特表 2015-522692 糖およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-522692(P2015-522692A)

(43)【公表日】2015年8月6日

(54)【発明の名称】糖およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C08B 37/00 20060101AFI20150710BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20150710BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20150710BHJP

   A61K 31/715 20060101ALN20150710BHJP

   A61P 37/04 20060101ALN20150710BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20150710BHJP

【ＦＩ】

   C08B37/00 P

   A61K47/48

   A61K47/42

   A61K31/715

   A61P37/04

   A61P31/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】74

(21)【出願番号】特願2015-522197(P2015-522197)

(86)(22)【出願日】2013年7月3日

(85)【翻訳文提出日】2015年3月12日

(86)【国際出願番号】IB2013055452

(87)【国際公開番号】WO2014013375

(87)【国際公開日】20140123

(31)【優先権主張番号】61/672,221

(32)【優先日】2012年7月16日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ジー．ケイ． ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】スリニヴァス コダリ

(72)【発明者】

【氏名】エヴグエニー ヴィノグラドヴ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C090

【Ｆターム（参考）】

4C076EE41A

4C076EE59A

4C086AA03

4C086EA20

4C086NA14

4C086ZB09

4C090AA01

4C090BA91

4C090BB53

4C090BC24

4C090DA23

(57)【要約】

本発明は、新規の糖およびその使用に関する。一態様では、本発明は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を有する糖に関する。別の態様では、本発明は、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を有する糖に関する。また別の態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を有する糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に由来する糖に関する。さらなる態様では、本発明は、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を有する糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に由来する糖に関する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載の糖に特異的に結合する単離抗体またはその断片およびその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む、天然には存在しない多糖。

【請求項2】

前記レジオナミン酸部分が前記グルコース部分に結合している、請求項１に記載の多糖。

【請求項3】

前記レジオナミン酸部分が前記ガラクトース部分に結合している、請求項１に記載の多糖。

【請求項4】

前記レジオナミン酸部分が前記Ｎ−アセチルガラクトサミン部分に結合している、請求項１に記載の多糖。

【請求項5】

前記レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分が１：１：２：３のモル比で存在する、請求項１に記載の多糖。

【請求項6】

【化1】

［式中、Ｌｅｇはレジオナミン酸部分であり、Ｇａｌはガラクトース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン部分であり、ｎは、４０〜６０の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、請求項１に記載の多糖。

【請求項7】

グラム陽性球菌多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項8】

エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項9】

エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項10】

エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項11】

細胞表面多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項12】

莢膜多糖である、請求項１に記載の多糖。

【請求項13】

免疫原性である、請求項１に記載の多糖。

【請求項14】

オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、請求項１に記載の多糖。

【請求項15】

殺菌免疫応答を誘導し得る、請求項１に記載の多糖。

【請求項16】

単離されている、請求項１に記載の多糖。

【請求項17】

合成物である、請求項１に記載の多糖。

【請求項18】

担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１に記載の多糖。

【請求項19】

前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１８に記載の多糖。

【請求項20】

前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、請求項１８に記載の多糖。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１２年７月１６日出願の米国特許仮出願第６１／６７２，２２１号の利益を主張する。

【0002】

本発明は、糖およびその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

グラム陽性菌による感染症は、世界中の保健医療施設において観察される感染症の発生率の上昇によって、医学的重要性が高まっている。ヒト病理に関して最も問題のあるグラム陽性菌には、とりわけブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種がある。なおさらに厄介なことは、これらのグラム陽性菌および他のグラム陽性菌が抗生物質耐性を示す傾向が増大していることであり、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）などである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

したがって、グラム陽性菌感染症を防止および処置する組成物および方法が依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

これらの必要性および他の必要性を満たすために、本発明は、新規の糖、それに対する抗体、およびその使用に関する。以下の節では、本発明の一部の態様および実施形態を記載する。

【0006】

一態様では、本発明は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む多糖に関する。一実施形態では、レジオナミン酸部分は、グルコース部分に結合している。別の実施形態では、レジオナミン酸部分は、ガラクトース部分に結合している。また別の実施形態では、レジオナミン酸部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分に結合している。一実施形態では、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分は、１：１：２：３のモル比で存在する。一実施形態では、多糖は、

【0007】

【化1】

［式中、Ｌｅｇはレジオナミン酸部分であり、Ｇａｌはガラクトース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン部分であり、ｎは、１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む。一実施形態では、ｎは、約４０から約６０の間である。一実施形態では、多糖の分子量は、約６０ｋＤａから約１００ｋＤａの間である。一実施形態では、多糖は、図７に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する。

【0008】

一態様では、本発明は、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む多糖に関する。一実施形態では、アルトルロン酸部分は、フコース部分に結合している。別の実施形態では、フコース部分は、グルコース部分に結合している。また別の実施形態では、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分は、１：４：２のモル比で存在する。さらなる実施形態では、多糖は、

【0009】

【化2】

［式中、Ｆｕｃはフコース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＡｌｔＡはアルトルロン酸部分であり、ｎは、１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む。一実施形態では、ｎは、約２８０から約３００の間である。別の実施形態では、多糖の分子量は、約２５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間である。一実施形態では、多糖は、図２に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する。

【0010】

一態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む多糖であって、好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である多糖に関する。別の態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である多糖に関する。一実施形態では、繰り返し単位は、

【0011】

【化3】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む。一実施形態では、ｎは、約８０から約１００の間である。別の実施形態では、繰り返し単位は、

【0012】

【化4】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む。また別の実施形態では、ｎは、約８０から約１００の間である。さらなる実施形態では、多糖の分子量は、約１０ｋＤａから２０ｋＤａの間である。一実施形態では、多糖は、図６に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する。

【0013】

一態様では、本発明は、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む多糖であって、好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である多糖に関する。別の態様では、本発明は、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である多糖に関する。一実施形態では、繰り返し単位は、［−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２］ｎ（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分であり、ｎは１０００から１００，０００の整数である）を含む。一実施形態では、ｎは約３５，０００から約４５，０００の間である。一実施形態では、多糖の分子量は約１０，０００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間である。一実施形態では、多糖は、図１に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する。

【0014】

一実施形態では、多糖は細胞表面多糖である。別の実施形態では、多糖は莢膜多糖である。

【0015】

一実施形態では、多糖は免疫原性である。別の実施形態では、多糖は、オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る。なおさらなる実施形態では、多糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。

【0016】

一実施形態では、多糖は単離されている。別の実施形態では、多糖は合成によって合成されている。

【0017】

一実施形態では、多糖は分枝している。

【0018】

一実施形態では、多糖はグラム陽性球菌多糖である。一実施形態では、多糖はエンテロコッカス属多糖である。一実施形態では、多糖はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である。一実施形態では、多糖は好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である。一実施形態では、多糖はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である。

【0019】

一実施形態では、多糖は細胞表面多糖である。別の実施形態では、多糖は莢膜多糖である。一実施形態では、多糖は免疫原性である。別の実施形態では、多糖は、オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る。なおさらなる実施形態では、多糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、多糖は単離されている。別の実施形態では、多糖は合成によって合成されている。

【0020】

一実施形態では、多糖は、担体タンパク質にコンジュゲートされている。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である。さらなる実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

【0021】

一態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0022】

一態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0023】

一態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含み、前記多糖が好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0024】

別の態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含み、前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0025】

また別の態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含み、前記多糖が好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0026】

さらなる態様では、本発明は、有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む組成物であって、前記多糖が、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含み、前記多糖が、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、組成物に関する。一実施形態では、組成物は免疫原性である。

【0027】

一態様では、本発明は、少なくとも２種の本明細書に記載の多糖を含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、少なくとも３種の本明細書に記載の多糖を含む。別の実施形態では、各多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。また別の実施形態では、担体分子は担体タンパク質である。さらなる実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ_１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である。一実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む。

【0028】

一態様では、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、有効量の本明細書に記載の多糖を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、免疫応答は、グラム陽性球菌に対するものである。別の実施形態では、免疫応答は、エンテロコッカス属に対するものである。

【0029】

一態様では、本発明は、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載の多糖を含む有効量の組成物を投与するステップを含む方法に関する。一実施形態では、免疫応答は、グラム陽性球菌に対するものである。別の実施形態では、免疫応答はエンテロコッカス属に対するものである。

【0030】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の単離多糖を生産する方法であって、多糖を産生する能力を有するグラム陽性球菌を培養するステップと；その細菌によって産生された多糖を単離するステップとを含む方法に関する。一実施形態では、グラム陽性球菌はエンテロコッカス属である。別の実施形態では、グラム陽性球菌はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）である。また別の好ましい実施形態では、グラム陽性球菌はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）である。一実施形態では、グラム陽性球菌はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５である。

【0031】

一態様では、本発明は、グラム陽性球菌を試料中で検出する方法であって、本明細書に記載の多糖を接触させるステップと；抗体−抗原コンジュゲート複合体を検出するステップとを含み、抗体−抗原複合体が存在することは、グラム陽性球菌が試料中に存在することを示す、方法に関する。

【0032】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の多糖に特異的に結合する抗体またはその断片に関する。一実施形態では、抗体またはその断片は単離されている。一態様では、本発明は、本明細書に記載の単離抗体またはその断片を含む組成物に関する。別の態様では、本発明は、グラム陽性球菌を試料中で検出する方法であって、本明細書に記載の抗体を接触させるステップと；抗体−抗原コンジュゲート複合体を検出するステップとを含み、抗体−抗原複合体が存在することは、グラム陽性球菌が試料中に存在することを示す、方法に関する。さらなる態様では、本発明は、単離抗体またはその抗体断片を生産する方法であって、有効量の本明細書に記載の多糖を哺乳動物に投与するステップと；抗体またはその断片を哺乳動物から単離するステップとを含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】多糖Ｐｆ１の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルを示すグラフである。

【図2】多糖Ｐｆ２の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。２ｐｐｍ付近の鋭いピークは、アセトン（内標準）および酢酸（カラム緩衝液に由来）である。

【図3】Ｐｆ２多糖の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルの断片を示すグラフである。

【図4】Ｐｆ２ ＯＳ１オリゴ糖の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図5】Ｐｆ２ ＯＳ１オリゴ糖およびＤ−アルトロースに由来するアセチル化２−ブチルグリコシドのＧＣトレースを示すグラフである。

【図6】Ｐｆ３多糖の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルを示すグラフである。

【図7】Ｐｆ４多糖試料の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＳＱＣスペクトルを示すグラフである。記載の多糖構造に関連しない一部の主要なシグナルは四角形の枠でマーキングされている。

【図8】Ｐｆ２（黒色の実線）およびＰｆ４（黒色の点線）多糖ＨＳＱＣ−メチル基スペクトルの重なりを示すグラフである。

【図9】Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株多糖Ｐｆ１１〜１４のＮＭＲスペクトルを示すグラフである。

【図10】パネルＡは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株ＴＸ００１６（ＤＯ）上で発現されたＰｆ１〜Ｐｆ４多糖のフローサイトメトリー分析を示すグラフであり、図１０、パネルＢは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）上で発現されたＰｆ１〜Ｐｆ４多糖のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。白塗りの棒は、平均免疫前血清ＭＦＩを表している。黒塗りの棒は、平均免疫後血清ＭＦＩを表している。

【図11】株ＴＸ００１６（ＤＯ）およびＥ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対する、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ２〜Ｐｆ４多糖によって誘導された抗血清のオプソニン作用活性を示すグラフである。パネルＡは、ＴＸ００１６（ＤＯ）株に対するＰｆ２血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ２によって逆転されることを示している。パネルＢは、Ｅ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するＰｆ３血清の部分ＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ３によって逆転されることを示している。パネルＣは、Ｅ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するＰｆ４血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ４によって逆転されることを示している。図１１のパネルＡおよびパネルＢにおけるラベル「Ｃ’なし」は、補体が存在しないことを指す。

【図12】Ｐｆ１−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート、Ｐｆ２−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート、Ｐｆ４−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート、およびＰｆ３（ＬＴＡ）に対するウサギ血清のＥＬＩＳＡスクリーニングを示すグラフである。パネルＡは、Ｐｆ１抗原に対するＰｆ１−ＣＲＭ_１９７抗血清を示している。パネルＢは、Ｐｆ２抗原に対するＰｆ２−ＣＲＭ_１９７抗血清を示している。パネルＣは、Ｐｆ３抗原に対するＰｆ３（ＬＴＡ）抗血清を示している。パネルＤは、Ｐｆ４抗原に対するＰｆ４−ＣＲＭ_１９７抗血清を示している。

【図13】Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２上で発現されたＰｆ１〜Ｐｆ４多糖のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。

【図14】株１，２３１，５０２（‘５０２）に対する、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ２−およびＰｆ４−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートによって誘導された抗血清のオプソニン作用活性を示すグラフである。図１４のパネルＡは、株‘５０２に対するＰｆ２血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ２によって逆転されることを示している。図１４のパネルＢおよびパネルＣは、株‘５０２に対するＰｆ４血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ４によって逆転されることを示している。パネルＢは、凡例の最後のボックスに誤植を含み、これは、「Ｐｆ４後＋Ｐｆ２」ではなく「Ｐｆ４後＋Ｐｆ４」と示されているべきである。図１４のパネルＣは図１４のパネルＢと同一であるが、訂正された凡例を含む。図１４のパネルＡ、パネルＢ、およびパネルＣ中の「ＨＩ Ｃ’」は、熱不活化補体を指す。

【図15】Ａは、式（Ｉ）（Ｐｆ４）によって示されるとおりのレジオナミン酸部分を含む糖；Ｂは、式（ＩＩ）によって示されるとおりのＰｆ２糖；Ｃは、式（ＩＩＩ）によって示されるとおりのＰｆ３糖、およびＤは、式（ＩＶ）；およびＥは、レバン部分（Ｐｆ１）を有する糖の構造である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本発明者らは意外にも、本明細書においてＰｆ１、Ｐｆ２、Ｐｆ３、およびＰｆ４と名付けた少なくとも４種の糖を発見および同定した。Ｐｆ１糖はレバン部分を含む。Ｐｆ２糖はアルトルロン酸部分を含む。Ｐｆ３糖はグリセロールホスファート部分を含む。Ｐｆ４糖はレジオナミン酸部分を含む。

【0035】

本明細書に記載の糖はいずれも、グラム陽性球菌から単離され得る。グラム陽性球菌は、グラム陽性に染色する化学有機栄養性中温性の非胞子形成球菌である。個々の生体は共通する球形の形態学的特徴を有し、細菌塊または鎖を形成し得る。グラム陽性球菌の例には、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種が含まれる。

【0036】

一実施形態では、糖は、エンテロコッカス属細菌から単離される。例示的なエンテロコッカス属種には、Ｅ．アビウム（Ｅ．ａｖｉｕｍ）、Ｅ．カセリフラブス（Ｅ．ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、Ｅ．ディスパー（Ｅ．ｄｉｓｐａｒ）、Ｅ．デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）変異体、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅ．フラヴェセンス（Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｅ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）、Ｅ．ムンディティ（Ｅ．ｍｕｎｄｔｉｉ）、およびＥ．ラフィノスス（Ｅ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓ）が含まれる。

【0037】

一実施形態では、糖は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）から単離される。多糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）のいずれの株からも単離することができる。Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株には、例えば、株Ｅ１１６２（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＱＪ００００００００）および株Ｕ０３１７（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＳＷ００００００００）、ならびに以下に列挙する株が含まれる。

【0038】

【表1】

【0039】

Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株の追加の例には、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，１４１，７３３（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＡＺ００００００００），１，２３０，９３３（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＡＳ００００００００）、１，２３１，４０８（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＢＢ００００００００）、１，２３１，４１０（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＢＡ００００００００）、１，２３１，５０１（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＡＹ００００００００）、１，２３１，５０２（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＡＸ００００００００）、Ｃｏｍ１２（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＢＣ００００００００）、およびＣｏｍ１５（ｇｅｎｏｍｅ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＣＢＤ００００００００）が含まれ、これらはまた、Ｐａｌｍｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、２０１０年５月；１９２（９）：２４６９〜７０に記載されている。Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株のまた別の例は、Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）またはＥ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）である。

【0040】

本明細書で使用する場合、「Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」または「Ｅ０１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」は、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ大学によって「Ｅ１５５」または「Ｅ０１５５」と名付けられたエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）株を指す。

【0041】

本明細書で使用する場合、その直後に「（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」を伴わない「Ｅ１５５」は、例えば、Ｕｔｒｅｃｔ大学に由来するＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５株などの、当技術分野で「Ｅ１５５」株として知られている任意のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株を指す。好ましくは、「（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」を伴わない用語「Ｅ１５５」は、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ大学に由来する「Ｅ１５５」株を除外する。

