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特表2015-527067Ｎ末端リシンを包有する組換タンパク質を製造する新規の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2015-527067(P2015-527067A)
(43)【公表日】2015年9月17日
(54)【発明の名称】Ｎ末端リシンを包有する組換タンパク質を製造する新規の方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20150821BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20150821BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20150821BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20150821BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20150821BHJP
C07K 14/33 20060101ALI20150821BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20150821BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20150821BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20150821BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/00 101
C07K14/33
A61K37/02
A61P21/02
A61P25/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2015-527810(P2015-527810)
(86)(22)【出願日】2013年8月20日
(85)【翻訳文提出日】2015年2月20日
(86)【国際出願番号】EP2013002506
(87)【国際公開番号】WO2014029497
(87)【国際公開日】20140227
(31)【優先権主張番号】12005953.0
(32)【優先日】2012年8月20日
(33)【優先権主張国】EP
(31)【優先権主張番号】61/684,948
(32)【優先日】2012年8月20日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ
(71)【出願人】
【識別番号】512042433
【氏名又は名称】メルツ ファーマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディト ゲゼルシャフト アウフ アクティーン
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100077517
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 敬
(74)【代理人】
【識別番号】100087871
【弁理士】
【氏名又は名称】福本 積
(74)【代理人】
【識別番号】100087413
【弁理士】
【氏名又は名称】古賀 哲次
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(72)【発明者】
【氏名】ユルゲン フレベルト
(72)【発明者】
【氏名】ミヒャエル シュミット
(72)【発明者】
【氏名】フレト ホフマン
(72)【発明者】
【氏名】ゲルハルト グロア
【テーマコード（参考）】
4B024
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B024AA01
4B024AA20
4B024BA38
4B024CA04
4B024CA20
4B024DA06
4B024GA11
4B065AA23Y
4B065AA26X
4B065AA71Y
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA06
4C084BA44
4C084CA04
4C084CA53
4C084ZA231
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA14
4H045CA11
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、前駆体タンパク質由来のＮ末端リシンを包有するクロストリジウム神経毒等の組換タンパク質を製造及び取得するための新規の方法に関する。本方法は、Ｐ’１位リシン特異的エンドプロテアーゼによって認識され得るＮ末端モチーフを含む前駆体タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程と、斯かる前駆体タンパク質を前記エンドプロテアーゼで切断する工程とを含む。更に本発明は、斯かる方法に用いられる新規前駆体タンパク質、斯かる前駆体タンパク質をコードする核酸配列、及び、Ｎ末端リシンを包有するクロストリジウム神経毒等の新規組換タンパク質に関する。【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質を生成するための方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーを含む前駆体タンパク質（ここで、Ｘはエンドプロテアーゼ認識配列であり、前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）を、ＸとＬｙｓとの間を特異的に切断するエンドプロテアーゼに接触させ、或いは接触を許容する工程を含む方法。
【請求項2】
前記Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーをコードする核酸配列を、親タンパク質をコードする核酸配列に挿入することにより、前記前駆体タンパク質をコードする組換核酸配列を得る工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記前駆体タンパク質を前記エンドプロテアーゼに接触させ、或いは接触を許容する前に、前記前駆体タンパク質をコードする核酸配列を、宿主細胞内で異種発現させる工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記エンドプロテアーゼがマイタケ（Grifola frondosa）由来のＬｙｓ−Ｎである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
Ｌｙｓ−Ｎが組換Ｌｙｓ−Ｎである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記エンドプロテアーゼ認識配列Ｘが配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）を有する、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記リンカーが配列ＴＫＧｎ（ここで、ｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される）を有する、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記親タンパク質がクロストリジウム神経毒である、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記クロストリジウム神経毒が、（ｉ）ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ、特にボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ及びＥ、特にボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ｅ、又は、（ii）（ｉ）のボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の機能性変異体から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記前駆体タンパク質が大腸菌（E. coli）宿主細胞内で発現される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項11】
Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカー（ここで、Ｘはエンドプロテアーゼ認識配列であり、前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）を含む前駆体タンパク質。
【請求項12】
前記エンドプロテアーゼ認識配列Ｘが配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）を有する、請求項１１に記載の前駆体タンパク質。
【請求項13】
前記リンカーが配列ＴＫＧｎ（ここで、ｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される）を有する、請求項１１又は１２に記載の前駆体タンパク質。
【請求項14】
クロストリジウム神経毒前駆体である、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の前駆体タンパク質。
【請求項15】
前記クロストリジウム神経毒前駆体が、配列番号１〜３の何れか１つに記載の配列を有する、請求項１４に記載の前駆体タンパク質。
【請求項16】
Ｎ末端が配列Ｌｙｓ−リンカー（ここで前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）からなり、特に少なくとも５０アミノ酸残基、特に少なくとも１００アミノ酸残基、特に少なくとも２００アミノ酸残基を含む、組換タンパク質。
【請求項17】
前記リンカーが配列ＴＫＧｎ（ここで、ｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される）を有する、請求項１６に記載の組換タンパク質。
【請求項18】
クロストリジウム神経毒である、請求項１６又は１７に記載の組換タンパク質。
【請求項19】
前記クロストリジウム神経毒が、配列番号４〜６の何れか一つに記載の配列を有する、請求項１８に記載の組換タンパク質。
【請求項20】
請求項１１〜１５の何れか一項に記載の前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、特に前記核酸が配列番号７〜９の何れか一つに記載の配列を有する核酸配列。
【請求項21】
請求項２０に記載の核酸配列を得る方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーをコードする核酸配列を、親タンパク質をコードする核酸配列に挿入する工程を含む方法。
