特表 2016-506380 グリシル−Ｌ−２−メチルプロリル−Ｌ−グルタミン酸を使用する自閉症スペクトラム障害の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-506380(P2016-506380A)

(43)【公表日】2016年3月3日

(54)【発明の名称】グリシル−Ｌ−２−メチルプロリル−Ｌ−グルタミン酸を使用する自閉症スペクトラム障害の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/00 20060101AFI20160205BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160205BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20160205BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20160205BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20160205BHJP

   C07K 5/083 20060101ALN20160205BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/02

   A61P25/00

   A61K45/00

   A61P43/00 121

   A61K9/08

   A61K9/107

   A61K9/51

   A61K9/20

   A61K9/06

   A61P25/18

   C07K5/083

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】87

(21)【出願番号】特願2015-545191(P2015-545191)

(86)(22)【出願日】2013年11月26日

(85)【翻訳文提出日】2015年7月28日

(86)【国際出願番号】US2013072049

(87)【国際公開番号】WO2014085480

(87)【国際公開日】20140605

(31)【優先権主張番号】61/730,829

(32)【優先日】2012年11月28日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ

(71)【出願人】

【識別番号】515146257

【氏名又は名称】ニューレン ファーマシューティカルズ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092093

【弁理士】

【氏名又は名称】辻居 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100082005

【弁理士】

【氏名又は名称】熊倉 禎男

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(72)【発明者】

【氏名】グラス ローレンス アーウィン

(72)【発明者】

【氏名】ビッカーダイク マイケル ジョン

(72)【発明者】

【氏名】スネイプ マイケル フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】デ コグラム パトリシア ペレス

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA12

4C076AA17

4C076AA36

4C076AA65

4C076BB01

4C076BB02

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB22

4C076BB36

4C076BB40

4C076CC01

4C076FF01

4C076FF11

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA19

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA15

4C084BA23

4C084CA59

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA28

4C084MA35

4C084MA38

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA181

4C084ZA182

4C084ZC751

4C084ZC752

4H045AA30

4H045BA12

4H045EA21

4H045FA20

4H045GA40

(57)【要約】

本発明は、グリシル−２−メチルプロリル−グルタミン酸（Ｇ−２−ＭｅＰＥ）およびその類似体を使用して自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を処置するための化合物、組成物および方法を提供する。自閉症スペクトラム障害には、自閉症、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、脆弱Ｘ症候群およびレット症候群が含まれる。化合物を含有する組成物には、水溶性製剤、油中水型マイクロエマルジョン、油中水型の粗いエマルジョン、油中水型液状結晶、ナノカプセル、錠剤および経口投与ゲルが含まれる。本発明の化合物および組成物は、静脈内、脳室内、非経口的または経口的に投与することができ、神経変性を処置すること、神経学的機能を促進すること、ＡＳＤの発作活動および他の症状を処置することにおいて効果を発揮することができ、自閉症スペクトラム障害を有するヒトを含む動物の寿命を長くすることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の症状を患っている動物を処置する方法であって、前記動物に、有効量のグリシル−２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｇ−２−ＭｅＰＥ）を投与することを含み、前記処置は、レット症候群自然経過／臨床重症度スケール、異常行動チェックリストコミュニティ版（ＡＢＣ）、ヴァインランド、重症度の臨床総合所見（ＣＧＩ−Ｓ）および介護人が記入した介護者負担質問票（ＣＳＱ）からなる群から選択される１つもしくは複数の行動検査、または脳波図（ＥＥＧ）スパイク周波数、ＥＥＧの周波数帯域での総パワー、手の運動、ＱＴｃおよび心拍変動（ＨＲＶ）、および前記症状を患っていない対照動物と比較した呼吸不整からなる群から選択される１つまたは複数の生理的検査によって評価される前記症状の改善をもたらす、方法。

【請求項2】

前記ＡＳＤが、自閉症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群（ＲＴＴ）、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、ならびに病的要求回避（ＰＤＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ｇ−２−ＭｅＰＥの前記有効量が、約０．００１ｍｇ／Ｋｇ〜約１００ｍｇ／Ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

脳に直接投与するときのＧ−２−ＭｅＰＥの前記有効量が、約０．００１ｍｇ／Ｋｇ〜約０．１ｍｇ／Ｋｇである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

全身投与するときのＧ−２−ＭｅＰＥの前記有効量が、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約１００ｍｇ／Ｋｇである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが、全身に、非経口的に、または脳に直接に投与される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが脳室に投与される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが、静脈内、皮下または経口経路を通して投与される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項9】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが、生理的に適合する水溶液、油中水型マイクロエマルジョン、油中水型の粗いエマルジョン、油中水型液状結晶、ナノカプセルまたは錠剤の中にある、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが水溶液可溶性ゲルに取り込まれている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが、前記動物の粘膜に投与される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ゲルが前記動物の口内に置かれ、前記Ｇ−２−ＭｅＰＥが前記ゲルから放出される、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の症状を有する動物を処置する方法であって、前記動物に、式１または式２の化合物

【化1】

（式中、ｍは０または１であり；
ｎは、０または１であり；
Ｘは、Ｈまたは−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｙは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｚは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｒ¹は、Ｈ、アルキルまたはアラルキルであり；
Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立してＨまたはアルキルであり：
各Ｒ⁵は、独立してＨ、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり；
各Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立してＨ、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−ＮＲ⁶Ｒ⁷はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである）
またはＹが−ＣＯ₂（アルキル）でありＺが−ＣＯ₂Ｈであるか、もしくはＹが−ＣＯ₂ＨでありＺが−ＣＯ₂（アルキル）である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン；
ならびに薬学的に許容されるその塩を投与することを含み、
ただし、前記化合物は、ＧＰＥ、Ｎ−Ｍｅ−ＧＰＥ、ＧＰＥアミド、ＡＰＥ、ＧＰＱまたはその塩でない、方法。

【請求項15】

前記化合物が、有効量のＧ−２−ＭｅＰＥである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記動物に、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、グリシル−プロリル−グルタミン酸（ＧＰＥ）、トランスフォーミング成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質（特にＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子生成物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘導成長因子、ｉｎｔ−２、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−４、ケラチノサイト成長因子２、神経膠活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、神経膠細胞系由来神経栄養因子、活性依存神経栄養性因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン）、α−、β−、γ−またはコンセンサスインターフェロン、ＴＮＦ−α、クロメチアゾール；キヌレン酸、Ｓｅｍａｘ、タクロリムス、Ｌ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、アンドレノコルチコトロピン−（４−９）類似体［ＯＲＧ２７６６］およびジゾルシピン（ＭＫ−８０１）、セレジリン；グルタミン酸アンタゴニスト、例えばメマチン（Ｎａｍｅｎｄａ）ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、ＧＶ１５０５２６；ＡＭＰＡアンタゴニスト、例えば２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４；アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１および／またはそのインテグリンα４受容体（α４β１およびα４β７）に対する抗炎症剤、例えば抗ＭＡｄＣＡＭ−１ｍＡｂ ＭＥＣＡ−３６７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９４７８）、フェノバム、フルオキセチンなどの選択的セロトニン再取込み阻害剤、またはリスペリドンなどの非典型的抗精神病薬からなる群から選択される第２の治療薬剤を投与することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記化合物の前記用量が、１日当たり１０ｍｇ／ｋｇを３回または１日当たり３０ｍｇ／ｋｇを３回である、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記動物がヒトである、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

（ａ）前記化合物が、式１の化合物であり；
（ｂ）ｍが、０であり；
（ｃ）ｎが、１であり；
（ｄ）Ｘ、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の少なくとも１つが水素でなく；
（ｅ）Ｘが、−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
（ｆ）Ｙが、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
（ｇ）Ｚが、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷である、
請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０１２年１１月２８日に出願の米国特許仮出願第６１／７３０，８２９号、表題「Treatment of Autism Spectrum Disorders Using Glycyl-2-Methylprolyl Glutamic Acid」、発明者Larry Glass, Michael John Bickerdike, Michael Fredrick SnapeおよびPatricia Perez DeCogramの優先権を主張する。本出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、一般に、自閉症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群（ＲＴＴ）、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、ならびに病的要求回避（ＰＤＡ）の療法に関する。詳細には、本発明は、グリシル−２−メチル−プロリル−グルタミン酸（Ｇ−２−ＭｅＰＥ）を使用するＡＳＤの処置に関する。

【背景技術】

【0003】

自閉症スペクトラム障害および神経発生障害（ＮＤＤ）は、益々多く診断されている。米国精神医学会（ＡＰＡ）のＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの第４版（ＤＳＭ−４）によると、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的交流および伝達の異常、限定的関心ならびに反復性の行動を特徴とする、関連する発達障害の集合である。ＤＳＭ−４によるＡＳＤの現行の分類は、５つの異なる形：古典的な自閉症または自閉性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を認めている。６番目の症候群となる病的要求回避（ＰＤＡ）は、さらなる特異的広汎性発達障害である。
より近年、米国精神医学会（ＡＰＡ）のＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの第５版（ＤＳＭ−５）は、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）をＡＳＤとして認めている。
本発明は、ＤＳＭ−４またはＤＳＭ−５のいずれの分類に関係なく、障害の処置に適用される。
神経発生障害（ＮＤＤ）には、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、アンゲルマン症候群、結節硬化複合群、フェランマクダーミド症候群、レット症候群、ＣＤＫＬ５突然変異（レット症候群およびＸ連鎖乳児けいれん障害とも関連する）および他が含まれる。全てではないがＮＤＤの多くは遺伝子突然変異によって引き起こされ、このように、時には単一遺伝子障害と呼ばれる。一部のＮＤＤ患者は、自閉症の行動および症状を示す。

【0004】

ＮＤＤの例として、脆弱Ｘ症候群は、罹患者が様々な程度の知的障害を有し、様々な関連精神症状を示す、Ｘ連鎖遺伝子障害である。臨床的には、脆弱Ｘ症候群は、知的障害、活動過多および注意力の問題、自閉症スペクトル症状、情緒不安定ならびにてんかんを特徴とする（Hagerman, 1997a）。脆弱Ｘ症候群で見られるてんかんは小児期に最も一般的に存在するが、その後成人期に向かって徐々に鎮静する。活動過多は、罹患男性のおよそ８０パーセントに存在する（Hagerman, 1997b）。突き出た耳および下顎などの身体的特色ならびに関節の過伸展性がみられることが多いが、診断に役立たない。知的障害は、表現型を規定する最も一般的な特色である。一般に、男性は女性よりも強く影響を受ける。女性は影響を受けないという初期の印象は、女性での特定の学習困難および他の神経精神医学的特色が存在するという理解に取って代わっている。男性にみられる学習障害は年齢と共により明確になるが、この長期的影響は明確な神経変性過程ではなく発達軌跡の平坦化の反映である可能性がより高い。

【0005】

脆弱Ｘ症候群で見られる脳機能の欠陥は、ヒトの脳構造の変化と平行している。ＭＲＩスキャン研究によれば、脆弱Ｘ症候群は、マッチさせた対照で予想されるより大きな脳容量と関連すること、さらにこの変化がＦＭＲＰプロモーター領域でのトリヌクレオチド拡張と相関することを明らかにする（Jakala et al., 1997）。顕微鏡レベルでは、脆弱Ｘ症候群をもつヒトは、ニューロン樹枝状構造の異常、特に異常に多い数の未熟樹状突起棘を示す（Irwin et al., 2000）。
ＮＤＤのための現在利用できる処置は、症候に基づく、つまり症状の管理に焦点を当てた支援的なものであり、多学科的アプローチを必要とする。学習の遅れおよび社会的障害の核心問題に対処するために、教育的および社会的な技術訓練および療法が早期に実施される。特別な学術的、社会的、職業的および支援サービスがしばしば必要とされる。同時に起こる不安、ＡＤＨＤ、うつ病、不適応挙動（攻撃性など）および睡眠問題の管理のために、医薬品、精神療法または行動療法を使用することができる。発作を制御するために、抗てんかん薬を使用することができる。

【0006】

関連技術の説明
欧州特許第０３６６６３８号は、ＧＰＥ（アミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕからなるトリペプチド）ならびにそのジペプチド誘導体Ｇｌｙ−ＰｒｏおよびＰｒｏ−Ｇｌｕを開示する。欧州特許第０３６６６３８号は、ＧＰＥが神経修飾物質として有効であり、ニューロンの電気的性質に作用できることを開示する。
国際公開第９５／１７２９０４号は、ＧＰＥが神経保護特性を有すること、ならびにＧＰＥの投与がニューロンおよびグリア細胞死の予防または阻害によって中枢神経系（ＣＮＳ）への傷害を低減できることを開示する。
国際公開第９８／１４２０２号は、ＧＰＥの投与が中枢神経系（ＣＮＳ）でコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）および一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の有効量を増加させ得ることを開示する。
国際公開第９９／６５５０９号は、パーキンソン病などの疾患の処置で、例えばＧＰＥの投与によってＣＮＳでＧＰＥの有効量を増加させることが、ＣＮＳでチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の有効量を増加させ、ＴＨによって媒介されるドーパミン産生を増加させ得ることを開示する。
国際公開第０２／１６４０８号は、患者内のＧＰＥと同等の生理作用を誘導することが可能な、アミノ酸置換および特定の他の改変を有する特定のＧＰＥ類似体を開示する。ＧＰＥ類似体の適用には、ＣＮＳの損傷または疾患を含む急性の脳損傷および神経変性疾患の処置が含まれる。

【発明の概要】

【0007】

ＡＳＤまたはＮＤＤの現行の有効な処置がなく、患者の看護は症状の管理に限定される。
本発明は、グリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミン酸（ＧＰＥ）の合成類似体およびペプチド様物質に関する。詳細には、本発明は、抗アポトーシスおよび抗壊死性であるＧＰＥ類似体およびペプチド模倣薬、それらを作製する方法、それらを含有する医薬組成物、ならびに動物において認知機能を強化するため、および／または記憶障害を処置するため、およびニューロン接続性を向上させるためのそれらの使用に関する。より具体的には、本出願は、ＡＳＤの処置におけるＧＰＥ類似体、Ｌ−グリシル−２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｇ−２ＭｅＰＥ）の使用方法に関する。

【0008】

米国特許第７，０４１，３１４号は、主題の組成物およびＧ−２−ＭｅＰＥの使用方法を開示する。

【0009】

一態様では、本発明は式１および式２の化合物：

【化1】

（式中、ｍは０または１であり；
ｎは、０または１であり；
Ｘは、Ｈまたは−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｙは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｚは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｒ¹は、Ｈ、アルキルまたはアラルキルであり；
Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立してＨまたはアルキルであり：
各Ｒ⁵は、独立してＨ、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり；
各Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立してＨ、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−ＮＲ⁶Ｒ⁷はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである）
またはＹが−ＣＯ₂（アルキル）でありＺが−ＣＯ₂Ｈであるか、もしくはＹが−ＣＯ₂ＨでありＺが−ＣＯ₂（アルキル）である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン；
ならびに薬学的に許容されるその塩を提供し、
ただし、化合物は、ＧＰＥ、Ｎ−Ｍｅ−ＧＰＥ、ＧＰＥアミド、ＡＰＥ、ＧＰＱまたはその塩でない。

【0010】

別の態様では、本発明は、自閉症スペクトル障害を有する動物の処置のための方法であって、動物へのグリシル−Ｌ−２−メチルプロリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｇ−２−ＭｅＰＥ）の有効量の投与を含む方法を提供する。
本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載される。本発明の他の態様および特色は、図を参照して理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明のＧＰＥの合成類似体の調製のための一般スキームである。

【図2-3】ＧＰＥのグリシン残基を改変するためのスキームである。

【図4-9】ＧＰＥのグルタミン酸残基を改変するためのスキームを表す。

【図10-11】ＧＰＥのペプチド結合を改変するためのスキームを表す。

【図12-15】ｉｎ ｖｉｔｒｏでニューロンをＧＰＥまたはＧ−２−ＭｅＰＥおよびオカダ酸で試験した結果を要約するグラフを表す。

【図12】オカダ酸により損傷を受けた皮質ニューロンへのＧＰＥの影響を示すグラフを表す。

【図13】オカダ酸により損傷を受けた皮質ニューロンへのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示すグラフを表す。

【図14】オカダ酸により損傷を受けた小脳微小外植片へのＧ−２−ＭｅＰＥ、ＧＰＥの影響を示すグラフを表す。

【図15】オカダ酸により損傷を受けた線条体細胞へのＧ−２−ＭｅＰＥまたはＧＰＥの影響を示すグラフを表す。

【図16】１８ヶ月齢のラットの線状体中のＣｈＡＴ陽性ニューロンの数への、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（０．０１２、０．１２、１．２および１２ｍｇ／ｋｇの用量）の皮下注射の影響を示す図である。

【図17】中年齢の１２ヶ月齢ラットにおける空間記憶保持へのＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響を示す図である。

【図18A-18B】３週間の処置および９日間の洗い出しに続く８アーム放射状迷路での老齢（１７ヶ月）ラットの空間作業記憶へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示す図である。図１８Ａは、異なる群の数日にわたる迷路習得プロファイルを示す。図１８Ｂは、群の数日にわたって平均した正しい迷路選択の割合を示す。

【図19A】老齢ラットの脳室下ゾーン（ＳＶＺ）におけるＰＣＮＡ陽性細胞の数によって評価したときの、神経芽細胞増殖へのＧ−２−ＭｅＰＥの４用量の単一の腹腔内投与の影響を示す図である。

【図19B】基剤処置ラット（左パネル）と比較した、Ｇ−２−ＭｅＰＥの最高用量（右パネル）で処置したラットにおける、ＰＣＮＡおよびダブルコルチン染色の共存へのＧ−２−ＭｅＰＥの４用量の単一の腹腔内投与の影響を示す図である。

【図19C】中年齢ラットにおけるＰＣＮＡ免疫組織化学的染色によって評価したときの、神経芽細胞増殖へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示す図である。

【図20A】若齢ラット（^*ｐ＜０．０１）および中年齢ラット（^*ｐ＜０．０１）と比較した、老齢ラットの海馬におけるＧＦＡＰ染色によって評価したときの、反応性星状神経膠細胞数の有意な増加を示す図である。

【図20B】ＧＦＡＰ染色で評価したときの星状神経膠細胞を示す、老齢ラットの大脳皮質の切片の写真を示し、そのいくつかは毛細管（矢印）の形成と関連している。

【図20C】老齢ラットの海馬のＣＡ４小領域においてＧＦＡＰ染色を使用して分析したときの、星状神経膠細胞数の低減への、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置（０．１２、０．１２、１．２および１２ｍｇ／ｋｇ／日の用量）の用量依存的影響を示す図である。

【図20D】小脳皮質においてＧＦＡＰ染色を使用して分析したときの、星状神経膠細胞数の低減への、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置（０．１２、０．１２、１．２および１２ｍｇ／ｋｇ／日の用量）の用量依存的影響を示す図である。

【図21】静脈内注射後のラットの循環中での、ＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの薬物動態学的特性を示す図である。

【図22】食塩水処置したＭｅＣＰ２欠損マウスと比較した、ＭｅＣＰ２欠損マウスでの生存期間の増加へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示す図である。

【図23】食塩水処置したＭｅＣＰ２欠損マウスと比較した、ＭｅＣＰ２欠損マウスでのｆＥＰＳＰ勾配によって測定したときの、海馬の長期増強へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示す図である。

【図24】細胞体からの距離の関数としての、樹状突起長へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示すグラフである。

【図25-26】食塩水基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、食塩水中、ｉ．ｐ．；２８日）のいずれかで処置した、野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスのオープンフィールドでの行動を例示するグラフである。運動（図２５）および立ち上がり行動（図２６）は、両方ともｆｍｒ１ノックアウトマウスで上昇している。歩行（強化された認知能の指標である可能性が最も高い）に関する試験２および３、ならびに立ち上がり（基剤処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスで見られた活動過多の消去の指標である）に関する３つ全ての試験で、これらの影響はＧ−２−ＭｅＰＥによる処置によって弱められる。Ｖ：基剤、ＮＮＺ：Ｇ−２−ＭｅＰＥ；ＦＸ：ｆｍｒ１ ＫＯおよびＷＴ＝野生型。黒丸：基剤処置野生型；白丸：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒三角：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；白三角：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図26】基剤（食塩水）処置ｆｍｒ１ ＫＯおよび野生型動物と比較した、連続通路試験における野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスの行動へのＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）の影響を示すグラフである。Ｆｍｒ１ ＫＯマウスは通路の嗜好を示さなかったが、これはモデルの活動過多の表現型が原因と考えられる。２８日間のＧ−２−ＭｅＰＥ処置により、この行動パターンは元に戻った。黒丸：基剤処置野生型；白丸：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒三角：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；白三角：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図27A-D】上昇プラス迷路での、食塩水基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）のいずれかを与えた野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスの行動を示す図である。図２７Ａは、アーム侵入の総回数へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示すグラフである。アーム侵入総回数の百分率で表される開放アーム侵入を、図２７Ｂに示す。図２７Ｃは、装置の中央で消費した時間へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を示すグラフである。白棒：基剤処置野生型；陰影のついた棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；斜線棒：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図28A-B】野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるアーム侵入回数へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響のグラフである。白棒：基剤処置野生型；陰影のついた棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；斜線棒：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図28C】Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置および基剤処置の野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける迷路の中央で消費した時間のグラフである。白棒：基剤処置野生型；陰影のついた棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；斜線棒：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図29】野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける脈絡恐怖条件づけへのＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）の影響を表すグラフである。黒棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；白棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ；陰影のついた棒：基剤処置野生型；斜線棒：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図30A】社会的行動である同一種の臭い嗅ぎへのＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響を示すグラフである。

【図30B】食塩水基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）のいずれかを与えた野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスによって埋められたガラス玉の数を示す図である。

【図30C】食塩水基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥのいずれかを与えた野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスの営巣スコアを示す図である。白棒：基剤処置野生型；陰影のついた棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型；斜線棒：基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ；黒棒：Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ。

【図31A】海馬細胞の培養のために使用した微流動チャンバーを例示する図である。

【図31B】ＧＦＰ陽性の未処置ＷＴの軸索を示す共焦顕微鏡写真である。

【図31C】棘が通常より多い状態を示すｆｍｒ１ ＫＯ軸索を示す図である。

【図31D】未処置のｆｍｒ１ ＫＯニューロン（図３１Ｅ）と比較して、海馬のｆｍｒ１ ＫＯニューロンを５０ｎＭの濃度のＧ−２−ＭｅＰＥと培養したときの棘数の明らかな低減を示す図である。

【図31F】ｆｍｒ１ ＫＯ海馬ニューロンへの０．５ｎＭ Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響を示す図である。

【図31G】５ｎＭの濃度のＧ−２ｅＰＥと培養したｆｍｒ１ ＫＯニューロンで観察された、軽度の処置陽性の影響を示す棘数の実質的な低減を示す図である。

【図31H】無毒性およびニューロン棘数での無影響を示す、基剤処置ニューロンを示す図である。

【図31I】２０μＭのＭＰＥＰで処置したｆｍｒ１ ＫＯ海馬培養を示す図である。平均（±ＳＤ）棘密度は、１マイクロメートル当たりの棘数で測定した。

【図32】各動物群の精巣重量を示すグラフである（^**基剤処置野生型マウスに対してｐ＜０．０１）。

【図33A】基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）のいずれかで処置した野生型およびｆｍｒ１ ＫＯ動物から得られたリンパ球でのｐＥＲＫ発現のウエスタンブロットの写真である。

【図33B】動物群でのｐＥＲＫレベルを表すグラフである。

【図33C】全ＥＲＫのウエスタンブロット分析を示す図である。

【図33D】各研究動物群でのＥＲＫの全体のレベルを示すグラフである。

【図34A】基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日）のいずれかを投与した野生型およびｆｍｒ１ノックアウトマウスから得られたリンパ球でのｐＡｋｔおよびＡｋｔのレベルのウエスタンブロットの写真である。

【図34B】研究動物群でのｐＡｋｔのレベルを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0012】

定義
投薬量または時間に関する用語「約」は特定の変数を指し、正常な測定誤差の範囲内にあるその変数周辺の範囲は、その変数の値から２０％以内にある。観察される結果に関する用語「約」は、変動が観察される変数の値から２０％以内にあることを意味する。

【0013】

用語「アルキル」は、炭素原子数が１〜６の直鎖状飽和ヒドロカルビル基、または炭素原子数が３〜６の分岐状もしくは環式の飽和ヒドロカルビル基を意味する。例示的なアルキル基には、直鎖および分岐鎖、または環式のアルキル基、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピルメチルおよびヘキシルが含まれる。
用語「動物」には、ヒトならびにヒト以外の動物、例えば家畜（ネコ、イヌ等）および畜産動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）が含まれる。
用語「アラルキル」は、式−（ＣＨ₂）_1-2Ａｒを意味し、式中、Ａｒは５−または６員環の炭素環式または複素環式の芳香環であり、任意選択で、Ｃｌ、Ｂｒ、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁸（式中、Ｒ⁸はＨまたはアルキルである）または−ＮＲ⁸Ｒ⁹（式中、Ｒ⁸は前に記載した通りであり、Ｒ⁹はＨまたはアルキルである）から選択される１〜３個の置換基で置換される。例示的なアラルキル基には、ベンジル、２−クロロベンジル、４−（ジメチルアミノ）ベンジル、フェネチル、１−ピロリルメチル、２−チエニルメチルおよび３−ピリジルメチルが含まれる。
用語「疾患」には、特にパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病、運動障害、発作、加齢による認知機能不全ならびに自閉症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群（ＲＴＴ）、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を含む自閉症スペクトラム障害、ならびに病的要求回避（ＰＤＡ）を含む動物の任意の不健康な状態が含まれる。
用語「脂肪アルコール残基」は、炭素原子数７〜２０個の、最高３個の炭素間二重結合を任意選択で含有する直鎖状ヒドロカルビル基である。例示的な脂肪アルコール残基には、デシル、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、リノレイルおよびエイコシルが含まれる。

【0014】

用語「増殖因子」は、細胞を刺激して成長または増殖させる細胞外のポリペプチドシグナル伝達分子を意味する。
用語「損傷」には、動物の任意の急性傷害、例えば、非出血性脳卒中、外傷性脳損傷、胎児仮死と関連する周産期窒息、例えば胎盤剥離、臍帯閉塞後、または子宮内成長遅滞と関連する上記窒息、十分な蘇生または呼吸の失敗に関連する周産期窒息、ニアミス溺水（ｎｅａｒ ｍｉｓｓ ｄｒｏｗｎｉｎｇ）、ニアミス乳児突然死（ｎｅａｒ ｍｉｓｓ ｃｏｔ ｄｅａｔｈ）、一酸化炭素吸入、アンモニアまたは他のガス中毒、心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖およびてんかん重積持続状態と関連する重度のＣＮＳ傷害、冠状動脈バイパス手術、低血圧症状および高血圧性危機、脳外傷および毒性の損傷と関連する脳窒息症状が含まれる。

【0015】

「記憶障害」または「認知障害」は、情報を学習、記憶または想起する能力の恒久的または一時的な障害または消失を特徴とする障害である。記憶障害は、正常な加齢、脳への損傷、腫瘍、神経変性疾患、脈管状態、遺伝子の状態（ハンチントン病）、水頭、他の疾患（ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ＡＩＤＳ、髄膜炎）、毒性物質、栄養欠乏、生化学的障害、心理的または精神的な機能不全から生じることができる。ヒトでの記憶障害の存在は、患者病歴の調査、検診、臨床検査、想像検査および神経心理学検査を通して確立することができる。標準的な神経心理学検査としては、これらに限定されないが、改訂短時間視覚記憶検査（ＢＶＭＴ−Ｒ）、ケンブリッジ神経心理学検査自動化バッテリー（ＣＡＮＴＡＢ）、児童記憶スケール（ＣＭＳ）、脈絡記憶検査、連続認識記憶検査（ＣＭＲＴ）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｏｒａｌ Ｗｏｒｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ検査および記憶機能質問表、デンマン神経心理学記憶スケール、ウェクスラー成人知能スケールＩＩＩのＤｉｇｉｔ Ｓｐａｎ ａｎｄ Ｌｅｔｔｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅサブテスト、フルドオブジェクト記憶評価（ＦＯＭＥ）、グラハム・ケンダルデザイン記憶検査、ギルド記憶検査、ホプキンス言語学習検査、学習および記憶バッテリー（ＬＡＭＢ）、記憶評価クリニック自己評価スケール（ＭＡＣ−Ｓ）、記憶評価スケール（ＭＡＳ）、ランズ記憶検査、認識記憶検査（ＲＭＴ）、レイ聴覚および言語学習検査（ＲＡＶＬＴ）、リバーミード行動記憶検査、ウェクスラー記憶スケールのラッセル版（ＲＷＭＳ）、空間作業記憶、記憶および学習検査（ＴＯＭＡＬ）、バーモント記憶スケール（ＶＭＳ）、ウェクスラー記憶スケール、記憶および学習の広範囲評価（ＷＲＡＭＬ）が挙げられる。

【0016】

用語「薬学的に許容される賦形剤」は、一般に安全で、無毒で、望ましい医薬組成物の調製で有益である賦形剤を意味し、獣医学的用途ならびにヒト医薬用途に許容される賦形剤が含まれる。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体であるか、またはエアゾール組成物の場合は気体であってもよい。
用語「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、所望の薬理特性を有する塩を意味する。そのような塩には、化合物に存在する酸性陽子が無機または有機の塩基と反応して形成することができる塩が含まれる。適する無機塩には、アルカリ金属、例えばナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムで形成されるものが含まれる。適する有機塩には、有機塩基、例えばアミン、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン等で形成されるものが含まれる。塩には、化合物に存在する１つまたは複数のアミン基と酸との反応によって形成される酸付加塩も含まれる。適する酸には、無機の酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸およびアルカン−およびアレーンスルホン酸、例えばメタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸）が含まれる。化合物に２つの酸性基が存在する場合は、薬学的に許容される塩は一酸単塩または二塩であってもよく、同様に、２つより多くの酸性基が存在する場合は、そのような基の一部または全部が塩を形成していてもよい。２つ以上のアミン基が化合物に存在する場合にも、同じ論法を適用することができる。

