特表 2016-534731 膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性幹細胞の懸濁及び集団化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-534731(P2016-534731A)

(43)【公表日】2016年11月10日

(54)【発明の名称】膵内分泌細胞への分化のためのヒト多能性幹細胞の懸濁及び集団化

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/02 20060101AFI20161014BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20161014BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20161014BHJP

   C12N 5/073 20100101ALN20161014BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/02

   C12N5/0735

   C12N5/10

   C12N5/073

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】118

(21)【出願番号】特願2016-527338(P2016-527338)

(86)(22)【出願日】2014年5月21日

(85)【翻訳文提出日】2016年6月24日

(86)【国際出願番号】US2014038993

(87)【国際公開番号】WO2015065524

(87)【国際公開日】20150507

(31)【優先権主張番号】61/962,158

(32)【優先日】2013年11月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/998,974

(32)【優先日】2013年12月30日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】フライヤー，ベンジャミン

(72)【発明者】

【氏名】ラニォスカス，ダイナ

(72)【発明者】

【氏名】ブラックムーア，マルシア

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ハイユン

(72)【発明者】

【氏名】リロバ，コスタディンカ

(72)【発明者】

【氏名】ネルソン， シェリー

(72)【発明者】

【氏名】ロソチャ，エリザベス

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BB04

4B065BB19

4B065BC08

4B065CA44

(57)【要約】

本開示は、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞に分化するための、凝集多能性幹細胞集団の調製方法を提供する。特に、本開示は、懸濁培養を使用して、多能性細胞をβ細胞、心細胞、及び神経細胞系統に分化させる方法を提供する。この方法は、これらの集団の分化の前に、凝集細胞集団を調製することを伴う。

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【特許請求の範囲】

【請求項1】

動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性細胞を平面接着培養下で凝集細胞集団に培養することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させることと、を含み、前記分化の工程がＣｙｐ２６阻害剤の使用を含む、方法。

【請求項2】

前記方法が、細胞周期のＧ０／Ｇ１期の細胞の割合を増加させる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記培養することが、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記環境が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記多能性細胞が接着性である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞周期のＧ０／Ｇ１期内の細胞の割合を増加させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、小分子及び任意追加的にＴＧＦβファミリーメンバーを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。

【請求項7】

前記小分子がＭＣＸであり、前記ＴＧＦβファミリーメンバーがＧＤＦ−８である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

多能性細胞を胚体内胚葉へ分化させる方法であって、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、多能性を凝集細胞集団に増殖させることと、前記平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、ＭＣＸ及びＧＤＦ８又はＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡを添加した培地において、前記動的懸濁液内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。

【請求項10】

前記増殖させることが、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む環境を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖させ、分化させる方法であって、多能性幹を平面接着培養下で凝集細胞集団に増殖させることと、前期平面接着培養から動的懸濁液へ多能性幹細胞の前記集団を移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性細胞集団を分化させることと、を含み、前記細胞を、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内で凝集細胞集団に増殖させる、方法。

【請求項12】

前記多能性細胞集団が、膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は、心筋前駆細胞集団を生成するために分化される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記多能性幹細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

請求項１１に記載の方法によって産生される、分化した膵臓前駆細胞の前記集団を含む、移植可能幹細胞由来の細胞産物。

【請求項15】

動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖させ、分化させる方法であって、
ａ．約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む環境内の平面接着培養下で、前記多能性細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、
ｂ．酵素又はキレート剤を使用して、前期平面接着培養から動的懸濁培養へ多能性細胞の前記集団を移植することと、
ｃ．動的に撹拌される懸濁培養系内で前記細胞集団を維持することと、
ｄ．膵臓前駆細胞集団、神経前駆細胞集団、又は心筋前駆細胞集団を生成するために、動的撹拌される懸濁培養系内で前記多能性細胞集団を分化させることと、を含み、
前記分化環境が、ほぼ低酸素から周囲の約３０％の範囲の酸素、０．１％〜約２％の範囲の脂質、又はそれらの組み合わせを含む、方法。

【請求項16】

前記幹細胞集団が、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、ＣＸＣＲ４の発現を欠く、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

増殖させるための前記環境がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記分化環境が、約０．１％〜約２％のウシ血清アルブミンを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記多能性細胞が、誘導型多能性幹細胞、ヒト臍帯組織由来細胞、単為生殖生物、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、及び羊水由来細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記方法が、β細胞転写因子を発現する膵臓前駆細胞を生成する、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

前記転写因子がＰＤＸ１及び／又はＮＫＸ６．１である、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６１／７４７，７９９号（２０１２年１２月３１日に出願）及同第６１／９６２，１５８号（２０１３年１１月１日に出願）に対する優先権を主張し、その全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第１３／９９８，９７４号（２０１３年１２月３０日に出願）の継続出願である。

【背景技術】

【0002】

本発明は、凝集した細胞集団において、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及びその他の多能性細胞を調製することを含む細胞分化の分野にある。一態様では、本発明は、多能性幹細胞の集団を生成し、膵臓内胚葉、膵内分泌前駆細胞、及び単一ホルモン膵内分泌細胞への分化のために、懸濁培養下でそれらを維持する方法を開示する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能的β細胞を生成するものがある。

【0004】

脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）からなる細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。

【0005】

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は内胚葉の前領域を特定し、ＣＤＸ１、２及び４は後半分を特定する。

【0006】

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−Β、レチノイン酸（「ＲＡ」）、及びＢＭＰリガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害することが報告されている（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１２：１２１５〜１２２０）。

【0007】

特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＦＴ１Ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織で高く発現し、また、ＣＤＸ２の発現は腸組織で高い。

【0008】

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。

【0009】

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、膵臓内胚葉の分化から生じる外分泌組織及び内分泌組織の両方を含有する。

【0010】

Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、報告によると、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵臓内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米国特許第７，５３４，６０８号）。

【0011】

Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１、１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１、６０：２３９〜２４７）は、膵内分泌細胞の数を有意に拡張するために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９、２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９、５：２５８〜２６５）。

【0012】

多能性幹細胞などの前駆細胞を培養するためのプロトコルの改善において、大きな進歩がなされた。ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２６３５３（Ａｍｉｔら）は、二次元培養系における未分化状態でのヒト胚性幹細胞の維持を開示する。Ｌｕｄｗｉｇら、２００６（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：１８５〜７）は。マトリックス上でのヒト胚性幹細胞の培養のためのＴｅＳＲ１画定培地を開示する。米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号（Ａｋａｉｋｅら）は、多能性幹細胞に接着するキャリアを使用して、懸濁液で多能性幹細胞を成長させる方法を開示し、同第２００９／００２９４６２号（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙら）は、マイクロキャリア又は細胞封入を使用して、懸濁液で多能性幹細胞を増殖させる方法を開示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００８／０１５６８２号（Ａｍｉｔら）は、基質接着の欠ける培養状況下において、懸濁培養下でヒト胚性幹細胞を増殖させ、維持する方法を開示する。

【0013】

米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓら）は、三次元培養システムにおいてアルギン酸ビーズ内に封入されたヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示する。

【0014】

これらの進歩にもかかわらず、機能的内分泌細胞に分化し得る多能性幹細胞を三次元培養系にて正常に培養する方法のための必要性が、依然として残っている。

【図面の簡単な説明】

【0015】

上記の発明の概要、並びに以降の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的で、図面の本発明の実施形態を示す。しかしながら、本発明は、示される正確な構成、実施例、及び手段に限定されない点は理解されるべきである。

【図1a】実施例１に従った、剥離直後（左手パネル）及び非接着性静的培養下での２４時間後（右手パネル）のヒト胚性幹（「ｈＥＳ」）細胞株Ｈ１の、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。剥離後の細胞（左手パネル）は、それぞれの断片が細胞の塊からなる、約２０〜３０マイクロメートルの平均断片直径を有する、単層の断片に類似した。非接着性静的培養下での２４時間後の細胞は、集団様構成を呈した。

【図1b】実施例１に従った、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する１２５ｍＬのスピナーフラスコ内で、４日間培養した後のヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞について、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＣＸＣＲ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１に関するフローサイトメトリーの結果を示す。細胞は、分化のマーカーであるＣＸＣＲ４の発現をほとんど呈せず、多能性（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のマーカーの高い発現を呈した。

【図1c】ステージ１の終了時の、分化から７２及び９６時間後の、ヒト胚性幹細株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す。図１ｃにおいて可視であるのは、７２時間後の４Ｘ倍率（左手パネル）、９６時間後の４Ｘ倍率（中央パネル）、及び９６時間後の１０Ｘ倍率（右手パネル）の疎性細胞凝集体である。

【図1d】マーカーＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、及びＣＤ９９に関する段階１の分化の終了時における、ヒト胚性幹細株Ｈ１をＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞のフローサイトメトリー結果を示す（実施例１を参照のこと）。図１ｄに示すとおり、多能性のマーカー、ＣＤ９の発現がほぼ排除されている一方、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びＣＤ９９の発現は極めて高かった。

【図1e】未分化Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時における、多能性に関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子の発現に関する、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）結果を示す（実施例１を参照のこと）。ステージ１の終了時の細胞は、未分化のＷＡ９１ ｈＥＳ細胞と対比して、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、及び胚体内胚葉（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（ＣＥＲ１）、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）に関連付けられた遺伝子における大きな増加を示した。

【図1f】細胞が胚体内胚葉から膵臓内胚葉へと更に分化したときの、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）処理した細胞の顕微鏡写真を示す（実施例１を参照のこと）。分化がステージ２、１日目（上部左手パネル）からステージ２、３日目（上部右手パネル）、ステージ３、４日目（下部左手パネル）、及びステージ４、１日目（下部右手パネル）へと進行するにつれて、細胞及び細胞集団に対する明白な形態的変化が可視である。

【図2a】実施例２に従って、ＥＤＴＡ処理後の撹拌された懸濁培養下で２日間の培養後、及び分化培養への遷移前の、多能性及び分化に関連付けられているマーカーについての、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞に関するフローサイトメトリーデータを示す。データは、分化のマーカー（ＣＳＣＲ４）の発現がほとんどなく、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示した。

【図2b】実施例２に従って、スピナーフラスコ内で成長させたステージ１、３日目の細胞、並びにスピナーフラスコ又は三角フラスコ内で成長させたステージ２、２日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞に分化した、ヒト胚性幹細株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の顕微鏡写真を示す。懸濁分化培養は、球状凝集体で、細胞のほぼ均一かつ同質の集団を形成した。

【図2c】多能性及び内胚葉分化の細胞表面マーカーについて、ステージ１の終了時におけるヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞に関するフローサイトメトリーデータを示す。図２ｃで可視であるように、多能性のマーカー、ＣＤ９の発現がほぼ排除されている一方、胚体内胚葉分化のマーカー、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）の発現は極めて高かった。

【図2d】未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞と比較した、ステージ１の終了時における、多能性に関連付けられている選択された遺伝子、及びヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡ処理した細胞の胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子の発現に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す（実施例２を参照のこと）。図２ｄは、多能性遺伝子（ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現の減少、及び胚体内胚葉に関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（「ＣＥＲ１」）、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）の大きな増加を示す。

【図2e-1】実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＮＫＸ６．１）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。

【図2e-2】実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＣＤＸ２）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。

【図2e-3】実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（ＳＯＸ２）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。

【図2e-4】実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によって、ステージ１から膵臓内胚葉へ分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化を示すマーカー（クロマグラニン）のフローサイトメトリーデータを示す。フローサイトメトリーデータは、機能的β細胞に必要な転写因子である、高いレベルのＮＫＸ６．１、及び両方の懸濁形式を有するシナプトフィジン（データ表示なし）及びクロマグラニンなどの高いレベルの内分泌膵臓マーカーを示す。

【図2f】実施例２に従った、スピナーフラスコ又は三角フラスコ内の懸濁によってステージ１から膵臓内胚葉へ更に分化された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の、ＥＤＴＡ処理した細胞について、分化に関連付けられている選択された遺伝子の発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。データをＷＡ０１ ｈＥＳ細胞の発現と比較する。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、高いレベルの膵臓前駆遺伝子の発現を示す。

【図3a】Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離された、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。図３ａに示すように、細胞は、小さい凝集体として表面から除去された。

【図3b】Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離し、次いで、３日間懸濁培養系内で増殖させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の位相差顕微鏡写真を示す。図３ｂにおいて可視であるのは、細胞集団のほぼ均一な球状集団の形成である。

【図3c】Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）での処理に続いて静的培養から剥離し、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離を使用して連続的に継代した、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞集塊の顕微鏡写真を示す。

【図4a】分化の異なるステージで指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の顕微鏡写真を示す。図４ａにおいて可視であるのは、分化のそれぞれのステージでの細胞の顕微鏡写真である。

【図4b】分化の異なるステージでの指向された分化プロトコルを使用する、細胞株Ｈ１の懸濁培養したヒト胚性幹細胞の分化のマーカー（ＣＸＣＲ４、ＣＤ５６、及びＰＤＸ１）に関するフローサイトメトリーの結果を示す。ステージ４、４日目における分化プロセスの終了時に、高い割合の細胞がＰＤＸ１発現に対して陽性であった。

【図4c】ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内に封入された分化細胞を移植した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの非空腹時血糖レベルを示す。

【図5a】分化培養への遷移前のヒト胚性幹細胞株Ｈ１のＥＤＴＡで処置した細胞に関する、多能性及び分化に関連付けられたマーカーについてのフローサイトメトリーデータを示す。図５ａに示すように、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。

【図5b】ステージ１での３つの異なる供給設定に関する、ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４及びＣＤ９９（分化のマーカー）、並びにＣＤ９（多能性マーカー）の、細胞の位相差画像及びフローサイトメトリーデータを示す。実験条件は以下の通りとした。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。

【図5c】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、膵臓内胚葉形態を呈する分化細胞の位相差画像を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。

【図5d-1】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし。

【図5d-2】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加。

【図5d-3】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン）、及び分化した細胞の選択非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）の選択マーカーについての、フローサイトメトリーの結果を示す。（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。

【図5e-1】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。

【図5e-2】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。

【図5e-3】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。

【図5e-4】胚体内胚葉の形成中に以下の供給設定を使用して分化させた、ステージ４の終了時点での、分化した細胞の選択膵臓及び非膵臓遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。（Ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（Ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（Ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における倍数差として示される。

【図5f】条件Ａ（分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間では培地変更なし）に従って分化させた細胞を埋め込んだ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内のＣペプチドの発現を示す。それぞれのＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜下に、５００万個の細胞を埋め込んだ。図５ｆに示すように、埋め込み後１２週目までにヒトＣペプチドが１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった。

【図5g】条件Ａ（分化開始から２４時間後で培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化させた細胞の前及び後投与（例えば、埋め込み）の、選択されたＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対するグルコース処理の影響を示す。図５ｇに示すように、グルコース処理は、空腹状態で平均０．９３ｎｇ／ｍＬから供給状態で２．３９ｎｇ／ｍＬまで、循環するヒトＣペプチドの有意な増加を誘導した。

【図5h】条件Ａ（分化開始から２４時間後で培地変更、４８時間での培地変更なし）に従って分化させた細胞を投与した、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与（すなわち、ＳＴＺ誘導糖尿病）の影響を示す。図５ｈから明白であるように、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織の移植片を有する動物（すなわち、細胞を投与されたもの）は、真性糖尿病を発症した未処置の対照とは異なり、正常な血糖レベルを維持した。

【図6a】分化前のＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。

【図6b】分化の様々なステージで、Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ上で成長させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の顕微鏡写真を示す。

【図6c】アクチビンＡ（ＡＡ）及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のプレート（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡプレート）、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のプレート（ＭＣＸ／ＧＤＦ８プレート）、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で、成長及び分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に関する、分化の日数の関数としての細胞計数（細胞／ｃｍ²）を示す。

【図6d】アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のプレート（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡプレート）、アクチビンＡ及びＷＮＴ３Ａを含有する培地内のマイクロキャリア（ＷＴＮ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア）、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のプレート（ＭＣＸ／ＧＤＦ８プレート）、並びにＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する培地内のマイクロキャリア（ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア）で成長及び分化させたヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞に関する、分化の日数の関数としての細胞計数（細胞／ｍＬ）を示す。

【図6e】ＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとして、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養又は平面培養で成長させた、細胞の分化の第１ステージに関するフローサイトメトリーの結果を示す。

【図6f】それぞれのマーカー（ＣＸＣＲ４及びＣＤ９）の合計発現として、（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、マイクロキャリア培養又は平面培養で成長させた、細胞の分化の第１ステージに関するフローサイトメトリーの結果を示す。

【図6g】（ａ）ＷＮＴ３Ａ及びＡＡ、又は（２）ＭＣＸ及びＧＤＦ８の存在下で、平面培養、又は懸濁培養下のマイクロキャリアビーズ上で分化させた、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞の分化に関連付けられている、選択された遺伝子の発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。

【図7】実施例７のプロトコルに従って分化させた細胞について、ステージ１、１日目からステージ４、３日目までの、バイオリアクターにおける分化の様々なステージでの細胞計数を示す。細胞計数は、画像に基づいた血球計算（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））によって決定される、１００万個の細胞／ｍＬとして示す。

【図8】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図9】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図10】実施例７の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図11】多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。

【図12】胚体内胚葉に関連付けられている選択遺伝子を含有する胚体内胚葉（「ＤＥ」）アレイに関する、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。

【図13】多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。

【図14】ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す（実施例７を参照のこと）。

【図15】未分化のステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ＣＤ９、ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の蛍光活性細胞分別（ＦＡＣＳ）の結果を示す（実施例７を参照のこと）。この結果も表８に示す。

【図16】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１６は、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現の穏やかな増加、並びに指向された分化前のステージ０プロセス中のＧＡＴＡ２発現における≧１００ｘの増加を示す。

【図17】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ０、１日目（すなわち、接種から２４時間後）及びステージ０、３日目（すなわち、接種から７２時間後）の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、未分化の遺伝子発現を示す。特に、図１７は、指向された分化前のステージ０プロセス中のＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、及びＦＧＦ４の発現における≧１００ｘの増加を示す。

【図18】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１８は、ステージ１、１日目の細胞について、多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００ｘの増加などの、遺伝子発現パターンの有意な変化を示す。

【図19】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図１９は、段階１、１日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図１８及び１９は、ＦＯＸＡ２発現における約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現における１０００ｘの増加などの、遺伝子発現パターンの有意な変化を示す。

【図20】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２０は、ステージ１、３日目の細胞について、多能性に関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。

【図21】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の遺伝子発現を示す。図２１は、段階１、３日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。

【図22】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目の細胞の、ＣＤ９、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４としても知られる）、及びＣＤ９９のＦＡＣＳの結果を示す。分化開始時のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団（図１５）から、ステージ１の終了時のＣＸＣＲ４発現細胞（細胞の９８．３％がＣＸＣＲ４陽性、±１．９標準偏差）の均質な集団（図２２）へのほぼ完全な遷移が観察された。

【図23】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ１、３日目、ステージ２、１日目、ステージ２、３日目の細胞について、ＤＥに関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２３は、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４ａ及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１、３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）がステージ２の終了時までに低減した発現を示したことを示す。

【図24】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目及びステージ２、３日目の細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、前腸遺伝子ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の遺伝子発現を示す。図２４に示すように、これらの遺伝子の発現は増加した。

【図25】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３の培地で成長させたステージ３、３日目の細胞（表７）のＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、クロモグラニン、ＮＫＸ２．２、及びＳＯＸ２のＦＡＣＳの結果を示す。図２５に示すように、細胞は、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現によって測定された（９０．９％±１１．９標準偏差のＰＤＸ１陽性、及び９９．２％±０．６標準偏差のＦＯＸＡ２陽性）、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。

【図26】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３、１日目及びステージ３、３日目の細胞について、ステージ４に関連付けられた選択遺伝子を含有する、ステージ４アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２６は、これらの細胞が、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の増加したレベルを呈することを示す。

【図27】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞について、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を示す。図２７に示すように、ステージ４、３日目の細胞は、高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５標準偏差のクロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、５８．３％±９．７標準偏差で陽性）の混合と一貫した発現パターンを更に発展させた。

【図28】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ３、３日目、ステージ４、１日目、及びステージ４、３日目の細胞について、ステージ４に関連付けられた選択遺伝子を含有するステージ４アレイに関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図２８は、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の増加した発現レベルを示す。

【図29】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞について、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す。特に、図２９は、異なる種材料ロットから３Ｌスケールで生成した、膵臓前駆物質の平均ＦＡＣＳ発現パターンを示す。

【図30】実施例７のプロトコルに従って分化させた、ステージ４、３日目の細胞のＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤに関するＦＡＣＳの平均結果を示す。ステージ４、３日目の細胞における分化の前に、細胞を増殖させてＩＳＭを形成し、次いで、その両方を０．５％ＢＳＡを添加した、カスタムの自家培地「ＩＨ３」又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のいずれかにおいて、ステージ０で成長させた。ＩＨ３培地内で成長させた細胞は、「ＩＨ３−Ｐ成長細胞」であり、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）で成長させた細胞は、「ＥＺ８成長細胞」である。異なる培地で成長させた細胞間の発現パターンには、有意差は観察されなかった。