【請求項22】
前記エンドプロテアーゼ認識配列Ｘが配列ＶＲＧＩＩＴＳを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記リンカーが配列ＴＫＧｎ（ここで、ｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される）を有する、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項24】
前記親タンパク質がクロストリジウム神経毒である、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項25】
請求項２０に記載の核酸配列、又は、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法で得られ得る核酸を含むベクター。
【請求項26】
請求項２０に記載の核酸配列、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法で得られ得る核酸、又は、請求項２５に記載のベクターを含む組換宿主細胞。
【請求項27】
請求項１１〜１５の何れか一項に記載の前駆体タンパク質、又は、請求項１６〜１９の何れか一項に記載の前駆体組換タンパク質を生成するための方法であって、請求項２０に記載の核酸配列、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法で得られ得る核酸、又は、請求項２５に記載のベクターを、組換宿主細胞内で発現させ、或いは請求項２６に記載の組換宿主細胞を、前記核酸配列が発現する条件下で培養する工程を含む方法。
【請求項28】
請求項１６〜１９の何れか一項に記載の組換タンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前駆体タンパク質由来のＮ末端リシンを包有するクロストリジウム神経毒等の組換タンパク質を製造及び取得するための新規の方法に関する。本方法は、Ｐ’１位リシン特異的エンドプロテアーゼによって認識され得るＮ末端モチーフを含む前駆体タンパク質をコードする核酸配列を発現する工程と、斯かる前駆体タンパク質を前記エンドプロテアーゼで切断する工程とを含む。更に本発明は、斯かる方法に用いられる新規前駆体タンパク質、斯かる前駆体タンパク質をコードする核酸配列、及び、Ｎ末端リシンを包有するクロストリジウム神経毒等の新規組換タンパク質に関する。
【背景技術】
【0002】
標準の遺伝暗号では、アミノ酸メチオニンは単一のコドン、即ちＡＵＧによりコードされる。ＡＵＧコドンは、タンパク質翻訳の開始を示す共通の開始コドンでもある。従って、真核生物及び始原細菌（archea）では、タンパク質合成は常にメチオニンから開始され、全タンパク質のＮ末端位置にはメチオニンが組み込まれる。細菌では、メチオニンのアミノ基にホルミル基が付加された誘導体Ｎ−ホルミルメチオニン（fMet）が、開始アミノ酸として用いられる。fMetはメチオニンと同じくＡＵＧコドンによりコードされる。当該コドンが翻訳開始に用いられる場合には、fMetが用いられて、新生ポリペプチド鎖の第一のアミノ酸を形成する。同じコドンがｍＲＮＡの更に下流に現れた場合には、通常のメチオニンが組み込まれる。
【0003】
約３分の２のタンパク質では、開始メチオニン又はＮ−ホルミルメチオニンはそれぞれ、翻訳後に切断される。
【0004】
Ｎ末端メチオニンの切除はメチオニル−アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によって触媒されるが、これはポリペプチド鎖の第二のアミノ酸残基の性質に依存する。細菌ではまずペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）によって、Ｎ−ホルミル基が除去されなければならない。Ｎ末端メチオニン除去（ＮＭＥ）は、タンパク質におけるＮ末端アミノ酸の多様性の主な原因となっている。ＮＭＥの結果、タンパク質のＮ末端には、Metの他にも、Gly、Ala、Pro、Cys、Ser、Thr、又はVal残基が存在し得ることになる。第二のアミノ酸がリシンの場合、ＮＭＥは生じない。
【0005】
ＮＭＥは、細菌及び下等真核生物において保存されている重要な経路である。ＮＭＥ専用の成分は全ての生物において特定されている。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸を決定することにより、ＮＭＥはタンパク質代謝回転（turnover）の制御に重要な役割を果たしている。
【0006】
タンパク質のＮ末端アミノ酸は、その半減期を律する重要な因子である。その規則はＮ末端則と呼ばれる。Ｎ末端則はユビキチン化及びプロテアソーム分解に関連し、真核生物及び原核生物の双方に当てはまるが、その程度は異なっている。原核生物と真核生物との間では、タンパク質分解装置は異なるが、基質認識の原理は保存されている。真核生物では、基質認識はＮ−リコグニン（N-recognin）により媒介される。Ｎ−リコグニンはＥ３リガーゼの一種であり、ユビキチンへの共有結合を介して基質を標識することにより、その後のプロテアソーム分解を可能とする。細菌では、Ｎ−リコグニンの基質結合部位と相同性を示すアダプタータンパク質ＣｌｐＳが、基質の不安定化Ｎ末端に結合し、これらを直接ＣｌｐＡＰプロテアーゼに転位する。
【0007】
Ｎ末端アミノ酸のタンパク質代謝回転に対する影響は生物に依存し、Ｎ末端アミノ酸修飾によって調節され得る。更に、デグロン（degrons）と呼ばれる更なる分解シグナルが、ポリペプチド配列内に見出される場合があり、Ｎ末端則に基づくタンパク質半減期の予測を曖昧なものとしている。タンパク質のＮ末端位に存在する場合、バリン、メチオニン、グリシン、プロリン、トレオニン、及びアラニンは、一般に安定化の機能を有すると考えられるのに対して、アルギニン、リシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、グルタミン、及びグルタミン酸は、不安定化の機能を有すると考えられる。
【0008】
細胞タンパク質の半減期は大きく異なる。タンパク質分解によって、異常なタンパク質が除去され、飢餓等のストレスに影響される遊離アミノ酸プールが維持され、更には、ホルモン、抗原、又は他のエフェクターとして機能する生物活性タンパク質断片の生成が可能となる。代謝の不安定性は多くの調節タンパク質が有する性質であり、その濃度は時間や細胞の状態に応じて変動する。タンパク質の半減期が短いと、タンパク質レベルの空間的勾配の形成及び迅速な調節が可能となる。
【0009】
大腸菌（E. coli）等の細菌での発現により得られる組換タンパク質の大部分は、Ｎ末端ホルミルメチオニンを包有する。Ｎ末端翻訳イニシエーターfMetの除去は、しばしば組換タンパク質の機能にとって不可欠であり、タンパク質の安定性の調節を可能とする。更に、人体ではfMetは免疫応答を引き起こす。
【0010】
第二のアミノ酸残基がリシンの場合には、メチオニル-アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）はＮ末端fMetを酵素的に切除しないので、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質はこれまで得られなかった。しかし、Ｎ末端に存在するリシンは不安定化アミノ酸（destabilising amino acid）であるから、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質の生成は、特に潜在的な有害性を有し、人体における生物活性を厳密に調節しなければならない医薬組換タンパク質には、有用であると考えられる。
【0011】
近年、ボツリヌス神経毒は、ジストニア及び痙攣の処置における治療剤として用いられている。クロストリジウム毒素は強い毒性を有するため、ヒトへの投与に当たっては、当該毒素を可能な限り高い純度及び再現性を以って製造し、その生物活性が厳密に制御されたクロストリジウム神経毒を取得する、という強い要請があった。
【0012】
クロストリジウム（Clostridium）は偏性嫌気性グラム陰性細菌の属で、凡そ１００種からなり、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）や破傷風菌（Clostridium tetani）等の重要な病原体を含む。何れの種も神経毒を産生し、これらはそれぞれボツリヌス毒素及び破傷風毒素と呼ばれる。これらの神経毒は神経細胞のカルシウム依存性神経伝達物質分泌の強力な阻害剤であり、人間の知る最も強力な毒素に分類される。ヒトにおける致死量は体重１ｋｇ当たり０．１ｎｇ〜１ｎｇである。
【0013】
汚染された食品からボツリヌス毒素を経口摂取し、或いは創傷においてボツリヌス毒素が発生すると、ボツリヌス中毒症（botulism）が生じ得る。これは種々の筋肉の麻痺を特徴とし、呼吸筋が麻痺すると患者が死に至る場合もある。
【0014】
ボツリヌス神経毒（botulinum neurotoxin：BoNT）及び破傷風神経毒（tetanus neurotoxin：TxNT）は何れも、罹患したニューロンの軸索からシナプスへと放出される神経伝達物質を阻害する。ボツリヌス毒素は末梢神経系の神経筋接合部及び他のコリン作動性シナプスで作用し、神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害するのに対して、破傷風毒素は主に中枢神経系で作用する。ここで抑制性神経伝達物質の放出を阻害することにより、筋肉の過活動を招き、結果としてアゴニスト及びアンタゴニスト筋肉組織の全身性収縮を生じる、termed a 強縮性痙攣。
【0015】
破傷風神経毒は免疫学的に独立した単一の型として存在するが、ボツリヌス神経毒には７種の異なる免疫原性の型が知られており、これらはBoNT/A〜BoNT/Gと呼ばれる。ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）株の多くは単一の型の神経毒のみを産生するが、複数種の毒素を産生する株も報告されている。
【0016】
ボツリヌスと破傷風神経毒とはアミノ酸配列の相同性が高く、ドメイン構造も類似している。これらの生物活性形は２つのペプチド鎖、即ち約５０ｋＤａの軽鎖と約１００ｋＤａの重鎖を含み、これらがジスルフィド結合で結合されてなる。リンカー或いはループ領域は、クロストリジウム毒素の種類によって長さは様々であるが、ジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基の間に位置する。このループ領域は未知のクロストリジウムプロテアーゼによるタンパク質分解により切断され、生物活性毒素となる。
【0017】
