特表 2016-524905 インビトロ診断法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-524905(P2016-524905A)

(43)【公表日】2016年8月22日

(54)【発明の名称】インビトロ診断法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/48 20060101AFI20160725BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20160725BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/48 Z

   C12Q1/26

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2016-526554(P2016-526554)

(86)(22)【出願日】2014年7月14日

(85)【翻訳文提出日】2016年3月18日

(86)【国際出願番号】EP2014064999

(87)【国際公開番号】WO2015007666

(87)【国際公開日】20150122

(31)【優先権主張番号】102013011995.2

(32)【優先日】2013年7月18日

(33)【優先権主張国】DE

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ

(71)【出願人】

【識別番号】516017846

【氏名又は名称】ユニベルジテート ツー ケルン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ ｚｕ Ｋｏｅｌｎ

(71)【出願人】

【識別番号】516017857

【氏名又は名称】ローベルト ボッシュ ゲゼルシャフト フュール メディツィーニシェ フォルシュング エム ベー ハー

【氏名又は名称原語表記】Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｏｓｃｈ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ ｍｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100185915

【弁理士】

【氏名又は名称】長山 弘典

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎 祐朗

(72)【発明者】

【氏名】シュヴァルツ ギュンター

(72)【発明者】

【氏名】シュワブ マティーアス

(72)【発明者】

【氏名】シェフラー エルケ

(72)【発明者】

【氏名】チャサール ユリカ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QR02

4B063QR06

4B063QS17

(57)【要約】

開示されているものは、体液中のウロチオン及び／又はジュカチオンの含量が決定されることを特徴とする、検査されるべき個体のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）活性の決定用インビトロ診断法である。
また、開示されているものは、モリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）及び／又はＭｏｃｏの分解段階が反応の基質として使用されそして形成されたジュカチオン及び／又はウロチオンの量が決定されることを特徴とする、任意の起源の検体の細胞抽出物におけるＴＰＭＴ活性の決定用のインビトロ診断法である。
最後に、開示されているものは、体液及び／又は細胞抽出物中において決定されるウロチオン及び／又はジュカチオンが、１つ以上の特定の疾患に関する増加した感受性のためのバイオマーカーとしての役目を果たすインビトロ診断法である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

体液中のウロチオン及び／又はジュカチオンの含量が決定されることを特徴とする、検査されるべき個体のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）活性の決定用インビトロ診断法。

【請求項2】

尿、血清及び／又は血漿中において、ウロチオン及び／又はジュカチオンの含量が決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

モリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）及び／又はＭｏｃｏの分解段階が反応用基質として使用され、そして形成されたジュカチオン及び／又はウロチオンの量が決定されることを特徴とする、任意の起源の検体の細胞抽出物におけるＴＰＭＴ活性の決定用インビトロ診断法。

【請求項4】

前記細胞抽出物が、線維芽細胞、赤血球、及び／又は生検材料に由来することを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記体液中のウロチオン及び／又はジュカチオンの含量が、患者中の最適なチオプリン用量決定のための役目を果たす、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ジュカチオンが、体液及び／又は細胞抽出物中において決定され、そしてモリブデン含有酵素の活性における変化により特徴付けられる１つ以上の特定の疾患に関する増加した感受性のためのバイオマーカーとしての役目を果たすインビトロ診断法。

【請求項7】

前記モリブデン含有酵素が、亜硫酸オキシダーゼである、請求項６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、体液中のチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（Thiopurin-S- methyltransferase）の酵素活性を決定するためのインビトロ法に関する。特に、本発明は、血漿、血清及び／又は尿中のウロチオン（Urothion）含量及び／又はジュカチオン(Jukathion)含量をインビトロで決定してチオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼの酵素活性を決定する方法に関する。さらに、本発明は、ウロチオン及び／又はジュカチオンをバイオマーカーとして用いたインビトロ診断法に関する。

