特表 2016-534745 ＤＮＡライブラリーの調製のためのＤＮＡアダプター分子およびその生成法および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2016-534745(P2016-534745A)

(43)【公表日】2016年11月10日

(54)【発明の名称】ＤＮＡライブラリーの調製のためのＤＮＡアダプター分子およびその生成法および使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20161014BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20161014BHJP

   C07F 9/6561 20060101ALI20161014BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C40B40/06

   C07F9/6561 ZCSP

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2016-544766(P2016-544766)

(86)(22)【出願日】2014年9月29日

(85)【翻訳文提出日】2016年2月25日

(86)【国際出願番号】EP2014070769

(87)【国際公開番号】WO2015044412

(87)【国際公開日】20150402

(31)【優先権主張番号】13186776.4

(32)【優先日】2013年9月30日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ハーン， ペーテル

(72)【発明者】

【氏名】アザウイ， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】グリューンフェルト， ペーテル

【テーマコード（参考）】

4H050

【Ｆターム（参考）】

4H050AA01

4H050AA02

4H050AA03

4H050AB20

(57)【要約】

本発明は、ＤＮＡライブラリーの調製のためのＤＮＡアダプター分子、ならびにこれらの生成法およびこれらの使用に関する。本発明は、分子生物学における適用のために、特に、次世代シーケンシングおよび／もしくはライブラリー多重化のために有用である。本発明は、ＤＮＡアダプター分子を開示し、このＤＮＡアダプター分子は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、ここで第１鎖の５’末端は、キナーゼの結合部位が利用可能でないように改変され、第１鎖の３’末端は、ライゲーションが起こることができないように改変され、リバース鎖の５’末端は、キナーゼの結合部位が利用可能でないように改変され、リバース鎖の３’末端は、（最後のヌクレオチドの３’位において）遊離ヒドロキシル基を特徴とする。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

二本鎖分子を含むＤＮＡアダプター分子であって、ここで
ａ．その第１鎖の５’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、５’位において遊離ホスフェートを含まないように改変されており、
ｂ．該第１鎖の３’末端は、最後のヌクレオチドが３’位において遊離ヒドロキシル基を含まないように改変されており、
ｃ．そのリバース鎖の５’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、５’位において遊離ホスフェートを含まないように改変されており、
ｄ．該リバース鎖の３’末端は、遊離ヒドロキシル基を特徴とする、
ＤＮＡアダプター分子。

【請求項2】

バーコード配列、ならびに増幅および配列決定プライマーのための結合部位を含む、請求項１に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項3】

２０〜９０、好ましくは４０〜７０、最も好ましくは４０〜６０塩基対の長さを有する点で特徴付けられる、請求項１または２に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項4】

前記両方の鎖の５’末端および前記第１鎖の３’末端にあるヒドロキシル基が、エステル化もしくはエーテル化されているという点で特徴付けられる、請求項１〜３のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項5】

前記リバース鎖の５’末端は、５‘−Ｃ３−スペーサーもしくは５‘−Ｄ−スペーサーの付着によって改変されているという点で特徴付けられる、請求項１〜４のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項6】

前記第１鎖の５’末端は、５’ Ｃ３−スペーサーもしくは５’−Ｏ−メチルデオキシヌクレオチドの付着によって改変されているという点で特徴付けられる、請求項１〜５のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項7】

前記第１鎖の３’末端は、３‘−Ｃ３−スペーサーもしくは３‘−アミノ−改変因子によって改変されるという点で特徴付けられる、請求項１〜６のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子。

【請求項8】

二本鎖分子を含むＤＮＡアダプター分子の生成のための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ．遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないようにその第１鎖の５’末端を改変する工程、
ｂ．遊離ヒドロキシル基が利用可能でないように該第１鎖の３’末端を改変する工程、
ｃ．遊離ヒドロキシル基および遊離ホスフェートが利用可能でないようにそのリバース鎖の５’末端を改変する工程、
を包含する、方法。

【請求項9】

前記第１鎖の５’末端の改変は、５‘−Ｏ−メチルデオキシチミジンモノホスフェートもしくは５‘−Ｃ３−スペーサーの付着によって達成される、請求項８に記載のＤＮＡアダプター分子の生成のための方法。

【請求項10】

前記第１鎖の３’末端の改変は、３‘−Ｃ３−スペーサーもしくは３‘−アミノ−改変因子の付着によって達成される、請求項８または９に記載のＤＮＡアダプター分子の生成のための方法。

【請求項11】

前記リバース鎖の５’末端の改変は、５‘−Ｃ３−スペーサーもしくは５‘−Ｄ−スペーサーの付着によって達成される、請求項８〜１０のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子の生成のための方法。

【請求項12】

ＤＮＡライブラリーを生成するための方法であって、該方法は、
１．二本鎖ＤＮＡを、好ましくは、物理的もしくは化学的もしくは酵素的な方法またはこれらの組み合わせによってフラグメント化する工程；
２．該フラグメント化された二本鎖ＤＮＡを、好ましくは、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼのような、３’→５｀エキソヌクレアーゼおよび５’→３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの助けを借りて、末端修復する工程；
３．該フラグメント化された二本鎖ＤＮＡの５’末端を、好ましくは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化する工程；
４．本発明に従うＤＮＡアダプター分子を、該フラグメント化され、末端修復され、かつ５’リン酸化された二本鎖ＤＮＡにライゲーションする工程であって、ここで本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、工程２の前に添加される、工程、
を包含する方法。

【請求項13】

ＤＮＡライブラリーを生成するための方法であって、該方法は、請求項１〜７のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子を、フラグメント化し、末端修復し、かつ５’リン酸化した二本鎖ＤＮＡにライゲーションする工程を包含し、ここでライゲーションの前に、酵素の不活性化を行わない、方法。