【0042】

本明細書で使用する場合、その直後に「（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」を伴わない「Ｅ０１５５」は、例えば、Ｕｔｒｅｃｔ大学に由来するＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５株などの、当技術分野で「Ｅ０１５５」株として知られている任意のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株を指す。好ましくは、「（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）」を伴わない用語「Ｅ０１５５」は、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ大学に由来する「Ｅ０１５５」株を除外する。

【0043】

本明細書に記載の糖は、例えば、本明細書に記載の方法を含めた当技術分野で知られている方法によって、グラム陽性球菌から単離され得る。本明細書で使用する場合、「単離された」は、特定の供給源から得られた、および分離されたことを指す。用語「単離された」はさらに、その個々の天然に存在する形態、状態、および／または環境にはないことを指す。例えば、「エンテロコッカス属から単離された」は、エンテロコッカス属細胞から得られ、分離された物質を指す。単離糖は天然には存在しない。

【0044】

したがって、一態様では、本発明は、レバン部分を含む天然には存在しない糖（例えば、Ｐｆ１）に関する。別の態様では、本発明は、アルトルロン酸部分を含む天然には存在しない糖（Ｐｆ２）に関する。追加の態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分を含む天然には存在しない糖（Ｐｆ３）に関する。さらなる態様では、本発明は、レジオナミン酸部分を含む天然には存在しない糖（Ｐｆ４）に関する。

【0045】

一実施形態では、糖は精製される。用語「精製された」は、完全に純粋である必要はない。例えば、精製された糖、コンジュゲート、または他の活性化合物は、タンパク質、脂質、または他の夾雑物の全部または一部から単離されるものである。単離糖を精製するための方法は、当技術分野で知られており、例えば、本明細書に記載の方法を含む。用語「精製された」は、その調製物が、再現可能な糖の特性決定データ、例えば、分子量、炭水化物残基含有率、炭水化物の結合、クロマトグラフィー応答、および／または免疫原性挙動を示すかぎり、一部の不純物を含むそれらの合成または調製の人為産物を保持している合成による糖の調製物も含み得る。

【0046】

別法で、本発明の別の実施形態では、糖は、合成によって、または化学的に合成される。糖は、従来の方法によって化学的に合成され得る。

【0047】

本発明のまた別の実施形態では、糖は、糖を産生する生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0048】

本明細書で使用する場合、用語「糖」は、単一の糖部分または単糖単位を、さらには、２個以上の単一の糖部分または単糖単位が共有結合して、二糖、オリゴ糖、および多糖を形成している組合せを指す。用語「糖」は、用語「炭水化物」と互換的に使用され得る。糖は、直鎖または分枝であってよい。

【0049】

「単糖」は、本明細書で使用する場合、オリゴ糖中の単一の糖残基を指す。用語「二糖」は、本明細書で使用する場合、グリコシド結合によって一緒に結合している２個の単糖単位または部分からなる糖を指す。

【0050】

一実施形態では、糖はオリゴ糖（ＯＳ）である。「オリゴ糖」は、本明細書で使用する場合、２個以上の単糖単位または部分を含有する化合物を指す。オリゴ糖の文脈内では、個々のモノマー単位または部分は、ヒドロキシル基を介して別の単糖単位または部分に結合しているか、または結合し得る単糖である。オリゴ糖は、保護されている単一の残基糖からの化学的合成か、または生物学的に産生された多糖の化学的分解かのいずれかによって調製され得る。別法では、オリゴ糖を、インビトロで酵素的方法によって調製することができる。

【0051】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも５個の単糖単位または部分の直鎖または分枝ポリマーを指す多糖（ＰＳ）である。明確にするために、ｎが約５を超えるより大きな数の繰り返し単位を、本明細書では多糖と称することとする。

【0052】

本発明の一実施形態では、多糖は、細菌から単離される。別の実施形態では、多糖は、従来の方法によって化学的に合成される。本発明のまた別の実施形態では、多糖は、糖を産生する生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0053】

一実施形態では、多糖は細胞表面多糖である。細胞表面多糖は、少なくとも一部がペプチドグリカン層、細胞壁、および莢膜を含めた最外側の細菌細胞膜または細菌細胞表面上に位置する多糖を指す。典型的には、細胞表面多糖は、インビボにおいて免疫応答の誘導に関連している。細胞表面多糖は、「細胞壁多糖」または「莢膜多糖」であってよい。細胞壁多糖は典型的には、不連続層を細菌表面上で形成している。

【0054】

一実施形態では、多糖は莢膜多糖である。莢膜多糖は、グリコシド結合によって結合した１個または複数の単糖の繰り返し単位を含むグリコポリマーを指す。莢膜多糖は典型的には、莢膜様層を細菌細胞の周囲に形成している。

【0055】

一実施形態では、糖は免疫原性である。例えば、本発明者らは、本明細書に記載の各糖が、免疫応答を誘導または誘発し得ることを発見した。用語「免疫原性」は、哺乳動物における体液および／または細胞媒介性免疫応答を開始し、誘起し、引き起こし、増強し、改善し、かつ／またはそれを増大する能力を指す。一実施形態では、哺乳動物は、ヒト、霊長類動物、ウサギ、ブタ、マウスなどである。

【0056】

一実施形態では、本明細書に記載の糖は、オプソニン活性を誘導し得る。別の実施形態では、本明細書に記載の糖は、オプソニン活性および食細胞活性（例えば、オプソニン作用活性）を誘導し得る。

【0057】

オプソニン活性またはオプソニン作用は、オプソニン（例えば、抗体または補体因子）が抗原（例えば、本明細書に記載の単離糖）に結合して、その抗原とファゴサイトまたは食細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、および多形核白血球（ＰＭＮＬ）との結合を促進するプロセスを指す。例えば、莢膜の存在によって典型的には貪食されない被包性（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）細菌などの一部の細菌は、オプソニン抗体で被覆されると、ファゴサイトによって認識されるようになる可能性が高い。一実施形態では、糖は、例えば、オプソニン性である抗体などの免疫応答を誘導する。一実施形態では、このオプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。

【0058】

食細胞活性または食作用は、食細胞が物体を飲み込み、その細胞質中に物体を囲い込むプロセスを指す。一実施形態では、糖は、食作用を促進する、例えば、抗体などの免疫応答を誘導する。一実施形態では、この食細胞活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。例えば、本明細書に記載の単離糖に対して生じるウサギ抗体は、例えば、インビトロ食作用アッセイによって示されるとおり、補体が存在する状態で糖を発現する株のオプソニン化食作用を特異的に媒介し得ることがある。

【0059】

また別の実施形態では、本明細書に記載の糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、この殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。

【0060】

例えば、インビボで細菌量の低減を測定することによる方法（例えば、エンテロコッカス属で攻撃されている哺乳動物において菌血症レベルを測定することによる方法）および／またはインビトロで細菌細胞死滅を測定することによる方法（例えば、インビトロオプソニン作用アッセイ）など、オプソニン作用、食作用、および／または殺菌活性を測定する方法は、当技術分野で知られている。一実施形態では、糖は、例えば、熱死滅させたグラム陽性球菌に対して生じた抗血清と比較するなど、適切な対照と比較すると、オプソニン活性、食細胞活性、および／または殺菌活性を誘導し得る。

【0061】

レジオナミン酸部分を含む糖
一態様では、本発明は、レジオナミン酸部分を含む糖に関する。レジオナミン酸（５，７−ジアセトアミド−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロソン酸またはＬｅｇ）は、Ｃ_１３Ｈ_２１Ｎ_２Ｏ_８⁻の分子式を有する９炭素α−ケト酸である。レジオナミン酸は、約３３３Ｄａの分子量を有する。

【0062】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分およびＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。

【0063】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分およびガラクトース（Ｇａｌ）部分を含む。

【0064】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分およびグルコース（Ｇｌｃ）部分を含む。

【0065】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、およびガラクトース部分を含む。別の実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、およびグルコース部分を含む。

【0066】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む。糖の好ましい配置では、レジオナミン酸部分は、グルコース部分に結合している。別の好ましい配置では、グルコース部分は、別のグルコース部分に結合している。一部の調製物では、糖は、ラムノース（Ｒｈａ）部分の少なくとも１個の単位をさらに含む。

【0067】

一実施形態では、糖は、レジオナミン酸部分を含む多糖である。一実施形態では、多糖は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む。多糖の好ましい配置では、レジオナミン酸部分はグルコース部分に結合している。別の好ましい配置では、グルコース部分は、別のグルコース部分に結合している。一実施形態では、多糖は、レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を１：１：２：３のモル比で含む。一部の調製物では、多糖は、ラムノース（Ｒｈａ）部分の少なくとも１個の単位をさらに含む。

【0068】

一実施形態では、糖は、少なくとも約＝、１ｋＤａ、１．４５ｋＤａ、１．５ｋＤａ、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２０ｋＤａから、多くとも約５０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、９００ｋＤａ、８００ｋＤａ、７００ｋＤａ、６００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１００ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａまでの分子量を有する。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、糖は、少なくとも約１ｋＤａから多くとも約５０００ｋＤａまで、好ましくは、少なくとも約５０ｋＤａから多くとも約１００ｋＤａまでの分子量を有する。一実施形態では、糖は、約６２．５ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態では、糖は、約９２．５ｋＤａの分子量を有する。

【0069】

本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）などの当技術分野で知られている方法によって測定される糖の重量を指す。所与の糖の分子量は、例えば、糖を合成する経路および環境、糖を単離するために使用する抽出条件、糖を単離する種、ならびに／または糖を採取する位置および時間などの因子に応じて変化し得ることに注意すべきである。さらに、天然供給源から単離および精製された糖は、サイズが不均質であり得る。したがって、分子量の値は、特定の集団における分子の分子量についての平均値または中央値を表し得る。

【0070】

一実施形態では、糖は、式（Ｉ）：

【0071】

【化5】

によって表される構造を含む。式（Ｉ）によって表される構造を含む糖は、少なくとも約１０００Ｄａ、好ましくは、少なくとも約１４００Ｄａ、最も好ましくは、少なくとも約１４５６Ｄａの分子量を有する。

【0072】

一実施形態では、式（Ｉ）によって表される構造を含む糖は、多糖である。一実施形態では、多糖は、式（Ｉ）：

【0073】

【化6】

［式中、ｎは、１以上の任意の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。

【0074】

本明細書において定義する場合、「ｎ」は、多糖分子中の繰り返し単位（括弧内に表されている）の数を指す。当技術分野で知られているとおり、生物高分子では、繰り返し構造には、例えば、分枝の欠失（ｍｉｓｓｉｎｇ ｂｒａｎｃｈｅｓ）など、不完全な繰り返しの領域が散在していてもよい。加えて、細菌などの天然供給源から単離および精製された多糖は、サイズおよび分枝が不均質であり得ることは当技術分野で知られている。そのような場合、ｎは、集団における分子についてのｎの平均値または中央値を表し得る。

【0075】

一実施形態では、式（Ｉ）中のｎは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０および多くとも１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０の整数である。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例示的な範囲には、例えば、少なくとも１から多くとも１０００まで；少なくとも１０から多くとも５００まで；および少なくとも２０から多くとも８０までが含まれる。好ましい一実施形態では、ｎは少なくとも３５から多くとも５５までである。例えば、一実施形態では、ｎは３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９であり、最も好ましくは、４０である。別の好ましい実施形態では、ｎは少なくとも５５から多くとも７５までである。例えば、一実施形態では、ｎは、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、または６９であり、最も好ましくは、６０である。

【0076】

この糖構造は、例えば、^１Ｄ、^１Ｈ、および／もしくは^１３Ｃを含めたＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの当技術分野で知られている方法およびツールによって決定することができる。一実施形態では、糖は、図７に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する多糖である。

【0077】

一実施形態では、糖は単離糖である。好ましい実施形態では、糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、本明細書に記載の株のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。好ましい実施形態では、糖は、次の株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株から単離される。

【0078】

一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離される糖である。好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離される多糖であり、多糖は、式（Ｉ）により表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、ｎは、少なくとも１および多くとも１００の整数であり、より好ましくは、ｎは、少なくとも１０から多くとも６０までの整数であり、最も好ましくは、例えば、ｎは約４３の整数であるなど、ｎは、少なくとも３０から多くとも５０までの整数である。一実施形態では、多糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離され、多糖は、式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、多糖の分子量は、少なくとも約２０ｋＤａ、好ましくは、少なくとも約４０ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも約６０ｋＤａ、最も好ましくは、約６２．５ｋＤａである。したがって、一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。別の実施形態では、単離多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0079】

別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離される糖である。一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離される多糖であり、多糖は、式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、ｎは少なくとも１および多くとも１００の整数であり、より好ましくは、ｎは、少なくとも２０から多くとも８０までの整数であり、最も好ましくは、例えば、ｎは約６０の整数であるなど、ｎは少なくとも５０から多くとも７０までの整数である。一実施形態では、多糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離され、多糖は、式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、多糖の分子量は、少なくとも約２０ｋＤａ、好ましくは、少なくとも約４０ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも約９０ｋＤａ、最も好ましくは、約９２．５ｋＤａである。したがって、一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり１以上の整数である式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。別の実施形態では、単離多糖は上記のとおりの分子量を有する。

【0080】

一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から単離される多糖であり、多糖は式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、ｎは、少なくとも１および多くとも１００の整数であり、より好ましくは、ｎは、少なくとも２０から多くとも８０までの整数、最も好ましくは、例えば、ｎは、約６０の整数であるなど、ｎは、少なくとも５０から多くとも７０までの整数である。一実施形態では、多糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から単離され、多糖は、式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含み、多糖の分子量は、少なくとも約２０ｋＤａ、好ましくは、少なくとも約４０ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも約９０ｋＤａ、最も好ましくは、約９２．５ｋＤａである。したがって、一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。別の実施形態では、単離多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0081】

別の実施形態では、本発明は、化学的に合成された、式（Ｉ）によって表される構造を含む糖に関する。さらなる実施形態では、糖は分枝多糖である。

【0082】

一実施形態では、本発明は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（Ｉ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む化学的に合成された多糖に関する。別の実施形態では、化学的に合成された多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0083】

一実施形態では、糖は免疫原性であり、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、糖は、オプソニン活性を誘導し得る。このオプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対するオプソニン活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対するオプソニン活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対するオプソニン活性を誘導し得る。

【0084】

別の実施形態では、糖は、オプソニン活性および食細胞活性（例えば、オプソニン作用活性）を誘導し得る。オプソニン作用活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。一実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0085】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対するオプソニン作用活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0086】

また別の実施形態では、糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、この殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対する殺菌活性を誘導し得る。一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0087】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対する殺菌活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対する殺菌活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対する殺菌活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対する殺菌活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対する殺菌活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0088】

アルトルロン酸部分を含む糖
一態様では、本発明は、アルトルロン酸部分を含む糖に関する。アルトルロン酸（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロキシ−６−オキソヘキサン酸またはＡｌｔＡ）は、Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_７の分子式を有する。アルトルロン酸は、約１９４Ｄａの分子量を有する。

【0089】

一実施形態では、糖は、アルトルロン酸部分およびフコース（Ｆｕｃ）部分を含む。

【0090】

一実施形態では、糖は、アルトルロン酸部分およびグルコース（Ｇｌｃ）部分を含む。

【0091】

一実施形態では、糖は、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む。糖の好ましい配置では、アルトルロン酸部分は、フコース部分に結合している。別の好ましい配置では、フコース部分は、グルコース部分に結合している。

【0092】

一実施形態では、糖は、アルトルロン酸部分を含む多糖である。一実施形態では、多糖は、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む。多糖の好ましい配置では、アルトルロン酸部分は、フコース部分に結合している。別の好ましい配置では、フコース部分は、グルコース部分に結合している。別の実施形態では、多糖は、アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を１：４：２のモル比で含む。

【0093】

一実施形態では、糖は、少なくとも約１ｋＤａ、１．０４６ｋＤａ、２ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２０ｋＤａから多くとも約５０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、９００ｋＤａ、８００ｋＤａ、７００ｋＤａ、６００ｋＤａ、５００ｋＤａ、４００ｋＤａ、または３００ｋＤａまでの分子量を有する。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、糖は、少なくとも約１ｋＤａから多くとも約５０００ｋＤａまで、好ましくは、少なくとも約５０ｋＤａから多くとも約５００ｋＤａまでの分子量を有する。一実施形態では、糖は、約３００．６ｋＤａの分子量を有する。

