特表 2016-507514 加齢黄斑変性の処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-507514(P2016-507514A)

(43)【公表日】2016年3月10日

(54)【発明の名称】加齢黄斑変性の処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/713 20060101AFI20160212BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20160212BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160212BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20160212BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20160212BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20160212BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/713

   C12N15/00 GZNA

   A61K48/00

   A61P9/00

   A61P27/02

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】157

(21)【出願番号】特願2015-551090(P2015-551090)

(86)(22)【出願日】2014年1月8日

(85)【翻訳文提出日】2015年9月7日

(86)【国際出願番号】AU2014000007

(87)【国際公開番号】WO2014107763

(87)【国際公開日】20140717

(31)【優先権主張番号】61/750,086

(32)【優先日】2013年1月8日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】515184684

【氏名又は名称】ベニテック バイオファーマ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】スーイ，デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】マオ，ティン

(72)【発明者】

【氏名】カオ，シー−チュ

【テーマコード（参考）】

4B024

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024CA11

4B024DA03

4B024EA04

4B024GA11

4B024HA17

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA332

4C084ZA362

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086ZA33

4C086ZA36

(57)【要約】

本発明は、加齢黄斑変性を処置するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）薬およびそのＲＮＡｉ薬の使用、さらには、本発明のＲＮＡｉ薬を含有する医薬組成物を対象とする。このＲＮＡｉ薬は、細胞中（ｉｎ ｖｉｖｏ中を含む）でその薬剤を発現するための発現カセットまたはコンストラクトと共に、ＡＭＤ関連遺伝子の発現を阻害、防止、または低減するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬（ＲＮＡ分子である）である。好ましくは、このＡＭＤ関連遺伝子は、滲出型ＡＭＤに関係するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列、
を含み、その際、前記エフェクター配列が、前記１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である前記ｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項2】

第２のエフェクター配列および第２のエフェクター相補配列を含む、請求項１に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項3】

５’から３’方向で、
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列、
第２のエフェクター相補配列；および
第１のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、前記１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である、請求項２に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項4】

５’から３’方向で、
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；および
第２のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、前記１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である、請求項２に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項5】

前記ＡＭＤ関連遺伝子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−β、およびＣＦＢの１つまたは複数から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項6】

前記ターゲット配列が、配列番号１〜３９のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項7】

前記ＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦ−Ａであり、かつ各エフェクター配列が配列番号４０〜４９から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項8】

前記ＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦＲ２であり、かつ各エフェクター配列が配列番号５０〜５９から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項9】

前記ＡＭＤ関連遺伝子がＰＤＧＦＲ−βであり、かつ各エフェクター配列が配列番号６０〜６９から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項10】

前記ＡＭＤ関連遺伝子がＣＦＢであり、かつ各エフェクター配列が配列番号７０〜７８から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項11】

ｍｉＲＮＡ構造内で発現される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項12】

前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬。

【請求項13】

請求項１から１２のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのｄｄＲＮＡｉ発現カセットであって、
（不特定の順序で）
１つまたは複数のプロモーター配列、
１つまたは複数のエフェクター配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；
および場合により、
１つまたは複数のターミネーター配列、
ループ配列、スペーサー配列、またはその両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエンハンサー配列
を含む前記ｄｄＲＮＡｉ発現カセット。

【請求項14】

ｍｉＲＮＡエンコーディング（ＭＥ）配列をさらに含む、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット。

【請求項15】

請求項１３または１４に記載のｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト。

【請求項16】

ウイルス送達コンストラクトである、請求項１５に記載のｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト。

【請求項17】

治療有効量の、請求項１５または１６に記載のｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを投与することを含む、対象におけるＡＭＤを処置する方法。

【請求項18】

前記ＡＭＤが滲出型ＡＭＤである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

治療有効量の、請求項１５または１６に記載のｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを投与することを含む、対象における脈絡膜血管新生を処置する方法。

【請求項20】

治療有効量の、請求項１５または１６に記載のｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを投与することを含む、対象におけるドルーゼン沈着物を低減する方法。

【請求項21】

前記ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを硝子体内注射により前記対象の眼に投与する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

請求項１５または１６に記載のｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は、加齢黄斑変性を処置するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）薬およびそのＲＮＡｉ薬の使用、さらには、本発明のＲＮＡｉ薬を含有する医薬組成物を対象とする。

【背景技術】

【0002】

本発明の背景
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、米国および他の多くの先進国における不可逆的な視力低下の主な原因である。「乾燥型」ＡＭＤが黄斑変性の最も一般的な種類であり、その状態の人々のうちの９０％が罹患している。この乾燥型は、眼に入った光を感受する網膜の特殊構造領域である黄斑内にドルーゼンが形成することにより特徴づけられる。典型的には、ドルーゼンは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞下に形成され、その存在は、光受容細胞を支持するＲＰＥ層の破壊または薄化により、光受容体の萎縮につながると考えられている。また、網膜内にドルーゼンが存在し続けることは、持続性の炎症反応につながり、また、滲出型ＡＭＤに最終的につながり得る二次応答のカスケードをもたらすと考えられている。

【0003】

ＡＭＤの「滲出型」は、多くの場合に脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と称されるプロセスにおける網膜の後ろに位置する血管系からの血管の異常な増殖により特徴づけられる。乾燥型のように優勢ではないものの、滲出型はより急速に発症し、また、より深刻な表現型であり、多くの場合に、視野の大部分の縮小をもたらす。

【0004】

滲出型ＡＭＤのための現行の標準治療は、細胞から分泌され、発生期血管の形成または成長を引き起こすことが公知の分子成分である血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）に対して強い親和性を有するモノクローナル抗体断片であるラニビズマブ（ＲＡＮ）である。ＲＡＮは、ＶＥＧＦ−Ａに結合して、その生物学的活性を阻害し、それにより、内皮細胞の表面上でのＶＥＧＦ−Ａとその受容体（ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）との相互作用を防止する。その結果、内皮細胞増殖の低減、血管漏出の低下、およびＣＮＶに特徴的な新たな血管形成の低減が生じる。

【0005】

しかしながら、ＲＡＮの眼内半減期は、硝子体内注射後９日間に過ぎず、したがって、血管増殖の抑制を有効に維持するためには、治療量を患者に毎月投与しなければならない。視力の安定化という点では患者の約９５％において有用であるが、視力の改善は、患者の２９％〜４０％において認められたにすぎない。ＲＡＮは、分泌されたＶＥＧＦ−Ａを拭き取る分子スポンジとして作用する。このプロセスにおける非効率性が、多くの患者において視力が安定化されるだけで改善しない理由の１つであり得る。言い換えると、これは、症状は治療するが、原因は治療しない。

【0006】

既存のモノクローナル抗体による滲出型ＡＭＤ治療の主な欠点は、頻繁で連続的な処置を必要とすること、典型的には眼への毎月の注射を必要とすることである。人口が急速に高齢化していることと、対応して、この治療の適用である硝子体内注射の投与に適任な臨床家の人数が少ないことを考え合わせると、これは、多大な負担を医療制度に課している。したがって明らかに、より長期の持続的処置および／または症状を反転させ得る処置が必要とされている。滲出型ＡＭＤのための代替処置も、その投与頻度、さらにはその副作用または不十分な有効性の結果として、同様に不十分である。

【0007】

治験を開始するさらに新しい薬物の１つが、ＶＥＧＦＲ−１受容体の第２結合ドメインおよびＶＥＧＦＲ２受容体１の第３ドメインを組み込んでいるＶＥＧＦ Ｔｒａｐ Ｅｙｅ（ＶＴＥ）のものである。これらの細胞外タンパク質配列をヒトＩｇＧバックボーンのＦｃセグメントに融合させることにより、開発者らは、非常に高いＶＥＧＦ結合親和性を有するキメラタンパク質を作成している（Ｓｔｅｗａｒｔ ＭＷ． Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ（２０１２）． ｄｏｉ：１０．１１３６／ｂｊｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ−２０１１−３００６５４）。ＶＥＧＦ−Ａファミリーのすべての異性体に結合するだけでなく、これは、ＶＥＧＦ−Ｂおよび胎盤成長因子にも結合する。

【0008】

しかしながら、このキメラタンパク質が依然として、相対的に短期の半減期を有するという事実により、ＶＴＥは依然として、２カ月毎に定期的に投与しなければならない。

【0009】

ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃにカップリングした改変可溶性Ｆｌｔ１受容体を発現する遺伝子治療用ベクターである。高親和性ＶＥＧＦ結合タンパク質として、ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１は、硝子体内注射による滲出型ＡＭＤの処置では、ＶＥＧＦの血管新生促進活性を中和するように機能する（Ｗａｓｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ． １９ ｎｏ． ２ Ｆｅｂ． ２０１１； ３２６〜３３４）。ＡＡＶベクターの使用は、１回の注射から数か月または数年にさえわたって持続する長期の発現を保証すると予測される。しかしながら、ｓＦＬＴ０１およびＩｇＧ１重鎖Ｆｃ融合タンパク質を収容するためには、一本鎖ＡＡＶを使用しなければならず、これは、効率的な導入のために高品質のベクターを必要とし、したがって、ウイルスカプシドタンパク質に対する免疫応答のリスクを増大させる。さらに、有病率の高い正常な成人集団が、ＡＡＶの血清型２変異体に暴露されていて、これに対して既存の免疫を有していることもある。

【0010】

分子ＰＦ−０４５２３６５５は、低酸素誘導遺伝子ＲＴＰ８０１の発現を阻害する１９ヌクレオチドｓｉＲＮＡである（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ． ２０１２ Ｓｅｐ；１１９（９）：１８６７〜７３）。今日までに行われた臨床研究において、これは、血管新生および血管漏出を防ぐが、ＶＥＧＦとは異なる経路により防ぐことが見出されている。ｓｉＲＮＡは、眼内に数週間にわたってしか残存しないことが実証されており、このことは、他の既存の治療および開発中の治療の多くと同様に、患者が、処置のために定期的な硝子体内注射を必要とするであろうことを意味する。多くの処置でそのようにすることができなければ、視力の連続的な低下および変性の進行が生じている。

【0011】

より一般に、滲出型ＡＭＤを処置および管理するための先行するｓｉＲＮＡベースの手法は失敗している。当初の前臨床的実験結果は励みとなるものであったが、後に、これらの分子の作用機序は、配列特異的ＲＮＡｉベースの機序によるものではなく、むしろ、ｓｉＲＮＡとＴｏｌｌ様受容体ＴＬＲ３との相互作用により媒介される非特異的インターフェロン応答の誘導によるものであることが実証された（Ｋｌｅｉｎｍａｎｎら、２００８）。Ｔｏｌｌ様受容体は、先天免疫系において鍵となる役割を果たす膜貫通タンパク質である。細胞表面上またはエンドソームなどの細胞内ベシクル上に多くの場合に位置するので、このファミリーの一部のファミリーメンバーは、内在細胞中に通常は存在しない二本鎖ＲＮＡを外来物質として認識し、分子応答カスケードの引き金を引く。これは、インターフェロンの活性化をもたらし、そのインターフェロンの活性化は、マウスモデルにおいて一過性の治療効果を有する。しかしながら、インターフェロンは、ヒトにおいてはかなり低い有効性を有し、これは、ヒト治験におけるこの処置の不十分な有効性が説明している。

【0012】

Ｒｅｔｉｎｏｓｔａｔは、両方とも眼コンパートメント内に天然に存在する血管形成阻害物質であるアンジオスタチンおよびエンドスタチンを発現する、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとしたレンチウイルスベクターである。エンドスタチンは、ＶＥＧＦシグナル伝達を遮断し、血管透過性を低減させ、低下細胞マトリックス接着を低下させ、かつ内皮細胞アポトーシスを促進する。アンジオスタチンは、内皮細胞増殖および遊走を防止する。その遺伝子は、網膜下注射により送達され、新たな血管の形成を阻害する。しかしながら、網膜下送達は、集中的な外科手術を必要とし、これは、硝子体内への送達とは異なり、外来患者の処置または地元の医師での処置に適さない。

【0013】

ＡＭＤ治療学、特に滲出型ＡＭＤの分野において、開発活動が盛んであるにも関わらず、副作用、処置様式、およびその頻度に関しても患者に優しい、より有効な治療を創製する必要が依然として存在する。本発明は、個体における滲出型ＡＭＤを管理および処置するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）薬およびそのＲＮＡｉ薬の使用を対象とする。

【0014】

ＲＮＡｉ経路は、
1441584294895_0
（ｄｓＲＮＡ）分子を、約２０〜２５のヌクレオチドの短い断片（一般に、ｓｉＲＮＡと称される）に切断する酵素
1441584294895_1
により開始される。次いで、ガイド鎖または活性鎖として公知の各断片の２本の鎖のうちの１本は、アルゴノートタンパク質ファミリーのメンバーへの結合により、
1441584294895_2
（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。ＲＩＳＣへの組み込みの後に、ガイド鎖は、そのターゲットｍＲＮＡと塩基対形成し、翻訳の阻害（翻訳機構の失速により）および／またはｍＲＮＡの切断の誘導のいずれかにより、ターゲットを阻害し、それにより、ターゲットが翻訳テンプレートとして使用されることを防ぐと考えられる。

【0015】

ダイサーにより産生される断片は二本鎖であるが、ガイド鎖のみが、遺伝子サイレンシングを指示する。アンチガイド鎖（一般に、パッセンジャー鎖およびキャリア鎖、または＊鎖と称される）は往々にして、ＲＩＳＣ活性化の間に分解される（Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｒら、２００５）。ＲＩＳＣアセンブリは、ｄｓＲＮＡダイサー産物のいずれの鎖をＲＩＳＣに負荷するかを選択する酵素により管理されると考えられる。この鎖は通常、その５’末端がその補足物とあまり緊密に対形成されていない鎖である。また、５’位には、一部のアルゴノートタンパク質への結合を促進するために、Ａについての明確なバイアスおよびより低い程度でＵについてのバイアスが存在するようである（Ｓｃｈｗａｒｚ ＤＳら、２００３； Ｆｒａｎｋ Ｆ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0016】

本発明は、この分野におけるＲＮＡｉ治療が直面する先行する困難を克服しつつ、上記ですでに検討したとおりの他の治療に随伴する問題の克服に努めるものである。

【0017】

本明細書におけるいずれの従来技術に対する参照も、この従来技術がオーストラリアまたはいずれの他の管轄における一般共通知識の一部を形成しているか、またはこの従来技術が、当業者により、容易に確認され、理解され、関連するとみなされると予測され得るであろうとの承認もしくは何らかの形の示唆ではなく、また、そのように解釈されるべきではない。

【課題を解決するための手段】

【0018】

発明の概要
ＡＭＤ、特に滲出型ＡＭＤのための長期治療が、いまだ叶えられることなく必要とされている。本発明者らは、特定のＲＮＡｉコンストラクトが、ＡＭＤの発生に関連する遺伝子（まとめて「ＡＭＤ関連遺伝子」と称される）の発現をダウンレギュレートする能力を有することを発見した。次いで、これは、ＡＭＤおよび随伴する視力低下の進行を減速させ、一部の場合には、視力の改善をもたらすことができる。これらのターゲット配列の長期抑制を達成するために、非侵襲性の手法でＲＮＡｉ薬をターゲット細胞へと向かわせるベクター送達ビヒクルの使用と一緒に、ＲＮＡｉ技術を利用することにより、この必要に応えることができ、また、患者に簡便で優しい手法で応えることができる。さらに、ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ（ｄｄＲＮＡｉ）コンストラクトから発現されるＲＮＡ薬は核で産生され、細胞表面上、またはエンドソームコンパートメント（ｅｎｄｏｍａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内のいずれのＴｏｌｌ様受容体とも相互作用しないので、ｄｄＲＮＡｉ薬は、ＴＬＲによりインターフェロン応答を活性化させることなく、産生され得る。

【0019】

本発明の一態様では、ＡＭＤ関連遺伝子、好ましくは、滲出型ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬（ＲＮＡ分子である）、および細胞（ｉｎ ｖｉｖｏを含む）中でこの薬剤を発現するための発現カセットまたはコンストラクトであって、この薬剤は、
・少なくとも１７のヌクレオチドのエフェクター配列（以下でさらに説明）、および
・エフェクター相補配列を含み、その際、このエフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して相補的か、または実質的に相補的であるＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬、および細胞中でこの薬剤を発現するための発現カセットまたはコンストラクトを提供する。

【0020】

ターゲット領域は、配列番号１〜３９のいずれか１つまたは複数から選択されるターゲット配列の転写産物内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択することができる。エフェクター相補配列は、二本鎖ＲＮＡセグメントを形成するようにアニールする傾向を有するように、エフェクター配列に対して実質的に相補的である。

【0021】

エフェクター配列は、ターゲット遺伝子のターゲット配列の転写産物内のターゲット領域を対象とする。したがって、エフェクター配列は、ターゲット領域を含有するターゲット遺伝子からの転写産物に対して、配列において実質的に相補的であることによって（「実質的な相補性」は以下で定義するとおり）、ターゲット領域に対して「指向性」である。したがって、エフェクター配列を含有する二本鎖部分を有するｄｄＲＮＡｉ薬などのＲＮＡｉ薬は、ターゲット領域を含有するターゲット遺伝子配列により、「ターゲット遺伝子配列の発現を阻害する」ことができる。したがって、ＡＭＤ関連遺伝子を有する細胞内で、エフェクターの配列（「エフェクター」は以下で定義するとおり）が、ターゲット遺伝子の（少なくとも）ｍＲＮＡターゲット配列の領域に対して実質的に相補的であるので、ＲＮＡｉ薬は、ターゲット遺伝子配列の発現を阻害することができる。これは、次の無作為の仮定的な短い配列を考えることで例示することができる：
５’ＧＧＣＡＴＴＧＣＧ３’ ターゲット配列内のターゲット領域
５’ＧＧＣＡＵＵＧＣＧ３’ ターゲット配列の転写産物
３’ＧＵＡＡＣＧ５’ ターゲット配列の転写産物中のターゲット領域に対して実質的に相補的なエフェクター配列。

【0022】

典型的には、ターゲット領域は、サイレンシングされるか、またはその発現が（転写または翻訳のレベルで）低減、阻害、もしくは防止されることが意図されている遺伝子のｍＲＮＡ内の核酸配列の領域である。

【0023】

上記の例示的な比較で示すことができるように、エフェクター配列とエフェクター相補配列との間の「実質的な相補性」は、１００％相補性であってよい。しかしながら、以下でより詳細に説明され、さらに定義されるとおり、実質的な相補性は、８０％〜１００％相補的であってよい。したがって、例えば、２０のヌクレオチドの長さを有するエフェクター配列では、２０のヌクレオチドのうちの１７のヌクレオチドが相補的である、すなわち、８５％相補性であれば、そのエフェクター配列は、エフェクター相補配列に対して実質的に相補的である。さらに通常は、二本鎖セグメントの一端が、ｓｈＲＮＡと称される「ヘアピン」形状の構造を形成するように、ループ配列により連結されている。そのようなＲＮＡ配列をコードするＤＮＡは、ループをコードするスタッファーまたはスペーサー配列により中断される、エフェクター配列に転写されるターゲット遺伝子の領域の中断される繰り返しを含有するので、これは「中断逆転繰り返し「ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ」構造としても公知である。

【0024】

上記のパラグラフにおいて記載した実質的に相補的のコンセプトは、エフェクター配列とターゲット配列との実質的な相補性にも等しく当てはまり、この際、実質的な相補性は、８０％〜１００％相補性であってよい。すなわち、ターゲット配列内のターゲット領域が２０ヌクレオチド長であり、かつエフェクター配列が２０ヌクレオチド長である場合に、エフェクター配列は、ターゲットと相補的な例えば、１６、１７、１８、または２０のヌクレオチドを有すればよく、これは、それぞれ８０％、８５％、９０％、および１００％相補性に等しい。

【0025】

いずれの場合においても、実質的な相補性は、全数に至るまで等しくなくてもよいことは分かるであろう。例えば、２２のヌクレオチドの配列に対する少なくとも８５％相補性は１８．７のヌクレオチドであり、したがって、２２のうちの１９が相補的であることが有効な要件となる。

【0026】

別法では、８０〜１００％相補性の実質的な相補性（エフェクターとターゲットとの間、およびエフェクターとその相補部との間の実質的な相補性の両方の内容において）は、Ｇ−Ｃ／Ａ−Ｕ塩基対形成しないヌクレオチドの数に関して記載することができる（下記で記載するとおりのウォッブル対を除く）。ヌクレオチド配列全体にわたる少なくとも８０％相補性で考慮すると、２つのＲＮＡの間の相補的領域内に、他の鎖上のヌクレオチドと相互に相補的ではない１、２、３、４、または５つのヌクレオチドが存在してよい。塩基対形成しない１、２、３、４、または５つのヌクレオチドが存在してよいかどうかは、関連配列の長さに依存する。例えば、エフェクター配列が１７ヌクレオチド長である場合、これは、７１％相補性に等しいにすぎないので、塩基対形成しないヌクレオチドを５つ有することはできない。１７ヌクレオチド配列では、少なくとも８０％相補性では、１７のヌクレオチドのうちの１４の間で相補性が存在しなければならない。

【0027】

本発明の好ましい一実施形態では、エフェクター配列およびその相補部により形成される二本鎖領域は、内因性ＲＮＡｉプロセシング経路のための天然基質である内在ｍｉＲＮＡの構造と同様のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）構造の一部として発現される。ｄｄＲＮＡｉコンストラクトから発現される二本鎖ＲＮＡのプロセシングは、不正確であり得、毒性をもたらし得る。ＭｃＢｒｉｄｅら（２００８）は、内在ｍｉＲＮＡの塩基およびループから配列を発現する「人工ｍｉＲＮＡ」コンストラクトを設計し、ｍｉＲバックボーンから発現されたｓｈＲＮＡのより正確なプロセシングがコンストラクトからの毒性の低減をもたらすことを示唆した。Ｗｕら（２０１１）は、ことによると、内在ｍｉＲＮＡに対するそれらのより大きな構造上の類似により、二重鎖のミスマッチ（パッセンジャー鎖中にミスマッチを含有）は時には、サイレンシング活性の増大を示すことを示した。

【0028】

本発明の一態様では、ＡＭＤ関連遺伝子、好ましくは、滲出型ＡＭＤ関連遺伝子の発現を阻害、防止、または低減するためのｄｄＲＮＡｉ薬、および細胞においてその薬剤を発現するための発現カセットであって、その薬剤が、
ターゲット領域の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して相補的または実質的に相補的な少なくとも１７ヌクレオチド長のエフェクター配列、およびエフェクター相補配列
を含み、その際、そのエフェクター配列およびそのエフェクター相補配列が、ｍｉＲＮＡ構造内で発現されるｄｄＲＮＡｉ薬、および細胞においてその薬剤を発現するための発現カセットを提供する。ターゲット領域は、配列番号１〜３９のいずれか１つまたは複数から選択される配列の転写産物内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択することができる。