【0017】

用語「保護基」は、別の保護されていない反応部位で化学反応を選択的に実行することができるように、さらに選択的反応が完了した後にその基を容易に除去することができるように、多官能化合物の１つまたは複数の反応部位を選択的にブロックする基である。
用語「治療的有効量」は、疾患を処置するために動物に投与したときに、当技術分野で認められる検査システムを使用して測定したときに、その疾患のために処置を実行するのに十分である薬剤の量を意味する。
疾患を「処置すること」またはその「処置」という用語には、その疾患の素因を有するかもしれないが、その疾患の症状をまだ起こしていないか示していない動物でその疾患が起こることを予防すること（予防的処置）、その疾患を阻止すること（その発達を遅らせるか停止させること）、その疾患の症状または副作用を軽減すること（待期的処置を含む）、およびその疾患を軽減すること（疾患の退行を引き起こすこと）を含めることができる。

【0018】

用語「機能的欠陥」は、神経学的傷害と関連した行動の欠陥を意味する。そのような欠陥には、パーキンソン病患者で観察される歩行の欠陥、ハンチントン病患者で観察される運動異常が含まれる。機能的欠陥には、異常な足位置および本明細書に記載される記憶障害も含まれる。
用語「ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰ」および「ＮＮＺ−２５９１」および「ＮＮＺ」は、環式のグリシル−２−アリルプロリンを意味する。

【0019】

用語「発作」は、発作的な動作を含む異常な動作をもたらす運動欠陥または運動制御の欠如をもたらす、脳の神経活動の異常なパターンを意味する。「発作」には、異常な運動活動が付随するか否かを問わず、脳波検査の異常が含まれる。
潜在的な水素原子（例えばピロリジン環などの水素原子）は明暸性のために式から省略されているが、存在するものと理解するべきである。

【0020】

自閉症スペクトラム障害
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的交流および伝達の異常、限定的関心ならびに反復性の行動を特徴とする、関連する発達障害の集合である。ＡＳＤの現行の分類は、５つの異なる形を認める：古典的な自閉症または自閉性障害、アスペルガー症候群、レット症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）。６番目の症候群、病的要求回避（ＰＤＡ）は、さらなる特異的広汎性発達障害である。しかし、ＰＤＡはＡＳＤとして認識されつつはあるが、それはまだ米国精神医学会によって発表されるＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ−ＩＶ）の一部でもないし、改訂版であるＤＳＭ−Ｖの一部でもない。
自閉症
古典的な自閉症は、非常に多様な神経発生的障害である。それは乳児期または早期小児期に一般的に診断され、明白な症状はしばしば６ヶ月齢から出現し、２〜３歳までに確立されるようになる。ＤＳＭ−ＩＶに示される基準によると、自閉症の診断は、（ａ）社会的交流の障害、（ｂ）伝達の障害、および（ｃ）限定的および反復性の関心および行動を含む三つ組の症状を必要とする。非典型的摂食などの他の機能不全も一般的であるが、診断に必須でない。これらの障害のうち、社会的交流障害が診断にとって特に重要であり、以下の障害の２つが自閉症の診断のために存在しなければならない：
（ｉ）社会的交流を調節するための複数の非言語的行動（例えばアイコンタクト）の使用の障害；
（ｉｉ）発達レベルに適当な同朋関係を発達させることができない；
（ｉｉｉ）喜び、関心または達成を共有しようと自発的に努めることがない；
（ｉｖ）社会的または感情的な互恵主義の欠如。

【0021】

自閉症での伝達障害は、以下の方法の１つまたは複数で明らかにすることができる：話し言葉の発達の遅れ（または完全な欠如）；会話を開始または持続させる能力の著しい障害；言葉の常同的および反復性の使用；および／または自発的な架空遊びの欠如。診断のためには、限定的、反復性および常同的行動パターン、例えば強度が異常とみなされる１つまたは複数の関心事への没頭、ルーチンもしくは儀式への頑なな執着、反復性の運動マンネリズムおよび／またはオブジェクトの一部への持続的関心も必要とされる。
最後に、自閉症の診断のためには、少なくとも１つの領域（すなわち社会的交流、言葉または想像遊び）の機能における障害が３歳未満で開始することが必要である。
自閉症は一般的に、脳波図（ＥＥＧ）でのてんかんまたはてんかん様活動と関連している。自閉症患者の６０パーセントも、ＥＥＧでてんかん様活動を有する（Spence and Schneider, 2009 Ped Res 65: 599-606）。
自閉症は、自閉症患者の中枢神経系（ＣＮＳ）で減損しているＩＧＦ−１の機能の乱れと関連してもいる（Riikonen et al., 2006 Devel Med Child Neurol 48: 751-755）。ＣＮＳでのＩＧＦ−１レベルは、フルオキセチンなどの症状を低減する薬剤による処置の後に自閉症患者で増加する（Makkonen et al., 2011 Neuropediatrics 42:207-209）。
重要なことに、自閉症は、ニューロン接続性に関してレット症候群および脆弱Ｘ症候群の特色を共有する。全ての３つの障害は、シナプス機能およびニューロン接続性の欠陥を特徴とする。これは、全て正常なシナプス接続の形成不全を示す、これらの患者群での死後のヒト脳の研究に反映される。これは、ニューロン樹状突起棘密度の低減であるか、または未熟なシナプスと関連しているが増強された樹状突起棘密度のいずれかである、変化した形態学的特徴に反映される。これは、自閉症、レット症候群および脆弱Ｘ症候群の動物モデルに反映され、これらは、それらの障害で病的であることが公知である遺伝子の変化に基づく。これらの動物モデルでは、ニューロン接続性の欠陥は、形態学的に、さらに長期増強（ＬＴＰ）の不全として明らかにされる。ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１［１〜３］およびＧ−２−ＭｅＰＥがシナプス形成を増加させるので、これは重要である。

【0022】

アスペルガー症候群
アスペルガー症候群またはアスペルガー障害は自閉症に類似し、特定の特色を共有する。自閉症と同様に、アスペルガー症候群も社会的交流の障害を特徴とし、これは限定的および反復性の関心および行動を伴う。したがって、アスペルガー症候群の診断は、自閉症と同じ三つ組の障害を特徴とする。しかし、言葉または認知能の発達の一般的な遅れおよび対象の環境への関心の欠如がないことによって、それは他のＡＳＤと異なる。さらに、アスペルガー症候群は古典的な自閉症より症候学的に一般的に重度でなく、アスペルガー患者は自足で活動することができ、比較的正常な生活を送ることができる。

【0023】

小児統合失調障害
小児統合失調障害（ＣＤＤ）はヘラー症候群としても知られ、小児が通例２〜４歳までに（すなわち自閉症およびレット症候群より遅くに）発症するが、その後、社会的伝達および他の技術の重度の喪失を示す状態である。小児統合失調障害は自閉症に非常に似ており、両方とも正常な発達と、その後の言葉、社会的遊びおよび運動技能のかなりの喪失を含む。しかし、小児統合失調障害は一般的に自閉症より後に起こり、より劇的な技術の喪失を含み、はるかにより一般的でない。
ＣＤＤの診断は、以下の領域の２つ以上での、以前に獲得した技術の劇的な喪失に依存する：言葉、社会的技能、遊び、運動技能（例えば、歩行、上り、握りなどの能力の劇的な減退）、腸または膀胱の制御（前にトイレのしつけをしたにもかかわらず）。発達上の技術の喪失は急であってもよく、数日から数週間のコースにわたって起こるか、より段階的であってもよい。

【0024】

特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）
特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）は、他の十分定義されたＡＳＤに関連した症状の全てではないがいくつかを示す患者を記載するＡＳＤである。ＡＳＤ診断のための主要な基準には、他人との付き合いの困難、反復性の行動および特定の刺激への感受性の増加が含まれる。これらは、上記のＡＳＤで全て見出される。しかし、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群および小児統合失調障害の全ては、それらの特異的診断を可能にする他の特色を有する。これらの４つの障害のうちの１つの特異的診断が不可能であるがＡＳＤが明らかな場合は、ＰＤＤ−ＮＯＳの診断が下される。そのような診断は、スペクトル中の他の状態に適用される年齢よりも遅い年齢で開始する症状からもたらすことができる。

【0025】

レット症候群
レット症候群（ＲＴＴ）は、専ら女性のみが罹患する（１０：０００中１人の生産児）神経発生的障害である。ＲＴＴは、自閉症スペクトラム障害に分類される（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、改訂第４版）（ＤＳＭ−ＩＶ−Ｒ）。米国では、およそ１６，０００人の患者が現在ＲＴＴに罹っている。（Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｕｓｔ ｄａｔａ）。レット症候群の診断のために、以下の症状が特徴的である：６〜１８ヶ月齢からの発達障害；３ヶ月齢から４歳の間に始まる頭部成長の速度低下；重度の言語障害；反復性および常同的な手の動作；ならびに異常歩行、例えばつま先歩きまたは不安定な硬直脚歩行。さらに、レット症候群の診断の助けとなることができるが診断に必須でない、いくつかの支援的な基準がある。これらには呼吸困難、ＥＥＧ異常、発作、筋硬直および痙縮、側弯症（脊柱の湾曲）、歯ぎしり、背に対して小さい手および足、成長遅延、減少した体脂肪および筋肉質量、異常な睡眠パターン、刺激感受性もしくは興奮、そしゃくおよび／もしくは嚥下困難、血行不良ならびに便秘が含まれる。

【0026】

ＲＴＴの開始は、発達および成長速度の低下を伴って、通常６〜１８ヶ月齢に始まる。これに、退行相（一般的に１〜４歳児童で）、疑似定常相（２〜１０歳）および以降の進行性の後期運動悪化状態が後に続く。ＲＴＴ症状には、成長の急激な減速ならびに言語および運動技能の退行、例えば、常同性の動作と置き換えられる意図的な手の動作、自閉症の特色、パニック様攻撃、睡眠周期の乱れ、振戦、発作、呼吸機能不全（一時的な無呼吸、過呼吸）、失行、ジストニア、運動異常、緊張低下、進行性の後彎症または側弯症、および重度の認知障害が含まれる。ほとんどのＲＴＴ患者は重度の身体障害を伴いながら成人まで生存し、１日２４時間の看護を必要とする。
ＲＴＴの８５％から９５％の症例は、Ｍｅｃｐ２遺伝子−メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードする遺伝子−の突然変異によって引き起こされることが報告されている（Amir et al. 1999. Nat Genet 23:185-188; Rett Syndrome Research Trust）。Ｍｅｃｐ２はＸ染色体（位置Ｘｑ２８）にマッピングされ、この理由で、男性でのこの遺伝子の突然変異は通常致死性である。ＲＴＴは遺伝子障害であるが、記録された症例の１％未満が遺伝性である。Ｍｅｃｐ２のほとんど全ての突然変異は新規に起こり、３分の２は第３および第４エクソンに位置する８つのＣｐＧジヌクレオチド（Ｒ１０６、Ｒ１３３、Ｔ１５８、Ｒ１６８、Ｒ２５５、Ｒ２７０、Ｒ２９４およびＲ３０６）の突然変異によって引き起こされる。

【0027】

ＭｅＣＰ２は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドに結合してＣＮＳでＤＮＡの転写サイレンシングを働かせるタンパク質である。ＭｅＣＰ２の低減または非存在の主要な影響は、樹状突起棘発達およびシナプス形成の障害であるようである。ＭｅＣＰ２発現は、脳成熟と一時的に相関するようであり、症状が約１８ヶ月齢で一般的に出現する理由を説明する。

【0028】

ＡＳＤに共通する特色の提示
ＡＳＤを総合して考えれば、全ての５つの形の間で症状の提示に共通性があることが明らかである。これらの共通する特色は、正常な社会的適格性の障害および反復性の行動である。アスペルガー症候群以外の全てにおいては、言語技術の不足が最も一般的に明らかである遅い知的発達の一貫した提示もある。その年齢の正常なパラメータと比較した認知能の低下が、自閉症、レット症候群、ＣＤＤおよびＰＤＤ−ＮＯＳではしばしばかなり顕著である。ＥＥＧでのてんかんまたは異常な活動の存在も、自閉症、脆弱Ｘ症候群およびレット症候群に共通する。てんかんは、異常なニューロン接続性の状況で起こる。ニューロン接続性の障害および乱れたシナプス機能は、自閉症、脆弱Ｘ症候群およびレット症候群、ならびにこれらの状態の動物モデルに共通する特色である。

【0029】

ＡＳＤの遺伝モデル
正当性を提供するために、ＡＳＤおよび神経発生障害の動物モデルは臨床状態に類似した症状を実証し、それらの症状の病因に関して相当な程度の表面的妥当性を有しなければならない。古典的自閉症は多くの異なる遺伝子障害によって引き起こされ得ることが知られており、数パーセントを越える自閉症症例の原因が単一の遺伝子欠損にあるとは考えられていない。実際、近年の研究は、稀な遺伝した遺伝子欠損に加えて、ＡＳＤの根底にあると考えられている染色体位置の多数の新規構造変動を明らかにした（Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007）。したがって、１ｐ、５ｑ、７ｑ、１５ｑ、１６ｐ、１７ｐおよびＸｑを含む、２０以上の主要な部位の遺伝子配列のコピー数変動（ＣＮＶ）、転位および反転が、ＡＳＤ遺伝子座としてマッピングされている。

【0030】

しかし、ＡＳＤの根底にある多元発生バックグラウンドおよび病因の複雑性にもかかわらず、特定の遺伝子欠損がＡＳＤをもたらすことができることが知られている。最もよく特徴付けられた欠損のいくつかは、ニューロリジン−３（ＮＬＧＮ３）、ニューロリジン−４（ＮＬＧＮ４）、ニューレキシン−１α（ＮＲＸＮ１）およびｓｈａｎｋ３を含む、シナプス後肥厚タンパク質のクラスターをコードする遺伝子の染色体異常から生じる（Sebat et al, 2007）。重要なことに、これらの欠損は変化したシナプス機能を指し、したがって、自閉症および関連障害での最終共通経路としての妨害されたニューロン接続性を指す（Minshew and Williams 2007 Arch Neurol. 64:945-950；Gilman et al., 2011 Neuron. 70:898-907）。そのような接続性欠陥は検死での形態学的所見に反映され、それは自閉症で増加する樹状突起棘密度を明らかにする（Hutsler and Zhang 2010 Brain Res. 1309:83-94）。

【0031】

ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４は、グルタミン酸作動性シナプスに存在するシナプス後細胞接着分子である。それらはシナプス後部位へのシナプス前接触を調整する役割をし、さらにシナプス後骨格タンパク質ｓｈａｎｋ３と相互作用する。ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４の突然変異はＡＳＤ集団で観察されており、全ＡＳＤ症例のだいたい１％を占める（Lintas & Persico, 2008）。Ｊａｍａｉｎおよび同僚は、２人の無関係な対象でそれぞれアスペルガー症候群および古典的自閉症をもたらす、ＮＬＧＮ３へのミスセンスおよびＮＬＧＮ４へのフレームシフトを最初に報告した（Jamain et al, 2003）。ＡＳＤ集団でのＮＬＧＮ３またはＮＬＧＮ４突然変異の発生率は低いが（実際、カナダの研究での９６人のＡＳＤ患者の研究ではあまり多くの突然変異が観察されなかった；Gauthier et al, 2005）、前臨床の研究では、ニューロリジン突然変異が自閉症の症状のモデルを実際生成することができることが確認された。したがって、マウスへの臨床的に報告されたＮＬＧＮ３への同じＲ４５１Ｃミスセンスの導入は、低下した社会的交流および強化された抑制性シナプス伝達を示す突然変異マウス系統をもたらす（Tabuchi et al, 2007）。
したがって、Ｒ４５１Ｃ突然変異マウスは、ＮＬＧＮ３突然変異に基づくＡＳＤのモデルに相当する。この場合、ＮＬＧＮ３のＲ４５１位置の突然変異は、「機能増加」突然変異になる。
対照的に、マウスでのＮＬＧＮ４の臨床突然変異のモデル化は、ＮＬＧＮ４の「機能喪失」突然変異によって達成される（古典的ノックアウトモデル）。このモデルでは、突然変異マウスは、社会的交流欠陥および減少した超音波発声を示す（Jamain et al, 2008）。伝達欠陥は臨床ＡＳＤの中心であり、ＮＬＧＮ４ノックアウトマウスでは、野生型雌対応物に曝露させた雄マウスからの超音波発声の低減はＡＳＤのモデルとしてのその系統の表面的妥当性を裏づける。

【0032】

シナプス前ニューレキシンタンパク質は、シナプス後ニューロリジン対応物との相互作用を通して反対側の樹状突起でシナプス後分化を誘導する。ニューレキシン−１α（ＮＲＸＮ１）遺伝子の突然変異は、多くの研究で報告されており（Sebat et al, 2007；Marshall et al, 2008；Kim et al, 2008；Yan et al, 2008）、これらはコピー数変異体の形で観察されている。ＮＬＧＮ突然変異と同様に、ＮＲＸＮ１遺伝子の突然変異が（遺伝子ノックアウトの形で）マウスに導入されるとき、特定のＡＳＤ様特色を有する突然変異系統が生成される（Etherton et al, 2009）。これらのＮＲＸＮ１ノックアウトマウスは、海馬の微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）周波数の減少および誘発電流の入出力関係の減少を示す。これらの電気生理学作用は、海馬での減少した興奮性伝達に関連する。減少した興奮性神経伝達に加えて、ＮＲＸＮ１ノックアウトマウスはパルス前抑制の減少を示すが、社会的行動は影響を受けないようである（Etherton et al, 2009）。

【0033】

ニューレキシン−ＮＬＧＮ経シナプス構築物と特定の特色を共有して、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）は、シナプスの経細胞接着活動にも関与する、シナプス前後に存在する免疫グロブリンファミリーのタンパク質である（Biederer et al, 2002）。ＣＡＤＭ１遺伝子の突然変異はＡＳＤ患者で検出されており、これらの状態のさらなる可能な原因を表すようである（Zhiling et al, 2008）。
ＣＡＤＭ１ノックアウトマウスの分析は、これらの動物がさらなる不安関連の行動、社会的交流の障害、ならびに社会的記憶および認識の障害を示すことを明らかにする。さらに、ＣＡＤＭ１ノックアウトマウスは劣った運動技能を実証する（Takayanagi et al, 2010）。これらの機能不全は、再びＡＳＤの総合的症状と一貫している。

【0034】

２２ｑ１３欠失症候群（フェラン−マクダーミド症候群としても知られる）は、第２２染色体のｑ１３．３末端の微小欠失によって引き起こされる稀な遺伝子障害である。この微小欠失は一般的な遺伝学的スクリーニングではほとんど発見されないため、診断を確定するためには蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検査が推奨される。近年の研究は、この症候群が、正常なニューロン機能のために不可欠であるシナプス後肥厚タンパク質、遺伝子ｓｈａｎｋ３のエラーによって引き起こされることを示している。興味深いことに、この遺伝子のエラーはＡＳＤとも関連していることから、２２ｑ１３欠失症候群は一般的にＡＳＤ診断に繋がる可能性がある（Durand et al, 2007；Moessner et al, 2007；Sykes et al, 2009）。２２ｑ１３欠失症候群と結果として生じるＡＳＤの診断との近い関連性を考慮して、この突然変異の突然変異マウスモデルを開発した。

【0035】

ｓｈａｎｋ３ノックアウトマウスは、減少した超音波発声（すなわち減少した社会的伝達）ならびにマウスの間での社会的交流障害時間を含む、ＡＳＤ症状を映すいくつかの欠陥を示す。さらに、これらのマウスは、誘発電流の入出力関係および長期増強（ＬＴＰ）障害によって測定された、海馬ＣＡ１興奮性伝達の障害を有する。ＬＴＰは、記憶の形成および固結化の根底にある生理過程であると考えられている。したがって、このモデルは、ＡＳＤと一貫して、ＮＬＧＮ４ノックアウトに類似の表現型を示す。
記したように、２２ｑ１３欠失症候群それ自体は、非常に稀である。しかし、２２ｑ１３欠失症候群は、ＡＳＤの病因で特異的遺伝子が関与する重要な情報を提供する。ｓｈａｎｋ３に加えて、この障害は、ＡＳＤのさらなる可能な遺伝子欠損を明らかにする。記載される２２ｑ１３欠失症候群の５０件ほどの症例のうち、１つを除く全症例は、ｓｈａｎｋ３を越えて、Ｉｓｌｅｔ Ｂｒａｉｎ−２遺伝子（ＩＢ２）として知られるさらなる遺伝子を含む遺伝子欠失を有する（Sebat et al, 2007）。ＩＢ２タンパク質はＭＡＰキナーゼおよびアミロイド前駆体タンパク質を含む多くの他のタンパク質と相互作用し、神経突起でのタンパク質輸送に影響するようであり、シナプス後肥厚に豊富である（Giza et al, 2010）。このタンパク質を欠くマウス（ＩＢ２−／−ノックアウトマウス）は、社会的交流の障害（社会的臭い嗅ぎおよび交流時間の減少）、探査行動の減少ならびに認知および運動欠陥を示す（Giza et al, 2010）。この行動表現型は、小脳細胞での興奮性伝達の減少と関連していた。したがって、ｓｈａｎｋ３ノックアウトと同様に、ＩＢ２突然変異の表現型はＡＳＤとも一貫している。
上記のシナプス後肥厚タンパク質欠損の動物モデルに加えて、ＡＳＤと様々な特色を共有する他の単生症候群が自閉症に至る可能性があることから、ＡＳＤまたは神経発生障害を標的にする薬物のための別の手段がもたらされる。これの優れた例は、脆弱Ｘ症候群である。

【0036】

脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、ｆｍｒ１遺伝子によってコード化されるタンパク質の発現の失敗をもたらす、Ｘ染色体の上の単一のトリヌクレオチド遺伝子配列（ＣＧＧ）の拡張によって引き起こされる。ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神発達遅滞１）は、正常な神経発達のために必要とされるタンパク質である。ＦＸＳは、児童に自閉症を起こすことができる（Hagerman et al, 2010）。自閉症と診断される全児童の２〜６％で、原因はＦＸＳ遺伝子突然変異である。さらに、ＦＸＳ児童のおよそ３０％はある程度の自閉症を有し、さらなる３０％はＰＤＤ−ＮＯＳと診断される（Hagerman et al, 2010）。実際、脆弱Ｘ症候群は自閉症の最も一般的な公知の単一遺伝子の原因である。ＦＸＳのモデルとして、したがってＡＳＤのさらなるモデルとして、ＦＭＲ１ノックアウトマウスが開発されている。ＦＭＲ１遺伝子のノックアウト突然変異は、異常な樹状突起棘の発達および切り取りなどのニューロン接続性欠陥（Comery et al, 1997）、ならびにシナプス後肥厚での樹枝状足場タンパク質（ｓｈａｎｋ１を含む）およびグルタミン酸受容体サブユニットの関連する調節不全（Schutt et al, 2009）をもたらすことが示されている。樹状突起形態へのこれらの影響は、接続性の機能測定の欠陥、例えば、皮質および扁桃（Zhao et al, 2005）および海馬（Lauterborn et al, 2007）でのＬＴＰ障害、ならびに認知障害（Kreuger et al, 2011）および社会的不安の増強（Spencer et al, 2005）をもたらす。これらの接続性欠陥は、死後分析で増強された樹状突起棘密度を示すＦＸＳ患者で反映される（Irwin et al., 2000 Cereb Cortex 10:1034-1048）。この増強された樹状突起棘密度は未熟なシナプスを伴い（Klemmer et al., 2011 J Biol Chem. 286:25495-25504）、すなわち、機能的に未熟な状態を表す可能性がある。

【0037】

自閉症、アスペルガー、ＣＤＤおよびＰＤＤ−ＮＯＳのＡＳＤと対照的に、レット症候群はほとんど単生の基礎を有するようであり、マウスにおいて優れた表面的妥当性でモデル化することができる。最高９６％の症例では、レット症候群はＭｅｃｐ２遺伝子の欠損によって引き起こされると考えられる（Zoghbi, 2005）。その結果、ＭｅＣＰ２ノックアウト突然変異マウスは、臨床レット症候群の全ての特質を有する動物モデルを提供し、表現型はＡＳＤのＮＬＧＮ４、ｓｈａｎｋ３およびＩＢ２ノックアウトモデルと多少の重複を示す。したがって、ＭｅＣＰ２ノックアウトマウスは、対応する社会的および空間記憶の減少（Moretti et al, 2006）ならびにオブジェクト認識の障害（Schaevitz et al, 2010）とともに海馬でＬＴＰの明らかな障害を示す。ＬＴＰのこの障害は、樹状突起棘密度の減少を伴う。レット症候群患者は、低下した樹状突起棘密度を示す（Belichenko et al., 1994 Neuroreport 5:1509-1513）。

【0038】

したがって、ヒトのＡＳＤは、齧歯動物を含む動物の認知障害または発達障害の多くの特色を共有する。したがって、マウスおよびラットなどの齧歯動物のＡＳＤの療法の研究は、ヒトで得られる結果をかなり予測する。自閉症、脆弱Ｘ症候群およびレット症候群で見られる共通の特色は、樹状突起棘密度の低下または未熟なシナプスを有する樹状突起棘密度の増強に反映される、ニューロン接続性欠陥の存在である。これらの形態学的変化の機能的結果は、これらの障害の動物モデルで類似しており、例えばＬＴＰの欠陥として反映される。

【0039】

臨床ＡＳＤおよびＡＳＤ動物モデルのＧ−２ＭｅＰＥによる処置
上記のように、ＡＳＤでは、神経突起発達障害、シナプス接続性の障害、ならびに結果としての社会的および認知機能の対応する障害を含む、保存された病理が観察される。そのようなシナプスの機能不全は、シナプス後肥厚タンパク質の遺伝的に変化した機能から生じる。正常な神経突起成長およびシナプス後発達は、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Chapleau et al, 2009）、およびインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１；Riikonen et al, 2006；Tropea et al, 2009）などの成長因子によって調節し、増強することができる。実際、ＩＧＦ−１は正常な樹状突起棘成長およびシナプス形成のために必須である（Cheng et al., 2003 J Neurosci Res. 73:1-9）。したがって、成長因子機能を促進する薬物は、ＡＳＤなどの進行性の発達障害の処置で有用である。ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰは、ＩＧＦ−１の末端トリペプチド、ＩＧＦ１（１〜３）の小分子類似体である。ＩＧＦ−１模倣類似体として、ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰは、様々な動物モデルで栄養および神経保護効果を発揮する。したがって、ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰは、上記の遺伝子突然変異から生じるシナプス機能不全に関係するものなどの、ＡＳＤおよびＦＸＳ症状の処置で有効である。

【0040】

臨床条件で、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群、小児統合失調障害およびＰＤＤ−ＮＯＳを呈するＡＳＤ患者、ならびに２２ｑ１３欠失症候群、脆弱Ｘ症候群および病的要求回避の患者は、ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰで処置される。患者は、社会的障害および伝達障害ならびに認知欠陥を示す。ｃＧ−２ＡｌｌｙｌＰによる、例えば毎日の、および別の例では経口経路による処置は、常同性の反復動作の向上、社会的機能の向上および薬物処置後の認知能力の向上を誘導することが観察される。

【0041】

ＡＳＤの動物モデルでは、ノックアウトマウスへの経口強制栄養または腹注による毎日のＧ−２ＭｅＰＥ処置は、ＡＳＤ様症状を改善する。Ｇ−２ＭｅＰＥは、以下のＡＳＤ突然変異マウスモデルで有効である：ＮＬＧＮ３（Ｒ４５１Ｃ）突然変異体、ＮＬＧＮ４ノックアウト、ＮＲＸＮ１ノックアウト、ＣＡＤＭ１ノックアウト、ｓｈａｎｋ３ノックアウト、ＩＢ２ノックアウト、ＦＭＲ１ノックアウトおよびＭｅＣＰ２ノックアウト。毎日亜長期にわたり（１〜１０週）投与すると、Ｇ−２ＭｅＰＥは、破裂刺激または高周波刺激の後に海馬でＬＴＰを向上させることにおいて有効である。同様に、Ｇ−２ＭｅＰＥは、皮質、海馬および小脳で場の細胞外シナプス後電位電気生理学の記録によって測定したときに、興奮性神経伝達を増加させる。向上した興奮性神経伝達（観察されるＡＳＤ様神経伝達欠陥の逆転）の結果、Ｇ−２ＭｅＰＥは、認知能力の認知および運動転帰検査を向上させることが観察される。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥはモリス水迷路およびラジアルアーム迷路検査での成績を向上させる。社会的交流のモデルでは、ＡＳＤ突然変異マウスに投与されるＧ−２ＭｅＰＥは、野生型雌との社会的交流にノックアウト雄が費やす時間を増加させる。さらに、雌野生型マウスへの超音波発声が増加する。
Ｇ−２ＭｅＰＥは本明細書に開示されるＧＰＥ類似体の化合物のメンバーであるので、開示される化合物のいずれもＡＳＤの症状の処置で効果を示すことができる。さらに、本発明の化合物および方法は基礎をなす神経学的機構に対処する（例えば、炎症性サイトカインの放出を阻害することによって神経炎症を減少させる）ので、本発明は症状の短期管理以上のものを提供することができる。むしろ、本発明の化合物および方法は、神経機能を向上させ、神経細胞移動を促進し、神経形成を促進し、ニューロン幹細胞分化を促進し、軸索および樹状突起の増生を促進し、シナプス伝達を促進し、それによってＡＳＤの有害な症状を軽減することができる。

