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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2017-502649(P2017-502649A)
(43)【公表日】2017年1月26日
(54)【発明の名称】テロメラーゼをコードするＤＮＡワクチン
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20170105BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20170105BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20170105BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20170105BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20170105BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 AZNA
A61P37/04
A61P35/00
A61K39/00 H
C12N9/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】77
(21)【出願番号】特願2016-526856(P2016-526856)
(86)(22)【出願日】2014年10月28日
(85)【翻訳文提出日】2016年6月27日
(86)【国際出願番号】EP2014073164
(87)【国際公開番号】WO2015063117
(87)【国際公開日】20150507
(31)【優先権主張番号】13190547.3
(32)【優先日】2013年10月28日
(33)【優先権主張国】EP
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US
(71)【出願人】
【識別番号】515267851
【氏名又は名称】アンヴェクティ
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＶＥＣＴＹＳ
(74)【代理人】
【識別番号】100101454
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 卓二
(74)【代理人】
【識別番号】100062144
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ピエール・ラングラード・ドゥモイヤン
(72)【発明者】
【氏名】サイモン・ウェイン−ホブソン
(72)【発明者】
【氏名】ティエリー・ユエ
(72)【発明者】
【氏名】クリステル・リアール
(72)【発明者】
【氏名】エロディ・プリケ
【テーマコード（参考）】
4B050
4C085
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050DD11
4B050LL01
4C085AA03
4C085BB01
4C085BB22
4C085BB23
4C085CC21
4C085EE01
(57)【要約】
本発明はテロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）タンパク質をコードする配列を含む核酸構築物を提供する。核酸構築物はテロメラーゼを過剰発現する細胞に対して、好ましくは異形成細胞または腫瘍細胞に対して、対象者の免疫応答を誘発する上で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項1】
テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）をコードする配列を含む核酸構築物。
【請求項2】
hTERTタンパク質が、当該タンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質とN末端で融合する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
hTERTタンパク質をコードする配列がTERTタンパク質の触媒活性の不活性化を提供する変異を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項4】
hTERTタンパク質が少なくとも１つのアミノ酸の欠失によりテロメラーゼ触媒活性を欠く、請求項３に記載の核酸構築物。
【請求項5】
hTERTタンパク質がアミノ酸867-869（VDD）の欠失によりテロメラーゼ触媒活性を欠く、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項6】
hTERTタンパク質がアミノ酸867-869（VDD）の1-12アミノ酸上流および／または下流のさらなる欠失によりテロメラーゼ触媒活性を欠く、請求項５に記載の核酸構築物。
【請求項7】
hTERTタンパク質が少なくともアミノ酸1-23の欠失により核小体局在化シグナルを欠く、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項8】
hTERTタンパク質がアミノ酸1-47の欠失により核小体局在化シグナルを欠く、請求項７に記載の核酸構築物。
【請求項9】
hTERTタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質がユビキチンである、請求項２〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項10】
hTERTタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質がカルレティキュリンのようなシャペロンタンパク質である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項11】
DNA、好ましくはDNAプラスミドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項12】
配列番号12のアミノ酸配列をコードする、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項13】
配列番号11または配列番号11のヌクレオチド3488-6961を含む、請求項１２に記載の核酸構築物。
【請求項14】
配列番号14、16または18のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号13、15、または17のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項15】
テロメラーゼを過剰発現する細胞、好ましくは異形成細胞、腫瘍細胞、またはオンコウイルスに感染した細胞に対して、対象者の免疫応答を誘発するのに用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項16】
患者の腫瘍の予防または処置に用いられる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項17】
ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来の配列を含む核酸構築物であって、hTERT由来の配列が
ｉ）hTERTの全てのまたは実質的に全てのエピトープを任意の順序でコードする、および
ｉｉ）テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くタンパク質をコードする、
核酸構築物。
ｉ）hTERTの全てのまたは実質的に全てのエピトープを任意の順序でコードする、および
ｉｉ）テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くタンパク質をコードする、
核酸構築物。
【請求項18】
配列番号61〜97に示す全てまたは実質的に全ての免疫原性配列を任意の順序で含む、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項19】
配列番号51〜配列番号60のフラグメントを任意の順序で含む配列をコードする、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項20】
タンパク質が、当該タンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質とＮ末端で融合している、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項21】
タンパク質が、アミノ酸867-869（VDD）の欠失によりテロメラーゼ触媒活性を欠く、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項22】
hTERTタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質がユビキチンである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項23】
hTERTタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質がカルレティキュリンのようなシャペロンタンパク質である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項24】
DNA、好ましくはDNAプラスミドである、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項25】
配列番号48をコードする配列を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項26】
配列番号50をコードする配列を含む、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項27】
テロメラーゼを過剰発現する細胞、好ましくは異形成細胞、腫瘍細胞、またはオンコウイルスに感染した細胞に対して、対象者の免疫応答を誘発するのに用いられる、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項28】
患者の腫瘍の予防または処置に用いられる、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗腫瘍ワクチン投与の分野に関するものである。本発明はさらに特に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質の不活性酵素体をコードする核酸構築物を提供するものである。
【背景技術】
【0002】
能動免疫療法での腫瘍特異的T細胞応答の刺激は、他の癌治療の形式よりもいくつかの理論的な利点がある。臨床的有用性を得るために、T細胞に基づく免疫療法は、腫瘍特異的抗原を認識するCD8およびCD4腫瘍反応性T細胞応答を共に刺激しなければならない。従って、複数の腫瘍関連抗原（TAAs）からMHCクラスIおよびIIエピトープを同定することに益々注目が集まってきている（非特許文献１）。しかし、様々なタイプの癌において、特徴ある腫瘍抗原のほとんどが不均一に発現することは、当該抗原を標的とする癌ワクチンの広い適応性を制限する。過去5年間に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）が最初の真の共通腫瘍抗原として登場し、癌免疫療法の普遍的な標的として活発に研究されている。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）は、染色体末端でテロメアDNAを合成するテロメラーゼ酵素の触媒サブユニットである。hTERTは、ほとんどのヒト腫瘍（＞85％）で、また実質的には全てのタイプの癌で、過剰発現している。さらに、テロメラーゼの活性化は細胞死のテロメア依存経路を回避する最も重要な腫瘍回避メカニズムの一つとなっている。腫瘍の成長に無関係の抗原を標的とする免疫療法の戦略が、臨床的に進行性の抗原欠失腫瘍変異体の選択をもたらし得ることは十分に確立されている。従って、テロメラーゼ活性の発現低下または欠失は、腫瘍細胞の増殖能に重大な影響を与える。さらに、通常の体細胞が一生においてほとんどまたは全くテロメラーゼを発現せず、また一般的に腫瘍細胞よりも長いテロメアを持つように、テロメラーゼは比較的癌細胞に特異的である。これらの知見は全て、抗癌免疫療法のおけるhTERTの臨床応用を正当化する。
【0003】
いくつかの抗癌ワクチン試験で広く使われているように、ペプチドワクチンは、hTERT抗原に関する最先端の戦略である。しかし、いくつかの要因、例えば、（1）ヒト白血球抗原（HLA）拘束性、（2）腫瘍細胞内でのペプチドの自然プロセシング、（3）腫瘍細胞の抗原提示の欠失、（4）抗原特異的T細胞の機能性、および（5）ワクチン投与後の宿主における免疫応答の長期持続が、このペプチドに基づくワクチン戦略の最適な成功に影響を与え得る。
【0004】
ペプチドワクチン、特に短いペプチドで獲得した免疫記憶反応は、非常に低く、持続しない。これらの最適ではない結果は、CD4T細胞の助けの欠如によって、一部説明可能である。加えて、提示細胞上のMHC／ペプチドワクチン複合体の半減期はたった数時間であり、ペプチドはそこで消失する。その後、樹状細胞はペプチドをリンパ球にもはや提示しなくなり、それ故に免疫寛容原性となる。このペプチド提示の欠失は、場合によって有害であり得る（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Cheever et al.、2009
【非特許文献2】Rosenberg et al.、2004
【発明の概要】
【0006】
本発明者は、ペプチド（長鎖のペプチドでも）ワクチン投与の欠点を示さない、hTERTのあるエピトープに限定されたDNAワクチンを開発した。特に、DNAワクチン投与は、高価かつ複雑なタンパク質の製造および精製の手順を回避する。その上、hTERTタンパク質をコードするDNAワクチンは、患者のHLA拘束性とは独立的にCTLおよびCD4ヘルパーT細胞を共に誘導することを可能にし、安全で、量的および質的にさらに良好な免疫応答を誘発する。
【0007】
本発明は、テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）タンパク質をコードする配列を含む核酸構築物を提供する。
【0008】
好ましい態様として、hTERTタンパク質は、ユビキチンのような、プロテアソームにhTERTタンパク質を向かわせることを促進するタンパク質とN末端で融合してもよい。
【0009】
本出願の核酸構築物は、対象者の免疫応答、好ましくは細胞免疫応答を誘発する上で有用である。免疫応答は、テロメラーゼを過剰発現する細胞に対する、好ましくは異形成細胞または腫瘍細胞、並びにオンコウイルスに感染した細胞に対するものである。
【0010】
本明細書に記載の方法は、患者の腫瘍を予防するまたは処置する方法であって、前述の核酸構築物を、必要とする患者に投与することを含む方法である。
【0011】
このような処置は、能動免疫療法または治療ワクチン投与と呼ぶことができる。なぜなら腫瘍に対する免疫応答、特に特異的CD4T細胞の応答を伴うCD8細胞傷害性T細胞の応答を誘発するからである。
【0012】
CD4およびCD8T細胞の両方の細胞レパートリーがhTERTの利用可能なエピトープによって刺激されるために、広範囲な免疫応答が獲得される。hTERTの多くのエピトープに対するCD4およびCD8T細胞の数は、ペプチドワクチン投与のそれよりも多い。CD4T細胞の誘導がおこり、インターロイキン、特にTh1サイトカインの産生が改善され、さらにCD4T細胞の誘導が起こり、抗腫瘍細胞の特性を持つCD8T細胞の最適な増殖および分化を可能とする。
【0013】
本発明の別の局面として、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来の配列を含む核酸構築物を提供し、hTERT由来の当該配列は、i）全ての、または実質的に全てのhTERTのエピトープを任意の順序でコードする、および、
ii）テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くタンパク質をコードする。
【0014】
実際に、本発明者は、本明細書ではまた「組換え（shuffled）」テロメラーゼ構築物と呼ばれる当該核酸構築物が、hTERT特異的生体内免疫応答、特に細胞傷害性CD8T細胞の応答もまた誘発することを証明した。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1A】INVAC-1プラスミドマップ
【0016】
【0017】
【0018】
【図1B】INVAC-1のゲルでの確認。INVAC-1発現ベクターは制限酵素マッピングによって確認した。パターンは、期待した制限酵素マップに一致した。
【0019】
【0020】
【図2A】hTERT、INVAC-1およびINVAC-1誘導体。INVAC-1およびINVAC-1誘導体がコードする、野生型のhTERTおよび修飾されたUbi-hTERTタンパク質の配列の模式図：pUTD10Not（Δ10Notとして省略）、pUTD10Cog （Δ10Cogとして省略）およびpUTD23Tyn （Δ23として省略）。
【0021】
【0022】
【図2B】INVAC-1誘導体のゲルでの確認。pUTD10Not、pUTD10CogおよびpUTD23Tyn発現ベクター（INVAC-1誘導体）は制限酵素マッピングによって確認した。パターンは、期待した制限酵素マップに一致した。
【0023】
【0024】
【図3】ウエスタンブロッティングにより評価した、異なる細胞株へ導入した野生型のhTERT、INVAC-1およびINVAC-1誘導体のインビトロでの発現
【0025】
野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）、エンプティーベクター（pNTC8685-eRNA41H、外来性のコード配列を持たないINVAC-1主鎖）、INVAC-1およびINVAC-1誘導体構築物（pUTD10Not/Δ10Not、pUTD10Cog/Δ10CogおよびpUTD23Tyn/Δ23）をHEK293T細胞に遺伝子導入した（A、C）。野生型hTERT、pNTC8685-eRNA41HエンプティーベクターおよびINVAC-1構築物をCrFK細胞に遺伝子導入した（B）。
【0026】
タンパク質の発現は、遺伝子導入後18〜96時間のHEK293T細胞（A、C）および遺伝子導入後24〜72時間のCrFK細胞にて観測した。
【0027】
細胞を回収した時間は各レーンの上に示した。細胞可溶化物由来の全てのタンパク質のうち15μgをメンブレンA、B、Cの各レーンに負荷し（hTERT、INVAC-1）、また全ての可溶化タンパク質のうち20μgをメンブレンCの各レーンに負荷した（Δ10Not、Δ10Cog、Δ23）。hTERTは抗hTERTウサギモノクローナル抗体で検出（hTERT、INVAC-1）、または抗タグV5で検出（Δ10Not、Δ10Cog、Δ23）した。β-アクチンタンパク質の検出は、ローディングコントロールとして用い、また抗β-アクチンマウスモノクローナル抗体で検出した。CrFK細胞からのhTERTタンパク質の検出、およびHEK293T細胞からのINVAC-1誘導体タンパク質の検出にはより長い露光時間を要した。
【0028】
【図4】免疫蛍光法による、異なる細胞株へ導入したhTERTおよびINVAC-1構築物の細胞内局在性の評価
【0029】
野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）、エンプティーベクター（pNTC8685-eRNA41H、外来性のコード配列を持たないINVAC-1主鎖）およびINVAC-1構築物を、HEK293T細胞（A）またはCrFK細胞（D）に24時間導入し、HeLa細胞（B）またはQT6細胞（C）に24時間および48時間導入した。
【0030】
細胞は、抗hTERTウサギモノクローナル抗体およびヤギAlexa Fluor 488（登録商標）ウサギ二次抗体（緑）で蛍光免疫染色した。核はDAPI（青）で染色した。未処理の細胞はDAPIでのみ染色した。細胞は蛍光顕微鏡（×63）で解析した。
【0031】
【図5】TRAPアッセイによる、hTERT、INVAC-1およびINVAC-1誘導体のテロメラーゼ活性の評価
【0032】
CrFK細胞に野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）、INVAC-1およびINVAC-1誘導体構築物を遺伝子導入した。24時間後に細胞を回収し、全細胞タンパク質を抽出して、テロメラーゼ（逆転写酵素）活性をテロメア反復増幅プロトコール（TRAP）アッセイによって評価した。野生型hTERTおよび未処理のCrFK細胞に対するINVAC-1（A、B）およびINVAC-1誘導体構築物（C、D）の、吸光度測定結果（OD450/690nm）および相対テロメラーゼ活性（RTA;サンプル／ポジティブコントロール比）を表示した（n=3、総タンパク質濃度のうち2.1μgのサンプル）。二標本t検定により、＊＊:p=0.0016、＊＊＊:p＜0.0001であった。
【0033】
INVAC-1およびINVAC-1誘導体を遺伝子導入したCrFK細胞においてテロメラーゼ活性は検出されなかった。
【0034】
【図6】INVAC-1の皮内投与後の、hTERT特異的CD8T細胞のインターフェロンγ分泌を有意なレベルで誘発するエレクトロポレーションの影響
【0035】
7週齢C57BL/6雌マウスを、100μgのINVAC-1または1×PBSにより皮内投与で免疫化した（グループ当たり2〜8匹のマウス）。そのうち半数のマウスに対し、免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与後14日目に、全マウスの脾臓を回収した。脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、H2bMHC拘束性の2つのhTERTペプチド（p429、p660）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞200,000個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定。＊:p値＜0.05、EP=エレクトロポレーション。
【0036】
【図7】hTERT特異的CD8T細胞のインターフェロンγ分泌を誘発する、エレクトロポレーションを伴うINVAC-1ワクチン投与における様々な投与経路の評価
【0037】
7〜10週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、25μgのINVAC-1または1×PBSによって、A）皮内投与または皮下投与で（グループあたり3〜8匹のマウス）、およびB）皮内投与または筋肉内投与で（グループあたり4〜5匹のマウス）免疫化した。全マウスに、免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与後14日目に、全マウスのA）脾臓または末梢血液を回収した。脾細胞またはPBMCはフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-B7MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p351、p1123およびp277）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞またはPBMC200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊:p値＜0.05。破線は、脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞10個の位置に、応答するマウスの決定を可能にするカットオフ値として、自発的に引いた。
