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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2016-517021(P2016-517021A)
(43)【公表日】2016年6月9日
(54)【発明の名称】遊離銅を決定するための方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/52 20060101AFI20160513BHJP
G01N 33/58 20060101ALI20160513BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20160513BHJP
【ＦＩ】
G01N33/52 C
G01N33/58 Z
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】30
(21)【出願番号】特願2016-511154(P2016-511154)
(86)(22)【出願日】2014年4月29日
(85)【翻訳文提出日】2015年12月8日
(86)【国際出願番号】IB2014061079
(87)【国際公開番号】WO2014181215
(87)【国際公開日】20141113
(31)【優先権主張番号】RM2013A000253
(32)【優先日】2013年4月29日
(33)【優先権主張国】IT
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US
(71)【出願人】
【識別番号】515120095
【氏名又は名称】カノークス４ドラッグ ソシエタ ペル アチオニ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】コラブフォ、ニコラ、アントーニオ
(72)【発明者】
【氏名】ベラルディ、フランチェスコ
(72)【発明者】
【氏名】レオポルド、マルチェッロ
(72)【発明者】
【氏名】ペッローネ、ロベルト
(72)【発明者】
【氏名】スキッティ、ロザンナ
【テーマコード（参考）】
2G043
2G045
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA01
2G043CA03
2G043DA01
2G043EA01
2G045AA13
2G045AA25
2G045BA13
2G045BB03
2G045BB11
2G045DA36
2G045DA38
2G045DB13
2G045FA11
2G045FB06
2G045FB09
2G045FB12
2G045GC15
(57)【要約】
本発明は、血清中の『遊離』銅の濃度、すなわち構造的にセルロプラスミンに結合しない血清銅の部分を決定するための新しい方法に関する。本発明は、アルツハイマー病患者の血清試料における、遊離銅を決定するための、感度及び精度が高い方法にも言及する。【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清試料において遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ）結合画分及び遊離銅を含む溶出画分を得る、固相抽出用の樹脂上に前記血清試料をロードするステップと、
ｂ）クマリン蛍光プローブを用いてステップａ）で溶出した画分中の遊離銅の濃度を決定するステップと
を含む上記方法。
ａ）結合画分及び遊離銅を含む溶出画分を得る、固相抽出用の樹脂上に前記血清試料をロードするステップと、
ｂ）クマリン蛍光プローブを用いてステップａ）で溶出した画分中の遊離銅の濃度を決定するステップと
を含む上記方法。
【請求項2】
前記樹脂がポリオレフィンである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記樹脂が超高分子量ポリエチレンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ロードするステップａ）において、移動相として生理溶液が使用される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記クマリン蛍光プローブが０．１から１０μＭの間の濃度範囲で使用される、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記クマリン蛍光プローブがＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯの溶液中で使用される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ステップｂ）が校正曲線の作成のステップを含む、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ステップｂ）における遊離銅の濃度の決定が、４３０ｎｍの励起波長（λｅｘ）及び４９０ｎｍの吸収波長（λｅｍ）で前記クマリンプローブの蛍光を読むことによって得られる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記クマリン蛍光プローブが以下の一般的な構造式：
（式中、
Ｒ１は、ｎが０から５までのＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである）