【背景技術】

【0002】

チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（以下、主にＴＰＭＴと称する）は、白血病及び慢性炎症性疾患の様々な形態の治療の薬物代謝における重要な酵素である。ＴＰＭＴは、細胞増殖抑制薬例えば６−メルカプトプリンを、その後腎排泄される、臨床的に不活性なメチル化形態（例えば６−メチルメルカプトプリン(6-Mercaptopurin)）に変換する。以下に提示されるＴＰＭＴの薬理学的意義にもかかわらず、その生理学的基質とヒトの代謝におけるＴＰＭＴの機能は不明である。

【0003】

チオプリン、例えば６−チオグアニン（６−ＴＧ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）又はアザチオプリン（ＡＺＡ）は、白血病、例えば、急性リンパ性白血病、自己免疫疾患（例えばクローン病、慢性関節リウマチ）の治療において、そして臓器移植のレシピエントにおいて、広く使用されているプリン代謝拮抗剤である。それらは、天然に存在する核酸塩基グアニンのアナログである。チオプリンの他の適応症は、例えば、非ホジキンリンパ腫、潰瘍性大腸炎、真性多血症、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、ベーチェット病、他の形態の血管炎、自己免疫性肝炎、アトピー性皮膚炎、重症筋無力症、視神経脊髄炎（Ｄｅｖｉｃ病）、拘束性肺疾患を含む様々な自己免疫疾患である。

【0004】

ＴＰＭＴは、チオプリン化合物をメチル化する酵素である。具体的には、ＴＰＭＴはチオプリン剤（Thioprin-Wirkstoffe）のＳ−メチル化を触媒する。メチル供与体は、次に反応によってＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインに変換されるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンである。つまり、ＴＰＭＴは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインを副産物として形成する一方で、Ｓ−メチル供与体としてＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを使用して、チオプリン剤を代謝する。

【0005】

ＴＰＭＴの酵素活性に影響を与える遺伝的多型は、患者の治療におけるチオプリン薬（Thiopurinmedikamenten）の応答及び副作用と相関する。

【0006】

チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ；ＥＣ２．１．１．６７）は、チオプリン薬、例えば、アザチオプリン（ＡＺＡ）及び６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）のＳ−メチル化を触媒する細胞質内酵素である。酵素活性は、赤血球（ＲＢＣ）中において、白人２００人中約１人における完全な欠損症を有する一方で、１１％が中間を示し、そして８９％が通常のＴＰＭＴを示し、非常に可変であることが示されている（Schaeffeler et al. 2004）。また、白人の１〜２％は、この三峰性分布から逸脱し、そして非常に高いレベルのＴＰＭＴ活性を示す（Schaeffeler et al. 2004）。チオプリン系免疫抑制剤は、比較的限られた治療範囲を与えることから、ＴＰＭＴ多型は、２種のメチル化代謝物、６−メチルメルカプトプリン（メチル化リボヌクレオチド）及びチオグアニンヌクレオチド（いわゆる６−ＴＧＮ）間の比率に影響し、したがって、炎症性腸疾患、急性リンパ性小児白血病、及び他の疾患を有する患者において、チオプリン治療の有効性と毒性を決定する(summarized in Teml et al. 2007)。例えば、ＴＰＭＴ活性が減少した又は欠損した個体は、これらの事例では極端に高い６−ＴＧＮレベルが存在するので、アザチオプリン又は６−ＭＰの基準用量を用いた治療の間に骨髄抑制の増加したリスクを有する。したがって、これらの患者は、チオプリン治療における個別適応用量を必要としている（Kaskas et al Gut 2002）。

【0007】

対照的に、チオプリン代謝物の集中的なメチル化がこれらのケースで発生し、そして活性な６−ＴＧＮ代謝物がこの理由のために少量形成されるため、非常に高いレベルのＴＰＭＴ活性を持つ個体は、治療への耐性を発達させるのに危険にさらされている（低すぎる６−ＴＧＮレベルのため）。また、肝臓の損傷が、高レベルの６−メチルメルカプトプリンリボヌクレアーゼによって引き起こされることがある(Dubinsky et al. 2000, Nygaard et al. CPT 2008)。急性リンパ性白血病及びＴＰＭＴ活性の高いレベルを有する小児患者は、標準的な治療条件の下で再発リスクの増大にさらされている(Stanulla et al. 2005)。

