特表 2016-521727 寸法および生物活性を維持するフリーズドライ高分子電解質複合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-521727(P2016-521727A)

(43)【公表日】2016年7月25日

(54)【発明の名称】寸法および生物活性を維持するフリーズドライ高分子電解質複合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/19 20060101AFI20160627BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/40 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/30 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20160627BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20160627BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/19

   A61K47/26

   A61K47/36

   A61K47/10

   A61K47/40

   A61K47/38

   A61K47/30

   A61K47/32

   A61K47/42

   A61K47/18

   A61K47/12

   A61K47/02

   A61K47/46

   A61K48/00

   A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】68

(21)【出願番号】特願2016-518808(P2016-518808)

(86)(22)【出願日】2014年6月9日

(85)【翻訳文提出日】2016年2月4日

(86)【国際出願番号】CA2014000490

(87)【国際公開番号】WO2014197970

(87)【国際公開日】20141218

(31)【優先権主張番号】61/833,010

(32)【優先日】2013年6月10日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】513297449

【氏名又は名称】ポリヴァロール ソシエテ アン コマンディト

(74)【代理人】

【識別番号】100086771

【弁理士】

【氏名又は名称】西島 孝喜

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100183379

【弁理士】

【氏名又は名称】藤代 昌彦

(72)【発明者】

【氏名】ブッシュマン マイケル ディー

(72)【発明者】

【氏名】ラベルチュ マルク

(72)【発明者】

【氏名】ヴェイユ ダニエル

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076BB11

4C076DD25

4C076DD38

4C076DD43

4C076DD51

4C076DD60

4C076DD67

4C076EE23

4C076EE30

4C076EE31

4C076EE37

4C076EE38

4C076EE39

4C076EE42

4C076FF65

4C076GG06

4C076GG47

4C084AA13

4C084MA44

4C084MA66

4C084NA03

4C086AA10

4C086EA16

4C086EA20

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA44

4C086MA66

4C086NA03

(57)【要約】

本発明は、ポリマー、核酸分子、凍結保護剤および緩衝剤を含む高分子電解質複合体組成物に関する。前記高分子電解質複合体組成物は、フリーズドライおよび再水和後に前記高分子電解質複合体の生物活性を保持する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリマー、核酸分子、凍結保護剤および緩衝剤を含む高分子電解質複合体組成物であって、フリーズドライ及び再水和後に前記高分子電解質複合体の生物活性を保持する、高分子電解質複合体組成物。

【請求項2】

フリーズドライ及び再水和後に約７５０ｎｍ未満のＺ平均を有する、請求項１に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項3】

フリーズドライ及び再水和後に凝集が実質的にない、請求項１又は２に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項4】

フリーズドライ及び再水和後に最大で０．５である多分散指数を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項5】

フリーズドライ及び再水和後に少なくとも約１０％のトランスフェクションレベルを達成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項6】

フリーズドライ及び再水和後約１０分以内に復元される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項7】

フリーズドライ及び再水和後約５分以内に復元される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項8】

フリーズドライ及び再水和後にほぼ等オスモル濃度である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項9】

フリーズドライ及び再水和後に約１００ｍＯｓｍ〜約７５０ｍＯｓｍの等オスモル濃度を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項10】

フリーズドライ及び再水和後にほぼ中性ｐＨを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項11】

フリーズドライ及び再水和後に約５〜８のｐＨを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項12】

フリーズドライされている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項13】

前記ポリマーがキトサンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項14】

前記キトサンの数平均分子量（Ｍ_n）が４〜２００ｋＤａである、請求項１３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項15】

前記キトサンのＭ_nが１０〜８０ｋＤａである、請求項１３又は１４に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項16】

前記キトサンの脱アセチル化度（ＤＤＡ）が７０〜１００％である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項17】

前記キトサンのＤＤＡが８０〜９５％である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項18】

キトサン／核酸のＮ／Ｐ比が１．２〜３０である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項19】

キトサン／核酸のＮ／Ｐ比が２〜１０である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項20】

キトサン／核酸のＮ／Ｐ比が５である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項21】

前記核酸分子が、プラスミド（ｐＤＮＡ）、ミニサークル、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及びリボ核酸分子の少なくとも１つである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項22】

前記リボ核酸分子が、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）又はメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）である、請求項２１に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項23】

前記凍結保護剤が、二糖、三糖、オリゴ糖／多糖、ポリオール、ポリマー、高分子量賦形剤、アミノ酸分子又はこれらの組み合わせである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項24】

前記二糖が、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース及びメリビオースの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項25】

二糖の濃度が０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項26】

二糖の濃度が０．５〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項27】

二糖の濃度が０．５〜２％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項28】

前記三糖が、マルトトリオース及びラフィノースの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項29】

三糖の濃度が０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項30】

三糖の濃度が０．５〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項31】

三糖の濃度が０．５〜２％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項32】

前記オリゴ糖／多糖が、デキストラン、シクロデキストリン、マルトデキストリン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びイヌリンの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項33】

前記デキストランのＭ_nが１〜７０ｋＤａである、請求項３２に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項34】

前記デキストランのＭ_nが１〜５ｋＤａである、請求項３２又は３３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項35】

オリゴ糖／多糖の濃度が０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項36】

オリゴ糖／多糖の濃度が０．５％〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項37】

オリゴ糖／多糖の濃度が０．５〜２％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項38】

前記ポリオールがマンニトール及びイノシトールの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項39】

前記ポリオールの濃度が、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項40】

前記ポリオールの濃度が０．５％〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項41】

前記ポリオールの濃度が２〜３％（ｗ／ｖ）である、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項42】

前記アミノ酸分子が、リシン、アルギニン、グリシン、アラニン及びフェニルアラニンの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項43】

前記アミノ酸分子の濃度が１〜１００ｍＭである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項44】

前記アミノ酸分子の濃度が３〜１４ｍＭである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項45】

前記アミノ酸分子の濃度が３〜８ｍＭである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項46】

前記アミノ酸分子の濃度が、更に好ましくは３〜４ｍＭである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項47】

前記高分子量賦形剤が、ＰＥＧ、ゼラチン、ポリデキストロース及びＰＶＰの少なくとも１つである、請求項２３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項48】

前記緩衝剤が、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムの少なくとも１つである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項49】

前記緩衝剤の濃度が１〜１００ｍＭである、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項50】

前記緩衝剤の濃度が３〜１４ｍＭである、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項51】

前記緩衝剤の濃度が３〜８ｍＭである、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項52】

前記緩衝剤の濃度が３〜４ｍＭである、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項53】

前記凍結保護剤がトレハロースであり、前記緩衝剤がヒスチジンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項54】

前記凍結保護剤が０．５〜２％（ｗ／ｖ）のトレハロースであり、前記緩衝剤が３〜４ｍＭのヒスチジンである、請求項５３に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項55】

前記凍結保護剤がスクロースであり、前記緩衝剤がヒスチジンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項56】

前記凍結保護剤が０．５〜２％（ｗ／ｖ）のスクロースであり、前記緩衝剤が３〜４ｍＭのヒスチジンである、請求項５５に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項57】

前記核酸がＤＮＡである、請求項１〜１３及び５３〜５６のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物。

【請求項58】

キトサンと、約５０μｇ／ｍＬの量のデオキシリボ核酸と、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の量のトレハロースと、約３ｍＭ〜約４ｍＭの量のヒスチジンとを含む、高分子電解質複合体組成物。

【請求項59】

キトサンと、約１００μｇ／ｍＬの量のデオキシリボ核酸と、約１％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）の量のトレハロースと、約６ｍＭ〜約８ｍＭの量のヒスチジンとを含む、高分子電解質複合体組成物。

【請求項60】

フリーズドライ及び再水和後にその生物活性を保持する高分子電解質複合体組成物を調製する方法であって、
ａ）キトサンを凍結保護剤及び緩衝剤と混合してキトサン組成物を形成する工程と、
ｂ）別途、核酸を前記凍結保護剤及び前記緩衝剤と混合して核酸組成物を形成する工程と、
ｃ）前記キトサン組成物を前記核酸組成物と混合して前記高分子電解質複合体組成物を形成する工程と
を含む方法。

【請求項61】

前記キトサンが、溶解されたキトサンである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記工程ａ）が、前記キトサンを前記凍結保護剤及び前記緩衝剤で希釈することを含む、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

前記工程ｂ）が、前記キトサンを前記凍結保護剤及び前記緩衝剤で希釈することを含む、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項64】

工程ｃ）で得た前記組成物をフリーズドライする工程ｄ）をさらに含む、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

前記核酸分子が、プラスミド（ｐＤＮＡ）、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及びリボ核酸分子の少なくとも１つである、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

前記凍結保護剤が、二糖、三糖、オリゴ糖／多糖、ポリオール、ポリマー、高分子量賦形剤、アミノ酸分子又はこれらの組み合わせである、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記緩衝剤が、クエン酸ナトリウム、クエン酸、ヒスチジン、リンゴ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムの少なくとも１つである、請求項６０〜６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

請求項１〜５９のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物と、前記組成物の復元のための説明書とを含むキット。

【請求項69】

水を更に含む、請求項６８に記載のキット。

【請求項70】

前記水が、対象への注射に好適な水である、請求項６８に記載のキット。

【請求項71】

対象への注射前に復元するための説明書を更に含む、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載のキット。

【請求項72】

前記高分子電解質複合体組成物が、その初期濃度の５倍の濃度で、水で復元される、請求項６９に記載のキット。

【請求項73】

前記高分子電解質複合体組成物が、その初期濃度の１０倍の濃度で、水で復元される、請求項６９に記載のキット。

【請求項74】

前記高分子電解質複合体組成物が、その初期濃度の２０倍の濃度で、水で復元される、請求項６９に記載のキット。

【請求項75】

核酸を必要とする対象に核酸を送達するための、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の高分子電解質複合体組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／８３３，０１０号の恩典および優先権を主張するものであり、前記仮出願の内容はその全体が参照により本明細書に援用されている。
本発明は、溶液中での安定性が増され、かつ長期保管中の物理的または化学的分解に対する耐性が改善された高分子電解質複合体組成物、かかる高分子電解質複合体組成物を得るための方法、および核酸の送達のためのこれらの高分子電解質複合体組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

治療薬、例えば、これらに限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えばプラスミド（ｐＤＮＡ）およびオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ならびにリボ核酸、例えば短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）の送達のためのナノ粒子組成物を開発するために、近年、有意な努力がなされている。しかし、これらのコロイド状組成物は、溶液中での限られた安定性を有することおよび長期保管中に物理的または化学的分解をこうむりやすいことが証明されている［１］。
凍結乾燥としても公知のフリーズドライによるこれらの組成物の脱水がそれらの長期安定性を増すために用いられている［２〜４］。この方法は、凍結、一次乾燥および二次乾燥という３つの主な工程から成る。この方法は、低減された体積の乾燥組成物を再水和して活性剤濃度を増加させ、治療投与量に達する可能性をもたらす。これは、小さい均一な粒径のナノ粒子を生じさせる希薄条件での調製を必要とする、ポリカチオンと核酸（ＮＡ）間で形成される自己集合性高分子電解質複合体組成物の場合、特に興味深い［１］。

【0003】

凍結乾燥時の溶液中でのナノ粒子の不可逆的凝集および官能性の喪失を防止するために、一般に、組成物への凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）の添加が求められる［４、５］。凍結・解凍研究は、所定の組成物に使用することができる可能性のある凍結保護剤の特定を可能にする［６、７］。二糖（例えばスクロース、トレハロース、ラクトースなど）、オリゴ糖／多糖（例えばセルロース、デキストランなど）、ポリマー（例えばＰＥＧ、ＰＶＰなど）などが長期保管用の組成物を安定させるために凍結保護剤として使用されている［３、４］。トレハロースも卓越したナノ粒子凍結保護剤である［４、１１〜１３］。しかし、多糖はそれらの嵩高さのためあまり有効な凍結保護剤でないことが判明している［１５、１６］のだが、フリーズドライされた非晶質二糖は、高温での保管時に複合体凝集のリスクが増して多糖より容易に結晶化することが判明した［１４］。オリゴ糖は、複合体の最適な安定化のための二糖と多糖両方の有利な特性を有するとすれば、優れた安定剤であり得る［１７］。低分子量デキストランは、フリーズドライして再水和したときポリプレックスの物理化学的特性および官能性を保持すること、その上、インビトロおよびインビボ研究中にスクロースより高い細胞生存率を保持することに有効であることが証明されている［１５］。

【0004】

緩衝剤を使用し、凍結乾燥プロセスの凍結段階によって起こる溶質の凍結濃縮中にｐＨを安定させることおよびナノ粒子酸加水分解を防止することができる［２］。フリーズドライ中に使用される緩衝剤は、一部（リン酸塩、コハク酸塩または酒石酸塩）が凍結中に結晶化または沈殿し、それに起因してｐＨがシフトして４単位にまで達するので、注意して選択しなければならない［２、２０〜２３］。Ｔｇ’は、最大限凍結濃縮された溶液のガラス転移温度を指し、フリーズドライ用の賦形剤を選択する際に考慮すべき重要なパラメータであり、最終生成物に影響を及ぼすことなく一次乾燥を行うことができる最高温度の良好な推定値である。クエン酸ナトリウムは、様々なｐＨ値でのそのより高いＴｇ’［２２］および中性に近いそのｐＫ_a（ｐＫ_a3＝６．４）［２４］を考えると、フリーズドライされた注射用組成物での使用に適している結晶化しない緩衝剤である。Ｌ−ヒスチジンも、その３つのｐＫ_a値のうちの１つが６．１であること、５．５〜６．５のｐＨでフリーズドライすると殆ど結晶化を示さないこと、および高いＴｇ’（−３３℃）を有すること［２１、２５］を考えると適切であり得る。賦形剤、大部分は凍結保護剤、一部は緩衝剤の使用は、ポリ（Ｄ，Ｌラクチド−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）（米国特許出願公開第２０１１／２６２４９０号）［２６〜２８］、ポリ（ｌ−リシン）（ＰＬＬ）［２９］、ポリ乳酸（ＰＬＡ）（米国特許出願公開第２０１１／０２７５７０４号）［３０］、ゼラチン［３１］、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）［７、１５、１７、３２〜３７］を用いて形成されるフリーズドライ高分子電解質複合体組成物の開発のために特徴付けられている。

【0005】

フリーズドライに関して最も多く記述されているものは、ＰＥＩベースナノ粒子系である。いくつかの二糖は、フリーズドライ中のＰＥＩ／ＮＡナノ粒子の凍結保護に有効と証明されている。以前の凍結保護剤選別研究は、比較的高いスクロース濃度（ｍＬ当たり５０μｇのＤＮＡを含有する組成物についての３７．５％（質量／体積）と等価）を要して凍結・解凍時に７０ｋＤａ（質量平均分子量（Ｍ_w））分岐ＰＥＩ／ＤＮＡ粒径を保持するが、ゼータ電位およびトランスフェクション効率が激減する結果となることを明らかにした［３２］。より最近の研究は、２５ｋＤａ（Ｍ_w）分岐ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を、粒子凝集もインビトロトランスフェクションの損失も伴うことなくはるかに低いスクロース、ラクトースまたはトレハロース濃度（ｍＬ当たり５０μｇのＤＮＡを含有する組成物についての１．２５％（質量／体積）と等価）で、ゼータ電位の許容可能な増加（１０〜２０ｍＶ）で、およびラクトース組成物を用いて最高インビボトランスフェクション効率でフリーズドライすることができることを明らかにした［３３］。スクロースまたはトレハロースばかりでなくマンニトールも凍結乾燥時のＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の凝集および有効性喪失を防止するために使用することができるだろうが、凍結保護剤はＰＥＩ／ＯＤＮまたはリボザイム複合体に必要とされなかった［３４］。

【0006】

以前の研究は、フリーズドライ時にナノ粒子を安定させるために高いスクロース／ＤＮＡ質量比が必要とされ、その結果、組成物が、典型的なプラスミドＤＮＡ投与量のための皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）注射と不適合であるオスモル濃度を有することになることを確証した［３２］。

