特表 2015-528493 合成的にデザインされた細胞外微小環境

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-528493(P2015-528493A)

(43)【公表日】2015年9月28日

(54)【発明の名称】合成的にデザインされた細胞外微小環境

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20150901BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20150901BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20150901BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/49 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/48 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/71 20060101ALN20150901BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20150901BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/435

   C12M3/00 AZNA

   C12N5/00 202A

   C07K14/475

   C07K14/49

   C07K14/50

   C07K14/48

   C07K14/705

   C07K14/71

   C07K14/78

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】60

(21)【出願番号】特願2015-531858(P2015-531858)

(86)(22)【出願日】2013年9月13日

(85)【翻訳文提出日】2015年3月12日

(86)【国際出願番号】KR2013008306

(87)【国際公開番号】WO2014042463

(87)【国際公開日】20140320

(31)【優先権主張番号】10-2012-0101746

(32)【優先日】2012年9月13日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VC

(71)【出願人】

【識別番号】514315469

【氏名又は名称】コロディス バイオサイエンス，カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＬＬＯＤＩＳ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ， ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100090398

【弁理士】

【氏名又は名称】大渕 美千栄

(74)【代理人】

【識別番号】100090387

【弁理士】

【氏名又は名称】布施 行夫

(72)【発明者】

【氏名】イ ソン グ

(72)【発明者】

【氏名】ポン ヒョ ジン

(72)【発明者】

【氏名】ホン ボン ジン

(72)【発明者】

【氏名】チョ キル ウォン

(72)【発明者】

【氏名】イ サンジェ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA21

4B029CC02

4B029GA01

4B029GA03

4B065AA90X

4B065BC41

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA40

4H045BA10

4H045CA50

4H045EA34

4H045FA71

(57)【要約】

本発明は、細胞外マトリックス又は成長因子に由来したプチドなどの様々な生理活性ペプチドで遺伝子組換え的に機能化されたイガイ接着タンパク質から製作された、生化学的及び物理的に定義された細胞外微小環境を提供する。合成細胞外微小環境は、様々な細胞内において細胞接着、増殖、分化及び形態形成などの細胞の挙動を調節するようにカスタマイズされる。本発明は、イガイ接着タンパク質にマトリクリプティック部位を提供することにより調節された微小環境を提供する。また、本発明は、特定の細胞の挙動が調節可能な微小環境を作成するために最適な組み合わせの細胞外マトリックス由来のペプチドモチーフをスクリーニングするための装置及び方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞接着、移動、増殖又は分化などの細胞の挙動を調節する少なくとも一つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来のペプチドモチーフを提供する生体材料組成物を含む、合成微小環境。

【請求項2】

前記微小環境用生体材料組成物が、イガイ接着タンパク質及び架橋剤を含む、請求項１に記載の合成微小環境。

【請求項3】

前記イガイ接着タンパク質が、細胞外マトリックス由来又は成長因子由来のペプチドモチーフの少なくとも一つ以上で機能化された、請求項２に記載の合成微小環境。

【請求項4】

前記細胞外マトリックス由来のペプチドモチーフが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及びカドヘリンよりなる群から選ばれ、前記ＧＦ由来のペプチドモチーフが、繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、上皮成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子又は血管内皮成長因子よりなる群から選ばれる、請求項３に記載の合成微小環境。

【請求項5】

前記ＥＣＭ由来又は前記ＧＦ由来のペプチドモチーフが、少なくとも２種類の異なる細胞表面受容体を同時に活性化させる組み合わせを含む、請求項３に記載の合成微小環境。

【請求項6】

前記２種類の異なる細胞表面受容体が、インテグリン、シンデカン、カドヘリン、ジストログリカン及び成長因子受容体よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項7】

前記インテグリンが、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、αｖβ３及びαｖβ５よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項8】

前記シンデカンが、シンデカン−１、シンデカン−２、シンデカン−３及びシンデカン−４よりなる群から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項9】

前記成長因子が、繊維芽細胞成長因子受容体、形質転換成長因子受容体、上皮成長因子受容体、神経成長因子受容体、血小板由来成長因子受容体又は血管内皮成長因子受容体から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項10】

前記一つの細胞表面受容体がインテグリンから選ばれ、もう一つの細胞表面受容体はシンデカン、カドヘリン及びジストログリカンよりなる群から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項11】

前記一つの細胞表面受容体がインテグリン及びヘパリンから選ばれ、もう一つの細胞表面受容体が成長因子受容体から選ばれる、請求項５に記載の合成微小環境。

【請求項12】

（ａ）架橋性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ組成物を得るステップと、
（ｂ）前記架橋性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ組成物を固体支持体の上に一定のパターンで配置するステップと、（ｃ）前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ組成物を架橋して合成微小環境アレイを得るステップと、を含む微小環境アレイ装置。

【請求項13】

細胞の挙動を調節する細胞外微小環境表面であって、前記微小環境表面はＥＣＭ又はＧＦ由来のペプチドモチーフの少なくとも一つ以上が存在し、細胞接着、拡散、増殖又は分化を調節するために組み合わせシグナル伝達を誘導する細胞表面受容体を活性化させるこ
とにより細胞の挙動を調節する、細胞外微小環境表面。

【請求項14】

前記微小環境表面が、ＥＣＭ由来又はＧＦ由来のペプチドモチーフの少なくとも一つと、少なくともマトリクリプティックペプチドモチーフによって組換え的に機能化されたイガイ接着タンパク質を含む、請求項１３に記載の細胞外微小環境表面。

【請求項15】

前記ＥＣＭ由来又はＧＦ由来のペプチドモチーフが、マトリクリプティックペプチドに隣接し、ＥＣＭ由来又はＧＦ由来のペプチドモチーフが細胞に露出されるように酵素消化が誘導されて、細胞接着、移動、増殖又は分化が調節される、請求項１３に記載の時空的に制御された細胞外微小環境表面。

【請求項16】

イガイ接着タンパク質を含む、細胞外微小環境表面。

【請求項17】

ＥＣＭ由来又はＧＦ由来のペプチドモチーフの少なくとも一つと、酵素感受性ペプチドモチーフの少なくとも一つによって組換え技術により機能化され、細胞接着、移動、増殖又は分化を調節する組み合わせシグナル伝達を誘導する、イガイ接着タンパク質。

【請求項18】

天然の細胞外微小環境の物理的又は機械的な合図を擬態する、物理的又は機械的な合図を有する、合成細胞外微小環境。

【請求項19】

前記弾性率が、約０．２ｋＰａ〜２ｋＰａである、請求項１８に記載の合成細胞外微小環境。

【請求項20】

前記空隙径が、約１０〜約１００μｍである、請求項１８に記載の合成細胞外微小環境。

【請求項21】

合成細胞外微小環境に少なくとも一つの細胞を接種し、インビトロで前記細胞を維持することを含むインビトロの細胞の培養方法であって、前記細胞外微小環境が、前記細胞が由来した組織の生化学的及び物理的な合図と一致する生化学的及び物理的な合図を有する、インビトロの細胞の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ：ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を生化学的に及び／又は機械的に擬態する合成的に調節された微小環境に関する。

【0002】

本発明は、２０１２年９月１３日付けで出願された大韓民国特許出願第１０−２０１２−０１０１７４６号を優先権主張の基礎とする利点を有する出願であり、全ての目的のために、前記出願の全体がここに完全に記載されたのように本明細書中に参考として援用されている。

【背景技術】

【0003】

生化学的な合図と物理的な合図(ｃｕｅｓ)により定義される細胞の微小環境は、細胞接着、増殖、分化及び表現型固有の機能の発現を含む細胞の広範な工程を決定する要素である（Ｄｉｓｃｈｅｒ ＤＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６；３２４（５９３５）：１６７３−７， ２００９及びＨｙｎｅｓ ＲＯ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ９（１２）：Ｍ３３−７， １９９９）。

【0004】

細胞は、一般に、細胞を取り囲む微小環境と相互作用して、生存及び生物学的機能を発揮するか、あるいは、細胞の分化の方向を決定することが知られている（Ｓｏｎｇ Ｘ，
ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２９６：１８５５−１８５７， ２００２及びＬｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．，
２１：６０５−６３１， ２００５）。

【0005】

組織内のほとんどの細胞は、全ての側面において細胞の機能を誘導するのに決定的な役割を果たす細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質複合体の集合により取り囲まれている。細胞は、インテグリン受容体などの特異的な細胞表面受容体を介して細胞外マトリックスに結合し、その結合は、細胞の機能に直接的な影響を及ぼし得る生化学的な合図として働く。また、細胞外マトリックスは、組織内において生化学的及び機械的刺激の修飾因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）として働く。例えば、細胞外マトリックスタンパク質は、成長因子を隔離及び放出し、栄養分の供給速度を調節するだけではなく、細胞の形態を調節し、機械的なシグナルを細胞の表面に伝達することができる。

【0006】

細胞外マトリックス及び成長因子が引き起こすシグナル伝達環境は、細胞の運命を調節する重要なメカニズムであり、このような微小環境的な刺激は、組合せ的なシグナル伝達経路を介して処理される。このようなシグナル伝達経路間の相互作用は、細胞の運命を決定するのに重要である（Ｆｌａｉｍ ＣＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．， １７（１）：２９−３９， ２００８）。

【0007】

例えば、繊維芽細胞の増殖、筋繊維芽細胞への分化及びコラーゲン合成の増加は、正常的な創傷治癒における重要なイベントであり、繊維芽細胞の増殖及び分化は、組合せ的なシグナル伝達経路により調節される（Ｇｒｏｔｅｎｄｏｒｓｔ ＧＲ， ｅｔ ａｌ．，
ＦＡＳＥＢ Ｊ．， １８（３）：４６９−７９， ２００４）。

