方法と組み合わせて使用する。そのような方法には、これらだけに限定されないが、リシン、システイン、チロシン、ヒスチジン、ホルミルグリシン、非天然アミノ酸、ピロリシン、および／またはピロリン−カルボキシ−リシンとのコンジュゲーションが含まれる。そのような方法を使用して、ＳｆｐまたはＡｃｐＳを介しての酵素的コンジュゲーションのために使用される以外の同じか、または異なる標識を結合させることができる。

【0235】

４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質およびペプチド基質
本明細書で使用する場合、用語「４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ」（ＰＰＴアーゼ）および「４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質」は互換的に使用され、ｐｐａｎ基を、補酵素Ａ（ＣｏＡ）またはその類似体などのドナー分子から、ペプチドタグまたはアシルキャリヤータンパク質などの基質に輸送することが可能なあらゆるタンパク質またはその断片を指す。

【0236】

ＰＰＴアーゼは、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）、および非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）に関連したキャリヤータンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素である。これらのキャリヤータンパク質は一般に、ＡＣＰ、アシルキャリヤータンパク質（ＦＡＳおよびＰＫＳ）と、またはＰＣＰ、ペプチジルキャリヤータンパク質（ＮＲＰＳ）と称される。ＡＣＰおよびＰＣＰは、約８０アミノ酸からなり、通常、ドメインとして、ＦＡＳ、ＰＫＳ、またはＮＲＰＳ多酵素複合体中にまとまっている。一部の場合には、ＡＣＰおよびＰＣＰは、自立した自律的に折り畳まれたタンパク質としても見出される。ＡＣＰは、対応する代謝中間体を、共有結合を介して、その柔軟なｐｐａｎ補欠分子族に運ぶので、脂肪酸およびポリケチド生合成に必須である。ＰＣＰは、非リボソームペプチド合成において、ペプチド中間体をＮＲＰＳ多酵素複合体中の活性部位間で輸送することによって、類似の機能を実行する。ＰＰＴアーゼは、配列および構造的類似性および基質特異性に基づいて、３つの群に分類されている。ＰＰＴアーゼの第１群のメンバー、例えば、大腸菌（Escherichia coli）のＡｃｐＳは、約１２０アミノ酸残基長であり、ホモ三量体として機能し、例えば、ＩＩ型ＦＡＳおよびＰＫＳ系のアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）に限定されるかなり狭い基質特異性を有する。枯草菌（Bacillus subtilis）のＳｆｐまたはヒトＰＰＴアーゼによって例示される第２群のメンバーは、モノマーとして機能し、ＮＲＰ、ＦＡＳ、およびＰＫＳに関係するキャリヤータンパク質を含む幅広い基質特異性を有することが報告されている（例えば、Suoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA3 98:99〜104、2001; Quadriら、Biochem.、37:1585〜95、1998; Liuら、Arch. Microbiol、183:37〜44、2005; Joshiら、J. Biol. Chem.、278:33142〜33149、2003を参照されたい）。第３群は、酵母サイトゾルＦＡＳに関連するものなどのＩ型ＦＡＳに共有結合するＰＰＴアーゼを含む（例えば、Fichtlschererら、Eur. J. Biochem.、267:2666〜71、2000を参照されたい）。

【0237】

本発明によれば、ＰＰＴアーゼには、これらだけに限定されないが、大腸菌（E. coli）からのＡｃｐＳ（Ｉ型ＰＰＴアーゼ）および枯草菌（B. subtilis）からのＳｆｐ（ＩＩ型ＰＰＴアーゼ）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、Ｓ．ポンベ（S. pombe）、Ｃ．アルバカンス（C. albacans）、Ｅ．ニデュランス（E. nidulans）、およびＰ．パツルム（P. patulum）からの脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）に関連した統合ＰＰＴアーゼドメイン（ＩＩＩ型ＰＰＴアーゼ）、大腸菌（E. coli）、フレキシネル菌（S.flexneri）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）、およびサルモネラ．オースチン（S. austin）からのＥｎｔＤ、Ｂ．プミルス（B. pumilus）からのＰｓｆ−１、Ｂ．ブレビス（B. brevis）からのＧｓｐ、アナベナ属（Anabaena sp.）からのＨｅｔｌ、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）からのＬｙｓ５、枯草菌（B. subtilis）からのＬｐａ−１４、ならびに大腸菌（E. coli）からの０１９５、Ｔ．マリティマ（T.maritima）ＭＳＢ８のＰＰＴアーゼ（ＮＰ＿２２８５０１）、ヒト（Homo sapiens）のＰＰＴアーゼ（ＮＰ＿０５６２３８）、ならびにそれらの相同体および変異体を含めた、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する天然に存在するタンパク質が含まれる。本発明のＰＰＴアーゼにはまた、上記のもの以外の種からの４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質、さらには、本明細書に記載のペプチド部分を４’−ホスホパンテテイニル化することが可能な人工的に、または組換えによって生成されたタンパク質が含まれる。

【0238】

ＳｆｐおよびＡｃｐＳは、キャリヤータンパク質ドメインについてのそれらの基質特異性と、それらの構造との両方に相違を示す２つのクラスの４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを表す（Flugalら、J. Biol. Chem.、275:959〜968、2000;Lambalotら、Chem. Biol.、3:923〜936、1996）。偽二量体（pseudodimeric）ＰＰＴアーゼのＳｆｐクラスは、サイズが約２３０残基であり、Ｓｆｐの結晶構造は、これが、同様のフォールドを取り入れている分子のＮ末端およびＣ末端の半分と、界面にある酵素の活性部位との二重の対称性を有することを示唆している（Hodnelandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99:5048〜5052、2002;Koglinら、Science、312:273〜276、2006）。対照的に、ＡｃｐＳは、約１２０残基長で、Ｓｆｐのサイズのほぼ半分であり、ＡｃｐＳの結晶構造は、この酵素が集合して三量体になっていて、ＡＣＰおよびＣｏＡ結合部位は、各モノマー間の界面で形成されることを示している（Reuterら、Embo. J.、18:6823〜6831、1999;Chirgadzeら、Embo. J.、19:5281〜5287、2000）。Ｓｆｐは、非リボソームペプチドシンテターゼ、ポリケチドシンターゼ、および脂肪酸シンターゼからのＰＣＰおよびＡＣＰドメインの両方を修飾し得るが、ＡｃｐＳは、ＡＣＰのみを修飾するという点で、Ｓｆｐは、ＡｃｐＳよりもかなり幅広い基質特異性を示すことが報告されている（Flugelら、J. Biol. Chem.、275:959〜968、2000; Parrisら、Structure、8:883〜895、2000; Mofidら、J. Biol. Chem.、277:17023〜17031、2002）。

【0239】

ＰＰＴアーゼの両方の種類のＡＣＰおよびＰＣＰ基質は、セリン残基を有する４へリックスバンドルタンパク質と同様のフォールドを取り入れて、ＳｆｐおよびＡｃｐＳとの相互作用について重要な役割を果たすことが示されている第２αへリックスの頂部にあるｐｐａｎ補欠分子族によって修飾される（Hodnelandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、99:5048〜5052、2002;Chirgadzeら、Embo. J.、19:5281〜5287、2000;Quadriら、Biochem.、37:1585〜1595、1998;Liら、Biochem.、42:4648〜4657、2003）。ＰＣＰおよびＡＣＰの間に明白なコンセンサス配列の相違は存在しないが、これら２種の間の最も有意な相違は、キャリヤータンパク質の静電表面電位であり、ＦＡＳおよびＰＫＳ系において、ＰＣＰでは中性タンパク質表面であり、ＡＣＰドメインでは負に荷電している酸性表面である（Parrisら、Structure、8:883〜895、2000）。

【0240】

短いペプチド群が、ＰＰＴアーゼのための有効な基質として同定されている。例えば、ｙｂｂＲ１３は、１１アミノ酸残基ペプチドであり、Ｓｆｐの基質である（J. Yinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A、102:15815〜15820、2005;Z. Zhouら、ACS Chem Biol.、2:337〜346、2007;Z. Zhouら、J. Am. Chem. Soc.、130: 9925〜9930、2008）。ｙｂｂＲ１３ペプチド（ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ（配列番号９））は、枯草菌（B. subtilis）ゲノムのファージ提示型ライブラリから単離された（J. Yinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A、102:15815〜15820、2005）。ｙｂｂＲ１３ペプチドの配列の一部は、ｙｂｂＲと呼ばれる枯草菌（B. subtilis）オープンリーディングフレームに由来し、これは、ＡＣＰ、ＰＣＰ、およびアリールキャリヤータンパク質（ＡｒＣＰ）などのＰＰＴアーゼの既知の基質に保存されている（Ｈ／Ｄ）Ｓ（Ｌ／Ｉ）トリ−ペプチド配列をＮ末端に含む。ｙｂｂＲペプチドは、ＰＣＰにおいて保存されていることが見出されているアミノ酸配列、ＤｘＦＦｘｘＬＧＧ（配列番号１０５９）をそのＮ末端に含まない。部位特異的標識のための４’−ホスホパンテテイニル化反応において基質として使用することができるｙｂｂＲ１３ペプチドの修飾およびバリアントは記載されている（J. Yinら、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A、102:15815〜15820、2005）。ＰＰＴアーゼのための追加のペプチド基質は、それぞれＳｆｐまたはＡｃｐＳとのそれらの反応性に基づき「Ｓ」または「Ａ」と称されるＳシリーズのペプチドおよびＡシリーズのペプチドである（Z. Zhouら、ACS Chem Biol.、2:337〜346、2007およびZ. Zhouら、J. Am. Chem. Soc.、130:9925〜9930、2008）。例示的なＳシリーズのペプチドには、これらだけに限定されないが、Ｓｆｐのための有効な基質であるＳ６が含まれ、例示的なＡシリーズのペプチドには、これらだけに限定されないが、ＡｃｐＳのための有効な基質であるＡ１が含まれる。Ｓ６およびＡ１ペプチドは両方とも、１２アミノ酸残基長である。

【0241】

ペプチド基質の例を、下記の表２に列挙する。本発明によれば、これらの短いペプチドタグは、ＰＰＴアーゼによって触媒される反応において標的タンパク質（抗体を含む）を部位特異的に標識するために使用することができる。加えて、本明細書に記載のペプチドタグおよび個々のＰＰＴアーゼのペアリング、例えば、ｙｂｂＲ１３／ＳｆｐまたはＳ６／ＳｆｐおよびＡ１／ＡｃｐＳは、例えば、細胞溶解産物中、または生細胞の表面上の１種（または複数の）標的タンパク質を直交的部位特異的に標識するために使用することもできる。

【0242】

【表2】

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【0243】

したがって、本発明は、表２に列挙されているペプチドタグのうちの１個または複数を含有する操作された抗体、およびそのような抗体を標識する方法、例えば、細胞毒とコンジュゲートする方法を提供する。標識化学を、下記および実施例において例示する。

【0244】

２．標識化学
本明細書において提供する修飾抗体またはその断片は、これらだけに限定されないが、Ｓｆｐ、ＡｃｐＳ、ヒトＰＰＴアーゼまたはＴ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼを含むＰＰＴアーゼまたはその変異体を使用して、短いペプチドタグ（挿入もしくはグラフトされているか、またはそれらの組合せ）を翻訳後修飾することによって、部位特異的に標識される。そのような翻訳後修飾は、短いペプチドタグ中の保存セリン残基と補酵素Ａ（ＣｏＡ）または補酵素Ａ類似体の４’−ホスホパンテテイニル（ｐｐａｎ）基との間でのＰＰＴアーゼ触媒反応を伴う。この反応では、ＣｏＡのｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の修飾ｐｐａｎ補欠分子族が、抗体に組み込まれている（すなわち、挿入もしくはグラフトされているか、またはそれらの組合せ）短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基とホスホジエステル結合を形成することによって、短いペプチドタグに結合される。ｐｐａｎまたは修飾ｐｐａｎは、末端基（ＴＧ）に連結しており、ホスホジエステル結合の形成は、それによって、末端基（ＴＧ）を修飾抗体またはその断片と、ｐｐａｎまたは修飾ｐｐａｎ部分を含むリンカーを介してコンジュゲートする。

【0245】

ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、１ステップ法によって標識し、この際、下記のスキーム（Ｉａ）〜（Ｉｃ）に示すとおり、その翻訳後修飾は、末端基（ＴＧ）に連結しているＣｏＡまたは末端基（ＴＧ）に連結しているＣｏＡ類似体を、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応させることによって起こる。別法では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片の翻訳後修飾の他の実施形態では、修飾抗体またはその断片を２ステップ法によって標識し、この際、その翻訳後修飾は、初めに、活性化ＣｏＡまたは活性化ＣｏＡ類似体を、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応させ、続いて、官能化された末端基（ＴＧ）を、活性化ＣｏＡ上の反応性基または活性化ＣｏＡと反応させることを伴う。そのような２ステップ法は、下記のスキーム（ＩＩａ）〜（ＩＩｆ）において図示する。本明細書において提供する修飾抗体またはその断片の翻訳後修飾の他の実施形態では、修飾抗体またはその断片を３ステップ法によって標識し、この際、その翻訳後修飾は、初めに、保護ｐｐａｎ補欠分子族を有するＣｏＡまたは保護ｐｐａｎ補欠分子族を有するＣｏＡ類似体を、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応させ、それによって、ＣｏＡまたはＣｏＡ類似体を抗体と結合させることを伴う。第２のステップでは、保護ｐｐａｎ補欠分子族を脱保護し、それによって、反応性官能基を保護ｐｐａｎ補欠分子族上で生成させる。第３のステップでは、この反応性官能基を、末端基（ＴＧ）に連結させ、それによって、末端基を修飾抗体またはその断片に結合させる。そのような３ステップ法は、以下のスキーム（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｆ）において図示する。

【0246】

１ステップ法
本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を標識するために使用する１ステップ法をスキーム（Ｉａ）において示す：

【0247】

【化90】

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［式中、
Ｒ_２は、Ｈまたは−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）_２であり、
リンカーユニット（ＬＵ）は、末端基（ＴＧ）をＣｏＡ類似体の修飾ｐｐａｎ補欠分子族に連結する化学部分であり、
末端基（ＴＧ）は、抗癌薬、抗炎症薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、および麻酔薬から選択される薬物部分、生物物理学的プローブ、フルオロフォア、アフィニティープローブ、キレーター、分光学的プローブ、放射性プローブ、脂質分子、ポリエチレングリコール、ポリマー、スピン標識、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体断片、ナノ粒子、量子ドット、リポソーム、ＰＬＧＡ粒子、多糖、または表面である。

【0248】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、またはそれらの任意の組合せから選択されるリンカーを含み、リンカーユニット（ＬＵ）は、自壊的（self-immolative）スペーサーを含有してもよい。

【0249】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーである。

【0250】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーである。

【0251】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、結合、−Ａ_１−、−Ａ_１Ｘ^２−、または−Ｘ^２−であり、この際、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍＣ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｓ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＮＨ（（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎＯ）_ｍ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ（Ｒ^４）_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【0252】

【化91】

[この文献は図面を表示できません]

【0253】

【化92】

[この文献は図面を表示できません]

【0254】

【化93】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８および９から選択され、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、または光切断可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、酵素的に切断可能なリンカー、光安定性のリンカー、光切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーである］。

【0255】

ある特定の実施形態では、Ｌ_１は、Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−であり、したがって、ＬＵは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｓ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−である。

【0256】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、結合、−Ａ_１−、−Ａ_１Ｘ^２−、または−Ｘ^２−であり、この際、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【0257】

【化94】

[この文献は図面を表示できません]

【0258】

【化95】

[この文献は図面を表示できません]

【0259】

【化96】

[この文献は図面を表示できません]

【0260】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、結合、−Ａ_１−、−Ａ_１Ｘ^２−、または−Ｘ^２−であり、この際、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【0261】

【化97】

[この文献は図面を表示できません]

【0262】

【化98】

[この文献は図面を表示できません]

【0263】

【化99】

[この文献は図面を表示できません]

【0264】

【0265】

【化100】

[この文献は図面を表示できません]

【0266】

【化101】

[この文献は図面を表示できません]

【0267】

【化102】

[この文献は図面を表示できません]

から選択され、
Ｒ^９は、独立に、ＨおよびＣ_１〜６ハロアルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８および９から選択され、
Ｌ_２は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、または切断不可能なリンカーであり、
Ｌ_３は、結合、非酵素的に切断可能なリンカー、または切断不可能なリンカーであり、
Ｌ_４は、結合、酵素的に切断可能なリンカー、または自壊的スペーサーである。

【0268】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、この際、
Ｌ_１は、結合、−Ａ_１−、−Ａ_１Ｘ^２−、または−Ｘ^２−であり、
Ｌ_２は、結合、−Ａ_２−、または−Ａ_２Ｘ^２−であり、
Ｌ_３は、結合、−Ａ_３−、または−Ａ_３Ｘ^２−であり、
Ｌ_４は、結合、−Ａ_４−、−Ａ_４Ｘ^２−、

【0269】

【化103】

[この文献は図面を表示できません]

【0270】

【化104】

[この文献は図面を表示できません]

【0271】

【化105】

[この文献は図面を表示できません]

【0272】

【化106】

[この文献は図面を表示できません]

【0273】

【化107】

[この文献は図面を表示できません]

【0274】

【化108】

[この文献は図面を表示できません]

【0275】

【0276】

【化109】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
Ａ_２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【0277】

【化110】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_３は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−または

【0278】

【化111】

[この文献は図面を表示できません]

であり、
Ａ_４は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ−、−（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−、−Ｓ（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、−（ＣＨ_２）_ｎ（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨ（（ＣＨ_２）_ｎＯ）_ｍ（ＣＨ_２）_ｎ−または−（Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍＮＨＣ（＝Ｏ）（ＣＨ_２）_ｎ−であり、
各Ｘ^２は、独立に、結合、

【0279】

【化112】

[この文献は図面を表示できません]

【0280】

【化113】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択され、
各ｍは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、および９から選択される。

【0281】

【0282】

【化114】

[この文献は図面を表示できません]

【0283】

【化115】

[この文献は図面を表示できません]

【0284】

【化116】

[この文献は図面を表示できません]

【0285】

【化117】

[この文献は図面を表示できません]

【0286】

【化118】

[この文献は図面を表示できません]

、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選択され、
各Ｒ^４は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、および−ＯＨから選択され、
各Ｒ^５は、独立に、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、または１〜３個の−ＯＨ基で置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
各Ｒ^６は、独立に、Ｈ、フルオロ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジルオキシ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているベンジル、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルコキシ、および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで置換されているＣ_１〜４アルキルから選択され、
Ｒ^７は、独立に、Ｈ、フェニル、およびピリジンから選択され、
Ｒ^８は、独立に、

【0287】

【化119】

[この文献は図面を表示できません]

【0288】

本明細書に記載の化合物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、Ｌ_１は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−［Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ］である（［Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ］などの括弧内に示されているこれらの式の部分は、その式のどの空き原子価（open valence）が括弧に囲まれた構造の残りの部分に結合しているかを同定するために、記載されている式に加えられている）。

【0289】

本明細書に記載の化合物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、Ｌ_２は、

【0290】

【化120】

[この文献は図面を表示できません]

から選択される。

【0291】

本明細書に記載の化合物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、Ｌ_３は、−（ＣＨ_２）_２〜６−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｌ_４−ＴＧ］；−（ＣＨ_２）_２〜６−ＮＨ−［Ｌ_４−ＴＧ］；−（ＣＨ_２）_２〜６−Ｓ−［Ｌ_４−ＴＧ］；−（ＣＨ_２）_２〜６−Ｚ−［Ｌ_４−ＴＧ］；および−（ＣＨ_２）_２〜６−Ｚ−Ｃ（＝Ｏ）−［Ｌ_４−ＴＧ］から選択され、この際、Ｚは、Ｏ、ＮＨ、またはＳである。

【0292】

本明細書に記載の化合物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、Ｌ_４は、結合または下式のｖａｌ−ｃｉｔリンカー：

【0293】

【化121】

[この文献は図面を表示できません]

である。Ｌ_４がｖａｌ−ｃｉｔリンカーである場合、Ｌ_３は好ましくは、−（ＣＨ_２）_２〜６−Ｃ（＝Ｏ）−である。

【0294】

本明細書に記載の化合物または方法のいずれかのある特定の実施形態では、ＴＧは、ＤＭ１もしくはＤＭ４などのマイタンシノイド、またはドロスタチン（dolostatin）１０化合物、例えば、オーリスタチンＭＭＡＦもしくはＭＭＡＥ、またはＮ−アセチル−γ−カリチアマイシンなどのカリチアマイシン、またはローダミンもしくはテトラメチルローダミンなどの標識もしくは色素である。

【0295】

本明細書で使用する場合、「リンカー」は、抗体またはその断片を末端基に連結することが可能な任意の化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件で、酸誘発切断、光誘発切断、ペプチダーゼ誘発切断、エステラーゼ誘発切断、およびジスルフィド結合切断などの切断に対して感受性があり得る。別法では、リンカーは、切断に対して実質的に耐性であり得る。リンカーは、自壊的スペーサーを含んでも、含まなくてもよい。

【0296】

末端基（ＴＧ）を本明細書において提供する修飾抗体またはその断片とコンジュゲートするために本明細書で使用する非酵素的に切断可能なリンカーの非限定的な例には、酸不安定性リンカー、ジスルフィド部分を含有するリンカー、トリアゾール部分を含有するリンカー、ヒドラジン部分を含有するリンカー、チオエーテル部分を含有するリンカー、ジアゾ部分を含有するリンカー、オキシム部分を含有するリンカー、アミド部分を含有するリンカー、およびアセトアミド部分を含有するリンカーが含まれる。

【0297】

末端基（ＴＧ）を本明細書において提供する修飾抗体またはその断片とコンジュゲートするために本明細書で使用する酵素的に切断可能なリンカーの非限定的な例には、これらだけに限定されないが、プロテアーゼによって切断されるリンカー、アミダーゼによって切断されるリンカー、およびβ−グルクロニダーゼによって切断されるリンカーが含まれる。