を有する化合物から選択される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【化1】
（式中、
Ｒ１は、ｎが０から５までのＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである）
を有する化合物から選択される、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記クマリン蛍光プローブが以下の一般的な構造式：
を有する化合物から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【化2】
を有する化合物から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するステップｃ）を含み、遊離銅のより高い濃度からアルツハイマー病の臨床診断が確認される、患者のアルツハイマー病の診断のための請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記閾値が０．５から５０μＭの間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ステップａ）及びｂ）が、その後の時点で前記患者から収集された血清試料で繰り返され、これらの試料中の遊離銅の濃度の時間ごとの進行が評価される、患者のアルツハイマー病の予後診断のための請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
銅のより高い濃度が軽度認知障害からアルツハイマー病への転換を指し示す、ステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するステップｃ）を含み、軽度認知障害を患っている患者の軽度認知障害（ＭＣＩ）の状態からアルツハイマー病への転換の素因の評価のための請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記閾値が０．５から３μＭの間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
固相上でクロマトグラフィー抽出を実行するための１つ又は複数の手段、及び１つ又は複数の蛍光クマリンプローブを含む、血清中の遊離銅の検出のためのキット。
【請求項17】
前記手段が固相として超高分子量ポリエチレンを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
前記クマリン蛍光プローブが以下の一般的な構造式：
（式中、Ｒ１は、ｎが０から５までのＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである）
を有する化合物から選択される、請求項１６又は１７に記載のキット。
【化3】
（式中、Ｒ１は、ｎが０から５までのＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである）
を有する化合物から選択される、請求項１６又は１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血清中の『遊離』銅の濃度、すなわち構造的にセルロプラスミンに結合しない血清銅の部分を決定するための新しい方法に関する。本発明は、アルツハイマー病患者の血清試料における、遊離銅を決定するための、感度及び精度が高い方法にも言及する。
【背景技術】
【0002】
血清銅の決定は、多数の疾患において、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）において、最も重要である。アルツハイマー病は、記憶喪失及び進行性の痴呆によって特徴づけられる神経障害である。疾患の原因は、ベータアミロイド（Αβ）タンパク質及びタウペプチドが脳内で凝集することと厳密に関連があるように見える。さらに、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）遺伝子のイプシロン４対立遺伝子は、アルツハイマー病の危険性を増加させることが証明された。アルツハイマー病の発症に関する最も一般的な仮説であると認識される、『アミロイドカスケード』についての新しい詳細が、最近出された。実際に、アルツハイマー病の発症及び進行の原因となる多様な病原性経路が仮定された。主に金属酸化還元反応を介した酸化的ストレスが、アルツハイマー病脳に脳障害を引き起こす可能性がある、ということを証明する十分な証拠がある。具体的には、ベータアミロイドタンパク質の過剰金属化が酸化的ストレス及びＨ２Ｏ２生産の酸化還元サイクルの根底にあり、Αβタンパク質オリゴマー形成及び沈着を決定する可能性があることが提唱された。金属の恒常性の乱れは、結果として、脳の銅貯蔵庫に供給し、Αβ酸化ストレスサイクルに入る可能性のある遊離銅の形成を導き、アルツハイマー病に多面効果を生み出す。この命題は、現在、遊離銅がアルツハイマー病患者の血清でわずかに、しかし、有意に増加することを示すいくつかの証拠によって支持される。
【0003】