【0038】
【図8】単回INVAC-1皮内免疫化およびエレクトロポレーション後のhTERT特異的CD8T細胞応答へのワクチン投与量の影響
【0039】
7週齢のC57BL/6雌マウスを、A）12.5、25、50または100μgのINVAC-1または1×PBSによって（グループ当たり4〜6匹のマウス）、およびB）100、200、400、800または1200μgのINVAC-1または1×PBSによって（グループ当たり3〜5匹のマウス）、皮内投与で免疫化した。免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与後14日目に、全マウスの脾臓を回収した。脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、H2bMHC拘束性の2つのhTERTペプチド（p429、p660）のプールによる19時間刺激を、トリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞200,000個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定。＊:p値＜0.05、＊＊:p値＜0.01。破線は、脾細胞200,000個個当たりの10スポットの位置に、応答するマウスの決定を可能にするために自発的に引いた。
【0040】
【図9】インターフェロン-γ分泌hTERT特異的CD8T細胞での、プライムブーストワクチンレジメンの影響
【0041】
7〜10週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、25μgのINVAC-1によって皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全マウスに、免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与後21日目に、同じ手順を用いて、追加免疫注射を行った。末梢血液は最初の免疫化前、初回刺激後7、15、21日目、および追加免疫後9、16、22日目に回収した。PBMCはフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-B7MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p351、p1123およびp277）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊:p値＜0.05。破線は、脾細胞200,000個個当たりの10スポットの位置に、応答するマウスの決定を可能にするために自発的に引いた。
【0042】
【図10】インターフェロン-γ分泌hTERT特異的CD8T細胞を誘発するINVAC-1、Δ10Not、Δ10CogまたはΔ23によるワクチン皮内投与（単回免疫対プライムブーストレジメン）と、それに続くエレクトロポレーションの評価
【0043】
A）7週齢のC57BL/6雌マウスを、100μgのINVAC-1、Δ10Not、Δ10CogまたはΔ23、あるいは1×PBSによる皮内投与で免疫化した（グループ当たり4匹のマウス）。エレクトロポレーションを、免疫化の直後に、各ワクチン投与部位で行った。半数のマウスが、最初のワクチン投与の21日後に、同じ手順で追加注射を受けた。単回注射または初回および追加注射を受けたマウスそれぞれに対して、最後の免疫化から14日または10日後にマウスの脾臓を回収した。脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、H2bMHC拘束性の2つのhTERTペプチド（p429、p660）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、単回注射または初回（PRIME、黒の点）および追加注射（PB、白の点）を受けたマウスの脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊:p値＜0.05。カットオフ値は、脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞10個の位置（破線）に、応答するマウスの決定を可能にする値として、自発的に設定した。PBはポストブースト（post-boost）の略。
【0044】
B）7〜10週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、100μgのINVAC-1、Δ10Not、Δ10CogまたはΔ23、あるいは1×PBSによる皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全てのマウスは免疫化の直後に各ワクチン投与部位にてエレクトロポレーションを行った。最初のワクチン投与の21日後に、マウスは同じ手順で追加注射を受けた。脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-B7MHC拘束性の3つのhTERTペプチド（p351、p1123およびp277）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊:p値＜0.05。カットオフ値は、脾細胞200,000個個当たり10スポットの位置に（破線）、応答するマウスの出現頻度を決定するために、自発的に設定した。
【0045】
【図11】エレクトロポレーションを伴う皮内免疫化後の、hTERT特異的T細胞応答の幅：INVAC-1、pNTC-hTERTおよびpNTC-hTERT-ΔVDD構築物の比較
【0046】
7〜13週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、25μgのINVAC-1、hTERTΔVDD（pNTC-hTERT-ΔVDD）、hTERT（pNTC-hTERT）またはエンプティーベクターNTC（pNTC8685-eRNA41H）により皮内経路で免疫化した（グループ当たり6匹のマウス）。48匹のマウスに、免疫化の直後に各ワクチン部位にてエレクトロポレーションを行った。半数のマウスが、最初のワクチン投与の21日後に、同じ手順で追加注射を受けた。単回注射または初回および追加注射を受けたマウスそれぞれに対して、最後の免疫化から14日または10日後にマウスの脾臓を回収した。
【0047】
脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、9-10個のhTERT重複ペプチド（11アミノ酸が重複した15アミノ酸長のペプチド）を持つ27個のプールに分けられる、一組の269個のhTERT由来精製ペプチド（純度＞70％、GenScript）による一晩（19時間）刺激を、トリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。
【0048】
各マウスに対して、スポットの中央値はトリプリケイトで実施の試験ごとに、また刺激の条件（培地またはペプチドプール）ごとに、算出した。その後、hTERT特異的T細胞の出現頻度（F）を、ペプチドプールによって刺激されたウェルのスポットの中央値から、培地によって刺激されたウェルのスポットの中央値を引き算して、算出した。負の数は、後の解析では0として設定した。
【0049】
解析は、単回の（A）またはプライムブーストの（B）ワクチン投与を受けたマウスに行った。（AおよびB）各ワクチン投与グループ（INVAC-1、hTERTΔVDD、hTERT、NTC）に対して、27プールのそれぞれに対して一つの値を得るために、脾細胞200,000個当たりのIFNγ分泌テロメラーゼ特異的T細胞の出現頻度（F）の中央値（n=6）を、刺激の条件ごとに算出した。
【0050】
（C）INVAC-1、hTERTΔVDD、hTERTまたはNTCによるワクチン投与後の、27プール（269精製ペプチド）で検出されたテロメラーゼ特異的T細胞の出現頻度（F）の全中央値の合計。統計解析は、Prism5というソフトウエアで、ダンの補正を伴うノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定を用いて行った。p値＜0.05は、統計学的に有意であると考えた。
【0051】
【図12】細胞傷害性CD8T細胞およびTh1CD4T細胞を産生する、INVAC-1のワクチン皮内投与とエレクトロポレーションの効力
【0052】
A）7〜10週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、25μgのINVAC-1または1×PBSによって、皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全てのマウスは、免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。注射の14日後、HLA-B7MHC拘束性のそれぞれのhTERTペプチド（p351またはp1123のいずれか）によってパルスされた、あるいはパルスされていない、同系の脾細胞を、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（CFSE）によって3つの異なる濃度：高濃度=1μM（621）、中濃度=0.5μM（987）および低濃度=0.1μM（非パルス）で標識した。同じ数の高濃度、中濃度、または低濃度CFSE標識細胞を、ワクチン投与したマウスに導入した。15-18時間後、ペプチドパルス細胞の消失を、フローサイトメトリーによって脾臓内で測定した。特異的溶解の割合は、コントロールマウスに対するワクチン投与したマウスでの、非パルス細胞に対するパルス細胞の割合を比較することで算出した。データは、各マウスの、INVAC-1による皮内ワクチン投与後の脾臓内での各ペプチドに対して、特異的溶解の割合を表している。水平の線は、ペプチド当たり、および、免疫化経路当たりの平均の溶解割合を示している。標準偏差もまた、プロットした（グループ当たり各マウスn=10）。統計解析は、Prism5というソフトウエアで、ダンの補正を伴うノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定を用いて行った。p値＜0.05は、統計学的に有意であると考えた。
【0053】
BおよびC）7〜10週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスを、25μgのINVAC-1または1×PBSによって、皮内経路で免疫化した（グループ当たり7〜10匹のマウス）。全てのマウスは免疫化直後に各ワクチン部位においてエレクトロポレーションを行った。免疫化の14日後に、全てのマウスの脾臓を回収した。脾細胞をフィコール精製し、B）半数を、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-DR1MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p1029、p578およびp904）のプールによる19時間刺激を、トリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は、脾細胞200,000個個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD4T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定、＊＊＊:p値＜0.001。
【0054】
C）脾細胞の残りの半数は、HLA-DR1MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p1029、p578およびp904）のプールによって、19時間刺激した。刺激した細胞の上清を回収し、hTERT特異的CD4T細胞が分泌するTh1/Th2およびTh17サイトカインの濃度を評価するために、上清をCBAアッセイで試験した。結果はサイトカイン濃度の中央値（pg/mL）である。ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定。＊:p値＜0.05。
【0055】
【図13】同系のHLA-A2/DR1遺伝子導入マウス腫瘍モデルにおける、INVAC-1による治療的または予防的ワクチン皮内投与と、それに続くエレクトロポレーションの影響
【0056】
A）5〜10週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスを、100μgのINVAC-1または1×PBSにより、皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全てのマウスは、免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。最初のワクチン投与の21日後に、マウスは同じ手順で追加注射を受けた。追加投与の1ヶ月後に、50,000個のSarc-2腫瘍細胞（マウス線維肉腫）を、皮下経路でマウスに接種した。腫瘍細胞移植後の異なる日数での、各ワクチン投与グループの腫瘍体積の中央値を示す。破線は、腫瘍の成長の遅延の計算を可能にする500mm3に引いた。
【0057】
B）24週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウス（グループ当たり10匹のマウス）に20,000個のSarc-2腫瘍細胞（マウス線維肉腫）を皮下経路で接種した。腫瘍細胞移植後4日目に、マウスを25μgのINVAC-1またはエンプティープラスミド（抗原配列を持たないNTC、INVAC-1主鎖）で免疫化した。全てのマウスは、免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。最初のワクチン投与の21日および35日後に、マウスは同じ手順で追加注射を受けた。腫瘍細胞移植後の異なる日数での、各ワクチン投与グループの腫瘍体積の中央値を示す。破線は、腫瘍の成長の遅延の計算を可能にする500mm3に引いた。
【0058】
【図14】GM-CSFによるINVAC-1によって誘発される細胞免疫応答の増強と、同系のHLA-A2/DR1遺伝子導入マウス腫瘍モデルにおけるインビボでの有効性
【0059】
A）7週齢のC57BL/6雌マウスを、25μgのINVAC-1、25μgのINVAC-1および0.5μgのmGM-CSF、または1×PBSによって、皮内投与で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。INVAC-1の免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与の14日後に、全てのマウスから脾臓を回収した。脾細胞をフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、H2bMHC拘束性の2つのhTERTペプチド（p429、p660）のプールによる19時間刺激を、トリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は脾細胞200,000個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定。＊＊:p値＜0.01。
【0060】
B）7〜10週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスを、100μgのINVAC-1または、100μgのINVAC-1および5μgのmGM-CSFによって、皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全てのマウスは、INVAC-1の免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。脾細胞をフィコール精製し、HLA-DR1MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p1029、p578およびp904）のプールによって、24時間刺激をトリプリケイトで実施した。刺激した細胞から上清を回収し、hTERT特異的CD4T細胞が分泌するTh1/Th2およびTh17サイトカインの濃度を評価するために、上清をCBAアッセイで試験した。結果はサイトカイン濃度の中央値（pg/mL）である。ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定。＊:p値＜0.05。＊＊:p値＜0.01。
【0061】
C）7〜10週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウス（グループ当たり10匹のマウス）に、20,000個のSarc-2腫瘍細胞（マウス線維肉腫）を皮下経路で接種した。腫瘍細胞移植後4日目に、25μgのINVAC-1および0.5μgのmGM-CSF、またはエンプティープラスミド（抗原配列を持たないNTC、INVAC-1主鎖）および0.5μgのmGM-CSF、または1×PBSおよび0.5μgのmGM-CSFによって、マウスを皮内経路で免疫化した。全てのマウスはINVAC-1の免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。最初のワクチン投与の21日および35日後に、マウスは同じ手順で追加注射を受けた。腫瘍細胞移植後の異なる日数での、各ワクチン投与グループの腫瘍体積の中央値を示す。破線は、腫瘍の成長の遅延の計算を可能にする500mm3に引いた。
【0062】
【図15】INVAC-1誘発型hTERT特異的CD8T細胞応答を増強するIL-12の影響
【0063】
7〜10週齢の遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスを、100μgのINVAC-1、100μgのINVAC-1および1ngのIL-12、1×PBS、または1×PBSおよび1ngIL-12によって、皮内経路で免疫化した（グループ当たり5匹のマウス）。全てのマウスは、INVAC-1の免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与の14日後に、全てのマウスの脾臓を回収した。脾細胞をフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-A拘束性の2つのhTERT特異的ペプチド（UCP4.1およびUCP2.1）のプールによる19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は脾細胞200,000個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。破線は、脾細胞200,000個個当たりの10スポットの位置に、応答するマウスの決定を可能にするために引いた。
【0064】
【図16】図16は、ベクター（7120bp）を発現するINVAC-1プラスミドの全ヌクレオチド配列を示している。ベクターの特徴は、図1Aの説明に詳述している。INVAC-1がコードするhTERT融合タンパク質は、3488の位置（メチオニンをコードするATG）で始まり、6961の位置（アスパラギン酸をコードするGAC）で終わる。INVAC-1/hTERTタンパク質は最初のアミノ酸配列（1-47AA）を、ユビキチンポリペプチド（76AA）で置換することで欠失させた。触媒部位は、VDD（配列中の＊）をコードし野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT;アクセッション番号NM_198253）のAA867-869に対応する、9bpの欠失（ヌクレオチド6172-6173の間）により不活性化させた。一段目はヌクレオチド配列で、二段目は対応するアミノ酸配列である。注釈（図1Aもまた参照）は配列の上部または下部のいずれかに記載した。「□」：ストップコドン。
【0065】
【図17】図17は、D10Notヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Ubi-hTERT）をコードするインサート配列を示している。hTERTは最初の23のアミノ酸配列（1-23AA）をユビキチンポリペプチド（76AA）で置換することで欠失させた。追加の欠失を、野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT：アクセッション番号NM_198253）のAA860-869に対応する、アミノ酸912-913（配列の＊参照）の間で行った。当該10アミノ酸の欠失は、ヒトTERT酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）を含み、また、さらにVDD配列の7AA上流の欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。一段目はヌクレオチド配列で、二段目は対応するアミノ酸配列である。注釈は配列の上部または下部のいずれかに記載した。「□」：ストップコドン。
【0066】
【図18】図18は、D10Cogヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Ubi-hTERT）をコードするインサート配列を示している。hTERTは最初の23のアミノ酸配列（1-23AA）をユビキチンポリペプチド（76AA）で置換することで欠失させた。追加の欠失を、野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT：アクセッション番号NM_198253）のAA867-876に対応する、アミノ酸919-920（配列の＊参照）の間で行った。当該10アミノ酸の欠失は、ヒトTERT酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）を含み、また、さらにVDD配列の7AA下流の欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。一段目はヌクレオチド配列で、二段目は対応するアミノ酸配列である。注釈は配列の上部または下部のいずれかに記載した。「□」：ストップコドン。
【0067】
【図19】図19は、D23Tynヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Ubi-hTERT）をコードするインサート配列を示している。hTERTは最初の23のアミノ酸配列（1-23AA）をユビキチンポリペプチド（76AA）で置換することで欠失させた。追加の欠失を、野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT：アクセッション番号NM_198253）のAA857-879に対応する、アミノ酸909-910（配列の＊参照）の間で行った。当該23アミノ酸の欠失は、ヒトTERT酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）を含み、また、さらにVDD配列の10AA上流および下流の欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。一段目はヌクレオチド配列で、二段目は対応するアミノ酸配列である。注釈は配列の上部または下部のいずれかに記載した。「□」：ストップコドン。
【0068】
【図20】INVAC-1組換え(shuffled)誘導体プラスミドマップ
【0069】
【0070】
［図２０Ａ]pUTScram:ベクターの特徴
【0071】
【0072】
［図２０Ｂ］pUTInv:ベクターの特徴
【0073】
【0074】
【図21A】pUTScramのゲルでの確認。pUTScram発現ベクターは制限酵素マッピングによって確認した。パターンは、期待した制限酵素マップに一致した。
【0075】
【0076】