【0042】

本発明の化合物
本発明の最も広い定義は概要で示したが、ここでは本発明の特定の化合物を説明する。
一態様では、本発明は式１および式２の化合物：

【化2】

（式中、ｍは０または１であり；
ｎは、０または１であり；
Ｘは、Ｈまたは−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｙは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｚは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯＮＲ⁶Ｒ⁷であり；
Ｒ¹は、Ｈ、アルキルまたはアラルキルであり；
Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は、独立してＨまたはアルキルであり：
各Ｒ⁵は、独立してＨ、アルキルまたは脂肪アルコール残基であり；
各Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立してＨ、アルキルもしくはアラルキルであるか、または−ＮＲ⁶Ｒ⁷はピロリジノ、ピペリジノもしくはモルホリノである）
またはＹが−ＣＯ₂（アルキル）でありＺが−ＣＯ₂Ｈであるか、もしくはＹが−ＣＯ₂ＨでありＺが−ＣＯ₂（アルキル）である化合物がラクトン化される場合に形成される、ラクトン；
ならびに薬学的に許容されるその塩を提供し、
ただし、化合物は、ＧＰＥ、Ｎ−Ｍｅ−ＧＰＥ、ＧＰＥアミド、ＡＰＥ、ＧＰＱまたはその塩でない。

【0043】

一部の態様では、本発明は以下を含む：
（ａ）化合物が、式１の化合物である；
（ｂ）ｍが、０である；
（ｃ）ｎが、１である；
（ｄ）Ｘ、Ｙ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵の少なくとも１つが水素でない；
（ｅ）Ｘが、−ＮＲ⁶Ｒ⁷である；
（ｆ）Ｙが、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷である；
（ｇ）Ｚが、−ＣＯ₂Ｒ⁵または−ＣＯ₂ＮＲ⁶Ｒ⁷である。
本発明の他の化合物は、Ｘが−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり、Ｒ⁶およびＲ⁷は独立してアルキルまたはアラルキルである、式１の化合物である。より好ましい実施形態は、Ｘが−ＮＲ⁶Ｒ⁷であり、Ｒ⁶およびＲ⁷の両方がアルキルである、式１の化合物である。
本発明のさらに別の化合物は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ、ｍが０であり、ｎが１であり、Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｈであり、Ｒ２がメチルであり、ＸがＮＲ⁶Ｒ⁷であって式中Ｒ⁶＝Ｒ⁷＝Ｈであり、ＹがＣＯ₂Ｒ⁵であって式中Ｒ⁵＝Ｈであり、ＺがＣＯ₂Ｒ⁵であって式中Ｒ⁵＝Ｈである、式１の化合物である。

【0044】

薬理学および有用性
本発明の化合物は、抗炎症性、抗アポトーシス性、抗壊死性および神経保護の作用を有することができる。それらのｉｎ ｖｉｖｏ活性は、細胞数、所望のマーカーの特異的染色、またはKlempt ND et al: Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor β1 mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Research: 13: 93-101で論じられるものなどの方法によって測定することができる。それらの活性は、当技術分野で公知であるか本明細書に記載される方法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することもできる。

【0045】

脳機能に影響を及ぼす状態は、加齢集団で多発するようになる。罹患者およびその家族にとって、記憶喪失および記憶障害は苦痛である。記憶の喪失または障害は、正常な加齢、脳への損傷、神経変性疾患および心因性または精神的な機能不全の結果として生じることができる。したがって、記憶および／または認知機能を増強し、記憶喪失または障害を処置または予防する新規化合物が同定され、特徴付けられることは、患者、その家族および社会にとって大変有益である。

【0046】

動物系において潜在的な治療薬剤の効果を研究することが望ましい。そのような有益な系の１つは、ラットである。加齢に伴い、ラットおよび他の動物（ヒトを含む）が記憶喪失、記憶障害および他の認知機能不全の症状を示す可能性が知られている。さらに、治療薬剤のラットでの研究がヒトでの治療効果を予測することが知られている。したがって、加齢ラットでのＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの効果ならびに認知機能の研究は、記憶欠陥または他の認知機能不全を有するか起こしやすい加齢ヒトでのそれらの薬剤の治療効果をかなり予測する。本発明の化合物は、認知機能を強化することおよび／または記憶障害を処置することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの認知強化活性および治療活性は、当業技術者に公知である標準的な神経心理学検査または行動試験によって測定することができる。そのような検査は上記の広範囲の利用可能な検査から選択することができ、検査する認知機能および動物の状態によって異なる。
実験動物で認知機能を検査するのに有益な標準的な行動試験としては、これらに限定されないが、モリス水迷路検査、受動回避応答検査、新規オブジェクト認識検査、嗅覚識別検査、８アーム放射状迷路検査およびＴ迷路検査が挙げられる。これらの検査は、加齢ラットの認知機能へのＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの影響の研究に、直接に適用できる。

【0047】

本発明の化合物は、ＧＰＥのそれらに類似する薬理学的および治療的活性を有することも予想され、これらの活性は、当技術分野で公知であり、本明細書に引用される文書で論じられる方法、およびＧＰＥの活性を測定するために使用される方法によって測定することができる。
化合物の治療比は、例えば、ラットなどの適する動物種において、低酸素虚血性損傷などの適するｉｎ ｖｉｖｏモデル（Sirimanne ES, Guan J, Williams CE and Gluckman PD: Two models for determining the mechanisms of damage and repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain (Journal of Neuroscience Methods: 55: 7-14, 1994）で有効な抗炎症性、抗アポトーシス性および抗壊死性の活性を与える用量を、その試験動物種で有意な観察可能な副作用を与える用量と比較することによって判定することができる。
化合物の治療比は、例えば、ラットなどの適する動物種において、適するｉｎ ｖｉｖｏモデル（下の例４、５および６）で有効な認知機能強化を与えるか記憶障害を処置する用量を、その試験動物種で有意な体重減少（または他の観察可能な副作用）を与える用量と比較することによって判定することもできる。

【0048】

本発明の化合物は、低酸素／虚血およびニューロン変性（米国特許第７，０４１，３１４号）外傷性脳損傷、運動障害および発作、脳卒中、ならびに心臓動脈バイパス移植手術（米国特許第７，６０５，１７７号）、非けいれん性発作（米国特許第７，７１４，０２０号）、および認知機能障害（米国特許出願第１２／９０３，８４４号）を含む、様々な神経変性性障害の処置に役立つことができる。さらに、本明細書の下でより詳細に説明されるように、本発明の化合物は、寿命を長くし、ニューロン活動を増加させ、レット症候群に関連する発作を処置することを含め、レット症候群の処置に役立つことができる。
マウス（ＭｅＣＰ２ノックアウトモデルを使用）でのレット症候群の１つの研究では、ＧＰＥは、寿命を長くし、ニューロン機能を増加させる効果を有することが見出された（米国特許出願公開第２００９／００９９０７７号）。しかし、本明細書でさらに開示されるように、天然に存在するペプチドであるＧＰＥは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで速やかに分解され、したがってレット症候群患者の長期療法におけるその有用性は不明である。

【0049】

医薬組成物および投与
一般に、本発明の化合物は、単独で、または本発明の少なくとも１種の他の化合物および／または処置する疾患のための少なくとも１種の他の従来の治療薬剤と組み合わせて、当技術分野で公知である通常の様式のいずれかによって治療的有効量で投与することができる。治療的有効量は、疾患または損傷、疾患の重症度、処置する動物の年齢および相対的な健康、化合物の効力ならびに他の因子によって大きく異なってもよい。抗炎症薬、抗アポトーシス薬、抗壊死薬、抗神経変性薬として、本発明の化合物の治療的有効量は、動物の質量の１キログラム当たり約０．００１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）〜約１００（ｍｇ／ｋｇ）、例えば約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇであってもよく、より低い用量、例えば約０．００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇは、脳脊髄液を介した投与、例えば側脳室内投与に適当であり、より高い用量、例えば約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約１０ｍｇ／ｋｇは、経口、全身（例えば経皮）または非経口（例えば静脈内）投与などの方法による投与に適当である。当業者は、不要な実験なしで、その技術およびこの開示を考慮して、所与の疾患または損傷のために本発明の化合物の治療的有効量を判定することができる。
一般に、本発明の化合物は、以下の経路の１つによって医薬組成物として投与することができる：経口、局所、全身（例えば経皮、鼻腔内、または坐薬による）、または非経口（例えば筋肉内、皮下または静脈内注射）、ＣＮＳへの投与（例えば脊椎内または槽間注射による）；埋め込みによる、および浸透ポンプ、埋込ポンプ、経皮パッチ等のような装置による注入による。組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、半固体、散剤、持続的放出製剤、溶液、懸濁液、エリキシル剤、エアゾール剤、可溶性ゲル剤または任意の他の適当な組成物の形をとることができ、本発明の少なくとも１つの化合物を、少なくとも１つの薬学的に許容されるか生理的に許容される賦形剤と一緒に含むことができる。適する賦形剤は、当業者周知であり、それらおよび組成物を製剤化する方法は、Gennaro AR: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2000のような標準的な参考文献に見出すことができる。適する液体担体、特に注射用溶液のためのものには、水、食塩水、デキストロース水溶液、グリコール等が含まれ、静脈内、脊椎内および槽内投与のためには等張性溶液が好ましく、ＣＮＳへの化合物の投与のためには人工脳脊髄液などの基剤も特に適する。上のテキストは、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる。

【0050】

本発明の化合物は、錠剤またはカプセル剤の形で経口投与することができる。一部の実施形態では、本発明の化合物は、マイクロエマルジョン、粗いエマルジョン、液状結晶またはナノカプセルの形の油中水型エマルジョンで調製することができる（米国特許出願第１２／２８３，６８４号、現在、２０１１年２月１５日に交付された米国特許第７，８８７，８３９号）。本発明の化合物は実質的な経口生物学的利用能を有することができるので、それらは都合良く長期投与に有利に使用できる。さらに、経口利用可能な組成物には、活性化合物を含有する可溶性ヒドロゲルが含まれ、このように、患者が錠剤またはカプセル剤を飲む必要がない神経保護化合物の経口投与を可能にする。そのような徐放性材料およびゲルは、当技術分野で公知である。

【0051】

本発明の化合物は、神経変性またはその症状をもたらす可能性がある状態の開始の後か前に投与することができる。例えば、低酸素／虚血は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術の過程で起きる可能性があることが知られている。したがって、患者を体外酸素投与システムに置く前に、本発明の化合物で前処置することができる。一部の実施形態では、手術の約４時間前、または外傷性もしくは他の神経損傷につながる可能性がある事象の約４時間前に、本発明の化合物の投与を開始することが望ましい可能性がある。他の実施形態では、神経損傷を修繕するために、手術の間に、または外科的処置の間に本発明の化合物を注入することが望ましい可能性がある。本発明の化合物は、緊急事態で、例えば脳卒中、低酸素事象、外傷性脳損傷または他の急性傷害を起こしたばかりの患者で使用することもできる。そのような状況では、神経損傷の診断直後に本発明の化合物を投与することができる。

【0052】

一部の状況では、現場で使用する前に、本発明の化合物を含有するキットを調製することができる。キットは、シリンジまたは他の送達デバイス、および取扱説明書とともに、薬学的に許容される製剤（例えば、注射または経口投与のための）の形の本発明の化合物を含有するバイアルを含むことができる。発作が診断される状況では、本発明の化合物を、抗けいれん薬と一緒に投与することができる。多くの抗けいれん薬が当技術分野で公知であり、本明細書で詳細に記載する必要がない。

【0053】

さらに、外傷性損傷、脳卒中または外科的処置などの一次傷害の後に、「二次性の」神経損傷が起こることがある。例えば、脳卒中、穿通性脳損傷またはＣＡＢＧ処置の後に、神経組織の炎症が神経変性につながる可能性がある。二次性の損傷は炎症性細胞（例えば、星状神経膠細胞および／またはミクログリア）の活性化の増加に反映されることがあり、炎症媒介物質の作用は神経傷害を引き起こす可能性がある。したがって、一部の実施形態では、傷害の前から始まり、傷害の約１００時間後までの期間、本発明の化合物を投与することが望ましいことがある。他の実施形態では、傷害の前から、傷害の間に、および傷害の後に、本発明の化合物を注入剤として連続的に、または所望の時間間隔で分割された別個の用量で投与することが望ましいことがある。

【0054】

本発明の化合物は、Ｇ−２−ＭｅＰＥをその中に取り込んだ持続的放出系またはゲル材料によって適切に投与することもできる。持続的放出組成物の適切な例には、成型品の形、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの半浸透性ポリマーマトリクスが含まれる。持続的放出マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., 1983）、ポリ（メタクリル酸−２−ヒドロキシエチル）（Langer et al., 1981）、エチレン酢酸ビニル（Langer et al.、上記）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。さらに、多糖（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キトサンまたは他のセルロース誘導体）およびポリエチレンオキシド誘導体（例えば、ポリエチレングリコール）に基づくゲル組成物を使用することができる。これらのゲル組成物は、水溶液に可溶性であり、生体適合性であり、無毒であり、したがって、口腔、鼻咽頭、尿生殖路、腸または直腸を含む任意の粘膜表面に、本発明の化合物を投与するために使用することができる。

【0055】

持続的放出組成物には、リポソームに取り込まれた化合物も含まれる。化合物を含有するリポソームは、それ自体公知である方法によって調製される：独国特許第３，２１８，１２１号；Epstein et al., 1985；Hwang et al., 1980；欧州特許第５２，３２２号；欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号；日本特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；および欧州特許第１０２，３２４号。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モルパーセントを超えるコレステロールである小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、選択される比率は最も効果的な療法について調整される。上記の刊行物のいずれも、各々が別々にそのように組み込まれたように、参照により完全に明示的に本明細書に組み込まれる。
本発明の化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの寿命を増加させるために、例えば国際公開第９５／３２００３号に記載されるコンジュゲート技術に基づいて、ポリエチレングリコールに付着させる（「ペグ化する」）こともできる。
望ましくは、可能であれば、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗壊死剤または抗神経変性剤として投与されるとき、本発明の化合物は経口投与されてもよい。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投薬量のサイズ、賦形剤の種類および当業者周知の他の因子によって大きく異なってもよい。一般に、最終組成物は、約０．０００１重量パーセント（重量％）〜約１０重量％の本発明の化合物、好ましくは約０．００１重量％〜約１重量％を含むことができ、残部は１種または複数の賦形剤である。

【0056】

組成物は、本発明の化合物に加えて、例えば、成長因子および関連誘導体（インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、トランスフォーミング成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ結合タンパク質（特にＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子生成物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘導成長因子から選択される少なくとも１つの薬剤を任意選択で含有することができる。ＦＧＦファミリーの追加のメンバーには、例えば、ｉｎｔ−２、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−４、ケラチノサイト成長因子２、神経膠活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、神経膠細胞系由来神経栄養因子、活性依存神経栄養性因子、サイトカイン白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン）、α−、β−、γ−またはコンセンサスインターフェロン、およびＴＮＦ−αが含まれる。神経保護治療薬の他の形には、例えば、クロメチアゾール；キヌレン酸、Ｓｅｍａｘ、タクロリムス、Ｌ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、アンドレノコルチコトロピン−（４−９）類似体［ＯＲＧ２７６６］およびジゾルシピン（ＭＫ−８０１）、セレジリン；グルタミン酸アンタゴニスト、例えばメマチン（Ｎａｍｅｎｄａ）ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、ＧＶ１５０５２６；ＡＭＰＡアンタゴニスト、例えば２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４；アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１および／またはそのインテグリンα４受容体（α４β１およびα４β７）に対する抗炎症剤、例えば抗ＭＡｄＣＡＭ−１ｍＡｂＭＥＣＡ−３６７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９４７８）が含まれる。フェノバムなどの向代謝性グルタミン酸受容体アンタゴニストによる併用療法も、有益であろう。さらに、本発明の化合物に加えて、組成物はフルオキセチンなどの選択的セロトニン再取込み阻害剤、ビロキサジンなどの選択的ノルエピネフリン再取込み阻害剤、またはリスペリドンなどの非定型的抗精神病薬を含むことができる。これらの薬剤のほとんど、特に成長因子などのペプチドは、経口活性がなく、注射または注入による投与を必要とする。

【0057】

組成物の調製
これらの化合物の調製で使用される出発材料および試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）などの民間供給業者から入手してもよいし、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989；Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991；March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992；およびLarock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989、などの参考文献に記載される手順に従って当業者周知の方法によって調製される。ほとんどの場合、アミノ酸およびそれらのエステルまたはアミド、および保護アミノ酸は、広く市販されており、改変されたアミノ酸およびそれらのアミドまたはエステルの調製は、化学および生化学の文献に広く記載されており、したがって当業者周知である。例えば、Ｎ−ピロリジン酢酸は、Dega-Szafran Z and Pryzbylak R. Synthesis, IR, and NMR studies of zwitterionic α-(1-pyrrolidine)alkanocarboxylic acids and their N-methyl derivatives. J. Mol. Struct.: 436-7, 107-121, 1997に記載され；Ｎ−ピペリジン酢酸は、Matsuda O, Ito S, and Sekiya M. Reaction of N-(alkoxymethyl)dialkylamines and N,N'-methylenebisdialkylamines with isocyanides. Chem. Pharm. Bull.: 23(1), 219-221, 1975に記載される。上記刊行物の各々は、参照により個々に組み込まれたものとしてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0058】

本発明の出発材料、中間体および化合物は、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等を含む従来の技術を使用して、単離および精製することができる。それらは、物理定数およびスペクトルデータを含む従来の方法を使用して特徴付けることができる。
本発明の化合物は、下記の方法によって、および実施例で示される通りに調製することができる。

【0059】

式１の化合物は、ＧＰＥの類似体、またはその改変体、例えばエステルもしくはアミドである。一般に、それらは、この明細書に付随する図１〜１１に示される反応スキームに従って、ペプチドおよび改変ペプチド合成の当業技術者に既に周知であるような方法によって、またはペプチドおよび類似体の合成の当業技術者周知の他の方法に従って調製することができる。

【0060】

便利には、本発明のポリペプチドの合成による生成は、Merrifield et al. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide: J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156, 1963に記載される固相合成方法に従ってもよい。この技術はよく理解されており、ペプチドの調製のための一般的な方法である。この方法の一般的な概念は、鎖の第１のアミノ酸の、共有結合による固体ポリマーへの付着に依存する。所望の配列が組み立てられるまで、続く保護アミノ酸を一度に１つ（段階的戦略）、またはブロックで（セグメント戦略）加える。最後に、保護されたペプチドを固体樹脂担体から取り外し、保護基を切り離す。この手順によって、試薬および副産物は濾過によって除去され、このように、中間物を精製する必要性が消失する。

【0061】

アミノ酸は、樹脂として適する任意のポリマーに付着させることができる。樹脂は、第１の保護アミノ酸が共有結合によってしっかりと連結することができる官能基を含有しなければならない。この目的のために、セルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸メチルおよびポリスチレンなどの様々なポリマーが適する。適する樹脂は市販されており、当業者周知である。そのような合成で使用できる適当な保護基には、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−アミロキシカルボニル（Ａｏｃ）、トシル（Ｔｏｓ）、ｏ−ブロモ−フェニルメトキシカルボニル（ＢｒＺ）、２，６−ジクロロベンジル（ＢｚｌＣｌ₂）およびフェニルメトキシカルボニル（ＺまたはＣＢＺ）が含まれる。追加の保護基は、上で引用したMerrifieldだけでなく、McOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973でも特定され、両参考文献は本明細書に完全に明示的に組み込まれる。
本発明のペプチドを調製する一般手順は、樹脂にカルボキシル末端保護アミノ酸を最初に付着させることを含む。付着後に樹脂を濾過し、洗浄し、カルボキシル末端アミノ酸のＩ−アミノ基の保護基（望ましくＢＯＣ）を除去する。この保護基の除去は、当然ながらそのアミノ酸と樹脂の間の結合を切断することなく起こらなければならない。次のアミノと必要に応じて側鎖の保護アミノ酸を、続いて樹脂上のアミノ酸の遊離Ｉ−アミノ基に連結する。この連結は、第２のアミノ酸の遊離カルボキシル基と樹脂に付着した第１のアミノ酸のアミノ基との間でのアミド結合の形成によって起こる。全てのアミノ酸が樹脂に付着するまで、この順序の事象を連続したアミノ酸で繰り返す。最後に、保護されたペプチドを樹脂から切り離し、保護基を取り外して所望のペプチドを露出させる。ペプチドを樹脂から分離し、保護基を取り外すために使用される開裂技術は、樹脂および保護基の選択に依存し、ペプチド合成技術に詳しい者に公知である。

【0062】

ペプチド合成の代替技術は、Bodanszky et al, Peptide Synthesis, 2nd ed, John Wiley and Sons, New York, 1976に記載される。例えば、本発明のペプチドは、アミド結合形成の化学的または酵素的方法を使用するアミノ酸またはペプチド断片の段階的またはブロック連結を含む、標準的な溶液ペプチド合成方法を使用して合成することもできる。（例えば、The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, New York, 1987中のH. D. Jakubke, p.103-165；J. D. Glass、同上、pp.167-184；および、酵素的ペプチド合成方法を記載する欧州特許第０３２４６５９Ａ２号を参照。）これらの溶液合成方法は、当技術分野で周知である。上記刊行物の各々は、参照により個々に組み込まれたものとしてその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
これらの方法の実施のために、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａなどの市販のペプチドシンセサイザが利用できる。
当業者は、利用可能なその技術および知識、ならびにこの開示を考慮して、本発明の化合物のために１つまたは複数の適する合成方法を開発することにおいて、不要な実験を企てる必要はない。

【0063】

例えば、ＧＰＥのグリシン残基が代替アミノ酸または非アミノ酸によって置き換えられる類似体は、図２および３に例示されるように、Ｃ保護プロリン−グルタミン酸ジペプチド（ジベンジルエステルなど）の調製、およびＮ保護グリシン類似体、例えばＢＯＣ−Ｎ−メチルグリシン、ＢＯＣ−Ｌ−バリン、Ｎ−ピロリジン酢酸等とのそのジペプチドの連結、続いて脱保護によって便利に調製することができる。ＧＰＥのグルタミン酸残基が代替アミノ酸またはアミノ酸アミドもしくはエステルによって置き換えられる類似体は、Ｎ保護グリシン−Ｌ−プロリンジペプチド（ＢＯＣ−グリシル−Ｌ−プロリンなど）の調製、およびＣ保護グルタミン酸またはその類似体、例えばｔｅｒｔ−ブチルγ−アミノブチレート、メチル４−アミノ−４−ジメチルカルバモイルブチレート、Ｌ−グルタミンメチルエステル、ジメチルＩ−メチルグルタメートなどとのそのジペプチドの連結によって便利に調製することができる。ラクトンは適当な一酸モノエステル誘導体の調製および還元によって調製することができ、Ｒ²がアルキルである類似体は、単に合成での適当な２−アルキルプロリンの使用によって便利に調製することができ、同様に、Ｒ³がアルキルである類似体は、合成で適当なＮ−アルキルグルタミン酸または類似体を用いて便利に調製することができる。２個以上のアミノ酸に改変を加える場合は、連結技術はなお同じであり、複数の改変アミノ酸または類似体が合成で使用されるだけである。選択される方法（固相または液相）のための適当な保護基の選択、および固相合成が使用される場合の適当な基質の選択は、当業者の技術の範囲内である。

【0064】

式２の化合物は、図２に示す連結反応と同等の、保護されたグルタミン酸または類似体もしくは誘導体とのプロリンカルボキシル基の連結によって図２の中間体Ａの類似体を与え、次に、ピロリジン窒素を、必要に応じてＡにおいて保護されている、式Ａ−−−（ＣＨ₂）_m−−−ＣＨ（Ｒ¹）−−−ＣＨ₂Ｒの基でアルキル化することであって、式中のＲはアルキル化状態の下の脱離基である方法などの方法に従って、適切に保護された５−オキソ−Ｌ−プロリンまたはその類似体もしくは誘導体から調製することができる。あるいは、適切に保護された５−オキソ−Ｌ−プロリンをピロリジン窒素の位置で先ずアルキル化して図４の中間体Ｂの類似体を与え、次に、これを適切に保護されたグルタミン酸または類似体もしくは誘導体と図４〜９に示す方法で連結することができる。

【実施例】

【0065】

以下の例は本発明の実施形態を例示することを目的とし、これらの具体例に範囲を限定することを意図しない。当業者は、不要な実験なしで、成功の可能性をもって他の実施形態を開発するために、本明細書に提供される開示および教示を適用することができる。全てのそのような実施形態は、本発明の一部とみなされる。

【0066】

（例１）Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシル−Ｌ−プロリル）−Ｌ−グルタミン酸の合成
以下の非限定例は、本発明の化合物、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミン酸の合成を例示する

【化3】

【0067】

全ての出発材料および他の試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した；ＢＯＣ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；Ｂｎ＝ベンジル。

【0068】

ＢＯＣ−Ｌ−プロリン−（β−ベンジル）−Ｌ−グルタミン酸ベンジルエステル
０℃まで冷却させたジクロロメタン（５０ｍｌ）中のＢＯＣ−プロリン［Anderson GW and McGregor AC: J. Amer. Chem. Soc.: 79, 6810, 1994］の溶液（１０ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミン（１．３９ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸エチル（０．９６ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。生じた混合液を、３０分間０℃で撹拌した。次にジベンジル−Ｌ−グルタメート（１０ｍｍｏｌ）の溶液を加え、混合液を２時間０℃で撹拌し、次に室温まで温め、一晩撹拌した。水性炭酸水素ナトリウムおよびクエン酸（２ｍｏｌｌ^-1）で反応混合液を洗浄し、次に乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、減圧で濃縮し、ＢＯＣ−Ｌ−プロリン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（５．０ｇ、９５％）を得た。

【0069】

Ｌ−プロリン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル
ＢＯＣ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−プロリンジベンジルエステル（３．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃まで冷却し、室温で２時間、トリフルオロ酢酸（２５ｍｌ）で処理した。減圧下で揮発性物質の除去の後、残留物をエーテルで粉砕して、Ｌ−プロリン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステルを得た。

【0070】

Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタミン酸
ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のジシクロヘキシルカルボジイミド（１０．３ｍｍｏｌ）の溶液を、ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のＬ−プロリン−Ｌ−グルタミン酸ジベンジルエステル（１０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０．３ｍｍｏｌ）の撹拌および冷却された（０℃）溶液に加えた。混合液を０℃で一晩、その後室温で３時間撹拌した。濾過後、濾液を減圧下で蒸発させた。生じた粗製のジベンジルエステルを酢酸エチル（３０ｍｌ）および１０％パラジウム炭（０．５ｇ）を含有するメタノール（３０ｍｌ）の混合液に溶解し、その後水素の取り込みが終わるまで常温常圧で水素化した。濾過した溶液を蒸発させ、残留物を酢酸エチルから再結晶させて、トリペプチド誘導体を得た。

【0071】

実施例の方法に従って代替のアミノ酸またはそれらのアミドもしくはエステルを使用することにより、式１の他の化合物が生成することが理解されよう。

【0072】

（例２）グリシル−Ｌ−２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｌ−グルタメートの合成

【化4】

【0073】

Ｌ−２−メチルプロリンおよびＬ−グルタミン酸ジベンジルエステルｐ−トルエンスルホネートはＢａｃｈｅｍから、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシンはＡｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓから、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢｏＰＣｌ、９７％）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．から購入した。

【0074】

メチルＬ−２−メチルプロリネート塩酸塩２
窒素雰囲気下の−５℃において、塩化チオニル（５．８４ｃｍ³、８０．１ｍｍｏｌ）を、無水メタノール（３０ｃｍ³）中の（Ｌ）−２−メチルプロリン１（０．４３ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に用心深く滴下添加した。反応混合液を還流下で２４時間加熱し、生じた淡黄色溶液を真空下で濃縮して乾燥させた。残留物をメタノールとトルエンの１：１の混合液（３０ｃｍ³）に溶解し、次に濃縮乾燥させて残留性塩化チオニルを除去した。この手順をさらに２回繰り返し、吸湿性の分光的に純粋なオフホワイト固体として塩酸塩２（０．６２ｇ、１０４％）を得た：
融点127-131℃; [α]_D -59.8 (c CH₂Cl₂中0.24); ν_max (フィルム)/cm^-1 3579, 3398 br, 2885, 2717, 2681, 2623, 2507, 1743, 1584, 1447, 1432, 1374, 1317, 1294, 1237, 1212, 1172, 1123, 981, 894, 861および764; δ_H (300 MHz; CDCl₃; Me₄Si) 1.88 (3H, s, Proα-CH₃), 1.70-2.30 (3H, br m, Proβ-H_AH_BおよびProγ-H₂), 2.30-2.60 (1H, br m, Proβ-H_AH_B), 3.40-3.84 (2H, br m, Proδ-H₂), 3.87 (3H, s, CO₂CH₃), 9.43 (1H, br s, NH)および10.49 (1H, br s, HCl); δ_C (75 MHz; CDCl₃) 21.1 (CH₃, Proα-CH₃), 22.4 (CH₂, Proγ-C), 35.6 (CH₂, Proβ-C), 45.2 (CH₂, Proδ-C), 53.7 (CH₃, CO₂CH₃), 68.4 (四重線, Proα-C)および170.7 (四重線, CO); m/z (FAB+) 323.1745 [M₂.H³⁵Cl.H⁺: (C₇H₁₃NO₂)₂.H³⁵Cl.Hは323.1738を必要とする]および325.1718 [M₂.H³⁷Cl.H⁺: (C₇H₁₃NO₂)₂.H³⁷Cl.Hは325.1708を必要とする].