セルロプラスミンは血液中で銅を運ぶ主要なタンパク質であり、タンパク質の活性化状態を形成するために構造的に６原子の銅を結合し、それは循環する銅の約８５〜９５％であると考えることができ、残りの銅が遊離であると定義される。以前の研究で、発明者は血清中の遊離銅を、銅及びセルロプラスミン測定から始め、以下に示す計算で決定した。血清銅濃度は、プラットホームＨＧＡ８００と共にグラファイト炉を備えたＡＡａｎａｌｙｓｔ ３００ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ原子吸光分光光度計を利用した原子吸光分析技術、又は、Ａｂｅら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９８９（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｒｕｍｌｉｎ、ＵＫ）の比色法のどちらかで血清銅濃度を測定することによって再確認された。セルロプラスミン濃度はＷｏｌｆ ＰＬ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９８２に従って免疫比濁分析検定（Ｈｏｒｉｂａ ＡＢＸ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）によって分析され、各々の血清銅及びセルロプラスミンペアについて、セルロプラスミンに結合する銅（ＣＢ）の量及びセルロプラスミンに結合しない銅（『遊離』銅）の量が、Ｗａｌｓｈら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００３に記載された標準手順に従って計算された。この計算はμｍｏｌ／Ｌの『遊離』銅を表し、セルロプラスミンが０．３％の銅を含むという証拠に基づく。さらに、発明者は基質としてｏ−ジアニシジンジヒドロクロリドを用いるセルロプラスミンオキシダーゼ活性の測定手順を最近記載した。
【0004】
以前、市販の標準物質（ヒト血清セルロプラスミン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でタンパク質のオキシダーゼ活性から始めるセルロプラスミン量を決定するための方法が記載されているが、分光光度分析よりタンパク質ピークの吸光度が減衰することが明らかになり、遊離銅値を推定するのに必要なタンパク質量を定量するために酵素検出を使用する上での信頼性が低下した。
【0005】
現況技術に記載された酵素法に基づく銅及びセルロプラスミンの定量化には、いくつかの欠点、例えば、高い費用、市販のセルロプラスミンの様々な純度、国際単位（Ｕｌ）で血清酵素を報告する一般的推奨、及び決定された濃度の低い正確度を伴う。
【0006】
Ｈｙｏ Ｊｕｎｇ Ｓｕｎｇら（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００９）は、生物系における遊離銅の決定のためのクマリンプローブの合成及び使用を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の範囲は、従来技術の欠点を伴わない、血清中の遊離銅を測定するための新しい方法及びキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の目的は、血清試料において遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、ａ）結合画分及び遊離銅を含む溶出画分を得る、固相抽出用の樹脂上に前記血清試料をロードするステップと、
ｂ）クマリン蛍光プローブを用いてステップａ）で溶出した画分中の遊離銅の濃度を決定するステップと
を含む上記方法である。
【0009】
本発明のさらなる目的は、ａ）、ｂ）と同一のステップ、及び、さらにステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するステップｃ）を含み、遊離銅のより高い濃度からアルツハイマー病の臨床診断が確認される、患者のアルツハイマー病の診断のために遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0010】
本発明のさらなる目的は、前記ステップａ）及びｂ）が、その後の時点で前記患者から収集された血清試料で繰り返され、これらの試料中の遊離銅の濃度の時間ごとの進行が評価される、患者のアルツハイマー病の予後診断のための遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0011】
本発明のさらなる目的は、遊離銅のより高い濃度が軽度認知障害からアルツハイマー病への転換を指し示す、ａ）及びｂ）と同一のステップ、並びに、さらにステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するステップｃ）を含み、軽度認知障害（ＭＣＩ）を患っている患者の軽度認知障害の状態からアルツハイマー病への転換の素因の評価のための遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【0012】
本発明のさらなる目的は、固相上でクロマトグラフィー抽出のための１つ又は複数の装置、及び１つ又は複数のクマリン蛍光プローブを含む、血清中の遊離銅の検出のためのキットである。
【0013】
発明者は、血清中の遊離銅濃度が血液タンパク質の存在のために不正確に見積もられることを観察し、さらに、低分子量の化学元素を血液タンパク質から分離する様々な方法、例えば膜フィルター装置、が正確に遊離銅の濃度を決定することができないことも観察した。本明細書に記載された本発明は、血液タンパク質から遊離銅を分離するステップの選択、及び、特異的な種類の蛍光プローブの選択に基づく。
