特表 2015-529076 鎖置換交換反応を使用する非核酸分析物の検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2015-529076(P2015-529076A)

(43)【公表日】2015年10月5日

(54)【発明の名称】鎖置換交換反応を使用する非核酸分析物の検出

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150908BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150908BHJP

   G01N 33/542 20060101ALI20150908BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20150908BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20150908BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   G01N33/53 D

   G01N33/53 M

   G01N33/542 A

   G01N21/64 C

   G01N21/64 F

   C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2015-530453(P2015-530453)

(86)(22)【出願日】2013年9月11日

(85)【翻訳文提出日】2015年4月24日

(86)【国際出願番号】EP2013068824

(87)【国際公開番号】WO2014041024

(87)【国際公開日】20140320

(31)【優先権主張番号】PA201270555

(32)【優先日】2012年9月11日

(33)【優先権主張国】DK

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ

(71)【出願人】

【識別番号】515064836

【氏名又は名称】ウニセンス ダイアグノスティクス エーピーエス

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゴトヘルフ， クルト ヴェテラエ

(72)【発明者】

【氏名】ザン， ザオ

(72)【発明者】

【氏名】シェルストラプ， ミシャエル ブレンドウム

(72)【発明者】

【氏名】ヘイエセン， クレスチャン

【テーマコード（参考）】

2G043

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G043AA01

2G043BA14

2G043BA16

2G043DA01

2G043EA01

2G043EA13

2G043JA02

2G043KA02

2G043KA05

2G043KA09

4B063QA01

4B063QA18

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムに関する。前記システムは、互いに特異的にハイブリダイズし得る１セットのオリゴヌクレオチドを含み、その特異的ハイブリダイゼーションに基づいてシグナルを発生させることができる。前記システムは、シグナルの変化をもたらす、分析物（単数または複数）の存在下での前記オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡の変化に依存する。一局面において、本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムを提供し、ここで上記システムは、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドＡ、第二のオリゴヌクレオチドＢおよび第三のオリゴヌクレオチドＳを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムであって、
前記システムは、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドＡ、第二のオリゴヌクレオチドＢおよび第三のオリゴヌクレオチドＳを含み、
オリゴヌクレオチドＡおよびＢの各々が、オリゴヌクレオチドＳ上の配列に相補的または部分的に相補的である配列を含み、かつオリゴヌクレオチドＡおよびＢが、動的平衡でオリゴヌクレオチドＳへのハイブリダイゼーションについて競合し、かつ場合により、オリゴヌクレオチドＡおよびＢの少なくとも一方が、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物と相互作用することができる共有結合で連結されている結合部分を含み；ならびに
オリゴヌクレオチドＡおよびＢの少なくとも一方、または前記オリゴヌクレオチドに結合された共有結合で連結されている結合部分が、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物と相互作用することができ、前記分析物と前記オリゴヌクレオチドまたは結合部分との相互作用が、結果としてハイブリダイゼーション平衡をシフトさせることになり、平衡における前記シフトが検出可能なシグナルをもたらす、分析物検出システム。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドが、別々のヌクレオチド鎖上にある、請求項１に記載の分析物検出システム。

【請求項3】

前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、共有結合によって部分的にまたは完全に接続されている、請求項１に記載の分析物検出システム。

【請求項4】

オリゴヌクレオチドＳが、１つより多くのハイブリダイゼーションドメインを含み、場合により、２つ以上のハイブリダイゼーションドメインが別々のヌクレオチド鎖上に位置する、請求項１に記載の分析物検出システム。

【請求項5】

第一のオリゴヌクレオチド（１）、第二のオリゴヌクレオチド（３）および第三のオリゴヌクレオチド（５）を含む、請求項１に記載の分析物検出システムであって、ここで
●前記第一のオリゴヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）を含み；
●前記第三のヌクレオチドが、前記シグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）を含み；
●共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）が、前記第一のオリゴヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチド上に位置し；
前記第一のオリゴヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチドと前記第三のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションが、前記第一のオリゴヌクレオチドまたは前記第二のオリゴヌクレオチドと前記第三のオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズされないときとは異なるシグナルを発生させるか、またはシグナルの発生を触媒することができ；かつ
前記分析物の存在が、前記検出システムの前記ハイブリダイゼーション平衡を変化させ、その結果、シグナルが変化することになる、
分析物検出システム。

【請求項6】

●前記第一のオリゴヌクレオチド（１）が、
〇分岐点移動領域（７）の５’側に位置する第一のトーホールド領域（８）
を含み；
●前記第二のオリゴヌクレオチド（３）が、
〇分岐点移動領域（７）の３’側に位置する第二のトーホールド領域（９）
を含み；かつ
●前記第三のオリゴヌクレオチド（５）が、
〇第一のトーホールド領域（８’）と、
〇第二のトーホールド領域（９’）と、
〇分岐点移動領域（７’）と
を含み；ここで
●前記第一のオリゴヌクレオチド（１）中の前記第一のトーホールド領域（８）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記第一のトーホールド領域（８’）とが、相補的配列を含み；
●前記第一のオリゴヌクレオチド（１）中の前記分岐点移動領域（７）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
●前記第二のオリゴヌクレオチド（３）中の前記第二のトーホールド領域（９）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記第二のトーホールド領域（９’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；かつ
●前記第二のオリゴヌクレオチド（３）中の前記分岐点移動領域（７）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含む、
請求項５に記載の分析物検出システム。

【請求項7】

− ■分岐点移動領域（７）の５’側に位置する第一のトーホールド領域（８）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■場合により、第一の基（２）であって、前記第一の基はシグナル伝達システムの第一の部分を形成する、第一の基
を含む、第一のオリゴヌクレオチド（１）と；
− ■分岐点移動領域（７）の３’側に位置する第二のトーホールド領域（９）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■場合により、第一の基（２）であって、前記第一の基はシグナル伝達システムの第一の部分を形成する、第一の基
を含む、第２のオリゴヌクレオチド（３）と；
− ■第一のトーホールド領域（８’）、
■第２のトーホールド領域（９’）、
■分岐点移動領域（７’）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■第二の基（６）であって、前記第二の基はシグナル伝達システムの第二の部分を形成する、第二の基
を含む、第三のオリゴヌクレオチド（５）と
を含む、請求項１に記載の分析物検出システムであって、
但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する前記第一の基（２）が、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）および／または前記第二のオリゴヌクレオチド（３）のいずれかに含まれることを条件とし；
但し、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）が、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）および／または前記第二のオリゴヌクレオチド（３）および／または前記第三のオリゴヌクレオチド（５）上に位置することを条件とし；ここで、
前記第一のオリゴヌクレオチド（１）中の前記第一のトーホールド領域（８）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記第一のトーホールド領域（８’）とが、相補的配列を含み；
前記第一のオリゴヌクレオチド（１）中の前記分岐点移動領域（７）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
前記第二のオリゴヌクレオチド（３）中の前記第二のトーホールド領域（９）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記第二のトーホールド領域（９’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
前記第二のオリゴヌクレオチド（３）中の前記分岐点移動領域（７）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）中の前記分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
前記第一のオリゴヌクレオチド（１）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーションが、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）がハイブリダイズされないときとは異なるシグナルを発生させるか、もしくはシグナルの発生を触媒することができるが、但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する前記第一の基（２）が前記第一のオリゴヌクレオチド（１）上に含まれることを条件とし；または
前記第二のオリゴヌクレオチド（３）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーションが、前記第二のオリゴヌクレオチド（３）と前記第三のオリゴヌクレオチド（５）がハイブリダイズされないとき発生もしくは触媒されるシグナルとは異なるシグナルを発生させるか、もしくはシグナルの発生を触媒することができるが、但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する前記第一の基（２）が前記第二のオリゴヌクレオチド（３）上に含まれることを条件とする、
分析物検出システム。

【請求項8】

前記第一の基（２）および前記第二の基（６）によって形成される前記シグナル伝達システムが、クエンチャー−フルオロフォアシグナル伝達システム、フルオロフォア−クエンチャーシグナル伝達システム、ＦＲＥＴシグナル伝達システム、ＤＮＡペルオキシダーゼ触媒シグナル伝達システム、またはクエンチャーおよび一重項酸素増感剤であり；ならびに場合により、前記シグナル伝達システムが、蛍光ナノ粒子を利用する、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項9】

ヘミンおよび／またはＡＢＴＳ^２−および／またはＨ_２Ｏ_２および／またはルミノールをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項10】

前記共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）が、有機分子、抗体、抗原、アプタマー、ビオチンおよびハプテンから成る群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項11】

前記共有結合で連結されている結合部分（４）が、１５０〜１５００Ｄａ、例えば１５０〜１２００Ｄａ、例えば１５０〜１０００Ｄａ、例えば１５０〜８００Ｄａ、例えば１５０〜６００Ｄａ、例えば１５０〜４００Ｄａ、例えば１５０〜３００Ｄａ、例えば３００〜１５００Ｄａ、例えば４００〜１５００Ｄａ、例えば６００〜１５００Ｄａ、例えば８００〜１５００Ｄａ、例えば１０００〜１５００Ｄａ、または例えば１２００〜１５００Ｄａの範囲内の分子量を有する有機分子である、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項12】

前記結合部分が、前記結合部分に結合されたその結合パートナーを有する、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項13】

前記分析物が、タンパク質、ペプチド、有機分子、抗体、抗原およびハプテンから成る群より選択される、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項14】

前記分析物が、１５０〜１５００Ｄａ、例えば１５０〜１２００Ｄａ、例えば１５０〜１０００Ｄａ、例えば１５０〜８００Ｄａ、例えば１５０〜６００Ｄａ、例えば１５０〜４００Ｄａ、例えば１５０〜３００Ｄａ、例えば３００〜１５００Ｄａ、例えば４００〜１５００Ｄａ、例えば６００〜１５００Ｄａ、例えば８００〜１５００Ｄａ、例えば１０００〜１５００Ｄａ、または例えば１２００〜１５００Ｄａの範囲内の分子量を有する有機分子である、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項15】

前記第一のオリゴヌクレオチド（１）が、前記第二のオリゴヌクレオチド（３）に共有結合で連結されており、かつ前記第二のオリゴヌクレオチド（３）が、前記第三のオリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている、前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システム。

【請求項16】

前記請求項のいずれかに記載の分析物検出システムを含む部品からなるキット。

【請求項17】

試料中のＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物の存在またはレベルを検出するための方法であって、前記方法は：
ａ）目的の分析物を含むまたは含むと推測される試料を提供するステップ；
ｂ）請求項１〜１５のいずれかに記載の分析物検出システムを提供するステップ；
ｃ）前記試料を前記分析物検出システムとともにインキュベートするステップ；
ｄ）分析物の検出されたレベルを基準レベルと比較するステップ；および
ｅ）前記試料中の分析物の存在またはレベルを決定するステップ
を含む、方法。

【請求項18】

前記第一のオリゴヌクレオチドと前記第三のオリゴヌクレオチド間、および前記第二のオリゴヌクレオチドと前記第三のオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡が、前記結合部分への分析物の結合に基づいて、および／または前記結合部分に対する結合パートナーの解離に基づいてシフトされる、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記試料が、生物学的試料、例えば、血液試料、例えば血清もしくは血漿、尿試料、糞便試料、生検試料または唾液試料である、請求項１７または１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分析物検出システムに関する。詳細には、本発明は、分析物が核酸、すなわちＤＮＡおよびＲＮＡ、ではない、分析物検出システムに関する。

【背景技術】

【0002】

様々な異なる方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、ＱＣＭ、電気化学的センサーなどを試料中のペプチド／タンパク質および他の分子の検出に利用することができる。これらの表面ベースの方法には高感度および多重感知能力が備わっているが、その固定手順は、タンパク質−リガンド結合に干渉することがあり、非特異的吸着に対抗するために慎重な洗浄およびブロッキングを必要とすることが多い。確立した均一アッセイはほんの少ししかなく、その中で、蛍光偏光は、小分子−タンパク質相互作用の研究に広く用いられている（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ、Ａｎａ Ｒｏｓｓｉ ＆ Ｃｏｌｉｎ Ｔａｙｌｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１１）。

【0003】

電気化学的バイオセンサーは、通常、電子を生成または消費する反応の酵素的触媒に基づく。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ペプチド、タンパク質、抗体およびホルモンなどの物質の検出および定量のために設計されたプレートベースのアッセイである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、固定されたリガンドの、そのリガンドがより大きいタンパク質に結合したときのサイズの増加を、金属薄膜の表面での屈折率の変化を記録することによって検出する。水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）検出スキームは、結晶表面に堆積された薄層の質量変化および物理的特性の測定に基づく。蛍光偏光は、直線偏光（ｐｌａｎ−ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）を用いて有効分子容の変化を検出することによって小さい蛍光リガンドのより大きいタンパク質への結合を検出する。

【0004】

試料中の核酸分子を検出することができる様々なアッセイ、例えば、ＰＣＲ、サザンブロット法、ノーザンブロット法およびＦＩＳＨも存在する。より最近のアプローチは、ＤＮＡトーホールド交換反応である。ＤＮＡトーホールド交換反応は、特異的トーホールド領域を各々が有する２本のＤＮＡ鎖が、支持体としての役割を果たす第三のＤＮＡ鎖とハイブリダイズするために互いに競合するシステムである。その大きなモジュラリティ、設計性および感度のため、それは、触媒性ＤＮＡネットワークの構築（Ｚｈａｎｇら、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｎｔｒｏｐｙ−ｄｒｉｖｅｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＤＮＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７、３１８、１１２１−１１２５）、ＤＮＡ鎖置換反応速度の制御（Ｚｈａｎｇら、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｔｏｅｈｏｌｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００９、１３１、１７３０３−１７３１４）、および核酸ハイブリダイゼーションの特性の最適化（Ｚｈａｎｇら、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ ２０１２、４、２０８−２１４）に用いられている。しかし、これらのシステムは、核酸分子の検出にしか適していない。

【0005】

それ故、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分子を検出するための改善された検出システムは有利であろうし、特に、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる小分子を検出するためのより効率的なおよび／または信頼性のある検出システムは有利であろう。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｚｈａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８、１１２１〜１１２５

【非特許文献2】Ｚｈａｎｇら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２００９）１３１、１７３０３〜１７３１４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムを提供する。前記システムは、互いに特異的にハイブリダイズし得る１セットのオリゴヌクレオチドを含み、その特異的ハイブリダイゼーション事象に基づいてシグナルを発生させることができる。前記システムは、シグナルの変化をもたらす、分析物（単数または複数）の存在下での前記オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡の変化に依存する。

【0008】

本明細書において、本発明者らは、小分子（例えば、抗原またはハプテン）を３本のＤＮＡ鎖の１本以上に結合させることにより、非核酸標的検出にＤＮＡトーホールド交換反応を活用する検出システムを提供する。小分子とその受容体タンパク質または抗体間の特異的結合は元の平衡をシフトさせるので、溶解状態の各成分の分布数変化を例えばＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）シグナルによってモニターすることができる。そのスキームを下に示す：