【図31】ステージ０で異なるｐＨレベルにあらかじめ成長させた、ステージ４、３日目の細胞のＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの平均結果を示す（実施例７を参照のこと）。ステージ４、３日目の細胞プロファイルには、有意な変化は観察されなかった。

【図32】アンチフォームＣで処理していないステージ４、３日目の細胞、及びアンチフォームＣ乳剤（９４ｐｐｍ）で処理したステージ４、３日目の細胞の、ＮＫＸ６．１、クロマグラニン（ＣＨＧＡ）、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、及びＮＥＵＲＯＤのＦＡＣＳの結果を比較する（実施例７を参照のこと）。アンチフォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ａ８０１１）は、ステージ４、３日目の細胞のプロファイルに影響を及ぼすことは観察されなかった。

【図33】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３３は、分化開始の２４時間前の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す（実施例８を参照のこと）。図３３に示すように、バイオリアクターからの細胞は、多能性に特徴的な遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化に特徴的な遺伝子（ＡＦＰ、及びＦＯＸＡ２：＜５０倍の増加、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、及びＴ：＜１０倍の増加した発現）の誘導が最小限であるか又はまったくないことを示した。

【図34】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３４は、分化開始から２４時間後の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。

【図35】実施例８のプロトコルに従って分化した細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３５は、分化開始から７２時間後の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された遺伝子発現を示す。

【図36(a)】実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、ステージ２、３日目、ステージ３、３日目、及び遺伝子によってはステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ａ）は、ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、及びＣＤＸ２の遺伝子発現を示す。

【図36(b)】実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、ステージ２、３日目、ステージ３、３日目、及び遺伝子によってはステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｂ）は、ＧＡＳＴ、ＨＡＮＤ１、ＨＨＥＸ、及びＨＮＦ４ａの遺伝子発現を示す。

【図36(c)】実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、ステージ２、３日目、ステージ３、３日目、及び遺伝子によってはステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｃ）は、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＯＳＲ１、及びＰＤＸ１の遺伝子発現を示す。

【図36(d)】実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、ステージ２、３日目、ステージ３、３日目、及び遺伝子によってはステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。。図３６（ｄ）は、ＰＲＯＸ１、ＰＦＴ１ａ、ＳＯＸ１７、及びＳＯＸ２の遺伝子発現を示す。

【図36(e)】実施例８のプロトコルに従って、ステージ２からステージ３及び４へ分化させた細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、これらの図は、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、ステージ２、３日目、ステージ３、３日目、及び遺伝子によってはステージ４、１日目の細胞の遺伝子発現を示す。図３６（ｅ）は、ＳＯＸ９の遺伝子発現を示す。データは、未分化のＨ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞（１の基準発現）と対比した、発現における差異として示される。

【図37】実施例８のプロトコルに従った分化のステージ４、３日目の細胞の選択遺伝子に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図３７に示すように、ステージ３、３日目の分化の終了時に、細胞は、ＰＤＸ１（＞１×１０⁶倍の誘導）及び他の膵臓遺伝子（ＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴの＞１０００倍の誘導）の高い発現レベル、並びに未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比較して、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失を特徴とする膵臓前駆細胞に分化している。

【図38】実施例８に従った分化プロトコル中の毎日の細胞計数を示す。特に、図３８は、プロセス日の関数としての細胞密度を示す。図３８は、ｐＨ６．８及び７．２で実行した２度のリアクター運転（ＰＲＤ１２０５及びＰＲＤ１２０７）の、分化プロトコルの細胞計数を示す。比較のために、細胞ドリフトの細胞計数も示す。

【図39(a)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ａ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５×１０⁶又は１０×１０⁶のステージ４、３日目の細胞の埋め込み後のＣ−ペプチドレベルを、時間の関数として示す。

【図39(b)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｂ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、５ｘ１０⁶又は１０ｘ１０⁶のステージ４、３日目の細胞の埋め込み後の、動物における非空腹時グルコースレベルを示す。

【図39(c)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｃ）は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内の、あらかじめ冷凍保存したステージ４、３日目の細胞の埋め込み後に産生されたＣ−ペプチドレベルを、時間の関数（埋め込み後の週）として示す。

【図39(d)】実施例８のプロトコルに従って分化させ、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス内に埋め込んだ、ステージ４、３日目の細胞の生体内の生物活性を図示する。細胞は、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して、腎臓被膜下の皮下に埋め込むか、又は超低級付着皿内でのインキュベーションの後に埋め込んだ。マウスは、血糖及びＣ−ペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。図３９（ｄ）では、解凍直後（０日目）又は解凍１日後（１日目）に埋め込んだ、腎臓移植片の、一度も冷凍保存しなかった／新鮮なステージ４、３日目の細胞、又は冷凍保存したステージ４、３日目の細胞によって処理された、マウスのＣ−ペプチドレベルを比較する。

【図40A】ステージ１、１日目に、ＭＣＸ化合物及びＧＤＦ−８（図４０Ａ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。この図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【図40B】ステージ１、１日目に、ＭＣＸのみ（図４０Ｂ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。この図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【図40C】ステージ１、１日目に、ＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡ（図４０Ｃ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。この図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【図40D】ステージ１、１日目に、ＷＮＴ３Ａのみ（図４０Ｄ）で処理した、実施例９のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。この図は、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【図41-1】図４１Ａ及び図４１Ｂは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、４μＭのＭＣＸ（図４１Ａ）、３μＭのＭＣＸ（図４１Ｂ）で細胞を処理した。

【図41-2】図４１Ｃ及び図４１Ｄは、ステージ１、１日目に様々な量のＭＣＸで処理した、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、ステージ１、１日目に、２μＭのＭＣＸ（図４１Ｃ）、及び１．５μＭのＭＣＸ（図４１Ｄ）で細胞を処理した。

【図42】図４２Ａ及び図４２Ｂは、実施例１１のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養下の培地交換頻度の役割を示す。図４２Ａは、ステージ１で完全な培地交換をして、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。図４２Ｂは、３日目の培地交換なしで、実施例１０のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。データは、懸濁培養系内で、分化の３日目に培地交換を受ける培養（図４２Ａ）が、３日目に培地交換を受けなかった培養（図４２Ｂ）に相当する効率を有する胚体内胚葉をもたらしたことを示唆する。

【図43】図４３Ａ及び図４３Ｂは、実施例１２のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。特に、これらの図は、懸濁培養下のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の役割を示す。ステージ１では、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加した培地（図４３Ａ）内、又はＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）若しくはいかなるグルタミン（０ＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））も含まない培地（図４３Ｂ）内で細胞を培養した。データは、懸濁培養系内で、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の添加が、胚体内胚葉が生成される効率に影響を与えないようであることを示唆する。

【図44-1】図４４Ａ及び図４４Ｂは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、様々な量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ａ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｂ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化させた細胞のＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。

【図44-2】図４４Ｃ及び図４４Ｄは、実施例１３のプロトコルに従って分化した細胞に対する、様々な量の重炭酸ナトリウムの影響を示す。図４４Ｃ及び図４４Ｄは、ステージ１で３．６４ｇ／ｌ（図４４Ｃ）又は２．４９ｇ／ｌ（図４４Ｄ）のいずれかを添加して、実施例１３のプロトコルに従って３日間分化させた細胞の位相差顕微鏡写真を示す。

【図45】実施例１４のプロトコルに従って分化させた細胞について、細胞密度の毎日の細胞計数を分化の関数として示す。細胞計数は、画像に基づくサイトメター（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））を使用して取得された。

【図46】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のｐＨレベルを示す。ｐＨレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図47】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地のグルコースレベルを示す。グルコースレベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図48】実施例１４の分化プロトコル中の時間（分化日数）の関数として、平均した毎日のバイオリアクター培地の乳酸レベルを示す。乳酸レベルは、ＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって決定された。

【図49】実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ０、１〜３日目及びステージ１、１日目〜３日目の細胞に関する、多能性と関連付けられている選択遺伝子を含有する多能性アレイの、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。

【図50】実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ０、１〜３日目、ステージ１、１日目〜３日目、及びステージ２、１日目〜３日目の細胞に関する、ＤＥと関連付けられている選択遺伝子を含有するＤＥアレイの、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定される、遺伝子発現を示す。

【図51】実施例１４のプロトコルに従って分化させる前の、ステージ０の細胞に関する、多能性に関連付けられているマーカー（ＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）のＦＡＣＳの結果を示す。特に、図５１は、多能性に関連付けられているマーカーの高い発現を示す。

【図52】実施例１４のプロトコルに従って、ステージ１の終了まで分化させた細胞の胚体内胚葉マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９のＦＡＣＳプロットを示す。

【図53】実施例１４のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目、ステージ２、２日目、及びステージ２、３日目の細胞に関する、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１の、未分化細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図５３は、前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現における増加を示す。

【図54】実施例１４のプロトコルに従って分化させた、ステージ２、１日目〜３日目及びステージ３、１日目〜３日目の細胞に関する、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＨＮＦ４Ａ、ＮＫＸ２−２、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、及びＰＦＴ１Ａの、未分化細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図５４に示すように、ＰＤＸ１の発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと６０倍増加した。

【図55】実施例１４のプロトコルに従って分化させたステージ３、１〜３日目及びステージ４、１日目〜３日目の細胞に関する、特定の遺伝子の、未分化の細胞と対比した倍数発現量としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。特に、図５５の上部パネルは、ＧＡＰＤＨ、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＡＲＸ、ＣＤＸ２、ＣＨＧＡ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＡＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、及びＭＡＦＢの遺伝子発現を示す。図５５の下部パネルは、ＭＡＦＢ、ＭＵＣＳ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＫＸ２−２、ＮＫＸ６−１、ＰＡＸ４、ＰＤＸ１、ＰＯＵＳＦ１、ＰＴＦ１Ａ、ＳＳＴ、及びＺ１Ｃ１の遺伝子発現を示す。

【図56】実施例１４のプロトコルに従って分化させた細胞の最後のステージの顕微鏡写真を示す。図５６において可視であるのは、ステージ０での、及びステージ１〜４の分化の終了時点での、細胞集団の代表的な顕微鏡写真（４×）である。

【図57】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＡＦＰ（図５７）。

【図58】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤ９９（図５８）。

【図59】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤ９（図５９）。

【図60】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＨ１（図６０）。

【図61】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＨ２（図６１）。

【図62】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＤＸ２（図６２）。

【図63】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＥＲ１（図６３）。

【図64】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＣＸＣＲ４（図６４）。

【図65】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＧＦ１７（図６５）。

【図66】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＧＦ４（図６６）。

【図67】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＦＯＸＡ（図６７）。

【図68】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＤＰＨ（図６８）。

【図69】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＴＡ４（図６９）。

【図70】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＡＴＡ６（図７０）。

【図71】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＧＳＣ（図７１）。

【図72】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＫＩＴ（図７２）。

【図73】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＭＩＸＬ１（図７３）。

【図74】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＭＮＸ１（図７４）。

【図75】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＮＡＮＯＧ（図７５）。

【図76】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＯＴＸ２（図７６）。

【図77】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＰＯＵＦ５Ｆ１（図７７）。

【図78】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＳＯＸ１７（図７８）。

【図79】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。ＳＯＸ７（図７９）。

【図80】以下の遺伝子の分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。Ｔ（図８０）。

【図81-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図81-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図81-3】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の割合を示す。特に、図８１は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図82-1】実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。

【図82-2】実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。左手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＧ２／Ｍにおける細胞の割合を示す。特に、左手パネルは、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。１組のデータにおいて、これらの集団をＥＤＵでも処理した。

【図82-3】実施例１５のプロトコルに従って分化させた細胞集団に対する、ＥＤＵ処理の影響を示す。右手パネルは、実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、ＥＤＵ陽性である細胞の％を示す。

【図83】実施例１５のプロトコルで使用された、一般的な操作パラメーターを示す。

【図84】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞の、ＥＤＵ取り込みの量を示す。特に、図８４は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した、ＥＤＵインキュベートした細胞集団の結果を示す。（１）無溶媒、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図85】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＧ０／Ｇ１における細胞の割合を示す。特に、図８５は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図86】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＳ期における細胞の割合を示す。特に、図８６は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図87】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従った分化の６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の細胞に関する、細胞周期のＳ期における細胞の割合を示す。特に、図８７は、分化の第１日目に以下の６つの条件のうちの１つで処理した集団の結果を示す。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【図88A-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ａは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、及びＣＤＨ２の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88A-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ａは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、及びＣＤＨ２の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88B-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｂは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＸＤ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、及びＦＧＦ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88B-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｂは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＣＸＤ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、及びＦＧＦ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88C-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｃは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ６の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88C-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｃは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ、ＧＡＴＡ４、及びＧＡＴＡ６の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88D-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｄは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、及びＭＮＸ１の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88D-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｄは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、及びＭＮＸ１の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88E-1】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88E-2】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88E-3】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88E-4】実施例１５のプロトコルの各種実施形態に従って分化させた細胞に関する、分化の０時間後、６時間後、２４時間後、３０時間後、４８時間後、及び７２時間後の、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現を示す。図８８Ｅは、未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵＦ５Ｆ１、及びＳＯＸ１７の遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88F-1】未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＳＯＸ７及びＴの遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図88F-2】未分化の細胞と対比した倍数発現としてｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、ＳＯＸ７及びＴの遺伝子発現を示す。図８８Ａ〜８８Ｆの基礎をなすデータが、図５８〜６７及び６９〜８０に示される。

【図89】実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図８９に示すとおり、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図８９の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図８９の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図90】実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９０に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９０の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９０の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図91】実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９１に示すように、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９１の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９１の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図92】実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で３日間培養した多能性細胞の、ＦＡＣＳによって決定された、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のたんぱく質発現パターンを示す。特に、図９２の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株のＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４の発現パターンを示す。図９２の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンのＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のたんぱく質発現パターンを示す。

【図93】実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で培養した多能性細胞の、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定された、遺伝子発現パターンを示す。図９３に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９３の左パネルは、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の遺伝子発現パターンを示す。図９３の右パネルは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの遺伝子発現パターンを示す。

【図94】実施例１６のプロトコルに従って中胚葉分化培地内で分化させた、細胞の顕微鏡写真を示す。図９４に示すように、細胞は心性細胞系統に向かって分化した。特に、図９４の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目におけるＨ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９４の右手パネルは、分化から１０日後の臍帯組織細胞（ＵＴＣ ＩＰＳＣ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。

【図95】実施例１６のプロトコルに従って外胚葉分化培地内で分化させた、細胞の顕微鏡写真を示す。図９５に示すとおり、細胞は神経細胞系統に向かって分化した。特に、図９５の左手パネルは、分化の３日目、５日目、及び１０日目におけるＨ１ ｈＥＳ細胞株のＷＢ０１０６サブクローンの細胞の顕微鏡写真を示す。図９５の右手パネルは、分化から１０日後の臍帯組織細胞（ＵＴＣ ｉＰＣＳ）から生成した、誘導された多能性幹細胞株の顕微鏡写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本出願は、凝集細胞集団において、内胚葉前駆細胞、膵内分泌細胞、中胚葉細胞、又は外胚葉細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及び他の多能性細胞の調製を目的とする。開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を説明又は例示する下記の小項目に分割する。

【0017】

定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能的細胞へと生体外で分化する能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。

【0018】

幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。「細胞培養」又は「培養」とは、全般的には、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養下の」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養である。細胞は、細胞成長及び細胞分裂のいずれか又は両方を促進する条件下で成長培地内に定置される場合に、培養下で増殖して、より大きな細胞の集団を生じさせる。細胞を培養下で増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって測定される場合がある（倍加時間と称する）。

【0019】

「増殖」は、本明細書で使用される場合、培養によって多能性幹細胞の数を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上など、及びこれらのパーセンテージ以内のレベルの分、増加させるプロセスである。単一の多能性幹細胞から得ることのできる多能性幹細胞の数は、多能性幹細胞の増殖能力に依存することが理解される。多能性幹細胞の増殖能力は、細胞の倍加時間、すなわち、細胞が培養下で有糸分裂を受けるために必要とされる時間、及び多能性幹細胞が未分化の状態で維持され得る期間（継代数に、それぞれの継代間の日数を掛けた数に等しい）によって計算され得る。

【0020】

分化は、特殊化されていない（「未拘束の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導された細胞とは、細胞の系統内でより特化した（「拘束された」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統系内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせ得るかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

【0021】

本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞と比べて、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。

【0022】

本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。とりわけ、ＦＡＣＳによる陽性は通常２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％を下回る。ＰＣＲによる陽性は通常３４周期（Ｃｔｓ）を下回るが、ＰＣＲによる陰性は通常３４．５周期を超える。

【0023】

本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書において互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。

【0024】

本明細書で使用するとき、「懸濁培養」は、表面に接着するよりもむしろ、培地内で懸濁された細胞の培養、単一細胞、又は集団を指す。

【0025】

本明細書で使用するとき、「無血清」は、ヒト又は動物血清を欠くことを指す。したがって、無血清培養培地は、血清又は血清の部分を含まない。

【0026】

細胞培養での多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化プロセスは、しばしばいくつかの連続したステージを通して進行していると見なされる。本明細書で使用するとき、様々なステージは、培養時間、及び本明細書に含まれる実施例において説明される試薬によって定義される。

【0027】

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する。ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（ＨＮＦ３β）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、短尾奇形、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７が挙げられる。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現で特徴付けられ得る。加えて、細胞がステージ１に留まることができる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。

【0028】

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」とは、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。これらのホルモンに加え、膵内分泌細胞に得直的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子の少なくとも１つによって特徴付けられ得る。ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮｕｅｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６。

【0029】

本明細書では、「ｄ１」、「ｄ １」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ ２」、及び「２日目」、「ｄ３」、「ｄ ３」及び「３日目」などは互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。

【0030】

「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖、デキストロースを指す。

【0031】

膵内分泌前駆細胞において発現されるたんぱく質及びそれをコードする遺伝子を特定する「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。

【0032】

「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡからＳＴＥＭＯＬＥＣＵＬＥ（商標）の商標で入手可能なＢＭＰ受容体阻害剤である、（（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン，塩酸；ＤＭ−３１８９））を指す。

【0033】

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体の１つ又は２つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。生体外での多能性幹細胞の分化は、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の発現の喪失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。

【0034】

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれらの３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。

【0035】

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、様々なフィーダー層を用いて、又はマトリックスたんぱく質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った懸濁培養下での培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが分化を制限する細胞密度で、培養容器内に多能性幹細胞を播種することによって達成される。典型的に、細胞の未分化を維持する播種密度が使用される。幹細胞の単一細胞懸濁液も播種され得るが、細胞の小さな集団が有利であり得ることが理解されよう。

【0037】

懸濁培養下にある間、栄養素及び成長因子の十分かつ一定の供給を多能性幹細胞に提供するために、培養培地は、毎日、又は１〜５日毎といった所定のスケジュールで交換又は補充され得る。多能性幹細胞の大きな集団は、細胞分化を引き起こし得るため、大きな多能性幹細胞凝集体を回避するための手段が取られ得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、形成された多能性幹細胞集団は、例えば、２〜７日毎に分離され、単一細胞又は細胞の小さな塊は追加の培養容器内に分割される（すなわち、継代される）か、又は同一の培養容器内に保持され、交換又は追加の培養培地で処理される。

【0038】

遠心分離から生じる多能性幹細胞のペレットを含む、大きな多能性幹細胞の塊は、酵素消化及び機械的分離のいずれか又は両方を受け得る。多能性幹細胞の塊の酵素消化は、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素に塊をさらすことによって実行され得る。大きな多能性幹細胞の塊の機械的分離は、塊を所定のサイズに破断するように設計されたデバイスを使用して実行され得る。加えて、又は別の方法として、機械的分離は、針又はピペットを使用して手動で実行され得る。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った、懸濁において多能性幹細胞を培養するために使用される培養容器は、その中で培養される多能性幹細胞が、そのような表面に接着又は結合することができないように設計された内部表面を有する任意の組織培養容器（例えば、多能性幹細胞を培養するために好適な純度等級を有するもの）であり得る（例えば、表面への結合又は接着を防ぐために非組織培養処理した容器）。好ましくは、計測可能な培養を得るために、本発明のいくつかの実施形態に従った培養は、温度、撹拌、ｐＨ、及び酸素などの培養パラメーターが、好適なデバイスを使用して自動的に監視及び制御される、制御下の培養系（好ましくは、コンピュータで制御される培養系）を使用して達成される。所望の培養パラメーターが決定されると、系は、多能性幹細胞の増殖及び分化を増すために必要とされる培養パラメーターの自動調整のために設定され得る。

【0040】

多能性幹細胞は、複数の継代に渡ってそれらの増殖性、多能性能力、及び核型安定性を維持しながら、動的条件下（すなわち、多能性幹細胞が懸濁培養内にある間、一定の運動（を受ける条件下（例えば、撹拌懸濁培養系））、又は非動的条件下（すなわち、静的培養）で培養され得る。