【0008】

ＴＰＭＴ欠損症の分子的原理はよく理解されている。ＴＰＭＴは、薬理遺伝現象が最適なチオプリン用量の調整のために一般的に認識されている診断ルーチン検査に翻訳されたいくつかの例の一つを構成している。これらの提言は、ＴＰＭＴの内因性基質が今日でも知られていないにもかかわらず、近年更新された(Relling et al. 2013)。

【0009】

ＴＰＭＴ活性は、一般的に赤血球（ＲＢＣ）において決定される。使用される測定方法に強く依存する、非常に低い、中間の、及び通常の活性に関するカットオフ値が定義された（例えば、放射化学測定(Weinshilboum et al. 1978)及びＨＰＬＣベースの方法(Kroplin et al. 1998)）。

【0010】

１９８０年代には、ＴＰＭＴ欠損症の遺伝的原理が築かれた(Weinshilboum et al. 1980)。今日では、変化したＴＰＭＴ活性に関連した２７個の一塩基多型（ＳＮＰ）が説明されている(Appell et al. 2013)。共同発明者のＳｃｈａｅｆｆｅｌｅｒ博士及びＳｃｈｗａｂ博士は、有志の健康な被験者の大規模コホート（１２２２人）において、ＴＰＭＴ遺伝子型−表現型の相関を調査した。彼らは、ＴＰＭＴ表現型の三峰性分布を確認することができ、そして被験者の０．６％でＴＰＭＴ欠損症が（１：１８０）、１０．２％でＴＰＭＴ活性の中間レベルが、そして８９．２％で通常又は高レベルが発見された(Schaeffeler et al Pharmcogenetics 2004)。

【0011】

正しいＴＰＭＴ表現型を予測するための遺伝子解析を使用した場合、陽性及び陰性予測に関する９０％より高い感度及び特異性があり、ＴＰＭＴ遺伝子型と表現型との間の一致は９８．４％である。それにもかかわらず、赤血球中の活性決定と臨床ルーチンにおけるＴＰＭＴの遺伝子検査とにおいて大幅な制限がある：（１）疾患関連貧血のために６〜８週間以内に輸血を受けた患者における正しいＴＰＭＴ表現型の決定は、誤分類の危険性が高い(Cheung et al. 2003; Ford et al. 2004, Schwab et al. 2001)。したがって、さらなる遺伝的分析が、これらの場合の全てにおいて根底にある。（２）日常の業務において、ＴＰＭＴ遺伝子型の遺伝子解析は、配列決定技術を用いて行われ、従って、既に知られている頻繁な変異のみが検出される。したがって、めったに発生しない分析されていないアレルのための誤分類が発生する可能性がある。

【0012】

以上の理由から、ＴＰＭＴによって排他的にメチル化された内因性基質の同定は、改善した臨床診断のために大きな意義及び大きな価値がある。このような直接的なバイオマーカーは、上記の制限をすべて削除し、血液中だけではなく尿中でも検出可能となり、臨床診断を大幅に簡素化することになるであろう。

【0013】

ＴＰＭＴ分析は、６−ＭＰを用いて治療される急性リンパ性白血病を有する子供の日常的治療に必要であることから(Relling et al. 2013)、この患者群における簡単な尿分析が、確かに非常に有利であろう。さらに、個体の約１〜２％は、増加したＴＰＭＴ活性を特徴としている；根底にある遺伝的原因は今も知られていない。ＴＰＭＴの内因性の反応生成物の決定も、非常に高いレベルのＴＰＭＴ活性を有する患者を特定するのに効果的であり(Schaeffeler et al. 2004)、したがって、低すぎる用量によるアザチオプリン又は６−ＭＰ療法の貧弱な応答のリスクを減少させる又は除去するであろう。