TxNT及びBoNTによる中毒の分子機構も類似していると考えられる。標的ニューロンへの侵入は、重鎖のＣ末端部が特定の細胞表面受容体に結合することにより媒介される。次いで毒素は受容体媒介性エンドサイトーシスによって取り込まれる。こうして形成されたエンドソームが有する低ｐＨによって、クロストリジウム毒素の立体構造が変化し、エンドソーム膜に組み込まれ得る状態となる。こうしてとクロストリジウム毒素はエンドソーム膜を通じて細胞質へと移行し、ここで重鎖と軽鎖とを連結するジスルフィド結合が還元される。その後、軽鎖がいわゆるSNARE-タンパク質を選択的に切断する。SNARE-タンパク質は、神経伝達物質のシナプス間隙への放出における複数の異なる工程、例えば神経伝達物質含有小胞の認識並びに細胞膜への結合及び融合等の工程において重要である。TxNT、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、及びBoNT/Gは、シナプトブレビン（synaptobrevin）又はVAMP（小胞関連膜タンパク質）のタンパク質分解的切断を生じ、BoNT/A及びBoNT/Eは細胞膜関連タンパク質SNAP-25を切断し、BoNT/Cは細胞膜内在タンパク質 シンタキシン（syntaxin）及びSNAP-25を切断する。
【0018】
近年、ボツリヌス神経毒はジストニア及び痙攣の処置における治療剤として使用されている。ボツリヌス毒素複合体を含む調製物は、例えばIpsen Ltd（Dysport（登録商標））やAllergan Inc.（Botox（登録商標））から市販されている。複合体形成タンパク質を含まない高純度の神経毒成分は、例えばMerz Pharmaceuticals GmbH、フランクフルト（Xeomin（登録商標））から入手可能である。
【0019】
通常、クロストリジウム神経毒は罹患筋肉組織に注射され、神経筋終板の近傍、即ち前記罹患筋肉を制御する神経細胞への取り込みを媒介する細胞受容体の近傍へと導入される。神経毒が様々な程度で拡散することが観察されている。神経毒の拡散は、注射量及び具体的な神経毒調製物に依存すると考えられる。これにより隣接する筋肉組織の麻痺等の有害な副作用が生じる場合があるが、注射用量を治療関連レベルまで低減することにより、斯かる副作用は大幅に抑えることができる。また、過剰投与の場合には免疫系による中和抗体の産生が誘発され、斯かる中和抗体によって、神経毒による不随意筋活動の弛緩が阻害される。
【0020】
高い毒性、重篤な副作用、及び免疫発現の可能性ゆえに、当該毒素を可能な限り高い純度及び再現性を以って製造し、その生物活性が厳密に制御されたクロストリジウム神経毒を取得する、という強い要請があった。現在まで、斯かる課題が十分に解決されているとは言えない。
【0021】
国際公開第２０１１／０００９２９号は、クロストリジウム神経毒のＮ末端プロリンをリシンで置換する旨を開示する。しかし、国際公開第２０１１／０００９２９号では、斯かる置換をどのように達成するかについては論じていない。更に、オリゴリシン配列をＮ末端に導入することも示唆している。しかし、斯かる挿入をどの位置にどうやって行うかについては記載していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0022】
本発明の目的の一つは、Ｎ末端リシンを包有するクロストリジウム神経毒等の組換タンパク質を製造及び取得するための、信頼性に優れた正確な方法を確立することである。特に本発明では、前駆体タンパク質を高い効率を以って、即ち略完全（near-complete）に切断すること、しかも所定の露出されたＮ末端切断部位において切断すること、即ち他の部位の偶発的な切断を伴わないことを意図する。斯かる方法に加えて、当該方法で使用されるクロストリジウム神経毒等の新規な前駆体タンパク質は、Ｎ末端リシンを包有する組換タンパク質、特にクロストリジウム神経毒等の組換医薬タンパク質に対する強い要請を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【0023】
第二のアミノ酸残基がリシンの場合には、Ｎ末端fMetはメチオニル−アミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により酵素的に除去されないため、これまでＮ末端リシンを有する組換タンパク質を得ることはできなかった。しかし、Ｎ末端に存在するリシンは不安定化アミノ酸（destabilising amino acid）であるから、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質の生成は、特に潜在的な有害性を有し、人体における生物活性を厳密に調節しなければならない医薬組換タンパク質には、有用であると考えられる。
【0024】
更に、Ｎ末端リシン残基によって、遊離アミノ基を介した連結が可能となる。
【0025】
驚くべきことに、Ｎ末端リシンを有するタンパク質、例えばＮ末端リシンを有するクロストリジウム神経毒を、以下の手法による組換により取得できることを見出した。即ち、組換宿主細胞による発現後、Ｐ’１位置のリシンに特異的なエンドプロテアーゼによって認識され得るＮ末端モチーフX-Lysをコードする配列を、クロストリジウム神経毒等の親タンパク質をコードする遺伝子内にクローン化し、続いてＰ’１位置のリシンに特異的なエンドプロテアーゼによって切断を行う。更に、驚くべきことに、露出されていない折り畳まれたタンパク質領域は、Ｐ’１位置のリシンに特異的なエンドプロテアーゼによって切断されなかった。
【0026】
即ち、一側面によれば、本発明は、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質を生成するための方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーを含む前駆体タンパク質（ここで、Ｘはエンドプロテアーゼ認識配列であり、前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）を、ＸとＬｙｓとの間を特異的に切断するエンドプロテアーゼに接触させ、或いは接触を許容する工程を含む方法に関する。
【0027】
別の側面では、本発明は、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカー（ここで、Ｘはエンドプロテアーゼ認識配列であり、前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）を含む前駆体タンパク質に関する。
【0028】
別の側面では、本発明は、Ｎ末端が配列Ｌｙｓ−リンカー（ここで前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）からなり、特に少なくとも５０アミノ酸残基、特に少なくとも１００アミノ酸残基、特に少なくとも２００アミノ酸残基を含む、組換タンパク質に関する。
【0029】
別の側面では、本発明は、本発明の前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、特に配列番号７〜９の何れか一つに記載の配列を有する核酸に関する。
【0030】
別の側面では、本発明は、本発明の核酸を得るための方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーをコードする核酸配列を、親タンパク質をコードする核酸配列内に挿入する工程を含む方法に関する。
【0031】
別の側面では、本発明は、本発明の核酸配列、又は、本発明の方法により得られ得る核酸を含むベクターに関する。
【0032】
更に別の側面では、本発明は、本発明の核酸配列、本発明の方法により得られ得る核酸、又は、本発明のベクターを含む組換宿主細胞に関する。
【0033】
別の側面では、本発明は、本発明の前駆体タンパク質、又は、本発明の前駆体組換タンパク質を生成するための方法であって、本発明の核酸配列、本発明の方法で得られ得る核酸、又は、本発明のベクターを、組換宿主細胞内で発現させ、或いは本発明の組換宿主細胞を、前記核酸配列が発現する条件下で培養する工程を含む方法に関する。
【0034】
別の側面によれば、本発明は、本発明の組換タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【0035】
本発明は、以下の発明の詳細な説明及びそこに含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【0036】
一つの観点では、本発明は、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質を生成するための方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーを含む前駆体タンパク質（ここで、Ｘはエンドプロテアーゼ認識配列であり、前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基と、（ii）少なくとも２つの連続するＧｌｙ残基とを含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む）を、ＸとＬｙｓとの間を特異的に切断するエンドプロテアーゼに接触させ、或いは接触させることを許容する工程を含む方法に関する。
【0037】
本発明において、用語「前駆体タンパク質を、・・・エンドプロテアーゼに接触させ・・・」とは、前記タンパク質と前記エンドプロテアーゼとを接触させる能動的及び／又は直接的な工程を指すのに対し、用語「前駆体タンパク質を、・・・エンドプロテアーゼに接触させることを許容する」とは、前記タンパク質と前記エンドプロテアーゼとが互いに接触するような条件を確立する間接的な工程を指す。
【0038】
本発明において、用語「エンドプロテアーゼ」又は「エンドペプチダーゼ」とは、非末端アミノ酸の（即ちポリペプチド鎖内の）ペプチド結合を破壊するプロテアーゼを指す。エンドプロテアーゼは末端アミノ酸を攻撃しないため、ペプチドをモノマーへと分解することはできない。
【0039】
本発明において、用語「ＸとＬｙｓとの間を特異的に切断するエンドプロテアーゼ」とは、特定の認識配列Ｘの後にリシン残基を有するポリペプチド配列を、前記配列Ｘとリシン残基との間で切断することにより、Ｎ末端リシン残基を有するポリペプチドを生成し得る特定のエンドプロテアーゼを指す。従来、斯かるエンドプロテアーゼは、大型タンパク質を質量分析に供するべく断片化するのに広く用いられてきた（例えば欧州特許出願第2081025号；Taouatas, Lys-N:A versatile enzyme for proteomics, Utrecht 2000, ISBN: 978-90-393-5488-9；Nonaka等, J. Biochem.124(1998)157〜162を参照）。即ち、タンパク質を多数の異なる位置で同時に切断し、種々の異なるタンパク質断片を生成するために用いられてきた。前駆体タンパク質をＮ末端のみで特異的に切断するべく、斯かるエンドプロテアーゼを標的化して使用することは、これまでに発表されていない。
【0040】
本発明において、用語「含む」（comprises）又は「含んでいる」（comprising）は、「これらに限定されないが、・・・・を含む」（including, but not limited to）ことを意味する。この用語は非限定的（open-ended）であり、そこに記載の１つ以上の特徴、要素、整数、工程、又は成分が存在することを規定しつつも、他の１つ以上の特徴、要素、整数、工程、成分、又はそれらの群の存在又は追加も排除されないことを意図する。従って、用語「含んでいる」（comprising）は、より限定的な用語「からなる」（consisting of）及び「本質的に・・・からなる」（consisting essentially of）を包含する。