【0008】

細胞を取り囲む細胞外マトリックスの機械的コンプライアンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）もまた、２Ｄ及び３Ｄ微小環境の両方において細胞の機能を調節する重要な要素である。ＭＳＣ細胞の運命を、例えば、幹細胞がマトリックスの剛性に対して知覚して反応する発症機序は完全に理解されないが、０．１〜１ｋＰａ範囲の軟性のマトリックスは、神経
性、脂肪生成、及び軟骨形成経路にＭＳＣを誘導する傾向にあるのに対し、１０ｋＰａよりも硬いマトリックスは、培地の特異的な組成により筋形成及び骨形成をサポートすると見られる（Ｅｎｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍａｔｒｉｘ ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｄｉｒｅｃｔｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｅ１ｌ ２００６， １２６：６７７−６８９； Ｐａｒｋ ＪＳ， ｅｔ ａｌ．， （２０１１）及びＴｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｔｒｉｘ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｎ
ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ
ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＴＧＦ−β， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２： ３９２１−３９３０．）。マトリックスの剛性の経時変化はまた、幹細胞の運命を導く重要な役割を果たす（Ｇｕｖｅｎｄｉｒｅｎ Ｍ， Ｂｕｒｄｉｃｋ ＪＡ （２０１２） Ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｄｙｎａｍｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３：７９２； Ｙｏｕｎｇ ＪＬ， Ｅｎｇｌｅｒ ＡＪ （２０１１） Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ
ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３２： １００２−１００９）。興味深いことに、アポトーシスはまた、マトリックスの剛性により調節されるように思われる（Ｐｅｌｌｉｎｇ
ｅｔ ａｌ． （２００９） Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ６６：４０９−４２２）。

【0009】

このため、細胞が増殖、分化、移動、アポトーシス又は他の特定の機能を行うなどの細胞の最終的な運命は、このような細胞外マトリックス微小環境のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）間の分子間相互作用に対する協調的反応である（Ｌｕｔｏｌｆ ＭＰ， ｅｔ
ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２３（１）：４７−５５， ２００５）。

【0010】

細胞接着リガンドを生体材料に組み込んで合成細胞外微小環境を調製するための様々な試みが行われている。生物学的に由来した材料又は合成された材料は、その材料及びその材料が誘導する細胞の挙動を調節するための細胞外微小環境用材料として検討されてきた。一例は、ＲＧＤペプチドモチーフ（ｍｏｔｉｆ）を有する架橋性ヒアルロン酸、アルギン酸塩、ポリエチレングリコール系ヒドロゲルがポリマー骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）にグラフトされた（ｇｒａｆｔｅｄ）ことである（Ｗｏｅｒｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ， ５：２４５−２５５，
１９９５； Ｉｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２７：３４５１−３４５８， ２００６； 及び米国公開特許公報第２００６−０１３４０５０号）。

【0011】

複雑な構造組成、純度、免疫原性及び病原体の伝達を含む天然の細胞外マトリックスタンパク質に関連する複雑さにより、合成生体材料は天然の細胞外マトリックスと細胞外マトリックスに結合された成長因子の調節特性を擬態するために、２次元又は３次元細胞外マトリックスの微小環境擬態体用材料として積極的に開発されてきた（Ｌｕｔｏｌｆ ＭＰ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２３（１）：４７−５５， ２００５； Ｏｇｉｗａｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ．， ２７（２０）：１６３３−７， ２００５）。

【0012】

しかしながら、従来の技術は、物理的又は生化学的な性質の欠如により、少なくとも異なる２種類の細胞表面受容体を同時に活性化させて組合せ的なシグナル伝達経路を誘導する微小環境を作り出すことができない。これに加えて、様々な微小環境合図はしばしば絡み合っており、現在の技術においては別々に調節することができない。例えば、ｔｙｐｅ
Ｉコラーゲン系ヒドロゲルは、３次元の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として広範に用いられるが、生化学的リガンド密度を増加させるためにその濃度を増加させると、マトリックスの機械的剛性において、同時変化を引き起こす（Ｗａｋｉｔａｎｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｆｕｌｌ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｉｎ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ａ １９９８； ４， ４２９−４４； Ｓｕｍａｎａｓｉｎｇｈｅ ＲＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ
ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｕｎｉａｘｉａｌ ｃｙｃｌｉｃ ｔｅｎｓｉｌｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＢＭＰ−２） ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ａ ２００６；１２：３４５９−６５）。

【0013】

このため、本発明者らは、組合せ的な受容体−リガンドの相互作用、制御された空隙の大きさと合成マトリックスの弾性を提供することにより、天然の細胞外マトリックス微小環境を擬態し、生化学的及び物理的に規定された合成微小環境構造物を開発した。本発明の合成微小環境構造物は、細胞接着及び内皮管形成アッセイ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｔｕｂｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）において証明されたように、細胞接着、移動、成長、増殖又は細胞の形態形成などの細胞の挙動を解明したり調節することにより、細胞培養又は組織工学環境をスクリーニングするための細胞培養環境の分析に使用可能である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、生化学的に及び／又は機械的に天然のＥＭＣ微小環境を擬態する合成調節微小環境に関する。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明は、細胞接着、移動、増殖又は分化などの細胞の挙動を正確に調節する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来又は成長因子由来のペプチドモチーフの少なくとも一つ以上を提供する架橋性生体材料組成物を含む合成微小環境を提供する。

【0016】

本発明の一側面によれば、細胞外マトリックス由来（ＥＣＭ）又は成長因子由来のペプチドモチーフの少なくとも一つ以上で機能化された生体材料と架橋剤を含む合成３次元微小環境をその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）作り出すための架橋性生体材料組成物を提供し、前記架橋剤は、広範なｐＨ条件下で共有結合、イオン結合、水素結合及びファンデルワールス相互作用を通じた化学的方法や、分子のもつれや絡合いを通じた物理的な方法、あるいは、化学的及び物理的な方法を同時に用いて架橋反応を媒介することができる。

【0017】

本発明の一実施形態において、様々な細胞外マトリックスタンパク質又は成長因子に由来する少なくとも一つ以上のペプチドモチーフで機能化された組換えタンパク質及び架橋剤からなる合成３次元微小環境を作り出すための架橋性生体材料組成物を提供し、前記架橋剤は、広範なｐＨ条件下で架橋反応を通じて化学的な架橋結合を媒介することができる。

【0018】

任意の好適な組換えタンパク質は、フィブリン、エラスチン、イガイ接着タンパク質を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記タンパク質は、組換えイガイ接着タンパク質である。

【0019】

任意の好適なイガイ接着タンパク質が本発明の生体材料として使用可能である。微小環境を生成する生体材料組成物は、基本的に２種類の成分を含む。第１の成分は、生理活性ペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質である。第２の成分は、架橋剤である。２つの成分は両方とも市販中の材料であるか、あるいは、合成若しくは天然の供給源から得られる。市販タンパク質の例としては、米国サウスカロライナ州ノース オーガスタ所在のコロディスバイオサイエンス社により市販されているＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭが挙げられる。任意の第３の成分は、カスタマイズ可能な微小環境の物理的又は機械的物性などの物理機械的物性を向上させるために前記組成物に添加可能な生体適合性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールやポリビニルアルコール）である。

【0020】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭは、コロディスバイオサイエンス社が開発した材料であり、イガイ接着タンパク質に基づくＥＣＭ擬似材料である。イガイ接着タンパク質は、ＥＣＭ又はＧＦを自然的に誘発する生理活性を擬態するために様々なＥＣＭ又はＧＦ由来のペプチドで組換え的に機能化され、これは、天然の又は組換えＥＣＭタンパク質又はＧＦタンパク質と比較したとき、１次細胞培養において天然の又は組換えＥＣＭ又はＧＦと略同じ生理活性を有することが裏付けられている。このように予めデザインされたＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ擬似体は、細胞外マトリックス微小環境の製造に際して大きなメリットを有する。例えば、細胞特異的又はユーザー定義により調整される細胞外微小環境を提供して、生化学的な合図の側面からみて、天然の微小環境を擬態することができる。

【0021】

前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭは、生理活性ペプチドで組換え技術により機能化されたイガイ接着タンパク質であり、配列番号１０〜１３よりなる群から選ばれるイガイ足糸タンパク質ＦＰ−５（配列番号２）の第１のペプチド、及び配列番号１乃至３よりなる群から選ばれるイガイＦＰ−１、イガイＦＰ−２（配列番号４）、配列番号５乃至８よりなる群から選ばれるＦＰ−３、イガイＦＰ−４（配列番号９）、イガイＦＰ−６（配列番号１４）及びその断片よりなる群から選ばれる少なくとも一つの第２のペプチドを含む融合タンパク質である。ここで、前記第２のペプチドは、ＦＰ−５のＣ−末端、Ｎ−末端、又はＣ−及びＮ−末端と接続される。好ましくは、第２のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＦＰ−１である。

【0022】

本発明において、生理活性ペプチドは、天然の細胞外マトリックスの微小環境を擬態するために必要である。また、例えば、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）又は物質Ｐなどの成長因子のような追加成分が含まれて、細胞及び組織培養、医療機器及び治療又は他の関連する適用分野において細胞外マトリックス擬似体の有利な効果をさらに向上させることができる。

【0023】

生理活性ペプチドは細胞外マトリックスタンパク質又は成長因子に由来して天然の細胞外微小環境の生化学的又は生物理学的合図を擬態する天然の又は合成ペプチドである。前記細胞外マトリックスタンパク質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、成長因子などの繊維状タンパク質であってもよい。ＥＣＭタンパク質は、インテグリンなどの接着活性に直接的に影響を及ぼすことがあり、インテグリンンなどの接着受容体は、再び多価の細胞外マトリックスタンパク質と結合した後に焦点接着複合体（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）内において、キナーゼ及びアダプタタンパク質で共にクラスターを形成する（ｃｏ−ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）ことにより、シグナル伝達経路を活性化させることができる。例えば、フィブロネクチン、ラミニン又はビトロネクチン由来のＲＧＤ含有ペプチド断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、インテグリンの活性を調節することができる。

【0024】

組合せ的なシグナル伝達を誘導するために、共に微小環境を生成する細胞外マトリック
スタンパク質由来のペプチドモチーフの好適な組み合わせは、ＥＣＭタンパク質又は成長因子から選ばれる。前記ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ヘパリン結合ドメイン、エンタクチン又はフィブリノゲンから選ばれる。例えば、インテグリンα１β１を活性化するＧＦＰＧＥＲ（配列番号２２）を含有するコラーゲンタイプＩ由来のＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭと、インテグリンαｖβ３を活性化するＩＫＶＡＶ（配列番号３７）を含有するラミニン由来のＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭの混合物は、２種類の異なるインテグリンαｖβ３−α１β１を同時に活性化させて内皮管形成を誘導することができる。前記成長因子は、繊維芽細胞成長因子、形質転換成長因子、神経成長因子、表皮成長因子、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦから選ばれる。