【0041】

多能性幹細胞の非動的培養について、多能性幹細胞は、コーティングされた又はされていない、ペトリ皿、Ｔフラスコ、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、又はＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＵＮＣ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））内で培養され得る。多能性幹細胞の動的培養について、多能性幹細胞は、スピナーフラスコ又は三角フラスコ、ステンレス鋼、ガラス又は単一使用プラスチック振とう器又は撹拌槽などの好適な容器内で培養され得る。培養容器は、制御ユニットに接続され、それにより制御された培養系を提供し得る。培養容器（例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコ）は、連続的又は断続的に撹拌され得る。好ましくは、培養容器は、多能性幹細胞を懸濁状態に維持するために十分に撹拌される。

【0042】

多能性幹細胞は、成長及び増殖を促進するために十分な栄養素及び環境的刺激を提供する、任意の培地内で培養され得る。好適な培地には、Ｅ８（商標）、ＩＨ３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１、又はＴｅＳＲ（登録商標）２が挙げられる。培地は、栄養素供給を補充し、細胞の副産物を除去するために、定期的に変更され得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、培養培地は毎日変更される。

【0043】

多能性幹細胞の供給源
本発明の方法では、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用が可能な多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などである。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。

【0044】

また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発明の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記述されたように調製してもよい（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。また、例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又は例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などの成人ヒト体性細胞に由来する細胞も好適である。本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）、Ｍａｈｅｒａｌｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）、Ｎａｋａｇａｗａｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１〜１０６，２００８）、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）、及び米国特許出願公開第２０１１−０１０４８０５号に記載された方法に従って誘導され得る。多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性細胞（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）を含む。本発明の方法における使用のために好適な細胞の他の供給源には、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物が挙げられる。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は米国特許第７，５１０，８７３号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国出願公開第２００５／００５８６３１号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国出願公開第２００７／０１２２９０３号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。

【0045】

多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞マーカーとして、例えば、以下のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は全て）の発現が挙げられる。ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１。一実施形態において、本発明の方法での使用に好適な多能性幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化のマーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４としても知られる）の発現を欠く。別の実施形態において、本発明の方法における使用のために好適な多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、又は全て）を発現する。

【0046】

例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。一実施形態では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞、例えば、Ｈ１ ｈＥＳ細胞である。代替の実施形態において、非胚性起源の多能性幹細胞が使用され得る。

【0047】

多能性幹細胞から膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の分化
多能性幹細胞の増殖
本発明は、以下に記載される実施形態のいくつかにおいて、幹細胞の隔離及び培養、特に動的懸濁培養系において多能性を保持する幹細胞集団の培養に関する。多能性細胞集団は、機能的β細胞を産生するように分化され得る。

【0048】

本発明の方法で使用される多能性幹細胞は、好ましくは、所望の終点に向けた分化の前に、動的懸濁培養下で増殖される。有利なことに、多能性幹細胞は、多能性を損失することなく、好適な培地内に懸濁状態で細胞の集団として培養され、増殖され得ることが発見されている。そのような培養は、多能性の損失を防ぐために、細胞又は細胞集団が十分に移植させられ続ける、動的懸濁培養系内で生じ得る。有用な動的懸濁培養系は、撹拌、振とう、再循環、又は培地を通したガスのバブリングなどを介して、培養内容物を撹拌するための手段を備えた系を含む。そのような撹拌は、増殖を促進し、早期分化を防ぐための細胞集団の十分な運動が維持される限り、断続的又は連続的であってよい。好ましくは、撹拌は、特定の速度で回転する羽根車などを介する連続的撹拌を含む。羽根車は、円形又は平坦な底部を有してよい。羽根車の撹拌速度は、集団が懸濁状態に維持され、沈降が最小化されるようなものであるべきである。更に、羽根車ブレードの角度は、沈降を回避するための細胞及び集団の上方運動を補助するために、調整され得る。また、羽根車の型、角度、及び回転速度は全て、細胞及び集団が均一なコロイド懸濁液のようなものにあるように調整され得る。

【0049】

多能性幹細胞集団の懸濁培養及び増殖は、使い捨て可能なプラスチック、再利用可能なプラスチック、ステンレス鋼又はガラス容器、例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコなどの適した動的培養系に、静的培養した幹細胞を移植することによって達成され得る。例えば、接着性静的環境、すなわち、プレート又は皿表面で培養した幹細胞は、まずキレート剤又は酵素で処理することによって表面から除去され得る。好適な酵素として、限定するものではないが、Ｉ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）の商標名で販売される商業的に入手可能な製剤が挙げられる。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）は、コラーゲン分解性又はたんぱく分解酵素（甲殻類から隔離される）を含み、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞剥離液である。したがって、一実施形態において、酵素は、コラーゲン分解酵素若しくはたんぱく分解酵素、又はコラーゲン分解及びたんぱく質分解酵素を含む細胞剥離液である。好適なキレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞培養は、好ましくは、群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、ただし培養表面からの群体の完全な剥離の前に、酵素又はキレート剤と共にインキュベートされる。一実施形態において、細胞培養は室温でインキュベートされる。一実施形態において、細胞は、２０℃を超える、２５℃を超える、３０℃を超える、又は３５℃を超える温度で、例えば、約２０℃〜約４０℃の間、約２５℃〜約４０℃の間、約３０℃〜約４０℃の間の温度、例えば、約３７℃で、インキュベートされる。一実施形態において、細胞は、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０分間、例えば、約１〜約３０分の間、約５〜約３０分の間、約１０〜約２５分の間、約１５〜約２５分の間、例えば、約２０分間、インキュベートされる。一実施形態において、この方法は、処理の後に細胞培養から酵素又はキレート剤を除去する工程を含む。一実施形態において、細胞培養は、酵素又はキレート剤の除去の後、１度又は２度以上洗浄される。一実施形態において、細胞培養は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）などの適切な培養培地で洗浄される。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２，Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、約１〜約１００μＭ、約１〜９０μＭ、約１〜約８０μＭ、約１〜約７０μＭ、約１〜約６０μＭ、約１〜約５０μＭ、約１〜約４０μＭ、約１〜約３０μＭ、約１〜約２０μＭ、約１〜約１５μＭ、約１〜約１０μＭ、又は約１０μＭの濃度であってよい。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、又は少なくとも１０μＭ添加される。細胞は、スクレーパ又はゴム製ポリスマンで静的培養系の表面から剥離され得る。培地及び細胞は、ガラスピペット又は他の好適な手段を使用して動的培養系に移植され得る。好ましい実施形態において、動的培養系内の培地は、毎日変更される。

【0050】

本発明は、一実施形態において、三次元の懸濁培養内で多能性幹細胞を培養し、増殖させる方法を提供する。とりわけ、この方法は、これらの多能性幹細胞の凝集細胞集団を形成することによって、多能性幹細胞の培養及び増殖をもたらす。細胞集団は、細胞を培養する前に、酵素（例えば、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）などの中性プロテアーゼ）又はキレート剤で多能性幹細胞培養を処理した結果として形成し得る。細胞は、好ましくは、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養され得る。一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞のそのような集団から、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を更に提供する。

【0051】

好ましくは、細胞集団は、凝集多能性幹細胞である。凝集幹細胞は、多能性の１つ又は２つ以上のマーカー、例えば、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化に関する１つ又は２つ以上のマーカーの発現を欠く（例えば、ＣＸＣＲ４の発現を欠く）。一実施形態において、凝集幹細胞は、多能性のマーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、分化に関するマーカーＣＸＣＲ４の発現を欠く。

【0052】

一実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法である。細胞集団は、動的撹拌又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、中性プロテアーゼ、例えば、Ｄｉｓｐａｓｅなどの酵素を細胞の剥離剤として使用して、平面接着培養から撹拌又は振とうされる懸濁培養系へ移植され得る。例示的な好適な酵素としては、限定されるものではないが、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）が挙げられる。細胞は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系において、特に撹拌される懸濁培養系において、多能性を維持する。

【0053】

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系、特に撹拌される（動的に撹拌される）懸濁培養系で多能性を維持する。

【0054】

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、動的に撹拌される懸濁培養系で多能性を維持する。

【0055】

本発明の細胞集団は、心性細胞などの中胚葉細胞、神経細胞などの外胚葉細胞、単一ホルモン陽性細胞、又は膵臓内胚葉細胞に分化し得る。この方法は、分化、例えば、膵臓内胚葉細胞の膵臓前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化を更に含み得る。別の実施形態において、膵臓前駆細胞は、β細胞転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現によって特性化される。

【0056】

一実施形態において、分化の工程は、懸濁培養系において少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９６時間以上、好ましくは約４８時間〜約７２時間後に実行される。分化は、実施例に記載されるもののような、培地成分のステージ式の進行を使用して実行され得る（例えば、表Ａ、並びに表１ａ及び１ｃを参照のこと）。

【0057】

好ましい実施形態において、三次元の細胞集団は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、によって産生される。更に好ましい実施形態は、平面接着培養系内で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、によって、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖及び分化させる方法である。

【0058】

別の実施形態は、膵臓前駆細胞へと分化された、増殖した多能性幹細胞集団の懸濁から調製された、分化した幹細胞を含む、移植可能な幹細胞由来の細胞産物である。より具体的には、移植可能な幹細胞由来の産物は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させることと、によって産生される。移植可能な幹細胞由来の細胞産物は、好ましくは、糖尿病を治療するために使用される。

【0059】

別の実施形態において、この方法は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のための、糖尿病の動物内への移植を含む。

【0060】

別の実施形態は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、酵素を使用して、多能性幹細胞を平面接着培養から除去することと、静的培養下で多能性幹細胞をマイクロキャリアに接着させることと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖することと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、を含む、懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖し、分化させる方法である。

【0061】

マイクロキャリアは、接着細胞について当該技術分野において既知の任意の形態であり得、とりわけ、マイクロキャリアはビーズであり得る。マイクロキャリアは、天然又は合成的に由来する材料からなり得る。例としては、コラーゲンベースのマイクロキャリア、デキストランベースのマイクロキャリア、又はセルロースベースのマイクロキャリアが挙げられる。例えば、マイクロキャリアビーズは、表面に結合して、マイクロキャリアに対して正に帯電している表面を提供するカチオントリメチルアンモニウムを有する、改質ポリスチレンビーズであり得る。ビーズ直径は、約９０〜約２００μｍ、あるいは約１００〜約１９０μｍ、あるいは約１１０〜約１８０μｍ、あるいは約１２５〜１７５μｍの範囲であり得る。マイクロキャリアビーズはまた、架橋デキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層であり得る。マイクロキャリアビーズは、ガラス、セラミックス、ポリマー（ポリスチレンなど）、又は金属であり得る。更に、マイクロキャリアは、シリコン、又はコラーゲンなどのたんぱく質などでコーティングされても、又はコーティングされなくてもよい。更なる態様では、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高める、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物（限定するものではないが、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチン、及びコラーゲンが挙げられる）で構成されるか、又はコーティングされてもよい。実施例は、低レベルの生物学的に関連する電気を産生する、亜鉛及び銅の微粒子ガルバーニ電気連結を有するマイクロキャリア、又は常磁性カルシウムアルギン酸マイクロキャリアなどの常磁性のマイクロキャリアといった、微小電流を有するマイクロキャリアを更に含む。

【0062】

いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉細胞集団は、多能性細胞集団の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。

【0063】

いくつかの実施形態において、本発明は、動的懸濁培養でステージ３〜５の細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化する段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、生成される膵臓内胚葉集団は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のために、糖尿病の動物内に移植される。本発明はまた、本発明の方法で使用する系又はキットを提供する。

【0064】

本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって取得される細胞、又は細胞の集団を提供する。

【0065】

本発明は、治療法を提供する。とりわけ、本発明は糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。

【0066】

本発明はまた、治療法で使用するために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法で使用する、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。糖尿病は、１型又は２型糖尿病であり得る。

【0067】

一実施形態において、治療法は、本発明の方法によって得られる、又は取得可能な細胞を患者に埋め込むことを含む。

【0068】

一実施形態において、治療法は、生体外で多能性幹細胞をステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、又はステージ５の細胞に分化させることと、例えば、本明細書に記載するように、分化した細胞を患者内に埋め込むことと、を含む。

【0069】

一実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載するように、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、多能性幹細胞を培養する工程を更に含む。

【0070】

一実施形態において、この方法は、埋め込みの工程の後に、生体内で細胞を分化させる工程を更に含む。

【0071】

一実施形態において、患者は哺乳類、好ましくはヒトである。

【0072】

一実施形態において、細胞は、分散した細胞として埋め込まれてもよく、又は肝門脈内に注入され得る集団として形成されてもよい。あるいは、細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に埋め込まれてもよい。埋め込み部位としては、例えば、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。

【0073】

生体内で埋め込まれた細胞の更なる分化、生存、又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にその場で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞は、当該技術分野において既知の内因性の成長因子、及び当該技術分野において既知の外因性の成長因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導され得る。

【0074】

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。

【0075】

一実施形態において、治療法は、埋め込み前に、細胞を三次元の支持体内に取り込むことを更に含む。細胞は、患者に埋め込む前に、生体外でこの支持体上に維持されてもよい。あるいは、細胞を含む支持体は、更に生体外で培養することなく、直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。

【0076】

本発明の特定の実施形態において、以下の１つ又は２つ以上が本発明の方法で使用され得る。

【0077】

【表1】

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【0078】

本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【実施例】

【0079】

本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。

【0080】

（実施例１）
ディスパーゼ／中性プロテアーゼを使用した細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及び集団化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）をＰＢＳ（カタログ番号１４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１３３０，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）内で、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（中性プロテアーゼ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ ＬＬＣ，カタログ番号Ｄ４８１８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）の１ｍｇ／ｍＬの溶液で処理した。群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、ただし培養表面からの群体の完全な剥離の前に、細胞を３７℃で１５〜２５分間インキュベートした。Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）をその後に除去し、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）培地で２度洗浄した。次いで、１０μＭ Ｙ−２７６３２を含むｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を、５ｍＬ／６０ｃｍ²の培養皿に添加し、スクレーバ又はゴム製ポリスマンを使用して表面から細胞を剥離した。次いで、培地及び細胞を、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、集団を９０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心分離させた。

【0081】

遠心分離の後、培地を吸引し、細胞を徐々に再懸濁して、全平面培養のうち、２２５〜２４０ｃｍ²につき１０μＭのＹ−２７６３２を含有する１２ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（１つのＴ２２５フラスコ又は４枚の１０ｃｍ皿に等しい、約９０００万個の細胞）内で簡潔に微粉化した。次いで、細胞懸濁液を、１０μＭのＹ−２７６３２を有する、２ｍＬ／ウェルの新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する超低級結合培養６ウェルの皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号３４７１、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に移植した。この方法で剥離させた細胞は、剥離させた断片の平均直径がおよそ２０〜３０マイクロメートル（図１ａ）で、それぞれが細胞の塊からなる、単層の断片に類似していた。これらの単層断片を懸濁状態で２時間インキュベートし（インキュベーション時間は、０．５〜４時間の範囲であり得る）、この時点で断片の凝集体が観察された。次いで、凝集体を、ガラスの１０ｍＬピペットを使用して短時間で微粉化し、低結合プレートで一晩インキュベートした（凝集体は、懸濁へ直接進行し得る）（凝集体はまた、無処理の細胞培養プラスチック及び標準組織培養処理したプラスチック内でインキュベートされ得る）。

【0082】

一晩のインキュベーション（１８〜２４時間）後、５０ｒｐｍ（３０〜８０＋ｒｐｍの範囲であり得る）で撹拌される、２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、１２５ｍＬのスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号４５００−１２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）に細胞及び培地を直接移植し、約７５ｍＬの最終体積を作製した。培地を４日間、毎日交換した。培養下での４日後に多能性が決定され、フローサイトメトリー結果は、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示したが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど示さなかった。これについては、図１ｂを参照されたい。これらのデータは、細胞剥離剤としてＤｉｓｐａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養形式からＨ１ ｈＥＳ細胞を細胞集団として正常に移植し、撹拌（動的）懸濁培養系内で多能性を維持し得ることを実証する。この実施例はまた、プレート及び三角フラスコの、撹拌よりもむしろ振とうされる懸濁系において、同等の結果で実行され得る。

【0083】

懸濁培養下での４日間後に（分化はまた、凝集体の形成から２４〜１２０時間後に開始し、好ましくは、分化開始前の２〜３日間培養し得る）、多能性細胞凝集体が培地成分のステージ式の進行で分化されて、膵臓の運命を形成するように細胞が誘導された。スピナー撹拌については、凝集体の分化のために６５ｒｐｍまで速度を上げた。培地及び成分を表１ａに示す。

【0084】

ステージ１の終了時に、試料に対してフローサイトメトリー及びＰＣＲを実行した。懸濁分化培養は、ステージ１（図１ｃ）の終了時に、疎性の凝集体の、均一かつ均質な細胞の集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーはかなり高く、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）については９７．２％の陽性、及びＣＤ９９については９７．３％の陽性であった（図１ｄ）。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比した、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図１ｅ）。

【0085】

その後、ＴＧＦ−βファミリーメンバー、ＧＤＦ８を除去し、ＦＧＦ７を培地に添加することによって、胚体内胚葉集団を原始前腸に更に分化させた。ＦＧＦ７での３日間の培養後、高いグルコース（２５ｍＭ）及び低濃度の脂質豊富なウシ血清アルブミン（ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する培地、又は比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、膵臓ＰＤＸ１発現運命に集団を分化させた。これらの培地への成分の詳細な添加を表１ａに示す。分化の終了時に、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。フローサイトメトリーによって測定される、いずれかの条件（グルコース＋２％のＦＡＦ−ＢＳＡ（Ａ）又は高いグルコース＋０．１％のＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（Ｂ）で分化させた集団は、機能的β細胞に必要とされる転写因子である高レベルのＮＫＸ６．１、及び高レベルの内分泌膵臓マーカー（シナプトフィジン及びクロモグラニンなど）を発現することが観察された（表１ｂ）。これらの結果は、条件Ａ及びＢの両方からの試料内で発現した、高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示す、ＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（データの表示なし）。

【0086】

それらが胚体内胚葉（ＤＥ）（図１ｃ）から原始前腸への、及び膵臓内胚葉（図１ｆ）への分化を通して進行した際の、細胞集団の典型的な形態は、細胞及び細胞集団に対する可視の形態的な変化を実証した。典型的に、多能性集団は、位相差顕微鏡法では高密度かつ暗く見え、その後、細胞がステージ２において原始前腸へと進行するにつれて外観がより疎性になる。この形態は、続くオールトランスレチノイン酸処理を反転させ、集団は再び、平滑な集団境界を有した更に高密度かつ均一なものとなる。

【0087】

ステージ４を通して条件Ｂに従って分化させた細胞は、ＡＬＫ５阻害剤を含有するステージ５の培地内で更に５日間保持された（表１ｃを参照のこと）。培養下でのこの追加の成熟は、内分泌マーカー発現（ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、ＰＰＹ、及びＰＣＳＫ１）における有意な増加をもたらした。その後、ＩＡＣＵＣ承認の研究プロトコルに従って、細胞集団をＳＣＩＤ−Ｂｇマウスの腎臓被膜内に埋め込み、マウスを２０週間観察し、２〜４週間毎に空腹／供給の状態でＣ−ペプチドを測定した。埋め込みから４週間後、２０時間の空腹、及びその後グルコース刺激の後、Ｃ−ペプチドは検出不可能であった。６週目までに、５匹中２匹の陽性マウスがいくらかの（０．０８７及び０．１３７ｎｇ／ｍＬ）ヒトＣ−ペプチドを示し、１０週目までに、５匹中５匹のマウスがＣ−ペプチドに対して陽性（０．０８５〜０．２９１ｎｇ／ｍＬ）であった。１６週目で、２０時間の空腹及びグルコース刺激の後、４匹のマウス全て（４／４）がＣ−ペプチド発現に対して陽性（０．３７７〜３．６２７ｎｇ／ｍＬ）であった。

【0088】

これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、次いで、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生成するように、懸濁培養系内で分化し得ることを示す。更に、生体内に埋め込んで成熟可能にさせた、分化した細胞集団は、生理学的に適切なレベルでのグルコースチャレンジに反応して、インスリンを発現した。

【0089】

【表2】

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【0090】

【表3】

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【0091】

【表4】

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【0092】

（実施例２）
ＥＤＴＡを使用した細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁及び集団化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１度洗浄し、非酵素的細胞剥離／継代剤であるＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７−７−１１Ｅ）で処理した。細胞を８分間室温でインキュベートした。次いで、ＥＤＴＡを除去し、１〜２分以上（９〜１０分の全ＥＤＴＡ露出）の後、１０μＭのＹ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートを濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブに収集した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートの濯ぎをもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。室温でのＥＤＴＡへの露出から９〜１０分後に、いくつかの細胞はプレート上に留まり、剥離された細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかったことに留意されたい。代わりに、表面から小さな凝集体として細胞が除去された。培地及び細胞をその後、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、細胞計数を実行した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ｃａｔ＃ＹＣ−Ｔ１００，Ｄｅｎｍａｒｋ）。必要に応じて、１０μＭのｙ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。