【0298】

ある特定の実施形態では、そのような酵素切断可能なリンカーは、カテプシンＺ、カテプシンＢ、カテプシンＨ、およびカテプシンＣを含めたカテプシンによって切断されるリンカーである。ある特定の実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、カテプシンＺ、カテプシンＢ、カテプシンＨ、またはカテプシンＣによって切断されるジペプチドを含めたカテプシンによって切断されるジペプチドである。ある特定の実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、カテプシンＢ−切断可能なペプチドリンカーである。ある特定の実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、カテプシンＢ−切断可能なジペプチドリンカーである。ある特定の実施形態では、酵素的に切断可能なリンカーは、カテプシンＢ−切断可能なジペプチドリンカーであり、これは、バリン−シトルリンまたはフェニルアラニン−リシンである。末端基（ＴＧ）を本明細書において提供する修飾抗体またはその断片とコンジュゲートするために本明細書で使用する酵素的に切断可能なリンカーの他の非限定的な例には、これらだけに限定されないが、β−グルクロニダーゼ−によって切断されるリンカー、例えば、

【0299】

【化122】

[この文献は図面を表示できません]

が含まれる。Ducryら、Bioconjugate Chem、vol. 21(1)、5〜13 (2010)を参照されたい。

【0300】

「自壊的スペーサー」は、一方の末端で第１化学部分に、かつ他方の末端で第２化学部分に共有結合していて、それによって、安定なトリパーテート（tripartate）分子を形成している二官能性化学部分である。自壊的スペーサーと第１化学部分との間の結合が切断すると、自壊的スペーサーは、迅速かつ自発的分子内反応を受け、それによって、第２化学部分から分離する。これらの分子内反応は一般に、１，４、または１，６、または１，８除去反応または環化などの電子再編成を伴って、高度に好ましい５員環または６員環を形成する。本発明のある特定の実施形態では、第１部分は、酵素切断可能なリンカーであり、この切断は酵素反応から生じる一方で、他の実施形態では、第１部分は酸不安定性リンカーであり、この切断は、ｐＨ変化によって起こる。本発明に適用する場合、第２部分は、本明細書において定義するとおりの「標識」基である。ある特定の実施形態では、自壊的スペーサーからの第１部分の切断は、タンパク分解酵素による切断から生じる一方で、他の実施形態では、これは、ヒドロラーゼによる切断から生じる。ある特定の実施形態では、自壊的スペーサーからの第１部分の切断は、カテプシン酵素による切断から生じる。

【0301】

ある特定の実施形態では、酵素切断可能なリンカーは、ペプチドリンカーであり、自壊的スペーサーは、その一方の末端ではペプチドリンカーに共有結合しており、その他方の末端では、薬物部分に共有結合している。このトリパータイト分子は安定しており、酵素が存在しない状態では、薬理学的に不活性であるが、酵素によって、スペーサー部分およびペプチド部分を共有結合している結合で酵素的に切断可能である。ペプチド部分がトリパーテート分子から切断されると、これは、スペーサー部分の自壊特性を開始して、その結果として、スペーサー部分を薬物部分に共有結合している結合の自発的切断をもたらし、それによって、薬理学的に活性な形態での薬物の放出を実行する。

【0302】

末端基（ＴＧ）を本明細書において提供する修飾抗体またはその断片とコンジュゲートする際に任意選択により使用される自壊的スペーサーの非限定的な例には、これらだけに限定されないが、ベンジルカルボニル部分、ベンジルエーテル部分、４−アミノブチラート部分、ヘミチオアミナール部分、またはＮ−アシルヘミチオアミナール部分を含む部分が含まれる。

【0303】

自壊的スペーサーの他の例には、これらだけに限定されないが、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル基と電子的に同様の、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールなどの芳香族化合物が含まれる。ある特定の実施形態では、アミド結合加水分解で環化を受ける本明細書で使用する自壊的スペーサーには、置換および非置換の４−アミノ酪酸アミドおよび２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが含まれる。

【0304】

ある特定の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0305】

【化123】

[この文献は図面を表示できません]

である一方で、他の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0306】

【化124】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｎは１または２である］である。他の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0307】

【化125】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｎは１または２である］である。他の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0308】

【化126】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｎは１または２である］である。他の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0309】

【化127】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｎは１または２である］である。他の実施形態では、自壊的スペーサーは、

【0310】

【化128】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｎは１または２である］である。

【0311】

スキーム（Ｉｂ）は、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片の翻訳後修飾を図示しており、この際、リンカーユニット（ＬＵ）は−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−である。

【0312】

【化129】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0313】

スキーム（Ｉａ）およびスキーム（Ｉｂ）のＣｏＡ類似体は、全くの化学合成によって得ることができるが、スキーム（Ｉａ）およびスキーム（Ｉｂ）のＣｏＡ類似体を好ましくは、化学的酵素的プロセスによって得、この際、パンテテイン類似体を化学的に合成し、次いで、対応するＣｏＡ類似体に生合成によって変換する（Kristine M. Clarkeら、「In Vivo Reporter Labeling of Proteins via Metabolic Delivery of Coenzyme A Analogues」、J. Am. Chem. Soc.、2005、127、p. 11234〜11235およびJordan L. Meierら、「Synthesis and Evaluation of Bioorthogonal Pantetheine Analogues for in Vivo Protein Modification」、J. Am. Chem. Soc.、2006、128、p. 12174〜12184を参照されたい）。スキーム（Ｉａ）のＣｏＡ類似体のための生合成変換を下記に示す：

【0314】

【化130】

[この文献は図面を表示できません]

他方で、スキーム（Ｉｂ）のＣｏＡ類似体のための生合成変換を下記に示す：

【0315】

【化131】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＬＵ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0316】

ある特定の実施形態では、生合成変換は、「インビボ」で起こり、この際、パンテテイン類似体は、周囲の培地から細胞に進入し、それによって、いったん細胞内部で、ＣｏＡ酵素的経路によって、対応するＣｏＡ類似体に変換される。具体的な実施形態では、大腸菌（E. coli）を、対応するＣｏＡ類似体へのパンテテイン類似体の生合成変換のために使用し、この際、パンテテイン類似体は、周囲培地から大腸菌（E. coli）に進入し、いったん細胞内部で、パンテテイン類似体は初めに、パントテン酸キナーゼ（ＰａｎＫまたはＣｏａＡ）によって、アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を使用してリン酸化され、次いで、ホスホパンテテインアデニリルトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴまたはＣｏａＤ）によってアデニル化されて、デホスホ−ＣｏＡ類似体をもたらし、次いで、さらに、デホスホ補酵素Ａキナーゼ（ＤＰＣＫまたはＣｏａＥ）によってリン酸化されて、ＣｏＡ類似体をもたらす。

【0317】

他の実施形態では、生合成変換は「インビトロ」で起こり、この際、酵素的ＣｏＡ経路は、パンテテイン類似体と共に再構成され、それによって、パンテテイン類似体は、再構成されたＣｏＡ酵素的経路によって「インビトロ」で、対応するＣｏＡ類似体に変換される。「インビトロ」変換の具体的な実施形態では、再構成されたＣｏＡ酵素的経路は、大腸菌（E. coli）ＣｏＡ酵素的経路であり、この際、パンテテイン類似体は初めに、ＣｏａＡおよびＡＴＰによってリン酸化され、次いで、ＣｏａＤによってアデニル化されて、デホスホ−ＣｏＡ類似体をもたらし、次いで、ＣｏａＥによってさらにリン酸化されて、ＣｏＡ類似体をもたらす。

【0318】

ある特定の実施形態では、リンカーユニット（ＬＵ）は、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２Ｓ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−であり、Ｒ_２は、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）_２であり、そのような実施形態では、末端基は、ＣｏＡに連結している。スキーム（Ｉｃ）は、具体的な実施形態のための、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片の翻訳後修飾を図示しており、この際、ＰＰＴアーゼは、組み込まれた短いペプチドタグ中の保存セリン残基と、補酵素Ａ（ＣｏＡ）に連結している末端基（ＴＧ）との間の反応を触媒する：

【0319】

【化132】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0320】

ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、スキーム（Ｉａ）、スキーム（Ｉｂ）、およびスキーム（Ｉｃ）に示したとおりの１ステップ法によって部位特異的に標識するが、この際、ＣｏＡまたはＣｏＡ類似体に連結している末端基が、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応する。

【0321】

１ステップ法は、
（ａ）小さなペプチドタグを含有するように操作されていて、そのペプチドタグが、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ａ）の構造を有する化合物：

【0322】

【化133】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、
Ｒ_２、リンカーユニット（ＬＵ）、およびＴＧは、本明細書に記載のとおりである］が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、修飾抗体またはその断片を末端基で標識するステップと
を含む。

【0323】

式（Ａ）の化合物を使用するそのような１ステップ法では、それによって、末端基（ＴＧ）を、修飾抗体またはその断片と、式（Ｉ−ａ）による構造を有するリンカーを介してコンジュゲートする。式（Ｉ−ａ）のリンカーは、４’−ホスホパンテテイニル部分と、抗体中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基との間に形成されるホスホジエステル結合によって、小さなペプチドタグに結合する：

【0324】

【化134】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＬＵは、本明細書において定義するとおりであり、＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］。

【0325】

ある特定の実施形態では、１ステップ法は、
（ａ）小さなペプチドタグを含有するように操作されていて、そのペプチドタグが、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｂ）の構造を有する化合物：

【0326】

【化135】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、修飾抗体またはその断片を末端基で標識するステップと
を含む。

【0327】

上記の式（Ｂ）の化合物を使用するそのような１ステップ法では、それによって、末端基を、修飾抗体またはその断片と、式（Ｉ−ｂ）による構造を有するリンカーを介して結合する。式（Ｉ−ｂ）のリンカーは、４’−ホスホパンテテイニル部分と、抗体中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基との間に形成されるホスホジエステル結合によって、小さなペプチドタグに結合する：

【0328】

【化136】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、本明細書において定義するとおりであり、＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］。

【0329】

他の実施形態では、１ステップ法は、
（ａ）小さなペプチドタグを含有するように操作されていて、そのペプチドタグが、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｃ）の構造を有する化合物：

【0330】

【化137】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートすることによって、修飾抗体またはその断片を末端基で標識するステップと
を含む。

【0331】

上記の式（Ｃ）の化合物を使用するそのような１ステップ法では、それによって、末端基を、修飾抗体またはその断片と、式（Ｉ−ｃ）による構造を有するリンカーを介して結合する。式（Ｉ−ｃ）のリンカーは、４’−ホスホパンテテイニル部分と、抗体中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基との間に形成されるホスホジエステル結合によって、小さなペプチドタグに結合する：

【0332】

【化138】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、本明細書において定義するとおりであり、＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］。
本明細書に記載の１ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、式（Ａ）、式（Ｂ）、または式（Ｃ）の構造を有する化合物、および発現される修飾抗体またはその断片と同じ細胞内で同時発現される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の１ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、細胞培地中で、式（Ａ）、式（Ｂ）、または式（Ｃ）の構造を有する化合物、および同じ細胞中または別の細胞中で産生される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の１ステップ法のある特定の実施形態では、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を、固体支持体上に固定化する。ある特定の実施形態では、固体支持体は、任意選択により、ビーズまたはカラム上のポリマーからなる。

【0333】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_４は、−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘ^２は

【0334】

【化139】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0335】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘ^２は

【0336】

【化140】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ＴＧは蛍光プローブである。

【0337】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0338】

【化141】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0339】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−、Ｘ^２は

【0340】

【化142】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0341】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘ^２は

【0342】

【化143】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ＴＧは、薬物部分である。

【0343】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0344】

【化144】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0345】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は−Ａ_２−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、Ｌ_４は

【0346】

【化145】

[この文献は図面を表示できません]

であり、；Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、Ａ_３は

【0347】

【化146】

[この文献は図面を表示できません]

であり、Ｘ^２は、

【0348】

【化147】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0349】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は−Ａ_２−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−−であり、Ｌ_４は

【0350】

【化148】

[この文献は図面を表示できません]

であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、Ａ_３は

【0351】

【化149】

[この文献は図面を表示できません]

であり、Ｘ^２は

【0352】

【化150】

[この文献は図面を表示できません]

であり、ＴＧは、薬物部分である。

【0353】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0354】

【化151】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0355】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、Ｌ_４は結合であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−である。

【0356】

【0357】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0358】

【化152】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0359】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、Ｌ_４は結合であり、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳであり、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｘ^２は−ＣＨＲ^４（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｒ^４は−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである。

【0360】

【0361】

ある特定の実施形態では、式（Ｂ）の化合物は、

【0362】

【化153】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0363】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｌ_２は結合であり、Ｌ_３は結合であり、Ｌ_４は−Ａ_４−であり、この際、Ａ_４は−（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣ（＝Ｏ）−である。

【0364】

【0365】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｌ_２は−Ａ_２−であり、この際、Ａ_２は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏであり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は、

【0366】

【化154】

[この文献は図面を表示できません]

であり、Ｌ_４は、

【0367】

【化155】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0368】

本明細書において提供する方法、化合物、および免疫コンジュゲートのある特定の実施形態では、Ｌ_１は−Ａ_１Ｘ^２−であり、この際、Ａ_１は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＳ−であり、Ｘ^２は−（ＣＨ_２）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、Ｌ_２は結合−であり、Ｌ_３は−Ａ_３−であり、この際、Ａ_３は−（ＣＨ_２）_ｎＣ（＝Ｏ）−であり、Ｌ_４は結合である。

【0369】

２ステップ法
別法では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、２ステップ法によって部位特異的に標識し、この際、第１のステップでは、官能基（Ｒ_１）を含有するＣｏＡのｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の修飾ｐｐａｎ補欠分子族を、４’−ホスホパンテテイニル部分と、抗体に組み込まれている短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基との間に形成されるホスホジエステル結合によって、短いペプチドタグに結合させる。第２のステップでは、官能基（Ｒ_１）と反応性である基に連結しているか、または直接結合している末端基（ＴＧ）を、ＣｏＡのｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の修飾ｐｐａｎ補欠分子族上の官能基（Ｒ_１）と反応させ、それによって、末端基を修飾抗体またはその断片に直接結合させるか、末端基を修飾抗体またはその断片にリンカーユニット（ＬＵ）を介して結合させる。

【0370】

２ステップ法の一実施形態をスキーム（ＩＩａ）において示す。

【0371】

【化156】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘおよび対応するＲ_１は、下記の表３に示すとおりであり、Ｒ_２、Ａ_１、Ｌ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである：

【0372】

【表3】

[この文献は図面を表示できません]

【0373】

ＸおよびＲ_１のアルケン、アルキン、トリアリールホスフィン、シクロオクテン、オキサノルボルナジエン、ジアリールテトラジン、モノアリールテトラジン、およびノルボルネンは、置換されていてもよい。

【0374】

スキーム（ＩＩａ）の２ステップ法は、
（ａ）ペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｄ）の化合物

【0375】

【化157】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｄ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基

【0376】

【化158】

[この文献は図面を表示できません]

をペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩａ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ａ）
［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ａ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0377】

スキーム（ＩＩａ）の２ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩｂ）による構造を有するリンカー：

【0378】

【化159】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ａ_１、Ｘ_２、Ｌ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、本明細書において定義するとおりであり、＊は修飾４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］を介して結合される。

【0379】

２ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩｂ）に示す。

【0380】

【化160】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ａ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0381】

スキーム（ＩＩｂ）の２ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｅ）の化合物

【0382】

【化161】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｅ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基

【0383】

【化162】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩ−ｃ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｃ）
［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0384】

スキーム（ＩＩｂ）の２ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｄ）による構造を有するリンカー：

【0385】

【化163】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１、Ａ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、およびＬ_４は、本明細書において定義するとおりであり、＊は修飾４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］を介して結合される。

【0386】

２ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩ−ｃ）に示す。

【0387】

【化164】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｘ_２、Ａ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0388】

スキーム（ＩＩｃ）の２ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｆ）の化合物

【0389】

【化165】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｆ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基

【0390】

【化166】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩｅ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｅ）
［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0391】

スキーム（ＩＩｃ）の２ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｆ）による構造を有するリンカー：

【0392】

【化167】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１、Ｌ_２、Ａ_３、Ｘ_２、およびＬ_４は、本明細書において定義するとおりであり、＊は修飾４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］を介して結合される。

【0393】

２ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩｄ）に示す。

【0394】

【化168】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、Ｘ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0395】

スキーム（ＩＩｄ）の２ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｇ）の化合物

【0396】

【化169】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｇ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル

【0397】

【化170】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩ−ｇ）の化合物：
Ｘ−ＴＧ
式（ＩＩ−ｇ）
［式中、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0398】

スキーム（ＩＩｄ）の２ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｈ）による構造を有するリンカー：

【0399】

【化171】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、およびＸ_２は、本明細書において定義するとおりであり、＊は修飾４’−ホスホパンテテイニル部分が、小さなペプチドタグに結合することを示している］を介して結合される。

【0400】

本明細書に記載の２ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、または式（Ｇ）の構造を有する化合物、および発現される修飾抗体またはその断片と同じ細胞内で同時発現される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の２ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、細胞培地中で、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、または式（Ｇ）の構造を有する化合物、および同じ細胞中または別の細胞中で産生される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の２ステップ法のある特定の実施形態では、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を、固体支持体上に固定化する。ある特定の実施形態では、固体支持体は、任意選択により、ビーズまたはカラム上のポリマーからなる。

【0401】

表４に、本明細書に記載の２ステップ法および３ステップ法で使用される式（Ｄ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基および式（ＩＩ−ａ）の化合物、ならびに結果として生じる、修飾抗体またはその断片中に設置された修飾セリンのある特定の実施形態を示す。注：Ａ_１、Ｌ_２、Ｌ^３、Ｌ_４，Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、およびＴＧは本明細書において定義するとおりであり、Ｙは、

【0402】

【化172】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0403】

【表4-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表4-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表4-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表4-4】

[この文献は図面を表示できません]

【表4-5】

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【0404】

表５に、本明細書に記載の２ステップ法および３ステップ法で使用される式（Ｅ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基および式（ＩＩ−ｃ）の化合物、ならびに結果として生じる、修飾抗体またはその断片中に設置された修飾セリンのある特定の実施形態を示す。注：Ｌ_１、Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４，Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、およびＴＧは本明細書において定義するとおりであり、Ｙは、

【0405】

【化173】

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である。

【0406】

【表5-1】

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【表5-2】

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【表5-3】

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【表5-4】

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【表5-5】

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【0407】

表６に、本明細書に記載の２ステップ法および３ステップ法で使用される式（Ｆ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基および式（ＩＩ−ｅ）の化合物、ならびに結果として生じる、修飾抗体またはその断片中に設置された修飾セリンのある特定の実施形態を示す。注：Ｌ_１、Ｌ_２、Ａ_３、Ｌ_４，Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、およびＴＧは本明細書において定義するとおりであり、Ｙは、

【0408】

【化174】

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である。

【0409】

【表6-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表6-2】

[この文献は図面を表示できません]

【表6-3】

[この文献は図面を表示できません]

【表6-4】

[この文献は図面を表示できません]

【表6-5】

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【0410】

表７に、本明細書に記載の２ステップ法および３ステップ法で使用される式（Ｇ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基および式（ＩＩ−ｇ）の化合物、ならびに結果として生じる、修飾抗体またはその断片中に設置された修飾セリンのある特定の実施形態を示す。注：Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、およびＴＧは本明細書において定義するとおりであり、Ｙは、

【0411】

【化175】

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である。

【0412】

【表7-1】

[この文献は図面を表示できません]

【表7-2】

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【表7-3】

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【表7-4】

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【表7-5】

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【0413】

３ステップ法
別法では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、３ステップ法によって部位特異的に標識し、この際、第１のステップでは、ＣｏＡの保護ｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の保護修飾ｐｐａｎ補欠分子族を、４’−ホスホパンテテイニル部分と、抗体に組み込まれている短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基との間に形成されるホスホジエステル結合によって、短いペプチドタグに結合させる。第２のステップでは、ＣｏＡの保護ｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の保護修飾ｐｐａｎ補欠分子族を脱保護し、それによって反応性官能基（Ｒ_１）を生成する。第３のステップでは、官能基（Ｒ_１）と反応性である基に連結しているか、または直接結合している末端基（ＴＧ）を、ＣｏＡのｐｐａｎ補欠分子族またはＣｏＡ類似体の修飾ｐｐａｎ補欠分子族上の官能基（Ｒ_１）と反応させ、それによって、末端基を修飾抗体またはその断片に直接結合させるか、末端基を修飾抗体またはその断片にリンカーユニット（ＬＵ）を介して結合させる。

【0414】

３ステップ法の一実施形態をスキーム（ＩＩＩａ）に示す。

【0415】

【化176】

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［式中、Ｘおよび対応するＲ_１は、表３において示したとおりであり、ＰＧは保護基であり、Ｒ_２、Ａ_１、Ｌ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0416】

スキーム（ＩＩＩａ）の３ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式Ｈの化合物

【0417】

【化177】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｈ−ａ）の保護４’−ホスホパンテテイニル基

【0418】

【化178】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）保護４’−ホスホパンテテイニル基を脱保護して、式（Ｄ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基：

【0419】

【化179】

[この文献は図面を表示できません]

を得るステップと
（ｄ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩａ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩａ）
［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ａ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0420】

スキーム（ＩＩＩａ）の３ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩｂ）による構造を有するリンカー：

【0421】

【化180】

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【0422】

３ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩＩｂ）に示す。

【0423】

【化181】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ａ_２、Ｘ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0424】

スキーム（ＩＩＩｂ）の３ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｊ）の化合物

【0425】

【化182】

[この文献は図面を表示できません]

が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｉ−ａ）の保護４’−ホスホパンテテイニル基

【0426】

【化183】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）保護４’−ホスホパンテテイニル基を脱保護して、式（Ｅ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基：

【0427】

【化184】

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を得るステップと
（ｄ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩ−ｃ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｃ）
［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0428】

スキーム（ＩＩＩｂ）の３ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｄ）による構造を有するリンカー：

【0429】

【化185】

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【0430】

３ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩＩｃ）に示す。

【0431】

【化186】

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［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｘ_２、Ａ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0432】