【図21B】pUTInvのゲルでの確認。pUTInv発現ベクターは制限酵素マッピングによって確認した。パターンは、期待した制限酵素マップに一致した。
【0077】
【0078】
【図22】hTERT、INVAC-1、pUTScramおよびpUTInv構築物。INVAC-1およびINVAC-1組換え(shuffled)誘導体がコードする、野生型hTERTおよび修飾Ubi-hTERTタンパク質の配列の模式図：pUTScram（Scrambled）およびpUTInv（Inverted）。
【0079】
修飾hTERT配列（ΔVDD）を10個の免疫原性フラグメントに分けた：フラグメント 1 （258 bp; Leu24 - Gly109）、フラグメント 2 （201 bp; Phe115 - Ala181）、フラグメント 3 （120 bp; Trp203 - Ala242）、フラグメント 4 （117 bp; Ser255 - Arg293）、フラグメント 5 （303 bp; Pro320 - Thr420）、フラグメント 6 （312 bp; Ala423 - Val526）、フラグメント 7 （210 bp; Cys528 - Gln597）、フラグメント 8 （477 bp; Arg599 - Lys757）、フラグメント 9 （576 bp; Lys760 - Ile951）、フラグメント 10 （516 bp; Asn958 - Asp1129）。
【0080】
【0081】
【図23】ウエスタンブロッティングにより評価した、野生型hTERT、INVAC-1およびINVAC-1組換え(shuffled)誘導体のインビトロでの発現
【0082】
野生型hTERT、INVAC-1、pUTScramおよびpUTInvをHEK293T細胞に遺伝子導入した。タンパク質の発現は、遺伝子導入後18-96時間、観測した。（AおよびC）18hおよび72hの野生型hTERTおよびINVAC-1サンプルは、総タンパク質濃度のうち15μgを負荷した。これらのサンプルは、タンパク質発現のポジティブコントロールとして用いた。（A）Scrambledのおよび（C）Invertedのタンパク質は、各レーン当たり、細胞溶解液由来の総タンパク質のうち20μgを負荷した。hTERTは、抗hTERTウサギモノクローナル抗体（hTERT、INVAC-1）、および抗タグV5マウスモノクローナル抗体（Srambled、Inverted）で検出した。細胞を回収した時間は各レーンの上部に示した。β-アクチンタンパク質を、ローディングコントロールとして使用し、抗βアクチンマウスモノクローナル抗体で検出した。INVAC-1組換え(shuffled)誘導体の生産物の検出は、野生型hTERTおよびINVAC-1のタンパク質の検出よりも長い露光時間を必要とした（1秒未満に対して、10秒から30分）。
【0083】
組換え(shuffled)タンパク質のシグナル強度はウエスタンブロット上（AおよびC）のβ-アクチンシグナルによって、ImageJソフトウエアを用いて標準化した。（B）がScrambled、（D）がInvertedである。カーブプロファイル下の、エリアに対応する任意の数字を得るために、ローディングコントロールおよびタンパク質のバンドのプロファイルプロットを各レーンについて得た。割合（相対密度）は、各サンプルのエリアバリューを、対応するローディングコントロールのエリアバリューで割って計算する。
【0084】
【図24】TRAPアッセイにより評価した、hTERT、INVAC-1およびINVAC-1組換え(shuffled)誘導体のテロメラーゼ活性
【0085】
CrFK細胞に、野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）、pUTScramおよびpUTInv構築物を遺伝子導入した。24時間後に細胞を回収し、全細胞タンパク質を抽出し、テロメラーゼ（逆転写酵素）活性をテロメア反復増幅プロトコール（TRAP）アッセイで評価した。（AおよびBそれぞれにおいて）野生型hTERTおよび未処理のCrFK細胞と比較した組換え（shuffled）構築物の、吸光度測定値（OD450/690nm）および相対テロメラーゼ活性（RTA; サンプル/ポジティブコントロールの比）を示した（n＝3、総タンパク質濃度のうち2.1μg）。独立t検定を実施した。
【0086】
pUTScramおよびpUTInv構築物を遺伝子導入したCrFK細胞では、テロメラーゼ活性は検出されなかった。
【0087】
【図25】hTERT特異的CD8T細胞のインターフェロンγの分泌を誘発する、エレクトロポレーションを伴う、INVAC-1、pUTScramおよびpUTInvによるワクチン皮内投与の評価
【0088】
9〜15週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、100μgのINVAC-1、pUTScram、pUTInvまたは1×PBSによって、2回の免疫化サイクルで（プライムブーストレジメン）、皮内経路で免疫化した（グループ当たり3〜5匹のマウス）。各免疫化の直後に各ワクチン投与部位にエレクトロポレーションを行った。マウスの脾臓は、二回目の免疫化の10日後に回収した。
【0089】
脾細胞はフィコール精製し、IFN-γELIspotアッセイにおいて、HLA-B7MHC拘束性の3つのhTERT特異的ペプチド（p277、p351およびp1123）のプールによって、または、これらを含まない培地で、19時間刺激をトリプリケイトで実施した。ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。結果は脾細胞200,000個当たりのIFNγを分泌するhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値である。マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定を行った。＊:p値＜0.05。カットオフ値を、脾細胞200,000個個当たりの10スポットの位置に、応答するマウスの出現頻度を決定するために、自発的に設定した（破線）。
【0090】
【図26】ワクチン皮内投与およびエレクトロポレーション後にhTERT特異的細胞傷害性CD8T細胞を生産するpUTScramおよびpUTInvの能力
【0091】
15週齢の遺伝子導入HLA-B7マウスを、100μgのINVAC-1、pUTScram、pUTInvまたは1×PBSによって、皮内経路で免疫化した（グループ当たり4〜6匹のマウス）。全てのマウスは免疫化の直後に各ワクチン部位にエレクトロポレーションを行った。ワクチン投与の14日後に、HLA-B7 MHC拘束性のそれぞれのhTERTペプチド（p351またはp1123のいずれか）によってパルスされた、またはパルスされていない、同系の脾細胞を、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（CFSE）によって3つの異なる濃度：高濃度=5μM（351）、中濃度=2μM（1123）および低濃度=0.2μM（非パルス）で標識した。各濃度で標識した同じ数のCFSE標識細胞の混合物を、後眼窩の血管を通してワクチン投与したマウスに導入した。15-18時間後、ペプチドパルス細胞の消失を、フローサイトメトリーによって脾臓内で測定した。特異的溶解の割合は、コントロールマウスに対するワクチン投与したマウスでの、非パルス細胞に対するパルス細胞の割合を比較することで算出した。データは、各マウスの、皮内ワクチン投与後の脾臓内での各ペプチドに対する、特異的溶解の割合を表している。水平の線は、ペプチド当たりの溶解割合の中央値を示している。統計解析は、Prism5というソフトウエアで、ダンの補正を伴うノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定を用いて行った。p値＜0.05は、統計学的に有意であると考えた。
【0092】
【図27】INVAC-1の組換え(shuffled)誘導体構築物に使用される、Ubi-hTERTのコドン最適化配列の、免疫原性セグメントの図を示す。一段目はUbi-hTERT（配列番号45）のコドン最適化ヌクレオチド配列のコドンであり、二段目は対応するアミノ酸配列（配列番号46）である。Ubi-hTERT配列は、免疫原性の配列を含む10個のフラグメントに分割した。当該フラグメントは、記号（＜...＞）で描写されている。免疫原性の配列は灰色で強調されている。非免疫原性のフラグメント間のhTERT配列は、pUTScramおよびpUTInv構築物には含まれないが、下線を引いた。Ubi-hTERTのC末端配列の14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。注釈は配列の上部または下部に記載している。（＊）はVDD配列の欠失を示す。「□」：ストップコドン。
【0093】
【図28】pUTScramインサート（3555 bp）の完全なヌクレオチド配列を示す。ベクターの特徴は図20の説明文に詳述している。Ubi-hTERT組換え(shuffled)インサート（Scrambled、1184AA）はpUTScram の923の位置（メチオニンアミノ酸をコードするATG）で開始し4474の位置（スレオニンアミノ酸をコードするACT）で終止している。hTERTタンパク質は最初の23アミノ酸（1-23AA）を欠失し、ユビキチンポリペプチド（76AA）で置換されていた。触媒部位は、VDDをコードし（配列中の＊）野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT;特許WO2007/014740およびhTERTアイソフォーム1 アクセッション番号 NM_198253）の867-869AAに対応する、9bpの欠失により不活性化した。hTERT配列は10個の免疫原性フラグメントに分割し、次に挙げる特異的順序に再構成した：フラグメント 7 （210 bp）、フラグメント 2 （201 bp）、フラグメント 6 （312 bp）、フラグメント 4 （117 bp）、フラグメント 9 （576 bp）、フラグメント 3 （120 bp）、フラグメント 1 （258 bp）、フラグメント 8 （477 bp）、フラグメント 10 （516 bp）、フラグメント 5 （303 bp）。10個のフラグメントは、6xGlyリンカー（Gリンカー; 18 bp）で架橋されている。Ubi-hTERT組換え(shuffled)インサートのC末端配列の14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。一段目はヌクレオチド配列（配列番号47）であり、二段目は対応するアミノ酸配列（配列番号48）である。注釈（図20Aもまた参照）は配列の上部または下部に記載している。「□」：ストップコドン。
【0094】
【図29】pUTInvインサート（3555bp）の完全なヌクレオチド配列を示す。ベクターの特徴は図20の説明文に詳述している。Ubi-hTERTの組換え(shuffled)インサート（Inverted、1184AA）は、pUTInv の923の位置（メチオニンアミノ酸をコードするATG）で開始し、4474の位置（スレオニンアミノ酸をコードするACT）で終止している。hTERTタンパク質は最初の23アミノ酸（1-23AA）を欠失し、ユビキチンポリペプチド（76AA）で置換されていた。触媒部位は、「VDD」をコードし（配列中の＊）野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT;特許WO 2007/014740およびhTERTアイソフォーム1 アクセッション番号 NM_198253）の867-869AAに対応する、9bpの欠失により不活性化した。hTERT配列は10個の免疫原性フラグメントに分割し、次に挙げる特異的順序に再構成した：フラグメント 10 （516 bp）、フラグメント 9 （576 bp）、フラグメント 8 （477 bp）、フラグメント 7 （210 bp）、フラグメント 6 （312 bp）、フラグメント 5 （303 bp）、フラグメント 4 （117 bp）、フラグメント 3 （120 bp）、フラグメント 2 （201 bp）、フラグメント 1 （258 bp）。10個のフラグメントは、6xGlyリンカー（G リンカー; 18 bp）で架橋されている。Ubi-hTERT組換え(shuffled)インサートのC末端配列の14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている。一段目はヌクレオチド配列（配列番号49）であり、二段目は対応するアミノ酸配列（配列番号50）である。注釈（図20Bもまた参照）は配列の上部または下部に記載している。「□」：ストップコドン。
【発明を実施するための形態】
【0095】
［発明の詳細な説明］［定義］
テロメラーゼ複合体は、RNAテンプレートと、「テロメラーゼ逆転写酵素」（TERT）と呼ばれ、テロメラーゼ活性の主要な決定因子である逆転写酵素を含むタンパク質構成要素とから成る。特記されない限り、本明細書において、「テロメラーゼ」という用語はTERTを指し、野生型のヒトテロメラーゼ、またはその変異型を含む。野生型ヒトテロメラーゼ（すなわちhTERT）は知られており（GeneBank アクセッション番号 NM_198253）、配列番号2のアミノ酸配列を持つ（cDNAは配列番号1に記載）。
【0096】
「テロメラーゼ触媒活性」はTERTのテロメラーゼ逆転写酵素としての活性のことを指す。「テロメラーゼ触媒活性を欠く」は核酸が変異TERTをコードし、不活性であることを意味する。
【0097】
本発明において「変異体」という用語は、対立遺伝子の変異体、スプライシングの変異体、自然または人工の変異体を指し、参照するhTERT配列と相同である。二つのアミノ酸配列が「相同である」、「実質的に相同である」または「実質的に類似している」とは、一つ以上のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基によって置換されている、または、80％を超えるアミノ酸残基が同一である、または、約90％を超えるアミノ酸残基、好ましくは約95％を超えるアミノ酸残基が類似している（機能的に同一である）ことである。好ましくは、類似のまたは相同の配列は、例えばGCG（Genetics Computer Group、Program Manual for the GCG Package、Version 7、Madison、Wisconsin）集積プログラム、または当業界に知られたいずれかのプログラム（BLAST、FASTA、など）を用いた配列比較によって同定される。
【0098】
「置換される」または「修飾される」ことによって、本発明は天然のアミノ酸から改変または修飾されたアミノ酸を含む。
【0099】
変異体は野生型のhTERTタンパク質から、一つまたはいくつかの変異（すなわち、置換、欠失、挿入）によって、さらに好ましくは一つまたはいくつかの単一点置換によって変化した配列を持つタンパク質を含む。当該変異体は保存的置換を含んでもよい。
【0100】
本明細書で用いられる「保存的置換」という用語は、全体の高次構造およびペプチドの機能を変えることなく、他の残基によってアミノ酸残基が置換されることを含み、限定されないが、同じ特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族性などのような特性）を持つアミノ酸との置換を含む。同じ特性を持つアミノ酸は当業界ではよく知られている。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性の塩基性アミノ酸で、互換可能である。同様に、イソロイシンは疎水性アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換してもよい。中性の親水性アミノ酸は、相互に置換可能であり、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニンを含む。
【0101】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、天然の環境から取り出したポリヌクレオチドと定義される。例えば、生きている細菌のゲノムに、またはジーンバンクの一部として、存在している天然のDNA分子は単離されておらず、例えば、クローニングの結果として細菌ゲノムの残存部から分離した同DNA分子は単離されている。典型的に、単離されたDNA分子には、天然のゲノム内で、5’末端または3’末端に直ちに近接しているDNA領域（例えばコーディング領域）がない。単離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であってもよく、その場合も、当該ベクターまたは当該組成物はそのポリヌクレオチドの天然の環境の一部でないことから、単離されていると定義される。
【0102】
「免疫原性の」という用語は、言及される組成物または構築物が、投与によって免疫応答を誘発可能であることを意味する。対象者の「免疫応答」は、自然免疫応答および適応免疫応答の発生のことを指し、抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、または体液性免疫応答かつ細胞性免疫応答を含む。「体液性免疫応答」は、抗体が媒介する免疫応答である。「細胞性免疫応答」はTリンパ球が媒介する免疫応答である。細胞性免疫応答は、活性化したT細胞、白血球細胞、または両方が産生したサイトカイン、ケモカイン、および同様の分子の産生を含む。免疫応答は、標準的なイムノアッセイおよび体液性免疫応答を検出する中和アッセイを用いて測定でき、これらのアッセイは当業界では知られている。
【0103】
本発明の文脈において、免疫応答は好ましくは細胞傷害性CD8T細胞および／またはCD4T細胞の刺激または増殖を包含し、ELIspotアッセイのようなイムノアッセイ、インビボ細胞傷害性試験またはサイトカイン分泌結合アッセイを用いて測定できる。
【0104】
本明細書に記載の、「処置」または「治療」または「免疫療法」という用語は、症状の軽減、寛解および／または除去、減少および／または安定化（例えば、さらなる進行期に進んでいないこと）、並びに、腫瘍または異形成の、またはそれらの症状の進行の遅延のいずれをも指す。従って、当該用語は、癌患者で観察される有効な抗腫瘍免疫応答の達成を含む。
【0105】
本明細書に記載の、「予防」または「予防している」という用語は、前駆症状の軽減、寛解および／または除去、減少および／または安定化（例えば、さらなる進行期に進んでいないこと）を指す。前駆症状とは、特定の症状が生じる前に疾病の開始を示している可能性のある変化または初期症状（または一連の症状）のことである。
【0106】
「テロメラーゼを過剰発現している」細胞とは、通常の状態においては一般的にはテロメラーゼを発現しないが、例えば変異または感染、特にオンコウイルスによる感染により発現している対象者の細胞を指すか、あるいは、（例えば変異または感染により）通常の状態と比較して高レベルでテロメラーゼを発現している対象者の細胞を指す。好ましくは、テロメラーゼを過剰発現している細胞は、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、またはそれを超える発現量の増加を示す。
【0107】
「患者」または「対象者」は、典型的な哺乳動物対象者であり、好ましくはヒト対象者であって、あらゆる年齢、性別、または重症度のヒト対象者である。
【0108】
［核酸構築物］本明細書において、患者へのワクチン投与を可能にするようデザインされた核酸構築物が提供される。核酸構築物は、テロメラーゼ触媒活性を欠き（細胞の不死化活性を消失する）、かつ核小体局在化シグナルを欠く（核小体への移動が妨げられる）テロメラーゼをコードする。
【0109】
本発明の核酸構築物は単離された形状である。
【0110】
核酸構築物はDNAまたはRNAであってよいが、好ましくはDNAであり、さらに好ましくは二本鎖DNAである。
【0111】
核酸構築物は天然のゲノム核酸ではなく、特にイントロンは含まない。
【0112】
第一の安全ロックとして、hTERT配列はテロメラーゼ触媒活性を欠く。より好ましい態様として、hTERTをコードする配列はhTERTタンパク質の触媒活性を不活性化させる変異を含む。「変異」という用語は、一つまたはいくつかのアミノ酸の置換、一つまたはいくつかのアミノ酸の欠失、および／または一つまたはいくつかのアミノ酸の挿入を含む。特定の態様として、hTERTタンパク質は少なくとも1つのアミノ酸の欠失によってテロメラーゼ活性を欠く。
【0113】
好ましくは、配列は欠失を示し、図2Aに示したように、好ましくはアミノ酸VDDの欠失を示す。好ましくは、hTERTタンパク質はアミノ酸867-869（VDD）の唯一の欠失によってテロメラーゼ触媒活性を欠く。別の特定の態様として、hTERTタンパク質は、アミノ酸867-869（VDD）のさらに1〜10、11または12アミノ酸上流および／または下流のアミノ酸の欠失により、テロメラーゼ触媒活性を欠く。
【0114】
第二の安全ロックとして、hTERTをコードする配列はさらに核小体局在化シグナルを欠く。核小体局在化シグナルはhTERTの細胞内局在に関連し、従ってその酵素活性に関連している。好ましくは、hTERTタンパク質は、少なくともアミノ酸1-23の欠失によって、さらに好ましくはアミノ酸1-27の欠失によって、核小体局在化シグナルを欠く。
【0115】
第一のおよび第二の安全ロックを提供する修飾に加えて、本発明の核酸構築物によってコードされたhTERTタンパク質は、野生型hTERT配列、または変異した配列であってもよい。
【0116】
配列表において、配列番号1は、野生型hTERTのcDNAである;
配列番号2は、対応するアミノ酸配列である;
配列番号3は、INVAC-1ベクターで用いられるhTERTのcDNAである;
配列番号4は、対応するアミノ酸配列である；
配列番号5は、pUTD10Notベクターで用いられるhTERTのcDNAである;
配列番号6は、対応するアミノ酸配列である;
配列番号7は、pUTD10Cogベクターで用いられるhTERTのcDNAである;
配列番号8は、対応するアミノ酸配列である;
配列番号9は、pUTD23Tynベクターで用いられるhTERTのcDNAである;
配列番号10は、対応するアミノ酸配列である。
【0117】
好ましい態様として、本発明は配列番号4のタンパク質をコードする核酸を使用する。
【0118】
当該核酸は配列番号3の配列を含んでもよい。
【0119】
別の態様として、核酸構築物は配列番号6、8または10のアミノ酸配列をコードし、好ましくは、配列番号5、7または9をコードする。
【0120】
好ましい態様として、核酸はさらにhTERTタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進する（生成されたペプチドのクラスＩへの提示を増やす）タンパク質を含んでもよい。より具体的には、hTERTタンパク質は、hTERTタンパク質がプロテアソームにを向かうことを促進するタンパク質をN末端で融合してもよい。当該タンパク質は、好ましくはユビキチンであってよく、あるいは、例えばカルレティキュリンのようなシャペロンタンパク質であってもよい。
【0121】
配列表において配列番号 11は、INVAC-1がコードするUbi-hTERTを含むINVAC-1プラスミドの全長配列である;
配列番号 12は、INVAC-1がコードするUbi-hTERTに対応するアミノ酸配列である;
配列番号 13は、pUTD10NotインサートのcDNAである;
配列番号 14は、対応するアミノ酸配列である;
配列番号 15は、pUTD10CogインサートのcDNAである;
配列番号 16は、対応するアミノ酸配列である;
配列番号 17は、pUTD23TynインサートのcDNAである;
配列番号 18は、対応するアミノ酸配列である。
【0122】
特定の態様として、核酸構築物は配列番号12のアミノ酸配列をコードする。
【0123】
より具体的には、核酸構築物は配列番号11を含んでもよく、あるいは配列番号 11のヌクレオチド3488-6961を含んでもよい。