【0007】

デキストラン（多糖）を二糖の代替品として使用して凍結乾燥７０ｋＤａ（Ｍ_w）分岐ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を安定させる可能性が調査された。デキストラン３ｋＤａは、複合体の完全性の保持にスクロースと同様に有効であったが、復元溶液のオスモル濃度をおおよそ４０％低下させた［１５］。デキストラン３ｋＤａ／スクロース組成物を再水和によって最大１０倍に濃縮してほぼ等張性にすることができ、測定される濁度の変動の不在によって判定して、濃縮による粒径の変更なくインビボ注射により好適な投与量（例えば１ｍｇ／ｍＬ）を得ることができた。しかし、１０倍濃縮後のその最終濃度に達するために、凍結保護剤の添加前に粒子を２００μｇ／ｍＬの初期ＤＮＡ濃度で調製しなければならず［１５］、この初期ＤＮＡ濃度は、小さい均一な粒径のナノ粒子を確実に生成する典型的な最大濃度（ｍＬ当たり１００μｇのＤＮＡ）［１］より高く、これは、これらの組成物における粒径および多分散性がより高くなるかもしれないことを示唆した。

【0008】

また、デキストラン使用の主な欠点は、ＰＥＧとそれらの公知不相溶性（リポプレックスのＰＥＧ化度の増加に伴うそれらの安定化効果減少）である［１７］。デキストラン５ｋＤａは、ＰＥＧ化ＰＥＩ／ＤＮＡポリプレックスの完全凝集を防止したが、粒径はなお１７０〜２４０％増加した［７］。イヌリン（別のオリゴ糖）は、ＰＥＧ化リポプレックスまたはポリプレックスのための有効な凍結保護剤であろう［７］。

【0009】

つい最近、６のアミノ／リン酸（Ｎ／Ｐ）比で調製した直鎖状ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体への緩衝剤（ｐＨ６の１０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン）の添加は、粒子の流体力学直径の（１７６から１１８ｎｍへの）減少、多分散指数（ＰＤＩ）の（０．１８から０．１３への）減少、ゼータ電位の（２９．６から３６．３ｍＶへの）増加をもたらしたが、それらのインビトロ代謝活性および遺伝子発現に有意な影響を及ぼさなかった［３６］。デキストランは、これらの複合体にとって不良な凍結保護剤であると判明したが、スクロースは、少なくとも２０００の凍結保護剤／ＤＮＡ質量比（ｍＬ当たり５０μｇのＤＮＡを含有する組成物についての１０％（質量／体積）と等価）で、フリーズドライ時にそれらの複合体を安定させた。１４％ラクトスクロース、１０％ヒドロキシプロピルベータデクス／６．５％スクロース、または１０％ポビドン／６．３％スクロースを含有する等張性組成物は、１７０ｎｍより小さい粒子で、４０℃で６週間の保管を通して安定していた。ラクトスクロースまたはヒドロキシプロピルベータデクス／スクロース組成物がインビトロで最も有効であった［３６］。別の緩衝剤（ｐＨ７のトリエタノールアミン）は、５０％グリセロールとの組み合わせでフリーズドライ時のＰＥＩ−マンノビオース（ＰＥＩｍ）／ｐＤＮＡ複合体の寸法の保持に有効であることが判明した。フリーズドライ組成物を−２０℃または４℃で３０日間保管することができ、さらに粒径を２００ｎｍで保持することができた（ＷＯ２０１０／１２５５４４）［３７］。

【0010】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）に共有結合でコンジュゲートさせたＰＥＩを使用して、ＰＥＧ−ＰＥＩ−Ｃｈｏｌ（０．５５４ｍｇ／ｍＬ）／ｐＤＮＡ（０．１５ｍｇ／ｍＬ）［ラクトースまたはスクロース中で調製したリポポリプレックス（０．３、１．５または３％（質量／体積）］を、組成物に緩衝剤を添加することなく、フリーズドライして５、１または０．５ｍｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度に再水和することができた。フリーズドライ試料の２年間、−２０もしくは−８０℃、６０％ＲＨでの保管後、または試料の復元および４℃で最大３カ月間の保管後、これらの組成物間での粒径または（インビトロ、インビボ、がん患者における）生物活性の変動は殆ど見られなかった（ＷＯ２００９／０２１０１７）［３５］。実際、リポポリプレックスは、低いスクロース含有量（ｍＬ当たり５０μｇのＤＮＡを含有する組成物についての０．０６２５％（質量／体積）と等価）でのほうが凍結・解凍後に分解を受けにくく、それらの物理化学的特性への修飾がなく、対照の少なくとも５０％のトランスフェクション効率を有すると以前に報告されていた［３２］。
当技術分野の現状を考えると、溶液中での高分子電解質複合体の安定性増加をもたらし、かつ例えばフリーズドライを要する長期保管中に高分子電解質複合体の物理的または化学的分解に対する耐性を改善し、ほぼ等オスモル濃度である有効用量を表す濃度で再水和される高分子電解質複合体組成物が、依然として必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の様々な態様は、ポリマー、核酸分子、凍結保護剤および緩衝剤を含む高分子電解質複合体組成物であって、フリーズドライおよび再水和後に前記高分子電解質複合体の生物活性を保持する、高分子電解質複合体組成物に関する。
本発明の様々な態様は、キトサンと、約５０μｇ／ｍＬの量のデオキシリボ核酸と、約０．５％（質量／体積）から約１％（質量／体積）の間の量のトレハロースと、約３ｍＭから約４ｍＭの間の量のヒスチジンとを含む、高分子電解質複合体組成物に関する。

【0012】

本発明の様々な態様は、キトサンと、約１００μｇ／ｍＬの量のデオキシリボ核酸と、約１％（質量／体積）から約２％（質量／体積）の間の量のトレハロースと、約６ｍＭから約８ｍＭの間の量のヒスチジンとを含む、高分子電解質複合体組成物に関する。

【0013】

本発明の様々な態様は、フリーズドライおよび再水和後にその生物活性を保持する高分子電解質複合体組成物を調製する方法であって、キトサンを凍結保護剤および緩衝剤と混合してキトサン組成物を形成する工程と、別途、核酸を凍結保護剤および緩衝剤と混合して核酸組成物を形成する工程と、前記キトサン組成物を前記核酸組成物と混合して高分子電解質複合体組成物を形成する工程とを含む方法に関する。

【0014】

本発明の様々な態様は、本明細書で定義の高分子電解質複合体組成物と、その組成物の復元のための説明書とを含むキットに関する。
本発明の様々な態様は、核酸を、それを必要とする対象に送達するための、本明細書で定義の高分子電解質複合体組成物の使用に関する。
添付の図面に言及することにする。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A-C】図１Ａは、ナノ粒子凝集（粒径の５倍増加）が凍結保護剤不在下で凍結・解凍（Ｆ／Ｔ）後に見られたが、組成物に少なくとも１％質量／体積マンニトール、０．５％（質量／体積）スクロース、０．５％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたは０．１％（質量／体積）トレハロース二水和物を添加すると凝集が防止された（直径≦１５０ｎｍ）ことを示すグラフを例示する。図１Ｂは、最低でも示されている凍結保護剤含有量を使用することによるトランスフェクション効率を示すグラフを例示する。図１Ｃは、ナノ粒子のルシフェラーゼ発現が凍結・解凍後に維持されたが、凍結保護剤不在下では有意な減少が見られたことを示すグラフを例示する。トランスフェクション効率およびルシフェラーゼ発現レベルを、賦形剤なしの作りたて（ｆｒｅｓｈ）対照（０ＦＴ）に対する百分率によって表し、前記０ＦＴは、全細胞の４３％のトランスフェクション効率およびタンパク質１ｍｇ当たり８．０３×１０¹⁰ＲＬＵ／分のルシフェラーゼ発現レベルを有した。

【図2A-H】図２は、１または１０％（質量／体積）マンニトール（図２Ａ〜２Ｂ）、スクロース（図２Ｃ〜２Ｄ）またはデキストラン５ｋＤａ（図２Ｅ〜２Ｆ）の存在下で凍結・解凍したナノ粒子が、凍結保護剤を含有しない新たに調製した粒子組成物（図２Ｇ）より球形であることを示す画像を例示する。凍結保護剤不在下で凍結・解凍したナノ粒子は、重度に凝集した（図２Ｈ）。

【図3A-D】図３Ａは、０．５％（質量／体積）スクロース、デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物を含有する組成物のフリーズドライおよび等体積への再水和はナノ粒子凝集をもたらし、再水和粒子は、新たに調製した複合体より最大２４倍大きいＺ平均を有したことを示すグラフを例示する。図３Ｂは、強度でのそれらの平均粒径が新たに調製した粒子より最大９．５倍大きかったことを示すグラフを例示する。図３Ｃは、多分散指数（ＰＤＩ）が０．３５より上であったことを示すグラフを例示する。図３Ｄは、ゼータ電位がゼロまたは負であったことを示すグラフを例示する。

【図4A-C】図４Ａ〜Ｃは、０．５％凍結保護剤を含有する組成物へのｐＨ４．５またはｐＨ６．５のクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝剤の添加が、作りたて試料中での顕微鏡的凝集の形成をもたらし、凍結・解凍後に完全凝集をもたらすことを示すグラフを例示する。

【図5A-B】図５Ａは、新たに調製したキトサン／ＤＮＡ複合体が異なる形態を有することを示す画像を例示する。図５Ｂは、１３．７５ｍＭの最終濃度に達するためのｐＨ６．５のＬ−ヒスチジンの添加が、わずかに大きくより球形のナノ粒子の形成をもたらすことを示す画像を例示する。

【図6A-C】図６Ａ〜Ｂは、０．５％凍結保護剤を含有する組成物へのＬ−ヒスチジンの添加が凝集を生じさせなかったことを示すグラフを例示する：作りたておよび凍結・解凍組成物において粒径のわずかな増加が見られる。図６Ｃは、ＰＤＩが０．３５より下で維持されることを示すグラフを例示する。

【図7A-I】図７Ａ〜Ｃは、０．５または１％（質量／体積）賦形剤および１３．７５ｍＭヒスチジンの存在下でフリーズドライしたナノ粒子を、それらのＰＤＩは減少したが粒径に影響を及ぼすことなく、それらの原体積の１０％ほどもの小ささで再水和することができることを示すグラフを例示する。図７Ｄ〜Ｆは、０．５％（質量／体積）スクロースまたはトレハロース二水和物と１３．７５ｍＭヒスチジンとを含有する組成物をフリーズドライし、粒子凝集なしに原体積（Ｒｈ１Ｘ）にまたはそれらの初期濃度の２０倍（Ｒｈ２０Ｘ）に再水和することができることを示すグラフを例示する。図７Ｇ〜Ｉは、０．５％（質量／体積）スクロースまたはトレハロース二水和物組成物を、それらの粒径またはＰＤＩを変化させずに３．４４ｍＭほどもの少ないＬ−ヒスチジンでフリーズドライすることができたことを示すグラフを例示する。

【図8A-H】図８Ａ〜Ｃは、複合体形成前の賦形剤でのキトサンおよびＤＮＡの希釈は作りたてナノ粒子の粒径に殆ど影響を及ぼさなかったが、Ｌ−ヒスチジンの存在はより低いＰＤＩを有する粒子を生じさせたことを示すグラフを例示する。図８Ｄ〜Ｈは、０．５％（質量／体積）スクロースまたはトレハロースと３．４４ｍＭヒスチジンとを含有する組成物のＲｈ１ＸまたはＲｈ２０Ｘで粒径（Ｚ平均または強度での平均粒径）変化は見られなかったが、ＰＤＩはＲｈ２０Ｘでわずかに低かったことを示すグラフを例示する。０．５％（質量／体積）デキストランを用いると、粒子はより大きかったが３００ｎｍ付近を維持し、ＰＤＩは、Ｒｈ１Ｘでの０．４から、Ｒｈ２０Ｘでの０．１８に減少した。

【図9A-D】図９Ａ〜Ｂは、賦形剤なしの作りたて対照（Ｌｙｏなし−Ｈｉｓ（０）−作りたて）の百分率によって表したトランスフェクション効率およびルシフェラーゼ発現レベルを示すグラフを例示する。前記Ｌｙｏなし−Ｈｉｓ（０）−作りたては、全細胞の５３％のトランスフェクション効率、およびタンパク質１ｍｇ当たり６．７５×１０^-5μＭのルシフェラーゼの発現レベルを有した。０．５％（質量／体積）凍結保護剤を含有する組成物は、フリーズドライ前には対照のほぼ１００％およびフリーズドライ後には対照の４５％未満のトランスフェクション効率を有したが、フリーズドライ後のそれらのルシフェラーゼ発現レベルは、対照の２５％未満であった。図９Ｃ〜Ｄは、０．５％凍結保護剤と３．４４ｍＭ Ｌ−ヒスチジンの両方を含有する組成物が、トレハロースが含有する組成物についてはフリーズドライ前に対照のほぼ１１０％、等体積への再水和（Ｒｈ１Ｘ）後に対照の８０％より上、および２０Ｘでの再水和後に対照の最大７７％のトランスフェクション効率を有したことを示すグラフを例示する。Ｌ−ヒスチジンとスクロースまたはトレハロース二水和物を含有する組成物は、対照と同様のルシフェラーゼ発現レベル（対照の１１６〜６６％）を有したが、デキストラン５ｋＤａを含有するものについては発現が対照の５７〜１２％であった。

【図10A-F】図１０Ａ〜Ｄは、０．５％トレハロース二水和物と３．５ｍＭ Ｌ−ヒスチジンとを含有するナノ粒子組成物の再水和前の２０Ｘ倍濃縮は、粒径およびＰＤＩの小規模な増加をもたらしたが、複合体のゼータ電位を変化させず、最終濃縮率２０Ｘに達するための１回または２回の逐次的フリーズドライ／再水和サイクルの使用は、ナノ粒子の物理化学的特性に影響を及ぼさなかったことを示すグラフを例示する。図１０Ｅ〜Ｆは、単回フリーズドライ後に２０Ｘ濃縮した組成物（ＦＤ／Ｒｈ２０ｘ）は対照の１００％のトランスフェクション効率を有したが、２回の逐次的フリーズドライサイクル［Ｒｈ（１０Ｘ＋２Ｘ）およびＲｈ（５Ｘ＋４Ｘ）］後、それらが対照の少なくとも８５％のトランスフェクション効率を有したことを示すグラフを例示する。２０Ｘの最終濃縮率を有するすべての組成物は、それらを１回または２回フリーズドライしたが、対照の６４〜６９％のルシフェラーゼ発現レベルを有した。

【図11A-C】図１１Ａ〜Ｂは、粒子形成後の１００μｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度のために１または２％（質量／体積）トレハロースと７または３．５ｍＭヒスチジンとを含有するＣＳ／ｓｉＲＮＡ組成物のＲｈ１ＸまたはＲｈ２０Ｘ時に、最小限の粒径変化（Ｚ平均）が見られたことを示すグラフを例示する。これらの組成物のＰＤＩは、Ｒｈ１Ｘ後０．２５未満であり、Ｒｈ２０Ｘ後０．２０未満であった。図１１Ｃは、１％トレハロースと７ｍＭ Ｌ−ヒスチジンとを含有する組成物は、組成物が作りたてであろうと、Ｒｈ１Ｘであろうと、Ｒｈ１０Ｘであろうと、ＦＤ後にサイレンシング効率を保持し、残留ｅＧＦＰ発現レベルが未処置細胞の５２から４７％の間であったことを示すグラフを例示する。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、適切な凍結保護剤タイプおよび濃度、ならびに緩衝剤タイプおよび濃度が、凍結乾燥される粒子懸濁液中に存在するという条件で、キトサン核酸ナノ粒子をフリーズドライし、濃縮することができ、再水和すると粒径が変化することも、生物活性が喪失することも、高浸透液が生じることもないとう本発明者らによる発見に端を発したものである。

【0017】

したがって、本発明の一実施形態は、溶液中での高分子電解質複合体の安定性増加および／または長期保管中の物理的もしくは化学的分解に対する高分子電解質複合体の耐性改善をもたらす、高分子電解質複合体組成物を提供する。
本発明の別の実施形態は、溶液中での高分子電解質複合体の安定性および／または長期保管中の物理的もしくは化学的分解に対する高分子電解質複合体の耐性改善をもたらす、フリーズドライ高分子電解質複合体組成物を提供する。
これらのうちのいくつかの実行例では、高分子電解質複合体は、多糖系高分子電解質複合体である。いくつかの事例では、前記高分子電解質複合体は、多糖と核酸間の高分子電解質複合体である。
本明細書において用いる用語「高分子電解質」は、繰り返し単位が電解質基を有するポリマーを指す。したがって、高分子電解質は、ポリカチオンおよびポリアニオンを含む。これらの基は、水溶液中で解離してポリマーを荷電させる。したがって、高分子電解質の特性は、電解質とポリマーの両方に似ている。