【請求項14】

キットであって、
−請求項１〜７のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子、
−好ましくは、３’→５｀エキソヌクレアーゼおよび５’→３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデスオキシヌクレオシドトリホスフェート、
−好ましくは、ポリヌクレオチドキナーゼ、
−好ましくは、リガーゼ、
−５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ならびに
−好ましくは、緩衝液、
を含む、キット。

【請求項15】

ＤＮＡライブラリーの生成のための、特に、次世代シーケンシングおよび／もしくはライブラリー多重化の分野における、請求項１〜７のうちの１項に記載のＤＮＡアダプター分子もしくは請求項１４に記載のキットの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡライブラリーの調製のためのＤＮＡアダプター分子、ならびにこれらの生成法およびこれらの使用に関する。本発明は、分子生物学における適用のために、特に、次世代シーケンシングおよび／もしくはライブラリー多重化のために有用である。

【背景技術】

【0002】

（技術水準）
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、ＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列の核酸塩基の配列を決定するための最新技術である。ＮＧＳの利点（速度、経済的有効性、正確性）は、遺伝情報の分析およびその実施を取り扱う全ての学術機関においてますます広がるようになっている。Ｒｏｃｈｅ、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＩｌｌｕｍｉｎａをはじめとする数社の世界的企業がＮＧＳ用の溶液を提供している。

【0003】

１回の実行で多くのサンプルを配列決定するために、既知の配列のバーコードが、規定のサンプルに添加され得、配列決定の後にサンプルに配列を割り当てるために使用され得る。

【0004】

多重配列決定（多くの異なるサンプルを同時に配列決定する）のための方法、組成物およびキットは、ＷＯ ２０１１１５６５２９ Ａ２に開示される。２つまたはそれより多くの異なるサンプルに由来する複数の標的ポリヌクレオチドは、１つの反応チャンバの中で配列決定され、その配列決定された標的ポリヌクレオチドの各々が由来するサンプルは、バーコードによって同定される。

【0005】

改善されたサンプルスループットを有する配列決定法を開示する別の文書は、ＷＯ ２００８０６１１９３ Ａ２である。ここでアダプター配列（タグ配列といわれる）は、サンプルに連結され、これはその後、混合され、配列決定される。

【0006】

ＷＯ ２０１３０３３７２１ Ａ１は、多重ＤＮＡ配列決定のためにバーコード設計を最適化するための方法を開示する。

【0007】

ＵＳ ２０１３０５９７６２ Ａ１は、サンプル中に存在する１種またはそれより多くの核酸の多重ＰＣＲのために有用な方法、組成物、キット、システムおよび装置を提供する。特に、１種またはそれより多くの標的配列の選択的増幅を可能にする種々の標的特異的プライマーが提供される。従って、アダプターは、平滑末端ライゲーション反応において標的配列にライゲーションされる。

【0008】

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）のためにＤＮＡライブラリーを調製する間に、大部分の場合における高分子ｄｓＤＮＡは、物理的もしくは化学的な方法によってフラグメント化され、上記配列決定プラットフォームに特異的なアダプター配列は、その生成されたＤＮＡ分子にライゲーションされている。上記アダプター配列は、一般に、プライマーのための結合部位を含み、バーコード配列を含み得、これは、混合物中で複数のバーコード添加ＤＮＡライブラリーを配列決定することを可能にし（多重化）、その後、そのそれぞれのバーコードに関する配列決定情報を元のサンプルに割り当てることを可能にする。

【0009】

上記フラグメントへの上記アダプター配列のライゲーションが行われ得る前に、無作為に形成されて上記フラグメント化の間に予測できないＤＮＡ末端部（ending）が、修復されなければならない。突出している３’末端は切り出され、突出している５’末端は、ポリメラーゼによって埋められて二本鎖にされる。続いて、上記フラグメントの５’末端は、キナーゼによってリン酸化される。その後、リン酸化されていないＤＮＡアダプター（これは、一方の側で平滑末端化されて、そこでのライゲーションが可能にされ、他方の側では３’突出を有して、そこでのライゲーションが回避される）は、リガーゼの助けを借りて、生成されたＤＮＡ分子へとライゲーションされる。リン酸化されていないアダプター配列のライゲーションは、上記アダプターの５’末端におけるホスホジエステル結合の形成をもたらさず、よってライゲーション後に上記ＤＮＡ二本鎖にニックを残すので、その失われているホスホジエステル結合は、その後、ニックトランスレーションを行うことができる酵素によって閉じられる必要がある。

【0010】

一般に使用されるアダプター配列は、末端修復ミックスに添加できない。なぜなら上記末端修復ミックス中の酵素は、ライゲーションの方向性を失わせ、アダプターのダイマーおよびオリゴマーが形成されるようにそれらを改変するからである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２０１１／１５６５２９号

【特許文献2】国際公開第２００８／０６１１９３号

【特許文献3】国際公開第２０１３／０３３７２１号

【特許文献4】米国特許出願公開第２０１３／０５９７６２号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

（目的）
本発明の目的は、ライブラリー調製の開始時に、フラグメント化されたＤＮＡにアダプター配列が既に添加され得るように、アダプター配列を改変することである。本発明の別の目的は、アダプターのダイマーおよびオリゴマーの形成を回避することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

（発明）
本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド分子を含むＤＮＡアダプター分子を開示し、ここで
ａ．その第１鎖の５’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、かつ５’位において遊離ホスフェートを含まず、その結果、キナーゼ結合部位が利用可能でないように改変（modify）されており、
ｂ．該第１鎖の３’末端は、最後のヌクレオチドが３’位において遊離ヒドロキシル基を含まず、その結果、ライゲーションが起こり得ないように改変されており、
ｃ．そのリバース鎖の５’末端は、一番目のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まず、かつ５’位において遊離ホスフェートを含まず、その結果、キナーゼ結合部位が利用可能でないように改変されており、
ｄ．該リバース鎖の３’末端は、（最後のヌクレオチドの３’位の）遊離ヒドロキシル基を特徴とする。