【0029】

本発明の一部の形態では、この薬剤は、１つを超えるエフェクター配列を有する。複数のエフェクターは、滲出型ＡＭＤ関連遺伝子の同じ領域（典型的には、同じ領域の変異体）、滲出型ＡＭＤ関連遺伝子の異なる領域、１つより多い滲出型ＡＭＤ関連遺伝子、または上記のすべての組み合わせをターゲティングし得る。

【0030】

ｄｄＲＮＡｉ薬などのＲＮＡｉ薬は、２つまたは３つ以上のエフェクター配列を含有してよい。上記で説明したとおり、ｄｄＲＮＡｉ薬は、各エフェクター配列についてのエフェクター相補配列を含み、したがって、複数のエフェクター−エフェクター相補部対を形成する（すなわち、第１のエフェクター−第１のエフェクター相補部対、第２のエフェクター−第２のエフェクター相補部対など）。これらの対は、それぞれの対のアニールが可能であるようにＲＮＡｉ薬が折り重なり得る限り、必ずではないが、互いに連続していてよい。様々な他の考察が、ＲＮＡｉ薬の長さに沿ったエフェクターおよびエフェクター相補部のいろいろな順序を示唆している。加えて、当業者であれば理解するであろうとおり、また、図面において図示しているとおり、任意の個別のエフェクター配列が、その薬剤中のその相補部と位置交換されていてよい。重要な特徴は、以下の様々な実施形態において例示するとおり、エフェクター配列が、その相補部とアニールして、二本鎖領域を形成し得ることである。例えば：
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；第３のエフェクター配列；第３のエフェクター相補配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター；第１のエフェクター相補配列；第２のエフェクター配列；および第２のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第１のエフェクター相補配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；第３のエフェクター配列；および第３のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第１のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドの配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および第２のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第１のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および第２のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬；
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第１のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第３のエフェクター配列；および第３のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬。

【0031】

非自己相補的ヌクレオチドは、エフェクターとその相補部との間にある場合にはループ配列として、また、あるエフェクター配列の相補部と次のエフェクター配列との間に位置する場合には、スペーサー配列として作用する。これらの実施形態のそれぞれでは、エフェクター配列およびその相補部、さらには、２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドの配列などの任意の追加の配列は、ｍｉＲＮＡ構造内で、またはその一部において発現される。

【0032】

上記実施形態のそれぞれの特定の形態では、各エフェクター配列は、少なくとも１７ヌクレオチド長、好ましくは１７〜３０ヌクレオチド長、より好ましくは１７〜２１ヌクレオチド長であり、配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列からの任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。エフェクター配列はすべて同じであっても、またはすべて異なっても、または組み合わせ、例えば、配列番号４７の少なくとも１０の連続するヌクレオチドの２つのエフェクター配列と、配列番号５６の少なくとも１０の連続するヌクレオチドの１つのエフェクター配列との組み合わせであってもよい。

【0033】

好ましくは、エフェクター配列は、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの任意の連続する１１、１２、１３、１４、１５、または１６のヌクレオチド、好ましくは、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの１７以上の連続するヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの１７〜２１の連続するヌクレオチドからなる群から選択される。典型的には、エフェクター相補部は、その対応するエフェクター配列と同じ長さ、またはほぼ同じ長さ（すなわち、±１５％ヌクレオチド長、または全長に応じて±１〜３のヌクレオチド）であろう。

【0034】

特定の実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８（４０および７８を含む）のいずれか１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列からなるか、または主にそれからなる。これらの実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬の配列番号４０〜７８、さらには、追加のヌクレオチドまたは他の化学的改変は、下記のアッセイに従って決定することができるとおり、ターゲット遺伝子の発現を阻害、低減、または防止するための活性を示す限り、配列番号４０〜７８「から本質的になる」であろう。同様に、ＲＮＡｉ薬は、下記のアッセイに従って決定することができるとおり、ターゲット遺伝子の発現を阻害、低減、または防止するための活性を示す限り、対応する配列番号よりも短いが、配列番号４０〜７８の１つ「から本質的になる」。

【0035】

代替実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アニールされて二重鎖を形成している２つの別々のＲＮＡ鎖からなる。次いで、この二重鎖は、ｍｉＲＮＡバックボーンに埋め込まれてよい。

【0036】

ｄｄＲＮＡｉ薬は、任意の適切なベクターまたはｄｄＲＮＡｉコンストラクトに挿入されたＤＮＡ発現カセットから発現されてよい。したがって、本発明の態様では、
（不特定の順序で）
・１つまたは複数のプロモーター配列、
・１つまたは複数のエフェクター配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列（好ましくは配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列）、
・１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
ならびに場合により、
・１つまたは複数のターミネーター配列、
・スペーサー配列、ループ配列、またはその両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；および
・１つまたは複数のエンハンサー配列
を含むｄｄＲＮＡｉ発現カセットを提供する。

【0037】

一部の実施形態では、複数のエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬が産生されるように、１つのプロモーターが、複数のエフェクターコード領域に機能的に連結されている。各エフェクターコード領域が、それ自身のプロモーターに機能的に連結されている代替実施形態では、複数のｄｄＲＮＡｉ薬が、単一の発現カセットから産生される。複数のプロモーターが存在するコンストラクトでは、これらは、すべて同じでも、または異なってもよい。好ましいプロモーターは、Ｕ６およびＨ１などのｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ＲＰＥ細胞特異的プロモーターＲＰＥ−６５（Ｂｏｙｅら２０１２）およびＶＭＤ２（Ｚｈｕら、２０１０）などのｐｏｌ ＩＩプロモーターであり、脈絡膜内皮特異的プロモーターＦＬＴ−１またはＩＣＡＭ２も、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトの発現を駆動するために使用することができる。

【0038】

エフェクター配列およびその相補部が、ｍｉＲＮＡ構造内で発現される実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは追加で、本明細書においてｍｉＲＮＡコード（ＭＥ）配列と称されるｍｉＲＮＡ構造をコードする配列を含む。ＭＥ配列はまた、ループ配列をコードすることができる。

【0039】

また、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットが発現のために挿入されているｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを提供する。加えて、コンストラクトのベクターバックボーンが送達システムと適合性である場合には、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトはまた、送達コンストラクトである。特に好ましい送達コンストラクトは、硝子体内への注射の後にｄｄＲＮＡｉ発現カセットを網膜深部の適切な細胞に送達することを可能にする改変アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターである（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａら、２０１１）。細胞内から治療用ｄｄＲＮＡｉ薬を産生する発現コンストラクトを送達するために改変ＡＡＶを使用することで、表面発現されるｔｏｌｌ様受容体３との核酸の直接的な相互作用に起因することが多いインターフェロン応答が回避される。これは、治験におけるｓｉＲＮＡベースの眼薬のいくつかの失敗の理由であると仮定される。

【0040】

したがって、この実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトであって、この発現カセットが、
（不特定の順序で）
１つまたは複数のプロモーター配列、
１つまたは複数のエフェクター配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
ならびに場合により、
１つまたは複数のターミネーター配列、
ループ配列、スペーサー配列、またはその両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；および
１つまたは複数のエンハンサー配列
を含み、その際、そのコンストラクトがウイルスベクター送達ビヒクルであるｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを提供する。

【0041】

好ましくは、発現カセットは、ｄｄＲＮＡｉ薬がｍｉＲＮＡ構造の一部として、またはその中で発現されるように、ＭＥ配列をさらに含む。

【0042】

一実施形態では、ウイルスベクター送達コンストラクトの発現カセットは、ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号４７）の５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列をコードする１つのＤＮＡ配列を含む。

【0043】

さらなる一実施形態では、ウイルスベクター送達コンストラクトの発現カセットは、ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＲＦ−２（配列番号５６）の５’ ＵＧＵＡＡＣＡＧＡＵＧＡＧＡＵＧＣＵＣＣＡ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列およびＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＦＡ（配列番号４７）の５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。

【0044】

また別の代替実施形態では、ウイルスベクター送達コンストラクトの発現カセットは、ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＲＦ−２（配列番号５２）の５’ ＡＡＧＵＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＵＧＧＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；ＡＭＤ関連遺伝子ＣＦＢ（配列番号７８）の５’ ＵＵＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＵＣＣＵＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列；およびＡＭＤ関連遺伝子ＰＤＧＦＲ−β（配列番号６３）の５’ ＵＡＧＣＵＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＵＣＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第３のエフェクター配列をコードする３つのＤＮＡ配列を含む。

【0045】

本発明はまた、配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１７ヌクレオチド長の配列およびその配列が共に二重鎖を形成する配列相補部を含み、滲出型ＡＭＤ関連遺伝子の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡ薬を提供する。

【0046】

一部の実施形態では、対象においてＡＭＤ関連遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現を阻害する方法であって、対象に、配列番号４０〜７８および配列番号４０〜７８とは１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なる配列のいずれか１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列から主になるか、またはそれからなるｄｄＲＮＡｉ薬を含む本発明の組成物を投与することを含む方法を提供する。このｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのｄｄＲＮＡｉ発現カセットまたはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトも投与することができる。

【0047】

別の実施形態では、本発明は、対象におけるＡＭＤ、好ましくは、滲出型ＡＭＤを処置するか、または網膜内での不適切な血管新生に起因する他の疾患を処置するための組成物であって、活性成分として、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを含む組成物を提供する。

【0048】

別の実施形態では、本発明は、主な成分として、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを有効量で含む医薬組成物を提供する。。この組成物は、例えば、対象におけるＡＭＤ、好ましくは、滲出型ＡＭＤを処置するか、または網膜内での不適切な血管新生に起因する他の疾患を処置するために使用することができる。一部の実施形態では、この組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。

【0049】

別の実施形態では、本発明は、対象におけるＡＭＤ、好ましくは、滲出型ＡＭＤを処置するか、または網膜内での不適切な血管新生に起因する他の疾患を処置するための組成物であって、活性成分として、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを含む組成物を提供する。

【0050】

別の実施形態では、本発明は、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための組成物であって、対象における滲出型ＡＭＤの処置において使用するために本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。

【0051】

別の実施形態では、本発明は、対象におけるＡＭＤを処置するための医薬品の調製における、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するためのｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを提供する。好ましくは、この医薬品は、滲出型ＡＭＤのためのものである。

【0052】

別の実施形態では、本発明は、場合により、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に、主な成分として、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを有効量で含むＡＭＤ処置用組成物を提供する。

【0053】

本発明は、また、対象における網膜内での不適切な血管新生に起因する疾患を処置するか、またはその進行を遅延させるための方法であって、対象に、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、または組成物を投与し、それにより、ＡＭＤの重症度を低減することを含む方法を提供する。

【0054】

また、本発明のさらなる態様は、対象におけるＡＭＤ、好ましくは、滲出型ＡＭＤの進行を低減するための方法であって、対象に、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、または組成物を投与し、それにより、ＡＭＤの重症度を低減することを含む方法を提供する。

【0055】

本発明の方法ではそれぞれ、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、または組成物を、好ましくは、硝子体内注射または網膜下注射により、対象の眼に送達する。

【0056】

さらなる一態様では、本発明は、（ａ）本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクト、または組成物、および（ｂ）薬学的に許容される担体または希釈剤を含むキットを提供する。

【0057】

ある種の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ薬または医薬組成物を、ＲＮＡｉ薬または医薬組成物を保持するための容器を含む使い捨てか、または再利用可能なデバイスの形態で提供することができる。一実施形態では、このデバイスは、シリンジ、好ましくは、硝子体内注射または網膜下注射に適したシリンジである。ＲＮＡｉ薬または医薬組成物は、すぐに使用できる状態か、またはさらなる成分の混合もしくは添加を必要とする状態のデバイスで提供することができる。

【0058】

本発明は、ヒトに適用されるが、本発明は、獣医学の目的のためにも有用である。本発明は、ウシ、ヒツジ、ウマ、および家禽などの家畜；ネコおよびイヌなどのコンパニオン動物；ならびに動物園の動物におけるＡＭＤまたは不適切な血管新生に起因する他の疾患の処置に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1A】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1B】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1C】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1D】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1E】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1F】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図1G】本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の構造の一部を示す。

【図2A】ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマップである。この発現カセットは、ヒトＵ６プロモーター（黒色の矢印）を含有し、ＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片としてこのベクターにクローニングされたｓｈＲＮＡ配列を発現するように設計された。

【図2B】ＡＭＤ関連遺伝子をサイレンシングするために設計されたＢａｍＨ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｓｈＲＮＡ断片の配置図を示す一般化マップである。ＢａｍＨｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の位置が示されており、白色の矢印は、ｍｉＲ３０ａの５’ステムからの配列、ｍｉｒ３０ａのループに由来する配列、およびｍｉＲ３０ａの３’ステムを示している。灰色の矢印は、予測されるパッセンジャー鎖を表し、黒色の矢印は、予測されるガイド鎖を表す。予測されるガイド鎖および予測されるパッセンジャー鎖の相対位置は、互換可能であってよい。黒色の線は、ｐｏｌ ＩＩＩ停止シグナルを示す。

【図2C】ＶＥＧＦ−Ａを有効にサイレンシングするｍｉＲ−８断片のＤＮＡ配列であり、これは、配列番号９８に対応する。小文字は、制限部位、ｍｉｒ３０ａ関連配列、およびｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列を示す。下線を付された配列は、ヒトｍｉＲ３０ａ前駆体ＲＮＡの塩基（５’および３’の両方）に由来し、イタリック体の配列は、ｍｉＲ３０ａのループ配列に由来する。大文字の配列は、予測されるパッセンジャー鎖配列を示し、太字で大文字の配列は、予測されるエフェクター配列（配列番号４７）を示す。

【図2D】Ｍ−ｆｏｌｄプログラムを使用して決定されたｍｉＲ−８の予測されるＲＮＡ二次構造を示す図であり（配列番号１４７）、予測されるダイサーおよびＤｒｏｓｈａプロセシング部位が矢印により示されている。

【図3A】ｐＧＬ３−ＶＥＧＦＡ−センスレポーターのマップである。このプラスミドは、ＳＶ４０プロモーター（灰色の矢印）および真核転写ターミネーターにより駆動されるホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ^＋）をコードする。親プラスミド（ｐＧＬ３；Ｐｒｏｍｅｇａ）の３’ＵＴＲに存在するＸｂａ ＩおよびＦｓｅ Ｉ制限部位を使用して、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の非コード鎖の一部を、ＦＬｕｃ＋転写ユニットの３’ＵＴＲに挿入した。このプラスミドを使用して、二重ルシフェラーゼアッセイにおいて、ｍｉＲ−２のパッセンジャー鎖の阻害活性を定量化した。

【図3B】ｐＧＬ３−ＶＥＧＦａ−アンチセンスレポーターのマップであり、特徴は、図３Ａに示される。図３Ａにおいて使用されるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の対応する部分を、Ｘｂａ ＩおよびＦｓｅ Ｉ制限部位を使用して、ＦＬｕｃ＋転写ユニットの３’ＵＴＲに挿入したが、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子のコード鎖を使用した。このプラスミドを使用して、二重ルシフェラーゼアッセイにおいて、ｍｉＲ−２のエフェクター鎖の阻害活性を定量化した。

【図4A】二重ルシフェラーゼアッセイを使用して決定されたＶＥＧＦ−Ａ発現の阻害パーセントを示すグラフであり；センサーコンストラクト中のセンスおよびアンチセンスターゲットの両方に対する活性が示されている（ｎ＝３±ＳＤ）。

【図4B】全長ＶＥＧＦ−Ａタンパク質を発現する全長ｃＤＮＡと共にｍｉＲ−２、ｍｉＲ−５、およびｍｉＲ−８のいずれかを同時形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ｑＲＴ ＰＣＲにより決定されたＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡレベルの阻害パーセントを示すグラフである。阻害パーセントは、形質移入されていない細胞および空ベクター対照（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒおよび空のＵ６発現カセット）に対して算出されている。

【図4C】ｍｉＲ−８を発現するアデノウイルスベクターを導入されているＡＲＰＥ−１９細胞におけるＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを示すグラフである。ＲＮＡおよびタンパク質の試料を、導入から２４、４８、７２、および９６時間後に収集した。三角形は、ループ配列が切断されている成熟したプロセシング済みのｍｉＲ−８の細胞内レベルを示している。

【図5A】上記のとおりにホタルルシフェラーゼレポーターを使用して決定されたＶＥＧＦＲ２の阻害パーセントを示すグラフであり、センスおよびアンチセンスレポーターコンストラクトの両方に対する活性が示されている（ｎ＝３±ＳＤ）。

【図5B】ｍｉＲ−Ｖ−２、ｍｉＲ−Ｖ−３、ｍｉＲ−Ｖ−７、またはｍｉＲ−Ｖ−１０と、ＶＥＧＦＲ２への全長ｃＤＮＡを発現するプラスミドを同時形質移入されたＨＥＫ２０３Ｔ細胞における、ＲＴ ＱＰＣＲにより決定されたＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルの阻害パーセントを示すグラフである。阻害パーセントは、空ベクター対照（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよび無関係プラスミド）と比較してｍＲＮＡ残存（ｍＲＮＡ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ）として算出した。

【図5C】５Ｂと同様に平行条件で形質移入された細胞のウェスタンブロット分析であり、ＶＥＧＦＲ２の低減を示している（矢印）。ゲル上でのＶＥＧＦＲ２のポジショニングを示すために、ＨＵＶＥＣ細胞からのタンパク質抽出物を同時に流した。

【図6A】ｍｉＲ−Ｖ−４またはｍｉＲ−Ｖ−９のいずれかと、ＰＤＧＦＲ−βへの全長ｃＤＮＡを発現するプラスミドとを同時形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＤＧＦＲ−β ｍＲＮＡレベルの阻害パーセントを示すグラフである。阻害パーセントは、対照（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよび無関係プラスミドおよび空のＵ６発現カセット）と比較してｍＲＮＡ残存として算出した。

【図6B】６Ｂと同様に平行条件で形質移入された細胞のウェスタンブロット分析であり、ＰＤＧＦＲ−βの低減を示している（矢印）。

【図7A】上記のとおりにホタルルシフェラーゼレポーターを使用して決定されたＣＦＢ発現の阻害パーセントを示すグラフであり、センスおよびアンチセンスレポーターコンストラクトの両方に対する活性が示されている（ｎ＝３±ＳＤ）。

【図7B】ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、またはｍｉＲ−Ｃ−９と、ＣＦＢへの全長ｃＤＮＡを発現するプラスミドとを同時形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＣＦＢ ｍＲＮＡレベルの阻害パーセントを示すグラフである。阻害パーセントは、対照（ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよび無関係プラスミドおよび空のＵ６発現カセット）と比較して算出した。

【図7C】７Ｂのとおりに平行処理ウェルで行われたウェスタンブロット分析は、ＣＦＢの低減を示した（矢印）。

【図8A】Ｕ６−ｍｉＲ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｍｉＲ−７の発現を駆動するために、ヒトＵ６プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ｍｉＲ−７コード配列は、図２Ａのものと同一であり、白色の矢印として示されており、ｍｉＲ−７パッセンジャーおよびｍｉＲ−７エフェクター配列の位置は、矢印として示されている。Ｕ６−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３２として列挙されている。

【図8B】ＶＭＤ２−ｍｉＲ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｍｉＲ−７(白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＶＭＤ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＶＭＤ２−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３３として列挙されている。

【図8C】ＩＣＡＭ２−ｍｉＲ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｍｉＲ−７(白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＩＣＡＭ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＩＣＡＭ２−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３４として列挙されている。

【図8D】ＲＰＥ−６５−ｍｉＲ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｍｉＲ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＲＰＥ６５プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＲＰＥ６５−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３５として列挙されている。

【図8E】ＦＬＴ−ｍｉＲ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｍｉＲ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＦＬＴプロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＦＬＴ−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３６として列挙されている。

【図9A】Ｕ６−ｍｉＲ−７−ｍｉＲ−Ｖ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｍｉＲ−７−ｍｉＲ−Ｖ−７の発現を駆動するために、ヒトＵ６プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ｍｉＲ−７−ｍｉＲ−Ｖ−７コード配列は、白色の矢印として示されており、ｍｉＲ−７パッセンジャーおよびｍｉＲ−７エフェクター配列、ならびにｍｉＲ−Ｖ−７パッセンジャーおよびｍｉＲ−Ｖ−７エフェクター配列の位置は、灰色の矢印として示されている。Ｕ６−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１３７として列挙されている。

【図9B】ＶＭＤ２−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＶＭＤ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＶＭＤ２−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７断片の配列は、配列番号１３８として列挙されている。

【図9C】ＩＣＡＭ２−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＩＣＡＭ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＩＣＡＭ２−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７断片の配列は、配列番号１３９として列挙されている。

【図9D】ＲＰＥ−６５−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＲＰＥ６５プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＲＰＥ６５−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７断片の配列は、配列番号１４０として列挙されている。

【図9E】ＦＬＴ−ｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７のマップである。これは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｍｉＲ−７ ｍｉＲ−Ｖ−７（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＦＬＴプロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＦＬＴ−ｍｉＲ−７断片の配列は、配列番号１４１として列挙されている。

【図10A】Ｕ６−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９のマップである。これは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９の発現を駆動するために、ヒトＵ６プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９コード配列は、白色の矢印として示されており、ｍｉＲ−Ｖ−７パッセンジャーおよびｍｉＲ−Ｖ−７エフェクター配列、ｍｉＲ−Ｃ−８パッセンジャーおよびｍｉＲ−Ｃ−８エフェクター配列、ならびにｍｉＲ−Ｐ−９パッセンジャーおよびｍｉＲ−Ｐ−９エフェクター配列の位置は、灰色の矢印として示されている。Ｕ６−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９断片の配列は、配列番号１４２として列挙されている。

【図10B】ＶＭＤ２−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９のマップである。これは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＶＭＤ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＶＭＤ２−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９断片の配列は、配列番号１４３として列挙されている。

【図10C】ＩＣＡＭ２−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９のマップである。これは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＩＣＡＭ２プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＩＣＡＭ２ ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９断片の配列は、配列番号１４４として列挙されている。

【図10D】ＲＰＥ６５−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９のマップである。これは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＲＰＥ６５プロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＲＰＥ６５−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９断片の配列は、配列番号１４５として列挙されている。