【0041】
Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓは、ｐ’１位のリシンに特異的なエンドプロテアーゼにより認識され、切断され得る。
【0042】
前記Ｎ末端リシンの下流に存在するリンカーは、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓを露出しているため、Ｐ’１位リシン特異的エンドプロテアーゼが、前記リシン残基を認識及び切断し得るようになっている。好適には、前記エンドプロテアーゼは、折り畳まれた非露出のタンパク質領域内のリシン残基を切断し得ない。
【0043】
本発明において、用語「前駆体タンパク質」とは、Ｎ末端リシンを有する切断タンパク質断片を生成するための切断シグナルを内部に持つタンパク質を指す。
【0044】
本発明において、用語「組換タンパク質」とは、組換技術を用いることにより生産されるタンパク質、即ち、組換タンパク質をコードする核酸配列を遺伝子的に操作し、次いで前記核酸配列を適切なインビトロ（in vitro）又はインビボ（in vivo）発現系で発現させることにより生産されるタンパク質を指す。即ち、組換タンパク質は化学的なタンパク質合成により生産されるものではない。特定の態様によれば、本用語は、大腸菌（E. coli）等の異種細胞でのタンパク質の発現により得られたタンパク質を含む組成物を指す。例として、これらに限定されるものではないが、発酵工程から得られる原料（上清、細胞溶解後の組成物）、斯かる原料の各成分を精製工程により分離して得られるタンパク質含有画分、単離された実質的に純粋なタンパク質、並びに、クロストリジウム神経毒等のタンパク質を含む医薬及び／又は化粧用製剤であって、更に医薬的に許容され得る溶媒及び／又は賦形剤を含む製剤が挙げられる。
【0045】
特定の態様によれば、リシン特異的エンドプロテアーゼによる前駆体タンパク質のＰ’１位Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓでの切断は、略完全（near-complete）である。
【0046】
本発明において、用語「Ｐ’１位」とは、ポリペプチド鎖内のプロテアーゼ切断部位直後（即ちＣ末端）のアミノ酸位置を指す。
【0047】
本発明において、用語「略完全」（near-complete）とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続くウェスタンブロット又は逆相クロマトラフィーで決定した場合に、約９５％超の切断、詳細には約９７．５％超、より詳細には約９９％超の切断と定義される。
【0048】
即ち、本発明の方法の特定の態様によれば、前駆体タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は逆相クロマトラフィーで決定した場合に、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓにおいて、約９７．５％超、より詳細には約９９％超まで切断される。
【0049】
本発明において、用語「約」（about）又は「凡そ」（approximately）は、所定の値又は範囲の２０％以内、或いは１０％以内、例えば５％以内を意味する。或いは、特に生物系において、用語「約」（about）は、所定の値の約１ｌｏｇ（即ち１桁分）以内、例えば２倍以内を意味する。
【0050】
特定の態様によれば、前駆体タンパク質のＮ末端モチーフＸ−Ｌｙｓでの切断は、折り畳まれた非露出のタンパク質領域内の他の内部リシン残基における偶発的な切断を伴わない。
【0051】
本発明において、用語「偶発的な切断を伴わない」（without accidental cleavage）とは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）又は質量分析で決定した場合に、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓでの前駆体タンパク質の切断により生じる切断産物の約１０％未満、特に約１％未満、とりわけ約０．１％未満が、Ｎ末端リシンを有する所望の組換タンパク質以外の切断産物であることを意味する。
【0052】
従って、本発明の方法の特定の態様によれば、ＬＣ−ＭＳ又は質量分析で決定した場合に、Ｎ末端モチーフＸ−リシンでの前駆体タンパク質の切断からもたらされる切断産物の約１０％未満、特に約１％未満、とりわけ約０．１％未満が、Ｎ末端リシンを有する所望の組換タンパク質以外の切断産物である。
【0053】
即ち、本発明の特定の態様によれば、前駆体タンパク質は、配列Ｘ−Ｌｙｓ−リンカー−Ｐから成るＣ末端部分を含み（ここでＰは親タンパク質配列である。）、また、組換タンパク質（即ち切断後）は、配列Ｌｙｓ−リンカー−Ｐから成る。本文脈において、用語「親タンパク質配列」は、Ｎ末端リシン残基で修飾することを意図するタンパク質配列に関する。
【0054】
特定の態様によれば、切断反応は、以下から選択される条件で実施される。エンドプロテアーゼの量：前駆体タンパク質１μｇ当たり約０．０００５〜約０．００５Ｕ；反応温度約１５℃〜約２５℃；反応時間約１時間〜約３時間；緩衝溶液のｐＨ約７〜約８、浸透圧約２５０〜約５００ｍＯｓｍ。
【0055】
特定の態様によれば、切断反応は、以下の条件で実施される。前駆体タンパク質１μｇ当たり０．００１ＵのＬｙｓ−Ｎ；反応温度２０℃；反応時間２時間；ｐＨ７．７；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２。
【0056】
特定の態様によれば、切断反応は、前記前駆体タンパク質を含む粗宿主細胞溶解物を用いて実施される。
【0057】
他の特定の態様によれば、前駆体タンパク質は切断反応に先立ち、特に最初のクロマトグラフ濃縮工程により精製され、又は部分的に精製される。
【0058】
本発明において、用語「精製される」（purified）は、約９０％超の純度に関する。本発明において、用語「部分的に精製される」（partially purified）とは、約９０％未満の純度、及び約２倍超の濃縮に関する。
【0059】
特定の態様によれば、本発明の方法は、前記Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーをコードする核酸配列を、親タンパク質をコードする核酸内に挿入することにより、前記前駆体タンパク質をコードする組換核酸配列を得る工程を更に含む。
【0060】
本発明において、用語「親タンパク質」（parental protein）とは、標準的な発現条件下で生成され、リシンとは異なるＮ末端残基を有する、当初のタンパク質を指す。
【0061】
特定の態様によれば、有効性の持続時間が親タンパク質と比べて短縮された、Ｎ末端リシンを有する組換タンパク質が生成される。
【0062】
特定の態様によれば、本発明の方法は、前記前駆体タンパク質と前記エンドプロテアーゼとを接触させ、又は接触を許容する前に、宿主細胞内で、前記前駆体タンパク質をコードする核酸配列を異種発現させる工程を更に含む。
【0063】
特定の態様によれば、前記エンドプロテアーゼは、マイタケ（Grifola frondosa）に由来するＬｙｓ−Ｎ、別名ＧＦＭＥＰである（Taouatas, loc. cit., 33頁）。この亜鉛金属エンドペプチダーゼは、１６７個のアミノ酸残基を有する単一のポリペプチド鎖からなり、リシン残基のアミノ側でタンパク質を切断する。Ｌｙｓ−Ｎは、一般にプロテオミクスにおけるタンパク質消化に使用される。広範な種類のリシン含有配列がＬｙｓ−Ｎで切断されることが示されている（Nonaka等., loc. cit., 159頁、表I及びII）。驚くべきことに、本発明者等は特に本明細書に記載の反応条件下で、他のリシンを含む配列領域を無償のまま残しつつ、Ｘとリシン残基との間を高い特異性を以って切断する配列Ｘ−Ｌｙｓ−リンカーを同定できることを見い出した。
【0064】
特定の態様によれば、Ｌｙｓ−Ｎは組換Ｌｙｓ−Ｎである。
【0065】
特定の態様によれば、前記エンドプロテアーゼ認識配列Ｘは、配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）を有する。
【0066】
特定の態様によれば、前記リンカーは、配列ＴＫＧnを有する。ここでｎは、１以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２，４、及び８から選択される。
【0067】
他の特定の態様によれば、前記エンドプロテアーゼは、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）に由来するＰＯＭＥＰである（Nonaka, loc. cit.; Dohmae等., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995) 2074〜2080）。
【0068】
特定の態様によれば、親タンパク質は、クロストリジウム神経毒である。
【0069】
本発明において、用語「クロストリジウム神経毒」は、クロストリジウム類の細菌、例えば破傷風菌（Clostridium tetani）及びボツリヌス菌（Clostridium botulinum）等から得られる天然神経毒、或いは別の材料から、例えば組換技術又は遺伝子修飾若しくは化学修飾により得られる神経毒を指す。特にクロストリジウム神経毒は、エンドペプチダーゼ活性を有する。
【0070】
特定の態様によれば、効果の持続時間が親クロストリジウム神経毒性と比べて短縮された、Ｎ末端リシンを有する組換クロストリジウム神経毒が生成される。
【0071】
特定の態様によれば、クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧから、又はかかるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の機能性変異体から選択される。
【0072】
本発明において、用語「ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ」は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）から得られる神経毒を指す。現在は、血清学的に識別可能な７種の型、通称血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧが、特定のサブタイプ（例えばＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４及びＡ５）と共に知られている。
【0073】