【発明の効果】
【0014】
本発明の方法は、現況技術の決定方法と比較して、いくつかの利点を伴う：− 高い精度及び正確度で血清中の遊離銅の濃度を決定することができること、
− 非常に減じられた費用と時間で血清中の遊離銅の濃度を決定することができること、
− 簡単に自動化可能な方法であること。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ ９：１中でＣｕ＋＋（１０−４Ｍ）の存在下における、クマリン蛍光プローブ７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミドの校正曲線（λｅｘ＝４３０ｎｍ、４９０ｎｍのλｅｍ）の図である。
【図2】ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯ ９：１中でＣｕ＋＋（１０−５Ｍ）の存在下における、クマリン蛍光プローブ７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミドの校正曲線（λｅｘ＝４３０ｎｍ、４９０ｎｍのλｅｍ）である。
【図3】受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線である。本発明の１つの実施形態に従って、７０２個の試料を分析した。曲線は、本発明を用いて、アルツハイマー病の診断が、高い特異度（８０％）及び個別の感度（６０％）で得ることができることを示す。
【図4】遊離血清銅レベルによって、アルツハイマー病に罹患した患者における悪化する可能性（ミニメンタルステート検査）を予測するモデルを示す図である。丸は、患者の遊離血清銅の値を表す。線は、ミニメンタルステート検査の予測された可能性のモデルが悪化していることを表す。現在の試験パネルの患者で、２．１μｍｏｌ／Ｌの遊離銅の値と一致する、ｚ−スコア−０．１３８を超える患者は、そのようなレベル未満の『遊離』銅の値を持つ患者よりも悪化する可能性が高まった。
【図5】遊離銅の濃度を用いて、軽度認知障害を訴え、やがてアルツハイマー病になる被験者の割合を予測することもできることを示す図である。遊離銅の濃度が１．６μΜを超える軽度認知障害被験者は、アルツハイマー病に転換する割合がより高い。
【図6】１つの実施形態に従って本発明の方法を実行する装置の写真である。
【図7】固相上の抽出によって分離された血清試料の分光光度分析を示す図である。分光光度分析によって、濾液中のタンパク質の存在を確かめることが可能になり、タンパク質の存在がより高いほど、これらのタンパク質が銅の読み取りをマスクするので、遊離銅の回収率に関する性能はより悪くなる。曲線の幅が狭くなるに従って、タンパク質組成は減少し、したがって、遊離銅の回収率が改善する。
【図8A】膜濾過によって分離された血清試料の分光光度分析を示す図である。
【図8B】膜濾過によって分離された血清試料の分光光度分析を示す図である。
【図9】現況技術の参照試験（計算された銅）によって、又は、本発明（Ｃ４Ｄ）に記載の方法によって決定されたセルロプラスミンに結合しない銅（非ｃｐ銅）の値で得られた、多項式及び「非パラメトリックｌｏｗｅｓｓ」（局所的な重み付けをした散布図平準化）直線回帰分析を示す図である。
【図10】現況技術の参照試験（計算された銅）によって、又は、本発明（Ｃ４Ｄ）に記載の方法によって決定された、健康な被験者、軽度認知障害（ＭＣＩ）被験者、及びアルツハイマー病（ＡＤ）被験者における、非ｃｐ銅の信頼区間（９５％）を示す図である。
【図11】現況技術の参照試験（計算された銅）によって決定された非ｃｐ銅濃度の値を用いて、又は、本発明（Ｃ４Ｄ）に記載の方法によって得られたＲＯＣ曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
前に示したように、本発明は血清試料において遊離銅の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。本記載において、「遊離銅」という用語は、全身循環で、構造的にセルロプラスミンに結合されない銅を意味する。アルブミン、小ペプチド、アミノ酸及び他の微量要素に不安定に結合し、それらの間で簡単に交換可能なその特性を指して、それは最近『不安定』銅とも名付けられている。遊離銅は、血液脳関門を横切って脳組織に簡単に到着することができる低分子量銅である。
【0017】
遊離銅を血清試料の血液タンパク質から分離するために、方法は、第１ステップ（ａ）固相抽出（ＳＰＥ）クロマトグラフィーを含む。血清試料は、当該分野の技術者に知られている手順に従って、例えば遠心分離によって、全血から得てもよい。分離を行う前の血清は、好ましくは、１から１０の間の希釈係数に従って、適切に希釈してもよい。血清は、例えば、クロマトグラフィーの移動相としても使用可能な生理溶液（０．９％ＮａＣｌ）で希釈してもよい。
【0018】
血清試料は、通常、例えば、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇの小型クロマトグラフィーカラムの固相（血液タンパク質を結合することができる樹脂）上に、ロードされる（接種される）。セルロプラスミンを含む、血清試料に存在する血液タンパク質は固相上に吸着されるが、固相から溶出される銅を含む画分は収集されて、方法の第２ステップｂ）にかけられる。したがって、本記載において、『溶出された画分』とは、固相抽出クロマトグラフィー（固相上のクロマトグラフィー抽出）で使用した樹脂に吸着されない画分を意味する。