【図10E】ＦＬＴ−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９のマップである。これは、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９（白色の矢印）の発現を駆動するために、ヒトＦＬＴプロモーター（黒色の矢印）を使用する。ＦＬＴ−ｍｉＲ−Ｖ−７−ｍｉＲ−Ｃ−８−ｍｉＲ−Ｐ−９断片の配列は、配列番号１４６として列挙されている。

【図11-1】本明細書で言及される配列である。

【図11-2】本明細書で言及される配列である。

【図11-3】本明細書で言及される配列である。

【図11-4】本明細書で言及される配列である。

【図11-5】本明細書で言及される配列である。

【図11-6】本明細書で言及される配列である。

【図11-7】本明細書で言及される配列である。

【図11-8】本明細書で言及される配列である。

【図11-9】本明細書で言及される配列である。

【図11-10】本明細書で言及される配列である。

【図11-11】本明細書で言及される配列である。

【図11-12】本明細書で言及される配列である。

【図11-13】本明細書で言及される配列である。

【図11-14】本明細書で言及される配列である。

【図11-15】本明細書で言及される配列である。

【図11-16】本明細書で言及される配列である。

【図11-17】本明細書で言及される配列である。

【図11-18】本明細書で言及される配列である。

【図11-19】本明細書で言及される配列である。

【図11-20】本明細書で言及される配列である。

【図11-21】本明細書で言及される配列である。

【図11-22】本明細書で言及される配列である。

【図11-23】本明細書で言及される配列である。

【図11-24】本明細書で言及される配列である。

【図11-25】本明細書で言及される配列である。

【図11-26】本明細書で言及される配列である。

【図11-27】本明細書で言及される配列である。

【図11-28】本明細書で言及される配列である。

【図11-29】本明細書で言及される配列である。

【図11-30】本明細書で言及される配列である。

【図11-31】本明細書で言及される配列である。

【図11-32】本明細書で言及される配列である。

【図11-33】本明細書で言及される配列である。

【図11-34】本明細書で言及される配列である。

【図11-35】本明細書で言及される配列である。

【図11-36】本明細書で言及される配列である。

【図11-37】本明細書で言及される配列である。

【図11-38】本明細書で言及される配列である。

【図11-39】本明細書で言及される配列である。

【図11-40】本明細書で言及される配列である。

【図11-41】本明細書で言及される配列である。

【図11-42】本明細書で言及される配列である。

【図11-43】本明細書で言及される配列である。

【図11-44】本明細書で言及される配列である。

【図11-45】本明細書で言及される配列である。

【図11-46】本明細書で言及される配列である。

【図11-47】本明細書で言及される配列である。

【図11-48】本明細書で言及される配列である。

【図11-49】本明細書で言及される配列である。

【図11-50】本明細書で言及される配列である。

【図11-51】本明細書で言及される配列である。

【図11-52】本明細書で言及される配列である。

【図11-53】本明細書で言及される配列である。

【図11-54】本明細書で言及される配列である。

【図11-55】本明細書で言及される配列である。

【発明を実施するための形態】

【0060】

実施形態の詳細な説明
以下では、本発明のいくつかの実施形態に詳細に言及する。本発明を、実施形態と併せて説明するが、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はないことは理解されるであろう。逆に、本発明は、特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲内に含まれ得るすべての代替形態、変更形態、および同等形態に及ぶことが意図されている。

【0061】

当業者であれば、本発明を実施する際に使用することができるであろう本明細書に記載のものと同様また同等の多くの方法および物質が分かるであろう。本発明は、記載の方法および物質に決して限定されることはない。

【0062】

本明細書において開示および定義されている本発明は、述べられているか、または内容および図面から明らかな個々の特徴の２つ以上の代替の組み合わせのすべてに及ぶことは理解されるであろう。これらの種々の組み合わせのすべてが、本発明の様々な代替態様を構成する。

【0063】

本明細書を説明するために、次の定義を適用し、適切な場合にはいつでも、単数形で使用されている用語も、複数形を含み、逆も同様である。記載されている何らかの定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載の定義が優先されることとする。

【0064】

定義
本明細書で使用する場合、内容が他を必要としない限り、用語「（単数）を含む」、ならびに「を含むこと」、「（複数）を含む」、および「を含んだ」などのその用語の変形は、さらなる添加剤、成分、整数、またはステップを除外することを意図したものではない。

【0065】

用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、一般に、細胞の細胞質中の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子により開始されるＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングプロセスを指す。ｄｓＲＮＡは、そのＲＮＡ発現産物が低減されるＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡ分子が実質的または完全な相動性を共有するＲＮＡであってよいターゲット核酸配列の発現を低減させる。

【0066】

「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」では、相同性を共有するターゲット核酸配列の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡ分子が意味されている。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、場合により少なくとも１つのヌクレオチドにより連結している二重鎖領域を有するヘアピン型またはステムループ型構造であり、「ヘアピン型ＲＮＡ」または「ショートヘアピン型ＲＮＡｉ薬」または「ｓｈＲＮＡ」と称される。この二重鎖は、エフェクター配列と、「エフェクター相補部」と本発明において称されるエフェクター配列に対して相補的な配列との間で形成される。典型的には、エフェクター相補部は、その対応するエフェクター配列と同じ長さである。以下で説明するとおり、エフェクター配列は、ターゲット核酸配列に対して相補的である。

【0067】

「エフェクター配列」は、ＲＩＳＣ複合体の一部である場合に、ターゲットヌクレオチド配列に結合し、それにより、細胞による分解のためにその配列をターゲティングするヌクレオチド配列である。これは、背景のセクションにおいて検討した「ガイド」鎖に類似している。エフェクター配列は、ターゲット領域からの転写産物に対して配列において相補的または実質的に相補的であることにより、ターゲット領域「に対して指向性」であるので、エフェクター配列を含有する二本鎖部分を有するＲＮＡ薬は、ターゲット遺伝子配列の発現を阻害することとなる。

【0068】

背景において検討したパッセンジャー鎖に類似した「エフェクター相補部」は、エフェクター配列にアニールするような十分な相補性をエフェクターに対して有する。おそらく、エフェクター相補部は、ターゲット遺伝子配列と同様の配列を有するであろうが、必ずしもそうである必要はない。

【0069】

「実質的に相補的」または「実質的な相補性」の上記のセクションにおいて既に詳述したとおり、配列は、アニーリング（下記で定義）のハイブリッド形成を可能にする十分な相補性を有することが意図されている。簡単には、上記のとおりの実質的な相補性は、
・エフェクターとその相補部との間、またはエフェクターとターゲット配列のターゲット領域との間の同一性パーセント（８０〜１００％）；または
・８０〜１００％の同一性パーセント要件に一致することを条件として、相補的ではないヌクレオチドの数が１、２、３、４、または５つであること
の点において説明することができる。

【0070】

したがって、実質的な相補性は、１００％相補性を含むが、１００％相補性は、本明細書を通じて、「相補的」または「相補的である」と称されることもある。ターゲット遺伝子のある領域に対して相補的または実質的に相補的な配列は、連続するターゲット配列にわたって、その程度の配列相補性を有する。一般に、本発明の二本鎖ＲＮＡ領域を、単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、または付加をもたらす変異誘発に掛けることができる。エフェクターとその相補部との間、またはエフェクターとターゲット配列のターゲット領域との間のこのレベルの相違は、ターゲット配列の発現を阻害し得るｄｄＲＮＡｉ薬の能力に対してマイナスの影響を及ぼさないと考えられる。

【0071】

第１のエフェクター配列が、ターゲット配列と共にＧ−Ｃ／Ａ−Ｕ塩基対形成しない１、２、３、４、または５つのヌクレオチドを有する場合には、その相違は、第１のエフェクター配列の最初または最後の５つのヌクレオチドにあり、エフェクター配列の中心部分には１または２つのヌクレオチド変化のみを伴うことが好ましい。

【0072】

上記のとおり、実質的な相補性では、その配列がハイブリッド形成可能か、またはアニーリング可能であることを意味することが意図されている。用語「ハイブリッド形成」および「アニーリング」（および文法的に同等の語）は、ヌクレオチド配列に関して本明細書において互換的に使用され、それらの相補性により、ワトソン−クリック型塩基対を形成することができるヌクレオチド配列を指す。好ましくは、実質的に相補的な配列は、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーの条件下でハイブリッド形成することができる：
・高ストリンジェンシー条件：０．１倍ＳＳＰＥ（または０．１倍ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、６５℃、
・中ストリンジェンシー条件：０．２×ＳＳＰＥ（または１．０倍ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳ、５０℃。

【0073】

別法では、「実質的に相補的」はまた、当業者には、特に、ＲＮＡ配列の文脈において、ＲＮＡ中においてグアノシンとウラシル残基との間で形成し得るいわゆる「ウォッブル対」などの非ワトソン−クリック型塩基対形成を含むと理解されるであろう。「相補的」は、本発明においては通常、ワトソン−クリック型塩基対形成を示すために使用され、「非相補的」は、そのような非相補配列がウォッブル対または他の相互作用を形成するとしても、非ワトソン−クリック型塩基対形成を意味するために使用される。本発明の内容において、「非対形成」配列に対する言及は、特に、ワトソン−クリック型塩基対を形成しない配列に関する。

【0074】

用語「ＲＮＡｉ薬」は、ＲＮＡｉを誘発するｄｓＲＮＡ配列を指す。この用語は、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ薬）および低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｉまたはｈｐＲＮＡｉ薬）と互換的に使用することができ、この際、ヘアピンは、ステム−ループ型構造を有する。

【0075】

ヘアピン型構造の「ループ」は、ヌクレオチドの少なくとも一部がそれ自体、ターゲット配列、エフェクター配列、またはエフェクター相補部のいずれかに対して非相補的である追加の配列である。ループは、ループを形成することができる２〜１００のヌクレオチドの配列であってよい。ループ配列のヌクレオチドのすべてが、アニーリングされていないことを必要とするわけではない。例えば、ＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＡＧＡＵＧＡＧＵのループ配列において、ヌクレオチドＡＣＵは、ＡＧＵとアニーリングされていてよいが、介在ＧＵＧＡＡＧＣＡＧＡＵＧ配列は、アニーリングされていないままである。

【0076】

ｄｄＲＮＡｉ薬がｍｉＲＮＡ構造の一部として発現される実施形態では、ループ配列は、ｍｉＲＮＡに由来してよく、ＭＥ配列によりコードされる。

【0077】

「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、遺伝子発現の転写後調節において機能する、生体中に存在する天然に生じる小分子ノンコーディングＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡ転写産物は、ヘアピン様構造を形成することができ、典型的には、二本鎖ＲＮＡ領域内に、またはそれに隣接して、ミスマッチおよびバルジを含有する。本発明のｄｄＲＮＡｉ薬が好ましくは発現されるｍｉＲＮＡ構造は、上記で詳述したとおり、ミスマッチおよび挿入を含有する。Ｗｕら（２０１１）は、ことによると、内在ｍｉＲＮＡに対するそれらのより大きな構造上の類似により、二重鎖のミスマッチ（パッセンジャー鎖中にミスマッチを含有）は時には、サイレンシング活性の増大を示すことを示した。同様に、Ｇｕら（２０１２）は、ｓｈＲＮＡ分子中のループ配列に隣接してバルジを導入することにより、ダイサープロセシングの精度の上昇が生じ得ることを示した。

【0078】

二本鎖折りたたみｍｉＲＮＡ構造において、トップ鎖上のヌクレオチドの少なくとも５０％が、ボトム鎖のヌクレオチドにアニーリングされている。アニーリングされていない（すなわち、対形成していない）ヌクレオチドでは、これらは挿入であってよく、すなわち、それらは、反対側の鎖上に対して相補的ヌクレオチドを有さないか、またはアニーリングしないミスマッチであってよい。例えば、ＧおよびＡである。二本鎖折りたたみｍｉＲＮＡ構造は、１つ以上のアニーリングされていないヌクレオチドにより分離されている２つ以上のアニーリングされたヌクレオチドを含有して、ヌクレオチドがアニーリングされていない「バブル」または「バルジ」を有する二本鎖ＲＮＡ構造をもたらしていてよい。

【0079】

「ｍｉＲＮＡコード配列」または「ＭＥ配列」では、ｍｉＲＮＡ構造へと折りたたまれ得るＲＮＡをコードする、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット（定義および説明については以下を参照されたい）内に含まれるＤＮＡ配列が意味されている。ｄｄＲＮＡｉ薬のエフェクター配列およびエフェクター相補部は、そのｍｉＲＮＡ構造内で、またはその一部として発現される。ＭＥ配列は、第１の部分および第２の部分を有する。単一のヘアピンを発現するための発現カセット（１つまたは複数のエフェクター／エフェクター相補部の対を有する）では、ＭＥ配列の第１の部分は、５’側の最大エフェクターまたはエフェクター相補部エンコード配列の上流（すなわち、５’側）に設置され、第２の部分は、３’側の最大エフェクターまたはエフェクター相補部エンコード配列の下流に（すなわち、３’側）に設置される。

【0080】

複数ヘアピン型構造のための発現カセットの場合には、各エフェクター／エフェクター相補部の対は、対応する第１および第２のＭＥ配列を有し、この際、第１のＭＥ配列は、エフェクターまたはエフェクター相補部エンコード配列の上流にあり、第２の部分は、対応するエフェクターまたはエフェクター相補部コード配列の下流にある。次の例示的な構造を有する発現カセットでは、５’から３’方向で、
・プロモーター
・第１のＭＥ配列；
・第１のエフェクター；
・第１のエフェクター相補配列；
・第２のＭＥ配列；
・第３のＭＥ配列；
・第２のエフェクター配列；
・第２のエフェクター相補配列；および
・第４のＭＥ配列
となる。

【0081】

第２および第３のＭＥ配列は、（ポイントを説明するために例示的な配列を使用すると）連続していてよいか、それらの間に介在配列を有してよいか、または第２および第３のＭＥ配列と同じ機能を果たす単一のＭＥ配列であってよいかのいずれかであることは分かるであろう。
ｉ） 連続する場合：ｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｇａｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｇｇｇａｃａｇｔｇａｇｃｃｃ
ＭＥ配列２ ＭＥ配列３
ｉｉ） 介在がある場合： ｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｇａｃａｇｔｇａｇｃｇａＡＴＴＧＣＣＡＴＧｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｇｇｇａｃａｇｔｇａｇｃｃｃ
ＭＥ配列２ 介在 ＭＥ配列３
ｉｉｉ）単一の場合：ｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｔｔｇａｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｇｔａｔａｔｔｇｃｔｇｇｇｇａｃａｇｔｇａｇｃｃｃ
ＭＥ配列

【0082】

ＲＮＡｉ薬の二本鎖または二重鎖領域は、少なくとも１７塩基対長であり、通常、１７〜３０塩基対の範囲である。ＲＮＡｉ薬は、細胞外部で化学的または酵素的に合成して、後で細胞に送達することができるか、または細胞内で適切なベクターによりｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５７３，０９９、ＷＯ２００４／１０６５１７、およびＷＯ１９９９／４９０２９を参照されたい）。

【0083】

用語「ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉ薬」または「ｄｄＲＮＡｉ薬」は、ＤＮＡ発現カセット（ｄｄＲＮＡｉ発現カセット」）から転写されるＲＮＡｉ薬を指す。ｄｄＲＮＡｉ発現カセット内でのターミネーターおよびプロモーターの配置に応じて、これらは、単一または複数のエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬を発現し得るか、または複数のｄｄＲＮＡｉ薬を発現し得る。発現カセットから転写されたｄｄＲＮＡｉ薬は、少なくとも２つのヌクレオチドにより連結された二重鎖領域を有する単一のヘアピン型構造へと自己アニーリングすることができる単一のＲＮＡとして転写され得る。単一のヘアピンは、１つのエフェクター配列およびその相補部（図１ＢまたはＥを参照されたい）を、または複数のエフェクター配列およびそれらの相補部（図１ＡまたはＤを参照されたい）を含み得る。別法では、この薬剤は、複数のｓｈＲＮＡドメイン（すなわち、エフェクター配列およびそれらの相補部により形成される複数のヘアピン型構造、図１ＣまたはＦを参照されたい）を有する単一のＲＮＡであってよい。

【0084】

ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、ｄｄＲＮＡｉベクターまたはｄｄＲＮＡｉコンストラクトと称されるベクターに結合させることができる。このベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでｄｄＲＮＡｉ発現カセットの転写を指定する配列を提供し得る。加えて、このベクターは、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットのための送達ビヒクルとして役立ち得る。例えば、ウイルスベースのベクターは、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットの発現に有用であり、さらには、ウイルス送達と適合性であるｄｄＲＮＡｉコンストラクトを生成する。

【0085】

そのような核酸が細胞に導入されている場合、細胞は、外在または異種の核酸またはベクターにより、「形質転換されている」か、「形質導入されている」か、または「形質移入されている」。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれ（共有結合され）ていてもよいし、されていなくてもよい。真核細胞に関しては、安定形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、宿主細胞染色体に組み込まれているか、または染色体外で（エピソームで）維持されていて、形質転換ＤＮＡが、細胞複製の間に娘細胞により遺伝されるものである。非複製分化細胞では、形質転換ＤＮＡは、エピソームとして存続し得る。

【0086】

「遺伝子発現」は、転写または翻訳のいずれかまたは両方を指し得る。

【0087】

「発現の阻害」は、ターゲット遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物の欠如またはそのレベルの観測可能な低下を指す。この阻害は、完全である必要はないが、本発明のＲＮＡｉまたはｄｄＲＮＡｉ薬またはｓｉＲＮＡ薬またはｄｄＲＮＡｉ発現カセットまたは発現コンストラクトの投与の結果として検出可能また観測可能な変化に至るに十分な部分的な阻害であってよい。阻害は、ｄｄＲＮＡｉ薬またはコンストラクトを欠いた細胞に対する、ターゲットからのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質産物のレベルの低下を決定することにより測定することができ、わずか１％、５％、または１０％であり得るか、または完全、すなわち、１００％阻害であり得る。阻害の効果は、外部特性、すなわち、細胞または生体の定量的および／または定性表現型の試験により決定することができる。

【0088】

「オフターゲット」効果は、ＲＮＡｉ試薬での処置の意図していない副作用を記載するために使用される用語である。これは、ノックダウンの代謝による補償（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）から生じるわずかな効果も起こるが、パッセンジャーまたはエフェクター配列および別のターゲット遺伝子との偶然の相動性の結果としてのターゲット配列の意図されていなかったノックダウンに関係していると往々にして考えられる。内在ＲＮＡｉ経路によるｍｉＲＮＡのプロセシングは往々にして、エフェクター鎖のみのＲＩＳＣへの負荷およびパッセンジャー鎖の分解をもたらす。オフターゲット効果の潜在的な供給源の１つは、パッセンジャー鎖のＲＩＳＣへの予期せぬ組み込みであり、その結果、パッセンジャー配列は、相同性を偶然に共有している遺伝子をサイレンシングさせ得ることとなる。ＲＩＳＣ負荷のステップは、ｄｓＲＮＡ前駆体中の潜在的なターゲット部位全体にわたってＲＮＡ二重鎖の予測される熱力学的安定性を「センシング」して、その二重鎖のうちで５’末端の安定性が低い方の鎖を優先的に負荷するという証拠が存在する。オフターゲット効果の可能性を最小限にするための戦略の１つは、二重ルシフェラーゼアッセイを使用して、パッセンジャー鎖の活性についてｄｄＲＮＡｉ分子をスクリーニングすることである。ＲＩＳＣへのこの鎖の付加は、望ましくない。

【0089】

本明細書で使用する場合、「血管内皮成長因子−Ａ遺伝子」または「ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子」には、血管形成を刺激するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、ヒトＶＥＧＦ−ＡをコードするＧｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００１０２５３６６（配列番号７９）で示されるとおりのヌクレオチド配列をコードする。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、これだけに限定されないが、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００１０２５２５０（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８０）またはＸＭ＿００１０８９９２５（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号８１）で示されるとおりのヌクレオチド配列を含めたＶＥＧＦ−Ａ遺伝子に対してオルソロガスまたはパラロガスな遺伝子である。別の実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、ヒト遺伝子または本明細書に記載のとおりの動物に由来する遺伝子であってよく、対立遺伝子変異型を含む。

【0090】

本明細書で使用する場合、「血管内皮成長因子受容体２遺伝子」または「ＶＥＧＦＲ２遺伝子」には、ＶＥＧＦのための受容体をコードする遺伝子が含まれる。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２遺伝子は、ヒトＶＥＧＦＲ２をコードするＧｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００２２５３（配列番号８２）で示されるとおりのヌクレオチド配列をコードする。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２遺伝子は、これだけに限定されないが、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿０１０６１２（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８３）またはＸＭ＿００１０８６８１４（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号８４）で示されるとおりのヌクレオチド配列を含めた、ＶＥＧＦＲ２に対してオルソロガスまたはパラソロガスな遺伝子である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２遺伝子は、ヒト遺伝子または本明細書に記載のとおりの動物に由来する遺伝子であってよく、対立遺伝子変異型を含む。

【0091】

本明細書で使用する場合、「ベータ型血小板由来成長因子受容体遺伝子」または「ＰＤＧＦＲ−β遺伝子」には、ＰＤＧＦＲ−β
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をコードする遺伝子が含まれる。一実施形態では、ＰＤＧＦＲ−β遺伝子は、ヒトＰＤＧＦＲ−βをコードするＧｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００２６０９（配列番号８５）で示されるとおりのヌクレオチド配列をコードする。別の実施形態では、ＰＤＧＦＲ−β遺伝子は、これだけに限定されないが、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００１１４２７０６（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８６）またはＸＭ＿００１１０７５９（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号８７）で示されるとおりのヌクレオチド配列を含めたＰＤＧＦＲ−βに対してオルソロガスまたはパラソロガスな遺伝子である。別の実施形態では、ＰＤＧＦＲ−β遺伝子は、ヒト遺伝子または本明細書に記載のとおりの動物に由来する遺伝子であってよく、対立遺伝子変異型を含む。

【0092】

本明細書で使用する場合、「補体因子Ｂ遺伝子」または「ＣＦＢ遺伝子」には、ドルーゼンの成分であるＣＦＢタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。一実施形態では、ＣＦＢ遺伝子は、ヒトＣＦＢをコードするＧｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００１７１０（配列番号８８）で示されるとおりのヌクレオチド配列をコードする。別の実施形態では、ＣＦＢ遺伝子は、これだけに限定されないが、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて受入番号ＮＭ＿００１１４２７０（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号８９）またはＸＭ＿００１１１３５５３（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号９０）で示されるとおりのヌクレオチド配列を含むＣＦＢに対してオルソロガスまたはパラソロガスな遺伝子である。別の実施形態では、ＣＦＢ遺伝子は、ヒト遺伝子または本明細書に記載のとおりの動物に由来する遺伝子であってよく、対立遺伝子変異型を含む。

