特表 2016-519076 マイクロＲＮＡ及びＥＧＦＲ−ＴＫＩ阻害剤を利用する癌の併用処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-519076(P2016-519076A)

(43)【公表日】2016年6月30日

(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡ及びＥＧＦＲ−ＴＫＩ阻害剤を利用する癌の併用処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20160603BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20160603BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20160603BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20160603BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20160603BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20160603BHJP

   C12N 9/99 20060101ALN20160603BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20160603BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7105ZNA

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P43/00 121

   A61K31/5377

   A61K31/517

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61P35/04

   A61P11/00

   A61P43/00 105

   A61P1/16

   A61P15/00

   C12N9/99

   C12N15/00 G

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】74

(21)【出願番号】特願2016-502684(P2016-502684)

(86)(22)【出願日】2014年3月14日

(85)【翻訳文提出日】2015年11月13日

(86)【国際出願番号】US2014028006

(87)【国際公開番号】WO2014143855

(87)【国際公開日】20140918

(31)【優先権主張番号】61/787,558

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/927,543

(32)【優先日】2014年1月15日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】515255755

【氏名又は名称】ミルナ セラピューティクス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ベイダー，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ザオ，ジェーン

(72)【発明者】

【氏名】ケルナー，ケビン

【テーマコード（参考）】

4B024

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B024AA01

4B024CA11

4B024HA17

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZA591

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZC751

4C085AA14

4C085AA15

4C085CC23

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085GG08

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC46

4C086BC73

4C086EA16

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA59

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

本開示は、被験体中の癌細胞を含む癌細胞を処置するための方法および組成物を提供し、これにより、二つ以上の治療剤が使用され、一つはEGFR-TKI剤であり、他方はマイクロRNAである。
【選択図】図３Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は：
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）薬剤を投与する工程；及び
ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−２１５から選択されるマイクロＲＮＡ、及び、配列番号：８−１２２として付録Ａに列挙されるマイクロＲＮＡを、被験体に投与する工程
を含み、
ここで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２６ではない
ことを特徴とする方法。

【請求項2】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はエルロチニブである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

癌は肺癌である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

肺癌は非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌である、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。

【請求項5】

癌は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項6】

耐性は一次である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。

【請求項7】

耐性は二次（獲得）である、ことを特徴とする請求項５に記載の方法。

【請求項8】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、マイクロＲＮＡ投与がない状態で有効であることが必要とされる用量の下で少なくとも５０％である有効量で投与される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のＩＣ_５０は、マイクロＲＮＡ投与が無い状態でＩＣ_５０に対して少なくとも２倍低減される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項10】

癌は肝臓癌である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項11】

肝臓癌は肝細胞癌である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項12】

被験体はＫＲＡＳ変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項13】

被験体はＥＧＦＲ変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項14】

癌は肝臓に転移性病巣を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項15】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、又はセツキシマブを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項16】

ＮＳＣＬは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に対する二次耐性を有する、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。

【請求項17】

ＨＣＣは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に対する二次耐性を有する、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はエルロチニブであり、マイクロＲＮＡは配列番号：１に少なくとも８０％同一の配列を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項19】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はＨＥＲ２阻害剤である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項20】

ＨＥＲ２阻害剤は、ラパチニブ、ペルツズマブ、又はトラスツズマブである、ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はエルロチニブであり、マイクロＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：１６８、又は配列番号：１６９に少なくとも８０％同一の配列を含み、癌は非小細胞肺（ＮＳＣＬ）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項22】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はエルロチニブであり、マイクロＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：１６８、又は配列番号：１６９に少なくとも８０％同一の配列を含み、癌は膵癌である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項23】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はラパチニブであり、マイクロＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：１６８、又は配列番号：１６９に少なくとも８０％同一の配列を含み、癌は乳癌である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項24】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はアファチニブであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、配列番号：１、配列番号：１６８、又は配列番号：１６９に少なくとも８０％同一の配列を含み、癌は非小細胞肺（ＮＳＣＬ）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項25】

癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は：
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）薬剤を投与する工程；及び
配列番号：１−６、８−１２２、又は１６８−１７９に少なくとも８０％同一の配列を含むマイクロＲＮＡを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がゲフィチニブである場合、配列は配列番号：３と同一ではない
ことを特徴とする方法

【請求項26】

マイクロＲＮＡはｍｉＲ−３４である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項27】

肺癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は：
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）薬剤を投与する工程；及び
ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、又はｍｉＲ−３４ｃから選択されるマイクロＲＮＡを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２６ではない
ことを特徴とする方法。

【請求項28】

肺癌は非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌である、ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

ＮＳＣＬは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

肝臓癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は：
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）薬剤を投与する工程；及び
ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、又はｍｉＲ−３４ｃから選択されるマイクロＲＮＡを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２６ではない
ことを特徴とする方法。

【請求項31】

肝臓癌は肝細胞癌である、ことを特徴とする請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

ＨＣＣは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

乳癌を患う被験体を処置する方法であって、該方法は：
被験体に上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）薬剤を投与する工程；及び
ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、又はｍｉＲ−３４ｃから選択されるマイクロＲＮＡを被験体に投与する工程
を含み、
ここで、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がゲフィチニブである場合、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１２６ではない
ことを特徴とする方法。

【請求項34】

ＮＳＣＬは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に耐性がある、ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はラパチニブである、ことを特徴とする請求項３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願＞
本出願は、２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願第６１／７８７，５５８号、及び、２０１４年１月１５日出願の米国仮特許出願第６１／９２７，５４３号の優先権の利益を請求するものであり、両出願は、全体を参照することで本明細書に組み込まれる。

【0002】

＜配列表＞
本出願は配列表を包含しており、これは、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体を参照することで本明細書に組み込まれる。２０１４年３月１１日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、１２１７２−２０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、２６，４２７バイトのサイズである。

【0003】

＜発明の分野＞
本発明は癌治療に関するものであり、より具体的には、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ阻害剤を利用する癌の併用療法に関するものである。

【背景技術】

【0004】

肺癌は、男性と女性の両方において最も高い癌に関連する死因である。２０１２年には肺癌の新しいケースが約２２０，０００までになると予測され、全ての癌診断の約１４％を占めている（Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ＆ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０１２， Ｓｏｃｉｅｔｙ）。肺癌は、２０１２年に推定１６０，０００の死亡が集計される、癌に関連する死の主要原因であり、これは、全ての癌による死の約２８％に等しい。肺癌は２つの主なクラスに分類される。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、患者の２０％に影響し、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は約８０％に影響する。ＮＳＣＬＣは３つの主なタイプから成る：腺癌、扁平上皮癌、及び大細胞癌であり、肺の腺癌及び扁平上皮癌は、全ての肺癌の大部分を占める（例えば、Ｆｏｒｇａｃｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ， ２００１． ７（１）：６−１３； Ｓｅｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， １９９８． １３７８（１）： Ｆ２１−５９を参照）。処置は、手術、放射線、治療、化学療法、及び標的化治療を含む。局所的なＮＳＣＬＣでは、手術は通常、最適な処置であり、これら患者の大半の生存は、手術後に化学療法を与えることにより改善する。標的治療は、疾患の癌遺伝子型又は段階に依存して使用され、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＶＥＧＦ−Ａ、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）、及びクリゾチニブ（Ｘａｌｋｏｒｉ（商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＬＫの阻害剤（未分化リンパ腫キナーゼ）、及びＲＯＳ１（ｃ−ｒｏｓ癌遺伝子、受容体チロシンキナーゼ）を含む。クリゾチニブは、特定の後期段階（局所的に進行した又は転移性の）非小細胞肺癌を処置するためにＦＤＡによって承認されており、変異したＡＬＫ遺伝子を発現するものに限定される。ベバシズマブは、カルボプラチン／パクリタキセルの化学療法と組み合わせて第一線の非鱗状のＮＳＣＬＣに使用するために、最初に承認された。それ以来、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋは、任意の白金ベースの化学療法と組み合わせた標準の第一線の処置としてベバシズマブを推奨し、その後、疾患が進行するまでベバシズマブを維持する（Ｓａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００６． ３５５（２４）： ２５４２−５０）。

【0005】

エルロチニブは、以前の従来の化学療法レジメンの失敗の後、ＮＳＣＬＣを患う患者のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）からの迅速な承認を受けた（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ， ２００５． １０（７）：４６１−６； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ， ２００３． ８（４）：３０３−６）。エルロチニブは、ＥＧＦＲキナーゼの可逆的な阻害剤であり、ＥＧＦＲキナーゼの活性部位にてＡＴＰ結合の競合的阻害剤として作用するように設計される（Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２００７． ７（３）：１６９−８１）。ゲフィチニブは、米国の外の国々で使用される別のＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤である。ゲフィチニブとエルロチニブを比較した、直接の相対的な有効性試験は存在しないが、データは、それらの間に主な治療上の差異がないことを示唆する（Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１０． １０（１１）： ７６０−７４）。ＥＧＦＲ−ＴＫＩを使用する初期の臨床試験は、ＮＳＣＬＣを患う処置された患者の約１０−２０％において観察された部分応答を適度に促進する（Ｆｕｋｕｏｋａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００３． ２１（１２）：２２３７−４６）。薬物応答は、女性、非喫煙者、アジア民族の患者、及び、腺癌又は気管支肺胞上皮癌の履歴を持つと診断された人において、より頻繁に生じる（Ｆｕｋｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００３． ２１（１２）：２２３７−４６； Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００５． ２３（３１）：８０８１−９２）。顕著に、両方の薬剤は、ほんの２か月のみまで全体的な患者の延命効果を延ばし、一次の又は獲得の（ａｃｑｕｉｒｅｄ）二次耐性により、それらは効能を失う（Ｓｈａｒｍａ， ｓｕｐｒａ； Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ２００５． ３５３（２）：１２３−３２）。

【0006】

ゲフィチニブとエルロチニブの不満足な応答率は、反応の遺伝的背景ｖｓ耐性のある患者人口を評価するために、複数の研究を引き起こした。臨床試験の遡及分析により、ＥＧＦＲ発現レベルはゲフィチニブに対する反応に関連しないことが明らかとなった（上述のＢｅｌｌ）。代わりに、薬物に反応する患者は、ＥＧＦＲキナーゼドメイン（ｉｄ．）の変異の活性化を頻繁に抱く。しかし、ＥＧＦＲ変異を患う患者の５０％未満は、応答を進行させて、ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する感受性を判定する付加的因子の存在を示す。一次耐性又は二次耐性は、次のものに関連した：（１）Ｋ−ＲＡＳ及びＥＧＦＲの変異が顕著に互いに相容れないように見えるという事実に関わらず、ＥＧＦＲ変異と共存し得る、Ｋ−ＲＡＳ（Ｇａｚｄａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， ２００４． １０（１０）：４８１−６； Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｍｅｄ， ２００５． ２（１）：ｅ１７）；（２）ＰＩ３Ｋ経路に信号を送り、ＥＧＦＲの不活性と置き換わる、ｃ−Ｍｅｔ、受容体チロシンキナーゼの増幅及び過剰発現（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００７． ３１６（５８２７）：０３９−４３）；（３）ＥＧＦＲ（通常Ｔ７９０Ｍ）の触媒ドメインにおける第２の変異の獲得（Ｐａｏ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｍｅｄ， ２００５． ２（３）： ｅ７３．；）（４）ＢＲＡＦ変異（Ｐｒａｔｉｌａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００８． ６８（２２）：９３７５−８３）；（５）ＡＬＫの移動（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００９． ２７（２６）：４２４７−５３）；（６）肝細胞成長因子（ＨＧＦ）過剰発現、ＭＥＴ受容体のリガンド（Ｙａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００８． ６８（２２）：９４７９−８７）；（７）他のＥＧＦＲ変異の存在（エクソン２０における、小さな挿入又は複製： Ｄ７７０＿Ｎ７７１、ｉｎｓ ＮＰＧ、ｉｎｓ ＳＶＱ、ｉｎｓ Ｇ及びＮ７７１Ｔ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００８． １４（１５）： ４８７７−８２）；及び、（８）ＰＩＫ３ＣＡ（Ｅｎｇｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ２００６． １１６（１０）：２６９５−７０６； Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６． ５４（２）：２０９−１５）、ＰＴＥＮ（Ｓｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００９． ６９（８）：３２５６−６１）、ＩＧＦ１Ｒ及びＫＤＭ５Ａの損失（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２００９． ４（１０） ｅ７２７３； Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． １４１（１）：６９−８０）を含む、ＥＤＦＲの信号ダウンストリームに影響を及ぼす遺伝的病変。Ｔ７９０Ｍ変異は、獲得耐性を備えたＥＧＦＲ変異体腫瘍の〜５０％に見出され；ＫＲＡＳ変異は全てのＮＳＣＬＣの１５−２５％に生じ；及び、変異したＢＲＡＦとＡＬＫの移動は、それぞれＮＳＣＬＣの２−３％及び５％に見出される（Ｐａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１０． １０（１１）：７６０−７４）。従って、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療に応答すると思われるＮＳＣＬＣ患者のパーセンテージは、比較的小さい。ＥＧＦＲ阻害剤に対する抵抗を媒介する、付加的であるが未確認の分子決定因子が存在し得る。

【0007】

単一の治療薬剤としてのエルロチニブの適度の効能は、他の治療レジメンによるこれらＥＧＦＲ−ＴＫＩの併用的使用を必要とする。シスプラチン／ゲムシタビン又はカルボプラチン／パクリタキセルと組み合わせたエルロチニブの効果を調べる、第ＩＩＩ相臨床試験ＴＲＩＢＵＴＥ／ＴＡＬＥＮＴ試験は、従来の化学療法のみに対する薬物の延命効果を実証することは出来なかった（Ｓｈａｒｍａ， ｓｕｐｒａ； Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００５． ２３（２５）：５８９２−９ ａｎｄ Ｇｉａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００４． ２２（５）：７７７−８４ ａｎｄ Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２００４． ２２（５）：７８５−９４）。それ故、エルロチニブは現在、ｍＴＯＲ及びＭＥＴに対する阻害剤等の、他の標的化した小分子阻害剤と組み合わせて試験されている（上述のＰａｏ）。この戦略がＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性を持つ患者において効果的かどうかが、これから確立される。利用可能なデータは、耐性遺伝子における変異を既に抱いている未処置の腫瘍における希少細胞から耐性腫瘍が発生すること、及び、これらの部分母集団がＴＫＩ処置（ｉｄ．）の間に選択されることを示唆する。また、既に未処置の腫瘍がＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞の異種特性を表示し、標的治療の単一の薬物の組み合わせが有効な処置に十分ではないことを示唆することも、起こり得る。代わりに、様々な組み合わせの連続的な使用は、前の処置中に正の選択を受ける、耐性腫瘍を排除するのに必要とされ得る。

【0008】

それ故、肺癌の処置の進歩にもかかわらず、肺癌患者の生存率は非常に低いままである。ＥＧＦＲ−ＴＫＩなど最新の標的治療は、相当な約束を持っているが、一次耐性及び二次耐性の存在又は発達により、単独療法における満足な効能を欠いている。ＥＧＦＲ阻害剤の他の標的化した処置との併用的使用は、ＥＧＦＲ阻害剤の効能を支援し、且つ、薬物耐性を克服又は予防するのを支援することもある。