【0094】

本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）などの当技術分野で知られている方法によって測定される糖の重量を指す。所与の糖の分子量は、例えば、糖を合成する経路および環境、糖を単離するために使用する抽出条件、糖を単離する種、ならびに／または糖を採取する位置および時間などの因子に応じて変化し得ることに注意すべきである。さらに、天然供給源から単離および精製された糖は、サイズが不均質であり得る。したがって、分子量の値は、特定の集団における分子の分子量についての平均値または中央値を表し得る。

【0095】

一実施形態では、糖は、式（ＩＩ）：

【0096】

【化7】

によって表される構造を含む。式（ＩＩ）によって表される構造を含む糖は、少なくとも約１０００Ｄａ、好ましくは、少なくとも約１４００Ｄａ、最も好ましくは、少なくとも約１０４６Ｄａの分子量を有する。

【0097】

一実施形態では、式（ＩＩ）によって表される構造を含む糖は、多糖である。別の実施形態では、多糖は、式（ＩＩ）：

【0098】

【化8】

［式中、ｎは、１以上の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。

【0099】

一実施形態では、式（ＩＩ）中のｎは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０および多くとも１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０の整数である。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例示的な範囲には、例えば、少なくとも１から多くとも１０００まで；少なくとも１０から多くとも５００まで；および少なくとも１００から多くとも３００までが含まれる。一実施形態では、多糖は、ｎが、少なくとも２００から多くとも４００までの整数であり、より好ましくは、ｎが、約２９０の整数である式（ＩＩ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。例えば、一実施形態では、ｎは、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、または２９５である。

【0100】

この糖構造は、例えば、^１Ｄ、^１Ｈ、および／もしくは^１３Ｃを含めたＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの当技術分野で知られている方法およびツールによって決定することができる。一実施形態では、糖は、図２に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する多糖である。

【0101】

一実施形態では、糖は単離糖である。一実施形態では、糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、本明細書に記載の株のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。好ましい実施形態では、糖は、次の株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。さらなる好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株から単離される。

【0102】

一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（ＩＩ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。一実施形態では、単離多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0103】

別の実施形態では、本発明は、化学的に合成された、式（ＩＩ）によって表される構造を含む糖に関する。さらなる実施形態では、糖は分枝糖である。

【0104】

一実施形態では、本発明は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（ＩＩ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む化学的に合成された多糖に関する。一実施形態では、化学的に合成された多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0105】

一実施形態では、糖は免疫原性であり、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、糖は、オプソニン活性を誘導し得る。このオプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン活性を誘導し得る。

【0106】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対するオプソニン活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ）に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対するオプソニン活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対するオプソニン活性を誘導し得る。

【0107】

別の実施形態では、糖は、オプソニン活性および食細胞活性（例えば、オプソニン作用活性）を誘導し得る。このオプソニン作用活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0108】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対するオプソニン作用活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ）に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0109】

また別の実施形態では、糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、この殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対する殺菌活性を誘導し得る。一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0110】

好ましい実施形態では、糖は、少なくとも次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０９８０のいずれかに対する殺菌活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ）に対する殺菌活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３０，９３３に対する殺菌活性を誘導し得る。別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，４１０に対する殺菌活性を誘導し得る。また別の好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0111】

グリセロールホスファート部分を含む糖
一態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分を含む糖に関する。グリセロールホスファート（２，３−ジヒドロキシプロピル二水素ホスファートまたはＧｒｏ−１Ｐ）は、Ｃ_３Ｈ_９Ｏ_６Ｐの分子式および約１７２Ｄａの分子量を有する。一実施形態では、糖は、グリセロールホスファート部分およびグルコース（Ｇｌｃ）部分を含む。

【0112】

一実施形態では、糖は、グリセロールホスファート部分を含む多糖である。一実施形態では、多糖は、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分を１：１のモル比で含む。別の実施形態では、多糖は、グリセロールホスファート部分およびグルコース部分を１：２のモル比で含む。

【0113】

一実施形態では、多糖はテイコ酸である。別の実施形態では、多糖はリポテイコ酸である。リポテイコ酸は、テイコ酸と、細菌の形質膜に結合していてよい脂質尾部とを含む。

【0114】

一実施形態では、糖は、少なくとも約１７０Ｄａ、１７２Ｄａ、３００Ｄａ、３４４Ｄａ、５００Ｄａ、６６８Ｄａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２０ｋＤａから多くとも約５０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、９００ｋＤａ、８００ｋＤａ、７００ｋＤａ、６００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１００ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａまでの分子量を有する。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、糖は、少なくとも約１７２Ｄａから多くとも約５０００ｋＤａまで、好ましくは、少なくとも約１ｋＤａから多くとも約１００ｋＤａまでの分子量を有する。より好ましくは、糖は、少なくとも約１０ｋＤａから多くとも約２０ｋＤａまでの分子量を有する。好ましい一実施形態では、糖は、少なくとも約１２ｋＤａから多くとも約１５ｋＤａまでの分子量を有する。

【0115】

本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）などの当技術分野で知られている方法によって測定される糖の重量を指す。所与の糖の分子量は、例えば、糖を合成する経路および環境、糖を単離するために使用する抽出条件、糖を単離する種、ならびに／または糖を採取する位置および時間などの因子に応じて変化し得ることに注意すべきである。さらに、天然供給源から単離および精製された糖は、サイズが不均質であり得る。したがって、分子量の値は、特定の集団における分子の分子量についての平均値または中央値を表し得る。

【0116】

一実施形態では、糖は、少なくとも１個のグリセロールホスファート部分を含む。別の実施形態では、糖は、式（ＩＩＩ）：

【0117】

【化9】

によって表される構造を含む。式（ＩＩＩ）によって表される構造を含む糖は、少なくとも約１００Ｄａ、好ましくは、少なくとも約１７２Ｄａ、より好ましくは、少なくとも約３３４Ｄａの分子量を有する。

【0118】

一実施形態では、式（ＩＩＩ）によって表される構造を含む糖は、多糖である。また別の実施形態では、糖は、式（ＩＩＩ）：

【0119】

【化10】

［式中、ｎは、１以上の任意の整数である］の繰り返し単位を少なくとも１個含む。

【0120】

一実施形態では、式（ＩＩＩ）中のｎは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０および多くとも１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０の整数である。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例示的な範囲には、例えば、少なくとも１から多くとも１０００まで；少なくとも１０から多くとも５００まで；および少なくとも５０から多くとも２００までが含まれる。一実施形態では、多糖は、ｎが約９０の整数である式（ＩＩＩ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。例えば、一実施形態では、ｎは、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９、最も好ましくは、９０である。

【0121】

一実施形態では、糖は、式（ＩＶ）：

【0122】

【化11】

を含む。

【0123】

一実施形態では、式（ＩＶ）によって表される構造を含む糖は、多糖である。別の実施形態では、多糖は、式（ＩＶ）：

【0124】

【化12】

［式中、ｎは、１以上の任意の整数である］の繰り返し単位を少なくとも１個含む。

【0125】

一実施形態では、式（ＩＶ）中のｎは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０および多くとも１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０の整数である。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例示的な範囲には、例えば、少なくとも１から多くとも１０００まで；少なくとも１０から多くとも５００まで；および少なくとも５０から多くとも２００までが含まれる。一実施形態では、多糖は、ｎが約９０の整数である式（ＩＶ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。例えば、一実施形態では、ｎは、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９、最も好ましくは、９０である。

【0126】

一実施形態では、多糖は、グリセロールホスファート、式（ＩＩＩ）の単位、および式（ＩＶ）の単位を含む。式（ＩＩＩ）の単位および式（ＩＶ）の単位は、多糖中に１：１のモル比で存在し得る。

【0127】

この糖構造は、例えば、^１Ｄ、^１Ｈ、および／もしくは^１３Ｃを含めたＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの当技術分野で知られている方法およびツールによって決定することができる。一実施形態では、糖は、図６に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する多糖である。

【0128】

一実施形態では、糖は単離糖である。好ましい実施形態では、糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、本明細書に記載の株のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。別の好ましい実施形態では、糖は、次の株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。さらなる好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株から単離される。

【0129】

一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数であるレバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含む。一実施形態では、単離多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0130】

別の実施形態では、本発明は、化学的に合成された、式（ＩＩＩ）によって表される構造を含む糖に関する。また別の実施形態では、本発明は、化学的に合成された、式（ＩＶ）によって表される構造を含む糖に関する。一実施形態では、糖は分枝糖である。

【0131】

一実施形態では、本発明は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（ＩＩＩ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む化学的に合成された多糖に関する。一実施形態では、化学的に合成された多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0132】

一実施形態では、化学的に合成された多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数である式（ＩＶ）によって表される構造の繰り返し単位を少なくとも１個含む。一実施形態では、化学的に合成された多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0133】

一実施形態では、糖は免疫原性であり、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、糖は、オプソニン活性を誘導し得る。このオプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン活性を誘導し得る。

【0134】

別の実施形態では、糖は、オプソニン活性および食細胞活性（例えば、オプソニン作用活性）を誘導し得る。このオプソニン作用活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0135】

また別の実施形態では、糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、この殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対する殺菌活性を誘導し得る。好ましい実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５に対する殺菌活性を誘導し得る。一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0136】

レバン部分を含む糖
一態様では、本発明は、レバン部分を含む糖に関する。レバン（（２→６）−β−Ｄ−フルクトフラナンまたは６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２）は、Ｃ_１８Ｈ_３２Ｏ_１６の分子式および約５０４Ｄａの分子量を有する。

【0137】

一実施形態では、糖は、少なくとも約５００Ｄａ、５０４Ｄａ、１ｋＤａ、２ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２０ｋＤａから多くとも約５０，０００ｋＤａ、３０，０００ｋＤａ、１０，０００ｋＤａ、５０００ｋＤａ、２０００ｋＤａ、１０００ｋＤａ、９００ｋＤａ、８００ｋＤａ、７００ｋＤａ、６００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１００ｋＤａ、９０ｋＤａ、８０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａまでの分子量を有する。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、糖は、少なくとも約５００Ｄａから多くとも約５０，０００ｋＤａまで、好ましくは、少なくとも約１ｋＤａから多くとも約３０，０００ｋＤａまでの分子量を有する。より好ましくは、糖は、少なくとも約５０００ｋＤａから多くとも約２５，０００ｋＤａまでの分子量を有する。好ましい一実施形態では、糖は、少なくとも約１０，０００ｋＤａから多くとも約２５，０００ｋＤａまでの分子量を有する。

【0138】

本明細書に記載の糖の分子量または平均分子量は、例えば、多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）などの当技術分野で知られている方法によって測定される糖の重量を指す。所与の糖の分子量は、例えば、糖を合成する経路および環境、糖を単離するために使用する抽出条件、糖を単離する種、ならびに／または糖を採取する位置および時間などの因子に応じて変化し得ることに注意すべきである。

【0139】

一実施形態では、糖は、単位のｎ数が１以上の任意の整数であるレバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含む多糖である。一実施形態では、ｎは、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、または３０および多くとも１００，０００、５０，０００、４０，０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、または４０の整数である。いずれの最小値およびいずれの最大値も、範囲を定義するために組み合わせることができる。例示的な範囲には、例えば、少なくとも１から多くとも１００，０００まで；少なくとも１０から多くとも５０，０００まで；および少なくとも５０から多くとも５０，０００までが含まれる。一実施形態では、多糖は、ｎが多くとも約４０，０００の整数であるレバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含む。

【0140】

この糖構造は、例えば、^１Ｄ、^１Ｈ、および／もしくは^１３Ｃを含めたＮＭＲ、２Ｄ ＴＯＣＳＹ、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹ、ならびに／またはＨＭＱＣなどの当技術分野で知られている方法およびツールによって決定することができる。一実施形態では、糖は、図１に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する多糖である。

【0141】

一実施形態では、糖は単離糖である。好ましい実施形態では、糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、本明細書に記載の株のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。別の好ましい実施形態では、糖は、次の株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれかから選択されるＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株から単離される。さらなる好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５から単離される多糖である。別の好ましい実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株から単離される。

【0142】

一実施形態では、単離多糖は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数であるレバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含む。一実施形態では、単離多糖は、上記のとおりの分子量を有する。

【0143】

別の実施形態では、本発明は、化学的に合成された、レバン部分を含む糖に関する。一実施形態では、糖は分枝糖である。

【0144】

一実施形態では、本発明は、ｎが、上記のとおり、１以上の整数であるレバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含む化学的に合成された多糖に関する。一実施形態では、化学的に合成された多糖は、レバン部分の繰り返し単位を少なくとも１個含み、上記のとおりの分子量を有する。

【0145】

一実施形態では、糖は免疫原性であり、哺乳動物において免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、糖は、オプソニン活性を誘導し得る。このオプソニン活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン活性を誘導し得る。

【0146】

別の実施形態では、糖は、オプソニン活性および食細胞活性（例えば、オプソニン作用活性）を誘導し得る。このオプソニン作用活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものであってよい。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。別の実施形態では、糖は、少なくともＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）に対するオプソニン作用活性を誘導し得る。

【0147】

また別の実施形態では、糖は、殺菌免疫応答を誘導し得る。一実施形態では、この殺菌活性は、グラム陽性球菌に対する、好ましくは、エンテロコッカス属種に対する、より好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の少なくとも１種の株に対するものである。例えば、一実施形態では、糖は、次のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株：Ｅ１１６２；Ｅ１６３６；Ｅ１６７９；Ｕ０３１７；Ｅ０１５５；ＴＸ００１６；１，２３０，９３３；１，２３１，４０８；１，１４１，７３３；１，２３１，４１０；１，２３１，５０１；１，２３１，５０２；Ｅ０９８０；Ｅ１０３９；Ｅ１０７１；Ｃｏｍ１２；Ｃｏｍ１５；およびＴＸ１３３０のいずれか少なくとも１種に対する殺菌活性を誘導し得る。一実施形態では、糖は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対する殺菌活性を誘導し得る。

【0148】

糖を含む組成物
一態様では、本発明は、本明細書に記載の糖のうちのいずれか少なくとも２種の組合せを含む組成物に関する。例えば、一実施形態では、組成物は、（ａ）レジオナミン酸部分を含む多糖；（ｂ）アルトルロン酸部分を含む多糖；（ｃ）グリセロールホスファート部分を含む多糖；および（ｄ）レバン部分を含む多糖のうちのいずれか少なくとも２種を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離多糖のうちのいずれか少なくとも３種を含む。また別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離多糖のうちのいずれか少なくとも４種を含む。

【0149】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の糖のいずれか少なくとも１種と、薬学的に許容できる添加剤、担体、緩衝剤、安定剤、アジュバント、またはそれらの混合物とを含む組成物に関する。好ましい実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離多糖と、担体分子とを含む。適切な担体分子には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（油滴またはリポソームなど）、および不活性ウイルス粒子が含まれ得る。微粒子担体の例には、ポリメタクリル酸メチルポリマーに由来するもの、さらにはＰＬＧとして知られているポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）に由来するマイクロ粒子が含まれる。

【0150】

多糖−タンパク質コンジュゲート
本明細書で使用する場合、「多糖−タンパク質コンジュゲート」は、１つまたは複数の共有結合によってタンパク質担体分子にコンジュゲートされている多糖分子を指す。標的ホストにおいて免疫原性であることが分かっている別の種のタンパク質に、多糖をコンジュゲートすることが望ましいことがある。したがって、一実施形態では、この担体分子は担体タンパク質である。本明細書において定義するとおり、そのような外来タンパク質を、「担体タンパク質」と称する。担体タンパク質は、多糖の抗原性および免疫原性を増強するために役立つ。本明細書で使用する場合、用語「担体効果」は、担体としてのより免疫原性な分子（例えば、異種タンパク質）に付着させることによって、弱免疫原性または非免疫原性分子の抗原性および免疫原性を増強するプロセスを指す。この場合、多糖−タンパク質コンジュゲートの組合せにおける多糖は、それを単独で提供した場合よりも、免疫原性が高くなる。担体タンパク質は、抗体応答を生じさせるためにＴ細胞ヘルプを刺激するためのＴ細胞エピトープを含有する。

【0151】

交差反応材料またはＣＲＭは、本発明の一部の実施形態のために特に有用である。非毒性であるにも関わらず、特定の細菌毒素に対して抗原性において類似している遺伝子改変タンパク質を生産することができる。これらは、「交差反応材料」またはＣＲＭと呼ばれる。ＣＲＭ_１９７は注目すべきものであり、それというのも、これは、天然のジフテリア毒素から単一のアミノ酸が変化しており、免疫学的に区別できないためである。それらの開示内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれるＰａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．、９：８９１〜９０６、（１９７２）および米国特許第５，６１４，３８２号を参照されたい。ＣＲＭ３２０１は、百日咳毒素の遺伝子操作変異体である。それらの開示内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれるＢｌａｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：６５６〜６５９、（１９８８）を参照されたい。