【0093】

集団が疎性に凝集しており、ペレットに遠心分離してピペットで再懸濁すると、単一の細胞に分離するであろうことから、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。所望の場合、更に、ＥＤＴＡ処理の期間を延長し、細胞をほぼ単一の細胞懸濁液にすることもできる。その後、ガラスピペットを使用して、３７℃、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内に３ｍＬ／ウェルで、２枚の非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に細胞懸濁液を移植した。細胞を懸濁状態で２時間インキュベートし、この時点で凝集体が観察された。次いで、ガラスピペットでの静かなピぺッティングによって、凝集体を微粉化して、大きな凝集体を破壊し、均質で均一な集団懸濁液を作製してから、撹乱せずに一晩インキュベートした。

【0094】

次いで、１８〜２４時間後に、細胞及び培地を５０ｍＬの円錐チューブ内で、９０ｇ（ｒｃｆ）で３分間遠心沈降させた。使用済みの培地の上澄を破棄し、新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）１内で細胞凝集体を懸濁させ、３７℃、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内にて５５ｒｐｍで撹拌されるスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，カタログ番号４５００−１２５，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）に、懸濁液を移植した。培地を２日間、毎日交換した。多能性は、撹拌される懸濁培養下での２日後、分化培養への遷移前に決定された。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を、散布図形式で図２ａに示す。これらのデータは、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１）の高い発現を示すが、分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現はほとんど又は全く示さない。これらの結果は、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、非酵素的剥離方法を使用して、平面接着培養系形式から懸濁培養へと移植され、動的撹拌される懸濁培養系で多能性を維持し得ることを示す。

【0095】

懸濁培養下での２日後、多能性細胞凝集体が培地成分のステージ式の進行で分化され、膵臓の運命を形成するように細胞が誘導された。スピナー撹拌は、５５ｒｐｍの速度に維持した。培地及び成分を表２ａに示す。

【0096】

ステージ１の終了時に、試料に対してフローサイトメトリー及びＰＣＲを実行した。懸濁分化培養は、ステージ１（図２ｂ）の終了時に、疎性の凝集体における細胞の均一かつ均質な集団を形成し、多能性のマーカー（ＣＤ９）の発現はほぼ除去されたが、胚体内胚葉分化のマーカーであるＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）はかなり高く、３つのスピナーフラスコにわたって、９５．９％±１．８ｓｄ（図２ｃ）であった。これらの結果は、未分化のＷＡ０１ ｈＥＳ細胞と対比した、多能性遺伝子（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現における劇的な減少、並びに胚体内胚葉と関連付けられている遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＣＥＲＢＥＲＵＳ、ＧＳＣ、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、及びＳＯＸ１７）における大きな増加を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ結果と相関した（図２ｄ）。

【0097】

次いで、スピナーフラスコからの胚体内胚葉集団を貯留し、別のスピナーフラスコ又は三角フラスコ（振とうされる撹拌系）のいずれかに分配し、ＧＤＦ８を除去し、ＦＧＦ７を培地に添加することによって原始前腸への更なる分化に差し向けた。ＦＧＦ７での３日間の培養後、比較的低いグルコース濃度（８ｍＭ）及び２％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有する培地のいずれかへの、オールトランスレチノイン酸の添加によって、膵臓ＰＤＸ１発現運命に集団を分化させた。これらの培地への成分の詳細な添加を表２ａに示す。分化の終了時に、膵臓前駆細胞のマーカーの発現について、試料を分析した。フローサイトメトリーを使用して、機能的β細胞に必要とされる転写因子である、高レベルのＮＫＸ６．１、及びシナプトフィジン及びクロモグラニンなどの高レベルの内分泌膵臓マーカー（表２ｂ及び図２ｅ）が、両方の懸濁形式で観察された。これらの結果は、スピナーフラスコ形式又は三角フラスコ形式で生成した試料内で発現した、非常に類似した高レベルの複数の膵臓前駆体遺伝子を示した、ＲＴ−ＰＣＲ結果と一貫した（図２ｆ）。

【0098】

これらの結果は、多能性細胞凝集体が形成され、その後、撹拌される系又は振とうされる懸濁系を含む、複数の懸濁培養形式の懸濁培養下で分化され、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のようなβ細胞転写因子の発現によって特徴付けられる膵臓前駆細胞集団を生成し得ることを実証する。

【0099】

【表5】

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【0100】

【表6】

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【0101】

（実施例３）
細胞株Ｈ１のヒト胚性幹細胞の懸濁集団化及び連続懸濁継代
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でコーティングされた、組織培養処理したポリスチレン上で成長させた、継代４０でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２度洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（１部のＰＢＳ対１部のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ａ−６９６４，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の半強度の溶液で処理した。細胞を室温で３分半インキュベートした（Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）は、コラーゲン分解性又はたんぱく分解酵素（甲殻類から隔離される）で構成され、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞剥離液である）。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）をその後に除去し、３分以上（６分半の全Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）露出）の後、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートを濯ぎ、ガラスピペットを使用して、除去された細胞を５０ｍＬの円錐チューブに収集した。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でプレートの濯ぎをもう１度実行し、除去された細胞と共に貯留した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）への露出後に、いくつかの細胞はプレート上に留まり、剥離された細胞は、単一の細胞懸濁液に完全には脱凝集されなかった。代わりに、表面から小さな凝集体として細胞が除去された（図３ａ）。培地及び細胞をその後、ガラスピペットを使用して５０ｍＬの円錐チューブに移植し、細胞計数を実行した。必要に応じて、１０μＭのｙ−２７６３２を含有する追加のｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を添加して、１００〜１５０万個の細胞／ｍＬの細胞の濃度を作製した。

【0102】

集団が疎性に凝集しており、ペレットに遠心分離してピペットで再懸濁すると、単一の細胞に分離するであろうことから、細胞を遠心分離しなかった。代わりに、均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。次いで、ガラスピペットを使用して、３７℃、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内に、２枚の超低結合培養の６ウェルの皿に細胞懸濁液を移植した。細胞を懸濁状態で９０分間インキュベートし、この時点で凝集体が観察された。次いで、凝集体を短時間で微粉化し、５５ｒｐｍで撹拌される２５ｍＬのｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地を含有する、１２５ｍＬのスピナーフラスコに直接移植した（合計最終体積は、約７５ｍＬであった）。培地を３日間毎日変更し、多能性を培養下での３日目に決定した。集団の位相差顕微鏡画像は、静的懸濁培養下で９０分後に形成され、培養下で３日間にわたって増殖した、集団の均一な球状集団を示している（図３ｂ）。懸濁培養下での３日間の終了時に、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４のフローサイトメトリー結果によって、細胞の多能性を分析した。細胞は、分化のマーカーである、ＣＸＣＲ４の発現がほとんどなく、多能性のマーカー（ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１）の高い発現を維持した。これらのデータは、Ｈ１ ｈＥＳ細胞が、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素的剥離方法を使用して、平面接着培養形式から懸濁培養に移植可能であり、動的撹拌される懸濁培養系内に多能性を維持することを示している。

【0103】

その後、更に２０回の継代のために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離を使用して、多能性集団を連続的に継代させた。各継代で、５０００万個の細胞を２分間、５０ｍＬの円錐チューブ内で重力沈降させ、ＰＢＳで２度洗浄し、３７℃の水浴内で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の添加の２及び４分後にチューブを静かに渦流することで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半強度の溶液で処理した。６分間のインキュベーションの後、細胞ペレットを撹乱させずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）をチューブから吸引した。次いで、細胞を３分以上インキュベートした（９分間の総Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）露出）。次いで、１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地でチューブを濯ぎ、ガラスピペットを使用して２度微粉化し、懸濁された細胞を７０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｃａｔ＃３５２３５０，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通過させた。１０μＭのＹ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地で、チューブの追加濯ぎを２度実行し、細胞ストレーナに通過させた。

【0104】

均一な懸濁液が形成されるまで、チューブ内の培地及び細胞を静かに渦流した。その後、ガラスピペットを使用して３ｍＬ／ウェルで、３７℃、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内の超低結合培養６ウェルの皿に細胞懸濁液を移植し、懸濁状態で２時間インキュベートし（０〜２８時間テスト）、この時点で、凝集体を培地の最終体積８０ｍＬでガラススピナーフラスコに移植した。あるいは、細胞懸濁液を、５５ｒｐｍで撹拌されるスピナーフラスコ、又は４０ｒｐｍで振とうされる三角フラスコへ直接定置してもよく、集団は培地の最終体積８０ｍＬで、撹拌懸濁液（図３ｃ）内に形成された。

【0105】

この連続継代方法を使用して、それぞれの継代でおよそ１：３の分割比で、細胞を２０回継代させた。多能性をそれぞれの継代でフローサイトメトリーによって測定し、染色体１２及び１７（ｈＥＳ細胞内で潜在的に不安定なものとして識別される２つの染色体）について、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを使用して、核型を決定した。ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＣＸＣＲ４発現のフローサイトメトリー結果を散布図形式で示す。この結果が、多能性のマーカーが高い発現であること、及び分化のマーカー（ＣＸＣＲ４）の発現がほとんど又は全くないことを示す一方、染色体１２及び１７のＦＩＳＨアッセイは、正常なコピー数を示した。これらのデータは、非哺乳類の酵素的細胞分離方法である、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用する、常用の連続継代によって、懸濁培養下でＨ１ ｈＥＳ細胞が維持され得、２０回の継代にわたっては、最初の入力細胞あたりに１×１０⁹細胞を生成する、動的撹拌される懸濁培養系で多能性及び安定した核型を維持することを示す。ＥＤＴＡもまた、この連続懸濁液に、６回の継代用として使用され得る。

【0106】

【表7】

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【0107】

（実施例４）
細胞株Ｈ１の懸濁培養されたヒト胚性幹細胞の指向された分化
継代４０でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養から剥離し、懸濁培養系形式に移植した。実施例３に述べた方法を使用する３０回の継代用に、細胞を動的撹拌される懸濁培養系に維持した。

【0108】

表３に示すとおり、多能性は最初の２０回の継代を通して確認され、フローサイトメトリーによって測定される、安定した高レベルの多能性マーカーが培養を通して維持された。多能性を確認し、糖尿病の治療のための細胞供給源を提供するそれらの能力を実証するために、正常な膵臓発達を繰り返すことを意図したモルフォゲン又は成長因子を含有する、異なる培地の段階式進行を通して、動的撹拌される懸濁培養系で細胞を膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、高いＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生じさせる。これらの細胞は、移植される際に、グルコースに反応してインスリンを分泌し、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおいて正常血糖を維持することができる、機能的グルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟した。図４ｃ及び表４ｃを参照されたい。

【0109】

これらの膵臓前駆細胞を生成するため、１６回の継代用に動的撹拌される懸濁培養系で増殖し、維持したＨ１ヒト胚性幹細胞を、実施例３に述べた方法を使用して分化させた。要約すると、細胞を３０回の継代用に増殖し、これらの継代の最初の２０回分の多能性をテストした。細胞は、１６回目の継代で分化された。集団形式の多能性細胞を４℃で３時間、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地からＦＢＣ溶液（表４ａ）へ移植した。その後、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂ−ＤＣＵ（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）制御ユニットによって調節される、３リットルのガラス懸濁バイオリアクターに細胞集団を移植し、表４ｂに従って、５５万個の細胞／ｍＬで、分化培地内で懸濁した。細胞を、温度、ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）を調節した、閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター（Ｆｅｒｍｐｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＢｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）提供の溶存酸素Ｏｘｙｐｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５）内で１４日間維持した。

【0110】

運転を通して、合計培地体積≦１．６リットル内でのＣＯ₂流量の調節によって、ｐＨをｐＨ ７．４に維持しながら、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持した。１５０ｃｃ／分の一定のガス流量で、ステージ１について２０％の溶存酸素設定値、及びステージ２以降について３０％の溶存酸素設定値を使用したＳａｒｔｏｒｉｏｕｓ制御システムの制御の下で、ＣＯ₂、空気、及びＯ₂でバイオリアクターヘッドスペースを連続的に灌流した。溶存酸素含量に応じて酸素流量を調節し、ｐＨに応じてＣＯ₂流量を調節した。温度は、電熱ジャケットにより、運転を通して３７℃に維持した。運転の開始時に、それぞれの培地交換（１回の交換ごとに培地の９３％を除去）について、羽根車（７０ｒｐｍで動作する３インチステンレス鋼ピッチブレード羽根車）を停止し、閉鎖系を維持するために、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したバイオリアクター内で、ディップチューブを通した蠕動ポンプによって、培地を除去又は添加した。分化の各ステージの終了時に、細胞／集団の画像を撮影し、フローサイトメトリー試料を収集し、ステージ１、３日目、及び３日後のステージ２の終了時にＣＸＣＲ４発現について分析した（図４ａ）。分化の開始時（表３、継代１６）で、ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団からＣＸＣＲ４発現（細胞の９８．５％がＣＸＣＲ４陽性、図４ｂ）細胞の集団へのほぼ完全な集団遷移が観察された。次いで、３日後のステージ２の終了時に、これらの細胞をほぼＣＸＣＲ４陰性状態に遷移し（細胞の７．０％がＣＸＣＲ４陽性）、ステージ３の終了時までに、細胞はほとんど完全にＣＤ５６陽性状態に遷移した。ステージ４の４日目の分化プロセスの終了時に、細胞はＰＤＸ１発現に対して８８．５％陽性（図４ｂ）であり、膵内分泌細胞（３３．５％クロモグラニン陽性）と膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１に対して６５．７％陽性）との混合物と一貫した発現パターンを示した。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓細胞への効率的なステージ式分化を示した。分化プロセスの終了時に、２７７万個の細胞／ｍＬが生成され（１．５リットルで４１億個の細胞）、インプットされたｈＥＳ細胞ごとに分化細胞５個の総質量増殖を示した。

【0111】

運転の終了時に、５００ｍＬを遠心分離及び洗浄のために除去し、生着、成熟、及び機能の動物モデルでテストした。残りの１０００ｍＬの細胞懸濁液を、ｋＳｅｐ（登録商標）４００システム（ＫＢＩ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｒｈａｍ ＮＣ）内で処理して、完全な閉ループ系において細胞産物を洗浄、濾過、及び濃縮した。細胞産物を、１リットルの開始体積から、最終濃度４１００万個の細胞／ｍＬに濃縮された細胞５０ｍＬまで濃縮した。次いで、自動化バイアル充填機（Ｆｉｌｌ−Ｉｔ，ＴＡＰ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＵＫ）を使用して、１．２ｍＬの充填体積を有する２４個のバイアル内に、これらの濃縮された細胞を分注し、液体窒素冷凍庫内に定置することによって凍結した。

【0112】

洗浄され、標準遠心分離によって濃縮された５００ｍＬの分化細胞を、腎臓被膜下に直接定置するか、又は皮下に埋め込まれた免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標），Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）内に定置するかのいずれかで、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウス１匹当たり５００万個の細胞の用量で移植した（１条件につき６体の動物）。埋め込みから１２週間後までに、埋め込まれた細胞は、空腹及びその後の供給に反応して、ＥＬＩＳＡ（ヒトＣ−ペプチドカスタムＥＬＩＳＡ Ｍｅｒｃｏｄｉａ，ｃａｔ＃ １０−１１４１−０１）によって検出される、有意なレベルの循環ヒトＣ−ペプチド（＞０．１ｎｇ／ｍＬ）を発現し、１６〜２０週後までに、動物は１ｎｇ／ｍＬを超える循環Ｃ−ペプチドを有した（表４ｃ）。

【0113】

埋め込みから２７週間（１９０日）後に、デバイス封入された免疫保護移植片を有する２体の動物を、単一の高用量のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）でそれぞれ処理して、全ての内因性マウスβ島細胞を選択的に殺し、糖尿病を誘導した（２５０ｍｇ／Ｋｇ）。対照動物において真性糖尿病を誘導するために十分なＳＴＺ処理から翌２週間は、移植された動物の血糖レベルが正常な範囲（＜１５０ｍｇ／ｄＬ）内に留まった。埋め込みから２９週間後、及びＳＴＺ投与の２週間後に、２体の動物がグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）についてテストされ、グルコース投与に反応する循環ヒトＣ−ペプチドにおける著しい増加を示した。更に、埋め込みから２０９日（２９．５週間）後、それぞれの移植片を除去する際に、動物の血糖レベルが＞５００ｍｇ／ｄＬへと劇的に増加した。

【0114】

これらの結果は、糖尿病を治療するためのヒト胚性幹細胞由来の細胞産物が、増殖及び分化された幹細胞の懸濁液から調製され得ることを実証する。産物は、計測可能な、撹拌される閉ループバイオリアクター系で生成され得、細胞産物は、商業的ｃＧＭＰの製造に必要とされる、閉ループ洗浄及び濃度で処理され得る。このヒト胚性幹細胞由来の細胞産物は、血糖を調節する能力であるＧＳＩＳ能力、及び細胞療法の除去時の糖尿病状態への回帰に示されるように、広く使用される糖尿病の動物モデルにおいて糖尿病を治療し得る。

【0115】

【表8】

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【0116】

【表9】

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（専門用語：時間０＝新しいステージの最初の供給、時間２４、４８、又は９６時間＝新しいステージ培地の経過時間）

【0117】

【表10】

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【0118】

（実施例５）
細胞株Ｈ１の接着培養されたヒト胚性幹細胞の懸濁形式における指向された分化
継代４１でのヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞，ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養から剥離し、例２に述べた方法を使用して懸濁培養系形式に移植した。

【0119】

図５ａに示すとおり、フローサイトメトリーによって細胞凝集体の多能性を測定し、細胞が高度に多能性であることを示す、多能性マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６１、及びＴＲＡ−１−８０の高い発現が観察された。次いで、正常な膵臓発達のモルフォゲン駆動体を繰り返すことを意図した、小分子及び成長因子を含有する、培地の段階式進行を通して、これらの多能性細胞を動的に撹拌される懸濁培養系で膵臓前駆体に分化させた。このプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を産生する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る、機能的なグルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。

【0120】

膵臓前駆細胞集団を生成するために、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地内で維持された集団形式の多能性細胞を、制御装置で調整した温度、ｐＨ、及び溶存酸素を有する、０．２リットルのガラス製の撹拌懸濁バイオリアクター（Ｄａｓｇｉｐ，カタログ番号ＤＳ０２００ ＴＢＳＣ，Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ，ＭＡ）に移植した。多能性細胞集団をバイオリアクターで２日間培養した。その時点（ステージ１、０日目）で培地を交換し、分化を開始させながら、表５ａに従って分化培地内において細胞約７０万個／ｍＬで、細胞凝集体を懸濁させた。その後、この閉鎖された無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を１４日間維持した。分化全体を通して、合計体積０．３リットル内でのＣＯ₂流量の調節によって、ｐＨをｐＨ ７．４に維持しながら、培地の重炭酸塩レベルを３．６４ｇ／Ｌに維持した。５リットル／時間の一定のガス流量において、３０％の溶存酸素設定値でのＤａｓｇｉｐ制御システムの制御下で、バイオリアクターヘッドスペースにＣＯ₂及び空気を注入した。溶存酸素含量に応じて空気流量を調節し、ｐＨに応じてＣＯ₂流量を調節した。

【0121】

【表11】

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【0122】

この実施例で、及び本明細書全体で使用されるとおり、ＳＣＩＯは、化学名４−｛［２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）−５−（１−メチルエチル）ピリミジン−４−ｙｌ］アミノ｝−Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）ピリジン−３−カルボキサミド及びＣＡＳ番号６７４７９４−９７−９を有する、Ａｌｋ５阻害剤である。ＳＣＩＯの化学構造を以下に示す。

【0123】

【化1】

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【0124】

温度は、運転を通して３７℃に維持した。運転開始時に、それぞれの培地交換（１回の交換につき培地の９５％を除去）について、羽根車を停止し、Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続した、バイオリアクターディップチューブを通る蠕動ポンプによって、培地を除去してから添加して、閉鎖系を維持した。

【0125】

ステージ１中、いくつかの異なる供給設定を試験した。（ａ）分化開始から２４時間後に培地変更、４８時間で培地変更なし、（ｂ）分化開始から２４時間後に培地変更、及び４８時間でグルコースをボーラス添加、並びに（ｃ）ステージ１を通して培地を変更せず、分化開始から２４時間後にグルコース及びＧＤＦ８をボーラス添加し、次いで、開始から４８時間後にグルコースをボーラス添加。