【0009】

【化1】

ここで、Ａ、ＢおよびＳは３つのＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、それらの中でＡおよびＢは両方ともＳに部分的に相補的である。Ｘは、Ａを標識した小分子を表し、およびＹは、その対応する結合タンパク質である。例えば、Ｙがなければ、ＡとＢにはＳとハイブリダイズする同等のまたはほぼ同等の能力があり、Ｙがあると、そのタンパク質の嵩高さ、電荷または他の効果がハイブリダイゼーションエネルギーに影響を及ぼすことになり、それ故、それらの割合は、例えば５０：５０から２０：８０に変化することになる。基本的に、この概念は、各々のハイブリッド形成のためのエネルギーの小さな摂動がそれら２つのＤＮＡハイブリッド間の平衡を比較的大きくシフトさせる結果になるという事実を利用する。

【0010】

典型的トーホールド交換反応システムにおいて、同じ分岐点移動領域を共有するがトーホールド領域が異なる２本のＤＮＡ鎖は、第三のＤＮＡとハイブリダイズするために互いに動的に競合することになる。置換サイクル全体を図２に示す。例えば、鎖Ａ（Ａ）は、最初に鎖Ｓ（Ｓ）と対合してＡＳ二重鎖を形成する。Ｓは、鎖Ｂ（Ｂ）のための別のトーホールド領域を有するので、Ｂ上のトーホールドにはＳ上のトーホールドとハイブリダイズする機会がある。ＡとＢの両方がＳと結合するとすぐに、配列対称性のため分岐点移動プロセスが起こることになる。この過程で、ＡおよびＢには互いに置き換わる機会が同等にあり、そのため生成物の半分は、ＢがＳの分岐点移動領域を完全に占有する一方でＡがもっぱらトーホールドによってＳと結合するものである。トーホールドは通常短いので、そのハイブリダイゼーションは不安定かつ一過性であり、結局、溶液中にＢＳ＋Ａの成分が残る。前記ステップすべてが可逆的である。ここで、Ｂがその分岐点移動領域内に標識された結合部分を典型的に有することに留意されたい。

【0011】

分析物の存在下、Ｂに連結された小分子への分析物の結合は、トーホールド結合に対して大きい影響を及ぼさないこともあるが、分岐点移動プロセスを遂行するＢに対するエネルギー障壁増加の原因になり、それ故、Ｓへの競合的結合に関してＡと比較してＢを不利（または場合によっては有利）にする。したがって、最終生成物において、熱力学的平衡は、より長いＡＳ二重鎖（場合によってはより長いＢＳ二重鎖）を形成する方向におよび標的分析物と結合した一本鎖Ｂを形成する方向にシフトされ、この分布数変化をＦＲＥＴまたは他の光学的方法によって検出することができる。

【0012】

実施例の節で、様々なタイプの研究により、この概念がＲＮＡおよびＤＮＡとは異なる分析物検出に実際に機能し得ることを証明する。

【0013】

結論として、微調整したトーホールド交換反応に基づきタンパク質と小分子の両方を検出し得る新規検出システムを開発した。このアッセイは、酵素を含まず、ＥＬＩＳＡなどの旧来のアッセイと比較して、タンパク質修飾、および二価抗原／抗体を捜索する努力をしなくて済む。

【0014】

かかるアッセイは、健康、食品、獣医学および環境関連活動における様々な標的の検出のための高感度で特異的で頑強な高スループットプラットフォームとして使用され得る。

【0015】

したがって、本発明の目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分子を検出し得る検出システムを提供することに関する。もう１つの目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる小分子を検出し得る検出システムであって、分析物を検出するために分析物上の１つの結合部位しか必要としない検出システムを提供することである。これは、例えば、分析物上の２つの結合部位を必要とするＥＬＩＳＡアッセイとは対照的である。小さな分析物のために２つの結合部位が存在しなくてもよい。

【0016】

したがって、本発明の１つの態様は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムに関し、このシステムは、少なくとも第一のオリゴヌクレオチドＡ、第二のオリゴヌクレオチドＢおよび第三のオリゴヌクレオチドＳを含み、この場合、
オリゴヌクレオチドＡおよびＢの各々は、オリゴヌクレオチドＳ上の配列に相補的または部分的に相補的である配列を含み、ならびにオリゴヌクレオチドＡおよびＢは、動的平衡でオリゴヌクレオチドＳへのハイブリダイゼーションについて競合し、ならびに場合により、オリゴヌクレオチドＡおよびＢの少なくとも一方は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物と相互作用することができる共有結合で連結されている結合部分を含み；ならびに
オリゴヌクレオチドＡおよびＢの少なくとも一方、または前記オリゴヌクレオチドに結合された共有結合で連結されている結合部分は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物と相互作用することができるので、前記分析物とオリゴヌクレオチドまたは結合部分との相互作用が、結果としてハイブリダイゼーション平衡をシフトさせることになり、その平衡におけるシフトが検出可能なシグナルをもたらす。

【0017】

前記分析物検出システムの説明に役立つ実例を図１および２に提供する。

【0018】

背景技術の節で説明したように、本件に類似したアッセイがＤＮＡ検出のために記載されている。しかし、その構成は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物、例えばタンパク質および小有機分子、の検出には適していない。そのような目的には、異なるシステム、例えばＥＬＩＳＡのほうが適している。

【0019】

本発明のもう１つの態様は、本発明による分析物検出システムを含む部品からなるキット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）に関する。

【0020】

本発明のさらにもう１つの態様は、本発明による第一のオリゴヌクレオチド、第二のオリゴヌクレオチドおよび第三のオリゴヌクレオチドを含む部品からなるキットを提供することである。

【0021】

本発明のさらにもう１つの態様は、試料中のＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物の存在またはレベル検出方法を提供することであり、この方法は、
ａ）目的の分析物を含むまたは含むと推測される試料を提供するステップ；
ｂ）本発明による分析物検出システムを提供するステップ；
ｃ）前記試料を前記分析物検出システムとともにインキュベートするステップ；
ｄ）分析物の検出レベルを基準レベルと比較するステップ；および
ｅ）前記試料中の分析物の存在またはレベルを決定するステップ
を含む。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１は、本発明による第一のオリゴヌクレオチド１（配列番号１）、第二のオリゴヌクレオチド３（配列番号２）および第三のオリゴヌクレオチド５（配列番号３）の特異的配列を用いる本発明の特定の実施形態を示す。８、８’および９、９’は、トーホールド領域を示し、７、７’は、分岐点移動領域を示す。矢印は、それらのオリゴヌクレオチドの５’から３’への方向を示す。

【図2】図２は、分析物が結合部分（４）に結合するときの平衡の変化の仕方の例を示す。図１に示したとおりの番号付け。ａ）標的分析物なければ、Ｓとハイブリダイズする同等のまたは同等に近い確率を有し、その結果ＡＳおよびＢＳが５０／５０比になるように、ＡおよびＢを設計することができる。ｂ）分析物の存在下では、その分析物（この場合は標的）の立体または静電効果に起因して分岐点移動プロセス中にＢに対するエネルギー障壁が実現され、その結果、ＡＳおよびＢＳが８０／２０比になる。

【図3】図３は、ビオチンが結合部分であり、ストレプトアビジン（ＳＴＶ）が分析物であるときの検出システムを示す。本発明による第一のオリゴヌクレオチド１の修飾を含む特異的配列（配列番号４）、第二のオリゴヌクレオチド３の修飾を含む特異的配列（配列番号５）および第三のオリゴヌクレオチド５の修飾を含む特異的配列（配列番号６）を呈示する。図１に示したとおりの番号付け。加えて、２および６はシグナル伝達システムを示し、ならびに４は結合部分を示す。

【図4】図４は、ストレプトアビジン（ＳＴＶ）検出のためのおよびビオチン検出のための三本鎖システムの結果を示す。（ａ）それぞれＳＴＶを含有するおよび含有しない２つの試料についての正規化ＦＲＥＴ効率。（ｂ）それぞれＳＴＶを含有するおよび含有しない２つの試料についての蛍光スペクトル。（ｃ）ＳＴＶ検出の滴定曲線。（ｄ）ＳＴＶ検出アッセイについての非変性ゲル分析。最初の２レーンは、１つのビオチンを有するシステムであり、その一方で最後の２レーンは、２つのビオチンを有するシステムである。挿入図は、２部位相互作用により鎖Ｂ上に結合されたＳＴＶのスキームである。（ｅ）阻害的戦略によるビオチンの定量的検出。分析物（ビオチン）を先ずＳＴＶと混合し、その後、その混合物をアッセイに添加する。分析物がＳＴＶ上の結合部位を占有することになり、したがって、ＳＴＶは不活性化される。

【図5】図５は、センサーアッセイのための３つの戦略を示す。戦略１では、分析物／標的（例えば、タンパク質または抗体）の直接検出をＡＢＳシステムにおける結合部分との相互作用によって達成する。阻害的戦略２では、未知の検体および対応するタンパク質を予混し、その後、正規のアッセイに添加する。検体が遊離リガンドを含むと、それらのリガンドがタンパク質の結合部位を塞ぐことになり、その結果、そのタンパク質はこのアッセイで機能できなくなる。競合的戦略３では、対応するタンパク質を先ず正規のＤＮＡアッセイと混合物して新たなアッセイを形成し、その後、未知の検体を添加して、タンパク質と結合するために鎖Ｂ上のリガンドと競合させ、かくして平衡に対して逆効果を及ぼす。

【図6】図６は、対照実験を示す。Ａ）図３に記載したＡＢＳシステムだが結合部分のないＡＢＳシステムに対する添加剤の影響。３フルオロフォア構成。Ｂ）図３に記載したＡＢＳだが、ビオチン結合部分を有するＡＢＳシステムに対する添加剤の影響。２フルオロフォア構成。ビオチン結合部分を含有するシステムにストレプトアビジンを添加したときを除き、いずれの分析物の添加後にも検出可能な変化は観察されなかった。

【図7】図７は、ストレプトアビジン結合アッセイの動態を示す。４ｎｔ（左）および６ｎｔ（右）のトーホールド長をそれぞれ有する２つのアッセイの比較。両方のアッセイにおいて、ビオチン修飾は、Ｂのトーホールド領域上に位置し、ＡおよびＳは、１対のフルオロフォア（Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ５５５）を有する。結果は、（ＡおよびＢ両方の上の）トーホールドが長いほど、ＳＴＶ結合効果が小さくなることを犠牲にして、確実に速く平衡に達することを示し、これは、（ｂ）におけるＦＲＥＴ結果によって確認される。最終設計は、好ましくは、動態とシグナル・ノイズ比の妥協案である。加えて、ＦＲＥＴ測定は、ＳＴＶ添加後に４ｎｔシステムが平衡に達するために３時間のインキュベーションで十分であることを示唆する（データは示されていない）。

【図8】図８は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が結合部分であり、抗ジゴキシゲニン（ａＤ）が分析物であるときの検出システムを示す。図Ａ）は、本発明による第一のオリゴヌクレオチド１の修飾を含む特異的配列（配列番号７）、第二のオリゴヌクレオチド３の修飾を含む特異的配列（配列番号８）および第三のオリゴヌクレオチド５の修飾を含む特異的配列（配列番号６）を示す。図１に示したとおりの番号付け。加えて、２および６はシグナル伝達システムを示し、ならびに４は結合部分を示す。棒グラフＢ）は、ａＤの検出に基づく生ＦＲＥＴシグナル変化を示す。Ｃ）ジゴキシゲニンの化学構造。グラフＤ）は、オリゴヌクレオチド１、３および５へのａＤの滴定に基づく、ＦＲＥＴシグナル変化を示す。Ｅ）は、オリゴヌクレオチドＡのみが見える、ネイティブポリアクリルアミドゲルの蛍光画像を示す。ａＤを添加するとＡＳ分布数の増加が見られる。

【図9】図９は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が結合部分であり、抗ジゴキシゲニン（ａＤ）が分析物であるときのヒト血漿における検出システムを示す。図Ａ）番号付けは、図８Ａと同じである。グラフＢ）はヒト血漿を一切添加していないセンサーの構成（ＡＢＳ）とヒト血漿を有する試料とを比較する三重対照実験の結果である。カラム１および３は、ヒト血漿なしでのａＤの検出に基づくＦＲＥＴ変化を示し、カラム２および５は、ヒト血漿におけるＦＲＥＴ変化を示す。カラム４および６は、それぞれヒト血漿を有さないおよび有する遊離ジゴキシゲニンの検出のために競合アッセイを示す。

【図10】図１０は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）が結合部分であり、抗ジゴキシゲニン（ａＤ）が分析物であるときのヒト唾液における検出システムを示す。図Ａ）番号付けは、図８Ａと同じである。棒グラフＢ）は、唾液試料中のａＤの検出に基づくＡＳ分布数の変化を示す。

【図11】図１１は、いくつかのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）分子が結合部分としての役割を果たし、抗ジゴキシゲニン（ａＤ）が分析物であるときの検出システムを示す。図Ａ）は、本発明による第一のオリゴヌクレオチド１の修飾を含む特異的配列（配列番号７）、第二のオリゴヌクレオチド３の修飾を含む特異的配列（配列番号９）および第三のオリゴヌクレオチド５の修飾を含む特異的配列（配列番号６）を示す。この図は、ａＤの結合のためのいくつかのＤＩＧ部分も示す。棒グラフＢ）は、ａＤの検出に基づくＡＳ分布数の変化を示す。

【図12】図１２は、競合／阻害センサーとして動作するときの検出システムを示す。ここで、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）は抗ジゴキシゲニン（ａＤ）と一緒に結合部分としての役割を果たし、遊離ＤＩＧは分析物としての役割を果たす。図Ａ）番号付けは、図８Ａと同じである。棒グラフＢ）は、緩衝液、ヒト血漿およびヒト唾液中の遊離ＤＩＧを検出する阻害アッセイにおけるＡＳ分布数変化を示す。

【図13】図１３は、阻害アッセイまたは競合アッセイによるＤＩＧ滴定曲線を示す。

【図14】図１４は、ビタミンＤ（ＶＤ）が結合部分であり、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）が分析物であるときの検出システムを示す。さらに、図１４は、阻害および競合アッセイにおける標的としての遊離ビタミンＤも示す。略図は、Ｂ上のＶＤへのＤＢＰの結合によって促進されるＢの鎖置換を示す。バンドシフトアッセイは、オリゴヌクレオチドＡのみが見える、ネイティブポリアクリルアミドゲルの蛍光画像を示す。ＤＢＰを添加するとＡＳ分布数の増加が見られる。第一のグラフは、センサーに対するＤＢＰの滴定を示す。第二および第三のグラフは、それぞれ、ＶＤの阻害的および競合的検出を示す。

【図15】図１５は、ＤＮＡ検出のための三本鎖アプタマーシステムの設計および結果を示す。本発明による第一のオリゴヌクレオチド１の修飾を含む特異的配列（配列番号１０）、第二のオリゴヌクレオチド３の修飾を含む特異的配列（配列番号１１）および第三のオリゴヌクレオチド５の修飾を含む特異的配列（配列番号１２）を提示する。図１および３に示したとおりの番号付け。（Ａ）構造スイッチングアプタマーによるＡＴＰ検出のスキーム。ＡＴＰの結合は、Ｂ上の有効トーホールドを短縮することになり、その結果、ＢＳの形成が妨げられる。（Ｂ）ＡＴＰ検出の滴定曲線。