【0124】
別の態様として、核酸構築物は配列番号14、16、または18のアミノ酸配列をコードし、好ましくは配列番号13、15、または17を含む。
【0125】
別の態様として、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）由来の配列を含む核酸構築物を提供し、hTERT由来の当該配列は、i）全ての、または実質的に全てのhTERTのエピトープを任意の順序でコードする、および、
ii）テロメラーゼ触媒活性および核小体局在化シグナルを欠くタンパク質をコードする。
【0126】
本発明の核酸構築物は単離された形状である。
【0127】
核酸構築物はDNAまたはRNAであってよいが、好ましくはDNAであり、さらに好ましくは二本鎖DNAである。核酸構築物は天然のゲノム核酸ではなく、特にイントロンは含まない。
【0128】
本明細書を通して、核酸構築物は「組換え（shuffled）構築物」または「ポリエピトープ構築物」と呼ばれる。
【0129】
「hTERTのエピトープ」という用語は、hTERTの抗原決定基であるアミノ酸フラグメントを指し、すなわち免疫系の細胞によって認識され、免疫原性がある、すなわち免疫応答を誘発し得る。好ましくは、hTERTのエピトープは、抗hTERT T細胞によって特異的に認識され得る。いくつかの免疫原性のhTERTのエピトープ配列が述べられてきた。例えば、MHCクラスI拘束性のhTERTのエピトープについての国際特許出願WO07014740が参照される。他のいくつかの例は本明細書に記載されている（図27および以下の表参照）。
【0130】
「組換え（shuffled）構築物」は、hTERTに対する特異的な免疫応答、すなわち、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）が野生型エピトープを認識する免疫応答を誘発可能である。
【0131】
「組換え（shuffled）構築物」のいずれもhTERT全長をコードする配列と一致しない。
【0132】
「実質的に全てのエピトープ」という用語は、核酸構築物が、野生型hTERTのエピトープの少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらに好ましくは少なくとも90％、または少なくとも95％を含むタンパク質をコードしていることを意味する。
【0133】
複数のエピトープをコードするポリヌクレオチド単位は、任意の順序に、連続して再構成することができる。すなわち、最初のポリヌクレオチド単位の3’末端を、二番目のポリヌクレオチド単位の5’末端（など）に直接連結させると、結果として連結したエピトープのみから成るペプチド配列をコードするポリヌクレオチドが生じる。あるいは、複数のエピトープは一アミノ酸のスペーサーまたはペプチドのスペーサーで分けることができる。すなわち、複数のポリヌクレオチド単位を、一つまたは複数のアミノ酸をそれぞれコードする一つまたは複数のコドンで分けることを意味する。典型的に、免疫原性のhTERTフラグメントは約4〜6のGlyアミノ酸で分けることができる。
【0134】
エピトープが再構成される順序は、次の判断基準に従い当業者が決定することができる：いくつかの順序は、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を促進することができ、あるいは、特に三次元コンフォメーションがポリペプチドの特性に影響を与えるならば、小胞体（ER）内で結果として発現したポリペプチドの輸送を促進することができる。またいくつかの順序は、いくつかのエピトープまたはアナログにおけるポリペプチドのプロセシングを促進し、重複するエピトープのプロセシングを回避することができる。
【0135】
好ましい態様として、hTERTのアミノ酸24-1132の全ての、または実質的に全ての免疫原性のエピトープが、任意の順序でではあるが、核酸構築物にコードされる。
【0136】
下記の表は、「組換え（Shuffle）」構築物において再配列可能な免疫原性の配列を示す：
【0137】
【0138】
【0139】
従って、本発明は、ポリエピトープの核酸構築物であって、配列番号61-97の全ての、または実質的に全ての免疫原性の配列を任意の順序で含む核酸構築物を提供する。
【0140】
配列は、テロメラーゼ触媒活性を欠く。好ましい態様として、hTERT触媒活性を持つフラグメントが、触媒活性を不活性化させる変異を含む。「変異」という用語は、一つまたはいくつかのアミノ酸の置換、一つまたはいくつかのアミノ酸の欠失、および／または一つまたはいくつかのアミノ酸の挿入を含む。特定の態様として、タンパク質は少なくとも1つのアミノ酸の欠失によってテロメラーゼ触媒活性を欠く。
【0141】
好ましくは、配列は欠失、好ましくは図22に表したようなアミノ酸VDDの欠失を示す。好ましくは、hTERTタンパク質はアミノ酸867-869（VDD）のみの欠失によって、テロメラーゼ逆転写酵素活性を欠く。別の特定の態様として、hTERTのアミノ酸867-869（VDD）の1〜10、11または12アミノ酸上流および／または下流のアミノ酸のさらなる欠失によって、タンパク質はテロメラーゼ触媒活性を欠く。
【0142】
配列はさらに、核小体局在化シグナルを欠く。核小体局在化シグナルは、hTERTの細胞内局在に関連し、従ってhTERTの酵素活性に関連している。好ましくは、タンパク質は、少なくともアミノ酸1-23の欠失によって、さらに好ましくはアミノ酸1-47の欠失によって、核小体局在化シグナルを欠く。
【0143】
好ましい態様として、核酸はさらにタンパク質がプロテアソームに向かうことを促進する（生成されるペプチドのクラスＩへの提示を増やす）タンパク質をコードしてもよい。より具体的には、タンパク質は、タンパク質がプロテアソームに向かうことを促進するタンパク質とN末端で融合してもよい。タンパク質は、好ましくはユビキチンであってよく、あるいは、例えばカルレティキュリンのようなシャペロンタンパク質であってもよい。
【0144】
ΔhTERTは、VDDである867-869アミノ酸を欠失させたhTERTを指す。
【0145】
特定の核酸構築物は、任意の順序で、ΔhTERTのLeu24-Gly109をコードするフラグメント1（配列番号51）、ΔhTERTのPhe115-Ala181をコードするフラグメント2（配列番号52）、ΔhTERTのTrp203-Ala242をコードするフラグメント3（配列番号53）、ΔhTERTのSer255toArg293をコードするフラグメント4（配列番号54）、ΔhTERTのPro320-Thr420をコードするフラグメント5（配列番号55）、ΔhTERTのAla423-Val526をコードするフラグメント6（配列番号56）、ΔhTERTのCys528-Gln597をコードするフラグメント7（配列番号57）、ΔhTERTのArg599-Lys757をコードするフラグメント8（配列番号58）、ΔhTERTのLys760-Ile95をコードするフラグメント9（配列番号59）、ΔhTERTのAsn958-Asp1129をコードするフラグメント10（配列番号60）を含む。
【0146】
好ましい構築物は、配列番号48を含み（本明細書では「Scrambled」とも呼ぶ）、また図28に示す。
【0147】
別の好ましい構築物は配列番号50を含み（本明細書では「Inverted」とも呼ぶ）、また図29に示す。
【0148】
［遺伝子構築物、免疫原性組成物、および投与］好ましくは、核酸は本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子、および宿主細胞または宿主生物でのタンパク質生産物の発現（例えば、転写および翻訳）を可能にする制御配列（例えば、適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を含む遺伝子構築物である。
【0149】
本発明の遺伝子構築物は、DNAまたはRNAであってもよく、好ましくは二本鎖DNAである。本発明の遺伝子構築物はまた、対象となる宿主細胞または宿主生物の形質転換に適した形式であってもよく、対象となる宿主細胞のゲノムDNAへの組込みに適した形式であってもよく、あるいは対象となる宿主生物内での独立した複製、維持および／または遺伝に適した形式であってもよい。例えば、本発明の遺伝子構築物はベクターの形式であってもよく、例えば、プラスミド、コスミド、YAC、ウイルスベクターまたはトランスポゾンのようなベクターであってもよい。特に、ベクターは発現ベクター、すなわちインビトロおよび／またはインビボでの（例えば、適切な宿主細胞、宿主生物および／または発現システムでの）発現に備えることが可能なベクターであってもよい。
【0150】
好ましいが限定されない局面として、本発明の遺伝子構築物は、i）本発明の少なくとも1つの核酸を含み、ii）例えばプロモーターや場合によっては適切なターミネーターのような、1つ以上の制御因子、および場合によっては、iii）例えば3’または5’UTR配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、および／または形質転換または組込み（の効率）を促進するまたは増加させる配列のような遺伝子構築物の一つ以上のさらなる配列ともまた、作動可能に連結される。
【0151】
特定の態様として、遺伝子構築物は、制限エンドヌクレアーゼで核酸ポリマーを切断し、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（RSV）プロモーターのようなプロモーターを含むプラスミドにクローニングすることによって作成可能である。好ましい態様として、TERT核酸配列をNTC8685-eRNA41H発現プラスミド（図1A参照）に挿入する。
【0152】
他のベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびアデノウイルス関連ベクターが含まれる。
【0153】
当該核酸、またはベクターを含んだ組成物が、作成可能である。組成物は免疫原性である。組成物は、ヒトまたは哺乳動物への投与に適した（すなわち、無毒性の、および必要であれば無菌の）担体または賦形剤を含むことができる。賦形剤は、薬の賦形剤、等張化剤、安定化剤またはアジュバントとして働く、液体、半固体、または固体の希釈剤を含む。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。等張剤は、その中でも、食塩、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。安定化剤は、その中でも、アルブミンを含むことができる。当業界で知られるアジュバントはいずれもワクチン組成物に用いてよく、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバントのような油性アジュバント、ミコレート性アジュバント、細菌リポ多糖（LPS）、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、アルミニウムヒドロキサイド、サポニン、DEAE-デキストラン、中性油（suchasmiglyol）、植物油（例えば落花生油）、プルロニック（登録商標）ポリオールを含む。
【0154】
核酸または組成物は、直接投与することが可能であり、または、投与前にリポソームに封入、あるいはコロイド金粒子上にコーティングすることができる。DNAワクチンをリポソームに封入する技術は当業界でよく知られており、例えばMurray、1991の例がある。同様に、ネイキッドDNAをコロイド金粒子上にコーティングする技術はYang、1992に記載されており、ウイルスベクターを使ったタンパク質発現の技術はAdolph、1996で見出されている。
【0155】
遺伝子免疫において、ワクチン組成物は、好ましくは、腫瘍またはどのタイプのリンパ器官にも、注射またはガス駆動微粒子銃によって皮内、皮下、筋肉内投与され、宿主生物の免疫応答を刺激するのに有効な量が運ばれる。本発明の好ましい態様として、投与は、注射のステップに加えて、本出願では「電気導入（electrotransfer）」とも呼ばれるエレクトロポレーションのステップを含む（Mir2008、SardesaiandWeiner2011に記載されているように）。
【0156】
組成物はまた、リポソーム遺伝子導入、微粒子銃またはウイルスによる形質導入（共培養技術を含む）を用いてリンパ系細胞または骨髄性細胞にエクスビボ（ex vivo）で投与してもよい。その後、処理した細胞を、対象者に再導入し、免疫化する。
【0157】
必要とする量は各構築物の免疫原性に依存し、事前に予測不可能であることは理解されるであろうが、与えられたいずれの構築物も適切な投与量を決定する過程は単純である。具体的には、徐々に増加する一連の投与量、例えば、約5-30μgで開始、あるいは好ましくは20-25μgで開始し、約500μg-約5mgまで、好ましくは500-1500μg、500-1200μg、または500-1000μgまでが、対応する種に投与され、結果として生じる免疫応答を、例えばIFNγELIspotアッセイ（実施例の項目に記載）による細胞免疫応答の検出、インビボ溶解アッセイまたはクロム放出アッセイを用いるCTL応答の検出、あるいはサイトカイン放出アッセイを用いるTh（ヘルパーT細胞）応答の検出によって観察する。
【0158】
好ましい態様として、ワクチン接種レジメンは1〜3回の注射を含み、好ましくは3週間または4週間後に繰り返される。
【0159】
特定の態様として、ワクチン接種のスケジュールは1回または2回の注射を含み、3週間または4週間後に3〜5回の注射を少なくとも1サイクル行う。
【0160】
別の態様として、最初の投与は1〜3回の注射から成り、例えば、少なくとも毎年1回、または二年に1回、または数年に1回の追加投与を行う。
【0161】
これらの態様は一例に過ぎず、他のいずれのワクチンレジメンも本明細書に包含される。
【0162】
［腫瘍の予防または処置］上述の核酸または免疫原性の組成物は、患者の腫瘍を予防または処置する方法において有用である。
【0163】
患者の腫瘍を予防または処置する方法が記載され、本法は患者が必要とする核酸または免疫原性の組成物の有効量を投与することを含む。核酸または免疫原性の組成物は患者の免疫応答を誘発するのに十分な量投与される。
【0164】
腫瘍は、細胞の望まれないいかなる増殖であってよく、特に良性腫瘍または悪性腫瘍であってよく、特に癌であってもよい。
【0165】
癌は、転移ステージを含むいかなる進行ステージにあってよい。癌は、慢性または非慢性（急性）であってもよい。
【0166】
特定の態様として、腫瘍は固形癌または癌腫である。例として、黒色腫、神経膠芽腫のような脳腫瘍、神経芽腫および星状細胞腫、および膀胱、乳、子宮頸部、大腸、肺の癌腫を含み、特に非小細胞肺癌（NSCLC）、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、または胃癌を含む。
【0167】
別の態様として、腫瘍は液性腫瘍であってよく、例えば、造血器腫瘍であってよく、すなわち慢性または急性リンパ性白血病、慢性あるいは急性骨髄性白血病のような白血病、または、ホジキン病、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫を含むリンパ腫であってよい。
【0168】
特定の態様として、本発明に従った処置は、化学療法、放射線療法、または手術を含む既存療法と組み合わせてもよい。GM-CSF、またはIL-2あるいはIL-12のようなサイトカインを例とする免疫調節性分子のアジュバントとの組み合わせもまた有用であり得る。
【0169】
図および実施例は、本発明の範囲を限定することなく説明するものである。
【実施例】
【0170】
［実施例１］［略号］
AA:アミノ酸、APC:抗原提示細胞、bp:塩基対、CTL:細胞傷害性Tリンパ球、CMV:サイトメガロウイルス、DNA:デオキシリボ核酸、EP:エレクトロポレーション、HTLV-1:ヒトT-リンパ好性ウイルスI、hTERT:ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ID:皮内、IM:筋肉内、IV:静脈内、LTRs:末梢反復配列、NoLS:核小体局在化配列、PBMC:末梢血単核球、RIG-I:レチノイン酸誘発遺伝子-I、RNA:リボ核酸、RT:室温、RTA:相対テロメラーゼ活性、SC:皮下、TRAP:テロメア反復増幅プロトコール、TERT:テロメラーゼ逆転写酵素、Ubi:ユビキチン、VDD:バリン-アスパラギン酸-アスパラギン酸
【0171】
［材料および方法］［プラスミドDNAベクター］
［INVAC-1］
INVAC-1は7120bpのプラスミド発現ベクターであり、127.4kDaのタンパク質に対応する、1158AA（Ubi-hTERT）のヒトユビキチン−テロメラーゼ融合構築物をコードしている（図1Aおよび16）。INVAC-1はヒトでの使用を意図されているため、テロメラーゼ逆転写酵素の酵素活性は安全上の理由から不活性化されている。実際に、INVAC-1がコードするヒトTERT配列は、3つのアミノ酸、バリン-アスパラギン酸-アスパラギン酸（867-869AA）をコードする9bpの欠失によって触媒部位が改変されている（図2A）。加えて、テロメラーゼの細胞内局在化に必要な核小体局在化配列（NoLS）（Yang、2002）を含む、タンパクのN末端部位の47AAは、ユビキチン（Ubi）コード配列（1-76AA）によって置換されている。
【0172】
Ubi-hTERT導入遺伝子は、細菌で高生産され、哺乳類細胞で高発現し、結果として効果的な免疫応答を得るように注意深く設計された合成遺伝子と結合している、NTC確認ベクター主鎖（Nature Technology Corporation、Lincoln、Nebraska）に挿入される。
【0173】
ターゲット遺伝子の発現は、最適化されたキメラプロモーター-イントロン（SV40-CMV-HTLV-1R合成イントロン）から開始される。SV40-CMV-HTLV-1R合成イントロンは、CMVプロモーター、エクソン１の開始部、HTLV-1Rから成り、HTLV-1Rは、5’スプライス受容部位、ウサギβ-グロブリンイントロンに基づいた合成3’受容部位、RNA輸送を改善するためのセリン-アルギニン（SR）タンパク質結合部位を含むエクソン2スプライシングエンハンサー（Lavigueur et al.、1993）、および目的遺伝子のスタートコドンの上流にあるエクソン2コザック配列を含む。ストップコドンとターミネーターの間のDNAは、潜在的なペプチド発現または意図されないマイクロRNAによる発現変化の可能性を減らすために限定されている。
【0174】
細胞の免疫応答を改善するため、ベクターは、RNAポリメラーゼIIIによって転写された、自然免疫応答のアクティベーターであるレチノイン酸誘発遺伝子-I（RIG-I）の二本鎖RNAアゴニストをコードする。
【0175】
当該ベクターに関連する病原性は知られていない。当該プラスミドは真核生物の標的細胞で複製されない。ベクターの主鎖自体はタンパク質コード配列を含まず、また他のタンパク質をコードする翻訳領域はベクター主鎖には確認されない。従って、抗生物質耐性遺伝子はない。プラスミド選抜は、抗生物質フリーのスクロース選択マーカーという手法によって実施する（RNA-OUT）。
【0176】
［遺伝子合成およびクローニング］Ubi-hTERT遺伝子は、重複する40塩基長のオリゴヌクレオチドアセンブリープロセス（GeneCust、Luxembourg）によって新規合成した。制限酵素部位を削除し、GCリッチ配列を弱めるために、いくつかの保守的な塩基改変を行った。インサートは、HindIII-XbaIクローニングサイトを用いて発現ベクターpcDNA3.1（＋）（Invitrogen、Carlsbad、USA）にクローニングし、配列決定により確認した。
【0177】
［Ubi-hTERTのクローニングベクターNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaIへのサブクローニング］ユビキチン-テロメラーゼインサートを、NTCによって作成されたNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI発現ベクターに導入した。しかし、最適なベクターNTC8685-eRNA41H（NTC-DV8685-41HLV参照）はUbi-hTERTインサートと適合する制限酵素サイトを持っていなかった。従って、当該ベクターをSalIおよびBglIIで切断し、Ubi-hTERTをサブクローニングするのに適切な制限酵素サイト、すなわちHindIII-XbaIを含む合成二本鎖オリゴヌクレオチドを連結させた:
SalI 「HindIII」 SmaI 「XbaI」 BglII
ＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴ（配列番号23）
【0178】
上述のポリリンカーを含む新しいベクター（NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI）は、制限酵素による切断、およびポリリンカー部位の上流と下流の配列にそれぞれアニーリングするpVAC5’（GCTTTTCTGCCAGGTGCTGA配列番号24）プライマーとpVAC3’（GCCAGAAGTCAGATGCTCAA配列番号25）プライマーとを用いた配列決定によって確認した。
【0179】
オーダーメイドのNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaIベクターを、HindIIIおよびXbaIで切断し、3631bpのベクターを12bpリンカーからゲル精製で分けた。pcDNA3.1-Ubi-hTERT構築物をHindIIIおよびXbaIで切断し、3489bpのUbi-hTERTインサートを、連結によってNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaIアクセプターへ導入し、NTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT（INVAC-1）を作成した（図1A）。ライゲーションによる生産物は、抗生物質フリー選抜の宿主NTC4862（DH5α attλ::P5/6 6/6-RNA-IN-SacB、catR）（NTC-DVU-CC1参照）に形質転換した。結果として得られたベクターは、制限酵素による切断：BglII/NotI=3496、3262、220、142bpバンド;NcoI=4084、3036bpバンド;HindIII/XbaI=3631、3489bpバンドによって確認した（図1B）。またUbi-hTERTの終端はpVAC5’およびpVAC3’プライマーを用いたDNA配列決定によって確認した。ヌクレオチドの変化は確認されなかった。
【0180】
［プラスミド製造］INVAC-1は、研究グレードの品質条件下で、NTCによって最初に作られた。プラスミドDNAは、NTC4862大腸菌（E.coli）細胞に、エレクトロポレーションを用いて形質転換した。細胞は、製造業者によって推奨された通り（NTC Instruction Manual、June2011）、6％スクロース培地に蒔き、培養した。抽出後、プラスミドDNAはエンドトキシンフリーの1×PBSに終濃度2mg/mlで再懸濁した。
【0181】
INVAC-1はその後、GLPおよびGMPスケールアップのため、またGMP製造のために、Eurogentec（ベルギー）によって製造された。INVAC-1プラスミド全長の配列決定は、この時点で実施した。
【0182】
［INVAC-1誘導体］全てのINVAC-1誘導体構築物は、約8.9kbの二本鎖DNAプラスミドで、酵素機能が不活性化したヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質をコードしている（図2A）。Ubi-hTERT導入遺伝子は、哺乳類の細胞で高レベルに安定かつ一過的な発現をするように作成された、pcDNA3.0由来のInvitrogen pcDNA3.1（＋）ベクター（5.4kb）に導入した。当該ベクターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期（CMV-IE）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（BHG-polyA）を、終止配列として含む。