【0093】

配列が遺伝子重複事象により分離されている場合に、その配列は「パラソロガス」であり、生体中の遺伝子が、同じゲノムにおいて２つの異なる位置を占めるように重複していれば、その２つのコピーはパラソロガスである。

【0094】

配列が種分化事象により分離されている場合に、その配列は「オルソロガス」であり、一つの種が２つの別々の種に派生した場合に、その結果生じた種における単一の遺伝子の派生コピーは、オルソロガスであると記載される。

【0095】

本明細書で使用する場合、「定量的表現型形質」は、宿主細胞における核酸の分子発現に関係する形質を指し、したがって、転写もしくは複製されたＲＮＡ分子の量、転写後改質されたＲＮＡ分子の量、翻訳されたペプチドもしくはタンパク質の量、またはそのようなペプチドまたはタンパク質の活性を含み得る。

【0096】

表現型が定性的形質である核酸の表現型発現の低減は、本発明のＲＮＡｉ薬の存在下で、そのＲＮＡｉ薬が存在しない状況と比較した場合に、その表現型形質が異なる状態へと変わることを意味する。したがって、核酸の表現型発現の低減は、その核酸（の一部）の定常状態のレベルの低減、その核酸（の一部）の翻訳の低減、または転写されたＲＮＡ（複数可）もしくは翻訳されたポリペプチド（複数可）の存在が真核細胞または生体に対して有する効果の低減として測定することができ、最終的には、表現型形質の変化をもたらすであろう。対象の核酸の表現型発現における低減が、表現型における観測可能な変化に随伴するか、または相関し得ることは明らかである。その評価は、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイ、遺伝子発現アッセイ、抗体結合、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、ならびに当技術分野で公知の他のアッセイおよび技法などの生化学的技法によるものであってよい。

【0097】

「ターゲット核酸」は、その転写産物がターゲティングされるコード配列または非コード配列の内在または外在ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってよい。

【0098】

「治療用組成物」または「医薬組成物」または「処置用組成物」は、ｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、またはｓｉＲＮＡ薬を含む組成物を指す。

【0099】

用語「処置する」または「処置」は、対象が望ましくない生理学的変化または障害を減速（緩和）し得る治療上の処置を指す。本発明の目的では、有益か、または所望の臨床結果には、これらだけに限定されないが、ＡＭＤの症状の緩和、ＡＭＤの安定化（すなわち、悪化また進行しないこと）、およびＣＮＶの安定化が含まれる。

【0100】

語句「治療有効量」は、（ｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害を処置するか、（ｉｉ）特定の疾患、状態、もしくは障害の１つもしくは複数の症状を減弱、寛解、もしくは除去するか、（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態、もしくは障害の１つまたは複数の症状の発症を予防または遅延させるか、（ｉｖ）特定の疾患、状態、もしくは障害の進行を予防もしくは遅延させるか、または（ｖ）処置の前に生じた損傷をある程度反転させる本発明の化合物の量を意味する。反転は完全である必要はないが、処置後の視力の何らかの臨床的に関連する回復を、損傷の反転と判断する。

【0101】

本発明は、罹患している個体、特に、滲出型ＡＭＤを有する個体において、ＡＭＤに関連する視力の退縮を低減するための新たなＲＮＡｉ薬、およびそのＲＮＡｉ薬の使用を提供する。処置は、次の１つまたは複数を目的とするものである：
ｉ． ＶＥＧＦ−Ａ発現に関連する特異的遺伝子をサイレンシングすることを目的とした１つまたは複数の配列を含有するＤＮＡコンストラクトを使用して、網膜細胞からのＶＥＧＦ−Ａ翻訳およびその後の分泌を長期間にわたってノックダウンすることにより、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に関連する血管形成を制御すること。ＶＥＧＦ−Ａは、したがって、血管形成および網膜の後ろの血管系からの血管の異常な増殖を刺激する。いくつかの既存の治療は、分泌されたＶＥＧＦ−Ａを「拭き取る」ために役立つに過ぎず、視力は安定化させ得るが、必ずしもすべての患者において視力を改善するものではない。
ｉｉ． ＶＥＧＦ−Ａおよびその受容体ＶＥＧＦＲ２の両方をノックダウンすることにより、血管形成の追加的な制御が得られるであろう。それというのも、この戦略は、２つの別個のステップにおいてプロセスに干渉すると予測されるためである。
ｉｉｉ． ３つのターゲット、すなわち、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−β、およびＣＦＢをノックダウンすることにより、ＡＭＤの反転が実現され得る。ＶＥＧＦＲ２のノックダウンは、血管形成を制御すると予測され、ＰＤＧＦＲ−βのノックダウンは、初期の血管形成を阻害また反転させると予測され、かつＣＦＢのノックダウンは、ドルーゼンの沈着を阻害、さらには反転させると予測される。
ｉｖ） 処置頻度の限定および治療用分子の局所注射によるＲＰＥ細胞への処置の限定。

【0102】

ターゲット遺伝子中の適切なターゲット配列を同定し、その配列に基づき機能するＲＮＡｉ薬を設計することは、常套的ではない。結果のセクションにおいて実証するとおり、紙上では良好な候補物質と思われたターゲット配列が、ターゲットを必ずしも有効にサイレンシングし得なかったり、または治療上の目的に有効なレベルでサイレンシングし得なかったりする。一部のエフェクター配列は、ターゲットをサイレンシングするために他のものよりもかなり有効に機能するが、特に、ＲＩＳＣへのパッセンジャー鎖の組み込むは望ましくなく、それというのも、これは、重大なオフターゲット効果および結果として生じる毒性につながり得るためである。しかし、配列自体の単なる外観検査では、いずれの配列がサイレンシングされ得るか、ましてどの程度までそれらをサイレンシングされ得るか、また、本発明の目的に十分であるかは、予測不可能である。２つ以上の無関係ターゲットをサイレンシングすることを求めているならば、なおさらである。

【0103】

ＶＥＧＦ−Ａは、ＡＭＤ治療に適したターゲットであるという当技術分野における認識にも関わらず、有効な治療を創製する努力は今日まで、背景において概説した問題に悩まされている。特にＲＮＡｉ技法によるサイレンシングに関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生産されたｓｉＲＮＡ薬を使用する先行する努力は、膜結合型ＴＬＲ３とのｓｉＲＮＡの相互作用およびその後のインターフェロンの活性化により失敗している。加えて、ＶＥＧＦ−Ａの大部分を分泌する細胞はＲＰＥ細胞であり、これは、一般に、眼の背部の特殊細胞の層の下に埋もれて存在する。ＲＮＡｉ成分は、高度に負荷された複合体であり、この物理的特性により、多数の細胞層を通過することは困難であり得る。利用される新たな範囲のターゲット、ｄｄＲＮＡｉ薬、およびウイルス送達薬は、これらの問題の克服に努めるものである。

【0104】

ＶＥＧＦ−Ａに加えて、これらのターゲットには、次の１つまたは複数が含まれる：
・ＶＥＧＦＲ２：ＶＥＧＦ−Ａの受容体；ＶＥＧＦＲ２のサイレンシングは、ＶＥＧＦ−Ａのサイレンシングと同様の結果を有すると予測される。
・ＰＤＧＦＲ−β：ＰＤＧＦＲ−βの受容体。この分子は、発生期血管の安定化に重要な内皮細胞の動員および安定化において役割を果たす。
・ＣＦＢ：これは、ドルーゼンの主な成分であり、ＡＭＤに関連した特徴的な細胞外沈着物である（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２０１０）。ＣＦＢのサイレンシングは、ドルーゼンの形成を阻害し得る。

【0105】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞の細胞質中で短い二本鎖ＲＮＡ分子により開始されるＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングプロセスである。哺乳動物では、ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される二本鎖ＲＮＡ分子により媒介される。ＲＮＡｉ薬の二本鎖または二重鎖領域は、少なくとも１７塩基対長、通常は、１７〜３０塩基対の範囲である。ＲＮＡｉ薬は、細胞外部で化学的または酵素的に合成して、後で細胞に送達することができるか、または細胞内で適切なベクター（ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、または非ウイルスリポソームベースの送達系など）によりｉｎ ｖｉｖｏで発現させることができる。

【0106】

ＡＭＤ治療薬としてのＲＮＡｉ薬の前臨床試験は、動物モデルの広範な使用を必要とする。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）および霊長類（例えば、マカク属、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｕｌａｒｉｓ）モデルが、処置の有効性を試験するために広く使用され、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）などの他の種は、治療用化合物の臨床安全性を決定するためのモデルとして一般に使用される。ＲＮＡｉ治療薬では、前治験のすべての段階で単一のＲＮＡｉ試薬を使用することができるので、ヒトと様々な前臨床試験種との間で高度に保存されたＡＭＤ関連遺伝子のヌクレオチド配列をターゲティングする試薬を設計することが有利である。保存が不十分な遺伝子では、異なる試験種の間でわずかに異なる配列を有する複数のＲＮＡｉ試薬を、潜在的な毒性を正確に決定するために平行して試験しなければならない。

【0107】

したがって、創薬プログラムに多大な利点をもたらすので、本出願に記載のＲＮＡｉ試薬を、可能な場合には、ヒトと潜在的な試験種（マウス、イヌ、およびマカクなどの霊長類）との間で保存された配列をターゲティングするように設計する。

【0108】

ｄｄＲＮＡｉ薬
ＲＮＡｉ薬は、ＤＮＡベクターから発現され得て、ＤＮＡ指向性ＲＮＡｉまたはｄｄＲＮＡｉと称される。これらは、最小限のオフターゲット事象で、遺伝子の活性を直接的にターゲティングし得る。ＡＭＤの場合には、これは、まだ叶えられていない臨床的処置の必要性に対処する特有の機会を提供する。したがって、本発明の一態様では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、少なくとも、
・少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；および
・第１のエフェクター相補配列
を含み、その際、第１のエフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して相補的または実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0109】

典型的には、第１のエフェクター配列は、第１のエフェクター相補配列と二本鎖領域を形成している。

【0110】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の配列は、ターゲット特異的ＲＮＡｉを媒介するために、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−β遺伝子などのＡＭＤ関連遺伝子に対して十分な同一性を有する必要がある。

【0111】

第１のエフェクター配列は、少なくとも１７ヌクレオチド長、好ましくは、１７〜３０のヌクレオチド、より好ましくは、１７〜２１のヌクレオチドである。これは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってもよい。第１のエフェクター配列が、１７のヌクレオチドよりも長い場合、第１のエフェクター配列の少なくとも１７の連続するヌクレオチドが相補鎖と二本鎖領域を形成していることが好ましい。したがって、本発明のこの実施形態によるｄｄＲＮＡｉ薬は、エフェクター配列（複数可）の長さおよび数により決定される最大長さを有し、すなわち、各エフェクター配列は、さらに長い配列内に含まれることはない。

【0112】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＡＭＤ関連ターゲット遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、ＡＭＤ関連遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａ、またはＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの１つまたは複数であり、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される。

【0113】

以下の表に例示するとおり、阻害、予防、または低減されるＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦ−Ａである場合、各エフェクター配列は、配列番号４０〜４９から選択される。阻害、予防、または低減されるＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦＲ２である場合、各エフェクター配列は、配列番号５０〜５９から選択される。阻害、予防、または低減されるＡＭＤ関連遺伝子がＰＤＧＦＲ−βである場合、各エフェクター配列は、配列番号６０〜６９から選択される。阻害、予防、または低減されるＡＭＤ関連遺伝子がＣＦＢである場合、各エフェクター配列は、配列番号７０〜７８から選択される。
表１：ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−β遺伝子ターゲット配列ならびにそれらに対応するｄｄＲＮＡｉエフェクター配列

【表1】

^ａターゲット遺伝子は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ（ＮＭ＿００１０２５３６６０）、ＶＥＧＦＲ２（ＮＭ＿００２２５３）、ＰＤＧＦＲ−β（ＮＭ＿００２６０９）、およびＣＦＢ（ＮＭ＿００１７１０）であり；遺伝子名の下の名称は、特定の遺伝子をターゲティングしたｄｄＲＮＡｉコンストラクトのバージョンを指す。
^ｂ列挙されているヒト配列でのターゲット位置
^ｃターゲット配列は、エフェクター配列により認識されるＤＮＡ配列である。
^ｄエフェクター配列は、ＡＭＤ関連遺伝子をターゲティングするｄｄＲＮＡｉ薬のダイサープロセシングにより産生される予測ＲＮＡ配列であり；Ｔは、エフェクターが、発現されるＲＮＡの構造を維持するように改質されているコンストラクトを指す。

【0114】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、好ましくは、ｍｉＲＮＡ構造内で、またはその一部として発現される。これらのｍｉＲＮＡ構造は、「ｍｉＲ配列」として示されている配列を有し、表２に挙げられており（配列番号９１〜１２９）、示されているエフェクター配列（配列番号４０〜７８）を発現するように設計されている。ｍｉＲＮＡ構造を発現するための発現カセットを含有する対応するコンストラクトも、「ｍｉＲ名称」として示されている。
表２：ＡＭＤ関連遺伝子の強い配列特異的サイレンシングを示すｍｉＲコンストラクト

【表2】

^ａ示されているヒトターゲット遺伝子に対するサイレンシング活性および好ましい鎖特異性について試験されたｍｉＲコンストラクト（図４〜７を参照されたい）。
^ｂｍｉＲコンストラクトの挿入に対応する配列番号
^ｃ示されているｍｉＲコンストラクトにより産生される予測エフェクター配列の配列番号

【0115】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬はいずれも、ｍｉＲＮＡ構造内で、またはその一部として発現され得る。本明細書を通じて説明するとおり、これは、細胞内でのｄｄＲＮＡｉ薬のより正確なプロセシングおよびより低い毒性で援助し得る。

【0116】

本発明の一実施形態では、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する。ターゲット配列は好ましくは、表１に列挙されているｄｄＲＮＡｉ ＶＥＧＦ−Ａターゲット配列（配列番号１〜１０）から選択され；これらの配列をターゲティングするｄｄＲＮＡｉ薬のダイサープロセシングにより産生されるであろう対応するエフェクター配列は、それぞれ配列番号４０〜４９に示されている。ＶＥＧＦ−Ａターゲット配列およびエフェクター配列は、ヒトと、前臨床試験種であるマウス、イヌ、およびマカクとの間でヌクレオチド配列の保存を示すように選択されていることに注意されたい。

【0117】

本発明の一代替実施形態では、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＶＥＧＦＲ２遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する。ターゲット配列は、好ましくは、表２に列挙されているｄｄＲＮＡｉ ａ ＶＥＧＦＲ２ターゲット配列（配列番号１１〜２０）から選択され、したがって、対応するエフェクター配列は、それぞれ表２に示されているとおりの配列番号５０〜５９から選択される。ＶＥＧＦＲ２ターゲット（配列番号１１〜２０）およびエフェクター配列（配列番号５０〜５９）は、ヒトと、前臨床試験種であるマウス、イヌ、およびマカクとに対して同一であるか、またはそれらの間で単一のヌクレオチドだけ異なることに注意されたい。

【0118】

本発明の一代替実施形態では、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＰＤＧＦＲ−β遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する。ターゲット配列は、好ましくは、表２に列挙されているｄｄＲＮＡｉ ＰＤＧＦＲ−βターゲット配列（配列番号２１〜３０）から選択され、したがって、対応するエフェクター配列は、それぞれ表２に示されているとおりの配列番号６０〜６９から選択される。ＰＤＧＦＲ−βターゲット（配列番号２１〜３０）およびエフェクター配列（配列番号６０〜６９）は、ヒトと、前臨床試験種であるマウスおよびマカクとに対して同一であるか、またはそれらの間で単一のヌクレオチドだけ異なることに注意されたい。

【0119】

本発明の一代替実施形態では、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＣＦＢ遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する。ターゲット配列は、好ましくは、表１に列挙されているｄｄＲＮＡｉ ＣＦＢターゲット配列（配列番号３１〜３９）から選択され、したがって、対応するエフェクター配列は、それぞれ表２に示されているとおりの配列番号７０〜７８から選択される。ＣＦＢターゲット（配列番号３１〜３９）およびエフェクター配列（配列番号７０〜７８）は、ヒトと、前臨床試験種であるマウスおよびマカクとに対して同一であるか、またはそれらの間で単一のヌクレオチドだけ異なることに注意されたい。

【0120】

すでに提示した説明により、ＤＮＡターゲット配列と、ｄｄＲＮＡｉ薬の対応するエフェクター配列との間の関係は（表１からのターゲットの配列番号２およびその対応するエフェクター配列の配列番号４１を使用すると）：
５’ ＧＧＣＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＴ ３’ − ＶＥＧＦ−Ａのターゲット配列（配列番号２）、
５’ ＧＧＣＣＵＣＣＧＡＡＡＣＣＡＵＧＡＡＣＵＵ ３’ − 配列番号２のｍＲＮＡ転写産物、
３’ ＡＡＧＵＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＧＧＡＧＧＣＣ ５’ − ５’から３’方向で読んだ場合に、ターゲット配列の転写産物に対して実質的に相補的であるとみなし得る、配列番号２をターゲティングするｄｄＲＮＡｉ薬のエフェクター配列（配列番号４１）
と示すことができる。

【0121】

背景のセクションで説明したとおり、ｄｄＲＮＡｉ薬の両方の鎖が、エフェクター配列である可能性を有する。しかしながら、配列の特定の特徴が、一方の鎖をＲＩＳＣに入れ、他方の鎖を分解することを支持するという証拠が存在する。ＲＩＳＣ負荷のステップは、ｄｓＲＮＡ前駆体中の潜在的なターゲット部位全体にわたってＲＮＡ二重鎖の予測される熱力学的安定性を「センシング」して、その二重鎖のうちで５’末端の安定性が低い方の鎖を優先的に負荷するという証拠が存在する。したがって、ターゲット部位配列を典型的には、ターゲット部位の３’末端でのＡＴ塩基対の数を最小限にするように、すなわち、エフェクター鎖の５’末端中のＡまたはＵ塩基の数を最小限にするように調節した。次いで、精密化ターゲット部位のリストを、有望な試験種間での、特にマウスおよびサルの間での保存についてスクリーニングした。次いで、ＢＬＡＳＴを使用して、ターゲット部位配列を、ヒトトランスクリプトームに対してスクリーニングして、他のヒト遺伝子に対して高い相同性を示すもの（＞３ミスマッチ）を廃棄した。これらのターゲット配列に基づくコンストラクトを、ｍｉＲＮＡバックボーンにおいて調製し、下記のとおりに、活性および鎖選択性について経験的に試験した。これらの配列優先性は、好ましい実施形態において反映され、他を上回る一部の配列の優位性を示すデータを、実施例セクションにおいて示す。

【0122】

例えば、本発明のこの態様の一実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、少なくとも、
５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’（配列番号４７）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；および
第１のエフェクター相補配列
を含むｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0123】

第１のエフェクター配列は、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中のターゲット領域に対して実質的に相補的である。この実施例では、ターゲット遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａである。

【0124】

好ましくは、第１のエフェクター配列は、５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’（配列番号４７）のうちの少なくとも１７以上の連続するヌクレオチドである。

【0125】

第１のエフェクター配列が、配列番号４７とは異なる１、２、３、４、または５つのヌクレオチドを有する場合、その相違は、好ましくは、最初および／または最後の５つのヌクレオチドに存在し、好ましくは、少なくとも中心の１０のヌクレオチドは、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0126】

代替実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、または配列番号７８のうちの任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列を含む。

【0127】

特に好ましい実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列を含む。好ましくは、この実施形態では、第１のエフェクターは、配列番号８の配列をターゲティングする配列番号４７から選択される。

【0128】

第１のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される配列を含んでよいか、または別法では、各エフェクター配列は、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってよい。またさらなる一実施形態では、各エフェクター配列は、そのうちの１７、１８、１９、または２０すべてのヌクレオチドが、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列からの連続するヌクレオチドである２０のヌクレオチドからなってよい。

【0129】

多重ターゲティングｄｄＲＮＡｉ薬
複数のエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬は、一連の分子ターゲットおよび個体間で存在し得る天然に存在するその変異体をターゲティングし得るという利点と、さらには、単一のエフェクター配列とは対照的に、複数のエフェクター配列で達成される相加効果または相乗効果の利点を有する。本発明では、一実施形態で、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βから選択される２または３つの異なるターゲット遺伝子が存在する場合、２または３つの遺伝子をターゲティングするために、単一のコンストラクトを利用することが特に有利である。このことにより、それぞれ異なる遺伝子をターゲティングする複数のｄｄＲＮＡｉ薬を送達する必要性が排除される。当業者には理解されるように、その送達が、各薬剤の同等および十分な濃度をもたらすことを保証することは困難であろう。

【0130】

本発明の一実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、ＡＭＤ関連遺伝子の１つより多いターゲット配列をターゲティングし得るように、２つ以上のエフェクター配列を含む。複数のターゲット配列は、１つの遺伝子の同じ領域にあってよい。例えば、個体間で配列に天然の変化を伴うＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、またはＰＤＧＦＲ−β内の１７〜３０ヌクレオチド領域、好ましくは、１７〜２１ヌクレオチド領域。別法では、ターゲット配列は、１つのターゲット遺伝子の異なる領域にあってよく、その際、ターゲット遺伝子は、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、またはＰＤＧＦＲ−βであってよい。

【0131】

上記のとおり、ターゲット配列はまた、異なるＡＭＤ関連遺伝子中にあってよい。例えば、第１のエフェクター配列は、ＶＥＧＦＲ２中の配列をターゲティングする一方で、同じｄｄＲＮＡｉ薬中の第２のエフェクター配列は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子中の配列をターゲティングする。好ましい実施形態では、それぞれがＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ中の配列をそれぞれターゲティングする少なくとも２つのエフェクター配列が存在する。一代替実施形態では、それぞれがＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−β中の配列をそれぞれターゲティングする少なくとも３つのエフェクター配列が存在する。

【0132】

より高い特異性を得るために、ｄｄＲＮＡｉ薬は、次のものを（不特定の順序で）含む：
・少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
・少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；
・第１のエフェクター相補配列；および
・第２のエフェクター相補配列。

【0133】

多重ターゲティングｄｄＲＮＡｉ薬の第１および第２のエフェクター配列は、それらの個々のエフェクター相補部と二本鎖領域を形成する。好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は、１７〜３０ヌクレオチド長である。より好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は両方とも、上記の表１において列挙した配列番号４０〜７８の配列のいずれか１つのうちの任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されるか、または表１において列挙した配列とは１、２、３、４、または５つのヌクレオチドの相違を有する配列である。