スキーム（ＩＩＩｃ）の３ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｋ）の化合物

【0433】

【化187】

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が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｋ−ａ）の保護４’−ホスホパンテテイニル基

【0434】

【化188】

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を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）保護４’−ホスホパンテテイニル基を脱保護して、式（Ｆ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基：

【0435】

【化189】

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を得るステップと
（ｄ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩｅ）の化合物：
Ｘ−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩ−ｅ）
［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0436】

スキーム（ＩＩＩｃ）の２ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｆ）による構造を有するリンカー：

【0437】

【化190】

[この文献は図面を表示できません]

【0438】

３ステップ法の別の実施形態をスキーム（ＩＩＩｄ）に示す。

【0439】

【化191】

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［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ａ_４、Ｘ_２、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0440】

スキーム（ＩＩＩｄ）の３ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）式（Ｌ）の化合物

【0441】

【化192】

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が存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、式（Ｌ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基

【0442】

【化193】

[この文献は図面を表示できません]

を短いペプチドタグに結合させることによって、修飾抗体またはその断片を標識するステップと、
（ｃ）保護４’−ホスホパンテテイニル基を脱保護して、式（Ｇ−ａ）の活性化４’−ホスホパンテテイニル基：

【0443】

【化194】

[この文献は図面を表示できません]

を得るステップと
（ｄ）活性化４’−ホスホパンテテイニル基を式（ＩＩ−ｇ）の化合物：
Ｘ−ＴＧ
式（ＩＩ−ｇ）
［式中、ＰＧは保護基であり、Ｘ、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させるステップと
を含む。

【0444】

スキーム（ＩＩＩｄ）の３ステップ法の結果として、末端基は、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩ−ｈ）による構造を有するリンカー：

【0445】

【化195】

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【0446】

スキーム（ＩＩＩｅ）は、３ステップ法のある特定の実施形態を示しており、この際、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニル補欠分子族のチオールが保護されているＣｏＡ類似体によって部位特異的に標識する。ステップ１では、保護ＣｏＡ類似体を、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応させ、それによって、短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基と共にホスホジエステル結合を形成することを介して、保護チオールを含有する補欠分子族を短いペプチドタグに結合させる。第２ステップでは、チオール保護基を除去し、結果として生じたペンダント４’−ホスホパンテテイニル基を有する修飾抗体またはその断片を、末端基（ＴＧ）に連結しているチオール反応性基と反応させる。

【0447】

【化196】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘ_ＳＨ、保護基（ＰＧ）、Ｒ_２、Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0448】

スキーム（ＩＩＩｆ）は、３ステップ法のある特定の実施形態を示しており、この際、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニル補欠分子族のチオールが保護されているＣｏＡ類似体を使用して部位特異的に標識する。ステップ１では、保護ＣｏＡ類似体を、抗体の中に操作して入れた短いペプチドタグの保存セリンと反応させ、それによって、短いペプチドタグの保存セリン残基のヒドロキシル基と共にホスホジエステル結合を形成することを介して、保護チオールを含有する補欠分子族を短いペプチドタグに結合させる。第２ステップでは、チオール保護基を除去し、結果として生じたペンダント４’−ホスホパンテテイニル基を有する修飾抗体またはその断片を、末端基（ＴＧ）に連結しているチオール反応性基と反応させる。

【0449】

【化197】

[この文献は図面を表示できません]

［式中、Ｘ_ＳＨ、保護基（ＰＧ）、Ｒ_２、Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである］。

【0450】

スキーム（ＩＩＩｅ）およびスキーム（ＩＩＩｆ）の３ステップ法では、チオール保護基には、これらだけに限定されないが、アセチル、アセトアミドメチル、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル、メトキシトリチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルチオール、および３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルが含まれる。スキーム（ＩＩＩｅ）およびスキーム（ＩＩＩｆ）のチオール反応性基には、これらだけに限定されないが、マレイミド、ハロアセチル、ハロアセトアミド、ピリジルジスルフィド、およびビニルスルホンが含まれる。

【0451】

スキーム（ＩＩＩｆ）の３ステップ法は、
（ａ）短いペプチドタグを含有するように操作されており、そのペプチドタグが４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素の基質である修飾抗体またはその断片を得るステップと、
（ｂ）修飾抗体またはその断片を、
（ｉ）チオール保護された補酵素Ａが存在する状態で、修飾抗体またはその断片を、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ活性を有する酵素と共にインキュベートし、それによって、補酵素Ａのチオール保護された補欠分子族を短いペプチドタグに結合させ；
（ｉｉ）チオール基を脱保護し、それによって、ペンダントチオールを有する４’−ホスホパンテテイニル基を形成し、かつ
（ｉｉｉ）４’−ホスホパンテテイニル基のペンダントチオールを式（ＩＩＩｆ）の化合物：
Ｘ_ＳＨ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧ
式（ＩＩＩｆ）
［式中、Ｘ_ＳＨは、これらだけに限定されないが、マレイミド、ハロアセチル、ハロアセトアミド、ピリジルジスルフィド、およびビニルスルホンを含めたチオール反応性基である。Ａ_２、Ｌ_３、Ｌ_４および、ＴＧは本明細書において定義するとおりである］
と反応させることによって標識するステップと
を含む。加えて、スキーム（ＩＩｆ）の２ステップ法では、末端基を、修飾抗体またはその断片に、式（ＩＩＩ−ａ）の構造を有するリンカー：

【0452】

【化198】

[この文献は図面を表示できません]

を介して結合させる。＊は、４’−ホスホパンテテイニル部分が小さなペプチドタグに結合していることを示し、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、およびＴＧは、本明細書において定義するとおりである。この実施形態では、Ｘ_２は、Ｘ_ＳＨおよびこれらだけに限定されないが、

【0453】

【化199】

[この文献は図面を表示できません]

および−Ｓ−Ｓ−を含めた、ペンダントチオールの反応によって形成される基である。

【0454】

ある特定の実施形態では、Ｘ_ＳＨ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧは、

【0455】

【化200】

[この文献は図面を表示できません]

であり、この際、
Ｘ_１は、結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎ）_ｍ−、

【0456】

【化201】

[この文献は図面を表示できません]

である。

【0457】

他の実施形態では、Ｘ_ＳＨ−Ｌ_２−Ｌ_３−Ｌ_４−ＴＧは、

【0458】

【化202】

[この文献は図面を表示できません]

である。
本明細書に記載の３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物、および発現される修飾抗体またはその断片と同じ細胞内で同時発現される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の２ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、細胞培地中で、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物、および同じ細胞または別の細胞によって同時発現される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。本明細書に記載の２ステップ法のある特定の実施形態では、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を、固体支持体上に固定化する。ある特定の実施形態では、固体支持体は、任意選択により、ビーズまたはカラム上のポリマーからなる。

【0459】

３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、同じ細胞中で同時発現される４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと接触させる。３ステップ法のある特定の実施形態では、チオール保護された補酵素Ａは、アセチル−補酵素Ａである。３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、細胞培地中で、同じまたは別の細胞によって同時発現されるチオール保護された補酵素Ａおよび４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と接触させる。３ステップ法のある特定の実施形態では、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を、固体支持体上に固定化する。固体支持体は、任意選択により、ビーズまたはカラム上のポリマーからなる。

【0460】

本明細書に記載の１ステップ法、２ステップ法、または３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、使用する方法に応じて、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、式（Ｇ）、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物、および４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素と、摂氏０〜３７度の温度にて、３〜１０、好ましくは７〜９、最も好ましくは約８のｐＨ値に調整された緩衝液または培地中で、５分〜４８時間の反応時間で接触させる。

【0461】

本明細書に記載の１ステップ法、２ステップ法、または３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、使用する方法に応じて、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、式（Ｇ）、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物と、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが存在する状態で溶液中で接触させる。本明細書に記載の１ステップ法、２ステップ法、または３ステップ法の他の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、使用する方法に応じて、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、式（Ｇ）、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物と、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが存在する状態で細胞培地中で接触させる。本明細書に記載の１ステップ法、２ステップ法、または３ステップ法のある特定の実施形態では、修飾抗体またはその断片を、使用する方法に応じて、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）、式（Ｆ）、式（Ｇ）、式（Ｈ）、式（Ｊ）、式（Ｋ）、または式（Ｌ）の構造を有する化合物と、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが存在する状態で細胞内部で接触させる。

【0462】

【0463】

【0464】

ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、１、２、３、４、５、６、７、または８の末端基（「ＴＧ」）−対−抗体比で標識し、この際、修飾抗体またはその断片は、抗体の構造的ループ中に設置された１、２、３、４、５、６、７、または８個の短いペプチドタグを含有し、その短いペプチドタグは、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｃ・テルモセルム（C.thermocellum）４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、ヒト４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、またはそれらの変異体型の基質である。例えば、４のＴＧ−対−抗体比は、末端基を、挿入されたＳ６タグの４つのコピーと、または挿入されたｙｂｂＲタグの４つのコピーと、または挿入されたＡ１タグの４つのコピーと、または挿入されたＳ６タグの２つのコピーおよび挿入されたｙｂｂＲタグの２つのコピーの組合せとコンジュゲートすることによって達成される。ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、２種の異なるペプチドタグおよび２種の異なる４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して、２種の異なる末端基で標識する。例として、Ａ１タグの２つのコピーを、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して第１末端基とコンジュゲートする。次いで、第２末端基を、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して、Ｓ６タグの２つのコピーに結合させる（例えば、Zhouら、ACS Chem. Biol.2:337〜346、2007を参照されたい）。

【0465】

ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、１、２、３、４、５、６、７、または８の末端基（ＴＧ）−対−抗体比（例えば、ＤＡＲ）で標識し、この際、修飾抗体またはその断片は、抗体の構造的ループ中に設置された１、２、３、４、５、６、７、または８個の短いペプチドタグを含有し、その短いペプチドタグは、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｔ・マリティマ（T.maritima）４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｃ・テルモセルム（C.thermocellum）４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、ヒト４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、またはそれらの変異体型の基質である。例えば、４のＴＧ−対−抗体比は、薬物部分を、挿入されたＳ６タグの４つのコピーと、または挿入されたｙｂｂＲタグの４つのコピーと、または挿入されたＡ１タグの４つのコピーと、または挿入されたＳ６タグの２つのコピーおよび挿入されたｙｂｂＲタグの２つのコピーの組合せとコンジュゲートすることによって達成される。ある特定の実施形態では、本明細書において提供する修飾抗体またはその断片を、２種の異なるペプチドタグおよび２種の異なる４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して、２種の異なる薬物部分で標識する。例として、Ａ１タグの２つのコピーを、ＡｃｐＳ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して第１薬物部分とコンジュゲートする。次いで、第２薬物部分を、Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを使用して、Ｓ６タグの２つのコピーに結合させる（例えば、Zhouら、ACS Chem. Biol.2:337〜346、2007を参照されたい）。

【0466】

３．Ｆｃ領域のフレームワークのさらなる変更
本発明は、部位特異的に標識された免疫コンジュゲートを提供する。本発明の免疫コンジュゲートは、例えば、抗体の特性を改良するために、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌの範囲内のフレームワーク残基に対する修飾をさらに含む修飾抗体またはその断片を含み得る。典型的には、抗体の免疫原性を低下させるために、そのようなフレームワーク修飾を行う。例えば、手法の１つは、１個または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系配列に「復帰変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けている抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、その抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することによって同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系配置に戻すために、例えば、部位特異的変異誘発によって、体細胞変異を、生殖細胞系配列に「復帰変異」させることができる。そのような「復帰変異」抗体も、本発明に内包されることが意図されている。

【0467】

別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ−細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内またはさらには１つまたは複数のＣＤＲ領域内の１個または複数の残基の変異を伴う。この手法はまた、「脱免疫化」と称され、Carrらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。

【0468】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはその代わりに、本発明の抗体を、Ｆｃ領域内に修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害活性などの抗体の１つまたは複数の機能特性を変更するように、操作することができる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾するか（例えば、１個または複数の化学部分を、抗体に結合させることができる）、またはそのグリコシル化を変更し、再び、抗体の１つまたは複数の機能特性を変更するように修飾することができる。これらの実施形態はそれぞれ、下記でさらに詳細に記載する。

【0469】

一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾して、ヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば、増加または減少させるようにする。この手法は、Bodmerらによる米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数を変更して、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを促進するか、または抗体の安定性を増大または低下させる。

【0470】

別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、１個または複数のアミノ酸変異を、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に導入して、抗体が、固有のＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合に対して減退したブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）の結合を有するようにする。この手法は、Wardらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。

【0471】

まだ他の実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えて、抗体のエフェクター機能を変更することによって、Ｆｃ領域を変更する。例えば、抗体がエフェクターリガンドのために変更されたアフィニティーを有するが、親抗体の抗原結合能力は維持するように、１個または複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。アフィニティーが変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であってよい。この手法は、例えば、両方ともWinterらによる米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載されている。

【0472】

別の実施形態では、抗体がＣ１ｑ結合を変更し、かつ／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を低減または廃止するように、アミノ酸残基から選択される１個または複数のアミノ酸を別のアミノ酸残基に置き換えることができる。この手法は、例えば、Idusogieらによる米国特許第６，１９４，５５１号に記載されている。

【0473】

別の実施形態では、１個または複数のアミノ酸残基を変更し、それによって、抗体が補体を固定する能力を変更する。この手法は、例えば、BodmerらによるＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１に記載されている。具体的な実施形態では、本発明の抗体またはその断片の１個または複数のアミノ酸を、ＩｇＧ１サブクラスおよびκアイソタイプのために図４において示されているものなどの１個または複数のアロタイプアミノ酸残基によって置き換える。アロタイプアミノ酸残基にはまた、これらだけに限定されないが、Jefferisら、MAbs. 1:332〜338(2009)によって記載されているとおりのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３サブクラスの重鎖の定常領域、さらには、κアイソタイプの軽鎖の定常領域が含まれる。

【0474】

まだ別の実施形態では、１個または複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、例えば、PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２に記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされていて、結合が改善されたバリアントは記載されている（Shieldsら、J. Biol. Chem. 276:6591〜6604、2001を参照されたい）。

【0475】

さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化（aglycosylated）抗体を作製することができる（すなわち、その抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化を変更して、例えば「抗原」に対する抗体のアフィニティーを高めることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができ、結果として、１個または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を消失させ、それによって、その部位でのグリコシル化を消失させる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させ得る。そのような手法は、例えば、Coらによる米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号に記載されている。

【0476】

加えて、または代わりに、少ない量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または二分性ＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体などの変更型のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。そのような変更グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、変更グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。変更グリコシル化機構を有する細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって、変更グリコシル化を有する抗体を生成する宿主細胞として使用することができる。例えば、Hangらによる欧州特許第１，１７６，１９５号は、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系を記載しており、この遺伝子は、フコシルトランスフェラーゼをコードするので、そのような細胞系中で発現された抗体は、低フコシル化を示すようになる。PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合させる能力が低下しており、その結果、その宿主細胞中で発現された抗体の低フコシル化が生じるバリアントＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃｌ３細胞を記載している（Shieldsら、(2002)J. Biol. Chem. 277:26733〜26740も参照されたい）。UmanaらによるＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾性グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作されていて、その操作された細胞系において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性を結果として上昇させる二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示すような細胞系を記載している（Umanaら、Nat. Biotech. 17:176〜180、1999も参照されたい）。

【0477】

別の実施形態では、抗体を、その生物学的半減期を増加させるように修飾する。様々な手法が可能である。例えば、Wardに付与された米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているとおり、以下の変異のうちの１つまたは複数を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。別法では、生物学的半減期を増加させるために、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載されているとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取り出されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、抗体をＣＨ１またはＣ_Ｌ領域内で変更することができる。

【0478】

４．抗体コンジュゲート
本発明は、部位特異的標識法、それによって調製される修飾抗体およびその断片、ならびに免疫コンジュゲートを提供する。本発明の方法を使用して、修飾抗体またはその断片を、薬物部分、例えば、抗癌薬、自己免疫治療薬、抗炎症薬、抗真菌薬、抗菌薬、抗寄生虫薬、抗ウイルス薬、または麻酔薬などの標識とコンジュゲートすることができる。抗体またはその断片を、いくつかの同一か、または異なる標識部分を使用し、本発明の方法を他のコンジュゲーション方法と組み合わせてコンジュゲートすることもできる。

【0479】

ある特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートの末端基は、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害薬、ＨＳＰ９０阻害薬、ＩＡＰ阻害薬、ｍＴｏｒ阻害薬、微小管安定薬、微小管不安定化薬、オーリスタチン、ドラスタチン、マイタンシノイド、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１の核外輸送の阻害薬、ＤＰＰＩＶ阻害薬、プロテアソーム阻害薬、ミトコンドリアにおけるホスホリル転移反応の阻害薬、タンパク質合成阻害薬、キナーゼ阻害薬、ＣＤＫ２阻害薬、ＣＤＫ９阻害薬、Ｅｇ５阻害薬、ＨＤＡＣ阻害薬、ＲＮＡポリメラーゼ阻害薬、ＤＮＡ損傷薬、ＤＮＡアルキル化薬、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ小溝結合薬、およびＤＨＦＲ阻害薬から選択される。

【0480】

さらに、本発明の修飾抗体または抗体断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分とコンジュゲートすることができる。治療用部分または薬物部分は、古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、サイトカインなどのタンパク質、アポトーシス薬、抗血管新生薬、または例えば、リンホカインなどの生物学的応答修飾薬が含まれ得る。

【0481】

一実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片を、細胞毒、薬物（例えば、免疫抑制薬）、または放射性毒素などの治療用部分とコンジュゲートする。細胞毒の例には、これらだけに限定されないが、タキサン（例えば、国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０１／３８３１８およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２６７５を参照されたい）、ＤＮＡ−アルキル化薬（例えば、ＣＣ−１０６５類似体）、アンスラサイクリン、ツブリシン類似体、デュオカルマイシン類似体、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、マイタンシノイド、および反応性ポリエチレングリコール部分を含む細胞傷害性薬（例えば、Sasseら、J. Antibiot. (東京）、53、879〜85 (2000)、Suzawaら、Bioorg. Med. Chem.、8、2175〜84 (2000)、Ichimuraら、J. Antibiot. (東京)、44、1045〜53 (1991)、Franciscoら、Blood (2003)（印刷による公開の前に電子的に公開）、米国特許第５，４７５，０９２号、同第６，３４０，７０１号、同第６，３７２，７３８号、および同第６，４３６，９３１号、米国特許出願公開第２００１／００３６９２３Ａ１号、係属中の米国特許出願第１０／０２４，２９０号および同第１０／１１６，０５３号、および国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ０１／４９６９８を参照されたい）、タキソン（taxon）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ｔ．コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、およびそれらの類似体または相同体が含まれる。治療薬にはまた、例えば、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、切除薬（ablating agent）（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラキスンブシル（thioepa chloraxnbucil）、メイファラン（meiphalan）、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）（例えば、Seattle Genetics、ＵＳ２００９０３０４７２１を参照されたい）が含まれる。

【0482】

本発明の修飾抗体または抗体断片とコンジュゲートすることができる治療用細胞毒の他の例には、デュオカルマイシン、カリチアマイシン、メイタンシン、およびオーリスタチン、ならびにそれらの誘導体が含まれる。カリチアマイシン抗体コンジュゲートの例は、市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（商標）；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）。

【0483】

細胞毒の種類、抗体に治療薬をコンジュゲートするためのリンカー、および方法のさらなる論述については、Saitoら、(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199〜215; Trailら、(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328〜337; Payne、(2003) Cancer Cell 3:207〜212; Allen、(2002) Nat. Rev. Cancer 2:750〜763; PastanおよびKreitman、(2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089〜1091; SenterおよびSpringer、(2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247〜264も参照されたい。

【0484】

本発明によれば、修飾抗体またはその断片を、細胞傷害性放射性医薬品を生成する放射性同位体とコンジュゲートすることもでき、これは、放射性免疫コンジュゲートと称される。診断用または治療用に使用するために抗体とコンジュゲートすることができる放射性同位体の例には、これらだけに限定されないが、ヨウ素^ｌ３１、インジウム^１１１、イットリウム^９０、およびルテニウム^１７７が含まれる。放射性免疫コンジュゲートを調製するための方法は、当技術分野で確立されている。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（ＣｏｒｉｘａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含めた放射性免疫コンジュゲートの例は市販されており、同様の方法を使用して、本発明の抗体を使用して、放射性免疫コンジュゲートを調製することができる。ある特定の実施形態では、大環状キレーターは、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これを、抗体にリンカー分子を介して結合することができる。そのようなリンカー分子は、当技術分野で一般に公知であり、Denardoら、(1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483〜90; Petersonら、(1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553〜7; およびZimmermanら、(1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943〜50に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照によって組み込まれている。

【0485】

本発明はさらに、異種タンパク質またはポリペプチド（またはその断片、好ましくは少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチド）とコンジュゲートした抗原に特異的に結合して、融合タンパク質を生成する修飾抗体またはその断片を提供する。とりわけ、本発明は、本明細書に記載の抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_ＨＣＤＲ、Ｖ_Ｌドメイン、またはＶ_ＬＣＤＲ）と、異種タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。

【0486】

追加の融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総称して、「ＤＮＡシャッフリング」と称される）の技法を介して生成することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、本発明の抗体またはその断片の活性を変更することができる（例えば、より高いアフィニティーおよびより低い解離速度を有する抗体またはその断片）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号；Pattenら、(1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8:724〜33; Harayama、(1998) Trends Biotechnol. 16(2):76〜82; Hanssonら、(1999) J. Mol. Biol. 287:265〜76;およびLorenzoおよびBlasco、(1998) Biotechniques 24(2):308〜313を参照されたい（これらの特許および刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）。組換え前にエラープローンＰＣＲによるランダム変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法に掛けることによって、抗体もしくはその断片、またはコードされる抗体もしくはその断片を変更することができる。抗原に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、１種または複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。