【0183】
［pUTD10Not（Δ10Notと略す）］hTERTコード配列は、pcDNA3.1プラスミド主鎖のヌクレオチド923-4492bpに位置する。pUTD10Notは、分子量約130.8kDaに相当する1189AAヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Δ10Not）をコードしている（図2A）。hTERTは、最初の23アミノ酸（1-23AA）を、ユビキチンポリペプチド（76AA）によって置換することで欠失させた。触媒部位のドメインでは、野生型hTERT（アクセッション番号NM_198253）のAA860-869（DGLLLRL「VDD」_配列番号21）に対応するアミノ酸912-913（＊マーク;図17）の間にさらなる欠失を導入した。この10アミノ酸の欠失は、hTERTの酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）、およびVDD配列の7AA上流のさらなる欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている（図2A）。
【0184】
［pUTD10Cog（Δ10Cogと略す）］hTERTコード配列は、pcDNA3.1プラスミド主鎖のヌクレオチド923-4492bpに位置する。pUTD10Cogは、分子量約130.8kDaに相当する1189AAヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Δ10Cog）をコードしている（図2A）。hTERTは、最初の23アミノ酸（1-23AA）を、ユビキチンポリペプチド（76AA）によって置換することで欠失させた。触媒部位のドメインでは、野生型hTERT（アクセッション番号NM_198253）のAA867-876（「VDD」FLLVTPH_配列番号22）に対応するアミノ酸919-920（＊マーク;図18）の間にさらなる欠失を導入した。この10アミノ酸の欠失は、hTERTの酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）、およびVDD配列の7AA下流のさらなる欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている（図2A）。
【0185】
［pUTD23Tyn（Δ23と略す）］hTERTコード配列は、pcDNA3.1プラスミド主鎖のヌクレオチド923-4453bpに位置する。pUTD23Tynは、分子量約129.4kDaに相当する1189AAヒトユビキチン−テロメラーゼ融合タンパク質（Δ23）をコードしている（図2A）。hTERTは、最初の23アミノ酸（1-23AA）を、ユビキチンポリペプチド（76AA）によって置換することで欠失させた。触媒部位のドメインでは、野生型hTERT（アクセッション番号NM_198253）のAA857-879（IRRDGLLLRL「VDD」FLLVTPHLTH_配列番号26）に対応するアミノ酸909-910（＊マーク;図19）の間にさらなる欠失を導入した。この23アミノ酸の欠失は、hTERTの酵素活性の不活性化をもたらす3AAの欠失（ΔVDD）、およびVDD配列の10AA上流および10AA下流のさらなる欠失を含む。Ubi-hTERTのC末端配列にある14アミノ酸はV5エピトープタグをコードしている（図2A）。
【0186】
［遺伝子合成およびクローニング］遺伝子は、重複する40塩基長のオリゴヌクレオチドアセンブリープロセス（GeneCust、Luxembourg）によって、ユビキチン−テロメラーゼ融合構築物として新規合成した。遺伝子合成は、特有の隣接する制限酵素サイトHindIII/XbaIを含み、望ましい発現システムへの遺伝子のサブクローニングを可能にした。合成遺伝子は、pcDNA3.1（＋）発現ベクター（Invitrogen、Carlsbad、USA）の制限酵素部位HindIIIとXbaIの間にクローニングした。プラスミドの配列は、PEGFP-N5’CGGTGGGAGGTCTATATAAG（配列番号27）およびBGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC（配列番号28）プライマーを用いた配列決定によって確認した。
【0187】
［プラスミド製造］全てのINVAC-1誘導体は、RD Biotech（Besancon、France）によって、大腸菌（E.coli）5-アルファ細胞（fhuA2Δ（argF-lacZ）U169 phoA glnV44 Φ80Δ（lacZ）M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17）（Lucigen Corporation、Middleton、USA、60602-2参照）に形質転換され、製造された。無菌の1×PBSに再懸濁した、濃縮されたエンドトキシンフリーギガプレッププラスミドストック（2mg/mL）を調製した。ベクターは、制限酵素マッピングによって確認した（HindIII-XbaI;図2B）。
【0188】
［pTRIP-CMV-hTERT］pTRIP-CMV-hTERTは、1232AA（約124.5kDaに相当する）の触媒活性を持つ野生型ヒトｔTERT（hTERT）タンパク質をコードする。当該プラスミドは、インビトロアッセイのポジティブコントロールとして使用した。構築物は特許出願WO2007/014740に最初に記載された。pTRIP-CMV-hTERTは、初めに、pBABE-hygro-hTERTプラスミド（Dr.Robert Weinbergのご厚意で譲渡された）由来のEcoRI-SalIhTERTインサートをpSP73ベクター（Promega Life Science、Wisconsin、USA）にサブクローニングして、pSPhTERT構築物を作成することで構築した。その後、BglII-SalIフラグメントをBamHIおよびXhoIで切断したレトロウイルス由来のpTRIP-CMVベクターに挿入し、pTRIP-CMV-hTERTを作成した。hTERTの発現は、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって開始される。
【0189】
pTRIP-CMV-hTERTプラスミドは、RD Biotech（Besancon、France）によって、大腸菌（E.coli）5-アルファ細胞（fhuA2Δ（argF-lacZ）U169 phoA glnV44 Φ80 Δ（lacZ）M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17）（Lucigen Corporation、Middleton、USA、60602-2参照）に形質転換され、製造された。
【0190】
2mg/mlの、無菌の1×PBSに再懸濁した、濃縮されたエンドトキシンフリーギガプレッププラスミドストックを調製した。製造したベクターは、制限酵素による切断によって確認した（EcoRI+BamHI=10286+2720+886bpバンド）。
【0191】
［pNTC-hTERT］pNTC-hTERTは、触媒活性を持つ1132AA野生型ヒトTERT（hTERT）タンパク質をコードする（配列番号2）。当該プラスミドは、hTERT特異的なインビボでのT細胞応答の幅を、INVAC-1構築物と比較して調査するために使用した。
【0192】
野生型hTERTインサートは、重複するオリゴヌクレオチドアセンブリープロセス（GenScript、USA）によって、HindIII-XbaIクローニングサイトを新規合成した。合成構築物（3417bp）はHindIIIおよびXbaIサイトによってpUC57（2710bp）にクローニングされ、その後M13/pUC（−20）およびM13/pUC（−26）プライマーを用いた配列決定と制限酵素マッピング（HindIII/XbaI）とによって、確認した。従って、hTERTインサートは、NTCによって、上述したクローニングベクターNTC8685-eRNA41H-HindIII-Xba（INVAC-1構築物参照）にサブクローニングした。結果として得られたベクターpNTC-hTERTは、制限酵素による切断（XmaI=4375、2041、506、120bpバンド;BamHI/XmnI=6887、155bpバンド;HindIII/XbaI=3631、3411bpバンド）、およびpVAC5’、pVAC3’およびhTERTseq（5’GGCAAGTCCTACGTCCAGTG3’、配列番号44）プライマーを用いたDNA配列決定によって確認した。
【0193】
pNTC-hTERTプラスミドは、INVAC-1プラスミドで前述した研究グレードの品質条件下で、NTCによって製造された。
【0194】
［pNTC-hTERT-ΔVDD］pNTC-hTERT-ΔVDDは、バリン-アスパラギン酸-アスパラギン酸をコードする9bpを欠失（ΔVDD;867-869AA）することによって触媒部位を改変した1129AAヒトTERT（hTERT）配列をコードする。当該プラスミドは、hTERT特異的なインビボでのT細胞応答の幅を、INVAC-1構築物と比較して調査するために使用した。
【0195】
hTERT-ΔVDD DNA配列は、3アミノ酸の欠失（ΔVDD）を除いて、野生型hTERTと同一である。hTERTの152bpのBamHI/XmnIフラグメントを含み、ΔVDD欠失およびEcoRV制限酵素サイトの付加を伴う167bpのDNAインサートは、GenScriptによって新規合成された。合成フラグメントは、EcoRVクローニングサイトを用いてpUC57ベクター（2710bp）にクローニングした。合成遺伝子は、M13/pUC（−20）およびM13/pUC（−26）プライマーを用いた配列決定および制限酵素による切断（BamHI/NdeI）によって確認した。当該ベクターは、その後BamHI/XmnIサイトを用いて切断され、ΔVDD-BamHI/XmnIフラグメントは、事前にBamHI/XmnIで切断したpNTC-hTERTベクターのhTERT領域（6887、155bpバンド）に、クローニングした。結果として得られたベクターpNTC-hTERT-ΔVDDは、制限酵素による切断（XmaI=4375、2032、506、120bpバンド;BamHI/XmnI=6887、146bpバンド;HindIII/XbaI=3631、3402bpバンド）と、pVAC5’、pVAC3’およびhTERTseq（5’GGCAAGTCCTACGTCCAGTG3’配列番号44）プライマーを使ったDNA配列決定によって、確認した。
【0196】
pNTC-hTERT-ΔVDDは、INVAC-1およびpNTC-hTERT構築物を作成した前述の方法で、NTCによって製造した。
【0197】
［ウエスタンブロットおよびTRAPアッセイのための、細胞培養および一過性形質転換］CrFK細胞（クランデルリース（Crandell Rees）ネコ腎細胞）、HEK293T細胞（ヒト胚性腎細胞）およびHeLa細胞（ヘンリエッタラックスヒト子宮頸部腺癌細胞）は、10％熱失活ウシ胎児血清（PAA、Velizy-Villacoublay、France）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies、Saint-Aubin、France）を追加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）で培養した。
【0198】
QT6（ニホンウズラ線維肉腫）細胞株は、10％熱失活ウシ胎児血清（PAA）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies）、1％トリ血清（PAA）、10mML-グルタミン（Sigma-Aldrich、St.Louis、USA）、0.5％トリプトースブロス（Sigma-Aldrich、St.Louis、USA）を追加したハムF10培地（Eurobio、Courtaboeuf、France）で培養した。
【0199】
細胞は、5％二酸化炭素を含む加湿した37℃の環境で、75cm2フラスコで、単層培養した。細胞は、遺伝子導入当日までに70-80％コンフルエンスまで増殖させた。ウエスタンブロットアッセイのために、5×105の細胞を6穴組織培養プレートに播種し、24時間培養した。TRAPアッセイのために、7×105細胞を6穴組織培養プレートに播種し、24時間培養した。
【0200】
INVAC-1およびINVAC-1誘導体構築物は、製造者（Polyplus-transfection Inc.、France）の説明書に従い、jetPrimeカチオン重合遺伝子導入試薬を用いて、標的細胞に遺伝子導入した。pTRIP-CMV-hTERTプラスミドが遺伝子導入された細胞は、ポジティブコントロールとして使用し、非遺伝子導入細胞またはpNTC8685-eRNA41Hエンプティープラスミド遺伝子導入細胞は、ネガティブコントロールとして使用した。遺伝子導入培地は4時間後に除去し、2mlのDMEM培養培地で置換した。適切な時間、すなわちウエスタンブロットアッセイのためには18-96時間、TRAPアッセイのためには24時間、遺伝子導入した後、細胞を回収して、テロメラーゼの発現および活性を解析した。
【0201】
［ウエスタンブロット］ウエスタンブロット解析のため、遺伝子導入したCrFKおよびHEK293T細胞は、プロテアーゼ阻害剤混合物（Roche Diagnostic、Indianapolis、USA）を追加したRIPAバッファー（Sigma-Aldrich、St.Louis、USA）で、10-20分氷上にて溶解した。溶解液は14,000rpmで15分、4℃にて遠心分離することによって清澄にした。上清を回収し、ブラッドフォード比色法を用いて、タンパク質濃度を測定した。タンパク質サンプルを95℃で5分変性させ、Nu-PAGE（登録商標）Novex4-12％Bis-Trisゲル（Invitrogen、Carlsbad、USA）で分離し、iBlot（登録商標）装置（Invitrogen、Carlsbad、USA）を使ってPVDF膜（iBlot（登録商標）transfer stack、Invitrogen、Carlsbad、USA）にエレクトロブロットした。Novex（登録商標）Sharp Prestained Protein Ladder （Invitrogen、Carlsbad、USA）を、分子量決定のために使用した。PVDF膜は約60kDaで切断し、1×PBS、0.05％Tween（登録商標）20、3％ミルクでブロックした。PVDF膜の上部は、ブロッキングバッファーで1/2000に希釈した抗hTERTウサギモノクローナル抗体（Abcam、Cambridge、UK）、または1/5000に希釈した抗V5マウスモノクローナル抗体（Invitrogen、Carlsbad、USA）で探索した。PVDF膜の下部は、1/5000に希釈した抗-β-アクチンマウスモノクローナル抗体（Sigma Aldrich SARL、Saint-Quentin Fallavier、France）で探索した。最後に関連タンパク質を、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合型二次抗体、すなわち1/5000に希釈した抗マウスHRP結合抗体（GE Healthcare、Velizy、France）またはブロッキングバッファーで1/1000に希釈した抗ウサギHRP結合抗体（GE Healthcare、Velizy、France）で室温にて1時間染色することにより、可視化した。免疫ブロットシグナルは、ECL HRP化学発光基質試薬キットを用いた高感度化学発光アッセイによって検出した。フィルムおよび対応するカセットは、GE Healthcare（Buckinghamshire、UK）から購入した。
【0202】
［TRAPアッセイ］テロメラーゼ活性は、製造者の説明書に従い、TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS kit（Roche Diagnostic GmbH Mannheim、Germany）を用いるテロメア反復増幅プロトコル（TRAP）の手法（Kim et al.1994）を用いて評価した。上述したように遺伝子導入後24時間後に、CrFK細胞を回収した。細胞は1×PBSで洗浄した後、1600rpmで5分、4℃にて遠心分離した。細胞は、0.2mlの溶解バッファーに再懸濁し、氷上で30分間培養した。溶解液は14,000rpmで20分、4-8℃にて遠心分離することによって清澄にした。上清を回収し、ブラッドフォード比色法を用いて、タンパク質濃度を測定した。上清はテロメラーゼが媒介するテロメア配列の伸長に使用し、伸長産物を、ビオチン化プライマーを使用したPCRによって増幅した。各細胞上清はTRAPアッセイを行う前に、事前に二つに分割した。一方は、85℃10分のテロメラーゼの熱失活によってネガティブコントロールを調製するために使用し、他方は、テロメラーゼが媒介するテロメア配列の伸長を評価するために使用した。さらに、反応混合液中に存在する216bpの長さの内部標準を、溶解液中に存在するであろうTaqDNA-ポリメラーゼ阻害剤による偽陰性の結果を排除するために、同時に増幅した。溶解バッファーをネガティブコントロールとして使用した。全ての反応混合液を25℃で20分加温した後、94℃で5分加温した。テロメラーゼ産物はPCRにより、94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒、72℃10分を30サイクル、最後に72℃10分および4℃保持を1サイクル行い、増幅した。
【0203】
PCR増幅産物2.5μlを、キットで提供された変性剤と室温で10分保温した。保温後、各ウェルに100μlのハイブリダイゼーションバッファーを加えた。各溶液を混合し、100μlを、ストレプトアビジンを塗布したマイクロプレートに移し、ゆっくり攪拌（300rpm）しながら37℃で2時間加温した。その後、各ウェルを洗浄バッファーで洗浄し、抗-ジゴキシゲニン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合抗体（1/50に希釈）と共に室温で30分保温した。その後、HRPの基質（TMB）を室温で15分添加し、比色法に供した。反応は、ELISA停止液で停止させた。
【0204】
各サンプルのテロメラーゼ活性のレベルは、サンプルのシグナルを、ポジティブコントロールテンプレート（8つのテロメア反復を持つテロメラーゼ産物と同じ配列のテンプレートDNA）の既知の量を用いて得られたシグナルと比較することで決定した。吸光度の値は、ブランク（リファレンス波長A690nm）に対してA450を測定することによって報告した。相対テロメラーゼ活性（RTA）を、次式を用いて算出した：RTA=[（AS-AS0）]/AS,IS]/[（ATS8-ATS8,0）/ATS8,IS]×100
ここでは、以下の通りに記載した：
AS：サンプルの吸光度
AS0：熱処理したサンプルの吸光度
AS,IS：サンプルの内部標準（IS）の吸光度
ATS8：コントロールテンプレート（TS8）の吸光度
ATS8,0：溶解バッファーの吸光度
ATS8,IS：コントロールテンプレート（Ts8）の内部標準（IS）の吸光度
【0205】
［免疫蛍光法］CrFK、HEK293T、HeLaおよびQT6細胞を8穴のLab-Tek（登録商標）チャンバースライド（Sigma-Aldrich、St.Louis、USA）に、200μlの培養培地中で、各ウェル当たり2×104個細胞を播種し、37℃、5％二酸化炭素の環境で一晩加温した。翌日、培養培地を廃棄し、新しい培地を200μl添加した。0.2μgのINVAC-1、pTRIP-CMV-hTERTまたはコントロールのエンプティープラスミドpNTC8685-eRNA41Hを含む混合溶液10μlと、OptiMEM（Life Technologies、Saint-Aubin、France）のFugeneHD（Promega France、Charbonnieres-les-bains、France）0.5μlとを、対応するチャンバーに加えた。チャンバー当たり2x104個の未処理の細胞をネガティブコントロールとして使用した。チャンバースライドは24時間、および48時間、37℃、5％二酸化炭素の環境で加温した。形質導入した細胞は、1×PBSで丁寧に洗浄し、細胞を固定化し透過処理するために、各ウェルに200μlの2％PFAを4℃で10分添加した。その後、ウェルを1×PBS 0.05％ Tween（登録商標）20で2回洗浄し、200μlのブロッキング溶液（1×PBS 0.05％ Tween（登録商標）20に溶解した、0.5％ Triton X100;Sigma-Aldrich、3％ BSA;Sigma-Aldrich、10％ヤギ血清;Invitrogen）と室温で30分加温した。ブロッキングバッファーで1/100に希釈した抗hTERTウサギモノクローナル一次抗体（Abcam、Cambridge、UK）を、細胞に添加し、室温で1.5時間攪拌した。1×PBS 0.05％ Tween（登録商標）20で3回洗浄後、ブロッキング溶液に1/500に希釈したヤギ由来抗ウサギAlexaFluor488（登録商標）二次抗体（Life Technologies、Saint-Aubin、France）を添加し、室温で45分攪拌した。ウェルは1×PBS 0.05％ Tween（登録商標）20で3回洗浄し、DAPIを含むVECTASHIELD（登録商標）をマウントさせた培地に乗せた。カバーガラスは、画像処理および画像解析システム（Axiovision、Carl Zeiss MicroImaging GmbH、Jena、Germany）を備えた蛍光顕微鏡（Axio observer Z1、Carl Zeiss MicroImaging GmbH、Jena、Germany）で解析した。
【0206】
［マウス］雌のC57BL/6マウス（6〜8週齢）は、Janvier研究室（Saint-Berthevin、France）から購入した。
【0207】
二系統の遺伝子導入マウス、HLA-B＊0702およびHLA-A2/DR1を使用した。
【0208】
HLA-B＊0702遺伝子導入マウスは、ヒトHLA-B＊0702のα1-α2ドメインと、H2D分子のマウスα3ドメインを発現する。当該マウスは、H2-DbおよびH2-Kb分子は発現しない（Rohrlich et al.、2003）。
【0209】
HLA-A2/DR1遺伝子導入マウスは、ヒトHLA-A＊0201α1-α2ドメイン、H2D分子のマウスα3、およびヒトβ2-ミクログロブリンを発現する。さらに、当該遺伝子導入マウスは、ヒトHLA-DRB1＊0101およびHLA-DRA＊0101分子を発現する。当該マウスは、マウスH2-Db、H2-KbおよびIAb遺伝子のノックアウトマウスである（Pajot et al.、2004）。
【0210】
両系統の遺伝子導入マウスは、6〜10週齢で使用し、パリのパスツール研究所より提供された。当該マウスは、パスツール研究所の特定病原体を除去した動物の施設（Animal Facilities Lwof fn°22、agreement number B7515-07）で育てられた。皮内（ID）、筋肉内（IM）または皮下（皮下）のワクチン接種または静脈内（IV）注射の前に、マウスは、1×リン酸緩衝食塩水（1×PBS、Life Technologies、Saint-Aubin、France）に溶解した2％キシラジン（Rompun、BayerSante、Loos、France）および8％ケタミン（Imalgen1000、Merial、Lyon、France）の混合溶液で、マウスの個々の体重および麻酔の持続時間に従って、腹腔内（IP）経路で麻酔を行った。マウスは全て、動物治療法に厳密に従い、また地域の動物実験法に従い、扱った（指令2010/63/UE）。