【0134】

一実施形態では、第１のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択され、第２のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される。第１および第２のエフェクター配列は両方とも、同じ配列であってよく、または別法では、異なる配列であってよい。

【0135】

第１および第２のエフェクター配列はそれぞれ、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドから選択される配列を含んでよく、または別法では、各エフェクター配列はまた、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってよい。またさらなる実施形態では、各エフェクター配列は、そのうちの１７、１８、１９、または２０すべてのヌクレオチドが、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列からの連続するヌクレオチドである２０のヌクレオチドからなってよい。２つ以上のエフェクター配列が存在する場合、それらは、上記の３種の組み合わせを表してよい。

【0136】

特に好ましい実施形態では、第１および第２のエフェクター配列は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくはこの実施形態では、各エフェクター配列は、配列番号４７および配列番号５６からなる配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されるので、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、
５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’（配列番号４７）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
５’ ＵＧＵＡＡＣＡＧＡＵＧＡＧＡＵＧＣＵＣＣＡ ３’（配列番号５６）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチド第２のエフェクター配列；および
第２のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬を提供することとなる。

【0137】

ロングヘアピン型バージョン
ｄｄＲＮＡｉ薬が、１つより多いエフェクター配列を含有し、また、ｄｄＲＮＡｉ薬が、ＲＮＡの一本鎖として発現される場合、これは、折りたたまれて、エフェクター配列と、エフェクター配列に対して相補的な配列の順序に応じて種々の構造を形成するであろう。一実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子、および／または１つもしくは複数のＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−β遺伝子中の１つもしくは複数ターゲット配列の発現を阻害するＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；
第２のエフェクター相補配列；および
第１のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。これは、図１Ａに示されているとおりの構造を有するｄｄＲＮＡｉ薬をもたらすはずである。また、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／１０６５１７を参照されたい。

【0138】

別法では、少なくとも１つのエフェクター、好ましくは、両方のエフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は両方とも、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される。例えば、一実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
５’ ＡＡＧＵＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＧＧＡＧＧＣＣ ３’（配列番号４１）の第１のエフェクター配列；
５’ ＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ３’（配列番号４４）の第２のエフェクター配列；
第２のエフェクター相補部；および
第１のエフェクター相補部
を含み、その際、そのＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦ−ＡであるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0139】

各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である。

【0140】

別法では、少なくとも１つのエフェクター、好ましくは、両方のエフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0141】

特に好ましい実施形態では、第１および第２のエフェクター配列は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８から、より好ましくは、配列番号４０〜５９から、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0142】

ｄｄＲＮＡｉ薬が３つのエフェクター配列を有するまた別の実施形態では、ターゲット遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
５’ ＡＡＧＵＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＧＧＡＧＧＣＣ ３’（配列番号４１）の第１のエフェクター配列；
５’ ＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ３’（配列番号４４）の第２のエフェクター配列；
５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’（配列番号４７）の第３のエフェクター配列；
第３のエフェクター相補配列；
第２のエフェクター相補配列；および
第１のエフェクター相補配列
を含むｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0143】

各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である。

【0144】

別法では、少なくとも１つのエフェクター、場合により、３つのエフェクターのうちの２つ、またはエフェクターの３つすべては、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0145】

特に好ましい実施形態では、第１、第２、および第３のエフェクター配列は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８から、より好ましくは、配列番号４０〜５９から、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0146】

また、エフェクター配列とそのエフェクター相補部とがアニーリングしてｄｓＲＮＡを形成することにより、単一のロングヘアピン型構造が形成されることを条件として、エフェクターおよびエフェクター相補部の順序は変わり得ることは、当業者には分かるであろう。例えば、２−エフェクター配列ｄｄＲＮＡｉ薬では、配列は、次の例示的な５’から３’への順序で配置されていてよい：
・第１のエフェクター−第２のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第１のエフェクター相補部；
・第２のエフェクター−第１のエフェクター−第１のエフェクター相補部−第２のエフェクター相補部；
・第１のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第１のエフェクター相補部；
・第１のエフェクター相補部−第２のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第１のエフェクター；
・第１のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第１のエフェクター。

【0147】

３−エフェクター配列ｄｄＲＮＡｉ薬では、配列は、次の例示的な５’から３’への順序で配置されていてよい：
・第１のエフェクター−第２のエフェクター−第３のエフェクター−第３のエフェクター相補部−第２のエフェクター相補部−第１のエフェクター相補部
・第１のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第３のエフェクター−第３のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第１のエフェクター相補部；
・第１のエフェクター−第２のエフェクター−第３のエフェクター相補部−第３のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第１のエフェクター相補部
・第１のエフェクター−第３のエフェクター−第２のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第３のエフェクター相補部−第１のエフェクター相補部
・第１のエフェクター相補部−第２のエフェクター相補部−第３のエフェクター相補部−第３のエフェクター−第２のエフェクター−第１のエフェクター相補部
・第１のエフェクター相補部−第２のエフェクター相補部−第３のエフェクター−第３のエフェクター相補部−第２のエフェクター−第１のエフェクター。

【0148】

またさらなる実施形態では、第１のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されてよく；第２のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されてよく；第３のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されてよく；任意のさらなるフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択されてよい。別法では、各エフェクター配列はまた、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってもよい。好ま しくは、この相違は、最初および／または最後の５つのヌクレオチドに存在し、少なくとも中心の１１〜１２のヌクレオチドは、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。各実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａのみがターゲティングされている際には、各エフェクター配列は、配列番号４０〜４９から選択され；ＶＥＧＦＲ２のみがターゲティングされている際には、各エフェクター配列は、配列番号５０〜５９から選択され；ＰＤＧＦＲ−βのみがターゲティングされている際には、各エフェクター配列は、配列番号６０〜６９から選択され；ＣＦＢのみがターゲティングされている際には、各エフェクター配列は、配列番号７０〜７８から選択される。

【0149】

第１、第２、および第３のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドから選択される配列をそれぞれ含んでよいか、または別法では、各エフェクター配列は、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってもよい。またさらなる一実施形態では、各エフェクター配列は、そのうちの１７、１８、１９、または２０すべてのヌクレオチドが配列番号４０〜７８からなる群から選択される連続するヌクレオチドである２０のヌクレオチドからなってよい。複数のエフェクター配列が存在する場合、これらは、上記の３つの種類の組み合わせを表してよい。

【0150】

多重ヘアピン型バージョン
一代替実施形態では、１つまたは複数のＡＭＤ関連遺伝子、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢまたはＰＤＧＦＲ−β遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補部；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；および
第２のエフェクター相補部
を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0151】

別法では、少なくとも１つのエフェクター、好ましくは、両方のエフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0152】

この結果、発現させるために使用する発現カセットの種類に応じて、図１ＢまたはＣにおいて示されているとおりの構造を有するｄｄＲＮＡｉ薬が生じる（本明細書中において下記を参照されたい）。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／０８７９２６およびＷＯ２００６／０８４２０９も参照されたい。

【0153】

いずれの実施形態でも、２つのターゲット配列が存在する場合、第１および第２のエフェクター配列が両方とも、個々のターゲット配列の転写産物の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であることが好ましい。

【0154】

好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は両方とも、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される。例えば、一実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’（配列番号４７）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
５’ ＡＡＧＵＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＧＧＡＧＧＣＣ ３’（配列番号４１）または５’ ＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ３’（配列番号４４）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列；および
第２のエフェクター相補配列
を含み、その際、ＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦ−ＡであるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0155】

各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である。

【0156】

別法では、少なくとも１つのエフェクター、好ましくは、両方のエフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補性を有する。

【0157】

特に好ましい実施形態では、第１および第２のエフェクター配列は、ターゲット領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0158】

ｄｄＲＮＡｉ薬が３つのエフェクター配列を有するまた別の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
５’ ＡＡＧＵＵＣＡＵＧＧＵＵＵＣＧＧＡＧＧＣＣ ３’（配列番号４１）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
５’ ＵＣＵＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ３’（配列番号４４）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列；
第２のエフェクター相補配列；
５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ（配列番号４７）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第３のエフェクター配列；および
第３のエフェクター相補配列
を含み、その際、ＡＭＤ関連遺伝子がＶＥＧＦ−ＡであるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0159】

ｄｄＲＮＡｉ薬が２つのエフェクター配列を有するまた別の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＲＦ−２の５’ ＵＧＵＡＡＣＡＧＡＵＧＡＧＡＵＧＣＵＣＣＡ ３’（配列番号５６）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＦＡ（配列番号４７）の５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列；および
第２のエフェクター相補配列．
を含むｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0160】

これらの実施形態における各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である。

【0161】

ＶＥＧＦＡ配列が第１であってよく、ＶＥＧＦＲ２配列が第２であってよいことは、当業者には分かるであろう。これは、同等の一実施形態である。

【0162】

ｄｄＲＮＡｉ薬が３つのエフェクター配列を有するまた別の実施形態では、１つまたは複数のＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＲＦ−２の５’ ＡＡＧＵＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＵＧＧＣ ３’（配列番号５２）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列；
第１のエフェクター相補配列；
ＡＭＤ関連遺伝子ＣＦＢの５’ ＵＵＡＵＡＧＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＵＣＣＵＣ ３’内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列（配列番号７８）；
第２のエフェクター相補配列；
ＡＭＤ関連遺伝子ＰＤＧＦＲ−βの５’ ＵＡＧＣＵＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＵＣＣ ３’（配列番号６３）のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第３のエフェクター配列；および
第３のエフェクター相補配列
を含むｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0163】

これらの実施形態の両方における各エフェクター配列は、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的である。配列が、異なる５’から３’への順序であってよく、また、同等の実施形態を表すことは、当業者には分かるであろう。例えば、ＰＤＧＦＲ−βが第１であってよく、ＶＥＧＦＲ２が第２であってよく、ＣＦＢが第３であってよい。別法では、少なくとも１つのエフェクター、および場合により、３つのエフェクターのうちの２つ、または３つすべてが、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0164】

特に好ましい実施形態では、第１、第２、および第３のエフェクター配列は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害し得る配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0165】

またさらなる実施形態では、第１のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドであってよく；第２のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドであってよく；第３のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドであってよく；任意のさらなるエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドであってよい。好ましくは、各エフェクター配列は、少なくとも１７の連続するヌクレオチドである。

【0166】

各エフェクター配列はまた、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってよい。好ましくは、この相違は、最初および／または最後の５つのヌクレオチドに存在し、少なくとも中心の１０〜１２のヌクレオチドは、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0167】

第１、第２、および第３のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドから選択される配列をそれぞれ含んでよいか、または別法では、各エフェクター配列はまた、１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有する配列番号４０〜７８の変異体であってよい。またさらなる実施形態では、各エフェクター配列は、そのうちの１７、１８、１９、または２０すべてのヌクレオチドが、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列からの連続するヌクレオチドである２０のヌクレオチドからなってよい。複数のエフェクター配列が存在する場合、それらは、上記の３種の組み合わせを表してよい。

【0168】

さらに、ロングヘアピン型構造または多重ヘアピン型構造では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、次の式のいずれかにより、追加のエフェクター配列および対応する相補配列を含んでよい：
ロングヘアピン型：
・［エフェクター配列］１〜１０［エフェクター相補配列］１〜１０
多重ヘアピン型：
・［エフェクター配列−エフェクター相補配列］１〜１０

【0169】

好ましくは、ロングヘアピン型の式では、エフェクター配列の数は、エフェクター相補配列の数と等しい。典型的には、２、３、４、または５つのエフェクター配列が存在し、したがって、それぞれ２、３、４、または５つのエフェクター相補配列が存在する。

【0170】

ｄｄＲＮＡｉ薬が、１つより多いエフェクター配列を含有する場合、それらのエフェクター配列は、同じでも、異なってもよい。例えば、ｄｄＲＮＡｉ薬が３つのエフェクター配列を有する場合、２つのエフェクター配列が同じ配列を有してもよく、１つは異なる。別法では、３つすべてのエフェクター配列が異なってよい。好ましくは、エフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドであるか、または１、２、３、４、または５つのヌクレオチド変化を有するその変異体である。好ましくは、この相違は、最初および／または最後の５つのヌクレオチドに存在し、少なくとも中心の１０〜１２のヌクレオチドは、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的である。

【0171】

天然に存在する変異体を有するターゲット配列の単一の領域、または単一のヌクレオチド多型をターゲティングする場合、少なくとも１つのエフェクター配列が、配列番号４０〜７８からなる群から選択される配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される一方で、他のエフェクター配列は、選択された配列の変異体であることが好ましい。例えば、第１のエフェクター配列は、配列番号４７の２０のヌクレオチドを含んでよく；したがって、第２のエフェクター配列は、配列番号４７の変異体であるべきである。

【0172】

ヘアピン型構造
上記の実施形態では、エフェクター配列は、その対応するエフェクター相補配列とハイブリッド形成して、ヘアピン型構造を形成する。ヘアピンの末端では、２つ以上の未結合のヌクレオチドが、「ヒンジ」または「ループ」を形成する。一実施形態では、未結合のヌクレオチドがエフェクター配列およびエフェクター相補部の一部であるので、エフェクター配列の少なくとも１７のヌクレオチドの一部のみが、その対応する相補配列と二重鎖を形成することとなる。例えば、エフェクター配列およびその相補部が両方とも２０ヌクレオチド長である場合、そのヌクレオチドの１８のヌクレオチドは塩基対形成して二本鎖領域を形成し得るが、残りの合計４つのヌクレオチドはエフェクター配列およびそのエフェクター相補配列との間で一緒に、一本鎖ループを形成することとなる。

【0173】

一代替実施形態では、それ自体、ターゲット配列、エフェクター配列、またはエフェクター相補部に対して非相補的である追加の配列が、「ループ」を作成するために、ｄｄＲＮＡｉに含まれていてよい。したがって、本発明のまた別の実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、ループを形成することができる２〜１００の不対ヌクレオチド、より好ましくは、２〜１０の不対ヌクレオチドの配列をさらに含む。好ましい実施形態では、ループは、ヌクレオチド配列ＡＡ、ＵＵ、ＵＵＡ、ＵＵＡＧ、ＵＵＡＣＡＡ、ＣＡＡＧＡＧＡ、またはＮ_１ＡＡＮ_２を含み、その際、Ｎ_１およびＮ_２は、Ｃ、Ｇ、Ｕ、およびＡのいずれかであり、同じでも、異なってもよい。別段に、特異的なループ配列は、ＡＣＵＧＵＧＡＡＧＣＡＧＡＵＧＧＧＵを含む。これらのループでは、ループ配列のすべてが、アニーリングされていないままでなければならないというわけではない。例えば、１８のヌクレオチドのループでは、例えば、最初および最後の３つのヌクレオチドは、相互にアニーリングしていてもよく、残りの介在する１５のヌクレオチドは、アニーリングされていない。

【0174】

ｄｄＲＮＡｉ薬がｍｉＲＮＡ構造の一部として発現される実施形態では、ループ配列は、ｍｉＲＮＡに由来してもよく、また、ｍｉＲＮＡエンコーディング（ＭＥ）配列によりコードされる。

【0175】

ｄｄＲＮＡｉ薬構造に応じて、１つまたは複数のループが存在してよい。ｄｄＲＮＡｉ薬が式［エフェクター配列］_１〜１０［エフェクター相補配列］_１〜１０に基づく構造を有する場合、図１Ｄに図示されているとおり、単一のループ型構造を生じさせる追加の非自己相補配列が、最後のエフェクター配列と、その最後のエフェクター配列のエフェクター相補配列との間に含まれている。したがって、この実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βから選択されるＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；
第２のエフェクター相補配列；および
第１のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0176】

ｄｄＲＮＡｉ薬が、式［エフェクター配列−エフェクター相補配列］_１〜１０に基づき、多重ヘアピン型構造を有する場合、図１ＥおよびＦに図示されているとおり（発現のために使用される発現カセットの種類による；本明細書において下記を参照されたい）、ループ型構造を生じさせるために、追加の非自己相補配列が、各エフェクター配列と、その相補配列との間に含まれている。この実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；
第１のエフェクター相補配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および
第２のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であり、遺伝子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの１つまたは複数から選択されるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0177】

２つより多いエフェクターおよび相補配列が存在し、したがって、２つより多いヘアピン型構造が存在するこの実施形態では、各ループ型構造を形成する追加の非自己相補配列の長さは、同じでなくてもよい。例えば、あるループ型構造は５つのヌクレオチドを有してよく、別のループ型構造は９つのヌクレオチドを有してよい。

【0178】

加えて、２つ以上のヘアピン型構造が存在する場合、各ループの間でスペーサー配列として作用する追加の非自己相補配列が存在し得る。この実施形態では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）薬であって、５’から３’方向で、少なくとも：
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；
第１のエフェクター相補配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；
少なくとも１７ヌクレオチド長の第２のエフェクター配列；
２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および
第２のエフェクター相補配列
を含み、その際、各エフェクター配列が、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であり、遺伝子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの１つまたは複数から選択されるｄｄＲＮＡｉ薬を提供する。

【0179】

２鎖ｄｄＲＮＡｉ薬
当業者であれば分かるとおり、ｄｄＲＮＡｉ薬全体が１配列として発現される必要はない。例えば、本発明の一実施形態では、第１のエフェクター配列は、（例えば、一方のＤＮＡ配列により転写されて）生成されてよく、第１のエフェクター相補配列は、（例えば、別のＤＮＡ配列から転写されて）生成されてよい。場合により、ループ配列は、転写産物に結合していてよいか、または一方の転写産物の３’末端および他方の転写産物の５’末端に結合しているループの一部に結合していてよいかのいずれかであり、そのループ配列は、エフェクターまたはエフェクター相補配列がｍｉＲＮＡ構造の一部として発現される場合、ｍｉＲＮＡに由来し得る。次いで、細胞内で、２つの転写産物は、第１のエフェクター配列とその相補部とのアニーリングによるハイブリッド形成により、ｄｄＲＮＡｉ薬を形成する。

【0180】

化学的に合成されたｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏで発現されるｄｄＲＮＡｉ薬
滲出型ＡＭＤの有効な処置は、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトからインビボで発現されるｄｄＲＮＡｉ薬を必要とするであろうと考えられている一方で（以下で概説するとおり）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現されるｄｄＲＮＡｉ薬を投与するか、または化学的に合成されるｓｉＲＮＡを投与して、それにより、一時的な効果を伴う治療として機能することが望ましい状況も存在し得る。ｉｎ ｖｉｖｏで発現されるｄｄＲＮＡｉ薬での長期治療を開始する前に、その処置に対する反応について患者をスクリーニングするために、例えば、細胞に組み込まれず、細胞中で複製されないｓｉＲＮＡで短期間処置することは有利であり得る。

【0181】

したがって、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させ、次いで、ターゲット細胞に送達することができる。別法では、ｓｉＲＮＡを化学的に合成し、次いで、ターゲット細胞に送達することができる。このことを考慮して、本発明の別の態様では、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するための低分子干渉ＲＮＡｉ薬（ｓｉＲＮＡ薬）であって、
少なくとも１７ヌクレオチド長の第１のエフェクター配列；および
第１のエフェクター相補配列；
を含み、その際、エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｓｉＲＮＡを提供する。

【0182】

上記のｄｄＲＮＡｉ薬と同様に、ｓｉＲＮＡ薬も、ＶＥＧＦ−Ａなどの単一の遺伝子中の複数のターゲット、またはＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βなどの１つより多い遺伝子中のターゲットを重複ターゲティングするために１つより多いエフェクター配列を含んでよい。エフェクター配列は、好ましくは、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される。

【0183】

ｓｉＲＮＡの設計においては、かなりの柔軟性が可能である。典型的には、ｓｉＲＮＡは、５’−ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル残基を有するｄｓＲＮＡ分子からなり、鎖長は、２０〜２９のヌクレオチドで様々であってよく、場合により、２つのヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含むように設計されていてよい。一部の実施形態では、各鎖は、Ｎ_１９〜２ＴＴ（ここで、ＴＴはデオキシリボヌクレオチド_７であってよい）として合成されてよい。ｓｉＲＮＡは、上記のとおりの配列番号４０〜７８の領域に基づき容易に設計することができ、また、単一の配列として、または任意に組み合わせて治療で使用することができる。別法では、ｓｉＲＮＡ薬は、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットから発現されるものと同様、または同一のエフェクターおよびエフェクター相補配列を含有する単一のＲＮＡ分子からなり得る。これらの配列は、配列番号４０〜７８に基づいてよく、単一の配列として、または相互に任意に組み合わせて治療で使用することができる。ｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミデートおよび従来のシンセサイザーを用いて化学的に合成することができ、したがって、広く市販されていて、当技術分野において日常的な方法に従って設計および合成することができる。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号４０〜７８の１つまたは複数からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドの配列を有する。

【0184】

発現カセットおよびｍｉＲＮＡバックボーン
本発明のｄｄＲＮＡｉ薬は、ＤＮＡ発現カセットから発現される。この発現カセットは、プロモーターなどの発現に必要な制御配列を、ｄｄＲＮＡｉ薬自体をコードするＤＮＡ配列と一緒に含む。ｄｄＲＮＡｉ薬がｍｉＲＮＡ構造の一部として発現される実施形態では、発現カセットはまた、そのｍｉＲＮＡ構造をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0185】

ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、
（不特定の順序で）
・１つまたは複数のプロモーター配列、
・１つまたは複数のエフェクター配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
・１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；
および場合により、
・１つまたは複数のターミネーター配列、
・ループ配列、スペーサー配列、またはそれら両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
・１つまたは複数のエンハンサー配列
を含む。

【0186】

最初のプロモーター配列および最後のターミネーター配列は、発現カセットがクローニングされるベクターに由来してよい。

【0187】

一実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）発現カセットであって、そのｄｄＲＮＡｉ薬がＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害し、そのｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、５’から３’方向で、：
プロモーター配列、
第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列、
第１のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列、および
ターミネーター配列
を含むＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）発現カセットを提供する。

【0188】

第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列内の１０以上、好ましくは、１７以上の連続するヌクレオチドをコードするＤＮＡである。特に好ましい一実施形態では、第１のエフェクター配列は、ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害することができる配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、この実施形態では、第１のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0189】

別法では、ｄｄＲＮＡｉ薬自体に関連して上記で概説したとおり、ターゲット配列の転写産物と塩基対形成してターゲット配列の発現を阻害するようにコードされた配列の能力に影響を及ぼさなければ、エフェクター配列をコードする配列は、配列番号４０〜７８とは１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なるエフェクター配列をコードしてよい。