【0152】

ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ_１９７、および百日咳トキソイドに加えて、担体タンパク質のさらなる例には、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（野生型または毒性を低減させた変異体）のニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からの溶血素、無莢膜型（Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ）ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）タンパク質、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）外毒素／トキソイド、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原、ロタウイルスＶＰ ７タンパク質、および呼吸系発疹ウイルスＦおよびＧタンパク質、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ならびにシュードモナス外毒素、または組換えによって生産された非毒性変異体緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａを含むその誘導体が含まれる。好ましい実施形態では、担体タンパク質はジフテリアトキソイドである。より好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ_１９７である。

【0153】

好ましい実施形態では、組成物は、担体分子に結合している多糖を含む。多糖は、当技術分野で知られている任意の適切な手段によって結合させることができる。好ましくは、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。担体タンパク質を多糖にコンジュゲートさせる方法は、当技術分野で知られている。

【0154】

「コンジュゲート免疫原性組成物」は、本明細書で使用する場合、免疫原性材料が、糖−タンパク質コンジュゲートが生じるように担体タンパク質に共有結合されている抗原糖を含む免疫原性組成物を指す。一実施形態では、本発明の糖−タンパク質コンジュゲートを、一価および／または多価免疫原性組成物として製剤化することができる。

【0155】

一価コンジュゲート免疫原の合成では、細菌の単一の血清型に由来する糖を、タンパク質にコンジュゲートさせることができる。多価コンジュゲート免疫原性組成物の合成では、糖−タンパク質コンジュゲートを、２種の異なる種の細菌から精製された糖の混合物を担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって生産することができる。別法では、多価コンジュゲート免疫原性組成物を、同じ細菌の２種以上の異なる血清型の細菌から精製された糖を組み合わせ、それを混合物として、担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、生産することができる。別法では、異なる糖を使用する別々の反応で、単一の種類の糖を担体タンパク質と反応させることによって生産した糖−タンパク質コンジュゲートを、混合することもできる。したがって、多価免疫原性組成物は、結合した糖の均質または不均質な集団を有する担体タンパク質を含んでもよい。

【0156】

例示的な糖−タンパク質組成物
一態様では、本発明は、レジオナミン酸部分を有する多糖および担体分子を含む組成物に関する。一実施形態では、多糖は、式（Ｉ）によって表される構造を含む。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。一実施形態では、この組成物は免疫原性である。

【0157】

別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合している多糖を免疫誘導量で含む多糖−タンパク質コンジュゲートであって、多糖が、式（Ｉ）によって表される構造を含む、多糖−タンパク質コンジュゲートに関する。一実施形態では、多糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）から単離および／または精製される。別の実施形態では、多糖は、化学的に合成される。また別の実施形態では、多糖は、糖を産生するための生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0158】

一態様では、本発明は、アルトルロン酸部分を有する多糖および担体分子を含む組成物に関する。一実施形態では、多糖は、式（ＩＩ）によって表される構造を含む。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。一実施形態では、この組成物は免疫原性である。

【0159】

別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合している多糖を免疫誘導量で含む多糖−タンパク質コンジュゲートであって、多糖が、式（ＩＩ）によって表される構造を含む、多糖−タンパク質コンジュゲートに関する。一実施形態では、多糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）から単離および／または精製される。別の実施形態では、多糖は、化学的に合成される。また別の実施形態では、多糖は、糖を産生するための生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0160】

一態様では、本発明は、グリセロールホスファート部分を有する多糖および担体分子を含む組成物に関する。一実施形態では、多糖は、式（ＩＩＩ）によって表される構造および／または式（ＩＶ）によって表される構造を含む。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。一実施形態では、組成物は免疫原性である。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。

【0161】

別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合している多糖を免疫誘導量で含む多糖−タンパク質コンジュゲートであって、多糖が、式（ＩＩＩ）によって表される構造および／または式（ＩＶ）によって表される構造を含む、多糖−タンパク質コンジュゲートに関する。一実施形態では、多糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）から単離および／または精製される。別の実施形態では、多糖は、化学的に合成される。また別の実施形態では、多糖は、糖を産生するための生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0162】

一態様では、本発明は、レバン部分を有する多糖および担体分子を含む組成物に関する。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。一実施形態では、組成物は免疫原性である。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。一実施形態では、多糖は、担体分子にコンジュゲートされている。

【0163】

別の態様では、本発明は、担体タンパク質に共有結合している多糖を免疫誘導量で含む多糖−タンパク質コンジュゲートであって、多糖がレバン部分を含む、多糖−タンパク質コンジュゲートに関する。一実施形態では、多糖は、エンテロコッカス属細菌、好ましくは、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）から単離および／または精製される。別の実施形態では、多糖は、化学的に合成される。また別の実施形態では、多糖は、糖を産生するための生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製される。

【0164】

コンジュゲーション
コンジュゲーションは、多糖の原子がタンパク質表面の原子に共有結合する直接的なものであってよい。コンジュゲーションは、リンカー分子を介したものであってもよく、このリンカー分子は、多糖およびタンパク質の両方と反応して、その２つを接続し、炭水化物をタンパク質につないでいる。

【0165】

一実施形態では、多糖およびタンパク質は一緒にコンジュゲートして、免疫原性多糖−タンパク質コンジュゲートまたはイムノコンジュゲートを形成している。一実施形態では、タンパク質の分子１個当たり、約１から約５０個の間のコンジュゲートされた多糖の分子が存在する。別の実施形態では、タンパク質の分子１個当たり、約１から約２０個の間のコンジュゲートされた多糖の分子が存在する。好ましい実施形態では、タンパク質の分子１個当たり、約２から約２０個の間のコンジュゲートされた多糖の分子が存在する。

【0166】

直接的な多糖とタンパク質とのコンジュゲーション
多糖およびタンパク質担体のコンジュゲートは、多糖ポリマー断片の還元末端基を担体タンパク質の第一級アミノ基と反応させて、担体タンパク質に共有結合しているポリマーの抗原決定基を得ることによって形成され得る。還元基は、炭水化物の選択的加水分解もしくは特異的酸化的開裂、または両方の組合せによって形成され得る。

【0167】

例えば、多糖をタンパク質とコンジュゲートさせるなどの、コンジュゲーションの方法は、当技術分野で知られている。一般に、多糖は、活性化するか、または別の方法でコンジュゲーションを受け易くするべきである、すなわち、少なくとも１個の部分が、タンパク質または他の分子と共有結合し得るようにしなければならない。例えば、多糖上にアルデヒド基を作出するために過ヨウ素酸を使用し、次いで、シアノ水素化ホウ素を使用して還元的アミノ化を行うことを記載している米国特許第４，３５６，１７０号を参照されたい。米国特許第４，６６３，１６０は、アルデヒド基を作出するために過ヨウ素酸を使用するが、次いで、多糖を、４−１２炭素部分で誘導体化されているタンパク質と、シッフ塩基反応を用いて、シアノ水素化ホウ素などの還元剤が存在する状態で結合させることを記載している。米国特許第４，６１９，８２８号は、多糖を活性化させ、次いで、多糖を、４〜８個の炭素原子からなるスペーサー橋を介してタンパク質にコンジュゲートさせるために、臭化シアンを記載している。コンジュゲーションのさらに他の方法が当技術分野で知られている。

【0168】

多糖を加水分解させて、１個の官能性アルデヒド基のみを有する多糖断片を形成する場合、多官能性タンパク質（少なくとも２個の遊離アミン基を有する）へのコンジュゲーションは、タンパク質の単一の分子が、共有結合した１個または複数の多糖断片を有するコンジュゲートをもたらす。本明細書で使用する場合、用語「多糖」または「多糖断片」は、コンジュゲーション反応の文脈において互換的に使用される。タンパク質に結合する多糖の数を、多糖または多糖断片のタンパク質に対する相対濃度および反応物の全体濃度を含めたコンジュゲーション反応の条件の変化によって、常法に従って調節することができることは容易に分かり得る。当然ながら、反応性または反応速度に影響を及ぼす任意の反応パラメーター、例えば、時間、温度、ｐＨなどの調節によって、最終組成およびコンジュゲートの構造は変わる。

【0169】

多糖断片が、断片の各末端に位置する少なくとも１個の官能性アルデヒド基を有する場合、多官能性タンパク質とのコンジュゲーションは、複数の種類のコンジュゲートをもたらし得る。例えば、特に、多くの遊離アミンがタンパク質上に存在し、また、莢膜断片がタンパク質に対して低いモル過剰で存在する場合、そのような反応物のコンジュゲーションは、格子またはネットワーク構造を形成する可能性を有する。ネットワークまたは格子の架橋程度および全体サイズは、コンジュゲーション反応の条件の常法に従う変化によって調節することができる。

【0170】

一実施形態では、コンジュゲーションを、当技術分野で知られている還元的アミノ化プロセスによって実施する。例えば、このプロセスは、対象の還元末端を還元せず、また、担体タンパク質または多糖に不利な影響を及ぼすこともないシアノ水素化ホウ素イオンまたは別の還元剤が存在する状態で、還元多糖断片および担体タンパク質を反応させることを伴い得る。

【0171】

シアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒａｔｅ）イオン（またはその同等物）は、多糖断片のカルボニル基とタンパク質のアミノ基との間で形成されるシッフ塩基中間体の穏やかな選択的還元剤として主に作用する。そのようなイオンの二次的な効果は、コンジュゲーションが起こった後にも多糖断片上に残っている任意の活性アルデヒド基のよりゆっくりとした還元である。任意選択により、コンジュゲーションの後に、追加のシアノ水素化ホウ素イオン（またはその同等物）を、そのような未反応の遊離アルデヒド基を還元するために加えることができる。より強力な還元剤、水素化ホウ素イオンをコンジュゲーションの後に加えて、残りのカルボニル基の適切な還元を保証することが多くの場合に望ましい。

【0172】

多糖−タンパク質コンジュゲート：リンカーの使用
直接的なコンジュゲーションの成功は、どれほど多くの表面基が各反応パートナーに対して利用可能であるかに依存している。立体効果が、多糖とタンパク質とのコンジュゲーションの効率に影響を及ぼすことが知られている。これは、コンジュゲートされるタンパク質上の、そうしなければアクセス不可能な部位にアクセスするために、高度に柔軟な二官能性リンカーまたはスペーサーアーム（リンカー）を使用することで克服することができる。リンカーは、どのような統一的な分類スキームも有さないが、しかしながら、次の特徴において共通している：リンカーは低分子量で、多糖およびタンパク質上の選択された官能基と段階的または同時に反応し得る二官能性試薬である。細菌多糖は、ヒドロキシル基、アシル化されていてもされていなくてもよいアミノ基、ホスホジエステル、およびカルボキシル基のような幅広い一連の官能基を有し得る。これらの官能基のいずれも、原則的に、リンカーを多糖にカップリングさせるために使用することができる。

【0173】

上記で検討したとおり、多糖を、リンカーとして知られている中間またはスペーサー分子を介して担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。例えば、本明細書において提供する方法によれば、多糖の還元末端の還元的アミノ化を、２個のアミノ基を含有する分子を使用して行う。本発明のある種の実施形態では、所与のモル量の多糖を、１０×モル過剰のジアミノエタン溶液と、０．２Ｍ ＫＨ_２ＰＯ_４中、約ｐＨ＝９、約２５〜１００℃、好ましくは１００℃の温度にて、約１〜６０分の間、好ましくは、約１５分にわたって反応させることによって、還元的アミノ化を達成する。その後、調製物中の多糖のモル濃度の２５倍に等しいモル量のピリジンボランを加えることができ、反応を約２５〜１００℃の間、好ましくは、約５０℃にて、約１から７２時間の間、好ましくは、約４８時間にわたって行う。

【0174】

次いで、還元的アミノ化反応の結果として生じた生成物を、「リンカー」と反応させることができる。本明細書で使用する場合、「リンカー」は二官能性分子であり、両方の官能基が、活性化多糖の末端アミノ基または担体タンパク質の構造中に存在するアミノ基のいずれかと反応することができるので、その結果この二官能性分子は、多糖および担体タンパク質を一緒に結合するために役立ち得る。本発明の一実施形態では、二官能基はジエステルであり、より詳細には、タンパク質のより効率的なグリコシル化に関連することが示されているアジピン酸のジエステルである。本発明の具体的な実施形態では、還元的アミノ化に供しておいた多糖をコハク酸または、より好ましくは、アジピン酸のスクシンイミジルジエステルとさらに反応させる；この反応は最良には、アジピン酸のスクシンイミジルジエステル（ＳＩＤＥＡ）またはコハク酸のスクシンイミジルジエステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｉｄｉｅｓｔｅｒ）（ＳＩＤＥＳ）のモル濃度の約１／５に等しいモル濃度（アミノ基として）のアミノ化多糖で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液中、約０℃から約２５℃の間にて、好ましくは、約４℃にて、約０．５から５時間の間、好ましくは、約２時間にわたって行うことができる。次いで、１，４ジオキサン（８０％ｖ／ｖ）を使用する沈殿によって、活性化多糖を収集することができるが、これは、上清中に、過剰のＳＩＤＥＡ（またはＳＩＤＥＳ）も残す。

【0175】

本発明の具体的な実施形態では、活性化多糖を、次のとおり精製されているＣＲＭ_１９７タンパク質に結合させることができる：ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）株によって産生されたＣＲＭ_１９７を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ膜に細菌培養物を通し、それによって、タンパク質を濾液から沈殿させ、次いで、ＣＲＭ_１９７をイオン交換クロマトグラフィーによって精製することによって培養培地から分離することができる。別法では、当技術分野で知られている任意の方法によって、実質的に純粋なＣＲＭ_１９７を得ることができる。

【0176】

活性化多糖は、有機溶媒および、活性化多糖の末端官能基とタンパク質との結合を促進するために任意選択により、任意の他の薬剤（縮合剤など）が存在する状態で、担体タンパク質に共有結合させることができる。

【0177】

本発明のある種の実施形態では、末端エステル基を有する活性化多糖を、担体タンパク質上に存在する遊離アミノ基に、次のとおりに共有結合させることができる：活性化多糖をジメチルスルホキシドに溶解させ、次いで、モノエステル−活性化多糖／担体タンパク質のアミノ基全部のモル比が約１：２であり、ＤＭＳＯの最終濃度が約５０％ｖ／ｖであるように、担体タンパク質の水溶液（例えば、限定ではないが、約２ｍｇ／ｍｌの濃度のＣＲＭ_１９７）に加えることができる。コンジュゲーション反応を４℃で行う。この反応は約２時間でほぼ完了するが、各種の具体的な糖コンジュゲートについて反応の収量を最高値に上昇させるために、反応を一晩進行させ続けることが適切である。次いで、こうして得られた糖コンジュゲートをゲルクロマトグラフィーによって精製する。

【0178】

リンカー
リンカーの使用は、コンジュゲート免疫原性組成物の分野では知られている。多糖と担体タンパク質との結合は、例えば、グルタルアルデヒドなどの架橋試薬を使用することによって達成することができる。しかしながら、ある種の実施形態では、多糖およびタンパク質担体をリンカーによって分離する。リンカーは、コンジュゲートの最適な免疫原性および多糖と担体とのより効率的なカップリングを促進する。リンカーは、２つの抗原成分を、その長さおよび柔軟性を所望のとおりに調節することができる鎖によって分離する。二官能性部位の間に、鎖は、ヘテロ原子および開裂部位を含めた様々な構造的特徴を含むことができる。またリンカーによって、抗原の翻訳特性および回転特性の増大に対応することが可能となり、結合部位と可溶性抗体とのアクセスが増大する。アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）の他に、適切なリンカーには、例えば、ε−アミノヘキサン酸、３−（２−ピリジルジチオ（ｐｙｒｉｄｙｉｄｉｔｈｉｏ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトン、およびｐ−ニトロフェニルアミンなどのヘテロ二官能性リンカーが含まれる。使用が企図されるカップリング試薬には、ヒドロキシスクシンイミドおよびカルボジイミドが含まれる。当業者に知られている多くの他のリンカーおよびカップリング試薬も、使用に適している。