【0211】
［hTERTペプチド］HLA-B＊0702、HLA-A＊0201またはHLA-DR拘束性のhTERTペプチドは以前に報告されている（表1の参考文献を参照）。H2-DbおよびH2-Kb拘束性のhTERTペプチドは、4つのオンラインで利用可能なアルゴリズム、Syfpeithi（http://www.syfpeithi.de/）、Bimas（http://www-bimas.cit.nih.gov/）、NetMHCpanおよびSMM（http://tools.immuneepitope.org/main/）を用いて、マウスMHCクラスI分子と結合させるために、インシリコのエピトープ予測によって決定した。全ての合成ペプチドはProimmune（Oxford、United Kingdom）から、凍結乾燥（90％を超える純度）の状態で購入した。凍結乾燥ペプチドは滅菌水に2mg/mLとなるよう溶解し、使用前は−20℃で保管した。ペプチド配列およびMHC拘束性の詳細は、表1に記載した。
【表1】
【0212】
［hTERTペプチドライブラリー］凍結乾燥hTERTペプチド（70％を超える純度）は、GenScript（USA）から購入した。当該セットは、重複する11AAを含み、INVAC-1 hTERTのタンパク質全ての配列をカバーする、15AAから成る269のペプチドによって構成されている。各ペプチドは、供給元の推奨に従い使用前に2mg/mlの滅菌水に再懸濁し、使用まで−20℃で凍結させた。9-10のhTERT重複ペプチドから成る27プール（表2）を、IFNγELIspotアッセイにてhTERT特異的T細胞応答の幅を調べるために用いた。
【表2】
【0213】
［腫瘍細胞株］INVAC-1が媒介する抗腫瘍効果を評価するために用いるSarc-2腫瘍細胞株は、自然発症の線維肉腫であるHLA-A2/DR3マウスから取得した。腫瘍マウスは、無菌状態に分離され、初代細胞の懸濁液を産生した。細胞株は、HLA-A＊0201分子の発現を示した。細胞は、10％FBS（Life Technologies）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRPMIグルタマックス培地（Life Technologies）で培養した。
【0214】
［マウスの免疫化およびインビボエレクトロポレーションの手順］皮内（ID）免疫化は、剃毛後、マウス側腹部下部に、インスリンシリンジおよび特異的針（U-100、29GX1/2’’−0.33×12mm、Terumo、Belgium）を用いて行った。剃毛後、免疫化の間および免疫化後に、赤斑は観察されなかった。筋肉内免疫化（IM）もまた、インスリンシリンジおよび特異的針U-100を使用して、前脛骨筋（anterior tribialis cranialis）に行われた。皮下免疫化（SC）もまた、インスリンシリンジおよび特異的針U-100を使用して、尾底部に行った。各マウスは、経験に基づき、12.5、25、50、100、200、400、800または1200μgのDNAまたは1×PBSに相当する、プラスミド（INVAC-1、NTC、pUTD10Not、pUTD10CogまたはpUTD23Tyn）による、予備刺激のIM、IDまたはSC注射を受けた。ワクチンレジメンに従い、マウスは同様のDNAまたは1×PBSによる二次注射または三次注射を受けることができた。
【0215】
インビボDNAエレクトロポレーションは、プレート電極（P-30-8G、IGEA）を備えたCLINIPORATOR（登録商標）2エレクトロポレーションシステムおよびソフトウエア（IGEA、Italy）を用いて行った。IDまたはSCワクチン投与の直後、注射部位に皮膚の層を形成し、全体を伝導性ゲル（LaboFH、blue contact gel、NM Medical、France）で覆い、プレート電極間に設置した。異なる電位の二つのパルスを与えた（HV-LV）:HV（1250V/cm、1Hz、100μs）1パルス、1000msブレイク、LV（180V/cm、1Hz、400ms）1パルス。IM注射の直後、各筋肉全体を伝導性ゲルで覆い、プレート電極間に設置した。異なる電位の二つのパルスを与えた（HV-LV）:HV（750V/cm、1Hz、100μs）1パルス、1000msブレイク、LV（100V/cm、1Hz、400ms）1パルス。
【0216】
ある実験では、DNAワクチン投与の18時間前、またはINVAC-1投与と同時に、最終濃度が25μl/側腹部となるように、0.5μgのマウスGM-CSFまたは1ngのマウスIL-12を、マウスにID注射した。両サイトカインはMiltenyi（Germany）から購入した。
【0217】
［ELIspotアッセイ］免疫化したマウスの脾臓を採取してすりつぶし、細胞懸濁液を70mmのナイロンメッシュ（Cell Strainer、BD Biosciences、France）に通して脾細胞を単離した。免疫化したマウスの血液を、麻酔下で後眼窩穿刺によって回収し、末梢血単核球（PBMC）を単離した。脾細胞またはPBMCは、フィコール（リンパ球分離培地、Eurobio、France）を用いて精製した。血液または脾臓からフィコール精製したリンパ球はCellometer（登録商標）Auto T4 Plus counter（Ozyme、France）を用いて数えた。
【0218】
ELIspot PVDFマイクロプレート（IFNγELIspotキット、Diaclone、Abcyss、France、ref.862.031.010P）を一晩、捕捉抗体（抗マウスIFN-γ）でコーティングし、1×PBSの2％ミルクでブロックした。細胞懸濁液をウェル当たり2×105細胞になるようにトリプリケイトでマイクロプレートに添加し、血清フリー培養培地上のHLA拘束性またはH2拘束性のhTERT由来ペプチド5μg/mlあるいはPMAイオノマイシン（各0.1μMおよび1μM）によって刺激した。19時間後、ビオチン複合型検出抗体とそれに続くストレプトアビジン-APおよびBCIP/NBT基質溶液によって、スポットを出現させた。スポットは、イムノスポットELIspotカウンターおよびソフトウエア（CTL、Germany）を用いて数えた。ELIspotデータを解析する際、スポットの出現頻度が、hTERT特異的CD8またはCD4T細胞に応じて、カットオフ値である10スポット以上であった場合に、ワクチン投与したマウスが応答マウスであると見なした。
【0219】
［インビボ細胞傷害性アッセイ］標的細胞を調製するために、高（5μM）、中（1μM）または低（0.2μM）濃度のCFSE（Vybrant CFDA-SE cell-tracer kit;Life Technologies、Saint-Aubin、France）を含む1×PBS溶液によって、無感作のHLA-B7マウス由来の脾細胞を標識した。5μMおよび1μMのCFSEで標識した無感作の脾細胞を、5μg/mLの2つの異なるHLA-B7ペプチド、すなわち1123および351で、室温で1.5時間パルスした。低濃度のCFSEによって標識した脾細胞は、パルスしなかった。すでにINVAC-1または1×PBSによってワクチン投与された各マウスは、初回注射の14日後または追加注射の10日後に、後眼窩の血管を通して、各フラクションから、同じ数の細胞を含む107CFSE標識細胞の混合物を受け取った。15-18時間後、脾臓由来単一細胞懸濁液を、MACSQUANT（登録商標）フローサイトメーター（Miltenyi、Germany）を用いたフローサイトメトリーによって解析した。
【0220】
ペプチドパルス細胞の消失は、コントロール（1×PBS）マウスに対するINVAC-1免疫化マウス中の、非パルス細胞集団（低（low）CFSE蛍光強度）に対するパルス細胞集団（高/中(high/midium)CFSE蛍光強度）の割合を比較することによって決定した。試験マウス当たりの特異的死亡の割合は、次式に従って算出した：[1−[平均値（CFSElowPBS/CFSEhigh/mediumPBS）/（CFSElowpDNA/CFSEhigh/mediumpDNA）]]×100。
【0221】
［サイトカイン結合アッセイ（CBA）］ワクチン投与したHLA-A2/DR1マウス由来の脾細胞（6x105細胞）を、HLA-DR拘束性hTERT由来ペプチド（578、904、および1029）5mg/mlと、37℃で24時間培養した。サイトカイン培養上清を回収し、試験まで−20℃で凍結させた。市販のキットである、マウスTh1/Th2/Th17 Cytometric Beads Array（CBA、BD Biosciences）キットを使用して、IL-2、IFNγ、TNFα、IL-4、IL-6、IL-17aおよびIL-10の各濃度を定量した。CBA免疫測定法は、製造元の説明書に従って実施した。フローサイトメトリーの取得は、FACScan LSRII フローサイトメトリー（BD Biosciences）を使用して行った。解析は、FCAP Array TM Software version 3.0（BD Biosciences）を用いて行った。
【0222】
［インビボ抗腫瘍効果］治療的ワクチン投与実験のために、24週齢のHLA-A2/DR1マウスに2.104個のSarc-2細胞を、右腹側部に皮下移植した。その後、移植4、21、35日後に、上述したようにマウスをDNAワクチンによってID経路で免疫化した後、エレクトロポレーションした。2〜3日ごとに、腫瘍の成長を、カリパスを使ってモニターした。マウスの体重もまた、2〜3日ごとにモニターした。マウスは、腫瘍が2000mm3に達した時点で、安楽死させた。癌研究における動物の愛護と使用のためのガイドライン、特に、直ちに治療介入を必要とする臨床徴候のモニターのためのガイドライン（Workman et al．2010、BJC）に従った。腫瘍の体積は、次式を用いて計算した。:（L＊l2）/2。結果はmm3で表した（L=長さ;l=幅）。
【0223】
予防的ワクチン投与のために、5-10週齢のHLA-A2/DR1マウスに上述したように二回（0日目と21日目）ワクチン投与した。最後の免疫化から32日後に、マウスに5.104個のSarc-2細胞を皮下移植した。マウスの体重と腫瘍の成長は上述したように2〜3日ごとにモニターした。マウスは腫瘍が2000mm3に達した時点で、安楽死させた。
【0224】
腫瘍の成長遅延（TGD）という判断基準を、ワクチン有効性の評価に使用した。コントロール集団と処理集団において、規定の腫瘍体積（500mm3）に至るまでの時間を比較する。
【0225】
［統計解析とデータ処理］Prism5ソフトウエアを、データ処理、解析およびグラフ化に使用した。データは、平均値±標準偏差または中央値として表した。ELIspotアッセイの統計解析は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定および／またはダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定を用いて行った。有意差は、危険率＜0.05で設定した。
【0226】
［結果］［INVAC-1プラスミドDNAの特徴および配列解析］
様々な制限酵素を用いた制限酵素マッピングによって示されるように、Ubi-hTERT導入遺伝子をpNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaIに挿入することに成功した（図1Aおよび1B）。結果として得られたpNTC8685-eRNA41H-HindIII-XbaI-Ubi-hTERT（INVAC-1）ベクターはまた、pVAC5’およびpVAC3’プライマーを用いて、接合部位において部分的に配列決定した。当該配列により、クローニング過程が成功したことが確認された。
【0227】
INVAC-1プラスミドの全長の配列決定は、Master Cell Bankのプラスミド材料において行った（配列番号11および図16）。結果は、1塩基を除いて予想される配列と一致した。実際、全長配列決定によって、データベースに登録されたヒトテロメラーゼ遺伝子（アクセッション番号NM_198253）と比較した際に、サイレント変異（G6064C;GGGグリシンがGGCグリシンへ）が同定された。当該サイレント変異は、INVAC-1の付加的な印と考えられた。なぜなら、この塩基変異は野生型テロメラーゼ遺伝子に存在する特有のBamHIサイトを破壊する（GGATCCがGCATCCへ）からである。
【0228】
［INVAC-1誘導体構築物の特徴および配列解析］異なるUbi-hTERT融合タンパク質を発現する3つのINVAC-1誘導体DNAプラスミドを、合成してクローン化した（図2A）。全てのUbi-hTERT導入遺伝子は、HindIIIおよびXbaIによる切断と電気泳動（図2B）によって示されるように、pcDNA3.1（＋）Invitrogen発現ベクターに、正常に連結された。インサートおよび連結部は、当該DNAインサートと隣接するベクター配列を照合するPEGFP-N5’およびBGHプライマーを用いて、配列決定した。配列決定の結果によって、導入遺伝子が正常にクローニングされたことを確認した（配列番号13、15、17および図17〜19）。
【0229】
［INVAC-1およびINVAC-1誘導体タンパク質はインビトロで正常に発現され、プロテアソーム経路によって分解される］インビトロでのHEK293TおよびCrFK細胞株への一過性の遺伝子導入の18時間から96時間後に、野生型hTERT、INVAC-1およびINVAC-1誘導体タンパク質の全体的な発現に関する情報を提供するために、ウエスタンブロットアッセイを行った。野生型hTERTタンパク質のバンドは、未修飾のhTERTのサイズである124.5kDa（図3Aおよび3Bの左部分）に一致した。野生型hTERTタンパク質の発現は、特にHEK293T細胞において、全時間帯に渡って安定であると思われた。対照的に、INVAC-1（図3Aおよび3Bの右部分、および図3Cの上部分）およびINVAC-1誘導体タンパク質（図3Cの下部分）は全時間帯に渡って速やかに分解された。
【0230】
野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）とは対照的に、INVAC-1構築物は二つの明瞭なバンドを生産した：上部の薄いバンドは、127.4kDaの予想サイズであるUbi-hTERT融合タンパク質に相当し、下部のバンドは、ユビキチンポリペプチドを欠く、INVAC-1にコードされるhTERTタンパク質（119kDa）に相当する。INVAC-1にコードされるhTERTタンパク質の二つの形態は、HEK293TおよびCrFKの両細胞株で検出された（図3Aおよび3B）。同じパターンが、INVAC-1誘導体構築物、Δ10Not、Δ10CogおよびΔ23で観察された（図3C）。まとめると、INVAC-1およびINVAC-1誘導体タンパク質の発現が野生型hTERTよりも弱いこと、その発現パターン、および発現タンパク質の全時間帯に渡る消滅の動態によって、当該タンパク質がユビキチン融合タンパク質の分解について提唱されたモデル（Bachmair、1986）に従い、ユビキチン依存プロテアソーム経路によって迅速に分解されたことが示唆される。119kDaのINVAC-1のバンドが迅速に出現したことは、当該タンパク質が、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼによってUbi-hTERT接続部位で翻訳と同時に、またはほぼ同時に切断されたことを示す。従って、当該タンパク質は、タンパク質分解のいわゆるN-end rule（Tasaki、2012;Varshavsky、1996）に従って、迅速なプロテアソーム依存分解経路に入った。
【0231】
本結果によって、INVAC-1およびINVAC-1誘導体にコードされたUbi-hTERTタンパク質のインビトロ発現パターンおよび同一性を確認した。hTERT誘導体タンパク質と融合したユビキチンポリペプチドは、N-end ruleに従ってタンパク質の分解を促進する役割を果たした。N-end ruleに従い、hTERTは、主要組織適合抗原複合体（MHC）クラスＩ分子（Cadima-Couto、2009;Michalek et al、1993）による抗原提示のためのペプチド生産に関するプロテアソームシステムによって迅速に分解される、不安定なペプチドになった。従って、本データは、哺乳類の組織培養細胞において分解の促進を受けるUbi-hTERT融合構築物は、インビボでもまた迅速に分解され得ること、および野生型hTERTよりも高いCD8＋T細胞応答を効率的に誘発できることを示している。
【0232】
［INVAC-1タンパク質は優勢な細胞質分布および核小体の排除パターンを示す］INVAC-1誘導体hTERTタンパク質の分解を促進させるために当該タンパク質を非局在化させる考えで、核小体局在化シグナル（hTERTのN末端部分）を除去した。従って、INVAC-1がコードするhTERTの細胞内局在化を、CrFK、HEK293、HeLa、QT6細胞株への遺伝子導入後に、免疫蛍光解析によって評価した（図4）。
【0233】
野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）は、遺伝子導入HEK293T細胞において24時間後に核および核小体に優勢に局在化していることが明らかとなった（図4A）。対照的に、INVAC-1タンパク質は、何よりもまず、明瞭な核小体排除パターンを示し、核と細胞質との間に分布した（図4A）。野生型hTERT（pTRIP-CMV-hTERT）およびINVAC-1プラスミドのHeLa細胞への一過性の遺伝子導入では、両タンパク質とも、遺伝子導入後の24時間および48時間後に、同様の局在化パターンを示した（図4B）。
【0234】
pNTC8685-eRNA41Hエンプティー主鎖ベクターを導入したHEK293TおよびHeLa細胞において見られた、弱い抗hTERT蛍光シグナルは、おそらく内在性のhTERTとの交差反応性が原因であろう。
【0235】
内在性hTERTタンパク質の発現に起因する非特異的蛍光バックグラウンドを取り除くために、非ヒト細胞株であるQT6ウズラ線維肉腫細胞およびCrFKネコ腎細胞を免疫染色に使用した。pNTC8685-eRNA41Hエンプティー主鎖ベクターによる一過性の遺伝子導入後の両細胞株において、バックグラウンドシグナルは観察されなかった（図4CおよびD）。予測通り、外因性の野生型hTERTタンパク質（pTRIP-CMV-hTERT）は主に、両細胞株の核および核小体で検出された（図4CおよびD）。すでにHEK293T細胞およびHeLa細胞で観察されたように、INVAC-1タンパク質は、CrFK細胞において24時間後に核および細胞質分布を示した（図4D）。興味深いことに、QT6細胞における24時間後および48時間後のINVAC-1の発現は細胞質分布のみを示した。本結果は、核小体局在化シグナルの削除が、本細胞株におけるタンパク質の分布を劇的に変えたことを示唆している。
【0236】
まとめると、本結果は、INVAC-1誘導体hTERTタンパク質が、様々な細胞株において、野生型hTERTと比較して、変化した細胞内分布を示すことを表している。この変化は、特異的細胞免疫応答を生み出すMHCクラスI提示のためのタンパク質のペプチドへのプロテアソーム分解を促進する上で有利であろう（AnderssonおよびBarry、2004）。
【0237】
QT6細胞およびCrFK細胞へのINVAC-1誘導体（pUTD10Not、pUTD10CogおよびpUTD23Tyn）による遺伝子導入（非特異的hTERTバックグラウンドを伴わない）によって、hTERT誘導体タンパク質の核小体排除パターンを確認した（データ不掲載）。hTERT誘導体タンパク質の細胞内分布は、野生型hTERTと比較して、主に細胞質分布であった。
【0238】
［INVAC-1およびINVAC-1誘導体は酵素活性を持たない］ヒトテロメラーゼは、腫瘍細胞の不死化に関与し、老化を防ぐことによって、腫瘍細胞の増殖において重要な働きを果たしている。従って、野生型テロメラーゼのワクチン製品としての利用は、安全への懸念につながり得る。
【0239】
テロメラーゼ陰性のCrFK細胞株におけるUbi-hTERT構築物のテロメラーゼ活性を評価するために、TRAPアッセイを行った。テロメラーゼ活性は、pTRIP-CMV-hTERTプラスミドを用いた野生型hTERTによって遺伝子導入したCrFK細胞でのみ検出された。INVAC-1またはINVAC-1誘導体を遺伝子導入したCrFK細胞では、テロメラーゼ活性は検出されなかった（図5）。
【0240】
図5Aおよび5Cに示すように、吸光度の生データは、INVAC-1およびINVAC-1誘導体のテロメラーゼ活性のレベルが、未処理細胞のレベルと同程度であることを示した。
【0241】
当該アッセイの特殊性を考慮に入れ、熱失活サンプルを含む様々なネガティブコントロールを用いて、完全に解析した結果を表す、相対テロメラーゼ活性（RTA）のデータは（図5Bおよび5D）、INVAC-1およびINVAC-1誘導体が完全にテロメラーゼ活性を欠いていることを示している。
【0242】
増幅の内部標準（IS）コントロールで処理した全てのサンプルは、CrFK可溶化サンプル中のTaqDNAポリメラーゼインヒビターの欠如を強く肯定し、従って、アッセイの特殊性を再度強調した。
【0243】
結論として、本結果によって、INVAC-1およびINVAC-1誘導体が酵素活性を全く持たないことを確認した。従って、テロメラーゼ活性に関して、ヒトにおけるINVAC-1の安全への懸念はない。
【0244】
［INVAC-1のID投与後に、hTERT特異的CD8T細胞のインターフェロンγ分泌を顕著なレベルに誘発する上で、エレクトロポレーションは有利である］hTERT特異的T細胞応答の強度を、皮内経路でINVAC-1を事前に免疫化した後に皮膚エレクトロポレーションを行った、または行わなかったC57BL/6マウスにおいて評価した（図6）。免疫注射の14日後に、マウスの脾臓を回収し、H2拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、誘発された免疫応答をモニターした。IFNγ＋CD8T細胞の出現頻度の顕著な違いが、INVAC-1のID注射後にエレクトロポレーションを行ったマウス群と、受けなかった群（p＜0.05）の間で見られた。従って、本結果は、INVAC-1のワクチン皮内投与後のhTERT特異的CD8T細胞応答を顕著なレベルに誘発する上で、エレクトロポレーションが有利であることを示す。
【0245】
［様々な投与経路によるINVAC-1ワクチン投与後のエレクトロポレーションは、hTERT特異的CD8T細胞のインターフェロンγの分泌を誘発する。ワクチンID投与が最良の経路と考えられる］従来のワクチンは、一般的にSCまたはIM経路で投与されている。しかしながら、皮内経路の免疫化は、近年ワクチン投与の分野で再度注目を集めている（Combadiere and Liard、2011）。従って、ID経路をINVAC-1の投与に試し、また従来のSCおよびIM経路と比較した。
【0246】
最初の実験のセットで、遺伝子導入HLA-B7マウスの複数のグループに対し、ID経路またはSC経路で免疫化した後、直ちにエレクトロポレーションを行った（図7A）。ワクチン投与／エレクトロポレーションの14日後に、マウスの脾臓を回収し、HLA-B7拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって脾臓で誘発された免疫応答をモニターした。次の実験のセットで、遺伝子導入HLA-B7マウスの一つのグループに対し、ID経路でINVAC-1によって、およびIM経路で他のプラスミドによって免疫化し、直後にエレクトロポレーションした。hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度を、HLA-B7拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、PBMCでモニターした。エレクトロポレーションを伴うINVAC-1のワクチン投与により、いずれのワクチン投与経路を使用しても、HLA-B7マウスにおいてhTERT特異的CD8T細胞応答を誘発し得ることを、確立した（図7Aおよび7B）。
