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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2015-519907(P2015-519907A)
(43)【公表日】2015年7月16日
(54)【発明の名称】膵内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20150619BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20150619BHJP
A61K 35/39 20150101ALN20150619BHJP
A61L 27/00 20060101ALN20150619BHJP
A61P 3/10 20060101ALN20150619BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 A
C12N5/00 202A
A61K35/39
A61L27/00 Z
A61P3/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2015-516197(P2015-516197)
(86)(22)【出願日】2013年6月6日
(85)【翻訳文提出日】2015年1月26日
(86)【国際出願番号】US2013044472
(87)【国際公開番号】WO2013184888
(87)【国際公開日】20131212
(31)【優先権主張番号】61/657,160
(32)【優先日】2012年6月8日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100190779
【弁理士】
【氏名又は名称】神谷 昌男
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】レザニア，アリレザ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C081
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC14
4B065BB19
4B065BB34
4B065CA44
4C081AB11
4C081BA13
4C081BC01
4C081CD34
4C081EA02
4C081EA13
4C087AA03
4C087BB51
4C087BB64
4C087CA04
4C087NA20
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、膵内分泌腺リッチクラスターへの膵内胚葉細胞の分化を促進し、ホルモン発現細胞におけるインスリン発現を増強する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することを含む、ホルモン発現細胞におけるインスリン発現を誘発する方法。
【請求項2】
前記エフリンリガンドを用いて前記膵内胚葉細胞を培養することが、ＮＫＸ６．１の発現も強化する、請求項２に記載の方法。
【請求項3】
エフリンリガンドを用いて前記膵内胚葉細胞を培養することが、非処理の膵臓内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現と比較して、前記膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現を強化する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記膵内胚葉細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記膵内胚葉細胞が、ほぼ約１０％未満のＣＤＸ２又はＳＯＸ２を発現する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記エフリンリガンドが、エフリンＡ３又はエフリンＡ４である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記膵内胚葉細胞が、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
請求項１の方法によって調製されたインスリン及びＮＫＸ６．１発現細胞。
【請求項10】
エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することによって調製された細胞集団であって、前記細胞集団が、エフリンリガンドで処理していない膵内胚葉細胞と比較して、強化されたインスリン及びＮＫＸ６．１を発現する、細胞集団。
【請求項11】
前記エフリンリガンドが、エフリンＡ３又はエフリンＡ４である、請求項１０に記載の細胞集団。
【請求項12】
アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において膵臓内胚葉細胞を培養することを含む、ホルモン発現細胞における成長ホルモン分泌抑制ホルモンの発現を増強する方法。
【請求項13】
インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現が抑制される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団より多くの成長ホルモン分泌抑制ホルモンを発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
インスリンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるインスリンの前記発現と比較して抑制される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
グルカゴンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの前記発現と比較して抑制される、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
グレリンの前記発現が、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した前記膵内胚葉細胞集団において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの前記発現と比較して抑制される、請求項１２に記載の方法。
【請求項18】
前記膵内胚葉細胞が、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理された前記膵内胚葉細胞が、多能性細胞の段階的分化によって取得される、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記膵内胚葉細胞の由来元である前記多能性細胞が、ヒト胚性多能性細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法。
【請求項22】
セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した前記膵内胚葉細胞集団が、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理されていない膵内胚葉細胞に比較して強化された量のＮＫＸ６．１を発現する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現レベルが、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞に比較して影響を受けない、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
スフィンゴシン−１受容体アゴニストを用いて膵内分泌細胞を培養することを含む、内分泌クラスターの形成を誘導するための方法。
【請求項25】
膵内分泌細胞を処理するために使用された前記スフィンゴシン−１受容体アゴニストが、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記膵内分泌細胞が、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性多能性幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）本出願は、２０１２年６月８日に出願された、米国特許仮出願第６１／６５７，１６０号の利益を主張するものであり、その全体が、あらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、内分泌細胞への多能性幹細胞の分化の調節因子として、エフリンリガンド及びスフィンゴシン−１−リン酸塩の使用を開示する。
【背景技術】
【0003】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
【0004】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として既知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【0005】
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、Ｈｈｅｘ及びＳｏｘ２は内胚葉の前領域を特定し、Ｃｄｘ１、２及び４は後半分を特定する。
【0006】