【図16】図１６は、分割型ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムを使用するときのシステムを示す。本発明による第一のオリゴヌクレオチド１の修飾を含む特異的配列（配列番号１３）、第二のオリゴヌクレオチド３の修飾を含む特異的配列（１つのビオチン：配列番号５、および２つのビオチン配列番号１４）および第三のオリゴヌクレオチド５の修飾を含む特異的配列（配列番号１５）を提示する。図１および３に示したとおりの番号付け。２ビオチンシステムでも、目視検査は可能である。１つのビオチンおよび２つのビオチン両方での検出を示す。（Ａ）分割型ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムを使用することによるＳＴＶ検出のスキームおよび結果。Ｂ上に２つのビオチンを組み込んだとき、ＳＴＶの存在下で色差は明白であり、裸眼ででも区別可能である。（Ｂ）１つのビオチンまたは２つのビオチンいずれかとともにＳＴＶを含有するまたは含有しない試料の吸光度。

【図17】図１７は、本発明による一本鎖システムの設計を示す。図１および３に示したとおりの番号付け。加えて、１１は、リンカー領域を示す。

【図18】図１８は、ＳＴＶ検出のための一本鎖システム、および実施例１２に提示する配列を使用したときに得られた結果を提示する。（ａ）一本鎖システムを使用することによるＳＴＶ検出のスキーム。トーホールド交換反応が分子内で起こり、結果として生ずる配置を分割型ＤＮＡペルオキシダーゼからの変色によって同定することができる。（ｂ）ＳＴＶを含有するまたは含有しない一本鎖試料の吸光度。

【図19】図１９は、特殊な小分子またはイオンの検出のための戦略を提供する。（ａ）水素結合による両面メラミン−チミン認識（ｂｉｆａｃｉａｌ ｍｅｒａｍｉｎｅ−ｔｈｙｍｉｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）（挿入図）を使用することによる、メラミン検出のスキーム。メラミンがなければ、鎖Ａは、鎖Ｂより長いトーホールドを有し、それ故、Ｓとの結合のより高い優先度を有する。Ｔ−Ｔミスマッチのための接続部として役立つことができるメラミンがあると、鎖Ｂは、Ａより長いトーホールドを有し、したがってより長いＢＳ二重鎖が予想される。（ｂ）Ｈｇ^２＋は、Ｈｇ^２＋が両側のチミン残基のＮ１窒素間に線形に結合している高特異的「サンドイッチ」複合体を、ＤＮＡにおけるＴ−Ｔミスマッチ部位で形成することは周知であるので、（ａ）と同じ構成を用いて水銀二価カチオンを検出することができる（挿入図）。

【図20】図２０は、鎖Ｓが内部に１つ（ａ）または２つ（ｂ）のヘアピンを有する、より高度な戦略を示す。内部ヘアピンの機能は、標識されたリガンドおよびその結合タンパク質の位置の周囲にマルチアーム接合部を、その三次元配置によってより大きい立体障害を生じさせてＳと結合タンパク質を有するＢとの間のハイブリダイゼーションを妨げるために、構築することである。

【発明を実施するための形態】

【0023】

ここで、本発明を以下でより詳細に説明することにする。

【0024】

分析物検出システム
１つの態様において、本発明は、３つのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡に基づく分析物検出システムであって、試料中の非核酸分析物を検出することができる分析物検出システムに関する。

【0025】

本発明のこの態様のある実施形態は、第一のオリゴヌクレオチド（１）、第二のオリゴヌクレオチド（３）および第三のオリゴヌクレオチド（５）を含む分析物検出システムであって、
●第一または第二のオリゴヌクレオチドが、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）を含み；
●第三のヌクレオチドが、そのシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）を含み；
●共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）が、第一または第二のオリゴヌクレオチド上に位置し；
第一または第二のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが、前記第一または第二のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズされないときとは異なるシグナルを発生させるか、またはシグナルの発生を触媒することができ；ならびに
分析物の存在が、当該検出システムのハイブリダイゼーション平衡を変化させ、その結果、シグナルが変化することになる、分析物検出システムである。

【0026】

前記分析物検出システムは、例えば、
●第一のオリゴヌクレオチド（１）が、
〇分岐点移動領域（７）の５’側に位置する第一のトーホールド領域（８）
を含み；
●第二のオリゴヌクレオチド（３）が、
〇分岐点移動領域（７）の３’側に位置する第二のトーホールド領域（９）
を含み；および
●第三のオリゴヌクレオチド（５）が、
〇第一のトーホールド領域（８’）と、
〇第二のトーホールド領域（９’）と、
〇分岐点移動領域（７’）と
を含み；
●第一のオリゴヌクレオチド（１）中の第一のトーホールド領域（８）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第一のトーホールド領域（８’）とが、相補的配列を含み；
●第一のオリゴヌクレオチド（１）中の分岐点移動領域（７）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
●第二のオリゴヌクレオチド（３）中の第二のトーホールド領域（９）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第二のトーホールド領域（９’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；および
●第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含む
ものであってもよい。

【0027】

特定の実施形態において、本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物を検出するための分析物検出システムであって、
− ■分岐点移動領域（７）の５’側に位置する第一のトーホールド領域（８）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■場合により、第一の基（２）（前記第一の基はシグナル伝達システムの第一の部分を形成する）
を含む、第一のオリゴヌクレオチド（１）と；
− ■分岐点移動領域（７）の３’側に位置する第二のトーホールド領域（９）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■場合により、第一の基（２）（前記第一の基はシグナル伝達システムの第一の部分を形成する）
を含む、第二のオリゴヌクレオチド（３）と；
− ■第一のトーホールド領域（８’）、
■第２のトーホールド領域（９’）、
■分岐点移動領域（７’）、
■場合により、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）、
■第二の基（６）（前記第二の基はシグナル伝達システムの第二の部分を形成する）
を含む、第三のオリゴヌクレオチド（５）と
を含み；
但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）が、第一のオリゴヌクレオチド（１）および／または第二のオリゴヌクレオチド（３）のいずれかに含まれることを条件とし；
但し、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）が、第一のオリゴヌクレオチド（１）および／または第二のオリゴヌクレオチド（３）および／または第三のオリゴヌクレオチド（５）上に位置することを条件とし；
第一のオリゴヌクレオチド（１）中の第一のトーホールド領域（８）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第一のトーホールド領域（８’）とが、相補的配列を含み；
第一のオリゴヌクレオチド（１）中の分岐点移動領域（７）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
第二のオリゴヌクレオチド（３）中の第二のトーホールド領域（９）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第二のトーホールド領域（９’）とが、相補的ヌクレオチドのストレッチを含み；
第一のオリゴヌクレオチド（１）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーションが、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）と第三のオリゴヌクレオチド（５）がハイブリダイズされないときとは異なるシグナルを発生させるか、もしくはシグナルの発生を触媒することができるが、但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）が第一のオリゴヌクレオチド（１）上に含まれることを条件とし；または
第二のオリゴヌクレオチド（３）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーションが、前記第二のオリゴヌクレオチド（３）と第三のオリゴヌクレオチド（５）がハイブリダイズされないとき発生もしくは触媒されるシグナルとは異なるシグナルを発生させるか、もしくはシグナルの発生を触媒することができるが、但し、シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）が第二のオリゴヌクレオチド（３）上に含まれることを条件とする、
システムに関する。

【0028】

本明細書において用いる場合、用語「検出すること」は、分析物の存在または不在の定性的検出のみならず、本発明を用いる分析物の量の定量も包含することを意図したものである。

【0029】

本明細書において用いる場合の「分析物」への言及は、単一の分析物はもちろん、適用可能な場合には２つ以上の分析物の検出も含む。

【0030】

オリゴヌクレオチドＡ、ＢおよびＳは、多くの場合、別々のヌクレオチド鎖上にあることになるが、共有結合によって部分的にまたは完全に接続されている２つ以上のオリゴヌクレオチドで本発明を行ってもよい。

【0031】

さらに、一般にＡ、ＢまたはＳと呼ぶ３つのオリゴヌクレオチドを便宜上使用して本発明を本明細書において一般的に説明するが、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドＡおよび／またはＢと類似していてもよい追加のオリゴヌクレオチド、例えば、追加のオリゴヌクレオチドＣまたは２つの追加のオリゴヌクレオチドＣおよびＤを使用して前記方法を行うことができることは明白であろう。あるいは、または加えて、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドＳに類似している１つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドを用いて本発明を行ってもよい。例として、第一の分析物の検出のための１セットのオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｓ）とともに第二の分析物の検出のための第二のセットのオリゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ、Ｓ’）を用いて本発明を行ってもよい。

【0032】

さらなる代替実施形態は、オリゴヌクレオチドＳが１つより多くのハイブリダイゼーションドメインを含むものである。この代替実施形態の例を、１つ以上のヘアピンターンを有しており、それにより複数のハイブリダイゼーションドメインを形成するＳを示す図２０で説明する。複数のハイブリダイゼーションドメインを図２０には単一のオリゴヌクレオチドＳの一部であるように示すが、２つ以上のかかる結合ドメインが別々のヌクレオチド鎖上に位置する配置を使用することも可能であろう。

【0033】

前に述べたように、前記システムは、前記システム内のオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡の変化に基づく。したがって、ある実施形態において、分析物の存在は、その検出システムのハイブリダイゼーション平衡を変化させ、その結果、例えばその分析物が不在であるときと比較して、シグナルが変化することになる。それ故、本発明は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）間で起こるハイブリダイゼーション事象を利用して試料中の非ＤＮＡ（または非ＲＮＡ）の存在またはレベルを検出するユニークなシステムを提示する。このアッセイには、例えばＥＬＩＳＡ試験と比較していくつかの利点がある。

【0034】

− 「実地」作業を殆ど必要とせず、それがこのアッセイを迅速かつ安価にする。

【0035】

− 成分が長時間安定している。

【0036】

− 等温条件下でアッセイを行ってよく、それが必要装置を安価にする。

【0037】

− 分析物への１つの結合事象しか必要としないので、小さな分析物をより容易に検出し得る。これは、例えば、分析物上に２つの結合部位を通常必要とするＥＬＩＳＡとは対照的である。

【0038】

− このアッセイは均一であり、したがって固定および洗浄プロセスをしなくて済み、ならびに非特異的吸着の問題も免れる。

【0039】

− このアッセイは、抗体標識またはタンパク質修飾しなくて済む。

【0040】

第一のオリゴヌクレオチド
第一のオリゴヌクレオチド（１）は、前記検出システムの一部を形成する。ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）の長さは、８〜１００ヌクレオチド、例えば１０〜１００、例えば１５〜１００、例えば２０〜１００、例えば３０〜１００、例えば４０〜１００、例えば５０〜１００、例えば６０〜１００、例えば７０〜１００、例えば８０〜１００、例えば９０〜１００、例えば８〜９０、例えば８〜８０、例えば８〜７０、例えば８〜６０、例えば８〜５０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、または例えば８〜１５ヌクレオチドの範囲内である。さらにもう１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）は、配列番号１、４、７、１０および１３から成る群より選択される。特定の配列を提供するが、異なる配列の組み合わせを選択することができるので、本発明は、これらの配列に決して限定されない。分析物がそれらの配列とは無関係に検出されるということが、このことを明示している。試料中の１つより多くの分析物を検出するために多重アッセイを設計する場合、異なる配列が有用であることもある。実施例の節に、異なるオリゴヌクレオチドセットでの結果を提示する。

【0041】

本文脈において、用語「５’側」は、核酸分子内の特定のポイントまたは領域に対して５’である位置にある核酸配列を指す。同様に、用語「３’側」は、核酸分子内の特定のポイントまたは領域に対して３’である位置にある核酸配列を指す。

【0042】

第二のオリゴヌクレオチド
第二のオリゴヌクレオチド（３）は、前記検出システムの一部を形成する。ある実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）の長さは、８〜１００ヌクレオチド、例えば１０〜１００、例えば１５〜１００、例えば２０〜１００、例えば３０〜１００、例えば４０〜１００、例えば５０〜１００、例えば６０〜１００、例えば７０〜１００、例えば８０〜１００、例えば９０〜１００、例えば８〜９０、例えば８〜８０、例えば８〜７０、例えば８〜６０、例えば８〜５０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、または例えば８〜１５ヌクレオチドの範囲内である。さらにもう１つの実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）は、配列番号２、５、８、９、１１および１４から成る群より選択される。上で述べたように、本発明は、これらの配列に決して限定されない。

【0043】

第三のオリゴヌクレオチド
第三のオリゴヌクレオチド（５）は、前記検出システムの一部を形成する。ある実施形態において、第三のオリゴヌクレオチド（５）の長さは、８〜１００ヌクレオチド、例えば１０〜１００、例えば１５〜１００、例えば２０〜１００、例えば３０〜１００、例えば４０〜１００、例えば５０〜１００、例えば６０〜１００、例えば７０〜１００、例えば８０〜１００、例えば９０〜１００、例えば８〜９０、例えば８〜８０、例えば８〜７０、例えば８〜６０、例えば８〜５０、例えば８〜４０、例えば８〜３０、例えば８〜２０、または例えば８〜１５ヌクレオチドの範囲内である。さらにもう１つの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチド（５）は、特定の配列番号３、６、１２および１５から成る群より選択される。上で述べたように、本発明は、これらの配列に決して限定されない。

【0044】

オリゴヌクレオチド（１、３、５）の各々は、天然および／または非天然ヌクレオチド両方を含んでよい。したがって、ある実施形態において、オリゴヌクレオチド（１、３、５）は、天然および／または非天然ヌクレオチドを含む。さらにもう１つの実施形態において、非天然ヌクレオチドは、ＰＮＡ、ＬＮＡ、キシロ−ＬＮＡ−、ホスホロチオエート−、２’−メトキシ−、２’−メトキシエトキシ−、モルホリノ−およびホスホロアミデート−含有分子またはこれらの類するものから成る群より選択される。非天然ヌクレオチドの利点は、例えばヌクレアーゼによって分解されにくいので、より生体安定性であり得る点である。しかし、前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡから成ることもある。したがって、さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、天然核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡから成る。

【0045】

本明細書において用いる場合の用語「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」または「核酸配列」は、リボ核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらのミミック／ミメティックのオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（主鎖）ホスホジエステル結合手から成る分子、ならびに同様に機能する天然に存在しない核酸塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間（主鎖）結合を有する分子、またはこれらの組み合わせを含む。かかる修飾または置換された核酸は、例えば細胞内取り込み増進、核酸標的に対する親和性強化ならびにヌクレアーゼおよび他の酵素の存在下での安定性増加などの望ましい特性のためネイティブ形態より好ましいことが多く、本文脈では用語「核酸類似体」または「核酸ミミック」によって記述される。核酸ミミック／ミメティックの好ましい例は、ペプチド核酸（ＰＮＡ−）、ロックド核酸（ＬＮＡ−）、キシロ−ＬＮＡ−、ホスホロチオエート−、２’−メトキシ−、２’−メトキシエトキシ−、モルホリノ−およびホスホロアミデート−含有分子またはこれらに類するものである。

【0046】

核酸、核酸分子または核酸配列は、例えば、もっぱらデオキシリボヌクレオチドから成ることもあり、もっぱらリボヌクレオチドから成ることもあり、もっぱら核酸ミミックもしくは類似体から成ることもあり、またはそれらのキメラ混合物から成ることもある。それらのモノマーは、典型的にはヌクレオチド間ホスホジエステル結合手によって連結されている。核酸のサイズは、典型的に、数モノマー単位、例えばそれらが一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれるときには５〜４０から、数千のモノマー単位にわたる。核酸または核酸配列が表示されているときには常に、別段の断り書きがない限り、ヌクレオチドが左から右へ５’から３’への順序であることならびに「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、および「Ｔ」がチミジンを示すことは理解されるであろう。