【0019】
試料は、ペリスタル型ポンプによって、例えば、１００μｌ／ｍｉｎから１ｍｌ／ｍｌの間、例えば２００、３００、４００、５００μｌ／ｍｉｎの流量で固相上にロードしてもよい。
【0020】
ステップａ）で、ポリオレフィン、好ましくは、例えば、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリメチルペンテン（ＰＭＰ）、ポリブテン−１（ＰＢ−１９）から選択される熱可塑性ポリオレフィンを、固相として使用してもよい。前記固相は、例えば、３５から７５％の間の結晶化度を持つ可能性がある。
【0021】
本発明の一実施形態によると、固相として超高分子量ポリエチレン（すなわち、３から６ＭＤａの間の原子質量で）の樹脂、例えば、カタログ番号４３４２６４−１ＫＧでＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能（超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＰＥ）及びその他同等の商用樹脂）が使用される。したがって、ステップａ）のすべては、非常に迅速で、簡単に自動化可能であり、さらに、一度適した溶媒、例えばメタノールで再生されると、固相は他の分離に再生利用されて、経済的な利点がある可能性がある。
【0022】
方法は、クマリン蛍光プローブを用いて、ステップａ）で溶出された画分の銅を決定する第２のステップ（ｂ）を含む。クマリン蛍光プローブは、［Ｃｕ＋＋］を結合すると、蛍光放射の減衰を記録することができるキレート化蛍光プローブである。クマリン蛍光プローブが例えば以下の一般的な構造式：【化1】
（式中、
Ｒ１は、ｎが０から５までのＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルである）
を有する化合物から選択されてもよい。
【0023】
本発明の一実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がｎ＝１のＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルでオルト位、パラ位又はメタ位のいずれかである上記の群から選択される。
【0024】
本発明の別の実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がｎ＝２のＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルでオルト位、パラ位又はメタ位のいずれかである上記の群から選択される。
【0025】
本発明の別の実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がｎ＝３のＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルでオルト位、パラ位又はメタ位のいずれかである上記の群から選択される。
【0026】
本発明の別の実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がｎ＝４のＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルでオルト位、パラ位又はメタ位のいずれかである上記の群から選択される。
【0027】
本発明の別の実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブは、Ｒ１がｎ＝５のＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、Ｒ２がＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＮＯ２、ＯＣＨ３、シクロヘキシルでオルト位、パラ位又はメタ位のいずれかである上記の群から選択される。
【0028】
本発明の別の実施形態によると、前記クマリン蛍光プローブが以下の構造式：【化2】
を有する７−（ジエチルアミノ）−２−オキソ−Ｎ−（（ピリジン−２−イル）メチル）−２Ｈ−クロメン−３−カルボキサミドである。
【0029】
クマリン蛍光プローブは、例えばＥｔＯＨ、ＭｅＯＨ、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で、ＰＢＳ又はＨｅｐｅｓなどの緩衝液と混合して使用してもよい。一実施形態では、クマリン蛍光プローブは、ＨＥＰＥＳ：ＤＭＳＯの溶液中で使用される。
【0030】
クマリン蛍光プローブは、好ましくは０．１から１０μΜの間、例えば１、２．５、５．０、９μΜの濃度範囲で、試料との反応に使用される。発明者は、この範囲において遊離銅の濃度と蛍光放射との間に直接的な相関関係があることを見いだし、例えば励起波長（λｅｘ）は４３０ｎｍであり、吸収波長（λｅｍ）は４９０ｎｍである。
【0031】
遊離銅の濃度を決定するために、ステップｂ）は、校正曲線を作成するさらなるステップを含んでもよい。校正曲線を作成するために、既知濃度の銅の複数のアリコートを使用してもよい。好ましくは、この曲線は、０．１から１０μΜの間の範囲である（図１を参照）。
【0032】