【0018】

本明細書において用いる用語「多糖」は、グリコシド結合によって互いに結合された単糖単位の長鎖から成る分子であって、加水分解されると構成要素の単糖またはオリゴ糖をもたらす分子を指す。

【0019】

いくつかの事例では、多糖はキトサンである。本明細書において用いる用語「キトサン」は、ランダムに分布するβ−（１−４）結合Ｄ−グルコサミン（脱アセチル化単位）とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（アセチル化単位）から成る直鎖状多糖を指す。キトサンは、エビおよび他の甲殻類の殻をアルカリ性水酸化ナトリウムで処理することによって一般に製造される。キトサンは、生体適合性、生分解性、粘膜付着性、抗菌／抗真菌活性および非常に低い毒性を含む、広範な有益特性を有する。
キトサンの分子量および鎖上のアミン基の量（脱アセチル化度またはＤＤＡ）は、その生物学的および生理的特性に大きな影響を及ぼす。例えば、アセチル基の量および分布は生分解性に影響を及ぼす。アセチル基の不在またはそれらの均質な分布の不在（ブロックではなくランダム）は非常に低い酵素的分解速度をもたらすからである。

【0020】

これらの実施形態のいくつかの実行例では、キトサンは化学的修飾を含むことがある。化学的修飾を含むキトサンの例としては、（ｉ）キチンおよび／もしくはキトサンに共有結合で結合させることができる、または核酸もしくはオリゴヌクレオチドと複合体化したキトサン系化合物にイオン的にもしくは疎水的に付着させることができる、特異的または非特異的細胞標的部分と、（ｉｉ）キチンおよびキトサンの物理的、化学的または生理的特性の改変に役立つ、キチンおよびキトサンの様々な誘導体または修飾体とを有する、キトサン系化合物が挙げられるが、これらに限定されない。かかる修飾キトサンの例は、特異的または非特異的標的リガンド、膜透過化剤、細胞内局在成分、エンドソーム溶解（細胞溶解）剤、核局在シグナル、コロイド安定剤、血液中での長い循環半減期を促進する薬剤を有する、キトサン系化合物、ならびに化学的誘導体、例えば、塩、Ｏ−アセチル化およびＮ−アセチル化誘導体である。キトサンの化学的修飾のためのいくつかの部位としては、Ｃ₂（ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ₃もしくはＮＨ₂）、Ｃ₃（ＯＨ）、またはＣ₆（ＣＨ₂ＯＨ）が挙げられる。

【0021】

本明細書で定義する実施形態のいくつかの実行例では、キトサンは、約４ｋＤａ〜約２００ｋＤａの間、好ましくは約５ｋＤａから約２００ｋＤａの間、より好ましくは約５ｋＤａから約１００ｋＤａの間、より好ましくは約１０ｋＤａから約８０ｋＤａの間である特定の平均分子量（Ｍｎ）を有する。キトサンは、好ましくは約７０％から約１００％の間、より好ましくは約８０％から９５％の間である特定の脱アセチル化度（ＤＤＡ）をさらに有する。
これらの実施形態のいくつかの実行例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）の１つまたは複数である。核酸は、例えば、プラスミド（ｐＤＮＡ）、ミニサークルまたはオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の１つまたは複数である。核酸は、短鎖干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）および短鎖ヘアピンリボ核酸（ｓｈＲＮＡ）またはメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の１つまたは複数であってもよい。
本明細書で定義する組成物に入るポリマーと核酸の比は、ポリマーのアミン基のモルの、核酸のリン酸基のモルに対する比（Ｎ／Ｐ比）によって決定される。いくつかの実行例では、本明細書で定義する組成物のＮ／Ｐ比は約１．２から約３０の間であり、好ましくは、Ｎ／Ｐ比は約２から約１０の間であり、より好ましくは、Ｎ／Ｐ比は約５である。

【0022】

キトサン／核酸高分子電解質複合体に関する研究が行われている［３８〜４５］。これらの研究は、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡなど）と、約８から２００ｋＤａの間の数平均分子量（Ｍ_n）および７２％から９５％の間の脱アセチル化度（ＤＤＡ）を有するキトサンとを含有する、高効率トランスフェクションのための組成物を含む（ＷＯ２００９／００７５３８３およびＷＯ２０１２／１４９２１５）。しかし、これらの研究は、これらの組成物の長期安定化に関連した複数の難題を考慮しておらず、それらの難題に取り組んでもいない。

【0023】

以前の研究は、低減された体積のフリーズドライ組成物の再水和によって治療濃度の等張性キトサン／核酸組成物を生成する可能性にも取り組んでいない。二糖（例えばスクロースまたはマンニトール）は、フリーズドライおよび短期保管（≦２カ月）時にキトサンベースポリプレックスの凝集および官能性の喪失を防止することになった［８〜１０］。初期組成物ｐＨは、フリーズドライ中のキトサン加水分解の状態にとって重要であり、溶液ｐＨを６から４．１に低下させると分解速度は３０倍増加することになった［２］。組成物の十分な緩衝を確実にするために緩衝液のモル濃度はキトサンモノマーのものと少なくとも同等でなければならず、さらに、生理的緩衝剤との競合、および他の望ましくない作用を防止するために注射する最終組成物中０．１Ｍ未満でなければならない。キトサン加水分解速度は、ＨＣｌ濃度の増加とともに増加することになり［１８］、より緻密なキトサン鎖高次構造を促進する溶媒の存在下では、その構造の中央に位置するグリコシド結合が加水分解にあまり利用できず、キトサン加水分解速度は減少することになる［１９］。

【0024】

レチノールを水溶性キトサン（１８ｋＤａ、９６％ＤＤＡ）に封入して球形ナノ粒子を形成し、それらの粒子をその後３日間、一切の凍結保護剤不在下で凍結乾燥させ、容易に再水和した。これらの再水和粒子は、わずかに小さい平均粒径および分布の広さを有したが、凍結乾燥は、それらのゼータ電位に影響を及ぼさず、封入されたレチノールを分解することもなかった［４６］。経口インスリン送達用のフリーズドライキトサン（８０ｋＤａ、８５％ＤＤＡ）／ポリ（γ−グルタミン酸）ナノ粒子を１．５％トレハロース中でフリーズドライし、ドライケーキの強い起泡破壊にもかかわらず、再水和複合体の寸法または形態（平均粒径≦２４５ｎｍ、ＰＤＩ＜０．３）の変更もインスリン含有量の低下もなかった［４７］。キトサンナノ粒子は、酸性ｐＨ値で加水分解感受性であることが明らかになった：ｐＨ＝１．２で粒子は分解し、ｐＨ＝２．０でのほうが２８％大きかった。トリメチルキトサン（ＴＭＣ；２００ｋＤａ、８５％ＤＤＡ、１５もしくは３０％の四級化度（ＤＱ））またはＴＭＣ−システインコンジュゲート（ＴＭＣ−Ｃｙｓ）とインスリンとで形成された高分子電解質複合体をスクロース中、２０のスクロース／インスリン（質量／質量）比で凍結乾燥させ、再水和後に粒径、ゼータ電位およびインスリン封入効率の変更はなかった［４８］。ガチフロキサシンの送達用のアルギネート（７５〜１００ｋＤａ）／キトサン（６５〜９０ｋＤａ、ＤＤＡ＞８０％）ナノ粒子を５％質量／体積マンニトール中で配合し、フリーズドライし、室温で最大１２カ月間保管した。初期体積で再水和後、粒径の最小限の（３４５から４１０ｎｍへの）増加しか認められず、それらのゼータ電位の変化も、それらのインビトロガチフロキサシン放出プロファイルの変化もなかった［４９］。メトキシポリ（エチレングリコール）グラフトキトサン（１０ｋＤａ、９７％ＤＤＡ）コポリマーのメトトレキサート組み込み高分子ナノ粒子を調製し、凍結保護剤不在下で２日間凍結乾燥させ、脱イオン水で再水和し、その後、特性づけした：粒径は１００ｎｍ未満であり、ゼータ電位値は＋２０〜＋４０ｍＶの範囲であり、負荷効率は６５％より高かった［５０］。

【0025】

本明細書において用いる表現「ゼータ電位」は、コロイド系の界面動電位を指す。ゼータ電位は、ギリシャ文字ゼータ（ζ）を用いて一般に表示され、したがってζ−電位である。ゼータ電位は、界面二重層（ＤＬ）における滑り面の位置での、その界面から離れているバルク流体中の地点に対する電位である。ゼータ電位は、分散媒と分散粒子に結合した静止流体層との間の電位差である。

【0026】

キトサンおよびポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、α−ＰＧＡ、ＰＧＡの可溶性塩、ＰＧＡの金属塩またはヘパリンのナノ粒子を、骨粗鬆症の処置のための標的部位への核酸の送達のために生成した。ナノ粒子は２６６ｎｍの平均粒径を有し、それらをフリーズドライし、２．５％ほどもの低いトレハロースで１３％粒径増加で再水和することができ、または２．５％ほどもの低いマンニトールで５７％平均粒径増加で再水和することができた（米国特許第７，９０１，７１１号）［５１］。ＰＥＧ化キトサン（１１０ｋＤａ、８７％ＤＤＡ）／ｐＤＮＡナノ粒子を１％マンニトール中で凍結乾燥させた後、１カ月、４℃または−２０℃で保管するか、または４０％スクロース中で凍結乾燥させた後、−２０℃で保管し、それらの粒径、ゼータ電位およびトランスフェクション効率は一切変化しなかった［８］。他のナノ粒子［ＤＮＡ：キトサン（９０ｋＤａ）：細胞溶解性ペプチド（電荷比１：６：１−／＋／−）］は、１０％ラクトース中でフリーズドライ時にそれらの粒径（３００〜３５０ｎｍ）を保持し、レポーター遺伝子ＣＭＶ−ＣＡＴのインビボ発現がウサギにおいて経口投与７２時間後に証明された（ＷＯ９７／４２９７５）［５２］。

【0027】

キトサン（ＣＳ：１７０ｋＤａ、８４％ＤＤＡ）／ｓｉＲＮＡ複合体（５０のＮ／Ｐ比）の凍結乾燥の研究により、１０％スクロースは再水和後の粒径の保持に必要であることが明らかになった。粒径は、作りたて組成物においてスクロース添加後に（１２６〜１６９ｎｍに）わずかに増加し、フリーズドライおよび再水和後１４２ｎｍであった［９］。凍結保護剤不在下での再水和複合体は大き過ぎて動的光散乱（ＤＬＳ）で粒径を測定することができなかった。試料遺伝子ノックダウン効率は、ｓｉＲＮＡ濃度に伴って増加し、スクロースの存在に依存した：より低いｓｉＲＮＡ濃度（≦２５ｎＭ）については、１０％スクロースで最高ノックダウン（６０％）が得られ、最高ｓｉＲＮＡ濃度（５０ｎＭ）については、最大ノックダウン効率（７０％）に達するのに５％スクロースで十分であった。キトサン／ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）複合体を５％以上のスクロース中で配合したとき、１０％のＨ１２２９細胞生存率低下が測定された。１０％スクロース組成物のサイレンシング活性は、２カ月間の室温での保管後、３２％に達した［９］。

【0028】

オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡの送達に使用したキトサンコーティングＰＬＧＡ複合体は、０．０５％（質量／体積）キトサンおよび１％（質量／体積）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）の溶液中でフリーズドライしたとき凝集することが明らかになった［１０］。緩衝剤：０．２５％（質量／体積）キトサン、１０％（質量／体積）ＰＶＡおよびｐＨ４．４の０．５Ｍ酢酸緩衝剤を補足したより高濃度の組成物中でのフリーズドライ時にも複合体凝集が生じる結果となった［５３］。フリーズドライ時の凝集は、５：１より大きい凍結保護剤：ナノスフェア質量比でのマンニトールの添加によって回避することができた［１０］。キトサンコーティング不在下では、フリーズドライ時のＰＬＧＡ／オリゴヌクレオチド粒子の凝集を１：１より大きい凍結保護剤：ナノスフェア質量比を用いることによってしか回避することができなかった［１０］。
最後に、キトサン／ＤＮＡ複合体は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤中で形成され、水性媒体中での遠心分離によって単離され、金型に濾過された後、凍結保護剤不在下でフリーズドライされた（特公平４−３５４４４５号）［５４］。

【0029】

希薄な状況で調製したポリマー／核酸ポリプレックスの物理化学的特性およびトランスフェクション効率をフリーズドライ時に保持するために、組成物は、ｍＬ当たり０．５〜１ｍｇのＤＮＡの等張性注射への再水和と不適合である濃度の凍結保護剤（二糖、三糖またはポリオール）を含む必要がある。それ故、最終注射投与量は非常に制限される。非常に高張性でなければフリーズドライ組成物をより高濃度に再水和することができないからである。高濃度の凍結保護剤への緩衝剤の添加は、凍結乾燥後のナノ粒子特性の保持に殆ど効果がない。しかし、その存在は、注射前により低い凍結保護剤濃度を有する再水和組成物のｐＨを制御するために必要とされ得る。デキストラン／スクロース組成物により、１０倍濃縮時のフリーズドライ分岐ＰＥＩ系組成物をほぼ等張性に再水和することが可能になるが、これらの組成物は、デキストランとスクロースに限られ、凍結乾燥後の粒径および完全性の維持に必要であり得るいかなる緩衝剤も含まない。

【0030】

別の実施形態では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマーと、核酸分子とフリーズドライ保護剤とを含む。本明細書において用いる表現「フリーズドライ保護剤」は、フリーズドライ材料を保護する分子を指す。フリーズドライ保護剤は、例えば、凍結保護物質および凍結保護剤を含む。公知の凍結保護剤としては、ポリヒドロキシ化合物、例えば、糖（単、二および多糖）、ポリアルコール、およびこれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。トレハロースおよびスクロースは、天然凍結保護剤である。トレハロースは、干ばつ期の間、仮死状態で生き残る（無水生活としても公知）様々な植物［例えば、イワヒバおよびシロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）］、真菌、および無脊椎動物によって生産される。この実施形態のいくつかの実行例では、凍結保護剤は、二糖、三糖、オリゴ糖／多糖、ポリオール、ポリマー、高分子量賦形剤、アミノ酸分子またはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数である。二糖は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオースおよびメリビオースの１つまたは複数であってもよい。二糖は、約０．１％（質量／体積）から約１０％（質量／体積）の間、好ましくは約０．５％（質量／体積）から約５％（質量／体積）の間、より好ましくは約０．５％（質量／体積）から約２％（質量／体積）の間である濃度で本発明の組成物中に存在してもよい。三糖は、マルトースおよびラフィノースの１つまたは複数であってもよい。三糖は、約０．１％（質量／体積）から約１０％（質量／体積）の間、好ましくは約０．５％（質量／体積）から約５％（質量／体積）の間、より好ましくは約０．５％（質量／体積）から約２％（質量／体積）の間の濃度で存在してもよい。オリゴ糖／多糖は、デキストラン、シクロデキストリン、マルトデキストリン、ヒドロキシエチルデンプン、フィコール、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびイヌリンの１つまたは複数であってもよい。オリゴ糖／多糖は、約０．１％（質量／体積）から約１０％（質量／体積）の間、好ましくは約０．５％（質量／体積）から約５％（質量／体積）の間、より好ましくは約０．５％（質量／体積）から約２％（質量／体積）の間である濃度で本発明の組成物中に存在してもよい。デキストランは、生体分子に浸透圧をかけるのに有用であり得る。いくつかの実行例では、デキストランは、１から７０ｋＤａの間、好ましくは１から５ｋＤａの間の平均分子量（Ｍ_n）を有する。ポリオールは、マンニトールおよびイノシトールの１つまたは複数であってもよい。ポリオールは、約０．１％（質量／体積）から約１０％（質量／体積）の間、好ましくは約０．５％（質量／体積）から約５％（質量／体積）の間、より好ましくは約２％（質量／体積）から約３％（質量／体積）の間である濃度で本発明の組成物中に存在してもよい。アミノ酸分子は、リシン、アルギニン、グリシン、アラニンおよびフェニルアラニンの少なくとも１つであってもよい。アミノ酸分子は、約１ｍＭから約１００ｍＭの間、好ましくは約３ｍＭから約１４ｍＭの間、より好ましくは約３ｍＭから約４ｍＭの間である濃度で本発明の組成物中に存在してもよい。高分子量賦形剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ゼラチン、ポリデキストロースおよびピリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の１つまたは複数であってもよい。