【0014】

また、ＴＰＭＴ欠損症は、シスプラチンの毒性に関連しているので、したがって、ＴＰＭＴの遺伝子分析は、シスプラチン治療の前に推奨される(Ross et al. 2009)。これらの患者はまた、内因性ＴＰＭＴ生成物の簡単かつ迅速な決定の恩恵を受けるであろう。

【0015】

副作用のリスクのため、小児白血病患者は、治療前に、遺伝的及び酵素的分析により、ＴＰＭＴ活性に関して検査される。これらの試験は、多くの労力を伴い、そして現在では、主に特に危機に瀕した患者群、例えば、小児患者においてのみ日常的に行われている一方で、他の患者群、例えば慢性炎症性疾患を有する患者は、最も頻繁には、最初に準最適な用量で治療され、毒性を回避している。とりわけ、ＴＰＭＴ活性が減少しそして欠損症ではない患者において用量を増加させることにより、患者により許容される最大チオプリン用量に、実験的に徐々に近づくようにする。そのプロセスでは、一方で、過剰投与に起因する重度又は致命的な副作用の危険が常に存在し、他方で、治療の成功を危うくする過少投与の危険性が存在する。

【0016】

≪非特許文献≫
1. Appell ML, Berg J, Duley J, Evans WE, Kennedy MA, Lennard L, Marinaki T, McLeod HL, Relling MV, Schaeffeler E, Schwab M, Weinshilboum R, Yeoh AE, McDonagh EM, Hebert JM, Klein TE, Coulthard SA. Nomenclature for alleles of the thiopurine methyltransferase gene. Pharmacogenet Genomics. 2013 Apr;23(4):242-8. doi: 10.1097/FPC.0b013e32835f1cc0.

2. Stanulla M, Schaeffeler E, Moricke A, Coulthard SA, Cario G, Schrauder A, Kaatsch P, Dordelmann M, Welte K, Zimmermann M, Reiter A, Eichelbaum M, Riehm H, Schrappe M, Schwab M. Thiopurine methyltransferase genetics is not a major risk factor for secondary malignant neoplasms after treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia on Berlin-Frankfurt-Munster protocols. Blood. 2009 Aug 13;114(7):1314-8. doi: 10.1182/blood-2008-12-193250. Epub 2009 Jun 17.

3. Teml A, Schaeffeler E, Schwab M. Pretreatment determination of TPMT--state of the art in clinical practice. Eur J Clin Pharmacol. 2009 Mar;65(3):219-21. doi: 10.1007/s00228-009-0618-7. Epub 2009 Feb 7.

4. Schaeffeler E, Zanger UM, Eichelbaum M, Asante-Poku S, Shin JG, Schwab M. Highly multiplexed genotyping of thiopurine s-methyltransferase variants using MALD-TOF mass spectrometry: reliable genotyping in different ethnic groups. Clin Chem. 2008 Oct;54(10):1637-47. doi: 10.1373/clinchem.2008.103457. Epub 2008 Aug 7.

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6. Dilger K, Schaeffeler E, Lukas M, Strauch U, Herfarth H, Muller R, Schwab M. Monitoring of thiopurine methyltransferase activity in postsurgical patients with Crohn's disease during 1 year of treatment with azathioprine or mesalazine. Ther Drug Monit. 2007 Feb;29(1):1-5.

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8. Stanulla M, Schaeffeler E, Flohr T, Cario G, Schrauder A, Zimmermann M, Welte K, Ludwig WD, Bartram CR, Zanger UM, Eichelbaum M, Schrappe M, Schwab M. Thiopurine methyltransferase (TPMT) genotype and early treatment response to mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA. 2005 Mar 23;293(12):1485-9.

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10. Schaeffeler E, Stanulla M, Greil J, Schrappe M, Eichelbaum M, Zanger UM, Schwab M. A novel TPMT missense mutation associated with TPMT deficiency in a 5-year-old boy with ALL. Leukemia. 2003 Jul;17(7):1422-4.