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−Ｂ、レチノイン酸（ＲＡ）、及びＢＭＰリガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣｄｘ２の発現を促進し、前方の遺伝子Ｈｈｅｘ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ，１２：１２１５〜１２２０）。
【0007】
特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ−１の非常に高い発現及びＣＤＸ２並びにＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。同様に、Ｆｏｘｅ１の高レベルの存在は、食道組織の指標である。肺組織において高度に発現されるのはＮＫＸ２．１である。ＳＯＸ２／Ｏｄｄ１（ＯＳＲ１）は胃組織において高度に発現される。ＰＲＯＸ１／Ｈｈｅｘ／ＡＦＰの発現は肝組織において高い。ＳＯＸ１７は胆管構造の組織で高度に発現される。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１／ＰＴｆ１ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織において高度に発現される。ＣＤＸ２の発現は、腸組織において高い。上記要約は、Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２００９，２３８：２９〜４２及びＡｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００９，２５：２２１〜２５１からの引用である。
【0008】
膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる（２００９ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２５：２２１〜２５１；２００９ Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２３８：２９〜４２）。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、及び胆管系を生じさせる。
【0009】
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【0010】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹（ＥＳ）細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫不全マウスの脂肪パッドにおけるこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米国特許第７，５３４，６０８号）。
【0011】
Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号）。次に細胞をノギンなどのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【0012】
小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−Ｂ受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１，１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、有意に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５：２５８〜２６５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
ヒト多能性幹細胞から膵臓細胞を産生するためのプロトコルの改善において、優れた研究が行われてきたが、機能性内分泌細胞及び特定のベータ細胞をもたらすプロトコルを作成する必要が依然として存在する。本出願では、エフリンリガンド及びスフィンゴシン−１−リン酸塩のクラス又はスフィンゴシン受容体のアゴニストが内分泌細胞の生成を強化し、内分泌ホルモン及び内分泌腺前駆細胞のクラスタリングを加速することを実証する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
一実施形態において、本発明は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において膵内胚葉細胞集団を培養することによって、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞集団は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞集団は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0015】
一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することによって、インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現を抑制する一方、ソマトスタチンの発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞集団は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団としてより多くのソマトスタチンを発現する。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞集団におけるインスリンの発現は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵臓内胚葉細胞集団におけるインスリンの発現と比較して抑制される。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵臓内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの発現は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグルカゴンの発現と比較して抑制される。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現は、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理していない膵内胚葉細胞集団におけるグレリンの発現と比較して抑制される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、アクチビンＡ又はアクチビンＣで処理した膵内胚葉細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉細胞の由来元である多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0016】
一実施形態において、本発明は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法を参照する。いくつかの実施形態において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞集団は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞と比較して、強化された量のＮＫＸ６．１を発現する。いくつかの実施形態において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞におけるインスリン、グルカゴン、及びグレリン等のホルモンの発現レベルは、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理していない膵内胚葉細胞と比較して、影響を受けない。いくつかの実施形態において、膵内分泌細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地で処理した膵内胚葉細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞の由来元である多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0017】
いくつかの実施形態において、本発明は、エフリンＡ４、エフリンＡ３、アクチビンＡ、アクチビンＣ、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地において膵内胚葉細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞の由来元である多能性幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
【0018】
一実施形態において、本発明は、スフィンゴシン−１受容体アゴニストで膵内分泌細胞を処理することによって、内分泌腺の発現を誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、膵内分泌細胞を処理するために使用されるスフィンゴシン−１受容体アゴニストは、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）である。
【0019】