【0009】

予備的研究は、特定のｍｉＲＮＡがインビトロで癌細胞を敏感にすることができることを示す（Ｂｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ， ２００７． １７（１５）：１２９８−３０７においてレビューされる）。例えば、ｌｅｔ−７は、肺癌細胞を、ＴＲＡＩＬベースのゲムシタビン又は放射線治療に対して敏感にすることができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００９． ６９（１６）： ６７０４−１２； Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００７． ６７（２２）： １０７８２−８； Ｗｅｉｄｈａａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２００７． ６７（２３）：１１１１１−６）。同様に、ｍｉＲ−３４は、前立腺、結腸、脳、胃、膀胱、及び膵臓の癌細胞株における従来の治療の効率を向上させる（Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２００８． ３７７（１）：１１４−９； Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ２００９． ４（８）：ｅ６８１６； Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ． ７０（１４）：１５０１−１２． Ａｋａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ３００（２）：１９７−２０４； Ｗｅｅｒａｒａｔｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏ Ｏｎｃｏｌ． １３（２）：１６５−７５； Ｊｉ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ， ２００８． ８：２６６； ａｎｄ Ｖｉｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１１． １３０（１１）： ２５２６−３８）。しかし、肺癌の細胞及び動物モデルにおける任意のエルロチニブ／ｍｉＲＮＡの組み合わせのための実証は、存在しないままである。

【0010】

近年、Ｚｏｎｇら（Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏ Ｉｎｔｅｒａｃ． ２０１０， １８４：４３１−４３８）は、ゲフィチニブに対してゲフィチニブ耐性細胞株Ａ５４９及びＨ４６０を敏感にする能力に関して、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１２６、及びｍｉＲ−１４５を試験した。ＩＣ_５０の最も大きな減少は、Ｈ４４０細胞（〜７倍）におけるｍｉＲ−１２６によって達成されたが、残りの状態は、２−３倍のＩＣ_５０の減少のみを結果として生じさせた（上述のＺｈｏｎｇにおける表２を参照）。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、特定のマイクロＲＮＡがＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株において一貫してアップレギュレート又はダウンレギュレートされ得、及び、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の特異的な組み合わせが、例えば、特定の癌細胞の処置において特に効果的である（例えば、相乗作用を示す、又はより大きな相加効果を持つ）ので、都合のよい及び／又は予期できない結果を有し得るという発見に、部分的に基づく。適宜、本発明は、様々な態様及び実施形態において、細胞、組織、及び／又は生物体を、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の特異的な組み合わせに接触させる工程を含む。より具体的に、本発明は、癌細胞、癌組織、及び／又は癌を持つ生物体を、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のそのような組み合わせに接触させる工程を含み得る。方法は、実験的、診断的、及び／又は治療的なものであり得る。方法は、組織又は生物体中に細胞を含む、細胞の増殖を阻害又は低減するために使用され得る。例えば、マイクロＲＮＡは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株において一貫してダウンレギュレート又はアップレギュレートされる、マイクロＲＮＡの模倣体又は阻害剤であり得る。

【0012】

適宜、様々な態様及び実施形態において、本発明は、癌を患う被験体を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、被験体にＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤を投与する工程、及び、被験体に、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４７、及びｍｉＲ−２１５のマイクロＲＮＡ模倣体を投与する工程を含む。同様の方法は、細胞又は組織（例えば、癌細胞又は腫瘍などの癌組織）をＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織をｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４７、及びｍｉＲ−２１５のマイクロＲＮＡ模倣体に接触させる工程を含む。
マイクロＲＮＡは、配列番号：１−６及び１６８−１７９の少なくとも１つに対して少なくとも８０％（又は、８５、９０、９５、１００％）同一である配列（ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４７、及びｍｉＲ−２１５、同様にファミリーメンバー、機能的ホモログ、シード配列、及びその共通配列）を含み得る。これら及び他のマイクロＲＮＡは、天然の核酸、その誘導体及び化学的修飾形態、同様に、核酸アナログを含み得る。

【0013】

様々な態様及び実施形態において、本発明は、被験体（例えば癌を患う被験体）にＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤を投与する方法、及び、被験体に配列番号：８−１２２として付録Ａに列挙したマイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡ模倣体（ダウンレギュレートしたマイクロＲＮＡ）を投与する方法を提供する。同様の方法は、細胞又は組織（例えば、腫瘍などの癌細胞又は癌組織をＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織を配列番号：８−１２２として付録Ａに列挙したマイクロＲＮＡのマイクロＲＮＡ模倣体（ダウンレギュレートしたマイクロＲＮＡ）に接触させる工程を含む。マイクロＲＮＡは、配列番号：８−１２２の少なくとも１つに対して少なくとも８０％（又は８５、９０、９５、１００％）同一の配列を含み得る。

【0014】

様々な態様及び実施形態において、本発明は、被験体（例えば癌を患う被験体）にＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤を投与する方法、及び、配列番号：１２３−１６７、好ましくは配列番号：１５６−１６７、より好ましくは配列番号：１５９、１６４、及び１６５として付録Ａに列挙されるマイクロＲＮＡの阻害剤（アップレギュレートしたマイクロＲＮＡ）を投与する方法を提供する。同様の方法は、細胞又は組織（例えば、癌細胞又は腫瘍などの癌組織）をＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に接触させる工程、及び、細胞又は組織を配列番号：１２３−１６７、好ましくは配列番号：１５６−１６７、より好ましくは配列番号：１５９、１６４、及び１６５として付録Ａに列挙されるマイクロＲＮＡの阻害剤（アップレギュレートしたマイクロＲＮＡ）に接触させる工程を含む。阻害剤は、マイクロＲＮＡに少なくとも８０％（又は８５、９０、９５、１００％）相補的な配列を含むマイクロＲＮＡであり得る。

【0015】

様々な実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、エルロチニブ、又は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、又はセツキシマブなどのアナログのＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤、或いは、ラパチニブ、ペルツズマブ、又はトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤であり得る。幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤はエルロチニブであり、マイクロＲＮＡは、配列番号：１−４の１つ（例えば、配列番号：１）に対して少なくとも８０％（又は８５、９０、９５、１００％）同一である。

【0016】

様々な実施形態において、癌は、本発明に従うマイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ阻害剤の組み合わせが有効な治療学であるという癌、例えば、肺癌（例えば非小細胞肺、ＮＳＣＬ）及び肝臓癌（例えば肝細胞癌、ＨＣＣ）であり得る。癌は肝臓に転移性の病変を含み得る。

【0017】

様々な実施形態において、癌は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に耐性がある。耐性は一次又は二次（獲得）であり得る。癌は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に対する一次又は二次の耐性を持つ肺（例えばＮＳＣＬ）の癌であり得る。癌は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤単独による処置に対する一次又は二次の耐性を持つ肝臓癌（例えばＨＣＣ）であり得る。

【0018】

様々な実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、マイクロＲＮＡ投与がない状態で有効であることが必要とされる用量未満（例えば、少なくとも５０％未満）である有効量で投与され得る。用量は、マイクロＲＮＡが無い状態で必要な用量の前に、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、又は９０％であり得る。

【0019】

様々な実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のＩＣ_５０は、マイクロＲＮＡ投与が無い状態でＩＣ_５０に対して低減される（例えば、少なくとも２倍）。ＩＣ_５０は、少なくとも１．５、２、２．５、３、４、５、又は１０倍まで低減され得る。

【0020】

様々な実施形態において、被験体は、ヒト、ヒト以外の霊長類、又は実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ）である。被験体はＫＲＡＳ変異を有し得る。被験体はＥＧＦＲ変異を有し得る。幾つかの実施形態において、被験体は、エルロチニブに対する一次又は二次の耐性を持ち、例えば、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対する耐性が発達した、又は発達させる可能性のある患者である。代替的に、被験体の癌は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対して十分な感受性を持ちうるが、単独療法のその毒性は、低用量のＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤が望ましいことを示し得る。

【0021】

本発明の様々な態様、実施形態、及び特徴が、以下に更に詳しく提示され且つ記載される。しかし、前述及び後述の記載は単に例示的且つ説明的なものである、請求されるように、本発明に制限されない。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】二次（獲得）耐性を持つ細胞株の生成を示す。ＨＣＣ８２７耐性細胞は、低濃度のエルロチニブ（ＩＣ_１０）において親細胞を処置することにより生成され、２−３か月にわたり、ＩＣ_９０まで濃度を絶えず増加させた。

【図2A】エルロチニブ耐性を制御する新規なｍｉＲＮＡ候補の識別を示す。ＲＮＡは、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞から分離され、そして、ＨＣＣエルロチニブ耐性細胞対親のエルロチニブ感受性細胞株において差次的に発現されるｍｉＲＮＡを識別するためにＡｇｉｌｅｎｔ／Ｓａｎｇｅｒ１２＿０ ｍｉＲＮＡアレイ上で試験された。薄い及び厚い箱の中のｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子群上でそれぞれコード化される。ＣＰ、シスプラチン；ＶＣ、ビンクリスチン；ＤＡ、ダウノルビシン；ＴＺ、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｄｉｍｅ）；ＤＲ、ドキソルビシン；ＰＴ、パクリタキセル；ＩＦＮ、インターフェロン；ＭＤＲ、多剤；Ａ、アポトーシス；Ｃ、セツキシマブ；Ｇ、ゲムシタビン；Ｔ、タモキシフェン；Ｍ、メトトレキサート；５−ＦＵ、５−フルオロウラシル；ＡＭ、アドリアマイシン。

【図2B】エルロチニブ耐性を制御する新規なｍｉＲＮＡ候補の識別を示す。ＲＮＡは、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞から分離され、そして、ＨＣＣエルロチニブ耐性細胞対親のエルロチニブ感受性細胞株において差次的に発現されるｍｉＲＮＡを識別するためにＡｇｉｌｅｎｔ／Ｓａｎｇｅｒ１２＿０ ｍｉＲＮＡアレイ上で試験された。薄い及び厚い箱の中のｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子群上でそれぞれコード化される。ＣＰ、シスプラチン；ＶＣ、ビンクリスチン；ＤＡ、ダウノルビシン；ＴＺ、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｄｉｍｅ）；ＤＲ、ドキソルビシン；ＰＴ、パクリタキセル；ＩＦＮ、インターフェロン；ＭＤＲ、多剤；Ａ、アポトーシス；Ｃ、セツキシマブ；Ｇ、ゲムシタビン；Ｔ、タモキシフェン；Ｍ、メトトレキサート；５−ＦＵ、５−フルオロウラシル；ＡＭ、アドリアマイシン。

【図2C】エルロチニブ耐性を制御する新規なｍｉＲＮＡ候補の識別を示す。ＲＮＡは、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞から分離され、そして、ＨＣＣエルロチニブ耐性細胞対親のエルロチニブ感受性細胞株において差次的に発現されるｍｉＲＮＡを識別するためにＡｇｉｌｅｎｔ／Ｓａｎｇｅｒ１２＿０ ｍｉＲＮＡアレイ上で試験された。薄い及び厚い箱の中のｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子群上でそれぞれコード化される。ＣＰ、シスプラチン；ＶＣ、ビンクリスチン；ＤＡ、ダウノルビシン；ＴＺ、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｄｉｍｅ）；ＤＲ、ドキソルビシン；ＰＴ、パクリタキセル；ＩＦＮ、インターフェロン；ＭＤＲ、多剤；Ａ、アポトーシス；Ｃ、セツキシマブ；Ｇ、ゲムシタビン；Ｔ、タモキシフェン；Ｍ、メトトレキサート；５−ＦＵ、５−フルオロウラシル；ＡＭ、アドリアマイシン。

【図3A】エルロチニブと特異的なｍｉＲＮＡの組み合わせの効果を実証する。図３Ａ：エルロチニブのみのＩＣ_５０値の判定。ｍｉＲ−３４は、固定された弱い濃度（〜ＩＣ_２５）でリバーストランスフェクトされた。その後、細胞は連続希釈法でエルロチニブにより処理された。組み合わせの効果は、用量反応曲線及びＩＣ_５０値の推移の目視検査によって評価された。

【図3B】エルロチニブと特異的なｍｉＲＮＡの組み合わせの効果を実証する。図３Ｂ：ｍｉＲＮＡのみのＩＣ_５０（或いはＩＣ_２０、又はＩＣ_２５）の値の判定。ｍｉＲ−３４は、固定された弱い濃度（〜ＩＣ_２５）でリバーストランスフェクトされた。その後、細胞は連続希釈法でエルロチニブにより処理された。組み合わせの効果は、用量反応曲線及びＩＣ_５０値の推移の目視検査によって評価された。

【図3C】エルロチニブと特異的なｍｉＲＮＡの組み合わせの効果を実証する。図３Ｃ：ｍｉＲ−３４ａとエルロチニブの組み合わせの効果の判定。ｍｉＲ−３４は、固定された弱い濃度（〜ＩＣ_２５）でリバーストランスフェクトされた。その後、細胞は連続希釈法でエルロチニブにより処理された。組み合わせの効果は、用量反応曲線及びＩＣ_５０値の推移の目視検査によって評価された。

【図4A】癌細胞中にＥＧＦＲ−ＴＫＩ感受性を回復させるマイクロＲＮＡ模倣体の例を示す。図４Ａ：親ＨＣＣ８２７細胞におけるエルロチニブの用量依存性の効果。細胞は３日間、連続希釈法でエルロチニブにより処理され、細胞の増殖はＡｌａｒｍａＢｌｕｅによって判定された。

【図4B】癌細胞中にＥＧＦＲ−ＴＫＩ感受性を回復させるマイクロＲＮＡ模倣体の例を示す。図４Ｂ：エルロチニブ（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ）に耐性のあるＨＣＣ８２７細胞は、細胞が親ＨＣＣ８２７におけるＩＣ_９０に等しい濃度で通常増殖するまで、１０週の期間にわたり、エルロチニブ濃度の増加により細胞を培養することによって開発された。

【図4C】癌細胞中にＥＧＦＲ−ＴＫＩ感受性を回復させるマイクロＲＮＡ模倣体の例を示す。図４Ｃ：ＨＣＣ８２７^ｒｅｓとＨ１２９９の細胞は、０．３ｎＭ ｍｉＲ−３４ａ又はｍｉＲ−ＮＣ（負の対照）でリバーストランスフェクトされ、連続希釈法でエルロチニブを補った培地においてインキュベートされた。３日後、細胞の増殖が判定された。エルロチニブのみの、又はｍｉＲＮＡと組み合わせた場合のＩＣ_５０値は、グラフに示される。

【図4D】癌細胞中にＥＧＦＲ−ＴＫＩ感受性を回復させるマイクロＲＮＡ模倣体の例を示す。図４Ｄ：ＨＣＣ８２７^ｒｅｓとＨ１２９９の細胞は、０．３ｎＭ ｍｉＲ−３４ａ又はｍｉＲ−ＮＣ（負の対照）でリバーストランスフェクトされ、連続希釈法でエルロチニブを補った培地においてインキュベートされた。３日後、細胞の増殖が判定された。エルロチニブのみの、又はｍｉＲＮＡと組み合わせた場合のＩＣ_５０値は、グラフに示される。

【図5A】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の間、特に、ＮＳＣＬＣ細胞におけるｍｉＲ−３４ａ模倣体とエルロチニブの間の相乗効果の例を示す。図５Ａ：組み合せの指標（ＣＩ）分析。ＣＩ値は、線形回帰方及び非線形回帰法によって生成された。傾向線は、任意の与えられた効果（ｆａ、影響を受けた画分、％阻害）でＣＩ値を示し、記号は、実際のデータポイントに由来するＣＩ値を表わす。ＣＩ＝１、相加性；ＣＩ＞１、拮抗性；ＣＩ＜１、相乗性。