【0047】

非天然ヌクレオチド
本明細書において用いる場合、「非天然ヌクレオチド」または「核酸類似体」または「人工ヌクレオチド」は、相補核酸配列（１）にハイブリダイズするように設計された、ＤＮＡまたはＲＮＡの構造類似体を意味すると解される。ヌクレオチド間結合（単数または複数）、糖および／または核酸塩基の修飾により、核酸類似体は、次の望ましい特性のいずれかまたはすべてを獲得し得る：１）最適化されたハイブリダイゼーション特異性または親和性、２）ヌクレアーゼ耐性、３）化学的安定性、４）可溶性；５）膜透過性；ならびに６）合成および精製の容易さまたは低い合成および精製コスト。核酸類似体の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸「ＬＮＡ」、２’−Ｏ−メチル核酸、２’−フルオロ核酸、ホスホロチオエート、および金属ホスホン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0048】

トーホールド領域
本文脈において、「トーホールド領域」は、ワトソン・クリック塩基対合を形成することができる２つの相補オリゴヌクレオチド領域を指し、またはトーホールド領域は、オリゴヌクレオチド中に位置する一本鎖配列を指すこともある。したがって、一本鎖オリゴヌクレオチドに関して用語「トーホールド領域」を用いるとき、それは一本鎖トーホールド領域を指し、これに対して二本鎖のもの（２つの一本鎖トーホールド領域が互いにハイブリダイズしているとき）に関して用語「トーホールド領域」を用いるとき、それは二本鎖領域を指すと解されたい。本文脈では、二本鎖トーホールド領域の各相補配列をＸおよびＸ’として識別することがある。

【0049】

トーホールド領域は、異なる位置を有してよい。ある実施形態において、第三のオリゴヌクレオチド（５）中に第一の（一本鎖）トーホールド領域（８’）および（一本鎖）第二のトーホールド領域（９’）は、分岐点移動領域（７’）の反対側に位置する。分岐点移動領域の反対側への一本鎖トーホールド領域８’および９’の配置は、アッセイを加速させ得る。

【0050】

異なるトーホールド領域間の交差ハイブリダイゼーションを最小限にするために、２つのトーホールド領域［８、８’］および［９、９’］は、異なる配列を有してもよい。したがって、ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の第一のトーホールド領域（７）および第二のオリゴヌクレオチド（１）中の第二のトーホールド領域（８）は似ていない。本文脈において、似ていないという表現は、異なる配列を有すると解してもよく、したがって１００％同一ではない。

【0051】

２つの一本鎖トーホールド領域は、長さが互いに異なってもよい。このようにして、ハイブリダイゼーションのシフトをより容易に認識できることがある。したがって、もう１つの実施形態において、第一のトーホールド領域（８）の長さは、１〜１０ヌクレオチド、例えば１〜８ヌクレオチド、例えば１〜６ヌクレオチド、例えば１〜４，ヌクレオチド、例えば２〜１０ヌクレオチド、例えば３〜１０ヌクレオチド、例えば４〜１０ヌクレオチド、例えば５〜１０ヌクレオチド、例えば７〜１０ヌクレオチドの範囲内、例えば３ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、例えば５ヌクレオチド、または例えば６ヌクレオチドである。

【0052】

本明細書において用いる場合、用語「ハイブリダイゼーション」または「アニーリング」は、二本鎖構造の１本の鎖の中のヌクレオチドが反対の鎖上のヌクレオチドとの特異的ワトソン・クリック塩基対合を被るような、二本鎖構造を形成するための一本鎖ヌクレオチドの会合を指す。この用語は、本発明によるオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオシド類似体、例えばデオキシイノシン、２つのアミノプリン塩基を有するヌクレオシド、およびこれらに類するもの、の対合も含む。

【0053】

さらなる実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の第一のトーホールド領域（８）および第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第一のトーホールド領域（８’）は、１〜１０、例えば２〜１０、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば２〜８、例えば２〜７、例えば２〜６、例えば２〜５、例えば２〜４相補的ヌクレオチドのストレッチを含む。

【0054】

さらにもう１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の第一のトーホールド領域（８）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第一のトーホールド領域（８’）とは、少なくとも７０％相補的、例えば７０〜１００％相補的、例えば７５〜１００％相補的、例えば８０〜１００％相補的、例えば８５〜１００％相補的、例えば９０〜１００％相補的、例えば９５〜１００％相補的、例えば９７〜１００％相補的、例えば９９〜１００％相補的、または例えば１００％相補的である。

【0055】

もう１つの実施形態において、第二のトーホールド領域（９、９’）の長さは、１〜１０ヌクレオチド、例えば１〜８ヌクレオチド、例えば１〜６ヌクレオチド、例えば１〜４，ヌクレオチド、例えば２〜１０ヌクレオチド、例えば３〜１０ヌクレオチド、例えば４〜１０ヌクレオチド、例えば５〜１０ヌクレオチド、例えば７〜１０ヌクレオチドの範囲内、例えば３ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、例えば５ヌクレオチド、または例えば６ヌクレオチドである。

【0056】

ある実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）中の第二のトーホールド領域（９）および第三のオリゴヌクレオチド（５）中の第二のトーホールド領域（９’）は、１〜１０、例えば２〜１０、例えば３〜１０、例えば４〜１０、例えば５〜１０、例えば２〜８、例えば２〜７、例えば２〜６、例えば２〜５、例えば２〜４相補的ヌクレオチドのストレッチを含む。

【0057】

分岐点移動領域
本文脈において、「分岐点移動」は、２つのトーホールド領域および分岐点移動領域内でのハイブリダイゼーションにより第一のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの平衡が第二のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの方におよびその逆にシフトする状況を指す。図２は、分岐点移動、および分析物の結合により平衡状態がどのように変化するかを示す。

【0058】

分岐点移動領域は、その相補的領域のため、第一のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチド間および第二のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチド間の分岐移動を助長する。したがって、ある実施形態において、分岐点移動領域（７、７’）の長さは、３〜３０ヌクレオチド、例えば４〜３０、例えば５〜３０、例えば７〜３０、例えば９〜３０、例えば１１〜３０、例えば１５〜３０、例えば２０〜３０、例えば２５〜３０、例えば３〜２５、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１１、例えば３〜９、例えば３〜７、例えば３〜５、または例えば３〜４ヌクレオチドの範囲内である。所望の長さを異なる温度および特定の配列に適応させてよい。さらにもう１つの実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）および第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）は、３〜３０相補的ヌクレオチド、例えば、４〜３０、例えば５〜３０、例えば７〜３０、例えば９〜３０、例えば１１〜３０、例えば１５〜３０、例えば２０〜３０、例えば２５〜３０、例えば３〜２５、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１１、例えば３〜９、例えば３〜７、例えば３〜５または例えば３〜４相補的ヌクレオチドのストレッチを含む。

【0059】

さらなる実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とは、少なくとも７０％相補的、例えば７０〜１００％相補的、例えば７５〜１００％相補的、例えば８０〜１００％相補的、例えば８５〜１００％相補的、例えば９０〜１００％相補的、例えば９５〜１００％相補的、例えば９７〜１００％相補的、例えば９９〜１００％相補的、または例えば１００％相補的である。さらにさらなる実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の分岐点移動領域（７）および第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）は、３〜３０相補的ヌクレオチド、例えば４〜３０、例えば５〜３０、例えば７〜３０、例えば９〜３０、例えば１１〜３０、例えば１５〜３０、例えば２０〜３０、例えば２５〜３０、例えば３〜２５、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１１、例えば３〜９、例えば３〜７、例えば３〜５、または例えば３〜４相補的ヌクレオチドのストレッチを含む。

【0060】

もう１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の分岐点移動領域（７）と第二のオリゴヌクレオチド（３）中の分岐点移動領域（７）とは、少なくとも７０％同一、例えば７０〜１００％同一、例えば７５〜１００％同一、例えば８０〜１００％同一、例えば８５〜１００％同一、例えば９０〜１００％同一、例えば９５〜１００％同一、例えば９７〜１００％同一、例えば９９〜１００％同一、または例えば１００％同一である。したがって、第一および第二のオリゴヌクレオチド中の２つの分岐点移動領域７は、完全に同一である必要はない。

【0061】

追加の実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）中の分岐点移動領域（７）および第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）は、３〜３０相補的ヌクレオチド、例えば４〜３０、例えば５〜３０、例えば７〜３０、例えば９〜３０、例えば１１〜３０、例えば１５〜３０、例えば２０〜３０、例えば２５〜３０、例えば３〜２５、例えば３〜２０、例えば３〜１５、例えば３〜１１、例えば３〜９、例えば３〜７、例えば３〜５、または例えば３〜４相補的ヌクレオチドのストレッチを含む。さらなる実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）と第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７’）とは、少なくとも７０％相補的、例えば７０〜１００％相補的、例えば７５〜１００％相補的、例えば８０〜１００％相補的、例えば８５〜１００％相補的、例えば９０〜１００％相補的、例えば９５〜１００％相補的、例えば９７〜１００％相補的、例えば９９〜１００％相補的、または例えば１００％相補的である。

【0062】

用語「配列同一性」は、等しい長さの２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の相同度の定量的尺度である。比較すべき２つの配列が等しい長さでない場合、ギャップの挿入または、代替的に、ポリペプチド配列もしくはヌクレオチド配列の末端での短縮を許すことにより、可能なベストフィットが得られるようにそれらをアラインしなければならない。配列同一性は、

【0063】

【化2】

として算出することができ、
この式中、Ｎ_ｄｉｆは、アラインしたときの２つの配列中の非同一残基の総数であり、およびＮ_ｒｅｆは、それらの配列の一方における残基の数である。それ故、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎ_ｄｉｆ＝２およびＮ_ｒｅｆ＝８）。ギャップは、特定の残基（単数または複数）の非同一性としてカウントする、すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎ_ｄｉｆ＝２およびＮ_ｒｅｆ＝８）。

【0064】

本発明のポリペプチドまたはアミノ酸に基づく実施形態すべてにおいて、１つ以上の配列間の配列同一性の百分率は、ｃｌｕｓｔａｌＷソフトウェア（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌＷ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によりそのプログラムのデフォルト設定を用いて実行したときのそれぞれの配列のアラインメントに基づく。本発明のヌクレオチドに基づく実施形態に関する１つ以上の配列間の配列同一性の百分率も、ｃｌｕｓｔａｌＷソフトウェアをデフォルト設定で使用するアラインメントに基づく。例えば、ヌクレオチド配列アラインメントのためのこれらの設定は、Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝３Ｄｆｕｌｌ、Ｇａｐ Ｏｐｅｎ １０．００、Ｇａｐ Ｅｘｔ．０．２０、Ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｄｉｓｔ．４、ＤＮＡ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ：ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ＩＵＢ）である。

【0065】

同様に、例えば前記オリゴヌクレオチドの１つについての相補配列を使用することによって、相補度を算出することができることは理解されるはずである。

【0066】

ある実施形態において、分岐点移動領域７と分岐点移動領域７’間のハイブリダイゼーションは、分岐点移動領域内に１つ以上のヘアピン、例えば、１〜５ヘアピン、例えば１〜３ヘアピン、例えば１〜２ヘアピンまたは例えば１ヘアピンを含む。理論により拘束されないが、Ｓの中央に２つの隣接するヘアピンがあると、ＡＳの複合体全体がホリデイジャンクション構造を有することになり、このホリデイジャンクションは、Ｍｇ^２＋の存在下で特定の３Ｄ構造を拡張し、それ故、ＳとハイブリダイズするためにＡと競合するタンパク質結合Ｂ鎖に対してより大きな立体障害をおそらくもたらすことになるという仮説が立てられる（図２０）。ある実施形態において、前記１つ以上のヘアピンは、１〜２０ヌクレオチド、例えば、３〜２０ヌクレオチド、例えば５〜２０ヌクレオチド、例えば１０〜２０ヌクレオチド、例えば３〜１５ヌクレオチド、例えば３〜１０ヌクレオチド、または例えば５〜１５ヌクレオチドの長さを有する。

【0067】

結合部分
本発明による結合部分（単数または複数）は、ワトソン・クリック塩基対合を形成しない分析物の前記アッセイによる検出を可能にする。同様に、ＤＮＡ結合タンパク質などのＤＮＡまたはＲＮＡに結合しない分析物の検出を可能にする。

【0068】

前記１つ以上の結合部分は、原則的に、前記３つのオリゴヌクレオチドのいずれに位置してもよい。ある実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、第一のオリゴヌクレオチド（１）上に位置する。もう１つの実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、第二のオリゴヌクレオチド（３）上に位置する。第三の実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、第三のオリゴヌクレオチド（５）上に位置する。ある実施形態において、前記結合検出システムは、１〜５、例えば１〜４、例えば１〜３、例えば１〜２、例えば１、例えば２〜５、または例えば３〜５の結合部分を含む。

【0069】

前記１つ以上の結合部分は、異なる位置にあってもよい。ある実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、第一のオリゴヌクレオチド（１）、第二のオリゴヌクレオチド（３）または第三のオリゴヌクレオチド（５）中の分岐点移動領域（７）の一部に共有結合で連結されている。

【0070】

検出すべき具体的な分析物に依存して、異なるタイプの結合部分を利用してもよい。したがって、ある実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、有機分子、抗体、抗原、アプタマー、ビオチンおよびハプテンから成る群より選択される。もう１つの実施形態において、前記抗原は、タンパク質抗原 ペプチド抗原または糖抗原である。一部の分析物は１つまたは少数のヌクレオチドと直接結合できることがあるので、場合によっては共有結合性接合を必要としない。これらの分析物としては、ＤＮＡ結合タンパク質、一部のイオン（図１９ｂ）または挿入分子、および小分子、例えばメラミン（図１９ａ）が挙げられる。ある実施形態において、前記結合部分は、共有結合で連結されている第一の部分が、その第一の部分に共有結合または非共有結合することができる第二の結合部分のためのハンドルとして機能するという意味で、サンドイッチ構造を有することもある。したがって、第二の結合部分は、二重機能Ｉ）第一の部分への結合およびＩＩ）分析物のための結合部位を有することがある。例えば、前記オリゴヌクレオチドの１つ以上についての部分を形成し、かつ分析物に結合することができるアプタマーの場合、共有結合で連結されている別の結合部分を必要としないこともある。

【0071】

小有機分子は、好ましい結合部分である。ある実施形態において、前記有機分子は、１５０〜１５００Ｄａ（ダルトン）、例えば１５０〜１２００Ｄａ、例えば１５０〜１０００Ｄａ、例えば１５０〜８００Ｄａ、例えば１５０〜６００Ｄａ、例えば１５０〜４００Ｄａ、例えば１５０〜３００Ｄａ、例えば３００〜１５００Ｄａ、例えば４００〜１５００Ｄａ、例えば６００〜１５００Ｄａ、例えば８００〜１５００Ｄａ、例えば１０００〜１５００Ｄａ、または例えば１２００〜１５００Ｄａの範囲内の分子量を有する。小有機分子もまた本発明のための好ましい分析物である。より具体的な実施形態において、共有結合で連結されている少なくとも１つの結合部分（４）は、ビタミンＤ、葉酸塩、エンロフロキサシン、ジゴキシゲニンから成る群より選択される。本発明による小有機分子および／または共有結合で連結されている結合部分のさらなる例は、次のものである：
毒素：ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ドウモイ酸（ＤＡ）、アフラトキシン（ＡＦＢ１、ＡＦＧ１、ＡＦＢ２、ＡＦＧ２、ＡＦＭ１）、デオキシニバレノール、オクラトキシンＡ（ＯＴＡ）。