【0247】
さらに、図7Aに示した通り、応答するマウスの数は、SC経路でワクチン投与したグループと比較して、ID経路でワクチン投与したマウスのグループにおいて多く、それぞれSC経路が8匹中3匹、ID経路が8匹中6匹の応答マウスであった。IM経路でワクチン投与したマウスと比較して、ID経路でワクチン投与したマウスのグループで、hTERT特異的CD8T細胞応答の出現頻度においてもまた、顕著な違いが観察された（p＜0.05）（図7B）。
【0248】
両実験は、INVAC-1が媒介するhTERT特異的CD8T細胞の誘発において、ID経路でのワクチン投与が、IM経路およびSC経路よりも有効であることを証明した。同様のデータが、他のマウスモデル、すなわちHLA-A2-DR1マウス（データ不掲載）を使用しても得られた。従って、後続のINVAC-1を使用して行う免疫原性の研究は全て、エレクトロポレーションを伴うワクチンID投与によって計画した。
【0249】
［INVAC-1およびエレクトロポレーションによる単回ID免疫化後の、hTERT特異的CD8T細胞応答における、ワクチン投与量の影響］試験した別の重要なパラメーターは、hTERT特異的CD8T細胞応答における、ワクチン投与量の影響であった。C57BL/6マウスを、INVAC-1の投与量を増やして、両側腹部下部に、エレクトロポレーションを伴って、ID経路で免疫化した。ワクチンの容量は、50μL／部位の一定のままであった。マウスは、最後に受けたワクチン投与量に応じて、2カ所または4カ所の部位でワクチン投与した。ワクチン投与/エレクトロポレーションの14日後に、マウスの脾臓を回収し、H2拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、特異的細胞免疫応答をモニターした。
【0250】
最初の実験のセットで、C57BL/6マウスは、2.5μgから100μgに渡る投与量の、INVAC-1/エレクトロポレーションによる単回ID注射を受けた（図8A）。PBSをワクチン投与したコントロールマウスと比較して100μgのINVAC-1をワクチン投与したマウスのグループで、hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度において、顕著な違いが観察された（p＜0.01）（図8A）。hTERT特異的CD8T細胞の中央値は、接種されたワクチンの投与量（12.5μgから100μgまで）に比例して、増加することもまた、観察された。応答するマウスの数はまた、ワクチン投与量に従って増加し、それぞれ、投与量12.5μgに対して6匹中4匹の応答マウス、投与量25μgに対して5匹中4匹の応答マウス、50μgおよび100μgの投与量に対し6匹中6匹の応答マウスであった。
【0251】
次の実験のセットで、C57BL/6マウスは、100μg〜1200μgの投与量のINVAC-1/エレクトロポレーションによる単回ID注射を受けた（図8B）。PBSでワクチン投与したコントロールマウスと比較して、800μgのINVAC-1を4mg/mLで投与したワクチン投与マウスのグループで、hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度において、顕著な違いが見られた（p＜0.05）（図8B）。hTERT特異的CD8T細胞の中央値は、100μgから800μgまでにおいて、接種されたワクチン投与量に比例すること、および、1200μgを注射すると当該中央値は減少することが分かった。応答する動物の中央値は、ワクチン投与量に応じて増加し、それぞれ、100μgの投与量に対して5匹中4匹の応答マウス、200μg以上の投与量に対して5匹中5匹または4匹中4匹の応答マウスであった。1200μgの投与量に対しては、全マウスが応答マウスであったが、カットオフ値に近い特異的応答のレベルのマウスが、5匹中2匹存在した。
【0252】
結論として、C57BL/6マウスにおけるワクチン特異的CD8T細胞の判断基準に対し、異なる量のINVAC-1の投与の結果として、容量反応が見られた。興味深いことに、コントロールマウスと比較して最大投与量（800および1200μg）でワクチンを注射したマウスにおいて、ワクチン毒性の兆候は見られなかった（体重観察および屠殺での目視による検死において）。同様のデータが、遺伝子導入HLA-B7マウスにおいて取得された（データ不掲載）。
【0253】
［hTERT特異的CD8T細胞応答のレベルを増加させるために、プライムブーストレジメンが、INVAC-1ワクチン投与において推奨される］従来のワクチン（BCG、麻疹、インフルエンザなど）に推奨されるたいていのワクチン投与プロコトールは、ワクチン特異的免疫応答の出現頻度を改善する目的で、プライムブーストレジメンを含む。従って、hTERT特異的CD8T細胞応答の発生におけるプライムブーストレジメンの影響を、NVAC-1ワクチンID投与およびエレクトロポレーションで試験した。当該目的のために、遺伝子導入HLA-B7マウスをINVAC-1によるID投与で免疫化し、皮膚のワクチン投与部位をワクチン投与直後にエレクトロポレーションした。最初の免疫化の21日後に、マウスは、同じワクチン投与手順を用いて、二回目のINVAC-1注射を接種した。HLA-B7拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイにより、hTERT特異的CD8T細胞応答をモニターする目的で、プライムブースト免疫化の後いくつかの時点で、末梢血液を採取した（図9）。hTERT特異的CD8T細胞応答のピークが初回投与の14日後に観察された。しかしながら、ワクチン投与したマウスのグループにおけるhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値は、相対的に低く（11.3スポット/200,000個のPBMC）、ワクチンに応答しないマウスが5匹中2匹存在した。追加免疫の後、hTERT特異的CD8T細胞のピークが注射の10日後に観察された。当該時点（初回投与の31日後、追加投与の10日後）のワクチン投与したマウスのグループにおけるhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値は、免疫前のサンプルにおけるhTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の中央値と顕著に異なった（p＜0.05）。追加投与後は、5匹中4匹の応答マウスが存在した。
【0254】
結論として、プライムブーストワクチン投与レジメンは、第一に、血液中を循環するhTERT特異的CD8T細胞（エフェクターT細胞）の出現頻度の上昇を可能にするため、第二に、抗癌ワクチン投与に関する重要なパラメーターである、特異的細胞免疫応答のピークに達するまでに必要な時間を短縮するために、INVAC-1ワクチン皮内投与/エレクトロポレーションにおいて推奨される。
【0255】
［エレクトロポレーションを伴うΔ10Not、Δ10CogまたはΔ23構築物によるワクチンID投与はまた、hTERT特異的CD8T細胞応答を誘発する。プライムブーストワクチン投与レジメンが、ワクチン特異的CD8T細胞の出現頻度を上昇させるために推奨される。］INVAC-1の開発と共に、他の3つのDNAプラスミド構築物（INVAC-1誘導体）を設計した：Δ10Not（pUTD10Not）、Δ10Cog（pUTD10Cog）またはΔ23（pUTD23Tyn）。3つの欠失は、hTERT酵素の触媒部位で行われた。これらの欠失は10-23アミノ酸残基に渡り、バリン−アスパラギン酸−アスパラギン酸（Val-Asp-Asp、または1文字表記ではVDD）の3つの決定的な残基に及んだ（図2A）。当該構築物は、酵素活性を取り除くいずれの欠失も、免疫原性を保持し得ることを示すために、設計された。
【0256】
当該仮定を確認するために、C57BL/6マウスを、INVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog、Δ23またはPBSによって、エレクトロポレーションを伴うID経路で免疫化した（図10A）。マウスの半数に、同様の手順を用いて、最初の免疫化の21日後にDNAまたはPBSの二回目の注射を接種した。マウスは、最後のワクチン投与／エレクトロポレーションの14日後（単回投与されたマウスのグループにおいて）または10日後（二回注射されたマウスのグループにおいて）に屠殺した。マウスの脾臓を回収し、誘発されたT細胞応答を、H2拘束性のhTERTペプチド（4ペプチドのプール）を用いたIFN-γELIspotアッセイによってモニターした。
【0257】
単回DNA注射を受けたマウスにおいて、PBSでワクチン投与されたコントロールマウスと比較して100μgのINVAC-1でワクチン投与したマウスのグループにおいてのみ、hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の顕著な違いが観察された（p＜0.05）（図10A、黒点）。応答マウスの出現頻度を解析すると、INVAC-1およびΔ10Cogでワクチン投与したマウスのグループにおいて、4匹中3匹の応答マウスであった。しかしながら、Δ10Cogにおいて、マウスは50/200,000個以下の脾細胞でhTERT特異的CD8T細胞応答が見られた、低い応答マウスであった。Δ23でワクチン投与したマウスのグループにおいて4匹中1匹のみが応答マウスであり、Δ10Notで処理したマウスには応答マウスは存在しなかった。二回のワクチン投与を受けたマウスにおいて（図10A、白点）、PBSで注射したコントロールマウスと比較してINVAC-1、Δ10Not、およびΔ10Cogで免疫化したマウスの脾臓において、hTERT特異的IFN-γ分泌CD8T細胞の有意な出現頻度の中央値が観察された（p＜0.001）。Δ23によってワクチン投与したマウスのグループにおいて、4匹中2匹のみが応答マウスであり、統計学的に有意ではなかった。結論として、1回または2回のワクチン投与の後、INVAC-1およびINVAC-1誘導体構築物はhTERT特異的CD8T細胞の誘発を可能とし、INVAC-1はC57BL/6マウスにおいてより強い免疫原性を有していた。
【0258】
次の実験のセットで、遺伝子導入HLA-B7マウスにINVAC-1、Δ10Not、Δ10Cog、Δ23またはPBS（図10B）によって、エレクトロポレーションを伴うIDワクチン投与をし、同様の手順を用いて初回投与の21日後に2回目の注射を接種した。最後の注射の10日後に脾臓を採取し、誘発されたCD8T細胞応答を、B7拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによってモニターした。図10Bに示したように、PBSを注射したコントロールマウスと比較して、INVAC-1、Δ10Not、Δ10CogおよびΔ23で免疫化したマウスの脾臓において、hTERT特異的IFN-γ分泌CD8T細胞の有意な出現頻度の中央値が観察された（p＜0.001）。
【0259】
INVAC-1で示したように、3つのINVAC-1誘導体Δ10Not、Δ10CogおよびΔ23もまた、二つの異なるマウス系統において、IDワクチン投与およびエレクトロポレーションの後、hTERT特異的CD8T細胞のインビボでの誘発が可能であった。プライムブーストワクチン投与レジメンはまた、有意なhTERT特異的CD8T細胞応答のレベルに達するために、INVAC-1誘導体に対しても推奨された。まとめると、本結果は、INVAC-1が、最善のhTERT特異的CD8T細胞応答の誘発を可能にする構築物であることを証明する。本結果は、おそらく、ウエスタンブロット法（図3）によって示したように、プラスミド遺伝子導入後のΔhTERTタンパク質発現レベルにおいて観察される違いによるものであろう。
【0260】
［エレクトロポレーションを伴うワクチンID投与後のhTERT特異的T細胞応答の幅は、ワクチン投与に使用したhTERTプラスミド構築物（INVAC-1、pNTC-hTERTまたはpNTC-hTERT-ΔVDD）によって異なる］INVAC-1構築物内で操作されたhTERT配列の修飾、すなわち、（1）核小体局在化シグナルの欠失、（2）ユビキチン配列の付与、（3）触媒部位内の欠失、の影響を、hTERTに対するT細胞免疫応答のレパートリーにおいて、評価した。INVAC-1のhTERT特異的細胞免疫応答を、INVAC-1によるID免疫化／エレクトロポレーションの後に評価し、天然/野生型のヒトTERT配列をコードするDNA（pNTC-hTERT）およびVDD領域のみ欠失したhTERT配列をコードするDNA（pNTC-hTERT-ΔVDD）によって誘発された応答と比較した。コントロールマウスは、25μgのpNTCエンプティーベクターでID注射を接種した後、エレクトロポレーションした。
【0261】
HLA-B7遺伝子導入マウスの最初のシリーズは、上述したワクチン投与プロコールを用いて（25μg/マウス）、4つの構築物のうちのいずれか一つによる単回投与を受けた。二つ目のシリーズのマウスには、上述したワクチン投与プロコールを用いて（25μg/マウス）、4つの構築物のうちのいずれか一つにより、初回注射および初回ワクチン投与の21日後に追加注射を接種した。
【0262】
単回注射の14日後または追加注射の10日後に、ワクチン投与したマウスおよびコントロールマウス由来の脾細胞を、hTERTの全タンパク質配列をカバーする11AAが重複する15AAの、269ペプチド（各10ペプチドから成る27プール）を用いて、IFNγELIspotアッセイに供した。
【0263】
初回投与後にペプチドの約12プールが認識されたことから、INVAC-Iによる免疫化は、膨大なhTERTエピトープに対するT細胞の大きなレパートリーを誘発した（図11A）。本データは、HLA-B7拘束性の最低12個のエピトープが、プロセシングの後に、樹状細胞表面に、MHCペプチド複合体として強力なT細胞応答の誘発を可能にする密度で、発現したことを示している。重要な本結果は、INVAC-1のプロセシングおよび莫大なhTERTペプチドのAPC表面への発現の能力を示している。他の構築物（hTERTおよびhTERTΔVDD）によって得られた応答との違いは、hTERTに対するT細胞レパートリーの幅を増やすという、INVAC-1で生み出された最適化された特徴を確証するものである。さらに、本結果は、ペプチド免疫化に比べてDNAワクチン投与の優位性を強調するものである。
【0264】
遺伝子導入マウスにおけるINVAC-1による二巡目の免疫化（プライムブースト）の二巡目の有効性が、本研究で確認された。少なくとも5つの新しいエピトープが明らかになったため、インビボＴ細胞レパートリーが改善された（図11B）。追加投与後、全部で、少なくとも17のエピトープが認められた。当該データによって、患者への数回の注射が、より良い抗腫瘍応答を獲得する上で有益であろうことが確認された。
【0265】
27プールのペプチドで検出された特異的Ｔ細胞の全出現頻度の中央値を合計することによって、当該データを包括的に解析したところ、1回（初回投与）または2回（プライムブースト）の免疫化の後に、3つのhTERT構築物の間で、大きな違いは見られなかった（図11C）。本結果は、INVAC-1による追加投与後に顕著に高いT細胞媒介免疫応答が見られたが、INVAC-1 hTERTに行った改変は、免疫応答の幅に影響を与えなかったことを示唆する。
【0266】
結論として、INVAC-1ワクチン投与は、T細胞が認識するペプチド／エピトープという点で野生型hTERTおよびhTERTΔVDD構築物とは異なり、膨大なhTERTエピトープに対する、幅広いレパートリーのT細胞免疫応答を媒介した。
【0267】
［エレクトロポレーションを伴うINVAC-1によるワクチンID投与は、抗癌免疫応答の特徴を有したhTERT特異的T細胞応答：細胞傷害性CD8T細胞およびTh1CD4T細胞を誘発する］抗腫瘍免疫応答に関連している免疫細胞の中で、細胞傷害性CD8Tリンパ球（CTL）およびTh1CD4T細胞が、最も強力なエフェクター細胞（Vesely et al.、2011）（Braumuller et al.、2013）として同定されている。
【0268】
第一のステップとして、hTERT特異的CD8T細胞の細胞傷害性活性を、INVAC-1によるワクチン皮内投与/エレクトロポレーションの後に、インビボで調べた。実際、当該活性は腫瘍細胞を死滅させるために必要である。INVAC-1免疫化によって誘発されたhTERT特異的CD8＋T細胞応答のインビボでの細胞溶解性の強さを測るために、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（CFSE）で標識した、ペプチドパルスした脾細胞を標識細胞として使用して、インビボ細胞傷害性アッセイを行った。INVAC-1（またはコントロールとしてPBS）によって、上述のようにID経路で初回投与またはプライムブーストワクチン投与したHLA-B7遺伝子導入マウスに対して、7.106の標的細胞を静脈内注射した。標的細胞は、3つの異なる濃度のCFSEでそれぞれ標識し、HLA-B7拘束性のhTERTペプチド（免疫優性ペプチドのp351、または準優位なペプチドのp1123）でパルスした、あるいは内部標準としてパルスしないままの、抗原刺激を受けていない類遺伝子性マウスの脾細胞由来であった。15〜18時間後、脾細胞を回収し、コントロールマウスに対する免疫化マウスでのペプチドパルス細胞の消失を、フローサイトメトリーで定量した。
【0269】
結果は、全てのマウスが、免疫優性ペプチドp351に対して、単回注射後に、特異的なCTLを発生させ、特異的溶解の中央値は35だったことを示している（図12A、白点）。三分の一のマウスが、準優位なペプチドp1123に対して、特異的なCTLを発生させた（図12A、黒点）。複数の注射サイクルが、準優位なペプチドp1123に対して特異的なCTLを発生させるマウスの数の増加を可能にすることが、期待できる。
【0270】
hTERT特異的CD4T細胞応答が、非小細胞肺癌（NSCLC）患者におけるより良い化学療法と関連し得ることが、近年述べられている（Godet et al.、2012）。それゆえ、INVAC-1ID注射後のhTERT特異的CD4T細胞応答の存在を調べた。当該目的のために、HLA-A2/DR1遺伝子導入マウスに対し、INVAC-1によるエレクトロポレーションを伴うID免疫化を行い、hTERT特異的CD4T細胞応答を、DR1拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、ワクチン投与後14日目の脾臓においてモニターした。図12Bに示したように、PBSを注射したコントロールマウスと比較して、IDワクチン投与したマウスの脾臓において、hTERT特異的IFN-γ分泌CD4T細胞の有意な出現頻度の中央値が見られた（p＜0.001）。
【0271】
Th1免疫が、インビボでの癌細胞の消失において、明確なポジティブな効果をもたらしたことが強調されている（Braumuller et al.、2013）。実際のところ、CD4+Th1細胞は、腫瘍に対する細胞媒介免疫を誘発する上で重要ないくつかのサイトカイン（IFN-γ、TNF-αおよびIL-2など）を産生する。従って、INVAC-1ワクチン皮内投与後に、hTERT特異的CD4T細胞によって分泌された様々なサイトカインを調べた。当該目的のために、INVAC-1をワクチン投与したHLA-A2/DR1遺伝子導入マウスを、hTERTによって24時間、インビトロで刺激するか、あるいは刺激しないままとした。上清を回収し、hTERT特異的CD4T細胞によって分泌されたTh1、Th2およびTh17サイトカインの濃度を評価するために、サイトカイン結合アッセイ（CBA）で試験した。
【0272】
図12Cに示したように、コントロールマウスの上清と比較して、INVAC-1によってワクチン投与したマウスから回収した脾細胞の上清において、有意な、Th1サイトカイン、IL-2、TNFαおよびIFNγの濃度が検出された（p＜0.05）。
【0273】
従って、INVAC-1によるワクチン皮内投与/エレクトロポレーションは、Th1のプロファイルを持った特異的CD4T細胞の増殖促進と共に、インビボでの細胞傷害性活性を示すhTERT特異的CD8T細胞の増殖促進を可能にする。両応答タイプは、有利な抗癌免疫応答の特徴である。
【0274】
［エレクトロポレーションを伴うINVAC-1による治療的または予防的ワクチンID投与は、HLA-A2/DR1遺伝子導入マウスにおける同型の腫瘍接種後の腫瘍の成長を遅延させる］ここまでの結果で、エレクトロポレーションを伴うINVAC-1のID注射が、マウスにおいて細胞傷害性CD8T細胞およびTh1CD4T細胞を誘発できたことが示された。従って、次のステップは、INVAC-1ワクチン皮内投与およびエレクトロポレーションによって与えられた遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスの防御作用を、Sarc-2（線維肉腫）腫瘍細胞接種後に評価することであった。最初の試みとして、遺伝子導入HLA-A2/DR1マウスに、プライムブースト戦略で、INVAC-1によってエレクトロポレーションを伴うIDワクチン投与を、あるいは、PBSでニセのワクチン投与を行った。予防的なワクチン投与の一ヶ月後に、50,000個のSarc-2細胞をSC経路でマウスに負荷した。腫瘍体積は2〜3日ごとに計測した。図13Aは、マウスの処置に従った腫瘍細胞負荷後の腫瘍体積の中央値の動態を示している。次いで、腫瘍成長遅延（TGD）は500mm3で計算した。当該判断基準は、コントロールグループと処置グループとで、規定の腫瘍に達する時間を比較することにより、腫瘍成長におけるワクチン処置の効果を計ることを可能にする。11日の腫瘍成長遅延が、INVAC-1をワクチン投与したマウスグループと、PBSを投与したマウスグループとの間で観察された。従って、INVAC-1による予防的なワクチン投与は、腫瘍成長を遅らせる原因であった。腫瘍接種は、最後のワクチン投与の1ヶ月後に行われたため、抗腫瘍効果は、ある程度、hTERT特異的記憶T細胞の存在に起因しているかもしれない。
【0275】
次の一連の実験で、遺伝子導入マウスに20,000個のSarc-2細胞を移植し、細胞接種の4日後に、INVAC-1により、エレクトロポレーションを伴うIDワクチン投与を行った（図13B）。コントロールマウスに、INVAC-1と同様の主鎖を有するが、いずれの腫瘍抗原もコードしていない「エンプティー」プラスミド（NTC）のID注射を接種した。腫瘍移植後、21日目と35日目に、同様の手順で、二回の追加ワクチン投与を行った。500mm3において腫瘍成長遅延を計算した。INVAC-1でワクチン投与したマウスグループと、NTCエンプティープラスミドを投与したマウスグループとの間で、4日の腫瘍成長遅延が観察された。結論として、INVAC-1による治療的ワクチン投与は、比較的弱いが、それにもかかわらず繰り返し観察される、腫瘍成長の遅延を可能にした。
【0276】