【0487】

さらに、本発明の修飾抗体またはその断片を、精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列とコンジュゲートすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、その多くが市販されているｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、９２５９ＥｔｏｎＡｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）に備えられているタグなどのヘキサ−ヒスチジンペプチド（配列番号１１０６）である。Gentzら、(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824において記載されているとおり、例えば、ヘキサ−ヒスチジン（配列番号１１０６）は、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製のために有用な他のペプチドタグには、これらだけに限定されないが、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（Wilsonら、(1984)Cell 37:767）、および「ＦＬＡＧ」タグ（A. Einhauerら、J. Biochem. Biophys. Methods 49: 455〜465、2001）が含まれる。本発明によれば、抗体または抗体断片を、それらの有効性を増強するために、腫瘍浸透性ペプチドとコンジュゲートすることもできる。

【0488】

他の実施形態では、本発明の修飾抗体または抗体断片を、診断薬または検出可能な薬剤とコンジュゲートする。そのような免疫コンジュゲートは、特定の療法の有効性を決定するなどの臨床的な検査手順の一部として、疾患または障害の発症、展開、進行、および／または重症度をモニタリングまたは予後判定するために有用であり得る。そのような診断および検出は、抗体を、これらだけに限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；これらだけに限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；これらだけに限定されないが、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４３０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５１４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５３２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６１０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどの蛍光物質；これらだけに限定されないが、ルミノールなどの発光物質；これらだけに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；これらだけに限定されないが、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、および^１２１Ｉ、）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、および^１１１Ｉｎ、）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、フッ素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^６４Ｃｕ、^１１３Ｓｎ、および^１１７Ｓｎなどの放射性物質；ならびに様々な陽電子放射型断層撮影を使用する陽電子放射性金属および非放射性常磁性金属イオンを含むが、これらだけに限定されない検出可能な物質とカップリングさせることによって、達成することができる。

【0489】

本発明の修飾抗体または抗体断片は、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に特に有用な固体支持体に結合させることもできる。そのような固体支持体には、これらだけに限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれる。

【0490】

５．医薬組成物
免疫コンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、本発明の免疫コンジュゲートを、薬学的に許容される担体または添加剤と混合する。組成物は追加的に、癌（乳癌、結腸直腸癌、肺癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、末梢神経梢腫瘍神経鞘腫、頭頚部癌、膀胱癌、食道癌、バレット食道癌、神経膠芽細胞腫、軟部組織の明細胞肉腫、悪性中皮腫、神経線維腫症、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、女性化乳房（gynacomastica）、および子宮内膜症）を治療または防止するために適した１種または複数の他の治療薬を含有することができる。

【0491】

治療薬および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローション、または懸濁液の形態の生理学的に許容される担体、添加剤、または安定剤と混合することによって調製することができる（例えば、Hardmanら、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill、New York、N.Y.、2001; Gennaro、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott、Williams, and Wilkins、New York、N.Y.、2000; Avisら(編)、Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications、Marcel Dekker、NY、1993; Liebermanら(編)、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets、Marcel Dekker、NY、1990; Liebermanら(編) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems、Marcel Dekker、NY、1990; WeinerおよびKotkoskie、Excipient Toxicity and Safety、Marcel Dekker, Inc.、New York、N.Y.、2000を参照されたい）。

【0492】

治療薬の投与レジメンの選択は、実体の血清または組織回転速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中での標的細胞のアクセス性を含めたいくつかの因子に依存する。ある特定の実施形態では、投与レジメンは、許容される副作用レベルに合わせて、患者に送達される治療薬の量を最大化する。したがって、送達される生物学的薬剤の量は部分的に、治療される特定の実体および状態の重症度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の適切な用量を選択する際には、ガイダンスが利用可能である（例えば、Wawrzynczak、Antibody Therapy、Bios Scientific Pub. Ltd、Oxfordshire、UK、1996; Kresina (編)、Monoclonal Antibodies、Cytokines and Arthritis、Marcel Dekker、New York、N.Y.、1991; Bach (編)、Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases、Marcel Dekker、New York、N.Y.、1993; Baertら、New Engl. J. Med. 348:601〜608、2003; Milgromら、New Engl. J. Med. 341:1966〜1973、1999; Slamonら、New Engl. J. Med. 344:783〜792、2001; Beniaminovitzら、New Engl. J. Med. 342:613〜619、2000; Ghoshら、New Engl. J. Med. 348:24〜32、2003; Lipskyら、New Engl. J. Med. 343:1594〜1602、2000を参照されたい）。

【0493】

適切な用量の決定は、臨床家によって、例えば、治療に影響を及ぼすと当技術分野で知られているか、もしくは疑われているか、または治療に影響を及ぼすと予想されているパラメータまたは因子を使用して行われる。一般に、用量は、最適な用量よりもやや少ない量で始まり、その後、所望か、または最適な効果が、何らかの負の副作用に対して達成されるまで、用量は少量刻みで増やされる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状または産生される炎症性サイトカインのレベルの診断尺度が含まれる。

【0494】

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルを、患者に対して毒性であることなく、特定の患者、組成、および投与方式について所望の治療的応答を達成するために有効な活性成分の量が得られるように、変化させることができる。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、治療期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および以前の病歴、ならびに医学分野で知られている同様の因子を含めた様々な薬物動態因子に依存するであろう。

【0495】

本発明の抗体またはその断片を含む組成物は、連続的な注入によって、または例えば、１日、１週、または１週間あたり１〜７回の間隔での投与によって提供することができる。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、脳内で、または吸入によって提供することができる。具体的な投与プロトコルは、重大な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を伴うものである。

【0496】

本発明の免疫コンジュゲートでは、患者に投与される投薬量は、患者の体重につき０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであってよい。投薬量は、患者の体重につき０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇであってよい。本発明の抗体またはその断片の投薬量は、キログラムでの患者の体重（ｋｇ）を使用して、それに投与用量（ｍｇ／ｋｇ）を掛けることによって計算することができる。

【0497】

本発明の免疫コンジュゲートの用量は繰り返すことができ、その投与を少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月、または少なくとも６ヶ月離すことができる。具体的な実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートの投与を、３週間毎に繰り返す。

【0498】

特定の患者についての有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康、投与の方法経路および用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る（例えば、Maynardら、A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice、Interpharm Press、Boca Raton、Fla.、1996; Dent、Good Laboratory and Good Clinical Practice、Urch Publ.、London、UK、2001を参照されたい）。

【0499】

投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚塗布、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内（intracerebrospinal）、病変内による注射もしくは注入によって、または持続放出系もしくインプラントによるものであってよい（例えば、Sidmanら、Biopolymers 22:547〜556、1983;Langerら、J. Biomed. Mater. Res. 15:167〜277、1981;Langer、Chem. Tech. 12:98〜105、1982;Epsteinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688〜3692、1985;Hwangら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030〜4034、1980；米国特許第６，３５０，４６６号および同第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必要な場合には、組成物は、注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの可溶化剤および局所麻酔薬を含んでもよい。加えて、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアゾール化剤を含む製剤を使用することによって、肺投与を使用することもできる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、および同第４，８８０，０７８号；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ９２／１９２４４、ＷＯ９７／３２５７２、ＷＯ９７／４４０１３、ＷＯ９８／３１３４６、およびＷＯ９９／６６９０３を参照されたい。

【0500】

本発明の組成物は、１種または複数の投与経路を介して、当技術分野で公知の１種または複数の様々な方法を使用して投与することもできる。当業者には分かるであろうが、投与経路および／または形式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の免疫コンジュゲートのために選択される投与経路には、例えば、注射または注入による静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。非経口投与は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を表し得、これには、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。別法では、本発明の組成物を、局所、表皮、または粘膜投与経路などの非−非経口経路を介して、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下、または局所で投与することができる。一実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートを注入によって投与する。別の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートを皮下投与する。

【0501】

本発明の免疫コンジュゲートを制御放出または持続放出系で投与する場合、ポンプを使用して、制御または持続放出を達成することができる（Langer、前出；Sefton、CRC Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20、1987; Buchwaldら、Surgery 88:507、1980; Saudekら、N. Engl. J. Med. 321:574、1989を参照されたい）。ポリマー物質を使用して、本発明の療法の制御または持続放出を達成することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise (編)、CRC Pres.、Boca Raton、Fla.、1974; Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、Smolen およびBall(編)、Wiley、New York、1984; RangerおよびPeppas、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61、1983を参照されたい;また、Levyら、Science 228:190、1985; Duringら、Ann. Neurol. 25:351、1989; Howardら、J. Neurosurg. 7 1:105、1989；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ公報ＷＯ９９／１５１５４；およびＰＣＴ公報ＷＯ９９／２０２５３を参照されたい。持続放出製剤で使用されるポリマーの例には、これらだけに限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセタート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。一実施形態では、持続放出製剤で使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性の不純物を含まず、貯蔵、滅菌、および生分解性において安定している。制御または持続放出系は、予防のまたは治療標的の近くに設置することができるので、全身用量の数分の一のみを必要とする（例えば、上記のGoodson, Medical Applications of Controlled Release、vol. 2、pp. 115〜138、1984を参照されたい）。

【0502】

制御放出系は、Langer（Science 249:1527〜1533、1990）による総説において論述されている。当業者に公知の任意の技法を使用して、１種または複数の本発明の免疫コンジュゲートを含む持続放出製剤を生成することができる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，５２６，９３８号、ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０５５４８、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／２０６９８、Ningら、Radiotherapy & Oncology 39:179〜189、1996; Songら、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372〜397、1995; Cleekら、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853〜854、1997;およびLamら、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759〜760、1997を参照されたい。

【0503】

本発明の免疫コンジュゲートを局所投与する場合、それらを軟膏剤、クリーム剤、経皮貼付剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアゾール剤、液剤、乳剤の形態で、または当業者に周知の他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、19th ed.、Mack Pub. Co.、Easton、Pa. (1995)を参照されたい。噴霧不可能な局所剤形では、局所塗布に適合性の担体または１種または複数の添加剤を含み、かつ場合によっては、水より高い動力学粘度を有する粘稠性から半固体または固体形態を典型的には使用する。適切な製剤には、限定ではないが、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬などが含まれ、これらを所望の場合には、補助剤（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤、または塩）で滅菌するか、またはそれらと混合して、例えば、浸透圧などの様々な特性に影響を及ぼす。他の適切な局所用剤形には、噴霧可能なエアゾール製剤が含まれ、この際、活性成分を、場合によっては、固体または液体不活性担体と組み合わせて、加圧揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）と混合してパッケージングするか、またはスクイズボトルにパッケージングする。所望の場合には保湿剤または湿潤剤を、医薬組成物および剤形に加えることもできる。そのような追加の成分の例は、当技術分野で周知である。

【0504】

免疫コンジュゲートを含む組成物を鼻腔内投与する場合には、これを、エアゾール形態、スプレー剤、ミスト剤に、または滴剤の形態に製剤化することができる。とりわけ、本発明に従って使用するための予防薬または治療薬は好都合に、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体）を使用することで、エアゾールスプレー剤提示の形態で、加圧パックまたはネブライザーから送達することができる。加圧エアゾールの場合には、投薬単位を、計測量を送達するためのバルブを装備することによって決定することができる。吸入器または注入器で使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンから構成）は、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤との粉末混合物を含有するように製剤化することができる。

【0505】

第２治療薬、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法薬、抗生物質、または放射線と共に同時投与または治療する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Hardmanら(編) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、10.sup.th ed.、McGraw-Hill、New York、N.Y.; Poole and Peterson(編) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach、Lippincott、Williams & Wilkins、Phila.、Pa.; ChabnerおよびLongo (編) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy、Lippincott、Williams & Wilkins、Phila.、Pa.を参照されたい）。治療薬の有効量は、症状を少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも約３０％；少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させ得る。

【0506】

本発明の免疫コンジュゲートと組み合わせて投与することができる追加の療法（例えば、予防薬または治療薬）を、本発明の免疫コンジュゲートから５分未満離して、３０分未満離して、１時間離して、約１時間離して、約１〜約２時間離して、約２時間〜約３時間離して、約３時間〜約４時間離して、約４時間〜約５時間離して、約５時間〜約６時間離して、約６時間〜約７時間離して、約７時間〜約８時間離して、約８時間〜約９時間離して、約９時間〜約１０時間離して、約１０時間〜約１１時間離して、約１１時間〜約１２時間離して、約１２時間〜１８時間離して、１８時間〜２４時間離して、２４時間〜３６時間離して、３６時間〜４８時間離して、４８時間〜５２時間離して、５２時間〜６０時間離して、６０時間〜７２時間離して、７２時間〜８４時間離して、８４時間〜９６時間離して、または９６時間〜１２０時間離して投与することができる。２種以上の療法を、患者の同じ１回の来院において投与することができる。

【0507】

ある特定の実施形態では、本発明の免疫コンジュゲートを、インビボでの適正な分布を保証するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。治療用の本発明の化合物がＢＢＢを通過することを保証するために（所望の場合には）、それらを、例えば、リポソームに製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つまたは複数の部分を含み、標的化薬物送達を増強することができる（例えば、Ranade、(1989)J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。例示的な標的化部分には、フォラートまたはビオチン（例えば、Lowらに付与された米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Umezawaら、(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（Bloemanら、(1995) FEBS Lett. 357:140; Owaisら、(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Briscoeら、(1995)Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreierら、(1994)J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれ、K. Keinanen;M. L. Laukkanen(1994)FEBS Lett. 346:123;J. J. Killion;I. J. Fidler(1994)Immunomethods 4:273も参照されたい。

【0508】

本発明は、本発明の免疫コンジュゲートを含む医薬組成物を単独で、または他の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与するためのプロトコルを提供する。本発明の併用療法の療法（例えば、予防薬または治療薬）は、付随して、または連続して対象に投与することができる。本発明の併用療法の療法（例えば、予防薬または治療薬）は、周期的に投与することもできる。サイクリング療法は、療法（例えば、薬剤）の１種に対する耐性の発生を低減するために、療法（例えば、薬剤）の１種の副作用を回避または低減するために、かつ／または療法の有効性を改善するために、一時期の第１療法（例えば、第１予防薬または治療薬）の投与、続く、一時期の第２療法（例えば、第２予防薬または治療薬）の投与、およびこの連続投与の繰り返し、すなわち、サイクルを伴う。

【0509】

本発明の併用療法の療法（例えば、予防薬または治療薬）を対象に同時に投与することができる。

【0510】

用語「同時に」は、療法（例えば、予防薬または治療薬）を正確に同じ時間に投与することに限定されず、むしろ、これは、本発明の抗体が他の療法（複数可）と一緒に作用して、それらが他の方法で投与された場合よりも高い利益をもたらすような順序で、かつ時間間隔内で、本発明の抗体またはその断片を含む医薬組成物を対象に投与することを意味している。例えば、各療法を、対象に、同時に、または異なる時点で任意の順序で連続して投与することができるが；しかしながら、同時に投与しない場合には、それらを、所望の治療効果または予防効果が得られるように、時間的に十分に近接して投与すべきである。各療法を、任意の適切な形態で、かつ任意の適切な経路によって別々に、対象に投与することができる。様々な実施形態では、療法（例えば、予防薬または治療薬）を、１５分未満、３０分未満、１時間未満離して、約１時間離して、約１時間〜約２時間離して、約２時間〜約３時間離して、約３時間〜約４時間離して、約４時間〜約５時間離して、約５時間〜約６時間離して、約６時間〜約７時間離して、約７時間〜約８時間離して、約８時間〜約９時間離して、約９時間〜約１０時間離して、約１０時間〜約１１時間離して、約１１時間〜約１２時間離して、２４時間離して、４８時間離して、７２時間離して、または１週間離して対象に投与する。他の実施形態では、２種以上の療法（例えば、予防薬または治療薬）を、患者の同じ１回の来院内で投与する。

【0511】

併用療法の予防薬または治療薬を対象に、同じ医薬組成物で投与することができる。別法では、併用療法の予防薬または治療薬を対象に、別々の医薬組成物で同時に投与することができる。予防薬または治療薬を対象に、同じか、または異なる投与経路によって投与することができる。

【0512】

本発明を十分に記載したが、本発明を、実例であって、さらなる限定を意図したものではない下記の実施例および特許請求の範囲においてさらに説明する。

【実施例1】

【0513】

ペプチドタグ付きＩｇＧ構築物の設計
４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）Ｓｆｐ（ＰＤＢＩＤ：２ＧＥ１、Koglinら、(2006)Science 312:273〜276）モデルのＮＭＲ構造をペプチド基質と共に外観検査することで、Ｓ６タグの反応性Ｓｅｒ残基は、酵素活性部位に深く挿入されており、補酵素Ａのαホスファートの近くに位置していることが明らかになる。ペプチド基質は、キンクにＳｅｒ残基を有するへリックス−キンク−ループコンホメーションを採用する。これらの観察に基づき、ＩｇＧ抗体の表面上のいくつかのループを選択した。選択手順は、下記のステップを伴う。本発明者らは初めに、ヒトＩｇＧ１Ｂ１２抗体（ＰＤＢＩＤ：１ＨＺＨ、Saphireら、(2001)Science 293:1155〜1159）をテンプレートとして使用して、トラスツズマブ相同性モデルを構築した。次いで、溶媒露出残基の有意な含有率を有するループを選択し、Ｓ６タグループに変換した。

【0514】

そのために、種々の戦略を開発した：全長ペプチドタグのグラフト、切断ペプチドタグのグラフト、および挿入（切断および全長の両方）。全長ｙｂｂＲタグのグラフトの一例は、変異抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｓ１３２Ｄ−Ｋ１３３Ｓ−Ｓ１３４Ｌ−Ｔ１３５Ｅ−Ｓ１３６Ｆ−Ｇ１３７Ｉ−Ｇ１３８Ａ−Ｔ１３９Ｓ−Ａ１４０Ｋ−Ａ１４１Ｌ−Ｌ１４２Ａ（配列番号１０２）によって例示される一方で、トラスツズマブ抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｐ１８９Ｇ−Ｓ１９０Ｄ−Ｓ１９１−Ｓ１９２Ｌ−Ｌ１９３Ｓ−Ｇ１９４Ｗ−Ｔ１９５Ｌ（配列番号１０９）変異体は、切断Ｓ６タグのグラフトを構成している。グラフト戦略の別のバリアントを、例えば、変異抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｓ１９０Ｇ−Ｓ１９１Ｄ−Ｓ１９２−Ｌ１９３−Ｇ１９４Ｓ−Ｔ１９５Ｗ−Ｑ１９６Ｌ−Ｔ１９７Ｌ−ＲＬＬＮ−Ｙ１９８（配列番号１１３）で使用し、この際、残基Ｓ１９０およびＳ１９１を、それぞれグリシンおよびアスパラギン酸に、Ｇ１９４をセリンに、Ｔ１９５をトリプトファンに、Ｑ１９６およびＴ１９７をロイシンに変異させ、切断Ｓ６タグＲＬＬＮ（配列番号１０６０）を、Ｌ１９７およびＹ１９８の間に挿入した。別法では、切断および全長ペプチドタグの両方を、抗体残基間のループに挿入した。

【0515】

実施例セクションを通じて、ペプチドタグ付き抗体を、グラフトまたは挿入されたペプチドタグを含有する免疫グロブリン重鎖または軽鎖によって名付ける。簡単にするために、関連する未修飾の重鎖または軽鎖は明示しない。例えば、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）は、対応するペプチドタグ付き重鎖、ならびにＸ’_５＝ＡｌａおよびＸ’_６＝Ｖａｌを有する随伴する未修飾κ軽鎖抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ（配列番号１１３１）を含むＩｇＧ１を指す（図３を参照されたい）。対照的に、ペプチドタグ付きｍＡｂ２重鎖構築物は、未修飾のλ軽鎖ｍＡｂ２−ＬＣ（配列番号２５）に随伴している。別の実施例として、抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｓ７６Ｄ−Ｓ７７−Ｌ７８−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ７９（配列番号３０）は、Ｘ’_１＝Ｌｙｓ、Ｘ’_２＝Ｇｌｕ、Ｘ’_３＝Ｍｅｔ、およびＸ’_４＝Ａｌａを有する未修飾のＩｇγ１重鎖抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ（配列番号１１３０）に随伴するペプチドタグ付き軽鎖を含有するＩｇＧ１抗体を指す（図３を参照されたい）。ペプチドタグ（複数可）が抗体の重鎖または軽鎖の定常領域に挿入またはグラフトされている場合には、定常領域の配列のみが示されている。

【0516】

すべての場合において、Ｓｆｐ酵素の活性部位により深くフィットすることを可能にするために、反応性Ｓｅｒ残基がループの先端に、またはその近くに存在するように、ペプチドタグを、選択されたループ上にマッピングさせた。次に、ＩｇＧとＳｆｐ酵素との複合体を構築して、不調和について検査した。重大な不調和を有するものを退け、対応するループを、選択肢から除外した。

【0517】

Ｓ６およびｙｂｂＲタグ配列をトラスツズマブＩｇＧ１の定常領域の構造的ループに体系的に挿入するために、ヒトＩｇＧ１Ｂ１２抗体（ＰＤＢＩＤ：１ＨＺＨ）の結晶構造を外観検査することと、さらには、ＭｏｌＳｏｆｔＬＬＣからのプログラムＩＣＭを使用することによって残基の溶媒露出表面積を計算することとの両方によって、挿入部位を選択した。

【実施例2】

【0518】

ペプチドタグ付きＩｇＧ構築物の生成
トラスツズマブＩｇＧ１の重鎖および軽鎖を、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐＯＧ発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で過渡的に発現させた。標準的な分子生物学的方法によって、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼで標識するためのペプチドタグを、トラスツズマブＩｇＧ１に様々な位置で組み込んだ。クローニングのために使用するすべてのプライマーを表８に列挙する。

【0519】

すでに記載されているＰＥＩ方法（例えば、Erbacherら、J Gene Med.、1:210〜222(1999)を参照されたい）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の細胞培養および形質移入を行った。簡単には、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、トラスツズマブ（ヒトκアイソタイプ）の重鎖および軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡを同時形質移入した。哺乳動物細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭｅｄｉｕｍ中、３７℃にて、５％ＣＯ_２下で培養し、形質移入の１日前に０．７×１０^６細胞／ｍｌに分けた。形質移入の後に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を５日間培養し、その後、２０００×ｇ、４℃にて３０分間の遠心分離によって採集した。