【0072】

薬物：モルフィン−３−グルクロニド（Ｍ３Ｇ）、経口抗凝固薬ワルファリン、インスリン。

【0073】

農薬：アトラジン、シマジン、クロルピリホス、カルバリル、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）。

【0074】

他の環境分析物：２−ヒドロキシビフェニル（ＨＢＰ）、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）。フェノール（ビスフェノールＡ、アトラジン、ポリ塩素化ビフェニル、３，７，８−ＴＣＤＤ）、メラミンおよび関連化合物。

【0075】

獣医薬／抗生物質：ペニシリンおよびセファロスポリン、クロラムフェニコールおよびクロラムフェニコールグルクロニド、フェニコール抗生物質残留物、テトラサイクリン、タイロシン、エリスロマイシン、スルホンアミド抗生物質。

【0076】

化学的汚染物質：甲殻類における４−ノニルフェノール、乳牛におけるインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）。

【0077】

ビタミン：ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ８（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２（コバラミン）。

【0078】

ホルモン：プロゲステロン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧ）、１７β−エストラジオール、Ｒ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、テストステロン、１９−ノルテストステロン、メチルテストステロン、ボルデノンおよびメチルボルデノン。

【0079】

火薬：２，４，６−トリニトロトルエン（ＴＮＴ）、２，４，６−トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、１，３，５−トリニトロベンゼン（ＴＮＢ）、トリアセトントリフェノキシド（ＴＡＴＰ）、ヘキサメチレントリペルオキシドジアミン（ＨＭＴＤ）、四硝酸ペンタエリトリトール（ＰＥＴＮ）、シクロトリメチレントリニトラミン（ＲＤＸ）。

【0080】

上記化合物リストも本発明に従って検出される分析物であり得ると解されたい。

【0081】

抗体および他のタンパク質分析物：
診断用抗体：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｐｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗体、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）抗体。

【0082】

ウイルス病原体に対する抗体：Ｇ型肝炎に対する抗体、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ｈＨＢＶ）に対する抗体、単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）に対する抗体、エプスタイン・バーウイルスに対する抗体（抗ＥＢＮＡ）、ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対する抗体、抗アデノウイルス抗体。

【0083】

薬物誘発性抗体：インスリンまたは顆粒球（ｉｎｓｕｌｉｎ ｏｒｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）に対する抗体、他の組換えまたは非組換えタンパク質または抗体薬に対する抗体。

【0084】

タンパク質：カゼイン、免疫グロブリンＧ、葉酸結合タンパク質、ラクトフェリン、およびラクトペルオキシダーゼ。

【0085】

アレルゲンまたはアレルギーマーカー：ピーナッツアレルゲン、パスタ中のコンアルブミン／トロポミオシン、ゴマ種子タンパク質、トロポミオシン、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体、ヒスタミン（ａ−イミダゾールエチルアミン。

【0086】

癌マーカー：前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体（α１−抗キモトリプシン）、炭水化物抗原（ＣＡ １９−９）、タンパク質血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、フィブロネクチン。

【0087】

他のマーカー：トロポニン（ｃＴｎ Ｉ）、グルコース６−リン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）に対する抗体、抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）抗体、ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、シスタチンＣ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）。

【0088】

前記結合部分は、前記結合部分に結合したその結合パートナーを有することがある。本文脈において、用語「結合パートナー」は、結合部分に非共有結合する（ｂｉｎｄ ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔｙ）ことがある分子を指すと解されたい。したがって、ある実施形態において、結合パートナーは、結合部分に非共有結合している。「結合部分」−「結合パートナー」カップルの非限定的な例は、抗体−抗原、ストレプトアビジン−ビオチン、葉酸受容体−葉酸である。したがって、ある実施形態において、前記結合部分は、前記結合部分に結合しているその結合パートナーを有する。

【0089】

検出される分析物のタイプに一部依存して３つの戦略を本検出システムに適用してよい。これらの戦略を下で概説し、例えばタンパク質もしくは抗体の検出（戦略１）または小分子分析物の検出（戦略２および３）に関して例示する。

【0090】

戦略１：直接アッセイ
１つの実施形態（戦略１）では、タンパク質または抗体が分析することとなる分析物である（図５、戦略１）。この戦略を用いて、結合部分へのタンパク質または抗体（分析物）の結合がハイブリダイゼーション平衡をシフトさせ、その後、それを検出することができる。この戦略を図３〜５ならびに対応する実施例１および２においてさらに詳細に概説する。

【0091】

戦略２：阻害アッセイ
もう１つの実施形態（戦略２）では、小分子分析物（標的分子）を含む（または含むと推測される）試料を先ず、結合部分に対する結合パートナー（例えば、抗体などのタンパク質）と混合し、その後、その混合物をその検出システムの残りの部分に添加する（図５、戦略２）。試料中に含まれている標的小分子（分析物）がある場合、それらがタンパク質（結合パートナー）の結合部位を占有することになり、それ故、オリゴヌクレオチドＢ上に連結された共有結合で連結されている同じ小分子との相互作用によりハイブリダイゼーション平衡に干渉するためのそのタンパク質の結合能力は殆どまたは全くなくなる。したがって、試料中の分析物の存在は、結果として、その検出システムのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション平衡を変化させることになる。これを阻害アッセイと呼ぶ。図４ｅは、ビオチン検出のためのかかるアッセイの結果を示す。

【0092】

戦略３：競合アッセイ
さらのもう１つの実施形態（戦略３）では、結合パートナー（タンパク質）を先ずアッセイに添加し、戦略１と同じ平衡シフトを生じさせ、その後、分析物（標的分子）を含むと推測される未知試料を添加する。遊離分析物分子が存在する場合、それらは、オリゴヌクレオチドＢ上の結合パートナー（タンパク質）に結合する、共有結合で連結されている結合部分と置き換わって、タンパク質と結合し、かくしてハイブリダイゼーション平衡を変化させ得る（図５、戦略３）。したがって、この戦略は競合アッセイである。阻害的戦略および競合的戦略両方において、元のアッセイと比較してシグナル変化が大きいほど、試料中に存在する標的分子は少ない。

【0093】

分析物
様々な種類の分析物が本発明によって検出され得る。前述のように、分析物は、ＤＮＡまたはＲＮＡでない。同様に、分析物は、ＤＮＡ相互作用性分析物、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質でなくてよい。ワトソン・クリック塩基対合を形成せず、ＤＮＡに結合する分析物の例は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えばヒストンである。ある実施形態において、分析物は、非ＤＮＡおよび非ＲＮＡ結合分析物である。

【0094】

ある実施形態において、分析物は、タンパク質、ペプチド、有機分子、抗体、抗原、糖、脂質およびハプテンから成る群より選択される。もう１つの実施形態において、分析物は、タンパク質抗原、ペプチド抗原、または糖抗原である。さらにもう１つの実施形態において、分析物は、１５０〜１５００Ｄａ、例えば１５０〜１２００Ｄａ、例えば１５０〜１０００Ｄａ、例えば１５０〜８００Ｄａ、例えば１５０〜６００Ｄａ、例えば１５０〜４００Ｄａ、例えばは１５０〜３００Ｄａ、例えば３００〜１５００Ｄａ、例えば４００〜１５００Ｄａ、例えば６００〜１５００Ｄａ、例えば８００〜１５００Ｄａ、例えば１０００〜１５００Ｄａ、または例えば１２００〜１５００Ｄａの範囲内の分子量を有する有機分子である。特定の実施形態において、分析物は、ビタミン、毒素、アレルゲン、火薬、薬物、例えばコカイン、抗生物質、例えばエンロフロキサシン、農薬、ホルモン、化学的汚染物質、バイオマーカーから成る群より選択される。さらに、上で述べたものが本発明による分析物のより広範なリストである。

【0095】

シグナル伝達システム
本発明による検出システムは、分析物を検出するときにシグナルまたはシグナルの変化をもたらすシグナル伝達システムを含む。シグナル伝達システムは、そのシグナル伝達システムの異なる部分を含むオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされるとシグナルが発生または触媒されるという原理に基づく。例えば実施例１において例証するように、オリゴヌクレオチド１（Ａ）とオリゴヌクレオチド５（Ｓ）のハイブリダイゼーションは、シグナル伝達システムの２つの部分が近接されると増加されたシグナルを発生させるが、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド５のハイブリダイゼーションは、シグナルを発生さる結果にならない。したがって、ある実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）は、第一の基（２）を含み、前記第一の基は、シグナル伝達システムの第一の部分を形成し、および第三のオリゴヌクレオチド（５）は、第二の基（６）を含み、前記第二の基は、シグナル伝達システムの第二の部分を形成する。

【0096】

同様に、シグナル伝達システムを第一のオリゴヌクレオチドと第三のオリゴヌクレオチドに分けてもよい。したがって、ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）は、第一の基（２）を含み、前記第一の基は、シグナル伝達システムの第一の部分を形成し、および第三のオリゴヌクレオチド（５）は、第二の基（６）を含み、前記第二の基は、シグナル伝達システムの第二の部分を形成する。

【0097】

シグナル伝達システムは、どのオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズするかに依存して、異なるシグナルをもたらす第三の部分を含んでもよく、これは、各オリゴヌクレオチドが、その検出システムの一部を構成することを意味する。したがって、ある実施形態において、
− 第一のオリゴヌクレオチド（１）は、第一の基（２）を含み、前記第一の基は、シグナル伝達システムの第一の部分を形成し；
− 第二のオリゴヌクレオチド（３）は、第三の基（１０）を含み、前記第三の基（１０）は、そのシグナル伝達システムの第三の部分を形成し；および
− 第三のオリゴヌクレオチド（５）は、第二の基（６）を含み、前記第二の基は、シグナル伝達システムの第二の部分を形成する。

【0098】

この構成を図４および対応する実施例において例証する。

【0099】

様々なタイプのシグナル伝達システムを利用してよい。したがって、ある実施形態において、第一の基（２）および第二の基（６）によって形成されるシグナル伝達システムは、クエンチャー−フルオロフォアシグナル伝達システム、フルオロフォア−クエンチャーシグナル伝達システム、ＦＲＥＴシグナル伝達システム、ＤＮＡペルオキシダーゼ触媒シグナル伝達システム、またはクエンチャーおよび一重項酸素増感剤である。シグナル伝達システムは、特にＦＲＥＴまたはクエンチャーシステムの場合、蛍光ナノ粒子を利用することがある。実施例の節は、本発明に従って利用され得る構成の様々な例を提供する。さらにもう１つの実施形態において、
Ｉ．シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）は、クエンチャーであり、およびシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）は、フルオロフォアである、または
ＩＩ．シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）は、フルオロフォアであり、およびシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）は、クエンチャーである、または
ＩＩＩ．シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）は、ＦＲＥＴドナーであり、およびシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）は、ＦＲＥＴアクセプターである、または
ＩＶ．シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）は、ＦＲＥＴアクセプターであり、およびシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）は、ＦＲＥＴドナーである、または
Ｖ．シグナル伝達システムの第一の部分を形成する第一の基（２）は、ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムの前半部であり、およびシグナル伝達システムの第二の部分を形成する第二の基（６）は、ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムの後半部である。

【0100】

ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムを使用するとき、その検出システムは、さらなる成分を含むことがある。したがって、さらなる実施形態において、前記検出システムは、ヘミンおよび／またはＡＢＴＳ^２−および／またはＨ_２Ｏ_２および／またはルミノールを含む。比色法、例えば金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）または量子ドット（ＱＤ）、を本発明によるアッセイに組み込むことも可能である。

【0101】

シグナル伝達システムの異なる部分が前記オリゴヌクレオチドの異なる位置に共有結合で連結されていてもてよい。したがって、ある実施形態において、シグナル伝達システムの第一の部分および／またはシグナル伝達システムの第二の部分および／またはシグナル伝達システムの第三の部分は、それがカップリングされるオリゴヌクレオチド上の分岐点移動領域（７、７’）の一部に共有結合で連結されている。

【0102】

もう１つの実施形態において、シグナル伝達システムの第一の部分および／またはシグナル伝達システムの第二の部分および／またはシグナル伝達システムの第三の部分は、それがカップリングされるオリゴヌクレオチド上のトーホールド領域（７、８）の一部に共有結合で連結されている。

【0103】

例えば、ＦＲＥＴ対が近接するとシグナルが発生または増加されるようにＦＲＥＴ対を設計する方法は、当業者には公知である。同様に、フルオロフォア−クエンチャー対が近接するとシグナルが消失または弱化するようにフルオロフォア−クエンチャー対を設計する方法は、当業者には公知である。実施例３およびその対応する図に、ＤＮＡペルオキシダーゼアッセイが、ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムの一部を含むオリゴヌクレオチドの各々が近接されたときにシグナルの発生を触媒するように設計され得る方法を示す。ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムの１つの利点は、それが、極少量の分析物の検出を可能にし得る増幅反応を構成する点である。もう１つの利点は、オリゴヌクレオチドが、より少ない修飾しか必要としないのでより容易に合成される点である。すべての上の例では、シグナル伝達システムの各部分を含む２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに起因して異なる対が近接される。上で説明したように、前記アッセイは、平衡反応に基づき、それ故シグナルは、例えば前記共有結合で連結されている結合部分に対する結合パートナーの結合または解離に起因する、ハイブリダイゼーション平衡の変化によって強化されることもあり、または弱化されることもある。

【0104】

特殊な実施形態では、分析物が核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいが、但し、シグナル伝達システムがＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムであることを条件とする。

【0105】

もう１つの特殊な実施形態において、分析物は、オリゴヌクレオチド（１）、（３）および／または（５）のいずれかの中の１、２または３個のチミン塩基と相互作用することができる、メラミンおよび構造的に関連がある化合物であってもよい。

【0106】

共有結合で連結されたオリゴヌクレオチド
場合によっては、検出システムがいくつかのオリゴヌクレオチドで構成されることは、ハイブリダイゼーション平衡に達するまでの時間を増加することがあるので、不利であることがある。本発明によるオリゴヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されていてもよく、これは、その検出システムが、３つの個別のオリゴヌクレオチドで作られているのではなく、１つまたは２つの個別のオリゴヌクレオチドでもっぱら構成されていることを意味する。この原理を実施例１２ならびに対応する図１７および１８において例証する。したがって、ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド、第二のオリゴヌクレオチドおよび第三のオリゴヌクレオチドは、共有結合で連結されている。

【0107】

したがって、ある実施形態において、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）は、第二のオリゴヌクレオチド（３）に共有結合で連結されている。もう１つの実施形態において、第三のオリゴヌクレオチド（５）は、第一のオリゴヌクレオチド（１）に共有結合で連結されている。さらなる実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）は、第三のオリゴヌクレオチド（５）に共有結合で連結されている。さらなる実施形態において、前記第一のオリゴヌクレオチド（１）は、第二のオリゴヌクレオチド（３）に共有結合で連結されており、および第二のオリゴヌクレオチド（３）は、第三のオリゴヌクレオチドに共有結合で連結されている。さらにもう１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）の３’末端は、第二のオリゴヌクレオチド（３）の５’末端に共有結合で連結されている。さらなる実施形態において、第二のオリゴヌクレオチド（３）の３’末端は、第三のオリゴヌクレオチド（５）の５’末端に共有結合で連結されている。