【0179】

担体および多糖などの１種または複数の抗原をコンジュゲートさせる（すなわち、共有結合させる）場合、コンジュゲーションは、当技術分野で知られている任意の化学的方法、プロセス、また遺伝的技法によるものであってよい。例えば、担体ポリペプチドと、炭水化物、オリゴ糖、脂質、リポオリゴ糖、多糖、オリゴ糖−タンパク質コンジュゲート、多糖−タンパク質コンジュゲート、ペプチド−タンパク質コンジュゲート、オリゴ糖−ペプチドコンジュゲート、多糖−ペプチドコンジュゲート、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、リポオリゴ糖−タンパク質コンジュゲート、多糖−タンパク質コンジュゲート、またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される１種または複数の抗原とを、これらに限定されないが、（１）タンパク質官能基を介しての直接的カップリング（例えば、チオール−チオール結合、アミン−カルボキシル結合、アミン−アルデヒド結合；酵素直接的カップリング）；（２）アミンのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス−アルデヒドを使用）；（３）チオールのホモ二官能性カップリング（例えば、ビス−マレイミドを使用）；（４）光活性化試薬を介してのホモ二官能性カップリング（５）アミンとチオールとのヘテロ二官能性カップリング（例えば、マレイミドを使用）；（６）光活性化試薬を介してのヘテロ二官能性カップリング（例えば、β−カルボニルジアゾ（ｃａｒｂｏｎｙｉｄｉａｚｏ）ファミリー）；（７）臭化シアン活性化またはカルボキシメチル化を介してのアミン−反応性基のポリ−またはオリゴ糖への導入；（８）マレイミド−ヒドラジドなどのヘテロ二官能性化合物を介してのチオール−反応性基の多糖またはオリゴ糖への導入；（９）疎水基をタンパク質に導入することを介してのタンパク質−脂質コンジュゲーションおよび（１０）反応性基を脂質に組み込むことを介してのタンパク質−脂質コンジュゲーションを含む技法によってコンジュゲートさせることができる。また、ビオチン−アビジン相互作用などのヘテロ二官能性「非共有結合カップリング」技法が企図される。オリゴ糖および多糖と免疫原性担体タンパク質とのコンジュゲーションを行うために当技術分野でよく知られている他の方法も、本発明の一部の実施形態の範囲内である。

【0180】

免疫原性組成物
一態様では、本発明は、有効量の少なくとも１種の本明細書に記載の糖、オリゴ糖、多糖、その多糖−タンパク質コンジュゲート、またはその生物学的同等物を含む免疫原性組成物に関する。例えば、一実施形態では、免疫原性組成物は、式（Ｉ）によって表される構造を含む少なくとも１種の多糖および／またはその多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、式（ＩＩ）によって表される構造を含む少なくとも１種の多糖および／またはその多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、式（ＩＩＩ）によって表される構造を含む少なくとも１種の多糖および／またはその多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。また別の実施形態では、免疫原性組成物は、式（ＩＶ）によって表される構造を含む少なくとも１種の多糖および／またはその多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、レバン部分を含む少なくとも１種の多糖および／またはその多糖−タンパク質コンジュゲートを含む。

【0181】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容できる賦形剤および／または薬学的に許容できる担体を含む。そのような薬学的に許容できる担体を、本発明の炭水化物をタンパク質に結合させる際に使用され、その炭水化物に対する免疫応答を変更する「担体タンパク質」と混同すべきではない。本明細書に記載のタンパク質担体との混同を回避するために、薬学的に許容できる賦形剤という用語が、薬学的に許容できる担体よりも好ましいであろうが、これらの用語は時折、互換的に使用されることがある。

【0182】

適切な薬学的に許容できる賦形剤には、任意かつすべての従来の溶媒、分散媒体、増量剤、固体担体、水性溶液、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性吸収遅延剤などが含まれる。適切な薬学的に許容できる賦形剤には、例えば、滅菌水、注射用水（ＷＦＩ）、滅菌等張性生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１種または複数、さらに、それらの組合せが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤は、貯蔵寿命または身体における有効性を増強する湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含んでよい。薬学的に許容できる賦形剤の調製および使用は当技術分野でよく知られている。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、本発明の免疫原性組成物中でのそれらの使用が企図される。

【0183】

ある種の実施形態では、免疫原性組成物は、１種または複数のアジュバントを含む。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、本発明の特定の実施形態の免疫原性組成物の免疫原性を増強するのに役立つ物質である。アジュバントは、当技術分野で知られている。

【0184】

方法
使用方法
一態様では、本発明は、哺乳動物に、有効量の本明細書に記載の少なくとも１種の糖を投与することにより、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法に関する。一実施形態では、方法は、グラム陽性球菌に対する免疫応答を誘導することを含む。グラム陽性球菌の例には、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種が含まれる。好ましい実施形態では、方法は、エンテロコッカス属種に対する、最も好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に対する免疫応答を誘導することを含む。

【0185】

別の態様では、本発明は、哺乳動物に、有効量の本明細書に記載の組成物を投与することにより、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、組成物が、少なくとも１種の本明細書に記載の糖を含む、方法に関する。一実施形態では、方法は、グラム陽性球菌に対する免疫応答を誘導することを含む。グラム陽性球菌の例には、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種が含まれる。好ましい実施形態では、方法は、エンテロコッカス属種に対する、最も好ましくは、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に対する免疫応答を誘導することを含む。

【0186】

診断用途
また別の態様では、本発明は、診断マーカーとしての本明細書に記載の糖の方法および使用に関する。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の単離糖は、グラム陽性球菌抗原および／または抗体（例えば、エンテロコッカス属抗原および／または抗エンテロコッカス属抗体など）の存在を試料中で検出するために有用であり得る。この試料は、グラム陽性球菌の感染が疑われる哺乳動物、食品もしくは水、または他の物質に由来するものであってよい。したがって、一態様では、本発明は、グラム陽性球菌を検査試料中で検出する方法に関する。方法は、試料を、少なくとも１種の本明細書に記載の糖の存在についてアッセイするステップを含む。グラム陽性球菌の例には、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種が含まれる。

【0187】

本明細書に記載の糖は、例えば、炭水化物をベースとする医薬組成物、免疫原性組成物において、かつ／または研究および診断ツールとして使用することができる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の糖、オリゴ糖、または多糖を、ＥＬＩＳＡおよびマイクロアレイを含めた診断アッセイを開発するために適した１種または複数の担体にコンジュゲートさせることができる。そのようなアッセイで使用するための例示的な担体には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ビオチン、標識、ガラススライド、または金表面が含まれる。

【0188】

一態様では、本発明は、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種による感染症などのグラム陽性球菌感染症を哺乳動物において診断するための方法に関する。方法は、（ｉ）本明細書に記載のとおりの糖を得るステップと；（ｉｉ）前記糖を特異的に認識し、それに結合するモノクローナル抗体を生産するステップと；（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体を、哺乳動物に由来する生体試料と反応させるステップと；（ｉｖ）糖に結合した抗体の存在を検出するステップとを含む。

【0189】

別の実施形態では、本発明は、哺乳動物がブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種による感染症などのグラム陽性球菌感染症に感染しているか、または暴露されたかどうかを検出する方法に関する。方法は、（ｉ）本明細書に記載のとおりの糖を得るステップと；（ｉｉ）哺乳動物から得た抗体を、前記糖と反応させるステップと；（ｉｉｉ）哺乳動物に由来する抗体が前記糖を認識し、かつそれに結合するかどうかを検出するステップとを含む。

【0190】

一実施形態では、本発明は、エンテロコッカス属種または関連微生物に属する細菌を検出および／または同定するためのキットまたはセットに関する。例えば、キットは、本明細書に記載の糖を生体試料中で検出することができるモノクローナル抗体などの標識されている、もしくは標識可能な化合物または作用物質などの試薬を含み得る。

【0191】

本明細書に記載の糖と免疫反応性の抗体
一態様では、本発明は、本明細書に記載の糖と免疫反応性の抗体に関する。抗体調製物は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウスモノクローナルＩｇＧ抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、その断片、またはそれらの組合せのうちのいずれか１種を含んでよい。哺乳動物において、この多糖を使用することによって、抗体を生成させることができ、次いで、この抗体を、感染の可能性がある対象の胃液からエンテロコッカス属感染を示す抗原を検出するためのアッセイにおいて使用することができる。

【0192】

本発明の多糖などの繰り返し構造に対する抗体応答は、いくつかの独特な特徴を示すことがある。例えば、繰り返し単位の規則性は、非常に多様な分子量の抗原分子が、その多糖に特異的な抗体に結合し得ることを意味し得る。第２に、より大きな長さの多糖の繰り返し構造は、Ｔ細胞非依存性抗体応答を誘導し得る。したがって、Ｔ細胞ヘルパーエピトープを有するタンパク質担体にコンジュゲートされている多糖を使用すると、Ｔ細胞非依存性抗体応答およびＴ細胞依存性抗体応答の両方を刺激することができる。したがって、多糖のサイズを適切に選択し、担体タンパク質を使用するかどうかによって、免疫応答を変更することができる。

【0193】

一態様では、本発明は、本明細書に記載の糖に特異的に結合する単離抗体またはその断片に関する。「単離」抗体は、本明細書で使用する場合、その天然環境の成分から同定ならびに分離および／または回収された抗体を指す。その天然環境の夾雑物成分は、その抗体についての診断用途または治療用途を妨害するであろう材料であり、これらには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。例示的な実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定した場合に、抗体９５重量％超になるまで、および最も好ましくは、９９重量％超になるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで；または（３）クマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を用いて、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１種の成分が存在しないので、組換え細胞内のインサイチュの抗体を含む。しかしながらふつうは、単離抗体を少なくとも１つの精製ステップによって調製する。

【0194】

特定の糖または特定の糖にあるエピトープに「特異的に結合」するまたは「特異的」である抗体は、任意の他の糖または糖エピトープに実質的に結合することなく、その特定の糖または特定の糖にあるエピトープに結合するものである。

【0195】

言葉「標識」は、本明細書において使用する場合、「標識された」抗体が生成するように、抗体に直接的または間接的にコンジュゲートさせる検出可能な化合物または組成物を指す。この標識は、単独で検出可能であってもよいし（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学変成を触媒してもよい。

【0196】

ポリクローナル抗体
ある種の実施形態では、抗多糖抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、本明細書において定義する場合、血清の調製に由来する種々の特異性を有し、かつ種々のＢ細胞クローンに由来する抗体の混合物を指す。ポリクローナル抗体の調製および特性決定は、当技術分野で知られている。

【0197】

ポリクローナル抗体は、哺乳動物において、例えば、本明細書に記載の免疫原または免疫原性組成物ならびに、所望の場合には、アジュバント、緩衝剤、および／または賦形剤の１種または複数の注射剤を投与することによって生じる。様々な動物種を、特異的抗血清を生産するために使用することができる。典型的には、抗糖ポリクローナル抗血清の生産のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、またはモルモットである。典型的には、アジュバントを含むか、または含まない免疫原または免疫原性組成物を、哺乳動物に複数の注射剤によって注射する。免疫原性材料には、本明細書に記載の糖、オリゴ糖、多糖、多糖−タンパク質コンジュゲート、またはより大きな免疫原のアセンブリが含まれ得る。典型的には、第１の免疫化から２〜６週後から開始して、血液を免疫化動物から収集し、凝固させ、血清を採取する。この血清は、免疫化動物に由来する抗糖ポリクローナル抗体を含有し、多くの場合に抗血清と称される。

【0198】

モノクローナル抗体
抗糖モノクローナル抗体は、既知のハイブリドーマ技法を使用することによって調製することができる。典型的には、モノクローナル抗体の調製は、初めに、適切な標的動物宿主を、本発明の糖、オリゴ糖、多糖、または多糖−タンパク質コンジュゲートを含む選択された免疫原で免疫化することを伴う。所望の場合には、アジュバント、緩衝剤、および／または賦形剤を含んでもよい。免疫化を、糖またはそのコンジュゲートに特異的に結合する抗体を産生または発現するようにＢリンパ球を誘発するために十分に行う。別法では、リンパ球をインビトロで免疫化する。

【0199】

次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。リンパ球の供給源によって、そのモノクローナル抗体がヒト由来または動物由来であるかが決まる。一般に、ヒト由来の抗体および細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用し、非ヒト哺乳動物供給源が望ましい場合には、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用する。

【0200】

不死化細胞系は典型的には、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、およびヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞系を利用する。このハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する１種または複数の物質を含有する適切な培養培地中で培養する。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を含まない場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「ＨＡＴ培地」）。

【0201】

不死化細胞系を、由来する種、融合、および成長特性などの実際的な検討に関して選択する。例えば、適切な不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベルの発現を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に対して感受性のあるものである。不死化細胞系の例には、マウス骨髄腫系が含まれる。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系は、ヒトモノクローナル抗体の生産についても記載されている。

【0202】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって、培養培地中に分泌される。次いで、この培養培地を、多糖を認識し、かつそれと結合するモノクローナル抗体の存在についてアッセイする。そのハイブリドーマ細胞によって産生された特定のモノクローナル抗体の抗多糖結合特異性を、当技術分野でよく知られている多数の手順のうちの１つによって決定する。例えば、抗体結合特異性は、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、または表面プラスモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）によって決定することができる。モノクローナル抗体によって認識される正確なエピトープは、エピトープマッピングによって決定される。そのような技法およびアッセイは、当技術分野でよく知られている。

【0203】

所望の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後に、限界希釈によって、クローンをサブクローニングし、標準的な方法を使用して培養する。この目的に適した培養培地には、例えば、ダルベッコ変性イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。別法では、ハイブリドーマ細胞を、インビボで、哺乳動物中で腹水として成長させる。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの慣用の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または腹水液から単離または精製する。

【0204】

別法では、所望の特異性を有し、所望の由来の種の抗体を、ファージディスプレイライブラリを使用することによって得ることができる。加えて、特に、抗体ディスプレイライブラリを生成およびスクリーニングする際に使用することができる方法および試薬の例は、当技術分野において見出すことができる。

【0205】

抗体の使用
一態様では、本発明は、例えば、エンテロコッカス属抗体および／または抗体断片などのグラム陽性球菌抗体および／または抗体断片を検出または生産するための本明細書に記載の糖の使用に関する。本明細書に記載の糖および／またはそれから生成される抗体は、ＥＬＩＳＡ関連技術およびマイクロアレイ関連技術を含めた当業者に知られている様々な免疫診断技法において使用することができる。加えて、これらの試薬は、例えば、免疫原性糖コンジュゲートに対する血清抗体レベルを含む抗体応答を評価するために使用することができる。本発明のアッセイ方法は、蛍光、化学発光、放射性、酵素標識、もしくは染料分子などの標識、および／または生体試料中の抗原もしくは抗体と、固体支持体に結合している対応する抗体もしくは抗原との複合体を直接的もしくは間接的に検出するための二次免疫試薬の使用を伴い得る。

【0206】

産生される抗体または抗体断片は他にも、受動免疫療法において、または例えば、エンテロコッカス属感染症などのグラム陽性球菌感染症に対する予防のために有用であり得る。

【0207】

糖を生産する方法
また別の態様では、本発明は、本明細書に記載の糖のうちの少なくとも１種を生産するための方法に関する。方法は、グラム陽性球菌を培養するステップと、その細菌によって産生された糖を収集するステップとを含む。一実施形態では、グラム陽性球菌には、ブドウ球菌属種、エンテロコッカス属種、および連鎖球菌属種が含まれる。一実施形態では、細菌はエンテロコッカス属細菌である。一実施形態では、細菌は、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）である。細菌は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の任意の株であってよい。好ましい実施形態では、細菌はＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）である。別の好ましい実施形態では、細菌はＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５である。さらなる実施形態では、細菌はＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）である。

【0208】

本明細書に記載の糖は、適切な培地中でグラム陽性球菌を培養することによって生産することができる。適切な培地は、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロスを含み得る。培地は、デキストロース、ヘミン、および／またはグルコースを含み得る。好ましくは、培地は、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロスおよびデキストロースを含む。Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）を、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロスおよびデキストロースを使用して培養する場合、好ましくは、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは、３７℃である。好ましい実施形態では、細菌を好気性条件下で培養する。別の好ましい実施形態では、細菌を１２〜６０時間にわたって培養する。

【0209】

例えば、加熱、酵素処理、遠心分離、および／または濾過などの培養物から標的物質を収集するために当技術分野で知られている方法を使用することによって、得られた培養物から糖を収集することができる。一実施形態では、細菌および糖を含有する培養物を遠心分離し、例えば、リゾチーム、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、および／またはプロナーゼなどの酵素で処理する。例えば、一実施形態では、適切な有機溶媒を、得られた上清に加えて、タンパク質を沈殿させ、その沈殿物を遠心分離によって除去する。次いで、適切な有機溶媒を上清にさらに加えることによって、糖を沈殿させることができ、その糖を遠心分離によって収集することができる。より具体的には、エタノールを、細菌が除去されている上清に対して約２５体積％の最終濃度で加え、遠心分離によってタンパク質を含有する沈殿を除去し、そこに、エタノールを約７５体積％の最終濃度までさらに加え、次いで、遠心分離によって沈殿物を収集することによって、本明細書に記載の糖を得ることができる。結果として生じた沈殿物を、窒素を用いて乾燥させることができる。結果として生じた沈殿物を、トリスおよび０．０５％アジ化Ｎａ中に再懸濁させることができる。