【0520】

結果として生じた培地上清を０．２２μｍ細孔サイズフィルターで濾過した。次いで、濾液を約１ｍＬ／分の流速で、ＰＢＳ２０カラム体積で予め平衡化させておいたタンパク質Ａアフィニティーカラムに負荷した。カラムをＰＢＳ２０カラム体積で洗浄した後に、抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）５カラム体積で溶離した。溶離液をすぐに、１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０）１０％（ｖ／ｖ）で中和した。３．５または７．０ｋＤａ分子量カットオフのＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ＰＢＳへの透析を行った。

【0521】

最終生成物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。タンパク質収量を、ブラッドフォード法か、またはＮＤ−１０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を使用する２８０ｎｍでの紫外線分光法かのいずれかによって決定した。ペプチドタグ付きトラスツズマブＩｇＧのタンパク質収量を表９に列挙する。

【0522】

【表8-1】

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【表8-2】

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【表8-3】

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【表8-4】

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【表8-5】

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【表8-6】

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【表8-7】

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【表8-8】

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【表8-9】

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【表8-10】

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【表8-11】

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【表8-12】

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【表8-13】

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【表8-14】

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【表8-15】

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【表8-16】

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【表8-17】

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【表8-18】

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【表9-1】

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【表9-2】

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【実施例3】

【0523】

Ｓｆｐ４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）の生成
枯草菌（B. subtilis）ＳｆｐＰＰＴアーゼを、ｐＥＴ２２ｂ発現ベクターに、ＰＩＰＥ法を使用してクローニングした（Klockら、Proteins 71:982〜994 (2008)を参照されたい）。末端Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）の切断を可能にするために、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス（tobacco etch virus）プロテアーゼ認識部位を、Ｓｆｐコード配列の下流に挿入した。クローニングのために使用したすべてのプライマーは表８に列挙している。

【0524】

タンパク質の発現および精製は、いくつかの小さな改変を伴うがYinらに従って行った（Nat. Protoc. 1:280-285(2006)を参照されたい）。初めに、ｐＥＴ２２ｂ／ｓｆｐ発現プラスミドを持つ大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞のグリセロールストックから、ＬＢスターター培養液５ｍＬに接種した。培養液を３７℃にて３００ｒｐｍで一晩インキュベートすることによって飽和するまで成長させた。翌日、このスターター培養液を使用して、ＴＢ培地１Ｌ（Ｓｉｇｍａ）に接種し、これを３００ｒｐｍでかき混ぜ、３７℃にて維持した。６００ｎｍで０．５の光学密度に達した後に、培養液を、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによって誘発し、温度を３０℃まで下げた。培養液をさらに１２〜１６時間振盪し、細菌細胞を遠心分離によって採集した。使用前は、細胞ペレットを−２０℃にて貯蔵した。

【0525】

タンパク質の精製を開始するために、凍結したペレットを氷上で１５分間融かし、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、および２Ｕ／ｍＬＤＮアーゼＩを含有する緩衝液中に再懸濁させた（細胞湿潤重量１ｇあたり緩衝液３ｍＬ）。細胞溶解を、０．５秒のスイッチオンおよび０．５秒のスイッチオフの間隔で４分間音波処理することによって誘発した。不溶性の細胞破片を除去するために、生じた溶解液を４０，０００×ｇで４℃にて２０分間遠心分離した。次いで、Ｈｉｓ_６タグ付きＳｆｐ酵素（「Ｈｉｓ_６」は配列番号１１０６として開示）を、５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ）４ｍＬを透明溶解液に添加することによって捕捉した。４℃にて１時間振盪した後に、樹脂−溶解液混合物を使い捨てカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に注いだ。沈降した樹脂を５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）２５カラム体積で洗浄し、５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）５カラム体積で溶離した。次いで、精製Ｓｆｐ酵素を１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール（ｐＨ７．５）に対して、３．５ｋＤａカットオフのＳｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＤｉａｌｙｓｉｓＣａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して２回透析し、その後、少なくとも１００μＭの最終濃度まで、１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。最後に、濃縮酵素を分取し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。

【0526】

逆Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを使用してＳｆｐの純度を上げるために、ＴＥＶ切断部位を、Ｃ末端Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）の前に導入した。この構築物のＮｉ−ＮＴＡ精製は上記のとおりに行った。しかしながら、溶離の後に、Ｓｆｐ酵素を、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含有するＴＥＶ切断緩衝液に交換した。Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）除去を、７％（ｗ／ｗ）ＴＥＶプロテアーゼで２３℃にて１時間、次いで４℃にて１６時間の消化によって実施した。次いで、ＴＥＶ消化されたＳｆｐ酵素を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化させたＮｉ−ＮＴＡカラムに再負荷した。切断酵素をカラムフロースルー、および５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）５カラム体積を用いる洗浄ステップから収集した。次いで、精製Ｓｆｐ酵素を１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール（ｐＨ７．５）に対して、３．５ｋＤａカットオフのＳｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＤｉａｌｙｓｉｓＣａｓｓｅｔｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して２回透析した。透析の後に、Ｓｆｐを少なくとも１００μＭの最終濃度まで、１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。最後に、濃縮酵素を分取し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。

【0527】

Ｓｆｐの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）除去をＬＣ−ＭＳによって検査し、Ｓｆｐ収量を、２８０ｎｍでの紫外線分光法（ＮＤ−１０００ＵＶ−ＶｉｓＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）によって、２８６２０Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を使用して定量化した。培養液１リットルあたりＴＥＶ−切断Ｓｆｐ酵素４８ｍｇが得られた。

【実施例4】

【0528】

ＰＰＴアーゼ相同体および変異体の同定および生成
Ｓｆｐ変異体Ｒ４−４
標準的な分子生物学的方法を使用して、本発明者らは、枯草菌（B. subtilis）ＳｆｐＰＰＴアーゼに次の変異を挿入した：Ｌｙｓ２８Ｇｌｕ、Ｔｈｒ４４Ｇｌｕ、およびＣｙｓ７７Ｔｙｒ。変異誘発反応のために使用したオリゴヌクレオチドの配列は表８に列挙している。

【0529】

タンパク質発現のために、ＴＢ培地０．５Ｌに、スターター培養液５ｍＬを接種した。その培養液を３００ｒｐｍでかき混ぜ、３７℃で維持した。６００ｎｍで０．５の光学密度に達した後に、培養液を、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加することによって誘発し、温度を３０℃まで下げた。培養液をさらに１６時間３００ｒｐｍで振盪し、細菌細胞を遠心分離によって採集した（３４００ｒｐｍで１５分）。使用前は、細胞ペレットを−２０℃にて貯蔵した。

【0530】

凍結したペレットを氷上で１０分間融かし、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１Ｕ／ｍＬＤＮアーゼＩ、およびｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する緩衝液中に再懸濁させた（細胞湿潤重量１ｇあたり緩衝液３ｍＬ）。細胞溶解を、氷上で０．５秒のスイッチオンおよび０．５秒のスイッチオフの間隔で３分間音波処理することによって誘発した。氷上でさらに１０分間インキュベートした後に、溶解液を４０，０００×ｇで４℃にて３０分間遠心分離した。次いで、Ｈｉｓ_６タグ付きＳｆｐ変異体Ｒ４−４（「Ｈｉｓ_６」は配列番号１１０６として開示）を、５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー（Ｑｉａｇｅｎ）２ｍＬを透明溶解液に添加することによって捕捉した。４℃にて１時間振盪した後に、樹脂−溶解液混合物を使い捨てカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に注いだ。フロースルーを収集し、沈降した樹脂を５０ｍＭトリス、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）５０カラム体積で洗浄し、５０ｍＭトリス、３００ｍＭＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）５カラム体積で溶離した。溶離液を、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を含有するＴＥＶプロテアーゼ切断緩衝液に、ＰＤ−１０カラムを使用して緩衝液交換した後に、Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）除去を、７％（ｗ／ｗ）ＴＥＶプロテアーゼで２３℃にて１時間、次いで４℃にて１６時間消化することによって実施した。

【0531】

次いで、ＴＥＶ消化されたＳｆｐ変異体Ｒ４−４を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化させたＮｉ−ＮＴＡカラム（床体積１ｍＬ）に再負荷した。切断酵素をカラムフロースルーから、および５０ｍＭトリス、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）５カラム体積を用いる洗浄ステップから収集した。次いで、精製Ｓｆｐ変異体Ｒ４−４を、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール（ｐＨ７．５）に対して、ＰＤ−１０カラムを使用して緩衝液交換した。ＢＳＡを標準として使用するブラッドフォードアッセイによると、この酵素は、３．１ｍｇ／ｍＬの最終濃度を１７ｍＬの最終体積で有し、これは、培養液１リットルあたりＴＥＶ切断Ｒ４−４変異体１０５ｍｇに対応する。最後に、酵素を１００〜１０００μＬ画分に分取し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。酵素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価し、Ｈｉｓ_６タグ（配列番号１１０６）除去をＥＳＩ−ＭＳによって検査した。

【0532】

ＡｃｐＳ
標準的な分子生物学的方法を使用して、本発明者らは、大腸菌（E. coli）Ｋ−１２からのａｃｐＳ遺伝子を、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１１０６）を有する組換え酵素の発現を可能にするｐＥＴ２２ｂベクターにクローニングした。クローニングのために使用したオリゴヌクレオチドの配列は表８に列挙している。

【0533】

飽和５ｍＬスターター培養液から接種した後に、ＡｃｐＳ酵素をＴＢ培地１Ｌ中で発現させた。３７℃にて３００ｒｐｍで培養液を振盪した後に、タンパク質生成を、１ｍＭＩＰＴＧを０．５の光学密度（６００ｎｍ）で添加することによって誘発した。タンパク質発現を３０℃および３００ｒｐｍにて一晩実施した。翌日、細胞を３４００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって採集した。細胞ペレットを、タンパク質精製の前に、−２０℃で貯蔵した。

【0534】

タンパク質精製を開始するために、凍結したペレットを氷上で１０分間融かし、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１Ｕ／ｍＬＤＮアーゼＩ、およびｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する緩衝液中に再懸濁させた（細胞湿潤重量１ｇあたり緩衝液３ｍＬ）。細胞溶解を、氷上の細胞懸濁液を、０．５秒のスイッチオンおよび０．５秒のスイッチオフの間隔で３分間音波処理することによって達成した。氷上でのさらなる１０分間のインキュベーション期間の後に、溶解液を４０，０００ｇで４℃にて３０分間遠心分離した。次いで、５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー２ｍＬを透明溶解液に加え、溶解液／樹脂混合物を４℃にて１時間振盪した。溶解液／樹脂混合物を使い捨てカラムに注いだ。フロースルーを収集した後に、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、３００ｍＭＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液５０カラム体積で洗浄した。溶離を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、３００ｍＭＮａＣｌ、および２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液５カラム体積で行った。３．５ｋＤａカットオフ透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、溶離液を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８）および３００ｍＭＮａＣｌを含有する緩衝液に一晩透析した。沈澱したタンパク質を、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することによって除去した。グリセロールを１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加した後に、Ｎｉ−ＮＴＡ−精製タンパク質を液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−８０℃にて貯蔵した（１００μＬおよび２００μＬアリコット）。ＡｃｐＳの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、収量を、ＢＳＡを標準として使用するブラッドフォードアッセイによって定量化した。培養液１リットルあたりＡｃｐＳ酵素約１３ｍｇが得られた。

【0535】

Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼ
Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼの発現を、１Ｌスケールで、天然ＦＭ培地中で、１０ｍＬ飽和スターター培養液を接種することによって実施した。培養液１Ｌを３００ｒｐｍで３７℃の温度にて振盪した。２．５時間後に、培養液は６００ｎｍで０．５の光学密度に達した。タンパク質生成を、アラビノースを０．１％（ｗ／ｖ）の最終濃度まで添加することによって誘発し、培養液をさらに４時間振盪した。細胞を４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって採集し、細胞ペレットを−２０℃で貯蔵した。

【0536】

Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼの初めの精製はＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）によって、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。細胞ペレットを融かし、溶解緩衝液（４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１ｍＭＴＣＥＰ）６０ｍＬに再懸濁させた。細胞懸濁液を氷上で１．５分間音波処理し（１秒パルスを使用）、１５０００ｒｐｍで５℃にて３０分間遠心分離した。透明溶解液を１．５ｍＬＮｉ−ＮＴＡカラム上に負荷した。フロースルーを収集した後に、カラムを洗浄緩衝液５カラム体積（４０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭＴＣＥＰ）で洗浄した。タンパク質溶離を、溶離緩衝液２カラム体積（２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、１ｍＭＴＣＥＰ）で実施した。

【0537】

Ｎｉ−ＮＴＡ溶離液を、ＡｋｔａＦＰＬＣシステムに接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してさらに精製した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を１ｍＬ／分の流速で、１ｍＭＥＤＴＡおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを補充した１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中で行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質含有画分を分析した後に、Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼを含有する画分を貯留し、ＳＥＣのために前に使用した緩衝液に対して再び透析した。次いで、精製酵素を、１０ｋＤａカットオフのＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５ＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。沈澱物を、１３０００ｒｐｍで２分間、テーブルトップ遠心分離器を使用して遠心分離することによって除去した。濃縮タンパク質（１．０ｍｇ／ｍＬ、４８μＭ）を１００μＬ画分に分取し、液体窒素中でフラッシュ凍結させ、−８０℃で貯蔵した。Ｔ・マリティマ（T.maritima）ＰＰＴアーゼの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、収量を、標準としてＢＳＡを使用するブラッドフォードアッセイによって定量化した。すべての精製ステップの後に、培養液１リットルあたりＡｃｐＳ酵素１．４ｍｇが得られた。

【実施例5】

【0538】

補酵素Ａ（ＣｏＡ）類似体の合成
ＣｏＡ−マレイミドエチルアミド−テトラメチルローダミン

【0539】

【化203】

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ＤＭＳＯ３００μＬに溶かしたテトラメチルローダミン−Ｃ２−マレイミド（５．５ｍｇ、１０．４μｍｏｌ）をＣｏＡ（水１５０μＬ中で１０．４μｍｏｌ）に１０×ＰＢＳ緩衝液７５０μＬ中で加え２３℃にて１時間撹拌した。反応の後に、反応混合物を凍結乾燥させて、粗製の生成物を得、これをＲＰ−Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。所望の生成物の画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＣｏＡ−マレイミドエチルアミド−テトラメチルローダミン（純度９４．４％で９．８ｍｇ）を暗紫色の粉末として得た。Ｃ_５２Ｈ_６４Ｎ_１１Ｏ_２２Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ算出値［ＭＨ］^＋：１３２０．３；観察値：１３２０．３。

【0540】

ＣｏＡ−マレイミドカプロイル（ＭＣ）−ＭＭＡＦ

【0541】

【化204】

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ＤＭＳＯ１．８ｍＬに溶かしたＭＣ−ＭＭＡＦ（Doroninaら、Bioconj. Chem. 17:114〜124 (2006)を参照されたい）（３６．０ｍｇ、３８．９μｍｏｌ）をＣｏＡ（水３１２μＬ中で３９．０μｍｏｌ）に１０×ＰＢＳ緩衝液２．９ｍＬ中で加え、２３℃で１時間撹拌した。反応の後に、反応混合物を凍結乾燥させて、粗製物質を得、これをＲＰ−Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。所望の生成物の画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ（純度９７．５％で３５．５ｍｇ）を白色の粉末として得た。Ｃ_７０Ｈ_１１２Ｎ_１３Ｏ_２７Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ算出値［ＭＨ］^＋：１６９１．７；観察値：１６９１．２。

【0542】

ＣｏＡ−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ

【0543】

【化205】

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ＤＭＳＯ３００μＬに溶かしたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ（Doroninaら、Bioconj. Chem. 17:114〜124 (2006)を参照されたい）（５．７ｍｇ、４．３μｍｏｌ）をＣｏＡ（水３４μＬ中で４．３μｍｏｌ）に１０×ＰＢＳ緩衝液２６６６μＬ中で加え、２３℃で１時間撹拌した。反応の後に、反応混合物を凍結乾燥させて、粗製物質を得、これをＲＰ−Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。所望の生成物の画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＣｏＡ−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ（純度９８．０％で６．１ｍｇ）を白色の粉末として得た。Ｃ_８９Ｈ_１３９Ｎ_１８Ｏ_３２Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ算出値［ＭＨ_２］^２＋／２：１０４９．４；観察値：１０４９．４。

【0544】

ＣｏＡ−Ａｃ−Ａｈｘ−ＭＭＡＦ

【0545】

【化206】

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ＤＭＳＯ４００μＬに溶かしたブロモアセチル−Ａｈｘ−ＭＭＡＦ（Alleyら、Bioconj. Chem. 19:759〜765(2008)を参照されたい）（１．３ｍｇ、１．４μｍｏｌ）をＣｏＡ（水４３μＬ中で５．４μｍｏｌ）にホウ酸塩緩衝液３．６ｍＬ（ｐＨ８．５で６．７ｍＭ）中で加え、２３℃で２４時間撹拌した。反応の後に、反応混合物を凍結乾燥させて、粗製物質を得、これをＲＰ−Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。所望の生成物の画分を合わせ、凍結乾燥させて、ＣｏＡ−Ａｃ−Ａｈｘ−ＭＭＡＦ（純度９６．９％で１．１ｍｇ）を白色の粉末として得た。Ｃ_６８Ｈ_１１２Ｎ_１３Ｏ_２６Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ算出値［ＭＨ］^＋：１６５１．７；観察値：１６５１．３。

【0546】

ＣｏＡ−開環−ＭＣ−ＭＭＡＦ

【0547】

【化207】

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ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ（水１ｍＬ中で５μｍｏｌ）を１ＭＮＨ_４ＯＨ_{（水溶液）}９ｍＬに添加し、２３℃にて３０分間撹拌した。反応の後に、反応混合物を凍結乾燥させて、粗製物質を得、これをＲＰ−Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。所望の生成物の画分を合わせ、凍結乾燥させて、マレイミド開環ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ３．９ｍｇを、上記のスキームに示すとおりの４種の位置異性体およびジアステレオ異性体の混合物（白色の粉末、純度９６．６％）として得た。Ｃ_７０Ｈ_１１４Ｎ_１３Ｏ_２８Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ算出値［ＭＨ］^＋：１７０９．７；観察値：１７０９．２。

【実施例6】

【0548】

インビトロでのＣｏＡ類似体でのペプチドタグ付きＩｇＧの標識
インビトロでのペプチドタグ付きＩｇＧとのＣｏＡ類似体の単一ステップコンジュゲーションを例示するために、様々なペプチドタグ付きトラスツズマブ構築物を、Ｓｆｐ酵素が存在する状態でＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと反応させた。一般に、コンジュゲーション反応を１０．０ｍＭまたは１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２を補充した５０ｍＭまたは７５ｍＭＨＥＰＥＳまたはトリス緩衝液、ｐＨ７．５または８．０中で実施した。ペプチドタグ付きトラスツズマブの最終濃度を、ペプチドタグ１個あたり５．０μＭに対応する２．５μＭで一定に維持した一方で、ＣｏＡ基質の最終濃度を通常、４０μＭ〜１００μＭで変化させた。コンジュゲーション反応を開始するために、Ｓｆｐ酵素を加えて、典型的には１μＭの最終濃度を得た。酵素反応を、２３℃または３７℃のいずれかにて１６時間進行させた。この時間の後に、反応の進行をＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣによって分析した。

【実施例7】

【0549】

挿入の標識
Ｓ６タグまたはｙｂｂＲタグが挿入されている異なる標的に対する６種のトラスツズマブ抗体および１種の第２抗体（「ｍＡｂ２」）とのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦのほぼ定量的なコンジュゲーションを、反応混合物をＳｆｐと共に、実施例６において記載したとおりにインキュベートすることによって達成した。抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１、図５Ａ）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７、図５Ｂ）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ３（配列番号９５、図５Ｃ）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３（配列番号９４、図５Ｄ）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬ−Ｎ３８９（配列番号１３０、図５Ｅ）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１２９、図５Ｆ）、およびｍＡｂ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１４８、図５Ｇ）の単一ステップコンジュゲーション反応混合物（表１０）のＨＰＬＣによって、タグ付き抗体が、ほぼ２の薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）を有する免疫コンジュゲートへとほぼ完全に変換されたことが示される。還元コンジュゲート試料のＥＳＩ−ＭＳは、設計された重鎖のみの部位特異的修飾を示唆している。抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｉ２−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ３（配列番号２７、図５Ｈ）では、ＨＰＬＣによって、かなりの量の未修飾抗体（３９％、保持時間４．８分）が保持されていて、ＤＡＲ＝１（４６％、保持時間５．４分）およびＤＡＲ＝２（１６％、保持時間５．９分）の種の混合物が観察されるので、免疫コンジュゲートの部分的な形成のみが示唆されている。

【0550】

【表10】

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【0551】

図６に示すとおり、トラスツズマブ免疫コンジュゲート（Ａ）抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３（配列番号１１２０）、（Ｂ）抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１１２２）、および（Ｃ）抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬ−Ｎ３８９（配列番号１１２１）を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＡｎＳＥＣ）によってＳｈｏｄｅｘＰＲＯＴＥＩＮＫＷ−８０３カラムで分析した。３つの場合すべてで、ＡＤＣはモノマーであった（検出可能量の凝集物質はない）。

【実施例8】

【0552】

ペプチドタグがグラフトされている構築物の標識
単一ステップで、ｙｂｂＲタグがグラフトされているトラスツズマブ抗体とのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦのインビトロＳｆｐ触媒コンジュゲーションも試みた。ＩｇＧ１構築物抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｓ１９０Ｄ−Ｓ１９１−Ｓ１９２Ｌ−Ｌ１９３Ｅ−Ｇ１９４Ｆ−Ｔ１９５Ｉ−Ｑ１９６Ａ−Ｔ１９７Ｓ−Ｙ１９８Ｋ−Ｉ１９９Ｌ（配列番号１１４）のＳｆｐ触媒反応を実施例６において記載したとおりに行った。反応混合物のＨＰＬＣ（図７）およびＥＳＩ−ＭＳ分析によって、ＭＭＡＦとの免疫コンジュゲート（コンジュゲートの期待質量：５０４８９Ｄａ、未修飾抗体の期待質量：４９２２３Ｄａ、観察値：４９２１６．８Ｄａ）が形成されなかったことが示されている。他のグラフトされた構築物も反応に失敗し、免疫コンジュゲートの形成に失敗した。