【0075】

Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリン５
窒素雰囲気下の０℃で、無水トリエチルアミン（０．４５ｃｍ³、３．２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１６ｃｍ³）中のメチルＬ−２−メチルプロリネート塩酸塩２（０．４２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）およびＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシン（９８．５％）３（０．５２ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）の混合液に滴下添加した。生じた溶液を２０分間撹拌し、０℃の塩化メチレン（８ｃｍ³）中の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．５６ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加し、反応混合液を室温まで温め、さらなる２０時間撹拌した。生じた白い混合液をＣｅｌｉｔｅ（商標）パッドを通して濾過し、１，３−ジシクロヘキシル尿素を部分的に除去し、パッドを塩化メチレン（５０ｃｍ³）で洗浄した。濾液を１０％塩酸水（５０ｃｍ³）および飽和炭酸水素ナトリウム水（５０ｃｍ³）で連続して洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、真空下で濃縮し、乾燥させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（３５ｇ ＳｉＯ₂；３０〜７０％酢酸エチル−ヘキサン；勾配溶出）による残留物のさらなる精製は、白色半固体として１，３-ジシクロヘキシル尿素を含有する暫定的メチルＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリネート４（０．５６ｇ）を得た：Ｒ_f０．６５（ＥｔＯＡｃ）；ｍ／ｚ（ＥＩ＋）３３４．１５３４（Ｍ⁺。Ｃ₁₇Ｈ₂₂Ｎ₂Ｏ₅は３３４．１５２９を必要とする）および２２４（１，３−ジシクロヘキシル尿素）。

【0076】

１，４−ジオキサン（３３ｃｍ³）中の不純物を含むプロリネート４（０．５６ｇ、約１．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｍ水酸化ナトリウム水（１０ｃｍ³、１０ｍｍｏｌ）を滴下添加し、混合液を室温で１９時間撹拌した。塩化メチレン（１００ｃｍ³）を次に加え、飽和炭酸水素ナトリウム水（２×１００ｃｍ³）で有機層を抽出した。合わせた水層を塩酸酸（３２％）で注意深く酸性化し、塩化メチレン（２×１００ｃｍ³）で抽出し、合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、真空下で濃縮して乾燥させた。続いて生じた残留物（０．４７ｇ）のフラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製（１７ｇ ＳｉＯ₂；５０％酢酸エチル−ヘキサンから３０％メタノール−ジクロロメタン；勾配溶出）は、塩酸塩２からの２段階でＮ保護ジペプチド５（０．４５ｇ、６０％）を白色フォームとして与えた。ＮＭＲ分析により、ジペプチド５は専らトランス配向配座異性体であることが示された：
R_f 0.50 (20% MeOH - CH₂Cl₂); [α]_D -62.3 (c CH₂Cl₂中0.20); ν_max (フィルム)/cm^-1 3583, 3324 br, 2980, 2942, 1722, 1649, 1529, 1454, 1432, 1373, 1337, 1251, 1219, 1179, 1053, 1027, 965, 912, 735および698; δ_H (300 MHz; CDCl₃; Me₄Si) 1.59 (3H, s, Proα-CH₃), 1.89 (1H, 6本線, J 18.8, 6.2および6.2, Proβ-H_AH_B), 2.01 (2H, dtt, J 18.7, 6.2および6.2, Proγ-H₂), 2.25-2.40 (1H, m, Proβ-H_AH_B), 3.54 (2H, t, J 6.6, Proδ-H₂), 3.89 (1H, dd, J 17.1および3.9, Glyα-H_AH_B), 4.04 (1H, dd, J 17.2および5.3, Glyα-H_AH_B), 5.11 (2H, s, OCH₂Ph), 5.84 (1H, br t, J 4.2, N-H), 7.22-7.43 (5H, m, Ph)および7.89 (1H, br s, -COOH); δ_C (75 MHz; CDCl₃) 21.3 (CH₃, Proα-CH₃), 23.8 (CH₂, Proγ-C), 38.2 (CH₂, Proβ-C), 43.6 (CH₂, Glyα-C), 47.2 (CH₂, Proδ-C), 66.7 (四重線, Proα-C), 66.8 (CH₂, OCH₂Ph), 127.9 (CH, Ph), 127.9 (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 136.4 (四重線, Ph), 156.4 (四重線, NCO₂), 167.5 (四重線, Gly-CON)および176.7 (四重線, CO); m/z (EI+) 320.1368 (M⁺.C₁₆H₂₀N₂O₅は320.1372を必要とする).

【0077】

ジベンジルＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリル−Ｌ−グルタメート７
室温の窒素下で、トリエチルアミン（０．５０ｃｍ³、３．５９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６０ｃｍ³）中のジペプチド５（０．３６ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）およびＬ−グルタミン酸ジベンジルエステルｐ−トルエンスルホネート６（０．７３ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）の溶液に滴下添加し、反応混合液を１０分間撹拌した。ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢｏＰＣｌ、９７％）（０．３７ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を加え、無色溶液を１７時間撹拌した。塩化メチレン溶液を１０％塩酸水（５０ｃｍ³）および飽和炭酸水素ナトリウム水（５０ｃｍ³）で連続して洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、濾過し、真空下で蒸発させ、乾燥させた。反復（２×）フラッシュカラムクロマトグラフィー（２４ｇ ＳｉＯ₂；３０〜７０％酢酸エチル−ヘキサン；勾配溶出）による生じた残留物の精製は、完全に保護されたトリペプチド７（０．６３ｇ、８９％）を無色の油として与えた。ＮＭＲ分析により、トリペプチド７は専らトランス配向配座異性体であることが示された：
R_f 0.55 (EtOAc); [α]_D -41.9 (c CH₂Cl₂中0.29); ν_max (フィルム)/cm^-1 3583, 3353 br, 2950, 1734, 1660, 1521, 1499, 1454, 1429, 1257, 1214, 1188, 1166, 1051, 911, 737および697; δ_H (400 MHz; CDCl₃; Me₄Si) 1.64 (3H, s, Proα-CH₃), 1.72 (1H, dt, J 12.8, 7.6および7.6, Proβ-H_AH_B), 1.92 (2H, 5本線, J 6.7, Proγ-H₂), 2.04 (1H, 6本線, J 7.3 Gluβ-H_AH_B), 2.17-2.27 (1H, m, Gluβ-H_AH_B), 2.35-2.51 (3H, m, Proβ-H_AH_BおよびGluγ-H₂), 3.37-3.57 (2H, m, Proδ-H₂), 3.90 (1H, dd, J 17.0および3.6, Glyα-H_AH_B), 4.00 (1H, dd, J 17.1および5.1, Glyα-H_AH_B), 4.56 (1H, td, J 7.7および4.9, Gluα-H), 5.05-5.20 (6H, m, 3 x OCH₂Ph), 5.66-5.72 (1H, br m, Gly-NH), 7.26-7.37 (15H, m, 3 x Ph)および7.44 (1H, d, J 7.2, Glu-NH); δ_C (100 MHz; CDCl₃) 21.9 (CH₃, Proα-CH₃), 23.4 (CH₂, Proγ-C), 26.6 (CH₂, Gluβ-C), 30.1 (CH₂, Gluγ-C), 38.3 (CH₂, Proβ-C), 43.9 (CH₂, Glyα-C), 47.6 (CH₂, Proδ-C), 52.2 (CH, Gluα-C), 66.4 (CH₂, OCH₂Ph), 66.8 (CH₂, OCH₂Ph), 67.1 (CH₂, OCH₂Ph), 68.2 (四重線, Proα-C), 127.9 (CH, Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.2, (CH, Ph), 128.3, (CH, Ph), 128.4, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 128.5, (CH, Ph), 135.2 (四重線, Ph), 135.7 (四重線, Ph), 136.4 (四重線, Ph), 156.1 (四重線, NCO₂), 167.3 (四重線, Gly-CO), 171.4 (四重線, CO), 172.9 (四重線, CO)および173.4 (四重線, CO); m/z (FAB+) 630.2809 (MH⁺.C₃₅H₄₀N₃O₈は630.2815を必要とする).

【0078】

グリシル−Ｌ−２−メチルプロリル−Ｌ−グルタミン酸（Ｇ−２−ＭｅＰＥ）
光から保護された水素雰囲気下の室温で、９１：９のメタノール−水（２２ｃｍ³）中の保護されたトリペプチド７（０．６３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）および１０重量％のパラジウム活性炭（０．３２ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）の混合液を２３時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）パッドを通して反応混合液を濾過し、７５：２５のメタノール−水（２００ｃｍ³）でパッドを洗浄した。減圧下で濾液を濃縮して乾燥させ、残留物を無水ジエチルエーテルで粉砕して、Ｇ−２−ＭｅＰＥおよび暫定的メチルアミン８（０．２７ｇ、８６％）の３８：１混合物を極めて吸湿性の白色固体として与えた。混合物の分析的逆相ＨＰＬＣ研究［Ａｌｔｅｃｈ Ｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ₁₈Ｓｉカラム、１５０×４．６ｍｍ、５μｍ；Ｈ₂Ｏ（０．０５％ＴＦＡ）で５分間洗い流し、その後ＭｅＣＮを溶出剤として１ｍｌ／分の流量で２５分間にわたる固定勾配；ダイオードアレイを使用して検出］は、それが、それぞれ２０７および１９７ｎｍで１３．６４および１４．４４分間の滞留時間を有する２つの溶出ピークの３８：１混合物であることを示した。¹Ｈ ＮＭＲ分析により、Ｇ−２−ＭｅＰＥは配座異性体の７３：２７のトランス：シス混合物であることが示された（比は、それぞれ主および副配座異性体のＧｌｕα−Ｈ陽子に帰属された、δ４．１８および３．７１での二重の二重項および三重項の相対強度から推定された）
融点144℃^φ; [α]_D -52.4 (c H₂O中0.19); δ_H (300 MHz; D₂O; 内部MeOH) 1.52 (3H, s, Proα-CH₃), 1.81-2.21 (6H, m, Proβ-H₂, Proγ-H₂およびGluβ-H₂), 2.34 (1.46H, t, J 7.2, Gluγ-H₂), 2.42^*(0.54H, t, J 7.3, Gluγ-H₂), 3.50-3.66 (2H, m, Proδ-H₂), 3.71^* (0.27H, t, J 6.2, Gluα-H), 3.85 (1H, d, J 16.6, Glyα-H_AH_B), 3.92 (1H, d, J 16.6, Glyα-H_AH_B)および4.18 (0.73H, dd, J 8.4および4.7, Gluα-H); δ_C (75 MHz; D₂O; 内部MeOH) 21.8 (CH₃, Proα-CH₃), 25.0 (CH₂, Proγ-C), 27.8^* (CH₂, Gluβ-C), 28.8 (CH₂, Gluβ-C), 32.9 (CH₂, Gluγ-C), 40.8 (CH₂, Proβ-C), 42.7 (CH₂, Glyα-C), 49.5 (CH₂, Proδ-C), 56.0^* (CH, Gluα-C), 56.4 (CH, Gluα-C), 69.8 (四重線, Proα-C), 166.5 (四重線, Gly-CO), 177.3 (四重線, Pro-CON), 179.2 (四重線, Gluα-CO), 180.2^* (四重線, Gluγ-CO)および180.6 (四重線, Gluγ-CO); m/z (FAB+) 316.1508 (MH⁺.C₁₃H₂₂N₃O₆は316.1509を必要とする).

【0079】

（例３）ｉｎ ｖｉｔｒｏ神経保護
異なる起源の神経細胞の神経変性へのそれらの影響を判定するために、ＧＰＥ類似体の治療効果を一連の実験においてｉｎ ｖｉｔｒｏで検討した。本明細書に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ系は当技術分野で確立されており、神経変性障害を患っているヒトでの効果を含む、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される神経保護効果の予測となることが公知である。

【0080】

材料および方法
以下の実験プロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｕｃｋｌａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたガイドラインに従った。
代謝された細胞培養上清の採取のための皮質星状神経膠細胞培養の調製
出産後１日目のラットからの１つの皮質半球を使用し、４ｍｌのＤＭＥＭに収集した。５ｍｌガラスピペットおよび１８ゲージ針を使用して粉砕を行った。１００μｍ細胞ストレーナーによって細胞懸濁液をふるい、５０ｍｌのＤＭＥＭで洗浄した（２５０ｇで５分間の遠心分離）。沈降物を、２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清に再懸濁した。懸濁液を２つの２５ｃｍ³フラスコ（フラスコ当たり１０ｍｌ）に加え、１０％ＣＯ₂の存在下において３７℃で培養し、続いて週に２回培地を交換した。細胞が集密に到達したとき、それらをＰＢＳで３回洗浄し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７に適合させ、さらに３日間インキュベートした。一時的保存のために、この上清を−８０℃で冷凍した。

【0081】

ラットＥ１８／Ｅ１９胚からの線条体および皮質組織の調製
母獣をＣＯ₂処理によって屠殺し、次に帝王切開のために準備した。手術の後、胚をそれらの羊膜腔から取り出し、断首した。頭部は、線状体のためにはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、皮質のためにはＰＢＳ＋０．６５％Ｄ（＋）−グルコース中の氷上に置いた。

【0082】

細胞の線条体組織抽出手順および調製
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、完全な脳を腹部側を上向きにして頭蓋から取り出した。立体顕微鏡下で線状体を両半球から切り裂き、線条体組織を氷上のファルコンチューブに入れた。次にＰ１０００ピペッタを使用して、線条体組織を１ｍｌの容量に粉砕した。交互排出の剪断力を用いて、ピペットチップ内で溶液を約１５回上下に優しくピペット操作することによって組織を粉砕した。組織断片は、３０秒以内にファルコンチューブの底に沈殿した。次に、解離した単細胞の懸濁液を含有する上清を、氷上の新しい無菌ファルコンチューブに移した。それらを過剰に粉砕することによって既に解離した細胞を過度に傷つけるのを避けるために、組織断片を再び粉砕した。第１の管の組織断片に１ミリリットルの氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、前の通りに粉砕した。組織断片を沈殿させ、上清を氷上の新しい無菌ファルコンチューブに取り出した。４℃で５分間、細胞を２５０ｇで遠心分離した。
線条体細胞の平板培養および培養
ポリ−Ｌ−リジン（０．１ｍｇ/ｍｌ）をコーティングした９６ウェルプレート（内部の６０ウェルのみ）に、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に細胞数２００，０００／ｃｍ²の密度で、線条体細胞を平板培養した。５％ＣＯ₂の存在下、細胞を１００％湿度下の３７℃で培養した。１日目、３日目および６日目に培地を交換した。
細胞の皮質組織抽出手順および調製
ＰＢＳ＋０．６５％Ｄ（＋）−グルコース含有ペトリ皿に、腹部側を上側にして２つの皮質半球をスパチュラによって完全な脳から注意深く取り出した。組織を固定するために皮質の吻側部分（嗅球の近く）に鉗子を入れ、側面に矢状方向の切り傷を２つつけて、パラホルムおよび嗅内皮質を取り出した。後部末端で前頭方向の切り傷をつけて、海馬構成体を取り出した。視覚皮質の領域１７／１８を捕えるために、最後の前頭切り傷は最後の切り傷から２、３ミリメートル離した。

【0083】

皮質をＰＢＳ＋０．６５％（＋）−グルコース中の氷上に置き、５分間３５０ｇで遠心分離した。上清を取り出し、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／０．５３ｍＭ）を３７℃で８分間加えた。等量のＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血清を加えることによって、反応を停止した。遠心分離および以降のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地での２回の洗浄によって、上清を取り出した。
１ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地中でガラス製のパスツールピペットで１回、その後２２ゲージ針を有する１ｍｌインスリンシリンジを使用して２回、細胞を粉砕した。細胞懸濁液を１００μｍ細胞ストレーナーに通過させ、１ｍｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７培地によって洗い落とした。細胞を計数し、６０μｌ当たり細胞数５０，０００に調整した。

【0084】

皮質細胞の平板培養および培養
９６ウェルプレートを０．２ｍｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジンでコーティングし、その後ＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌラミニンでコーティングし、その後６０μｌの皮質星状神経膠細胞馴化培地を各ウェルに加えた。その後、６０μｌの皮質細胞懸濁液を加えた。１００％湿度下の３７℃で、細胞を１０％ＣＯ₂の存在下で培養した。１日目に、培地を全て交換し（１：１のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７および星状神経膠細胞馴化培地）、１μＭシトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（有糸分裂阻害剤）を添加した。２日目および５日目に、培地の２／３を交換した。

【0085】

Ｐ８動物からの小脳微小外植片：調製、培養および固定
２つの半球の積層小脳皮質をＰ８ラットから外植し、ＰＢＳ＋０．６５％Ｄ（＋）グルコース溶液中で小片に切り分け、２３ゲージ針で粉砕し、その後押圧で１２５μｍ孔径の篩に通した。得られた微小外植片を２回遠心分離し（培地交換）（６０ｇ）、無血清ＢＳＡ添加ＳＴＡＲＴＶ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）に入れた。培養のために、１００％湿度下の３４℃で、５％ＣＯ₂の存在下で、３５ｍｍサイズの６ウェルプレートに置かれた０．１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたカバーガラスの上に、４０μｌの細胞懸濁液を３時間接着させた。その後、１ｍｌのＳＴＡＲＴＶ培地を毒素および薬物と一緒に加えた。１００％湿度下の５％ＣＯ₂の存在下での培養の２〜３日後に、培養を監視（評価）した。細胞計数分析のために、パラホルムアルデヒドの上昇濃度（０．４％、１．２％、３％および４％で各々３分間）で培養を固定し、その後ＰＢＳで洗浄した。

【0086】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞への毒素および薬物投与ならびにデータ分析
ＧＰＥ類似体の神経保護効果を研究するために、神経細胞に毒性損傷を引き起こすためにオカダ酸を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで一連の実験を実行した。オカダ酸は、ニューロンへの損傷を引き起こすことが公知である、当技術分野で認知された毒素である。さらに、オカダ酸による損傷の後の神経細胞または神経細胞機能の回復は、他の毒素によって引き起こされる損傷からの回復の予測となると認識されている。
ニューロンに毒性の損傷を引き起こすために、１：１００部の３０ｎＭまたは１００ｎＭの濃度のオカダ酸および０．５ｍＭの３−ニトロプロピオン酸にューロンを曝露させた（小脳微小外植片のためにだけ）。皮質培養のためにｉｎ ｖｉｔｒｏで８日目（ＤＩＶ）に、線条体培養のために９ＤＩＶに、ＧＰＥ（１ｎＭ−１ｍＭ）またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１ｎＭ−１ｍＭ）を使用した。インキュベーション時間は、２４時間であった。生存率は、マルチウェルプレートリーダーでの５９５ｎｍでの比色エンドポイントＭＴＴアッセイによって判定した。小脳微小外植片のために、最も高い細胞密度を有する４つのウィンドウ（０．６５ｍｍ²の視野）を選択し、神経突起増生を示す細胞を計数した。

【0087】

結果
ＧＰＥ類似体Ｇ−２−ＭｅＰＥは、全ての３つの試験したｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、同等の神経保護効果を示した（図１２〜１５）。
皮質培養は１０μＭ濃度のＧＰＥ（図１２）またはＧ−２−ＭｅＰＥ（１０μＭ、図１３）に応答し、神経保護はそれぞれ６４％および５９％であった。
培養の他の２つのタイプは、Ｇ−２−ＭｅＰＥのより低い用量で神経保護を実証した（小脳微小外植片：図１４および線条体細胞：図１５）。線条体細胞は、Ｇ−２−ＭｅＰＥの１ｎＭ〜１ｍＭの範囲内で神経保護を実証し（図１５）、出産後の小脳微小外植片は約１ｎＭ〜約１００ｎＭの用量範囲内でＧ−２−ＭｅＰＥによる神経保護を実証した（図１４）。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥは神経保護剤であり、神経変性障害を患っているヒトで治療効果を示すことができると結論づける。培養でニューロンに直接に投与されるときＧ−２−ＭｅＰＥは神経を保護することができるので、罹患動物の脳に直接に投与されるとき、そのＧ−２−ＭｅＰＥはｉｎ ｖｉｖｏで有効性を示すことができる。
（例４）加齢ラットでの線条体コリン作動性ニューロンへのＧ−２−ＭｅＰＥの影響
Ｇ−２−ＭｅＰＥがコリン作動性ニューロンに影響を及ぼすことができるかどうか判定するために、加齢ラットを研究した。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）は、コリン作動性神経のための神経伝達物質アセチルコリンの生合成に関与する酵素である。ＣｈＡＴの免疫検出は、組織に存在するコリン作動性神経の数を判定するのに使用することができることは周知である。存在するコリン作動性神経の数が、脳でのコリン作動性神経路の生理機能に関連していることも周知である。
この実験では、１８ヶ月齢のラットの脳での、ＣｈＡＴ陽性ニューロンの数へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を試験した。

【0088】

方法
１８ヶ月齢雄ラットは、５つの処置のうちの１つを受けた。対照群は基剤（食塩水だけ、ｎ＝４）で処置され、４群はＧ−２−ＭｅＰＥの単一用量で処置された。０．０１２（ｎ＝４）、０．１２（ｎ＝５）、１．２（Ｉｎ＝５）および１２ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）の用量が、それぞれ皮下に与えられた。薬物処置の３日後に過量のペントバルビタールでラットを屠殺した。正常食塩水および４％パラホルムアルデヒドで脳を潅流し、潅流固定剤で一晩固定した。組織が沈むまで、０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５％スクロースに脳を保存した。線状体の凍結冠状切片をマイクロトームで切り、４℃で０．１Ｍ ＰＢＳ中の０．１％アジ化ナトリウムに保存した。遊離浮遊切片法を使用する染色によって、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の免疫反応性を確立した。簡潔には、抗体を１％ヤギ血清で希釈した。免疫組織化学染色の前に、４℃で一晩、切片を０．１Ｍ ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）中の０．２％トリトンにインキュベートした。５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂で、切片を２０分間前処置した。次に、振盪機の上で２日間、４Ｄ中のウサギ（Ｒｂ）抗ＣｈＡＴ（１：５０００）抗体（一次抗体）と切片をインキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ（商標）（１５分×３ｄ）を使用して切片を洗浄し、次に室温で一晩、ヤギ抗ウサギビオチン化二次抗体（１：１０００）とインキュベートした。切片を洗浄し、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ）（１：１０００）で３時間、続いて３、３−ジアミノベンジンテトラヒドロ塩化物（ＤＡＢ、０．０５％）中のＨ₂Ｏ₂（０．０１％）でインキュベートして、着色した反応生成物を生成した。これらの切片をクロムミョウバンでコーティングしたスライドの上にマウントし、乾燥させ、脱水してカバーをした。
光学顕微鏡および１ｍｍ２×１０００格子を使用して、ＣｈＡＴに対応する特異的免疫反応性を示す両方の半球の線条体ニューロンを計数した。計数のために使用した線条体領域のサイズは、イメージ分析装置を使用して測定した。ｍｍ²当たりのニューロン総数を、群の間で比較した。
データは対応のあるｔ検定を使用して解析し、平均±ＳＥＭで提示した。結果を、図１６に示す。

【0089】

結果
図１６は、Ｇ−２−ＭｅＰＥで処置した動物の脳でＣｈＡＴ免疫陽性ニューロン数が増加したことを示す。老齢ラットの脳でＣｈＡＴのレベルを増加させることにおいて、Ｇ−２−ＭｅＰＥの投与が有効なことをこれは明らかに示す。ＣｈＡＴはコリン作動性神経伝達物質アセチルコリンの合成に関与する酵素であるので、Ｇ−２−ＭｅＰＥが中央齢ラットの脳でコリン作動性伝達物質の量を増加させることができると結論づける。

【0090】

（例５）ラットでの空間参照記憶へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響
Ｇ−２−ＭｅＰＥがＣｈＡＴを増加させることができ、したがってコリン作動性神経機能を向上させる能力を有することを実証したので、次に、Ｇ−２−ＭｅＰＥが認知および／記憶の年齢関連の変化の処置で役立つことができるかどうか検討した。したがって、記憶のための確立された検査を使用して、ラットで一連の研究を実行した。
実験１：モリス水迷路検査
モリス水迷路検査は、ラットで空間参照記憶を評価するためのよく認知された検査である。
対象
１２、８または４ヶ月齢の雄ウィスターラットを使用した。

【0091】

方法
試験環境および機器
モリス水迷路検査は、無毒の色素で黒に着色した水を２５ｃｍの深さまで満たした黒いプラスチックプールを使用して実行した。壁も均一な黒色に見えるように、プールは円形の黒い挿入片を有した。プールの中央で交差する２つの想像上の直角の線によって、プールを４つの四半部（東西南北）に分けた。水面下２ｃｍにあって見えないように、金属プラットホームをプールの端から５０ｃｍのＳＥ四半部の地理的中心に置いた。訓練を通して、プラットホームはその位置のままであった。

【0092】

プラットホームに進むためにラットが使用することができる余分の迷路手がかり（すなわち部屋内のプールを囲むオブジェクト）を、実験で使用した。特徴のあるポスターまたは絵を、壁に掛けた。部屋内の家具は、検査期間中移動しなかった。プールの配置は、実験者による各方面からのそれへの容易なアクセスを可能にした。検査の間は毎日、プールを空にし、２５℃±２℃の水で再び満たした。
プールの最も遠い点（実験者の位置に対して）は「北」と命名し、他の方位点「東」、「南」および「西」はそれぞれプールの右端、底および左端の点であった。これらの点は、プールの外側にテープで印を付けた。

【0093】

習得期間（Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｐｈａｓｅ）
各群のラットは、水中のプラットホームまで泳ぐように訓練された。
ラットは、４日連続で１日当たり６回の６０秒試験を受けた。試験は、４つの出発位置（北、南、東、西）の１つのプールの壁に面している水にラットを入れることから始まった。任意の所与の試験の出発位置が前の試験のそれと異なるように、出発位置の順序は疑似ランダム的に選択し、いかなる出発位置も毎日の訓練中に２度より多く使用されなかった。所与の日に全てのラットについて位置の同じ順序を使用したが、日によって異なった。ラットがプラットホームを発見したとき、または６０秒経過したときのいずれか早いときに試験は終了した。試験は、ストップウォッチで計時した。ラットがプラットホームを発見した場合は、ラットをそこに１５秒間留まらせた後に保持容器に移動させた。プラットホームを発見しなかった場合は、ラットを手動でそこに導き、１５秒間プラットホームに置いた。試験と試験の間隔は６０秒であった。試験間のいかなる干渉も最小にするために、保持容器にはカバーをした。ラットの毎日の検査の終了時に、動物をタオルで乾燥させ、被毛が乾燥するまで保持バケツ内の暖房ランプの下に置いた。プラットホームを見つけるために要した時間（潜伏時間、秒）を、各訓練試験の各ラットについて得た。所与の試験でラットがプラットホームを発見しなかった場合は、それらの潜伏時間スコアはその試験の最大長（６０秒）であった。

【0094】

薬物処置
習得期間の完了から３日後に、薬物または基剤を１週または３週の間連続的に注入するために、ハロセン麻酔の下で皮下にミニ浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を植え込んだ。注入の完了時に、ポンプを取り出し、傷を再縫合した。
５つの処置群は以下の通りであった：
１．食塩水１週間（ｎは当初７であったが、体重が急減した１匹のラットは除外され、下垂体腫瘍があったことが後に見出された）；
２．食塩水３週間（ｎ＝８）；
３．Ｇ−２−ＭｅＰＥ低用量（０．９６ｍｇ／日）１週間（ｎ＝８）；
４．Ｇ−２−ＭｅＰＥ低用量（０．９６ｍｇ／日）３週間（ｎ＝８）；
５．Ｇ−２−ＭｅＰＥ高用量（４．８ｍｇ／日）３週間（ｎ＝７）。
４ヶ月齢（ｎ＝３）および８ヶ月齢（ｎ＝９）の対照ラットは、薬物処置を受けなかった。いかなる薬物を受ける前に群の平均成績がほぼ同等であるように、習得中のそれらの水泳時間に基づいて１２ヶ月齢ラットを５群のうちの１つに割り当てた。

【0095】

保持（参照記憶）期間
元のプラットホーム位置を記憶するか再学習するラットの能力を、元の訓練の４週後に検査した。これは、３週ポンプ注入の場合は最低７日間、１週ポンプ注入の場合は２１日間、残留薬物が洗い流されたであろうことを意味する。保持検査手順は、習得のそれと同一であった。薬物動態学的研究は、皮下投与されたＧ−２−ＭｅＰＥの血漿中濃度がほぼ一次動態学的パターンでピークまで上昇した後低下し、血漿中半減期（ｔ_1/2）は約３０〜６０分であったことを示す。したがって、保持研究が実施されるときまでに、Ｇ−２−ＭｅＰＥ含有ミニポンプを取り出してから少なくとも７日後に、Ｇ−２−ＭｅＰＥのほぼ全ては動物の循環から除かれていた。

【0096】

データ分析
習得および保持期間の日ごとの試験ごとに各ラットの水泳潜伏時間を記録し、期間中の変化は分散分析を使用して検討した。
３週間基剤および３週間高用量Ｇ−２−ＭｅＰＥを、習得および保持で比較した。３週にわたって与えられたＧ−２−ＭｅＰＥ高用量は、４週遅れの後に元の水迷路作業の保持を向上させた。

【0097】

結果
図１７は、対照として若齢対照（４ヶ月）を使用した、高用量（４．８ｍｇ／日）Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置および低用量（０．９６ｍｇ／日）処置加齢ラットおよび食塩水処置加齢ラットの間の比較を示す。Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置の前に、加齢（１２ヶ月齢）群の間に差はなかった。対照的に、プラットホームに到達するのに４ヶ月齢動物はより高齢の動物より少ない時間を必要とした。食塩水またはＧ−２−ＭｅＰＥのいずれかが投与された、検査のなかった３週間の後、習得期間の検査４日目および保持期間の検査１日目に必要とされた同様の時間に示されるように、食塩水だけを受けた動物は、プラットホームに到達する能力の向上を示さなかった。対照的に、高用量または低用量のＧ−２−ＭｅＰＥによる処置を受けた動物は、食塩水処置対照と比較して、プラットホームに到達するために必要とした時間の減少に反映される通り、記憶が向上した。さらに、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置動物は、４ヶ月齢若齢動物（図１７）および８ヶ月齢動物（データ示さず）と類似の成績を有した。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、若齢ラットに対して記憶欠陥を前に示していた中央齢ラット動物で記憶を向上させることができると結論づける。さらに、再検査するときまでにＧ−２−ＭｅＰＥは循環から洗い流されていたので、Ｇ−２−ＭｅＰＥの記憶増強効果はコリン作動性ニューロンの機能の向上による可能性があったと結論づける。