【0126】

表５ｂに示すとおり、リアクターごとに、プロセスの開始、中間、及び終了時の細胞計数を取得した。ステージ１の終了時に、フローサイトメトリーによるたんぱく質発現パターンについて、細胞を試料採取した。条件Ａ（分化開始から２４時間後に胚体内胚葉に培地変更、その後４８時間培地変更なし）において分化した細胞が、分化のマーカー（ＣＤ９９及びＣＸＣＲ４）の誘導、並びに多能性マーカー発現（ＣＤ９）の低減によって測定される、最良の結果を示した（図５ｂ）。胚体内胚葉形成の終了時点での、ＣＤ９のより低い発現との組み合わせにおけるＣＸＣＲ４及びＣＤ９９のより高い発現は、膵臓遺伝子のより高い発現、及び分化における後の代替器官運命を示す遺伝子のより低い発現と相関した（図５ｄ及び５ｅ）。具体的には、分化の第１のステージを通して培地を変更しないこと、又はステージ１においてバルク供給形式でグルコースを培地に添加することのいずれか又は両方は、４つのステージの分化の終了時の非常に異なる凝集体形態と相関する、ステージ１の終了時のより低いＣＸＣＲ４レベルをもたらした（図５ｃ）。具体的には、条件Ｂ及びＣは、ステージ４の終了時に、フローサイトメトリーによって測定される、より低い膵臓遺伝子発現（ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡ）、及び非膵臓遺伝子（ＣＤＸ２及びＳＯＸ２）のより高い発現を有した（図５ｄ及び表５ｂ）。これらの発見はｑＲＴ−ＰＣＲ（図５ｅ）によって裏付けられており、条件Ａは条件Ｃよりも膵臓遺伝子の発現が有意に高く、条件ＢはＡ及びＣの中間であることを示した。更に、条件Ｃは、例えば、ＣＤＸ２、ＡＦＰ、及びアルブミン（図５ｅ）など、代替の非膵臓運命を示す有意により高いレベルの遺伝子を発現した。これらのデータは、ＤＥ形成の最後の４８時間に培地変更なしで生成される、均質で高いＣＸＣＲ４を発現する胚体内胚葉（ＤＥ）が、純粋な膵臓内胚葉集団に後から変換できることを示す。

【0127】

４つのステージの分化の終了時に、条件Ａに従って分化した細胞をバイオリアクターから除去し、０．１％のＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ１３１培地で洗浄し、ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスに埋め込んだ。それぞれのマウスに、５００万個の細胞を腎臓被膜下に直接移植した。埋め込み後４週間毎に、採血を実行し、血糖及びＣペプチドを測定した。埋め込みの１２週間後までに、ヒトＣペプチドは、ＥＬＩＳＡによって１ｎｇ／ｍＬを超えるレベルで検出可能であり、１６週目でＣペプチドレベルは平均２．５ｎｇ／ｍＬであった（図５ｆ）。埋め込み後２０週で、空腹にさせてから供給した状態の動物でＣペプチドを測定した。グルコース処理は、空腹状態の０．９３ｎｇ／ｍＬから、供給状態の２．３９ｎｇ／ｍＬまで、循環ヒトＣペプチドにおける有意な増加を誘導し（図５ｇ）、移植された細胞が機能的ＧＳＩＳコンピテント組織へと成熟したことを示した。更に、動物にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与（マウスβ細胞は、ヒトβ細胞と比較して、より敏感であり、ＳＴＺによって優先的に破壊される）を与えて、糖尿病の状態を誘導した際、機能的ＧＳＩＳコンピテント組織の移植片を有する動物は、真性糖尿病を発症した未処理の対照とは異なり、正常な血糖レベルを維持した（図５ｈ）。これらの結果は、ｈＥＳ分化細胞移植片を有する動物が、機能的膵臓組織移植片によって、ＳＴＺ誘導糖尿病から保護されたことを実証する。

【0128】

【表12】

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【0129】

（実施例６）
細胞株Ｈ１のマイクロキャリア接着培養されたヒト胚性幹細胞の懸濁液形式における指向された分化
Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３マイクロキャリアビーズ（Ｃ３）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カタログ番号Ｃ３２７５）を、１５ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を含有する、２０ｍＬの体積のシリコンコーティングされたガラスシンチレーションバイアル瓶内に、４００ｍｇのビーズを４〜２４時間浸漬することによって、培養用に調製した。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３は、架橋デキストランのマトリックスに化学結合させた、変性コラーゲンの薄い層から構成される。Ｃｙｔｏｄｅｘ（登録商標）３の変性コラーゲン層は、トリプシン及びコラゲナーゼが挙げられる、様々なプロテアーゼにより消化されやすく、細胞の生存率、機能及び完全性を最大限維持しつつ、細胞をマイクロキャリアから取り外すという性能を提供する。

【0130】

浸漬後、ビーズを加圧滅菌し、無菌ＤＰＢＳで濯ぎ、１０μＭのＹ２７６３２を添加したマウス胚性繊維芽細胞調湿培地（ＭＥＦ−ＣＭ）内で再懸濁した。その後、１２５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ガラススピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に、ビーズ１００ｍｇ／フラスコの密度でビーズを移植した。Ｙ２７６３２と共にビーズ及びＭＥＦ−ＣＭを含有するスピナーを、３７℃、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内で少なくとも６０分間均衡化した。

【0131】

継代４４での、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して平面接着培養から剥離した（３７℃で８分間インキュベーションして、単一の細胞懸濁液を形成）。次いで、細胞を洗浄し、Ｙ−２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭ内で懸濁し、１１００万個のｈＥＳ細胞を、静的（静止）インキュベーション期間中６時間、ビーズに接着させた。次いで、Ｙ−２７６３２を有するＭＥＦ−ＣＭをスピナーフラスコに添加して、７５ｍＬの最終培地体積を作製し、細胞及びビーズをガラススピナーフラスコ内で５０ｒｐｍの羽根車速度で撹拌した。ＭＥＦ−ＣＭを毎日５０ｍＬの培地交換をしながら、この様式で５日間細胞を成長させた。培養下で５日後に、フラスコは５３×１０⁶個の細胞（±１２×１０⁶ＳＤ）を含有した。対照として、１００万個のＨ１ ｈＥＳ細胞もまた、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の１：３０希釈でコーティングされた、６ウェルの組織培養ポリスチレン皿に播種し、ＭＥＦ−ＣＭの毎日の培地変更を維持した。

【0132】

多能性培養下で５日後に、正常な膵臓発達モルフォゲンを繰り返すことを意図した、小分子及び／又は成長因子のいずれか又は両方を含有する異なる培地の段階式進行を通して、これらの細胞はその後、動的撹拌される懸濁培養系で膵臓前駆体に分化した。正常な膵臓発達を繰り返すための方法として、２つの培地製剤、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを使用してＤＥを形成したもの、及びＧＤＦ８を有するＭＣＸ化合物を使用してＤＥを形成したもの（それぞれ、表６ａ及び６ｂ）をテストした。培地を毎日変更し、ＲＴ−ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによって試料を特徴付け、細胞特性を決定した。マイクロキャリア上の細胞の位相差画像を撮影し、細胞の分化が開始する前の、多能性培養系としての細胞形態の時間経過を図６ａに示す。培養分化を示す時間経過を図６ｂに示す。また、実験を通して様々な時点で細胞計数を取得し、結果を、平面培養下又は懸濁マイクロキャリア培養下のいずれかの培地製剤について、表面積の関数（図６ｃの細胞／ｃｍ²）又は培地体積（図６ｄの細胞／ｍＬ）として示した。

【0133】

プロセスを通した様々な点で、フローサイトメトリー及びＲＴ−ＰＣＲによって、細胞が特徴付けられた。分化の第１のステージのフローサイトメトリーの結果、胚体内胚葉の形成を、ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）及びＣＤ９（Ｘ軸）の細胞発現のドットプロットとして図６ｅに示し、結果をまた、各マーカーの全発現として図６ｆに表す。結果は、全ての条件において、ＣＸＣＲ４発現の利得、及び多能性表面マーカー、ＣＤ９の損失によって定義されるように、実質的に大多数の細胞が胚体内胚葉を形成することを示す。更に、胚体内胚葉のより効率的な形成が、ＭＣＸ／ＧＤＦ８マイクロキャリア＞ＭＣＸ／ＧＤＦ８平面＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡマイクロキャリア＞ＷＮＴ３Ａ／ＡＡ平面からの処理の順位で生じる。ＭＣＸ／ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＣＥＲＢＥＲＵＳ（Ｃｅｒ１）、グースコイド、及びＦＧＦ１７（図６ｇ）のより低い発現を示すため、細胞に対する、培地に特異的な影響はないように見えるが、全ての処理条件は、胚体内胚葉遺伝子であるＣＤ９９、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＫＩＴ、及びＳＯＸ１７の類似した発現レベルを示す（図６ｇ及び表６ｃ）。これらのプロセスは、膵臓細胞転写因子、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同時発現によって特徴付けられる、膵臓前駆細胞集団を生成する。これらの細胞が移植される際、それらは、糖尿病のストレプトゾトシン誘導モデルにおける高血糖を補正し得る、機能的なグルコース刺激インスリン分泌組織に更に成熟する。

【0134】

下の表６ａで使用するとおり、Ｂ２７はＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｂ−２７（登録商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。

【0135】

この実施例で使用するとおり、ＭＣＸ化合物は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンであり、以下の式（式１）を有する。

【0136】

【化2】

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【0137】

上記のＭＣＸ化合物の代わりに、他の環式アニリンピリジノトリアジンもまた使用され得る。かかる化合物としては、限定されるものではないが、１４−メチル−３，５，７，１４，１８，２４，２８−ヘプタアザテトラシクロ［２０．３．１．１〜２，６〜．−１〜８，１２〜］オクタコサ−１（２６），２（２８），３，５，８（２７），９，１１，２２，２４−ノナエン−１７−ｏｎ−ｅ、及び５−クロロ−１，８，１０，１２，１６，２２，２６，３２−オクタアザペンタシクロ［２４．２．２．１〜３，７〜−１〜９，１３〜．１〜１４，１８〜］トリトリアコンタ−３（３３），４，６，９（３２），１０−，１２，１４（３１），１５，１７−ノナエン−２３−オンが挙げられる。これらの配合物を以下に示す（式２及び式３）。

【0138】

【化3】

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【0139】

例示の好適な化合物は、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号に開示され、その開示は、ＭＣＸ化合物、関連する環式アニリンピリジノトリアジン、及びそれらの合成に関連するため、その全体が組み込まれる。

【0140】

この実施例のステージ４で使用したＣｙｐ２６阻害剤は、Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンであり、これは、ＣＡＳ番号２０１４１０−５３−９及び以下の構造を有する。

【0141】

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

【0142】

このＣｙｐ２６阻害剤は、「Ｃｙｐｉ」としても知られている。このＣｙｐ２６阻害剤の構造及び合成は、米国特許番号第７，３７８，４３３号に開示されており、その開示はＣｙｐ２６阻害剤及びそれらの合成に関連することから、その全体が組み込まれる。

【0143】

【表13】

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【0144】

【表14】

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【0145】

【表15】

[この文献は図面を表示できません]

【0146】

（実施例７）
この実施例には、Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株のサブクローン、ＷＢ０１０６を使用した。ＷＢ０１０６を、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で、ＤＤＬ−１３と呼ばれるＨ１株種材料から誘導した。Ｈ１株のＷＢ０１０６サブクローンを、継代２３で解凍したＤＤＬ−１３バイアルから、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）基質上のｍＴＥＳＲ１（登録商標）１培地内に誘導し、続いてＥＤＴＡを使用して継代した。ＷＢ０１０６を継代２８で凍結し、正常な核型（ＦＩＳＨ及びＧバンド）、膵臓前駆細胞に分化する能力、及び集団を形成し、懸濁培養下で増殖する適格性に基づいて、これらの研究のために選択した。

【0147】

その後、Ｔ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）内のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の基質上の培地内に、ＷＢ０１０６ ＷＣＢバイアルを解凍し、第１の継代で細胞を複数のＴ２２５フラスコへ増殖させた。第２の継代で、単一の２層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ２）を播種するため、複数のＴ２２５フラスコからの細胞を結合して使用した。ＣＳ２が７０％コンフルエントになると、隣接するポンプチュービングを有するＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングアセンブリキャップを培地ポートに結合し、系を閉鎖した。Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングによって系を閉鎖した後、袋又はボトルをＴｅｒｕｍｏ接合装置で溶接し、蠕動ポンプを使用して液体体積（培地、ＰＢＳ^-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、又は懸濁細胞）を移した。

【0148】

細胞をＣＳ２から剥離するために、細胞をＰＢＳ^-/-で１度洗浄し、その後ＰＢＳ^-/-で希釈したＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標） の半強度の溶液で処理し、４〜５分間インキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ２を軽打して細胞の剥離を促進した。０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２を含有する、培地のボトルを、ＣＳ２内にポンプで注入することで残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、不活性化してから、濯ぎ液を収集した。第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。その後、２００ｍＬ中の２．０〜２．５×１０⁸個の細胞を、１層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内に移植し、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内で２時間、３７℃でインキュベートした。２つのＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培地ポート間に結合したポンプチュービングを有する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングの閉ループを使用して、細胞懸濁液を蠕動ポンプによって７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。閉ループチュービングを無菌０．２マイクロメートル濾過器と交換して、ガス交換を可能にし、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション（１２〜２２時間、最適１８時間）の後、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）内の細胞は、多能性細胞の丸い球状の凝集体（集団）を形成した。

【0149】

懸濁細胞集団を含有する０．５％のＢＳＡを添加した培地を、０．５％のＢＳＡを添加し、５５〜６５ｒｐｍで維持した０．４リットルの新鮮な培地と共に、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）から１リットルの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）へと移植した。移植から２４時間後に、１リットルの使い捨てスピナーフラスコを加湿、５％のＣＯ₂インキュベーターから除去し、集団を５〜１０分間沈降させた。その後、容器内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引してから、４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナーフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移植から４８時間後）の終了時に繰り返した。

【0150】

３日目の終了時（ＣＳ２からスピナーフラスコへの移植から７２時間後）に、継代及び更なる増殖のために、細胞集団をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理によって分離した。１リットルの使い捨てスピナーフラスコを加湿、５％のＣＯ₂インキュベーターから除去することによって、継代プロセスを開始した。細胞の均質な懸濁液を維持するため、フラスコをバイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上に定置した。細胞懸濁液を、１００ｍＬのピペットによってスピナーフラスコから除去し、４つの１７５ｍＬの円錐ポリカーボネートチューブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ−Ｎａｌｇｅｎｅ；Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）間に均等に分配し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。細胞ペレットを撹乱させずに、使用済みの培地を吸引した。その後、カルシウム又はマグネシウムを含まない２５ｍＬのＤＰＢＳ（ＤＰＢＳ^-/−）を各チューブに添加し、細胞を円錐チューブ内に結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。ＤＰＢＳ^-/-を円錐チューブから吸引し、３０ｍＬの５０％のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）／５０％のＤＰＢＳ^-/-溶液をチューブに添加した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。その後、細胞ペレットを撹乱させずに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を可能な限り完全に吸引し、細胞懸濁液が均一な乳白色に見えるまで、円錐チューブを３〜５分間、連続的にそっと軽打した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地１０ｍＬを細胞懸濁液に添加し、２〜４度微粉化して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を不活性化した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地９０ｍＬを細胞に添加し、懸濁液を４０マイクロメートルの細胞ストレーナ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に通過させた。

【0151】

濾過した細胞懸濁液の１００ｍＬの体積における細胞密度を、ＮＣ−１００ ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ，Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で決定し、追加の培地を添加して、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地内に、１×１０⁶個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度をもたらした。その後、２２５ｍＬ（２億２５００万個の細胞）の細胞懸濁液を１リットルの使い捨てスピナーフラスコに移植し、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内で、撹拌せずに１時間インキュベートした。フラスコをその後、インキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上にて１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液を混合している間、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地の追加の２２５ｍＬを細胞懸濁液に添加した。スピナーフラスコをその後、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーターに３０分間戻した。フラスコをその後、インキュベーターから除去し、バイオセーフティーキャビネット内のスピナプレート上にて１００ｒｐｍで１〜３分間撹拌した。細胞懸濁液を混合している間、最終体積が６００ｍＬとなるように、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、０．５％のＢＳＡを添加した培地の追加の１５０ｍＬを細胞懸濁液に添加して、フラスコをインキュベーター内の撹拌懸濁液に戻した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離から２４及び４８時間後の両方で、細胞集団をフラスコの底部に５〜１０分間沈降させた。あらゆる集団の損失を確実に最小化するために、４００ｍＬの使用済み培地を吸引によってフラスコから除去し、新鮮な培地と交換した。このプロセスを使用して、Ｈ１細胞を基質上の接着培養から、細胞集団としての懸濁培養へ変換した。

【0152】

最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理から７２時間後、細胞集団分離及びスピナーフラスコ播種（継代）のプロセスを繰り返して、複数の継代中（検査範囲：１〜１０回の継代）細胞を懸濁液に維持した。最初の２４時間後に培地を除去しなかったことを除き、上記のプロセスに従って、２００ｍＬの新鮮な培地を添加した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）分離から４８時間後に、集団をフラスコの底部に５〜１０分間沈降させ、６００ｍＬを吸引し、４００ｍＬの新鮮な培地をフラスコに添加した。

【0153】

これらの懸濁液で継代し、培養した細胞はその後、将来の使用のために冷凍保存し、保管することができる。冷凍保存用に懸濁増殖細胞を調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させなかったことを除き、懸濁継代に関して上記に述べたとおりに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で細胞集団を分離した。それぞれの１リットルの使い捨てフラスコから生成された、１００ｍＬの細胞懸濁液の細胞計数を決定した。次に、細胞懸濁液を結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次に、細胞ペレットを撹乱させることなく、遠心管からの培地を可能な限り完全に除去した。次に、１ｍＬ当たり１億５０００万個の細胞の最終濃度を得るために、低温の（＜４℃）ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を滴下により添加して、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）クライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉクライオバック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に移植する間、細胞溶液を氷浴内で保持した。

【0154】

次いで、以下のとおり、バイアル内の懸濁増殖細胞を自動凍結保存装置内に高密度で凍結した。チャンバを４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。次いで、試料が−７℃に達するまで、チャンバ温度を２℃／分で下げた。試料バイアルが−７℃に達すると、チャンバが−４５℃に達するまで、チャンバを２０℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度が−２５℃に達するまで、チャンバ温度を１０℃／分で素早く上昇させ、その後、試料バイアルが−４５℃に達するまで、チャンバを０．８℃／分で更に冷却した。次いで、チャンバが−１６０℃に達するまで、チャンバ温度を３５℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持してから、バイアルをガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0155】

撹拌槽バイオリアクターに接種するために、高密度で冷凍保存された細胞を、液体窒素保管容器から取り出し、解凍し、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ；Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種するために使用した。４〜５のバイアルを、ガス相液体窒素保管容器から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。次いで、２ｍＬのガラスピペットを介して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブに移植した。次いで、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加した９ｍＬの培地（ＩＨ３又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（「Ｅ８（商標）」））を滴下によりチューブに添加した。次に、細胞を８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。チューブから上澄を吸引して、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加した１０ｍＬの新鮮な培地（ＩＨ３又はＥ８（商標））を添加して、細胞を含有する体積を培地移植ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｍｏｏｒｐａｒｋ，ＣＡ）内に分注した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。多能性幹細胞接種用の調製において、バイオリアクターを１．５Ｌの培地（０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する、ＩＨ３又はＥ８（商標））で調製し、３７°に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌し、溶存酸素設定値を３０％として（ＣＯ₂、空気、Ｏ₂、及びＮ₂を調節）、ＣＯ₂によって６．８〜７．１ｐＨに調節した。接種の直後、バイオリアクターを細胞計数用に試料採取し、０．２２５×１０⁶個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度をもたらすよう、必要に応じて培地体積を調整した。

【0156】

撹拌槽バイオリアクターに接種した細胞は、連続的に撹拌されるタンクで細胞集団を形成し、合計３日間リアクター内の多能性培地（ＩＨ３又はＥ８（商標）、０．５％のＢＳＡを添加）に維持された。培地は毎日変更し、部分的な培地交換を接種から２４時間後に行い、１〜１．３リットルの使用済み培地を除去して、１．５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から４８時間後に、１．５〜１．８リットルの使用済み培地を除去し、１．５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から７２時間後に、＞９０％の使用済み培地を除去して、分化培地を添加することにより、多能性細胞分化を開始した（表７）。

【0157】

ステージ式の分化プロセスを開始した後は、温度（３７°）、ｐＨ（分化用に７．４）、及び溶存酸素（ステージ１については１０％のＤＯ設定値、それ以外は常時３０％のＤＯ設定値、ＣＯ₂、Ｏ₂、Ｎ₂、及び空気の調節）が調節された、閉鎖した撹拌懸濁バイオリアクターに、細胞を１２日間以上維持した分化プロセス全体を通し、培地交換のたびに、ディップチューブを介して培地を除去する前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、バイオリアクター内の培地を閉鎖されたボトル又は袋から除去するか、又はそこに添加して、閉鎖系を維持した。十分な培地を容器に添加して、羽根車を完全に浸らせた後で、羽根車及び加熱器に再び電圧を加えた。