【0031】

いくつかの他の実施形態では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマー、核酸分子、フリーズドライ保護剤および緩衝剤を含む。本組成物のための緩衝剤は、クエン酸ナトリウム、ヒスチジン、リンゴ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムの少なくとも１つを含み得る。緩衝剤は、本明細書において定義する組成物中に、約１ｍＭから約１００ｍＭの間、好ましくは約３ｍＭから約１４ｍＭの間、好ましくは約３ｍＭから約８ｍＭの間、より好ましくは約３ｍＭから約４ｍＭの間である濃度で存在してもよい。

【0032】

これらの実施形態のいくつかの事例では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマー、核酸、トレハロースおよびヒスチジンを含む。

【0033】

これらの実施形態のいくつかの事例では、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、核酸、トレハロースおよびヒスチジンを含む。
これらの実施形態の他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマー、核酸、約０．５％（質量／体積）〜約２％（質量／体積）の量のトレハロース、および約３ｍＭ〜約８ｍＭの量のヒスチジンを含む。
これらの実施形態の他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、核酸、約０．５％（質量／体積）〜約２％（質量／体積）の量のトレハロース、および約３ｍＭ〜約８ｍＭの量のヒスチジンを含む。

【0034】

これらの実施形態の他の事例は、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、約５０μｇ／ｍＬの量のデオキシリボ核酸、約０．５％（質量／体積）〜約１％（質量／体積）の量のトレハロース、および約３ｍＭ〜約４ｍＭの量のヒスチジンを含む。
これらの実施形態の他の事例は、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、約１００μｇ／ｍＬの量のリボ核酸、約１％（質量／体積）〜約２％（質量／体積）の量のトレハロース、および約６ｍＭ〜約８ｍＭの量のヒスチジンを含む。
他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマー、核酸、スクロースおよびヒスチジンを含む。
他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、核酸、スクロースおよびヒスチジンを含む。

【0035】

他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、ポリマー、核酸、約０．５％（質量／体積）〜約２％（質量／体積）の量のスクロース、および約３ｍＭ〜約４ｍＭの量のヒスチジンを含む。
他の事例では、高分子電解質複合体組成物は、キトサン、核酸、約０．５（質量／体積）〜約２％（質量／体積）の量のスクロース、および約３ｍＭ〜約４ｍＭの量のヒスチジンを含む。
本実施形態の特定の実行例によると、高分子電解質複合体組成物はフリーズドライされる。分かるであろうが、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ、ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎまたはｃｒｙｏｄｅｓｉｃｃａｉｏｎ）としても公知のフリーズドライは、腐食しやすい材料を保存するためにまたはその材料の輸送をより適便にするために用いられる脱水法である。フリーズドライは、材料を凍結させ、次いで周囲圧を低下させて材料中の凍結水を固相から気相へ直接昇華させることによって作動する。

【0036】

フリーズドライ法は、凍結前に製品を処理する任意の方法を含む前処理工程を含むことがある。この工程は、例えば、これらに限定されるものではないが、安定性を増加させる成分および／もしくは加工を増進する成分の添加、高蒸気圧溶媒の減少、または表面積の増加などの操作含む。前処理方法としては、凍結濃縮、溶液相濃縮、製品の外観を保つための配合、反応生成物を安定させるための配合、表面積を増加させるための配合、および高蒸気圧溶媒の減少が挙げられる。
小規模での凍結は、典型的には、材料をフリーズドライ用フラスコに入れ、シェルフリーザーと呼ばれる槽内でそのフラスコを回転させることによって行われ、前記槽は、機械冷凍、ドライアイスとメタノール、または液体窒素により冷却される。大規模での凍結は、通常、フリーズドライマシンを使用して行われる。この工程では、材料を、その材料の固相と液相が共存できる最低温度であるその三重点より下に冷却することが重要である。これにより、後続の工程で融解ではなく昇華が確実に起こることになる。結晶が大きいほどフリーズドライは容易である。

【0037】

一次乾燥段階中に、圧力を低下させ、水が昇華するために十分な熱を材料に印加する。必要な熱の量は、昇華分子の昇華潜熱を用いて算出することができる。この最初の乾燥段階中に材料中の水の約９５％が昇華される。この段階での圧力を部分真空の印加によって制御する。真空は、昇華を加速するため、計画的乾燥法として有用なものとされる。さらに、冷却コンデンサチャンバおよび／またはコンデンサプレートは、水蒸気が再凝固するための表面を提供する。氷は一次乾燥段階で除去されたので、二次乾燥段階の目的は未凍結水分子の除去である。フリーズドライ法のこの部分は、材料の吸着等温線によって左右される。この段階での温度は、水分子と凍結材料間で形成された一切の物理化学的相互作用を破壊するために、一次乾燥段階での温度より高温に上昇され、０℃より上であることさえある。

【0038】

好適なフリーズドライ装置としては、マニホールド型フリーズドライ装置、回転型フリーズドライ装置およびトレー式フリーズドライ装置が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本発明は、本明細書で定義の高分子電解質複合体および高分子電解質複合体組成物を調製する方法も提供する。この実施形態の一実行例では、前記方法は、ポリマー組成物および核酸組成物を調製する工程、前記ポリマー組成物と前記核酸組成物を混合して高分子電解質複合体組成物を形成する工程を含む。その後、その得られた高分子電解質複合体組成物をフリーズドライすることができる。
この実施形態のいくつかの実行例では、前記方法は、ポリマーを溶解する工程と、溶解されたポリマーを好適なフリーズドライ保護剤および好適な緩衝剤と混合してポリマー組成物を形成する工程とを含む。前記方法は、核酸分子を好適なフリーズドライ保護剤および好適な緩衝剤と混合して核酸組成物を形成する工程も含む。その後、ポリマーと核酸組成物を混合して高分子電解質複合体組成物を形成する。その後、その得られた高分子電解質複合体組成物をフリーズドライすることができる。

【0039】

別の実行例では、前記方法は、キトサンを溶解する工程、および溶解されたキトサンを好適な凍結保護剤および好適な緩衝剤と混合してキトサン組成物を形成する工程を含む。前記方法は、核酸分子を好適な凍結保護剤および好適な緩衝剤と混合して核酸組成物を形成する工程も含む。その後、キトサンと核酸組成物を混合して高分子電解質複合体組成物を形成する。得られた高分子電解質複合体組成物
本発明は、容器、容器上のラベル、本明細書で定義の高分子電解質複合体組成物、および使用説明書のうちの１つまたは複数を含む、製品または商用パッケージもしくはキットも提供する。本明細書で定義の高分子電解質複合体組成物に加えて、製品または商用パッケージもしくはキットは、使用前に高分子電解質複合体組成物を復元するための水も含むことがある。
本発明は、容器、容器上のラベル、本明細書で定義のフリーズドライ高分子電解質複合体組成物、および使用説明書のうちの１つまたは複数を含む、製品または商用パッケージもしくはキットも提供する。本明細書で定義のフリーズドライ高分子電解質複合体組成物に加えて、製品または商用パッケージもしくはキットは、使用前に高分子電解質複合体組成物を復元するための水も含むことがある。好適な

【0040】

この実施形態のいくつかの実行例では、水は対象への注射に好適である。高分子電解質複合体組成物を水で初期濃度の５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍の濃度で復元することができる。１回より多くの復元サイクルを行うことによって、例えば２回の復元サイクルを行うことなどによって、高分子電解質複合体組成物を水で初期濃度の２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍または６０倍の濃度で復元することができる。

【0041】

本明細書で定義の高分子電解質複合体組成物を（各組成物に特異的な、例えば、これらに限定されるものではないが、ｍＬ当たり約１００μｇの核酸などの）希薄条件で調製して、核酸送達用の小さい均一な粒径のナノ粒子を生成することができる。フリーズドライされ再水和された組成物は、小さいナノ粒子径および低い多分散指数を有することができる。
本明細書において用いる用語「多分散性」または「多分散指数」（ＰＤＩ）は、所定のポリマー試料中の分子量の分布の尺度を指す。算出されるＰＤＩは、数平均分子量で割った質量平均分子量である。これは、ポリマーの枝内の個々の分子質量の分布を示す。ＰＤＩは、１以上の値を有するが、ポリマー鎖が均一な鎖長に近づくにつれてＰＤＩは一（１）に近づく。

【0042】

実施形態のいくつかの実行例では、本明細書で定義の新たに調製した、フリーズドライおよび／または再水和組成物は、以下の特性の１つまたは複数を有する：
（Ａ）それらは、トランスフェクション中の細胞取り込みを促進するために正のゼータ電位を有する。ゼータ電位は、複合体形成とフリーズドライ間および組成物再水和と注射間の短期安定化を確保にするために十分な高さのものである。
（Ｂ）それらは、ナノ粒子の均一な凍結乾燥をもたらすので、フリーズドライおよび再水和後の組成物において最小限の凝集しか検出されないか、または凝集は検出されない。
（Ｃ）それらは、フリーズドライおよび再水和後に高分子電解質複合体生物活性を保持する。
本明細書で定義の高分子電解質複合体に関して本明細書において用いる表現「生物活性」は、本明細書で定義の高分子電解質複合体の生物活性、細胞活性または薬理を指し、特に、プラスミドＤＮＡを送達するときのタンパク質を発現するそれらの能力（トランスフェクション効率）およびｓｉＲＮＡを送達するときＲＮＡｉにより遺伝子発現をサイレンシングさせるそれらの能力（両方とも、望ましくない毒性または免疫応答の誘導を伴わない）を指す。これらの生物活性は、好ましくは、特性Ａ〜Ｇの１つまたは複数とともに保持される。

【0043】

Ｄ）診療所での使いやすさのために、本明細書で定義のフリーズドライ組成物は、対象への注射に都合のよい時間内に完全に復元される。
Ｅ）診療所での使用時に限られた注射体積で治療投与量に達するために、本明細書で定義の再水和高分子電解質複合体組成物は、最大核酸濃度を有する。
Ｆ）それらは、より高い最終核酸濃度への再水和時にほぼ等張性になるように最小量の賦形剤を有する。特に、再水和製剤は、注射時の細胞傷害、患者の不快感または疼痛を最小にするためにほぼ等張性である。
Ｇ）本明細書で定義の再水和高分子電解質複合体組成物は、注射時の細胞傷害、患者の不快感または疼痛を最小にするためにほぼ中性のｐＨを有する。特に、本明細書中で定義の組成物は、溶液中でのポリカチオンまたはナノ粒子の沈殿を防止するためにやや酸性であり得る。

【0044】

実施形態のいくつかの実行例では、本明細書中で定義の作りたて組成物、凍結・解凍組成物および／またはフリーズドライされ再水和された組成物は、以下のナノ粒子物理化学的特性の１つまたは複数を提供する：
Ａ）ナノ粒子Ｚ平均は７５０ｎｍ未満、好ましくは５００ｎｍ未満、より好ましくは２５０ｎｍ未満である。ナノ粒子Ｚ平均は、例えばＤＬＳによって決定することができる。
Ｂ）ナノ粒子平均多分散指数（ＰＤＩ）は最大で０．５、好ましくは最大で０．３５、最も好ましくは最大で０．２５である。ナノ粒子平均ＰＤＩは、例えばＤＬＳによって評価することができる。
Ｃ）ナノ粒子平均ゼータ電位は正であり、組成物の短期安定性を確実にするために十分なものである。ナノ粒子平均ゼータ電位は、例えばＬＤＶによって評価することができる。
Ｄ）本発明の組成物には凝集実質的にがない。凝集の存在は、例えばＥＳＥＭによって評価することができる。

【0045】

本明細書で定義の組成物のナノ粒子はまた、以下のインビトロ有効性基準の少なくとも１つまたは複数を提供する：
Ａ）それらは、賦形剤なしの作りたて高分子電解質粒子のトランスフェクションレベルの約１０％より大きい、好ましくは約２５％より大きい、最も好ましくは約５０％より大きいトランスフェクションレベルを提供する。トランスフェクションレベルは、例えばフローサイトメトリーによって評価することができる。
Ｂ）それらは、賦形剤なしの作りたてＣＳ／ＤＮＡ粒子の発現レベルの１０％より大きい、好ましくは２５％より大きい、および最も好ましくは５０％より大きいルシフェラーゼ発現レベルを提供する。ルシフェラーゼ発現レベルは、例えばルミノメトリーによって評価することができる。
Ｃ）それらは、作りたて高分子電解質粒子のサイレンシング効率の１０％より大きい、好ましくは２５％より大きい、最も好ましくは５０％より大きいサイレンシング効率を提供する。サイレンシング効率は、例えばフローサイトメトリーによって評価することができる。

【0046】

本明細書で定義する組成物は、それらを臨床使用に好適なものにする、以下の水和時性能基準の１つまたは複数を提供する：
Ａ）フリーズドライケーキが約１０以内、より好ましくは約９分以内、より好ましくは約８分以内、より好ましくは約７分以内、より好ましくは約６分以内および最も好ましくは約５分以内に完全に復元される。復元レベルは、復元時に目視検査によって評価することができる。

【0047】

Ｂ）最終核酸濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、および最も好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬである。最終ＤＮＡ濃度は、初期ＤＮＡ含有量および用いた再水和率から決定することができる。いくつかの事例では、最終ＤＮＡ濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、および最も好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬである。最終ＲＮＡ濃度は、初期ＤＮＡ含有量および用いた再水和率から決定することができる。いくつかの他の事例では、最終ＲＮＡ濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、および最も好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬである。最終ＲＮＡ濃度は、初期ＲＮＡ含有量および用いた再水和率から決定することができる。

【0048】

Ｃ）本明細書で定義の再水和組成物は、ほぼ等オスモル濃度（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）である。いくつかの事例では、本明細書で定義の再水和組成物は、約１００から７５０ｍＯｓｍの間、好ましくは約１５０から５００ｍＯｓｍの間、および最も好ましくは約２００から約４００ｍＯｓｍの間であるオスモル濃度を有する。再水和組成物のオスモル濃度は、組成物のオスモル濃度モデルで決定することができる。
Ｄ）本明細書で定義の再水和組成物は、ほぼ中性ｐＨを有する。特定の態様では、本明細書で定義の再水和組成物は、５から８の間、より好ましくは５．５から７．５の間、最も好ましくは６から７の間であるｐＨを有する。再水和組成物のｐＨは、ｐＨメーターを使用して決定することができる。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態では、本明細書で定義の組成物を対象の障害または疾患の処置に使用し、前記対象は動物またはヒトである。本明細書において用いる「処置」および「処置すること」は、障害または疾患に関連した病状および症状を予防、抑制および緩和することを含む。処置は、治療有効量の本明細書に記載する組成物を投与することによって行うことができる。いくつかの事例では、本明細書で定義の組成物は、動物またはヒトなどの対象への注射に好適である。注射は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、腹腔内、髄腔内、硬膜外、心臓内、関節内、陰茎海綿体内または硝子体内であり得る。
いくつかの事例では、本明細書に定義の組成物を遺伝子治療に使用することができる。本明細書において用いる表現「遺伝子治療」は、治療用核酸を対象の細胞に送達することにより疾患を処置するための薬物としての核酸、例えばＤＮＡの使用を指す。遺伝子治療の最も一般的な形態は、機能的な治療用遺伝子をコードする核酸を使用して突然変異遺伝子を置換することを含む。他の形態は、突然変異を直接修正すること、または（天然ヒト遺伝子ではなく）治療タンパク薬をコードするＤＮＡを使用して処置を行うことを含む。
この説明は、本発明の範囲を制限するためにではなく本発明を例証するために与える下記実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。

【0050】

実験およびデータ分析
高分子電解質複合体組成物の調製
室温キトサン（Ｍ_n １０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を４ｍＬ Ｌａｂ Ｆｉｌｅガラスバイアルに計り入れ、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水および１Ｎ ＨＣｌを各バイアルに添加した。最終キトサン濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、ＨＣｌ最終濃度は２８ｍＭであった。完全溶解を確実にするために、バイアルを回転板上に配置して一晩、室温で撹拌した。そのキトサン保存溶液を濾過滅菌した。