【0098】

実験２：８アーム放射状迷路検査
元の実験の５ヶ月後に、今では１７ヶ月齢のラットを、放射状アーム迷路で空間作業記憶について再検査した。
方法
機器
機器は、各々アームの先端に食糧カップを有する８本の同一のアームに連絡している中央のプラットホームからなる。
検査手順
放射状迷路手順の前から最後まで、少なくとも１０日間、ラットに部分的に食糧を与えなかった。
所定位置から実験者がラットの行動を明瞭に観察することができるように、迷路を組み立て、配置した。実験者は、それらの配向により迷路のアームを時計回りの方向で１から８まで番号をつけた。

【0099】

前訓練（薬物前）
１日目に、ドアをアームに挿入し、各ラットを５分間、２０個の食糧ペレットを置いた中央プラットホームに閉じ込めた。これは１日に１回、４日の間続き、ラットの全てはペレットの一部を消費するのが観察された。次の日、ラットを５分間全迷路を探索させた。全てのアームは各アームの先端に位置する食糧カップに２つの食糧ペレットを餌として置き、各アームの入口および中央部に１つのペレットを置いた。２つの連続セッションで８本未満のアームを探索したラットについては、これを少なくとも５日間、最高８日間繰り返した。全てのラットは、前訓練の９日目に最終セッションを受けた。この点で、９日のうちの８日に１本のアームだけに侵入した高齢ラットの１匹を、この手順の将来の検査から除外するべきであると決められた。さもなければ、それらが前訓練で実施した探索の量に関係なく全ラットが含まれた。高齢群の間で、最終前訓練セッションで侵入したアームの数に、統計的有意差はなかった（薬物：Ｆ（２，３１）＝０．４４、ｐ＝０．６５）。

【0100】

薬物処置
検査の３０日前（前訓練の５日後）に、３週間連続的に薬物を注入するために、１７匹の雄ウィスター系月齢ラットに皮下ミニ浸透ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を植え込んだ（ハロセン麻酔下）。注入の完了時に、ポンプを取り出して、傷を再縫合した（９日間、流失させた）。
処置群は以下の通りであった：
１．若齢対照（４ヶ月齢）、ｎ＝６；
２．食塩水ｎ＝１０；
３．Ｇ−２−ＭｅＰＥ低用量（２．４ｍｇ／ｋｇ／日）ｎ＝１３
４．Ｇ−２−ＭｅＰＥ高用量（１２．４ｍｇ／ｋｇ／日）ｎ＝５
食塩水および低用量群は、それらが１週間または３週間の処置を受けたか否かを問わず、この実験の第１相（ラットが１２ヶ月齢のとき）の処置を受けた全てのラットで構成される。食塩水および高用量群の各々の１匹のラットは、皮膚腫瘍のために落とされた。低用量ラットの１匹は、前訓練することができなかったという事実のために、この実験に加わらなかった（下記を参照する）。

【0101】

検査（薬物後）
作業記憶検査は、流出の９日目に開始した。ラットは、１２日間に１０回の毎日の訓練セッションを受けた。食糧カップに餌を置いたことだけ以外は、手順は前訓練の場合と同じであった。ラットは、８本のアームのいずれかを訪れることによって最高１６回の選択をするのに６分あった。選択とは、全ての４つの足がアーム内にあることと規定された。実験者は、ペンと紙でアーム侵入の順序を記録した。全ての８本のアームに侵入するか、１６回選択するか、または６分が経過した後に、セッションを終了した。全ての８本のアームに侵入するのに実際にかかった時間を記録した。

【0102】

データ分析
ラットが前に訪れていないアームに侵入したとき、アーム選択が正しいとみなした。成績は、以下のパラメータに従って毎日分類した：
１）正しい選択（ＣＣ）８〜１２は、選択した回数の総数で割り算した正しい選択の回数である。検査で全８本のアームの訪問に失敗した動物については、この比の分母は１２とみなされる。
２）有効な正しい選択（ＷＣＣ）８〜１２は、作業記憶データが導き出される尺度である。ＣＣ８〜１２について上で記載されるようにデータを収集したが、このパラメータについては、セッションで全８本のアームに侵入したラットだけが含まれた。
８本未満のアームに侵入したラットは、どのアームを前に訪問したかを記憶することができず、したがって、いかなる理由であれ迷路を探索しなかった動物に対して、検査を完了することができないほどの記憶障害を有していたので、作業記憶を確認するために使用されなかった。

【0103】

結果
ＣＣ８〜１２：１０日間にわたって全ての群による全般的な向上があった（Ｆ（９，３２４）＝４．０１、ｐ＜０．０００１）が、有意な群効果（Ｆ（３，３６）＝１．１９、ｎｓ）または群×日数相互作用（Ｆ（２７，３２４）＝１．０５、ｎｓ）はなかった（データ示さず）
ＷＣＣ８〜１２：図１８Ａは、１０日間の検査にわたる、ＷＣＣ８〜１２スコアによる習得プロファイルを示す。有意な群（Ｆ（３，１２）＝４．２７、ｐ＝０．０２９）および日数（Ｆ（９，１０８）＝２．０９、ｐ＝０．０３６）の効果があったが、これらの因子間の相互作用は有意でなかった（Ｆ（２７，１０８）＝１．０６、ｎｓ）。高用量Ｇ−２Ｍｅ−ＰＥ群は日数全体で最大の向上を示し、若齢対照が続いた。低用量Ｇ−２Ｍｅ−ＰＥと食塩水の間に、ごくわずかな差しかなかった。

【0104】

図１８Ｂは、高用量Ｇ−２−ＭｅＰＥ（ｎ＝５）に曝露させたラットは、基剤処置ラットと比較して、食糧ペレットを得るためにより多くの正しい侵入を行ったことを示す結果を示す（^*ｐ＜０．０５、ｎ＝１０）。この研究から、Ｇ−２−ＭｅＰＥは加齢ラットで空間記憶を向上させると結論づける。
（例６）Ｇ−２−ＭｅＰＥは、加齢ラットの脳で神経芽細胞増殖を増加させ、星状細胞増加症を低減させる
ニューロン変性はニューロン数の減少をもたらすことができるので、１つの望ましい治療目的は脳のニューロン数を増加させることである。ニューロンは、ニューロンより分化していない細胞である神経芽細胞から導かれるが、神経系統の中にある。一般的に、神経芽細胞は、明確な細胞体、神経突起（軸索および樹状突起）を有し、最終的に他のニューロン（例えば、シナプス）と接続する成熟した表現型に成熟させる条件に曝露させられる。したがって、神経芽細胞増殖の測定は、神経細胞増殖の周知の早期マーカーになっている。したがって、医薬用薬剤によって誘導される神経芽細胞の増殖の増加を検出することは、動物で神経細胞の成長を予測するための認められた方法である。ラットおよびヒトは神経細胞増殖で類似の機構を共有するので、ラットでの神経芽細胞増殖の変化のｉｎ ｖｉｖｏ検出は、ヒトでの類似の影響の予測となる。
認知機能障害の１つの組織学的相関物は、罹患動物の脳での星状細胞数の増加であることも知られている。したがって、神経芽細胞増殖を刺激すること、および星状細胞増加症を処置することにおいてＧ−２−ＭｅＰＥが役立つことができるかどうか判定するために、加齢ラットで一連の研究を実行した。

【0105】

方法および材料
免疫組織化学
これらの研究を実行するために、組織を固定してパラフィンに包埋し、標準的な方法を使用して切片を得た。海馬のレベルを含有する冠状切片（６μｍ）を切り、染色のためにクロムミョウバンでコーティングされたスライドの上にマウントした。切片をキシレンで脱パラフィンし、一連のエタノールで脱水し、０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートした。

【0106】

それぞれアポトーシスおよび増殖を経ている反応性グリア細胞および細胞に印を付けるために、グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対する一次抗体を使用した。抗原アンマスキング（カスパーゼ−３およびＰＣＮＡ染色）のために、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で切片を高パワーで１分間加熱した。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするために、５０％メタノール中の１％Ｈ₂Ｏ₂で３０分間全切片を前処理した。次に、非特異的なバックグラウンド染色をブロックするために、ＰＢＳ中の１．５％の規定ウマ血清または２．５％の規定ヒツジ血清を室温で１時間適用した。次に切片を以下の一次抗体とインキュベートした：モノクローナルマウス抗ＧＦＡＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ、１：５００に希釈）；マウス抗ＰＣＮＡ抗体（ＤＡＫＡ、Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ、１：１００に希釈）。４℃で２日間の一次抗体とのインキュベーションの後（一晩インキュベートしたＰＣＮＡ染色を除く）、切片をビオチン化ウマ抗マウスまたはヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００、Ｓｉｇｍａ）と４℃で一晩インキュベートした。使用の１時間前に調製したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標）（Ｓｉｇｍａ、１：２００）を室温で３時間適用し、次に０．０５％３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）およびＰＢＳ中で反応させて褐色の反応生成物を生成した。切片を一連のアルコールからキシレンで脱水し、マウント剤でカバーガラスをかぶせた。
若齢（４ヶ月齢）、中央齢（９ヶ月齢）および老齢のラット（１８ヶ月齢）の対照およびＧ−２−ＭｅＰＥ処置群からとられた脳試料で、免疫組織化学的染色を実施した。
インキュベーション溶液から一次抗体が除かれたこと以外は、対照切片を同様に処理した。ＰＣＮＡ陽性細胞の数を脳室下ゾーンで数え、ＧＦＡＰ陽性細胞は大脳皮質で評価した。

【0107】

実験１：Ｇ−２−ＭｅＰＥは、加齢ラットの脳で神経芽細胞増殖を刺激する
脳室下ゾーン（ＳＶＺ）および歯状回（ＤＧ）は、成人の神経形成を受け入れる２つの脳領域である。ＳＶＺおよびＤＧでの神経形成の低減は、加齢に伴う記憶減退と相関することが多く報告されており、記憶向上への神経成長因子および上皮成長因子の影響は、ＳＶＺの前駆体増殖の増加によることが報告されている。細胞増殖のマーカーとしてＰＣＮＡを使用して、ＰＣＮＡに陽性の細胞を計数することによって、ＳＶＺでの細胞増殖を調べた。選択された動物では、神経細胞特異的薬剤であるダブルコルチンで染色された通り、増殖細胞の少なくともいくつかは神経芽細胞と同定された。
１８ヶ月齢雄ラットを、Ｇ２−ＭｅＰＥの単一用量（０、０．０１２、０．１２、１．２、１２ｍｇ／ｋｇの用量）で腹腔内処置した。処置の３日後に脳を収集し、ＰＣＮＡおよびＧＦＡＰの免疫組織化学的染色を実施した。ＰＣＮＡ陽性細胞をＳＶＺで計数し、次に計数のために使用した心室壁の長さに従って細胞数を細胞数／ｍｍとして平均した（図１９Ａ）。最高用量（１２ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）で処置した群は、基剤処置群と比較してＰＣＮＡ陽性細胞数の有意な増加を示した（^*ｐ＜０．０５、ｎ＝７）。データは、神経形成の向上へのＧ−２ＰＥの用量依存的影響を示した。

【0108】

蛍光二重標識は、ＰＣＮＡと神経芽細胞のマーカーダブルコルチンとの共存を示した。図１９Ｂは、基剤処置ラット（左パネル）と比較した、Ｇ−２−ＭｅＰＥの最高用量（右パネル）で処置したラットでのＰＣＮＡ（緑、×２０）およびダブルコルチン（赤、×２０）の増加を示すラットの脳の一部の写真である。２つのマーカーが共存することが明らかになった（図１９Ｂ、写真、×１００）。Ｇ−２−ＭｅＰＥは神経芽細胞を含む脳細胞の増殖を刺激することができると、我々は結論づける。神経芽細胞はニューロンの前駆体細胞であるので、Ｇ−２−ＭｅＰＥは本発明の化合物で処置した動物の脳でニューロンの集団を増加させることができるとさらに結論づける。

【0109】

実験２：Ｇ−２−ＭｅＰＥは、中央齢ラットの脳のＳＶＺで、神経芽細胞増殖を刺激する
Ｇ−２−ＭｅＰＥ（１．２ｍｇ／ｋｇ）の影響を、９ヶ月齢の中央齢ラットで研究した。Ｇ−２−ＭｅＰＥ（１．２ｍｇ／ｋｇ）または基剤を、腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。ＰＣＮＡ免疫組織化学的染色を使用して、処置の３日後にＳＶＺでの細胞増殖を調べた。図１９Ｃは、Ｇ−２−ＭｅＰＥの処置の後の、ＰＣＮＡ陽性細胞数の有意な増加を示す（^**ｐ＜０．００５、ｎ＝４）。ＰＣＮＡで染色した増殖細胞のいくつかは神経芽細胞と同定された（上の実験１を参照）ので、Ｇ−２−ＭｅＰＥは中央齢ラットの脳で神経芽細胞増殖を刺激することができると結論づける。

【0110】

実験３：加齢脳での星状細胞増加症
高齢での星状神経膠細胞の機能不全は炎症を誘発する可能性があり、さらなるニューロン変性につながることを益々多くの証拠が示唆している。活性化星状神経膠細胞の上方制御はかなり報告されており、おそらく抑圧された内因性神経形成を通した、加齢に伴う記憶減退と密接に関連する。
反応性星状神経膠細胞のマーカーとしてＧＦＡＰを使用して、Ｇ−２ＭｅＰまたは基剤で処置した加齢ラットの海馬のＣＡ４小領域でＧＦＡＰ陽性細胞を計数した。加齢動物の海馬（図２０Ａ）および大脳皮質で、反応性星状神経膠細胞の有意な増加を見出した。星状神経膠細胞のいくつかは、若齢（^*ｐ＜０．０１）および中央齢ラット（^*＃ｐ＜０．０１）と比較して、老齢ラットでの毛細管と関連した（図２０Ｂの写真、矢印）。
脈管構成要素の一部として、ＧＦＡＰ陽性の星状神経膠細胞は血管形成で役割も果たし（図２０Ｂ、矢印）、脳での炎症性応答にも寄与する。したがって、老齢の脳で見られる上昇したＧＦＡＰ星状神経膠細胞は、脳変性の慢性期を示すことができる。

【0111】

実験４：Ｇ−２−ＭｅＰＥは、老齢の脳で星状細胞増加症を低減する
老齢ラットの海馬のＣＡ４小領域で、星状細胞増加症へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響も評価した。１８ヶ月齢雄ウィスターラットを、以下の通りに５つの処置群に割り当てた：基剤、０．１２ｍｇ／ｋｇ／日、０．１２、１．２および１２ｍｇ／ｋｇ／日（各々ｎ＝６）。
コンピュータプログラム（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １）を使用して、ＧＦＡＰ陽性細胞を計数した。結果を、図２０Ｃおよび２０Ｄに示す。Ｇ−２−ＭｅＰＥを腹腔内に投与し、ＧＦＡＰ陽性細胞の数を注射の３日後に調べた。視覚的スコアリング系（０＝星状神経膠細胞なし、１＝少数の星状神経膠細胞、２＜５０％、３＞５０％）を使用して、５つの異なる皮質領域で星状神経膠細胞の数を推定した。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、特に０．１２および１２ｍｇ／ｋｇの用量で処置した群で、基剤処置群と比較して海馬のＣＡ４領域で反応性星状神経膠細胞数を低減した（図２０Ｃ；^*ｐ＜０．０５）。類似の効果が、大脳皮質でのＧ−２−ＭｅＰＥについて観察された（図２０Ｄ）。

【0112】

通例、ラット脳の皮質の深葉に位置するＧＦＡＰ陽性の星状神経膠細胞はわずかしかなく、存在するものは通常白質トラックと密接に関連している。しかし、ＧＦＡＰ陽性の細胞が、血管と密接に関連して皮質の中間層にあることが見出された。
本明細書で提供される研究の結果は、加齢が脳でのいくつかの変化に関連していることを示す。第１に、年齢依存性の記憶喪失および認知機能の喪失がある。第２には、年齢依存性の星状神経膠細胞の増加がある。ラットでのこれらの知見の全ては互いと、ならびに実験動物およびヒトでの認知機能および記憶の維持におけるコリン作動性神経の公知の役割と一貫している。

【0113】

予想外なことに、老齢動物に送達されたＧＰＥ類似体Ｇ−２−ＭｅＰＥは、上の年齢関連の変化の全てを少なくとも部分的に逆戻りさせることを見出した。第１に、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、神経毒オカダ酸または３−ＮＰに曝露させた動物の脳細胞に存在するＣｈＡＴの量を増加させる。Ｇ−２−ＭｅＰＥのこの影響は、周知の神経保護薬剤ＧＰＥのそれを模倣した。これらの影響は、皮質細胞、小脳細胞および線条体細胞で見られ、これらの影響が脳の異なる部分に広範囲にわたることを示す。第２には、Ｇ−２−ＭｅＰＥは線状体でＣｈＡＴを増加させ、コリン作動性ニューロンがＧ−２−ＭｅＰＥに感受性であることを示す。これらの観察された化学的および組織学的変化は、行動の変化と平行していた。Ｇ−２−ＭｅＰＥで処置した老齢動物は、基剤処置対照と比較して２つの周知の検査系で記憶の向上を示した。次に、Ｇ−２−ＭｅＰＥは加齢脳で神経芽細胞増殖を誘導した。最後に、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、加齢脳の海馬および皮質で観察された星状細胞増加症の増加を逆戻りさせた。本明細書で引用した研究の多くでは、検査への薬物送達の停止から十分な時間が経過し、存在する薬物はほとんどなかった可能性があることから、Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響は、薬剤の急性効果によるものではなかった。

【0114】

（例７）ＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの薬物動態の比較
これらの研究の目的は、標準的な薬物動態学的方法を使用して、動物でＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの薬物動態プロファイルをｉｎ ｖｉｖｏで比較することであった。

【0115】

方法
ＧＰＥおよびＧ２ＭｅＰＥの薬物動態を判定するために、１８０〜２４０ｇの重さの成体雄ウィスターラットを使用した。静脈内ボーラス注射および血液試料採取を促進するために、実験の３日前にハロセン麻酔の下で全てのラットに留置頸静脈カニューレを外科的に植え込んだ。６匹のラットの群に、０．１Ｍコハク酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した３０ｍｇ／ｋｇ ＧＰＥまたは１０ｍｇ／ｋｇ Ｇ２ＭｅＰＥのいずれかの単一の静脈内ボーラス注射を与えた。ＧＰＥまたはＧ２ＭｅＰＥの注射の１０および０分前、ならびにＧＰＥまたはＧ２ＭｅＰＥの注射の１、２、４、８、１６、３２、６４および１２８分後に、哺乳動物組織のためのＳｉｇｍａプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するヘパリン処置した管に、血液試料（各約２２０μｌ）を収集した。４℃で１５分間、３０００ｇで試料を遠心分離し、血漿を取り出し、抽出および放射線免疫検定法（「ＲＩＡ」）または逆相ＨＰＬＣによるアッセイまで−８０℃で保存した。使用したＲＩＡおよびＨＰＬＣ方法は従来通りであった。
単一の静脈内ボーラス注射の後の薬物排泄は、式Ｃ＝Ｃ₀ｅ^-ktに従う一次過程であることが見出され、式中、Ｃは任意の時点での薬物濃度を表し、Ｃ₀は時間（ｔ）がゼロに等しいときの濃度であり、ｋは１時間当たりの濃度の単位で表した一次速度定数である。ｋおよび半減期（ｔ_1/2）は、Ｌｏｇ Ｃ＝−ｋｔ／２．３＋ｌｏｇ Ｃ₀のように、血漿中濃度対時間の片対数グラフの排泄段階での、線形回帰直線の勾配から計算された。結果は、平均±標準誤差で表した。

【0116】

結果
図２１は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射の後のＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥのｉｎ ｖｉｖｏ血漿中濃度のグラフを示す。黒四角は各時点でのＧＰＥの濃度を表し、黒三角は各時点でのＧ−２−ＭｅＰＥの濃度を表す。
ＧＰＥおよびＧ−２−ＭｅＰＥの血漿中濃度は、注射から１分間以内に著しく増加した。３０ｍｇ／ｋｇのＧＰＥの注射の後、４０．０±１０．８ｍｇ／ｍｌのピーク濃度が観察された。ＧＰＥの血漿中濃度は、その後一次動態学的過程に従って速やかに低下した。ＧＰＥの一次速度定数は０．１５±０．０１４ｎｇ／ｍｌ／分であると見出され、ｔ_1/2は４．９５±０．４３分であると見出され、血漿からのＧＰＥの推定クリアランスは１３７．５±１２．３ｍｌ／時間であると見出された。

【0117】

１０ｍｇ／ｋｇのＧ−２−ＭｅＰＥの注射の後、ピーク濃度は１９１±１６．１ｍｇ／ｍｌであると見出された。Ｇ−２−ＭｅＰＥの血漿中濃度は、その後一次動態学的過程に従って低下した。Ｇ−２−ＭｅＰＥの一次速度定数は０．０３３±０．００１ｎｇ／ｍｌ／分であると見出され、ｔ_1/2は２０．７±０．３５分であると見出され、推定クリアランスは３０．１±０．５ｍｌ／時間であると見出された。
注射の後、送達されたＧ−２−ＭｅＰＥの用量（１０ｍｇ／ｋｇ）と比較して送達されたＧＰＥのより高い用量（３０ｍｇ／ｋｇ）にもかかわらず、Ｇ−２−ＭｅＰＥの最大血漿中濃度はＧＰＥの最大血漿中濃度より約４．８倍高かった。
Ｇ−２−ＭｅＰＥのより低い送達用量にもかかわらず、１２５分未満の全ての時点でＧＰＥよりＧ−２−ＭｅＰＥの血漿中濃度が高いとの知見は、ＧＰＥの公知の血漿中濃度に基づくと全く予想外であった。Ｇ−２−ＭｅＰＥのｔ_1/2は、ＧＰＥのｔ_1/2より４倍以上長かった。

【0118】

ＧＰＥのそれと比較したＧ−２−ＭｅＰＥの半減期の増加に関する知見は、ＧＰＥのｔ_1/2に基づくと完全に予想外であった。Ｇ−２−ＭｅＰＥのｔ_1/2の増加は、Ｇ−２−ＭｅＰＥが循環からより遅く排除されることを意味する。この知見は、ＧＰＥのクリアランス速度に基づくと全く予想外である。

【0119】

これらの研究から、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、ヒトを含む動物の脳で加齢の有害作用の多くを逆戻りさせることが可能である、強力な薬剤であると結論づける。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥを含むＧＰＥ類似体は、神経保護、記憶の向上、神経芽細胞増殖の増加および星状細胞増加症の低減を含む望ましい治療効果をもたらすことができ、ヒトで加齢の有害作用を逆戻りさせるか軽減することにおいて役立つことができる。
本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載したが、本出願に記載される状態のために本発明の化合物の同等物を調製し、投与することができることは、その知識およびこの開示に関係がある分野の当業者に明らかになり、全てのそのような同等物は、本出願の請求項の範囲に含まれるものとする。

【0120】

（例８）レット症候群の処置Ｉ
レット症候群（ＲＴＴ）モデルにおける寿命および長期増強へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置がレット症候群の発達および進行に影響を与えることができるかどうかをその障害のマウスモデルで判定するために、ヘミ接合性ＭｅＣＰ２（１ｌｏｘ）雄マウスを使用した。ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＭｅＣＰ２−ＫＯ）マウス系は、ヒト障害、レット症候群に特徴的な生理的および神経学的異常の範囲および重症度を厳密に模倣するとして、当技術分野で広く認められる。

【0121】

全ての実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで実施され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに承認された。Ｇ−２−ＭｅＰＥはＡｌｂａｎｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）によって合成され、Ｎｅｕｒｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｉｍｉｔｅｄによって供給された。

【0122】

方法
処置
ヘミ接合性ＭｅＣＰ２（１ｌｏｘ）雄マウスを、２０ｍｇ／ｋｇ／日のＧ−２−ＭｅＰＥまたは食塩水で処置した（０．０１％ＢＳＡ、生存実験では１群当たりｎ＝１５、ＬＴＰ実験ではｎ＝２０）。処置は、生後４週から腹腔内に投与した。生存実験のために、処置は実験期間を通して維持された。ＬＴＰ実験のために、マウスを９週目まで処置し、その時点で切片調製のために使用した。
生存
ＭｅＣＰ２欠損変異マウスは、約４〜６週齢でＲＴＴ症状を起こし、１０〜１２週で死ぬ（Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331）。野生型対照およびＭｅＣＰ２欠損動物の生存を、基剤処置およびＧ−２−ＭｅＰＥ処置群で比較した。生存は処置の開始（４週）から毎週測定し、各毎週の区間（ｘ軸）に生存したマウスの割合（ｙ軸）を示すために、カプランマイアー生存曲線を生成するために使用した（図２２を参照）。

【0123】

長期増強（電気生理）
ＭｅＣＰ２欠損マウスは、機能的および超微細構造的シナプスの機能不全、海馬依存性記憶および海馬長期増強（ＬＴＰ）のかなりの障害を患うことが以前に報告されている（Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1):319-327）。ＲＴＴモデルでシナプスの機能へのＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響を検査するために、基剤およびＧ−２−ＭｅＰＥで処置した９週齢の動物で海馬ＬＴＰを比較した。そうするために、食塩水またはＧ−２−ＭｅＰＥで処置したＭｅＣＰ２欠損マウスからの海馬の切片のニューロンで、ベースライン電位の％としてのｆＥＰＳＰの勾配を測定した（図２３）。

【0124】

結果
図２２は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置がＭｅＣＰ２欠損マウスの生存を増加させたことを示す。野生型マウス（上の線）は対照動物であり、したがってそれらの生存は各時点で１００％であった。食塩水だけで処置したＭｅＣＰ２欠損マウスは、野生型マウスより非常に速やかに死に（点線）、その結果、約１１週までにＭｅＣＰ欠損マウスのわずか５０％が生存した。しかし、驚くほど対照的に、Ｇ−２−ＭｅＰＥで処置したＭｅＣＰ２欠損マウスは、食塩水処置マウスより実質的に長く生存することを予想外に見出した。約１５週後に、動物の５０％は生存した。初期に提示されたデータは、ＭｅＣＰ２マウスが生存に関して影響を受け、その結果、未処置の場合には動物の５０パーセントが１１週までに死んでいたことを示した。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置動物は向上した生存を示し、５０パーセントが１６週で死んでいた。この研究では、寿命データは一貫しない獣医学的処置によって損なわれ、その結果、マウスは一貫してそれらの歯を削らなかったが、これは、実験の開始時に認知されなかったｍｅｃｐ２マウスの必要条件である。結果は、レット症候群に無関係な早期の動物死が観察された（特に対照群で）。データの再調査は、対照群を再実行したときに、群での差がより小さいとはいえ、Ｇ−２−ＭｅＰＥの効果が持続することを示した（５０パーセント死までの時間は対照で１３．５週、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置動物では１６週）。ｍｅｃｐ２マウスのＧ−２−ＭｅＰＥ処置によって、安全性の懸念は提議されなかった。
これらの結果は、Ｇ−２−ＭｅＰＥがＭｅＣＰ２欠損マウスの生存を実質的に増加させることができることを実証する。ＭｅＣＰ２欠損マウスはレット症候群のヒトでの病理および治療効力の予測となるので、Ｇ−２−ＭｅＰＥがレット症候群を有するヒトの寿命を長くすることができると結論づける。

【0125】

図２３は、食塩水処置した変異マウスと比較してＭｅＣＰ２欠損動物でｆＥＰＳＰ勾配によって測定したときに、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置が海馬の長期増強（ＬＴＰ）を増加させたかどうか判定するための研究の結果を示す。図２３に示すように、予想外にも、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、食塩水だけで処置した動物と比較してＭｅＣＰ２欠損マウスでｆＥＳＰＳの勾配を増加させることを見出した。
これらの結果は、ＭｅＣＰ２欠損マウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置でＧ−２−ＭｅＰＥが役立つことができることを実証した。ＭｅＣＰ２欠損マウスはレット症候群のヒトでの病理および治療効力の予測となるので、Ｇ−２−ＭｅＰＥがレット症候群を有するヒトのための有効な療法となることができると結論づける。
（例９）Ｇ−２−ＭｅＰＥは樹状突起の分枝を向上させ、樹状突起棘を長くする
樹状突起へのＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響を評価する。トランスジェニックｍｅｃｐ２ノックアウトマウス（ｎ＝１５〜２０）に、Ｇ−２−ＭｅＰＥを腹腔内に１日１回、２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。屠殺後、下の表１に従って、９週後にゴルジ染色の後に樹状突起棘密度、棘の長さおよび分枝を調べた：

【0126】

【表1】

【0127】

樹状突起の長さは、食塩水（３匹の別々のマウスから３つのニューロンを分析した、ｎ＝９）またはＧ−２−ＭｅＰＥ（第４週から２０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．１／日；３匹の別々のマウスから３つのニューロンを分析した、ｎ＝９）で処置した９週齢雄ｍｅｃｐ２無突然変異マウスからの代表的な海馬ＣＡ１ニューロンの細胞体からの距離によって評価した。
Ｇ−２−ＭｅＰＥは樹状突起の分枝を向上させ、樹状突起棘を長くすることが観察された。図２４は、この研究の結果を表す。μｍで表した樹状突起の長さ（縦軸）を、細胞体からの距離（μｍ；水平軸）に対してプロットする。細胞体の近くに樹状突起がある細胞の場合、樹状突起は短かった。しかし、細胞体からの距離が増加するに従って、食塩水処置（白四角）は、細胞体から７０μｍの距離の最大値まで増加し、細胞体からさらに離れた距離に低下した樹状突起長を生成した。対照的に、Ｇ−２ＭｅＰＥ（黒四角）による処置は、細胞体からの距離の範囲の多くにわたって、より長い樹状突起を生成した。