【図5B】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の間、特に、ＮＳＣＬＣ細胞におけるｍｉＲ−３４ａ模倣体とエルロチニブの間の相乗効果の例を示す。図５Ｂ：イソボログラム分析。対角線の点線は相加性を示し、正方形の記号は、５０％及び８０％（Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ４６０）又は３０％及び５０％（Ｈ２２６）癌細胞阻害をそれぞれ達成するのに必要な用量を示す。相加性の線より下のデータポイントは相乗性を示し、それより上のデータポイントは拮抗性を表示する。

【図5C】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の間、特に、ＮＳＣＬＣ細胞におけるｍｉＲ−３４ａ模倣体とエルロチニブの間の相乗効果の例を示す。図５Ｃ：曲線推移の分析。非線形の回帰傾向線に由来するデータは、単一の薬剤（ＩＣ_５０ ｅｑ）のＩＣ_５０値に標準化され、同じグラフにおいてプロットされた。単一の薬剤の用量反応曲線（灰色、黒）に対する組み合わせ用量反応曲線（点線）の左及び右の推移は、それぞれ相乗性又は拮抗性を示す。実際の実験データポイントが示される。

【図6A】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａの特定の比率がどのようにしてＡ５４９細胞において相乗的に協同するのかを示す。図６Ａ：要約表は、様々な濃度及び比率で組み合わされたエルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能（ｆａ）、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す。ｍｉＲ−３４−エルロチニブのモル比、１：５３３、１：１３３３、１：３３３３（ＩＣ_５０：ＩＣ_５０の比率）、１：８３３３、及び１：２０８３３が示される。

【図6B】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａの特定の比率がどのようにしてＡ５４９細胞において相乗的に協同するのかを示す。図６Ｂ：様々な薬物の比率の組み合せ指標プロット。実際のデータポイントからのＣＩ値は記号によって示される。

【図6C】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａの特定の比率がどのようにしてＡ５４９細胞において相乗的に協同するのかを示す。図６Ｃ：８０％癌細胞阻害でのイソボログラム。正方形の記号は、様々な比率の８０％のイソボール（ｉｓｏｂｏｌｅ）を表わす。点線は、８０％（±２％）の阻害をもたらした実際のエルロチニブ−ｍｉＲ−３４ａの組み合わせに由来するイソボールを表わす。

【図6D】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａの特定の比率がどのようにしてＡ５４９細胞において相乗的に協同するのかを示す。図６Ｄ：様々な薬物の比率の曲線推移の分析。

【図7A】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａがどのようにしてＨＣＣ細胞において相乗効果を示すのかを示す。図７Ａ：組み合せ指標分析。グラフの説明については図５を参照。

【図7B】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａがどのようにしてＨＣＣ細胞において相乗効果を示すのかを示す。図７Ｂ：イソボログラム分析。グラフの説明については図５を参照。

【図7C】癌細胞におけるマイクロＲＮＡ模倣体とＥＧＦＲ−ＴＫＩの相乗効果の例、特に、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａがどのようにしてＨＣＣ細胞において相乗効果を示すのかを示す。図７Ｃ：曲線推移の分析。グラフの説明については図５を参照。

【図8A】ＮＳＣＬＣ細胞におけるエルロチニブ耐性を制御する遺伝子の内因性のｍｉＲ−３４及びｍＲＮＡのレベルを示す。ＲＮＡの合計は、エルロチニブ耐性に関係する遺伝子のｍｉＲ−３４ａ／ｂ／ｃ及びｍＲＮＡのレベルを測定するために、三通りのｑＲＴ−ＰＣＲにおいて使用された。データは、ハウスキーピングｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡそれぞれに標準化され、ＨＣＣ８２７細胞のレベルと比較して、パーセント変化として表わされた。ｕ、検出されない。

【図8B】ＮＳＣＬＣ細胞におけるエルロチニブ耐性を制御する遺伝子の内因性のｍｉＲ−３４及びｍＲＮＡのレベルを示す。ＲＮＡの合計は、エルロチニブ耐性に関係する遺伝子のｍｉＲ−３４ａ／ｂ／ｃ及びｍＲＮＡのレベルを測定するために、三通りのｑＲＴ−ＰＣＲにおいて使用された。データは、ハウスキーピングｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡそれぞれに標準化され、ＨＣＣ８２７細胞のレベルと比較して、パーセント変化として表わされた。ｕ、検出されない。

【図8C】ＮＳＣＬＣ細胞におけるエルロチニブ耐性を制御する遺伝子の内因性のｍｉＲ−３４及びｍＲＮＡのレベルを示す。ＲＮＡの合計は、エルロチニブ耐性に関係する遺伝子のｍｉＲ−３４ａ／ｂ／ｃ及びｍＲＮＡのレベルを測定するために、三通りのｑＲＴ−ＰＣＲにおいて使用された。データは、ハウスキーピングｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡそれぞれに標準化され、ＨＣＣ８２７細胞のレベルと比較して、パーセント変化として表わされた。ｕ、検出されない。

【図9A】エルロチニブに耐性のあるＮＳＣＬＣ細胞における単一の薬剤の用量反応曲線を示す。細胞は、示された濃度におけるエルロチニブ又はｍｉＲ−３４ａ単独で、三通りに処置された。細胞の増殖は、エルロチニブ処置又はｍｉＲ−３４ａリバーストランスフェクションそれぞれの３日後又は４日後に測定された。非線形回帰傾向線はＧｒａｐｈｐａｄを使用して生成され、ＩＣ_５０とＩＣ_２５の値が計算された。非線形回帰傾向線の適合度はＲ^２値によって示される。アスタリスクは、用量反応曲線（Ｈ２２６）の外挿に由来する理論上のＩＣ_５０値を表示する。

【図9B】エルロチニブに耐性のあるＮＳＣＬＣ細胞における単一の薬剤の用量反応曲線を示す。細胞は、示された濃度におけるエルロチニブ又はｍｉＲ−３４ａ単独で、三通りに処置された。細胞の増殖は、エルロチニブ処置又はｍｉＲ−３４ａリバーストランスフェクションそれぞれの３日後又は４日後に測定された。非線形回帰傾向線はＧｒａｐｈｐａｄを使用して生成され、ＩＣ_５０とＩＣ_２５の値が計算された。非線形回帰傾向線の適合度はＲ^２値によって示される。アスタリスクは、用量反応曲線（Ｈ２２６）の外挿に由来する理論上のＩＣ_５０値を表示する。

【図10A】ＮＳＣＬＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図10B】ＮＳＣＬＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図10C】ＮＳＣＬＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図10D】ＮＳＣＬＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図11】ＨＣＣ細胞におけるエルロチニブ耐性を制御する遺伝子のｍｉＲ−３４及びｍＲＮＡの発現を示す。ＲＮＡの合計は、エルロチニブ耐性に関係する遺伝子のｍｉＲ−３４ａ／ｂ／ｃ及びｍＲＮＡのレベルを測定するために、三通りのｑＲＴ−ＰＣＲにおいて使用された。データは、ハウスキーピングｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡそれぞれに標準化され、ＨＣＣ８２７細胞のレベルと比較して、パーセント変化として表わされた。ｕ、検出されない。

【図12A】エルロチニブに耐性のあるＨＣＣ細胞における単一の薬剤の用量反応曲線を示す。細胞は、示された濃度におけるエルロチニブ又はｍｉＲ−３４ａ単独で、三通りに処置された。細胞の増殖は、エルロチニブ処置又はｍｉＲ−３４ａリバーストランスフェクションそれぞれの３日後又は６日後に測定された。非線形回帰傾向線はＧｒａｐｈｐａｄを使用して生成され、ＩＣ_５０とＩＣ_２５の値が計算された。非線形回帰傾向線の適合度はＲ^２値によって示される。アスタリスクは、用量反応曲線（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｃ３Ａ、ＨｅｐＧ２）の外挿に由来するエルロチニブの理論上のＩＣ_５０値を表示する。

【図12B】エルロチニブに耐性のあるＨＣＣ細胞における単一の薬剤の用量反応曲線を示す。細胞は、示された濃度におけるエルロチニブ又はｍｉＲ−３４ａ単独で、三通りに処置された。細胞の増殖は、エルロチニブ処置又はｍｉＲ−３４ａリバーストランスフェクションそれぞれの３日後又は６日後に測定された。非線形回帰傾向線はＧｒａｐｈｐａｄを使用して生成され、ＩＣ_５０とＩＣ_２５の値が計算された。非線形回帰傾向線の適合度はＲ^２値によって示される。アスタリスクは、用量反応曲線（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｃ３Ａ、ＨｅｐＧ２）の外挿に由来するエルロチニブの理論上のＩＣ_５０値を表示する。

【図13A】ＨＣＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図13B】ＨＣＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図13C】ＨＣＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図13D】ＨＣＣ細胞において様々な濃度及び比率で組み合わされた、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの効能、ＣＩ、及びＤＲＩの値を示す要約表を示す。Ｆａ＞６５％、ＣＩ＜０．６、ＤＲＩ＞２をもたらす組み合わせは灰色で強調され、関連して考慮される。Ｆａ、影響を受けた画分（細胞の増殖の％阻害）；ＣＩ、組み合せ指標；ＤＲＩ、用量減少指標。

【図14】ｍｉＲ−３４−Ｍｉｍが、４つの試験した乳癌細胞株（ＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ４７Ｄ）にわたりラパチニブとの相乗効果を示したことを示すデータを示す。記号は、実際のデータポイントに由来するＣＩ値を表わす。ＣＩ、組み合せ指標；Ｆａ、影響を受けた画分（＝増殖の阻害）；ＣＩ＝１、相加性；ＣＩ＞１、拮抗性；ＣＩ＜１、相乗性。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、特定のマイクロＲＮＡがＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株において一貫してアップレギュレート又はダウンレギュレートされ得、及び、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の特異的な組み合わせが、例えば、特定の細胞の処置において特に効果的である（例えば、相乗作用を示す、又はより大きな相加効果を持つ）ので、都合のよい及び／又は予期できない結果を有し得るという発見に、部分的に基づく。適宜、本発明は、様々な態様及び実施形態において、細胞、組織、及び／又は生物体を、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の特異的な組み合わせに接触させる工程を含む。より具体的に、本発明は、癌細胞、癌組織、及び／又は癌を持つ生物体を、マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のそのような組み合わせに接触させる工程を含み得る。方法は、実験的、診断的、及び／又は治療的なものであり得る。方法は、組織又は生物体中に細胞を含む、細胞の増殖を阻害又は低減するために使用され得る。例えば、マイクロＲＮＡは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ耐性細胞株において一貫してダウンレギュレート又はアップレギュレートされる、マイクロＲＮＡの模倣体又は阻害剤であり得る。

【0024】

＜マイクロＲＮＡ＞
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後に遺伝子発現を調節し、且つ、複数の遺伝子産物及び細胞の経路を調製することにより細胞運命を判定する、小さな非コードの、自然に発生するＲＮＡ分子である（Ｂａｒｔｅｌ， Ｃｅｌｌ， ２００４． １１６（２）：２８１−９７）。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写を低下させること、タンパク質翻訳機構を遮断することの何れかにより、遺伝子発現に干渉する（上述のＢａｒｔｅｌ）。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの広範であるが特異的なセットを標的とする能力をこれら調節性のＲＮＡに賦与する、完全に又は単に部分的に相補的な配列を備えたｍＲＮＡを標的とする。現在まで、細胞増殖、分化、アポトーシス、幹細胞発達、及び免疫機能と同様に多様であるプロセスにおける役割を持つ、〜１，５００のヒトの注釈されたｍｉＲＮＡ遺伝子がある（Ｃｏｓｔｉｎｅａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００６． １０３（１８）：７０２４−９）。大抵、ｍｉＲＮＡの誤調節は、癌を含むヒト疾患の発現に寄与し得る（Ｅｓｑｕｅｌａ−Ｋｅｒｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２００６． ６（４）：２５９−６９； Ｃａｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６． ６（１１）：８５７−６６）。癌において規制緩和されたｍｉＲＮＡは、本物の腫瘍サプレッサ又は癌遺伝子として機能することができる。単一のｍｉＲＮＡは、複数の癌遺伝子および腫瘍形成性シグナル経路を標的とし（Ｆｏｒｇａｃｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ， ２００１． ７（１）：６−１３）、及び、この能力を将来の治療に翻訳することは、腫瘍不均一性に対して有効な治療法を作り出す見込みを持ち得る。故に、ｍｉＲＮＡは、癌のための強力な治療薬になる可能性があり（Ｖｏｌｉｎｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００６． １０３（７）：２２５７−６１； Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ２００８． １５（６）：３４１−５５）、それは、複数の癌経路に介在する場合に上手く処置されるのみである「経路疾患」としての癌に関する我々の現在の理解に従って作用する（Ｗｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ２０１０． ７０（１４）： ５９２３−５９３０．； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００８． ３２１（５８９７）：１８０１−６； Ｐａｒｓｏｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００８． ３２１（５８９７）：１８０７−１２）。

【0025】

２０１３年３月時点で、Ｍｉｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）は、ｃＧＭＰ材料の製造、及び、ｍｉＲ−３４をベースとする補足治療（ＭＲＸ３４）のためのＩＮＤを可能にする研究の伝導を支持するための臨床前の開発プログラムを完了した。Ｍｉｒｎａは、マウス、ラット、及び非ヒト霊長類を使用して、非ＧＬＰ予備的研究においてｍｉＲ−３４模倣体を包含する製剤の薬物動態学の特性と同様に、毒性も評価した。臨床観察、体重、臨床化学（ＬＦＴ、ＲＦＴ、その他を含む）、血液学、肉眼的所見、選択した器官及び補体（ＣＨ_５０）の組織病理学によって測定されるように、これらの実験は、ＭＲＸ３４の予測された治療レベルで有害事象を示さなかった。加えて、脂質ナノ粒子中で処方されたｍｉＲＮＡ模倣体は、完全に免疫適格のマウス、ラット、非ヒト霊長類、同様に、ヒト全血試料において実証されるように、固有の免疫系を誘発しない。以前の臨床データのより詳細な調査は、Ｂａｄｅｒ， Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０１２； ３：１２０において提供される。

【0026】

本発明の方法において、特異的なマイクロＲＮＡ（例えば、剛性のマイクロＲＮＡ模倣体又は阻害剤）は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤との併用療法の一部として被験体に投与される。特異的な実施形態において、そのようなマイクロＲＮＡは、配列番号：１−１７９から成る群から選択される。これらのマイクロＲＮＡは当該技術分野で周知であり、当業者は、マイクロＲＮＡが、従来の自然に発生する配列（本明細書で提供される）、及びその任意の化学的に修飾したバージョン及び配列同族体を含むことを理解する。

【0027】

様々な態様及び実施形態において、本発明は、トランスフェクションを介して細胞に送達されない、マイクロＲＮＡ模倣体又は阻害剤を利用する。むしろ、様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、注入又は輸液などの方法によって投与され得る。幾つかの実施形態において、分離された細胞、組織、又はその培養物ではなく、被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、又は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、非ヒト霊長類などの実験動物）であり得る。