【0108】

前記オリゴヌクレオチドの２つ以上が互いに共有結合で連結されているとき、その検出システムが本発明による第一、第二および第三のオリゴヌクレオチドをなお含むことは理解されるはずである。

【0109】

特殊な実施形態において、分析物は、核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいが、但し、前記オリゴヌクレオチドの２つ以上が上で説明したように共有結合で連結されていることを条件とする。

【0110】

さらにもう１つの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、リンカーによって共有結合で連結されている。追加の実施形態において、前記リンカーは、ホスホジエステル結合手、ヌクレオチド、例えば１〜２０、例えば１〜１０、１〜５、３〜１０ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、Ｃ−リンカー、例えばＣ１−Ｃ２０リンカー、ＰＥＧリンカー、ジスルフィドリンカー、およびスルフィドリンカーから成る群より選択される。当業者が他の適するリンカーを見つけてもよい。

【0111】

部品からなるキット
前記検出システムを部品からなるキットの形態で提供してもよい。したがって、本発明のある態様は、本発明による分析物検出システムを含む部品からなるキットに関する。

【0112】

もう１つの態様において、本発明は、本発明による第一のオリゴヌクレオチド１、第二のオリゴヌクレオチド３および第三のオリゴヌクレオチド５を含む部品からなるキットに関する。

【0113】

前記キットは、さらなる成分を含んでもよい。したがって、ある実施形態において、前記キットは、ヘミンおよび／またはＡＢＴＳ^２−および／またはＨ_２Ｏ_２をさらに含む。これらの成分は、ＤＮＡペルオキシダーゼアッセイを用いるときの前記キットのパーツであり得る。前に説明したように、前記結合部分に対する結合パートナーを前記キットに含めることが有利であることもある。したがって、さらなる実施形態において、前記キットは、前記結合部分に対する結合パートナーを含む。さらにもう１つの実施形態において、前記結合パートナーは、１つ以上の結合部分に非共有結合でカップリングされている。さらにもう１つの実施形態において、前記結合パートナーは、共有結合で連結されている結合部分を含むオリゴヌクレオチドとは別のそのキットの区画内にある。

【0114】

試料中の分析物の存在またはレベルの検出方法
本発明は、試料中の分析物の存在の検出方法も提供する。したがって、本発明のある態様は、試料中のＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物の存在またはレベル検出方法であって、
ａ）目的の分析物を含むまたは含むと推測される試料を提供するステップ；
ｂ）本発明による分析物検出システムを提供するステップ；
ｃ）前記試料を前記分析物検出システムとともにインキュベートするステップ；
ｄ）分析物の検出レベルを基準レベルと比較するステップ；および
ｅ）前記試料中の分析物の存在またはレベルを決定するステップ
を含む方法に関する。

【0115】

前記試料が、その試料を含むことが判っていることもあり、または分析物がその試料中に存在するかどうか判らないこともあることは理解されるはずである。第一の事例では定量が目的であることがあるのに対して、第二の事例については存在を検出するだけで十分であることがある。

【0116】

さらにもう１つの実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡとは異なる分析物は、核酸分子ではない。

【0117】

好ましくは、ハイブリダイゼーション平衡に達するまでインキュベーションステップを継続する。したがって、ある実施形態では、平衡に達するまでインキュベーションステップＣ）を継続する。しかし、そのアッセイを実時間でモニターしてもよい。ハイブリダイゼーション平衡は、結合部分への分析物の結合によって変化し得る。したがって、ある実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間および第二のオリゴヌクレオチド（３）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーション平衡は、結合部分への分析物の結合によってシフトされる。

【0118】

結合部分に対する結合パートナーがアッセイに含まれる場合、そのハイブリダイゼーション平衡は、異なる様式で変化される。したがって、もう１つの実施形態において、第一のオリゴヌクレオチド（１）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間および第二のオリゴヌクレオチド（３）と第三のオリゴヌクレオチド（５）間のハイブリダイゼーション平衡は、結合部分（４）に対する結合パートナーの前記結合部分からの解離によってシフトされる。

【0119】

結合部分に対する結合パートナーを様々な時点でアッセイに含めてよい。さらにもう１つの実施形態では、試料をその検出システムのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする前に、結合部分に対する結合パートナーをその試料とともにインキュベートする。もう１つの実施形態では、試料をその検出システムのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした後、結合部分に対する結合パートナーをその試料とともにインキュベートする。さらにもう１つの実施形態では、結合部分に対する結合パートナーを、試料とのインキュベーション前に、その検出システムのオリゴヌクレオチドとともにインキュベートする。結合親和性に依存して、上記溶液の各々が最適なものであり得る。さらなる詳細については、図１３も参照されたい。

【0120】

さらなる実施形態において、結合部分からの結合パートナーの解離は、その結合パートナーへの分析物の結合によって生ずる。

【0121】

インキュベーション時間は、用いられる試料のタイプ、分析物および正確なオリゴヌクレオチドに依存して、アッセイごとに異なってよい。したがって、ある実施形態において、インキュベーションステップｃ）は、１分〜２４時間、例えば１分〜１２時間、例えば１分６時間、例えば１分〜２時間、例えば１〜６０分、例えば１〜３０分、例えば１〜１５分、例えば１〜５分、例えば５〜６０分、例えば１０〜６０分、例えば１５〜６０分、例えば３０〜６０分、例えば１〜６時間、例えば２〜６時間または例えば４〜６時間の期間、行われる。

【0122】

本アッセイの利点は、アッセイ中に温度を変える必要がないことがある点である。したがって、さらなる実施形態では、前記方法を等温条件下で行う。これは、加熱室または加熱板のみを使用してアッセイを行うことを意味する。同様に、室温の作業場でアッセイを行ってもよい。その場合、その後、必要な装置を使用してアッセイを分析することができる。ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムを使用する場合、目視検査によって結果を決定してもよい。さらにもう１つの実施形態では、前記方法を４〜５０℃、例えば１０〜５０℃、例えば２０〜５０℃、例えば２５〜５０℃、例えば３０〜５０℃、例えば３５〜５０℃、例えば４０〜５０℃、例えば４〜４０℃、例えば４〜３５℃、例えば４〜３０℃、例えば４〜２５℃、または例えば４〜２０℃の範囲内の温度で行う。さらにもう１つの実施形態では、等温条件下でアッセイを行う。

【0123】

試料
試料は、様々な起源からのものであってよい。ある実施形態において、試料は、環境から得られる試料、例えば水試料である。もう１つの実施形態において、試料は、生物学的試料である。さらなる実施形態において、試料は、食品試料、またはプラスチックである。プラスチックを、毒性であり得る軟化剤の存在について試験してもよい。

【0124】

さらにもう１つの実施形態では、生物学的試料を哺乳動物、例えばヒトから得た。さらなる実施形態において、生物学的試料は、血液試料、例えば血清もしくは血漿、尿試料、糞便試料、生検試料、または唾液試料である。アッセイに最適な条件をもたらすために、試料を本発明によるアッセイで用いる前に精製または実質的に精製してもよい。したがって、さらにもう１つの実施形態において、試料は、精製された試料である。試料を精製することの利点は、反応条件をより容易に制御できる点である。

【0125】

前記アッセイを様々な方法によって読み取ってよい。したがって、ある実施形態では、分析物の存在またはレベルを目視検査、光学密度、分光法、吸光分光法、蛍光分光法、電気化学、ＱＣＭ、ＳＰＲ、または顕微鏡法によって判定する。

【0126】

レベルまたは存在を決定することができるように、試料を基準レベルと比較することを必要とすることがある。したがって、さらにもう１つの実施形態において、基準レベルは、所定の値、標準曲線、または陰性対照である。基準レベルを様々な基準に基づいて、例えば、ＲＯＣ曲線の使用によって設定してもよく、前記ＲＯＣ曲線は、例えば診断試験において使用されることが多い。

【0127】

診断試験の精度を受信者動作特性曲線（「ＲＯＣ曲線」）によって特性評価してもよい。ＲＯＣは、診断試験の様々な可能なカットオフポイントについての偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。ＲＯＣ曲線は、感度と特異度の間の関係を示す。すなわち、感度の増加は、特異性の減少を伴うことになる。曲線が左軸の近くそしてまたＲＯＣ空間の上端の近くをたどるほど、試験の精度は高い。逆に、曲線がＲＯＣグラフの４５度対角線に近くなるほど、試験の精度は低い。ＲＯＣ下面積は、試験精度の尺度である。試験の精度は、その試験が、どれ程よく被験群を問題の疾患への罹患者と非罹患者に分けるかに依存する。１の曲線下面積（「ＡＵＣ」と呼ばれる）は、完璧な試験を表し、その一方で０．５の面積は、あまり有用でない試験を表す。したがって、本発明のバイオマーカーおよび診断法は、０．５０より大きいＡＵＣを有し、より好ましい試験は、０．６０より大きいＡＵＣを有し、さらにいっそう好ましい試験は、０．７０より大きいＡＵＣを有する。

【0128】

試験の有用性の他の有用な尺度は、陽性的中率および陰性的中率である。陽性的中率は、実際に陽性である試験陽性者の百分率である。陰性的中率は、実際に陰性である試験陰性者の百分率である。したがって、当業者は、特定の必要基準に基づいて基準レベルを決定することができることになる。

【0129】

本発明の態様の１つについての文脈の中で説明した実施形態および特徴が、本発明の他の態様にもあてはまることに留意されたい。図面への参照により本発明を例示するために参照番号を本明細書およびクレームにおいて用いる場合、これらが単に説明のためのものであり、本発明を限定と解釈すべきでないことにも留意されたい。

【0130】

本出願において引用するすべての特許および非特許文献は、それら全体が参照により本明細書に援用されている。

【0131】

ここで、以下の非限定的実施例で本発明をさらに詳細に説明することにする。

【実施例】

【0132】

（実施例１）
タンパク質：ストレプトアビジン（ＳＴＶ）の検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、内部ビオチン修飾を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0133】

【表1】

【0134】

すべてのオリゴヌクレオチドは、デンマークのＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓから購入した。その会社が合成直後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行った。

【0135】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0136】

ストレプトアビジンを含めて、すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0137】

図３は、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0138】

方法
フルオロフォア接合
標識手順は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって与えられたプロトコルを参照するが、少し変更を加える。より具体的には、アミン修飾ＤＮＡ（１６μＬ、１００μＭ）をリン酸緩衝液（１０μＬ、０．４Ｍ、ｐＨ８．５）と混合し、その後、ＤＭＳＯに溶解した活性化色素−エステル（１００μｇ、約８０ｎｍｏｌ）を添加した。この混合物において、ＤＮＡの最終濃度は約４０μＭであり、エステルとアミンのモル比は５０：１であった。２８℃で一晩のインキュベーション後、その混合物をエタノール沈殿、続いてＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズでの逆相ＨＰＬＣ精製（１５分にわたって０．１Ｍ ＴＥＡＡ中５〜４０％ＭｅＣＮ）によって処理した。２６０ｎｍでの吸収最大値がある対応するピーク内の試料を回収し、凍結乾燥させ、２００μＬ Ｈ_２Ｏに再溶解した。使用前にＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計によって到達濃度を決定した。

【0139】

ＳＴＶ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
典型的なアッセイでは、１：１：１の正確な化学量論比を有する鎖Ａ、ＢおよびＳを、１×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＡｃ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）_２）に混ぜ入れ、加えて標的タンパク質としてのＳＴＶも混ぜ入れた。典型的最終濃度は、各ＤＮＡ成分について２０ｎＭ、およびＳＴＶについて２５０ｎＭであった。実際のセンシングには必要でないが、一価結合を確実なものにするために過剰なＳＴＶを使用した。反応速度データは、システムがほぼ平衡に達するために３時間で十分であることを示した（データを示さない）が、便宜上、その混合物を測定前に一晩、室温（ＲＴ）でインキュベートした。

【0140】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
７０μＬのアッセイ混合物を石英キュベットにピペットで移し、異なる試料間で２回、１×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］によって洗浄した。走査型分光蛍光計（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｍａｘ−３、ＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ Ｉｎｃ．）で蛍光測定を行った。Ａｌｅｘａ５５５については５３０ｎｍで励起が果たされた。ＦＲＥＴ効率をＥ＝Ｉ_Ａ／（Ｉ_Ａ＋Ｉ_Ｄ）として算出した。この式中、Ｉ_Ａは、アクセプターピーク蛍光強度（Ａｌｅｘａ６４７については６６７ｎｍ）であり、およびＩ_Ｄは、ドナーピーク蛍光強度（Ａｌｅｘａ５５５については５６６ｎｍ）である。

【0141】

ゲル実験およびＴｙｐｈｏｏｎスキャン
バルクＦＲＥＴ測定に使用した１５μＬの各試料を、３μＬの６×ゲル負荷色素（ＮＥＢ）と混合した後、６％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ゲル（アクリルアミド／ビスアクリルアミド；１９：１）のウェルに負荷し、冷蔵庫の中で溶離した（７０Ｖ、１．５時間）。ゲル自体および泳動用緩衝液の両方を作るために１×ＴＢＥ−Ｍｇ^２＋（［Ｍｇ^２＋］＝１２．５ｍＭ）を使用した。

【0142】

電気泳動後、染色なしで、蛍光モードでＴｙｐｈｏｏｎ ９４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してゲルをスキャンした。赤色レーザー（６３３ｎｍ）と６７０ｎｍバンドパスフィルター（６５５ｎｍと６８５ｎｍの間の光を透過させ、６７０ｎｍに中心を置く透過ピークを有する）を、それぞれ、Ａｌｅｘａ６４７色素の励起および発光のための組み合わせとして選んだ。８．３×７．３ｃｍミニゲルについての典型的スキャン時間は、２００μｍの画素サイズを使用したとき３分であった。その後、そのゲルをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ ７．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって分析した。レーン作成およびバンド検出は、手作業で行った。

【0143】

結果
ＳＴＶがなければ、３本のＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーション事象は平衡に達することになり、その場合、ＢはＳと結合するための４ｎｔトーホールドを有するが、Ａは３ｎｔトーホールドしか有さないので、ＡＳ二重鎖より長いＢＳ二重鎖が存在するはずである。ビオチン−ＳＴＶ相互作用によってＢと結合することができるＳＴＶがあると、ＳＴＶの嵩高さが高感度の分岐点移動プロセスを妨げるので元の平衡はシフトされることになり、前記分岐点移動プロセスによってしかＢはＡと置き換わってＳとハイブリダイズすることができないため、その試料にはより短いＢＳ二重鎖とより長いＡＳ二重鎖が存在するはずである。

【0144】

ＦＲＥＴ（フォルスター共鳴エネルギー移動）対を形成する２つのフルオロフォアを、溶液中のＡＳ二重鎖の分布数を表すＦＲＥＴシグナルを発するように、それぞれＡおよびＳ上に付ける（図３も参照されたい）。正規化ＦＲＥＴ効率のほぼ倍増がＳＴＶ添加後に明示された（図４ａ）。それらの多岐にわたる代表生蛍光データも示す（図４ｂ）。加えて、滴定曲線を作成した。それを図４ｃに示す。この図は、定量検出の可能性およびサブナノモルの感度を示す。溶液中の各成分をそれぞれ観察することができる非変性ＰＡＧＥゲルからさらなる証拠が得られる（図４ｄ）。選択励起および発光波長が、ここではバンド強度のみがＡの量を表わすことが保証することは、注目に値する。結果は、ＳＴＶの存在下ではずっと短い一本鎖Ａ（ｓｓＡ）が残され、同時により長いＡＳ二重鎖が形成されるという予想に完全に従う（図４ｄ、１ビオチン）。