本発明の実施形態として、本発明の方法によって調製される方法、及び本発明の細胞を使用する方法も意図される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1A】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、インスリンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1B】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ソマトスタチンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1C】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、グレリンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1D】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、グルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1E】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＰＤＸ−１の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1F】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＮＫＸ６．１の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図1G】実施例１に記載のように分化したヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞において、ＮＧＮ３の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを示す。
【図2】インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を示す。図２Ａは対照、図２Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処理した細胞、図２Ｃは、実施例２に記載のように、１００ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ３で処理した細胞を示す。
【図3】インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を示す。図３Ａは対照、図３Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ４で処理した細胞、図３Ｃは、実施例２に記載のように、１００ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ４で処理した細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【0021】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分割する。
【0022】
定義幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。
【0023】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【0024】
分化は、特殊化されていない（「コミットされていない」）又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分化した細胞」又は「分化誘導された細胞」とは、細胞の系統内でより特殊化した（「コミットした」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「コミットした」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又はコミットして）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系統は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、コミットされていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【0025】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現とは、未分化細胞と比較して、陽性マーカーのレベルの増加、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【0026】
本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。
【0027】
本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。
【0028】
本明細書で使用するとき、「ステージ１」及び「Ｓ１」は、胚体内胚葉（ＤＥ）に特徴的なマーカーを発現する細胞を同定するために互換的に使用される。
【0029】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する：ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。
【0030】
本明細書で使用するとき、「腸管」は、以下のマーカーのうちの少なくとも一つを発現する胚体内胚葉に由来する細胞を指す：ＨＮＦ３β、ＨＮＦ１β、又はＨＮＦ４α。腸管細胞は、肺、肝臓、膵臓、胃、腸などの全ての内胚葉臓器を生じさせ得る。
【0031】
本明細書で使用するとき、原腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定する「ステージ２」及び「Ｓ２」は互換的に使用される。
【0032】
「前腸内胚葉」とは、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、十二指腸の一部を生じさせる内胚葉細胞を指す。
【0033】
「後方前腸」は、後方胃、膵臓、肝臓、及び十二指腸の一部を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【0034】
「中腸内胚葉」は、腸、十二指腸の一部、虫垂、及び上行結腸を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【0035】
「後腸内胚葉」は、横行結腸の遠位３分の１、下行結腸、Ｓ状結腸、及び直腸を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【0036】
「ステージ３」及び「Ｓ３」の双方は、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。「前腸系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４α。
【0037】
「ステージ４」及び「Ｓ４」は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓前腸前駆細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、Ｐｒｏｘ１、及びＨＮＦ４α。
【0038】
本明細書で使用するとき、「ステージ５」及び「Ｓ５」は、膵臓内胚葉及び膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。
【0039】
「膵内分泌細胞」、又は「膵臓ホルモン発現細胞」、又は「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」、又は「ステージ６細胞」、又は「Ｓ６細胞」は、本明細書において互換的に使用され、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。
【0040】
「膵臓インスリン陽性細胞」は、インスリン、ＨＢ９、ＮＫＸ２．２、及びＮＫＸ６．１を発現する細胞の内分泌腺集団を指す。
【0041】
「膵内分泌前駆細胞（precursor cell）」又は「膵内分泌前駆細胞（progenitor cell）」は、細胞を発現する膵臓ホルモンになり得る膵臓内胚葉細胞を指す。そのような細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現し得る：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ−１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、又はＡＲＸ。
【0042】
本明細書では、「ｄ１」、「ｄ１」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ２」、及び「２日目」、「ｄ３」、「ｄ３」及び「３日目」等は互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。
【0043】
「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖、デキストロースを指す。
【0044】
膵内分泌前駆細胞において発現されるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を特定する「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。
【0045】