以前にアルツハイマー病に罹患した患者について報告されたように、セルロプラスミンに結合しない血清銅（『遊離』銅）は上昇するように見え、わずかであるがその増加は、通常アルツハイマー病患者と健康で高齢の被験者（疾患の初期も含む）を区別するのに十分である。
【0033】
それゆえに、ステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するさらなるステップｃ）を含み、遊離銅のより高い濃度からアルツハイマー病の臨床診断が確認される、アルツハイマー病の疑いがある患者のアルツハイマー病の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法は本発明の目的である。
【0034】
「アルツハイマー病の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法」という表現は、アルツハイマー病の疑いがある患者におけるアルツハイマー病の臨床診断を確かめる方法を意味する。
【0035】
明らかに、クロマトグラフィー上にロードされる前に、血清が特定の希釈係数によって希釈されるならば、閾値と比較するステップｃ）において、ステップｂ）で決定された遊離銅濃度を希釈係数で乗じなければならない。
【0036】
銅の閾値（カットオフ）は、例えば、健康な個体及びアルツハイマー病の個体の一組の試料（統計的に有意な）の濃度を加工することによって得られるＲＯＣ（受信者操作特性）曲線によって決定してもよい。そのような加工を通して、０．５から５０μｍの間好ましくは０．５から３μｍの間、例えば１、１．５、２、２．５、３μｍの閾値が得られた。
【0037】
好ましくは、前記診断方法は、『銅の表現型機能障害』でアルツハイマー病の疑いがある患者におけるアルツハイマー病の臨床診断を確認する検査として使用される。
【0038】
Ｓｑｕｉｔｔｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００９）が示すように、患者のアルツハイマー病の予後をモニターするため、並びに、軽度認知障害（軽度認知障害）からアルツハイマー病への転換を予測するために、前記患者の血清中の遊離銅の濃度を決定することは重要である（図５）。
【0039】
軽度認知障害の臨床症状は、記憶障害によって特徴づけられ、客観的な測定によって証明できるが、痴呆の定義は与えられていない。正確な診断が重要であるのは、状態が軽度であるにもかかわらず、軽度認知障害は通常、アルツハイマー病の前兆であると考えられるという事実にある。これは、軽度認知障害からアルツハイマー病までの進行の高い統計率に起因する。
【0040】
通常、健康な状態からアルツハイマー病への年間転換率は、０．１７％から３．８６％にわたる。軽度認知障害からアルツハイマー病への変転換率は非常に高く、６％から４０％にわたる。場合によっては、軽度認知障害は、痴呆への進行がない良性の状態である可能性がある。２つのグループの平均を比較することによって明らかにされるように、遊離銅濃度は、軽度認知障害被験者を健康な対照個体と区別する（図５）。遊離銅濃度を用いて、軽度認知障害で、やがてアルツハイマー病になる被験者の割合を予測することもできる。遊離銅濃度が１．６μΜを超える軽度認知障害被験者は、アルツハイマー病に転換する割合がより高く、つまり１年につき１７％であり、銅が１．６μΜ以下の軽度認知障害被験者に関しては、つまり１年につき１０％である。銅が１．６μΜを超える軽度認知障害被験者は、銅が１．６μΜ以下の軽度認知障害被験者よりもアルツハイマー病に転換する割合がより高く、最初の２年以内にアルツハイマー病へ転換した割合が２４〜３５％の間にあるのに対し、遊離銅が１．６μΜ以下の軽度認知障害被験者で３年半以内に転換したのは２５〜３０％であることを、カプラン−マイヤー統計分析は立証する。分析を５年のフォローアップに限定すると、アルツハイマー病へ転換する割合は、銅が１．６μΜ以下の軽度認知障害被験者では５０％未満であり、一方、銅が１．６μΜを超える軽度認知障害コホートでは、患者の５０％が４〜６年以内に転換する（図５）。
【0041】
一実施形態では、本発明の方法は、銅のより高い濃度が軽度認知障害からアルツハイマー病への転換を示す、ステップｂ）で決定された値を、閾値（カットオフ）と比較するステップｃ）を含み、軽度認知障害を患っている患者の軽度認知障害（ＭＣＩ）の状態からアルツハイマー病への転換を予測するために使用される。この閾値は、例えば０．５から３μΜの間であり、好ましくは１．６μΜである。前記予測方法のステップａ）及びｂ）を、上記に開示されたステップａ）及びｂ）のいずれかの実施形態に従って実行してもよい。
【0042】
本発明のさらなる目的は、患者のアルツハイマー病の予測のためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、上記に開示されたステップａ）及びｂ）のいずれかの実施形態に記載の方法のステップａ）及びｂ）は、異なる時点で収集された前記患者のより多くの試料で実行され、各々の試料から得られたデータの定量化は、交互に比較され、したがって前記患者の血清試料中の遊離銅の濃度の時間ごとの進行が構築される。
【0043】
本発明のさらなる目的は、固相上でクロマトグラフィー抽出を実行するための手段又は指示、及び１つ又は複数の蛍光クマリンプローブを含む、血清中の遊離銅の検出のためのキットである。固相上でクロマトグラフィー抽出を実行するための手段は、例えば、固相樹脂を含むクロマトグラフィーカラムである。一実施形態では、前記手段は固相として超高分子量ポリエチレンを含む。さらなる実施形態では、前記クマリン蛍光プローブは、上記の構造式を有する化合物から選択される。