【0014】

第１鎖およびリバース鎖は、いかなる突出もなしに（平滑末端）、相補的な塩基対形成によって互いにアニールされる。好ましくは、二本鎖内のヌクレオチドは、３´末端および５´末端での上述の末端ヌクレオチド以外に改変されていない。しかし、上記二本鎖が、ヌクレアーゼに対して高められた安定性を有するヌクレオチド、特に、（ホスホロチオエートのように）改変された骨格を有するヌクレオチドを含むことは排除されない。好ましくは、両方の鎖が、正確に同じ長さを有し（同一のヌクレオチド数を有する）、ここで上記リバース鎖のヌクレオチド配列は、上記第１鎖のヌクレオチド配列の逆相補体である。

【0015】

有利なことには、本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、ＤＮＡライブラリー調製の間に、フラグメント化されたＤＮＡに直接付加され得る。技術水準とは逆に、本明細書では、本発明に従うＤＮＡアダプター分子を添加する前およびリガーゼを添加する前に末端修復酵素を不活性化する必要はない。本発明に従うアダプター分子は平滑末端化されるので、それらは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｆｕポリメラーゼのような、５’→３’ポリメラーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの基質ではない。

【0016】

さらに、本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、有利なことには、酵素によるライゲーションが一方向で（上記リバース鎖の３’末端の遊離ヒドロキシル基で）のみ起こり得るように設計される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、技術水準から公知のバーコードアダプターを示し、これは、平滑末端ライゲーションに最適化されているが、末端修復の間もしくはその前に添加することができない（および末端修復酵素の不活性化なしでは添加できない）。左側には、平滑末端化ライゲーション部位が示される。３’部位でのライゲーションを回避するために、その第１鎖（配列番号９）は、（突出部の分解を回避するために）ホスホロチオエート改変ヌクレオシドＡ^＊Ｃ^＊を含む３’突出を有する。相補的リバース鎖（配列番号１０）は、短い方である。両方の鎖の５’は、アダプターダイマーの形成を低下させるために、リン酸化されていない（遊離５’ＯＨを有する）。上記バーコード配列には下線が付されている。

【0018】

【図2】図２は、本発明に従うバーコードアダプターの例を示す。繰り返すと、左側には、平滑末端化ライゲーション部位が示される。３’部位でのライゲーションを回避するために、その第１鎖（配列番号１１）は、Ｍ１によって改変されている。上記第１鎖の５’は、リン酸化を回避し、アダプターのダイマーおよびオリゴマーの形成を低減するために、Ｍ２によって改変されている。上記リバース鎖（配列番号１２）の５’は、アダプターのダイマーおよびオリゴマーの形成を低減するために、Ｍ３によって改変されている。そのバーコード配列には下線が付されている。上記リバース鎖の３’末端は、遊離３’−ＯＨを有する。

【0019】

【図3】図３は、本発明に従う改変されたバーコードアダプターを示し、ここで第１鎖（配列番号１３）の５’改変は、５’−ＯＭｅＴである。平滑末端生成のために、そのリバース鎖（配列番号１４）は、遊離３’−ＯＨ基を有する３’末端において相補的なＡを有する。

【0020】

【図4】図４は、標準的プロトコル、ならびに改変されていないおよび改変されたＤＮＡアダプター分子での新たな（もしくは改変された）ライブラリー調製プロトコルを使用することによって生成されるＤＮＡライブラリーのＣｔ値の比較を示す（ここで１Ａは、基準である）。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１（第１の列）の中のものに相当する。

【0021】

【図5】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図6】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図7】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図8】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図9】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図10】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【図11】図５〜１１は、標準的ライブラリー調製後（Ｂ）もしくは本発明に従う改変プロトコルでのライブラリー調製後（Ａ）のいずれかでの、本発明に従う改変されたバーコードアダプター（図６〜１１）もしくは改変されていないバーコードアダプター（図５）を使用するＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分析を示す。上記ＤＮＡライブラリーは、小さなサイズマーカーと大きなサイズマーカーとの間のサイズ範囲（３５〜１０３８０ｂｐ）においてＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐを使用して定量される。識別子１Ａ〜３Ｅは、表１の中のものに相当する。第１のピーク（４０ｂｐ）は、結合されていないアダプター分子に相当する。図５Ｂおよび図６〜１１中の第２のピークは、ＤＮＡライブラリーに相当する。１０．０００ｂｐを超えるピークは、残りの剪断されていないゲノムＤＮＡに相当する。図５Ａにおいて、マルチピークパターンは、アダプターオリゴマーに相当し、これらは、他の図には存在しない。

【発明を実施するための形態】

【0022】

用語「遊離ヒドロキシル基」とは、本明細書で使用される場合、−ＯＨもしくは脱プロトン化された−Ｏ⁻をいう。用語「遊離ホスフェート」とは、脱プロトン化ホスフェート（−ＯＰＯ_３^２−）、一水素ホスフェートもしくは二水素ホスフェートを記載するために本明細書で使用される。

【0023】

用語「ポリメラーゼ」とは、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは、５’→３’ポリメラーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼをいう。好ましいポリメラーゼは、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼもしくはＰｆｕポリメラーゼのような平滑末端を作り得る酵素である。

【0024】

用語「キナーゼ」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド分子の遊離５’−ヒドロキシル末端へのホスフェートの付加を触媒するポリヌクレオチド５’−ヒドロキシル−キナーゼをいう。好ましいキナーゼは、Ｔ４キナーゼもしくはＴ７キナーゼである。

【0025】

「ポリヌクレオチド分子」とは、本明細書で使用される場合、１本の鎖において共有結合された１３個またはそれより多くのヌクレオチドモノマーから構成される生体ポリマーである。