【0128】

（例１０）マウスでのレット症候群の処置ＩＩ
マウスの交配および遺伝子タイピング
ＭｅＣＰ２生殖細胞系無対立遺伝子マウスを使用する（Chen et al., 2001）。遺伝子タイピングは、Chen et al.（Chen et al., 2001）の通りに実施する。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置
生存測定、夜間の活動分析およびイムノブロット分析のために、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（Ａｌｂａｎｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）によって合成され、Ｎｅｕｒｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｉｍｉｔｅｄによって提供された）を腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ、基剤＝食塩水、０．０１％ＢＳＡ）により毎日投与する。処置はＰ１５から始まり、実験中維持される。細胞内生理実験のために、Ｐ１５からそれらが急性切片調製のために使用されるＰ２８〜Ｐ３２まで、２週の間毎日マウスをＧ−２−ＭｅＰＥ（２０ｍｇ／ｋｇ体重、基剤＝食塩水、０．０１％ＢＳＡ）で注射する。光学式画像化実験のために、まぶた縫合の日から画像化の日まで毎日マウスをＧ−２−ＭｅＰＥ（２０ｍｇ／ｋｇ体重、基剤＝食塩水、０．０１％ＢＳＡ）で注射する。

【0129】

切片生理学調製
ビブラトームを使用して＜４℃ ＡＣＳＦで、知覚運動皮質当たりの冠状切片（３００μｍ厚）を切る。スライシングから２０分間は３７℃で、実験の残り期間中は室温で、切片をインキュベートする。切片をＷａｒｎｅｒチャンバーに移し、層５に位置する視覚的に同定された錘体神経から記録をとる。１２６ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＮａＨＰＯ４、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２ｍＭ ＣａＣｌ２および１４ｍＭブドウ糖を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を３１５〜３２０ｍＯｓｍおよびｐＨ７．４に調整し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で泡立たせる。細胞内ピペット溶液は、１００ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ ＮａＧＴＰおよび１０ｍＭ Ｎａ−ホスホクレアチンを含有した。

【0130】

細胞内完全細胞記録
Ｓｕｔｔｅｒ Ｐ−８０プラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホウ珪酸塩ピペット（３〜５ＭΩ、ＷＰＩ）を抜く。赤外線ＤＩＣオプティクス（Ｚｅｉｓｓ）を有するＡｃｈｒｏｐｌａｎ ４０×水浸レンズで細胞を可視化し、ビデオモニタに投影される赤外線カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）で検出する。ＢＮＣ−２１１０コネクタブロックおよびＭシリーズ二重チャネル収集カード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続されているＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）に記述されているカスタム収集およびリアルタイム解析ソフトウェアによって、実験を進めた。ギガシールおよび破裂を達成し、低レベルのリークおよび直列抵抗について完全細胞記録を連続的に検証する。各記録のために、入力および直列抵抗を測定するために５ｍＶ試験パルスを約１０回電圧固定で加える。その後、誘発ファイヤリング速度および細胞興奮性を数量化するために、電流固定で約１０回のパルス（５００ミリ秒、１０ｐＡインクリメントで４０〜１４０ｐＡ）を加える。アクセス抵抗性、リークおよび細胞内在性の興奮性が、群を横断して一貫していることを検証する。最後に、−６０ｍＶの電圧固定下の自発的なＥＰＳＣを１０ｋＨｚでサンプリングし、低域通過を１ｋＨｚでフィルタリングする。Ｍａｔｌａｂに記述されたカスタムソフトウェアパッケージを使用して分析を実施し、全ての事象は自動化された閾値によって検出され、各事象について実験者によって個々に盲目的に検証される。

【0131】

ゴルジ染色
Ｐ２８マウスからの試料（＜１ｃｍ）を、１０％ホルマリンおよび３％重クロム酸カリで２４時間固定する。次に、室温の暗所の２％硝酸銀に２日間、組織を移す。次に、これらの試料からの切片を５０μｍ厚で切り、蒸留水に入れる。運動皮質に対応する切片をスライドの上にマウントし、１０分間空気乾燥させ、次に９５％アルコール、１００％アルコールおよびキシレンの逐次的なすすぎを通して脱水し、次にカバーガラスで密封した。Ｚｅｉｓｓ Ｐａｓｃａｌ ５ Ｅｘｃｉｔｅｒ共焦点顕微鏡を使用して、１０×（完全細胞）および１００×（棘画像化）で画像を取得する。

【0132】

内在性シグナルの光学式画像化
この実験のために、成体の（＞Ｐ６０）野生型（ＳＶＥＶまたはＢＬ６）およびＭｅＣＰ２（＋／−）突然変異雌（ＢＬ６）を使用する。野生型対照群は、ＭｅＣＰ２＋／−雌または野生型の年齢を一致させたＳＶＥＶ雌の野生型同腹仔で構成される。片目の遮断のために、アベルチン（０．０１６ｍｌ／ｇ）で動物に麻酔をかけ、片目のまぶたを４日間縫合する。画像化の前に、縫合を取り除き、遮断した目を再び開いた。遮断縫合が元のままである動物および遮断された目の状態が健康そうである動物だけを、画像化セッションのために使用する。Ｇ−２−ＭｅＰＥシグナル伝達活性化のために、Ｇ−２−ＭｅＰＥ含有溶液を遮断の全期間中毎日腹腔内（ＩＰ）に注射する。画像化セッションのために、マウスにウレタンで麻酔をかける（１．５ｇ／ｋｇ；最終投薬量まで各々２０〜３０分、全投薬量の２０％をＩＰ投与し、０．０２ｍｌの１％クロロプロチキセンも最初の投与と一緒に注射される）。運動を最小にするために、頭蓋を露出させ、オーダーメードのプレートを頭部に接着する。ｄｒｅｍｅｌドリルで頭蓋をＶ１の上で薄くし、食塩水（１．５％）中のアガロース溶液およびガラス製カバーガラスでカバーをする。画像化セッションの間、動物には継続的に酸素を与え、暖房ブランケットでその温度を維持し、目を周期的にシリコーン油で処置し、生理的状態を継続的に監視する。いずれかの片目に与えられる周期的刺激を表示するモニターの前に、麻酔下マウスを置く。刺激は、均一な灰色の背景の前で９秒／サイクルで漂流している、寸法が９°×７２°の縦または水平の白い棒からなった。頭蓋表面は赤色光（６３０ｎｍ）で照らし、２５分の各刺激セッションの間に１５フレーム／秒の速度で輝度の変化をＣＣＤカメラ（Ｃａｓｃａｄｅ ５１２Ｂ、Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で捕捉する。遅いシグナルノイズを取り除くために側頭の高域フィルター（１３５フレーム）を用い、その後、刺激周波数に対応する側頭の高速フーリエ変換（ＦＦＴ）構成要素を各ピクセルで抽出するために、シグナルをコンピュータ処理する。各目への視覚的誘発反応の強度を測定するために、ＦＦＴ振幅を使用する。眼球優位性指数は、ＯＤＩ＝（Ｒｃｏｎｔｒａ−Ｒｉｐｓｉ）／（Ｒｃｏｎｔｒａ＋Ｒｉｐｓｉ）として、各ピクセルでの各目の応答（Ｒ）から導かれる。両眼ゾーンは、画像化した半球と同側の目の刺激によって活性化された領域と規定される。

【0133】

心拍数測定
リアルタイム心拍数は、テールクリップセンサー（Ｍｏｕｓｅ ＯＸ Ｏｘｉｍｅｔｅｒ−Ｏａｋｍｏｎｔ、ＰＡ）を使用して測定する。マウスは麻酔されていないが、取り付けた開放系プラスチック管の中に物理的に拘束する。記録セッションの前に、慣れさせるために実験動物を収容するケージの中に管を一晩置く。体温は、記録時間中、約８２〜８４°Ｆに維持する。各マウスについて１５分の３試験を記録し、マウスは８週齢であり、Ｐ１５から基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥで処置する。
夜間活動の測定
赤外線活性化運動モニタリングチャンバー（Ｏｐｔｏ−Ｖａｒｉｍａｘ−ＭｉｎｉＡ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）を使用することにより、自発的な運動活動を測定する。実験ごとに、記録を開始する少なくとも３時間前に、マウスをチャンバー内に置く。通常の１２時間暗サイクル（午後７時〜午前７時）の間、運動を監視する。１時点当たり１動物当たり１つの暗サイクルを収集する。
結果
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置がＲＴＴ疾患の主な特徴の発達に影響を与えるかどうか試験するために、２週齢の突然変異動物にそれらの寿命の間、腹腔内注射を毎日与える。下に詳述するように、シナプスの生理、シナプスの分子組成および皮質可塑性の測定、ならびに健康関連の測定、例えば心拍数、運動活動レベルおよび寿命を次に取得する。

【0134】

ＭｅＣＰ２突然変異マウスのシナプス生理へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響
近年の研究は、ＭｅＣＰ２−／ｙマウスの複数の脳領域にわたるニューロンが、ＢＤＮＦの過剰発現によって救済される表現型（Chang et al., 2006）である自発的活動の重大な低減を提示することを報告している（Chang et al., 2006；Chao et al., 2007；Dani et al., 2005；Nelson et al., 2006）。同様に、ＩＧＦ１誘導体の急性適用は、ラット海馬培養で誘発興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）振幅を４０％上昇させることが示されている（Ramsey et al., 2005；Xing et al., 2007）。ＭｅＣＰ２−／ｙ生理的表現型を救済することにおけるＧ−２−ＭｅＰＥの効力を試験するために、急性脳切片で細胞内の完全細胞記録を取得し、層５の皮質ニューロンで興奮性シナプスドライブ（自発的なＥＰＳＣ振幅および周波数）を測定する。ここで、−／ｙ動物から記録されるＥＰＳＣは、野生型動物で測定されるＥＰＳＣと比較して、振幅が有意に低い。この傾向は、Ｇ−２−ＭｅＰＥで処置したＭｅＣＰ２−／ｙ動物から記録されるＥＰＳＣで部分的に反転され、それらは基剤処置ＭｅＣＰ２−／ｙマウスからのＥＰＳＣより振幅が有意に大きい。細胞全体で平均したときにも、これらの差が見られる。これらの測定全体にわたって、アクセス抵抗性、リークおよび細胞内在性の興奮性が、群を横断して一貫していることも検証する。ＥＰＳＣ区間の数量化は、野生型とＭｅＣＰ２−／ｙ動物の間でＥＰＳＣ事象間の区間のわずかな増加（ＥＰＳＣ周波数の低減）も示す（Ｐ＝０．０４、コルモゴロフ−スミルノフ検査）。したがって、我々の知見は、ＭｅＣＰ２−／ｙマウスの皮質細胞での興奮性シナプスドライブの低減、およびＧ−２−ＭｅＰＥ処置に続くその部分的救済が、一部、この領域での興奮性伝達を媒介するシナプスの強度の変化の結果としての、ＥＰＳＣ振幅の変化によることを示す。

【0135】

Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置は、皮質棘成熟を刺激する
ニューロンをまばらにおよび明確に標識するためにゴルジ染色を使用し、標識細胞で樹状突起の棘の密度および形態を測定するために高分解能共焦画像化を適用し、臨界期間マウス（Ｐ２８）からの運動皮質の切片中の層５の錘体神経に分析を制限した。
低倍率画像化は錐体細胞の樹状突起の範囲を明らかに正確に示すが、シナプス接触を数え、各棘の形態学的クラスを判定するためにより高い倍率を使用する。我々は、棘を大きくふくらんだ（「キノコ」、Ｍ）、短くずんぐりした（「ずんぐりした」、Ｓ）、短く細い（「細い」、Ｔ）または糸状仮足（Ｆ）と分類する。単位枝当たりの棘の密度の比較は、処置によりノックアウトで大きく改善される、ノックアウトニューロンでの棘密度の低下の傾向を示す。

【0136】

総合的に、これらの結果は、ノックアウトで樹状突起の接触の数および成熟状態の欠陥が、Ｇ−２−ＭｅＰＥの投与に続いて処置することができる方法で、興奮性伝達での機能的欠損を支える可能性を示す。
成体ＭｅＣＰ２＋／−マウスでの眼球優位性（ＯＤ）可塑性は、Ｇ−２−ＭｅＰＥによって低減される
ＯＤ可塑性の発達上の変化は一部ＩＧＦ−１経路の活性化によって制御され、（１〜３）ＩＧＦ−１の投与は野生型若齢マウスでＯＤ可塑性を低減することができる（Tropea et al., 2006）。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置が成体ＭｅＣＰ２突然変異体で観察される長期ＯＤ可塑性を安定させることができるかどうか試験する。Ｐ６０齢以上の雌ＭｅＣＰ２＋／−マウスの片目を４日間遮断し、同時にＧ−２−ＭｅＰＥで処置する。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置は、成体Ｍｅｃｐ２＋／−マウスでＯＤ可塑性を低減し、Ｇ−２−ＭｅＰＥがシナプスの安定化または成熟を実際に速やかに誘導することができることを示す。
ＭｅＣＰ２−／ｙマウスの徐脈をＧ−２−ＭｅＰＥによって処置する
神経生理学症状の改善におけるＧ−２−ＭｅＰＥの効力を検討することに加えて、生物体の健康状態へのその影響を特徴付けようと努める。臨床および実験の証拠は、レット症候群患者での不安定な呼吸リズムおよびベースラインの心臓迷走神経緊張の減少などの自律神経系機能不全を示す（Julu et al., 2001）。交感神経系を通して血圧ホメオスターシスを調節するフィードバック機構、例えば過換気によって誘導される心拍数の減少の制御不良は、レット症候群患者で一般的であり、生命にかかわる心臓不整脈を引き起こすことがある（Acampa and Guideri, 2006; Julu et al., 2001）。

【0137】

よく理解されていないが、心臓の自律神経障害の発生病理は、脳幹での未熟なニューロン接続が原因である可能性を示唆する。ＭｅＣＰ２−／ｙマウスでの心拍数異常、およびＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響を検討するために、基剤またはＧ−２−ＭｅＰＥで処置した非麻酔下の野生型およびＭｅＣＰ２−／ｙ動物でリアルタイム心拍数を監視する。野生型マウスは、１分当たり７５０拍動を中心とする心拍数測定値の規則的分布を示す。対照的に、ＭｅＣＰ２−／ｙマウスは、平均がより低いより不規則な心拍数を示し、その発生はＧ−２−ＭｅＰＥによる処置の後に有意に低減される。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ投与は、運動活動および寿命を向上させる
ＭｅＣＰ２−／ｙマウスは、それらが次第に不活発になる４〜６週齢から始まるレット様症状を起こし、歩行運動失調を起こし、１０〜１２週齢で死ぬ（Chen et al., 2001）。ケージ化領域の中での夜間の赤外線交差事象を数えることによって、６週後にマウスでベースライン運動活動も記録する。ＭｅＣＰ２ノックアウトマウス（ＫＯ）は、野生型マウス（ＷＴ）と比較して著しく低減された運動活動レベルを示すが、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（ＫＯ−Ｔ）による処置はこれらのレベルを上げる。
最後に、ＭｅＣＰ２ＫＯ同腹仔と比較して、Ｇ−２−ＭｅＰＥで処置したＭｅＣＰ２−／ｙマウスは、平均余命の約５０％の増加を示す（０．５確率生存率の増加）。

【0138】

海馬でのニューロン細胞体サイズへのＧ−２−ＭｅＰＥ処置の影響も測定する。運動活動について上で記載したように、マウスをＧ−２−ＭｅＰＥで処置する。海馬のＣＡ３領域内のニューロンでの細胞体サイズは、野生型動物と比較してＭｅＣＰ２ ＫＯ動物で有意に損なわれる。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置はＫＯ動物で平均細胞体サイズを増加させるが、野生型動物では細胞体サイズにほとんど影響を及ぼさない。
（例１１）マウスでのレット症候群における生存への経口Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響
レット症候群は、運動技能の喪失を含む慢性衰弱性障害であるため、容易に投与される調製物を使用してレット症候群を処置するのが望ましい。このため、Ｇ−２−ＭｅＰＥおよび関連化合物の予想外の有益な治療的および薬物動態特性を利用することができる（米国特許第７，０４１，３１４号、同第７，６０５，１７７号、同第７，７１４，０７０号、同第７，８６３，３０９号、ならびに米国出願第１１／３１５，７８４号および同第１２／９０３，８４４号）。

【0139】

したがって、米国特許出願公開第２００９／００７４８６５号において記載されている通り、ＭｅＣＰ２欠損マウスにＧ−２−ＭｅＰＥを経口投与する。手短に言うと、薬学的に有効量のＧ−２−ＭｅＰＥ（動物１匹当たり２０または８０ｍｇ／ｋｇ）を含有する、水溶剤、油中水型エマルジョン（マイクロエマルジョン、粗いエマルジョン、または液状結晶）、またはゲル組成物を毎日投与する。ＭｅＣＰ２欠損動物の対照では、食塩水だけを投与し、野生型動物を使用して、上記の例８において記載されている研究の設計と類似のベースラインデータを得る。
野生型動物では、生存は、各時点において１００％と定義される。ＭｅＣＰ２欠損動物では、生存は実質的に低下する。しかし、Ｇ−２−ＭｅＰＥをＭｅＣＰ２欠損マウスに経口投与した後、生存は実質的に上昇する。

【0140】

（例１２）マウスでのレット症候群における発作活性へのＧ−２ＭｅＰＥの影響
発作は、レット症候群の状況を処置するのに、突出して危険で困難であるので、ＭｅＣＰ２欠損動物において発作活性へのＧ−２ＭｅＰＥの影響を決定する。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、神経変性疾患を有する動物における発作活性を処置するのに有効となり得る（米国特許第７，７１４，０２０号）。したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥがＭｅＣＰ２欠損マウスにおいて発作活性も処置し得るかどうかを決定するための実験を実施する。
米国特許第７，７１４，０２０号において記載されている方法を使用し、食塩水またはＧ−２−ＭｅＰＥのどちらか一方により処置された野生型マウスおよびＭｅＣＰ２欠損マウスの脳波記録を得る。
Ｇ−２ＭｅＰＥが、運動発作および非けいれん性発作の両方を軽減するのに有効となり得ることが見出される。

【0141】

結論
ＭｅＣＰ２欠損動物におけるｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に基づくと、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、レット症候群を有するヒトを処置するのに有効な療法となり得ると結論づける。さらに、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、天然化合物（（１〜３）ＩＧＦ−１；グリシル−プロリル−グルタミン酸またはＧＰＥ）（図２１）よりも、予想外に長い半減期を有しているので、Ｇ−２−ＭｅＰＥの使用は、ＧＰＥを含めた他の医薬剤よりも明確かつかなりの利点を有すると結論づける。

【0142】

例えば、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、経口投与後に、消化管細胞により分解されない、消化管細胞により吸収される、および中枢神経系において活性である（参照により本明細書に完全に組み込まれている、Ｗｅｎらの米国出願第１２／２８３，６８４号、米国出願公開第２００９／００７４８６５号、米国特許第７，８８７，８３９号）。したがって、Ｇ−２ＭｅＰＥは、静脈、皮下、脳室内、または非経口で送達する必要がない。実際に、マイクロエマルジョン、粗いエマルジョン、液状結晶調製物、ナノカプセル、およびヒドロゲルを含む、経口用製剤は、神経機能を改善し、かつ神経変性状態を処置することができる、錠剤、カプセル剤およびゲル剤などの経口投与調製物の製造に使用することができる（米国特許第７，８８７，８３９号）。本発明の化合物は、患者の運動機能が錠剤またはカプセル剤の嚥下に要する機能を欠く状況で使用することができる。いくつかのタイプの化合物を経口投与するための可溶性ゲル剤が存在しており、これらは、本発明の化合物または組成物を患者に送達するため使用することができる。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、容易に経口投与することができ、かつレット症候群を含む神経変性障害を処置するのに経口で有効であるので、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、レット症候群患者の長期療法に都合がよくかつ利益をもたらし得る。
さらに、レット症候群は、他の自閉症スペクトラム障害と主要な特徴を共有しているので、本発明の化合物は、他のＡＳＤを有する動物、ならびに自閉症、アスペルガー症候群、小児統合失調障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を有するヒトにおいて、治療的利益を実現するのに有用となり得る。

【0143】

（例１３）ＡＳＤの処置
Ｓｈａｎｋ３欠損マウスモデル
ＡＳＤに伴う２２ｑ１３欠失症候群のモデルとして、Ｓｈａｎｋ３欠損マウスを、本研究に使用する。
２２ｑ１３欠失症候群は、Ｓｈａｎｋ３遺伝子における欠失または突然変異と連鎖している（Bonaglia et al, 2006）。Ｓｈａｎｋ３遺伝子は、グルタミン酸作動性シナプスにおいて、フレームワークを形成する、マスター足場タンパク質をコードする（Boeckers et al, 2006）。Ｓｈａｎｋ３は、シナプス後肥厚（ＰＳＤ）のコアの重要な部分であり、α−アミノ−３−ヒドロキシル−５−メチル−４−イソオキサゾール−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、向代謝性グルタミン酸（ｍＧｌｕ）、およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）グルタミン酸受容体、ならびに細胞骨格要素の構成要素を含めた、ＰＳＤおよびシナプスに対する多くの重要な機能的要素を動員する。２２ｑ１３欠失／Ｓｈａｎｋ３突然変異の割合を探求する最近の研究により、Ｓｈａｎｋ３のハプロ不全は、ＡＳＤ症例の０．５％〜１％の頻度で、ＡＳＤの単一遺伝子型を引き起こすおそれがあることが示唆される（Durand et al, 2007；Moessner et al, 2007；Gauthier et al, 2008）。

【0144】

完全長Ｓｈａｎｋ３の発現の撹乱したマウスモデルの生成は、当分野において以前に説明されている（Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1:15, p4）。手短に言うと、Ｂｒｕｃｅ４ Ｃ５７ＢＬ／６胚性幹細胞を使用し、エクソン４およびエクソン９の前に挿入されるｌｏｘＰ部位を有するマウス系を生成した。フロックスアレルを切り取り、エクソン４〜エクソン９を欠失させ、すなわちＳｈａｎｋ３のアンキリン反復ドメインを完全に欠失させて系を維持した。異型接合体−異型接合体の交雑由来のメンデル頻度を含む、野生型（＋／＋）、異型接合体（＋／−）およびノックアウト（−／−）マウスを作製した。完全長Ｓｈａｎｋ３ ｍＲＮＡの５０％減少は、異型接合体（ｑＰＣＲ）、およびＳｈａｎｋ３タンパク質の発現低下において確認された（Ｓｈａｎｋ３抗体Ｎ６９／４６によるイムノブロッティングによる）。
野生型マウスと異型接合体との交雑により生成した異型接合体マウスを使用して、本例において、２２ｑ１３欠失症候群の原因であるＳｈａｎｋ３のハプロ不全を最良にモデル化する。

【0145】

方法
薬物処置
１〜３ヶ月齢の野生型および異型接合体Ｓｈａｎｋ３欠損マウスを４種の処置群：プラセボ処置野生型、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群、および２種のＳｈａｎｋ３欠損Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置群に分割する。これらの動物に、プラセボ（水）、または水に製剤化したＧ−２−ＭｅＰＥを、１４日間、ｂ．ｉ．ｄで経口投与して与える。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、２種の用量：１５または６０ｍｇ／ｋｇで投与する。
方法論
方法論の詳細な説明は、Ｂｏｚｄａｇｉら（Molecular Autism 2010, 1:15）において見出すことができる。

【0146】

行動解析
行動評価は、いくつかの時点で行い、Ｂｏｚｄａｇｉらにより記載されている方法論に則る、社会的交流および超音波社会伝達の解析を含む。手短に言えば、各処置群における雄−雌の社会的交流を評価するものである。対象となる雄は、集団で収容され、清潔な敷わらを有するクリーンケージ中で個別に試験される。各試験セッションは５分間、続く。各対象マウスを、様々な慣れていない発情Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌とペアにする。デジタル閉回路テレビカメラ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、ＮＪ、米国）を、ケージから水平に３０ｃｍのところに置く。超音波マイクロホン（Ａｖｉｓｏｆｔ ＵｌｔｒａＳｏｕｎｄＧａｔｅ ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ ｍｉｃｒｏｐｈｏｎｅ ｃａｐｓｕｌｅ ＣＭ１５；Ａｖｉｓｏｆｔ Ｂｉｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）をケージの上２０ｃｍに設置する。マイクロホンのサンプリング周波数は２５０ｋＨｚであり、解像度は１６ビットである。使用した機器は、対象の雄とパートナーの雌により発せされる鳴き声を区別することができないが、マウスの雄−雌の交流の間の鳴き声の優勢は、通常、雄により発せられる。装置全体は、２５ワットの単一赤色光により照明される、消音環境チャンバ（ＥＮＶ−０１８Ｖ；Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ Ａｌｂａｎｓ、ＶＴ、米国）中に入れられている。続いて、Ｎｏｌｄｕｓ Ｏｂｓｅｒｖｅｒソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｅｓｂｕｒｇ、ＶＡ、米国）を使用し、対象の遺伝子型および処置群を知らされていない実験責任者により、鼻と鼻との臭い嗅ぎ、鼻と肛門性器との臭い嗅ぎ、および他の体の領域の臭い嗅ぎの測定について、対象の雄からのビデオを採点評価する。超音波発声は、遺伝子型／処置群の情報を知らされていない、高度の訓練を受けた２名の実験責任者により、手動で特定し、統計のまとめをＡｖｉｓｏｆｔ ｐａｃｋａｇｅを使用して計算する。評価者間信頼性は、９５％である。データは、独立スチューデントｔ検定を使用して解析する。

【0147】

嗅覚の馴化／脱馴化試験を、各群について、雄および雌マウスで実施する。この方法論は、以前に説明されている通りである（Silverman et al 2010, Yang et al 2009およびSilverman et al 2010）。非社会的および社会的匂いは、以下の順：水、水、水（蒸留水）；アーモンド、アーモンド、アーモンド（１：１００希釈アーモンド抽出物；バナナ、バナナ、バナナ（１：１００希釈人工バナナフレーバー）；社会１、社会１、社会１（慣れていない性別を適合させたＢ６マウスを収容しているケージの底をぬぐったもの）；および社会２、社会２、社会２（異なる群の慣れていない性別を適合させた１２９／ＳｖＩｍＪマウスを収容している第２のケージの底をぬぐったもの）で、各２分間、ホームケージに逐次挿入した一連の綿棒に提供される。各馴化事象および各脱馴化事象の各セットについて、一元反復測定ＡＮＯＶＡを各処置群内で行い、次いで、テューキー事後検定を行う。

【0148】

海馬のスライスの電気生理学
ティッシュチョッパーを使用して、検死後短時間の海馬のスライス（３５０μｍ）をマウスから調製する。スライスを３２℃に維持し、実験を３２℃で行う。スライスは、ＮａＣｌ、１２５．０；ＫＣｌ、２．５；ＭｇＳＯ₄、１．３；ＮａＨ₂ＰＯ₄、１．０；ＮａＨＣＯ₃、２６．２；ＣａＣｌ₂、２．５；グルコース、１１．０（ｍＭ）を含有する、リンガー溶液により灌流する。このリンガー溶液を、細胞外記録（電極溶液：３Ｍ ＮａＣｌ）の間、３２℃で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２で泡立てた。領域ＣＡ３に置いたバイポーラ−タングステン電極を用いて、シャッファー側枝−求心性交連の刺激（３０秒毎に１００マイクロ秒のパルス）により喚起される、領域ＣＡ１における放射状層から記録される興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）のベースラインが確立する前に、スライスを１時間維持する。試験刺激強度は、最大応答の半分となる振幅を有するｆＥＰＳＰが得られるよう調節する。この初期ＥＰＳＰ傾き（ｍＶ／ミリ秒）は、４回の連続応答の平均波形から決定する。入力−出力（Ｉ／Ｏ）曲線は、低Ｍｇ²⁺（０．１ｍＭ）溶液において、ファイバーボレー増幅に対してｆＥＰＳＰ傾きをプロットすることにより生成される。ＡＭＰＡ受容体媒介性およびＮＭＤＡ受容体媒介性Ｉ／Ｏの関係は、イオントロピー性グルタミン酸受容体アンタゴニスト：２−アミノ−２−ホスホノペンタン酸ＡＰＶ（５０μＭ）および６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオンＣＮＱＸ（１００μＭ）の存在下で測定される。一対のパルス応答は、１０〜２００ミリ秒の刺激時間間隔で測定し、第１の刺激パルスに対する第２の刺激パルスへの平均応答比として表される。

【0149】

ＬＴＰは、対照マウスおよび遺伝子組換えマウスについて、高周波数刺激（１００Ｈｚ、５分間空けて１秒の刺激を４回）、またはシータバースト刺激（ＴＢＳ）（２００ミリ秒空けて、１００Ｈｚで４回のパルスを１０バースト）、または単一１００Ｈｚ刺激のいずれかにより、誘発される。長期抑制（ＬＴＤ）を誘発するため、シャッファー側枝を低周波数刺激またはペアドパルス低周波数刺激（１Ｈｚで１５分間、９００回のパルス）により刺激して、ｍＧｌｕ受容体依存性ＬＴＤを誘発する。データは、平均±ＳＤとして表され、統計解析は、αレベル０．０５で有意性を設定し、分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはスチューデントｔ検定を使用して行う。

【0150】

結果
行動
雄の試験対象による合計の社会的臭い嗅ぎの累積時間は、プラセボ処置野生型群よりも、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群の方が短い。さらに、雄−雌社会的交流の間、超音波発声は、野生型対照によるものよりも、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群によるものの方が少なく発せられる。
２種のＳｈａｎｋ３欠損群におけるＧ−２−ＭｅＰＥ処置により、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群と比べて、合計の社会的臭い嗅ぎの累積時間がかなり増加する。さらに、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置群は、プラセボ処置突然変異体群よりも超音波発声数が増加することを示す。
マウスが社会的フェロモンを検知できることを確認しようとした嗅覚の馴化／脱馴化研究において、４つの群すべてが、正常な馴化レベル（一連の３つの同じ臭い嗅ぎに消費した時間の減少により示される）および期待される脱馴化（異なる臭い嗅ぎの消費の増加により示される）を示す。