【0044】
一実施形態では、キットは銅の既知の力価を有する対照の１つ又は複数のアリコートをさらに含み、これらの対照は、校正曲線を作成するために使用してもよい。
【0045】
本発明の一部の実施形態を例示することを目的とする実施例は、以下に報告され、いかなる場合も、そのような実施例は、本記載及び後続の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されないことになっている。
【実施例】
【0046】
（例１）血液タンパク質分離のために、固相抽出（ＳＰＥ）クロマトグラフィー法を設定した。固相としては、相互作用し、血清タンパク質を保持することができる、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＰＥ）樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４３４２６４−１ＫＧ）が用いられた。移動相としては、タンパク質（セルロプラスミン）結合性銅の放出を阻止するために、純水ではなく生理溶液（０．９％のＮａＣｌ）を使用し、一定の溶出流量（流量：４００μｌ／ｍｉｎ）を維持するためにペリスタル型ポンプによって吸引した。１ｍｌのクロマトグラフィーカラムに５００ｍｇの樹脂を充填し（図６）、２つの異なる方針を用いて調整した：
− カラムに入れた５００ｍｇの樹脂は、６ｍｌの生理溶液で調整した。
− ５００ｍｇの樹脂を約３ｍｌのメタノール中に懸濁し、次いでカラムにロードするために用いた。
次いで、６ｍｌの蒸留水をカラムに通して溶出し、完全にメタノールを除去し、その後６ｍｌの生理溶液を通した。次いで、いずれの場合も、５０μｌの血清をロードし、生理溶液で溶出した。最初の２５０μｌの溶出液及び後続の５００μｌのアリコートは別に収集した。分光光度分析により、２５０μｌのアリコート（図７のアリコート１）ではタンパク質が検出されず、一方、後続の５００μｌのアリコート（図７のアリコート２及び３）ではタンパク質の存在が観察された。あらゆる実験室のニーズのために、目的のアリコートを収集するために要する時間を減じるために、カラム調整のために必要な移動相体積を減らすことによって、プロトコールを改善することができる。前記技術の１つの利点は、メタノール吸着タンパク質を溶出する（約２ｍｌ）ことによってカラムを再生させる可能性によってもたらされる。再生され、後続の３回の分離に使用されたカラムでは、分光光度分析により、２５０μｌのアリコート中にタンパク質が検出されない、という期待される結果が確認された。プロトコールのすべては、最長３０分で展開する。最適化された方法は、２０分又は１５分又は１０分まで時間を短縮し、６サイクル／時間まで短縮する。
【0047】
１．比較実験様々な血清試料中の遊離銅濃度を、既知の遊離銅濃度を使って決定した。解析した試料及びその濃度のリストを表１に報告する。試料中の遊離銅濃度は、本発明の方法によって、特に実施例１に詳細に記載された実施形態に従って、同時に、分離ステップで固相（ＳＰＥ）上のクロマトグラフィー抽出の代わりに濾過膜を使用することによって、決定された。
【0048】
しかし、得られた結果は、異なる種類の濾過膜を用いることによって、試料に含まれる遊離銅の回収率が３５〜７７％減少したことを示す。特に、実験は、膜装置が１：１０（Ｃｕ検定で許容される最大の希釈度）に希釈された血清試料からタンパク質を除去することができないことを示す。
【0049】
これに反して、固相（ＳＰＥ）上のクロマトグラフィー抽出を用いた濾過収量は、接種した血清量に比例する。さらに、ＭｅＯＨ溶出液において、濾過した量にほぼ反比例するタンパク質量が得られ、方法の正確度が確認される（１０μｌ濾過後に１ｍＬ中に保持されるタンパク質は、５０μｌで５ｍＬ中より多く、さらに２５μｌで２．５ｍＬ中より多い）。
【0050】
５０μｌを接種したタンパク質画分は、最初の２回の５００μｌ画分に収集される。次いで、全血清を１ｍＬで収集する。最初の２５０μｌ画分を除いても、その他の２つの画分は、タンパク質を含む画分である。
【0051】
要約すると、膜装置による濾過は効率的ではないが、固相上のクロマトグラフィー抽出による濾過はより正確でより迅速である。【表1】
【0052】
２．比較実験以下に記載された実験では、本発明に記載の方法、及び現況技術で用いられ、Ｗａｌｓｈら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００３に記載された参照方法（計算された銅）の両方を用いて、かなりの個体の試料から得られた血清中の「遊離銅」の濃度を決定した。
【0053】
本発明に記載の方法は、以下に、及び図９〜１１に、Ｃ４Ｄ（Ｃａｎｏｘ４Ｄｒｕｇの頭字語）という名称によってより簡潔に示される。
【0054】
次の分析：ａ．現況技術の参照試験との比較、
ｂ．Ｃ４Ｄ試験の精度、
ｃ．Ｃ４Ｄ試験の直線性、
ｄ．Ｃ４Ｄ試験の検出限界、
ｅ．Ｃ４Ｄ試験の基準範囲、
ｆ．判別妥当性
ｉ．手段の比較、
ｉｉ．診断正確度（特異度、感度、陽性予測値、陰性予測値）。
が報告されている。
【0055】
２．１参照試験との比較（ＣＬＳＩ用語：真度／比較性）現況の技術において、遊離銅、すなわちセルロプラスミンに結合していない（非Ｃｐ銅）、は直接測定されず、次のアルゴリズム：