【0025】

好ましくは、ペプチドモチーフの好適な組み合わせは、式Ａ−Ｂ又はＡ１−Ｂ１を有し、前記Ａは、インテグリンαｖβ３、αｖβ５、ヘパリン又はシンデカンを活性化するペプチドモチーフであり、前記Ｂは、インテグリンα１β１、α３β１、α４β１、α５β１又はα６β１を活性化するペプチドモチーフである。Ａ１は、成長因子受容体を活性化するペプチドモチーフであり、Ｂ１は、インテグリン、ヘパリン又はシンデカンを活性化するモチーフである。

【0026】

より好ましくは、インテグリンαｖβ３、αｖβ５又はシンデカンを活性化するための好適なペプチドモチーフ（Ａ）は、ＩＤＡＰＳ（配列番号６０）、ＩＫＶＡＶ（配列番号３７）、ＲＱＶＦＱＶＡＹＩＩＩＫＡ（配列番号３６）、ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ（配列番号４７）、ＭＮＹＹＳＮＳ（配列番号３１）、ＲＧＤＶ（配列番号６３）、ＷＱＰＰＲＡＲＩ（配列番号５７）、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号４０）、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧ（配列番号４１）、ＳＰＰＲＲＡＲＶＴ（配列番号５６）、ＫＮＮＱＫＳＥＰＬＩＧＲＫＫＴ（配列番号５８）、ＧＤＬＧＲＰＧＲＫＧＲＰＧＰＰ（配列番号９８）、ＡＴＥＴＴＩＴＩＳＷＲＴＫＴＥ（配列番号９９）、ＴＬＦＬＡＨＧＲＬＶＦＭ（配列番号１００）、ＫＧＨＲＧＦ（配列番号２１）、ＦＲＨＲＮＲＫＧＹ（配列番号１０１）、ＫＲＳＲ（配列番号１０２）、ＦＨＲＲＩＫＡ（配列番号１０３）、ＨＡＶ（配列番号１０４）、ＡＤＴＰＰＶ（配列番号１０５）、ＤＱＮＤＮ（配列番号１０６）から選ばれる。インテグリンα１β１、α２β１,α３β１、α４β１、α５β１又はα６β１を活性化するための他の好適なペプチドモチーフ（Ｂ）は、表１に示す群から選ばれる。

【0027】

【表1】

【0028】

本発明の一実施形態において、インテグリンαｖサブタイプとインテグリンβサブタイプの両方の活性を組合せ的に調節する合成微小環境が提供される。前記イガイ接着タンパク質は、主としてコラーゲンタイプＩに由来してα２β１を標的とするＧＦＰＧＥＲ（配
列番号２２）などのペプチド、及びラミニンに由来してαｖβ３を標的とするＩＫＶＡＶ（配列番号３７）などのペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質からなる、機能化されたイガイ接着タンパク質の組み合わせである。

【0029】

本発明の一実施形態において、インテグリンα又はこのサブタイプとインテグリンβの両方の活性を組合せ的に調節する合成微小環境が提供される。前記イガイ接着タンパク質は、主としてコラーゲンタイプＩに由来してα２β１を標的とするＧＦＰＧＥＲ（配列番号２２）などのペプチド、及びフィブロネクチンに由来してα５β１を標的とするＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）などのペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質からなる、機能化されたイガイ接着タンパク質の組み合わせである。

【0030】

本発明の一実施形態において、インテグリン若しくはインテグリンのサブタイプ及びヘパリンの両方の活性を組合せ的に調節する合成微小環境が提供される。イガイ接着タンパク質は、主としてコラーゲンタイプＩに由来してα２β１を標的とするＧＦＰＧＥＲ（配列番号２２）などのペプチド、及びコラーゲンタイプＩに由来してヘパリンを標的とするＫＧＨＲＧＦ（配列番号２２）などのペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質からなる、機能化されたイガイ接着タンパク質の組み合わせである。

【0031】

本発明の一実施形態において、インテグリン若しくはインテグリンのサブタイプ及び成長因子受容体の両方の活性を組合せ的に調節する合成微小環境が提供される。イガイ接着タンパク質は、主としてフィブロネクチンに由来してα５β１を標的とするＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）などのペプチド、及びＦＧＦに由来してＦＧＦ受容体；ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを標的とするＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）などのペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質からなる、機能化されたイガイ接着タンパク質の組み合わせである。

【0032】

本発明の他の実施形態において、前記イガイ接着タンパク質は、ＦＰ−１５１融合タンパク質であり、前記タンパク質は、フィブロネクチン由来のペプチドであるＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）ペプチドで遺伝子組換え技術により機能化されてフィブロネクチンリッチ（ｒｉｃｈ）な細胞外マトリックスを擬態するヒドロゲルを形成する。

【0033】

本発明に用いて好適な化学的に架橋剤は、天然の又は合成起源の、任意の生体的合成ポリマーであってもよい。好ましくは、架橋剤は適切な官能基を有して、イガイ接着タンパク質と直接的に又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を介して共有結合的に結合可能な合成ポリマーである。このような条件を満たす任意のポリマーが本発明に使用可能であり、特定のポリマーの選択、このようなポリマーの確保又は製造は、この技術分野において公知の任意の方式により行われる（参考文献：Ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ｅｄ． Ｂｒｏｎｚｉｎｏ， Ｓｅｃｔｉｏｎ ４， ｅｄ． Ｐａｒｋ ）。このような架橋性ポリマーとして好適なものは、ポリ（アルキレンオキシド）、特に、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリペプチド、ポリリシンなどのポリアミノ酸、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、ポリエステル、ポリホスファゼン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）及びこれらのグラフト（ｇｒａｆｔ）ポリマーを含むコーポリマーよりなる群から選ばれる。

【0034】

前記ポリマーは、一般に、最小１，０００から数百万ダルトン（Ｄａ）までの様々な範囲の分子量を有するように選ばれる。好ましくは、選ばれたポリマーは、分子量が約３０，０００〜５０，０００ダルトンであってもよく、ポリマーそのものの分子骨格が分解可能なものであってもよい。分解可能なポリマー骨格を有するポリマーは、例えば、ポリ（グリコール酸）及びポリ（乳酸）を含むポリ（ａ−ヒドロキシ酸）の脂肪族ポリエステルのように骨格内にエステル基を含有するポリマーなどその内部に加水分解性基を有する骨
格を有するポリマーを含む。分子骨格そのものが分解可能であるときには、このような分解性を提供するために必ずしも低分子量のポリマーである必要はない。

【0035】

本発明の一実施形態において、その場で形成可能た３次元細胞外マトリックスを擬態する組成物が提供される。前記組成物は、マルチアーム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ａｒｍ）ＰＥＧと天然の細胞外マトリックスの３次元細胞外マトリックス微小環境を擬態したイガイ接着タンパク質を含む。マルチアームＰＥＧは、４アーム、６アーム、８アーム若しくは１０アームＰＥＧから選ばれる。好ましいマルチアームＰＥＧは、４アーム〜８アームから選ばれる。最も好ましいマルチアームＰＥＧは、６アーム及び８アームＰＥＧである。

【0036】

他の好ましい一実施形態において、好適な化合物は、４〜８アームＰＥＧ−コハク酸、４〜８アームＰＥＧ−グルタル酸、４〜８アームＰＥＧ−スクシミジルスクシネート、４〜８アームＰＥＧ−スクシミジルグルタレート、４〜８アームＰＥＧ−アクリレート又は４〜８アームＰＥＧ−プロピオンアルデヒドよりなる群から選ばれるいずれか一種である。

【0037】

８アームＰＥＧ−ＳＧからなる合成微小環境形成組成物が、ＥＣＭ由来のペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質とによって容易に形成可能であるか、あるいは、イガイ接着タンパク質又は６アームＰＥＧ−アミンなどとのイガイ接着タンパク質の混合物によって、６アームＰＥＧ−ＳＧからなるヒドロゲル形成組成物が形成可能である。本発明において用いるＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ及びマルチアームＰＥＧから形成されたＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌは、ＰＣＴ／ＫＲ２０１１／００１８３１（Ａｄｈｅｓｉｖｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｉｍｉｃ）に記述されており、参照することにより本書に組み込まれる。

【0038】

本発明の一実施形態において、内皮の形態形成のための合成微小環境が提供され、前記微小環境は、血管新生を引き起こすインテグリンを媒介する組み合わせのシグナル伝達を提供する。

【0039】

内皮細胞は、広範なインテグリンサブユニットを発現する。血管内皮細胞は、αｖβ３、αｖβ５、α１β１、α２β１、α３β１、α５β１、α６β１、α６β４を含むインテグリンのサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）を発現し、これらのインテグリンはリガンドの組み合わせと結合する。

【0040】

α１β１、α３β１及びα５β１は、静止血管において低レベルで発現されるが、血管形成の間に少なくともα５β１の発現を上方に調節する（Ｋａｉｒｂａａｎ Ｍ， ｅｔ
ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ （２００３） ３１４：１３１−１４４）。

【0041】

αｖβ３、αｖβ５及びα２β１は、静止血管においてほとんど検出されないが、スプラウト（ｓｐｒｏｕｔ）においてはその発現量が大幅に増加する（Ｍａｘ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ （１９９７） ３３：２０８−２０８）。

【0042】

本発明の一実施形態において、内皮管形成などの細胞形態形成をするための内皮細胞によって活用されたβ１インテグリンを含有するヘテロダイマーを調節する合成３次元微小環境が提供される。

【0043】

インテグリンは、細胞表面接着分子の上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）であり、１８個の異なるα鎖（α１−α１１、αｖ、αＩＩｂ、αＬ、αＭ、αＸ、αＤ、αＥ）と８個の異なるβ鎖（β１−β８）がヘテロダイマーとして非共有結合的に会合する。インテグ
リンは、細胞と細胞との間の相互作用及び細胞とマトリックスとの間の相互作用を媒介するのに重要な役割を果たし、細胞増殖、生存、分化及び移動などの細胞の主な機能に関与している。

【0044】

内皮細胞（ＥＣ）において、αｖなどのいくつかの種類のインテグリンにより媒介される細胞−マトリックス相互作用は、細胞の形態形成の重要なモジュレーターである（Ｓｔｕｐａｃｋ ＤＧ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． ２００４， ６４：２０７−３８ ＷｉｃｋｓｔｒＳＡ， ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；９４：１９７−２２９）。

【0045】

前記αｖインテグリンサブユニットは、４個の異なるβサブユニット（β３、β５、β６及びβ８）と、同様にβ１と選択的に対をなし、順に１ダースの他のαサブユニットと対をなすことができる。