【0151】

電気生理学
刺激強度に対して興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）傾きをプロットすると、対照群に対してプラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群における、Ｉ／Ｏ曲線の減衰が実証される。異型接合体のプラセボ処置群では、野生型対照群と比べて、Ｉ／Ｏ関数の平均傾きの５０％減少を反映して、ＡＭＰＡ受容体媒介性電場電位の低下も観察する。対照的に、シナプスＮＭＤＡ受容体機能を測定するため、競合的ＡＭＰＡ／カイニン酸受容体アンタゴニストＣＮＱＸの存在下で、Ｉ／Ｏ関係を解析すると、野生型とプラセボ処置異型接合体群との間に差はない。これらの結果は、Ｓｈａｎｋ３異型接合体マウスにおいて、ＡＭＰＡ受容体媒介性基礎伝達の特異的な低下があることを示している。
両方の異型接合体群におけるＧ−２−ＭｅＰＥ処置により、ＡＭＰＡ受容体媒介性電場電位が正常化され、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群と比べて、Ｉ／Ｏ関数の平均傾きの増加が引き起こされる。
プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群におけるＬＴＰの維持は、野生型対照と比べて、明らかに損なわれている。ＴＢＳ ＬＴＰ試験（２００ミリ秒空けて、１００Ｈｚで４回のパルスを１０バースト）もまた、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群において、ＴＢＳ後６０分で、増強作用がかなり低下することを示す。ＬＴＰで観察されるシナプス可塑性の改変とは対照的に、突然変異体群では、長期抑制（ＬＴＤ）は有意に変化しなかった。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群と比べて、Ｓｈａｎｋ３欠損群の両方において、海馬の長期増強（ＬＴＰ）、およびその維持が向上した。

【0152】

考察
乏しい社会的適格性および反復性の行動は、一般的な特徴であり、ＡＳＤの形態すべての重要な診断手段である。遅い知的発達および不十分な言語技術の発達もやはり、アスペルガー症候群を除いて、ＡＳＤすべてにおいて存在する、一般的な特徴である。

【0153】

上記のこの動物モデルは、臨床的なヒト状態と類似した症状を実証するものとして、当分野において容認されてきた。上で考察した突然変異体モデル（ＮＬＧＮ３、ＮＬＧＮ４、ＣＡＤＭ１、ＮＲＸＮ１、ＦＭＲ１、ｓｈａｎｋ３）はすべて、社会的技能の障害または社会的不安の増加を示す。海馬への興奮性伝達の減少は、ＮＲＸＮ１、ｓｈａｎｋ３、ＭｅＣＰ２、およびＦＭＲ１突然変異体動物モデルにおいて特定されている。現在のところ、ＡＳＤの多元発生モデルまたは多因子性モデルが記載されている。ヒト集団においてＡＳＤを生じることが知られている遺伝子欠損に基づく上記の動物モデルは、ＡＳＤ療法の効力を試験するための最良の機会を提供する。
したがって、ＡＳＤの動物モデルにおけるＧ−２−ＭｅＰＥの効力は、ＡＳＤを患っているヒト対象において、その効力をかなり予測する。

【0154】

（例１４）Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により、レット症候群のｉｎ ｖｉｔｒｏヒトモデルにおける、ニューロンの形態が変化する
ニューロンの形態へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を試験するため、Marchetto et al., A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells, Cell 143:527-539 (2010)（補足情報を含む）において記載されているＲＴＴのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを使用した。このモデルは、様々なＭｅＣＰ２突然変異を有するヒトＲＴＴ患者の線維芽細胞から発生する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用する。

【0155】

方法
細胞培養およびレトロウイルス感染
ＲＴＴ線維芽細胞（４種の異なるＭｅＣＰ２突然変異を有する）、および対照の線維芽細胞は、皮膚生検の移植片から生成する。標的ＭｅＣＰ２遺伝子に対するｓｈＲＮＡを、レンチウイルスベクターＬｅｎｔｉＬｏｘ３．７にクローニングする（Ｍａｒｃｈｅｔｔｏらに記載さている通り）。線維芽細胞は、レトロウイルスリプログラミングベクター（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４）により感染させる。感染の２日後、ｈＥＳＣ培地を含む、有糸分裂的に不活性なマウス胚線維芽細胞に線維芽細胞を植え付ける。２週間後、線維芽細胞のバックグラウンドから発現したｉＰＳＣコロニーを手で採取し、胚幹細胞培養培地ｍＴｅＳＲ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するマトリゲルコーティング皿（ＢＤ）上のフィーダーフリー条件に移し、手で継代する。生成したクローンの遺伝子発現プロファイルをヒトゲノムＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ（商標）アレイを使用して測定し、リプログラミングが成功していることを確認する。

【0156】

ニューロンの分化：ＮＰＣおよび成熟ニューロン
ニューロンの前駆細胞（ＮＰＣ）を得るため、細胞クラスターの機械的解離、およびＦＧＦ２を含まないｈＥＳＣ培地中の低粘着性皿上に５〜７日間、植え付けることにより胚様体（ＥＢ）を形成させる。その後、ＥＢを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＮ２培地（分裂終了細胞の成長および発現用の無血清補給物）中のポリオルニチン／ラミニンコーティング皿上に植え付ける。得られたロゼットを７日後に採集し、アクターゼにより解離させ、ＮＰＣ培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；０．５Ｘ Ｎ２；０．５Ｘ Ｂ２７およびＦＧＦ２）によりコーティングされている皿上に植え付ける。同一条件のアクターゼを用い、１〜２代の継代後にＮＰＣの均質集団を達成する。成熟ニューロンを得るため、浮遊ＥＢを１ｕＭまたはレチノイン酸により、３週間処理する（４週間の分化の合計時間を与える）。成熟ＥＢを、３７℃で１時間、パパインおよびＤＮＡｓｅにより解離させ、ＦＧＦ２を含まないＮＰＣ培地中のポリオルニチン／ラミニンコーティング皿に植え付ける。

【0157】

Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処理
ＲＴＴのニューロン培養を、１週間、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（１ｎＭ〜１０μＭ）により処理する。
免疫細胞化学およびニューロン形態の定量
細胞は、４％パラホルムアルデヒド中で固定化し、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００により浸透化する。次に、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００および５％ロバ血清を含有するＰＢＳ中、室温で１時間、細胞をブロッキングする。蛍光シグナルは、Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡を使用して検出し、画像はＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３により加工する。以下の一次抗体を使用する。ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１（１：１００）、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８（１：５００）、ヒトＮｅｓｔｉｎ（１：１００）、Ｔｕｊ−１（１：５００）、Ｍａｐ２（１：１００）；ｍｅＣＰ２（１：１０００；ＶＧＬＵＴ１（１：２００）、Ｐｓｄ９５（１：５００）、ＧＦＰ（１：２００）、Ｓｏｘ１（１：２５０）、Ｍｕｓｈａｓｉ１（１：２００）ならびにｍｅ３Ｈ３Ｋ２７（１：５００）。細胞体サイズは、Ｓｙｎ：：ＥＧＦＰ（商標）を使用してニューロンを特定した後、適切なソフトウエア（例えばＩｍａｇｅＪ）を使用して測定する。ニューロンの樹状突起および棘の形態を、ｚスタック光学セクションの個々の投影から検討し、ｚ面において値をもつ解像度と相関する０．５ｕｍ増分でスキャンする。各光学セクションは、５００ｌｐｓにおいて３回スキャンし、次いでカルマンフィルターした結果である。シナプスの定量に関すると、画像は、Ｂｉｏｒａｄ ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（商標）共焦点顕微鏡を使用し、１ｕｍのｚ−ステップにより撮影する。シナプスの定量は、遺伝子型に対して盲検で行う。Ｍａｐ２に陽性のプロセスに沿って、ＶＧＬＵＴ１斑点だけを計数する。統計的有意性は、二元ＡＮＯＶＡ検定およびボンフェローニ事後検定を使用して試験する。

【0158】

カルシウムイメージング
ヒトｉＰＳＣ由来のニューロンネットワークを、Ｓｙｎ：ＤｓＲｅｄレポーター構築物を有するレンチウイルスベクターにより感染させる。細胞培養物を滅菌Ｋｒｅｂｓ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＫＨＢ）により２回洗浄し、ＫＨＢ中、室温で４０分間、２〜５μＭ Ｆｌｕｏ−４ＡＭ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によりインキュベートする。ＫＨＢで２回洗浄することにより、過剰の色素を除去し、さらに２０分間のインキュベートを行い、細胞内色素濃度を平衡にして、脱エステル化させる。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１倒立型蛍光共焦点顕微鏡（オリンパスオプティカル（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ）、日本）に４８８ｎｍ（ＦＩＴＣ）フィルターを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ ＯＲＣＡ−ＥＲ（商標）デジタルカメラ（浜松ホトニクス株式会社、日本）を使用し、５０００フレームの低速度撮影画像シーケンス（１００倍率）を、３３６×２５６ピクセルの領域において、２８Ｈｚで取得する。画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ７．７（商標）（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により取得する。続いて、ＩｍａｇｅＪ（商標）およびＭａｔｌａｂ７．２（商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）における書換え型ルーチンを使用して、画像を加工する。

【0159】

電気生理学
分化の６週間後に、星状神経膠細胞と共培養した細胞から、全細胞パッチクランプ記録を行う。新鮮なＨＥＰＥＳ−緩衝化食塩水（処方に関する補足方法を参照されたい）により、浴を絶えず灌流する。記録用マイクロピペット（ｔｉｐ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ３−６ＭΩ）を、補足文書において記載されている内部溶液により満たす。記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ（商標）増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行う。シグナルは、２ｋＨｚでフィルターをかけて、５ｋＨｚでサンプリングする。全細胞キャパシタンスは、完全に補償される。直列抵抗は補償されないが、１０ｍＶパルスに応答して、容量性電流の増幅により、実験中、モニターされる。記録はすべて、室温で行い、化学品はＳｉｇｍａから購入する。自発性シナプス後電流の周波数および振幅は、Ｍｉｎｉ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（商標）ソフトウエア（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｌｅｏｎｉａ、ＮＪ）を用いて測定する。ＷＴおよびＲＴＴ群の統計的比較は、ｐ＝０．０５の有意水準で、ノンパラメトリックコルモゴロフ−スミルノフ両側検定を用いて行う。ＥＰＳＣは、ＣＮＱＸまたはＤＮＱＸ（１０〜２０μＭ）によりブロッキングし、ＩＰＳＰは、ビククリン（２０μＭ）により阻害させる。

【0160】

結果
ＲＴＴ ｉＰＳＣ由来のニューロンは、グルタミン酸作動性シナプス数の低下、棘密度の低下、およびより小さな細胞体サイズにより特徴づけられる。ＲＴＴニューロンもまた、ある種の電気生理学的欠陥、すなわち対照と比較した場合、自発的シナプス電流の周波数および振幅の有意な低下を示す。ＲＴＴニューロンは、細胞内カルシウム移行の頻度が低下することを示す。
ＲＴＴ表現型のいかなる病変も弱体化し得るかどうかを試験するため、上記のモデルにおいて、Ｇ−２−ＭｅＰＥを試験する。
細胞培養物を各薬物濃度により処理すると、非処理ＲＴＴ対照と比べて、処理されたＲＴＴ細胞培養物の形態学的および生理学的パラメータのすべてが改善される。具体的には、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処理ＲＴＴ細胞において、グルタミン酸作動性シナプス数がかなり増加することを観察している。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処理の濃度はすべて、ＲＴＴ由来ニューロンにおけるＶＧＬＵＴ１斑点数を増加させる。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処理は、自発性シナプス後電流の周波数および振幅、ならびにＧ−２−ＭｅＰＥ処理ＲＴＴニューロンのシナプス活性により生じるカルシウム移行の頻度を正常にする。
ヒトＲＴＴの本ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルでは、ＲＴＴ患者由来のｉＰＳＣ、およびそれらから分化したニューロンは、ＭｅＣＰ２発現の異常により特徴づけられる。本発明の上記の詳細な説明において考察した通り、ＲＴＴ症例の大部分は、ＭｅＣＰ２遺伝子の突然変異を伴う。したがって、ヒトＲＴＴの本ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるＧ−２−ＭｅＰＥの効力は、ＲＴＴを患っているヒト対象において、その効力をかなり予測する。

【0161】

（例１５）レット症候群を有するヒトにおけるＧ−２−ＭｅＰＥの影響
方法
レット症候群を有する３０名の対象を動員する。対象は女性であり、１６〜２９歳の年齢である（平均＝１２．１、ＳＤ＝４．４）。対象はすべて、ＩＱ＜６０であり、ＭＥＣＰ２遺伝子の突然変異を有する。対象はまた、ＥＥＧにおけるエーテルスパイク活性、または高速フーリエ変換（ＦＦＴ）により検出されるＥＥＧの低周波数帯域の増加も示す。対象には、併用医薬が研究前の少なくとも６週間安定であるように指示される。不注意の徴候を処置するための医薬品を服用している対象は、午前中に試験を受け、午後にはその医薬品を服用するよう指示される。ＱＴｃ間隔が＞４５１の対象を除外する。
この研究は、プラセボ、Ｔ．Ｉ．Ｄで５日間１０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥ、またはＴ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥのいずれかの３種の用量を用いた無作為二重盲検プラセボ対照並行試験である。

【0162】

対象は、以下の文書：レット症候群自然経過／臨床的重症度尺度（Ｒｅｔｔ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ／Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃａｌｅ）、異常行動チェックリスト−コミュニティ版（ＡＢＣ）、ヴァインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄｓ）、重症度の臨床全般印象（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ）（ＣＧＩ−Ｓ）、および介護人が記入した介護者負担質問票（ｔｈｅｉｒ ｃａｒｅｒｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ ｔｈｅ Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ Ｓｔｒａｉｎ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＣＳＱ）を使用して、ベースラインで試験する。
対象は、睡眠ポリグラフ技法を使用して、２４時間連続的にＥＥＧ、ＥＣＧ、および呼吸速度の初期ベースライン記録を可能にするため、入院を基本とするクリニックに入れられる。手の動きも、Ｑ−Ｓｅｎｓｏｒ（商標）を使用して記録する。派生ＥＥＧ測定は、以下：ＥＥＧにおける単位時間当たりのスパイク、ＥＥＧの周波数帯域での総パワー、ＱＴｃおよび心拍変動（ＨＲＶ）、ならびに呼吸不整を含む。
有害事象もまた、有害事象の標準安全尺度およびＳＭＵＲＦ誘発を使用して記録する。
統計的に、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置の影響は、ベースラインスコアからの変化への処置の影響に対する、共分散の反復解析（ＡＮＣＯＶＡ）を行うことにより解析する。

【0163】

結果
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、プラセボによる処置の間に存在するものほど多くの有害事象を生じることはなく、有害事象はすべて、短期間かつ軽度の重症度である。深刻な有害事象は報告されてない。ＱＴＣが増加する例は報告されていない。
呼吸速度または心拍変動には影響を及ぼさないことが観察される。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、ＥＥＧにおける単位時間当たりのスパイクの総合的に有意な低下が生じる。Ｔ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、プラセボと比較して、スパイク活性を低下させる。この用量のＧ−２−ＭｅＰＥはまた、プラセボと比較して、ＥＥＧのデルタ帯域の出力も低下させる。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置はまた、Ｑ−Ｓｅｎｓｏｒ（商標）デバイスを使用して計数される、２４時間の期間当たりの手の動きの合計も低下させる。この効果は、プラセボと比較して、Ｔ．Ｉ．Ｄ．で３０ｍｇ／ｋｇの用量に対して顕著である。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、レット症候群自然経過／臨床的重症度スコアへの有意な影響は全体的にない。しかし、Ｔ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥにより、プラセボと比較すると、以下の準尺度：「試験によるこの通院における非言語的伝達（Ｎｏｎｖｅｒｂａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｉｓ ｖｉｓｉｔ ｂｙ ｅｘａｍ）」、「この通院におけるてんかん／発作（Ｅｐｉｌｅｐｓｙ／Ｓｅｉｚｕｒｅｓ ａｔ ｔｈｉｓ ｖｉｓｉｔ）」、および「手の使用」に対して有意な影響が生じる。

【0164】

結論
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、本研究において中枢神経系機能にかなりの改善が生じる。比較的短期間の処置にもかかわらず、脳の電気的活性の異常が低減し、これは効力の明確な兆候である。こうした効果は、用量依存的であり、Ｔ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥの処置後に見られる。これらの効果は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ投与後のレット症候群のｍｅｃｐ２ノックアウトトランスジェニックマウスモデルにおいて見られる、ＣＮＳ機能の改善を反映する。
用量依存的効果はまた、客観的な計数デバイス、および主観的な評点により評価される、手の使用に関しても観察される。これは、無目的な手書き動作は、レット症候群の臨床表現型の特徴であること、およびこの障害に特有であることの両方なので、興味深い。
レット症候群自然経過／臨床的重症度尺度の非言語的伝達の評点は、処置により改善される。この尺度は、アイコンタクトを主に評価する。これは、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる長期間処置が、集団における社会的関係性を改善し得るという見込みを提起する。
Ｇ−２−ＭｅＰＥは、この集団において十分に耐容される。ＱＴｃ間隔の延長または無呼吸などの、患者集団における特定の懸念の標準尺度または領域のどちらにおいても、影響は観察されない。

【0165】

（例１６）自閉症スペクトラム障害を有するヒトへのＧ−２−ＭｅＰＥの影響
方法
Ｇ−２−ＭｅＰＥがＡＳＤの症状を処置できるかどうかを決定するため、ＡＳＤを有するヒトにおいて研究を実施する。自閉症スペクトラム障害を有する２０名の対象を動員する。対象は男性であり、１６〜６５歳の年齢である（平均＝１８．１、ＳＤ＝３．４）。対象はすべて、ＩＱ＞６０であり、自閉症障害またはアスペルガー障害の厳密なＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ診断を受けている。対象はまた、ＡＤＩ−ＲおよびＡＤＯＳ−Ｇ文書に従い、自閉症スペクトラム障害に対する基準も満たしており、自閉症スペクトラム障害に対して提案されているＤＳＭ−Ｖ基準を満たす。対象には、併用医薬が研究前の少なくとも６週間安定であるように指示される。不注意の徴候を処置するための医薬品を服用している対象は、午前中に試験を受け、午後にはその医薬品を服用するよう指示される。自閉症に適応される非定型抗精神病医薬品により良好に処置される対象は、除外される。対象には、脆弱Ｘ症候群または結節性硬化症を含む、既知の遺伝障害についてスクリーニングがかけられ、脆弱Ｘ症候群または結節性硬化症を有する対象は除外される。制御不能なてんかんを有する対象は除外される。

【0166】

本研究は、３つの相との二重盲検のプラセボ対照クロスオーバー試験である。対象は、無作為順序で、クロスオーバーの各相に入れられる。この試験相では、対象は、プラセボ、Ｔ．Ｉ．Ｄで５日間、１０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥ、またはＴ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥのいずれかを投与される。クロスオーバーの各相は、１４日間のウォッシュアウト期間により、分離される。
対象は、以下の文書：ウェクスラーＩＱ、異常行動チェックリスト−コミュニティ版（ＡＢＣ）、ヴァインランド、エール−ブラウン強迫観念強迫行為尺度（ＹＢＯＣＳ）強迫行為準尺度（ｃｏｍｐｕｌｓｉｏｎ ｓｕｂｓｃａｌｅ）、対人応答性尺度（ＳＲＳ）、重症度の臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｓ）、および介護人が記入した介護者負担質問票（ＣＳＱ）を使用して、ベースラインで試験する。

【0167】

対象は、２種の作業、すなわち目から心を読むテスト−改訂版（ＲＭＥＴ）、および視線追跡（Ｅｙｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）（ＥＴ）作業、ならびに改善に関する臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｉ）が与えられる。作業は、プラセボ、またはＧ−２−ＭｅＰＥのいずれかの用量の投与の２時間後に開始する。ＲＭＥＴは、わずかな感情的な顔の表情の目から感情を読み取る能力を評価する、コンピュータをベースとする作業であり、自閉症患者の感情認知の試験に広く使用されている（２００１年）。重要なことに、ＲＥＭＴは、単回用量の医薬剤でさえも改善を検知することができる（Guastella et al., 2010）。視線追跡の問題は、ヒトの顔の写真の目を見る消費時間が短い自閉症患者の特徴である。やはり、単回投与の薬物介入により、自閉症における視線追跡の欠陥を改善し得る（Andari et al, 2010）。
有害事象もまた、標準安全尺度を使用して記録される。
統計的に、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置の影響は、ベースラインスコアからの変化への処置の影響に対する、共分散の反復解析（ＡＮＣＯＶＡ）を行うことにより解析する。
結果
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、プラセボによる処置の間に存在するものほど多くの有害事象を生じることはなく、有害事象はすべて、短期間かつ軽度の重症度である。深刻な有害事象は報告されていない。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、ＲＭＥＴ試験の成果において、総合的にかなりの改善がもたらされる。Ｔ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥにより処置すると、ＲＭＥＴに対する正答率が向上する。
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、ＥＴ試験において、目の領域を見るのに消費した時間に、総合的にかなりの改善がもたらされる。処置期間の終了時におけるＣＧＩ−Ｉスコアは、有意な差を示す。正の処置効果は、ベースラインＣＳＱスコアと相関がある。

【0168】

結論
Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、目から心を読むテスト−改訂版および視線追跡作業における成果にかなりの改善がもたらされる。これらの効果は、用量依存的であり、Ｔ．Ｉ．Ｄで３０ｍｇ／ｋｇの経口Ｇ−２−ＭｅＰＥの処置後に見られる。
これらの尺度の改善は、社会的情報処理の過程改善を反映する。社会的交流欠陥は、自閉症スペクトラム障害に対する中心的な症状診断であり、したがって、このことは重要な知見である。
Ｇ−２−ＭｅＰＥはまた、改善に関する臨床全般印象により指標が示される、機能の総合的な改善も生じる。本研究からの症例報告書のフリーテキスト注記には、社会的関係性の改善に関係するこうした効果が示されている。このことは、ＲＭＥＴおよびＥＴ作業において観察される変化が、日常生活における社会活動に関連し得ることを暗示している。
Ｇ−２−ＭｅＰＥは、この集団において十分に耐容される。

【0169】

（例１７）自閉症スペクトラム障害へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を決定するための動物モデル
Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響を以下のＡＳＤの遺伝モデル：Ｔｂｘ１異型接合体マウス、Ｃｎｔｎａｐ２ノックアウトマウス、およびＳｌｃ９ａ６ノックアウトマウスでさらに試験する。Ｇ−２−ＭｅＰＥを、脆弱Ｘ症候群のｆｍｒ１ノックアウトマウスモデルでも試験する。
Ｔｂｘ１． ＴＢＸ１遺伝子の突然変異は、自閉症スペクトラム障害を伴う（Paylor et al., 2006）。トランスジェニックＴｂｘ１マウスは、社会的交流、超音波発声、反復性の行動、および作業記憶に選択的に障害がある（Hiramoto et al., 2011）。
Ｃｎｔｎａｐ２． コンタクチン関連タンパク質様２（ＣＮＴＮＡＰ２）遺伝子の突然変異体を有する患者の３分の２は、自閉症スペクトラム障害と診断される（Alarcon et al., 2008；Arking et al., 2008；Bakkaloglu et al., 2008；Strauss et al., 2006；Vernes et al., 2008）。Ｃｎｔｎａｐ２ノックアウト（ＫＯ）マウスは、社会的行動、超音波発声、および反復性の行動におけるＡＳＤ関連表現型を示す（Penagarikano et al., 2011）。
Ｓｌｃ９ａ６． この遺伝子は、ＡＳＤ症候群に関与しており、ナトリウム−水素（ｓｏｄｉｍ−ｈｙｄｒｉｇｅｎ）交換輸送体６（ＮＨＥ６）をコードする。ＳＬＣ９Ａ６における突然変異は、知的障害（Gilfillan et al., 2008）および自閉行動（Garbern et al., 2010）を伴う。Ｓｌｃ９ａ６について、ＫＯマウスは、運動過多、および小脳機能障害を示す（Stromme et al., 2011）。
Ｆｍｒ１． ＦＭＲ１遺伝子をサイレンシングすると脆弱Ｘ症候群が生じ、この表現型には、自閉症が含まれる。脆弱Ｘ症候群の患者の３分の２は、自閉症スペクトラム障害のスクリーニング基準を満たす（Harris et al., 2008）。脆弱Ｘ症候群の小児患者も、発作閾値の低下を示す。ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、若年性発作感受性を含めた、脆弱Ｘ症候群の表現型の多くを複製する（Yan et al., 2004）。

【0170】

方法
上記モデルの各々における動物は、引用文献において記載されている方法論に従って生成する。遺伝モデルごとに、対応する野生型動物も得る。各モデルにおける動物を、３つの群（ｎ＝１０〜ｎ＝２０）：プラセボ処置野生型マウス、突然変異体Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置群、および突然変異体プラセボ処置対照群に分ける。
この処置は、腹腔内投与する：プラセボ（食塩水）またはＧ−２−ＭｅＰＥを２０ｍｇ／ｋｇ／日。
各モデルにおいて示されるＡＳＤの重要な特徴の測定は、引用文献に従って行われる。
結果
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により、ＡＳＤ表現型に関連するすべての尺度が改善される。

【0171】

（例１８）脆弱Ｘ症候群におけるＧ−２−ＭｅＰＥの影響
マーティンベル症候群またはマーカーＸ症候群としても知られている脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、自閉症の最も一般的な単一遺伝子が原因であり、精神発達遅滞の最も一般的な遺伝的原因である。多様な知的障害、細長い顔、大きな耳および大きな精巣（巨精巣症）などの身体的特徴、ならびに常同性運動、社会的不安、および注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を含む神経行動表現型により特徴づけられる。ＦＸＳの症状および徴候は、はい歩き動作、歩行動作またはひねり動作、拍手動作または手の噛みつき動作の遅延、活動過多行動または強迫観念行動、精神発達遅滞、会話および言語発達の遅延、アイコンタクトを避ける傾向、常同性運動、社会的不安、および注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を含むことができる。

【0172】

ＦＸＳが根底にある遺伝学的基礎は、Ｘ染色体上の脆弱Ｘ精神発達遅滞１遺伝子（ＦＭＲ１）のＣＧＧ反復の拡張である。このＦＭＲ１遺伝子により、脆弱Ｘ精神発達遅滞タンパク質またはＦＭＲＰと呼ばれる、タンパク質が生じる。正常な人々のＦＭＲ１遺伝子は、１０倍〜約４０倍よりも少ない反復である、トリヌクレオチドセグメント（ＣＧＧ）を含有する。これらの反復ＣＧＧセグメントは、他のトリヌクレオチドセグメント（ＡＧＧ）に散在しており、このトリヌクレオチドセグメントは、ＦＭＲＰをコードするオリゴヌクレオチドを安定化することができる。罹患男性の場合、ＣＧＧトリヌクレオチドは、約２００倍から１０００倍を超えて反復していることがあり、これにより、ＦＭＲＰをコードするオリゴヌクレオチド（すなわち、ＦＭＲ１ ＲＮＡ）を不安定にする。これにより、正常な神経発達に必要な十分な量の脆弱Ｘ精神発達遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）の発現に失敗する。具体的に脆弱Ｘ症候群に対して利益を示す、薬物処置は現在のところ存在していない。

【0173】

脆弱Ｘ症候群のＦＭＲ１ノックアウトマウスモデル
ＦＸＳの遺伝学的基礎は、公知であるので、ＦＸＳの原因および特徴を研究するのに有用な動物系を作製することは可能である。ｆｍｒ１遺伝子ノックアウト突然変異体マウスが入手可能であり、巨精巣症、学習欠陥および活動過多を含む、臨床的ＦＸＳの多くの特徴を示す。臨床的ＦＸＳと同様に、ｆｍｒ１ノックアウト（ｆｍｒ１ ＫＯ）モデルは、神経プルーニング（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｕｎｉｎｇ）に失敗していることを示し、このことは、樹状スーパーヌメラシー、ならびにＥＲＫおよびＡｋｔの過剰リン酸化を示している。結果として、ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ヒト対象において、ＦＸＳの薬物処置の可能性を試験するための価値のあるツールである。ｆｍｒ１ ＫＯマウスにおいて、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置は、ＦＸＳの徴候および症状の多くを改善するのに有効であることを実証する。
ｆｍｒ１ノックアウトマウスモデルにおいて、Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響を検討した。以下の尺度を解析した。

【0174】

ａ）（ｉ）オープンフィールド試験、（ｉｉ）連続通路試験、（ｉｉｉ）高架式十字迷路試験、（ｉｖ）脈絡恐怖条件づけ試験、ならびに（ｖ）社会的行動試験を用いて、不安状態、自発運動行動および社会活動、学習および種に典型的な行動を評価した。

【0175】

齧歯動物では、新しい環境に曝露されると、通常、不安が誘発される。罰および欲求不満となるご褒美なしと共に、目新しさは、内部不安状態を反映する、行動抑制を引き起こすことができる（Gray (1987) Br J Psychol 69:417-434）。齧歯動物では、不安に内在する行動抑制は、凍結行動、すなわち自発運動の減少、または社会的交流などの進行中の行動の減少として表現される。この凍結行動は、不安および忌避に感受性の高い脆弱Ｘ症候群患者を含めたヒト対象（Gray (1987) Br J Psychol 69:417-434）では、不安の体験中に見られる注意および中断の増加に匹敵する（Tranfaglia (2011) Dev Neurosci. 33:337-348）。齧歯動物における不安はまた、開放空間の中央または持ち上げられた状況などの環境に晒され続けることを嫌がることとしても表現される（Pellow et al, (1985) J Neurosci Methods 14:149-167）。したがって、自発運動または閉鎖空間の嗜好を測定すると、オープンフィールド、連続通路、および高架式十字迷路装置において、不安を指数化することができる。