【0145】

この実施例では、２つのビオチンを１本のＢ鎖上にも付けた。これは、ＳＴＶが四価結合能力を有し、そのためビオチン標識されたＢが２部位相互作用によって巻き上がり、ＳＴＶに巻き付くことになるという事実（図４ｄ挿入図）を利用する。かくしてトーホールドは全く機能することができず、したがって、よりいっそう短いＢＳおよび長いＡＳが予想される。実際、ＳＴＶ添加後の変化は、１ビオチンシステムより印象的である（図４ｃ、２ビオチン）。

【0146】

補足説明
上の結果に加えて、以下の観測を行った（データは示さない）：
１．フルオロフォア−クエンチャー対をＦＲＥＴの代わりに代替レポーターシステムとして試した。これも安定な結果をもたらした。

【0147】

２．２つの陰性対照を試験した：ビオチンを有さないシステムに添加したＳＴＶ、ビオチン標識されたシステムに添加した他のタンパク質（トロンビンまたは他の抗体）。いずれも有意なＦＲＥＴ変化を呈示しない。

【0148】

３．このセンシングアッセイの感度は、ＦＲＥＴ値の測定に使用される計器の感度に依存する。これまでに行った研究では、標的タンパク質として１ｎＭほどもの低さのＳＴＶを、最終濃度として１ｎＭ ＤＮＡを有するアッセイを使用することにより首尾よく検出した。

【0149】

結論
本発明者らは、ビオチン−ＳＴＶ相互作用をモデルシステムとしてうまく利用して、３本のＤＮＡ鎖の平衡に基づくアッセイには特異的標的タンパク質はもちろん小分子も検出する大きな可能性があることを証明した。バルクＦＲＥＴデータとＴｙｈｐｏｏｎスキャンゲル実験の両方で本発明者らの設計の有効性を確認し、ＳＴＶ添加後、シグナルを倍増（または設計しだいで半減）させることができる。

【0150】

（実施例２）
小分子：ビオチンの検出
実施例１において説明したシステムにおいて阻害戦略（図５；戦略２）を適用することにより、ビオチンを検出することができる。この実験では、検出される標的としてのビオチンを先ず所定量のＳＴＶと混合し、その後、その混合物全体を標準アッセイに添加する。遊離ビオチンの存在下では、ＳＴＶ上のすべての活性結合部位が占有されることになり、それ故、それは、ＤＮＡ平衡に効果を及ぼすことができない。このシグナルオフ検出法を、１４ｎＭのＤＮＡ、２０ｎＭのＳＴＶ、および一連の濃度のビオチンを使用することによって試験した。滴定曲線を図４ｅに示す。ビオチンとＳＴＶ間のモル比は、ＳＴＶの四価特性と一致する。

【0151】

方法
ストレプトアビジン添加前の実施例１におけるアッセイと同一のアッセイ構成を、１４ｎＭ ＤＮＡを使用して用いた。様々な濃度のビオチンを先ずストレプトアビジン（２０ｎＭ）と予混した。室温で３時間のインキュベーション後、その混合物を正規のアッセイに添加し、室温で一晩、暗所でインキュベートした。

【0152】

結果
標的分子としてのビオチンの不在下、ＳＴＶは、平衡に対して前と同じ効果を示す。試料がビオチンを含有する場合、これらの遊離ビオチンがＳＴＶの結合部位を塞ぐことになり、その結果、ＳＴＶはこのアッセイで機能できなくなる。このシグナルオフ検出法は、ビオチンの検出のための滑らかな校正曲線をもたらした。結果は、四価のＳＴＶを表す（図４ｅ）。

【0153】

（実施例３）
ビオチン検出アッセイの特異性
対照システムは、２つのＦＲＥＴ対を有するが、標識された結合部分を一切有さない、３本のＤＮＡ鎖から成り得る。このシステムへの標的ストレプトアビジン、ＩｇＧ、トロンビンまたはＡＴＰのいずれの添加も、検出可能なシグナル変化をもたらすことにならず（図６ａ）、これは、平衡をシフトさせる結合事象である設計の有効性を確認するばかりでなく、このシステムの良好な特異性の証拠としても役立つ。

【0154】

実施例１において説明したビオチンシステムに様々な標的を添加することにより特異性も試験し、それらのいずれも非特異的検出可能効果を示さなかった（図６ｂ）。リガンドを有さない対照システムにＳＴＶを添加することによってもこのアッセイの有効性を確認し、ＦＲＥＴシグナル変化は観察されなかった。

【0155】

（実施例４）
緩衝液中の抗ジゴキシゲニン（ａＤ）検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、内部ジゴキシゲニン修飾を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0156】

【表2】

【0157】

Ａ、ＢおよびＳについてのオリゴヌクレオチドすべてを、ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｅｒＭａｄｅ−１２オリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内で合成した。合成後、ＤＮＡ鎖をＴＯＰカートリッジ精製し、エタノール沈殿した。

【0158】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0159】

５−アミノアリル−ｄＵホスホロアミダイトは、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した。

【0160】

抗ジゴキシゲニンは、Ｒｏｃｈｅから購入した。

【0161】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0162】

図８Ａは、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0163】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0164】

ジゴキシゲニン接合
アミン修飾ＤＮＡ（１００μＬ、５０μＭ）をＤＭＦ（１００μＬ、１５０ｎｍｏｌ）中の活性化ジゴキシゲニンエステル（ＤＩＧ−ＮＨＳ）に添加し、その後、トリエチルアミン（２μＬ）をこれに添加した。この混合物において、ＤＮＡの最終濃度は２５μＭであり、エステルとアミンのモル比は３０：１である。２５℃で１時間のインキュベーション後、その混合物をエタノール沈殿、続いてＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズでの逆相ＨＰＬＣ精製（１５分にわたって０．１Ｍ ＴＥＡＡ中５〜４０％ＭｅＣＮ）によって処理した。２６０ｎｍでの吸収最大値がある対応するピークを有する試料を回収し、凍結乾燥させ、２００μＬ Ｈ_２Ｏに再溶解した。使用前にＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計によって到達濃度を決定した。

【0165】

ａＤ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例１と同じだが、標的タンパク質としてＳＴＶの代わりにａＤを用い、２倍過剰の抗ジゴキシゲニン（２０ｎＭの各ＤＮＡ成分、および４０ｎＭのａＤ）を用いた。

【0166】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例１と同じである。

【0167】

ゲル実験およびＴｙｐｈｏｏｎスキャン
実施例１と同じ。

【0168】

結果
得られた結果を図７に示す。ａＤの存在下でＡＳの３０％分布数増加を表すＦＲＥＴ値が観察される。様々なａＤ濃度での滴定を図８Ｄに示す。電気泳動によるａＤの補足的検出法を図８Ｅに示す。

【0169】

（実施例５）
ヒト血漿中の抗ジゴキシゲニン（ａＤ）の検出。

【0170】

材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、内部ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）修飾を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0171】

【表3】

【0172】

Ａ、ＢおよびＳについてのオリゴヌクレオチドすべてを、ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｅｒＭａｄｅ−１２オリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内で合成した。合成後、ＤＮＡ鎖をＴＯＰカートリッジ精製し、エタノール沈殿した。

【0173】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0174】

５−アミノアリル−ｄＵホスホロアミダイトは、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した。

【0175】

抗ジゴキシゲニンは、Ｒｏｃｈｅから購入した。

【0176】

ヒト全血は、デンマーク、スカイビュー（Ｓｋｅｊｂｙ）にあるオーフス大学病院（Ａａｒｈｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の血液バンクによって寄付された。

【0177】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0178】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0179】

ジゴキシゲニン接合
実施例４と同じ。

【0180】

ヒト血漿調製
ヒト全血は、ドナーから採血され次第、前記病院によってＥＤＴＡ緩衝剤で処理され、その採血から３０分以内にその全血試料から血漿が分離された。これは、３０００ｇで１５分間の２０℃での遠心分離によって行われた。血漿を構成する最上層がピペットで注意深く取り出され、直ちにより小さいアリコートで冷凍された。

【0181】

ａＤ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例５と同じ。しかし、一晩のインキュベーションの前に、目的の抗体（ａＤ）と予混された１５％ ｖ／ｖ 純粋血漿に試料を添加した。

【0182】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例４と同じである。しかし、ヒト血漿を含有するスペクトルを、ＴＡＥ−Ｍｇ緩衝液中のヒト血漿のみを含有する試料（６０μＬ １×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］中の１０μＬ 血漿）をリファレンスとして使用するリファレンスサブトラクションに付した。

【0183】

結果
３回の独立した実験からの得た結果を図９に示す。観察することができるように、緩衝液へのａＤの添加前のＡＳ百分率と血漿へのａＤの添加前のＡＳ百分率は、同一である（Ｂ中の試料１および２）。２当量のａＤを添加すると、Ｆｒｅｔ増加は、緩衝液中（試料３）と比較して血漿中（試料５）でのほうがほんの少しずつ低い。緩衝液中（試料４）および血漿中（試料６）での戦略３によるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）の検出についての結果も含める；これは、実施例８においてさらに詳細に説明することにする。

【0184】

（実施例６）
ヒト唾液中での抗ジゴキシゲニン（ａＤ）の検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、内部ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）修飾を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0185】

【表4】

【0186】

Ａ、ＢおよびＳについてのオリゴヌクレオチドすべてを、ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｅｒＭａｄｅ−１２オリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内で合成した。合成後、ＤＮＡ鎖をＴＯＰカートリッジ精製し、エタノール沈殿した。

【0187】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0188】

５−アミノアリル−ｄＵホスホロアミダイトは、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した。

【0189】

抗ジゴキシゲニンは、Ｒｏｃｈｅから購入した。

【0190】

ヒト唾液は、１時間絶食していたヒトドナーから採集した。

【0191】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0192】

図１０は、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0193】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0194】

ジゴキシゲニン接合
実施例４と同じ。

【0195】

ヒト唾液調製
１時間絶食していた男性ヒトから１時間にわたってファルコンチューブに唾液を採集した。その唾液を１分間、徹底的にボルテックスし、その後、４℃、１０，０００ｇで１０分間、遠心分離した。液体を固体から分離し、唾液を１００ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ遠心濾過器によって濾過した。

【0196】

ａＤ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例５と同じ。しかし、一晩のインキュベーションの前に、目的の抗体（ａＤ）と予混された１５％ ｖ／ｖ 濾過唾液に試料を添加した。

【0197】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例７と同じである。しかし、ヒト血漿を含有するスペクトルを、ＴＡＥ−Ｍｇ緩衝液中の濾過唾液のみを含有する試料（６０μＬ １×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］中の１０μＬ 血漿）をリファレンスとして使用するリファレンスサブトラクションに付した。

【0198】

結果
結果は、実施例７に匹敵し、ＦＲＥＴ値は、ヒト唾液中、ａＤの存在下でＡＳの２８％分布数増加を表す。結果を図１０にも示す。

【0199】

（実施例７）
ＤＮＡに対する複数のＤＩＧ修飾を用いるａＤの検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、４つの内部ジゴキシゲニン修飾（しかし４つの内部ジゴキシゲニン修飾に限定されない）を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0200】

【表5】

【0201】

Ａ、ＢおよびＳについてのオリゴヌクレオチドすべてを、ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｅｒＭａｄｅ−１２オリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内で合成した。合成後、ＤＮＡ鎖をＴＯＰカートリッジ精製し、エタノール沈殿した。

【0202】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0203】

５−アミノアリル−ｄＵホスホロアミダイトは、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した。

【0204】

抗ジゴキシゲニンは、Ｒｏｃｈｅから購入した。

【0205】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0206】

図１１は、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0207】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0208】

ジゴキシゲニン接合
実施例４と同じ。

【0209】

ａＤ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例１と同じだが、標的タンパク質としてＳＴＶの代わりにａＤを用い、および８倍過剰の抗ジゴキシゲニン（２０ｎＭの各ＤＮＡ成分、および１６０ｎＭのａＤ）を用いる。

【0210】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例１と同じである。

【0211】

ゲル実験およびＴｙｐｈｏｏｎスキャン
実施例１と同じ。

【0212】

結果
結果は、実施例４に匹敵し、ＦＲＥＴ値は、ａＤの存在下でＡＳの３３％分布数増加を表す。

【0213】

（実施例８）
戦略２および３によるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）の検出。

【0214】

図１２は、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0215】

材料
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのジゴキシゲニンを加えて、実施例４、５および６のとおり。

【0216】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0217】

ジゴキシゲニン接合
実施例４と同じ。

【0218】

ＤＩＧ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例４、５および６と同じだが、競合アッセイのために遊離ＤＩＧを様々な濃度で試料にさらに添加する。

【0219】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例７、９および１０と同じであるが、ヒト血漿および唾液を添加して、またはせずに、それぞれのシグナル調整を行う。

【0220】

結果
結果は、実施例４、５および６に匹敵し、ＦＲＥＴ値は、ＤＩＧが存在しない正規３０％増加と比較して、３２０ｎＭ ＤＩＧの存在下でＡＳのほんの０．５％の分布数増加、および４０ｎＭ ＤＩＧの存在下で１１％ＡＳ分布数増加を表す。４０ｎＭ ＤＩＧを含有するヒト血漿および唾液の場合、ＡＳ分布数増加は、ＤＩＧなしでの２６％および２８％増加と比較して、それぞれ５％および２％である。結果を図１２にも示す。

【0221】

（実施例９）
ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）およびビタミンＤ（ＶＤ）の検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをＡｌｅｘａフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用し、その一方でＢは、内部ビタミンＤ修飾を有する。それらの配列を下に与える（下線付けは、トーホールド領域を示す）：

【0222】

【表6】

【0223】

Ａ、ＢおよびＳについてのオリゴヌクレオチドすべてを、ＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｅｒＭａｄｅ−１２オリゴヌクレオチド合成装置を用いて社内で合成した。合成後、ＤＮＡ鎖をＴＯＰカートリッジ精製し、エタノール沈殿した。

【0224】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0225】

５−アミノアリル−ｄＵホスホロアミダイトは、Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから購入した。

【0226】

活性化ビタミンＤエステルは、社内でコレカルシフェロールから２段階で合成した。

【0227】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0228】

図１４は、オリゴヌクレオチドが互いにどのようにハイブリダイズし得るのかを示す。

【0229】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0230】

ビタミンＤ接合
実施例４におけるＤＩＧ−ＮＨＳと同じだが、ＤＩＧ−ＮＨＳの代わりに活性化ビタミンＤエステルを用いる。

【0231】

ＤＢＰ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例４と同じだが、標的タンパク質としてａＤの代わりにＤＢＰを用いる。

【0232】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
試料調製およびＦＲＥＴ測定は、実施例１と同じである。

【0233】

ゲル実験およびＴｙｐｈｏｏｎスキャン
実施例１と同じ。

【0234】

結果
結果は、実施例１に匹敵するが、ＦＲＥＴ値は、ＤＢＰの存在下でＡＳの２０％分布数増加を表す。結果を図１４にも示す。

【0235】

さらに、阻害的戦略および競合的戦略両方をビタミンＤの検出に用いた。様々な濃度のビタミンＤを、ＤＢＰタンパク質の添加前（阻害的戦略２）または後（競合的戦略３）に、アッセイ混合物に添加した。図１４中の校正曲線から明白であるように、両方の方法がビタミンＤの検出に成功した。