【0051】

組成物への賦形剤の添加を１）複合体形成後、または２）キトサンおよびＤＮＡ予存溶液を希釈する場合には複合体形成前、または３）キトサンおよびｓｉＲＮＡ保存溶液を希釈する場合には複合体形成前に行った：
１）層流フード下で、保存キトサン溶液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２７１μｇ／ｍＬに希釈し、次いで１００μＬを１００μＬのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰＬｕｃ）と１００μｇ／ｍＬで混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させ、その後、試料体積を、必要に応じて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、および／または無菌２、４もしくは２０％（質量／体積）マンニトール、スクロース、デキストラン５ｋＤａもしくはトレハロース二水和物、および／またはｐＨ４．５もしくは６．５の７０ｍＭクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝剤、またはｐＨ６．５の１３．７５、２７．５もしくは５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジンで、４００μＬにした。

【0052】

２）層流フード下で、保存キトサン溶液を、必要に応じて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、および／または無菌２、４もしくは２０％（質量／体積）スクロース、デキストラン５ｋＤａもしくはトレハロース二水和物、および／またはＨ６．５の１３．７５もしくは５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジンで、２７１μｇ／ｍｌに希釈した。２００μｇ／ｍＬ ＤＮＡ保存溶液を同じ方法に従って１００μｇ／ｍＬに希釈した。その後、１００μＬのキトサン組成物を１００μＬのＤＮＡ組成物と混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させた。
３）層流フード下で、保存キトサン溶液を、必要に応じて、ＲＮａｓｅ不含水、無菌８％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａおよび／またはトレハロース二水和物、およびｐＨ６．５の１４ｍＭ Ｌ−ヒスチジンで、２７１または５４２μｇ／ｍＬに希釈した。１ｍｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡ保存溶液を同じ方法に従って１００または２００μｇ／ｍＬに希釈した。その後、１００μＬのキトサン組成物を１００μＬのｓｉＲＮＡ組成物と混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させた。

【0053】

凍結・解凍する試料を１．５ｍＬクライオバイアルに移し、少なくとも２時間、−１℃／分の速度で−８０℃に凍結させた。使用前３０分間、室温で試料を解凍した。
フリーズドライする試料を２ｍＬ血清バイアルに移し、１３ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーを用いてフリーズドライし、すべての試料を収容しているトレーを透水性膜で覆って埃または細菌汚染を防止した。フリーズドライは、２サイクルの一方を用いて、Ｍｉｌｌｒｏｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｅｒ ＰＣ／ＰＬＣで行った：
１）１時間で室温から−４０℃に勾配凍結し、その後、−４０℃で２時間、等温を維持し；４８時間、−４０℃で、１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で一次乾燥させ；そして１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で二次乾燥させ、１２時間で温度を３０℃に上昇させ、そしてその後、３０℃で６時間、等温を維持する。
２）段階的に５℃に冷却して３０分間、等温で維持し、段階的に−５℃に冷却して３０分間、等温で維持し、その後、３５分間で−４０℃に勾配冷却して２時間、等温で維持し、４８時間、−４０℃で、１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で一次乾燥させ、そして１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で二次乾燥させ、１２時間で温度を３０℃に上昇させ、そしてその後、３０℃で６時間、等温を維持する。

【0054】

試料にストッパーをし、圧着させ、使用するまで４℃で保管した。使用１５〜３０分前に、必要に応じて原体積の１００％、２０％、１０％または５％と同じ体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して試料を再水和した。
４０μＬまたは４００μＬ試料を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により粒径および多分散性（ＰＤＩ）を測定した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水または賦形剤で希釈した、全試料または試料の小部分を、測定に使用した。粒径分析中、賦形剤のタイプおよびそれらの最終濃度によって計器で希釈剤粘度を調整した。各試料について、少なくとも２回の連続粒径分析を２５℃で行い、１２〜２０の逐次的読み取り（１０秒光子カウント／読み取り）の結果として得た各分析を平均してデータセットを得た。各分析に要した逐次的読み取り数を前記装置によって最適化した。Ｚ平均直径、強度による粒径分布、およびＰＤＩを相関関数から導出した。

【0055】

粒子ゼータ電位、すなわち表面電荷、をレーザードップラー速度計測法によって測定した。全試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ水およびＮａＣｌ溶液で希釈して、１０ｍＭ ＮａＣｌを有する８００μＬの試料を得た。賦形剤のタイプおよびそれらの最終濃度によって前記計器で希釈剤粘度を調整した。各試料について、３回の連続ゼータ電位分析を２５℃で行い、１０〜２０の逐次的読み取りの結果として得た各分析を平均してデータセットを得た。各分析に要した逐次的読み取り数を前記装置によって最適化した。
ナノ粒子の形態を環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）撮像によって評価した。気体噴霧法を用いて研磨シリコンウェーハ上で小量の試料を粉砕し、その後、金でスパッタコーティングした。より高い解像度のためにＥＳＥＭの高真空モードを用いて観察を行った。高真空観察パラメータは次の通りであった：加速電圧＝２０ｋＶ、スポットサイズ＝３、作動距離 約５ｍｍ。
測定値を得るために少なくとも１００μＬの試料を要する微小電極を使用して、異なる組成物のｐＨを測定した。

【0056】

初期濃度の２０倍で再水和されたフリーズドライ試料のオスモル濃度の測定に関係する試料の大きな体積、および作りたて溶液のオスモル濃度に対するナノ粒子の明らかな無視できる影響を考えて、賦形剤のみを使用して組成物オスモル濃度を推定するモデルを開発した。スクロース、デキストラン５ｋＤａ、トレハロース二水和物、およびＬ−ヒスチジンの系列希釈物のオスモル濃度を用いて追加のモデルを確立し、その後、それを、５％（質量／体積）デキストラン、５％（質量／体積）トレハロース二水和物、およびｐＨ６．５の３５ｍＭ Ｌ−ヒスチジンを含有する組成物で検証した。次いで、５０μｇのＤＮＡ／ｍＬのナノ粒子を伴う組成物の推定におけるこのモデルの精度を、ｐＨ６．５の３．４４ｍＭヒスチジンと０．５％（質量／体積）スクロース、デキストランまたはトレハロースとを含有するフリーズドライされ再水和された５倍濃縮状態の組成物で検証した。このモデルは、スクロースまたはトレハロースを含有する上記組成物にはそれぞれ６および８％のオスモル濃度過小推定で許容され得たが、デキストラン含有組成物には５７％のオスモル濃度過小推定で不適当であった。

【0057】

ヒト胎児腎２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を使用して、組成物のトランスフェクション効率および遺伝子発現レベルを評価した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したｐＨ７．４の高グルコースＤＭＥＭでＨＥＫ２９３細胞を増殖させ、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。トランスフェクション当日に約５０％集密（ウェル当たり約１５００００細胞）に達するように、トランスフェクション２４時間前に６０，０００細胞／ウェルを２４ウェルプレートにプレーティングした。各試料を使用して２４ウェルプレートの２ウェルにトランスフェクトした。一方のウェルはフローサイトメトリーでのトランスフェクション効率分析用であり、他方のウェルは、ルシフェラーゼ発現定量用であった。各ウェルに、正確な体積のナノ粒子組成物をトランスフェクション培地（１０％ＦＢＳを補足したｐＨ６．５の高グルコースＤＭＥＭ）とともに添加して、２．５μｇのＤＮＡを含有する合計５００μＬのトランスフェクション培地と試料を得た。その後、細胞を２４時間３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、次いでトランスフェクション培地を５００μＬの増殖培地で置換した。細胞をさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした後、分析した。

【0058】

フローサイトメトリーでトランスフェクション効率を測定した。２０，０００事象を試料ごとに収集し、４８８ｎｍアルゴンレーザーを使用してトランスフェクト細胞における増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の励起後に光電子増倍管で５１０／２０ｎｍバンドパスフィルターにより蛍光を検出した。非トランスフェクト細胞を使用してＨＥＫ２９３細胞系自己蛍光を測定し、相応じて蛍光検出ゲートを調整した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）も用いて、記録した事象から死細胞およびデブリを排除した。最後に、そのデータを用いてトランスフェクション効率を分析するときにＦＳＣを用いてそれらの事象から重複を特定し、排除した。

【0059】

Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイを使用して試料中のルシフェラーゼタンパク質含有量を定量することにより遺伝子発現を評価し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定された各試料の全タンパク質含有量に対して正規化した。分析するトランスフェクト試料を含有する各ウェルから増殖培地を除去し、細胞をｐＨ７．４の１００μＬ ＰＢＳで２回洗浄し、ウェル当たり１００μＬのＧｌｏ溶解バッファーを使用して５分間、室温で細胞を溶解し、その後、細胞溶解物を分析まで−２０℃で保管した。溶解物を室温で解凍した。ルシフェラーゼ発現を白色９６ウェルプレートで測定した：２５μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬を２５μＬの細胞溶解物と混合し、その後、発光を測定した。ルシフェラーゼ含有量を相対光単位毎分（ＲＬＵ／分）で表すか、または既知濃度の組換えルシフェラーゼ標準物質の系列希釈物で作成した標準曲線を使用してμｇに変換した。タンパク質含有量を透明９６ウェルプレートで測定した：２００μＬのＢＣＡ研究試薬を２５μＬの細胞溶解物と混合し、試料を３０分間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、次いで室温に冷却し、５６２ｎｍでの吸光度を測定した。２００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質の系列希釈物を使用して作成する、標準曲線を作成し、試料と並行して分析し、吸光度読取値をタンパク質濃度に変換した。

【0060】

増強緑色蛍光タンパク質陽性ヒト非小細胞肺癌（ｅＧＦＰ陽性Ｈ１２９９）細胞を使用して組成物のサイレンシング効率を評価した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したｐＨ７．４のＲＰＭＩ−１６４０で細胞を増殖させ、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。トランスフェクション当日に約７５〜８５％集密に達するようにトランスフェクション２４時間前に４５，０００細胞／ウェルを２４ウェルプレートにプレーティングした。各ウェルに、正確な体積のナノ粒子組成物をｐＨ６．５の高グルコースＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）とともに添加して、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含有する合計５００μＬの培地と試料を得た。その後、細胞を４時間３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、５５μＬ ＦＢＳを補足し、そしてその後、さらに４４時間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした後、分析した。サイレンシング効率をフローサイトメトリーによって測定した。１０，０００事象を試料ごとに収集し、４８８ｎｍアルゴンレーザーを使用してトランスフェクト細胞における増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の励起後に光電子増倍管で５１０／２０ｎｍバンドパスフィルターにより蛍光を検出した。未処置細胞に対するｅＧＦＰ強度の平均減少を計算した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）も用いて、記録した事象から死細胞およびデブリを排除した。最後に、そのデータを用いてトランスフェクション効率を分析するときにＦＳＣを用いてそれらの事象から重複を特定し、排除した。

【実施例】

【0061】

（例１）
凍結保護剤はナノ粒子凝集を防止し、凍結・解凍サイクル後にトランスフェクション効率を保持する
１−キトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン（Ｍｎ １０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を一晩、室温でＨＣｌに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終キトサン濃度を得た。その保存溶液を２７１μｇ／ｍｌに希釈し、次いで１００μＬを１００μＬのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰＬｕｃ）と１００μｇ／ｍＬで混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させ、その後、試料体積を、表１の通り、無菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水および／または無菌２０％（質量／体積）マンニトール、２０％（質量／体積）スクロース、２０％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａ、もしくは２０％（質量／体積）トレハロース二水和物で４００μＬにした。

【0062】

【表1】

【0063】

２−試料凍結・解凍（乾燥なし）
凍結・解凍する試料を１．５ｍＬクライオバイアルに移し、少なくとも２時間、−１℃／分の速度で−８０℃に凍結した。試料を使用前に３０分間、室温で解凍させた。

【0064】

３−ＤＬＳ測定
０．１％〜１０％（質量／体積）の範囲の濃度のマンニトール、スクロースおよびデキストラン５ｋＤａで出発して、凍結保護剤選別を行った。後でトレハロース二水和物を試験したが、最初の３つの凍結保護剤について測定した粒径は、上記のその上限のまま変わらなかったため選別中にさらなる凍結保護剤を添加する必要がないと思われたので、０．１〜３％（質量／体積）の範囲の濃度でしか試験しなかった。２つが新たに調製した試料であり、２つが凍結・解凍サイクル後の試料である４つの試料を、組成物ごとに分析した。各試料について、２回の連続したＤＬＳ粒径分析を行い、１２〜２０の逐次的読み取り（１０秒光子カウント／読み取り）の結果として得た各々を平均してデータセットを得た。各分析に要した逐次的読み取り数をその装置によって最適化した。強度での平均粒径を、そのデータセットから得た相関関数から導出した。凍結保護剤を含有しない組成物は、凍結・解凍時に凝集を示し、粒径が約５倍増加した。少なくとも１％（質量／体積）マンニトール、０．５％（質量／体積）スクロース、０．５％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたは０．１％（質量／体積）トレハロース二水和物を含有する組成物は、凍結・解凍時に１５０ｎｍ未満の強度でのナノ粒子平均粒径を維持した。より高い凍結保護剤含有量では、試料間で粒径変動が見られなかった（±１２５ｎｍ）。マンニトールは、最も有効性の低い凍結保護剤であり、０．１または０．５％（質量／体積）の濃度で凍結・解凍後に粒子は３００ｎｍより大きかった（図１Ａ）。

【0065】

４−ＥＳＥＭ撮像
凍結保護剤を有さない組成物を凍結・解凍前および後に観察した一方、低（１％（質量／体積））および高（１０％（質量／体積））マンニトール、スクロースまたはデキストラン５を含有する試料を凍結・解凍後に観察した。気体噴霧法を用いて研磨シリコンウェーハ上で小量の試料を粉砕し、その後、金でスパッタコーティングした。より高い解像度のために環境制御型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）の高真空モードを用いて観察を行った。高真空観察パラメータは次の通りであった：加速電圧＝２０ｋＶ、スポットサイズ＝３、作動距離 約５ｍｍ。凍結保護剤不在下で新たに調製した複合体は、寸法が２００ｎｍ未満であり、異なる形態（球形、棒状またはドーナツ形）を有したが、大部分は、凍結・解凍後に大きい（５００ｎｍより大きい）球形凝集体を形成した。１または１０％凍結保護剤中で凍結・解凍させた試料は、より球形であり、２００ｎｍより小さいままであった（図２Ａ〜Ｈ）。１％質量／体積マンニトール中で調製した複合体は、ＤＬＳで前に見られたように、スクロースまたはデキストラン５中で調製したものよりわずかに大きいようであった。

【0066】

５−インビトロトランスフェクション
マンニトールを含有する組成物は、前に見られたように凍結・解凍時に粒径を保持する点で最小の有効性であったのでインビトロで試験しなかった。凍結・解凍時に２００ｎｍ未満の粒径を保持することを示し、最大で３％（質量／体積）の凍結保護剤を含有した組成物のみをインビトロアッセイした。これらは、０．５〜３％（質量／体積）スクロース、０．５〜３％（質量／体積）デキストラン５、および０．１〜３％（質量／体積）トレハロース二水和物であった。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したｐＨ７．４の高グルコースＤＭＥＭ中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートしたＨＥＫ２９３細胞を、インビトロ研究に使用した。トランスフェクションのために約５０％集密（１ウェル当たり約１５００００細胞）に達するように、トランスフェクション２４時間前に６０，０００細胞を２４ウェルプレートのウェルごとにプレーティングした。各試料を２４ウェルプレートの２ウェルにトランスフェクトした。一方のウェルはフローサイトメトリーでのトランスフェクション効率分析用であり、他方のウェルは、ルシフェラーゼ発現定量用であった。各ウェルに、正確な体積のナノ粒子組成物をトランスフェクション培地（１０％ＦＢＳを補足したｐＨ６．５の高グルコースＤＭＥＭ）とともに添加して、２．５μｇのＤＮＡを含有する合計５００μＬのトランスフェクション培地と試料を得た。その後、細胞を２４時間３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした。各ウェル中のトランスフェクション培地を５００μＬの増殖培地で置換し、細胞をさらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした後、分析した。