【0210】

別法で、本発明の別の実施形態では、糖を化学的に合成する。糖を、従来の方法によって化学的に合成することができる。

【0211】

本発明のまた別の実施形態では、糖を、糖を産生するための生合成経路をクローニングおよび発現させた後に、代理宿主中で発現させることによって調製する。例えば、宿主細胞を、本明細書に記載の糖に対して構造的類似性を有する糖を産生するように変更することができ、宿主細胞中で産生される糖の繰り返し単位は、本明細書に記載の糖の繰り返し単位と部分的に同一である。糖は、例えば、本明細書に記載の糖の繰り返し単位と比較して、その糖の繰り返し単位が分枝の欠失を有し、サイズが不均質であり、かつ／または分枝配置が不均質である場合に、本明細書に記載の糖に構造的に類似している。好ましくは、宿主細胞は、細菌宿主細胞である。

【実施例】

【0212】

（実施例１）
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株
クローナルコンプレックス１７（ＣＣ１７）に関連する２つの株、ＴＸ００１６（ＤＯ）および株Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を、表面炭水化物を分析するために選択した。心内膜炎患者からもともとは単離されたＴＸ００１６株は、多形核白血球［ＰＭＮ］）媒介性死滅に対して耐性である。

【0213】

（実施例２）
発酵
５００ｍＬ種培養物を、通気させることなく、２％デキストロースを含むＣｏｌｕｍｂｉａブロス中、３７℃にて一晩成長させた。体積全体を、８Ｌ撹拌タンク反応器内の同じ培地７．５Ｌに、ｐＨ制御下で加え、６時間または２４時間成長させた。熱処理（６０℃で１時間）によって死滅させた後に、細胞を遠心分離によって採取し、トリス／スクロース緩衝液１５０ｍｌに再懸濁させ、１ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび１０Ｕ／ｍｌムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）で一晩処理した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０分）の後に、上清を１００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼおよび１０Ｕ／ｍｌ ＤＮアーゼで８時間にわたって、次いで、プロナーゼ（５０μｇ／ｍｌ）で一晩処理した。エタノールを２５％まで加え、沈殿物を遠心分離の後に廃棄した。上清を７５％エタノールまで調節し、結果として生じた沈殿物を保持した。７５％エタノールで２回洗浄した後に、ペレット状物を窒素で乾燥させ、３０ｍＭトリスｐＨ７．５および０．０５％アジ化Ｎａ２０ｍｌに再懸濁させた。こうして、粗製の炭水化物２〜３ｇを、湿潤細胞５０〜１００ｇから得た。

【0214】

（実施例３）
抗原精製
粗製の多糖を、５０ｍＭトリスｐＨ７．５／１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡化させておいたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００カラム（直列の１６／６０および２６／６０カラム）に流速０．５ｍｌ／分で負荷した。画分を、２１５ｎＭ、２５４ｎＭ、および２８０ｎＭでのＵＶ吸収によって、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ検出試薬を用いる天然ＰＡＧＥゲル電気泳動によって、かつ炭水化物生化学アッセイ（アントロン、デオキシ−糖Ｏ−アセチル）でモニターした。ＴＸ００１６（ＤＯ）株から抽出された多糖では、回収された画分を、アントロン活性を伴う主要なピークに対応する５つの貯留物にまとめた。最初の４つのＳＥＣ貯留物は、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ染色により、高分子量物質を含有し；５番目は含有せず、さらには調査しなかった。個々のＳＥＣ貯留物を、２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化させておいたアニオン交換カラムクロマトグラフィー（ＡＥＣ）カラム（直列の２×ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ）に適用し、炭水化物を１Ｍ ＮａＣｌ勾配で溶離した。画分を上記のとおりにスクリーニングし、対象のピーク活性に対応する試料を貯留し、３０ＫＤａ ＭＷＣＯスピンフィルターで濃縮し、水に対して透析し、生化学分析前に凍結乾燥させた。

【0215】

（実施例４）
抗原構造分析
炭水化物試料の構造決定は、^１Ｈ−ＮＭＲおよび２Ｄ−ＮＭＲ分析（ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ／ＲＯＥＳＹおよび^１Ｈ／^１３Ｃ ＨＳＱＣ）を伴った。単糖組成を、酢酸アルジトール誘導体のＧＣ−ＭＳによって決定した。試料をＣｉｕｃａｎｕおよびＫｅｒｅｋ手順（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ．１９８４；１３１：２０９〜２１７）によってメチル化した。部分メチル化誘導体を、対応する酢酸アルジトールに変換し、高オリフィス電圧ＥＳＩ質量分析法に連結したガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。

【0216】

（実施例５）
分子量の決定
精製多糖の重量平均分子量（Ｍｗ）を、オンライン示差屈折率（ｄＲＩ）、紫外線（ＵＶ）、および多角度光散乱（ＭＡＬＬＳ）の三重検出システムに連結しているサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。サイズ排除クロマトグラフィーでは、多糖のサイズに基づく分離を、ＴＳＫ−ゲルＧＭＰＷｘｌ混合床分析カラムで、水性ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．８）を移動相として使用する０．８ｍＬ／分の流速での定組成溶離で行った。検出器については、ＯｐｔｉＬａｂ ｒｅｘ ｄＲＩ、ＴＲＥＯＳ三角度ＭＡＬＬＳ検出器（両方ともＷｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）およびＶａｒｉａｎ単波長ＵＶ検出器を使用した。０．１３３ｍＬ／ｇの一般的なｄｎ／ｄｃ値をすべての多糖試料について、ＳＥＣ−ＵＶ−ＲＩ−ＭＡＬＬＳによってＭｗを決定するために使用した。データの取得および分析を、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＡＳＴＲＡソフトウェア（ｖ． ５．３．４．２０）を使用して行った。

【0217】

（実施例６）
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ１多糖の構造分析
この多糖は、ＳＥＣによりボイド容量付近の単一ピークとして溶離し、結合することなくＡＥＣを通過した。これは、バシラス属に関連したレバン様ポリマーとして同定され、例えば、熱、寒冷、凍結温度、飢餓など）などの環境ストレスに対する忍容性を促進し得る。

【0218】

試料の単糖分析（酢酸アルジトールのＧＣ）は、グルコースおよびマンノースが等量で存在することを示した。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、アノマーシグナルを含有しなかったが、３．５ｐｐｍと４ｐｐｍとの間に多数のシグナルが存在し、タンパク質または他の不純物の証拠はなかった。これらのデータによって、このポリマーが、還元すると、ＭａｎおよびＧｌｃをもたらすフルクトースから構成されていることが示されている。２Ｄ ＮＭＲデータ（表１、図１）の分析によって、ポリマーが大部分、−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２−（レバン）繰り返し単位を有する規則的な構造を有することが示された。結合の種類は、スペクトルを、様々なフルクトースポリマーについて公開されているデータと比較することによって決定した。スペクトルは、鎖の末端または異なる置換種類かもしれない未定義の起源のフルクトースのマイナーシグナルを含有した。

【0219】

【表2】

【0220】

（実施例７）
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ２多糖の構造分析
この多糖を、第２のＳＥＣ貯留物からアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。アントロンのポジティブピークは、ＡＥＣカラムから０．２２Ｍ ＮａＣｌで溶離した。この試料を濃縮し、ＮＭＲ分析（図２、３）の前に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５で脱塩した。ＰＳの酸性加水分解によって調製した酢酸アルジトールのＧＣ分析によって、フコースおよびグルコースが３：２の量で存在することが示された。ＰＳの２Ｄ ＮＭＲスペクトルのセット（ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＮＯＥＳＹ／ＲＯＥＳＹ、および^１Ｈ／^１３Ｃ ＨＳＱＣ）を記録し、割り当てた（表２、図３）。スペクトルは、６種の単糖のスピン系を含有した。ピラノース形態のβ−ガラクツロン酸に典型的なＴＯＣＳＹシグナルパターンおよびビシナルＨ−Ｈ結合定数を有する３種のフコース、２種のグルコース、および１種の単糖が同定された。ウロン酸の同定は決定的ではない。それというのも、光学的に純粋な２−ブタノールを用いたアセチル化グリコシド／エステルのＧＣ−ＭＳによってその絶対配置を決定しようとしても、ガラクツロン酸の誘導体が見出されていなかったためである。この単糖の^１３Ｃ ＮＭＲデータは、β−ガラクツロン酸の期待値と一致しなかった。また、β−Ｇａｌに典型的であるＨ−１とＨ−５との間のＮＯＥ相関は観察されなかった。この状況は、β−ＧａｌおよびエクアトリアルなＨ−５と同じく環配置を有する^４Ｃ_１配座でα−Ｌ−アルトルロン酸が存在し、結果として、Ｈ−１とＨ−５との間にＮＯＥが存在しないことを指し示した。

【0221】

ＰＳにおける単糖間の接続を、ＮＯＥ相関（Ａ１：Ｂ１，２；Ｂ１：Ｅ３；Ｃ１：Ｂ３；Ｄ１：Ｆ４；Ｆ１：Ｃ３）および^１３Ｃ化学シフトに基づき同定した。置換効果の分析によって、グルコースがＤ−配置を有すると推測すると、フコースはＬ−配置を有するはずであることが示された。

【0222】

ウロン酸の暫定的な同定をさらに調査するために、ＰＳの部分加水分解を行った（０．５Ｍ ＴＦＡ、９０℃、２時間）。これによって、酸性の二糖（ＯＳ１）を得、これをアニオン交換クロマトグラフィーおよびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５でのゲルクロマトグラフィーによって単離した。これは、明瞭で完全に説明可能なＮＭＲスペクトルを生成した（図４、表３）。ＮＭＲスペクトルの割り当てによって、ウロン酸がα−ａｌｔｒｏ−配置を有することが確認された。

【0223】

Ｌ−フコースおよびＤ−グルコースの絶対配置を、２−ブタノールの光学的に純粋な異性体を用いて調製したアセチル化２−ブチルグリコシドのＧＣ分析によって決定した。アルトルロン酸の絶対配置を同定するために、ＯＳ１を１Ｍ ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（９０℃、２時間）で処理して、メチルエステルを得、ＮａＢＨ_４を用いて水中で還元し（２時間、３０℃）、過剰のＮａＢＨ_４を４ＭのＨＣｌで分解し、ホウ酸をメタノールと共に２回蒸発させ、残渣を（Ｒ）−２−ＢｕＯＨ−ＡｃＣｌ（１０：１）で９０℃にて３時間にわたって処理し、乾燥させ、アセチル化させた。生成物のＧＣ分析によって、これが、Ｄ−アルトロースおよび（Ｓ）−２−ＢｕＯＨから調製された標準と同一であり、かつ（Ｒ）−２−ＢｕＯＨで得られた誘導体とは異なり、したがってアルトルロン酸のＬ−配置を示すことが示された（図５）。

【0224】

メチル化分析（Ｃｉｕｃａｎｕ−Ｋｅｒｅｋ手順、部分的にメチル化した酢酸アルジトールのＧＣ）によって、ＮＭＲデータと一致して、３−、４−、および２，３−置換のフコース、末端および４−置換のグルコースの存在が示された。

【0225】

多糖の高オリフィス電圧ＥＳＩ質量スペクトルによって、その構造が、Ｈ_２Ｏが１個少ない繰り返し単位（計算された正確な質量９３８．３ａｍｕ）に対応する９３７．７ａｍｕ（ネガティブモード）または９３９．７ａｍｕ（ポジティブモード）に顕著なピークを含むことが確認されたが、これらのスペクトルから、有意な構造情報を演繹することはできなかった。他のピークは、ヘキソース（１６２）または６−デオキシヘキソース（１４６）残基の付加または欠失に対応した。

【0226】

【表3】

【0227】

【化13】

【0228】

（実施例８）
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ３多糖の構造分析
この多糖を、ＡＥＣカラムから０．５８Ｍ ＮａＣｌで溶離した第１および第２のＳＥＣ貯留物から同定した。これは、非常に弱いアントロン活性しか示さなかった。先行する^１Ｈ−ＮＭＲ調査の後に、これらの試料を合わせ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５で脱塩し、テイコ酸化合物が存在することにより、ＰＦ３と呼んだ。ＰＦ３（ＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、ＲＯＥＳＹ、^１Ｈ／^３１Ｐ ＨＭＱＣおよび^１Ｈ／^１３Ｃ ＨＳＱＣ）の２Ｄ ＮＭＲスペクトルのセットを記録し、割り当てた（表３）。スペクトルは、３種の単糖、すべてのα−Ｇｌｃｐ、およびリン酸化グリセロールのスピン系を含んでいた。単糖および二糖置換を伴うか、または伴わないグリセロールホスファート主鎖を表す４つの別個の構造単位の構造を以下に示す：

【0229】

【化14】

【0230】

脂質シグナルが存在したが（１ｐｐｍ Ｈ周囲のこぶ）、これは、この炭水化物が、細胞膜に付着したリポテイコ酸であることを示唆している。この脂質をさらには分析しなかった。非グリコシル化構造が目立ち（Ｇｒｏ１）、グリコシル化したもの（Ｇｒｏ２＋Ｇｒｏ３）とほぼ等しい割合で存在する。単糖および二糖修飾単位は、等しい割合で存在した（Ｇｒｏ２＝Ｇｒｏ３）。単糖間の接続を、ＮＯＥ相関（Ａ１：Ｇｒｏ３−２；Ｂ１：Ｇｒｏ２−２；Ｃ１：Ａ１，２）および^１３Ｃ化学シフトに基づき同定した。^１Ｈ−^３１Ｐ ＨＭＱＣによって、グリセロールＨ−１とＨ−３との間の相関が^３１Ｐで０．４ｐｐｍにて示された（図６）。３−Ｇｒｏ−１Ｐ−単位は、ポリマー末端に存在し得る。高分子量ＳＥＣ画分におけるこのリポテイコ酸の存在は、そのミセル様性質（ｍｉｃｅｌｌｕｌａｒｎａｔｕｒｅ）を反映している。ＰＡＧＥ分析によって、Ｐｆ３は、ＳＤＳ界面活性剤が存在する状態で、低分子量化合物として移動することが確認された。構造は同一であるが、脂質尾部を有さない化合物も、ＡＥＣによって、ＳＥＣ貯留物３および４から精製した。

【0231】

【表4】

【0232】

【化15】

【0233】

（実施例９）
Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ４多糖の構造分析
Ｐｆ４炭水化物を、ＡＥＣから１．２Ｍ ＮａＣｌで溶離したＳＥＣ貯留物３および４から回収した。試料は不均質で、ヘテロ七量体繰り返し構造を有する主なヘテログリカンを少量のラムナンおよびペプチド夾雑物と共に含有した。不均質性は、２個の非化学量論的グルコース残基のＮＭＲ分析による存在によって明白であった。少量のポリマーは、３個のＲｈａ繰り返し単位から明らかに作製されている。さらにアニオン交換（保持）およびＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（ボイド容量で溶離）によってそれらを精製することは不可能であったので、これらの少量の夾雑物は、主な多糖に共有結合し得る。単糖組成分析によって、約１：３：３の比のＲｈａ、Ｇｌｃ、およびＧａｌが同定された。試料（図７）および得られた断片（以下）のＮＭＲ分析によって、次の構造が導かれ、側鎖Ｇｌｃは、残基ＨおよびＤに結合していた：

【0234】

【化16】

【0235】

Ｈ’およびＤ’は一置換されている。Ｇｌｃ ＡおよびＢは約５０％である。Ｌｅｇは、すべてアキシアル位の環プロトン（大きな結合定数、約１０Ｈｚ）およびＨ／Ｃ７−９のＮＭＲシフトを有するレジオナミン酸（５，７−ジアセトアミド−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌロソン酸）である。０．５Ｍ ＴＦＡ（９０℃、１．５時間）での部分的な酸性加水分解によって、オリゴ糖の混合物と、ＰＦ４のすべて未同定の成分を含有するより高い分子質量ピークとが生じた。少量のラムナンは回収されず、おそらく完全に脱重合された。オリゴ糖をアニオン交換クロマトグラフィーによって分離して、中性の混合物ＯＳ１および酸性の二糖ＯＳ２を得た：