【0028】

本発明に関連して使用されるマイクロＲＮＡは、７−１３０のヌクレオチド長の、２本鎖ＲＮＡ分子であり得、これは、２つの別個の鎖又はヘアピン構造の何れかを持つ。例えば、マイクロＲＮＡは、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、７−３０、７−２５、１５−３０、１５−２５、１７−３０、又は１７−２５のヌクレオチド長であり得る。「ガイド鎖」と称される２つの鎖の１つは、下記の表に示される親マイクロＲＮＡ配列のシード配列（ヌクレオチド位置２−９）と同一、又はほぼ同一である配列を包含する。本明細書で使用されるように、「ほぼ同一」は、多くとも１又は２の置換及び／又は削除が可能であることを意味する。幾つかの実施形態において、ガイド鎖は、本明細書に提供される完全長の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％同一である配列を含む。「パッセンジャー鎖」と称される２つの鎖のもう一方は、対応する与えられたマイクロＲＮＡのシード配列に相補的、又はほぼ相補的である配列を包含する。本明細書で使用されるように「ほぼ相補的である」は、多くとも１又は２の不一致及び／又は削除が可能であることを意味する。幾つかの実施形態において、パッセンジャー鎖は、本明細書に提供されるそれぞれの完全長の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％同一である配列を含む。幾つかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ、ｍｉＲ−４４９ｃ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１４７の模倣体、又は、それのアナログ或いは同族体である。幾つかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、これらマイクロＲＮＡの１つのシード配列を含む。

【0029】

【表1】

【0030】

マイクロＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ模倣体）は、例えば、米国特許第７，８５８，１１７号及び第７，３７１，４０４；米国特許出願公開第２００９−０３０６１９４号及び第２０１１−０００９６４１号に記載されるものなどのリポソームにおいて処方され得る。他の送達技術は当該技術分野で既知であり且つ利用可能であり、発現ベクター、脂質、又は様々なリガンド接合体を含む。

【0031】

特定の実施形態において、本発明の方法は、配列番号：１２３−１６７、好ましくは配列番号：１５６−１６７、より好ましくは配列番号：１５９、１６４、及び１６５として付録Ａに列挙されるマイクロＲＮＡから選択されたマイクロＲＮＡの阻害剤を投与する工程を含む。マイクロＲＮＡの阻害剤は当該技術分野で周知であり、典型的には標的マイクロＲＮＡに相補的であるアンチセンスの分子であるが、他のタイプの阻害剤も使用され得る。マイクロＲＮＡの阻害剤は、例えば米国特許第８，１１０，５５８号に記載される。特定の実施形態において、マイクロＲＮＡの阻害剤は、配列番号：１２３−１６７、好ましくは配列番号：１５６−１６７、より好ましくは配列番号：１５９、１６４、及び１６５として付録Ａに列挙される、対応するアップレギュレートしたマイクロＲＮＡに相補的又はほぼ相補的である、９−２０、１０−１８、又は１２−１７のヌクレオチド長の配列を包含する。

【0032】

マイクロＲＮＡ及びその阻害剤はまた、化学的に修飾され得、例えば、マイクロＲＮＡは、パッセンジャー鎖（例えば、ＮＨ_２−（ＣＨ_２）_６−Ｏ−）の上に５’キャップを持ち、及び／又は、同じ鎖の第１及び／又は第２のヌクレオチドにおいて不一致を有し得る。他の可能な化学修飾は、骨格修飾（例えばホスホロチオエート、モルホリノ）、リボース修飾（例えば２’−ＯＭｅ、２’−Ｍｅ、２’−Ｆ）、２’−４’−ロック（ｌｏｃｋｅｄ）／架橋糖（例えばＬＮＡ、ＥＮＡ、ＵＮＡ）、同様に、核酸塩基を含み得る（例えば、Ｐｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ， ２０１１． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ． ， １３３（２４）：９２００−９２０３を参照）。特定の実施形態において、マイクロＲＮＡ、特にｍｉＲ−３４及びｍｉＲ−１２４は、米国特許第７，９６０，３５９号、米国特許出願公開第２０１２−０２７６６２７号及び第２０１２−０２８８９３３号に記載されるような修飾を有する。

【0033】

マイクロＲＮＡは、用量当たり０．００１−１０．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（例えば、必王に応じて２、４、６、８週、又はそれ以上の期間につき、１、２、３、又はそれ以上の用量で、用量当たり０．０１−３．０、０．０２５−１．０、又は０．２５−０．５ｍｇ／ｋｇ）での遅いボーラス注入として静脈内に投与され得る。

【0034】

＜ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤＞
本発明の方法は、被験体にＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤を投与する工程を含む。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のファミリーは、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーに応じて機能を結合し且つ誘発する、４つの構造上関連する細胞表面受容体チロシンキナーゼを含む。ヒトにおいて、これは、Ｈｅｒ−１及びＥｒｂＢ１として知られるＥＧＦＲ、Ｎｅｕ及びＥｒｂＢ２と称されるＨｅｒ−２、Ｈｅｒ−３（ＥｒｂＢ３）、及びＨｅｒ−４（ＥｒｂＢ４）を含む。ＥｒｂＢシグナル伝達の過剰活性化は、広範囲の固形腫瘍の発達に関連する。従って、様々な付加的な実施形態において、本発明は、マイクロＲＮＡとエルロチニブの組み合わせに加えて、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブ、及びセツキシマブなどの他のＥＧＦＲ阻害剤、更に、ラパチニブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤も含む。

【0035】

特定の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩはエルロチニブであり、薬物の活性成分は現在、商標「ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）」の下で売買されている。他に明白に記述されない限り、本明細書における用語「エルロチニブ」は、式Ｉの化合物、同様に、その塩又はエステルの何れかを指す。

【0036】

【化1】

【0037】

エルロチニブは、チロシンキナーゼ阻害剤、化学名「Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン」を持つキナゾリンアミンである。特定の実施形態において、エルロチニブは塩酸エルロチニブである。経口投与のためのＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）錠剤は、２５ｍｇ、１００ｍｇ、及び１５０ｍｇのエルロチニブと同等な塩酸エルロチニブ（２７．３ｍｇ、１０９．３ｍｇ、及び１６３．９ｍｇ）及び以下の非活性成分を包含して、３つの投薬強度で利用可能となる：ラクトース一水和物、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、ナトリウムデンプングリコレート、ラウリル硫酸ナトリウム、及び二酸化チタン。錠剤はまた、製品識別のために、ＦＤ＆Ｃ Ｙｅｌｌｏｗ ＃６（２５ｍｇのみ）を含む微量の着色料を包含する。更なる情報は、承認された薬物ラベルから利用可能である。

【0038】

エルロチニブはまた、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９００，２２１号、及び対応するＰＣＴ公報ＷＯ０１／３４５７４に記載される。

【0039】

ＮＳＣＬＣのための、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）の承認され且つ推奨された用量は１５０ｍｇ／日であり、膵臓癌のための承認された用量は１００ｍｇ／日である。必要な場合、用量は５０ｍｇの減衰で低減され得る。

【0040】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤がエルロチニブである特定の実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６の配列（例えば、ヒトｍｉＲ−１２６の配列又はシード配列との、１００、９５、９０、８５、又は８０％未満の同一性）を持たない。

【0041】

特定の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤はゲフィチニブであり、薬物の活性成分は、商標「ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）」の下で売買されている。他に明白に記述されない限り、本明細書における用語「ゲフィチニブ」は、式ＩＩの化合物、同様に、その塩又はエステルの何れかを指す。

【0042】

【化2】

【0043】

ゲフィチニブは、化学名「４−キナゾリンアミン、Ｎ−（３−クロロ−４フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−４−モルホリン）プロポキシ］」を備えたチロシンキナーゼ阻害剤であり、ＺＤ１８３９としても知られる。臨床の製剤は、活性成分、ラクトース一水和物、微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、ラウリル硫酸ナトリウム、及びステアリン酸マグネシウムを包含する２５０ｍｇの錠剤として供給される。単一の治療としての推奨された用量は、１日当たり１つ２５０ｍｇの錠剤である。更なる情報は、承認された薬物ラベルに見出すことができる。

【0044】

アファチニブ、パニツムマブ、及びセツキシマブなどの他のＥＧＦＲ阻害剤、同様に、ラパチニブ、ペルツズマブ、及びトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤は当該技術分野で既知であり、故に、当業者は、本発明との使用に要求されるような、それらの構造、製剤、薬注、及び投与（例えば、承認された薬物ラベルなど公表された医用情報に基づく）を容易に理解する。

【0045】

＜癌＞
本発明は、被験体における癌細胞及び／又は組織を含む、癌細胞及び／又は組織を処置するための、又は、分離した癌細胞及び／又は組織のインビトロの処置のための方法及び組成物を提供する。被験体における場合、処置される被験体は動物（例えば、ヒト又は実験動物）であり得る。

【0046】

処置される被験体は、癌（例えば、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、腺癌、扁平上皮癌、及び大細胞癌）、膵癌、又は肝臓における癌、或いは、乳癌、ＨＣＣ、結腸直腸癌、頭頚部癌、前立腺、脳、胃、又は膀胱の癌を含むＥＧＲＦ阻害から利益を得る他のタイプの癌）と診断されたかもしれない。幾つかの実施形態において、細胞又は被験体は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対する一次又は二次の耐性を有している。

【0047】

被験体は、局所的に進行した、切除不能な、又は転移性の癌を有し得、及び／又は、以前の一次治療に失敗したかもしれない。幾つかの実施形態において、被験体は、少なくとも２、４、６、８、１０か月以上続く、ＥＧＲＲ−ＴＫＩ薬剤による以前の処置を受けている。他の実施形態において、被験体はＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ変異を有している（Ｂａｌａｋ ｅｔ ａｌ． ２００６． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １２（１）：６４９４−５０１）。他の実施形態において、被験体は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対する１以上のかなりの副作用を経験しており、故に用量の減少を必要とする患者である。処置される被験体はまた、次の１つによって特徴付けられたものであり得る：（１）Ｋ−ＲＡＳ変異；（２）ｃ−Ｍｅｔの増幅と過剰発現；（３）ＢＲＡＦ変異；（４）ＡＬＫ転位；（５）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）過剰発現；（６）他のＥＧＦＲ変異（エクソン２０における小さな挿入又は再生：Ｄ７７０＿Ｎ７７１、ｉｎｓ ＮＰＧ、ｉｎｓ ＳＶＱ、ｉｎｓ Ｇ及びＮ７７１Ｔ）；及び（７）ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＩＧＦ１Ｒ及びＫＤＭ５Ａの損失を含む、ＥＧＦＲの信号ダウンストリームに影響を及ぼす遺伝子病変。

【0048】

様々な実施形態において、癌は肝臓癌（例えば、ＨＣＣ）である。肝臓癌はＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に耐性がないこともある。代替的に、肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対する一次又は二次の耐性を有し得る。被験体は、マイクロＲＮＡが無い状態のＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対するレスポンダになり得る。被験体は、マイクロＲＮＡが無い状態のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対するレスポンダになり得ない。幾つかの実施形態において、被験体は、少なくとも２、４、６、８、１０か月以上続く、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤による以前の処置を受けている。他の実施形態において、被験体は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤に対する１以上のかなりの副作用を経験しており、故に用量の減少を必要とする患者である。

【0049】

様々な実施形態において、肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、中程度、進行している、又は末期であり得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は転移性又は非転移性であり得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は切除可能又は切除不能であり得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、単一の腫瘍、多発性腫瘍、又は、（門脈又は肝静脈の中への）浸潤性増殖パターンを備えた十分に定められていない腫瘍を含み得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、繊維層板型、擬腺状（アデノイド）、多形態性（巨大細胞）、又は明細胞パターンを含み得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、十分に分化された形態、及び、肝細胞に似た腫瘍細胞、小柱の形態、索、及び巣を含み、及び／又は、細胞質中に胆汁色素を含み得る。肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、十分に分化されていない形態を含み得、悪性上皮細胞は、非凝集性（ｄｉｓｃｏｈｅｓｉｖｅ）、多形態性、未分化、及び／又は巨大である。幾つかの実施形態において、肝臓癌（例えばＨＣＣ）は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、硬変症、又は２型糖尿病に関連する。

【0050】

幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の治療上有効な量が減少される。例えば、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の毎週又は毎月の用量は、最大推奨投与量又は最大耐用量に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少される。他の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、マイクロＲＮＡ（又はマイクロＲＮＡ阻害剤）の投与が無い状態で効果的であるために必要とされる用量の下で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の効果的な用量で投与される。例えば、エルロチニブは、１日当たり５０、４０、３０、２５ｍｇ以下の用量で投与され得る。幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のＩＣ_５０は、マイクロＲＮＡの処置（又は、阻害剤が投与される場合のマイクロＲＮＡ阻害剤の処置）が無い状態でＩＣ_５０に対して少なくとも４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、又は１００倍にまで減らされる。ＩＣ_５０は、例えば、実施例に示されるように判定され得る。

【0051】

＜併用化学療法＞
併用化学療法又は多剤療法は、１より多くの薬又は他の治療（例えば、単独療法とは対照的に、単独で得られる任意の治療である）の使用である。本発明に関して本明細書に使用されるように、この用語は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤とマイクロＲＮＡの特異的な組み合わせを使用することを指す。

【0052】

（例えば比率、用量、時間などの）範囲の説明のために本明細書に使用されるように、用語「約」は、変更を包含する、関連する範囲の誤差内にあり、実質的に同じである（例えば、正常な又はガウスの分布に追従する現象について９５％などの、当該技術分野で容認される信頼区間内にある）変形を包含するか、さもなくば、定量化されるものの効果を実質的に変更しない。

【0053】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の投薬の量及び／又はスケジュールは、臨床的に承認された、又は実験的なガイドラインに従い得る。ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤セクションにおける記載に加えて、様々な実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の用量は、ＦＤＡ薬物ラベル、又は、別の機関のラベル／指示書によって処方された用量であり得る。

【0054】

同様に、マイクロＲＮＡの投薬の量及び／又はスケジュールは、臨床的に承認された、又は実験的なガイドラインに従い得る。様々な実施形態において、マイクロＲＮＡの用量は、１日当たり約１０、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、又は２５０ｍｇ／ｍ^２である。

【0055】

様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、１週間（７日）にわたり、１、２、３、４、５、６、又は７日量で被験体に投与される。マイクロＲＮＡは、１４日にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日量で被験体に投与され得る。マイクロＲＮＡは、２１日にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日量で被験体に投与され得る。マイクロＲＮＡは、２８日にわたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８日量で被験体に投与され得る。

【0056】

様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、２週間（合計１４日）；１週間の休暇付きで１週間（合計１４日）；３週間連続（合計２１日）；１週間の休暇付きで２週間（合計２１日）；２週間の休暇付きで１週間（合計２１日）；４週間連続（合計２８日）；１週間の休暇付きで３週間連続（合計２８日）；２週間の休暇付きで２週間（合計２８日）；３週間の休暇付きで１週間（合計２８日）、で投与される。

【0057】

様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、７、１４、２１、又は２８日のサイクルの１日目に投与され；２１又は２８日のサイクルの１及び１５日目に投与され；２１又は２８日のサイクルの１、８、及び１５日目に投与され；又は、２１又は２８日のサイクルの１、２、８、及び１５日目に投与される。マイクロＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、又は８週間ごとに１回投与され得る。

【0058】

臨床医は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤−マイクロＲＮＡ治療の経過を処方することができる。併用療法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２のサイクルの間、投与され得る。

【0059】

ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤−マイクロＲＮＡ治療の経過は、臨床エンドポイントが満たされるまで継続され得る。幾つかの実施形態において、疾患進行又は受け入れがたい毒性が生じるまで、治療が継続される。幾つかの実施形態において、癌の欠如として定められる病理学的な完全寛解（ｐＣＲ）率を達成するまで、治療が継続される。幾つかの実施形態において、癌の部分的又は完全寛解まで、治療が継続される。癌を患う複数の被験体へのマイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の投与は、粗生存率（ＯＳ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）、無病生存率（ＤＦＳ）、反応率（ＲＲ）、クオリティオブライフ（ＱｏＬ）、又はそれらの組み合わせを増加させ得る。