【0190】

任意の所与のＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列は、ウラシル（Ｕ）塩基の代わりにチミン（Ｔ）塩基を有することを除いて、ＲＮＡと同じ配列であることは、当業者であれば分かるであろう。ロングヘアピン型構造中に１つより多いエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬をコードするｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、５’から３’方向で、
プロモーター配列；
第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列；
第２のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列；
場合により、ループを形成することができる配列をコードする配列；
第２のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；
第１のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；および
場合により、ターミネーター配列
を含む。

【0191】

好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される第１および第２のエフェクター配列をコードする。好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は、配列番号４０〜５９から選択される。別法では、ターゲット配列の転写産物と塩基対形成してターゲット配列の発現を阻害するようにコードされたエフェクター配列の能力に影響を及ぼさなければ、ＤＮＡ配列は、配列番号４０〜７８とは１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なるエフェクター配列をコードする。

【0192】

式［エフェクター配列−エフェクター相補配列］_１〜１０に基づき、ｄｄＲＮＡｉ薬が１つより多いエフェクター配列および多重ヘアピン型構造を有する場合、各［エフェクター配列−エフェクター相補配列］対の発現は、単一のプロモーターにより、または別法では別々のプロモーターにより制御されてよい。別々のプロモーターが企図される場合、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、５’から３’方向で、
プロモーター配列、
第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列、
第１のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；
場合により、ターミネーター配列；
プロモーター配列；
第２のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列；
第２のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；および
場合により、ターミネーター配列
を含む。

【0193】

この実施形態では、各エフェクター／エフェクター相補部は、単一のヘアピン型構造として発現されるので、複数のｄｄＲＮＡｉ薬が、１つの発現カセットから産生される。

【0194】

単一のプロモーターが企図されている場合、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、５’から３’方向で、：
プロモーター配列
第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列、
第１のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；
第２のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列；
第２のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；および
場合により、ターミネーター配列
を含む。

【0195】

上記の実施形態と同様に、このＤＮＡ配列は、好ましくは、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドから選択される第１および第２のエフェクター配列、または配列が配列番号４０〜７８とは１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なるエフェクター配列をコードする。好ましくは、第１および第２のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0196】

上述のｄｄＲＮＡｉ薬はいずれも、好ましくは、発現カセットからｍｉＲＮＡ構造で発現される。

【0197】

ｄｄＲＮＡｉコンストラクトから発現されるｓｈＲＮＡのプロセシングは、不正確であり得る。ＲＮＡｉプロセシング経路のための天然基質であるｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ構造内での、またはその一部としてのｄｄＲＮＡｉの発現が、これを最小限にする１つの方法である。ＭｃＢｒｉｄｅら（２００８）は、内在ｍｉＲＮＡの塩基およびループから配列を発現する「人工ｍｉＲＮＡ」コンストラクトを設計し、これらは、発現されたｓｈＲＮＡのより正確なプロセシングを示唆する毒性の低減を示した。Ｗｕら（２０１１）は、ことによると、内在ｍｉＲＮＡに対するそれらのより大きな構造上の類似により、二重鎖のミスマッチ（パッセンジャー鎖中にミスマッチを含有）は時には、サイレンシング活性の増大を示すことを示した。同様に、Ｇｕら（２０１２）は、ループ配列に隣接するバルジのｓｈＲＮＡ分子への導入は、ダイサープロセシングの精度の上昇をもたらし得ることを示した。

【0198】

エフェクターおよびエフェクター相補部がｍｉＲＮＡ構造として発現される実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、「ｍｉＲＮＡエンコード配列」または「ＭＥ配列」と称されるｍｉＲＮＡ構造をコードする配列をさらに含む。これは、発現されると折りたたまれてｍｉＲＮＡ構造になるＲＮＡをコードするｄｄＲＮＡｉ発現カセット内に含まれるＤＮＡ配列である。したがって、エフェクター配列およびエフェクター相補部は、そのｍｉＲＮＡ構造の一部として、またはその内部で発現される。ｍｉＲＮＡ構造で発現されるｄｄＲＮＡｉ薬を示す図から理解されるとおり、また、本明細書において既に詳述したとおり、ＭＥ配列は、必要とされるように、エフェクター配列およびエフェクター相補配列の上流および下流に設置されるであろう。例として単一のエフェクター−エフェクター相補部の対を有するｄｄＲＮＡｉ薬を発現する発現カセットを使用すると、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）発現カセットであって、５’から３’方向で、
プロモーター配列、
第１のＭＥ配列、
第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列、
場合により、ループを形成することができる配列をコードする配列、
第１のエフェクター相補配列をコードするＤＮＡ配列；
第２のＭＥ配列；および
場合により、ターミネーター配列
を含み、その際、第１および第２のＭＥ配列によりコードされる配列が、ｍｉＲＮＡ構造を形成することができるｄｄＲＮＡｉカセットを提供する。したがって、エフェクター配列およびエフェクター相補部は、そのｍｉＲＮＡ構造の一部として、またはその内部で発現される。

【0199】

ループを形成することができる配列をコードする場合による配列も、ＭＥ配列であり得る。例えば、特定のｍｉＲＮＡ構造を、ｄｄＲＮＡｉ薬がその内部で、またはその一部として発現される構造として利用するならば、ｄｄＲＮＡｉ薬のループ配列は、同じｍｉＲＮＡに由来してよい。代替実施形態では、ループ配列は、ＭＥ配列によりコードされるｍｉＲＮＡ構造とは異なるｍｉＲＮＡに由来してよいが、それでもなお、ｍｉＲＮＡ由来または起源の配列である。

【0200】

別法では、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットを、プロモーターおよびターミネーターの間の配列の全長の産物である、発現されるｄｄＲＮＡｉ薬の全長に対する言及によって記載することもできる。例えば、単一のエフェクターｄｄＲＮＡｉ中のエフェクター配列の長さが、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドからなる場合、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、プロモーターおよびターミネーターの間に３４〜６０のヌクレオチドの長さを有するであろう。この長さは、「ループ」または「ヒンジ」配列の２〜１００のヌクレオチドをさらに含んで、３６〜１６０のヌクレオチドの長さとなってもよい。各エフェクター配列が１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のヌクレオチドからなる複数のエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬では、比例して、全長が増大する。

【0201】

ｍｉＲＮＡ構造（複数可）をコードするＭＥ配列の存在も、全長に加わるであろう。

【0202】

本発明のｄｄＲＮＡｉ発現カセットを設計する有用な方法の１つは、ダイサーがヌクレオチドを２２ごとに切断すると仮定することであり（「２２ｎｔフェージング（２２ｎｔ ｐｈａｓｉｎｇ）」とも称される）、したがって、エフェクター配列は、配列番号４０〜７８からなる群からの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを、適切なスペーサーおよび適切なプロモーターのための他の配列要求と共にコードするように設計され得る。

【0203】

ｍＲＮＡの二次構造の影響を回避し、したがって、それらの機能を独立に果たし得るので、ｍＲＮＡの種々の部位をターゲティングする薬剤が、ｓｈＲＮＡコンストラクションには適している。

【0204】

Ｕ６プロモーターを使用する場合には、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ配列がグアニン（Ｇ）塩基で始まることが、必須ではないが好ましく；Ｈ１プロモーターを使用する場合には、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ配列がアデニン（Ａ）塩基で始まることが、必須ではないが好ましい。したがって、それに応じて、エフェクターエンコード配列は、改変されていてよい。

【0205】

ｓｈＲＮＡの発現を駆動するためのｍｉＲＮＡ由来配列の使用は、ｐｏＩ ＩＩプロモーターを使用すると、特に有利である。ｐｏｌ ＩＩプロモーターでの転写開始部位は、往々にして不明確である。ｓｈＲＮＡのダイサープロセシングは、ｓｈＲＮＡの構造に大きく依存するので、多くの場合に、プロセシングは、転写開始部位のわずかな変化により、大きな影響を受けないであろう。したがって、ｍｉＲＮＡ由来配列の使用は、ｐｏｌ ＩＩプロモーターを利用するｄｄＲＮＡｉコンストラクトの設計において、より大きな柔軟性を可能にする。

【0206】

一部の場合には、ｓｈＲＮＡの長さを増大させることが有利であり得る。これを達成するための方法の１つは、５’または３’方向のいずれかでｓｈＲＮＡ中のエフェクター配列の長さを延長して、ターゲット配列に対するその相補性を最大化し、また、エフェクター相補部の長さを延長して、ｓｈＲＮＡのステム内での塩基対形成を最大化することである。例えば、配列番号８中の配列に隣接する追加の配列をターゲティングするために、配列番号４７をベースとするｓｈＲＮＡを、５’または３’方向に容易に延長して、３０のヌクレオチドステムを有するｓｈＲＮＡを生産することができる。エフェクター配列は、本明細書において他の箇所で定義したとおり、ターゲットに対して実質的な相同性を共有し得るであろう。

【0207】

一部の場合には、エフェクター、エフェクター相補部、またはループ配列内でＤＮＡ配列ＴＴＴＴを回避することが望ましいことがある。それというのも、これらは、Ｕ６またはＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを使用する発現コンストラクトにおいて転写ターミネーターとして作用し得るためである。ｓｈＲＮＡ設計はまた、Ｕ６停止が、ｓｈＲＮＡの３’末端に１〜５Ｕ残基を付加すると予測されることを考慮すべきである。ロングヘアピン型ＲＮＡを設計する場合には、ダイサーによりプロセシングされるエフェクター配列が５’ＵまたはＡを含む可能性を最大化し、それにより、ＡＧＯ２への組み込みを促進するように、エフェクター配列の正確な選択を（配列番号４０〜７８からの配列か、またはそれに隣接する配列のいずれかを使用して）改変することが時には有利である。

【0208】

個別のプロモーターまたは単一のプロモーターで各［エフェクター配列−エフェクター相補配列］対の発現を制御するかどうかの選択は、いくつかの因子に左右される。プロモーター間の干渉を最小限にするためには、単一のプロモーターを利用することができる。単一のプロモーターのみを伴うｄｄＲＮＡｉコンストラクトはまた、サイズが比較的小さく、このことは、場合によっては、産生（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製）および送達の両方の間でのコンストラクトの安定性に重要であり得る。加えて、単一のプロモーターを使用することで、プロモーター間の何らかの相同的な組換えの可能性が回避される。

【0209】

しかし、各エフェクター配列または相補部の発現のある程度の調節が必要とされる状況では、複数のプロモーターを有するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを設計し、それにより、各［エフェクター配列−エフェクター相補配列］対の発現を別々のプロモーターにより制御することが有利である。エフェクター配列が異なる配列を有する状況では、配列の性質は、ある１つの配列が、より高い発現レベルで発現されることを意味することがある。各エフェクター配列のより均等な発現レベルを保証することが望ましい場合には、より高度に発現されるエフェクター配列を、より弱いプロモーターと対にすることができ、逆も同様である。さらに、特にｐｏｌ ＩＩＩプロモーターでは、転写されるべき任意の１配列の長さが、比較的短いと、より効率的な発現を達成することができる。複数のプロモーターを使用する場合には、発現カセット中のプロモーター間の何らかの相同的な組換えのリスクを最小限にするために、プロモーターがすべて同じというわけではないことが好ましい。２つのプロモーターの場合には、好ましくは、それぞれ異なる。３つのプロモーターの場合には、少なくとも２つ、場合により３つすべてが、相互に異なる。

【0210】

エフェクター配列をコードするＤＮＡ配列は、プロモーター配列に作動可能に連結されている。配列は、別のヌクレオチド配列と機能的に関連した状態に置かれている場合に、別のヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されている。例えば、コード配列がプロモーター配列に作動可能に連結されているならば、これは一般に、そのプロモーターが、そのコード配列の転写を促進し得ることを意味する。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が典型的には連続していて、また、２つのタンパク質コード領域を合わせる必要がある場合には、連続していて、かつリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーはプロモーターから数キロ塩基離れても機能することがあり、またイントロン配列が様々な長さを有し得るので、一部のヌクレオチド配列は、連続していなくても、作動可能に連結され得る。

【0211】

「プロモーター」または「プロモーター配列」または「プロモーターエレメント」は、一般に、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、かつ、ｍＲＮＡまたは任意のＲＮＡポリメラーゼの任意のクラスにより転写される任意の種類のＲＮＡなどのポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。プロモーターおよびターミネーターは、異なる遺伝子から取られていてよいが、典型的には相互にマッチされる。すなわち、プロモーターおよびターミネーターエレメントは、それらがその中に天然に存在する同じ遺伝子から取られる。より弱い、またはより強いレベルの転写を達成するために、プロモーターはまた、分子技法を使用して、他の方法で、例えば、制御エレメントの変更により変更されていてもよいし、変更されていなくてもよい。

【0212】

プロモーターに関連して言及される用語「構成的な」は、そのプロモーターが、特異的な刺激（例えば、熱ショック、薬品、光など）が存在しない状態で、作動可能に連結された核酸配列の転写を指示することができることを意味する。典型的には、構成的プロモーターは、実質的に任意の細胞および任意の組織においてコード配列の発現を指示することができる。ｄｄＲＮＡｉ薬を転写するために使用されるプロモーターは、好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより制御されるユビキチン、ＣＭＶ、β−アクチン、ヒストンＨ４、ＥＦ−１アルファ、もしくはｐｇｋ遺伝子のためのプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩにより制御されるプロモーターエレメントなどの構成的プロモーターである。他の実施形態では、ＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｕ１、ｈＡＡＴ、β−アクチン、またはハイブリッドＰｏｌ ＩＩプロモーターなどのＰｏｌ ＩＩプロモーターを使用する。他の実施形態では、Ｕ６プロモーター（例えば、Ｕ６−１、Ｕ６−８、Ｕ６−９）、Ｈ１プロモーター、７ＳＬプロモーター、ヒトＹプロモーター（ｈＹ１、ｈＹ３、ｈＹ４（Ｍａｒａｉａら（１９９４）を参照されたい）、およびｈＹ５（Ｍａｒａｉａら（１９９４）を参照されたい）、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、ヒトｔＲＮＡプロモーター、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター、さらには、機能性ハイブリッド、およびこれらのプロモーターの任意の組み合わせなどの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより制御されるプロモーターエレメントを使用する。その活性を低下または上昇させるために改変されているこれらのプロモーターすべての変異体も利用することがでる。例えば、強いプロモーターが、それに作動可能に連結されている配列の多すぎる発現の原因となる場合には、それを、その活性を低下させるように改変することができる。

【0213】

Ｕ６プロモーターを使用する場合には、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ配列がグアニン（Ｇ）塩基で始まることが好ましく；Ｈ１プロモーターを使用する場合には、プロモーターに作動可能に連結されているＤＮＡ配列がアデニン（Ａ）塩基で始まることが好ましい。したがって、核酸の配列は、別のプロモーターよりもある１つのプロモーターを使用することが好ましいことがある。

【0214】

別法では、一部の実施形態では、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトから発現される複数のｄｄＲＮＡｉ薬の誘導性発現を可能にするプロモーターを選択することが最適であることがある。これだけに限定されないが、テトラサイクリン応答系およびｌａｃオペレーター−リプレッサー系（ＷＯ０３／０２２０５２ Ａ１公報；および米国特許出願公開第２００２／０１６２１２６Ａ１号を参照されたい）、エクジソン制御系、またはグルココルチコイド、プロゲスチン、エストロゲン、ＲＵ−４８６、ステロイド、甲状腺ホルモン、環式ＡＭＰ、サイトカイン、レギュレーターのカルシフェロールファミリーにより制御されるプロモーター、またはメタロチオネインプロモーター（亜鉛またはカドミウムなどの無機金属により調節）を含めた、そのようなプロモーターを使用する誘導性発現のためのいくつかのシステムが、当技術分野では公知である。

【0215】

本発明の一部の実施形態で有用なプロモーターは、組織特異的または細胞特異的であり得る。用語「組織特異的」は、プロモーターに対して適用される場合、異なる種類の組織（例えば、脳）では、目的の同じヌクレオチド配列を相対的に発現させることなく、特異的な種類の組織に対して目的のヌクレオチド配列の選択的発現を指示することができるプロモーターを指す。用語「細胞特異的」は、プロモーターに対して適用される場合、同じ組織内の異なる種類の細胞では、目的の同じヌクレオチド配列を相対的に発現は相対的に発現させることなく、特異的な種類の細胞では目的のヌクレオチド配列の選択的発現を指示することができるプロモーターを指す。用語「細胞特異的」は、プロモーターに対して適用される場合、単一の組織内のある領域において目的のヌクレオチド配列の選択的発現を促進することができるプロモーターも意味する。別法では、プロモーターは、構成的または制御可能であり得る。加えて、プロモーターは、異なる特異性を有するように改変され得る。

【0216】

本発明において特に有用な細胞特異的プロモーターの例には、ＲＰＥ細胞特異的プロモーターＲＰＥ−６５およびＶＭＤ２、ならびに脈絡膜内皮特異的プロモーターＦＬＴ−１またはＩＣＡＭ２が含まれる。

【0217】

上記のとおり、エンハンサーエレメントが、場合により、本発明のｄｄＲＮＡｉコンストラクトに含まれる。

【0218】

ｄｄＲＮＡｉ発現カセットまたはコンストラクトが、１つより多いターミネーター配列またはエレメントを含有する場合、そのターミネーター配列またはエレメントは、同じでも異なってもよいか、または任意のカセット内で１回だけ現れるターミネーションエレメントおよび２回以上現れるターミネーションエレメントの組み合わせが存在し得る。どのようなターミネーター配列またはエレメントが使用されても、それらは、使用される肝臓特異的プロモーターと共に適切に機能することを保証するように選択されるべきである。Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、またはＰｏｌ ＩＩＩプロモーターが使用される場合には、適切なターミネーター配列を使用すべきである。本発明で有用なターミネーションエレメントには、Ｕ１停止配列（Ｕ１ボックス）、合成ポリＡターミネーター、およびいわゆるミニマルポリＡターミネーターが含まれる。ＭＡＺ１およびＭＡＺ２などの転写ポーズ部位（Ａｓｈｆｉｅｌｄら、ＥＭＢＯ Ｊ １９９４ Ｖｏｌ１３ Ｎｏ ２３ ５６５６ ｐｐおよびＹｏｎａｈａおよびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ ＥＭＢＯ Ｊ． ２０００ Ｊｕｌ． １７；１９（１４）：３７７０〜７を参照されたい）が、転写停止のカップリングおよびポリアデニル化を促進するために、ポリＡターミネーターの上流に挿入されていてよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターでは、配列ＴＴＴＴ、ＴＴＴＴＴ、またはＴＴＴＴＴＴが、ターミネーターとして共通して使用される。これらの場合、転写産物は典型的には、配列ＵＵにより停止される。

【0219】

ｄｄＲＮＡｉ薬発現コンストラクト
ｄｄＲＮＡｉ薬は、本明細書において「ｄｄＲＮＡｉコンストラクト」と称される任意の適切なベクターまたはｄｄＲＮＡｉコンストラクトに挿入されたＤＮＡ発現カセットから発現されてよい。ＡＭＤのための治療薬を開発するに際しての以前の難題は、投与を繰り返すことを必要とせずに、長期間の発現を保証する正確な細胞の効率的かつ均一な形質導入であった。

【0220】

コンストラクトのベクターバックボーンが送達システムと適合性である場合、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトも、送達コンストラクトである。特に好ましい送達コンストラクトは、ウイルスベクターである。細胞内から治療用ｄｄＲＮＡｉ薬を産生する発現コンストラクトを送達するために、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、またはレンチウイルス（ＬＶ）などのウイルスベクターを使用することで、表面発現されるｔｏｌｌ様受容体３との核酸の直接的な相互作用に多くの場合に起因するインターフェロン応答が回避される。これが、治験におけるｓｉＲＮＡベースの眼薬の数回の失敗の主な理由である。

【0221】

本発明の場合、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬が、網膜層内の深部にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞または他の細胞に届く必要がある。この作用のために、本発明は、マウスモデルにおいて、硝子体内注射の後にＲＰＥ層に浸透し得ることが示されている改変型アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを利用する。野生型の非改変型ＡＡＶ血清型は、この経路により目に導入された場合に、細胞の隣接層よりも多く形質導入するには限られた能力を有する。この理由により、本発明では、改変型ＡＡＶベクターを利用することが好ましい。

【0222】

例えば、チロシン残基を置換して、形質導入の増大をもたらすために、ＡＡＶ株の部位特異的突然変異誘発が使用されている（Ｌｉ Ｚｈｏｎｇ、Ｂａｏｚｈｅｎｇ Ｌｉ、Ｃａｔｈｒｙｎ Ｓ． Ｍａｈ，（２００８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０５（２２）： ７８２７〜７８３２）。ＡＡＶベクターに対する同様の改変により、硝子体内注射の後に網膜の全層にわたって形質導入し得るベクターが作製されている（Ｈｉｌｄａ Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ、Ａｓｔｒａ Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ、Ｑｉｕｈｏｎｇ Ｌｉら（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． １７（３）：４６３〜４７１）。同様に、ＡＡＶベクター中の特異的セリン、トレオニン、またはリシン残基が、宿主細胞のキナーゼ／ユビキチン化／プロテアソーム機構を回避し、かつ、形質導入効率を有意に上昇させるように改変されている（Ｇａｂｒｉｅｌ Ｎ、Ｈａｒｅｅｎｄｒａｎ Ｓ、Ｓｅｎ Ｄら（２０１３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１３（２）：８０〜９３）。特異的ターゲット組織について増大した組織特異性または免疫原性の低減の所望の特性を有する変異体を単離するために、ＡＡＶカプシド変異体のライブラリを作出する方法をスクリーニングすることができる。最近では、Ｓｃｈａｆｆｅｒらが、７マーペプチドがカプシド配列に挿入されているＡＡＶ変異ベクターの硝子体内注射後に幅広い経網膜送達を示し得ている（Ｄａｌｋａｒａ, Ｄ．、Ｌ．Ｃ． Ｂｙｒｎｅ、Ｒ．Ｒ． Ｋｌｉｍｃｚａｋら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５：１８９ｒａ７６）。