【0236】

【化17】

【0237】

ＯＳ１は、Ｇｌｃ ＡおよびＧａｌ Ｇでの部分的な置換によって不均質であった（Ｇａｌ Ｇは、加水分解によって部分的に喪失された）。ＯＳ１のＮＭＲスペクトルは全般的に、予想と一致し、詳細な割り当ては、存在する変異体が多すぎるので行わなかった。ＭＳ（負イオン）によって、Ｈｅｘ２ＨｅｘＮＡｃ１（ｍ／ｚ５４４．６）、Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ１（ｍ／ｚ７０６．７）、およびＨｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ１（ｍ／ｚ８６８．８）が示された。Ｐｆ４ ＯＳ２についてのＮＭＲデータを表４に示す。ネガティブモードＥＳ ＭＳ ｍ／ｚ４９５．４（計算分子質量４９６．１９）。Ｇｌｃ、Ｇａｌ、ＧａｌＮの配置を決定し、すべてＤであることを見出した。内部イノシトールを用いる酢酸アルジトールのＧＣ分析によって、この主なＰｆ４多糖は、夾雑物に対して試料質量の約８０％を占めていることが示される。

【0238】

【表5】

【0239】

【化18】

【0240】

Ｐｆ２抗原と比較したＰｆ４の相対純度を評価するために、２Ｄ−ＨＳＱＣメチル基ＮＭＲスペクトルを比較した。これらのスペクトルの間で重複は検出されなかったので、本発明者らは、この試料が、抗原相互汚染（図８）を比較的含まないと結論付ける。

【0241】

（実施例１０）
株Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）から同定された類似の多糖（Ｐｆ１１〜Ｐｆ１４）
ＴＸ００１６（ＤＯ）株について上記したのと同じ精製スキームを使用して、Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）として知られている第２のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）臨床株から多糖を単離した。Ｐｆ１、Ｐｆ３、およびＰｆ４と同一のＮＭＲスペクトルを有する多糖が同定され、それぞれＰｆ１１、Ｐｆ１３、およびＰｆ１４と名付けた（図９）。しかしながら、Ｐｆ２に類似した多糖は、使用した培養および単離条件下では存在しなかった。代わりに、Ｐｆ２に類似したＳＥＣおよびＡＥＣ特性を有するが、Ｐｆ４にマッチするＮＭＲスペクトルを有するＰｆ１２と名付けた炭水化物が単離された。Ｐｆ１２は、ＳＥＣからＰｆ１４よりも早く溶離したためであった。

【0242】

ＴＸ００１６およびＥ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株から精製したＰｆ１〜Ｐｆ４収量のまとめを表５に示す。構造的に同等の多糖Ｐｆ４（ＴＸ００１６）およびＰｆ１２／Ｐｆ１４（Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））は、Ｐｆ１／ Ｐｆ１１（レバン）、Ｐｆ２およびＰｆ３／Ｐｆ１３（ＬＴＡ）抗原よりも高い収量で回収された。

【0243】

【表6】

【0244】

（実施例１１）
抗原ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの調製
シアニル化手順および１−シアノ−４−ジメチルアミノ−ピリジニウムテトラフルオロボラート（ＣＤＡＰ）試薬を使用して、Ｐｆ１、Ｐｆ２、およびＰｆ４のＣＲＭ_１９７担体タンパク質コンジュゲートを調製した。ＣＤＡＰは、シアナート基を炭水化物ヒドロキシル基に導入し、これは、タンパク質担体のアミノ基と共に共有結合を形成し得る。ＰＳ抗原（水１ｍｌ中の５ｍｇ）をＣＤＡＰ（アセトニトリル中１００ｍｇ／ｍｌ ５０μｌ）と室温にて合わせ、３０秒間にわたって混合した。０．２Ｍ ＴＥＡ５０μｌを加え、反応物を穏やかに２分間にわたって混合した。等体積のＣＲＭ_１９７（ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｍｇ／ｍｌ）を導入し、混合物を室温にて１６時間撹拌した。反応混合物を１００ｋＤａ ＭＷＣＯスピン透析管に移し、０．９％ＮａＣｌ中で３回洗浄した。最後の２ｍｌ体積をＳＥＣカラムに適用して、遊離担体タンパク質を除去し、未コンジュゲートの遊離多糖の分集団に対して、コンジュゲートされた多糖を濃縮した。遊離多糖よりも先に溶離する、コンジュゲートに対応する画分を貯留し、その炭水化物およびペプチド含有量を定量化した。

【0245】

（実施例１２）
抗血清の調製
ウサギに、１×１０^８熱死滅細菌およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）アジュバント（ＣＳＬ）１００μｇを０、４、および６週目に皮下注射することによって、ＴＸ００１６（ＤＯ）株に対して生じるポリクローナルな全細胞抗血清を調製した。細胞は、６５℃で４５分間にわたって加熱することによって死滅させた。８週目にウサギから採血したが、３匹の動物すべてが、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイにおいて強い応答を示した（データは図示せず）（精製抗原に対するＥＬＩＳＡ力価については図１２を参照されたい）。

【0246】

精製炭水化物に対して特異的な抗血清を生じさせるために、ウサギ３〜４匹からなる群に、コンジュゲートさせた多糖２５μｇおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）１００μｇを０、６、および８週目に筋肉内注射した。１０週目にウサギから採血し、精製抗原に対するＥＬＩＳＡ力価を決定した（図１２を参照されたい）。未コンジュゲートのＰｆ３ ＬＴＡ抗原についてのワクチン接種スケジュールは、１００μｇをＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ１００μｇと共に０週目および１週目に皮下注射し、続いて、１０μｇ（アジュバントなし）を２〜４週目に週１回で３回静脈注射することを含んだ。５週目にウサギから採血し、精製抗原に対するＥＬＩＳＡ力価を決定した。Ｐｆ１、Ｐｆ２、およびＰｆ４ ＥＬＩＳＡでは、５μｇ／ｍｌ抗原を、ｐＨ１０．０炭酸水素塩コーティング緩衝液中で、高結合マイクロタイタープレートに適用し、０日目およびワクチン接種後の検査採血時点で試料採取した動物由来の連続希釈した血清で調査した。Ｐｆ３ ＬＴＡ血清力価を測定するＥＬＩＳＡのために、１μｇ／ｍｌ抗原を、マイクロプレートコーティング用の１μｇ／ｍｌメチル化ヒト血清アルブミンと合わせて、結合を改善した。ＫＰＬ製のＨＲＰ検出キットを使用して、ＥＬＩＳＡを展開した。

【0247】

Ｐｆ１およびＰｆ２コンジュゲートに対して生じた抗血清では、４匹のウサギすべてが応答し、最大半量結合活性は、１：５００〜１：１０００の範囲の血清希釈で観察された。ＣＲＭ_１９７−Ｐｆ４抗血清では、ワクチン接種された３匹のウサギすべてが応答し、最大半量結合活性は、１：３０００〜１：１０，０００の範囲の血清希釈で観察された。Ｐｆ３ ＬＴＡ抗血清の活性は、炭水化物コンジュゲートに対して誘発された抗血清よりも著しく低く、４匹のウサギすべてが、最大半量血清力価を１：１００〜１：５００の希釈範囲で示した。比較すると、マッチさせた免疫前血清の最大の非特異的ＥＬＩＳＡ結合活性は無視できるものであり、１：１００超の希釈で、免疫血清の活性の５％未満であった。

【0248】

（実施例１３）
フローサイトメトリー
ウサギ抗血清およびマッチさせた採血前（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）対照血清を、フローサイトメトリー検出のための一次抗体として使用した。一晩細菌培養物を１×ＰＢＳ中で洗浄し、加熱（４５分、６５℃）によって死滅させた。次いで、細胞を２％ＢＳＡ／ＰＢＳで、室温にて１時間にわたってブロックした。ＰＢＳ中で洗浄した後に、細胞を、一次ウサギ抗体を含むＰＢＳ中の２％ＢＳＡに再懸濁させ、室温にて１時間インキュベートした。洗浄した後に、フィコエリトリンコンジュゲートさせたロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ＰＡ）での二次標識を続けた。細菌細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ）で分析した。ＰＥチャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を各試料で決定した（２０，０００イベントをカウント）。

【0249】

Ｐｆ１〜Ｐｆ４抗血清で調査したＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株ＴＸ００１６およびＥ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）のフローサイトメトリー分析を図１０に示す。特異的な血清によって検出された抗原の表面染色を、マッチさせた免疫前血清対照と比較する（コンジュゲートに対して生じた血清では１：５００希釈；Ｐｆ３ ＬＴＡ血清では１：４００希釈）。インビボ成長条件下では、抗原を精製した株であるＴＸ００１６の表面上で、Ｐｆ１多糖は有意なレベルで発現されなかった。Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株表面で検出された低レベルのＰｆ１活性は、マッチさせた免疫前対照で検出されたものとは有意に異ならなかった。高レベルのＰｆ２抗原がＴＸ００１６（ＤＯ）上で検出されたが、株Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）上では検出されなかった。Ｐｆ３およびＰｆ４（それぞれＰｆ１３およびＰｆ１２／１４）に等しい実質的なレベルの多糖が、株Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）上で検出された。

【0250】

Ｐｆ１〜Ｐｆ４抗血清で調査した追加のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株のフローサイトメトリー分析を以下の表５に示す。さらに、図１３は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）１，２３１，５０２上で発現されたＰｆ１〜Ｐｆ４多糖のフローサイトメトリー分析を示している。

【0251】

【表7】

【0252】

【表8】

【0253】

（実施例１４）
ＨＬ−６０オプソニン作用アッセイ
Ｐｆ１〜Ｐｆ４抗原をそこから精製した同じ発酵から、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ）およびＥ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の凍結前細菌ストックを調製した。細胞をペレット化し、１ｍｌ当たり１ＯＤ_６００単位の濃度まで、ＤＰＢＳ２０％グリセロール中に懸濁させ、凍結させた。解凍した細胞を１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌまで、ＯＰＡ緩衝液（ハンクス平衡塩溶液、０．１％ゼラチン、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２）中で希釈し、１０μｌ（１０^３ＣＦＵ）を、連続希釈した血清１０μｌで、４℃にて１時間にわたって、Ｕ底組織培養マイクロプレート内でオプソニン化した。その後、補体１０μｌ（Ｂａｂｙ Ｒａｂｂｉｔ Ｓｅｒｕｍ、Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ）およびＨＬ−６０細胞２０μｌ（０．５×１０^７／ｍｌ）を加え、混合物を３００ｒｐｍ、３７℃にて１時間にわたって、５％ＣＯ_２インキュベーター中で振盪した。各反応物５０μｌのうちの１０μｌを、水２００μｌを含有する予め湿らせておいたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ ＨＶフィルタープレートの対応するウェルに移した。液体を減圧濾過した後に、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロス（２％グルコースを含む）１５０μｌを適用し、濾過し、プレートを３７℃にて一晩インキュベートした。翌日、クマシー染料で染色した後に、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）分析器およびＩｍｍｕｎｏＣａｐｔｕｒｅソフトウェアを使用して、コロニーを数えた。あらゆる検出可能なＯＰＡ活性の特異性を確立するために、オプソニン作用ステップの前に、免疫血清を２０μｇ／ｍｌ精製抗原と共にプレインキュベートした。ＯＰＡアッセイは、観察されるいずれの死滅も、これらの成分に依存していることを実証するために、好中球様ＨＬ６０または補体を伴わない対照反応を含む。

【0254】

熱死滅ＴＸ００１６（ＤＯ）に対して生じた抗血清は、ＯＰＡアッセイにおいて殺菌活性を示し得なかった。対照的に、抗原特異的オプソニン活性が、Ｐｆ２、Ｐｆ３およびＰｆ４抗血清について検出された（図１１）。Ｐｆ２特異的抗血清は、ＴＸ００１６（ＤＯ）株に対しては活性を示したが、使用した発酵条件下でＰｆ２多糖を産生しないＥ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対しては示さなかった。Ｐｆ３およびＰｆ４抗血清は、Ｅ１５５（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）株に対しては活性を示したが、これらの抗原が細菌表面上に存在するにも関わらず、ＴＸ００１６に対しては示さなかった。Ｐｆ１抗血清は、検査したＯＰＡ条件下で、これらの株を死滅させることはできなかった。抗原特異的オプソニン活性は、追加のＥ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）株に対するＰｆ２、Ｐｆ３、およびＰｆ４抗血清についてのオプソニン作用アッセイによっても検出された。以下の表６を参照されたい。表６では、観察されたＯＰＡ活性は、フローサイトメトリーによって決定された相対発現レベルに重ねた網掛けのセル（表５においてと同じ）によって表されている。

【0255】

さらに、図１４は、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｐｆ２およびＰｆ４抗原によって誘導される抗血清のオプソニン作用活性を示している。より具体的には、図１４は、株１，２３１，５０２（‘５０２）に対する、Ｅ．フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）多糖−コンジュゲートであるＰｆ２−ＣＲＭ_１９７およびＰｆ４−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの活性を示している。図１４のパネルＡは、株‘５０２に対するＰｆ２血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ２によって逆転されることを示している。図１４のパネルＢおよびパネルＣは、株‘５０２に対するＰｆ４血清のＯＰＡ活性が２０μｇ／ｍｌ Ｐｆ４によって逆転されることを示している。パネルＢは、凡例の最後のボックスに誤植を含み、これは、「Ｐｆ４後＋Ｐｆ２」ではなく「Ｐｆ４後＋Ｐｆ４」と示されているべきである。図１４のパネルＣは図１４のパネルＢと同一であるが、訂正された凡例を含む。図１４のパネルＡ、パネルＢ、およびパネルＣ中の「ＨＩ Ｃ’」は、熱不活化補体を指す。

【0256】

【表9】

【0257】

（実施例１５）
本明細書に記載の糖に結合する抗体の調製
本実施例では、多糖Ｐｆ１、Ｐｆ２、Ｐｆ３、Ｐｆ４などの本明細書に記載の糖、ならびに／またはそのイムノコンジュゲートおよび／もしくはその免疫原性組成物に特異的に結合し得るモノクローナル抗体の調製物を説明する。

【0258】

モノクローナル抗体を生産するための技法は当技術分野で知られている。利用することができる免疫原には、本明細書に記載の精製糖、本明細書に記載の糖を含有するイムノコンジュゲート、および本明細書に記載の糖を細胞表面上に発現する細胞が含まれる。当業者であれば、過度に実験することなく、免疫原を選択することができる。

【0259】

Ｂａｌｂ／ｃなどのマウスを、完全フロイントアジュバント中で乳化されていて、１〜１００マイクログラムの量で皮下または腹腔内注射される免疫原で免疫化する。別法では、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）中で乳化し、動物の後足肉趾に注射する。次いで、免疫化マウスを１０〜１２日後に、選択されたアジュバント中で乳化させた追加の免疫原で追加免疫する。その後、数週間にわたって、マウスを、追加の免疫化注射で追加免疫することもできる。抗糖抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイにおいて検査するために、眼窩後方採血によってマウスから血清試料を定期的に得ることができる。

【0260】

適切な抗体力価が検出された後に、抗体について「陽性」の動物に、免疫原の最後の静脈内注射を注射することができる。３〜４日後に、マウスをと殺し、脾臓細胞を採取する。次いで、脾臓細胞を、ＡＴＣＣ、Ｎｏ．ＣＲＬ １５９７から入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１などの選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させる（３５％ポリエチレングリコールを使用）。この融合によって、ハイブリドーマ細胞が生じ、次いで、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するためにＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）培地を含有する９６ウェル組織培養プレートに播種することができる。

【0261】

ハイブリドーマ細胞を、糖に対する反応性についてＥＬＩＳＡにおいてスクリーニングする。糖に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当技術分野における技能の範囲内である。

【0262】

陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射して、抗糖モノクローナル抗体を含有する腹水を生じさせることができる。別法では、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコまたはローラーボトル中で成長させることができる。腹水中に生じたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈殿、続いて、ゲル排除クロマトグラフィーを使用して達成することができる。別法では、抗体とタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇとの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーを利用することができる。

【0263】

本発明の態様
次の条項において、本発明の追加の実施形態を記載する：
Ｃ１． レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む単離多糖。
Ｃ２． 前記レジオナミン酸部分が前記グルコース部分に結合している、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ３． 前記レジオナミン酸部分が前記ガラクトース部分に結合している、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ４． 前記レジオナミン酸部分が前記Ｎ−アセチルガラクトサミン部分に結合している、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ５． 前記レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分が１：１：２：３のモル比で存在する、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ６．