【0026】

本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、好ましくは、増幅および配列決定プライマーのための結合部位、ならびに好ましくはバーコード配列をさらに含む。

【0027】

上記バーコード配列は、好ましくは、３〜２０個、より好ましくは、４〜８個の塩基対の長さを有する。好ましくは、上記バーコード配列は、第１鎖の５’末端近くに位置する。

【0028】

上記ＤＮＡアダプター分子は、好ましくは、２０〜９０個、より好ましくは、３０〜７０個、最も好ましくは、４０〜６０個の塩基対の長さを有する。

【0029】

一番目のおよび／もしくは最後のヌクレオチドが遊離ヒドロキシル基を含まない発現とは、本発明に従うＤＮＡアダプター分子が、両方の鎖の５’末端での通常は存在するヒドロキシルもしくはホスフェート、ならびにそのリバース鎖の３’末端に通常は存在するヒドロキシルが、他の基（本明細書では「末端形成基（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」といわれる）によって置換されるように改変され、このことにより、上述のそれぞれの酵素の基質ではない改変ヌクレオチドを生じることを意味する（mend）。好ましくは、これら末端形成基は、水素、置換されたかもしくは置換されていないアルキル、アルコキシアミノおよび他の公知の鎖終結因子から独立して選択される。これら末端形成基が、それ自体、遊離ヒドロキシル基を、もしくは遊離ホスフェートでさえも含み得ることは、排除されない。なぜなら、これらは上記酵素の基質ではないからである。

【0030】

本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、好ましくは、両方の鎖の５’末端および第１鎖の３’末端が鎖終結因子を含むという点で改変される。

【0031】

３’末端および５’末端の鎖終結因子は、当業者に周知である。リバース鎖の５’末端および第１鎖の３’末端では、任意の考えられる鎖終結因子がそれぞれ、遊離の３’−ＯＨもしくは５’−ＯＨをブロックするように選択され得る。

【0032】

第１鎖の３’末端に関する鎖終結因子の好ましい例は、２’３’−ジデオキシヌクレオシド（式１）もしくは３’−改変デオキシヌクレオチド（好ましくは式２に示されるとおり）である：

【化1】

Ｂ＝核酸塩基であり、好ましくは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）から選択され、Ｍは、ＮＨ_２−Ｌから選択され、Ｌは、好ましくは、直鎖状もしくは分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣ３もしくはＣ４アルキルから選択され、
ここで

【化2】

は、３´→５´方向において上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖の続いているヌクレオチド配列への共有結合である。

【0033】

５’末端のための鎖終結因子の好ましい例は、以下のような、エーテル化デオキシヌクレオチド（式３）、４’−アミノ−デオキシヌクレオチド（式４）および５’−アミノ−デオキシヌクレオチド（式５）である：

【化3】

Ｂ＝上記のとおりに選択される核酸塩基であり、好ましくはＲ＝Ｃ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＣＨ_３であり、
ここで

【化4】

は、５´→３´方向において上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖もしくはリバース鎖の続いているヌクレオチド配列への共有結合である。

【0034】

好ましくは、両方の鎖の５’末端は、互いから独立して、５’−ＯＭｅ−デオキシヌクレオチドによって改変されており、最も好ましくは、５‘−ＯＭｅデオキシチミジン（５’−ＯＭｅＴ）、末端５‘−Ｃ３−スペーサー改変および／もしくは５‘−Ｄ−スペーサー改変されている。この改変は、ポリヌクレオチドキナーゼによる、特に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化が、上記改変された５’末端では行うことができないという事実を生じる。有利なことには、両方の鎖の５’末端は、アダプターのダイマーおよびオリゴマーの形成を回避するためにリン酸化されないままである。

【0035】

好ましくは、５‘−Ｃ３−スペーサーもしくは５‘−Ｄ−スペーサーは、以下のように設計される：

【化5】

ここでＸは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ_ｘおよびハロゲンから選択され、好ましくは、Ｘは、−ＯＨもしくは−ＯＲ_ｘであり、より好ましくは、Ｘは、−ＯＨであり、
ここでＲ_ｘは、必要に応じて置換されたおよび／もしくは分枝状のＣ１〜Ｃ３アルキル残基であり、より好ましくは、Ｒ_ｘは、ＣＨ_３であり、
ここで

【化6】

は、５´→３´方向において上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖もしくはリバース鎖の続いているヌクレオチド配列への共有結合である。

【化7】

【0036】

５‘−ＯＭｅデオキシチミジレート（５‘−Ｏ−メチルデオキシチミジンモノホスフェート（本明細書では５’−ＯＭｅＴともいわれる））。

【0037】

好ましくは、上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖の５’末端は、５’スペーサーもしくは５’エーテル化デオキシヌクレオチド（好ましくは、式３に従う）、好ましくは、５‘−Ｏメチルデオキシヌクレオチドによって改変される。用語スペーサーは、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する炭化水素残基、好ましくは、２〜４個の炭素原子を有するアルクジイル基（ａｌｋｄｉｙｌ ｇｒｏｕｐ）、最も好ましくは、直鎖状Ｃ３（５’−Ｃ３−スペーサー）を意味する。上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖の５’末端の改変は、リン酸化、特に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化が可能でないという事実を生じる。さらに、上記好ましい改変は、ＤＮＡ二本鎖のコンホメーションに対して最小の影響（立体障害）を有して、上記リバース鎖の反応性遊離３’−ＯＨの効率的なライゲーションを可能にする。