【実施例9】

【0553】

混合グラフト／挿入構築物の標識
単一ステップで、Ｓ６タグまたはｙｂｂＲタグがグラフト／挿入されているトラスツズマブ抗体とのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦのインビトロＳｆｐ触媒コンジュゲーションも試みた。２種のトラスツズマブ変異体、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ６４Ｌ−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｋ６５（配列番号９９）および抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｓ７６Ｄ−Ｓ７７−Ｌ７８−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ７９（配列番号３０）を、実施例６において記載したとおりにＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦおよびＳｆｐと反応させた。抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ６４Ｌ−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｋ６５（配列番号９９）は、反応混合物（図８Ａ）のＨＰＬＣによって示されているとおりに、部分的に修飾されたが、抗ｈＨＥＲ２−ＬＣ−Ｓ７６Ｄ−Ｓ７７−Ｌ７８−ＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｑ７９（配列番号３０）（図８Ｂ）は、同一の条件下で反応に失敗した（表１１）。

【0554】

【表11】

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【実施例10】

【0555】

蛍光色素での標識
酵素的抗体標識を細胞毒の部位特異的結合の他にも適用するために、本発明者らは、抗体−フルオロフォアコンジュゲートを生成するＳｆｐ触媒作用の実行可能性を実証する。この実施例は、実施例６において記載したとおりに行われた、Ｓ６タグがグラフトまた挿入されているトラスツズマブ抗体とのＣｏＡ−テトラメチルローダミン（ＣｏＡ−ＴＭＲ）の２種のＳｆｐ触媒コンジュゲーションを表している。反応混合物のＨＰＬＣトレースを２８０ｎｍおよび５５５ｎｍの両方でモニタリングした（図９）。後者の波長は、ＴＭＲ色素の吸収最大（約５５０ｎｍ）に近い。さらに、抗体−フルオロフォアコンジュゲートの逆重畳積分質量スペクトルのデータを表１２にまとめる。

【0556】

切断グラフトされたＳ６タグを含有する抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｐ１８９Ｇ−Ｓ１９０Ｄ−Ｓ１９１−Ｓ１９２Ｌ−Ｌ１９３Ｓ−Ｇ１９４Ｗ−Ｔ１９５Ｌ（配列番号１０９）では、コンジュゲーションは結果として主に、抗体コンジュゲート１個あたり２色素の形成をもたらした（図９Ａ）。同様に、残基Ｔ３５９およびＫ３６０の間に挿入された全長Ｓ６タグを有する抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）は主に、各抗体に対して２個の色素分子のコンジュゲーションを示した（図９Ｂ）。結果は、Ｓ６タグを、修飾抗体の蛍光標識のコンジュゲーションのために使用することができることを例示している。

【0557】

【表12】

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【実施例11】

【0558】

チオエーテルまたは加水分解マレイミド連結を介して連結する細胞毒でのほぼ定量的な標識
本発明のコンジュゲートでは観察されないが、マレイミド連結したペイロードは、アルブミン、グルタチオン、およびシステインの反応性チオールとのマレイミド交換を介して血漿中で脱コンジュゲーションを受けることがある（Alleyら、Bioconjugate Chem. 2008、19、759〜765）。マレイミドをベースとするコンジュゲートは、マレイミドカプロイル連結の化学的開環によって安定化することができる（Shenら、Nature Biotech. 30:184〜189 (2012)を参照されたい）。この加水分解手順を検査するために、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）の個々のＡＤＣを、ＣｏＡ−開環−ＭＣ−ＭＭＡＦを使用して調製した。さらに、代替のチオール反応性化学反応を検査するために、本発明者らは、ＭＭＡＦ細胞毒をＣｏＡの末端チオールに、アセトアミドをベースとするチオエーテル連結を介して結合させ、結果としてＣｏＡ−Ａｃ−Ａｈｘ−ＭＭＡＦを生じさせた（Alleyら、Bioconj. Chem. 19:759-765(2008)を参照されたい）。これらの酵素的コンジュゲーション反応（実施例６に記載のプロトコルによる）のＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣ結果を表１３にまとめる。ＤＡＲ＝２のほぼ定量的な標識が、ＣｏＡ−開環−ＭＣ−ＭＭＡＦ（図１０Ａ）と反応させた抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）およびＣｏＡ−Ａｃ−Ａｈｘ−ＭＣ−ＭＭＡＦ（図１０Ｂ）と反応させた抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）について観察された。

【0559】

【表13】

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【実施例12】

【0560】

切断可能なリンカーを用いての細胞毒でのほぼ定量的な標識
切断可能なリンカーを介して結合される細胞毒でのペプチドタグ付きＩｇＧの標識を実証するために、本発明者らは、カテプシンＢ感受性バリン−シトルリンリンカーを含有するＣｏＡ−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦを、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）（図１１Ａ）または抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）（図１１Ｂ）のいずれかと、Ｓｆｐが存在する状態でコンジュゲートした。この単一ステップの酵素的コンジュゲーションのＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳ結果を表１４にまとめるが、これは、両方のタグ位置について、ＤＡＲ＝２のほぼ定量的な標識を示している。

【0561】

【表14】

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【実施例13】

【0562】

ｐＨの関数とした標識反応の最適化
この実験の目的は、ＣｏＡ基質とペプチドタグ付き抗体のＳｆｐ触媒コンジュゲーションのために最適なｐＨ範囲を決定することである。３つの実験において、２．５μＭの抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）または２．５μＭの抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）を１０μＭのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと、０．２５μＭのＳｆｐ（抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）で）または１．０μＭのＳｆｐ（抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）で）が存在する状態で反応させ、ｐＨをｐＨ５．０〜１０．０で滴定した。このｐＨ範囲をカバーするために、５種の緩衝液を利用した：ｐＨ５．０では７５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ５．５、６．０、および６．５では７５ｍＭＭＥＳ緩衝液；ｐＨ７．０、７．５、および８．０では７５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液；ｐＨ９．０では７５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ１０．０では７５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液。すべての緩衝液に、１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２を補充して、酵素活性を保証した。一連のｐＨ滴定を２３℃にて２５〜３５分間、各反応について１００μＬの体積で行った。４％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３０μＬを添加することによって、酵素反応をクエンチした後に、反応混合物を、表１５にまとめるとおり、２８０ｎｍでのＨＰＬＣによって分析した。

【0563】

【表15】

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【0564】

ＨＰＬＣ結果は、８〜９のｐＨ範囲が、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦをペプチドタグ付きトラスツズマブとコンジュゲートするために最適であることを示している。このｐＨ範囲で、最低量の脱共役抗体（ＤＡＲ＝０）および最高量の二コンジュゲートＡＤＣ（ＤＡＲ＝２）をＨＰＬＣによって検出することができた。さらに、ｐＨに対して２のＤＡＲを有するＡＤＣのパーセンテージをプロットしたところ（図１２）、最適なｐＨは、検査された２つの部位について、Ｓ６タグの挿入部位から独立していることが示されている。

【実施例14】

【0565】

酵素濃度の関数とした標識反応の最適化
効率的な酵素的コンジュゲーションに必要なＳｆｐの量を検査するために、２．５μＭの抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）を３７℃にて１６時間、５０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと共に、１０ｍＭＭｇＣｌ_２を補充した５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、Ｓｆｐ酵素が存在しない状態で、または０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、もしくは１０μＭＳｆｐ酵素が存在する状態でインキュベートした。１６時間後に、反応物のアリコットをＥＳＩ−ＭＳによって分析した。０．１μＭのＳｆｐ濃度では、主に非コンジュゲート修飾抗体が、ＥＳＩ−ＭＳによって検出され得る（図１３Ａ）。定量的コンジュゲーションは、０．２５μＭに等しい（図１３Ｂ）か、または０．５μＭのＳｆｐなどの０．２５μＭ超（図１３Ｃ）のすべてのＳｆｐ濃度について得られた。

【実施例15】

【0566】

ＣｏＡ類似体の関数としての標識反応の最適化
ペプチドタグ付きＩｇＧ１抗体の定量的標識に必要であろうＣｏＡ基質の最少濃度を決定するために、２．５μＭ抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）を０．２５μＭまたは１．０μＭＳｆｐと共に、１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２を含有し、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦを次の濃度：２．５、５、７．５、１０、１５、２５、および５０μＭで補充した７５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中でインキュベートした。反応を２３℃にて１３時間進行させ、次いで、４％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３０μＬでクエンチした。ＨＰＬＣ分析（図１４Ａおよび１４Ｂ、表１６）によれば、ほぼ定量的な抗体コンジュゲーションが、７．５μＭ以上のすべてのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ濃度で達成された。標識度は、Ｓｆｐ濃度からはほぼ独立しており、ＤＡＲ２種の８６％は、０．２５μＭＳｆｐで観察され、ＤＡＲ２種の９２％は、１．０μＭＳｆｐで観察された。

【0567】

【表16】

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【0568】

抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１２９）免疫コンジュゲートの凝集状態を決定するために、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）（２．５μＭ）５．６ｍｇを４０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦと、１μＭＳｆｐが存在する状態で、１０ｍＭＭｇＣｌ_２を補充した５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中で反応させた。２３℃で３日間インキュベートした後に、反応混合物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ１００−ＨＲサイズ排除カラム（Ｓｉｇｍａ）で精製した。ＥＳＩ−ＭＳによって定量的コンジュゲーションを確認した後に（観察質量５１７８６．４０Ｄａ；免疫コンジュゲートでの期待質量５１７９１Ｄａ；未修飾抗体の期待質量５０５２５Ｄａ）、個々のＡＤＣの四次構造をＴｒｉｃｏｒｎＳ２００カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析した。ＡＤＣは主に、モノマー（９８％）であり、痕跡量のオリゴマー化種（２％）を含有した。

【実施例16】

【0569】

Ｓ６抗体およびＡＤＣの熱安定性
ペプチドタグ付き免疫コンジュゲートの熱安定性を試験するために、精製ＡＤＣ試料を示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）（表１７）または示差走査熱分析（ＤＳＣ）（表１８）によって測定した。試料を０．２５ｍｇ／ｍＬ（１．６７μＭ）の最終濃度まで、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で希釈した。ＤＳＦでは、ＳＹＰＲＯＯｒａｎｇｅゲル染色液（Ｓｉｇｍａ）を５倍の最終濃度まで、ＡＤＣの熱的アンフォールディングを示すためのトレーサーとして加えた。試料を蛍光スキャン２０回／度で、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）装置中で加熱した。ＤＳＣでは、熱的アンフォールディングを、温度を１分あたり摂氏１度の速度で上昇させながらＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ−ＤＳＣ装置中で熱容量を測定することによってモニタリングした。３状態モデルを仮定する個々のコントローラソフトウェアパッケージを使用して、溶融温度を計算した。

【0570】

すでに記載されたとおり（Wakankarら、Bioconjugate Chem. 2010、21、1588〜1595）、未修飾トラスツズマブは、２つの遷移を示す。遷移は、ＤＳＦによっては摂氏６９．７度および８１．１度で、ＤＳＣによっては摂氏７２．３度および８１．０度で観察された。未修飾抗体と同様に、程度は異なるものの、多くのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ免疫コンジュゲートが２つの遷移を示す（図１５）。熱融点のＤＳＦおよびＤＳＣ測定は十分に一致するが、ＤＳＦは、ほぼ２度低い第１遷移を報告する。一般に、多くの操作された非コンジュゲート抗体および個々のペプチドタグ付きＡＤＣは、野生型抗体である抗ｈＨＥＲ２と比較すると、ほとんど不安定化を示さない。

【0571】

【表17】

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【0572】

【表18】

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【実施例17】

【0573】

ペプチドタグ付きＡＤＣの薬物動態特性
ＭＭＡＦペイロードを有する２種のペプチドタグ付きトラスツズマブＡＤＣ（２のＤＡＲ）のインビボ安定性をチェックするために、本発明者らは、薬物動態（ＰＫ）研究をマウスにおいて行った。抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）および抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）を３匹のマウスに、１．０ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ濃度を使用して静脈内注射した。１０の試料を０．２、１、３、７、２４、４８、９６、１６８、２４０、および３３６時間目に収集した。両方のＡＤＣの血漿力価を２週間まで、抗ヒトＩｇＧ、さらには抗ＭＭＡＦ抗体および切断ヒトＨＥＲ２（細胞外ドメイン３〜４）をコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＬＩＳＡアッセイを使用してモニタリングした。次いで、ＥＬＩＳＡ結果を未修飾トラスツズマブＩｇＧ１のＰＫ研究と比較した。抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）が、未修飾トラスツズマブと比較して迅速な崩壊をマウスにおいて示した一方で、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）は、２週間にわたって、未修飾トラスツズマブと同様の血清クリアランスを示した（図１６）。両方のＡＤＣについて、抗ｈＩｇＧおよび抗ＭＭＡＦ力価は互いの跡をたどっていて、これは、マウスにおけるインビボ曝露の間に、もしあるとしても、薬物はほとんど失われないことを示唆している。

【実施例18】

【0574】

ペプチドタグ付きＡＤＣのインビトロ効力
ペプチドタグ付きＡＤＣのインビトロ細胞殺滅アッセイをＨＥＲ２発現ＭＤＡ−２３１細胞系で実施した。ＤＡＲ＝２のＡＤＣを、実施例６において記載したとおりに、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１２１）および抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１２７）を切断不可能なＭＣ−ＭＭＡＦおよび切断可能なＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ（実施例１２）と反応させることによって調製した。対応するＡＤＣ、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１１７）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１１８）、抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｔ３５９−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｋ３６０（配列番号１１０８）、および抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ−ＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｎ３８９（配列番号１１０７）のインビトロ効力を、ＰＣ３−３１（高いＨＥＲ２のコピー数）およびＰＣ３（低いＨＥＲ２のコピー数）ＥｒｂＢ２操作細胞で検査した。ＰＣ３−３１細胞系に関して、すべてのペプチドタグ付きＡＤＣは、強力な細胞傷害性活性をピコモル範囲の５０％効果濃度（ＥＣ_５０）で明示した。対照的に、ＰＣ３細胞での対応するＥＣ_５０値は、６０ｎＭよりも高かった。結果を表１９および図１７にまとめるが、これらは、４種のコンジュゲートすべてが高度に強力なＤＣであり、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性細胞を抗原依存的に殺滅することを示している。

【0575】

【表19】

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【実施例19】

【0576】

細胞培地中での細胞傷害性ＣｏＡ類似体でのペプチドタグ付きＩｇＧの標識
ＰＰＴアーゼ触媒４’−ホスホパンテテイニル化の生体直交性は、馴化培地などの複雑な混合物中でのペプチドタグ付きＩｇＧの部位特異的標識を可能にする。ペプチドタグ付き抗体の分泌の後に、外因的に加えられたＰＰＴアーゼ（Ｓｆｐなど）および薬物−ＣｏＡ基質（ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦなど）は、均一なＡＤＣの形成をもたらし、これは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用する単一ステップで精製することができる。

【0577】

例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ＣＨ３ドメインにＳ６タグ挿入を有するＩｇＧ１重鎖をコードするプラスミドＤＮＡおよび未修飾κ軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡを形質移入した。ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁培養液４０ｍＬを３７℃にて５日間培養した。２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって採集した後に、培地上清に、４０μＭのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の最終濃度まで補充した。次いで、培地上清を２つの２０ｍＬアリコットに分けた。組換えによって産生されたＳｆｐ酵素（５μＭ）をアリコットの１つに添加し（表２０、実験＃２を参照されたい）、酵素反応を室温にて２４時間進行させた。

【0578】

【表20-1】

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【0579】

抗体精製を、床体積０．２５ｍＬを有するタンパク質ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムを使用して各実験について実施した。ＰＢＳで平衡化させた後に、培地上清をカラムに約１ｍＬ／分の流速で注入し、フロースルーを収集した。ＰＢＳ２０カラム体積で洗浄した後に、結合した抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）６カラム体積を使用して溶離し、直後に、１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で中和して、約８の最終ｐＨを達成した。溶離液の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価し、抗体収量をブラッドフォード法によって決定した。最後に、Ｓｆｐ依存性培地中ＡＤＣ形成を、タンパク質Ａ溶離液のＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析によって確認した。

【実施例20】

【0580】

アセチルＣｏＡでのペプチドタグ付きＩｇＧのインビトロ標識およびその後の細胞毒とのコンジュゲーション
アセチルＣｏＡによる免疫コンジュゲートの調製の原理は、３ステップ化学酵素的コンジュゲーションプロトコルであり、この際、アセチル部分は、ＣｏＡの反応性チオール基のための保護基として役立つ。さらに、ＳｆｐなどのＰＰＴアーゼは、触媒作用について、大きなＣｏＡ類似体（例えば、ぺプチジル−ＣｏＡ）を許容するが、触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）は、ＣｏＡ自体と比較するとかなり低下する（Sieberら、J. Am. Chem. Soc.125: 10862〜10866 (2003)を参照されたい）。したがって、小さなアセチル基が、天然ＣｏＡ基質で見られるのと同様の酵素の動態を保証すると予測される。

【0581】

例えば、ペプチドタグ付きＩｇＧ抗体とのアセチル化ｐｐａｎ部分の共有結合的コンジュゲーションを、実施例６において記載したとおりに、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦの代わりにアセチルＣｏＡを使用して実施する。ＥＳＩ−ＭＳにより定量的コンジュゲーションを確認した後に、コンジュゲートを反応緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、０．１５ＭＮａＣｌ）に透析する。透析したコンジュゲートを約５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．５Ｍヒドロキシルアミンおよび２５ｍＭＥＤＴＡを含む反応緩衝液（ｐＨ７．２）を含有する脱アセチル化溶液１０％（ｖ／ｖ）を補充する。この化学的チオエステル切断反応を室温にて３時間進行させ、続いて、反応混合物を、１０ｍＭＥＤＴＡを補充した反応緩衝液（ｐＨ７．２）に緩衝液交換する。ＥＳＩ−ＭＳにより定量的脱アセチル化を確認した後に、次いで、脱保護ｐｐａｎ部分を１５当量のチオール反応性マレイミド−ＭＣ−ＭＭＡＦ（０．５ｍＭ）と室温にて１時間コンジュゲートする。反応物を、ＰＢＳへの緩衝液交換によってクエンチする。最後に、定量的ＡＤＣ形成をＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析によって確認する。

【実施例21】

【0582】

細胞培地中でのアセチルＣｏＡでのペプチドタグ付きＩｇＧの標識およびその後の細胞毒とのコンジュゲーション
均一なＡＤＣのＰＰＴアーゼ触媒生成の生体直交性により、細胞培地中でのＩｇＧでの部位特異的標識が可能である（実施例１９を参照されたい）。細胞傷害性薬物分子を抗体に直接的に結合させる代わりに、ＡＤＣ生成のためのアセチルＣｏＡでの培地中標識を、３ステップ化学酵素的コンジュゲーションプロセスによって実施することも可能である。小さなアセチルＣｏＡ類似体は、大きな細胞傷害性ＣｏＡ類似体と比較すると改善された触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）でコンジュゲーション反応を可能にし、それによって、定量的コンジュゲーションのために必要な酵素量をかなり減らすことを可能にする。さらに、プロセスの開発のために、標識反応を大きな培養体積で非毒性化合物と共に行うことが有利であろう。アセチル−ｐｐａｎ部分とコンジュゲートしたペプチドタグ付きＩｇＧは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用する単一ステップで精製することができる。精製アセチル−ｐｐａｎ−コンジュゲート抗体から出発して免疫コンジュゲートを調製するために、その後の２つの化学反応を実施例２０において記載したとおりに実施する。

【実施例22】

【0583】

細胞培地中でのアセチルＣｏＡまたは生体直交性ＣｏＡ類似体でのペプチドタグ付きＩｇＧの標識およびその後の細胞毒とのコンジュゲーション
均一なＡＤＣのＰＰＴアーゼ触媒生成の生体直交性により、細胞培地中でのＩｇＧの部位特異的標識も可能である（実施例１９を参照されたい）。細胞傷害性薬物分子を抗体に直接的に結合させる代わりに、ＡＤＣ生成のためのアセチルＣｏＡでの培地中標識を、３ステップ化学酵素的コンジュゲーションプロセスによって実施することも可能である。小さなアセチルＣｏＡ類似体は、大きな細胞傷害性ＣｏＡ類似体と比較すると改善された触媒効率（ｋ_ｃａｔ／Ｋ_Ｍ）でコンジュゲーション反応を可能にし、それによって、定量的コンジュゲーションのために必要な酵素量をかなり減らすことを可能にする。さらに、プロセスの開発のために、標識反応を大きな培養体積で非毒性化合物と共に行うことが有利であろう。アセチル−ｐｐａｎ部分とコンジュゲートしたペプチドタグ付きＩｇＧは、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用する単一ステップで精製することができる。精製アセチル−ｐｐａｎ−コンジュゲート抗体から出発して免疫コンジュゲートを調製するために、その後の２つの化学反応を実施例２０において記載したとおりに実施する。

【0584】

別法では、アセチルＣｏＡを使用する代わりに、培地中標識を、アジド、アルケン、アルキン、ケトン、またはアルデヒド部分などの生体直交性基に共有結合しているＣｏＡ類似体で行うこともできる。培地中ＰＰＴアーゼ触媒作用の後に、ｐｐａｎ結合した生体直交性基を有するペプチドタグ付き抗体を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを使用して均一に精製する。ＡＤＣ調製のためのこの２ステップ化学酵素的標識戦略の最後のステップとして、相補的生体直交性基と反応させることは、抗体への薬物部分の部位特異的結合につながる。図２２は、カルボニル官能化されたＣｏＡ類似体をＡ１タグ付き抗体と部位特異的に結合させ、続いて、末端基（ＴＧ）のオキシムライゲーションを行うための２ステップ法を例示している。細胞培地中で第１ステップを行った後に、生じたカルボニル官能化された抗体をタンパク質Ａアフィニティー精製によって精製する。次いで、第２ステップは、ｐｐａｎ連結カルボニル基をアミノオキシ誘導体化ＴＧと反応させることを伴う。反応の後に、過剰のＴＧを透析または緩衝液交換によって除去する。カルボニル官能化されたＣｏＡ類似体（ケトンＣｏＡ）の合成は、実施例２３に記載する。