【0046】

β１インテグリンは、血管形成の生成に際しての間に、ＥＣの接着、移動と生存に必要である（Ｃａｒｌｓｏｎ ＴＲ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． ２００８； １３５（１２）：２１９３−２０２）。

【0047】

前記β１サブユニットは、少なくとも１０個の異なるαサブユニットと結合して最大のインテグリンサブファミリを構成する。β１インテグリンサブファミリの要素は、主としてフィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンなどの細胞外マトリックス成分と結合するが、一部のβ１インテグリンサブユニットは、細胞−細胞接着に直接的に関与する（Ｈｙｎｅｓ， １９９２； Ｈａａｓ ａｎｄ Ｐｌｏｗ， １９９４）。

【0048】

一実施形態において、細胞形態形成のための合成微小環境が提供される。前記合成微小環境は、内皮細胞が形態形成のために活用されるβ１インテグリンを含有するヘテロダイマーを調節するＭＡＰＴｒｉｘ^TM 組成物を含む。本発明に好適なＭＡＰＴｒｉｘ^TM 組成物は、２以上の異なる生理活性ペプチドモチーフを提供し、前記ペプチドモチーフのうちの一つはαｖを含有するインテグリンを調節し、もう一つはβ１を含有するインテグリンを調節する。好ましくは、β１インテグリンを含有するヘテロダイマーは、α２β１又はα５β１から選ばれる。好ましい一実施形態において、前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM 組成物は、α２β１とαｖβ３インテグリンを同時に調節する。他の好ましい一実施形態において、前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ組成物は、α５βとαｖβ３１インテグリンを同時に調節する。

【0049】

また、本発明は、弾性率が調節された微小環境を提供し、この細孔径は、生体材料組成物に対するエンハンサーを添加することにより一貫している。

【0050】

本発明のエンハンサーは、イガイ接着タンパク質と架橋剤との間の架橋ポリマーから形成された分子鎖を物理的に絡み合わせることにより相互侵入鎖（ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｃｈａｉｎｓ）を形成する。生成された微小環境は、調節された弾力性を提供することができる。

【0051】

前記エンハンサーは、架橋性又は非架橋性の、天然の、半合成の又は合成物質から選ばれる。

【0052】

エンハンサーは、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、キチン、キトサン及びこれらの誘導体を含む群から選ばれる一種以上の多糖、セルロース及びこれらの誘導体であってもよいが、これらに限定されない。加えて、エンハンサーは、コラーゲン、フィブリノゲン、ゼラチン及びその誘導体を含む群から選ばれるポリペプチド又はタンパク質であってもよいが
、これらに限定されない。前記半合成の又は合成ポリマーは、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）から選ばれる。ホモ又はコーポリマーは、メタアクリルアミド、メタアクリル酸およびその塩、メタ（アクリレート）、エチレングリコール、エチレンオキシド、スチレンスルホネート、ビニルアセテート又はビニルアルコールから選ばれるモノマーからなる。

【0053】

好適なエンハンサーは、キトサン又はキチンを含む自然的に発生する多糖、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（乳酸）などの合成ポリマーのホモ又はコーポリマーである。

【0054】

一実施形態において、マルチアームＰＥＧ−ＳＧからなる弾性的に調節された微小環境形成組成物は、ＥＣＭ由来のペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質とエンハンサーで容易に形成されて、イガイ接着タンパク質−マルチアームＰＥＧの弾性を増加させるか、あるいは、イガイ接着タンパク質又は６アームＰＥＧ−アミンなどとのイガイ接着タンパク質の混合物によって、６アームＰＥＧ−ＳＧからなるヒドロゲル形成組成物が形成される。

【0055】

一実施形態において、その場で形成可能な、弾性的に調節された微小環境を形成する細胞外マトリックスを擬態した組成物が提供される。前記組成物は、マルチアームＰＥＧ、ＧＲＧＤＳＰを含有するイガイ接着タンパク質及びエンハンサーからなり、天然の細胞外マトリックスの微小環境を擬態する。マルチアームＰＥＧは、４アーム、６アーム、８アーム、１０アーム又は１２アームＰＥＧから選ばれる。好ましいマルチアームＰＥＧは、４〜８アームから選ばれる。最も好ましいマルチアームＰＥＧは、４、６及び８アームＰＥＧである。

【0056】

他の好ましい一実施形態において、好適な化合物は、４〜８アームＰＥＧ−コハク酸、４〜８アームＰＥＧ−グルタル酸、４〜８アームＰＥＧ−スクシミジルスクシネート、４〜８アームＰＥＧ−スクシミジルグルタレート、４〜８アームＰＥＧ−アクリレート又は４〜８アームＰＥＧ−プロピオンアルデヒドよりなる群から選ばれるいずれか一種である。

【0057】

本発明は、生体材料組成物における濃度向上剤を選ぶことにより、容易に調節可能な弾性を有する細胞外微小環境を提供し、これは、空隙径などの物理的な合図と生化学的な合図が一致している。

【0058】

一実施形態において、０．１ｋＰａ〜２ｋＰａの弾性を有する微小環境を提供する生体材料組成物を提供し、このとき、平均的な空隙径は１００μｍであり、これは、生化学的な合図と一致する。

【0059】

足場の空隙径は、足場内における細胞の挙動に影響を及ぼし、このような空隙径のわずかな変化は、細胞の挙動に大きな影響を与えることができる。

【0060】

空隙が大き過ぎる場合には、足場の機械的性質は空隙容量により損なわれ、空隙径がさらに増加すると、比表面積は、最終的に、細胞接着を制限するレベルにまで減少する。

【0061】

細胞活性は、細胞と周りのＥＣＭとの間の特異的なインテグリン−リガンド相互作用により影響を受ける。初期の細胞接着は、足場内における増殖、移動及び分化などの全ての後発事象を仲介する。その結果、足場内の平均的な空隙径は、細胞接着、次の増殖、移動及び浸入に影響を及ぼす。このため、細胞移動のための適正な空隙径と細胞接着のための特異的な表面領域との間のバランスを維持することが重要である（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ．
（Ｍａ Ｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｎａｎｏｆｉｂｅｒ ｍａｔｒｉｘ ａｓ ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．２００５． １１ （１ −２）：１０１−９．； Ｋａｒａｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｖ， Ｋａｐｌａｎ Ｄ． Ｐｏｒｏｓｉｔｙ ｏｆ ３Ｄ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． （２００５） ２６（２７）：５４７４−９１．）

【0062】

表２にまとめて示すように、最適な空隙径は、様々な細胞類型に応じて変化する （（０’Ｂｒｉｅｎ ＦＪ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ｏｎ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＧＡＧ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２００５； ２６（４）：４３３−４１）。最近の研究においては、ＣＧ足場の狭い範囲の上に接種して３週間骨形成培地で維持された間充織幹細胞は、より大きな空隙を有する足場に改善された骨形成を示すことが報告されている（Ｂｙｒｎｅ ＥＭ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｂｙ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐｏｒｏｕｓ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｉｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｓｃｉ Ｍａｔｅｒ Ｍｅｄ． ２００８ Ｎｏｖ； １９（１ １）：３４５５−６３）。

【0063】

【表2】

【0064】

また、本発明は、インテグリンとの相互作用により前記細胞の挙動に相乗効果を誘導する成長因子を擬態するペプチドモチーフが存在することにより、細胞の成長、増殖又は分化をより正確に調節する合成微小環境を提供する。

【0065】

成長因子は、細胞増殖及び分化を調節可能な自然発生的なポリペプチドである。成長因子は、組織の発生、再生及び創傷治癒を含む種々の生理的過程の調節において重要である。

【0066】

繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）は
、ほとんどの細胞を刺激してＦＧＦへの分裂及び非有糸分裂を促す。ＦＧＦは、創傷治癒への細胞移動（走化性）、血管形成（血管新生）、神経細胞再生調節（神経細胞成長を誘導する）及び特定の細胞における発現、細胞生存の促進又は抑制を活性化することができる（Ｏｒｎｉｔｚ ａｎｄ Ｉｔｏｈ， Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００１ ２（３）， ３００５．１−３００５．１２）。

【0067】

今日、酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子を含む２３種からなるＦＧＦが知られており、各ＦＧＦは、活性ドメインとして、カノフィン（ｃａｎｏｆｉｎ）、ヘキサフィン（ｈｅｘａｆｉｎ）、デガフィン（ｄｅｃａｆｉｎ）モチーフを有する（Ｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２００８ Ｆｅｂ；１０４（３）：６６７−８２．， Ｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｄｅｖ
Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２００９． ６９（１３）：８３７−５４．， Ｓｈｉｚｈｏｎｇ Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｉｔｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．
Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１０； １１（６）： ２２９１−２３０５）。

【0068】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦ擬似体は、天然の又は組換え繊維芽細胞成長因子と類似する生物活性を有し、イガイ接着タンパク質は、酸性ＦＧＦ由来のペプチドＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤＧＬＬＹＧＳ（配列番号９１）、ＷＦＶＧＬＫＫＮＧ ＳＣＫＲＧ（配列番号９２）、塩基性ＦＧＦ由来のペプチドＨＦＫＤＰＫＲＬ ＹＣＫ（配列番号９３）、ＦＬＰＭＳＡＫＳ（配列番号９４）、ＫＴＧＰＧＱＫＡＩＬ（配列番号９５）、ＡＮＲＹＬＡＭＫＥＤＧＲＬＬＡＳ（配列番号９６）及びＷＹＶＡＬＫＲＴＧＱＹＫＬＧ（配列番号９７）、ＦＧＦ−３由来のペプチドＳＧＲＹＬＡＭＮＫＲＧＲＬＹＡＳ（配列番号１０７）、ＦＧＦ−９由来のペプチドＳＧＬＹＬＧＭＮＥＫＧＥＬＹＧＳ（配列番号１０８）、ＦＧＦ−Ｉ０由来のペプチドＳＮＹＹＬＡＭＮＫＫＧＫＬＹＧＳ（配列番号１０９）、ＦＧＦ−１７由来のペプチドＳＥＫＹＩＣＭＮＫＲＧＫＬＩＧＫ（配列番号１１０）を含む繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）で組換え技術により機能化された。

【0069】

本発明の実施形態において、インテグリン−繊維芽細胞成長因子擬似体の相互作用により存在するペプチド（配列番号９３）で組換え技術により機能化されたイガイ接着タンパク質により、内皮の管形成を促す合成微小環境が提供される。