【0158】

バイオリアクターのプロセスを監視するため、細胞集団を含有する培地の試料を毎日取り出して、図７に示すとおり、細胞の数及び生存性を決定した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））。プロセスの間は、細胞の一般的な増殖が観察され、０．２２５×１０⁶個の生育細胞／ｍＬの接種材料が、ステージ４、３日目で平均０．９２×１０⁶個の生育細胞／ｍＬを生成するように増殖した。バイオリアクター接種並びに多能性細胞の集団化及び培養の間は、酸性設定値（ｐＨ ７．０〜６．８）で細胞を維持することによって、ステージ４、３日目の平均細胞産出量が、平均１．３×１０⁶個の細胞／ｍＬに増加した（図７）。

【0159】

毎日の計数に加え、バイオリアクター培地試料をＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって分析した。リアクター設定値によって、ほとんどの培養培地に共通する安定な標準ｐＨ７．４に対し、ステージ０の培地のｐＨは酸性であり、細胞代謝の結果として、リアクター培地のｐＨがステージ０を経て低下したことが観察された。これらの結果は、分化６日目の終了を経て増加する乳酸濃度、及び低下するグルコースレベルの傾向と相関した（図９及び１０）。合わせて、これらのデータは、ステージ０及び分化の最初の２ステージ（１〜６日目）でリアクター内の細胞が最も迅速に成長し、グルコースを消耗したことを示した。しかしながら、ステージ３以降は、リアクター内の細胞代謝（乳酸レベル減少及びグルコースレベル増加）が低下し、ステージ３の細胞数のピーク、及びそれに続くステージ４にわたる細胞密度の低下と相関した。

【0160】

ｐＨ及び代謝におけるステージに特異的な変化が、ｍＲＮＡ発現パターンにおけるステージの変化に一致したかどうかを判断するため。４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）指定の多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）、又はステージ４（Ｓ４）を使用して、バイオリアクター細胞試料のテストを実行し、全ての運転及びアレイにわたる発現を標準化するため、過去の未分化のＨ１（ＷＢ０１０６）ｈＥＳ細胞試料を対照として、結果を比較した。

【0161】

これらのアレイを使用して、分化のステージごとの遺伝子発現を決定した。バイオリアクターに解凍した種材料細胞は、ステージ０、１日目及びステージ０、３日目（バイオリアクター接種から２４及び７２時間後：図１１、１２、１３、及び１４）には、未分化の遺伝子発現パターンを示したこともまた、観察された。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の欠損を示した、フローサイトメトリー結果とよく相関した（図１５及び表８）。遺伝子発現に関するフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、安定な多能性状態と一貫した、多能性（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の遺伝子に関する、堅牢かつ安定な発現パターンを示したが、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴの遺伝子発現における穏やかだが可変である増加と、指向された分化の前のステージ０プロセス中の、いくつかの試料におけるＣＥＲ１、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、及びＧＡＴＡ２発現の≧１００ｘ増加と、もまた認められた。

【0162】

ステージ０の完了時（リアクター接種から７２時間後）に、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表７）に細胞を移植した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２発現の約７００ｘの増加、及びＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現の１０００ｘの増加といった、遺伝子発現パターンに有意な変化が認められた（図１８及び１９）。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を経て遷移していることを示した。未分化細胞と対比して、ステージ１、１日目にはＣＤＸ２レベルが上昇したことも認められたが（対照に対して発現が４７０ｘの増加）、これは発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルはステージ１、１日目からステージ１、３日目までに９４％下降し、分化の誘導前に観察されたレベルと同等のレベルに戻った（図１４、１９、及び２１）。

【0163】

ＤＥ分化培地への露出から７２時間後に、細胞は胚体内胚葉の仕様と一貫したプロファイルを発現し、ＣＸＣＲ４レベルがピークに達し、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７は過去の対照に対して＞１０００ｘで発現した。胚体内胚葉と一貫して、遺伝子ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、及びＴが、ステージ１、１日目に観察された、上昇したレベルから下降したこともまた認められた（図２０及び２１）。

【0164】

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現の変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化開始時（図１５）のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、ステージ１の終了時（図２２）のＣＸＣＲ４発現細胞（９８．３％のＣＸＣＲ４陽性細胞、±１．９ＳＤ）の均質な集団まで、ほぼ完全な遷移も見られた。

【0165】

胚体内胚葉の形成（ステージ１）の完了後、原始前腸の形成（ステージ２）の誘導に使用するモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに、培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１の３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）はステージ２の終了までに発現の減少を示した（図２３）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現が増加した（図２４）。

【0166】

細胞をステージ２の培地で７２時間培養した後、培養をステージ３の培地に切り替えた（表７）。この培地では一度、細胞は、この図２５に示す、ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現（９０．９％±１１．９ＳＤ ＰＤＸ１陽性及び９９．２％±０．６ＳＤ ＦＯＸＡ２陽性）によって測定された内肺葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。これらの結果は、遺伝子発現に対するｑＲＴ−ＰＣＲによって分析された、試料からのデータによって確認された。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了（Ｈ１と対比して３８，０００ｘ）からステージ３、１日目（Ｈ１と対比して２００，０００ｘ）まで、２４時間で５倍増加し、更に４８時間後のステージ３、１日目で再び倍増した（Ｈ１と対比して４３５，０００ｘ）。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特定化していたことを示す（図２６）。この観察は、図２６に示すとおり、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主の増加したレベルによって、更に支持された。加えて、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現がほとんど又は全くないこと（対照の２〜１０％又はｑＲＴ−ＰＣＲによる３２〜３７試料Ｃｔｓ）及び内胚葉系統のその他のマーカーＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２の発現レベルが高いことも見られ、比較的形成力のある腸管運命から膵臓運命まで、バイオリアクター内の細胞集団の仕様及び遷移を更に示した。

【0167】

図２７に示すように、ステージ４、３日目の分化プロセスの終了時に、細胞は、高いレベルのＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現を保持し、膵内分泌細胞（２８．１％±１２．５ＳＤクロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、５８．３％±９．７ＳＤ陽性）の混合と一貫した発現パターンを更に発達させた。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への効率的なステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察された結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲからのデータで更に確認した。膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主は全て、増加した発現レベルを示した。（図２８）。

【0168】

異なる種材料、ステージ０の培地、ステージ０の培地のｐＨ、及びアンチフォームの使用など、複数の可変的なプロセスをテストしたが、図２７で観察された発現パターンは、複数回の運転にわたって一貫性を保持した。種材料の複数の供給源がテストされ、それぞれ、＞９０％ ＦＯＸＡ２、＞７５％ ＰＤＸ１、及び＞５０％ ＮＫＸ６．１で膵臓内胚葉運命を効率的に生成した（図２９）。更に、０．５％のＢＳＡを添加した「ＩＨ３」と呼ばれるカスタムの自家培地、又は０．５％のＢＳＡを添加した市販の培地Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）のステージ０で細胞を成長させた際に、バイオリアクター産物の発現パターンに有意差がなかったことが認められた。ステージ０の培養下のｐＨの役割を実験した際に、比較的低いｐＨ（６．９）でステージ０において成長させた細胞は、平均的な運転に対し、バイオリアクター内での増殖が増加したが（図７）、ステージ４、３日目の細胞プロファイルにおいては有意な変化がなかった（図３１）ことが認められた。加えて、９４百万分率でアンチフォームＣ乳剤（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ａ８０１１）の使用は、スパージングによって産生される泡を減少させることがわかったが、ステージ０の終了からステージ４、３日目の細胞まで、細胞のプロファイルに影響する様子は見られなかった（表９及び図３２）。

【0169】

それぞれのバイオリアクター分化の終了時に、産生細胞を冷凍保存した。３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを有するＭＣＤＢ１３１、又は３．６３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、グルコース（８ｍＭ最終）、及び１ｘ Ｇｌｕｔａｍａｘを有するＭＣＤＢ１３１で細胞を洗浄してから、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる、低温の（＜４℃）冷凍保存培地に移植した。次いで、冷凍保存培地内の細胞集団を周囲温度で最大１５分間維持し、４５分間温度を４℃まで下げ、２．００℃／分で−７．０℃（試料）まで更に下げる、冷却プロファイルを使用して、自動凍結保存装置（ＣＲＦ）で細胞を凍結させた。次いで、試料をすばやく冷却し、チャンバ温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。次いで、チャンバ温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（チャンバ）に上げることによって、補償の増加を提供した。次いで、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。次いで、チャンバを３５．０℃／分の速さで−１６０℃に冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0170】

細胞は、蒸気相液体窒素保管容器から取り出し、バイアルを３７℃の水浴に移植することによって解凍可能であった。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。次いで、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、合計２０ｍＬの最終体積になるまで、滴下式で２分以上希釈した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低級付着培養皿に１時間移植させた。次いで、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上澄を除去し、分析用又は生体内研究用に、細胞をステージ４の培地で再懸濁した。

【0171】

あるいは、解凍後、バイアルに入れた細胞を空の１２５ｍＬのガラス製Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを含有する１０ｍＬのＭＣＤＢ１３１培地を滴下によりフラスコに添加した。次いで、最終体積を同一培地の８０ｍＬに調節した。ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を４０〜６５ｒｐｍで一晩（１２〜２８時間）かき回した。次いで、細胞を特性化するか、又は生体内研究に使用した。

【0172】

ＩＨ３培地の組成は、以下、並びに米国公開特許第２０１３／０２３６９７３号に示されており、その開示は、公的な細胞培養培地に関連することから、その全体が組み込まれる。ＩＨ３培地内のＢＳＡの量は、変わり得る。

【0173】

【表16】

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【0174】

【表17】

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【0175】

【表18】

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【0176】

【表19】

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【0177】

材料：
・ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
・ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７−７−１１Ｅ）
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ、カタログ番号ＹＣ−Ｔ１００、Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
・非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−６９６４、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（ＦｅｒｍＰｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＤＯ ＯｘｙＰｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）、Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・Ｍｍ ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＰＥＰＴＩＤＥ ＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ ＣＡＴ＃ １０−１１４１−０１）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ＭＣＤＢ１３１、及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（ＰＫＣ賦活物質）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）
・ＭＣＤＢ １３１カスタム培地

【0178】

（実施例８）
冷凍保存されたバイオリアクターによって生成された膵臓前駆集団の成熟及び機能
それぞれのバイオリアクター研究に十分な細胞を生成するため、Ｈ１ ｈＥＳ（ＷＢ０１０６）細胞の１つの継代３１のマスター細胞バンクバイアルを解凍した。５つのＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた２層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ２）を播種するのに十分な細胞が生成されるまで、ＥＤＴＡ継代を使用し、Ｍａｔｒｉｇｅｔ（商標）での複数の継代に対応するｍＴｅＳＲ（登録商標）１１培地における接着状況下で、細胞を増殖した。ＣＳ２内で成長する接着細胞が７０％コンフルエントになると、隣接するポンプチュービングを有するＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングアセンブリキャップを培地ポートに結合し、系を閉鎖した。系が閉鎖した後、袋又はボトルを、Ｔｅｒｕｍｏ接合装置を介してＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）で溶接し、全ての液体体積（培地、ＰＢＳ^-/-、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）、又は懸濁細胞）を、蠕動ポンプを使用して移植した。

【0179】

ＣＳ２から細胞を剥離するため、カルシウム又はマグネシウムを含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ^-/-）で細胞を１度洗浄してから、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半分濃度の溶液（等量のＰＢＳ^-/-で希釈）で処理し、４〜５分間インキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）溶液を除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ２を軽打して細胞の剥離を促進した。１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ（登録商標）１のボトルをポンプでＣＳ２に注入して濯ぎ、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を不活性化してから、濯ぎ剤を収集した。第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。１．６〜２．０×１０⁹個の細胞が、最終体積２リットルでＣＳ２から回復された。１層当たり２．０〜２．５×１０⁸個の細胞を４つのＣＳ２、又は８個の１層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）に移植し、１層当たり２００ｍＬの体積で、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内で２時間、３７℃でインキュベートした。

【0180】

ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培地ポート間に結合された、隣接したポンプチュービングを有する、Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングの閉ループを使用して、細胞懸濁液を蠕動ポンプによって７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。次いで、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）を、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーターで１８時間、３７°で一晩インキュベートした。次いで、Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋから２リットルの細胞及び培地を貯留し、１バイオリアクター当たり１．５リットルの新鮮なｍＴｅＳＲ（登録商標）培地と共に、２つの３リットルＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内へ１リットルずつ移植した。バイオリアクター接種から２４時間後に培地全体を交換して、分化を開始する前に、ＴｅＳＲ（登録商標）培地で更に２日間細胞を維持した。次いで、分化を開始し、表１０に記載のとおりに指向した。温度（３７°）、ｐＨ（ドリフト、又は多能性細胞用に６．８若しくは７．２及び分化用に７．４へＣＯ₂によって調節）、及び溶存酸素（３０％のＤＯ設定値、ＣＯ₂／空気調節）に対して調節された、閉鎖した無菌懸濁バイオリアクター内で、細胞を合計１４又は１５日間（２日間のｍＴｅＳＲ（登録商標）＋１２又は１３日間のステージ式の分化）維持した。それぞれの培地交換の前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）に接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、培地を除去又は添加して、閉鎖系を維持した。羽根車を浸らせるのに十分な培地を添加した後で、電熱ジャケットに再び電圧を加えた。

【0181】

これらの方法を使用して、３リットルリアクターで２回の産生運転を開始した。最初のリアクター運転では、多能性培養培地の最初の２日間で、２つの異なるｐＨ設定値をテストした。細胞の代謝活動によって時間の経過と共にリアクター環境が酸性化するにつれ、ｐＨが下方に「ドリフト」するように、固定のＣＯ₂ガス注入率５％で、リアクター１をｐＨ７．２に設定した。リアクター２は、ＣＯ₂ガスレベルで調節されたｐＨ７．２に設定した。２回目のリアクター運転では、リアクター１のｐＨを６．８、及びリアクター２を７．２に設定し、いずれもＣＯ₂ガスレベルで調節した。

【0182】

バイオリアクタープロセスを監視するため、分化のそれぞれのステージの終了時に細胞集団を採取し、フローサイトメトリーで分析した（表１１、表１２）。分化開始時のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、胚体内胚葉形成の完了時のＣＸＣＲ４発現細胞（９６．９〜９８．１％のＣＸＣＲ４陽性細胞）の均質集団へのほぼ完全な遷移が観察された。

【0183】

フローサイトメトリーで観察された結果は、ｒｔ−ＰＣＲで分析した２つの試料の結果と相関した。多能性から膵臓運命へのステージ式分化に特徴的な遺伝子発現について、プロセスを通して試料をテストした。指向された分化の開始前に、多能性又は早期の分化運命に関連付けられた遺伝子のパネルについて、低密度アレイでバイオリアクター細胞集団からのｍＲＮＡをテストした。

【0184】

未分化のＨ１対照と比較すると（図３３）、バイオリアクターからの細胞は、多能性に特徴的な遺伝子（ＰＯＵ５Ｆ１、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、及びＺＦＰ４２）の発現を保持し、分化に特徴的な遺伝子（ＡＦＰ、及びＦＯＸＡ２：＜５０倍増、ＦＯＸＤ３、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、及びＴ：＜１０倍増の発現）の誘導が最小値である又はまったくないことを示した。ただし、細胞がステージ１、１日目の分化培地に接触すると、遺伝子発現パターンが劇的に変化し、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＦＧＦ１７ｍ、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、及び短尾奇形（Ｔ）発現のレベルが、未分化のＨ１ ｈＥＳ細胞よりも１００〜１０００倍増加した（図３４）。ステージ１、３日目（胚体内胚葉の形成）の終了までに、ＣＤ９、ＣＤＸ２、ＦＧＦ４、ＭＩＸＬ１、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、及び短尾奇形（Ｔ）は、ステージ１、１日目に対して発現が減少した一方、ＣＤ９９、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＫＩＴ、ＯＴＸ、又はＳＯＸ１７などの特徴的な胚体内胚葉遺伝子の発現はピークに達した（図３５）。

【0185】

ステージ１の終了時に、ＧＤＦ８を含有するものからＦＧＦ７を含有する培地へ細胞培養培地を変更した。ステージ２にわたる特定の遺伝子の増加（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）、発現の減少（ＨＡＤ１及びＳＯＸ１７）、全体的に安定な高い発現（ＨＮＦ４α）、又は低い発現／発現なし（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）といった、いくつかの異なる遺伝子発現パターンが認められた（図３６ａ〜ｅ）。これらのパターンは、リアクター内の細胞が、減少する中胚葉（ＨＡＮＤ１及びＳＯＸ１７）のマーカーに対応する前腸（ＡＦＰ、ＡＴＯＨ１、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４α、ＯＳＲ１、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＳＯＸ２、及びＳＯＸ９）発現になっていることを示した。しかしながら、ステージの終了までに、細胞はより成熟した腸又は膵臓運命（ＣＤＸ２、ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ａ）にまだ特定化していなかった。

【0186】

未分化の対照に対してｍＲＮＡにおける＞１００，０００倍の増加（図３６）、及びフローサイトメトリーによるＰＤＸ１を発現する細胞の７６〜９８％（表１１）によって実証された、ＰＤＸ１発現によって測定されるとおり、ステージ３の終了までに、細胞は膵臓系統に特定化していた。また、膵臓（ＧＡＳＴ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１ａ、及びＳＯＸ９）、並びにＡＦＰ及びＣＤＸ２などの腸の他の遺伝子の誘導も観察され、細胞がより成熟した運命に特定化し始めたことを示した。

【0187】

表１１及び１２に示すように、ステージ４の３又は４日目の分化プロセスの終了までに、細胞は、膵内分泌細胞（４７〜５４％クロマグラニン陽性）及び膵臓前駆細胞（ＮＫＸ６．１の場合、３３〜５２％陽性）の混合と一貫した発現パターンを示した。このステージの特異的なマーカー発現パターンは、未分化のＨ１ヒト胚性幹細胞と比べて高い発現レベルのＰＤＸ１（誘導倍率＞１×１０⁶）及びその他の膵臓遺伝子（誘導倍率＞１０００のＡＲＸ、ＧＣＧ、ＧＡＳＴ、ＩＮＳ、ＩＳＬ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＴＦ１ａ、及びＳＳＴ）、並びにＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現のほぼ全損失に特徴付けられる膵臓前駆細胞への、多能性集団からの効率的なステージ式分化を示した（図３７）。

【0188】

分化プロセスの終了時に、０．０８〜０．４５×１０⁶個の細胞／ｍＬが生成された（図３８：毎日の細胞計数）。次いで、このプロセスで生成された細胞を冷凍保存するか、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して動物の皮下に直接埋め込むか、又は腎臓被膜下に定置した。細胞を冷凍保存するため、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる冷凍保存培地に、細胞を移植した。細胞集団を周囲温度で冷凍保存培地内に懸濁した後で、クライオバイアルを自動凍結保存装置（ＣＲＴ）に１５分以内で移植した。次いで、チャンバ温度を４５分間４℃に下げ、２．００℃／分でー７．０℃（試料）まで更に下げた。次いで、試料をすばやく冷却し、チャンバ温度を２５．０℃／分の速度で−４５．０℃まで下げた。次いで、チャンバ温度を１０．０℃／分で−２５．０℃（チャンバ）に上げることによって、補償の増加を提供した。次いで、温度が−４０．０℃に達するまで、試料を０．２℃／分で冷却した。次いで、チャンバを３５．０℃／分の速さで−１６０℃に冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0189】

細胞をガス相液体窒素で保存した後、保管場所から除去することによって細胞を解凍し、３７℃の水浴に移植した。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。次いで、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、合計２０ｍＬの最終体積になるまで、滴下式で２分以上希釈した。次いで、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標） で合計細胞数を決定し、細胞懸濁液を超低級付着培養皿に１時間移植させた。次いで、５０ｍＬの円錐内の培地から細胞を単離し、上澄を除去し、細胞をステージ４の培地で再懸濁した。次いで、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイスを介して動物の皮下に、若しくは腎臓被膜下に細胞を埋め込むか、又は超低級付着皿内で細胞を一晩インキュベートしてから、動物に埋め込んだ。

【0190】

動物は、血糖及びＣペプチドレベルについて、移植片埋め込み後４週間おきに監視された。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内部で非冷凍保存の膵臓前駆細胞を用いて、又は腎臓被膜下への細胞の直接定置によって処理した動物は、１６週目までに１ｎｇ／ｍＬを超えるＣペプチドを発現するまで成熟し、埋め込み後２０週目までに２ｎｇ／ｍＬのＣペプチドに達した（図３９ａ及び３９ｄ）。更に、宿主のβ細胞機能をアブレーションするためにＳＴＺで処理する際に、移植片が除去されるまで、移植された動物は正常血糖を維持し、単一の高用量のＳＴＺによって誘導される糖尿病から動物を保護する能力が、移植片にあることを示した。