非Ｃｐ銅＝銅総量−０．４７２ｘＣｐ
に基づいて計算される（Ｗａｌｓｈら、Ａｎｎ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００３）。
【0056】
この手順は、発明者のデータベースで１１％と等しい偽陰性値の割合を決定する。本発明に記載の非Ｃｐ銅の直接測定は、２つの分布が非対称であるので、このエラーを決定しない。図９に、試験された２７３例の被験者の２種類の定量による値を示す。直線回帰、多項式及び「非パラメトリックｌｏｗｅｓｓ」（局所的な重み付けをした散布図平準化）回帰分析は、線形フィットが十分ではないこと、２次要素をモデルに挿入することは、適応効果を有意に強化して（０．５２５から０．５９１まで、Ｒ２−変化に対する試験、ｐ＜０．００１）、曲線性が存在することが示唆されること、及び、そのような曲線性は、区分的回帰によって、計算された非Ｃｐ銅の臨界点値０を持つ２つの直線回帰に分解することができることを示す。計算された非Ｃｐ銅の負の値が手続き的なエラーと考えることでき、比較的わずかであるので、２つの測定間の一致は、負でない値についてのみ実行された。比較するのは２つの測定装置ではなく、２つの検出モード（セルロプラスミンへ結合する銅の化学式に基づく標準規格のもの、及び本発明に記載の直接測定に基づくもの）であることを考慮すれば、クラス内相関係数は、「総一致」ではなく「一貫性」の評価のために計算された。
【0057】
参照試験との比較分析は、クラス内相関は０．７５と等しいこと（９５％の信頼区間：０．６９〜０．８０）、及び、組織的影響が２つの検出モード（識別テスト、ｐ＝０．９５９）の間に存在しないことを示す。
【表2】
【0058】
基準範囲を定めるために、発明者が根拠をおいた試料は、１４７例の被験者から成り、そのために神経科医が認知障害、並びに、過去及び最近の心血管性エピソード及び脳血管性エピソードの存在を除外した。対照被験者の平均年齢は、４９歳（ＤＳ＝１２．８）であり、女性が５３％、男性が４７％であった。性別及び年齢の非ｃｐ銅への影響に関する予備分析は、性別が関連性のある影響を持たないこと（Ｆ（１．１４０）＝０．８４６、ｐ＝０．３５９、年齢の二乗＝０．００６）、及び年齢効果は、男性と女性で有意差のないこと（Ｆ（１．１４０）＝０．６３１、ｐ＝０．４２８、年齢の二乗＝０．００４）を示した。年齢効果は、統計的に有意であることを証明し（Ｆ（１．１４０）＝５．１１４、ｐ＝０．０３５、年齢の二乗＝０．０３５）、非Ｃｐ銅の３．５％が年齢可変性に起因することが示された。追加の年齢１０年ごとに、非Ｃｐ銅が０．０９マイクロモル増加することを伴い、関係は実質的に線形である。次いで、年齢補正値を、次の式：年齢補正非Ｃｐ銅＝（ｃ４ｄ−０．００９＊（年齢−４９．０５））
に従って得た。
【0059】
新しい値を、非パラメトリックＣＬＳＩ手順で分析した。基準上限（９５％）は、１．９１と等しかった（関連する９０％の信頼区間は、１．７８〜２．０６と等しかった）。
【0060】
２．２．識別能力及び数値（マイクロモル）分散分析により、両測定で、対照、軽度認知障害（ＭＣＩ）患者、及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の間で明白な識別能力が示された（Ｆ（２．２６５）＝４７．３１７、ｐ＜０．００、年齢の二乗＝０．２６０、非Ｃｐ銅について測定；Ｆ（２．２６５）＝３２．６９５、ｐ＜０．００１、年齢の二乗＝０．１９８、現況技術の方法に従って非Ｃｐ銅について計算）。図１０は、３つのグループの平均及び信頼区間を示す。
【0061】
対照と標的病状（アルツハイマー病の可能性、及び／又は見込みの診断）に罹患した患者の間の比較だけを考慮すると、ＲＯＣ曲線は、現況技術の参照試験によって非Ｃｐ銅を計算すると０．７６１の正確度（ＡＵＣ−曲線下面積として測定）を、及び本発明に記載の方法で非Ｃｐ銅を測定すると０．８０６を示した。そのような差異は、統計的に有意であることを証明した（ペアワイズＲＯＣ比較、ｐ＜０．００１）。図１１にハイライトされるように、９５％の特異度で、感度は、現況技術の方法によって計算された決定の４４％から、本発明の方法によって測定された決定の５６％へ進む。
【0062】
２．３診断の正確度（特異度、感度、陽性予測値、陰性予測値）対照被験者の試料の基準限界に基づいてセットされた（９５％）特異度で（１．９）、４８．３％（９５％の信頼区間：３８％〜５８％）と等しい方法感度が検出された。陽性テスト（ＬＲ＋）の尤度比は９．９４であり、従来通りに認められたカットオフ（＞５）を優に上回った。陰性テスト（ＬＲ−）の尤度比は０．５４であり、従来通りに認められたカットオフ（＜０．２）と比較して値は適切ではなく、高い割合の偽陰性（非Ｃｐ銅の値が１．９未満のＡＤ患者）に起因した。テストの陽性予測値（ＰＰＶ）を推定するために、発明者は、可変的な発生率（年齢、並びに、他の遺伝的、及び臨床的条件に基づく）によって特徴づけられた３つのシナリオを推察した。
【0063】
以下に、上記の実験に関連した結果のいくつかを、表形式にまとめる。表２に、本発明の方法で達成できる診断正確度の値を要約する。表３．１〜３．３に、図１１で報告したＲＯＣ曲線を加工するために用いた値が報告される。【表3】
【表4-1】
【表4-2】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【国際調査報告】