【0060】

様々な実施形態において、処置は、癌腫瘍の大きさ及び／又は数を減少させ；癌腫瘍がその大きさ及び／又は数を増加させるのを妨げ；及び／又は、癌腫瘍が転移するのを妨げる。

【0061】

本発明の方法において、投与は、必ずしも任意の特定の送達システムに限定されず、且つ、限定されないが、非経口（皮下、静脈内、髄内、関節内、筋肉内、又は腹腔内注射を含む）、直腸、局所、経皮、又は経口（例えば、カプセル、懸濁液、又は錠剤で）を含み得る。固体への投与は、単一用量又は繰返しの投与で、及び、様々な生理学的に許容可能な塩の形態の何れかで、及び／又は、医薬組成物の一部として許容可能な医薬担体及／又は添加剤と共に、行われ得る。生理学的に許容可能な塩の形態、及び、標準医薬製剤の技術、投与量、及び賦形剤は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ （ＰＤＲＲ） ２００５， ５９ｔｈ ｅｄ．， Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， ２００４； ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ｅｄｓ． Ｇｅｎｎａｄｏ ｅｔ ａｌ． ２１ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ２００５を参照）。

【0062】

加えて、１匹の動物において達成される効果的な投与量は、当該技術分野で既知の転換比率を使用して、ヒトを含む別の動物における使用のために推測され得る。例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−２４４ （１９６６）、及び、同等な表面積の投与量因子の表２を参照。Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−２４４ （１９６６）、及び、同等な表面積の投与量因子の表２。

【0063】

【表2】

【0064】

様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の前、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤と同時、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の後、又はそれらの組み合わせで投与される。マイクロＲＮＡは静脈内に投与され得る。マイクロＲＮＡは、全身で又は局部的に投与され得る。

【0065】

本発明の併用療法は具体的に、任意の特定の経過又はレジメンに限定されず、且つ、別々に又は他の治療手段（例えば、化学療法又は放射線療法）と共に利用されてもよい。

【0066】

本発明に係る併用療法は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤とマイクロＲＮＡを越えて（ｂｅｙｏｎｄ）付加療法（例えば製薬、放射線など）を含み得る。同様に、本発明はアジュバント療法（例えば、手術と組み合わせた場合）として使用され得る。様々な実施形態において、被験体はまた、外科的切除、経皮的なエタノール又は酢酸の注射、経カテーテル動脈の化学塞栓術、ラジオ波焼灼療法、レーザアブレーション、冷凍切除、焦点式外部ビーム放射線定位的照射（ｆｏｃｕｓｅｄ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｂｅａｍ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、選択的な内部放射線治療、動脈内のヨウ素−１３１−リピドール投与、及び／又は高強度焦点式超音波によって、処置される。

【0067】

マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の組み合わせは、アジュバント、ネオアジュバント、随伴性、同時的、又は姑息的な治療として使用され得る。マイクロＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の組み合わせは、第１線治療、第２線治療、又はクロスオーバー治療として使用され得る。

【0068】

幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の治療上有効な量は、マイクロＲＮＡとの組み合わせを介して減少される。例えば、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤の毎日、毎週、又は毎月の用量は、最大推奨投与量又は最大耐用量に対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少され得る。他の実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤は、マイクロＲＮＡ（又はマイクロＲＮＡ阻害剤）の投与が無い状態で効果的であるために必要とされる用量の下で、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上の効果的な用量で投与される。幾つかの実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤のＩＣ_５０は、マイクロＲＮＡ（又はマイクロＲＮＡ阻害剤）が無い状態でＩＣ_５０に対して少なくとも４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、又は１００倍にまで減らされる。

【0069】

併用療法の更なる記載と実施形態は、以下の実施例のセクションで提供される。

【0070】

以下の実施例に議論され且つ更に示されるように、本発明は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤とマイクロＲＮＡが特に効果的である（例えば、相乗的か、添加剤より多い）組み合わせで投与される、癌（例えば、肺癌又は肝臓癌）を処置するための方法と組成物を提供する。相乗効果及び同義語は当該技術分野で共通して使用される一方、特性は必ずしも定められ且つ定量化されるとは限らない（及び、従って、主張される相乗効果は実際に存在しないこともある）。本発明と下記の実施例に関して、組み合わせ指標（ＣＩ）値は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤とマイクロＲＮＡの様々な組み合わせの効果を定量化するために使用された。

【0071】

様々な実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ薬剤とマイクロＲＮＡの組み合わせは、癌（例えば肺癌又は肝臓癌）においてＣＩ＜１を示す。組み合わせは、癌においてＣＩ＜０．９５、０．９０、０．８５、０．８０、０．７５、０．７０、０．６５、０．６０、０．５５、０．５０、０．４５、０．４０、０．３５、０．３０、又は０．２０を示すことができる。

【0072】

以下の実施例は、本発明の実例となる実施形態を提供する。当業者は、本発明の精神又は範囲を変更することなく実行され得る、多数の改良及び変更を理解する。そのような修飾と変更は本発明の範囲内に包含される。実施例は、任意の方法で本発明を制限しない。

【実施例】

【0073】

＜実施例１：エルロチニブ耐性細胞株の選択＞
Ｅｎｇｅｌｍａｎら（前出）に記載されているプロトコルに従って、エルロチニブの獲得耐性を備えるＮＳＣＬＣ株を作成した。簡単に述べると、エルロチニブ（ＩＣ_{５０ｅｒｌｏ}＝０．０５４μＭ）に対して高感度の親ＨＣＣ８２７細胞を、細胞中のＩＣ９０に相当する濃度でのエルロチニブを含む培地中で増殖できるようになるまで、１０週間にわたってエルロチニブ濃度を増加させながらインキュベートした。選択を経て、個々の細胞クローンから３細胞株（ＨＣＣ８２７^{クローン ５、６、７}）を得た。加えて、我々は、おそらく複数のクローン（ＨＣＣ８２７^{ｒｅｓ ｐｏｏｌ}図１参照）に由来する異種の大量培養物を得た。

【0074】

表３は、ｍｉＲＮＡとＥＧＦＲ−ＴＫＩの組み合わせの効果を評価するために使用される４つのＮＳＣＬＣ細胞のリストを提供する。特定の細胞株を、これらの細胞におけるＥＧＦＲ−ＴＫＩのＩＣ_５０値、発ガン特性、およびｍｉＲＮＡに対する感受性に基づいて選択した。このリストは、エルロチニブに耐性がある細胞株、および感受性である細胞を含む。科学文献に報告されているように、これらの細胞株の各々に対するエルロチニブのＩＣ_５０値を示す。これらの例では、＞１μΜのＩＣ_５０値を有する細胞株は耐性であるとみなされる。

【0075】

【表3】

【0076】

＜実施例２：エルロチニブ耐性を制御し示差的に発現するマイクロＲＮＡ候補の同定＞
すべての４つの細胞株ならびに親ＨＣＣ８２７株をＲＮＡ抽出のために使用し、ｍＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０）およびｍｉＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｓａｎｇｅｒｌ２＿０）アレイ解析に供した。予想外に、比較的少数のｍＲＮＡのみが、抵抗性株と親株との間で異なって発現していた（データは示さず）。照的に、ｍｉＲＮＡの発現レベルは有意に変化した。耐性細胞と親株との間のｍｉＲＮＡ発現の比較は、クローン＃７がＨＣＣ８２７に最も密接に関連する（Ｒ^２＝ ０．９３４７）ことを示し、耐性プールは最も関連していない（Ｒ^２＝ ０．８３０８）株である。これは、プールが複数のクローンから生じたという仮説と一致する。親株と比較した場合、ｍｉＲＮＡの監修なしのクラスタリングは、すべての耐性ＨＣＣ８２７細胞にわたって、１５のアップレギュレートされたｍｉＲＮＡ及び２３のダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡを同定した（図２Ａ）。遺伝子クラスター中にコード化され、ポリシストニックな転写産物として発現するｍｉＲＮＡ、つまりｍｉＲ−１０６Ｂ〜９３〜２５及びｍｉＲ−２４〜２７Ｂ〜２３Ｂはすべて、それぞれアップレギュレート又はダウンレギュレートされていることがわかった。これは、遺伝的メカニズムがエルロチニブ耐性細胞におけるｍｉＲＮＡの発現差異に寄与することを示唆している。示差的に発現するｍｉＲＮＡの多くは、以前に他の化学療法に対する抵抗性と関連付けられており−例えば、エルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞でアップレギュレートされるｍｉＲＮＡは、従来の抵抗性に寄与し、ダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡは、化学療法抵抗性を抑制する。２つのｍｉＲＮＡ（ＬＥＴ−７ｂのｍｉＲ−４８６）は、セツキシマブ、つまり抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体に対する抵抗性に関連付けられてきた。エルロチニブ耐性への関与は、すべてのｍｉＲＮＡについて新規である。これらのｍｉＲＮＡにより抑制されることが予想される遺伝子産物を検索すると、エルロチニブ耐性細胞においてダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡはＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＭＥＴおよびＨＧＦを含む既知のエルロチニブ耐性遺伝子を抑制する傾向が強いことが明らかとなった。定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＭＥＴおよびＨＧＦの両方が、すべてのエルロチニブ耐性細胞株で強く過剰発現されたことを示した。このことは、獲得されたエルロチニブ耐性におけるＨＧＦ／ＭＥＴ軸の役割を示す以前の報告と一致している。ＭＥＴとＨＧＦの過剰発現は、以前に報告されているように遺伝子増幅の結果である可能性があり、またはその代わりに、我々のデータセット（さらなる調査の対象）によって示唆されるように、これらの遺伝子を抑制するｍｉＲＮＡ発現の喪失の結果であるかもしれない。付録Ａは、図２Aの基礎となる定量的なデータを提供する。

【0077】

＜実施例３：エルロチニブとマイクロＲＮＡの組み合わせの効果＞
組み合わせの研究において使用される肺癌細胞株は、エルロチニブに対して耐性の細胞株（Ｈ１２９９、Ｈ４６０、ＨＣＣ８２７、すべて耐性）、または感受性の細胞株（ＨＣＣ８２７親）を含んでいた。組み合わせの主な目的は、エルロチニブの増強された治療効果（ＩＣ_５０の減少）を達成すること、およびエルロチニブの用量及び毒性を低減することであった。組み合わせの働きの評価を、「固定濃度モデル（Ｆｉｘｅｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ）」（Ｆｉｅｂｉｇ、ＨＨ、併用試験）に従って実施した。細胞毒性化合物Ａ（エルロチニブ）を７−８の濃度で、および化合物Ｂ （ｍｉＲＮＡ）を弱い濃度で、試験した。細胞増殖に対する薬物またはｍｉＲＮＡの効果を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて評価した。エルロチニブの単独の及び組み合わせにおけるＩＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて計算した。

【0078】

まず、エルロチニブ単独の、又はｍｉＲＮＡ単独のＩＣ_５０値を、細胞中で測定した。ｍｉＲＮＡは固定の弱い濃度（〜ＩＣ_２５）でリバーストランスフェクトされた。使用されるマイクロＲＮＡの配列を、表１に示した。スクランブル配列を、陰性対照として使用した。その後、細胞を、連続希釈したエルロチニブで処理した。細胞増殖の阻害を、薬物処理後３日で、ＡｌａｒｍａＢｌｕｅアッセイによって分析した。ｍｉＲＮＡと組み合わせたエルロチニブのＩＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて決定した。組み合わせの効果は、用量反応曲線及びＩＣ_５０値の変化を目視検査することによって評価した。エルロチニブ単独についての、または６つの試験されたｍｉＲＮＡそれぞれとの組み合わせのＩＣ_５０の結果を、それぞれ表４に報告する。

【0079】

【表4】

【0080】

＜実施例４：エルロチニブ及びｍｉＲＮＡについてのインビボでの有効性評価＞
インビボでのエルロチニブ／マイクロＲＮＡの組み合わせの効果を試験するために、例えば、安定的にルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する同所性の異種移植片に基づく腫瘍マウスモデルが使用される 。典型的な有効性研究は、グループあたり８匹の動物を含む。エルロチニブ／ｍｉＲＮＡの組み合わせの次に、他の研究グループは、エルロチニブ単独、ｍｉＲＮＡ単独、並びにエルロチニブ／ｍｉＲ−ＮＣ及び無処置の対照が含まれている。肺の腫瘍病変がＩＶＩＳイメージングを通じて明らかになると、ｍｉＲＮＡ処置を開始する。ｍｉＲＮＡを、ナノ粒子中に組み合わせ、適度に有効な用量で静脈内に一日おきに投与して、エルロチニブ増強の検出（１−１０ｍｇ／ｋｇ）を可能にした。エルロチニブを、マウスにおいて良好な耐用性が示された／日の用量で、胃管栄養により毎日投与される。治療期間は、２−４週間かまたは対照マウスが瀕死になるか、どちらかが最初に来るまでである。動物は、毒性の徴候を検出するために、厳密にモニターされる。屠殺に際し、肺および肺腫瘍組織を収集し、組織病理学的分析（Ｈ＆Ｅ；Ｋｉ６７およびＣＡＳＰ３ のＩＨＣ、正当化される場合）に供した。ＲＮＡを、正常肺、肺腫瘍、脾臓、および全血から抽出して、定量ＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡ模倣体の濃度を測定する。さらに、腫瘍サンプルは、直接／検証のｍｉＲＮＡの標的のノックダウンについて、試験する（ＱＲＴ−ＰＣＲ）ために使用される。主要器官への転移のレベルは、Ｈ＆Ｅ及びヒト特異的なＩＨＣ染色（ＳＴＥＭ１２１、ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ社）のいずれかによって、評価することができる。

【0081】

エルロチニブ／ ｍｉＲＮＡの組み合わせは、腫瘍組織中の既知のｍｉＲＮＡ標的の同時抑制により、エルロチニブ単独よりも優れたインビボでの有効性を示すことが期待される。また、エルロチニブ／ｍｉＲＮＡの組み合わせで処置した動物は、転移を発達させ、および改善された生存を示す可能性が低いことも予想される。

【0082】

＜実施例５：ＥＧＦＲ−ＴＫＩおよびｍｉｃｒｏＲＮＡについては生体外の効果評価＞

【0083】

導入
本実施例は、プライマリの及び獲得されたエルロチニブ耐性を備えるＮＳＣＬＣ細胞において、ｍｉＲ−３４ａとエルロチニブの関係性、及び組み合わせの治療活性を調べる。薬物の組み合わせをエルロチニブに対して不応性であることが知られている癌の種類である、肝細胞癌細胞（ＨＣＣ）のパネルにおいて試験した。複数の分析方法を使用して、癌細胞増殖の薬物誘導性抑制を決定して、相加効果、拮抗作用又は相乗効果を明らかにする。データは、試験した全ての癌細胞におけるエルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａ模倣体との間で強力な相乗効果を示す。相乗効果は、用量レベルおよび薬物の比率の範囲にわたって観察され、エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ＡについてのＩＣ_５０用量の要件を、それぞれ４６倍および１３倍まで減少させる。最大の相乗効果は、単一薬物単独でによって誘導され、それ故臨床的に関連があるものよりも高レベルの癌細胞の阻害のを提供する投与量において検出される。。データは、マイクロＲＮＡベースの治療法と組み合わせて使用される場合、以前にＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療について研究されていないＮＳＣＬＣおよびその他の癌の大部分は、薬物に対する感受性であると判明する。