【0038】

最も好ましい５’−ＯＭｅデオキシヌクレオチドは、５’−ＯＭｅデオキシチミジレート（５’−ＯＭｅＴ）である。５‘−ＯＭｅデオキシシチジレート（５‘−Ｏ−メチルデオキシシチジンモノホスフェート）、５‘−ＯＭｅデオキシアデニレート（５‘−Ｏ−メチルデオキシアデノシンモノホスフェート）、もしくは５‘−ＯＭｅデオキシグアニレート（５‘−Ｏ−メチルデオキシグアノシンモノホスフェート）による改変もまた、可能である。上記５’−ＯＭｅデオキシヌクレオチド改変（もしくは５’−アミノ−デオキシヌクレオチド）に関しては、さらなる相補的デオキシヌクレオチドが、上記ＤＮＡアダプター分子のリバース鎖の３’末端に付加され、その結果、第１鎖の５´末端での改変ヌクレオチドが、その後のニック修復に干渉しないように、この相補的なヌクレオチドとの通常の、安定化されていない塩基対を形成し得る。例えば、第１鎖の５’末端の改変が、５‘−ＯＭｅチミジン（もしくは５’−アミノデオキシチミジンモノホスフェート）である場合、その相補的なヌクレオチドは、デオキシアデニンである。

【0039】

ライブラリー調製のために使用される場合、本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、リバース鎖の３’末端を用いてのみ、ＤＮＡフラグメントの第１鎖の５’リン酸化末端へとライゲーションされる。上記ＤＮＡアダプターの第１鎖の５’末端と、上記ＤＮＡフラグメントのリバース鎖の３’−ＯＨとの間に、ニックが残っている（上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖の５’末端改変に起因して、上記５’末端は、遊離ホスフェートを含まない）。上記ニックは、好ましくは、５’末端での改変ヌクレオチド（好ましくは、５’−ＯＭｅＴ）を切り出し、非改変ヌクレオチド（好ましくは、デオキシチミジンモノホスフェート）によって置換する、（ＤＮＡポリメラーゼＩのような）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼを用いる、ヌクレオチド除去修復（ここでは、ニック修復ともいわれる）によって、その後修復される。上記リガーゼは、好ましくは、上記サンプル中になお存在して活性であり、次いで、上記ＤＮＡフラグメントのリバース鎖の遊離３’−ヒドロキシル基を、上記ＤＮＡアダプターの第１鎖の修復された５’末端へとライゲーションする。

【0040】

本発明に従うＤＮＡアダプター分子の第１鎖の３’末端は、好ましくは、３‘−Ｃ３−スペーサーもしくは３‘−アミノ−改変因子によって改変される。その改変された３’末端は、リガーゼに関してブロックされ、５’リン酸化ＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡ分子への連結が起こることができない。

【化8】

ここでＸは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ_ｘおよびハロゲンから選択され、好ましくは、Ｘは、−ＯＨもしくは−ＯＲ_ｘであり、より好ましくは、Ｘは、−ＯＨであり、
ここでＲ_ｘは、必要に応じて置換されたおよび／もしくは分枝状のＣ１〜Ｃ３アルキル残基であり、より好ましくは、Ｒ_ｘは、ＣＨ_３であり、
ここで

【化9】

は、３´→５´方向において上記ＤＮＡアダプター分子の第１鎖の続いているヌクレオチド配列への共有結合である。

【0041】

また、本発明の一部は、二本鎖を含むＤＮＡアダプター分子の生成のための方法であり、この方法は、以下の工程を有する：
ａ．キナーゼ結合部位、特に遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないような、その第１鎖の５’末端の改変、
ｂ．遊離ヒドロキシル基が利用可能でなく、かつ５’リン酸化ｄｓＤＮＡを有する結合が形成できないような、該第１鎖の３’末端の改変、
ｃ．キナーゼ結合部位、特に遊離ヒドロキシル基も遊離ホスフェートも利用可能でないような、そのリバース鎖の５’末端の改変。
ここで、工程ａ〜ｃは任意の順序で行われ得る。

【0042】

二重鎖は、標準的なオリゴヌクレオチド合成によって合成される２つの１本鎖をアニールすることによって通常は得られる。一般に、上述の改変は、それぞれの３’末端および５’末端に関するオリゴヌクレオチド合成のために、既に予め改変された構成ブロックを使用することによって導入される。しかし、用語改変はまた、オリゴヌクレオチド合成後にそれぞれの３’末端および５’末端を改変する可能性（あまり好ましくはない）、例えば、遊離５’−ＯＨを有する標準的な５’−チミジン（より正確には、デオキシチミジンモノホスフェート）がメチルエーテルに変換されて、５’−ＯＭｅＴを得ることを含む。

【0043】

好ましい改変は、上記に記載される。

【0044】

本発明の別の部分は、ＤＮＡライブラリーを生成するための方法であり、該方法は、好ましくは以下の工程を包含する：
１．二本鎖ＤＮＡを、好ましくは、物理的もしくは化学的もしくは酵素的な方法またはこれらの組み合わせによってフラグメント化する工程；
２．該フラグメント化された二本鎖ＤＮＡを、好ましくは、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼのような、３’→５｀エキソヌクレアーゼおよび５’→３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの助けを借りて、末端修復する工程；
３．該フラグメント化された二本鎖ＤＮＡの５’末端を、好ましくは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼのようなポリヌクレオチドキナーゼによってリン酸化する工程；
４．本発明に従うＤＮＡアダプター分子を、該フラグメント化され、末端修復され、かつ５’リン酸化された二本鎖ＤＮＡにライゲーションする工程であって、ここで本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、工程２の前に添加され、好ましくは酵素（特に末端修復酵素）の不活性化はライゲーションの前に行われない、工程。