11. Kaskas BA, Louis E, Hindorf U, Schaeffeler E, Deflandre J, Graepler F, Schmiegelow K, Gregor M, Zanger UM, Eichelbaum M, Schwab M. Safe treatment of thiopurine S-methyltransferase deficient Crohn's disease patients with azathioprine. Gut. 2003 Jan;52(1):140-2.

12. Schwab M, Schaeffeler E, Marx C, Zanger U, Aulitzky W, Eichelbaum M. Shortcoming in the diagnosis of TPMT deficiency in a patient with Crohn's disease using phenotyping only. Gastroenterology. 2001 Aug;121(2):498-9.

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16. Relling MV, Gardner EE, Sandborn WJ, Schmiegelow K, Pui CH, Yee SW, Stein CM, Carrillo M, Evans WE, Hicks JK, Schwab M, Klein TE. Clinical pharmacogenetics implementation consortium guidelines for thiopurine methyltransferase genotype and thiopurine dosing: 2013 update. Clin Pharmacol Ther. 2013 Apr;93(4):324-5. doi: 10.1038/clpt.2013.4. Epub 2013 Jan 17. No abstract available.

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24. Goto, M., Sakurai, A., Ohta, K., and Yamakami, H. (1969). Die Struktur des Urothions. J. Biochem. 65:611-620.

【発明の開示】

【0017】

したがって、治療中に副作用を生じることなく有効なチオプリン用量を決定することができるようにするために、各々の患者におけるＴＰＭＴ活性を決定するための、単純で、費用効果が高く、そして迅速な方法が求められている。

【0018】

この問題は、請求項１に定義される、ＴＰＭＴの酵素活性を決定するための方法により解決される。好ましい実施態様は、従属請求項に提示されている。さらに、１つ以上の特定の疾患に関する増加した感受性のためのバイオマーカーとしてウロチオン及び／又はジュカチオンを使用したインビトロ診断法に関する保護が求められている。

【0019】

この発明は、ＴＰＭＴがモリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）の異化における必須の工程を触媒するという発明者の洞察に基づいている。

【図面の簡単な説明】

【0020】

図１は、Ｍｏｃｏ（ＭＰＴ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）、Ｍｏｃｏ（ＭＰＴ）とＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、並びにＭｏｃｏ（ＭＰＴ）及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）のインキュベーション後のウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【0021】

図２は、アルカリホスファターゼの存在下（＋ＡＰ）及び非存在下における、異なる量のＭｏｃｏ（ＭＰＴ）と組み換えＴＰＭＴとのインキュベーション後の、ウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【0022】

図３は、３ｎｇ／μＬ精製ＴＰＭＴと、基質としてのＭｏｃｏ（Ａ）又は６−メルカプトプリン（Ｂ）との定常状態の動態を示している。（Ａ）アルカリホスファターゼの存在下における、ＴＰＭＴによるウロチオン合成の動態。（Ｂ）ＴＰＭＴによる６−メチルメルカプトプリン合成の動態。（Ｃ）Ａ及びＢで示されている反応速度論の動態パラメータ。

【0023】

図４は、１６μＭ ３，４，５−トリヨード安息香酸（阻害剤）の存在下及び非存在下における、５００μＭ ＳＡＭ、２５０μＭ ＤＴＴ、及び５μＭ Ｍｏｃｏと肝臓抽出物（１．７μｇ／μＬ）５００μｇとのインキュベーション後の、ウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【0024】

図５は、２．５μＭ ３，４，５−トリヨード安息香酸（阻害剤）の存在下及び非存在下における、５００μＭ ＳＡＭ、２５０μＭ ＤＴＴ、及び１０μＭ Ｍｏｃｏと３ｎｇ／μＬ精製ＴＰＭＴとのインキュベーション後の、ジュカチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムである。

【0025】

図６は、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体及びＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者由来ヒト肝臓タンパク質抽出物におけるウロチオンのインビトロ合成を示す。

【0026】

図７は、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）及びＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）、並びにＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する５人（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）のＲＢＣ由来タンパク質抽出物におけるウロチオンのインビトロ合成を示す。