【0191】

このパターンは、冷凍保存された細胞で処理した動物でも観察された。解凍後１時間培養した、冷凍保存した膵臓前駆細胞を有する腎臓被膜移植片によって処理した動物（１２０７Ｂ）は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．５６ｎｇ／ｍＬ及び１．０９ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを有した一方、解凍後一晩培養した細胞（１２０７Ｃ）は、１６及び２０週目でそれぞれ平均０．８１ｎｇ／ｍＬ及び１．３５ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを有した（図３９ｄ）。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）デバイス内で冷凍保存した膵臓前駆細胞で処理した動物は、１６週までに１ｎｇ／ｍＬを超えるＣペプチドを有し、非冷凍保存の対照と同様に、ＳＴＺ処理から１週間後にＣペプチドの治療用レベルを発現することができた（０．９８ｎｇ／ｍＬ、図３９ｃ）。これらの結果は、動物モデルでテストしたときに、冷凍保存された膵臓前駆細胞が、非冷凍保存の対照と同等に機能し得ることを示す。

【0192】

【表20】

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【0193】

注：
・上記の表１０の基本培地は、Ｇｌｕｔａｍａｘを栄養補助剤に使用しない場合、ステージ１〜５で５ｍＭを任意追加的に含む。
・Ｃｙｐｉ（［１００ｎＭ］）は、上記の表１０のステージ４に、任意追加的に追加し得る。

【0194】

【表21】

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【0195】

【表22】

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【0196】

撹拌槽バイオリアクター内の細胞凝集体が経験するずれ応力の計算
３１ ＤＡＳＧＩＰバイオリアクターにおいて７０ｒｐｍの撹拌速度で混合される、２．７リットルのＤＡＳＧＩＰ撹拌懸濁バイオリアクター内の細胞凝集体が経験する、ずれ応力を決定した。ずれ応力値を計算するため、以下に述べる前提条件を作製した。

【0197】

前提条件：
１．細胞凝集体に課される最大ずれ応力は、乱流渦の結果ではない。
２．細胞凝集体に課される最大ずれ応力は、凝集−凝集又は凝集−羽根車の衝突の結果ではない。
３．隔壁（すなわち、ディップチューブ及びプローブ）が課すずれ応力は、これらの計算では取り組まれない。

【0198】

本明細書の計算の目的のため、以下に示す専門用語及び物理的パラメーターを使用する。

【0199】

【表23】

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【0200】

【表24】

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【0201】

【表25】

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【0202】

列記した培地及びバイオリアクタオーパラメーターを以下の等式に適用した。

【0203】

等式：
レイノルズ数：

【0204】

【数1】

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【0205】

凝集体に対する最大ずれ応力（Ｃｈｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｗｏｎ １９９０）

【0206】

【数2】

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【0207】

１単位質量当たりの散逸される電力（ε）

【0208】

【数3】

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【0209】

消費電力（Ｐ）

【0210】

【数4】

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【0211】

動力数計算は、整流装置を含まない撹拌槽に対して、Ｎａｇａｔａ（１９７５）が導出した実験的相関関係に基づいている。

【0212】

【数5】

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【0213】

２．７ＬのＤＡＳＧＩＰバイオリアクター内において撹拌速度７０ｒｐｍで細胞凝集体に課された、少なくとも０．２５パスカル（２．５ｄｙｎ／ｃｍ²）の最大ずれ応力を計算した。集団の最も外側を含む細胞は、最も高いレベルのずれ応力を経験する。これらのずれ応力値は、記述した前提条件に大きく依存する。

【0214】

（実施例９）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の役割
２％の脂肪酸フリーのＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、追加の２．５ｍＭグルコース（カタログ番号Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００のストック濃度のＩＴＳ−Ｘ（カタログ番号５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を添加した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭのグルコース（カタログ番号Ａ１３０５１ ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含有するＭＣＤＢ−１３１培地で、三角／振とうフラスコ、スピナーフラスコ、又はコーティングされていない超低級結合若しくは非組織培養処理した６ウェルプレートに、０．２５×１０⁶〜２×１０⁶個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。この様式で添加されたＭＣＤＢ−１３１培地は、この適用の目的で「ステージ１基本培地」と称される。この培地内の集団を、３μＭ ＭＣＸ（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願第１２／４９４，７８９号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及び１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、又は３μＭのＭＣＸのみ、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ、のいずれかで、分化の第１日目に処理した。２日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８又は１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡのいずれかを添加した、新鮮なステージ１の基本培地に細胞を移植した。分化開始から時間０（補助剤を加えた基本培地の添加直前）から７２時間後の範囲の様々な時点で、フローサイトメトリー、ＰＣＲ、及びウエスタンプロット用に試料を収集した。

【0215】

フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、分化の３日後にそれぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データは（図４０ａ〜ｂのＦＡＣＳプロットに示され、表１３に要約されているとおり）、懸濁培養下で、分化の１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバーの不在での３μＭのＭＣＸの添加が、１日目に３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８、又は２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理される際に得られるものに相当するレベルで、胚体内胚葉を生成することを示す。

【0216】

【表26】

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【0217】

（実施例１０）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ化合物濃度の用量反応
実施例９に記載したとおり、ステージ１基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０⁶〜２×１０⁶個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。分化の１日目に、１．５、２、３、又は４μＭ ＭＣＸを含有するステージ１の基本培地、及び２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地で、集団を処理した。３日目に培地交換は行わなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。

【0218】

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データは（図４１Ａ〜ＤのＦＡＣＳプロットに示され、表１４に要約されているとおり）、懸濁培養下で、２μＭ未満の濃度のＭＣＸを添加した結果、（ＣＸＣＲ４陽性のより低い割合及びＣＤ９陽性細胞のより高い割合によって証明されるとおり）胚体内胚葉陽性細胞が次第に少なくことを示している。更に、４μＭを上回る濃度のＭＣＸは、細胞に対する有害な影響を呈し、細胞生存性の低下をもたらす。ただし、ＢＳＡ濃度を高めることによって、濃度≧４マイクロモルを使用し得るように、ＭＣＸの影響を調節することができる。反対に、より低いＢＳＡ濃度で使用する際は、濃度≦１．５マイクロモルを使用して、胚体内胚葉を生成し得る。

【0219】

【表27】

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【0220】

（実施例１１）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下での培地交換頻度の役割
実施例９に記載したとおり、ステージ１基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０⁶〜２×１０⁶個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。分化の１日目に、３μＭ ＭＣＸを含有するステージ１の基本培地、及び２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地で、集団を処理した。対照集団は、３日目に培地交換を受けたが、３日目に別個の容器への培地交換は行われなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。

【0221】

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、それぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。結果を図４２Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１５に要約する。

【0222】

【表28】

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【0223】

（実施例１２）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）の使用
三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０⁶〜２×１０⁶個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。

【0224】

分化の１日目に３μＭのＭＣＸを、２日目に１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を含有する新鮮なステージ１の基本培地を添加した、ステージ１の基本培地（例９に記載）＋又は−ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）内で集団を懸濁することによって、胚体内胚葉の生成にＧｌｕｔａｍｘ（商標）の添加が必要かどうかを決定するため、この実施例を実行した。３日目に培地交換は行わなかった。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリー及びＰＣＲ分析用の試料を収集した。

【0225】

フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、それぞれの条件下で、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。結果を図４３Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１６に要約する。

【0226】

【表29】

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【0227】

（実施例１３）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下での重炭酸ナトリウム濃度の役割
実施例９に記載したとおりのステージ１の基本培地（３．６４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムを含有）、又は、２．４３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する変性されたステージ１の基本培地で、三角／振とうフラスコ又はスピナーフラスコに、０．２５×１０⁶〜２×１０⁶個の細胞／ｍＬの範囲の細胞密度で、多能性ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。実施例１２に記載したとおり、ＭＣＸ及びＧＤＦ−８を含有するステージ１の基本培地で集団を処理した。分化の３日目の終了時に、フローサイトメトリーのための試料を収集した。分化のそれぞれの日に、位相差画像もまたキャプチャした。

【0228】

次いで、フローサイトメトリーを使用して、細胞表面マーカーＣＸＣＲ４、ＣＤ９９、及びＣＤ９を発現する細胞の割合を測定することにより、胚体内胚葉が生成された効率を決定した。データを図４４Ａ及びＢのＦＡＣＳプロットに示し、表１７に要約する。懸濁培養では、３．６４ｇ／Ｌを含有する培地で細胞を分化したときより（平均して９７．３５％の細胞発現ＣＸＣＲ４）、２．４３ｇ／Ｌほどの低さの重炭酸ナトリウムレベルのほうが、胚体内胚葉を生成する効率が低いように見える（平均して、８７．４％の細胞発現ＣＸＣＲ４）。また、位相差顕微鏡で観察したとおり（図４４Ｃ及びＤ）、ステージ１の終了時に、重炭酸塩レベルの差異は集団形態の差異と相関したことが観察された。また、高い重炭酸塩レベル下で分化した細胞は、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸塩で分化した細胞よりも疎性の集団を形成することが認められた。

【0229】

【表30】

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【0230】

（実施例１４）
計測可能バイオリアクタープロセスでの人為的な多能性幹細胞からの膵臓前駆集団の生成
細胞療法には、１用量当たりに多数の（＞１０⁸）細胞が必要とされる。この実施例は、現在の細胞療法製造基準で可能であるよりも、３〜５桁大きい誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）質量を分化させることができるプロセスを実証する。

【0231】

この実施例では、ｉＰＳ細胞株、ＵＴＣ（米国特許出願１３／３３０，９３１号（米国公開特許第２０１３／０１５７３６５号）で以前に記述された臍帯組織細胞由来で、その開示は、それがｉＰＳ細胞株の誘導に関連するために、参照により組み込まれる）を使用した。細胞は、「フットプリント」フリーの様式でプラスミド遺伝子移入を使用して、マウスの胚性フィーダー細胞に誘導され、継代１５で冷凍保存した。

【0232】

これらの冷凍保存した細胞から、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）のＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地（Ｅ８（商標））で、供給源の培地バイアルをヒト組み換えラミニン（ｈｒＬａｍｉｎｉｎ，カタログ番号ＬＮ−５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））へ直接解凍することによって、一連の細胞バンクを生成して、自家種材料を生成した。この解凍し、増殖した材料を、将来のバンク用の種材料として役立つ、「プレ−プレマスター細胞バンク」（プレ−プレＭＣＢ）と呼んだ。次いで、プレ−プレＭＣＢ ３を使用して、連続細胞バンク、プレ−ＭＣＢ、ＭＣＢ、及びワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を生成した。次いで、１つのＷＣＢバイアルを解凍し、Ｅ８（商標）での３回の継代用に、ＥＤＴＡ継代を使用してｈｒＬａｍｉｎで増殖した。細胞はまず、解凍からＴ２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎ，ＮＹ）へ播種してから、複数のＴ２２５フラスコへ継代した。次いで、複数のＴ２２５フラスコを継代し、単一の１層Ｃｅｌｌ Ｓｔａｃｋ（商標）（ＣＳ１）を播種するために結合した。ＣＳ１内の細胞がコンフルエントになると、細胞をＰＢＳ^-/-で１度洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の半分濃度の溶液（ＰＢＳ^-/-で希釈）で処理し、４〜５分間インキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を除去し、酵素溶液の適用から３分後に、ＣＳ１を軽打して細胞の剥離を促進した。０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有するＥ８（商標）をＣＳ１に添加して、残留のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を濯ぎ、不活性化した。次いで、濯ぎ液を収集し、第２の濯ぎ液の体積を添加し、収集し、第１の濯ぎ液と共に貯留した。

【0233】

０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する培地内の細胞を、２２５ｍＬリットル中１×１０⁶個の細胞／ｍＬの濃度で、１リットルの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）へ移植した。加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内において、６０分間静的懸濁液内で細胞を集団化させ、次いで、５５〜６５ｒｐｍで５分間撹拌し、０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する追加の培地２２５ｍＬを添加した。細胞を更に３０分間静的培養下で沈降させ、次いで、０．５％のＢＳＡを添加し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有する追加の培地１５０ｍＬをスピナーフラスコに添加した。その後、加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内において、５０〜７０ｒｐｍで、細胞を連続的に撹拌した。２４時間後、スピナーフラスコをインキュベーターから除去し、集団を５〜１０分間沈降させた。その後、容器内に２００ｍＬが残るまで培地を吸引してから、４００ｍＬの追加の新鮮な培養培地をスピナーフラスコに添加した。このプロセスを２日目（移植から４８時間後）の終了時に繰り返した。

【0234】

次いで、最初のＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）処理から７２時間後、細胞集団分離及びスピナーフラスコ播種（継代）のプロセスを繰り返して、複数の継代中（検査範囲：１〜１０回の継代）、細胞を懸濁液に維持した。

【0235】

このプロセスを使用して、ＵＴＣ ｉＰＳ細胞を基質上の接着培養から、細胞集団として懸濁培養へ変換し、その後、懸濁液内で増殖した。これらの懸濁液で継代し、培養した細胞はその後、後の使用のために冷凍保存し、保管した。冷凍保存用に懸濁液で増殖した細胞集団を調製するために、細胞を４０マイクロメートルの細胞ストレーナに通過させなかったことを除き、上記に述べたとおりに、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）で細胞集団を分離した。次いで、１リットルの使い捨てフラスコから細胞を計数し、必要に応じて結合し、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、上澄を可能な限り完全に除去した。次いで、１ｍＬ当たり１億５０００万個の細胞の最終濃度を得るために、低温（＜４℃）のＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）１０を滴下により添加して、１．８ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）クライオバイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）又は１５ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉクライオバック（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に移植する間、細胞溶液を氷浴内で保持した。

【0236】

次いで、以下のとおり、バイアル内の懸濁増殖細胞を自動凍結保存装置内に高密度で凍結した。チャンバを４℃に予冷し、試料バイアル温度が６℃に達するまで、温度を保持した。次いで、試料が−７℃に達するまで、チャンバ温度を２℃／分で下降させた。試料バイアルが−７℃に達すると、チャンバが−４５℃に達するまで、チャンバを２０℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度が−２５℃に達するまで、チャンバ温度を１０℃／分で素早く上昇させ、その後、試料バイアルが−４５℃に達するまで、チャンバを０．８℃／分で更に冷却した。次いで、チャンバが−１６０℃に達するまで、チャンバ温度を３５℃／分で冷却した。次いで、チャンバ温度を−１６０℃で少なくとも１０分間保持してから、バイアルをガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0237】

撹拌槽バイオリアクターを接種するために、高密度で冷凍保存された細胞を、液体窒素保管容器から取り出し、解凍し、閉鎖された０．２リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ；Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を播種するために使用した。クライオバイアルを、ガス相液体窒素保管容器から除去し、３７℃の水浴内に１０５秒間直接定置した。次いで、２ｍＬのガラスピペットを介して、解凍されたバイアル内容物を５０ｍＬの円錐チューブに移植した。次いで、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加された９ｍＬのＥ８（商標）を、滴下によりチューブに添加した。次に、細胞を８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。その後、チューブから上澄を吸引し、０．５％のＢＳＡを含有し、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤、Ｙ−２７６３２を添加された、１０ｍＬの新鮮なＥ８を添加した。細胞を含有するこの体積を培地移植ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），ＳａｎｉＳｕｒｅ，Ｍｏｏｒｐａｒｋ，ＣＡ）へ分注し、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−ｆｌｅｘチュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。多能性幹細胞接種用の調製において、０．５％のＢＳＡ、１０マイクロモルのＲｈｏキナーゼ阻害剤であるＹ−２７６３２を添加したＥ８（商標）培地、０．１５Ｌをバイオリアクターに準備し、３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌し、ＣＯ₂によってｐＨを６．８〜７．１に調節し、溶存酸素設定値を３０％とした（ＣＯ₂、空気、Ｏ₂、及びＮ₂で調節）。接種の直後、バイオリアクターを細胞計数用に試料採取し、０．２２５×１０⁶個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度をもたらすよう、必要に応じて培地体積を調整した。

【0238】

撹拌槽バイオリアクターに接種された細胞は、連続的に撹拌されるタンク内に細胞集団を形成した。接種後、リアクター内の、０．５％のＢＳＡで添加したＥ８（商標）培地に、細胞集団を３日間維持した。培地は毎日変更し、接種から２４時間後に使用済み培地の９０％を除去して、０．１５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から４８時間後に、使用済み培地の９０％を除去して、０．１５リットルの新鮮な培地を添加した。接種から７２時間後に、＞９０％の使用済み培地を除去して、分化培地を添加することにより、多能性細胞分化を開始した（表１８）。

【0239】

ステージ式の分化プロセスを開始した後は、温度（３７℃）、ｐＨ（分化用に７．４）、及び溶存酸素（ステージ１については１０％のＤＯ設定値、それ以外は常時３０％のＤＯ設定値、ＣＯ₂、Ｏ₂、Ｎ₂、及び空気の調節）が調節された、閉鎖した撹拌懸濁バイオリアクターに、細胞を１２日間以上維持した分化プロセス全体を通し、培地交換のたびに、ディップチューブを介して培地を除去する前に羽根車を５〜２０分停止して、集団を沈降させた。Ｔｅｒｕｍｏ（商標）チューブ接合装置を使用したＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに接続したディップチューブを通る蠕動ポンプによって、バイオリアクター内の培地を閉鎖されたボトル又は袋から除去するか、又はそこに追加して、閉鎖系を維持した。十分な培地を容器に添加して、羽根車を完全に浸らせた後で、羽根車及び加熱器に再び電圧を加えた。

【0240】

バイオリアクターのプロセスを監視するため、細胞集団を含有する培地の試料を毎日取り出して、図４５に示すとおり、細胞の数及び生存性を決定した（ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標））。プロセスの間は、細胞の一般的な増殖が観察され、生育細胞０．２２５×１０⁶個／ｍＬの接種材料が、ステージ４、３日目で０．６５×１０⁶個の生育細胞／ｍＬを生成するように増殖した（図４５）。

【0241】

毎日の計数に加え、バイオリアクター培地試料をＮＯＶＡ ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって分析した。ステージ０のリアクター設定値（ｐＨ６．８）によって、ステージ０の培地のｐＨは、ステージ０を通して酸性であった（ｐＨ６．８）（図４６）ことが観察された。ステージ０の酸性設定値は、細胞の代謝活動を低減させるようであり、ステージの０培地では、比較的低い乳酸及び高いグルコースレベルが観察された。細胞がステージ３の終了までの分化を開始すると、細胞は、培地内のほとんど全てのグルコースを消費し（図４７）、高いレベルの乳酸を生成した（図４８）。また、細胞密度の増加が、ステージ１及び２にわたって観察された（図４５）。

【0242】

ｐＨ及び代謝におけるステージに特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたとおりの、ｍＲＮＡ発現パターンにおけるステージの変化に一致したかどうかを判断するため、以下のことを行った。多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）、腸管（ＧＴ）又はステージ４（Ｓ４）を指定する、４つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙｓ（Ｌｉｆｅ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した。全ての運転及びアレイにわたって発現を標準化するため、未分化のＵＴＣｉＰＳ細胞試料を対照として対比した、倍率差として結果を表示した。

【0243】

これらのアレイを使用して、分化のステージごとに遺伝子発現を決定した。次いで、バイオリアクターに解凍した種材料細胞は、ステージ０の１、２、及び３日目（バイオリアクター接種から２４、４８、及び７２時間後：図４９及び５０）には、未分化の遺伝子発現パターンを示したことが観察された。これらの結果は、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の高い発現レベル、並びにＣＸＣＲ４／ＣＤ１８４の欠損を示した、フローサイトメトリー結果とうまく相関した（図５１）。これらのフローサイトメトリー及びｑＲＴ−ＰＣＲデータは、多能性（ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＴＤＧＦ、及びＺＦＰ４２）の遺伝子に関する、堅牢かつ安定な発現パターンと、安定な多能性状態と一貫した分化（ＣＤ９９、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＨＡＮＤ２、ＨＮＦ４α、ＫＩＴ、ＭＮＸ１、ＭＩＸＬ１、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨＲ１Ｒ、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、Ｔ、ＴＭＰＲＳＳ２、及びＶＷＦ）の間に特徴的に発現する遺伝子の発現がないことと、を示した。

【0244】

ステージ０の完了時（リアクター接種から７２時間後）に、ＭＣＸ及びＧＤＦ８を含有する分化培地（表１８）に細胞を移植した。この培地変更の２４時間後、ＦＯＸＡ２、ＨＡＮＤ２、ＰＲＤＭ１、ＰＴＨ１Ｒ、及びＳＯＸ１７発現の＞１０ｘの増加、ＣＥＲ１、ＦＧＦ４、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、及びＭＩＮＸ１の＞１００ｘ増加、及びＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＭＩＸＬ１、及びＴ発現の＞１０００ｘの増加といった、遺伝子発現パターンに有意な変化（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）が認められた。これらの増加した発現レベルは、細胞が中内胚葉運命を経て遷移していることを示した。未分化細胞と対比して、ＣＤＸ２レベルがステージ１、１日目に上昇したことも認められたが（対照に対して発現が２７００ｘの増加）、これは発現の一過性の増加であり、ＣＤＸ２レベルはステージ１、３日目までに、分化の誘導前に観察されたレベルと同等のレベルまで、９７％下降した（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）。