【実施例23】

【0585】

ケトンＣｏＡの合成
２５ｍＭＣｏＡ−ＳＨ水溶液（２０μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）７８４μＬを、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）９．０ｍＬに加えた。メチルビニルケトン（３０μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨ_２Ｏ中で１０倍に希釈した後に、結果として生じた水溶液２５μＬを２ｎＭＣｏＡ−ＳＨ溶液に加えた。反応混合物を室温にて１時間振盪した。反応物を液体窒素中でクエンチし、−８０℃で貯蔵した。

【0586】

反応混合物を粒径５μｍおよび１０×１００ｍｍ寸法のＳｕｎＦｉｒｅＰｒｅｐＣ_１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で精製した。反応混合物４〜６ｍＬを注入した後に、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／水（Ａ）と０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／アセトニトリル（Ｂ）との間の次の勾配を５ｍＬ／分の流速で適用した。

【0587】

【表20-2】

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ＨＰＬＣ精製されたケトンＣｏＡをＬＣ−ＭＳによって確認した。Ｃ_２５Ｈ_４３Ｎ_７Ｏ_１７Ｐ_３ＳでのＥＳＩ−ＭＳ計算値［ＭＨ］^＋：８３８．２；観察値：８３８．１。所望の生成物を凍結乾燥させると、ケトンＣｏＡ２．９３ｍｇ（３．５μｍｏｌ）が収率１８％で得られた。

【実施例24】

【0588】

４のＤＡＲを有するＡＤＣの生成および特性
４のＤＡＲを有するＡＤＣは、同じ酵素の基質である複数のペプチドタグを１個の抗体に挿入／グラフトすることによって生成することができる（図１９Ａ）。例えば、ｙｂｂＲタグおよびＳ６タグは両方とも、ＰＰＴアーゼＳｆｐによって基質として認識される。逆に、複数の異なるリガンドでの抗体の標識は、２種の異なるＰＰＴアーゼの基質であるペプチドタグを１個の抗体に挿入／グラフトすることによって達成される。例えば、Ａ１タグは、ＡｃｐＳＰＰＴアーゼによって専ら認識されるが、Ｓ６タグは、ＳｆｐＰＰＴアーゼによって優先的に修飾される。さらに、より高いＤＡＲ（例えば、６、８、１０、１２などのＤＡＲ）を有する免疫コンジュゲートを、追加のタグを加えることによって生成することができる。酵素的コンジュゲーションを、システイン、ピロリシン、ピロリン−カルボキシ−リシン、および非天然アミノ酸を介する部位特異的コンジュゲーション、さらにはＬｙｓ、Ｃｙｓ、またはＴｙｒ選択的化学反応などの化学選択的方法などの他の標識戦略と組み合わせることもできる。

【0589】

４のＤＡＲを有する均一なＡＤＣを調製するために、２個のペプチドタグを、トラスツズマブＩｇＧ１の重鎖に、すなわち、１個のＳ６タグをＶ_Ｈドメインに、かつ１個のｙｂｂＲタグをＣＨ３ドメインに組み込んだ（抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３−Ｅ３８８−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１４２））。この二重タグ付き抗体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で５０ｍＬスケールで発現させた。形質移入の後に、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を５日間培養し、その後、３４００ｒｐｍで１５分間遠心分離することによって採集した。結果として生じた培地上清を、０．２２μｍ細孔サイズフィルターで濾過した。精製を、床体積０．６ｍＬを有し、ＰＢＳ２０カラム体積で平衡化させておいたタンパク質ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して達成した。濾過した培地上清を約１ｍＬ／分の流速で負荷した。ＰＢＳ２０カラム体積でカラムを洗浄した後に、ペプチドタグ付き抗体を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）５カラム体積で溶離し、直後に、１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０）で約８の最終ｐＨまで中和した。ブラッドフォード法に従うと、全収量は、培養液１リットルあたり精製抗体８ｍｇであった。抗体構築物の純度をＳＤＳ−ゲル電気泳動によって評価した。３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒＵｎｉｔで濃縮した後に、２．５μＭ抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｖ２−ＧＤＳＬＳＷＬＬＲＬＬＮ−Ｑ３−Ｅ３８８−ＤＳＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１４２）を５０μＭＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ、１μＭＳｆｐ、１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２と共に、７５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５中、２３℃にて１６時間インキュベートして、二重タグ付き抗体を４個の薬物分子で酵素的標識した。

【0590】

還元および脱グリコシル化抗体構築物の逆重畳積分質量スペクトルによって、２個のｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦユニットがトラスツズマブの各重鎖に共有結合していることが確認された（観察質量５４２２３．２０Ｄａ；期待質量５４２３１Ｄａ）。脱共役種（期待質量５１７００Ｄａ）も一標識種（期待質量５２９６６Ｄａ）も、ＥＳＩ−ＭＳによって観察されなかった。４のＤＡＲを有するＡＤＣへのほぼ定量的な変換（ピーク面積積算によれば９５％）がＨＰＬＣ分析によってさらに確認された（図１９Ｂ）。

【実施例25】

【0591】

タンパク質発現および精製プラットフォーム（ＰＥＰＰ）を使用してのペプチドタグ付きＡＤＣの包括的なライブラリの生成
ヒトＩｇＧ１Ｂ１２抗体の結晶構造の試験および表面アクセス性計算（実施例１）に基づき、２６８種のペプチドタグ付きトラスツズマブＩｇＧ１構築物からなるライブラリが提案された。定常領域へのＳ６およびｙｂｂＲタグ配列の体系的な挿入を、表８に列挙したオリゴヌクレオチドを使用する標準的な分子生物学的方法によって達成した。ＰＥＩ法（Meissnerら、2001）に従って、トラスツズマブの重鎖また軽鎖遺伝子のいずれかを有する配列確認されたプラスミドを使用して、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞に過渡的同時形質移入した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）３５ｍＬの体積中、３７℃にて、５％ＣＯ_２下での５日間の各ライブラリメンバーの培養をＰＥＰＰシステムで実施した（Gonzalez R、Jennings LL、Knuth M、Orth AP、Klock HE、Ou W、Feuerhelm J、Hull MV、Koesema E、Wang Y、Zhang J、Wu C、Cho CY、Su AI、Batalov S、Chen H、Johnson K、Laffitte B、Nguyen DG、Snyder EY、Schultz PG、Harris JL、Lesley SA. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010、107(8):3552〜7）。自動細胞採集の後に、同じシステムを使用して、ペプチドタグ付き抗体のライブラリをタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単には、培地上清の０．２２μｍ濾過の後に、各濾液を、沈降樹脂０．２ｍＬを含有するタンパク質Ａアフィニティーカラムにほぼ１ｍＬ／分の流速で負荷した。次いで、カラムをＰＢＳ２０カラム体積で洗浄し、続いて、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０の５カラム体積で溶離した。すぐに、溶離液を１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５％（ｖ／ｖ）で中和した。

【0592】

タンパク質Ａ精製抗体の収量を決定するために（表２１）、溶離液のタンパク質濃度をＮＤ−１０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍで、ＩｇＧ分子について事前設定されたモル吸光係数を使用して二重に測定した。ペプチドタグ付き抗体を、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−０．５遠心濾過デバイス（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した後に、酵素触媒コンジュゲーション反応を、２０℃にて約１６時間、２．５μＭのペプチドタグ付き抗体、２０μＭのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質、および１μＭのＳｆｐ酵素で、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２および２０ｍＭのＮａＣｌを補充したトリス−ＨＣｌ緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ８．０）中で行った。ペプチドタグ付き抗体の標識度を、分析用ＨＰＬＣによってＰＬＲＰ−Ｓカラム（４０００Å、５μＭ、５０×４．６ｍｍ、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中で２５〜５０％アセトニトリルの６分の直線勾配で定量化した。対応する脱共役抗体を陰性対照として使用した（表２１）。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４遠心濾過デバイス（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して抗体コンジュゲートを濃縮した後に、酵素反応を、Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ−ＴＯＦ装置（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での質量分析法によってさらに分析した。還元および脱グリコシル化抗体コンジュゲートの逆重畳積分ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを、濃縮反応混合物１０μＬを使用することによって得た（表２１）。

【0593】

ペプチドタグ付きＡＤＣ構築物をＮｉ−ＮＴＡ（ニッケル−ニトリロ三酢酸）クロマトグラフィーによってさらに精製して、Ｓｆｐ酵素および過剰のＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡカラム（それぞれ床体積０．２ｍＬ）をＰＢＳで平衡化させた後に、濃縮したコンジュゲーション試料をカラムに、ほぼ１ｍＬ／分の流速で負荷した。次に、カラムをＰＢＳ２０カラム体積で洗浄し、続いて、２５０ｍＭイミダゾールおよび３００ｍＭＮａＣｌを補充したトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）５カラム体積で溶離した。ブラッドフォードアッセイによると、ペプチドタグ付きＡＤＣの回収率は、タンパク質Ａ精製出発物質の３９％と平均された。次いで、ＰＥＰＰシステムを使用して、ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することで各試料をＰＢＳに緩衝液交換した。緩衝液交換の後に、ペプチドタグ付きＡＤＣを、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４遠心濾過デバイス（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、コンジュゲートの濃度を、ＰＢＳでの希釈によって調整した。適切な濃度に調整したら、ＡＤＣ試料をＤＳＦ（示差走査蛍光分析）、ＬＣ９０（ＬａｂＣｈｉｐ９０）、ＡｎＳＥＣ（分析用サイズ排除クロマトグラフィー）、およびインビトロ効力アッセイ（データは図示せず）によってさらに特徴付けた。

【0594】

元々計画された２６８種のペプチドタグ付きトラスツズマブ抗体のうち、発現を１８３種の構築物について検査した（６８％）。発現レベルは、培養液１リットルあたり抗体０〜３０ｍｇ超の範囲の大きな変動性を示し（表２１）、平均は、培養液１リットルあたり抗体１６ｍｇ（±８ｍｇ標準偏差）である。さらに、発現レベルは、ペプチドタグ挿入の位置と相関しており、４６種の軽鎖構築物（培養液１リットルあたり１３±８ｍｇ）が、１３７種の重鎖構築物（培養液１リットルあたり１７±８ｍｇ）よりも低い平均発現レベルを示している。発現レベルは、ペプチドタグの種類にも依存しており：ｙｂｂＲタグ挿入を有する９５種の抗体構築物は平均して、Ｓ６タグ挿入を有する対応する８８種の構築物（培養液１リットルあたり１３±８ｍｇ）よりも高い発現レベル（培養液１リットルあたり１９±７ｍｇ）を示す。逆の傾向が、逆相ＨＰＬＣ分析に基づくコンジュゲーション効率について観察される：ほぼ定量的なＡＤＣ形成（薬物−対−抗体比≧１．９）を示す４４種（７２％）のペプチドタグ付き構築物は、Ｓ６ペプチド配列の挿入に基づく一方で、１７種（２８％）のｙｂｂＲタグ付き抗体しか、対応するＡＤＣへのほぼ定量的な変換を示さなかった。

【0595】

平均すると、重鎖構築物は、軽鎖でのペプチド挿入よりも効率的にコンジュゲートした：軽鎖にペプチドタグ挿入を有する構築物のうちの１９％（４３種のうちの８種）は少なくとも１．９のＤＡＲを示したが、重鎖にペプチドタグ挿入を有する構築物のうちの４０％（１３１種のうちの５３種）は、同じ効率でコンジュゲートし得た。最良の全体コンジュゲーション効率は、ＣＨ１ドメインの複数のループ領域でのペプチドタグ挿入によって示される。総じて、１８３種の発現ペプチドタグ付き抗体のうち、１７４種の構築物のコンジュゲーション効率が決定され得、６１種（３５％）の構築物が１．９以上の薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）をもたらした。

【0596】

結果として生じたＡＤＣの熱安定性は、ペプチドタグ挿入の部位に依存する。例えば、実施例２６において詳細に例示するとおり、ＣＨ２ドメインでの多くのペプチドタグ挿入は、ＤＳＦ（示差走査蛍光分析）測定によると、最低観察熱遷移（Ｔｍ１）のかなりの低下につながる。分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって試験された１５６種のペプチドタグ付きＡＤＣのうちの１３５種（８７％）では、凝集または抗体オリゴマーはほとんど観察されなかった（≧９０％モノマー種）。ペプチドタグ付きＡＤＣのインビトロ効力は、期待されたとおり、それらの標識度と相関した。好ましい特性を有する多数のペプチドタグ付きＡＤＣを生成することができるが、データも、発現収量、熱安定性、コンジュゲーション効率、および他の特性が、タグ挿入部位の選択によって多大な影響を受けることを説明している。

【0597】

【表21-1】

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【表21-2】

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【表21-3】

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【表21-4】

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【表21-5】

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【表21-6】

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【表21-7】

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【表21-8】

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【表21-9】

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【表21-10】

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【表21-11】

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【表21-12】

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【実施例26】

【0598】

薬物動態（ＰＫ）研究およびさらなる特徴付けのための、選択されたペプチドタグ付きＡＤＣのスケールアップ
ＰＥＰＰシステムでは、ＰＫ研究のための十分な量のペプチドタグ付きＡＤＣが得られない。その後で、実施例２５で検査した１８３種の抗体（表２１）のうちから選択した９７種の構築物（表２２）の発現を、２００〜１０００ｍＬ培養体積までスケールアップした。スケールアップについての選択基準は、実施例２５で調製したＡＤＣについて観察された高いコンジュゲーション効率、合理的な発現収量、インビトロ効力が確認されたこと、および低い凝集レベルであった。

【0599】

選択されたＳ６／ｙｂｂＲタグ付き抗体をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃にて、５％ＣＯ_２下で５日間発現させた後に、培養物を遠心分離によって採集し、結果として生じた培地上清を０．２２μｍフィルター（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。抗体発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検査した。次に、濾液を０．５〜１ｍＬ／分の流速で、タンパク質Ａ樹脂０．５ｍＬを含有するＰＢＳ平衡化カラムに、ＭＩＮＩＰＵＬＳＥｖｏｌｕｔｉｏｎぜん動ポンプ（ＧｉｌｓｏｎＩｎｃ．）を使用することによって負荷した。カラムをＰＢＳ１００〜２００カラム体積で洗浄した後に、抗体構築物を０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で２つの２．５ｍＬ画分に溶離した。両方の画分をすぐにトリス−ＨＣｌ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ８．０）２５〜３８％（ｖ／ｖ）で中和した。タンパク質Ａ精製抗体（表２２）の収量を決定するために、溶離液のタンパク質濃度をＮＤ−１０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２８０ｎｍで、ＩｇＧ分子について事前設定されたモル吸光係数を使用して二重に測定した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＤｉａｌｙｓｉｓＣａｓｓｅｔｔｅｓ（３．５〜７．０ｋＤａカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、各構築物の第２溶離画分を、その後のＤＳＦによる非コンジュゲート抗体の熱安定性測定のためにＰＢＳに透析した（表２３）。各ペプチドタグ付き抗体の第１溶離画分をコンジュゲーション緩衝液（２０ｍＭＮａＣｌおよび１２．５ｍＭＭｇＣｌ_２を補充されている７５ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０）に透析した。抗体濃度を２．５μＭに調整した後に、コンジュゲーション反応を、ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦおよびＳｆｐ酵素をそれぞれ３０〜６０μＭおよび１〜４μＭの最終濃度まで加えることによって開始した。酵素反応を室温にて約１６〜２０時間進行させ、その後、標識度を分析用逆相ＨＰＬＣによって、個々の脱共役抗体を対照として使用して検査した（表２２）。すべてのコンジュゲーション反応を質量分析法によって、Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ−ＴＯＦ装置で分析した（表２２）。ほぼ定量的なコンジュゲーションを確認した後に、反応混合物を、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過デバイス（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１ｍＬの最終体積まで濃縮した。遠心分離によって沈澱物を除去した後に、Ｓｆｐ酵素および過剰のＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ基質をＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって、ＨｉＬｏａｄ２６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００分取グレードカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、ＰＢＳ中、１ｍＬ／分の流速で除去した。ＳＥＣの後のペプチドタグ付きＡＤＣの純度を、逆相ＨＰＬＣによって評価した。０．２２μｍ濾過の後に、ＡＤＣの最終収量を上記のとおり、ＮＤ−１０００ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での三重の測定を使用して決定した（表２２）。

【0600】

【表22-1】

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【表22-2】

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【表22-3】

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【表22-4】

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【表22-5】

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【表22-6】

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【表22-7】

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【表22-8】

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【0601】

選択されたペプチドタグ付き抗体の発現レベルは、細胞培養液１リットルあたり２５ｍｇと平均され（４〜５７ｍｇ／Ｌの範囲）（表２２）、精製ＡＤＣの最終収量は、細胞培養液１リットルあたり１４ｍｇと平均された（１〜３８ｍｇ／Ｌの範囲）（表２２）。ＨＰＬＣおよびＭＳによって検査すると、すべてのＡＤＣが、２個のＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ分子と、１．９の平均ＤＡＲ（ＤＡＲは１．５〜２．０の範囲）で部位特異的にコンジュゲートした（表２２）。調製された９７種のＡＤＣのうちの９２種で、凝集またはオリゴマー種は検出されなかった（表２２）。分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定すると、すべての他のＡＤＣは、少なくとも８１％モノマーであった（２種のＡＤＣについてはデータがない）。非コンジュゲート抗体およびＡＤＣの熱安定性をＤＳＦによって特徴付けた（表２３）。野生型トラスツズマブでは、２つのＤＳＦ熱溶融遷移（Ｔｍ１およびＴｍ２）が６９．７℃および８１．２℃で観察された。９７種のペプチドタグ付き抗体のうちの２８種では、両方の遷移が、野生型トラスツズマブで観察された遷移から３℃未満の範囲内である。ＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦのコンジュゲーションは、非コンジュゲート抗体に対して、ＡＤＣのＴｍ１を平均して１．２℃低下させ、ＡＤＣのＴｍ２を平均して０．６℃低下させた（表２３）。３７種の抗体（およびＡＤＣ）では、熱安定性が、Ｔｍ１における差異によって示されるとおり、野生型トラスツズマブに対してかなり（＞３℃）低下した。この遷移は、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン（アミノ酸残基２２８〜３４０）のアンフォールディングに帰せられ、実際に、不安定化した抗体のうちの多くが、ＣＨ２ドメイン中の位置に挿入されたペプチドタグを有する。具体的に、図１８のプロットは、ＣＨ２ドメインへのペプチドタグ挿入は一般に、重鎖の隣接するＣＨ１およびＣＨ３ドメインへの個々のペプチドタグ挿入のＴｍ１値よりも低いＴｍ１値につながることを示している。上述のとおり、ペプチドタグの位置は、結果として生じる抗体およびＡＤＣの特性に有意に影響を及ぼし得る。

【0602】

【表23-1】

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【表23-2】

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【表23-3】

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【表23-4】

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【表23-5】

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【表23-6】

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【表23-7】

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【0603】

精製ＡＤＣを、２種の操作された細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６およびクローン４０、ならびに標的化抗原ヒトＨＥＲ２を細胞表面上に内因性発現する２種の細胞系（ＪｉｍＴ１およびＨＣＣ１９５４）を含めた選択された細胞系（表２４）に対するインビトロ効力について特徴付けた。ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞は、細胞１個あたり約５００，０００コピーのＨＥＲ２を安定発現する一方で、クローン４０は、約５０００コピー／細胞しか発現しない。ＨＣＣ１９５４細胞は、高レベル（約５００，０００コピー／細胞）のヒトＨＥＲ２を表面上に内因性発現する（Clinchy B、Gazdar A、Rabinovsky R、Yefenof E、Gordon B、Vitetta ES. Breast Cancer Res Treat. (2000) 61:217〜228）。ＪｉｍＴ１細胞系は、細胞１個あたり約８０，０００コピーのＨＥＲ２を発現する（Mocanu M-M、Fazekas Z、Petras M、Nagy P、Sebestyen Z、Isola J、Timar J、Park JW、Vereb G、Szollosi J.Cancer Letters (2005)227:201〜212）。自動システム（Melnickら、(2006)Proc Natl Acad Sci U S A. 103:3153〜3158）を用いて、細胞を様々な濃度のＡＤＣと共にインキュベートしてから５日後に、細胞増殖アッセイをＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）で行った（Rissら、(2004) Assay Drug Dev Technol. 2:51〜62）。トラスツズマブペプチドタグ付き−ＭＭＡＦＡＤＣは特異的に、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６、ＨＣＣ１９５４、およびＪｉｍＴ１細胞を殺滅し（表２４）：トラスツズマブペプチドタグ付き−ＭＭＡＦＡＤＣのＩＣ_５０値は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６、ＨＣＣ１９５４、およびＪｉｍＴ１細胞についてそれぞれ約０．４５ｎＭ、０．２４ｎＭ、および２．０ｎＭと平均され（表２４）、異なるＨＥＲ２発現レベルと一致した。抗原陰性（低Ｈｅｒ２）対照細胞系ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン４０の殺滅は、最高試験濃度（３３ｎＭ）でも、９７種のＡＤＣのうちの９２種で観察されなかった。

【0604】

【表24-1】

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【表24-2】

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【表24-3】

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【表24-4】

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【表24-5】

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【表24-6】

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【表24-7】

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【表24-8】

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【0605】

良好な薬物動態特性がＡＤＣのインビボ有効性には必須である（Hamblettら、Clin Cancer Res.、10:7063〜7070 (2004); Alleyら、Bioconjug. Chem. 19:759〜765 (2008)）。抗体とのＣｏＡ−ＭＣ−ＭＭＡＦ分子のコンジュゲーションは、その生物物理学的特性に負の影響を及ぼし得、その結果、対応するＡＤＣの迅速なクリアランスおよびインビボ有効性の劇的な低下が生じ得る（Hamblettら、2004）。インビボクリアランスおよびＡＤＣインビボ安定性に対するコンジュゲーション部位の作用を評価するために、薬物動態（ＰＫ）研究を、非担腫瘍マウスにおいて、８６種のペプチドタグ付きトラスツズマブＡＤＣ（表２５）で行った。