【0223】

典型的には、ＡＡＶのゲノムは、２個の遺伝子のみを含有する。「ｒｅｐ」遺伝子は、ＤＮＡ複製において利用される少なくとも４つの別々のタンパク質をコードする。「ｃａｐ」遺伝子産物は、差別的にスプライシングされて、ウイルスのカプシドを含む３つのタンパク質を生成する。ゲノムを発生期ウイルスにパッケージングする場合、末端逆位配列（ＩＴＲ）のみが、絶対配列（ｏｂｌｉｇａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり；ｒｅｐおよびｃａｐは、ゲノムから削除して、選択した異種配列と置き換えることができる。しかしながら、複製に必要なタンパク質を産生し、ＡＡＶベースの異種コンストラクトを発生期ウイルス粒子にパッケージングするためには、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をトランスに供給しなければならない。アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの同時感染により通常は供給されるヘルパー機能も、１つまたは複数のＤＮＡ発現プラスミドの形態でトランスに供給することができる。このゲノムは通常、２つの遺伝子のみをコードするので、送達ビヒクルとして、ＡＡＶが、４．５一本鎖キロ塩基（ｋｂ）のパッケージング容量により制限されることは意外ではない。しかしながら、このサイズ制限が、置換遺伝子治療のために送達され得る遺伝子を限定することはあるが、これが、ｄｄＲＮＡｉベクターなどの比較的短い配列のパッケージングおよび発現に不利な影響を及ぼすことはない。

【0224】

本発明は、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害するためのｄｄＲＮＡｉ薬を発現するためのｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトであって、
（不特定の順序で）
１つまたは複数のプロモーター配列、
１つまたは複数のエフェクター配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；
および場合により、
１つまたは複数のターミネーター配列、
ループ配列、スペーサー配列、または両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエンハンサー配列を含み、その際、そのコンストラクトがウイルス送達コンストラクトであり、好ましくは、ウイルス送達コンストラクトがＡＡＶ改変型ベクターである、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを提供する。

【0225】

好ましくは、この発現カセットは、ＭＥ配列をさらに含み、ｄｄＲＮＡｉ薬がｍｉＲＮＡ構造の一部として、またはその内部に発現されるようになっている。

【0226】

好ましい実施形態では、ウイルス送達コンストラクトの発現カセットは、ＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＲＦ−２（配列番号５６）の５’ ＵＧＵＡＡＣＡＧＡＵＧＡＧＡＵＧＣＵＣＣＡ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第１のエフェクター配列、およびＡＭＤ関連遺伝子ＶＥＧＦ−Ａ（配列番号４７）の５’ ＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣ ３’のうちの任意の１０以上の連続するヌクレオチドの第２のエフェクター配列をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。

【0227】

ウイルス送達後の本発明のｄｄＲＮＡｉ薬の発現は、持続的であり、薬物の１回の投与から、患者の寿命までであり得る。したがって、本発明の別の態様では、本発明によるｄｄＲＮＡｉ発現カセットが挿入されているウイルスベクターを含むｄｄＲＮＡｉ治療薬を提供する。好ましくは、この発現カセットは、本明細書を通じて記載している組み合わせおよび実施形態から選択されるロングヘアピン型構造または多重ヘアピン型構造のいずれかとして、複数のｄｄＲＮＡｉ薬をコードする。好ましい実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬のエフェクター配列およびエフェクター相補配列は、ｍｉＲＮＡ構造内で発現される。

【0228】

典型的には、ウイルスベクターの生産において、ウイルスの正常な内在遺伝子をゲノムから削除し、選択した異種の配列と交換することができる。しかしながら、複製に必要なタンパク質を産生し、ウイルスベースの異種コンストラクトを発生期ウイルス粒子にパッケージングするためには、ゲノムから取り除いたウイルスタンパク質をトランスに供給しなければならない。限定ではないが、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成、ＤＮＡ合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、結紮、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準的な技術を含めた当技術分野で周知の任意の適切な遺伝子工学技術を使用して、コンストラクトの生成を達成することができる。ウイルスコンストラクトはまた、ウイルスの複製および伝播を可能にする遺伝子を含有してよいが、好ましい実施形態では、そのような遺伝子は、トランスに供給されるであろう。加えて、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、天然の形態または改変形態で組み込まれる任意の既知の生体のゲノムからの遺伝子または遺伝子配列を含有してよい。例えば、好ましいウイルスコンストラクトは、細菌中でのコンストラクトの複製に有用な配列を含む。

【0229】

ウイルスベースのｄｄＲＮＡｉコンストラクトの生成の後に、コンストラクトを、ウイルス粒子にパッケージングする。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、そのゲノムが、ウイルスｄｄＲＮＡｉコンストラクトのコピーを含む感染性ウイルス粒子を生産することができる。方法の１つは、ウイルスｄｄＲＮＡｉコンストラクトをウイルス粒子に組み込むために必要なウイルスタンパク質、さらには、特定のウイルス送達システムに必要か、または好ましい他の配列（例えば、複製、構造タンパク質、およびウイルスアセンブリに必要な配列）、および組織侵入のためのウイルス由来また人工リガンドのいずれかをトランスで安定発現するパッケージング細胞を利用する。ウイルスｄｄＲＮＡｉコンストラクトをパッケージング細胞に形質移入した後に、次いで、パッケージング細胞は、ウイルス配列を複製し、ウイルスタンパク質を発現し、ｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを感染性ウイルス粒子にパッケージングする。パッケージング細胞系は、これだけに限定されないが、当業者に公知であるか、または当業者により開発された２９３、ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＰｅｒＣ６、Ｄ１７、ＭＤＣＫ、ＢＨＫ、アメリカンチェリー（ｂｉｎｇ ｃｈｅｒｒｙ）、フェニックス（ｐｈｏｅｎｉｘ）、Ｃｆ２Ｔｈ、または任意の他の系統を含めた、ウイルスタンパク質を発現することができる任意の細胞系であってよい。パッケージング細胞系の１つは、例えば、米国特許第６，２１８，１８１号に記載されている。

【0230】

別法では、機能性粒子の効率的な生産を達成するために、必要なウイルスタンパク質を安定発現しない細胞系に、１つまたは複数のコンストラクトを同時形質移入することができる。そのコンストラクトの１つは、ウイルスベースのｄｄＲＮＡｉコンストラクトであり、他のコンストラクトは、細胞が機能性ウイルスを、さらには他のヘルパー機能を産生することが可能であるために必要なタンパク質をコードする核酸を含む。

【0231】

パッケージング細胞系または複製およびパッケージングコンストラクトは、エンベロープ遺伝子産物を発現しなくてもよい。これらの実施形態では、エンベロープ遺伝子をコードする遺伝子は、ウイルスベースのｄｄＲＮＡｉコンストラクトと同時形質移入される別のコンストラクト上に供給されていてよい。エンベロープタンパク質は、ウイルス粒子の宿主範囲を部分的に担っているので、ウイルスは、偽型であってよい。上記のとおり、「偽型」ウイルスは、ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有するウイルス粒子である。当業者であれば、使用されるウイルス送達システムおよびターゲティングされた細胞に適した偽型を選択することができる。

【0232】

特異的な宿主範囲をもたらすことに加えて、選択された偽型は、非常に高い力価までウイルスを濃縮することを可能にし得る。別法では、ウイルスは、感染を特異的な種に限定する環境栄養性エンベロープタンパク質で偽型になっていてよい（例えば、環境栄養性エンベロープは、例えば、マウス細胞の感染のみを可能にし、両栄養性エンベロープは、例えば、ヒト細胞およびマウス細胞の両方の感染を可能にする）。加えて、遺伝的に改変されたリガンドを、細胞特異的ターゲティングのために使用することができる。

【0233】

パッケージング細胞系における産生の後に、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含有するウイルス粒子を精製および定量（タイター）する。精製ストラテジには、密度勾配遠心分離、または好ましくは、カラムクロマトグラフィーによる方法が含まれる。

【0234】

方法
本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｓｉＲＮＡ薬のｄｄＲＮＡｉコンストラクトの投与により、網膜内の細胞中で発現される遺伝子の発現が阻害される。したがって、本発明の別の態様では、個体におけるＡＭＤを処置する方法であって、治療有効量のｄｄＲＮＡｉコンストラクトを、処置を必要とする患者に投与することを含み、その際、そのｄｄＲＮＡｉ薬が、ＡＭＤ関連遺伝子、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する方法を提供する。好ましくは、処置されるＡＭＤは、滲出型ＡＭＤである。

【0235】

患者に投与されるｄｄＲＮＡｉ薬は、以下の１つまたは複数であってよい：
・第１のエフェクター配列；および第１のエフェクター相補配列を含み；その際、そのエフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；第３のエフェクター配列；第３のエフェクター相補配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第１のエフェクター相補配列；第２のエフェクター配列；および第２のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第１のエフェクター相補配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；第３のエフェクター配列；および第３のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第２のエフェクター相補配列；および第１のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第１のエフェクター相補配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および第２のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；第１のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第２のエフェクター配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのループ配列；および第２のエフェクター相補配列を含み、その際、各エフェクター配列が、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して実質的に相補的であるｄｄＲＮＡｉ薬、
・５’から３’方向で、第１のエフェクター配列；第１のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第２のエフェクター配列；第２のエフェクター相補配列；２〜１００の非自己相補的ヌクレオチドのスペーサー配列；第３のエフェクター配列；および第３のエフェクター相補配列を含むｄｄＲＮＡｉ薬、
・ｍｉＲＮＡ構造内で、またはその一部として発現される上述のｄｄＲＮＡｉ薬のいずれか。

【0236】

当業者には理解されるように、また、図において示されているとおり、いずれの特定のエフェクター配列も、ｄｄＲＮＡｉ薬中で、その相補部と位置交換していてよい。上記の各実施形態の特定の形態では、各エフェクター配列は、配列番号４０〜７８のいずれか１つからの配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１７ヌクレオチド長である。エフェクター配列は、すべて同じか、またはすべて異なるか、または例えば、配列番号４７の少なくとも１０の連続するヌクレオチドの２つのエフェクター配列と、（例えば）配列番号５６の少なくとも１０の連続するヌクレオチドの１つのエフェクター配列との組み合わせであってよい。

【0237】

好ましくは、エフェクター配列は、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの任意の連続する１１、１２、１３、１４、１５、または１６のヌクレオチド、最も好ましくは、配列番号４０〜７８のいずれか１つのうちの１７以上の連続するヌクレオチドからなる群から選択される。典型的には、エフェクター相補部は、対応するエフェクター配列と同じ長さ、またはほぼ同じ長さ（すなわち、±１５％ヌクレオチド長さ、または全体長さに応じて１〜３つのヌクレオチドだけ異なる）である。

【0238】

本明細書の先行するセクションにおいて記載したとおり、これらのｄｄＲＮＡｉ薬はそれぞれ、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト中のｄｄＲＮＡｉ発現カセットにより投与することができる。好ましくは、ｄｄＲＮＡｉコンストラクトは、そのコンストラクトが、眼の背部にあるＲＰＥ細胞をターゲティングすることができるように、ＡＡＶベースのコンストラクトである。それぞれ単一のｄｄＲＮＡｉ薬を発現することができる２つ以上のｄｄＲＮＡｉ発現カセットまたはコンストラクトを送達することにより、または別法では、かつ最も好ましくは、１つより多いｄｄＲＮＡｉ薬を発現することができる１つのｄｄＲＮＡｉ発現カセットまたはコンストラクトを送達することにより、多重ターゲティングを達成することができる。

【0239】

代替実施形態では、エフェクター配列はそれぞれ、１つまたは複数のターゲット配列の転写産物中の１つまたは複数のターゲット領域に対して１００％相補的であってよいか、または１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なってよい。

【0240】

ＡＭＤを処置する方法は、場合により、ＡＭＤの症状を有し、処置を必要とする個体を同定する先行ステップを含んでよい。その同定ステップは、対象を、滲出型ＡＭＤまたは乾燥型ＡＭＤを有すると鑑別診断することを含んでよい。

【0241】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬をより長期的に、または安定的に提供するために、このｄｄＲＮＡｉ薬を、本発明のｄｄＲＮＡｉコンストラクトにより、すなわち、細胞に送達される適切なベクターに挿入されたｄｄＲＮＡｉ発現カセットからのｄｄＲＮＡｉ薬のｉｎ ｖｉｖｏでの発現により提供する。このｄｄＲＮＡｉ発現カセットは、
１つまたは複数のプロモーター配列、
配列番号４０〜７８からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドをコードする配列からなる群から選択される１つまたは複数のＤＮＡ配列；
１つまたは複数のエフェクター相補配列をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列；
および場合により、
１つまたは複数のターミネーター配列、
ループ配列、スペーサー配列、またはその両方をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列、
１つまたは複数のエンハンサー配列
を含む。

【0242】

本明細書において既に概説したとおり、ｄｄＲＮＡｉ発現カセットのこれらの構成要素は、異なる５’から３’への配置を有してよく、それらはすべて、本発明の方法において使用するために適している。この発現カセットはまた、好ましくは、ｍｉＲＮＡ構造を形成することができる配列をコードするＤＮＡ配列を含む。

【0243】

好ましくは、本発明の方法におけるターゲットＡＭＤ関連遺伝子はＶＥＧＦ−Ａである。したがって、本発明の一実施形態では、ｄｄＲＮＡｉ薬は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する。第１のエフェクター配列をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、表１において列挙されている配列番号４０〜４９からの配列内の任意の１０以上の連続するヌクレオチドのｄｄＲＮＡｉエフェクターコード配列から選択される。別法では、すでに詳述したとおり、ターゲット配列と塩基対形成してＶＥＧＦ−Ａターゲット配列の発現を阻害するようにコードされた配列の能力に影響しなければ、エフェクター配列をコードする配列は、配列番号４０〜４９とは、１、２、３、４、または５つのヌクレオチドだけ異なっていてよい。

【0244】

典型的には、各エフェクター配列は、対応するエフェクター相補配列と共に二本鎖領域を形成する。

【0245】

一代替実施形態では、本発明の方法におけるターゲットＡＭＤ関連遺伝子は、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの１つまたは複数である。

【0246】

一代替実施形態では、個体におけるＡＭＤを処置する方法は、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するために、配列番号４０〜７８として上記で列挙したものなどの１つより多いエフェクター配列を有するｄｄＲＮＡｉ薬をコードするｄｄＲＮＡｉコンストラクトを治療有効量で投与することを含む。

【0247】

本発明の処置方法のいずれにおいても、患者は、投与されるｄｄＲＮＡｉコンストラクトが補助的治療となるような他の処置を受けることもできる。

【0248】

ＡＭＤおよび特に滲出型ＡＭＤは、多くの場合に脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と称されるプロセスにおいて、網膜の後ろに位置する血管系からの血管の異常な増殖により特徴づけられる。したがって、ＣＮＶを制御することは、滲出型ＡＭＤに罹患している患者に対してプラスの効果を有する。したがって、本発明の別の態様は、個体における脈絡膜血管新生を処置する方法であって、処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、発現カセット、またはコンストラクトを投与することを含み、その際、そのｄｄＲＮＡｉ薬が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの１つまたは複数中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する方法である。これらの遺伝子はそれぞれ、血管形成、血管新生、またはＶＥＧＦ経路におけるそれらの役割により、目的のターゲットである。

【0249】

ＡＭＤの病因における別の重要な因子は、ドルーゼンと称される眼の基底での細胞外沈着物の形成である。これらの沈着物は、黄斑のゆがみの一因となり、また、血管新生において役割を果たし得る。ＣＦＢは、ドルーゼンの構成要素である。したがって、そのタンパク質産生物の発現を阻害するためにＣＦＢ遺伝子をターゲティングすることは、沈着するドルーゼンの量を低減させ、したがって、ＡＭＤに罹患している患者に対してプラスの効果を有する。したがって、個体におけるドルーゼン沈着物を低減する方法であって、処置を必要とする患者に、治療有効量の本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、発現カセット、またはコンストラクトを投与することを含み、その際、そのｄｄＲＮＡｉ薬が、ＣＦＢ中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害する方法を提供する。

【0250】

したがって、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＦＢ、およびＰＤＧＦＲ−βの組み合わせをターゲティングすることにより、ドルーゼンの沈着を阻害しようと努めながら、血管形成、したがって、ＣＮＶを最小限にしようと努めることは、当技術分野で以前には企図されたことのないＡＭＤ、特に、滲出型ＡＭＤのための多面的な攻撃戦略をもたらし、ＡＭＤの進行を停止させるだけでなく、視力を回復させようと努めることである。

【0251】

一部の場合には、組み込まれているか、または安定的に維持されているｄｄＲＮＡｉコンストラクトからのｄｄＲＮＡｉ薬の長期の発現とは対照的に、ｄｄＲＮＡｉ薬またはｓｉＲＮＡ薬の一時的な存在に依存することが好ましいことがある。例えば、処置に対する患者の忍容性を初めに決定すべき場合である。この例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された本発明のｄｄＲＮＡｉ薬またはｓｉＲＮＡ薬を投与することができる。

【0252】

本発明のさらなる一態様では、ＡＭＤを処置するか、ＣＮＶを処置するか、ドルーゼンの沈着を最小限にするか、またはＡＭＤの症状を緩和するために、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための活性成分としてｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ｄｄＲＮＡｉ薬、またはｓｉＲＮＡ薬を含む組成物を提供する。

【0253】

本発明のさらなる一態様では、ＡＭＤを処置するか、ＣＮＶを処置するか、ドルーゼンの沈着を最小限にするか、またはＡＭＤの症状を緩和するために、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するためのｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ｄｄＲＮＡｉ薬、またはｓｉＲＮＡ薬の使用を提供する。同様に、ＡＭＤを処置するか、ＣＮＶを処置するか、ドルーゼンの沈着を最小限にするか、またはＡＭＤの症状を緩和するために、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための医薬品の調製におけるｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ｄｄＲＮＡｉ薬、またはｓｉＲＮＡ薬の使用を提供する。

【0254】

好ましくは、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである。

【0255】

本発明の方法で使用されるｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ｄｄＲＮＡｉ薬、またはｓｉＲＮＡ薬の１つまたは複数のエフェクター配列は、ＡＭＤ関連ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害することができる配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、１つまたは複数のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0256】

本発明の方法ではそれぞれ、本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを、好ましくは、硝子体内注射により対象の眼に送達するが、網膜下注射も利用することができる。

【0257】

医薬組成物
本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｓｉＲＮＡ薬、またはｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることにより、医薬組成物に製剤化することができる。したがって、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、ｄｄＲＮＡｉコンストラクト、またはｓｉＲＮＡ薬と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0258】

別の実施形態では、本発明は、ＡＭＤ関連遺伝子中の１つまたは複数のターゲット配列の発現を阻害、防止、または低減するための主な成分として、有効量の本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｄｄＲＮＡｉ発現カセット、またはｄｄＲＮＡｉ発現コンストラクトを、場合により、薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含むＡＭＤ処置用組成物を提供する。

【0259】

医薬剤形で、本薬剤またはｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターを単独で、または他の薬学的に活性な化合物と組み合わせて投与することができる。薬剤またはｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターの用量レベルは、送達ビヒクルの性質、ターゲット細胞の形質導入の相対的な容易さ、ターゲット細胞におけるＲＮＡｉ薬の発現レベルなどに応じて、変化するはずであることは、当業者であれば容易に分かるであろう。

【0260】

本発明のｄｄＲＮＡｉ薬、ｓｉＲＮＡ薬、またはｄｄＲＮＡｉ発現カセットを含むベクターは、それらをオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステルなどの水性または非水性溶媒中に、所望の場合には、溶解補助剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および防腐剤などの従来の添加剤と共に溶解、懸濁、または乳化させることにより、注射または投与用の製剤に製剤化することができる。

【0261】

対象の眼への本発明の医薬組成物の最も好ましい投与様式は、硝子体内注射によるものである。代替投与方法は、網膜下注射である。

【0262】

本発明により企図される薬学的に許容される担体または希釈剤には、使用される投薬量および濃度で受容者に対して毒性ではない任意の希釈剤、担体、賦形剤、安定剤が含まれ、また、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血漿アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0263】

一般に、製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉の固体担体またはその両方と均一かつ十分に混合し、必要な場合には、生成物を成形することにより調製される。製剤化は、周囲温度、適切なｐＨ、所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち、使用される投薬量および濃度で受容者に非毒性である担体と混合することにより行うことができる。

【0264】

本発明の組成物で使用されるｄｄＲＮＡｉコンストラクト、ｄｄＲＮＡｉ薬、またはｓｉＲＮＡ薬の１つまたは複数のエフェクター配列は、ＡＭＤ関連ターゲット遺伝子領域の発現を少なくとも７０％阻害することができる配列内の任意の１０以上、好ましくは、任意の１７以上の連続するヌクレオチドを含む。好ましくは、その１つまたは複数のエフェクター配列は、配列番号４０〜７８、より好ましくは、配列番号４０〜５９、最も好ましくは、配列番号４０〜４９から選択される。

【0265】

別の実施形態では、上記のとおりのＲＮＡｉ薬または医薬組成物を含むキットまたは製品を提供する。

【0266】

他の実施形態では、上述の治療用途において使用するためのキットであって、
- ＲＮＡｉ薬または医薬組成物を保持する容器；
- 取扱説明を記載したラベルまたは添付文書
を含むキットを提供する。

【0267】

ある種の実施形態では、本キットは、ＡＭＤを処置するためか、または上記のとおりのＡＭＤ関連状態を処置するための１つまたは複数のさらなる活性成分を含有してよい。

【0268】

キットまたは「製品」は、容器と、容器上か、または容器に随伴するラベルまたは添付文書を含んでよい。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器は、状態を処置するために有効なＲＮＡｉ薬または医薬組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下用注射針で穿刺可能なストッパーを備えた静脈内輸液バッグまたはバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、このＲＮＡｉ薬または医薬組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。一実施形態では、ラベルまたは添付文書は、取扱説明を含み、このＲＮＡｉ薬または医薬組成物がＡＭＤを処置するためか、または上記のとおりのＡＭＤ関連状態を処置するために使用することができることを示す。

【0269】

キットは、（ａ）ＲＮＡｉ薬または医薬組成物；および（ｂ）第２の活性成分を含有する第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施形態でのキットは、このＲＮＡｉ薬または医薬組成物および他の活性成分を、ＡＭＤを処置するためか、または上記のとおりのＡＭＤ関連状態を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含んでよい。別法では、または加えて、キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、およびデキストロース液などの薬学的に許容される緩衝剤を含む第２（または第３）の容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含めた商業上および使用者の立場から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。

【0270】

ある種の実施形態では、ＲＮＡｉ薬または医薬組成物を、ＲＮＡｉ薬または医薬組成物を保持するための容器を含めた使い捨てまたは再利用可能なデバイスの形態で提供することができる。一実施形態では、デバイスは、シリンジ、好ましくは、硝子体内注射または網膜下注射に適したシリンジである。デバイスは、ＲＮＡｉ薬または医薬組成物１〜２ｍＬを保持し得る。ＲＮＡｉ薬または医薬組成物を、すぐに使用することができる状態で、またはさらなる成分を混合または添加することを必要とする状態でデバイス中に提供することができる。