【0245】

ステージ１の分化培地への露出から７２時間後に、細胞は胚体内胚葉の仕様と一貫したプロファイルを発現し、ＣＸＣＲ４レベルが過去の対照に対して約４００ｘでピークに達し、ＦＯＸＡ２は過去の対照に対して１３６ｘで発現し、ＳＯＸ１７は過去の対照に対して４７０，０００ｘで発現した。胚体内胚葉と一貫して、ステージ１（３日目）の終了時のＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ４、ＧＳＣ、ＭＩＸ１、及びＴの遺伝子発現が、ステージ１、１日目に観察された上昇レベルから下降したこともまた認められた（図４９及び５０の未分化の対照と対比した倍数発現）。

【0246】

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現のこれらの変化は、フローサイトメトリーによって観察された結果と相関した。分化開始時（図５１）のＣＤ９発現／ＣＸＣＲ４陰性多能性細胞集団から、ステージ１の終了時（図５２）のＣＸＣＲ４発現細胞（９８．６％のＣＸＣＲ４陽性）の均質な集団まで、ほぼ完全な遷移が見られた。

【0247】

胚体内胚葉の形成（ステージ１）の完了後、原始前腸の形成の誘導に使用するモルフォゲンである、ＦＧＦ７を含有するものに、培地を変更した。原始前腸の形成と一貫して、ステージ２、１及び３日目のＨＮＦ４α及びＧＡＴＡ６発現レベルが増加した一方、ステージ１、３日目に高いレベルで発現した遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＥＯＭＥＳ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、ＳＯＸ１７、及びＶＷＦ）はステージ２の終了までに発現の減少を示した（図５０及び５３の未分化の対照と対比した倍数発現）。前腸遺伝子（ＡＦＰ、ＨＨＥＸ、ＰＤＸ１、及びＰＲＯＸ１）の発現が増加した（図５３の未分化の対照と対比した倍数発現）。

【0248】

細胞をステージ２の培地で７２時間培養した後、培養をステージ３の培地に切り替えた（表１８）。この培地で一度、細胞は、遺伝子発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって測定されたとおり、内胚葉膵臓系統と一貫したマーカーを発現した。ＰＤＸ１の遺伝子発現は、ステージ２、３日目の終了時点で対照に対して１２，０００×から、ステージ３、３日目の終了時点で対照に対して７３９，０００×へと、６０倍増加した。これらのデータは、細胞が膵臓運命に特定化していたことを示した（図５４）。この観察を支持するものは、図５４及び５５に示すとおり、膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主に関して、未分化の対照と対比した発現レベルの増加であった。興味深いことに、ＯＣＴ４／ＰＯＵ５Ｆ１発現（ｑＲＴ−ＰＣＲによる３７試料Ｃｔｓ）がないことと、内胚葉系統ＡＦＰ、ＡＬＢ、及びＣＤＸ２の他のマーカーの発現レベルが高いことと、がまた観察された。このことは、バイオリアクター内の細胞集団が、多能性細胞集団から最初に比較的形成力のある腸管運命へ分化してから、膵臓運命へ更に分化したことを示す（図５４及び５５）。

【0249】

４ステージ分化プロセスの終了時に、細胞は、高いレベルのＰＤＸ１（ＦＡＣＳによる９５．６％陽性、ｑＲＴ−ＰＣＲによる対照に対する約１，０００，０００倍の誘導）発現を維持した。細胞は、膵臓前駆細胞（ＦＡＣＳによるＮＫＸ６．１の３９．２％陽性）及び膵臓分泌細胞の集団（ＰＡＸ６の９．４％陽性、クロモグラニンの１２．４％陽性、ＮＫＸ２．２の１５．２％陽性、全てＦＡＣＳによる）と一貫した発現パターンを示した。このステージに特異的なマーカー発現パターンは、多能性集団から膵臓前駆細胞への効率的なステージ式分化を示した。フローサイトメトリーで観察されたこれらの結果を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって確認した。膵臓内で通常発現する遺伝子（ＡＲＸ、ＧＡＳＴ、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＴＦ１Ａ、及びＳＳＴ）の宿主は全て、ステージ４、３日目に発現レベルが増加していることも認められた。（図５５）。参照のため、それぞれのステージ終了時の細胞集団の代表的な顕微鏡写真（４ｘ）を、図５６に示す。

【0250】

【表31】

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【0251】

【表32】

[この文献は図面を表示できません]

【0252】

【表33】

[この文献は図面を表示できません]

【0253】

材料：
・ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）細胞株Ｈ１（ＷＡ０１細胞、ＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）
・ＰＢＳ（カタログ番号１４１９０、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）
・Ｙ−２７６３２（Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
・ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１７−７−１１Ｅ）
・ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）−（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ Ａ／Ｓ、カタログ番号ＹＣ−Ｔ１００、Ａｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）
・非組織培養処理した６ウェルの皿（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号Ｆａｌｃｏｎ ３５１１４６，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ−６９６４、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
・ｐＨ、及び溶存酸素（ＤＯ）バイオリアクタープローブ（ＦｅｒｍＰｒｏｂｅ（登録商標）ｐＨ電極２２５ｍｍ、モデル番号Ｆ−６３５、及びＤＯ ＯｘｙＰｒｏｂｅ（登録商標）１２ｍｍセンサー、モデル番号Ｄ−１４５（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・免疫保護マクロ封入デバイス（ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（商標）、Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）
・Ｍｍ ＨＵＭＡＮ Ｃ−ＰＥＰＴＩＤＥ ＥＬＩＳＡ（ＭＥＲＣＯＤＩＡ，カタログ番号１０−１１４１−０１）
・ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ＭＣＤＢ１３１及びＩＴＳ−Ｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
・ＦＡＦ−ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ）
・レチノイン酸、グルコース４５％（２．５Ｍ）、ＳＡＮＴ（Ｓｈｈ阻害剤）（Ｓｉｇｍａ）
・ＧＤＦ８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）
・ＭＣＸ
・ＦＧＦ７（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）
・ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰ受容体アンタゴニスト）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）
・ＴＰＰＢ（ＰＫＣ賦活物質）（ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ）

【0254】

（実施例１５）
細胞株ＷＡ０１から胚体内胚葉へのヒト胚性幹細胞の分化：懸濁培養下でのＭＣＸ／ＧＤＦ８の細胞周期制御としての役割
２％の脂肪酸フリーのＢＳＡ（カタログ番号６８７００，Ｐｒｏｌｉａｎｔ，ＩＡ）、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、追加の２．５ｍＭグルコース（カタログ番号Ｇ８７６９，Ｓｉｇｍａ）、及び１：５０，０００のストック濃度のＩＴＳ−Ｘ（カタログ番号５１５０００５６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を追加した、３．６４ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭのグルコース（カタログ番号Ａ１３０５１ ＤＪ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を含有するＭＣＤＢ−１３１培地において、三角／振とうフラスコ内に０．５×１０⁶個の細胞／ｍＬで、多能性ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）からの集団を播種した。この様式で添加したＭＣＤＢ−１３１培地は、この実施例の目的でステージ１基本培地、又は「未希釈」培地と称される。ＧＳＫ３Ｂ阻害剤（１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願第１２／４９４，７８９号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、「ＭＣＸ」と称される。

【0255】

分化の第１日目に、以下の６つの条件のいずれかで集団を処理した。（１）未希釈、（２）３μＭのＭＣＸ＋１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８（カタログ番号１２０−００，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、（３）３μＭのＭＣＸのみ、（４）１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８のみ、（５）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ（カタログ番号１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（カタログ番号３３８−ＡＣ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、又は（６）２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａのみ。

【0256】

それぞれの条件下の培地を、分化の開始から２４及び４８時間後に変更した。これらの時間に、条件１、２、３、及び４の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を添加した新鮮なステージ１の基本培地に変更し、条件５及び６の細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加した新鮮なステージ１の基本培地に変更した。

【0257】

分化開始の１時間前、及び分化開始（「時間０」と称する）から５、２３、２９、４７、７１時間後に、懸濁試料を非組織培養で処理した６ウェルの皿に移植し、ＥｄＵ（Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で１時間インキュベートした。次いで、ＥｄＵでインキュベートした細胞を、分化の開始から０、６、２４、３０、４８、又は７２時間後の時間に、フローサイトメトリーによって評価して、細胞周期のＧ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージの細胞の割合を測定した。

【0258】

このプロトコルに続き、細胞周期のＧ０／Ｇ１、Ｓ、又はＧ２／Ｍステージで細胞の割合における有意差が観察され（図８２〜８７）、かつ、ＭＣＸ及びＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、他の４つの処理状況と比べ、ＥｄＵの取り込みにおいて４０％近く低減したことが認められた（図８１）。ＥｄＵ取り込みにおけるこの低減は、ＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料からのＧ０／Ｇ１細胞の３８％増加、及びＭＣＸのみで処理した細胞についてはＧ０／Ｇ１細胞で５４％の増加に一致した。ＧＤＦ８、ＷＮＴ３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は未希釈培地で処理した細胞では、分化の開始から６時間後に、ＥｄＵ取り込みのこれらの変化及びＧ０／Ｇ１への増加した遷移は観察されなかった。むしろ、図８１及び８２に示すとおり、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、又は未希釈培地で処理された細胞は、分化の開始から６時間後に、ＥｄＵ取り込みでの細胞の割合における最小限の減少（平均、４８．１％、ＳＤ±１．２）と、Ｇ０／Ｇ１内の細胞数の平均１３％の減少と（標準偏差、±５％）を実証した。

【0259】

ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞のＧ０／Ｇ１値間の範囲には、他の処理条件に比べ、プロセスの後半に類似の差異が観察された。時間０から３０時間後に、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は未希釈培地で処理した細胞と比べ、Ｇ０／Ｇ１内に４３〜４５％少ない細胞を有した。Ｇ０／Ｇ１細胞の割合間のこのギャップは、分化の開始から４８時間後も維持されており、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理された細胞の７１．９〜７５．５％が細胞周期のＧ０／Ｇ１内にある一方、ＧＤＦ８で処理した細胞の４８．５％、ＷＮＴ３Ａで処理した細胞の５５．８％、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡで処理した細胞の５７．７％、又は未希釈培地で処理した細胞の４９％がＧ０／Ｇ１内にあった。ＥＤＵ取り込み及びＧ０／Ｇ１プロファイルで観察された差異に加え、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した細胞は、ＷＮＴ３Ａ＋アクチビン、ＧＤＦ８、ＷＮＴ−３Ａ、又は未希釈培地で処理した細胞と比べ、時間０から３０及び４８時間後には細胞周期のＳ期に１５〜３３％多い細胞を有した。

【0260】

胚体内胚葉形成の終了時の遺伝子発現によって測定されたとおり、データ（図５７〜８０及び８８ａ〜ｆに示す、ＣＤ９９、ＣＤ９、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＣＥＲ１、ＣＸＣＲ４、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＧＳＣ、ＫＩＴ、ＭＩＸＬ１、ＭＮＸ１、ＮＡＮＯＧ、ＯＴＸ２、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、及びＴの遺伝子発現）は、懸濁培養下で、第１日目のＴＧＦ−βファミリーメンバー、ＧＤＦ８を含む又は含まないＭＣＸの添加が、１日目に２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３Ａ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで細胞が処理されるときに得られるものに相当する胚体内胚葉を生成したことを示した。ただし、胚体内胚葉の形成のプロセスを通して観察された細胞周期における差異と一貫して、遺伝子発現における中間差異が見られた。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理された試料では、遺伝子Ｔ（短尾奇形）、ＧＡＴＡ４、及びＣＤＸ２は、分化の最初の２４時間内に、ＷＮＴ−３Ａ＋アクチビンＡ又はその他の３つのテスト条件で処理された細胞よりも、実質的に高いレベルで誘導された。逆に、多能性の遺伝子（ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４）の発現は、最初の細胞多能性、又はテストされたその他の４つの条件と比べて、ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８で処理した試料内で、２４時間までに劇的に減少した（図８８ｅ）。ＭＣＸ又はＭＣＸ＋ＧＤＦ８試料における、ＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７などの遺伝子の発現誘導の大きさは、分化の開始から２４時間後にテストされた他の４つの条件と比べてはるかに小さかったが、４８時間までには、全ての試料がＦＧＦ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７を相当するレベルで発現した。（図８８ｃ及びｅ）。

【0261】

（実施例１６）
測定可能な懸濁分化プロセスを使用した外胚葉及び中胚葉性組織の生成
この実施例は、外胚葉又は中胚葉性組織の生成を目的とした、測定可能な製造プロセスを得るために、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の増殖及び分化の両方を行えるプロセスを実証する。

【0262】

２つの細胞株、すなわち、Ｈ１（ＷＡ０１）ｈＥＳ細胞株のサブクローン、ＷＢ０１０６と、臍帯組織細胞（ＵＴＣ）から生成された、誘導型多能性幹細胞株（ｉＰＳＣ）は、これらの研究用の種材料を提供するために懸濁増殖された。前の実施例に記載したとおり、懸濁増殖した細胞を、自動凍結保存装置内にて高密度で冷凍してから、解凍して、閉鎖された３リットルのガラスバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ，Ｊｕｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は使い捨て可能な３リットルの１回使用バイオリアクター（Ｍｏｂｉｕｓ（登録商標）、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）に、最終細胞濃度０．２２５×１０⁶個の細胞／ｍＬで接種した。撹拌槽バイオリアクターに接種した細胞は、連続的に撹拌されるタンクで細胞集団を形成し、合計３日間リアクター内の多能性培地（Ｅ８（商標）、０．５％のＢＳＡを添加）に維持された。接種から７２時間後に、中胚葉／心組織（１）又は外胚葉／神経組織（２）を形成するため、それぞれの分化培地内で、細胞集団をプラスチックの使い捨て三角フラスコ（ＰＥＴＧ １２５ｍＬフラスコ，カタログ番号４１１２，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）へ移植することにより、多能性細胞分化を開始した。

【0263】

ステージ式分化プロセスを開始した後、細胞は、振とう器プラットフォーム（ＭＡＸＱ ４１６ｈｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）上の加湿、５％のＣＯ₂インキュベーター内に、１００ｒｐｍで１０日間維持した。分化の開始から１日後、３日後、５日後、及び７日後に、フラスコ内の培地を、表１９に記載したとおりに作製した新鮮な培地に交換した。参照用に分化の開始前、次いで分化の開始から３、５、７、及び１０日後に、ｑＲＴ−ＰＣＲ試料を採取した。

【0264】

ｍＲＮＡ発現パターンにおける外胚葉又は中胚葉に特異的な変化が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出されるかどうかを決定するため、３つのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（Ｌｉｆｅ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）指定の多能性、胚体内胚葉（ＤＥ）及びステージ６（Ｓ６）を使用し、発現を標準化するため、適切な未分化の多能性幹細胞試料を対照として結果を比較した。

【0265】

これらのアレイを使用して、外胚葉（図８９）又は中胚葉（図９０）の分化培地で培養した、多能性細胞の遺伝子発現パターンを決定した。それぞれの条件において振とうフラスコ内で分化された細胞は、多能性アレイで測定されたとおり、３日目〜１０日目の延長培養にわたり、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４、ＴＤＧＦ１、及びＺＦＰ４２のような多能性の遺伝子に関する、減少した多能性遺伝子発現を実証した。外胚葉又は中胚葉に分化したｈＥＳ又はｉＰＳ細胞からの試料では、ＣＸＣＲ４の発現が増加した。これらの結果は、分化に特徴的な遺伝子の高い発現を示す、ｑＲＴ−ＰＣＲデータと相関した。外胚葉分化培地で処理された細胞は、分化の開始から３〜１０日後に、ｑＲＴ−ＰＣＲによる、増加したレベルのＡＲＸ、ＮＥＵＲＯＤ、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６（＞１００倍）、及びＺＩＣ１（＞１０００倍）を発現した（図９１）。これらのデータはＦＡＣＳアレイによって確認され、このＦＡＣＳアレイは、外胚葉運命への分化の開始から３日後に、ｉＰＳＣ及びｈＥＳ細胞の両方が、ＳＯＸ２（多能性及び神経幹細胞の両方に必要な遺伝子）の高い発現を維持したが、ＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４（多能性に必要な遺伝子）の発現を失い、ＰＡＸ６発現（神経及び内分泌分化の遺伝子）を増したことを示した（図９２）。

【0266】

中胚葉分化培地で処理した細胞における分化の類似の運動もまた、観察された。多能性遺伝子発現は、１０日間の分化にわたって下降したが（図９０）、３日目には早期の一過性中内胚葉運命（ＣＥＲ１、ＥＯＭＥＳ、ＣＫＩＴ、及びＶＷＦ）に特徴的な遺伝子の早期の誘導が観察され、１０日目には、これらの遺伝子発現レベルが基準値近くまで低下した（図９３）。また、分化の開始から３、５、７、及び１０日後の特徴的な中胚葉遺伝子の発現が、早期かつ増加する遺伝子発現を示したことも観察された（図９３のＣＤＨ２、ＣＤＸ２、ＧＡＴＡ６、ＨＮＦ４α、ＭＮＸ１、ＰＲＤＭ１、及びＳＯＸ１７）。ｉＰＳ及びｈＥＳ細胞試料の両方で、遺伝子誘導の同一パターンが観察され、分化プロセスが指向されたものであり、事実上自然発生ではないことを示した。

【0267】

ｑＲＴ−ＰＣＲによって観察された遺伝子発現のこれらの変化は、位相差顕微鏡によって観察され、かつ集団の凍結切片によって免疫染色された結果と相関した。中胚葉の分化懸濁培養下で１０日目までに、１０個の集団の中の約１つが自発的に「拍動」を開始し、細胞が心筋組織に分化されたことを示唆した（図９４、左パネル、１０日目、白い棒線）。いくつかの集団の染色した断片は、筋形成を示す、線状の末端から末端のβチューブリン染色パターンを示した（図９４、右パネル）。

【0268】

外胚葉運命に分化した集団については、中胚葉に分化した集団と比べたときに（図９４）、著しく異なる形態パターンが観察された（図９５、左パネル）。外胚葉分化の間、集団は、中胚葉運命に分化した細胞よりも大きく、かつ濃密であり、外胚葉分化した細胞はより少ない合計βチューブリンを発現した。βチューブリンを発現した細胞は、神経細胞に特徴的な、より樹状突起パターンの染色（図９５、右パネル、白矢印）を示した。

【0269】

これらの結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＦＡＣＳデータとの組み合わせにおいて、懸濁状態で積み重なって増殖した細胞は、指向された再現可能な様式で、懸濁培養下で中胚葉又は外胚葉運命に分化し得ることを示す。

【0270】

【表34】

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【0271】

【表35】

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【0272】

以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。

【図1a】

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【図1b】

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【図1c】

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【図1d】

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【図1e】

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【図1f】

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【図2a】

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【図2b】

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【図2c】

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【図2d】

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【図2e-1】

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【図2e-2】

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【図2e-3】

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【図2e-4】

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【図2f】

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【図3a】

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【図3b】

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【図3c】

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【図4a】

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【図4b】

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【図4c】

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【図5a】

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【図5b】

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【図5c】

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【図5d-1】

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【図5d-2】

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【図5d-3】

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【図5e-1】

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【図5e-2】

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【図5e-3】

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【図5e-4】

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【図5f】

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【図5g】

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【図5h】

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【図6a】

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【図6b】

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【図6c】

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【図6d】

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【図6e】

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【図6f】

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【図6g】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【図20】

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【図21】

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【図22】

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【図23】

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【図24】

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【図25】

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【図26】

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【図27】

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【図28】

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【図29】

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【図30】

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【図31】

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【図32】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【図36(a)】

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【図36(b)】

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【図36(c)】

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【図36(d)】

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【図36(e)】

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【図37】

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【図38】

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【図39(a)】

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【図39(b)】

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【図39(c)】

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【図45】

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【図46】

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【図47】

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【図48】

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【図49】

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【図50】

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【図51】

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【図52】

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【図53】

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【図54】

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【図55】

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【図56】

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【図57】

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【図58】

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【図59】

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【図60】

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【図61】

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【図62】

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【図63】

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【図64】

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【図65】

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【図66】

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【図67】

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【図68】

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【図69】

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【図70】

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【図71】

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【図72】

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【図73】

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【図74】

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【図75】

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【図76】

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【図77】

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【図78】

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【図79】

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【図80】

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【図81-1】

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【図81-2】

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【図81-3】

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【図82-1】

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【図82-2】

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【図82-3】

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【図83】

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【図84】

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【図85】

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【図86】

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【図87】

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【図88A-1】

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【図88A-2】

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【図88B-1】

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【図88B-2】

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【図88C-1】

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【図88C-2】

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【図88D-1】

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【図88D-2】

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【図88E-1】

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【図88E-2】

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【図88E-3】

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【図88E-4】

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【図88F-1】

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【図88F-2】

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【図89】

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【図90】

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【図91】

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【図92】

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【図93】

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【図94】

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【図95】

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【図39(d)】

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【図40A】

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【図40B】

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【図40C】

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【図40D】

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【図41-1】

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【図41-2】

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【図42】

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【図43】

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【図44-1】

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【図44-2】

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【国際調査報告】

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