【0264】

【化19】

［式中、Ｌｅｇはレジオナミン酸部分であり、Ｇａｌはガラクトース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ７． ｎが約４０から約６０の間である、条項Ｃ６の多糖。
Ｃ８． 前記多糖の分子量が約６０ｋＤａから約１００ｋＤａの間である、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ９． 図７に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１０． 分枝している、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１１． グラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１２． エンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ１１の多糖。
Ｃ１３． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ１２の多糖。
Ｃ１４． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ１３の多糖。
Ｃ１５． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ１３の多糖。
Ｃ１６． 細胞表面多糖である、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１７． 莢膜多糖である、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１８． 免疫原性である、条項Ｃ１の多糖。
Ｃ１９． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１８の多糖。
Ｃ２０． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１８の多糖。
Ｃ２１． レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む分枝多糖。
Ｃ２２． 前記レジオナミン酸部分が前記グルコース部分に結合している、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２３． 前記レジオナミン酸部分が前記ガラクトース部分に結合している、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２４． 前記レジオナミン酸部分が前記Ｎ−アセチルガラクトサミン部分に結合している、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２５． 前記レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分が１：１：２：３のモル比で存在する、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２６．

【0265】

【化20】

［式中、Ｌｅｇはレジオナミン酸部分であり、Ｇａｌはガラクトース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２７． ｎが約４０から約６０の間である、条項Ｃ２２の多糖。
Ｃ２８． 前記多糖の分子量が約６０ｋＤａから約１００ｋＤａの間である、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ２９． 図７に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ３０． グラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ３１． エンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ３０の多糖。
Ｃ３２． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ３１の多糖。
Ｃ３３． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ３２の多糖。
Ｃ３４． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ３２の多糖。
Ｃ３５． 細胞表面多糖である、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ３６． 莢膜多糖である、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ３７． 免疫原性である、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ３８． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ３７の多糖。
Ｃ３９． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ３７の多糖。
Ｃ４０． 化学的に合成されている、条項Ｃ２１の多糖。
Ｃ４１． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖がレジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分を含む、免疫原性組成物。
Ｃ４２． 前記レジオナミン酸部分が前記グルコース部分に結合している、条項Ｃ４１の多糖。
Ｃ４３． 前記レジオナミン酸部分が前記ガラクトース部分に結合している、条項Ｃ４１の多糖。
Ｃ４４． 前記レジオナミン酸部分が前記Ｎ−アセチルガラクトサミン部分に結合している、条項Ｃ４１の多糖。
Ｃ４５． 前記レジオナミン酸部分、Ｎ−アセチルガラクトサミン部分、ガラクトース部分、およびグルコース部分が１：１：２：３のモル比で存在する、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ４６． 前記多糖が、

【0266】

【化21】

［式中、Ｌｅｇはレジオナミン酸部分であり、Ｇａｌはガラクトース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ４７． ｎが約４０から約６０の間である、条項Ｃ４２の組成物。
Ｃ４８． 前記多糖の分子量が約６０ｋＤａから約１００ｋＤａの間である、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ４９． 前記多糖が図７に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５０． 前記多糖が分枝している、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５１． 前記多糖がグラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５２． 前記多糖がエンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ５１の組成物。
Ｃ５３． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ５２の組成物。
Ｃ５４． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ５３の組成物。
Ｃ５５． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ５３の組成物。
Ｃ５６． 前記多糖が細胞表面多糖である、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５７． 前記多糖が莢膜多糖である、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５８． 前記多糖が化学的に合成されている、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ５９． 前記多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ４１の組成物。
Ｃ６０． 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、条項Ｃ５９の組成物。
Ｃ６１． 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ６０の組成物。
Ｃ６２． アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む単離多糖。
Ｃ６３． 前記アルトルロン酸部分が前記フコース部分に結合している、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ６４． 前記フコース部分がグルコース部分に結合している、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ６５． 前記アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分が１：４：２のモル比で存在する、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ６６．

【0267】

【化22】

［式中、Ｆｕｃはフコース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＡｌｔＡはアルトルロン酸部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ６７． ｎが約２８０から約３００の間である、条項Ｃ６３の多糖。
Ｃ６８． 前記多糖の分子量が約２５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間である、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ６９． 図２に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７０． 分枝している、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７１． グラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７２． エンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ７１の多糖。
Ｃ７３． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ７２の多糖。
Ｃ７４． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ７３の多糖。
Ｃ７５． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ７３の多糖。
Ｃ７６． 細胞表面多糖である、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７７． 莢膜多糖である、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７８． 免疫原性である、条項Ｃ６２の多糖。
Ｃ７９． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ７８の多糖。
Ｃ８０． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ７８の多糖。
Ｃ８１． アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む分枝多糖。
Ｃ８２． 前記アルトルロン酸部分が前記フコース部分に結合している、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８３． 前記フコース部分がグルコース部分に結合している、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８４． 前記アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分が１：４：２のモル比で存在する、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８５．

【0268】

【化23】

［式中、Ｆｕｃはフコース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＡｌｔＡはアルトルロン酸部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８６． ｎが約２８０から約３００の間である、条項Ｃ８５の多糖。
Ｃ８７． 前記多糖の分子量が約２５０ｋＤａおよび約３５０ｋＤａの間である、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８８． 図２に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ８９． グラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ９０． エンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ８９の多糖。
Ｃ９１． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ９０の多糖。
Ｃ９２． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ９１の多糖。
Ｃ９３． エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ９１の多糖。
Ｃ９４． 細胞表面多糖である、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ９５． 莢膜多糖である、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ９６． 免疫原性である、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ９７． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ９６の多糖。
Ｃ９８． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ９６の多糖。
Ｃ９９． 化学的に合成されている、条項Ｃ８１の多糖。
Ｃ１００． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖がアルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分を含む免疫原性組成物。
Ｃ１０１． 前記アルトルロン酸部分が前記フコース部分に結合している、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０２． 前記フコース部分がグルコース部分に結合している、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０３． 前記アルトルロン酸部分、フコース部分、およびグルコース部分が１：４：２のモル比で存在する、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０４． 前記多糖が、

【0269】

【化24】

［式中、Ｆｕｃはフコース部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ＡｌｔＡはアルトルロン酸部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造の繰り返し単位を含む、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０５． ｎが約２８０から約３００の間である、条項Ｃ１０４の組成物。
Ｃ１０６． 前記多糖の分子量が約２５０ｋＤａから約３５０ｋＤａの間である、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０７． 前記多糖が図２に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０８． 前記多糖が分枝している、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１０９． 前記多糖がグラム陽性球菌多糖である、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１１０． 前記多糖がエンテロコッカス属多糖である、条項Ｃ１０９の組成物。
Ｃ１１１． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）多糖である、条項Ｃ１１０の組成物。
Ｃ１１２． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、条項Ｃ１１１の組成物。
Ｃ１１３． 前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、条項Ｃ１１１の組成物。
Ｃ１１４． 前記多糖が細胞表面多糖である、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１１５． 前記多糖が莢膜多糖である、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１１６． 前記多糖が化学的に合成されている、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１１７． 前記多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ１００の組成物。
Ｃ１１８． 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、条項Ｃ１１７の組成物。
Ｃ１１９． 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ１１８の組成物。
Ｃ１２０． グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む単離多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である単離多糖。
Ｃ１２１． グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む単離多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である単離多糖。
Ｃ１２２． 前記繰り返し単位が、

【0270】

【化25】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の組成物。
Ｃ１２３． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１２２の多糖。
Ｃ１２４． 前記繰り返し単位が、

【0271】

【化26】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の組成物。
Ｃ１２５． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１２４の多糖。
Ｃ１２６． 前記多糖の分子量が約１０ｋＤａから２０ｋＤａの間である、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の多糖。
Ｃ１２７． 図６に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の多糖。
Ｃ１２８． 細胞表面多糖である、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の多糖。
Ｃ１２９． 莢膜多糖である、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の多糖。
Ｃ１３０． 免疫原性である、条項Ｃ１２０またはＣ１２１の多糖。
Ｃ１３１． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１３０の多糖。
Ｃ１３２． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１３０の多糖。
Ｃ１３３． グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む分枝多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である分枝多糖。
Ｃ１３４． グリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含む分枝多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である分枝多糖。
Ｃ１３５． 前記繰り返し単位が、

【0272】

【化27】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１３６． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１３５の多糖。
Ｃ１３７． 前記繰り返し単位が、

【0273】

【化28】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１３８． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１３７の多糖。
Ｃ１３９． 前記多糖の分子量が約１０ｋＤａから２０ｋＤａの間である、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４０． 図６に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４１． 細胞表面多糖である、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４２． 莢膜多糖である、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４３． 免疫原性である、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４４． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１４３の多糖。
Ｃ１４５． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１４３の多糖。
Ｃ１４６． 化学的に合成されている、条項Ｃ１３３またはＣ１３４の多糖。
Ｃ１４７． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖がグリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含み、前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である免疫原性組成物。
Ｃ１４８． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖がグリセロールホスファート部分およびグルコース部分の繰り返し単位を含み、前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である免疫原性組成物。
Ｃ１４９． 前記繰り返し単位が、

【0274】

【化29】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５０． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１４９の組成物。
Ｃ１５１． 前記繰り返し単位が、

【0275】

【化30】

［式中、Ｇｒｏ−１Ｐはグリセロールホスファート部分であり、Ｇｌｃはグルコース部分であり、ｎは１〜１０００の整数である］によって表される構造を含む、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５２． ｎが約８０から約１００の間である、条項Ｃ１５１の組成物。
Ｃ１５３． 前記多糖の分子量が約１０ｋＤａから２０ｋＤａの間である、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５４． 前記多糖が、図６に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５５． 前記多糖が細胞表面多糖である、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５６． 前記多糖が莢膜多糖である、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５７． 前記多糖が化学的に合成されている、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５８． 前記多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ１４７またはＣ１４８の組成物。
Ｃ１５９． 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、条項Ｃ１５８の組成物。
Ｃ１６０． 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ１５９の組成物。
Ｃ１６１． −６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む単離多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である単離多糖。
Ｃ１６２． −６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む単離多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である単離多糖。
Ｃ１６３． 前記繰り返し単位が［−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２］ｎ（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分であり、ｎは１０００〜１００，０００の整数である）を含む、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１６４． ｎが約３５，０００から約４５，０００の間である、条項Ｃ１６３の多糖。
Ｃ１６５． 前記多糖の分子量が約１０，０００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間である、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１６６． 図１に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１６７． 細胞表面多糖である、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１６８． 莢膜多糖である、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１６９． 免疫原性である、条項Ｃ１６１またはＣ１６２の多糖。
Ｃ１７０． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１６９の多糖。
Ｃ１７１． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１６９の多糖。
Ｃ１７２． −６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である、多糖。
Ｃ１７３． −６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含む多糖であって、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である、多糖。
Ｃ１７４． 前記繰り返し単位が、［−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２］ｎ（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分であり、ｎは１０００から１００，０００の整数である）を含む、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１７５． ｎが約３５，０００から約４５，０００の間である、条項Ｃ１７４の多糖。
Ｃ１７６． 前記多糖の分子量が約１０，０００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間である、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１７７． 図１に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１７８． 細胞表面多糖である、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１７９． 莢膜多糖である、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１８０． 免疫原性である、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１８１． オプソニン活性を有する免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１８０の多糖。
Ｃ１８２． 殺菌免疫応答を誘導し得る、条項Ｃ１８０の多糖。
Ｃ１８３． 化学的に合成されている、条項Ｃ１７２またはＣ１７３の多糖。
Ｃ１８４． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖が−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含み、前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）多糖である免疫原性組成物。
Ｃ１８５． 有効量の多糖と、薬学的に許容できる賦形剤とを含む免疫原性組成物であって、前記多糖が−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分である）の繰り返し単位を含み、前記多糖がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５多糖である免疫原性組成物。
Ｃ１８６． 前記繰り返し単位が［−６−β−Ｄ−Ｆｒｕｆ−２］ｎ（式中、Ｆｒｕはフルクトース部分であり、ｎは１０００〜１００，０００の整数である）を含む、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１８７． ｎが約３５，０００から約４５，０００の間である、条項Ｃ１８６の組成物。
Ｃ１８８． 前記多糖の分子量が約１０，０００ｋＤａから２０，０００ｋＤａの間である、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１８９． 前記多糖が、図１に示されているとおりのＮＭＲスペクトルを有する、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１９０． 前記多糖が細胞表面多糖である、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１９１． 前記多糖が莢膜多糖である、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１９２． 前記多糖が化学的に合成されている、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１９３． 前記多糖が担体タンパク質にコンジュゲートされている、条項Ｃ１８４またはＣ１８５の組成物。
Ｃ１９４． 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、条項Ｃ１９３の組成物。
Ｃ１９５． 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ１９４の組成物。
Ｃ１９６． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれか一条項のとおりの少なくとも２種の多糖を含む組成物。
Ｃ１９７． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの少なくとも３種の単離多糖を含む、条項Ｃ１９６による組成物。
Ｃ１９８． 条項Ｃ１〜４０のいずれか一条項のとおりの少なくとも１種の多糖と、条項Ｃ６２〜Ｃ９９のいずれか一条項のとおりの少なくとも１種の多糖と、条項Ｃ１２０〜Ｃ１４６のいずれか一条項のとおりの少なくとも１種の多糖と、条項Ｃ１６１〜Ｃ１８３のいずれか一条項のとおりの少なくとも１種の多糖とを含む、条項Ｃ１９６による組成物。
Ｃ１９９． 各多糖が担体分子にコンジュゲートされている、条項Ｃ１９６による組成物。
Ｃ２００． 前記担体分子が担体タンパク質である、条項Ｃ１９９による組成物。
Ｃ２０１． 前記担体タンパク質が、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ_１９７、破傷風トキソイド、コレラトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性トキソイド（ＬＴ）、ニューモリシントキソイド、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質Ａ（ＰｓａＡ）、連鎖球菌属のＣ５ａペプチダーゼ、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、およびシュードモナス外毒素、またはその誘導体からなる群から選択されるタンパク質である、条項Ｃ２００による組成物。
Ｃ２０２． 前記担体タンパク質がＣＲＭ_１９７である、条項Ｃ２０１による組成物。
Ｃ２０３． 薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、条項Ｃ１９６による組成物。
Ｃ２０４． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの有効量の多糖を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法。
Ｃ２０５． 前記免疫応答がグラム陽性球菌に対するものである、条項Ｃ２０４の方法。
Ｃ２０６． 前記免疫応答がエンテロコッカス属に対するものである、条項Ｃ２０５の方法。
Ｃ２０７． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの多糖を含む有効量の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法。
Ｃ２０８． 前記組成物が、条項Ｃ４１〜Ｃ６１、Ｃ１００〜Ｃ１１９、Ｃ１４７〜Ｃ１６０、またはＣ１８４〜Ｃ１９５のいずれかのとおりの組成物を含む、条項Ｃ２０７の方法。
Ｃ２０９． 前記免疫応答が、グラム陽性球菌に対するものである、条項Ｃ２０７の方法。
Ｃ２１０． 前記免疫応答が、エンテロコッカス属に対するものである、条項Ｃ２０９の方法。
Ｃ２１１． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの単離多糖を生産する方法であって、前記多糖を産生する能力を有するグラム陽性球菌を培養するステップと；前記細菌によって産生された多糖を収集するステップとを含む方法。
Ｃ２１２． 前記グラム陽性球菌がエンテロコッカス属である、条項Ｃ２１１の方法。
Ｃ２１３． 前記グラム陽性球菌がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）である、条項Ｃ２１２の方法。
Ｃ２１４． 前記グラム陽性球菌がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）ＴＸ００１６（ＤＯ；Ｅ１７９４）である、条項Ｃ２１３の方法。
Ｃ２１５． 前記グラム陽性球菌がエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）Ｅ０１５５である、条項Ｃ２１３の方法。
Ｃ２１６． 試料中のグラム陽性球菌を検出する方法であって、条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの多糖を接触させるステップと；抗体−抗原コンジュゲート複合体を検出するステップとを含み、前記抗体−抗原複合体が存在することは、グラム陽性球菌が前記試料中に存在することを示す、方法。
Ｃ２１７． 条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの多糖に特異的に結合する単離抗体またはその断片。
Ｃ２１８． 条項Ｃ２１７のとおりの単離抗体またはその断片を含む組成物。
Ｃ２１９． グラム陽性球菌を試料中で検出する方法であって、条項Ｃ２１７のとおりの抗体を接触させるステップと；抗体−抗原コンジュゲート複合体を検出するステップとを含み、前記抗体−抗原複合体が存在することは、グラム陽性球菌が前記試料中に存在することを示す、方法。
Ｃ２２０． 単離抗体またはその抗体断片を生産する方法であって、条項Ｃ１〜Ｃ４０、Ｃ６２〜Ｃ９９、Ｃ１２０〜Ｃ１４６、またはＣ１６１〜Ｃ１８３のいずれかのとおりの有効量の多糖を哺乳動物に投与するステップと；前記哺乳動物によって産生された前記抗体またはその断片を単離するステップとを含む方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【国際調査報告】