【0084】

材料および法
細胞株：ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈ２２６を、ＨＣＣ８２７親およびＨＣＣ８２７^ｒｅｓは、マイクロＲＮＡおよびＥＧＦＲ−ＴＫＩの組合せの効果を評価するために使用した。特定の細胞株を、これらの細胞におけるＥＧＦＲ−ＴＫＩの高いＩＣ_５０値、それらの発癌特性、およびｍｉＲＮＡに対する感受性に基づいて選択した。これら細胞株は、いずれかの耐性（Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、Ｈ２２６）または感受性（ＨＣＣ８２７）細胞に耐性である。さらに、獲得耐性を有する細胞株を、１０週間にわたってエルロチニブの増加した選択圧を適用し、ＩＣ１０の等量で開始し、ＩＣ９０等量で終わることによって作成した。 細胞増殖はＩＣ９０選択下で通常の二倍の速度を示したので、耐性細胞を低希釈（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ）または高希釈で播種して、純粋に近い耐性クローン（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ−＃５、６および７）を作成した。肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞における効果を研究するために、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、Ｃ３ＡおよびＨｅｐＧ２を使用した。 Ｈｕｈ７細胞をＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから取得した。米国培養菌保存施設（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から他のすべての親細胞を購入し、サプライヤーの指示に従って培養した。

【0085】

ＲＮＡ単離およびｑＲＴ−ＰＣＲ：細胞ペレットからの全ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってｍｉｒＶＡＮＡ ＰＡＲＩＳ ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて単離した。ＲＮＡ濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）の上の吸光度測定（Ａ２６０）により決定された。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの定量化に関しては、我々が市販で入手可能な試薬を使用した。下記条件の下でＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換した：４℃１５分；１６℃３０分；４２℃３０分；８５℃５分。ｃＤＮＡ合成に続いて、以下のサイクリング条件の下でＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ ＳＤＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）上の２μＬのｃＤＮＡでｑＰＣＲを実行した：９５℃１分間（最初の変性）；その後、９５℃５秒間、６０℃３０秒間の５０サイクル。ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＡｓｓａｙおよびＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙを、すべての肺および肝細胞株中のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現解析のために使用した。ｍｉＲＮＡ発現について、メーカーの試薬への付加物は、ｍｉＲＮＡアッセイの勾配、直線性、および感度を向上させるために、ＤＭＳＯ（６％の最終濃度）および塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ；ＲＴおよびＰＣＲの両方において５０ ｍＭの終濃度）を含む。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方の発現レベルを、ＨＣＣ８２７親細胞株に対する相対定量によって決定した。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ標的の生のＣｔ値を、選択されたハウスキーピング遺伝子に対して標準化してデルタＣｔ値を作成し、線形空間に変換してパーセンテージ発現として表した。

【0086】

ｍｉＲＮＡおよびＥＧＦＲ−ＴＫＩによる処理：エルロチニブ塩酸塩は、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ）から購入した。 合成のｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲのＮＣ模倣体は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）によって製造された。各薬物単独でのＩＣ_５０値を決定するために、ウェル当たり２０００−３０００細胞を９６ウェルプレートフォーマットに播種し、エルロチニブまたはｍｉＲ−３４Ａのいずれかで次のように処理した。（ｉ）ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲＮＡｉＭａｘ ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、階段希釈（０．０３−３０ ｎＭ）中に３回繰り返してｍｉＲ−３４ａ模倣体をリバーストランスフェクトした。対照として、細胞はまた、ＲＮＡｉＭａｘ単独で、又は陰性対照のｍｉＲＮＡ模倣体（ｍｉＲ−ＮＣ）と組み合わせてトランスフェクトされた。細胞は、肺または肝臓癌細胞の細胞増殖をそれぞれ判定するために、トランスフェクションの４日または６日後にＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。増殖データはモックでトランスフェクトされた細胞に対して標準化した。（ｉｉ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０及び２０ｍＭストック溶液として調製されたエルロチニブを、一日０．１から１００μＭ．の範囲の終濃度で播種した後、細胞に添加した。溶媒のみ（Ｈ２２６およびＨＣＣ８２７中において最終０．５％ＤＭＳＯ、他のすべての細胞株において最終１％ＤＭＳＯ）を、対照として別々のウェル中に加えた。三日後、細胞増殖をアラマーブルーで測定し、溶媒対照に標準化した。

【0087】

退行趨勢線＆ＩＣ_５０値：線形および非線形回帰傾向線は、それぞれ、ＣｏｍｐｕＳｙｎ （ＣｏｍｂｏＳｙｎ， Ｉｎｃ， Ｐａｒａｍｕｓ， ＮＪ）およびＧｒａｐｈｐａｄ （Ｐｒｉｓｍ） ソフトウェアを使用して作成した。両方のソフトウェアプログラムは類似の値を生成したが、非線形傾向線は、実際のデータのためのより良いフィットを提供し、ＩＣ_５０、ＩＣ_２５および他の薬物濃度（ＩＣｘ社）を計算するためにされた。

【0088】

「固定濃度」法で決定された組合せの効果
「固定濃度」法を、獲得された抵抗性を備える細胞株（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ）について使用した。 細胞を、上記のような固定の弱い濃度（〜ＩＣ_２５）にて、ｍｉＲ−３４ａでリバーストランスフェクトした。翌日、階段希釈（０．０１−１００μＭ）のエルロチニブで細胞を処理した。細胞増殖の阻害を、３日後にＡｌａｒｍａＢｌｕｅによって分析した。単一薬物の効果を測定するために、および潜在的に、脂質担体またはビヒクルが寄与する効果を補正するために、 細胞はまた、モックトランスフェクションと組み合わせて、溶媒（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓにおいて０．５％ＤＭＳＯ、他のすべての細胞株において１％ＤＭＳＯ）またはエルロチニブとｍｉＲ−３４Ａの組合せで処理した。すべての増殖データは、溶媒（ＤＭＳＯ）で処理したモックトランスフェクト細胞に対して標準化された。組み合わせの効果は、ｍｉＲ−３４ａの存在下または非存在下での、エルロチニブ用量反応曲線の目視検査およびＩＣ_５０値の推移によって評価した（Ｇｒａｐｈｐａｄを使用してグラフ化及び計算した）。

【0089】

「固定の割合」法で決定された組合せの効果
細胞は、ｍｉＲ３４ａの７濃度と組み合わせたエルロチニブの７濃度のそれぞれで処理された。各薬物は、ＩＣ_５０にほぼ等しい濃度、およびその２．５倍（ＮＳＣＬＣ）または２倍（ＨＣＣ）増加した濃度で、上記または下記にて（ａｂｏｖｅ ｏｒ ｂｅｌｏｗ）使用される。このマトリックスから、１３の異なる比率を表す、合計４９の異なる組み合わせが得られた。各薬物はまたこれらの濃度で単独で使用された。ｍｉＲ−３４ａおよびエルロチニブを上に記載されるように加えて、細胞増殖をＡｌａｍａｒＢｌｕｅにより判定した。各データポイントを３回繰り返して行った。

【0090】

組み合わせインデックス（ＣＩ）値の計算
ロエベの加法モデルに基づくＣＩ値は、薬物−薬物相互作用の性質を評価するために決定され、前記相互作用は様々な薬物−薬物濃度および効果のレベルについて相加性（ＣＩ＝１）、拮抗的（ＣＩ＞１）、または相乗的（ＣＩ＜１）であり得る（Ｆａ、影響さらたフラクション；癌細胞増殖の阻害）。ＣＩ値を計算し比較するために、線形回帰および非線形の回帰傾向線の両方を使用した。ＣＩ値に基づく線形回帰分析は、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア （ＣｏｍｂｏＳｙｎ Ｉｎｃ．， Ｐａｒａｍｕｓ， ＮＪ） を用いてｃｈｏｕらの方法に従って行われ、それによって双曲線、双曲線とシグモイド用量効果曲線は線形形式に変換された（Ｃｈｏｕ ＴＣ （２０１０） Ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０： ４４０−６， ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ａｌｓｏ ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ＣｏｍｂｏＳｙｎ， Ｉｎｃ．， ｗｗｗ．ｃｏｍｂｏｓｙｎ．ｃｏｍ）。非線形回帰傾向線に由来するＣＩ値は、式１を用いて計算され、式中ＣＡ，ｘおよびＣＢ，ｘは効果 Ｘ （Ｆａ）を生成するための組合せ中の薬物Ａおよび薬物Ｂの濃度である。ＩＣ_ｘ，ＡおよびＩＣ_ｘ，Ｂは、同じ効果を生成するための単一の薬物として用いられる薬物Ａおよび薬物Ｂの濃度である。

【0091】

【数1】

【0092】

薬物濃度を決定するために式１で必要なＣＩ値（ＣＡ_，ｘ，Ｃ_Ｂ，ｘ，ＩＣ_ｘ，ＡおよびＩＣｘ_，Ｂ）は、線形回帰傾向線に由来するＨｉｌｌの式（式２）、ＩＣ_５０、およびＨｉｌｌ勾配（ｎ）を用いて算出する（Ｇｒａｐｈｐａｄ）。

【0093】

【数2】

【0094】

アイソボログラム
エルロチニブおよびｍｉＲ−３４ａの用量依存性の相互作用を記述するために、癌細胞増殖の５０％および８０％阻害のレベルに影響を及ぼすアイソボログラムを作成する。単一剤−単独または組み合わせ−は通常、５０％の癌細胞の阻害に達するので、５０％のアイソボログラムは単一の使用対組み合わせの実際の比較を提供した。８０％のアイソボログラムは、腫瘍学における実用的な意味を有する高い効果レベルでの組み合わせの有用性を示すために使用された。これらの各々において、相加性は、単一の使用（ＩＣ_５０、ＩＣ_８０）から、組み合わせの各薬物に関する用量要件を推定することによって決定された。相加性の線より上または下のデータポイントは、それぞれ拮抗作用または相乗効果を示す。 ４９の全組み合わせについて、組み合わせで必要な薬物の濃度は、同じ効果に到達するための単一剤のみのものと比較され、倍率変化（用量減少指数、ＤＲＩ）として表された。

【0095】

曲線推移解析
用量反応曲線の直接の比較を可能にするために、および相乗的な薬物 − 薬物相互作用を同定するために、各薬物単独の、又は組み合わせの非線形回帰傾向線（ＩＣ_５０：ＩＣ_５０の比率又は示される他の比率）は、それ自身のＩＣ_５０値に対して標準化され、ＩＣ_５０等量（ＩＣ_５０ ｅｑ）と呼ばれる。組み合わせのＩＣ_５０等量は、式３を用いて計算され、Ｚｈａｏ Ｌ， Ａｕ ＪＬ Ｗｉｅｎｔｊｅｓ ＭＧ （２０１０） Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ （Ｅｌｉｔｅ Ｅｄ） ２： ２４１−９．中に記載されている。単一剤および組合せのデータは、単一の薬物に対して任意の所定の効果を達成するのに必要な低い薬物濃度を示すために、同じダイアグラム中でグラフ化された。これは、用量反応曲線の左推移を示し、相上Ｉｄを示す。

【0096】

【数3】

【0097】

統計的分析
統計分析は、Ｅｘｃｅｌ（マイクロソフト）、ＣｏｍｐｕＳｙｎ及びＧｒａｐｈｐａｄ ソフトウェアを用いて行った。平均および標準偏差を、三回の実験から計算した。線形および非線形回帰傾向線のフィットの良さは、Ｒ（ＣｏｍｐｕＳｙｎ）とＲ２（Ｇｒａｐｈｐａｄ）の値でそれぞれ記述され、薬物非感受性の制限により、Ｈ２２６およびＨｅｐＧ２を除くほとんどの細胞株について０．９＞であった。

【0098】

結果
ｍｉＲ−３４ａは、非小細胞肺癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を回復する。

【0099】

獲得耐性を備える細胞の薬剤耐性を研究するために、我々は、活性化型ＥＧＦＲ変異体（アミノ酸７４５−７５０の欠失をもたらすエクソン１９の欠失）を発現するＨＣＣ８２７細胞を使用した。ＨＣＣ８２７は０．０２２μＭ（図４Ａ）のＩＣ_５０値でエルロチニブに対し高い感受性を示す。親細胞株のＩＣ９０に同等の濃度で培養物が増殖抑制の徴候を示さなくなるまで、１０週間にわたって増加するエルロチニブ濃度に対して親ＨＣＣ８２７細胞を曝露することによって、エルロチニブ耐性の細胞株を発達させた。このプロセスの間に、個々の細胞クローン（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ−＃５、＃６、＃７）並びに耐性細胞（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ）のプールを増殖させた。全ＲＮＡを単離し、ｍｉＲ−３４ファミリーメンバーおよび抵抗性を誘導することが知られている遺伝子のレベルを定量的ＰＣＲにより調べた。エルロチニブに耐性のＨＣＣ８２７細胞は、おそらくＥＧＦＲシグナルをバイパスするように機能する、ＭＥＴ及びそのリガンドＨＧＦのｍＲＮＡレベルの増加を示した（図８Ａ−Ｃ）。対照的に、ＡＸＬ、ＧＡＳ６、ＫＲＡＳ、ＦＧＦＲ１、ＥＲＢＢ３、ＰＩＫ３ＣＡおよびＥＧＦＲ自体など、抵抗性に関連する他の遺伝子の発現レベルは上昇しなかった。ｍｉＲ−３４ｂ／ｃファミリーメンバーは、いくつかの耐性ＨＣＣ８２７細胞中で減少した（図８Ａ−Ｃ）。興味深いことに、ｍｉＲ−３４ａエルロチニブ耐性ＨＣＣ８２７細胞では減少せず、このことは、ＭＥＴ遺伝子の増幅によってｍｉＲ−３４が独立して起こり得る、これらの細胞中の耐性の開始において、ｍｉＲ−３４ａが因果的役割を果たしてはいないことを示唆している。

【0100】

ＭＥＴとＡＸＬ両方がｍｉＲ−３４によって直接抑制され、ＡＸＬの阻害がエルロチニブ耐性と拮抗することができるので、合成のｍｉＲ−３４模倣体の導入は、エルロチニブ感受性を回復し得る。この可能性を探るために、ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ細胞を、固定の弱い濃度（０．３ ｎＭ）で使用されるｍｉＲ−３４ａの非存在下または存在下のどちらかで、０．０３〜１００μＭの範囲で増加するエルロチニブ濃度に暴露した。エルロチニブの効果は、ｍｉＲ−３４Ａと組み合わせたエルロチニブがエルロチニブ単独に対して低いＩＣ_５０値を生成するように、濃度依存性であることが予想された。図４Ｃに示されるように、エルロチニブはＨＣＣ８２７^ｒｅｓ細胞（ＩＣ ５０＝２５．２μＭ）中ではさほど強力ではなかった。しかし、ｍｉＲ−３４Ａと組み合わせて使用される場合、 エルロチニブのＩＣ_５０値は０．０９４μＭまで減少した。この結果は、ｍｉＲ−３４ａの少量の添加が、親ＨＣＣ８２７細胞のものと同様のエルロチニブ感受性を回復させ得ることを示している。 負の陰性対照のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−ＮＣ）の添加はエルロチニブの効力を向上させなかったので、効果はｍｉＲ−３４Ａ配列に特異的であった（図４Ｃ）。したがって、ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ細胞において生成されたデータは、ｍｉＲ−３４ａがエルロチニブの獲得耐性を備える癌細胞を感作させ得ることを示している。