好適な態様によれば、クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ及びＥ、特にボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ｅ、又は斯かる任意のボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の機能性変異体から選択される。
【0074】
本発明において、用語「ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の機能性変異体」とは、アミノ酸配列及び／又はアミノ酸配列をコードする核酸配列においてボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒とは異なるが、なお機能的に活性である神経毒を指す。本文脈において「機能的に活性」（functionally active）又は「生物学的に活性」（biologically active）とは、前記変異体が神経毒受容体に結合し得るとともに、神経細胞内に摂取され、罹患神経細胞からの神経伝達物質放出を阻害し得ることを意味する。本発明において、用語「機能的に活性」とは、組換クロストリジウム神経毒が、天然ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の生物学的機能を、少なくとも約５０％、特に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、及び最も詳細には少なくとも約９０％実施し得る性質を有することを指す。生物学的機能としては、これらに限定されるものではないが、神経毒の神経細胞中への侵入、二本鎖神経毒に由来する軽鎖の放出、及び軽鎖のエンドペプチダーゼ活性が挙げられる。
【0075】
タンパク質レベルにおいて、機能性変異体は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の主な特徴、例えばエンドペプチダーゼ活性に関して重要な軽鎖内の残基、或いは、神経毒受容体への付着又はエンドソーム膜を介した転位に関して重要な重鎖内の残基等を維持するであろう。しかし、親ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の１つ以上のアミノ酸の欠失、親ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の１つ以上のアミノ酸の付加、及び／又は親ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒の１つ以上のアミノ酸の置換を含む、１つ以上の突然変異を含んでいてもよい。好適には、前記欠失、付加、及び／又は置換されるアミノ酸が複数の場合は、連続するアミノ酸である。本発明の教示によれば、機能性変異体が生物学的活性を維持する限り、任意の数のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換され得る。例えば１個、２個、３個、４個、５個、最高１０個、最高１５個、最高２５個、最高５０個、最高１００個、最高２００個、最高４００個、最高５００個のアミノ酸、更にはより多くのアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換され得る。従って、機能性変異体の神経毒は、天然神経毒の生物学的に活性な断片であってもよい。この神経毒断片は、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／又は、１つ以上の内部欠失を含んでいてもよい。
【0076】
他の態様によれば、クロストリジウム神経毒の機能性変異体は、更にシグナルペプチドを含む。通常、前記シグナルペプチドは神経毒のＮ末端に位置するであろう。斯かるシグナルペプチドは多数のものが当業界で公知であり、本発明に含まれる。特にシグナルペプチドは、真核細胞又は原核細胞の小胞体膜、ゴルジ膜、又は細胞膜等の生物膜を介した神経毒の輸送をもたらす。シグナルペプチドが神経毒に付着すると、神経毒の細胞上清への分泌を媒介することが見出された。特定の態様によれば、シグナルぺプチドは分泌の過程で、或いは分泌の後で切断されるため、分泌タンパク質はＮ末端のシグナルペプチドを欠き、ジスルフィド架橋で共有結合された個別の軽鎖及び重鎖から構成され、またタンパク質分解活性である。
【0077】
特定の態様によれば、機能性変異体は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約7０％、又は最も詳細には少なくとも約８０％の配列同一性、及び少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は最も詳細には少なくとも約９５％の配列相同性を有する。配列同一性及び／又は相同性を決定する方法及びアルゴリズムは、例えば欠失、付加、及び／又は置換を有する変異体と親配列との比較等が、当業者に周知である。ＤＮＡレベルでは、機能性相同体をコードする核酸配列と親クロストリジウム神経毒をコードする核酸配列とは、遺伝子コードの縮重ゆえ、より大きく異なり得る。コドンの文法は原核生物と真核生物との間で異なることが知られている。従って、クロストリジウム神経毒等の原核細胞のタンパク質を真核細胞発現系で発現させる場合、核酸配列を発現宿主細胞のコドンの文法に適応させることは必須であるか、或いは少なくとも有益である。これは即ち、核酸レベルでは配列同一性又は相同性はむしろ低くてもよいことを意味する。
【0078】
本発明において、用語「変異体」（variant）とは、親クロストリジウム神経毒の化学的、酵素的、又は遺伝子的に修飾された誘導体、例えば神経毒ボツリヌス菌（C.botulinum）、特にボツリヌス菌（C.botulinum）神経毒血清型Ｅの化学的又は遺伝子的に修飾された神経毒等を指す。化学的に修飾された誘導体は、単一アミノ酸又は２〜約１００個のアミノ酸を含むポリペプチドのピルビン酸化、リン酸化、硫酸化、脂質化、ＰＥＧ化、グリコシル化及び／又は化学的付加により修飾されたもの、例えば誘導体の発現に使用される宿主真核細胞で生じる修飾等であってよい。酵素的に修飾された誘導体は、誘導体発現に使用される宿主真核細胞の酵素による修飾等、エンド又はエキソタンパク質分解酵素等の酵素活性により修飾されたものである。上記で指摘したように、遺伝子的に修飾された誘導体は、前記クロストリジウム神経毒のアミノ酸配列中に含まれる１以上のアミノ酸の欠失もしくは置換により、又は前記クロストリジウム神経毒のアミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸（２〜約１００個のアミノ酸を含むポリペプチドを含める）を付加することにより修飾されたものである。斯かる化学的又は遺伝子的に修飾された誘導体を設計及び構築するための方法、並びに斯かる変異体の機能性を試験するための方法は、当業者には周知である。
【0079】
特定の態様によれば、前記クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）神経毒血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ、特に血清型Ａ又はＥ、特にＥから選択されるクロストリジウム神経毒の機能性変異体であり、ここで前記機能性変異体は、神経毒軽鎖及び神経毒重鎖の間のリンカー領域中に、エンドプロテアーゼ認識配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）の第二のコピーを含む。
【0080】
特定の態様によれば、前駆体タンパク質は、大腸菌（E. coli）宿主細胞において発現される。
【0081】
特定の態様によれば、大腸菌（E. coli）細胞は、大腸菌（E. coli）XL1-Blue、Nova Blue、TOP10、XL10-Gold、BL21、及びK12から選択される。
【0082】
他の観点によれば、本発明は、前駆体タンパク質に関し、ここで前記前駆体タンパク質は、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーを含み、ここでＸは、エンドプロテアーゼ認識配列であり、ここで前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基、並びに（ｉｉ）少なくとも２つの連続的なＧｌｙ残基を含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含む。
【0083】
特定の態様によれば、エンドプロテアーゼ認識配列Ｘは、配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）を有する。
【0084】
特定の態様によれば、リンカーは配列ＴＫＧnを有し、ここでｎは１以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される。
【0085】
好適な態様によれば、前記前駆体タンパク質はクロストリジウム神経毒前駆体である。
【0086】
好適な態様によれば、クロストリジウム神経毒前駆体は、配列番号１〜３の任意の１つに見出される配列を有する。
【0087】
他の観点によれば、本発明は組換タンパク質に関し、ここで前記組換タンパク質のＮ末端は、配列Ｌｙｓ−リンカーから成り、ここで前記リンカーは、（ｉ）少なくとも第二のＬｙｓ残基及び／又はＴｈｒ残基、並びに（ii）少なくとも２つの連続的なＧｌｙ残基を含む、少なくとも３つのアミノ酸残基を含み；特に、ここで前記組換タンパク質は、少なくとも５０個のアミノ酸残基、特に少なくとも１００個のアミノ酸残基、特に少なくとも２００個のアミノ酸残基を含む。
【0088】
現在まで、斯かるＮ末端を有するペプチドとしては、短いペプチドのみが公知であったが（例えば中国特許出願第１７２４５６６号公報参照）、それらは組換タンパク質ではなかった。
【0089】
特定の態様によれば、リンカーは配列ＴＫＧnを有し、ここでｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される。
【0090】
特定の態様によれば、組換タンパク質は、クロストリジウム神経毒である。
【0091】
特定の態様によれば、クロストリジウム神経毒は、配列番号４〜６の任意の１つに見出される配列を有する。
【0092】
他の観点では、本発明は、本発明の前駆体タンパク質をコードする核酸配列に関する。
【0093】
特定の態様によれば、核酸配列は、クロストリジウム神経毒をコードする。
【0094】
特定のかかる態様によれば、前記核酸配列は、配列番号７〜９の任意の１つに見出される配列を有する。
【0095】
他の観点では、本発明は、本発明の核酸配列を得るための方法であって、Ｎ末端モチーフＸ−Ｌｙｓ−リンカーをコードする核酸配列を、親タンパク質をコードする核酸配列内に挿入する工程を含む方法に関する。
【0096】
特定の態様によれば、エンドプロテアーゼ認識配列Ｘは、配列ＶＲＧＩＩＴＳ（配列番号１０）を有する。
【0097】
特定の態様によれば、リンカーは配列ＴＫＧnを有し、ここでｎは２以上の整数であり、特に２〜１２の範囲から選択され、特に２〜８、特に２、４、及び８から選択される。
【0098】
特定の態様によれば、親タンパク質は、クロストリジウム神経毒である。