【0176】

通常、この不安は、繰り返し曝露すると軽減する。不安のこうした軽減は、進行中の行動の増加、したがって、凍結動作の減少または自発運動の増加のどちらかとして反映される。不安におけるこうした減少は、実験状況への馴化として説明することができる。この馴化は、目新しさを知覚することが減少することを反映し、以前の体験の記憶に依存する。すなわち、自発運動は、齧歯動物が試験環境に慣れるので、この環境への繰り返し曝露の間に変化するであろう。この変化は、齧歯動物がその環境に以前に曝露されたという記憶を形成しない場合、起こることはないであろう。したがって、オープンフィールドへの馴化は、齧歯動物において認知能力に障害がある場合、変わり得る。齧歯動物はまた、ある環境を罰の提示と関連させて学ぶことになり、罰を伴う環境への曝露時には、凍結行動を示すことになろう。この応答は、脈絡恐怖条件づけとして知られており、これはやはり、記憶への環境情報をコード化することができる能力に依存する（Garcia et al (1997) J Neurophysiol. 78:76-81）。
ｂ）（ｉ）海馬における樹状突起棘密度、および（ｉｉ）精巣重量を含めた、表現型の解剖学的側面も測定した。
ｃ）全リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔの脳レベルをアッセイした。

【0177】

ＥＲＫの活性化は、この神経細胞内のシグナル伝達タンパク質のリン酸化に反映される。ＥＲＫは、ヒトの脳において、免疫組織化学により活性化されものとして、通常、明らかにされていない（Perry et al (1999) Neuroreport. 10:2411-2415）。しかし、ＣＮＳ機能に影響を及ぼす障害では、ＥＲＫが異常に活性化され得る。このことは、アルツハイマー病（Perry et al (1999）および自閉症（Zou et al (2011) Genes Brain Behav. 10:615-624）において起こる。ＥＲＫのリン酸化はまた、脆弱Ｘ症候群において、およびこの障害のｆｍｒ１ノックアウトマウスモデルにおいて脳でも起こる（Wang et al (2012) J Neurochem. 121:672-679）。

【0178】

Ａｋｔの活性化は、アルツハイマー病（Griffin et al (2005) J Neurochem. 93:105-117）などの脳における病変状態、および自殺者（Karege et al (2007) Biol Psychiatry. 61:240-245）でも見られる。脆弱Ｘ症候群では、Ａｋｔの異常リン酸化（ｍＴｏＲ経路）が脳においても見られる（Hoeffer et al (2012) Genes Brain Behav. 11:332-341）。
脆弱Ｘ症候群などの自閉症スペクトラム障害における、ヒトの脳中のＥＲＫおよびＡｋｔの異常活性化のこうした知見は、脆弱Ｘ症候群のｆｍｒ１ノックアウトマウスモデルに反映され、したがって、有効なモデルと見なすことができる。

【0179】

動物
Ｆｍｒ１ノックアウト（ｆｍｒ１ ＫＯマウスおよび野生型の同腹子（Jackson Laboratory）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上で生成し、第８世代を超えるために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上に繰り返し戻し交配した。マウスを集団で収容（１ケージ当たり４〜６匹）し、特に明記しない限り、動物すべてに食物および水を自由摂取させた。マウスを、温度管理環境（２１±１℃）中、１２時間の明／暗周期（１９：００〜７：００の間消灯）で維持した。
作業を、１日当たりに行われる作業を１つ以下で、記載されている順序で行った。
試験を開始する前に、動物に１週間の最低順応期間を許した。予防的処置または治療的処置は、順応期間中、行わなかった。健常な動物だけを研究に入れた。
実験中、マウスはすべて、同じ装置で一度試験し、非実験動物は、実験前に数分間、この装置に入れた。次に、この装置を各マウスの試験前に、湿潤ティッシュおよび乾燥ティッシュにより清潔にした。この目的は、実験対象すべてにとって、低いが一定のマウスのバックグラウンド匂いを作り出すことであった。
実験者は、全試験およびデータ解析の間、遺伝子型および処置を知らされていなかった。
実験は、ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ、１９８６の要件に則って行った。
これらの動物を以下の処置群に分けた。
１．ｆｍｒ１ ＫＯ＋基剤（食塩水）
２．Ｗｔ＋基剤（食塩水）
３．ｆｍｒ１ ＫＯ＋Ｇ−２−ＭｅＰＥ（食塩水中１００ｍｇ／ｋｇ）
４．Ｗｔ＋Ｇ−２−ＭｅＰＥ（食塩水中１００ｍｇ／ｋｇ）

【0180】

Ｇ−２−ＭｅＰＥは、１日１回、食塩水０．１ｍｌ中１００ｍｇ／ｋｇの用量をｉ．ｐ．で、２８日間、投与した。基剤処置動物は、０．１ｍｌ食塩水を２８日間、毎日注射した。その後、薬物または基剤処置を停止し、すべての試験が終了するまで、動物を連日、試験した。最後に、ｐＡｋｔおよびｐＥＲＫの発現を決定するために、動物を犠牲にした。
本例において使用する場合、用語「Ｇ−２−ＭｅＰＥ」、「ＮＮＺ」、「ＮＮＺ２５６６」、「ＮＮＺ−２５６６」、および「２５６６」は、同じ意味を有しており、互換的である。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、ＩＧＦ（１〜３）（「ＧＰＥ」）と比べて、予想外に長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが示され、すなわち、脆弱Ｘ症候群を有するヒトを含めた動物の療法に対する良好な候補と見なされた。

【0181】

１．解剖学的解析
海馬細胞の培養物を野生型およびｆｍｒ１ ＫＯ胎児マウス（妊娠の１４〜１６日）から調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで３日後、緑色の蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を使用して、培養の時間的経過中に、樹状突起棘密度をモニターした（Ethell and Yamaguchi, 1999；Ethell et al., 2001, Henkemeyer et al., 2003）。樹状突起棘は、通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７〜１４日（ＤＩＶ）の間で形成される。１４ＤＩＶまでに、ほとんどの樹状突起物は、棘である。ｆｍｒ１ ＫＯおよびＷＴの海馬の一次細胞培養物における、樹状突起棘密度への、Ｇ−２−ＭｅＰＥ、ポジティブ対照（ｍＧｌｕＲ５アンタゴニストである、２−メチル−６−（フェニルエチニル）−ピリジンまたはＭＰＥＰ）、および基剤対照の影響を評価した。Ｆｍｒ１ ＫＯおよび野生型培養物は、１７ＤＩＶに処理した。
処置群：
１． ０．５ｎＭのＧ−２−ＭｅＰＥ
２． ５ｎＭのＧ−２−ＭｅＰＥ
３． ５０ｎＭのＧ−２−ＭｅＰＥ
４． ２０μＭ濃度のＭＰＥＰ
５． ＭＰＥＰ−基剤およびＧ−２−ＭｅＰＥ-基剤（食塩水）

【0182】

棘の形態、神経突起増生、およびシナプス形成などの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物効果を検出する能力がある、迅速な薬物試験の可能性を開く、コンパートメント化した培養系であるマイクロ流体チャンバ（図３１Ａを参照されたい）を使用した。コンパートメント化チャンバにおける、処置済みおよび未処置ニューロンは、ウエスタンブロット分析のためにも使用することができる。このコンパートメント化培養は、メッセンジャーの順行性および逆行性輸送、ならびにＦＸＳに関連するタンパク質への、薬物の効果を評価する新規な手法である。この領域の免疫検出および処置において、この手法に、もっぱら軸索コンパートメントへの接近を提供する他の新規な可能性も考えられる。

【0183】

統計学的解析
パラメトリックデータは、二元ＡＮＯＶＡ（対象因子間としての遺伝子型および性別）を使用して解析した。研究すべてに関して、データを正規分布した。ｐ値＜０．０５が、全体にわたり、統計学的に有意であると見なした。

【0184】

２．リン酸化ＥＲＫおよびＡｋｔの発現のウエスタンブロット分析
リン酸化細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）およびタンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）の発現は、以前に説明されている通り（Lopez Verrilli et al.2009）、行動実験において処理されたエーテル基剤またはＧ−２ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．；２８日間）を投与したｆｍｒ１ ＫＯ動物および野生型動物由来のリンパ球において、ウエスタンブロット分析により測定した。ＥＲＫは、成長因子伝達、増殖、ストレスおよびアポトーシスに対するサイトカイン応答の原因になる、古典的なＭＡＰＫシグナル伝達タンパク質である。Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路において、重要な構成要素であり、核内因子κＢ（ＮｆκＢ）およびＢｃｌ−２ファミリータンパク質などの多くの下流エフェクターに結合して調節することにより、細胞生存および代謝を調節している。

【0185】

ウエスタンブロットを行うために、Ａｋｔ（１／１０００）（細胞シグナル伝達）、ＥＲＫ１／２（１／２０００）（細胞シグナル伝達）、抗ホスホＡｋｔ（１／１０００）および抗ホスホ−ＥＲＫ（１／２０００）（細胞シグナル伝達）に対して、抗体を使用した。ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２タンパク質の全含有量（リン酸化されているもの）は、抗ホスホＡｋｔ（１／１０００）および抗ホスホＥＲＫ抗体（１／２０００）（細胞シグナル伝達）を含む膜をブロッティングすることにより評価した。ＡｋｔまたはＥＲＫリン酸化を、同一試料中のタンパク質含有量に正規化し、基低レベルを１００％と見なして、基底条件に対する変化％として表した。タンパク質負荷は、ｂ−アクチン抗体（１／１０００）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含む膜をストリッピングおよび再ブロッティングすることにより評価した。

【0186】

３．行動試験
ａ．オープンフィールド試験
オープンフィールドは、１０ｃｍの正方形に分割した、５０×３０ｃｍの灰色の周囲を囲ったＰＶＣアリ−ナである。マウスを、試験の５〜２０分前に、実験室に持ち込んだ。マウスを隅に面するようにして正方形の隅に置き、３分間観察した。入った正方形（体全部）および立ち上がり（両前肢が地面から離れているが、グルーミングの一部としてではない）数を数えた。最初の立ち上がり（後脚）までの潜伏時間も書き留めた。フィールド周囲のマウスの動きを、３００秒間、ビデオ追跡装置（ｖＮＴ４．０、観測点）により記録した。各試験について、マウスが最も明るいところであるフィールドの中央部分への侵入潜伏時間、この中央領域において消費した総時間、および全行動（ｃｍでの進路長さについて）を、初期曝露、初期曝露の１０分後、および初期曝露の２４時間後に記録した。
オープンフィールドチャンバに曝露されている間に、マウスは環境に馴化し、したがって、それほど動き回らず、経時的に示される移動が減少した。移動および立ち上がりは、３回の曝露中に記録した。１０分間および２４時間において、運動または立ち上がりが減少しなかったことは、それぞれ短期間および長期間の記憶に欠陥があることを示した。

【0187】

結果
移動時間
基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、基剤処置野生型群と比べて、オープンフィールドにおいてより長い距離を動き、ｆｍｒ１ ＫＯ動物では活動過多であることを実証した。この活動過多は、Ｇ−２−ＭｅＰＥの投与により、ｆｍｒ１ ＫＯ動物では元に戻った。ｆｍｒ１ノックアウトマウスでは、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより、２回目および３回目の試験で、移動がかなり減少したことが観察され、これらの動物において、試験環境の記憶保持が改善されたこと、および総合的に立ち上がりが減少したこと（すなわち、活動過多の弱化）を示唆した（図２５）。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0188】

立ち上がり行動
基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、基剤処置野生型対照と比べて、立ち上がり行動が増加することを示した。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、野生型マウスでは効果がないが、ｆｍｒ１ ＫＯマウスでは、立ち上がり行動がかなり減少した。ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、１０分間で馴化を示さず、これは、短期間の記憶欠陥を示すものである。短期間および長期間の記憶試験の間、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、野生型＋基剤対照とは差がなかった（図２６）。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0189】

ｂ．連続通路試験
連続通路試験を使用して、ｆｍｒ１ ＫＯマウスにおいて、不安へのＧ−２−ＭｅＰＥの影響を評価した。装置は、４つの連続した、徐々に不安を惹起する直線的に連結した通路からなる（各連続通路は、より明るい色でペイントされており、低い壁を有し、かつ／または前の通路よりも狭くなる）。動物を端の壁に面するように通路１の閉端に置いた。各通路に最初に侵入した潜伏時間、各通路において消費した時間量、および各通路に侵入した回数を、３００秒の全試験時間中に記録した。
結果
野生型マウスは、通路１において最も多くの時間を消費し、次第に、その後の通路ではそれほど時間を消費しなかった。Ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、活動過多であり、すべての通路で時間を消費した。この場合、通路選択の欠如は、ＦＸＳモデルマウスの活動過多の性質に関係している可能性が高い。Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置により、ｆｍｒ１ノックアウト動物において、正常な行動パターンに戻り、ＦＸＳの行動表現型が元に戻ることと一致した（図２７）。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0190】

ｃ．高架式十字迷路
高架式十字迷路（ＥＰＭ）は、不安および自発運動を試験するための、さらなる試験システムである。ＥＰＭは、Ｌｉｓｔｅｒの説明に従って組み立てた（Lister 1987）。手短に言えば、迷路は、十字の形状で、床の高さより上に持ち上げられている、互いに対向した２つの開放アームおよび２つの閉鎖アームからなった。この開放アームは、一層むき出しになっており、したがって、より不安を惹起した。したがって、野生型マウスは、閉鎖アームにおいてより多くの時間を消費し、閉鎖アームにより多く訪れた。マウスは、５分間試験され、それらの行動を記録した。行われた測定には、アームおよび迷路の中央において消費した時間、ならびにアーム侵入の回数が含まれた。

【0191】

結果
野生型マウスと比べて、ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、活動過多および認知障害が組み合わさった行動パターンを示した。驚くべきことに、ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、アーム侵入の総回数がわずかに減少したこと（行動が低下した指標）（図２８Ａ）、および全アーム侵入の百分率として、開放アームになされた侵入の比が明らかに増加したしたこと（図２８Ｂ）を示した。この行動表現型は、Ｇ−２−ＭｅＰＥを投与されたｆｍｒ１ノックアウト動物では観察されなかった（図２８Ａおよび２８Ｂ）。実際に、「パーセント開放アーム侵入」という尺度は、薬物処置により完全に正常化した。中央（ここで、開放アームまたは閉鎖アームへの侵入選択が行われる）において消費した時間は、ベンゾジアゼピンなどの抗不安性化合物による処置により減少することが知られている。基剤処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、中央において消費した時間が非常に顕著に増加することを示した（図２８Ｃ）。したがって、このことは、どちらのアームに侵入するかというためらいを反映したものであり、突然変異体動物において、認知欠陥の指標となり得る。中央空間で余分に消費した時間（図２８Ｃ）は、恐らく、アーム侵入総回数の減少が根底にある。中央で消費した時間は、２８日間のＧ−２−ＭｅＰＥ処置により、正常化した。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした効果は、実質的かつ統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0192】

ｄ．脈絡恐怖条件づけ
脈絡恐怖条件づけは、条件づけ（学習）手順の最も基礎となるものである。それは、新規環境（暗チャンバ）に動物を置くこと、嫌忌的な刺激を与えること（脚に、０．２ｍＡの電気ショックを１秒間）、次にその刺激を除くことが含まれる。動物を同じ環境に戻すと、動物が嫌忌的な刺激を伴う環境を記憶して連想する場合、一般に、凍結応答を実証することになろう。凍結は、恐怖に対する種に特異的な応答であり、呼吸を除く運動がなくなるものとして定義される。
脆弱Ｘ症候群の臨床的徴候は、精神発達遅滞であり、この場合、学習および記憶が、大いに障害を受ける可能性がある。恐怖条件づけ作業において、Ｇ−２−ＭｅＰＥおよび基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ、および野生型動物を試験し、この場合、脈絡に対する応答における凍結行動を測定した。これらの試験では、マウスは、嫌忌的な体験（脚へのショック）と環境的合図（暗チャンバ）との間の相関を学習かつ記憶しなければならなかった。試験前に、０．２ｍＡで１秒間の脚へのショックに対するマウスの反応について、マウスを観察し、それらが刺激を検知した証拠として、両方の遺伝子型において、発声、ジャンプ行動、および過度の走りがあることに気付いた。

【0193】

結果
基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、野生型マウスと比べて、条件づけ脈絡に曝露された際の凍結行動の割合がかなり低いことを示した。Ｇ−２−ＭｅＰＥにより処置した場合、ｆｍｒ１ ＫＯ群は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型群と比較した場合、凍結行動に有意な差を示さなかった。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により、ｆｍｒ１ ＫＯマウスモデルにおいて脈絡恐怖条件づけで見られた欠陥が正常化するものと結論づける。また、基剤と比較して、ｆｍｒ１ ＫＯ動物における凍結行動の率が、統計的に有意（^**）に低下し、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて見られた認知欠陥が元に戻ることを反映すると結論づけた。こうしたＧ−２−ＭｅＰＥ処置の効果は、完全に予想外であった（図２９）。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこれらの効果は、実質的であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0194】

ｅ．社会的行動
マウスは、社会的な種であり、この種は、群れで、接近、追尾、匂い嗅ぎ、仲間のグルーミング、遭遇に対する攻撃、性的交流、親の行動、巣作り、および眠りを含めた、容易に点数化できる社会的行動に従事する。本研究において、マウスにおける社会的認知および社会的記憶は、反復曝露の際に、親交を誘発するために新しいマウスを臭い嗅ぎに消費した時間の量、および新たな刺激動物が導入された場合に臭い嗅ぎが高いレベルに戻ることを評価することにより評価した。

【0195】

結果
一連の匂い嗅ぎ
Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、与えられたマウスへの匂い嗅ぎが高まることを示し（基剤処置野生型対照に対して^***ｐ＜０．００１）（図３０Ａ）、社会的行動において、機能異常があることを示唆した。この影響は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）による２８日間の処置によってなくなった。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、野生型群では、有意な効果はなかった。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ動物の匂い嗅ぎ行動は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型群とは、有意な差がなかった。Ｇ−２ＭｅＰＥは、ｆｍｒ１ ＫＯマウスで見られた社会的行動における異常を正常化したと結論づける。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ｆｍｒ１ ＫＯ動物は、基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯ動物ほど、実質的にかつ統計的に有意に、臭い嗅ぎをしなかったことを示すことも見出した。Ｇ−２−ＭｅＰＥのこうした効果は、実質的、統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった（図３０Ａ）。

【0196】

種に典型的な行動
マウスは、自発的に、実験室で多くの基材に穴を掘る。この行動は、野生の祖先に起因し、この場合、マウスは、土に埋められている、発見すべき種子、穀物、昆虫、および他の食物、またはマウスの自然の生息場所にある落ち葉を求めて探し回ると思われる。それは一般的な自然の齧歯動物の行動を引き出すものであり、管理された実験室条件下で定量的なデータをもたらし、かつプリオン疾患、脆弱Ｘ、系統差、および脳の病変にかなり敏感なことが分かっている。野生型とｆｍｒ１ ＫＯ群の両方の巣作りおよびガラス玉覆い隠し行動への、Ｇ−２−ＭｅＰＥの影響を試験した。

【0197】

結果
図３０Ｂおよび３０Ｃは、ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、野生型マウスほど、ガラス玉覆い隠し（図３０Ａ）および営巣（図３０Ｂ）にかなり従事しないことを示している。それらのすべてが種に典型的な行動である、巣作りおよびガラス玉覆い隠しに関する、海馬の病変により生じる強固な障害は、ＦＸＳ患者において十分に確立されている症状である、空間学習および記憶の障害を補足する。Ｇ−２−ＭｅＰＥは、野生型マウスでは、有意な効果はなかった。ｆｍｒ１ ＫＯマウスにＧ−２−ＭｅＰＥを投与した後、この群は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置野生型群とは有意な差がなかった。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により、ｆｍｒ１ ＫＯ動物において、ガラス玉覆い隠し行動が正常化されると結論づける。同じ効果プロファイルが、営巣行動においても見られた。ｆｍｒ１ ＫＯ動物において、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、ガラス玉覆い隠し行動および営巣行動の両方が増加することも見出した。
Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした効果は、実質的であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0198】

４．樹状突起棘は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのｆｍｒ１ ＫＯマウスのニューロンにおいて増加する
樹状突起棘数は、正常の野生型動物に比べて、ｆｍｒ１ ＫＯマウスにおいて増加する。Ｇ−２−ＭｅＰＥが、この異常が元に戻るのに有用となり得るかどうかを決定するため、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスのニューロンを、マイクロ流体チャンバ中で培養し、ＧＦＰを使用して形態を視覚化した。ｆｍｒ１ ＫＯ動物に由来するニューロンは、対照の培養物（０．２６±０．０８）と比べると、０．５ｎＭのＧ−２−ＭｅＰＥにより処置しても、有意な改善を示さず（平均±ＳＤ、ｎ＝３の独立した実験：０．３３±０．０７）、５ｎＭ（０．２９±０．０５）でも有意な改善を示さなかったことを観察した。興味深いことに、Ｇ−２−ＭｅＰＥを５０ｎＭで培養物に添加した場合（０．２６±０．１０）、ＷＴ対照（０．２８±０．０９）と比較して、樹状突起棘の有意な減少を観察した。これらの値は、一対事後解析により有意な差（ｐ＜０．００５）となり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0199】

５．巨精巣症
Ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ヒト脆弱Ｘ症候群患者（巨精巣症）がそうである通り、精巣サイズおよび重量の増加を示した。ＷＴ−基剤注入動物、およびＷＴ−Ｇ−２−ＭｅＰＥ注入動物、ならびにｆｍｒ１ ＫＯ−基剤処置動物、およびｆｍｒ１ ＫＯ−Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置動物における精巣重量を測定した。巨精巣症は、ＷＴの同腹の動物と比較して、ｆｍｒ１ ＫＯマウスにおいて明白であり、１２〜２８％の精巣重量の増加を示した。基剤処置野生型マウスにおける精巣の平均重量は１８ｍｇであり、基剤処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスでは、２２．４７ｍｇ（ｐ＜０．００１）であった。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置ＷＴマウスでは、平均精巣重量は１８．３６ｍｇであり、ｆｍｒ１ ＫＯのＧ−２−ＭｅＰＥ処置マウスでは、精巣重量は１８．７へとかなり減少した。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置後のＦＸＳマウスにおける、精巣の縮小という本発明者らの観察を支持して、精巣において、ＧｐＩ ｍＧｌｕＲ ＲＮＡがかなり多量に発現し、細精管および生殖細胞において、高いレベルでｍＧｌｕＲ５とｍＧｌｕＲ１の両方が発現するのを伴うことが、Ｓｔｏｒｔｏ（２００１）により以前に発表されているが、そこでのそれらの機能は知られていない。しかし、ｍＧｌｕＲアンタゴニストによる処置後に、ＦＸＳマウスにおける巨精巣症の軽減という矛盾した報告が存在することに留意することは興味深く、（同じ実験室からでさえも）現在のところ、精巣におけるｍＧｌｕＲの役割は、十分に理解されていないことを示している。作用機序にかかわらず、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、ｆｒｍ１ ＫＯ動物において巨精巣症を元に戻すのに有効であることを見出した。

【0200】

Ｇ−２−ＭｅＰＥは、野生型マウスにおいて精巣重量にほとんど影響を及ぼさなかった。しかし、Ｇ−２−ＭｅＰＥ投与は、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて見られる精巣重量の増加を有意に元に戻した（図３２）。Ｇ−２−ＭｅＰＥのこうした効果は、実質的、統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0201】

５．Ｒａｓ−Ｍｅｋ−ＥＲＫおよびＡｋｔ発現
ニューロンは、脆弱Ｘ精神発達遅滞タンパク質により非常に影響を受け、このタンパク質は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ−Ａｋｔ−哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）、およびＲａｓ-ＥＲＫシグナル伝達カスケードを介して、局所的な樹状突起翻訳を調節し、ｍＧｌｕＲ５シグナル伝達カスケードに関与する。これらの経路がＧ−２−ＭｅＰＥ処置により影響を受けるかどうかを決定するため、行動試験が終了した後（Ｇ−２−ＭｅＰＥを最後に注射して１２日後）、動物を犠牲にして、ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔの発現を測定した。ここで、Ｇ−２−ＭｅＰＥ（１００ｍｇ／ｋｇ）によるｆｍｒ１ ＫＯマウスを４週間処置すると、半定量的ホスホ特異的ウエスタンブロット法によりアッセイすると、リン酸化ＥＲＫ１／２経路タンパク質のレベルに影響を及ぼすことを実証した。この効果が、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより最後に処置を行って１２日後に、動物で観察されたことは、まったく予想外のことであった。

【0202】

全ＥＲＫ発現は、ｆｍｒ１ノックアウトまたは薬物処置のいずれによっても有意に影響を受けなかったが（図３３Ｃおよび３３Ｄ）、ｆｍｒ１ ＫＯのＧ−２−ＭｅＰＥ処置マウスでは、ＥＲＫ発現レベルの増加が観察された（ｐ＜０．０５）。
リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のレベルによって指標とされる、ＥＲＫ活性化は、野生型対照と比べて、基剤処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて増加した（図３３Ａおよび３３Ｂ）。Ｇ−２−ＭｅＰＥによる４週間の処置により、ｆｍｒ１ ＫＯ基剤処置マウスと比べて、ｆｍｒ１ ＫＯマウスの脳において増加したｐＥＲＫがかなり低下した。ウエスタンブロットを、存在しているＧＡＰＤＨタンパク質の量に正規化した。ｆｍｒ１ ＫＯ−基剤処置マウスにおいて増加したＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）は、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置によってかなり低下した（ｐ＜０．０５）。
脆弱Ｘ症候群を有する個体について以前に報告された通り、ｍＴＯＲシグナル伝達、およびｍＴＯＲにより活性化される別の翻訳イニシエータであるｅＩＦ４Ｆを活性化するタンパク質である、リン酸化Ａｋｔのレベルが、基剤処置野生型マウスと比べて、基剤処置ｆｍｒ１ ＫＯマウスの脳においてかなり増加したことを観察した。総合的に、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより処置されたｆｍｒ１ ＫＯマウスにおける全Ａｋｔと比べて（ｐ＜０．０５）、Ａｋｔリン酸化がかなり低下することを観察した（図３４Ａおよび３４Ｂ）。Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置のこうした結果は、実質的、統計的に有意であり、従来技術に基づくと完全に予想外であった。

【0203】

結論
結論として、優れた表面的妥当性を有する脆弱Ｘ症候群のモデルである、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて記載した研究は、以下にまとめられている通り、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置の場合にすべてが逆戻りした野生型マウスと比べて、多くの表現型変化があることを明確に実証した。

【0204】

・活動過多：
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、オープンフィールド試験、連続通路試験、および高架式十字迷路試験において活動過多を示した。この活動過多は、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより元に戻った。総合的に、これらのデータは、得られた他の行動試験データ、および脆弱Ｘ症候群患者において示される重要な欠陥と一致する。これらの異常は、Ｇ−２−ＭｅＰＥによる処置によって元に戻った。
・学習：
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、馴化（短期記憶）に欠陥を示し、この欠陥は、Ｇ−２−ＭｅＰＥ処置により元に戻った。
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、脈絡恐怖条件づけにおける学習欠陥を示し、この欠陥は、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより元に戻った。
・社会的行動および複雑な種に典型的な行動：
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、異常な社会的交流を示し、これはＧ−２−ＭｅＰＥにより元に戻り；
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、ガラス玉覆い隠し、および次の建物（ｎｅｘｔ ｂｕｉｌｄｉｎｇ）において異常を示し、これらは、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより元に戻った。

【0205】

・ＣＮＳおよび末梢形態および分子経路：
− ｆｍｒ１ ＫＯマウスに由来する海馬のニューロンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹状突起棘数の増加を示し、効果は、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより元に戻り；
− Ｇ−２−ＭｅＰＥにより、ｆｍｒ１ ＫＯマウスの脳において、ＥＲＫおよびＡｋｔの異常な活性化は元に戻った。
・巨精巣症
− ｆｍｒ１ ＫＯ対照マウスは、巨精巣症を示し、これは、Ｇ−２−ＭｅＰＥにより元に戻った。
ｆｍｒ１欠乏ミラー効果を有するマウスの徴候および症状が、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を有するヒトにおいて見られるので、ならびにｆｍｒ１ ＫＯマウスにおける根底にある遺伝子欠損が、ＦＸＳを有するヒトと同じであるので、これらの結果は、脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおいて、効果をかなり予測すると結論づける。

【0206】

ｆｍｒ１ノックアウト動物において観察されるＧ−２−ＭｅＰＥの効果は、動物における正常なニューロンおよびシナプス状態を誘発する薬物の能力による可能性が高いと結論づける。この結論は、以下の知見により支持される。（１）Ｇ−２−ＭｅＰＥは、約３０分間のｉｎ ｖｉｖｏでの血漿半減期を有した。（２）ｆｍｒ１ノックアウト動物の行動試験の正常化は、行動試験を実施する時までに、動物の身体から、Ｇ−２−ＭｅＰＥが恐らく完全に洗い流されたかなり後に観察された。（３）ｐＡｋｔおよびｐＥＲＫの発現の測定は、Ｇ−２−ＭｅＰＥが恐らく洗い流されたかなり後に行われた。
したがって、Ｇ−２−ＭｅＰＥは、脆弱Ｘ症候群および他の自閉症スペクトラム障害を患っているヒトに対する有効な処置となり得ると結論づける。

【0207】

参照文献
本明細書で引用した、以下の参照文献、ならびにすべての特許、特許出願、および他の出版物は、参照により完全に組み込まれている。
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図31E】

【図31F】

【図31G】

【図31H】

【図31I】

【図32】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図34A】

【図34B】

【国際調査報告】