【0027】

図８は、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）及びＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）、並びにＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する２人（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）の尿におけるウロチオン含量の決定を示す。

【発明の詳細な説明】

【0028】

モリブデン補因子（Ｍｏｃｏ）の構造：

【化1】

【0029】

Ｍｏｃｏの異化最終生成物及び排出物は、以下の構造のウロチオンである（Goto and Sakurai, 1969）：

【化2】

【0030】

ウロチオンは、ＩＵＰＡＣ名２−アミノ−７−（１，２−ジヒドロキシエチル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−チエノ[３，２−ｇ]プテリジン−４−オン、又は用語２−アミノ−７−（１，２−ジヒドロキシエチル）−６−メチルチオ−１Ｈ−チエノ[３，２−ｇ]プテリジン−４−オンとしても知られている。それは、ヒトの尿から単離された硫黄含有プテリジン誘導体である。

【0031】

Ｍｏｃｏからウロチオンへの転換に関与する酵素は、未だ不明である。本発明者らは、ＴＰＭＴがＭｏｃｏのメチル化を触媒することを初めて実証した。本発明はこの知見に基づくものである。

【0032】

ホスファターゼの存在下におけるＳ−アデノシルメチオニン依存性反応において、ＴＰＭＴはＭｏｃｏをウロチオンに変換することが可能である。ＴＰＭＴの直接の反応生成物は、ウロチオンのリン酸化形態（ジュカチオン）であり、これは、以下の図に示すように、まだ知られていないホスファターゼにより、次に、ウロチオンに変換される。２−チオプリンメチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）の基質の形成をもたらす工程は不明である。Ｓ−アデノシルメチオニン依存性反応において、ＴＰＭＴはジュカチオンを形成する。

【0033】

体液中、例えば尿中のウロチオンの含量は、ＴＰＭＴ活性と相関しており、したがって、ＴＰＭＴ活性を決定するための信頼できるバイオマーカーとして使用されることができる。したがって、ウロチオン含量の決定は、他のより正確でない方法、例えば他の基質や遺伝子検査による活性の決定を、置換することができる。

【0034】

説明される方法におけるウロチオンの使用が可能となる：
・あらゆる種類のチオプリン関連副作用（例えば、骨髄抑制、肝毒性、膵炎、インフルエンザ様症候群）の回避
・チオプリンの全ての適応症、例えば、白血病、慢性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病）、臓器移植、自己免疫疾患、肺線維症などに関する、チオプリン治療中の治療応答の予測
・シスプラチン関連ＴＰＭＴ媒介中毒性難聴の回避。

【0035】

したがって、ウロチオン及びジュカチオンは、血液中のチオプリン代謝物決定のための代替としての、チオプリン治療における治療モニタリング用の非常に信頼できるバイオマーカーである。

【化3】

【0036】

以下の生化学的分析は、ＴＰＭＴがウロチオンの異化に関与していることを証明している。

【0037】

１．腎臓タンパク質抽出物中のウロチオンのインビトロ合成は、Ｓ−アデノシルメチオニンとＭｏｃｏに依存している。これは、図１に示されている。図１は、Ｍｏｃｏ（ＭＰＴ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）、Ｍｏｃｏ（ＭＰＴ）とＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、並びにＭｏｃｏ（ＭＰＴ）及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）と腎臓抽出物（Ｋｉｄｎｅｙ）のインキュベーション後のウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムである。３種の全ての成分が一緒にインキュベートされた場合にのみ、ウロチオンの形成を観察することができる。使用量：１．７μｇ／μＬ腎臓抽出物、５μＭ Ｍｏｃｏ、５００μＭ ＳＡＭ、０．１Ｍトリス／塩酸（ｐＨ７．５）中２５０μＭ ＤＴＴ。反応物を３７℃で４時間インキュベートした後、６０℃で１時間熱変性して停止させ、そして、ＱＡＥセファロースによって精製した。溶出液を乾燥させ、ＨＰＬＣ溶媒に溶解した。ＨＰＬＣ分析を、Ｃ４ Ｒｅｐｒｏｓｉｌ（登録商標）１００ ＨＰＬＣカラム上で、定組成溶出により、１５０×２ｍｍ、粒子サイズ５μｍ（Ｄｒ. Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）、２０ｍＭ酢酸及び１５％メタノールで行った。