【0070】

同様に、イガイ接着タンパク質は、ＴＧＦ−α由来のペプチドＨＡＤＬＬＡＶＶＡＡＳＱ（配列番号１１１）、ＴＧＦ−β由来のペプチドＫＶＬＡＬＹＮＫ（配列番号１１２）、ＥＧＦ由来のペプチドＣＭＨＩＥＳＬＤＳＹＴＣ（配列番号１１３）、ＮＧＦ由来のペプチドＰＥＡＨＷＴＫＬＱＨＳＬＤＴＡＬＲ（配列番号１１４）、ＰＤＧＦ由来のペプチドＳＶＬＹＴＡＶＱＰＮＥ（配列番号１１５）、ＶＥＧＦ由来のペプチドＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ（配列番号１１６）を含む、様々な成長因子タンパク質由来のペプチドで、組換え技術により機能化される。

【0071】

８アームＰＥＧ−ＳＧからなる合成微小環境形成組成物は、ＥＣＭ由来のペプチドで機能化されたイガイ接着タンパク質で容易に形成されるか、あるいは、６アームＰＥＧ−ＳＧからなるヒドロゲル形成組成物は、イガイ接着タンパク質又は６アームＰＥＧ−アミン
などとのイガイ接着タンパク質の混合物から形成される。

【0072】

本発明は、ヒアルロン酸を含む生体材料組成物からなる合成微小環境を提供する。ヒアルロン酸（また、ヒアルロナン又はヒアルロン酸塩又はＨＡ）は、連結性の、上皮の、神経の組織全体に分散されたアニオン性の、非硫酸化型のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）である。細胞外マトリックスを構成する主要成分として、ヒアルロン酸は、細胞増殖及び移動、及び細胞性成長因子及び栄養成分の貯蔵及び拡散に大きく貢献する。また、細胞間の間隔を維持する役割も果たす（Ｊ． Ｎｅｃａｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ （ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）： ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｎｉ Ｍｅｄｉｃｉｎａ， ５３， ２００８ （８）： ３９７−４１１）。

【0073】

しかしながら、イガイ接着タンパク質はリジン（ｌｙｓｉｎｅ）リッチであるためプラスに帯電され、ヒアルロン酸はマイナスに帯電され、したがって、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMとヒアルロン酸との間の静電気相互作用により凝集体を形成するため、ヒドロゲルを形成することは困難である。

【0074】

一実施形態において、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM及びヒアルロン酸からなるヒドロゲルは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMをＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）させてリジン残基のアミン基とヒアルロン酸のカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）との間の静電相互作用を減少させることにより形成することができる。

【0075】

タンパク質のＰＥＧ化は、最先端の技術であり、タンパク質治療のデリバリーを高めるために使用されている。ロバートらにより開示されたＰＥＧ化技術の典型的な例は、本発明において使用することができる（Ｒｏｂｅｒｔｓ ＭＪ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ． Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ２００２． ５４（４）：４５９−７６．及びＢａｉｌｏｎ Ｐ， Ｗｏｎ ＣＹ．， ＰＥＧ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． ２００９． ６（１）：１−１６）。

【0076】

本発明に用いられるヒアルロン酸は、一般に、１，０００ダルトンから３百万ダルトン（Ｄａ）までの広範な分子量を有するものから選ばれる。好ましくは、分子量が１万ダルトンから５０万ダルトンまでであるヒアルロン酸のうちから選ばれる。

【0077】

細胞外マトリックスの特殊な形態である基底膜は、４種類の主成分（ラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン及びペルレカン）からなり、全体の９８％を構成し、ヒアルロン酸、ヘパランやコラゲナーゼを含む残りの２％を構成する（Ｖａｌｅｒｉｅ Ｓ． ＬｅＢｌｅｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２００７ ２３２（９）． １１２１−１１２９）。

【0078】

一実施形態において、一般に、ヒアルロン酸の重量比は制限されないが、合成微小環境の組成は、天然の細胞外マトリックスと同様であり、例えば、好ましくは、ヒアルロン酸の重量比は０．１〜４０重量％、さらに好ましくは、０．５〜２重量％である。

【0079】

本発明は、構造調節された合成微小環境を提供する。形態などの足場構造（ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）は、細胞結合や拡散に影響を及ぼすことがよく知られている。例えば、マイクロスケールの構造を有する足場に結合する細胞は、まるで平らな表面において培養されるかのように平らに広がる。ナノスケールの構造物は、タンパク
質を吸収するためにより大きな表面積を有し、細胞膜受容体と相互作用するはるかに多くの結合部位が存在し、細胞の形状や活性に大きな影響を与える（Ｍ． Ｍ． Ｓｔｅｖｅｎｓ ａｎｄ Ｊ． Ｈ． Ｇｅｏｒｇｅ， Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．３１０ （２００５） １１３５−８）。

【0080】

多孔性及び細孔構造に関して、多孔性と細孔構造は、細胞の生存、増殖及び移動に重要な役割を果たすため、合成３次元微小環境を設計するの重要な要素である（Ａｎｎａｂｉ
Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｒｏｓｉｔｙ ａｎｄ
Ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｂ Ｒｅｖ． ２０１０． １６（４）：３７１−８３）。ヒドロゲルの空隙率は、ＰＥＧの分子量、濃度、酸性度、ゲル化温度及びゲル化時間に依存する。

【0081】

本発明は、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMの濃度と分子量、及びマルチアームＰＥＧの濃度を調節することにより、空隙率及び空隙構造が調節された微小環境のための架橋性生体材料組成物を提供する。

【0082】

本発明の一実施形態において、合成微小環境の空隙径は、０．１〜１，０００μｍである。好ましくは、０．１〜１００μｍの空隙を有する合成微小環境である。

【0083】

また、本発明は、ＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｘ−ＮＨ_２又はＭＡＰ−ＥＣＭ１−Ｘ−ＥＣＭ２−Ｙ−ＮＨ_２の式のうちのいずれか一方を有するマトリクリプティック部位を提示することによって、調節微小環境を提供する。このとき、前記ＭＡＰは、組換えイガイ接着タンパク質であり、ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ３、ＦＰ４、ＦＰ５、ＦＰ６若しくは配列番号１５のＦＰ−１５１融合タンパク質を含むそれらとの組み合わせから選ばれ、前記ＥＣＭは、細胞外マトリックス若しくは成長因子由来のペプチドモチーフであり、前記Ｘ及びＹは、酵素による分解速度が同一又は異なる酵素感受性ペプチドモチーフである。

【0084】

前記式に存在する末端アミン基は、マルチアームＰＥＧで架橋して、図１に示すように、マトリクリプティック部位を有するヒドロゲルを形成するために使用可能である。

【0085】

マトリクリプティック部位は、ＥＣＭタンパク質内に存在する生物学的に活性な配列であり、分子の可溶型では露出されないが、タンパク質の構造的または立体構造の変化が起こると発言することができる。これらの配列は、結合組織内においてシグナル伝達部位の固有の制限を示し、ＥＣＭのリモデリングが起こる様々な条件で外部に露出されて活性化される。マトリクリプティック部位の発現を促すメカニズムは、タンパク質の多量体化、タンパク質分解及び機械力を含む（Ｄａｖｉｓ ＧＥ， ｅｔ ａｌ，． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｊｕｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｍａｔｒｉｃｒｙｐｔｉｃ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２０００； １５６： １４８９−１４９８）。

【0086】

生体内での細胞の微小環境は、化学的及び生物物理的な合図の時空間パターンにより定義され、細胞の挙動は、時空を超えて変化する細胞外環境内のこれらの合図により正確に調節される（Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｎ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ
ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ． ２０１０ Ｏｃｔ；１２（５）：７８７−９５）。

【0087】

このため、動的側面、すなわち、外部刺激による細胞と基質との間の相互作用を調節する能力が導入されれば、細胞培養や再生医療への応用のための表面設計においてより多くの機会が開かれる。

【0088】

本発明者らのアプローチは、マトリクリプティック部位をイガイ接着タンパク質内に含めることである。マトリクリプティック部位は、ＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｘ−ＮＨ_２又はＭＡＰ−ＥＣＭ１−Ｘ−ＥＣＭ２−Ｙ−ＮＨ_２の式を有するＥＣＭ由来のペプチド内に組み込まれた少なくとも一つ以上の酵素感受性ペプチドを含む。

【0089】

前記マトリクリプティック部位含有イガイ接着タンパク質を含むヒドロゲル形成組成物は、３次元微小環境を含むマトリクリプティック部位を容易に形成することができる。ヒドロゲルの分解は、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼやコラゲナーゼなどの細胞が分泌する酵素を解して起こるように操作することができる。ヒドロゲルの分解が始まると、細胞はＥＣＭペプチドに露出されて、細胞の挙動を調節するシグナル伝達現象が誘発される。

【0090】

好適な酵素感受性ペプチドモチーフは、コラゲナーゼ、エラスターゼ、因子ＸＩＩＩａ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）若しくはトロンビンに由来する。

【0091】

好ましくは、ＭＭＰ由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＧＰＱＧＩＡＧＱ（配列番号６５）、ＧＰＱＧＩＡＳＱ（配列番号６６）、ＧＰＱＧＩＦＧＱ（配列番号６７）、ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号６８）、ＧＰＶＧＩＡＧＱ（配列番号６９）、ＧＰＱＧＶＡＧＱ（配列番号７０）又はＧＰＱＧＲＡＧＱ（配列番号７１）である。

【0092】

好ましくは、コラゲナーゼ由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＬＧＰＡ（配列番号７２）又はＡＰＧＬ（配列番号７３）である。

【0093】

好ましくは、因子ＸＩＩＩａ由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＮＱＥＱＶＳＰ（配列番号７４）である。

【0094】

好ましくは、エラスターゼ由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号７５）である。

【0095】

好ましくは、プラスミン由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＹＫＮＲ（配列番号７６）、ＮＮＲＤＮＴ（配列番号７７）、ＹＮＲＶＳＥＤ（配列番号７８）、ＬＩＫＭＫＰ（配列番号７９）又はＶＲＮ（配列番号８０）である。

【0096】

好ましくは、トロンビン由来の酵素感受性ペプチド断片は、ＧＬＶＰＲＧ（配列番号８１）である。

【0097】

本発明の一実施形態において、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＩＫＶＡＶ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ（配列番号８２）、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＧＦＰＧＥＲ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ（配列番号８３）、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＧＲＧＤＳＰ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ（配列番号８４）又はＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＧＲＧＤＳＰ−ＩＫＶＡＶ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ（配列番号８５）の式を有するラミニン由来のペプチドモチーフに組み込まれたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチドモチーフによって、組換え技術により機能化されたイガイ接着タンパク質を含む、調節された３次元微小環境の酵素消化性組成物が提供される。