【0099】
他の観点では、本発明は、本発明の核酸配列、又は本発明の方法により得ることができる核酸を含むベクターに関する。
【0100】
更に他の観点によれば、本発明は、本発明の核酸配列、本発明の方法により得られる核酸又は本発明のベクターを含む組換宿主細胞に関する。
【0101】
特定の態様によれば、大腸菌（E. coli）は、大腸菌（E. coli）XL1-Blue、Nova Blue、TOP10、XL10-Gold、BL21、及びK12から選択される。
【0102】
他の観点によれば、本発明は、本発明の前駆体タンパク質、又は本発明の組換タンパク質を生成するための方法であって、本発明の核酸配列、本発明の方法により得ることができる核酸、又は本発明のベクターを、組換宿主細胞中で発現させる工程、或いは前記核酸配列が発現されるような条件下で、本発明の組換宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。
【0103】
特定の態様によれば、前駆体タンパク質、又は組換タンパク質は、発現後に精製され、または組換タンパク質の場合は、切断反応後に精製される。特定のかかる態様によれば、タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。特定の態様によれば、エンドプロテアーゼは、免疫親和性クロマトグラフィーにより除去される。
【0104】
他の態様によれば、本発明は、本発明の組換タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【0105】
特定の態様によれば、組換タンパク質は、クロストリジウム神経毒である。
【0106】
特定のかかる態様によれば、医薬組成物は、頸部ジストニア（痙性斜頸）、眼瞼けいれん、重篤な原発性腋窩多汗症、アカラシア、腰痛、良性前立腺肥大症、慢性局所疼痛神経障害、片頭痛及び他の頭痛障害、並びに美容又は審美的用途のリストから選択される疾患又は症状の処置に用いられる。
【0107】
ボツリヌス神経毒による処置が現在検討されており、本発明の医薬組成物が使用され得る他の適応としては、小児の失禁、過活動膀胱による失禁、神経因性膀胱による失禁、裂肛、損傷、又は中枢神経系疾患に関連する痙攣性障害（例えば外傷、脳卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、又は脳性麻痺等）、四肢、顔、顎又は声帯に影響を及ぼす局所性ジストニア、顎関節（ＴＭＪ）疼痛障害、糖尿病性神経障害、創傷治癒、唾液分泌過剰、声帯機能不全、下顎の大きさを減少させる咬筋縮小、慢性頭痛及び慢性筋骨格系疼痛の処置及び予防、いびき音の処置、胃内容排出時間の延長による体重削減の支援が挙げられる。
【実施例】
【0108】
実施例１：Ｌｙｓ−ＮのＮ末端切断部位を有するボツリヌス毒素突然変異体の生成エンドペペプチダーゼ認識配列、リシン及び所要のリンカー配列をコードするＤＮＡ配列（実施例３参照）を、遺伝子合成及びサブクローニングにより、大腸菌（E.coli）の発現ベクターに含まれるボツリヌス毒素Ｅ型のＤＮＡ配列に付加した。得られたコンストラクトを大腸菌（E.coli）発現株（BL21）に形質転換させ、修飾されたボツリヌス毒素を組換発現させた。大腸菌（E.coli）細胞溶解物に由来する毒素を、親和性クロマトグラフィー（ｈｉｓ−タグ）及び最終サイズ排除クロマトグラフィー工程により精製した。
【0109】
実施例２：Ｌｙｓ−Ｎ（組換体）による切断精製されたボツリヌス毒素（実施例１）を、毒素１μｇ当たり０．００１ＵのＬｙｓ−Ｎと共に、ｐＨ７．７で、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣl、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ2中、２０℃で２時間培養した。これにより、露出されたリシン残基のタンパク質分解的Ｎ末端的切断が生じる。折り畳まれたタンパク質領域内に存在する非露出のリシン残基は攻撃されない。露出リシン残基から配列Ｎ末端が首尾よくタンパク質分解により除去され、それによりＮ末端リシンが生成されたことを、Ｎ末端配列の一部分であるタグの免疫ブロッティング法及びエドマン分析法により分析した。
【0110】
実施例３：Ｎ末端切断モチーフの決定実施例２に記載したように、モチーフを含むＮ末端リシンを有する一連のＢｏＮＴ/Ｅ系コンストラクトを構築し、Ｌｙｓ−Ｎによる切断を試験した。これらの実験の結果を以下の表１に示す。
【0111】
【表1】
【配列表フリーテキスト】
【0112】
配列番号1MAYPYDVPDYAVRGIITSKTKGGPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCVRGIITSKTKSLVPRGSKALNDLCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0113】
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【0114】
配列番号3MAYPYDVPDYAVRGIITSKTKGGGGGGGGPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCVRGIITSKTKSLVPRGSKALNDLCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0115】
配列番号4KTKGGPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCVRGIITSKTKSLVPRGSKALNDLCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0116】
配列番号5KTKGGGGPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCVRGIITSKTKSLVPRGSKALNDLCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0117】
配列番号6KTKGGGGGGGGPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCVRGIITSKTKSLVPRGSKALNDLCIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK
【0118】
配列番号7ATGGCATATCCGTATGATGTTCCGGATTATGCAGTTCGTGGTATTATTACCAGCAAAACCAAAGGTGGCCCGAAAATCAACAGCTTCAACTATAACGATCCGGTGAACGATCGTACCATCCTGTATATTAAACCGGGCGGTTGCCAGGAATTTTACAAAAGCTTCAACATCATGAAAAACATCTGGATTATTCCGGAACGTAACGTGATTGGCACCACCCCGCAGGATTTTCATCCGCCGACCAGCCTGAAAAACGGCGATAGCAGCTATTATGATCCGAACTATCTGCAGTCTGATGAAGAAAAAGATCGCTTCCTGAAAATCGTGACCAAAATCTTCAACCGCATCAACAACAACCTGAGCGGCGGCATTCTGCTGGAAGAACTGAGCAAAGCGAATCCGTATCTGGGCAACGATAACACTCCAGATAACCAGTTTCATATTGGTGATGCGAGCGCGGTGGAAATTAAATTTAGCAACGGCTCTCAGGACATTCTGCTGCCGAACGTGATTATTATGGGCGCGGAACCGGACCTGTTTGAAACCAACAGCAGCAACATTAGCCTGCGTAACAACTATATGCCGAGCAACCATGGTTTTGGCAGCATTGCGATTGTGACCTTTAGCCCGGAATATAGCTTTCGCTTCAACGATAACAGCATGAACGAATTTATTCAGGACCCGGCGCTGACCCTGATGCACGAGCTGATTCATAGCCTGCATGGCCTGTATGGCGCGAAAGGCATTACCACCAAATATACCATCACCCAGAAACAGAATCCGCTGATTACCAACATTCGTGGCACCAACATTGAAGAATTTCTGACCTTTGGCGGCACCGATCTGAACATTATTACCAGCGCGCAGAGCAACGATATCTATACCAACCTGCTGGCCGATTATAAAAAAATCGCGTCTAAACTGAGCAAAGTGCAGGTGAGCAATCCGCTGCTGAATCCGTATAAAGATGTGTTTGAAGCGAAATATGGCCTGGATAAAGATGCTAGCGGCATTTATAGCGTGAACATCAACAAATTCAACGACATCTTCAAAAAACTGTATAGCTTTACCGAATTTGATCTGGCCACCAAATTTCAGGTGAAATGCCGCCAGACCTATATTGGCCAGTATAAATATTTTAAACTGAGCAACCTGCTGAACGATAGCATTTACAACATCAGCGAAGGCTATAACATCAACAACCTGAAAGTGAACTTTCGTGGCCAGAACGCGAATTTAAATCCGCGTATTATTACCCCGATTACCGGCCGTGGACTAGTGAAAAAAATTATCCGTTTTTGCGTGCGTGGCATTATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGTGCCGCGTGGCAGCAAAGCGTTAAATGATTTATGCATCGAAATCAACAACGGCGAACTGTTTTTTGTGGCGAGCGAAAACAGCTATAACGATGATAACATCAACACCCCGAAAGAAATTGATGATACCGTGACCAGCAATAACAACTACGAAAACGATCTGGATCAGGTGATTCTGAACTTTAACAGCGAAAGCGCACCGGGCCTGTCTGATGAAAAACTGAACCTGACCATTCAGAACGATGCGTATATCCCGAAATATGATAGCAACGGCACCAGCGATATTGAACAGCATGATGTGAACGAACTGAACGTGTTTTTTTATCTGGATGCGCAGAAAGTGCCGGAAGGCGAAAACAACGTGAATCTGACCAGCTCAATTGATACCGCGCTGCTGGAACAGCCGAAAATCTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACAACGTGAACAAACCGGTGCAGGCGGCGCTGTTTGTGAGCTGGATTCAGCAGGTGCTGGTTGATTTTACCACCGAAGCGAACCAGAAAAGCACCGTGGATAAAATTGCGGATATTAGCATTGTGGTGCCGTATATTGGCCTGGCCCTGAACATTGGCAACGAAGCGCAGAAAGGCAACTTTAAAGATGCGCTGGAACTGCTGGGTGCGGGCATTCTGCTGGAATTTGAACCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTGTTTACCATCAAAAGCTTTCTGGGCAGCAGCGATAACAAAAACAAAGTGATCAAAGCGATTAACAACGCGCTGAAAGAACGTGATGAAAAATGGAAAGAAGTGTATAGCTTCATTGTGTCTAACTGGATGACCAAAATCAACACCCAGTTCAACAAACGTAAAGAACAAATGTATCAGGCGCTGCAGAACCAGGTGAACGCGATTAAAACCATCATCGAAAGCAAATACAACAGCTACACCCTGGAAGAAAAAAACGAACTGACCAACAAATATGACATCAAACAAATCGAAAATGAACTGAACCAGAAAGTGAGCATTGCCATGAACAACATTGATCGCTTTCTGACCGAAAGCAGCATTAGCTACCTGATGAAACTGATCAACGAAGTGAAAATCAACAAACTGCGCGAATATGATGAAAACGTGAAAACCTACCTGCTGAACTATATTATTCAGCATGGCAGCATTCTGGGCGAAAGCCAGCAAGAACTGAACAGCATGGTTACCGATACCCTGAACAACAGCATTCCGTTTAAACTGAGCAGCTACACCGATGATAAAATCCTGATCAGCTACTTCAACAAATTCTTCAAACGCATCAAAAGCAGCAGCGTGCTGAACATGCGTTATAAAAACGATAAATACGTAGATACCAGCGGCTATGATAGCAATATCAACATTAACGGTGATGTGTATAAATACCCGACCAACAAAAACCAGTTCGGCATCTACAACGATAAACTGAGCGAAGTGAACATTAGCCAGAACGATTATATCATCTACGATAATAAATATAAAAACTTCAGCATCAGCTTTTGGGTGCGTATTCCGAACTACGATAACAAAATCGTGAACGTGAACAACGAATACACCATCATTAACTGCATGCGTGATAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACCATAACGAAATCATCTGGACCCTGCAGGATAACGCCGGCATTAACCAGAAACTGGCCTTTAACTATGGCAACGCGAACGGCATTAGCGATTACATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACGATCGTCTGGGCGATAGCAAACTGTATATTAACGGCAACCTGATCGACCAGAAAAGCATTCTGAACCTGGGCAACATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTCAAAATTGTGAACTGCAGCTATACCCGTTATATTGGCATCCGCTATTTCAACATCTTCGATAAAGAACTGGATGAAACCGAAATTCAGACCCTGTATAGCAACGAACCGAACACCAACATCCTGAAAGATTTCTGGGGCAACTATCTGCTGTACGATAAAGAATATTATCTGCTGAACGTGCTGAAACCGAACAACTTTATTGATCGCCGTAAAGATAGCACCCTGAGCATTAACAACATTCGTAGCACCATTCTGCTGGCCAACCGTCTGTATAGCGGCATTAAAGTGAAAATTCAGCGCGTGAACAATAGCAGCACCAACGATAACCTGGTGCGTAAAAACGATCAGGTGTATATCAACTTTGTGGCCAGCAAAACCCACCTGTTTCCGCTGTATGCGGATACCGCGACCACCAACAAAGAAAAAACCATTAAAATCAGCAGCAGCGGCAACCGTTTTAACCAGGTGGTGGTGATGAACAGCGTGGGCAACAACTGTACAATGAACTTCAAAAACAACAACGGCAACAACATTGGCCTGCTGGGCTTTAAAGCGGATACCGTGGTGGCGAGCACCTGGTATTATACCCACATGCGTGATCATACCAACAGCAACGGCTGCTTTTGGAACTTTATTAGCGAAGAACATGGCTGGCAGGAAAAATGA
【0119】
配列番号8ATGGCATATCCGTATGATGTTCCGGATTATGCAGTTCGTGGTATTATTACCAGCAAAACCAAAGGTGGTGGCGGCCCGAAAATCAACAGCTTCAACTATAACGATCCGGTGAACGATCGTACCATCCTGTATATTAAACCGGGCGGTTGCCAGGAATTTTACAAAAGCTTCAACATCATGAAAAACATCTGGATTATTCCGGAACGTAACGTGATTGGCACCACCCCGCAGGATTTTCATCCGCCGACCAGCCTGAAAAACGGCGATAGCAGCTATTATGATCCGAACTATCTGCAGTCTGATGAAGAAAAAGATCGCTTCCTGAAAATCGTGACCAAAATCTTCAACCGCATCAACAACAACCTGAGCGGCGGCATTCTGCTGGAAGAACTGAGCAAAGCGAATCCGTATCTGGGCAACGATAACACTCCAGATAACCAGTTTCATATTGGTGATGCGAGCGCGGTGGAAATTAAATTTAGCAACGGCTCTCAGGACATTCTGCTGCCGAACGTGATTATTATGGGCGCGGAACCGGACCTGTTTGAAACCAACAGCAGCAACATTAGCCTGCGTAACAACTATATGCCGAGCAACCATGGTTTTGGCAGCATTGCGATTGTGACCTTTAGCCCGGAATATAGCTTTCGCTTCAACGATAACAGCATGAACGAATTTATTCAGGACCCGGCGCTGACCCTGATGCACGAGCTGATTCATAGCCTGCATGGCCTGTATGGCGCGAAAGGCATTACCACCAAATATACCATCACCCAGAAACAGAATCCGCTGATTACCAACATTCGTGGCACCAACATTGAAGAATTTCTGACCTTTGGCGGCACCGATCTGAACATTATTACCAGCGCGCAGAGCAACGATATCTATACCAACCTGCTGGCCGATTATAAAAAAATCGCGTCTAAACTGAGCAAAGTGCAGGTGAGCAATCCGCTGCTGAATCCGTATAAAGATGTGTTTGAAGCGAAATATGGCCTGGATAAAGATGCTAGCGGCATTTATAGCGTGAACATCAACAAATTCAACGACATCTTCAAAAAACTGTATAGCTTTACCGAATTTGATCTGGCCACCAAATTTCAGGTGAAATGCCGCCAGACCTATATTGGCCAGTATAAATATTTTAAACTGAGCAACCTGCTGAACGATAGCATTTACAACATCAGCGAAGGCTATAACATCAACAACCTGAAAGTGAACTTTCGTGGCCAGAACGCGAATTTAAATCCGCGTATTATTACCCCGATTACCGGCCGTGGACTAGTGAAAAAAATTATCCGTTTTTGCGTGCGTGGCATTATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGTGCCGCGTGGCAGCAAAGCGTTAAATGATTTATGCATCGAAATCAACAACGGCGAACTGTTTTTTGTGGCGAGCGAAAACAGCTATAACGATGATAACATCAACACCCCGAAAGAAATTGATGATACCGTGACCAGCAATAACAACTACGAAAACGATCTGGATCAGGTGATTCTGAACTTTAACAGCGAAAGCGCACCGGGCCTGTCTGATGAAAAACTGAACCTGACCATTCAGAACGATGCGTATATCCCGAAATATGATAGCAACGGCACCAGCGATATTGAACAGCATGATGTGAACGAACTGAACGTGTTTTTTTATCTGGATGCGCAGAAAGTGCCGGAAGGCGAAAACAACGTGAATCTGACCAGCTCAATTGATACCGCGCTGCTGGAACAGCCGAAAATCTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACAACGTGAACAAACCGGTGCAGGCGGCGCTGTTTGTGAGCTGGATTCAGCAGGTGCTGGTTGATTTTACCACCGAAGCGAACCAGAAAAGCACCGTGGATAAAATTGCGGATATTAGCATTGTGGTGCCGTATATTGGCCTGGCCCTGAACATTGGCAACGAAGCGCAGAAAGGCAACTTTAAAGATGCGCTGGAACTGCTGGGTGCGGGCATTCTGCTGGAATTTGAACCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTGTTTACCATCAAAAGCTTTCTGGGCAGCAGCGATAACAAAAACAAAGTGATCAAAGCGATTAACAACGCGCTGAAAGAACGTGATGAAAAATGGAAAGAAGTGTATAGCTTCATTGTGTCTAACTGGATGACCAAAATCAACACCCAGTTCAACAAACGTAAAGAACAAATGTATCAGGCGCTGCAGAACCAGGTGAACGCGATTAAAACCATCATCGAAAGCAAATACAACAGCTACACCCTGGAAGAAAAAAACGAACTGACCAACAAATATGACATCAAACAAATCGAAAATGAACTGAACCAGAAAGTGAGCATTGCCATGAACAACATTGATCGCTTTCTGACCGAAAGCAGCATTAGCTACCTGATGAAACTGATCAACGAAGTGAAAATCAACAAACTGCGCGAATATGATGAAAACGTGAAAACCTACCTGCTGAACTATATTATTCAGCATGGCAGCATTCTGGGCGAAAGCCAGCAAGAACTGAACAGCATGGTTACCGATACCCTGAACAACAGCATTCCGTTTAAACTGAGCAGCTACACCGATGATAAAATCCTGATCAGCTACTTCAACAAATTCTTCAAACGCATCAAAAGCAGCAGCGTGCTGAACATGCGTTATAAAAACGATAAATACGTAGATACCAGCGGCTATGATAGCAATATCAACATTAACGGTGATGTGTATAAATACCCGACCAACAAAAACCAGTTCGGCATCTACAACGATAAACTGAGCGAAGTGAACATTAGCCAGAACGATTATATCATCTACGATAATAAATATAAAAACTTCAGCATCAGCTTTTGGGTGCGTATTCCGAACTACGATAACAAAATCGTGAACGTGAACAACGAATACACCATCATTAACTGCATGCGTGATAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACCATAACGAAATCATCTGGACCCTGCAGGATAACGCCGGCATTAACCAGAAACTGGCCTTTAACTATGGCAACGCGAACGGCATTAGCGATTACATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACGATCGTCTGGGCGATAGCAAACTGTATATTAACGGCAACCTGATCGACCAGAAAAGCATTCTGAACCTGGGCAACATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTCAAAATTGTGAACTGCAGCTATACCCGTTATATTGGCATCCGCTATTTCAACATCTTCGATAAAGAACTGGATGAAACCGAAATTCAGACCCTGTATAGCAACGAACCGAACACCAACATCCTGAAAGATTTCTGGGGCAACTATCTGCTGTACGATAAAGAATATTATCTGCTGAACGTGCTGAAACCGAACAACTTTATTGATCGCCGTAAAGATAGCACCCTGAGCATTAACAACATTCGTAGCACCATTCTGCTGGCCAACCGTCTGTATAGCGGCATTAAAGTGAAAATTCAGCGCGTGAACAATAGCAGCACCAACGATAACCTGGTGCGTAAAAACGATCAGGTGTATATCAACTTTGTGGCCAGCAAAACCCACCTGTTTCCGCTGTATGCGGATACCGCGACCACCAACAAAGAAAAAACCATTAAAATCAGCAGCAGCGGCAACCGTTTTAACCAGGTGGTGGTGATGAACAGCGTGGGCAACAACTGTACAATGAACTTCAAAAACAACAACGGCAACAACATTGGCCTGCTGGGCTTTAAAGCGGATACCGTGGTGGCGAGCACCTGGTATTATACCCACATGCGTGATCATACCAACAGCAACGGCTGCTTTTGGAACTTTATTAGCGAAGAACATGGCTGGCAGGAAAAATGA
【0120】
配列番号9ATGGCATATCCGTATGATGTTCCGGATTATGCAGTTCGTGGTATTATTACCAGCAAAACCAAAGGTGGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCCCGAAAATCAACAGCTTCAACTATAACGATCCGGTGAACGATCGTACCATCCTGTATATTAAACCGGGCGGTTGCCAGGAATTTTACAAAAGCTTCAACATCATGAAAAACATCTGGATTATTCCGGAACGTAACGTGATTGGCACCACCCCGCAGGATTTTCATCCGCCGACCAGCCTGAAAAACGGCGATAGCAGCTATTATGATCCGAACTATCTGCAGTCTGATGAAGAAAAAGATCGCTTCCTGAAAATCGTGACCAAAATCTTCAACCGCATCAACAACAACCTGAGCGGCGGCATTCTGCTGGAAGAACTGAGCAAAGCGAATCCGTATCTGGGCAACGATAACACTCCAGATAACCAGTTTCATATTGGTGATGCGAGCGCGGTGGAAATTAAATTTAGCAACGGCTCTCAGGACATTCTGCTGCCGAACGTGATTATTATGGGCGCGGAACCGGACCTGTTTGAAACCAACAGCAGCAACATTAGCCTGCGTAACAACTATATGCCGAGCAACCATGGTTTTGGCAGCATTGCGATTGTGACCTTTAGCCCGGAATATAGCTTTCGCTTCAACGATAACAGCATGAACGAATTTATTCAGGACCCGGCGCTGACCCTGATGCACGAGCTGATTCATAGCCTGCATGGCCTGTATGGCGCGAAAGGCATTACCACCAAATATACCATCACCCAGAAACAGAATCCGCTGATTACCAACATTCGTGGCACCAACATTGAAGAATTTCTGACCTTTGGCGGCACCGATCTGAACATTATTACCAGCGCGCAGAGCAACGATATCTATACCAACCTGCTGGCCGATTATAAAAAAATCGCGTCTAAACTGAGCAAAGTGCAGGTGAGCAATCCGCTGCTGAATCCGTATAAAGATGTGTTTGAAGCGAAATATGGCCTGGATAAAGATGCTAGCGGCATTTATAGCGTGAACATCAACAAATTCAACGACATCTTCAAAAAACTGTATAGCTTTACCGAATTTGATCTGGCCACCAAATTTCAGGTGAAATGCCGCCAGACCTATATTGGCCAGTATAAATATTTTAAACTGAGCAACCTGCTGAACGATAGCATTTACAACATCAGCGAAGGCTATAACATCAACAACCTGAAAGTGAACTTTCGTGGCCAGAACGCGAATTTAAATCCGCGTATTATTACCCCGATTACCGGCCGTGGACTAGTGAAAAAAATTATCCGTTTTTGCGTGCGTGGCATTATCACCAGCAAAACCAAAAGCCTGGTGCCGCGTGGCAGCAAAGCGTTAAATGATTTATGCATCGAAATCAACAACGGCGAACTGTTTTTTGTGGCGAGCGAAAACAGCTATAACGATGATAACATCAACACCCCGAAAGAAATTGATGATACCGTGACCAGCAATAACAACTACGAAAACGATCTGGATCAGGTGATTCTGAACTTTAACAGCGAAAGCGCACCGGGCCTGTCTGATGAAAAACTGAACCTGACCATTCAGAACGATGCGTATATCCCGAAATATGATAGCAACGGCACCAGCGATATTGAACAGCATGATGTGAACGAACTGAACGTGTTTTTTTATCTGGATGCGCAGAAAGTGCCGGAAGGCGAAAACAACGTGAATCTGACCAGCTCAATTGATACCGCGCTGCTGGAACAGCCGAAAATCTATACCTTTTTTAGCAGCGAATTCATCAACAACGTGAACAAACCGGTGCAGGCGGCGCTGTTTGTGAGCTGGATTCAGCAGGTGCTGGTTGATTTTACCACCGAAGCGAACCAGAAAAGCACCGTGGATAAAATTGCGGATATTAGCATTGTGGTGCCGTATATTGGCCTGGCCCTGAACATTGGCAACGAAGCGCAGAAAGGCAACTTTAAAGATGCGCTGGAACTGCTGGGTGCGGGCATTCTGCTGGAATTTGAACCGGAACTGCTGATTCCGACCATTCTGGTGTTTACCATCAAAAGCTTTCTGGGCAGCAGCGATAACAAAAACAAAGTGATCAAAGCGATTAACAACGCGCTGAAAGAACGTGATGAAAAATGGAAAGAAGTGTATAGCTTCATTGTGTCTAACTGGATGACCAAAATCAACACCCAGTTCAACAAACGTAAAGAACAAATGTATCAGGCGCTGCAGAACCAGGTGAACGCGATTAAAACCATCATCGAAAGCAAATACAACAGCTACACCCTGGAAGAAAAAAACGAACTGACCAACAAATATGACATCAAACAAATCGAAAATGAACTGAACCAGAAAGTGAGCATTGCCATGAACAACATTGATCGCTTTCTGACCGAAAGCAGCATTAGCTACCTGATGAAACTGATCAACGAAGTGAAAATCAACAAACTGCGCGAATATGATGAAAACGTGAAAACCTACCTGCTGAACTATATTATTCAGCATGGCAGCATTCTGGGCGAAAGCCAGCAAGAACTGAACAGCATGGTTACCGATACCCTGAACAACAGCATTCCGTTTAAACTGAGCAGCTACACCGATGATAAAATCCTGATCAGCTACTTCAACAAATTCTTCAAACGCATCAAAAGCAGCAGCGTGCTGAACATGCGTTATAAAAACGATAAATACGTAGATACCAGCGGCTATGATAGCAATATCAACATTAACGGTGATGTGTATAAATACCCGACCAACAAAAACCAGTTCGGCATCTACAACGATAAACTGAGCGAAGTGAACATTAGCCAGAACGATTATATCATCTACGATAATAAATATAAAAACTTCAGCATCAGCTTTTGGGTGCGTATTCCGAACTACGATAACAAAATCGTGAACGTGAACAACGAATACACCATCATTAACTGCATGCGTGATAACAACAGCGGCTGGAAAGTGAGCCTGAACCATAACGAAATCATCTGGACCCTGCAGGATAACGCCGGCATTAACCAGAAACTGGCCTTTAACTATGGCAACGCGAACGGCATTAGCGATTACATCAACAAATGGATCTTTGTGACCATTACCAACGATCGTCTGGGCGATAGCAAACTGTATATTAACGGCAACCTGATCGACCAGAAAAGCATTCTGAACCTGGGCAACATTCATGTGAGCGATAACATCCTGTTCAAAATTGTGAACTGCAGCTATACCCGTTATATTGGCATCCGCTATTTCAACATCTTCGATAAAGAACTGGATGAAACCGAAATTCAGACCCTGTATAGCAACGAACCGAACACCAACATCCTGAAAGATTTCTGGGGCAACTATCTGCTGTACGATAAAGAATATTATCTGCTGAACGTGCTGAAACCGAACAACTTTATTGATCGCCGTAAAGATAGCACCCTGAGCATTAACAACATTCGTAGCACCATTCTGCTGGCCAACCGTCTGTATAGCGGCATTAAAGTGAAAATTCAGCGCGTGAACAATAGCAGCACCAACGATAACCTGGTGCGTAAAAACGATCAGGTGTATATCAACTTTGTGGCCAGCAAAACCCACCTGTTTCCGCTGTATGCGGATACCGCGACCACCAACAAAGAAAAAACCATTAAAATCAGCAGCAGCGGCAACCGTTTTAACCAGGTGGTGGTGATGAACAGCGTGGGCAACAACTGTACAATGAACTTCAAAAACAACAACGGCAACAACATTGGCCTGCTGGGCTTTAAAGCGGATACCGTGGTGGCGAGCACCTGGTATTATACCCACATGCGTGATCATACCAACAGCAACGGCTGCTTTTGGAACTTTATTAGCGAAGAACATGGCTGGCAGGAAAAATGA
【配列表】
【国際調査報告】