【0067】

６−トランスフェクション効率
フローサイトメトリーを用いてトランスフェクション効率を測定した。試料調製：分析する試料を収容している各ウェルから増殖培地を除去し、細胞をｐＨ７．４の１００μＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ウェル当たり１００μＬのトリプシン／ＥＤＴＡを使用して５分、３７℃でトリプシン処理し、その後、１００μＬ増殖培地を添加し、全試料をサイトメトリーチューブに移した。フローサイトメトリー測定：２００００事象を試料ごとに収集し、４８８ｎｍアルゴンレーザーを使用してトランスフェクト細胞における増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の励起後に光電子増倍管で５１０／２０ｎｍバンドパスフィルターにより蛍光を検出した。非トランスフェクト細胞を使用してＨＥＫ２９３細胞系自己蛍光を測定し、相応じて蛍光検出ゲートを調整した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）も用いて、記録した事象から死細胞およびデブリを排除した。最後に、そのデータを用いてトランスフェクション効率を分析するときにＦＳＣを用いてそれらの事象から重複を特定し、排除した。凍結・解凍組成物中のトランスフェクト細胞の百分率を、全細胞の４３％のトランスフェクション効率を有した、凍結保護剤を含有しない新たに調製した複合体（０ＦＴ）で得られたトランスフェクト細胞の百分率に対して表した。インビトロ試験した凍結保護剤を含有するすべての組成物は、凍結・解凍後にトランスフェクション効率を保持し、新たに調製した複合体のものの少なくとも８７％のトランスフェクションレベルであった。凍結保護剤不在下で凍結・解凍したナノ粒子は、新たに調製した複合体のものの２５％のトランスフェクションレベルしか有さなかった（図１Ｂ）。

【0068】

７−ルシフェラーゼ発現
相対光単位毎分（ＲＬＵ／分）でのルシフェラーゼ発現を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイを使用して測定し、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで測定した各試料における全タンパク質含有量に対して正規化した。試料調製：分析する試料を収容している各ウェルから増殖培地を除去し、ｐＨ７．４の１００μＬ ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ウェル当たり１００μＬ Ｇｌｏ溶解バッファーを使用して５分間、室温で細胞を溶解し、その後、細胞溶解物を分析まで−２０℃で保管した。溶解物を使用前に室温で解凍した。ルシフェラーゼ発現定量：白色９６ウェルプレートにおいて２５μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ試薬を２５μＬの細胞溶解物と混合し、その後、発光を測定した。タンパク質含有量定量：透明９６ウェルプレートにおいて２００μＬのＢＣＡ研究試薬を２５μＬの細胞溶解物と混合し、試料を３０分間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、その後、室温に冷却し、５６２ｎｍでの吸光度を測定した。２００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質の系列希釈物を使用して作成する、標準曲線を作成し、試料と並行して分析し、吸光度読取値をタンパク質濃度に変換した。ルシフェラーゼ発現レベルを、タンパク質１ｍｇ当たり８．０３×１０¹⁰ＲＬＵ／分の発現レベルを有する、凍結保護剤不在下の作りたてキトサン／ＤＮＡ複合体について得た値に対して正規化した。ルシフェラーゼ発現は、作りたて対照より４０〜６０％低い発現レベルを有した１％および３％（質量／体積）トレハロースをそれぞれ配合した試料を除いて、作りたて複合体と凍結保護剤存在下で凍結・解凍した複合体との間で同様であった。凍結保護剤不在下で凍結・解凍した試料は、作りたて対照より７５％少ないルシフェラーゼを発現した（図１Ｃ）。

【0069】

【表2】

【0070】

（例２）
凍結・解凍時のナノ粒子凝集を防止する低凍結保護剤含有量組成物はフリーズドライ中の凝集を防止できない
１−キトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
凍結保護剤を含有しないナノ粒子組成物（組成物＃１）または０．５％（質量／体積）スクロースを含有するナノ粒子組成物（組成物＃９）、０．５％（質量／体積）デキストラン５を含有するナノ粒子組成物（組成物＃１５）もしくは０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物を含有するナノ粒子組成物（組成物＃２１）を、実施例１に記載の通り調製した。フリーズドライする試料を２ｍＬ血清バイアルに移し、１３ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーをしてフリーズドライし、すべての試料を収容しているトレーを透水性膜で覆って埃または細菌汚染を防止した。
２−試料フリーズドライ
フリーズドライは、次のサイクルを用いて、Ｍｉｌｌｒｏｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｅｒ ＰＣ／ＰＬＣで行った：１時間で室温から−４０℃に勾配凍結し、その後、−４０℃で２時間、等温を維持し；４８時間、−４０℃で、１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で一次乾燥させ；そして１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で二次乾燥させ、１２時間で温度を３０℃に上昇させ、そしてその後、３０℃で６時間、等温を維持する。試料にストッパーをし、圧着させ、使用するまで４℃で保管した。使用１５〜３０分前に、フリーズドライ前の初期体積と同じ体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して試料を再水和した。すべての試料が５分以内に再水和されたが、凍結保護剤を用いると再水和が瞬時に起こり、いずれの凍結保護剤も用いないほうがわずかに遅かった。

【0071】

３−ＤＬＳ測定
２つが新たに調製した試料であり、２つがフリーズドライして初期体積に再水和した後の試料である、４つの試料を組成物ごとに分析した。各試料について、２または３回の連続した粒径分析を行い、１２〜２０の逐次的読み取り（１０秒光子カウント／読み取り）の結果として得た各々を平均してデータセットを得た。各分析に要した逐次的読み取り数をその装置によって最適化した。Ｚ平均直径、強度での平均粒径およびＰＤＩを、そのデータセットから得た相関関数から導出した。すべてのフリーズドライして再水和した組成物は、新たに調製したナノ粒子と比較して大きい凝集体を生じさせた：Ｚ平均は、最大２４倍増加し（図３Ａ）、強度での平均粒径は、最大９．５倍増加し（図３Ｂ）、ＰＤＩ値は、０．７より上であり、約４倍の平均増加であった（図３Ｃ）。

【0072】

４−ゼータ電位測定
２つが新たに調製した試料であり、２つがフリーズドライして初期体積に再水和した後の試料である、４つの試料を組成物ごとに分析した。フリーズドライ試料を、フリードライ前のそれらの体積と同じ体積のＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して再水和し、その後、１５〜３０分間放置して安定させた。作りたて試料および再水和試料に４００μＬ ２０ｍＭ ＮａＣｌを補足し、必要に応じて、それらの体積をゼータ電位分析前にＭｉｌｌｉ−Ｑ水で８００μＬにした。ゼータ電位をレーザードップラー速度計測法（ＬＤＶ）によって測定した。各試料について、３回の連続したゼータ電位分析を行い、１０〜２０回の逐次的読み取りの結果として得た各々を平均してデータセットを得た。各分析に要した逐次的読み取り数をその装置によって最適化した。新たに調製した組成物は、３０から３２ｍＶの間のゼータ電位を有し、したがって、凍結保護剤はナノ粒子の表面電荷に対して影響を及ぼさなかった。フリーズドライして再水和した組成物は、０〜−５ｍＶのゼータ電位を有した（図３Ｄ）。

【0073】

【表3】

【0074】

（例３）
クエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝剤系はキトサン系組成物と相溶性でない−クエン酸三ナトリウムはキトサンゲル化を促進する
１−キトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン（Ｍｎ１０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を一晩、室温でＨＣｌに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終キトサン濃度を得た。その保存溶液を２７１μｇ／ｍｌに希釈し、その後、１００μＬを１００μＬのプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰＬｕｃ）と１００μｇ／ｍＬで混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させ、その後、試料体積を、表４の通り、無菌２％（質量／体積）スクロース、２％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたは２％（質量／体積）トレハロース二水和物と、ｐＨ４．５または６．５の無菌７０ｍＭクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝剤とで４００μＬにした。

【0075】

【表4】

【0076】

２−試料凍結・解凍
試料を実施例１に記載の通りに凍結・解凍した。
３−ＤＬＳ測定
調製した作りたておよび凍結・解凍試料を、実施例２に記載の通りに粒径およびＰＤＩについて分析した。クエン酸／クエン酸三ナトリウムを含有する組成物は、凍結・解凍前に大きい粒子を形成し、強度での平均粒径は９００ｎｍより大きかった（図４Ｂ）。凍結・解凍後、試料は完全に凝集し、ＤＬＳ分析に適さず、Ｚ平均は３５００ｎｍより上であり（図４Ａ）、ＰＤＩ値は０．６６より上であった（図４Ｃ）。

【0077】

４−クエン酸／クエン酸三ナトリウム不相溶性
キトサン、スクロースまたはトレハロース二水和物を、図５の通り、ｐＨ６．２のクエン酸／クエン酸三ナトリウム緩衝剤と混合するか、またはキトサンをクエン酸もしくはクエン酸三ナトリウムのみと混合した。

【0078】

【表5】

【0079】

キトサン溶液は、緩衝剤またはクエン酸三ナトリウムの存在下で濁ってきたが、クエン酸の存在下では濁ってこなかった（データを示さない）。濁度は、クエン酸三ナトリウムの存在下で最大であり、キトサン／クエン酸三ナトリウム混合物のゲル化により溶液中で白色雲状構造が形成した（データを示さない）。ゲル化は、負電荷を有する三価クエン酸三ナトリウムによる正電荷を有するキトサン鎖の架橋によって生じ得る（データを示さない）。

【0080】

【表6】

【0081】

（例４）
Ｌ−ヒスチジンはキトサン系組成物と不相溶性であり、多分散指数がより低いナノ粒子懸濁液をもたらす
１−ＥＳＥＭ撮像のためのキトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン／ＤＮＡ複合体を実施例３に記載の通り調製した。室温で３０分間の複合体安定化後、試料体積を、表７の通り、無菌４％（質量／体積）スクロース、４％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたは４％（質量／体積）トレハロース二水和物、ｐＨ６．５の無菌５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤またはＭｉｌｌｉ−Ｑ水で４００μＬにした。

【0082】

【表7】

【0083】

２−ＥＳＥＭ撮像
ＥＳＥＭ試料調製および撮像は、実施例１に記載の通り行った。凍結保護剤またはヒスチジン不在下で配合した作りたてナノ粒子は、球形、棒状またはドーナツ形の形態を有した（図５Ａ）が、ｐＨ６．５および１３．７５ｍＭの最終濃度のＬ−ヒスチジンの添加後、より球形であった（図５Ｂ）。１３．７５ｍＭヒスチジンを有するまたは有さない１％（質量／体積）凍結保護剤中での複合体の配合は、観察されたナノ粒子に同様の影響を及ぼした。

【0084】

３−凍結・解凍後のＤＬＳ分析のためのキトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン／ＤＮＡ複合体を実施例３に記載の通り調製した。室温で３０分間の複合体安定化後、試料体積を、表８の通り、無菌２％（質量／体積）スクロース、２％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたは２％（質量／体積）トレハロース二水和物と、ｐＨ６．５の無菌５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤またはＭｉｌｌｉ−Ｑ水とで４００μＬにした。試料を実施例１に記載の通り凍結・解凍した。

【0085】

【表8】

【0086】

４−ＤＬＳ測定
ヒスチジンなしの各組成物の二つ組（組成物＃９〜１１）を新たに調製して分析した。ヒスチジンを有する各組成物の二つ組（組成物＃１２〜１４）を新たに調製して凍結・解凍後に分析した。粒径およびＰＤＩ分析は実施例２に記載の通り行った。ヒスチジンの添加は、作りたて組成物に殆ど影響を及ぼさなかった（図６Ａ〜Ｃ）：Ｚ平均は、スクロースおよびトレハロースの存在下でそれぞれ３０および１３ｎｍ増加し、デキストランの存在下で３４ｎｍ減少し、強度での平均粒径は、スクロースおよびトレハロースの存在下でそれぞれ１２および２９ｎｍ増加し、デキストランの存在下で４８ｎｍ減少し、ＰＤＩは、すべての凍結保護剤の存在下で０．０５減少した。ヒスチジンの存在下で凍結・解凍時に組成物において有害反応は見られなかった（図６Ａ〜Ｃ）：Ｚ平均および強度での平均粒径は２００ｎｍ未満であり、平均ＰＤＩ値は０．３５未満であった。

【0087】

【表9】

【0088】

（例５）
Ｌ−ヒスチジンは、凍結保護剤を含有する組成物に添加したとき、フリーズドライ後のナノ粒子凝集を防止する
組成物をナノ粒子径およびＰＤＩを有意に変化させることなく最大２０倍濃縮することができ；
組成物中のＬ−ヒスチジンを最少にし、その上、フリーズドライ後の粒子凝集をなお防止することができる。

【0089】

１−フリーズドライおよびより高濃度への再水和のためのキトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン／ＤＮＡ複合体を実施例３に記載の通り調製した。室温で３０分間の複合体安定化後、試料体積を、表１０の通り、無菌２％（質量／体積）スクロース、２または４％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物と、ｐＨ６．５の５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤とで４００μＬにした。

【0090】

【表10】

【0091】

Ｒｈ１Ｘ、Ｒｈ５ＸおよびＲｈ１０Ｘ：組成物＃３〜５の６試料（表１０参照）を実施例２に記載の通り調製し、フリーズドライした。各組成物について、２つの試料を４００μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑでそれらの原体積に再水和（Ｒｈ１Ｘ）し、２つを８０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで再水和５倍濃縮（Ｒｈ５Ｘ）し、２つを４０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで再水和１０倍濃縮（Ｒｈ１０Ｘ）した。Ｒｈ１ＸおよびＲｈ２０Ｘについては、組成物＃１、２および４（表１０参照）の４つの試料を実施例２に記載の通り調製し、フリーズドライした。各組成物について、２つの試料を４００μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｒｈ１Ｘ）でそれらの原体積に再水和し、２つを２０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で再水和２０倍濃縮（Ｒｈ２０Ｘ）した。再水和試料を１５〜３０分間放置して安定させた後、分析した。すべての試料は５分以内に再水和したが、Ｒｈ２０Ｘは、そのケーキ体積に比べて小さい再水和体積を考えると、より達成困難であった。

【0092】

２−より高濃度に再水和された組成物のＤＬＳ測定
粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。組成物＃３〜５（１３．７５ｍＭ ヒスチジンと１％（質量／体積）デキストラン、または０．５もしくは１％（質量／体積）トレハロース二水和物）の最大１０倍濃縮される再水和（Ｒｈ１Ｘ〜Ｒｈ１０Ｘ）は、１２０から１５５ｎｍまで幅がある粒子Ｚ平均に対して影響を及ぼさず（図７Ａ）、または１３１から１６５ｎｍまで幅がある強度での平均粒径に対して影響を及ぼさなかった（図７Ｂ）。ナノ粒子ＰＤＩ値は、濃縮率が増加すると０．１８から０．０５に減少した（図７Ｃ）。１３．７５ｍＭヒスチジンに併せた０．５％スクロースまたはトレハロースを含有する組成物であって、それらの初期濃度の２０倍で再水和された組成物は、２５０ｎｍ（Ｚ平均、図７Ｄ）または２００ｎｍ（強度での平均粒径、図７Ｅ）より小さい粒子を生じさせ、デキストランおよびＲｈ２０Ｘを含有する組成物は、３０５ｎｍのＺ平均（図７Ｄ）および３２４ｎｍの強度での平均粒径（図７Ｅ）を有した。０．３７のＰＤＩを有した０．５％デキストランＲｈ１Ｘを除いて、すべての組成物が０．２未満のＰＤＩ値を有し、組成物Ｒｈ２０Ｘ中のナノ粒子は、組成物ＲＨ１Ｘでのものより劣ったＰＤＩ値を有した（図７Ｆ）。

【0093】

３−より低いヒスチジン含有量を有するフリーズドライ用のキトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン／ＤＮＡ複合体を実施例３に記載の通り調製した。室温で３０分間の複合体安定化後、試料体積を、表１１の通り、無菌２％（質量／体積）スクロース、デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物と、ｐＨ６．５の５５、２７．５または１３．７５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤とで４００μＬにした。

【0094】

【表11】

実施例２に記載の通り各組成物の二つ組を調製し、フリーズドライし、そしてその後、それらの原体積に４００μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで再水和した（Ｒｈ１Ｘ）。