【0045】

上記酵素は、技術水準にある公知の適切な緩衝液中に添加される。工程２および３は、並行して、特に、ポリメラーゼおよびキナーゼのミックスを添加することによって、行われ得る。両方の酵素は、まとめて、本明細書中で「末端修復酵素」とも称される。上記ミックスは、それぞれ、「末端修復酵素ミックス」とも称される。末端修復のために使用されるポリメラーゼ、およびキナーゼは、同じ緩衝液（好ましくは、マグネシウムおよび（ＴＲＩＳ−ＨＣｌのような）緩衝化剤を含み、好ましくは７〜８の間のｐＨを有する）中で、十分に機能する。この緩衝液は、「末端修復緩衝液」ともさらにいわれる。末端修復のために、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（好ましくは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）はまた、「末端修復緩衝液」に、もしくは別個に、いずれかで添加される。

【0046】

本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、上記で説明されるように構成される（好ましくは、上記の１個もしくは数個の好ましい特徴を含む）。好ましくは、工程２の前に添加された上記ＤＮＡアダプター分子は、バーコード配列を含む。工程１において、いくつかの個々のＤＮＡプローブは、デバイスの個々の区画の中で並行して処理され得る。好ましくは、あらゆる個々のＤＮＡプローブへと、異なるバーコードを有するＤＮＡアダプター分子が添加される。次世代シーケンシングに関しては、上記サンプルは、一般に、バーコードのライゲーションの後にプールされる。これらバーコードは、配列を、配列決定後にサンプルへと割り当てることを可能にする。

【0047】

原理的には、上記バーコードアダプターは、工程１の後に、および工程４の前もしくはその間のあらゆるときに、添加され得る。

【0048】

有利なことには、本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、上記末端修復および５’末端のリン酸化が行われる前に、上記フラグメント化されたＤＮＡに既に添加されていてもよい。これは、工程１においてのみ、個々のプローブ（これらは、フラグメント化されたＤＮＡおよびバーコードを有する本発明に従うＤＮＡアダプター分子である）が添加されるという利点を有する。このことは、工程２〜４において、好ましくは、同じ物質および体積が全てのサンプルに添加されるので、例えば、ピペッティングロボットでの、その後の工程の自動化を可能にする。

【0049】

技術水準の公知のプロトコルにおいて、小体積（２μｌもしくはそれより小さい）の個々に区別されたバーコードアダプターは、ライゲーションの直前に、末端修復および末端修復酵素の不活性化後に、上記サンプルに手動で添加されなければならない。このエラーが生じやすい小体積のピペッティングは、本発明によれば回避され得る。

【0050】

しかし、本発明において、上記バーコードアダプターは、工程１の後に各サンプルに添加され得、続いての工程は、ピペッティングロボットから完全に行われ得る。上記ロボットには、ユニバーサル末端修復ミックスおよびライゲーションミックスが供給され得、同一の予め設定された体積を各サンプルに添加しさえすればよい。このことは、反応体積の不正確さおよび損失を最小限にする。さらに、上記ロボットは、各ピペッティング工程の後に、ピペット用チップを替える必要はない。

【0051】

特に、ＤＮＡライブラリー調製に関して、好ましくは、上記フラグメント化され、末端修復されかつ５’リン酸化された二本鎖ゲノムＤＮＡの他方の末端に第２のＤＮＡアダプター分子がライゲーションされる。この第２のＤＮＡアダプター分子は、好ましくは、逆方向プライマー配列を含み、好ましくは、ユニバーサルアダプター分子であり、これは、あらゆるプローブに対して同じである。上記第２のＤＮＡアダプター分子は、本発明に従うＤＮＡアダプター分子もしくは技術水準で使用されるとおりの一般的なＤＮＡアダプター分子（二本鎖ポリヌクレオチド分子も含む）のいずれかである。上記第２のＤＮＡアダプター分子は、好ましくは、改変された骨格（ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｔｈｉｏａｔｅ）として）を有するヌクレオチドを含む。

【0052】

好ましくは、上記第２のＤＮＡアダプター分子は、本発明に従うＤＮＡアダプター分子（第１鎖およびリバース鎖の５’末端、ならびに第１鎖の３’末端は、上記のように改変されている）である。ユニバーサルアダプター分子として、上記第２のＤＮＡアダプター分子は、バーコードを含む必要はないが、好ましくは、逆方向プライマー配列を含む。有利なことには、それはまた、工程１の後に添加され得る。

【0053】

上記第２のＤＮＡアダプター分子（もしくはユニバーサルアダプター分子）が、本発明に従うＤＮＡアダプター分子である場合、これは、ライゲーションを行う前に、酵素、特に、末端修復酵素の不活性化が必要ないという利点を有する。

【0054】

上記第２のＤＮＡアダプター分子（もしくはユニバーサルアダプター分子）が、技術水準から公知の一般的ＤＮＡアダプター分子である場合、末端修復酵素の不活性化は、ライゲーション（工程４）の前に行われなければならず、これは、好ましくは、高温（これは、使用される酵素に依存し、好ましくは、６０℃より高い温度）でのインキュベーションによって行われる。この場合、上記第２のＤＮＡアダプター分子は、不活性化後に、好ましくは、ライゲーションミックス中のリガーゼとともに添加される。

【0055】

工程１〜３は、別の研究室で独立して行われ得るので、本発明はまた、本発明に従うＤＮＡアダプター分子を、フラグメント化され、末端修復されかつ５’リン酸化された二本鎖ＤＮＡへとライゲーションする工程であって、ここで好ましくは、ライゲーションの前に、酵素の、特に、末端修復酵素の不活性化が行われない工程を含む、ＤＮＡライブラリーの生成のための方法を包含する。

【0056】

上記ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであり、これは、好ましくは、当該分野で周知の条件（例えば、室温で２時間もしくは１６℃で一晩）で行われる。ライゲーションで使用するのに好ましい酵素は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼである。