【0038】

２．ウロチオンのＳ−アデノシルメチオニン依存性合成は、ホスファターゼの存在及びＭｏｃｏの量に依存している。図２から明らかであるように、インビトロにおいて、アルカリホスファターゼは、この反応を触媒することができ、図２は、アルカリホスファターゼの存在下（＋ＡＰ）及び非存在下における、異なる量のＭｏｃｏ（ＭＰＴ）と精製されたＴＰＭＴとのインキュベーション後の、ウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。溶出時間２４分時点におけるピークの増加は、ウロチオンの形成を示している。溶出時間３１分時点でのピークの増加は、ジュカチオンの形成を示している。使用量：２０ｎｇ／μＬ ＴＰＭＴ、２〜１６μＭ Ｍｏｃｏ、５００μＭ ＳＡＭ、０．１Ｍトリス／塩酸（ｐＨ７．５）中２５０μＭ ＤＴＴ。反応物を３７℃で１時間インキュベートした後、６０℃で１時間熱変性して停止させた。溶出液を乾燥させ、ＨＰＬＣ溶媒に溶解した。ＨＰＬＣ分析を、ＹＭＣ Ｃ１８ Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）カラム上で、メタノール勾配（０〜２５％、２０分、１ｍＬ／分）の溶出により、２０ｍＭギ酸を用いて、２５０×４ｍｍ、粒子サイズ５μｍで行った。

【0039】

３．ウロチオンにおける精製されたＴＰＭＴによるＭｏｃｏのインビトロでの変換：組み換え技術によって発現されそして精製されたＴＰＭＴによる比較分析によると、図３に示されるように、基質としての変性Ｍｏｃｏ酵素（ヒト亜硫酸オキシダーゼ）由来のＭｏｃｏを、ホスファターゼの存在下でウロチオンに変換することができることが示されている。この反応の動態パラメータは、Ｋ_Ｍ＝２μＭそしてｋ_ｃａｔ＝０．１２９ｓ^―１である。基質としての６−メルカプトプリン（Ｋ_Ｍ＝６９μＭそしてｋ_ｃａｔ＝０．０４７ｓ^―１）と比較すると、生理学的基質から予想されるように、それらはより効果的な基質結合及び触媒反応を有意に示す。図３は、３ｎｇ／μＬ精製ＴＰＭＴ及び基質としてのＭｏｃｏ（Ａ）又は６−メルカプトプリン（Ｂ）による定常状態の動態を示している。（Ｃ）Ａ及びＢに示される動態の動態パラメーター。

【0040】

４．ＴＰＭＴ阻害剤の３，４，５−トリヨード安息香酸の存在下及び非存在下における、肝臓抽出物によるＭｏｃｏのウロチオンへのインビトロにおける変換が、図４に示される。図により、１６μＭ ３，４，５−トリヨード安息香酸（阻害剤）の存在下及び非存在下における、５００μＭ ＳＡＭ、２５０μＭ ＤＴＴ、及び５μＭ Ｍｏｃｏと肝臓抽出物（１．７μｇ／μＬ）５００μｇとのインキュベーション後の、ウロチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムが示される。

【0041】

５．ＴＰＭＴ阻害剤の３，４，５−トリヨード安息香酸の存在下及び非存在下における、精製されたＴＰＭＴによるＭｏｃｏのジュカチオンへのインビトロにおける変換が、図５に示される。２．５μＭ ３，４，５−トリヨード安息香酸（阻害剤）の存在下及び非存在下における、５００μＭ ＳＡＭ、２５０μＭ ＤＴＴ、及び１０μＭ Ｍｏｃｏと１ｎｇ／μＬ精製ＴＰＭＴとのインキュベーション後の、ジュカチオン分析のＨＰＬＣクロマトグラムが示される。