【0098】

本発明の一実施形態において、ＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＩＫＶＡ
Ｖ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ−ＧＦＰＧＥＲ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号８６）又はＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＩＫＶＡＶ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ−ＧＲＧＤＳＰ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号８７）の式を有するコラーゲンタイプＩおよびラミニン由来のペプチドモチーフに組み込まれたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチドモチーフによって、組換え技術により機能化されたイガイ接着タンパク質ＦＰ−１（配列番号３）若しくはＦＰ−１５１（配列番号１５）を含む、調節された３次元微小環境の酵素消化性組成物が提供される。

【0099】

本発明の他の実施形態において、ＦＰ−１（配列番号３）及びＦＰ−１５１（配列番号１５）の間に組み込まれているＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＩＫＶＡＶ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ−ＧＦＰＧＥＲ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号８６）又はＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫＡＫＰＳＹＰＰＴＹＫ−ＩＫＶＡＶ−ＧＰＱＧＩＡＧＱ−ＧＲＧＤＳＰ−ＧＰＱＧＩＷＧＱ（配列番号８７）の式を有するコラーゲンタイプＩ又はラミニン由来のペプチドモチーフに組み込まれたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチドモチーフによって、組換え技術により機能化されたイガイ接着タンパク質ＦＰ−１（配列番号３）若しくはＦＰ−１５１（配列番号１５）を含む、調節された３次元微小環境の酵素消化性組成物が提供される。

【0100】

本発明は、特定の細胞の挙動を調節するために組み合わせシグナル伝達を誘導する最適な合成微小環境をスクリーニング又は設計するペプチドモチーフの組み合わせを同定するためのハイスループット・スクリーニング（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）に使用可能である。再生医療及び創薬の分野において、幹細胞の適切な分化環境をスクリーニングすることは特に緊急の課題である。

【0101】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルは、ハイスループット・スクリーニングのためのヒドロゲルアレイの形でありうる。「ヒドロゲルアレイ」は、２以上のマイクロローケーション（ｍｉｃｒｏｌｏｃａｔｉｏｎ）の組み合わせである。好ましくは、前記アレイは、アドレス可能な行および列においてマイクロローケーションで構成される。本発明により製造されるＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲル及び／又はヒドロゲルアレイの厚さ及び寸法は、エンドユーザーのニーズに応じて変更可能である。

【0102】

また、本発明は、
（ａ）架橋性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物を得るステップと、
（ｂ）前記架橋性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物を固体支持体上に一定のパターンで配置するステップと、
（ｃ）前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物を架橋してＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルアレイを得るステップと、
を含むＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルアレイ装置を提供する。

【0103】

本発明の一実施形態において、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルアレイが提供される。前記アレイは、１２×８ウェルの取り外し可能なストリップからなる９６ウェルマイクロタイタープレートである。前記ストリップ内の各々のウェル（合計で７ウェル）は、異なるＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ組成物で予めコーティングされて異なる３次元微小環境を生成し、再構成された基底膜がコーティングされた一つの列がポジティブコントロールとして用いられる（図１参照）。目的の細胞を各々のウェルに接種し、それによって細胞を異なる３次元微小環境において培養することができる。前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルアレイを用いたアッセイにより、所望の細胞挙動を誘導する合成３次元微小環境を同定及びデザイン可能である。

【図面の簡単な説明】

【0104】

本発明の上述および他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて読むことにより、以下の実施形態から明らかである。

【図1】図１は、調節された３次元微小環境を概略的に示すものであり、１Ａ）はＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｘ−ＮＨ_２から形成されたヒドロゲル、１Ｂ）は、ＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｘ−ＮＨ_２及びＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｙ−ＮＨ_２の混合物から形成されたヒドロゲルであり、前記Ｘ及びＹは、異なる酵素分解速度を有する酵素感受性モチーフであり、１Ｃ）は、ＭＡＰ−ＥＣＭ−Ｘ−ＥＣＭ−Ｙ−ＮＨ_２から形成されたヒドロゲルである。。

【図2】図２は、１００μｍの同じ空隙を有する各々の合成マトリックスの弾性率を示す。

【図3a】図３ａ及び図３ｂは、空隙径におけるＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン濃度の影響を示す電子顕微鏡写真である。図３ａは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM濃度１５ｍｇ／ｍｌのヒドロゲルである。

【図3b】図３ｂは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM濃度２０ｍｇ／ｍｌのヒドロゲルである。

【図4a】図４ａ乃至図４ｄは、同一の空隙径を有するが異なる弾性率を有する各々のＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルの電子顕微鏡写真である。図４ａ：８９２Ｐａ。

【図4b】図４ｂ：５７６Ｐａ。

【図4c】図４ｃ：５１０Ｐａ。

【図4d】図４ｄ：６２１Ｐａ。

【図5】図５は、ｔｙｐｅＩＶ細菌性コラゲナーゼより消化された酵素感受性モチーフを含有するＭＡＰを示すものである。ＭＡＰは、組換えイガイ接着タンパク質であり、Ｅ−ＭＡＰは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む様々なコラゲナーゼに対して感受性のあるＭＭＰ感受性モチーフＧＰＱＧＩＡＧＱを含む。

【図6a】図６ａ及び図６ｂは、ケラチノサイトに対する最適な細胞外微小環境をスクリーニングするための微小環境アレイを示す。接着とシグナル分子の組み合わせは、９６ウェルの表面にコーティングされている。ＥＣＭ組成物は、ヘパリンに対するコラーゲン由来のインテグリン結合モチーフと成長因子受容体結合モチーフの様々な重量比を有する。

【図6b】ヘパリンに対するフィブロネクチン由来のインテグリン結合モチーフと成長因子受容体結合モチーフの様々な重量比を有する。

【図7a】図７ａは、内皮管形成を誘導する最適な組み合わせのインテグリン媒介性のシグナル伝達のスクリーニングのための細胞外微小環境アレイのレイアウトを示すものである。

【図7b】図７ｂは、内皮管形成を誘導する最適な組み合わせのインテグリン媒介性のシグナル伝達のスクリーニングのための細胞外微小環境アレイのレイアウトを示すものである。

【図8a】図８ａは、天然の細胞外マトリックスを擬態するためにヒアルロン酸溶液と混合されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液を示すものである。ＰＥＧ化されたＭＡＰＴｒｉｘ^TM溶液は透明であり、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭとヒアルロン酸との混合物は不透明である。Ａ）ヒアルロン酸との混合前のＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液、Ｂ）ヒアルロン酸と混合されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液。左側のバイアルは、ＰＥＧ化されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液が含まれているものであり、右側のバイアルは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチンが含まれているものである。

【図8b】図８ｂは、天然の細胞外マトリックスを擬態するためにヒアルロン酸溶液と混合されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液を示すものである。ＰＥＧ化されたＭＡＰＴｒｉｘ^TM溶液は透明であり、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭとヒアルロン酸との混合物は不透明である。Ａ）ヒアルロン酸との混合前のＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液、Ｂ）ヒアルロン酸と混合されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液。左側のバイアルは、ＰＥＧ化されたＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチン溶液が含まれているものであり、右側のバイアルは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMフィブロネクチンが含まれているものである。

【図9a】図９ａ及び図９ｂは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM微小環境アレイ上において培養されたＨａＣａＴの細胞接着プロファイルである。細胞数は、任意の生理活性ペプチドを有しないＭＡＰＴｒｉｘ^TM上の平均細胞数に対して標準化した。各バーは、３つのウェルの平均値を示す。図９ａ：ＨａＣａＴ付着及び成長において、コラーゲン又はビトロネクチン由来のインテグリンα１β１／α２β１及びヘパリンの組み合わせシグナル伝達の効果。

【図9b】図９ｂ：ＨａＣａＴ付着及び成長において、α１β１／α２β１及び塩基性ＦＧＦ及びＥＧＦ擬似体の組み合わせシグナル伝達の効果。

【図10】図１０は、管形成において、ＥＣＭペプチドモチーフが提示する、単一及び組み合わせの効果を示す。αｖβ３−α２β１組み合わせインテグリン結合モチーフを含むＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭは、内皮管形成において最も良好な環境を提供した。αｖβ３−α５β１組み合わせインテグリン結合モチーフを含むＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭは、内皮管形成において標準の環境を提供した。

【図11a】図１１ａ乃至図１１ｃは、内皮管形成の時間的経過を示す。図１１ａ：血管新生インテグリン結合モチーフの単一表示。

【図11b】図１１ｂ：血管新生インテグリン及びシンデカン結合モチーフの組み合わせ表示。

【図11c】図１１ｃ：２つの異なる血管新生インテグリンの組み合わせ表示。

【図12a】図１２ａは、再構成された基底膜ＧｅｌＴｒｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養された内皮管形成を示す。

【図12b】図１２ｂは、再構成された基底膜ＧｅｌＴｒｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において培養された内皮管形成を示す。

【図13】図１３は、良好な微小環境を提供するインテグリン結合モチーフにおける内皮管形成の時間的経過を示す。

【図14】図１４は、無血清条件下での内皮管形成における物理的性質の効果を示す。空隙径は、ＰＥＧ−ＳＧ類型により調節される。

【図15a】図１５ａは、内皮管形成における物理的な合図の効果を示すものである。２つの異なる空隙構造及び空隙径を有するヒドロゲルは、ゲル化温度を変化させることにより製造される。熱アニーリングを行ったゲルは、よりコンパクトな３次元微小環境を有した。良い空隙率を有するマクロ多孔性構造は、αｖβ３−α２β１（重量比が５０／５０及び７５／２５）である場合内皮管形成をサポートした。これに対し、空隙率が不足している繊維構造のゲルは、同じシグナル伝達環境において管形成関係性を誘導しなかった。

【図15b】図１５ｂは、内皮管形成における物理的な合図の効果を示すものである。２つの異なる空隙構造及び空隙径を有するヒドロゲルは、ゲル化温度を変化させることにより製造される。熱アニーリングを行ったゲルは、よりコンパクトな３次元微小環境を有した。良い空隙率を有するマクロ多孔性構造は、αｖβ３−α２β１（重量比が５０／５０及び７５／２５）である場合内皮管形成をサポートした。これに対し、空隙率が不足している繊維構造のゲルは、同じシグナル伝達環境において管形成関係性を誘導しなかった。

【図15c】図１５ｃは、内皮管形成における物理的な合図の効果を示すものである。２つの異なる空隙構造及び空隙径を有するヒドロゲルは、ゲル化温度を変化させることにより製造される。熱アニーリングを行ったゲルは、よりコンパクトな３次元微小環境を有した。良い空隙率を有するマクロ多孔性構造は、αｖβ３−α２β１（重量比が５０／５０及び７５／２５）である場合内皮管形成をサポートした。これに対し、空隙率が不足している繊維構造のゲルは、同じシグナル伝達環境において管形成関係性を誘導しなかった。

【図16】図１６は、ＦＧＦＲ１リン酸化反応におけるＦＧＦ擬似体としてのＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦの濃度効果を示すものである。ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦは、５０倍から１００倍までの高濃度において組換えｂＦＧＦと同様の生物活性を有する。

【図17a】図１７ａは、フィブロネクチン由来のＲＥＤＶ（配列番号６１）を提供するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌ上において培養されたＨＵＶＥＣの内皮管形成において、組換えｂＦＧＦとＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦを比較したものである。

【図17b】図１７ｂは、フィブロネクチン由来のＲＥＤＶ（配列番号６１）を提供するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌ上において培養されたＨＵＶＥＣの内皮管形成において、組換えｂＦＧＦとＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦを比較したものである。

【図18】図１８は、ヒト真皮繊維芽細胞が酵素感受性モチーフの濃度が異なるＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌにおいて培養されるときの細胞形態を示す写真である。動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMとＭＡＰＴｒｉｘ^TMの重量比は７５：２５〜５０：５０であり、再構成された基底膜において培養された真皮繊維芽細胞と略同じ細胞形態を示す。

【図19】図１９は、動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌにおいて培養された繊維芽細胞の形態に及ぼす血清の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0105】

下記の実施例は、本発明の好ましい一実施形態を説明するために提供され、本発明は例示の目的でのみ提供される下記の特定の実施例によりその範囲が制限されることはない。本発明に開示されているように、機能的に同じ製品、組成物及び方法は、本発明の範囲に含まれることが自明である。

【0106】

実施例１．生化学的に定義された微小環境を提供するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌの作成

【0107】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌゲル溶液を下記のように調製した：自然発生的な細胞外マトリックスを擬態する、組み合わせシグナル伝達が誘導可能な合成３次元微小環境は、表２にまとめたように調製された。各ＥＣＭ組成物の最終的な濃度が２０ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７.４）中で調製した。

【0108】

前記ＥＣＭ組成物は、ラミニンα１鎖に基づく組み合わせ由来のαｖβ３結合ペプチドモチーフによって、αｖβ３−α２β１、αｖβ３−α３β１、αｖβ３−α５β１、αｖβ３−シンデカンの組み合わせシグナル伝達を誘導できるように構成された。ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ溶液は、２０ｍｇ／ｍｌの４アーム及び８アームＰＥＧ−ＳＧ（１：１（ｖ／ｖ））と混合しＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．４）に溶解した。前記調製されたＭＡＰＴｒｉｘＨｙＧｅｌ^TM溶液は、４８ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に添加した後、２時間３７℃でゲル化した。

【0109】

前記調製されたＭＡＰＴｒｉｘＨｙＧｅｌ^TM溶液は、４８ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に添加した後、２時間３７℃でゲル化した。

【0110】

図７ａ及び図７ｂに示すように、４８ウェルプレートのレイアウトは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のそれぞれの組成と各組成の濃度勾配が細胞の挙動に及ぼす影響を同時に解明できるように、各ＥＣＭ組成物の様々な細胞外マトリックス組成と各組成の濃度勾配に基づいて、ラミニンα１鎖由来のαｖβ３結合ペプチドモチーフであるＩＫＶＡＶ（配列番号３７）によってコーティングした。

【0111】

αｖβ３−α２β１、αｖβ３−α３β１、αｖβ３−α５β１、αｖβ３−シンデカン組み合わせシグナル伝達を誘導するＥＣＭ組成物は、マイクロウェルの各行に沿って作成され、ＥＣＭ組成物の濃度勾配は、細胞の挙動における各インテグリン結合ペプチドモチーフの影響を定量化できるようにマイクロウェルの各列に沿って作成された。

【0112】

一般的に、コラーゲンタイプＩ由来のα１β１又はα２β１結合ペプチドモチーフであるＧＦＰＧＥＲ（配列番号２２）、ＤＧＥＡ（配列番号２３）、ラミニンα１鎖由来のＮ
ＲＷＨＳＩＹＩＴＲＦＧ（配列番号３８）、ラミニンβ１鎖由来のＹＩＧＳＲ（配列番号４４）、フィブロネクチンドメインＩＩＩ由来のα４β１結合ペプチドモチーフであるＲＥＤＶ（配列番号６１）、フィブロネクチンドメインＩＩＩ由来のα５β１結合ペプチドモチーフであるＧＲＧＤＳＰ（配列番号５２）、シンデカン結合ペプチドモチーフであるフィブロネクチン由来のＳＰＰＲＲＡＲＶＴ（配列番号５６）およびラミニンα１鎖由来のＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ（配列番号４０）を含む様々なＥＣＭ由来のペプチドの組み合わせを提示することにより、自然発生的な内皮細胞の細胞外マトリックスを擬態する生化学的微小環境が作成された。

【0113】

【表3】

【0114】

実施例２：機械的に定義された微小環境を提供するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌの作成

【0115】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌ試料は、マルチアームＰＥＧ−ＳＧ及びエンハンサーとしてのポリ（ビニルアルコール）の異なる重量比で６ウェルプレートで調製した。各ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌ試料の組成を、表２に記載した。ＭＡＰＴｒｉｘ^TMは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）における最終濃度が２０ｍｇ／ｍｌ及び４０ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ溶解され、各々５０ｍｇ／ｍｌ及び１００ｍｇ／ｍｌのポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ、１００，０００ダルトン）を溶解させたＰＢＳ緩衝液と混合した。混合されたＭＡＰＴｒｉｘ^TM／ＰＶＡ溶液を更に２０ｍｇ／ｍｌの４アームＰＥＧ−ＳＧ及び／または８アームＰＥＧ−ＳＧの架橋結合溶液と混合した後、２５℃１時間でマトリックスを形成させた。

【0116】

【表4】

【0117】

凍結乾燥された試料の形態を測定するために、走査型電子顕微鏡を用いた。全ての試料を液体窒素で冷却させ、直ちに破砕した。イオンスパッター（Ｅ−１０３０、Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて白金で試料をコーティングした後、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ−４８００走査型電子顕微鏡（Ｓ−４８００、Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いた。

【0118】

図４ａ乃至図４ｄに示すように、各試料は異なる空隙構造及び形態を有するにも拘わらず、各試料の空隙径は、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM及びポリ（ビニルアルコール）の濃度とは無関係に同じであった。全ての試料の平均空隙径は約１００μｍであり、各試料は、図２に示すように、異なる弾性を示した。

【0119】

レオロジー研究のために、ゲルを１２ウェルプレートに調製し、６ウェルプレートにおいて膨潤させた。直径１．２ｃｍ以下に切断し、試料をレオメーター（直径１．３ｃｍ）の下部プレートにロードし、上側固定具を下げた後に、データ収集の間の脱水を防ぐために、湿度室を試料の周囲に配置した。貯蔵弾性率（Ｇ’）及び損失弾性率（Ｇ”）のデータを、０．１〜１０Ｈｚの周波数範囲にわたって、一定の歪みモード（５％）で収集した。

【0120】

表３にまとめたように、一般に、ゲル化溶液へのＰＶＡの添加は、得られたヒドロゲルの弾性を増加させた。しかしながら、弾性の増加におけるＰＶＡ添加の効果は、低分子のイガイ接着タンパク質（２２ｋＤａタンパク質）において有意であった。

【0121】

４アームＰＥＧ／８アームＰＥＧ（重量比＝５０：５０）の混合物を架橋剤として用いる場合、弾性におけるＭＡＰＴｒｉｘ^TMの効果はそれほど重要ではなかった。

【0122】

マルチアームＰＥＣ−ＳＧ及びＭＡＰＴｒｉｘ^TM間の架橋反応中に、その結果として生
成されるＭＡＰＴｒｉｘ^TMマルチアームＰＥＧ鎖及びＰＶＡ鎖は、絡み合って相互貫入ネットワーク（ＩＰＮ）を形成した。ＰＶＡ系ＩＮＰヒドロゲルは、改善された機械的性質を示すので、ＰＶＡの存在は、機械的強度を向上させることができる（Ｓｅｏｎ Ｊｅｏｎｇ Ｋｉｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ） ａｎｄ ｐｏｌｙ（Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）． ２００３． Ｊｏｕｍａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８９ （８）． ２０４１−２０４５．）

【0123】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TM、ＰＶＡ及びマルチアームＰＥＧの濃度に応じて、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM
ＨｙＧｅｌの弾性は０．１５〜０．９ｋＰａであった。実施例２から、０．１〜２ｋＰａを有するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌは、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM、ＰＶＡ及びマルチアームＰＥＧ−ＳＧの濃度及び分子量を調節することにより容易に調製可能であることは明白であり、このとき、各空隙径は比確定一定に保たれる。

【0124】

【表5】

【0125】

実施例３．酵素消化性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌの作成

【0126】

ＭＭＰ感受性モチーフであるＧＰＱＧＩＡＧＱ配列に結合されたラミニン由来のペプチドＩＫＶＡＶをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてイガイ接着タンパク質に添加した（ＦＰ１−ＦＰ−５−酵素感受性モチーフ−ＦＰ１）。前記イガイ接着タンパク質とＭＭＰ感受性ＩＫＶＡＶの融合タンパク質を動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TM（Ｄｙｎａｍｉｃ ＭＡＰＴｒｉｘ^TM）ラミニンと命名した。

【0127】

５ｍｇの動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンを１０ｍｌのＰＢＳ（１Ｘ）内に溶解し、ＩＶ型細菌性コラゲナーゼを前記動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニン溶液内に添加した。ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニン：コラゲナーゼは、２５：１であった。３７℃で２時間インキュベーションした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより消化をモニターし、消化された動的ＭＡＰＴｒｉｘ
^TMラミニン由来の様々な画分の見掛けの分子量は、２９、１８及び１２ｋＤａであった。前記動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニン及びＦＰ１−ＦＰ５の分子量は、各々２４ｋＤａ及び１６ｋＤａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の各々の画分の見掛け上の分子量は、イガイ接着タンパク質の高いｐＩ値（９．８９）により、予測された分子量よりも大きかった（例えば、２４ｋＤａと比較して〜２９ｋＤａ）。前記画分の分子量から、動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンが酵素消化性であると結論した。