「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は本明細書で互換的に使用され、米国カリフォルニア州のＳｔｅｍｇｅｎｔから入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤を示す。
【0046】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。インビトロでの多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（米国カリフォルニア州のＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により説明されているように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを使用して現像することにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【0047】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、すなわち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【0048】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、種々のフィーダー層を用いて培養中に、又はマトリックスタンパク質コート容器を用いることによって、簡単に増殖しうる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。多能性細胞は、酵素的、機械的、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）のような種々のカルシウムキレーターの利用を用いて、培養プレートから簡単に取り除くことができる。あるいは、多能性細胞を、任意のマトリックスタンパク質又はフィーダー層がない状態で、懸濁液中で増殖させてよい。
【0049】
多能性幹細胞の供給源使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などである。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２等の多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。
【0050】
多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、Ｔｒａ １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【0051】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、及びＴｒａ １−８１のうちのすくなくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【0052】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【0053】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞であり、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１の発現はＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い。
【0054】
膵内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。あるいは、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【0055】
本発明の膵内分泌細胞は、細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１、並びに以下の転写因子、すなわち、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様において、細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、細胞である。
【0056】
一実施形態において、本発明は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地においてステージ５の集団を培養することによって、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現は、この細胞集団において、未処理細胞集団におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現の少なくとも２倍に増強される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞集団は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞集団は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0057】
一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地においてステージ５細胞を培養することによって、インスリン、グルカゴン、及びグレリンの発現を抑制する一方、ソマトスタチンの発現を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、処理した細胞集団は、未処理培養の少なくとも２倍のソマトスタチンを発現する。いくつかの実施形態において、インスリンの発現は、未処理培養におけるインスリンの発現の約半分に抑制される。いくつかの実施形態において、グルカゴンの発現は、未処理培養におけるグルカゴンの発現の約１０分の１に抑制される。いくつかの実施形態において、グレリンの発現は、未処理培養におけるグレリンの発現の約３分の１に抑制される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0058】
一実施形態において、本発明は、セマフォリン３ａ又はエピゲンを含む培地においてステージ５細胞を処理することによって、ＮＫＸ６．１の発現を増強する方法を参照する。いくつかの実施形態において、処理した細胞集団は、処理していない培養の少なくとも２倍のＮＫＸ６．１を発現する。いくつかの実施形態において、処理した培養におけるホルモンの発現レベルは、未処置培養と比較して影響を受けない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、多能性細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性細胞である。
【0059】
いくつかの実施形態において、本発明は、エフリンＡ４、エフリンＡ３、アクチビンＡ、アクチビンＣ、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地においてステージ５細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、エフリンＡ４又はエフリンＡ３を含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、アクチビンＡ又はアクチビンＣを含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、ステージ５細胞は、セマフォリン３ａ、又はエピゲンを含む培地において培養される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
【0060】
一実施形態において、本発明は、エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することを含む、インスリン発現を誘導する方法に関する。いくつかの実施形態において、エフリンリガンドは、エフリンＡ３及びエフリンＡ４から選択される。いくつかの実施形態において、エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することによって、インスリン及びＮＫＸ６．１の発現を増強する。いくつかの実施形態において、エフリンリガンドを用いて膵内胚葉細胞を培養することは、膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現を、未処理の膵内胚葉細胞におけるインスリン及びＮＫＸ６．１の発現の少なくとも２倍に増強する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、本発明の方法において使用される多能性幹細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
【0061】
一実施形態において、本発明は、本発明の方法によって調製される、インスリン及びＮＫ６．１を発現する細胞に関する。
【0062】
一実施形態において、本発明は、スフィンゴシン−１受容体アゴニストを用いて膵内胚葉細胞を培養することを含む、内分泌腺クラスター形成を誘発するための方法に関する。いくつかの実施形態において、膵内胚葉細胞は、多能性幹細胞の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。
【0063】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【0064】
（実施例１）インスリン発現の強力な誘発因子としてのエフリンＡ４の確認