【0606】

各ペプチドタグ付きＭＭＡＦＡＤＣを、３匹のマウスに１ｍｇ／ｋｇの単回用量で静脈内注射した。次いで、９つの血漿試料を３４０時間の時間経過にわたって収集し、その後、ＡＤＣの血漿力価をＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、血漿試料からトラスツズマブＡＤＣ分子を捕捉するために、固定化されたヒトＨＥＲ２の細胞外ドメインを使用する。このアッセイの捕捉ステップの後に、抗ＭＭＡＦ抗体を使用して、「無傷」のトラスツズマブＭＭＡＦコンジュゲートの血漿中濃度を専ら測定する。第２ＥＬＩＳＡ実験において、抗ｈＩｇＧ抗体は、コンジュゲートおよび非コンジュゲートトラスツズマブ分子の両方の血漿中濃度を示すシグナルを生成する。ＡＤＣのペイロード脱コンジュゲーションがインビボで起こらなければ、抗ＭＭＡＦおよび抗ｈＩｇＧＥＬＩＳＡは両方とも、ＡＤＣ血漿中濃度において同一の読み出し情報をもたらすと予測される。しかしながら、インビボでペイロードが喪失した場合には、抗ＭＭＡＦＥＬＩＳＡは、抗ｈＩｇＧＥＬＩＳＡよりも低いシグナルを生成すると予測される。したがって、両方のＥＬＩＳＡシグナルを比較することで、個々のＡＤＣのインビボ曝露の間のペイロード脱コンジュゲーションの定量化が可能となる。ＰＫデータの解釈は、マウスに静脈内注射するために使用したのと同じＡＤＣで生成された標準曲線に基づく。

【0607】

血漿中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）は重要な薬物動態パラメータであり、これを使用して、投与された生体治療薬の総クリアランスおよび生物学的利用能を決定することができる。各ペプチドタグ付きＭＭＡＦＡＤＣについて、２つの特徴的なＡＵＣ値、ＡＵＣｈＩｇＧおよびＡＵＣＭＭＡＦをそれぞれ抗ｈＩｇＧおよび抗ＭＭＡＦＥＬＩＳＡ実験によって得た。表２５に、検査した８６種のペプチドタグ付きＡＤＣのＡＵＣｈＩｇＧおよびＡＵＣＭＭＡＦ値、さらには、それらの個々の比をまとめる。得られたＡＵＣｈＩｇＧ値は幅広い範囲にわたって広がり、３２５５３ｎＭ・ｈｒの最高値は、１３６２ｎＭ・ｈｒの最低値よりも約３０倍高く、平均は１６９３５ｎＭ・ｈｒであった。図２０Ａ〜Ｃは、高いＡＵＣｈＩｇＧ値を示す３種のペプチドタグ付きＭＭＡＦＡＤＣのＰＫ曲線を例示している（配列番号２４８のＡＤＣ、２８３３４ｎＭ・ｈｒ；配列番号３３のＡＤＣ、２１０１１ｎＭ・ｈｒ；配列番号２５１のＡＤＣ、２１６８９ｎＭ・ｈｒ）。逆に、低いＡＵＣｈＩｇＧ値を示す３種の構築物のＰＫ曲線（配列番号２１８のＡＤＣ、１３６２ｎＭ・ｈｒ；配列番号２０２のＡＤＣ、１７５７ｎＭ・ｈｒ；配列番号２４４のＡＤＣ、２３７８ｎＭ・ｈｒ）は図２０Ｄ〜Ｆに示す。ＡＵＣｈＩｇＧ値の大きな変動にも関わらず、抗ｈＩｇＧおよび抗ＭＭＡＦ力価は両方とも、互いに跡をたどっていて、このことは、もしあるとしても、ペイロード脱コンジュゲーションがインビボでほとんど起こらなかったことを示唆している。さらに、検査した８６種すべてのペプチドタグ付きＡＤＣのＡＵＣＭＭＡＦ値とＡＵＣｈＩｇＧ値との間の比は、１．０±０．１（ＡＵＣ（ＭＭＡＦ）／ＡＵＣ（ｈＩｇＧ）±標準偏差、表２５および図２１を参照されたい）と平均され、このことは、ＭＣ−ＭＭＡＦと４’−ホスホパンテテイン（ｐｐａｎ）部分の末端チオールとの間でのマレイミドをベースとした連結は、ＰＫ実験の時間経過にわたって、循環中で安定なままであったことを示唆している。同様に、これらの結果は、ｐｐａｎ補欠分子族と、挿入されたＳ６／ｙｂｂＲ／Ａ１ペプチドタグのセリン残基との間でのホスホジエステルをベースとする連結の高いインビボ安定性も示している。

【0608】

ペプチドタグ付きＡＤＣのうちの一部について観察された迅速なクリアランスはおそらく、薬物結合の結果というよりも、Ｓ６、Ａ１、またはｙｂｂＲペプチド配列がＩｇＧ１分子の特異的な領域に挿入されたことの結果である。タグ挿入部位と薬物動態プロファイルとの間の推定上の関係を、それぞれ１３６２ｎＭ・ｈｒおよび１７５７ｎＭ・ｈｒの最も低い、および三番目に低い測定ＡＵＣｈＩｇＧ値を示す配列番号２１８および配列番号２０２の２種のペプチドタグ付きＭＭＡＦＡＤＣによって例示する。両方のＡＤＣが、重鎖のＣＨ２ドメインにＳ６タグを含有する。マウス循環における不安定性に加えて、これらのＡＤＣは、ＰＫ研究の検査した８６種の試料のうちで、５番目に低い、および９番目に低い熱安定性も示す。ＤＳＦ測定によれば、対応するＡＤＣは、４９．０℃のＴｍ１（配列番号２１８のＡＤＣ）および５１．２℃のＴｍ１（配列番号２０２のＡＤＣ）を示し、結果として、６９．７℃のＴｍ１を有する野生型トラスツズマブと比較してそれぞれ２０．７℃および１８．５℃の低下を生じた。逆に、最も高いＡＵＣｈＩｇＧ値（１９６９５〜３２５５３ｎＭ・ｈｒ）を有する４０種のＡＤＣは、６７．４℃の平均Ｔｍ１値を示し、これは、野生型トラスツズマブのＴｍ１をわずか２．３℃下回るだけであり、このことは、ＡＤＣの薬物動態と熱安定性との間にあり得る相関を示唆している。さらに、これらの４０種のＡＤＣのうちの２６種は、重鎖のＣＨ１ドメインのループ領域にＳ６、ｙｂｂＲ、またはＡ１タグを含有する。上述のとおり、これらの好ましい部位でのペプチドタグ挿入は、最良の全体コンジュゲート効率も示し、それらをＡＤＣ生成のための好ましい候補としている。これらには、配列番号１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１４９、１５１、１５２、１５７、１５８、１６０、１６６、１６８、１６９、１７８、１７９、２５０、２５１、２５６、２５７、２５９、２６５、２６７、２６８、２７７、２７８、３５６、３５８、３５９、３６４、３６５、３６７、３７１、３７３、３７４、３８０、および３８１に対応する、Ｓ１１９〜Ｔ１２０、Ｔ１２０〜Ｋ１２１、Ｔ１３５〜Ｓ１３６、Ｓ１３６〜Ｇ１３７、Ｇ１３８〜Ｔ１３９、Ａ１６２〜Ｌ１６３、Ｔ１６４〜Ｓ１６５、Ｓ１６５〜Ｇ１６６、Ｇ１９４〜Ｔ１９５、Ｔ１９５〜Ｑ１９６、およびＥ３８８〜Ｎ３８９（ＣＨ３ドメイン）の間に重鎖挿入を伴う抗体が含まれる。

【0609】

【表25-1】

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【表25-2】

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【表25-3】

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【表25-4】

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【表25-5】

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【表25-6】

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【表25-7】

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【実施例27】

【0610】

細胞培地中での同時発現４’−ホスホ−パンテテイニルトランスフェラーゼでのペプチドタグ付きＩｇＧの標識
ＡＤＣの調製プロセスを合理化するために、同時発現４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）でのペプチドタグ付き抗体の酵素的標識を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で実施した。精製ステップの数の低減に加えて、抗体生成の間にＰＰＴアーゼが同時発現することによって、そのような酵素の添加および組換え産生されたバージョンの除去に関連する問題を回避し得た。概念証明として、大腸菌（E. coli）からのＡｃｐＳＰＰＴアーゼを使用して、Ａ１タグ付き抗体をアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）と、細胞培地中で部位特異的にコンジュゲートした。

【0611】

同時発現を促進するために、ＡｃｐＳＰＰＴアーゼをコードする遺伝子を、Ｎ末端シグナル配列ＭＫＴＦＩＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＩＦＬＬＰＧＡＴＡ（配列番号３５５）を追加する哺乳動物用発現ベクターｐＲＳにクローニングした。構築物、ｐＲＳ−ＡｃｐＳも、Ｃ末端Ｈｉｓ_６タグを組換え酵素（配列番号１１０６）に追加する。Ａ１タグ付き抗体ｍＡｂ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＧＤＳＬＤＭＬＥＷＳＬＭ−Ｎ３８９（配列番号３５６）を同時発現させるために、１２−アミノ−酸Ａ１ペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド断片を、抗体ｍＡｂ２−ＨＣ（配列番号１４７）の重鎖遺伝子に、哺乳動物用発現ベクターｐＭ４中で挿入し、結果として、構築物ｐＭ４−Ａ１を生じさせた。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーター下で、対応する軽鎖も同時発現する。ＰＥＩ法（Meissnerら、2001）を使用して、２９３個のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞に組換え発現プラスミドｐＭ４−Ａ１およびｐＲＳ−ＡｃｐＳの１：１混合物を過渡的に形質移入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２００ｍＬの５つのアリコット中、３７℃にて５％ＣＯ_２下で５日間培養した。次に、細胞培養物を、２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって採集し、０．２２μｍフィルターに通し、貯留した。細胞培地中での効率的なコンジュゲート形成に必要な最少抗体および酵素濃度を決定するために、濾液のアリコットを未濃縮のままにするか、または３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過ユニット（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２倍、５倍、１０倍、および２０倍に濃縮した。濃縮試料を３，７２４×ｇで２分間遠心分離して、沈澱物を除去した。ＡｃｐＳ触媒作用のための細胞培地条件を最適化するために、すべての試料に、１０倍反応緩衝液（ｐＨ８．８）を、７５ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の最終濃度まで補充した。次いで、標識反応を、アセチルＣｏＡ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることによって開始した。結果として１．５ｍＬ〜１５ｍＬの体積で生じた反応混合物を３７℃にて約１６時間インキュベートした。

【0612】

Ａ１タグ付き抗体の標識度を決定し、さらに、酵素および抗体の両方の発現レベルを定量化するために、すべての反応混合物をそれぞれＮｉ−ＮＴＡおよびタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。未濃縮試料を除いて、すべての反応混合物をＰＢＳで２倍に希釈し、その後、ＰＢＳ平衡化タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（床体積０．５ｍＬ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）にほぼ１ｍＬ／分の流速で負荷した。カラムフロースルーをそのまま、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）０．５ｍＬを充填されたＰＢＳ平衡化ＩＭＡＣカラムに注入した。すべてのタンパク質ＡおよびＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムを、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのイミダゾールを補充した５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）４０カラム体積で洗浄した。Ｈｉｓ_６タグ付き（配列番号１１０６）ＡｃｐＳ酵素をＮｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムから、３００ｍＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのイミダゾールを含有する５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）６カラム体積で溶離した。同様に、Ａ１タグ付き抗体をタンパク質Ａアフィニティーカラムから、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）６カラム体積で溶離し、直後に、１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１０）１２％（ｖ／ｖ）で中和した。

【0613】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＳＩ−ＭＳによって、ＡｃｐＳ酵素およびＡ１タグ付き抗体の溶離をそれぞれ確認した。ＵＶ−Ｖｉｓおよびブラッドフォード測定によって、Ａ１タグ付き抗体０．１７ｍｇ〜０．３４ｍｇおよびＡｃｐＳ酵素０．１２ｍｇ〜０．１５ｍｇが回収されたことが示された（表２６）。このことは、抗体濃度は、アセチルＣｏＡでの標識反応の間、未濃縮細胞培地における０．０８μＭ（１３ｍｇ／Ｌ）から、２０倍濃縮細胞培地における１．５μＭ（２３０ｍｇ／Ｌ）までの範囲であることを示唆している。したがって、Ａ１タグ付き抗体の濃度は、細胞培地の濃縮係数にほぼ比例する。同様に、ＡｃｐＳＰＰＴアーゼの濃度は、未濃縮細胞培地における０．６μＭ（９ｍｇ／Ｌ）から、２０倍濃縮細胞培地における６．８μＭ（１００ｍｇ／Ｌ）まで上昇した。

【0614】

【表26】

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【0615】

精製された抗体構築物を、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過ユニットを使用して濃縮し、還元し、脱グリコシル化し、続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ−ＴＯＦ装置（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で質量分光分析した。表２６において示すとおり、馴化細胞培地の２倍濃縮係数が、１ｍＭのアセチルＣｏＡ基質、０．１６μＭ（２４ｍｇ／Ｌ）のＡ１タグ付き抗体、および１．１μＭ（１７ｍｇ／Ｌ）のＡｃｐＳ酵素が存在する状態でのほぼ定量的なコンジュゲーションには十分である。特に、アセチルＣｏＡ基質のアセチル基は、培地中標識の間に完全に切断除去され、それによって、馴化細胞培地中でのチオエステル結合の加水分解を示す。３０倍濃縮細胞培地での独立実験において、外因的に付加されたアセチルＣｏＡが存在しない状態では、コンジュゲート形成は質量分析法によって検出され得ないことが見出された。したがって、この陰性対照は、有意な量のＣｏＡまたはその類似体の１種が細胞培地中に存在することを否定するものである。

【0616】

まとめると、この実験は、ペプチドタグ付き抗体を、補充したＣｏＡ類似体で、２倍濃縮細胞培地中でＰＰＴアーゼ触媒作用によって定量的に標識することができることを実証している。生産セル系の発酵の間の抗体濃度は、現行の概念証明実験においてよりもかなり高いので、ペプチドタグ付き抗体との補充ＣｏＡ類似体の酵素的コンジュゲートを生産レベルまで大規模化し得ることが予測され得る。補充されるＣｏＡ類似体は、チオール基、保護チオール基、またはアルデヒド、ケト基、アジド基、もしくはアルキン基などの生体直交性反応性基を特徴とする。タンパク質Ａ精製の後に、反応性基で酵素的に活性化させた抗体を、相補的毒素類似体と反応させて、対応するＡＤＣを第２のステップにおいて得ることができる。

【実施例28】

【0617】

細胞培地中でのケトンＣｏＡでのペプチドタグ付き抗体の部位特異的修飾
この実験の目的は、馴化細胞培地中で生体直交性基をペプチドタグ付き抗体に部位特異的に結合させることの実行可能性を実証することである。２ステップ法の第１ステップを、実施例２３にその合成を記載したケトンＣｏＡ類似体で実施した。このカルボニル官能化されたＣｏＡ類似体でのペプチドタグ付き抗体の培地中標識の成功によって、２ステップ法の第２ステップにおける、オキシムライゲーションによるアミノオキシ官能化ペイロードのその後の結合が可能となるであろう（図２２も参照されたい）。

【0618】

ＰＥＩ法（Meissner ら、2001）を使用して、２９３個のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）細胞に、実施例２７において記載した組換え発現プラスミドｐＭ４−Ａ１およびｐＲＳ−ＡｃｐＳの１：１混合物を過渡的に形質移入した。同時形質移入した哺乳動物細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４００ｍＬ中、３７℃にて５％ＣＯ_２下で５日間培養した後に、細胞培養物を２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって採集し、０．２２μｍフィルターに通した。次に、透明細胞培地６０ｍＬのアリコットを、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過ユニット（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２０倍濃縮した。３，７２４×ｇで５分間遠心分離することによって沈澱物を除去した後に、１ｍＭの最終濃度でケトンＣｏＡを含む濃縮物１．３１ｍＬならびに７５ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の最終濃度の１０倍反応緩衝液（ｐＨ８．８）を補充することによって、標識反応を開始した。１．５ｍＬの総体積の酵素反応物を３７℃にて約１６時間インキュベートした。

【0619】

カルボニル官能化されたＣｏＡ類似体での標識度を質量分析法によって分析する前に、反応混合物をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＰＢＳでの２倍希釈の後に、希釈した反応混合物をＰＢＳ平衡化タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（床体積０．６ｍＬ、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、約１ｍＬ／分の流速で負荷した。カラムマトリックスをＰＢＳ約４０床体積で洗浄し、その後、残留物質を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）６カラム体積で溶離した。最後に、溶離液を１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ１０）１２％（ｖ／ｖ）を加えることによって中和した。

【0620】

抗体の純度を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計でのＵＶ−Ｖｉｓ測定によれば、抗体０．３４ｍｇが回収されたが、これは、２０倍濃縮細胞培地中の１．５μＭの抗体濃度（２３０ｍｇ／Ｌ）に対応した。これは、２０倍濃縮細胞培地中でのアセチルＣｏＡでの標識反応の間に測定された抗体濃度（実施例２７）を正確に再現している。ケトンＣｏＡでの抗体標識度を質量分析法によって評価するために、中和した溶離液を、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過ユニットを使用して濃縮し、脱グリコシル化し、還元した。Ａｇｉｌｅｎｔ６５２０Ｑ−ＴＯＦ装置での質量分光分析は、所望のカルボニル官能化された抗体コンジュゲート（観察値５１９９５．３２；期待値５１９９９．６）の形成を示し、その際、約２４％の副生成物としての４’−ホスホパンテテイン−修飾抗体（観察値５１９２５．４２；期待値５１９２９．６）の形成を伴った。非コンジュゲート抗体は、逆重畳積分質量スペクトルにおいては検出不可能であった（期待値５１５８９．２）。副生成物としての４’−ホスホパンテテイン−修飾抗体の存在は、ＣｏＡ−ＳＨとメチルビニルケトンとの反応の間のケトンＣｏＡの形成が不完全であることによって説明されるであろう（実施例２３）。

【0621】

実験結果は、馴化細胞培地中での抗体とのカルボニル基の部位特異的コンジュゲーションの実行可能性を示している。この手法は、アジドおよびアルキン部分などの他の生体直交性基にも適用することができる。そのような生体直交性基は、細胞培地において完全に不活性であり、相補性官能基を含有するペイロードとのみ専ら反応し、それによって、２ステップ法の第２ステップにおける均一なＡＤＣの形成を保証する。

【実施例29】

【0622】

ｙｂｂＲタグ付きトラスツズマブＭＭＡＦＡＤＣのインビボ有効性評価
ｙｂｂＲタグ付きトラスツズマブＡＤＣである抗ｈＨＥＲ２−ＨＣ−Ｅ３８８−ＤＳ−ｐｐａｎ−ＭＣ−ＭＭＡＦ−ＬＥＦＩＡＳＫＬＡ−Ｎ３８９（配列番号１１２２）のインビボ有効性を、免疫不全ヌードマウスへのヒト腫瘍細胞系の移植に基づく異種移植片腫瘍モデルを使用して評価した。すでに記載されているとおり（SausvilleおよびBurger、2006）、そのような腫瘍異種移植片マウスでの研究は、抗癌試薬のインビボ有効性に対する貴重な洞察をもたらしている。具体的には、インビボ有効性研究を、ＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６細胞を皮下注射されたｎｕ／ｎｕマウスで実施した（MortonおよびHoughton、2007）。この細胞系を、上述のｙｂｂＲタグ付きＭＭＡＦＡＤＣに対して抗原依存的にその高い感受性を明らかにした先行するインビトロ効力アッセイに基づき選択した（表２４を参照されたい）。腫瘍が約２００ｍｍ^３のサイズに達した後に、ｙｂｂＲタグ付きＭＭＡＦＡＤＣを、５ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのいずれかの単回用量で静脈内注射したが、その際、各処置群は９匹のマウスを含んだ。抗体−薬物コンジュゲートを投与した後に、腫瘍成長を毎週モニタリングした。図２３に示すとおり、ｙｂｂＲタグ付きＭＭＡＦＡＤＣの静脈内投与は、両方の用量レベルで腫瘍の退縮をもたらした。さらに、ＡＤＣでのマウスの処置は、忍容性が良好で、いずれの処置群においても体重減少は観察されなかった。３ｍｇ／ｋｇの低い単回用量でのＭＤＡ−ＭＢ２３１クローン１６腫瘍の有効な退縮は、ｙｂｂＲタグ付きＡＤＣが、ＨＥＲ２依存性腫瘍マウスモデルにおいて有効であることを実証している。すべての動物研究を、Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication; National Academy Press, 8^th edition、2001)に従って行った。

【図1】

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【図2-1】

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【図2-2】

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【図2-3】

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【図2-4】

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【図2-5】

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【図2-6】

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【図3】

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【図4-1】

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【図4-2】

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【図4-3】

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【図5-A】

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【図5-B】

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【図5-C】

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【図5-D】

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【図5-E】

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【図5-F】

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【図5-G】

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【図5-H】

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【図6-1】

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【図6-2】

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【図7】

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【図8-A】

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【図8-B】

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【図9-A】

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【図9-B】

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【図10-A】

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【図10-B】

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【図11-A】

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【図11-B】

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【図12】

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【図13-A】

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【図13-B】

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【図13-C】

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【図14-A】

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【図14-B】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19-A】

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【図19-B】

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【図20-1】

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【図20-2】

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【図20-3】

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【図21】

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【図22】

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【図23】

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【配列表】

2015519906000001.app

【国際調査報告】

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