【0042】

６．通常のＴＰＭＴ活性を有する個体由来のヒト肝臓タンパク質抽出物におけるＭｏｃｏのインビトロ合成を示す。ＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者と比較して、ウロチオン合成における約６０％減少した活性が観察される。

【0043】

７．ＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者と比較した、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体のＲＢＣ由来タンパク質抽出物におけるＭｏｃｏのインビトロにおける変換は、ウロチオン合成における約７０％の活性の減少を示す。図７から明らかなように、５０％減少したウロチオン合成は、ＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する者の５人で検出された。示されているものは、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）及びＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）、並びにＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する１人（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）のＲＢＣ由来タンパク質抽出物におけるウロチオンのインビトロ合成である。

【0044】

８．ＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者と比較した、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体の尿におけるウロチオン含量の決定は、ウロチオン含量の有意な違いを示さない一方で、ＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する２人においては、ウロチオンは全く検出することができなかった（図８）。示されているものは、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体（Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ）及びＴＰＭＴ遺伝子座におけるヘテロ接合変異を有する者（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）、並びにＴＰＭＴ遺伝子座におけるホモ接合変異を有する２人（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）におけるウロチオン含量の決定である。

【0045】

《実施例／材料及び方法》
ウロチオン検出：１０μＭ Ｍｏｃｏ（ヒト亜硫酸オキシダーゼから単離された）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ(ｐＨ７．２)、１ｍＭ ＳＡＭ、２５０μＭジチオトレイトール及び１．７μｇ／μＬ肝臓タンパク質抽出物又は３．４μｇ／μＬ ＲＢＣ中で３７℃で４時間インキュベートする。アルカリホスファターゼ３３単位、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ(ｐＨ８．３)の添加後、インキュベーションを少なくとも４時間（３７℃）実施し、インキュベーションを８０℃、１５分で停止させる。ウロチオンのＨＰＬＣ分析を、メタノール勾配（０〜２５％、２０分、１ｍＬ／分）における溶出及び２０ｍＭギ酸におけるＹＭＣ Ｃ１８ Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（５μｍ粒子サイズ、２５０×４ｍｍカラム）上で実施する。

【0046】

酵素の３ｎｇ／μＬの最終濃度を精製されたＴＰＭＴによる反応動態のために使用した。３，４，５−トリヨード安息香酸で反応を停止させた。上記のように分析を行った。

【0047】

尿中のウロチオンを検出するために、Ｆｌｏｒｉｓｉｌ（登録商標）二段階固相抽出（５００ｍｇマトリックス／ｍＬ尿、５０％アセトンによる溶出）及びアミノプロピルマトリックス（５００ｍｇマトリックス／ｍＬ尿、２０ｍＭ酢酸による溶出）を実施した。ＨＰＬＣ分析を、粒子サイズ５μｍのＣ１８ Ｒｅｐｒｏｓｉｌ（登録商標）１００、２５０×３ｍｍカラムＤｒ. Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ）を用いて、次のＨＰＬＣ分析を実施した。２０ｍＭギ酸を溶出液として供給し、溶出をメタノール勾配（０〜２５％、２０分、１ｍＬ／分）で行った。クレアチニンをＶａｓｉｌｉａｄｅｓに従って決定した。

【産業上利用性】

【0048】

本発明によれば、ウロチオンのレベルが、体液又は細胞抽出物中でインビトロにおいて決定され、ＴＰＭＴ活性と相関する。このようにして得られたデータを用いて、ウロチオンレベルのカットオフの値を、ＴＰＭＴ欠損個体、減少したＴＰＭＴ活性を有する個体、通常のＴＰＭＴ活性を有する個体、そして非常に高いレベルのＴＰＭＴ活性を有する個体の層別化のために決定することができる。そして、これらのカットオフ値は、ＴＰＭＴ変異体においてのＲＢＣ又は遺伝子診断におけるＴＰＭＴ活性の測定を使用している現在の手順との類似性において、チオプリンを用いた患者の用量調整治療のために役立つ。

【図1】

【図2】

【図4】

【図5】

【図3】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】