【0095】

４−より低いヒスチジン含有量を有するフリーズドライ組成物のＤＬＳ測定
粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。ヒスチジン含有量の減少は、０．５％（質量／体積）スクロースまたはトレハロース二水和物を含有する再水和組成物の粒径に影響を及ぼさず、粒子の直径は１６０ｎｍ未満であった（図７Ｇ〜Ｈ）。これら２つの組成物のＰＤＩは、ヒスチジン含有量を１３．７５から３．４４ｍＭに低下させたとき、０．２５以下のままであった（図７Ｉ）。デキストラン組成物Ｒｈ１ＸのＺ平均および強度での平均粒径は、ヒスチジン濃度を１３．７５から３．４４ｍＭに低下させると、それぞれ、１５１から７１ｎｍに、および４７７から１５７ｎｍに減少した（図７Ｇ〜Ｈ）。これらの組成物の平均ＰＤＩは、ヒスチジン含有量を１３．７５から６．８８ｍＭに低下させると０．３７から０．２５に減少し、３．４４ｍＭヒスチジンでの最終ＰＤＩは０．２４であった（図７Ｉ）。

【0096】

５−オスモル濃度モデルおよび推定値
２０倍小さい体積（２０倍濃縮）で再水和されるフリーズドライ試料のオスモル濃度を測定するために要する作りたて試料の大きい体積を考えて、組成物オスモル濃度を推定するためのモデルを開発した。ナノ粒子オスモル濃度が無視できると仮定して、賦形剤（スクロース、デキストラン５ｋＤａ、トレハロース二水和物およびＬ−ヒスチジン）のみの系列希釈物を使用してモデルを確立した。得られたモデルは、５％（質量／体積）デキストランと５％（質量／体積）トレハロース二水和物とｐＨ６．５の３５ｍＭ Ｌ−ヒスチジンとを含有する組成物のオスモル濃度を１．８％の精度で予測した。このモデルに基づき、オスモル濃度は、凍結保護剤、ヒスチジン含有量、および再水和による濃縮率に依存して、４から５７０ｍＯｓｍの間で変動した。スクロースを含有する組成物のオスモル濃度のほうが高く、デキストラン５ｋＤａを含有する組成物のオスモル濃度のほうが低かった。２つの組成物は、等張性に近かった：２７９ｍＯｓｍの０．５％ｄｅｘ−ｈｉｓ（１３．７５）−Ｒｈ２０Ｘ、および２６８ｍＯｓｍの０．５％ｄｅｘ−ｈｉｓ（１３．７５）−Ｒｈ１０Ｘ。

【0097】

【表12】

【0098】

（例６）
複合体形成前に核酸およびキトサンに凍結保護剤および緩衝剤を添加することにより作りたて組成物中のナノ粒子濃度を最大にすることができ；
これらの組成物中の凍結保護剤および緩衝剤含有量を最少にすることにより、ほぼ等張性のままでより高い濃度にケーキを復元することが可能になり；および
ナノ粒子物理化学的特性およびトランスフェクション効率を有意に変化させることなくこれらの組成物を最大２０倍濃縮することができる。

【0099】

１−１３．７５ｍＭヒスチジンを含有する濃縮キトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン（Ｍｎ１０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を一晩、室温でＨＣｌに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終キトサン濃度を得た。そのキトサン保存溶液を、表１３の通り、無菌凍結保護剤溶液（２または４％（質量／体積）スクロース、デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物）、ｐＨ６．５の無菌５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して２７１μｇ／ｍｌに希釈した。

【0100】

【表13】

【0101】

表１４の通り、無菌凍結保護剤溶液（２または４％（質量／体積）スクロース、デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物）、ｐＨ６．５の無菌５５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、および／またはＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用してＤＮＡ（２００μｇ／ｍＬでのｐＥＧＦＰＬｕｃ）保存溶液を１００μｇ／ｍｌに希釈した。

【0102】

【表14】

【0103】

各組成物の二つ組を調製した。各二つ組について、１００μＬのキトサン溶液と１００μＬのその相補ＤＮＡ溶液（例えば、キトサン組成物＃１とＤＮＡ組成物＃１）を混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させた後、分析した。

【0104】

２−１３．７５ｍＭヒスチジンを含有する濃縮組成物のＤＬＳ測定
粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。複合体形成後ではなく前のキトサンまたはＤＮＡへの凍結保護剤およびＬ−ヒスチジンの添加により、２００ｎｍ未満のＺ平均、２５０ｎｍ未満の強度での平均粒径および０．３未満のＰＤＩ値を有する、２倍希釈された組成物組成物の生成が可能になった（図８Ａ〜Ｄ）。Ｌ−ヒスチジンなしで調製した組成物は、Ｚ平均が１１５から１７６ｎｍの間の様々であり、強度での平均粒径が１４４から２１４の間であり、ＰＤＩ値が０．２１から０．２６の間である粒子を有し、Ｌ−ヒスチジン（Ｌ−ｈｉｓｔｄｉｎｅ）を用いて調製した組成物のほうがわずかに粒径が大きく、Ｚ平均は１４３から１８７ｎｍの間であり、強度での平均粒径は１６５から２３７ｎｍの間であったが、より小さいＰＤＩ値（０．１３〜０．１８）を有した（図８Ａ〜Ｃ）。複合体形成前のキトサンおよびＤＮＡへの賦形剤の添加は、ナノ粒子形成後に添加したときに以前に見られたものよりわずかに大きい粒子を生じさせたが、ＰＤＩ値は同様のままであった（図８Ｃ〜Ｅの「０ＦＴ，Ｈｉｓなし」および「０ＦＴ，１３．７５ｍＭ Ｈｉｓ，ｐＨ６．５」を参照されたい）。

【0105】

３−より高濃度に再水和するための３．４４ｍＭヒスチジンを含有する濃縮キトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン／ＤＮＡ複合体をセクション１に記載の通り調製したが、表１５および１６の通り、５５ｍＭではなく１３．７５ｍＭのヒスチジン保存溶液を使用してキトサンおよびＤＮＡを希釈した。

【0106】

【表15】

【0107】

【表16】

【0108】

試料を実施例２に記載の通りフリーズドライした。Ｒｈ１Ｘ試料を２００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再水和し、Ｒｈ１０Ｘ試料を２０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再水和し、Ｒｈ２０Ｘ試料を１０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で再水和した。すべての試料は５分以内に再水和したが、Ｒｈ２０Ｘは、そのケーキ体積に比べて小さい再水和体積を考えると、より達成困難であった。
４−より高濃度に再水和された、３．４４ｍＭヒスチジンを含有する濃縮組成物のＤＬＳ測定
他の組成物（＃１７〜１９）の各々についての６つの複製物：２つのＲｈ１Ｘ、２つのＲｈ１０Ｘおよび２つのＲｈ２０Ｘ、をセクション３に記載の通り調製した。粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。３．４４ｍＭヒスチジンのみを用いてフリーズドライしたナノ粒子を、粒子凝集を見ることなく、最大２０倍に再水和することができ、凍結保護剤に依存して、粒子Ｚ平均が３〜６８ｎｍ増加し、強度での平均粒径がＲｈ１Ｘと比較して７〜４６ｎｍ増加した（図８Ｄ〜Ｅ）。再水和濃縮率を１Ｘから２０Ｘに増加させるとＰＤＩ値が減少し、ＰＤＩは、スクロース組成物については０．１７から０．０６に、デキストラン組成物については０．４０から０．１８に、およびトレハロース二水和物組成物については０．１５から０．１０になった（図８Ｆ）。

【0109】

５−より高濃度に再水和された、３．４４ｍＭヒスチジンを含有する濃縮組成物のゼータ電位測定
組成物＃１５の二つ組をＲｈ１Ｘ調製し、他の組成物（＃１７〜１９）の各々についての６つの複製物（２つの作りたて、２つのＲｈ１Ｘ、および２つのＲｈ２０Ｘ）をセクション３に記載の通り調製した。再水和試料を１５〜３０分間放置して安定させた。すべての試料は５分以内に再水和したが、Ｒｈ２０Ｘは、そのケーキ体積に比べて小さい再水和体積を考えると、より達成困難であった。作りたて試料および再水和試料に６００μＬ １３ｍＭ ＮａＣｌを補足し、ゼータ電位分析前に必要に応じてそれらの体積をＭｉｌｌｉ−Ｑで８００μＬにした。ゼータ電位を実施例２に記載の通り測定した。新たに調製した組成物は、２４ｍＶのゼータ電位を有し、フリーズドライして再水和した組成物は、それらの凍結保護剤または再水和体積に関係なく、１８〜２１ｍＶのゼータ電位を有した（図８Ｇ）。

【0110】

６−より高濃度に再水和された、３．４４ｍＭヒスチジンを含有する濃縮組成物のＥＳＥＭ撮像
他の組成物（＃１７〜１９）の各々についての６つの複製物：２つのＲｈ１Ｘ、２つのＲｈ１０Ｘおよび２つのＲｈ２０Ｘ、をセクション３に記載の通り調製した。ＥＳＥＭ試料調製および撮像は、実施例１に記載の通り行った。３．４４ｍＭヒスチジンを含有する組成物について観察されたナノ粒子は、１３．７５ｍＭヒスチジンを含有する組成物について以前に観察されたものより球形でない形状であった。これは、ＤＬＳで観察されたＰＤＩの変動と一致する。フリーズドライした後Ｒｈ１Ｘした組成物と、フリーズドライした後Ｒｈ２０Ｘした組成物の間に有意差は観察されなかったが、それらは、新たに調製した組成物より球形の粒子を有するようであった。粒子は、大部分が、２００ｎｍより下の直径であった（データを示さない）。

【0111】

７−インビトロトランスフェクション
各組成物（＃１５〜２２）の６つの複製物：２つの作りたて、２つのＲｈ１Ｘ、および２つのＲｈ２０Ｘ、をセクション３に記載の通り調製した。Ｆｕｇｅｎｅベースリポプレックスをトランスフェクション効率の陽性対照として使用した。インビトロトランスフェクションを実施例１に記載の通り行った。

【0112】

８−ｐＨ
組成物＃１５〜２２のｐＨを、新たに調製した試料、およびフリーズドライしてそれらの初期体積に再水和した（Ｒｈ１Ｘ）またはそれらの初期体積の二十分の一に再水和した（Ｒｈ２０Ｘ）試料に関して測定した。Ｌ−ヒスチジン不在下で、新たに調製した試料は、凍結保護剤の存在または性質に関係なく５．８±０．２の平均ｐＨを有した。それらの平均ｐＨは、Ｒｈ１Ｘ後に７．０±０．２、およびＲｈ２０Ｘ後に５．１±０．２であった。３．４４ｍＭ Ｌ−ヒスチジンを含有する新たに調製した組成物は、凍結保護剤の存在または性質に関係なく６．４２±０．０５の平均ｐＨを有したが、フリーズドライ試料のｐＨは、Ｒｈ１Ｘ後に６．５０±０．０６、およびＲｈ２０Ｘ後に６．４８±０．０２であった。

【0113】

９−オスモル濃度
上記方法は、２倍の複合体量を有する組成物を生じさせたので、前に開発したオスモル濃度モデルの妥当性を、フリーズドライして再水和５倍濃縮した組成物＃１７〜１９について検証した。このモデルは、スクロースを含有する組成物（＃１７）またはトレハロースを含有する組成物（＃１９）にはそれぞれ６および８％のオスモル濃度過小推定で許容され得たが、デキストランを含有する組成物（＃１８）には５７％のオスモル濃度過小推定で不適当であった。組成物＃１７および１９のオスモル濃度を、作りたて、またはそれらの初期体積に再水和された（Ｒｈ１Ｘ）、それらの初期体積の十分の一に再水和された（Ｒｈ１０Ｘ）およびそれらの初期体積の二十分の一に再水和された（Ｒｈ２０Ｘ）フリーズドライ試料について推定した。このモデルに基づき、オスモル濃度は、スクロースを含有する試料については１９から３７２ｍＯｓｍの間で変動し、トレハロース二水和物を含有する試料については１７から３３９ｍＯｓｍの間で変動した。両方の組成物Ｒｈ２０Ｘが等張性に近かった：３７２ｍＯｓｍでの０．５％ｓｕｃ−ｈｉｓ（３．４４）−Ｒｈ２０Ｘ、および３３９ｍＯｓｍでの０．５％ｔｒｅ−ｈｉｓ（３．４４）−Ｒｈ２０Ｘ。

【0114】

１０−トランスフェクション効率
トランスフェクション効率を実施例１に記載の通り測定した。試料トランスフェクション効率を、全細胞の５３％のトランスフェクション効率を有した賦形剤不在下の作りたて複合体（図９Ａ、Ａ：Ｌｙｏなし−Ｈｉｓ（０）−作りたて）について得た値に対して正規化した。Ｆｉｇｅｎｅは、作りたて対照の１１６％のトランスフェクション効率を有した（図９Ａおよび９Ｃ）。ヒスチジンなしの作りたて組成物は、作りたて対照の９０〜１００％のトランスフェクション効率を有し（図９Ａ）、３．４４ｍＭヒスチジンを有する作りたて組成物は、作りたて対照の１０８〜１１３％のトランスフェクション効率を有した（図９Ｃ）。凍結保護剤不在下で３．４４ｍＭヒスチジンを用いてまたはなしでフリーズドライした組成物は、対照の２２％未満のトランスフェクション効率を有した（図９Ａおよび９Ｃ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤を用いて、しかしヒスチジンなしでフリーズドライした組成物は、対照の約４０％のトランスフェクション効率を有した（図９Ａ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤および３．４４ｍＭヒスチジンを用いてフリーズドライし、再水和１Ｘ（Ｒｈ１Ｘ）した組成物は、作りたて対照に比べて、スクロースについては１００％、デキストランについては８５％、およびトレハロースについては８３％のトランスフェクション効率を有した（図９Ｃ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤および３．４４ｍＭヒスチジンを用いてフリーズドライし、再水和２０Ｘ（Ｒｈ２０Ｘ）した組成物は、作りたて対照に比べて、スクロースについては４８％、デキストランについては５３％、およびトレハロースについては７８％のトランスフェクション効率を有した（図９Ｃ）。

【0115】

１１−ルシフェラーゼ発現
ルシフェラーゼ発現を実施例１に記載の通り定量した。測定したルシフェラーゼ相対光単位毎分（ＲＬＵ／分）を、既知濃度の組換えルシフェラーゼ標準物質の系列希釈物で作成した標準曲線を用いてμＭに変換した。試料ルシフェラーゼ発現レベルを、タンパク質１ｍｇ当たり６．７６×１０^-5μＭのルシフェラーゼの発現レベルを有した賦形剤不在下の作りたてキトサン／ＤＮＡ複合体（Ｃｔｌ）について得た値に対して正規化した。凍結保護剤不在下で３．４４ｍＭヒスチジンを用いてまたはなしでフリーズドライした組成物は、対照について測定されたルシフェラーゼレベルの１０％未満を発現した（図９Ｂおよび９Ｄ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤を用いて、しかしヒスチジンなしでフリーズドライした組成物は、対照について測定されたルシフェラーゼレベルの２５％未満を発現した（図９Ｂ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤および３．４４ｍＭヒスチジンを用いてフリーズドライし、再水和１Ｘ（Ｒｈ１Ｘ）した組成物は、スクロースおよびトレハロース二水和物については陽性対照と同様のルシフェラーゼ発現レベル、ならびにデキストランについては陽性対照の５６％のルシフェラーゼ発現レベルを有した（図９Ｄ）。０．５％（質量／体積）凍結保護剤および３．４４ｍＭヒスチジンを用いてフリーズドライし、再水和２０Ｘ（Ｒｈ２０Ｘ）した組成物は、スクロースについては陽性対照と同様のルシフェラーゼ発現レベル、デキストランについては陽性対照の１２％のルシフェラーゼ発現レベル、およびトレハロース二水和物については陽性対照の６５％のルシフェラーゼ発現レベルを有した（図９Ｄ）。

【0116】

【表17】

【0117】

（例７）
注射前の最終再水和が助長するために２回の逐次的フリーズドライ／再水和サイクルを用いて組成物を最大２０倍濃縮（ケーキ体積に対してより大きい再水和体積）することができ、これは、ナノ粒子の物理化学的特性およびトランスフェクション効率の有意に変化を伴わない
１−複数回のフリーズドライのための０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有するキトサン／ＤＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン（Ｍｎ １０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を一晩、室温でＨＣｌに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終キトサン濃度を得た。そのキトサン保存溶液を、表１８の通り、無菌２％（質量／体積）トレハロース二水和物、ｐＨ６．５の無菌１４ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、２７１μｇ／ｍｌに希釈した。