本実施例は、ヒトＥＳ細胞の分化から膵内胚葉／内分泌培養の産出に関する多様なタンパクの役割を理解するために実施された。
【0065】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３２（ロック阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を補充したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；米国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿上に、１×１０5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養物は、以下のように膵内胚葉／内分泌系に分化した：ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１培地（０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ（カタログ番号６８７００，米国アイオワ州アンケニーのＰｒｏｌｉａｎｔ）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、４．５ｍＭのＤ−グルコース（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭのＭＣＸ化合物（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−へプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］へプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願公開第２０１０−００１５７１１号；参照によりその全体を本明細書に組み入れる）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地（カタログ番号１０３７２−０１９、米国カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１日間培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養し、次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）、及び２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州ミネアポリスのＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのＧｌｕｃｏｓｅ、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦活体；カタログ番号５６５７４０；米国ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ、Ｓｉｇｍａ）、及び１００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤；カタログ番号０４−００１９；米国カリフォルニア州サンディエゴのＳｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ、１０μＭのフォルスコリン、及び１０ｎＭのＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、及び１００ｎＭのＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充し、２〜３日目のみ、１００ｎＭのＡＬｋ５阻害剤ＳＤ−２０８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２〜１６１に開示される）を添加したＭＣＤＢ−１３１培地で３日間処理した。
【0066】
ステージ５の１日目に、以下の表Ｉに列挙された因子が培地内に混合され、Ｓ５（ステージ５の３日目）が完了した後、関連の膵内胚葉／内分泌遺伝子のＰＣＲ分析のためにｍＲＮＡが収集された。対照として、培養物は、上記に列挙したＳ５培地のみで処理された。トータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州バレンシアのＱｉａｇｅｎ）を用いて抽出し、製造元の指示に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（米国カリフォルニア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して逆転写した。ｃＤＮＡは、カスタムのＴａｑｍａｎ Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に予め充填されたＴａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓを使用して増幅した。データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析し、ΔΔＣｔメソッドを使用して、未分化ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に正規化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入された。
【0067】
【表1】
【0068】
【表2】
【0069】
図１Ａ〜図１Ｇは、実施例１に記載のように、表Ｉに列挙されたインスリン（図１Ａ）、ソマトスタチン（図１Ｂ）、グレリン（図１Ｃ）、グルカゴン（図１Ｄ）、ＰＤＸ−１（図１Ｅ）、ＮＫＸ６．１（図１Ｆ）、及びＮＧＮ３（図１Ｇ）の因子の存在下において、ステージ５に分化されたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞内の以下の遺伝子の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデータを表す。
【0070】
図１に示されるように、エフリン−Ａ４は、対照培養（図１Ｆ）に比較すると、ＮＫＸ６．１及びインスリンのｍＲＮＡ発現を増強する一方、ＰＤＸ−１（図１Ｅ）及びＮＧＮ３発現（図１Ｇ）に関して最小限の影響を示す。アクチビン−Ａ及びアクチビン−Ｃ等の因子は、ソマトスタチン（図１Ｂ）の発現を有意に増強する一方、インスリン（図１Ａ）、グルカゴン（図１Ｄ）、及びグレリン（図１Ｃ）の発現を抑制した。更に、セマフォリン３ａ及びエピゲン等の因子は、ＮＫＸ６．１の発現を増強する一方、未処理培養に比較すると、ホルモンの発現に影響を与えなかった。図１において、対照培養の異なるマーカーの発現の平均レベルは、グラフ上で破線によって示される。
【0071】
（実施例２）Ｓ５でのインスリン発現に関するエフリンの影響の検証
この実施例は、実施例１において特定された該当点の検定を説明する。具体的には、プロトコルのＳ５でのエフリン−Ａ３又はエフリン−Ａ４の添加の影響を以下に列挙する。
【0072】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３２が補充されたｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；米国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿上に、１×１０5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養物は、以下のように膵内胚葉／内分泌系統に分化した：ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１の培地（上記の実施例１を参照）で１日間培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養し、次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、及び２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目、１：２００希釈のＩＴＳ−Ｘ（米国カリフォルニア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭのレチノイン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦活体、カタログ番号５６５７４０、米国ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン、及び１００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ、１０μＭのフォルスコリン、及び１０ｎＭのＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、及び１００ｎＭのＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈；４．５ｍＭグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、１００ｎＭのＡＬｋ５阻害剤（２〜３日目のみ）（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００７，７２：１５２〜１６１に開示）、及び＋／−０〜１００ｎｇ／ｍＬのエフリン−Ａ３又はエフリン−Ａ４（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で３日間処理した。