【0128】

実施例４．微小環境アレイの調製

【0129】

９６ウェルプレートの表面上に、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭを組み合わせで又は単独で、共有結合で固定化した微小環境アレイを調製した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５）中で、一連のＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を調製した。

【0130】

１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中の１００μｌのＥＤＣ（１０ｍＭ）及びＮＨＳ（１０ｍＭ）溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、ＣＯＯＨ基を活性化させ、１時間室温においてインキュベートした。活性化後に、冷緩衝溶液でプレートを洗浄し、ＥＤＣ／ＮＨＳ試薬を完全に除去した。１００μｌのＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭ溶液を活性化された９６ウェルプレートに加えて、室温において４時間インキュベートした。

【0131】

ＭＡＰＴｒｉｘ^TMがコーティングされたウェルプレートを緩衝溶液又は純水で広範に洗浄し、非結合のＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＥＣＭを除去した。

【0132】

図示の如く、インテグリン及び調節された受容体の組み合わせを介したシグナル伝達勾配を作成するために、インテグリン結合モチーフの調節された受容体結合モチーフに対する濃度勾配（重量／重量）は、１００／０、７５／２５、５０／５０及び２５／７５であった。

【0133】

実施例５．細胞接着／増殖アッセイ

【0134】

無血清の条件下でケラチノサイト細胞接着及び増殖アッセイのために、ＨａＣａＴ細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中の微小環境アレイ上で２４時間増殖させた。１日後に、１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えて４回に亘って非接着細胞を除去し、各ウェルに１０μｌのＭＴＴ基質を加え、さらに２時間３７℃でインキュベーションを続けた。ＭＴＴ処理した細胞を溶解し、５７０ｎｍにおける吸光度を分光光度計で測定した。細胞数は、任意の生理活性ペプチドを有さないＭＡＰＴｒｉｘ^TM上の平均細胞数に対して標準化した。各バーは、３個のウェルの平均値を示す。

【0135】

図９ａ及び図９ｂに、細胞接着／増殖プロファイルを示す。

【0136】

生理活性ペプチドを有さないＭＡＰＴｒｉｘ^TMをネガティブコントロールとして用いた。図９ａ及び図９ｂに示すように、コラーゲン−成長因子の組み合わせに比べて、コラーゲン−ヘパリンの組み合わせの方が細胞接着及び増殖において高い相乗効果を誘導し、コラーゲン由来のペプチドＧＬＰＧＥＲ（配列番号２０）及びヘパリン又は成長因子擬態体の組み合わせシグナル伝達は、ＨａＣａＴ付着及び増殖において最も有利な環境を提供する。

【0137】

このようなプロファイルを用いて、ケラチノサイト増殖に対して相乗効果を誘導する分
子シグナルの組み合わせを道程した。

【0138】

分析された１９５シグナル伝達の組み合わせを、これらの特徴的な効果を基づいて、３つの主なグループに分けることができた。（１）細胞接着及び増殖を相乗的に促進する組み合わせ、（２）細胞接着及び増殖を穏やかに促進する組み合わせ及び（３）細胞接着及び増殖を促進しなかった組み合わせ。各シグナル対に対する応答の分析は、対比するシグナルに対する応答の複素スペクトルを明らかにすることができ、複合シグナル伝達微小環境における細胞運命の仕様に対する重要な意味をもち、これは細胞療法又は組織再生アプリケーションのために解明されるべきである。

【0139】

実施例６．管形成の分析

【0140】

１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び内皮細胞グロースサプリメント（ＥＧＧＳ、３０μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が補充された内皮増殖培地（Ｍ１９９培地）を用いてＨＵＶＥＣ細胞を播種した。

【0141】

ＨＵＶＥＣ細胞を無血清Ｍ１９９培地内で１分間４００ｇで遠心分離することによって洗浄し、洗浄されたＨＵＶＥＣｓを無血清Ｍ１９９培地内に再懸濁させ、実施例１で調製した各ＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルの上に５×１０^４細胞／ウェルの密度にて１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＨＵＶＥＣｓの形態はモニターされ、位相差顕微鏡で規則的な間隔（６時間おきに）にて撮影を行った。

【0142】

【表6】

【0143】

ＨＵＶＥＣ細胞の形態からみて、各微小環境子の効果は、図１１ａ（単一インテグリン−結合モチーフを提示する微小環境）及び図１１ｂ（組み合わせインテグリン−結合モチーフを提示する微小環境）に示すように、全く異なっていた。

【0144】

αｖβ３又はα５β１インテグリン結合モチーフを提示するＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物は、内皮管形成に対して有利な環境を提供するのに対し、α２β１又はα４β１インテグリン結合モチーフを提示するＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物は、内皮管形成においてあまり好ましくない環境を提供した（図１１ａ）。

【0145】

αｖβ３−α２β１組み合わせインテグリン結合モチーフを提示するＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物は、内皮管形成において有利な環境を提供した。しかしながら、αｖβ３−α５β１組み合わせインテグリン結合モチーフを提示するＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物は、内皮管形
成において通常の環境を提供した。

【0146】

図１２ａ及び図１２ｂ、図１３ａ及び図１３ｂに示すように、形態分析を行ったところ、αｖβ３−α２β１組み合わせインテグリン結合モチーフを提示するＭＡＰＴｒｉｘ^TM組成物は、天然の内皮基底膜と類似の微小環境を示すことが分かる。

【0147】

実施例７．内皮管形成におけるＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌの物理的な合図の影響

【0148】

図１５ａに示すように、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌのアニーリングを受けた場合には、その表面形態及び弾性は、元のＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌとは全く異なっていた。

【0149】

内皮管形成における表面の形態及び空隙径の影響を調べた。

【0150】

図１５ｂ及び図１５ｃにおいて示したように、両方のマトリックすがＨＵＶＥＣに対して同じ生化学的な合図を示す場合、空隙の形態を有する軟らかいマトリックスは内皮管形成を誘導するが、繊維状形態を有する硬質のマトリックスは内皮管形成をサポートしない。

【0151】

実施例８．ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦの機能分析

【0152】

真皮繊維芽細胞（ＨＳ２７）を無血清培地に播種して２日間培養し、無血清培地を交換し、さらに１日間培養した。細胞をＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦで５分間処理した後に、細胞溶解物に対してｐＦＧＦＲ１及びｐＥＲＫに対する抗体を用いた免疫ブロッティングを行った。ＦＧＦＲ１及びＥＲＫのリン酸化レベルを免疫ブロッティングで評価した。

【0153】

図１６は、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦは、高濃度のＦＧＦＲ１を活性化できることを示した。同様の試験は、同じ手順でＨＵＶＥＣ細胞において行い、その結果、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦの約５０から１００倍までの高濃度において、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦは天然のＦＧＦと同様の生物活性を示すことが分かった。

【0154】

細胞接着を促すが、内皮管形成をサポートしないフィブロネクチン由来のペプチドＲＥＤＶ（配列番号）を有するＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌを調製した。ＨＵＶＥＣｓを無血清培地に播種して２日間培養し、無血清培地を交換し、さらに１日間培養した。細胞をＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦ及び組換えｂＦＧＦで処理した後に１日間維持した。

【0155】

図１７ａ及び図１７ｂに示すように、細胞の形状又は形態は、ｂＦＧＦ処理済みの細胞の方がより管形成に近かったが、互いに非常に類似していた。

【0156】

２つの例は、ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＦＧＦに基づくヒドロゲルは、可溶性因子を示す合成微小環境を提供することができることを示した。

【0157】

実施例９．動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンから形成されたヒドロゲルにおける繊維芽細胞の培養

【0158】

酵素感受性ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌゲル溶液を下記のように調製した：動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニン及びＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンをＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ ７.４）内において各々最終濃度２０ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、１０ｍｇ／ｍｌの４アーム及び８アームＰＥＧ−ＳＧ（１：１（ｖ／ｖ））と混合した。ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンに対する動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンの割合は、１００：０、７５：２５、５０：５０、
２５：７５及び０：１００であった。調製されたＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌ溶液を４８ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加し、３７℃で２時間ゲル化させた。再構成された基底膜であるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧｅｌＴｒｅｘをポジティブコントロールとして用いた。

【0159】

１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び内皮細胞グロースサプリメント（ＥＧＧＳ、３０μｇ／ｍｌ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が補充された内皮増殖培地（Ｍ１９９培地）を用いてＨｓ２７真皮繊維芽細胞を播種した。

【0160】

Ｈｓ２７真皮繊維芽細胞を無血清Ｍ１９９培地内において１分間４００ｇで遠心分離することによって洗浄し、洗浄されたＨｓ２７真皮繊維芽細胞を無血清Ｍ１９９培地内に再懸濁させ、前記細胞を３×１０^４細胞／ウェルの密度で各々の動的ＭＡＰＴｒｉｘ^TMヒドロゲルの上に播種し、３７℃で６時間インキュベートした。Ｈｓ２７真皮繊維芽細胞の形態はモニターされ、位相差顕微鏡で撮影を行った（図１８参照）。

【0161】

繊維芽細胞は、ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンに対する動的Ｄｙｎａｍｉｃ ＭＡＰＴｒｉｘ^TMラミニンの割合が７５：２５及び５０：５０であるとき、ＧｅｌＴｒｅｘの上に培養された繊維芽細胞と同様にチューブ状の構造を形成した（図１９）。ＦＢＳ（１０％）を前記ＭＡＰＴｒｉｘ^TM ＨｙＧｅｌに添加して組み合わせシグナル伝達を生成すれば、前記細胞の形態はＧｅｌＴｒｅｘ上の細胞とより類似した。

【0162】

これらの例に示されたように、組み合わせシグナル伝達とともに、マトリックスの力学的特性（すなわち、酵素による調節された分解）は、細胞の挙動に顕著な影響を及ぼすとことは明らかである。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5】

【図6a】

【図6b】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図9a】

【図9b】

【図10】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図12a】

【図12b】

【図13】

【図14】

【図15a】

【図15b】

【図15c】

【図16】

【図17a】

【図17b】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】