【0118】

【表18】

【0119】

表１９の通り、無菌２％（質量／体積）トレハロース二水和物、ｐＨ６．５の無菌１４ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水を使用して、ＤＮＡ（４００μｇ／ｍＬでのｐＥＧＦＰＬｕｃ）保存溶液を１００μｇ／ｍｌに希釈した。

【0120】

【表19】

【0121】

２１の試料を調製した。各試料について、６２５μＬの希釈キトサン溶液（表１８）を６２５μＬの希釈ＤＮＡ溶液（表１９）と混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させた後、分析またはフリーズドライした。

【0122】

２−試料フリーズドライ
１５の試料をフリーズドライした。各試料について、表２０の通り１２００μＬを１０ｍＬ血清バイアルに移し、実施例２に記載の通り２０ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーを用いてフリーズドライした。６つの試料を１２０μＬで再水和Ｒｈ１０Ｘし、その後、表２０の通り各試料の１００μＬを２ｍＬ血清バイアルに移し、実施例２に記載の通り１３ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーを用いてフリーズドライした。３つの試料を２４０μＬで再水和Ｒｈ５Ｘし、その後、表２０の通り、２００μＬを使用して、一方のバイアルはＤＬＳ分析用であり、他方はトランスフェクション用である２つの２ｍＬ血清バイアルに１００μＬの試料を充填した。実施例２に記載の通り１３ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーを用いて試料をフリーズドライした。

【0123】

【表20】

３−ＤＬＳまたはトランスフェクションのための試料の再水和
実験により、再水和試料の希釈がナノ粒子特性（粒径、ゼータ電位、トランスフェクション効率など）に影響を及ぼさないことが明らかになったので、試料を分析前に下記の通り再水和し、希釈した。
試料＃１を分析３０分前に６０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑで再水和Ｒｈ２０Ｘし、その後、分析の１５分前に１１４０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで希釈した。
試料＃２を分析３０分前に５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑで再水和Ｒｈ２０Ｘ（１０Ｘ＋２Ｘ）し、その後、分析の１５分前に９５０μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで希釈した。
試料＃３を分析３０分前に２５μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑで再水和Ｒｈ２０Ｘ（５Ｘ＋４Ｘ）し、その後、分析の１５分前に４７５μＬ Ｍｉｌｌｉ−Ｑで希釈した。
すべての試料が５分以内に再水和したが、試料＃１（Ｒｈ２０Ｘ）は、そのケーキ体積に比べて小さい再水和体積を考えると、より達成困難であった。試料＃２および３は、容易かつ迅速に再水和した上、２０Ｘの最終濃縮率にも達した。

【0124】

４−より高濃度に再水和された、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有する濃縮組成物のＤＬＳ測定
３つの複製物をセクション１に記載の通り新たに調製し、各組成物の３つのフリーズドライ複製物をセクション３に記載の通り再水和した。粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン中で配合したナノ粒子を２回フリーズドライして、粒子凝集を見ることなく２０Ｘの最終濃縮率（Ｒｈ２０Ｘ）に達することができた。新たに調製した粒子と比較して、Ｒｈ２０Ｘに達するために用いたフリーズドライ・再水和サイクルの数に依存して、Ｘ平均は５６〜６８ｎｍ増加し、強度での平均粒径は５４〜６３ｎｍ増加した。Ｚ平均（１８０〜１９２ｎｍ）および強度での平均粒径（２０４〜２１３ｎｍ）は、行ったフリーズドライ・再水和サイクルの数に関係なく、Ｒｈ２０Ｘ試料間で同様であった（図１０Ａ〜Ｂ）。ＰＤＩ値は、フリーズドライおよび再水和後、新たに調製したときの０．１７から、Ｒｈ２０Ｘ後の０．２０から０．２５の間に、わずかに増加した（図１０Ｃ）。

【0125】

５−より高濃度に再水和された、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有する濃縮組成物のゼータ電位測定
前にＤＬＳによって分析した試料（セクション４）に４００μＬ ２０ｍＭ ＮａＣｌを補足し、その後、それらのゼータ電位を実施例２に記載の通り測定した。新たに調製したナノ粒子は、１９ｍＶの平均ゼータ電位を有し、フリーズドライして再水和した組成物は、Ｒ２０Ｘに達するために用いたフリーズドライサイクルの数に関係なく１８〜２１ｍＶのゼータ電位を有した（図１０Ｄ）。

【0126】

６−より高濃度に再水和された、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有する濃縮組成物のインビトロトランスフェクション
３つの複製物をセクション１に記載の通り新たに調製し、各組成物の３つのフリーズドライ複製物をセクション３に記載の通り再水和した。インビトロトランスフェクションを実施例１に記載の通り行った。

【0127】

７−より高濃度に再水和された、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有する濃縮組成物のトランスフェクション効率
トランスフェクション効率を実施例１に記載の通り測定した。試料トランスフェクション効率を、全細胞の４４％のトランスフェクション効率を有した０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物およびｐＨ６．５の３．５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン中で調製した作りたて複合体（図１０Ｅ、作りたて）について得た値に対して正規化した。すべてのフリーズドライ組成物が作りたて対照の８５〜１００％のトランスフェクション効率を有した（図１０Ｅ）：単一フリーズドライサイクル後に再水和２０Ｘした組成物（ＦＤ／Ｒｈ２０Ｘ）は、作りたて試料と同等のトランスフェクション効率（１００％）を有し、再水和１０Ｘし、その後、フリーズドライしてＲｈ２Ｘした組成物［Ｒｈ（１０Ｘ＋２Ｘ）］は、対照の８６％のトランスフェクション効率を有し、再水和５Ｘし、その後、フリーズドライしてＲｈ４Ｘした組成物［Ｒｈ（５Ｘ＋４Ｘ）］は、対照の８５％のトランスフェクション効率を有した。

【0128】

８−より高濃度に再水和された、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物と３．５ｍＭヒスチジンとを含有する濃縮組成物のルシフェラーゼ発現
ルシフェラーゼ発現を実施例１に記載の通り定量し、相対光単位毎分（ＲＬＵ／分）で表した。試料ルシフェラーゼ発現レベルを、タンパク質１ｍｇ当たり５．２４×１０⁸ＲＬＵ／分の発現レベルを有した、０．５％（質量／体積）トレハロース二水和物およびｐＨ６．５の３．５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン中で調製した作りたて複合体（図１０Ｆ：作りたて）について得た値に対して正規化した。最終Ｒｈ２０Ｘのすべてのフリーズドライ組成物は、作りたて対照のものの６４〜６９％の値で、同様のルシフェラーゼ発現レベルを有した（図１０Ｆ）：単一フリーズドライサイクル後に再水和２０Ｘした組成物（ＦＤ／Ｒｈ２０Ｘ）は、対照の６４％のルシフェラーゼ発現レベルを有し、再水和１０Ｘし、その後、フリーズドライしてＲｈ２Ｘした組成物［Ｒｈ（１０Ｘ＋２Ｘ）］は、対照の発現の６９％で、より高いルシフェラーゼ発現レベルを有し、再水和５Ｘし、その後、フリーズドライしてＲｈ４Ｘした組成物［Ｒｈ（５Ｘ＋４Ｘ）］は、対照の６６％のルシフェラーゼ発現レベルを有した。

【0129】

【表21】

【0130】

（例８）
キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子を、ＣＳ／ＤＮＡナノ粒子と比較して高い初期核酸濃度で調製することができるが、賦形剤含有量を相応じて増加させなければならない；
ナノ粒子物理化学的特性およびサイレンシング効率を有意に変化させることなく、これらの組成物を最大１０倍濃縮することができる。

【0131】

１−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物の調製
キトサン（Ｍｎ １０ｋＤａ、９２％ＤＤＡ）を一晩、室温でＨＣｌに溶解して５ｍｇ／ｍＬの最終キトサン濃度を得た。そのキトサン保存溶液を、表２２の通り、無菌凍結保護剤溶液（８％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物）、ｐＨ６．５の無菌１４ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、およびＲＮａｓｅ不含水を使用して、２７１または５４２μｇ／ｍｌに希釈した。

【0132】

【表22】

【0133】

抗ＡｐｏＢ ｓｉＲＮＡ（センス：ＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵ、アンチセンス：ＡＵＵＧＧＵＡＵＵＣＡＧＵＧＵＧＡＵＧＡＣＡＣ、１ｍｇ／ｍＬで）保存溶液を、表２３の通り、無菌凍結保護剤溶液（８％（質量／体積）デキストラン５ｋＤａまたはトレハロース二水和物）、ｐＨ６．５の無菌１４ｍＭ Ｌ−ヒスチジン緩衝剤、および／またはＲＮａｓｅ不含水を使用して、１００または２００μｇ／ｍｌに希釈した。

【0134】

【表23】

【0135】

各複製物について、１００μＬのキトサン溶液と１００μＬのその相補ｓｉＲＮＡ溶液（例えば、キトサン組成物＃１とｓｉＲＮＡ組成物＃１）を混合して、５のＮ／Ｐ比の複合体を形成した。キトサン添加直後におおよそ１０回、ピペットでその溶液を吸い上げ、吐き出すことによって混合を行った。試料を室温で３０分間放置して安定させた後、分析した。
２−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のフリーズドライ
フリーズドライする試料を２ｍＬ血清バイアルに移し、１３ｍｍブチル凍結乾燥ストッパーを用いてフリーズドライした。すべての試料を収容しているトレーを透水性膜で覆って埃または細菌汚染を防止した。フリーズドライは、次のサイクルを用いて、Ｍｉｌｌｒｏｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｅｒ ＰＣ／ＰＬＣで行った：段階的に５℃に冷却して３０分間、等温で維持し、段階的に−５℃に冷却して３０分間、等温で維持し、その後、３５分間で−４０℃に勾配冷却して２時間、等温で維持し、４８時間、−４０℃で、１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で一次乾燥させ、そして１００ミリトル（約１３．３Ｐａ）で二次乾燥させ、１２時間で温度を３０℃に上昇させ、そしてその後、３０℃で６時間、等温を維持する。試料にストッパーをし、圧着させ、使用するまで４℃で保管した。使用１５〜３０分前に、Ｒｈ１Ｘ試料を２００μＬのＲＮａｓｅ不含水で再水和し、Ｒｈ１０Ｘ試料を２０μＬのＲＮａｓｅ不含水で再水和し、Ｒｈ２０Ｘ試料を１０μＬのＲＮａｓｅ不含水で再水和した。すべての試料が５分以内に再水和した。

【0136】

４−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のＤＬＳ測定
各組成物の９つの複製物：３つの新たに調製したもの（ＦＤなし）、３つのＲｈ１Ｘおよび３つのＲｈ２０Ｘ、をセクション１および２に記載の通り調製した。粒径およびＰＤＩ分析を実施例２に記載の通り行った。すべての組成物は、Ｒｈ２０Ｘ後の重度凝集を防止したが、作りたて組成物と比較して、Ｒｈ１Ｘおよび／またはＲｈ２０後に粒径の有意な変化を示さなかったのは組成物＃２および４だけであり、それらのＺ平均はそれぞれ２１および９ｎｍ増加した（図１１Ａ）。平均ＰＤＩ値は、大部分が（組成物＃１、Ｒｈ１Ｘを除く）０．２５未満であり、組成物＃２および４は、ＲＨ２０Ｘ後にそれぞれ０．１６および０．２０のＰＤＩ値を有した（図１１Ｂ）。

【0137】

５−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のゼータ電位測定
各組成物の９つの複製物：３つの新たに調製したもの（ＦＤなし）、３つのＲｈ１Ｘおよび３つのＲｈ１０Ｘ、をセクション１および２に記載の通り調製した。すべてが５分以内に再水和したが、再水和試料を１５〜３０分間、放置して安定させた。ＲＮａｓｅ不含水を使用して作りたておよび再水和試料の体積を４００μＬにし、その後、ゼータ電位分析前に４００μＬ ２０ｍＭ ＮａＣｌを添加した。ゼータ電位を実施例２に記載の通り測定した。新たに調製した組成物は、２１ｍＶのゼータ電位を有し、フリーズドライして再水和した組成物は、それらの再水和体積に関係なく２１〜２３ｍＶのゼータ電位を有した。

【0138】

６−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のＥＳＥＭ撮像
組成物＃２の９つの複製物：３つの新たに調製したもの（ＦＤなし）、３つのＲｈ１Ｘおよび３つのＲｈ１０Ｘ、をセクション１および２に記載の通り調製した。ＥＳＥＭ試料調製および撮像は、実施例１に記載の通り行った。観察されたすべてのナノ粒子は球形の形状であり、大部分が１００ｎｍより下の直径であった。作りたて、Ｒｈ１ＸまたはＲｈ１０Ｘ組成物からの粒子間に有意差は観察されなかった。

【0139】

７−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のインビトロサイレンシング
組成物＃２の９つの複製物：３つの新たに調製したもの（ＦＤなし）、３つのＲｈ１Ｘおよび３つのＲｈ２０Ｘ、をセクション１および２に記載の通り調製した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ２をサイレンシング効率の陽性対照として使用した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足したｐＨ７．２のＲＰＭＩ−１６４０で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートした、ｅＧＦＰ陽性Ｈ１２９９細胞を、インビトロ研究に使用した。トランスフェクションのために約７５〜８５％集密に達するように、トランスフェクション２４時間前に２４ウェルプレートのウェルごとに４５，０００細胞をプレーティングした。１００ｎＭのｓｉＲＮＡを含有する合計５００μＬの溶液のために、ナノ粒子組成物は、各ウェル内の培養培地をｐＨ６．５の高グルコースＤＭＥＭ（ＦＢＳ不含）で置換した。細胞を４時間、３７℃、５％ＣＯ₂でインキュベートし、その後、５５μＬ ＦＢＳを補足し、その後、さらに４４時間インキュベートした後、分析した。

【0140】

８−濃縮キトサン／ｓｉＲＮＡナノ粒子組成物のサイレンシング効率
フローサイトメトリーを用いてサイレンシング効率を測定した。試料調製：分析する試料を収容している各ウェルから増殖培地を除去し、細胞をｐＨ７．４の５００μＬリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ウェル当たり７５μＬのトリプシン／ＥＤＴＡを使用して５分間、３７℃でトリプシン処理し、その後、３２５μＬ増殖培地を添加し、全試料をサイトメトリーチューブに移した。フローサイトメトリー測定：１００００事象を試料ごとに収集し、４８８ｎｍアルゴンレーザーを使用して細胞における増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の励起後に光電子増倍管で５１０／２０ｎｍバンドパスフィルターにより平均蛍光強度を測定した。前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）も用いて、記録した事象から死細胞およびデブリを排除した。最後に、そのデータを用いてトランスフェクション効率を分析するときにＦＳＣを用いてそれらの事象から重複を特定し、排除した。平均残留ｅＧＦＰ強度を未処置細胞について測定された平均ｅＧＦＰ発現の百分率として表した。組成物＃２のサイレンシング効率は、５％の残留ｅＧＦＰ発現を有するＤｈａｒｍａＦＥＣＴ２より低かった（データを示さない）が、ＦＤは、ＣＳ／ｓｉＲＮＡのサイレンシング効率に悪影響を及ぼさなかった。作りたて組成物は、未処置細胞の５２％の、Ｒｈ１Ｘは４９％の、およびＲ１０Ｘは４７％の、残留ｅＧＦＰ発現を有した（図１１Ｃ）。

【0141】

【表24】

【0142】

本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる修飾が可能であること、本出願が、本発明の原理に一般に準拠する、ならびに本発明が属する技術分野内の公知のまたは慣例的な施行の範囲内に入るような、および上文に記載の本質的特徴に当てはまり得るような、および添付の「特許請求の範囲」の範囲に倣うような本開示からの逸脱を含む、本発明のあらゆる変形、使用または適応を包含することを意図したものであることは、理解されるであろう。

【0143】

本明細書中で言及したすべての文献は、参照により本明細書に援用されている。
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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A-5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】

【図7H】

【図7I】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図2A-2H】

【国際調査報告】