【0073】
ステージ５の終了時、対照及びエフリン処理の培養物は、（米国マサチューセッツ州ケンブリッジのＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのモルモットアンチインスリン抗体を使用して）インスリンタンパク質発現に対して固定染色された。図２は、インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を表す。図２Ａは対照細胞、図２Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処理した細胞、図２Ｃは、１００ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ３で処理した細胞を示す。図３は、インスリンに対して免疫染色した細胞の画像を表す。図３Ａは対照細胞、図３Ｂは５０ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ４で処理した細胞、図３Ｃは、１００ｎｇ／ｍＬのエフリンＡ４で処理した細胞を示す。これらのデータは、実施例１のデータと一致して、ステージ５でのエフリン−Ａ３及びエフリン−Ａ４両方の添加が、インスリンのタンパク質発現を有意に増強したことを示す。
【0074】
（実施例３）Ｓ６でのスフィンゴシン−１−リン酸塩の添加は、内分泌ホルモンを含む細胞クラスター形成を大幅に加速
この実施例では、ステージ６での内分泌腺クラスター形成の進行、及び内分泌腺リッチクラスターの形成の加速化におけるスフィンゴシン−１−リン酸塩の影響を説明する。
【0075】
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ｈＥＳＣ Ｈ１、継代４０）の細胞は、１０μＭのＹ２７６３２を補充したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダ国バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０希釈；米国ニュージャージー州のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で被覆された皿上に、１×１０5細胞／ｃｍ2で、単一細胞として播種した。播種の４８時間後に、培養物を、不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で洗浄した。培養物は、以下のように膵内胚葉／内分泌系統に分化した：ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−３日）：細胞は、ステージ１の培地（上記の実施例１を参照）で１日間培養された。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び０．１μＭのＭＣＸ化合物を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養した。次いで、細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地でもう１日培養し、次いで、
ｂ）ステージ２（前駆腸管−２日）：細胞は、０．１％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、４．５ｍＭのＤ−グルコース、０．２５ｍＭのアスコルビン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）及び２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理し、次いで、
ｃ）ステージ３（前腸−２日）：細胞は、１日目、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈（米国カリフォルニア州のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ（米国ミネソタ州のＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭのレチノイン酸（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ賦活体、カタログ番号５６５７４０、米国ニュージャージー州ギブスタウンのＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ、米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）、及び１００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、米国カリフォルニア州のＳｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＭＣＤＢ−１３１培地で処理した。２日目、細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１７ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ、１μＭのＲＡ、２５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２００ｎＭのＴＰＢ、及び１０ｎＭのＬＤＮを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で処理し、次いで、
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−２日）：細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、４．５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、５０μＭのＬＤＮ−１９３１８９、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、２ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、１ｎｇ／ｍＬのＡＡ、及び１００ｎＭのＴＰＢを補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で２日間処理し、次いで、
ｅ）ステージ５（膵内胚葉／内分泌−３日）：ステージ４細胞は、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、１５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、１０μＭのフォルスコリン、０．２５ｍＭのアスコルビン酸、及び１ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、２〜３日目のみ１００ｎＭのＡＬＫ５阻害剤ＳＤ２０８を添加して補充したＭＣＤＢ−１３１培地で３日間処理し、次いで、
ｆ）ステージ６（膵内胚葉−３〜１０日）：ステージ５細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、１５ｍＭのグルコース、１Ｘ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＲＡ、０．２５ｍＭのアスコルビン酸を補充したＭＣＤＢ−１３１倍地で３〜１０日間処理した。一部の培養物は、１０μＭのスフィンゴシン−１−リン酸塩（米国ミズーリ州のＳｉｇｍａ）を３日間添加した。
【0076】
図４Ａ〜図４Ｄは、スフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）で処理し、１日目（図４Ａ）、７日目（図４Ｂ）、及び１０日目に２つの異なる拡大率（図４Ｃ及び図４Ｄ）で撮像した細胞のＳ６培養の位相差画像を表す。画像は、７日目に、内分泌細胞のクラスタリングの明確な証拠が存在すること、１０日目に、クラスターが膵内胚葉上皮の薄層によって相互に分離したことを示す。
【0077】
図５Ａ〜図５Ｄは、Ｈｂ９（図５Ａ）及びＮＫＸ６．１（図５Ｂ）に対して免疫染色、又はインスリン（図５Ｃ）及びＨｂ９（図５Ｄ）に対して免疫染色した細胞の画像を表す。図５Ａ及び図５Ｂは、内分泌腺クラスタリングではＨｂ９が濃縮した一方、クラスター周囲の膵臓上皮ではＮＫＸ６．１が濃縮したことを示す。Ｈｂ９が濃縮したクラスター内の細胞の一部は、ＮＫＸ６．１にも陽性であった。図５Ｃ及び図５Ｄに示されるように、クラスターではインスリン及びＨｂ９が濃縮した。この形態的変化は、ＮＫＸ６．１＋ＰＤＸ−１＋リッチ上皮が内分泌腺クラスターを生じさせる膵臓の発達と密接に類似する。それぞれの実例において、１対の画像は、同じ視野の細胞で異なるフィルターを使用して取得された。
【0078】
図６Ａ及び図６Ｂは、１０μＭのスフィンゴシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）で処理し、ステージ６の開始後３日間培養した細胞の、異なる拡大率の位相差画像を表す。これらの画像は、ステージ６の開始後３日間だけで、内分泌腺クラスターが発現したことを示す。これは、対照培養のクラスター形成よりも約７日間早い。
【0079】
図６Ｃ及び図６Ｄは、対照細胞（図６Ｃ）、及びＳ１Ｐで処理し、ＮＫＸ２．２に対して免疫染色した細胞（図６Ｄ）を表す。Ｓ１Ｐで処理した培養において、内分泌クラスターでは、ＮＫＸ２．２＋細胞が培養全体で均一に分布された対照培養（図６Ｄ）と比較して、ＮＫＸ２．２＋細胞でも濃縮（図６Ｃ）した。
【国際調査報告】