【0271】

以下では、本発明を次の非限定的実施例を参照しつつ説明する。

【0272】

実施例
１． ＶＥＧＦ−Ａをサイレンシングするためのコンストラクトの設計および調製
ヒトと前臨床試験種であるマウスおよびマカクとの間で良好に保存されているＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡ中のＲＮＡｉターゲット配列を認識するように、ＶＥＧＦ−ＡをターゲティングするｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを設計した。表２において列挙したエフェクター配列を発現するために、１０のｄｄＲＮＡｉコンストラクト（ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２、ｍｉＲ−３、ｍｉＲ−４、ｍｉＲ−５、ｍｉＲ−６、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−８、ｍｉＲ−９、およびｍｉＲ−１０）を作出した。オリゴヌクレオチドを合成し（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を作製するためにアセンブルし、これを、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６ ｈｙｇｒｏのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位にクローニングした。これらのコンストラクトは、ｓｈＲＮＡの発現を駆動するために、ヒトＵ６プロモーターを使用した。そのようなコンストラクトの１つについてのベクターおよびインサートのマップが、図２Ａおよび２Ｂに示されている。ｍｉＲ−８でのインサートの配列および発現されるｓｈＲＮＡの予測二次構造が、図２Ｃおよび２Ｄに示されている。ｍｉＲ−１〜１０を調製するために使用されるＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片の配列は、配列番号９１〜１００として列挙する。

【0273】

２． ＶＥＧＦ−Ａをターゲティングするコンストラクトの活性および鎖特異性
二重ルシフェラーゼアッセイを使用して、ｍｉＲコンストラクトの活性を決定した。ホタルルシフェラーゼは、約４時間の比較的短い半減期を有するので、ホタルルシフェラーゼ活性の測定は、ＲＮＡｉ阻害活性を評価するための代理マーカーをもたらす。これらの実験のために、ＶＥＧＦ−Ａ ｃＤＮＡの領域を含有するセンサーコンストラクトを、ホタルルシフェラーゼ発現コンストラクトｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）の３’ＵＴＲにクローニングした。ＸｂａＩおよびＦｓｅＩ制限部位が隣接する断片を調製するために、当技術分野で周知の方法を使用して、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ａ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｏｍｐａｎｙ）から得られるＶＥＧＦ−Ａ ｃＤＮＡクローンの領域をＰＣＲにより増幅し；次いで、これらの増幅された断片を、ｐＧＬ３の３’ＵＴＲ中のＸｂａＩ／ＦｓｅＩ部位にクローニングした。ＶＥＧＦ−Ａの５つの別々の領域をこうして増幅して、表３に示されているとおりのアッセイｍｉＲ１〜１０を評価するために使用することができるレポーターコンストラクトを調製した。これらの５つの領域（Ａ〜Ｅ、表３）を、両方の配向でクローニングし、それにより、ＲＩＳＣ負荷の鎖優先性（ｓｔｒａｎｄ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を決定することができるようにした。「センス」レポーターコンストラクトは、パッセンジャー鎖の活性をアッセイし、「アンチセンス」と称されるレポーターは、エフェクター鎖の活性をアッセイした。強いエフェクター活性および弱いパッセンジャー活性を有するｄｄＲＮＡｉコンストラクトが、治療用途には非常に好ましい。それというのも、上記で検討したとおり、これらは、より少ないオフターゲット効果をもたらす可能性があるためである。

【0274】

ＶＥＧＦ−ＡをターゲッティングするｍｉＲコンストラクトのそれぞれの活性および鎖優先性をアッセイするために、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って、二重ルシフェラーゼアッセイを行った。簡単には、製造元（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅを使用して、特異的ｄｄＲＮＡｉコンストラクトを、適切なＶＥＧＦ−Ａセンサーおよびウミシイタケルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＲＬ：Ｐｒｏｍｅｇａ）（後者は、ウェル間の形質移入効率を正規化し得る）と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時形質移入した。細胞を、４８時間にわたって培養し、Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｅｒｉｔａｓルミノメーターを使用する製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）のプロトコルに従って、二重ルシフェラーゼアッセイを行った。

【0275】

代表的な実験の結果が、図４Ａに示されている。これらのデータは、１０のｄｄＲＮＡｉコンストラクトのすべてが、アンチセンスターゲットの有意なサイレンシングを示すが、異なるｄｄＲＮＡｉコンストラクト間でのパッセンジャー鎖のＲＩＳＣ負荷における顕著な相違を反映して、センスターゲットに対する活性においては有意に異ったことを示した。これらのデータに基づき、ｍｉＲ−２、５、および８を、さらに分析するために選択した。

【0276】

天然のＶＥＧＦ−Ａに対するこれらのコンストラクトの活性を確認するために、造元（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質を発現する発現プラスミドをｍｉＲ−２、５、および８のための発現コンストラクトと共に同時形質移入した。４８時間後に、改変Ｔｒｉｚｏｌプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを単離した。製造元（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のプロトコルに従ってＲＴ ＱＰＣＲ Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄを使用して、ＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのデータ（図４Ｂ）は、ＶＥＧＦ−Ａ ｓｈＭｉＲ２、５、および８は、形質移入細胞において、定常状態のＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡレベルを有意に低下させることを示している。

【0277】

内在発現されるＶＥＧＦ−Ａに対するｓｈＭｉＲ−８の活性をさらに確認するために、ＡＲＰＥ−１９と名付けられている自発的に生じる網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞系に、ｍｉＲ−８を発現するアデノウイルスコンストラクト（ＭＯＩ＝２００）を形質導入した。２４、４８、７２、および９６時間目に、ＲＮＡおよびタンパク質を細胞から単離した。上記のとおりＲＴＱＰＣＲを使用して、ＶＥＧＦ−Ａ ｍＲＮＡレベルを決定した。製造元（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のプロトコルに従ってＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて行われるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、タンパク質レベルを決定した。これらのデータ（図４Ｃ）は、ｍｉＲ−８が、タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方において、ＶＥＧＦ−Ａ発現を強力にサイレンシングし、その際、ノックダウンのレベルは経時的に上昇したことを示した。

【0278】

ｍｉＲ−８からのｓｈＲＮＡ発現のレベルを定量化するために、カスタムＲＴ−ＱＰＣＲアッセイを開発した。ｍｉＲ−８の発現ｓｈＲＮＡからプロセシングされたエフェクターＲＮＡのレベルを定量化するために、合成ＲＮＡ標準（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびフォワードＤＮＡプライマー（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、このアッセイを開発した。合成ＲＮＡ標準およびＤＮＡプライマーの配列は、以下である：
合成ＲＮＡ標準：ＵＧＧＧＵＵＡＵＧＵＧＧＧＵＧＧＧＵＧＵＧＵＣＵＡＣＣＧＣＣＵ（配列番号１３０）
フォワードプライマー（ＤＮＡ）：ＴＡＴＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＣＴＡＣ（配列番号１３１）
リバースプライマー（ＤＮＡ）：キットからのｍｉＳｃｒｉｐｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー（Ｑｉａｇｅｎ）。

【0279】

製造元（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従ってｍｉＳＣＲＩＰＴ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、ＲＮＡを逆転写した。このキットの構成要素は、ＲＮＡをポリアデニル化し、逆転写酵素、およびｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用する固定されたオリゴｄＴプライマーの作用により、ｃＤＮＡコピーを合成する。当業者に周知のプロトコルを使用して、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＱＲＴ ＰＣＲアッセイを使用して、ｃＤＮＡを増幅し、定量化した。標準曲線を用意するために、既知の量の合成ＲＮＡ標準を逆転写し、ＱＰＣＲ増幅した。ＲＮＡを上述のＡＲＰＥ−１９細胞から単離し、このアッセイを使用して、発現されたｓｈＲＮＡのレベルを定量化した。図４Ｂは、ｍｉＲ−８から発現されプロセシングされたｓｈＲＮＡのレベルが経時的に上昇し、タンパク質およびＲＮＡレベルにおいてＶＥＧＦ−Ａノックダウンのレベルと相関したことを示している。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ-８がＶＥＧＦ−Ａを強力にサイレンシングしたことを示した。ＶＥＧＦ−Ａターゲット配列ならびにｍｉＲ−２、５、および８のエフェクター配列は、ヒトと、前臨床試験種であるマウスおよびマカクとの間でヌクレオチド配列の完全保存を示すことに注意されたい。

【0280】

３． ＶＥＧＦＲ２をサイレンシングするためのコンストラクトの設計および調製
上記の基準を使用して、ヒトと前臨床試験種であるマウスおよびマカクとの間で保存されているＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡ中のターゲット配列を認識するように、ＶＥＧＦＲ２をターゲティングするｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを設計した。多くの場合に、ヒト、マウス、およびサル種の間で完全に保存されている配列を見出すことは困難であった。１０のｄｄＲＮＡｉコンストラクト（ｍｉＲ−Ｖ−１、ｍｉＲ−Ｖ−２、ｍｉＲ−Ｖ−３、ｍｉＲ−Ｖ−４、ｍｉＲ−Ｖ−５、ｍｉＲ−Ｖ−６、ｍｉＲ−Ｖ−７、ｍｉＲ−Ｖ−８、ｍｉＲ−Ｖ−９、およびｍｉＲ−Ｖ−１０）がコンストラクトされた。これらを調製するために使用されたＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列は、表２においてまとめられているとおりの配列番号１０１〜１１０として列挙される。実施例１において記載したとおりに、インサートをｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１−Ｕ６ ｈｙｇｒｏにクローニングした。

【0281】

４． ＶＥＧＦＲ２をターゲティングするコンストラクトの活性および鎖特異性
実施例２に記載のプロトコルおよび表３に列挙されているレポーターコンストラクトを使用して、二重ルシフェラーゼアッセイを上記のとおりに行って、ｍｉＲ−Ｖ−１からｍｉＲ−Ｖ−１０の活性および鎖優先性を決定した。
表３：ｍｉＲコンストラクトの活性および鎖特異性をアッセイするために使用したレポーターコンストラクト

【表3】

^ａｍｉＲコンストラクトの活性および鎖特異性をアッセイするための二重ルシフェラーゼアッセイにおいて使用される特定のｌｕｃ融合コンストラクトを記載するコード。
^ｂｌｕｃ融合コンストラクトに含まれる配列。
^ｃ個々のレポーターでアッセイされたｍｉＲコンストラクト。

【0282】

これらの実験の結果は図５Ａに示されている。これらのデータは、１０のコンストラクトのすべてが、アンチセンスレポーターコンストラクトの有意なサイレンシングを達成し得たが、異なるｄｄＲＮＡｉコンストラクト間でのパッセンジャー鎖のＲＩＳＣ負荷における顕著な相違およびオフターゲット作用についてその結果生じる当然の性向を反映して、センスレポーターコンストラクトに対する活性においては有意に異ったことを示した。これらのデータに基づき、ｍｉＲ−Ｖ−２、−３、−７、および−１０を、さらに分析するために選択した。

【0283】

天然のＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡに対するこれらのコンストラクトの活性を確認するために、製造元（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従ってＦｕｇｅｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＶＥＧＦＲ２ ｍｉＲ−Ｖ−２、３、７、および１０を発現するプラスミド、ならびにＶＥＧＦＲ２のための全長ｃＤＮＡを発現する発現プラスミドを同時形質移入した。７２時間後に、ＲＮＡを、上記のとおりに単離した。製造元のプロトコルに従ってＲＴ ＱＰＣＲ 「Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ」を使用して、ＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのデータ（図５Ｂ）は、ｍｉＲ−Ｖ−２、３、７、および１０が、対照と比較して、定常状態のＶＥＧＦＲ２ ｍＲＮＡレベルを有意に低下させたことを示した。図５Ｃは、ｍｉＲ−Ｖ−２、３、７、および１０は、ウェスタンブロット分析により評価すると、形質移入された細胞の平行ウェルにおいて、ＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルも著しく低下させたことを示している。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ−Ｖ−２、３、７、および１０は、ＶＥＧＦＲ−２を強力にサイレンシングしたことを示した。

【0284】

５． ＰＤＧＦＲ−βをサイレンシングするためのコンストラクトの設計および調製
ヒトと、前臨床試験種であるマウスおよびマカクとの間で良好に保存されたＰＤＧＦＲ−Ｂ ｍＲＮＡ中のターゲット配列を認識するように、上記の基準を使用して、ＰＤＧＦＲ−ＢをターゲティングするｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを設計した。多くの場合に、ヒト配列と、マウスおよびサルモデルの両方における対応する配列との間には、単一のヌクレオチドミスマッチが存在する。１０のｄｄＲＮＡｉコンストラクト（ｍｉＲ−Ｐ−１、ｍｉＲ−Ｐ−２、ｍｉＲ−Ｐ−３、ｍｉＲ−Ｐ−４、ｍｉＲ−Ｐ−５、ｍｉＲ−Ｐ−６、ｍｉＲ−Ｐ−７、ｍｉＲ−Ｐ−８、ｍｉＲ−Ｐ−９、およびｍｉＲ−Ｐ−１０）を作製した。これらを調製するために使用したＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列は、表２にまとめられているとおりの配列番号１１１〜１２０として列挙されている。実施例１において記載したとおりに、インサートを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１−Ｕ６ ｈｙｇｒｏにクローニングした。

【0285】

６． ＰＤＧＦＲ−βをターゲティングするコンストラクトの活性および鎖特異性
実施例２において記載したプロトコルを表３に列挙されているレポーターコンストラクトと共に使用して、二重ルシフェラーゼアッセイを上記のとおりに行い、ｍｉＲ−Ｐ−１からｍｉＲ−１０の活性および鎖優先性を決定するために使用した。これらのデータは、１０のコンストラクトのすべてが、アンチセンスレポーターコンストラクトの有意なサイレンシングを示したことを示した。これらのデータに基づき、ｍｉＲ−Ｐ−４およびｍｉＲ−Ｐ−９を、その後の分析のために選択した。

【0286】

天然のＰＤＧＦＲ−β ｍＲＮＡに対するこれらのコンストラクトの活性を確認するために、製造元（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＰＤＧＦＲ−β ｍｉＲ−Ｐ−４またはｍｉＲ−Ｐ−９のいずれかを発現するプラスミドおよびＰＤＧＦＲ−βの全長ｃＤＮＡを発現するプラスミドを同時形質移入した。４８時間後に、上記のとおりに、ＲＮＡを単離した。製造元のプロトコルに従ってＲＴ ＱＰＣＲ「Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ」を使用して、ＰＤＧＦＲ−β ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのデータ（図６Ａ）は、ｍｉＲ−Ｐ−４およびｍｉＲ−Ｐ−９が、対照に対して、定常状態ののｍｉＲ−Ｐ−４およびｍｉＲ−Ｐ−９レベルを有意に低下させたことを示した。図６Ｂは、ｍｉＲ−Ｐ−４およびｍｉＲ−Ｐ−９は、対照と比較して、細胞の平行形質移入ウェルにおいてＰＤＧＦＲ−βタンパク質レベルも著しく低下させたことを示す。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ−Ｐ−４およびｍｉＲ−Ｐ−９がＰＤＧＦＲ−βを強力にサイレンシングしたことを示した。

【0287】

７． ＣＦＢをサイレンシングするためのコンストラクトの設計および調製
ヒトと、前臨床試験種であるマウスおよびマカクとの間で保存されたＣＦＢ ｍＲＮＡ中のターゲット配列を認識するように、上記の基準を使用して、ＣＦＢをターゲティングするｓｈＲＮＡを発現するｄｄＲＮＡｉコンストラクトを設計した。多くの場合に、ヒト配列と、マウスおよびサルモデルの両方における対応する配列との間には、単一のヌクレオチドミスマッチまたは複数のミスマッチが存在する。９つのｄｄＲＮＡｉコンストラクト（ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−２、ｍｉＲ−Ｃ−３、ｍｉＲ−Ｃ−４、ｍｉＲ−Ｃ−５、ｍｉＲ−Ｃ−６、ｍｉＲ−Ｃ−７、ｍｉＲ−Ｃ−８、およびｍｉＲ−Ｃ−９）を作製した。これらを調製するために使用したＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列は、表２にまとめられているとおりの配列番号１２１〜１２９として列挙されている。実施例１において記載したとおり、インサートを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１−Ｕ６ ｈｙｇｒｏにクローニングした。

【0288】

８． ＣＦＢをターゲティングするコンストラクトの活性および鎖特異性
実施例２において記載したプロトコルを表３に列挙されているレポーターコンストラクトと共に使用して、二重ルシフェラーゼアッセイを、ｍｉＲ−Ｃ−１〜９の活性および鎖優先性を決定するために上記のとおりに使用した。これらの実験の結果は、図７Ａにおいて示されている。これらのデータは、コンストラクトの多くが、アンチセンスレポーターコンストラクトの有意なサイレンシングを示したが、異なるｄｄＲＮＡｉコンストラクト間でのパッセンジャー鎖のＲＩＳＣ負荷における顕著な相違およびオフターゲット作用の当然の可能性を反映して、センスレポーターコンストラクトに対する活性においては有意に異ったことを示した。これらのデータに基づき、ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、およびｍｉＲ−Ｃ−９を、その後の分析のために選択した。

【0289】

天然のＣＦＢ ｍＲＮＡに対するこれらのコンストラクトの活性を確認するために、上述の方法を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、またはｍｉＲ−Ｃ−９のいずれかを発現するプラスミドおよびＣＦＢの全長ｃＤＮＡを発現するプラスミドを同時形質移入した。４８時間後に、ＲＮＡを収集し、ＲＴ ＱＰＣＲ「Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ」を使用して、ＣＦＢ ｍＲＮＡレベルを決定した。これらのデータ（図７Ｂ）は、ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、およびｍｉＲ−Ｃ−９が、対照処理された細胞に比較すると、定常状態ののＣＦＢ ｍＲＮＡレベルを有意に低下させたことを示した。図７Ｃは、ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、またはｍｉＲ−Ｃ−９が、対照と比較すると、平行形質移入細胞においてＣＦＢタンパク質レベルも著しく低下させたことを示した。ウェスタンブロット分析により決定されたとおりであった。まとめると、これらのデータは、ｍｉＲ−Ｃ−１、ｍｉＲ−Ｃ−８、およびｍｉＲ−Ｃ−９が、ＣＦＢを強力にサイレンシングしたことを示した。

【0290】

９． ＶＥＧＦ−Ａをターゲティングするコンストラクト
ＶＥＧＦ−Ａをターゲティングする治療用のｍｉＲ−ベースのｓｈＲＮＡを発現するように設計されたコンストラクトを調製した。これらは、すべての細胞においてｓｈＲＮＡを発現するであろうＵ６プロモーターか、または適切な細胞において治療用のｓｈＲＮＡを発現するであろう４つの組織特異的プロモーターのうちの１つを使用した。４つの組織特異的プロモーターは、ヒトＶＤＭ２プロモーター、ヒトＩＣＡＭ２プロモーター、ヒトＲＰＥ６５プロモーター、およびヒトＦＬＴプロモーターであった。

【0291】

図２Ｃに記載のｍｉＲ−７配列に融合したプロモーター配列からなるＤＮＡ断片を合成した（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｒｏｎ）。これらの断片は、ＡＡＶベクターへのクローニングを可能にするために、隣接する制限部位を含有した；ｐｏｌ ＩＩプロモーターを使用するコンストラクトのために、ＡＡＶベクターは、適切な転写停止を保証するために、最小限のポリアデニル化部位を含有した。これらの断片のマップが、図９に示されており、配列番号１３２〜配列番号１３６として列挙されている。

【0292】

１０． ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングするコンストラクト
ＶＥＧＦＦ−ＡおよびＶＥＧＦＲ２をターゲティングする治療用のｍｉＲ−ベースのｓｈＲＮＡを発現するように設計されたコンストラクトを調製した。これらは、すべての細胞においてｓｈＲＮＡを発現するであろうＵ６プロモーターか、または実施例９における４つの組織特異的プロモーターのうちの１つを使用した。

【0293】

ｍｉＲ−７−ｍｉＲ−Ｖ−７に融合したプロモーター配列からなり、実施例９に記載されているとおり、ＡＡＶベクターへのクローニングを可能にするために、隣接する制限部位を含有するＤＮＡ断片を合成した（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｒｏｎ）。これらの断片のマップが、図１０に示されており、配列番号１３７〜配列番号１４１として列挙されている。

【0294】

１１． ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−β、およびＣＦＢをターゲティングするコンストラクト
ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−β、およびＣＦＢをターゲティングする治療用のｍｉＲ−ベースのｓｈＲＮＡを発現するように設計されたコンストラクトを調製した。これらは、すべての細胞においてｓｈＲＮＡを発現するであろうＵ６プロモーターか、または実施例９における４つの組織特異的プロモーターのうちの１つを使用した。単一のベクターに組み込まれた一連の制限酵素を使用して、単一のコンストラクトｍｉＲ−Ｖ−７、ｍｉＲ−Ｃ−８、およびｍｉＲ−Ｐ−９配列からのヘアピンをそれぞれ、単一のベクターに（同じ順序で）サブクローニングした。その結果生じた発現コンストラクトはまた、実施例９において記載したとおり、ＡＡＶベクターへのクローニングを可能にするために、隣接する制限部位を含有した。これらのコンストラクトを発現するために使用された実際のプロモーターには、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎにおいて独立に合成されるヒトＵ６プロモーター、ＦＬＴプロモーター、およびＩＣＡＭ２プロモーターが含まれた。産生されたコンストラクトはそれぞれ、使用前に確認された配列であった。これらの断片のマップが、図１１に示されており、配列番号１４２から配列番号１４６として列挙されている。

【0295】

参考文献
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ＷＯ１９９９／４９０２０、
ＷＯ２００３／０２２０５２。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【図11-7】

【図11-8】

【図11-9】

【図11-10】

【図11-11】

【図11-12】

【図11-13】

【図11-14】

【図11-15】

【図11-16】

【図11-17】

【図11-18】

【図11-19】

【図11-20】

【図11-21】

【図11-22】

【図11-23】

【図11-24】

【図11-25】

【図11-26】

【図11-27】

【図11-28】

【図11-29】

【図11-30】

【図11-31】

【図11-32】

【図11-33】

【図11-34】

【図11-35】

【図11-36】

【図11-37】

【図11-38】

【図11-39】

【図11-40】

【図11-41】

【図11-42】

【図11-43】

【図11-44】

【図11-45】

【図11-46】

【図11-47】

【図11-48】

【図11-49】

【図11-50】

【図11-51】

【図11-52】

【図11-53】

【図11-54】

【図11-55】

【配列表】

2016507514000001.app

【国際調査報告】