【0057】

上記で説明されるとおりのライゲーション工程には、好ましくは、ニック修復酵素、好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および５’→３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを添加することによって、ニック修復（工程５）が続く。上記ニック修復酵素は、好ましくは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼのように熱安定性である。好ましくは、上記反応ミックスを、好ましくは６０℃より高い温度へと加熱することによって、上記リガーゼは、末端修復酵素が活性化される間に不活性化される。工程４および工程５のために使用される酵素は、ミックス、すなわちニック修復酵素およびリガーゼを含む、「ライゲーションおよびニック修復酵素ミックス」として、同時に添加され得る。工程４および工程５で「ライゲーション緩衝液」として使用される緩衝化剤は、有利なことには、ＴＲＩＳ−ＨＣｌのような、かつ好ましくは７〜８の間のｐＨを有する「末端修復緩衝液」と同じであり得る。「ライゲーション緩衝液」は、好ましくは、マグネシウムをも含む。ニック修復のために、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（好ましくは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）はまた、「ライゲーション緩衝液」もしくは別個にのいずれかで添加される。

【0058】

上記ＤＮＡライブラリーを生成するために使用されるＤＮＡは、好ましくは、ゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡライブラリーの重要な特徴のうちの１つは、上記ゲノムＤＮＡライブラリーが、元のゲノム（ゲノムＤＮＡ）上の遺伝子もしくは配列のセットのコピー数、および上記ゲノムＤＮＡ上の遺伝子もしくは配列のセットの量的比率を実質的に維持していることにある。

【0059】

本発明の別の目的は、ＤＮＡライブラリーを生成するためのキット、好ましくは、上記で記載されるＤＮＡライブラリーを生成するための方法を行うためのキットであり、上記キットは、
ｉ．本発明に従うＤＮＡアダプター分子、
ｉｉ．好ましくは、末端修復のために：３’→５｀エキソヌクレアーゼおよび５’→３’ポリメラーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、ならびにデオキシヌクレオシドトリホスフェート（好ましくは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）、
ｉｉｉ．好ましくは、５’リン酸化のために：ポリヌクレオチドキナーゼ、
ｉｖ．好ましくは、ライゲーションのために：リガーゼ、
ｖ．好ましくは、上記のとおりの第２のＤＮＡアダプター分子（好ましくは、ユニバーサルアダプター）、
ｖｉ．好ましくは、ニック修復のために：５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、および
ｖｉｉ．好ましくは、緩衝液（上記のとおり、好ましくは、マグネシウムおよびＡＴＰを含む）
を含む。

【0060】

従って、上記キットは、少なくとも本発明に従うＤＮＡアダプター分子を、および最も好ましくは、リガーゼを含む。

【0061】

上記異なる酵素は、好ましくは、上記に記載されるように選択される。

【0062】

構成要素ｉｉおよびｉｉｉは、好ましくは、上記で定義されるとおり「末端修復酵素ミックス」として、好ましくは、上記で定義されるとおりの「末端修復緩衝液」とともに、またはさらにはこの緩衝液と混合されて提供される。

【0063】

構成要素ｉｖおよびｖは、好ましくは、「ライゲーションおよびニック修復酵素ミックス」、「末端修復酵素ミックス」として、好ましくは、上記で定義されるとおりの「ライゲーション緩衝液」と一緒にまたはさらにはこの緩衝液と混合されて、提供される。

【0064】

上記緩衝液中に提供されない場合、上記キットはまた、デオキシヌクレオシドトリホスフェート（好ましくは、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ）を、「ｄＮＴＰミックス」として別個の成分として含み得る。

【0065】

本発明の一部はまた、特に、次世代シーケンシングおよび／もしくはライブラリー多重化の分野において使用するための、ＤＮＡライブラリーを生成するための、上記で記載されるＤＮＡアダプター分子または上記のキットの使用である。本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、非常に単純かつ強いプロトコルを可能にするので、自動化溶液（automated solution）とともに使用するために特に適している。

【0066】

本発明に従うＤＮＡアダプター改変は、ライブラリー多重化を、特に、自動化プロトコルにおいて可能にしかつ促進する。なぜなら、そのバーコード化アダプターは、ライブラリー調製の開始時に上記ＤＮＡに（５’末端の末端修復およびリン酸化が行われる前に上記フラグメント化ＤＮＡに）手動で既に添加されていてもよく、その後、上記ライブラリー調製は、ピペッティングロボットで行われてもよいからである。さらに有利な特徴は、上記末端修復酵素の熱不活性化が、必要でないということである：その末端修復されたライブラリーフラグメントは、上記酵素（上記末端修復ミックス中に存在する）によってはさらに改変されず、本発明に従うＤＮＡアダプター分子は、同様にそれら酵素の基質でもない。上記ＤＮＡリガーゼを添加する前にライゲーションに先だってそれら酵素を不活性化することは、必要ではなく、上記ライゲーションは、活性な末端修復酵素の存在下で行われ得る。このことは、上記サンプルの時間を浪費する加熱および冷却なしで、劇的に短縮された自動化ライブラリー調製プロトコルを可能にする。

【0067】

本発明は、以下の図面および実施例によって、それらに限定されることなく、さらに記載される。

【実施例】

【0068】

実施例１：標準的なプロトコルおよび改変されたライブラリー調製プロトコルにおいて異なって改変されたＤＮＡアダプター分子の比較

【0069】

ＤＮＡアダプター改変の種々の組み合わせを試験するために、以下の１本鎖を合成し、種々の組み合わせで適用する：

【0070】

【表1-1】

【表1-2】

【0071】

用語「／５ＳｐＣ３／」とは、上記で記載され、本明細書で定義されるとおりの５’−Ｃ３−スペーサーをいい、上記５’−Ｃ３−スペーサーは、以下の式の１−ヒドロキシプロピル−３−ホスファチジル終結因子である：