【0236】

（実施例１０）
アプタマーシステムの例としてのＡＴＰ検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実験では使用する。ＡおよびＳは、内部アミン修飾を伴い、これをフルオロフォア標識のためのハンドルとして使用する。Ｂは、３’末端にＡＴＰアプタマーの配列を含むが、追加の修飾を一切有さない。それらの配列を下に与える（イタリック体は、トーホールド領域を示し；下線付けは、アプタマー領域を示す）：

【0237】

【表7】

【0238】

すべてのオリゴヌクレオチドをデンマークのＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓから購入した。その会社が合成直後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行った。

【0239】

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７スクシンイミジルエステルおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５スクシンイミジルエステルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。

【0240】

すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0241】

方法
フルオロフォア接合
実施例１と同じ。

【0242】

ａＦ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
実施例１と同じだが、ＳＴＶの代わりに様々な濃度のＡＴＰ分子を用いた。

【0243】

分光蛍光計によるＦＲＥＴ測定
実施例１と同じ。

【0244】

結果
この実施例の設計は、ＤＮＡ二重鎖とアプタマー−標的複合体との間の標的誘発性スイッチングを典型的に被る、いわゆる構造スイッチングアプタマーにヒントを得ている。ここでは、アプタマーの一部（８ｎｔ）がＢ上のトーホールドとして役立ち、このトーホールドは、Ａのほうが短いトーホルド（４ｎｔ）を有するので、Ｓ上のトーホールドとハイブリダイズすることができ、その結果、溶液中で二重鎖が優位を占めることになる。標的（ＡＴＰ）が存在する場合、アプタマー−標的結合は、二重鎖中の水素結合との競争に勝つほど強く、したがってＢ上に機能性トーホールドは残らない。それ故、ＡＳ二重鎖が大部分を占めることになる。このスキームを図１５ａに示す。

【0245】

滴定曲線をマイクロモルスケールで作成した（図１５ｂ）。ＡＳ二重鎖についてのＦＲＥＴの６０％までの増加を１ｍＭ ＡＴＰの存在下で観察することができる。ここで使用した各ＤＮＡ成分の濃度は、２０ｎＭであった。

【0246】

結論
この実施例において、本発明者らは、トーホールド交換反応システムと構造スイッチングアプタマー設計を併用して、アプタマー−標的結合により標的の検出を果たした。増幅せずとも、既にＦＲＥＴシグナル変化は観察できるほど有意になっており、定量さえ可能である。このアプタマーシステムが、５’末端または３’末端いずれかに位置するアプタマー領域を用いて機能し得ることに注目される。

【0247】

（実施例１１）
ＤＮＡペルオキシダーゼシグナル伝達システムを使用するストレプトアビジン（ＳＴＶ）検出
材料
Ａ、ＢおよびＳとそれぞれ名付けた３本のＤＮＡ鎖をこの実施例において使用し、それらのうちのＢのみが修飾を有する。それらの配列を下に与える（イタリック体は、トーホールド領域を示し；下線付けは、ＤＮＡペルオキシダーゼのＧリッチ領域を示す）：

【0248】

【表8】

【0249】

すべてのオリゴヌクレオチドは、デンマークのＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓから購入した。その会社が合成直後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行った。

【0250】

すべての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0251】

方法
ＳＴＶ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
典型的なアッセイでは、１：１：１の正確な化学量論比を有する鎖Ａ、ＢおよびＳを、１×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＡｃ（ｐＨ７）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）_２）に混ぜ入れ、加えて標的タンパク質としてのＳＴＶも混ぜ入れた。その混合物を室温（ＲＴ）で３時間インキュベートし、その後、それにヘミン（フェリプロトポルフィリンＩＸクロリド）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））およびＨ_２Ｏ_２（過酸化水素）を添加した。典型的最終濃度は、ビオチン標識ＤＮＡについて２００ｎＭ、ＳＴＶについて４００ｎＭ、ヘミンについては２μＭ、ならびにＡＢＴＳおよびＨ_２Ｏ_２については２ｍＭであった。

【0252】

Ｎａｎｏｄｒｏｐによる吸光度測定
室温での半時間のインキュベーション後、１．５μＬの各アッセイ混合物をＮａｎｏｄｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）の受け台にピペットで移し、紫外・可視モードで測定した。４２０ｎｍでの吸光度を記録した。

【0253】

結果
この実施例において、本発明者らは、ＡとＳ間のハイブリダイゼーションによってそれらが一緒にされるとその触媒能力を回復することができる分割型ＤＮＡザイムのＡとＳ両方の末端への組み込みの例を与える。２ビオチンシステムのスキームを図１６に示す。

【0254】

ＳＴＶがなければ、Ｂのほうが長いトーホールドを有するので、ＳはＢと結合する傾向がある。別々のグアニン四重鎖部分のため、低いペルオキシダーゼ活性を見いだすことができる。ＳＴＶがあると、鎖Ｂはそのトーホールドを失い、そのタンパク質の表面にはめ込まれるので、ＡＳ二重鎖の形成は、十分に機能性のグアニン四重鎖をもたらす。必要反応物、例えばＨ_２Ｏ_２、ＡＢＴＳ^２−およびヘミンの添加後、緑色が見えてくることとなり、４２０ｎｍでの最大吸光度を記録することができる。

【0255】

有意な吸光度変化を図１６において観察することができ、その差は、裸眼でも区別可能である。１ビオチンシステムの変化も明白であるが、より強いバックグラウンドのため直接視覚化によりに識別することは難しいことに留意されたい。

【0256】

結論
本発明者らは、本発明者らのアッセイに光シグナルを備えさせるために新たなレポーターシステムを利用した。このシステムの利点は、共有結合標識の代わりに純粋なＤＮＡの伸長しか必要としない点、ならびに触媒的および比色定量的特徴が結果を直接目視ででも検出できるようにさせる点である。この方法を、実施例３で説明したような一本鎖システムにおいても利用してよい。

【0257】

（実施例１２）
ストレプトアビジン（ＳＴＶ）検出のためのＤＮＡグアニン四重鎖ペルオキシダーゼを併用した一本鎖システム
材料
Ｌと名付けた１本のＤＮＡ鎖のみをこの実験において使用する。特定の位置の内部アミン基を修飾し、それをさらなる標識のためのハンドルとして使用する。その配列を下に与える（イタリック体は、トーホールド領域を示し；下線付けは、ＤＮＡペルオキシダーゼのＧリッチ領域を示す）：

【0258】

【表9】

【0259】

このオリゴヌクレオチドは、デンマークのＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａ／Ｓから購入した。その会社が合成直後にＲＰ−ＨＰＬＣ精製を行った。

【0260】

ストレプトアビジンを含めて、すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0261】

図１７は、分析物の存在に依存してオリゴヌクレオチドがどのように自己ハイブリダイズし得るのかを示す。

【0262】

位置（ヌクレオチド）１〜５（２）は、Ｇ４−ＤＮＡ（ＤＮＡペルオキシダーゼ）の４分の１である。位置６〜７（８）は、第一のトーホールドである。位置８〜１７（７またはＡ）は、第一の分岐点移動領域である。位置１８〜２７（７またはＢ）は、第二の分岐点移動領域であり、これは第一の分岐点移動領域と同じ配列を有するが、小分子修飾をもたらす。位置２８〜３１（９）は、第二のトーホールドである。位置３２〜３７（１１）は、柔軟性をもたらすループ領域である。位置３８〜４１（９’）は、第三のトーホールド領域であり、これは第二のトーホールド領域と相補的である。位置４２〜５１（７’またはＳ）は、第三の分岐点移動領域であり、これは第一または第二の分岐点移動領域と相補的である。位置５２〜５３（８’）は、第四のトーホールドであり、これは第一のトーホールドと相補的である。位置５４〜６６（６）は、ＤＮＡペルオキシダーゼの残りの４分の３である。

【0263】

方法
ビオチン接合
この手順は、実施例１におけるフルオロフォア接合手順と同じであるが、色素−ＮＨＳエステルの代わりにビオチン−ＮＨＳエステルを用いる。

【0264】

ＳＴＶ検出のためのアッセイおよびその機能の構築
典型的なアッセイでは、鎖Ｌを１×［ＴＡＥ−Ｍｇ^２＋］緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＡｃ（ｐＨ７）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２．５ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）_２）に混ぜ入れ、加えて標的タンパク質としてのＳＴＶも混ぜ入れた。その混合物を室温（ＲＴ）で３時間インキュベートし、その後、ヘミン（フェリプロトポルフィリンＩＸクロリド）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））およびＨ_２Ｏ_２（過酸化水素）を添加した。典型的最終濃度は、ビオチン標識ＤＮＡについて２００ｎＭ、ＳＴＶについて４００ｎＭ、ヘミンについては２μＭ、ならびにＡＢＴＳおよびＨ_２Ｏ_２については２ｍＭであった。

【0265】

Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計による吸光度測定
室温での１時間のインキュベーション後、１．５μＬの各アッセイ混合物をＮａｎｏｄｒｏｐ １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）の受け台にピペットで移し、紫外・可視モードで測定した。４２０ｎｍでの吸光度を記録した。

【0266】

結果
この設計の観念は、３つのオリゴヌクレオチドすべてを１本の長いＤＮＡ鎖に単純に組み込むことであり、これは、化学量論の問題を免れるばかりでなく、分子内反応のために鎖置換の反応速度を加速させる可能性も有する。１本のＤＮＡ鎖に対して３つの修飾を施す困難を回避するために、分割型ＤＮＡペルオキシダーゼと呼ばれる別のレポーターシステムを選んで、前の設計で使用したＦＲＥＴシステムの代わりに用いた。ＤＮＡペルオキシダーゼの正確な配列およびその分割方法は、Ｓｈｉｍｒｏｎ，Ｓ．；Ｗａｎｇ，Ｆ．；Ｏｒｂａｃｈ、Ｒ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ−ｆｒｅｅ ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｈｅｍｉｎ／Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ＤＮＡｚｙｍｅ ｎａｎｏｗｉｒｅｓ、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１２、８４、１０４２−１０４８に記載されている。満足なことに、このシグナル伝達システムは、オリゴヌクレオチドが共有結合で連結されている場合でさえ、ハイブリダイゼーション平衡に基づく本発明による検出システムのために機能し得る。

【0267】

この実施形態における長いＤＮＡ鎖は、いくつかの領域から成る（図１８）。配列中の５’から３’は、次のとおりである：グアニン四重鎖の４分の１、領域ａ＋領域ｂ（これは元の鎖Ａを表す）、領域ｂ＋領域ｄ（これは、元の鎖Ｂを表し、したがってその鎖上にビオチンを有する）、柔軟なヒンジとしてのループｅ、領域ｄ^＊＋領域ｂ^＊＋領域ａ^＊（これはＳ鎖に由来する）、そして最後に、グアニン四重鎖の４分の３。

【0268】

ＳＴＶがなければ、トーホールドｄのほうがトーホールドａより長いので、ｄ^＊ｂ^＊は、優先的にｂｄとハイブリダイズすることになる。この状態では、エネルギー的に好適でないバルジへの第一の領域ｂの押し込みを行わない限り、２つのグアニン四重鎖部分を合体させることはできない。第二の領域ｂのビオチンの上にＳＴＶが結合すると、そのタンパク質塊が局所ハイブリダイゼーションまたは分岐点移動を妨げて、領域ｂ^＊にその好適なパートナーとして第一の領域ｂを選ぶように強いることになる。その結果、前記グアニン四重鎖の２つの成分は、ヘミンの助けで、ＡＢＴＳ^●−へのＡＢＴＳ^２−のＨ_２Ｏ_２媒介酸化を触媒する能力があることが判っている完全なＧテトラッドを形成するためのまさに正しい位置を占有する。生成物ＡＢＴＳ^●−は緑色を有するので、この反応の動態を目視でまたは分光光度計によって検出することができる。その配座変化過程を図１８ａに示す。

【0269】

ペルオキシダーゼ基質としてＡＢＴＳを添加した１時間後のＳＴＶを有するまたは有さない試料の吸光度を図１８ｂに与える。５０％より大きい増加をＳＴＶ添加後に観察することができる。これは、ＳＴＶ結合がＧテトラッドの再構成およびより大きな構成体をもたらすという概念を証明する。同じ配列を有するが、その鎖上にビオチンがないＤＮＡ鎖とＳＴＶを混合することによる対照実験も行い、この場合、シグナル変化は見いだせなかった。

【0270】

結論
この実施例では、標的タンパク質検出を果たすためにリガンドで標識した１本だけのＤＮＡ鎖を使用することにより、前記検出システムをさらに単純化した。さらに、新たな触媒法をレポーターおよび増幅アプローチとして利用する。この実施例におけるＳＴＶの結合は、鎖置換交換反応の分子内平衡を乱し、これは過酸化生成物の吸光度に反映された。本発明者らは、タンパク質または小分子（それぞれ、抗体および抗原）も標的にし、かつ指標として変色を用いるこのシステムは、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ））の代替法になる可能性があると考える。

【0271】

（実施例１３）
トーホールド長および結合部分の位置の効果
アッセイの性能を最適化するために、様々な試験を行った（データを示さない）。

【0272】

ＡおよびＢの融解温度が近いことは、平衡の感度にとって重要であると考えられる。ＡとＢは同じ分岐点移動領域を共有するので、トーホールド領域がこのシステムにおける標的結合事象の効果の大きさの点での決定因子になる。本発明者らは、ＳＴＶの存在と不在のより良好な区別のためにＡ上のトーホールド長を調整した。結果は、Ａが２ｎｔまたは３ｎｔトーホールドを有するとき、ＳＴＶの効果、すなわち相対ＦＲＥＴ変化、が最大であることを示した。Ａについての４ｎｔトーホールドが最適でない理由は、このシステムのＢに対する２つの修飾が平衡を変化させるからであり得る。本発明者らは、標準構成（実施例１）においてＡには３ｎｔトーホールドを使用した。その構成ではＡも修飾を有するからである。

【0273】

熱力学に加えて、本発明者らは、トーホールド長もこのシステムの動態に効果を及ぼすことを見いだす。より長いトーホールドは、反応速度を有意に増加させて、平衡への到達をはるかに速くさせる。これは、トーホールドが長いほど、結果として、全プロセス中の律速段階であるトーホールドハイブリダイゼーションが速くなるという事実と一致する。

【0274】

ビオチンの位置の効果もこの実施例において調査した。Ｂ上の３つの代表位置：トーホールド領域（ＴＨ）、分岐点移動領域（ＢＭ）および３’末端（Ｔ３）、のうちの１つをビオチンで標識した。ＦＲＥＴシグナル変化の点から見て、トーホールド上のビオチンがＳＴＶ結合に対して最も高感度であり、続いてＢＭの上のビオチンが高感度であったことが判明した。Ｂの３’末端におけるビオチンは、無視できるＳＴＶ効果しか示さなかった。これは、尤もなことである。ＤＮＡ分岐点移動は、マグネシウムの存在下で異種構造に対して非常に敏感であり、そのため小さな局所環境変化がかなりの障害となり得ることは公知であったからである。しかし、単純なハイブリダイゼーションは、この特質を有さない。

【図3】

【図20(a)】

【図20(b)】

【図1】

【図2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2015529076000001.app

【手続補正書】

【提出日】2015年5月12日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【国際調査報告】