【0101】

ｍｉＲＮＡが一次性の耐性機構に対抗できるかどうかを判定するために、我々はＮＲＡＳとＴＰ５３遺伝子の変異を有するＨ１２９９細胞を使用した。 ここれらの細胞において、エルロチニブは１１．０μＭのＩＣ_５０値を生成しました（図４Ｄ）。０．３ ｎＭでのｍｉＲ−３４Ａとの組み合わせで、エルロチニブ用量反応曲線はｘ軸に沿って推移し、これは約４倍低いＩＣ_５０値（３．０μＭ）を示した。 この結果は、エルロチニブの効力を変化させなかったｍｉＲ−ＮＣとは対照的であり、ｍｉＲ−３４ａが獲得抵抗ならびに一次性の抵抗の両方を備える非小細胞肺癌細胞を感作させ得ることを示唆している。

【0102】

ｍｉＲ−３４ａおよびエルロチニブは、非小細胞肺癌細胞において協働する。

【0103】

エルロチニブのＩＣ_５０値の推移は、固定のｍｉＲ−３４ａ濃度がエルロチニブの有効性を向上させるかどうか示した。 しかし、「固定された濃度モデル」としても知られるこのモデルは、相乗効果を評価することはできない。 両方の薬物が互いに増強できるかどうかを調べるために、我々は、加法のＬｏｅｗｅのコンセプトに基づく「固定比率−モデル」を採用した （Ｃｈｏｕ ＴＣ （２０１０） Ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０： ４４０−６． Ｔａｌｌａｒｉｄａ ＲＪ （２００１） Ｄｒｕｇ ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ： ｉｔｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２９８： ８６５−７２． Ｔａｌｌａｒｉｄａ ＲＪ （２００６） Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｉｓｏｂｏｌｏｇｒａｍｓ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１９： １−７．）。このモデルでは、組合せ指数（ＣＩ）値は、各用量反応曲線（薬物単独で、または組み合わせで）の傾斜およびＩＣ_５０値に基づいて計算され、薬物−薬物相互作用は相加性（ＣＩ＝１）、拮抗性（ＣＩ＞１）、または相乗性（ＣＩ＜１）であるかどうかを定義する。ＣＩ値の精度が用量反応曲線傾向線のフィットに依存するので、ＣＩ値は、線形または非線形回帰傾向線（材料および方法を参照）の２つの方法 のいずれかを使用して、により算出した。４つのエルロチニブ耐性の細胞株を使用し、それらの全ては遺伝的構成が異なっていた：Ａ５４９（ＫＲＡＳ、ＳＴＫ１１、ＣＤＫＮ２Ａの中の変異）、Ｈ４６０（ＫＲＡＳ、ＳＴＫ１１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＩＫ３ＣＡの中の変異）、Ｈ１２９９（ＮＲＡＳ、ＴＰ５３の中の変異）およびＨ２２６（ＣＤＫＮ２Ａの中の変異）［３７］。定量ＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの細胞において、エルロチニブ感受性のＨＣＣ８２７細胞と比較して、ＡＸＬ、ＧＡＳ６およびＦＧＦＲ１のｍＲＮＡレベルの顕著な増加を示し、エルロチニブ耐性についての説明をさらに提供した（図８Ａ−Ｃ）。ｍｉＲ−３４のレベルはＨ１２９９およびＨ４６０細胞で有意に減少した。 最初のステップにおいて、エルロチニブ又はｍｉＲ３４ａを連続希釈で細胞に添加さして、各薬物単独のＩＣ_５０値を決定した。エルロチニブについては、これらは、４．２および＞５０μＭの範囲であった（図９Ａ−Ｂ）。ｍｉＲ３４ａのＩＣ_５０値は０．４乃至１５．６ｎＭの範囲であった。どちらの薬物も１００％の癌細胞を阻害することできず、いずれの薬物の最大活性も７５％を超えなかった。エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａはＨ２２６細胞において最も有効でなく、用量−応答曲線の外挿の結果として理論上のＩＣ_５０値を得た。第２のステップでは、各薬物を、それ自身のおおよそのＩＣ_５０値に等しく、ならびにそれらの上記および下記（固定比率）の倍数での濃度で、混合した。対照として、各薬物単独をこれらの濃度で単独で使用した。両方の線形および非線形回帰モデルは、試験されたすべての細胞株において１．０をよく下回るＣＩ値を生じ、強い相乗効果を示した（図５Ａ）。我々が適切であると考えたＣＩ値は０．６を下回るものである。ほとんどの細胞系統において、相乗効果は、より高い用量レベルおよび癌細胞抑制のより高い大きさで、観察された。薬物の組み合わせの実用化には最大の癌細胞阻害（７５％阻害またはそれ以上）での相乗効果が求められるので、これは重要ある。両方のモデルが同様の結果を生成したが、一般的には、非線形回帰傾向線は、実際のデータについてより良いフィットを提供した。

【0104】

次に我々は、アイソボログラムを生成し、相乗効果のための読み出しとして、５０％および８０％の癌細胞の阻害における各薬物の用量要件を決定した。薬の効能が頻繁にそのＩＣ_５０で評価され、我々の研究では各薬物単独が５０％のほとんどの癌細胞を阻害することが可能であって、それにより各薬物単独と組み合わせとの比較が実際のデータの範囲内で可能となったので、５０％の効果のレベルが選択された。腫瘍学の適用のための高阻害活性で相乗効果を示すことが重要であるため、８０％の効果のレベルが選択された。８０％の阻害を達成するような各薬物単独の濃度は、用量−反応曲線の外挿に基づいており、 自然の中では理論的であるが、ｍｉＲ−３４Ａ−エルロチニブの組合せは、容易に８０％阻害以上を達成し、実際のデータの範囲内である。二つの薬物は、Ｈ２２６細胞中ではあまり有効はなかったので、３０％および５０％の阻害でのアイソボログラムが、Ｈ２２６データ用に作成された。図５Ｂに示されるように、組み合わせのイソボール（ｉｓｏｂｏｌｅ）は、すべての細胞株について相乗的イソロ−ブをよく下回り、効果レベルは強い相乗効果を示した。エルロチニブ用量の要件は、５０％阻害を達成するために、ほとんどの細胞株において２μＭまたはそれ以下にまで減少し。４から４６倍だけ投与量を減少させた。同様に、ｍｉＲ−３４ａの必要な濃度も、ｍｉＲ−３４ａ単独に比べて、組み合わせにおいて実質的に少なく、７から１３倍だけその量を減少させた。減少指標（ＤＲＩ）とも呼ばれるこの用量レベルの減少は、８０％阻害で著しく明白であり、用量の要件は２８倍（エルロチニブ）および３３倍（ｍｉＲ−３４ａ）まで減少したれる

【0105】

第三に、我々は曲線推移解析を行い、それにより各薬物の濃度がそれ自身のＩＣ_５０値に対して正規化された（Ｚｈａｏ Ｌ， Ａｕ ＪＬ Ｗｉｅｎｔｊｅｓ ＭＧ （２０１０） Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ （Ｅｌｉｔｅ Ｅｄ） ２： ２４１−９．）。この薬物濃度のＩＣ_５０当量（ＩＣ_５０ ｅｑ）への変換により、単一の薬物および組み合わせから、各用量反応曲線を直接比較することが可能となる。傾向線が生成され、０から１００％の阻害の効果レベルに及ぶ。趨勢線の傾斜は薬物潜在能力を示し、実際のデータポイントから最大の活性をｇｕａｇｅｄすることができる。組み合わせのＩＣ_５０当量が単一剤Ｉｄと比較して任意の効果を達成するには低い場合、相乗効果が同定される。これは、組み合わせ趨勢線の左の変更で視覚的に示される。図８Ａ−Ｃに見られるように、組相乗効果を示す単一剤から十分に分離されている。Ｈ４６０およびＨ２２６細胞において、組み合わせのＩＣ_５０当量は、単一剤のものと比較して、低い効果レベル（０−２５％）でより大きくなり、３０％以上の効果レベルでより低くなっている。この観察は、これらの細胞における２５％を下回る阻害での拮抗作用と、２５％を上回る阻害での相乗効果を示す、ＣＩプロットからのデータと一致している（図４Ａ）。従って、分析は、癌細胞阻害の高いレベルを誘導する薬物濃度について相乗効果を明らかにする。組み合わせの利点は、抑制の実際のレベルが、組み合わせについて単一剤に対して大きく− 単一の薬物の最大活性が７５％よりも大きくなく、組み合わせて使用した場合９０％を超えて拡張され得る、という事実によってさらに明らかにされる。

【0106】

エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの様々な割合は、相乗的に協働する。

【0107】

我々の分析では、エルロチニブとｍｉＲ−３４は、２つの薬物がそれらのＩＣ_５０値に由来する比率で組み合わされる場合に協同することを示唆している。薬物 − 薬物相互作用が相対的な量に応じて変化し得るので、我々は、エルロチニブを０．４１乃至１００μＭの濃度で、ｍｉＲ−３４ａを０．１２乃至３０ｎＭの濃度で組み合わせることにより、複数のエルロチニブ−ｍｉＲ−３４Ａの比率の影響を検討した。薬物の用量は、２．５倍増加し、各薬物はまた対照として単独で使用された。このマトリックスから、１３の異なる薬物の比を表す４９の薬物の組み合わせが得た（図６Ａ）。癌細胞の阻害のレベル、ＣＩおよびＤＲＩ値は、各組み合わせについて同定され、ＣＩプロット、アイソボログラムおよび曲線推移図にグラフ化された。本実施例で我々は、ｍｉＲ−３４ａとエルロチニブがＩＣ_５０：ＩＣ_５０の比（モル比１：３３３３）および次のモルベースの比（１：５３３、１：１３３３、１：８３３３および１：２０８３３３）で加えられる組み合わせに焦点を当てた。

【0108】

算出されたＣＩ値は、これらの比率の全てで組み合わされるエルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａが強い相乗効果を提供すると予測している（図６Ｂ）。７５％阻害よりも大きな効果レベルにて、ＣＩ値は０．２未満であった。より多くの量のエルロチニブを含む比率は、−７５％未満の効果レベルで低い相乗効果を提供し、７５％を上回る阻害効果レベルでわずかに優れていた。同様に、アイソボログラムは、様々なエルロチニブ−ｍｉＲ−３４Ａの比率について、強力な相乗効果を示している（図６Ｃ）。実際のデータ点は、単一剤として用いる場合、−８０％の癌細胞の抑制を誘導するために３０ ｎＭのｍｉＲ−３４Ａ又は１００μΜのエルロチニブが必要とされることを示している。 対照的に、組み合わせにおいて必要とされるエルロチニブの用量レベルは、ｍｉＲ−３４ａの量が増加するにつれて実質的に減少した。例えば、１２ｎＭのｍｉＲ−３４ａが使用される場合、２．５６μΜのエルロチニブは単に−８０％の阻害を誘導するのに必要とされ、これにより、−４０倍だけエルロチニブの用量の要件を減少させる。これらの比率の相乗効果に関するさらなる証拠は、曲線推移解析から来ており、該解析は、単一剤単独のＩＣ_５０値と比較してはるかに低い、組み合わせのＩＣ_５０当量を明らかにする（図６Ｄ）。ＩＣｓｏ ｅｑデータは、様々な比率間での相乗効果の用量依存度を示すＣＩデータと相関しており： 低い比率は低効果レベルで低い相乗効果を示し、これは癌細胞の阻害の高レベルでは反転する。

【0109】

４９の組合せの完全な範囲はＨ１２９９、Ｈ４６０およびＨ２２６細胞においても試験され、Ａ５４９細胞で得られた結果を確認た。（図１０Ａ−Ｄ）複数の比率は良好な相乗効果を提供し、より高い効力を有するものがより高い薬物濃度のものにクラスター化された。これらの中では、我々のカットオフを満たし、＞７５％の癌細胞の抑制を生成し、各薬物についてＣＩ＜０．６およびＤＲＩ＞２であった。

【0110】

エルロチニブおよびｍｉＲ−３４ａは、肝細胞癌の細胞において相乗的に同時に協働する。

【0111】

エルロチニブ及びｍｉＲ−３４ａの協働の活性について他の癌の適応症において有用性があるかどうかを調べるために、我々は、肝細胞癌の細胞モデルにおいてこの組み合わせを調査した。エルロチニブが単一剤としての進行型の肝臓の患者で適度に有効であり、ソラフェニブとの組み合わせにおいて全生存期間および増悪までの時間を延長するのに失敗したため、肝臓癌を試験プラットフォームとして選んだ。（Ｐｈｉｌｉｐ ＰＡ， Ｍａｈｏｎｅｙ ＭＲ， Ａｌｌｍｅｒ Ｃ， Ｔｈｏｍａｓ Ｊ， Ｐｉｔｏｔ ＨＣ， ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ （ＯＳＩ−７７４） ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３： ６６５７−６３． Ｔｈｏｍａｓ ＭＢ， Ｃｈａｄｈａ Ｒ， Ｇｌｏｖｅｒ Ｋ， Ｗａｎｇ Ｘ， Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｐｈａｓｅ ２ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｃａｎｃｅｒ １１０： １０５９−６７． Ｚｈｕ ＡＸ， Ｒｏｓｍｏｒｄｕｃ Ｏ， Ｅｖａｎｓ Ｊ， Ｒｏｓｓ Ｐ， Ｓａｎｔｏｒｏ Ａ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） ＳＥＡＲＣＨ： Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ， ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｐｌｕｓ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ （ＨＣＣ）． ３７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２８−Ｏｃｔｏｂｅｒ ２ （ａｂｓｔｒ ９１７））．

【0112】

さらに、現在臨床試験中のＭＲＸ３４、ｍｉＲ−３４ａのリポソームは、前臨床動物実験で効果的に肝臓腫瘍を除去し、したがってエルロチニブとの組み合わせで魅力的な薬物であり得る。使用された細胞モデルは、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｃ３Ａ、ＨｅｐＧ２、およびＨｕｈ７を含み、そのうちのいくつかは、エルロチニブ感受性の肺癌株と比較して、エルロチニブ耐性遺伝子ＡＸＬ、ＨＧＦ、ＦＧＦＲ１、およびＥＲＢＢ３のアップレギュレーションを示す（図１１）。まとめると、ｍｉＲ−３４ファミリーメンバーのレベルは、肝臓癌細胞において低いか又は検出不能であった。我々の予想と一致して、エルロチニブのＩＣ_５０値は、これらの４つの細胞株で、２５μＭ以上であった（図１２Ａ−Ｂ）。ｍｉＲ−３４ａのＩＣ_５０値は、０．３乃至２．３ ｎＭの範囲であって、ゆえに、肺癌細胞のそれと同様であった。これらの値は、ＩＣ_５０：ＩＣ_５０の固定比率でエルロチニブとｍｉＲ−３４ａとを組み合わせるために、およびＣＩ、イソボール、及びＩＣ_５０ｅｑの値を生成するために、ガイドとして使用される（図７）。さらに、各組み合わせは、複数の比率にわたって組み合わせの効果を評価するために、異なる濃度のマトリックスで試験された（図１３Ａ−Ｄ）。我々のデータは、試験した全ての細胞株においてエルロチニブとｍｉＲ−３４ａとの間の強力な相乗効果を予測する。相乗効果は癌細胞の阻害の高レベルで観察され、従って、活性の望ましい範囲内で生じた（図７Ａ）。この結果は、より高い用量および効果レベルでの相乗効果を示す、ＩＣ_５０ｅｑの曲線推移解析によって確認された。分析はまた、組み合わせの最大の阻害活性が、単一剤のものと比較して実質的に拡大されることを示している（図７Ｃ）。 ５０％より大きな阻害、例えば８０％を誘導するためにｍｉＲ３４ａで使用される場合、アイソボログラムは、エルロチニブ用量の明確な減少を示す（図７Ｂ）。組み合わせにおいて、エルロチニブは、５０％の癌細胞を阻害するために、２μＭという低濃度で使用され得、それによって、その単独での使用（ＨｅｐＧを参照）と比較して７５倍投与量を低下させる。相乗効果は特定の比率に限定されないが、試験されたほとんどの比率にわたって明らかである （図１３Ａ−Ｄ）。したがって、データは、肺癌細胞において生成されたものと類似しており、エルロチニブ単独では不十分な癌におけるエルロチニブｍｉＲ−３４ａの組み合わせに関して、増強された有効性を予測する。