【化10】

【0072】

用語「／５ｄＳｐ／」とは、以下の式の５’−Ｄ−スペーサーとしての１，２−ジデオキシリボシル−３−ホスフェートをいう：

【化11】

【0073】

本明細書では、用語「／３ＡｍＭＯ／」とは、以下の式の３’−アミノ−改変因子としての６−アミノヘキシル−１−ホスフェートをいう：

【化12】

【0074】

本明細書では、「／３ＳｐＣ３／」とは、以下の式の３’−Ｃ３−スペーサーとしての１−オキシ−３−プロパノールをいう：

【化13】

【0075】

本明細書では、「ＯＭｅＴ／」とは、以下の化学構造の５´末端改変因子としての５’−Ｏ−メチルデオキシチミジンモノホスフェートである：

【化14】

【0076】

改変されたアダプター鎖の種々の組み合わせを、ＤＮＡライブラリー調製標準プロトコル（ＱＩＡＧＥＮ ＧｅｎｅＲｅａｄ^ＴＭ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ （Ｌ） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ０３／２０１３）において改変されていないアダプター配列（１Ａ）に対して並行して使用する。このために、調製１回あたりＥ．ｃｏｌｉ由来の１μｇのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（予め長さ１５０塩基対へとフラグメント化されている）を、末端修復反応において適用する。その後、上記酵素を熱不活性化し、上記の異なって改変されたアダプターの組み合わせを、改変されていないユニバーサルアダプターＸ（第１鎖 Ｘ＿ｆｗｄ： ５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号１５）；リバース鎖： Ｘ＿ｒｅｖ： ５’−ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣ^＊Ｔ^＊Ｔ−３’（配列番号１６）；^＊＝ホスホロチオエート）と一緒に、ライゲーション反応に適用する。

【0077】

本実施例において、表１に従う以下のアダプターの組み合わせを使用する：１Ａ（改変されていないアダプター−技術水準）、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、３Ｂ、３Ｅ。

【0078】

標準的プロトコルと並行して、アダプター分子の同じ組み合わせでの改変されたライブラリー調製プロトコルを行う。上記標準的プロトコルとは対照的に、上記バーコードアダプターＢ２＿Ｉｎｄｅｘ＿１を、上記ｇＤＮＡと一緒に末端修復反応へとピペッティングする。上記末端修復反応の終了後に、上記ユニバーサルアダプターＸのみを、ライゲーションに添加する。

【0079】

以下の表において、２つのライブラリー調製プロトコル（「新たなプロトコル」および「標準的プロトコル」）を例証する：

【0080】

【表2】

【0081】

末端修復反応の準備の後に、上記混合物を、２０分間、２５℃でインキュベートし、その後、１０分間、７０℃での酵素不活性化工程を行う。次に、ライゲーションおよびニック修復ミックス、ライゲーション緩衝液およびｄＮＴＰsとユニバーサルアダプターを一緒に、末端修復されたＤＮＡに添加することによってライゲーションおよびニック修復反応物を準備する。この混合物を、１０分間、２５℃でインキュベートし、その後、５分間、７２℃でインキュベートする。

【0082】

得られたライブラリーを、ＧｅｎｅＲｅａｄ^ＴＭサイズ選択（ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， ＤＥ， １００ｂｐカットオフ）で精製する。精製後、得られたライブラリーを、アダプターを配置したプライマーの助けを借りて定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量し、上記サンプルのフラグメントサイズ分布を、キャピラリーゲル電気泳動を使用して分析する。

【0083】

標準的プロトコルを使用することによって生成されるＤＮＡライブラリーのＣｔ値の比較は、改変されていないアダプター分子１Ａと種々のアダプター改変（アダプター２Ｃを除く）との間で有意差を示さない。この事実は、図３に図示される。これは、本発明に従うアダプター改変が、アダプター分子の機能性に影響を及ぼさないことを示す。

【0084】

新たなプロトコルを使用することによるものと比較した、標準的プロトコルを使用することによって生成されるＤＮＡライブラリーのＣｔ値の比較は、新たなプロトコルの後の上記改変されたアダプター分子のＣｔ値が、標準的プロトコル後に匹敵するかもしくは僅かにより良好であることを示している。上記改変されていないアダプター分子は、新たなプロトコルを使用する場合に、標準的プロトコルと比較して有意に悪いＣｔ値を与える。このことは、本発明に従う改変されたアダプター分子の使用の下での収量が、適用されるライブラリー調製プロトコルとは比較できる程度に高く無関係であることを示す。

【0085】

得られたＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズ分布を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ Ｃｈｉｐｓと比較する。標準的プロトコルに関しては、改変されていない（技術水準）ＤＮＡアダプターで得られたＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズの分布と、本発明に従う改変されたＤＮＡアダプターで得られたＤＮＡライブラリーのフラグメントサイズの分布とは、匹敵する。そのフラグメントサイズは、平均して約２４０ｂｐ（フラグメント化後のライブラリーフラグメントの１５０ｂｐ＋アダプター分子の９０ｂｐ）である。本発明に従う改変されたＤＮＡアダプター分子と新たなプロトコルとを使用することから生じるライブラリーに関しても、同じことが当てはまる。

【0086】

改変されていないアダプター分子と新たなプロトコルとを使用することから生じるライブラリーに関してのみ、小さいフラグメントサイズの領域にある明らかなピークが、エレクトロフェログラムにおいて認識できる。これは、改変されていないアダプター分子が、新たなプロトコルにおいて適用される場合にダイマー化およびオリゴマー化されること、従って、新たなプロトコルに適用可能でないことを示す（図５Ａ）。

【0087】

アダプターのダイマーおよびオリゴマーは、定量的ＰＣＲの間のライブラリー定量化を改ざんし、他方で、それらはライブラリーを配列決定するときに読み取り能力を低減する。なぜならそれらは、何ら有用な情報を含まずに、ｅｈ ＤＮＡライブラリーとして増幅および配列決定されるからである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2016534745000001.app

【国際調査報告】