【0113】

議論
成果は薬物の比率、薬物濃度および所望の効力に依存するので、薬物−薬物相互作用の正確な評価は複雑である（Ｃｈｏｕ ＴＣ （２０１０） Ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｅｒｇｙ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０： ４４０−６）。ｍｉＲ−３４ａ模倣体とエルロチニブとの間の薬理学的関係を調べるために、我々は複数の分析アプローチを使用して、薬物の強化を明らかにし（「固定濃度」モデル）、相加効果、拮抗作用、および相乗効果を区別した（「固定比率」モデル）。我々は、線形または非線形データ回帰に由来する、ＣＩ値、アイソボログラムおよびＩＣ_５０当量を調べた。ｍｉＲ−３４ａが、一次性又は二次性／獲得耐性に関連するかどうかについて試験された全ての癌細胞におけるエルロチニブに対する感受性を増強する、ということを我々のデータは示す。もっともらしい説明は、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡが多数の癌経路を阻害するという事実によって提供される。この仮説を支持して、エルロチニブ耐性に特異的にリンクされる遺伝子産物であるＡＸＬおよびＭＥＴは、ｍｉＲ−３４Ａによって直接抑制される（Ｋａｌｌｅｒ Ｍ， Ｌｉｆｆｅｒｓ ＳＴ， Ｏｅｌｊｅｋｌａｕｓ Ｓ， Ｋｕｈｌｍａｎｎ Ｋ， Ｒｏｈ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ−３４ａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｕｌｓｅｄ ＳＩＬＡＣ ａｎｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １０： Ｍ１１１ ０１０４６２． Ｍｕｄｄｕｌｕｒｕ Ｇ， Ｃｅｐｐｉ Ｐ， Ｋｕｍａｒｓｗａｍｙ Ｒ， Ｓｃａｇｌｉｏｔｔｉ ＧＶ， Ｐａｐｏｔｔｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｘｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｉＲ−３４ａ ａｎｄ ｍｉＲ−１９９ａ／ｂ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３０： ２８８８−９９． Ｈｅ Ｌ， Ｈｅ Ｘ， Ｌｉｍ ＬＰ， ｄｅ Ｓｔａｎｃｈｉｎａ Ｅ， Ｘｕａｎ Ｚ， ｅｔ ａｌ． （２００７） Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐ５３ ｔｕｍｏｕｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｎａｔｕｒｅ ４４７： １１３０−４．）。

【0114】

意外なことに、ＥＧＦＲ経路を含む複数の発癌性シグナル伝達経路の制御におけるｍｉＲ−３４ａの関与の証拠があるにもかかわらず、エルロチニブはまたｍｉＲ−３４ａ模倣体の治療効を増強した （Ｌａｌ Ａ， Ｔｈｏｍａｓ ＭＰ， Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｒ Ｇ， Ｎａｖａｒｒｏ Ｆ， Ｏ’Ｄａｙ Ｅ， ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｂｏｕｎｄ ｍＲＮＡｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｍｉＲ−３４ａ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ７： ｅ１００２３６３．）。 したがって、この結果は、ｍｉＲＮＡ模倣体が単一の遺伝子指向性療法（ｇｅｎｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ）と協働できることを示し、他の組み合わせの探索を誘っている。従って、様々な追加の実施形態において、本発明は、ゲフィチニブ、アファチニブ、パニツムマブおよびセツキシマブなどの他のＥＧＦＲ阻害剤、ならびにラパチニブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブなどのＨＥＲ２阻害剤と、ｍｉＲ−３４ａとの組み合わせを含む。

【0115】

獲得耐性を備える肺癌細胞（ＨＣＣ８２７^ｒｅｓ）では、少量のｍｉＲ−３４ａを添加によって、エルロチニブＩＣ_５０値を０．１μＭより下まで低減することができた。 これは注目すべき結果であり、ｍｉＲ３４ａが、親ＨＣＣ８２７細胞と比較して同等のエルロチニブ感受性を、この細胞株に付与できることを示唆している。一次性の耐性を伴う肺癌細胞では、エルロチニブのＩＣ_５０用量要件は４から４６倍減少し、約２μＭであった。 これは、臨床的有用性を有する濃度の範囲内で有り得る（Ｓｈａｒｍａ ＳＶ， Ｂｅｌｌ ＤＷ， Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ Ｊ Ｈａｂｅｒ ＤＡ （２００７） Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ７： １６９−８１．）。エルロチニブは、最大１５０ｍｇの経口投与量として毎日与えらる。ＭＲＸ３４の臨床用量レベルは未だ確立されていないが、臨床で使用されるｍｉＲ−３４ａとエルロチニブとのモル比は、我々の細胞研究で相乗効果を示した比率の範囲内であり得る。

【0116】

エルロチニブは現在、活性ＥＧＦＲ変異を備えるＮＳＣＬＣ患者のための一次治療として使用されている。 少なくとも１つの先の化学療法レジメンで失敗した、局所的に進行したか又は転移したＮＳＣＬＣについて、化学療法および２次および３次の治療の後の維持療法としても使用される。臨床試験は、従来の化学療法単独と比べて、シスプラチン／ゲムシタビンまたはカルボプラチン／パクリタキセルとの組み合わせでは、エルロチニブの生存利益を示すのを失敗した（Ｉｄ． Ｈｅｒｂｓｔ ＲＳ， Ｐｒａｇｅｒ Ｄ， Ｈｅｒｍａｎｎ Ｒ， Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ Ｌ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＢＥ， ｅｔ ａｌ． （２００５） ＴＲＩＢＵＴＥ： ａ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＯＳＩ−７７４） ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２３： ５８９２−９．）。ＨＣＣにおけるエルロチニブ・プラス・ソラフェニブを調査し、最近の第ＩＩＩ相試験も、そのエンドポイントを満たさなかった（Ｚｈｕ ＡＸ， Ｒｏｓｍｏｒｄｕｃ Ｏ， Ｅｖａｎｓ Ｊ， Ｒｏｓｓ Ｐ， Ｓａｎｔｏｒｏ Ａ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） ＳＥＡＲＣＨ： Ａ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ， ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ， ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｐｌｕｓ ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ （ＨＣＣ）． ３７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２８−Ｏｃｔｏｂｅｒ ２（ａｂｓｔｒ ９１７））。したがって、併用療法の他のアプローチが望まれる。我々のデータは、エルロチニブとｍｉＲ−３４ａとの組み合わせが特に有効であり、エルロチニブで治療できるＮＳＣＬＣ患者集団を実質的に広げ得ることを示す。組み合わせはＨＣＣ細胞においても同様に相乗的であり、このことは、相乗的相互作用がそれらの作用分子機構の結果であり、ＮＳＣＬＣ以外の癌にも適用可能であることを示唆した。

【0117】

＜実施例６：ラパチニブおよびｍｉＲ−３４模倣体（ＭＩＲ−Ｒｘ３４）は乳癌細胞において協働する＞
ヒト乳癌細胞株ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１、およびＭＣＦ−７（ＡＴＣＣから）は、ｍｉＲ−Ｒｘ３４及びラパチニブの組み合わせの効果を評価するために使用された。ラパチニブは、ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州）から購入した。 合成のｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−ＮＣの模倣体は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＴＸ）によって製造された。各薬物単独のＩＣ_５０値を決定するために、ウェル当たり２，０００−３，５００細胞を９６ウェルプレートフォーマットに播種し、ラパチニブまたはｍｉＲ−３４ａのいずれかで次のように処理した。（ｉ）ｍｉＲ−３４Ａの模倣体は、公開されたプロトコルに従って、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＲＮＡｉＭＡＸリポフェクタミンを用いて、連続希釈（０．０３−３０ ｎＭ）中で３組でリバーストランスフェクトした。対照として、細胞はＲＮＡｉＭＡＸトランス単独（モック）でトランスフェクトされた。細胞は、細胞増殖を決定するために、トランスフェクションの６日後にＡｌａｍａｒＢｌｕｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートした。増殖データは、モックでトランスフェクトされた細胞に対して正規化された。（ｉｉ）ラパチニブは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭストック溶液として調製され、０．１から１００μＭの範囲の最終濃度で播種した一日後、細胞に添加した。溶媒のみ（全細胞株中で１％の最終ＤＭＳＯ）を対照として別々のウェル中の細胞に添加した。三日後、細胞増殖をアラマーブルーで測定し、溶媒対照に対して正規化した。

【0118】

併用の研究を、ラパチニブの〜ＩＣ_５０比率及びｍｉＲ−Ｒｘ３４（比率＝ ＩＣ_５０ラパチニブ／ ＩＣ_５０ｍｉＲ−Ｒｘ３４）で行った。 細胞は、上記または下記の２倍の増加内の、対応するＩＣ_５０および濃度にほぼ等しい濃度で、ｍｉＲ−Ｒｘ３４ａと組み合わせたラパチニブで処理された。 ラパチニブ／ｍｉＲ−Ｒｘ３４ａの比率はＢＴ−５４９で４０００、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１で３３３３．３、ＭＣＦ−７で５０００、およびＴ４７Ｄで６０００である。細胞をｍｉＲ−Ｒｘ３４ａでリバーストランスフェクトし、ラパチニブをトランスフェクションの３日間後に添加し、細胞増殖をＡｌａｍａｒＢｌｕｅによってラパチニブ添加の３日後に測定した。

【0119】

ＣＩ値は、単一剤の用量反応曲線の非線形回帰に基づいて計算され、および、組み合わせで使用される場合、０（阻害なし）から１（１００％阻害）までの軸上ので、癌細胞の阻害のレベルに対して示される。相乗的と考えられ、臨床的価値を有する組み合わせは、最大の癌細胞阻害における低いＣＩ値（＜０．６）を有するものである。図１４に示されるようにｍｉＲ−Ｒｘ３４は、すべての４つの乳癌細胞株（ＢＴ−５４９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｔ４７Ｄ）にわたってラパチニブと相乗作用する。記号は、実際のデータポイントに由来するＣＩ値を表わす。ＣＩ（組み合わせインデックス）；Ｆａ、影響された画分、（＝増殖の抑制）；ＣＩ＝１、相加性；ＣＩ〉１、拮抗性；ＣＩ〈１、相乗性。

【0120】

＜実施例７：ＮＳＣＬＣにおけるエルロチニブ＋ ＭＲＸ３４療法＞
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、ＭＲＸ３４＋エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日１５０、１００、または５０ｍｇの経口用量のエルロチニブ、および、５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、ＭＲＸ３４の３０分乃至３時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、ＭＲＸ３４は、５０、７０、９３、１２４、または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0121】

別の例では、エルロチニブは毎日１５０、１００、または５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴の間、１週間に２回（ｔｈｒｅｅ ｔｗｉｃｅ）（例えば月曜日と火曜日）、与えられる。特定の状況では、５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルでＭＲＸ３４を与える。

【0122】

別の例において、エルロチニブは毎日１５０、１００、または５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴によって毎日与えられるが、ただし１週間につき５日間連続で行われ、２日間の休みを設ける。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0123】

＜実施例８：膵臓癌におけるエルロチニブ＋ＭＲＸ３４療法＞
膵臓癌、例えば膵管腺癌を有する患者を治療するために、ＭＲＸ３４＋エルロチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日１００、または５０ｍｇの経口用量のエルロチニブ、および、５０ｍｇ／ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、ＭＲＸ３４の３０分乃至３時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0124】

別の例では、エルロチニブは毎日１００、または５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴の間、１週間に２回（（例えば月曜日と火曜日）、与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0125】

別の例において、エルロチニブは毎日１００、または５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ｍ２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴によって毎日、ただし１週間あたり５日間連続と２日間のオフで与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0126】

＜実施例９：乳癌におけるラパチニブ＋ＭＲＸ３４療法＞
乳癌、例えば、ホルモン受容体陽性、ＨＥＲ２陽性転移性乳癌を備える患者を試験するために、ＭＲＸ３４＋ラパチニブの組み合わせを次のように使用することができる。患者は毎日１５００、１２５０、１０００、または７５０ｍｇの経口用量のラパチニブ、および、５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、ＭＲＸ３４の３０分乃至３時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0127】

別の例では、ラパチニブは毎日１５００、１２５０、１０００、または７５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴の間、１週間に２回（例えば月曜日と火曜日）、与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0128】

別の例において、ラパチニブは毎日１５００、１２５０、１０００、または７５０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴によって毎日、ただし１週間あたり５日間連続と２日間のオフで与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0129】

別の例において、ラパチニブおよびＭＲＸ３４は上記のように、及び、２１日周期の１−１４日目でカペシタビン２０００ｍｇ／ｍ^２／日（約１２時間おきに２つの用量で経口投与される）と組み合わされて、投与される。

【0130】

別の例において、ラパチニブおよびＭＲＸ３４は、上記のように、および一日一回２．５ｍｇのレトロゾールと組み合われて、投与される。

【0131】

＜実施例１０：ＮＳＣＬＣにおけるアファチニブ＋ＭＲＸ３４療法＞
非小細胞肺癌を有する患者を治療するために、ＭＲＸ３４＋アファチニブの組合せを次のように使用することができる。患者は毎日４０、３０、または２０ｍｇの経口用量のアファチニブ、および、５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、ＭＲＸ３４の３０分乃至３時間の静脈内への点滴を受ける。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0132】

別の例では、アファチニブは毎日４０、３０、または２０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴の間、１週間に２回（例えば月曜日と火曜日）与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0133】

別の例において、アファチニブは毎日４０、３０、または２０ｍｇの経口用量として与えられ、および、ＭＲＸ３４は５０ｍｇ／ ｍ^２乃至１６５ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量レベルで、３０分乃至３時間の点滴によって毎日、ただし１週間あたり５日間連続と２日間のオフで与えられる。特定の状況では、ＭＲＸ３４は５０、７０、９３、１２４または１６５ｍｇ／ｍ^２の用量レベルで与えられる。

【0134】

明細書は、明細中で引用される引用の教えに照らして最も徹底的に理解される。明細書内の実施形態は、発明の実施形態の実例を提供し、発明の範囲を限定するようには解釈されるべきでない。当業者は、他の多くの実施形態が本発明により包含されることを容易に認識する。当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または、ただ日常的な実験のみを用いて確認できよう。こうした等価物は以下の請求項で包含されるように意図される。

【0135】

【表5-1】

【0136】

【表5-2】

【0137】

【表5-3】

【0138】

【表5-4】

【0139】

【表5-5】

【0140】

【表5-6】

【0141】

【表5-7】

【0142】

【表5-8】

【0143】

【表5-9】

【0144】

【表5-10】

【0145】

【表5-11】

【0146】

【表5-12】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11】

【図12】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【配列表】

2016519076000001.app

【国際調査報告】