［INVAC-1ワクチンID投与/エレクトロポレーションと同時のマウスGM-CSF投与は、hTERT特異的細胞免疫応答の強度と質を改善し、HLA-A2/DR1遺伝子導入マウスにおける同系の腫瘍負荷後の腫瘍の成長を遅延させる］様々なサイトカインが、これまで、動物モデルおよびヒトの両方の、抗癌ワクチン投与の研究において、抗原認識およびT細胞増殖を促進させる免疫調製物質として使用されてきた。最も頻繁に使用されるサイトカインの一つは、GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）である。当該サイトカインは、抗原提示細胞の成熟を助け、Th1細胞免疫応答を支持することが知られている（Parmiani et al.、2007）。抗腫瘍ワクチンに関してGM-CSFが果たす主な役割に関して、INVAC-1ワクチンID投与およびエレクトロポレーション後のhTERT特異的T細胞応答に対するマウスGM-CSF（mGM-CSF）の追加の影響を試験した。当該目的のために、C57BL/6マウスに、エレクトロポレーションを伴うID経路でのINVAC-1ワクチン投与の18時間前に、mGM-CSFのID注射を接種した（図14A）。別のマウスのグループは、mGM-CSFを接種することなく、INVAC-1/エレクトロポレーションでIDワクチン投与した。コントロールマウスはPBSによってニセのワクチン投与行い、エレクトロポレーションした。注射の14日後に、マウス脾臓を回収し、H2拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、誘発された免疫応答をモニターした。INVAC-1のID注射の前にmGM-CSFを接種したマウスのグループと、mGM-CSFを接種しなかったマウスのグループの間には、IFNγ＋CD8T細胞の出現頻度において、有意な違いが観察された（p＜0.001）。従って、mGM-CSFの接種は、hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の大幅な増加を可能にした。第二のステップは、hTERT特異的CD4T細胞の質、および、特にTh1特異的T細胞の産生に対する免疫調整物質の影響を調査することにあった。当該目的のために、INVAC-1またはINVAC-1/mGM-CSFをワクチン投与したHLA-A2/DR1遺伝子導入マウス由来の脾細胞を、DR1拘束性のhTERTペプチドのプールで、24時間、インビトロで刺激するか、あるいは、刺激しないままとした。上清を回収し、hTERT特異的CD4T細胞が分泌したTh1、Th2およびTh17サイトカインの濃度を評価するために、サイトカイン結合アッセイ（CBA）によって試験した。図14Bに示したように、INVAC-1のみでワクチン投与したマウス由来の上清と比較して、INVAC-1/mGM-CSFでワクチン投与したマウスから回収した脾細胞の上清では、Th1サイトカイン、IL-2、TNFαおよびIFNγの有意な濃度が見られた。mGM-CSFを接種すると、Th1抗腫瘍サイトカインであるTNFα（p＜0.01）、IFNγ（p＜0.05）およびIL-2（p＜0.05）の濃度において、大幅な増加が見られた。
【0277】
その後、mGM-CSFが抗腫瘍効果を増強できるかどうかを評価するために、mGM-CSF/INVAC-1の組み合わせを、Sarc-2動物腫瘍モデルで研究した。
【0278】
当該目的のために、HLA-A2/DR1遺伝子導入マウスに、20,000個のSarc-2細胞を移植し、細胞移植の4日後に、エレクトロポレーションを伴うINVAC-1およびmGM-CSFのIDワクチン投与を行った（図14C）。コントロールマウスには、エンプティープラスミド（NTC）およびmGM-CSF、あるいはPBSおよびmGM-CSFを、ID注射した。二回の追加ワクチン投与は、腫瘍移植の21日後および35日後に、同様の手順で行った。腫瘍成長遅延（TGD）は、500mm3で計算した。14日のTGDが、INVAC-1/mGM-CSFをワクチン投与したマウスグループと、NTC/mGM-CSFを接種したマウスグループとの間に見られた；10日のTGDが、INVAC-1/mGM-CSFを接種したグループと、PBS/mGM-CSFを接種したグループとの間に見られた。当該結果は、mGM-CSFを併用するINVAC-1の治療的ワクチン投与が、腫瘍成長の遅延も可能にしたことを示している。
【0279】
［INVAC-1ワクチン皮内投与/エレクトロポレーションと共にマウスのIL-12を投与することは、hTERT特異的CD8T細胞応答の強度を改善させる］INVAC-1ワクチン皮内投与およびエレクトロポレーション後のhTERT特異的CD8T細胞応答におけるIL-12サイトカインの影響もまた、調べた。当該目的のために、HLA-A2/DR1マウスに、エレクトロポレーションを伴うINVAC-1のID投与と共に、IL-12のID注射を接種した（図15）。別のグループのマウスには、IL-12の接種を行わずに、INVAC-1/エレクトロポレーションによるIDワクチン投与を行った。コントロールのマウスは、PBSとIL-12、またはPBS単独で、エレクトロポレーションを伴うニセのワクチン投与を行った。注射の14日後に、マウスの脾臓を回収し、A2拘束性のhTERTペプチドを用いたIFN-γELIspotアッセイによって、誘発された免疫応答をモニターした。応答マウスの出現頻度は、IL-12を注射すると増加した。実際、INVAC-1によってワクチン投与したグループおよびINVAC-1/IL-12によってワクチン投与したグループのそれぞれにおいて、5匹中2匹、および5匹中4匹の応答マウスが存在した。
【0280】
［実施例２］［略号］
AA:アミノ酸、bp:塩基対、CTL:細胞傷害性Tリンパ球、CMV:サイトメガロウイルス、DNA:デオキシリボ核酸、EP:エレクトロポレーション、ID:皮内、NoLS:核小体局在化配列、RNA:リボ核酸、RTA:相対テロメラーゼ活性、TRAP:テロメア反復増幅プロトコール、TERT:テロメラーゼ逆転写酵素、Ubi:ユビキチン、VDD:バリン-アスパラギン酸-アスパラギン酸
【0281】
［材料と方法］［プラスミドDNAベクター］
［INVAC-1］
INVAC-1構築物は実施例1に記載されている。
【0282】
［INVAC-1組換え（shuffled）誘導体］pUTScramおよびpUTInv構築物は、酵素的に不活性な、ヒトユビキチン−テロメラーゼに基づく融合タンパク質をコードする約8.9kbの二本鎖DNAプラスミドである。Scrambledの、およびInvertedの導入遺伝子は、哺乳類細胞において安定かつ一過性の発現を高レベルで行うように設計されたpcDNA3.0由来のInvitrogen pcDNA3.1（＋）ベクター（5.4kb）に挿入した。導入遺伝子の発現は、広範囲の哺乳類細胞において効率的で高レベルな発現を可能にする、ヒトサイトメガロウイルス最初期（CMV）プロモーターから行われる。ベクターは、クローニングを可能にするマルチクローニングサイト（MCS）を含む。効率的な転写終結は、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナルによって行われる。
【0283】
［pUTScram（Scrambledと命名）］Ubi-Scrambled hTERTインサート（Scrambled、1184AA）は、pUTScramプラスミドの923の位置で始まり、4474の位置で終わる（図20A）。pUTScramは、約130.2kDaのタンパク質に相当する、1184AAのヒトユビキチン−テロメラーゼに基づく融合構築物（Scrambled）をコードする。hTERTタンパク質は、最初の23アミノ酸（1-23AA）を削除し、ユビキチンポリペプチド（76AA）で置換した。触媒部位は、VDDをコードし、野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT;特許WO2007/014740およびhTERTアイソフォーム1 アクセッション番号NM_198253）のAA867-869に相当する、9bpの欠失（＊マーク;図28）により不活性化した。hTERT配列を10個の免疫原性のフラグメントに分け、次の特異的な順番に再構成した：フラグメント7（210bp）、フラグメント2（201bp）、フラグメント6（312bp）、フラグメント4（117bp）、フラグメント9（576bp）、フラグメント3（120bp）、フラグメント1（258bp）、フラグメント8（477bp）、フラグメント10（516bp）、フラグメント5（303bp）。これらの１0個のフラグメントは、6xGlyリンカー（Gリンカー;18bp）で架橋されている。結果として、76個の非免疫原性のAA（228bp）はhTERT配列から削除された。Ubi-hTERT組換え（shuffled）インサートのC末端配列の14アミノ酸は、V5エピトープタグをコードしている（図22）。
【0284】
［pUTInv（Invertedと命名）］Ubi-inverted hTERTインサート（Inverted、1184AA）は、pUTInvプラスミドの923の位置で始まり、4474の位置で終わる（図20B）。pUTInvは、約130.2kDaのタンパク質に相当する、1184AAのヒトユビキチン−テロメラーゼに基づく融合構築物（Inverted）をコードする。hTERTタンパク質は、最初の23アミノ酸（1-23AA）を削除し、ユビキチンポリペプチド（76AA）で置換した。触媒部位は、VDDをコードし、野生型ヒトテロメラーゼ（hTERT;特許WO2007/014740；アクセッション番号NM_198253）のAA867-869に相当する、9bpの欠失（＊マーク;図29）により不活性化した。hTERT配列を10個の免疫原性のフラグメントに分け、次の特異的な順番に再構成した：フラグメント10（516bp）、フラグメント9（576bp）、フラグメント8（477bp）、フラグメント7（210bp）、フラグメント6（312bp）、フラグメント5（303bp）、フラグメント4（117bp）、フラグメント3（120bp）、フラグメント2（201bp）、フラグメント1（258bp）。これらの１0個のフラグメントは、6xGlyリンカー（Gリンカー;18bp）で架橋されている。結果として、76個の非免疫原性のAA（228bp）はhTERT配列から削除された。Ubi-hTERT組換え（shuffled）インサートのC末端配列の14アミノ酸は、V5エピトープタグをコードしている（図22）。
【0285】
［遺伝子合成およびクローニング］当該遺伝子は、ユビキチン-テロメラーゼに基づく融合構築物として、重複する40塩基長のオリゴヌクレオチドアセンブリープロセス（GeneCust、Luxembourg）によって、新規合成した。制限酵素部位を削除し、かつGCリッチ配列を弱めるために、いくつかの保守的な塩基改変を行った。遺伝子合成により、望ましい発現システムに当該遺伝子をサブクローニングできるようにする、特有の隣接した制限酵素サイトHindIII/XbaIを含めた。合成した遺伝子は、pcDNA3.1（＋）発現ベクター（Invitrogen、Carlsbad、USA）の制限酵素サイトHindIIIとXbaIとの間にクローニングした。プラスミドの配列は、PEGFP-N5’CGGTGGGAGGTCTATATAAG（配列番号27）およびBGH CAGGGTCAAGGAAGGCAC（配列番号28）プライマーを用いた配列決定によって、確認した。
【0286】
［プラスミド製造］GeneCustによって合成したINVAC-1組換え誘導体は、RD Biotech（Besancon、France）の大腸菌（E.coli）5-α細胞（fhuA2Δ（argF-lacZ）U169 phoA glnV44 Φ80 Δ（lacZ）M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17）（Lucigen Corporation、Middleton、USA、ref.60602-2）に形質転換して製造した。細胞はアンピシリン（#EU04000D、Euromedex）を含有するLeno×Broth培地に蒔き、増殖させた。抽出および精製した後、1×の滅菌PBSに再懸濁した、濃縮されたエンドトキシンフリーギガプレッププラスミドストック（2mg/mL）を調製した。ベクターは、制限酵素マッピングによって確認した（HindIII-XbaI;図21）。
【0287】
［pTRIP-CMV-hTERT］当該DNAプラスミドは、すでに実施例1に記載した。
【0288】
［ウエスタンブロットおよびTRAPアッセイのための細胞培養物と一過性の遺伝子導入物］CrFK細胞（クランデルリース(Crandell Rees)ネコ腎細胞）、HEK293T細胞（ヒト胚性腎細胞）は、10％熱失活ウシ胎児血清（PAA、Velizy-Villacoublay、France）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies、Saint-Aubin、France）を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養した。
【0289】
細胞は、37℃の、5％CO2を含む加湿した環境下で、75cm2のフラスコにおいて単層で増殖させた。細胞は、遺伝子導入当日に、コンフルエンスの70-80％まで増殖した。ウエスタンブロットアッセイのために、5×105の細胞を6穴の組織培養プレートに播種し、24時間培養した。TRAPアッセイのために、7×105の細胞を6穴の組織培養プレートに播種し、24時間培養した。
【0290】
INVAC-1、pUTScramおよびpUTInv構築物を、jetPrimeカチオンポリマー遺伝子導入試薬を用いて、製造元の説明書（Polyplus-transfection Inc.、France）に従い、標的細胞に遺伝子導入した。pTRIP-CMV-hTERTプラスミドを遺伝子導入した細胞をポジティブコントロールとして用い、非遺伝子導入細胞をネガティブコントロールとして用いた。遺伝子導入培地は4時間後に取り除き、2mLのDMEM培養培地で置換した。適切な遺伝子導入時間（ウエスタンブロットアッセイでは18-96時間、TRAPアッセイでは24時間）の後、細胞を回収してテロメラーゼの発現および活性を解析した。
【0291】
［ウエスタンブロット］ウエスタンブロット解析は、遺伝子導入したHEK293T細胞を用いて行った。ウエスタンブロットの手順は実施例1に記載した通りである。
【0292】
［TRAPアッセイ］手順は、実施例1に記載した通りである。
【0293】
［マウス］本実験では、HLA-B＊0702遺伝子導入マウス系統を使用した。
【0294】
HLA-B＊0702遺伝子導入マウスは、当該分子のヒトHLA-B＊0702α1-α2ドメインおよびH2D分子のマウスα3ドメインを発現する。当該マウスは、H2-DbおよびH2-Kb分子を発現しない（Rohrlich、Cardinaud et al. 2003）。
【0295】
マウスは、9〜15週齢で使用し、パリのパスツール研究所より提供された。当該マウスは、パスツール研究所の特定病原体を除去した動物の施設（Animal Facilities Lwof fn°22、agreement number B75 15-07）で育てられた。皮内（ID）または静脈内（IV）注射の前に、マウスは1×リン酸緩衝食塩水（1×PBS、Life Technologies、Saint-Aubin、France）に溶解した2％キシラジン（Rompun、BayerSante、Loos、France）および8％ケタミン（Imalgen1000、Merial、Lyon、France）の混合溶液で、マウスの個々の体重および麻酔の持続時間に従って、腹腔内（IP）経路で麻酔を行った。マウスは全て、動物治療法に厳密に従い、また地域の動物実験法に従い、扱った（指令2010/63/UE）。
【0296】
［hTERTペプチド］HLA-B＊0702拘束性のhTERTペプチドは、実施例1に既に記載した。凍結乾燥したペプチドは、2mg/mLで滅菌水に溶解し、使用するまで−20℃で保管した。
【0297】
［マウスの免疫化およびインビボエレクトロポレーションの手順］皮内（ID）免疫化は、マウス側腹部の下部に、インスリンシリンジおよび特殊な針（U-100、29GX1/2’’-0.33x12mm、Terumo、Belgium）で剃毛後に行った。剃毛後、免疫化手順の間および後に赤斑は観察されなかった。各マウスは、プラスミド（INVAC-1、pUTScramまたはpUTInv）による初回刺激のID注射を、100μgのDNAまたは1×PBSで受けた。ワクチンレジメンに従って、マウスは、DNAまたは1×PBSの二回目の注射を同様に受けることができた。
【0298】
インビボDNAエレクトロポレーションは、プレート電極が付属したCLINIPORATOR（登録商標）2エレクトロポレーションシステムおよびソフトウエア（IGEA、Italy）を用いて行った。ワクチン皮内投与の直後、注射部位に皮膚の層を形成し、全体を伝導性ゲル（LaboFH、青色接触ゲル、NM Medical、France）で覆い、プレート電極間に設置した。異なる電位の二つのパルスを与えた（HV-LV）:HV（1250V/cm、1Hz、100μs）1パルス、1000msブレイク、LV（180V/cm、1Hz、400ms）1パルス。
【0299】
［ELIspotアッセイ］ELIspotアッセイは、実施例1に記載の方法に従って行った。HLA-B＊0702拘束性の三つの特異的hTERTペプチド（p277、p351およびp1123）から成る一つのプールのみ、実施例2では使用した。
【0300】
［インビボ細胞傷害性アッセイ］インビボ溶解アッセイは、実施例1に記載した手順に従って行った。HLA-B＊0702拘束性の二つの特異的hTERTペプチド（p351およびp1123）のみ、それぞれ免疫優勢のペプチドおよび準優位のペプチドとして、実施例2では使用した。
【0301】
［統計解析とデータ処理］GraphPadPrism5ソフトウエアを、データ処理、解析およびグラフ化に使用した。データは、平均値±標準偏差または中央値として表している。ELIspotアッセイの統計解析は、マン・ホイットニーのノンパラメトリック検定および／またはダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定を用いて行った。有意差は、危険率＜0.05で設定した。
【0302】
［結果］［INVAC-1プラスミドDNAの特徴および配列解析］
INVAC-1プラスミドDNAの特徴および配列解析は、すでに実施例1に記載した。
【0303】
［INVAC-1組換え(shuffled)誘導体構築物（pUTScramおよびpUTInv）の特徴および配列解析］二つのINVAC-1組換え(shuffled)誘導体遺伝子を合成してクローニングした（図20）。当該構築物は、実施例1に記載されたINVAC-1ヌクレオチド配列、および国際特許出願WO2007/014740に記載された野生型hTERTアミノ酸配列に基づいている。
【0304】
哺乳類細胞において高レベルで発現するために、コドンの最適化を行った（図27）。Scrambledの、およびInvertedのUbi-hTERT組換え(shuffled)導入遺伝子は、HindIIIおよびXbaIによる切断および電気泳動（図21）に示したように、pcDNA3.1（＋）Invitrogen発現ベクターに連結させることに成功した。インサートおよび接続部位は、DNAインサートと隣接したベクター配列を照合するPEGFP-N5’およびBGHプライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果によって、導入遺伝子が正常にクローニングされたことを確認した（図28および29）。
【0305】
［INVAC-1組換え(shuffled)誘導体タンパク質は、インビトロで正常に発現し、プロテアソーム経路によって分解される］インビトロでのHEK293T細胞株への一過性の遺伝子導入の18時間から96時間後に、野生型hTERT、INVAC-1、pUTScramおよびpUTInvタンパク質の全体的な発現に関する情報を提供するために、ウエスタンブロットアッセイを行った。野生型hTERTタンパク質のバンドは、未修飾のhTERTのサイズである124.5kDa（図23Aおよび23Cの左部分）に一致した。実施例1において、INVAC-1タンパク質は、安定なレベルに発現された野生型hTERTタンパク質とは反対に、全時間帯に渡って速やかに分解されることが分かった。Scrambledの、およびInvertedの組換え(shuffled)タンパク質の特異的なバンドが全時間帯に渡って検出された（図23Aおよび23Cの右側）。両タンパク質において、特異的なバンドはタンパク質全体の予想サイズ（130.2kDa）よりも小さいサイズ（＜110kDa）で観察された。Scrambledの、およびInvertedのタンパク質のこれらの形態は、分解産物に相当する。実際、Scrambledの、およびInvertedの発現した未分解の産物は、ウエスタンブロット解析においては検出不可能だった。当該構築物は、生産後直ちにタンパク質の分解が高速で行われたこと示唆する1つから3つまでの特異的なバンドを、それぞれ提示した。INVAC-1のような、Scrambledの分解産物の全時間帯に渡る同様の分解パターンは、βアクチンローディングコントロールへの標準化後に、証明した（ImageJ解析：図23B）。Invertedの分解産物は、他のINVAC-1誘導体タンパク質に、より近いパターンを持っている（図23C、23Dおよび図3C:pUTD10Not、pUTD10CogおよびpUTD23Tyn、実施例1参照）。
【0306】
［INVAC-1組換え(shuffled)誘導体は優勢な細胞質分布および核小体排除パターンを示す］INVAC-1およびINVAC-1誘導体（pUTD10Not、pUTD10CogおよびpUTD23Tyn、実施例1参照）で示したように、pUTScramおよびpUTInvがコードするScrambledの、およびInvertedの組換えタンパク質は、核小体排除パターンによって、核と細胞質との間に分布した（データ不掲載）。
【0307】
［INVAC-1組換え(shuffled)誘導体は、酵素活性を持たない］テロメラーゼ陰性CrFK細胞株中の、Ubi-hTERT組換え（shuffled）構築物のテロメラーゼ活性を評価するために、TRAPアッセイを行った。テロメラーゼ活性は、pTRIP-CMV-hTERTプラスミドを用いて野生型hTERTを遺伝子導入したCrFK細胞でのみ見られた。
【0308】
図24Aに示したように、吸光度の生データは、Scrambledの、およびInvertedのタンパク質のテロメラーゼ活性のレベルが、未処理の細胞のレベルと同程度であることを示した。当該アッセイの特殊性を考慮に入れ、熱失活サンプルを含む様々なネガティブコントロールを用いて完全に解析した結果を表す、相対テロメラーゼ活性（RTA）のデータは（図24B）、当該組換え(shuffled)タンパク質が、完全にテロメラーゼ活性を欠いていることを示している。
【0309】
［組換え(shuffled)hTERT構築物は、hTERT特異的CD8T細胞応答を誘発する］INVAC-1の特徴の範囲を広げる多様なhTERTエピトープの抗原提示を誘発するよう、pUTScramおよびpUTInv構築物を設計した。pUTScram、pUTInvおよびINVAC-1の免疫原性の比較は、各種構築物によって皮膚エレクトロポレーションを伴ってID免疫化されたHLA-B7マウスにおいて、二回の免疫化（プライムブーストレジメン）の後、行った。マウスは、二回目のワクチン投与/エレクトロポレーションの10日後に屠殺した。マウスの脾臓を回収し、誘発されたCD8T細胞応答を、HLA-B7MHCクラスI拘束性のhTERTペプチド（3つのペプチドp277、p351およびp1123のプール）を用いたIFN-γELIspotアッセイによって、モニターした。コントロールマウスと比較して、INVAC-1、pUTScram（Scrambled）およびpUTInv（Inverted）によってワクチン投与したマウスで、hTERT特異的CD8T細胞の出現頻度の有意な差が見られた（図25）。
【0310】
当該結果は、人工的なhTERT組換え（shuffled）構築物pUTScram（Scrambled）およびpUTInv（Inverted）は、INVAC-1と同様に、二回の免疫化サイクルの後、有意に高レベルなhTERT特異的CD8T細胞応答を誘発することができたことを示している。実際、INVAC-1で既に示したように、プライムブーストワクチン投与レジメンの利点は、既に活性化した特異的T細胞を選択的に刺激することと、新しい特異的TCRを含む二次的なhTERT特異的T細胞を産生するために、エピトープの提示の幅を広げることである。
【0311】
［人工的に組換えた(shuffled)hTERT構築物であるpUTScramおよびpUTInvによるワクチン投与は、インビボの細胞傷害性hTERT特異的CD8T細胞を誘発する］抗腫瘍免疫応答に関連している免疫細胞の中で、細胞傷害性CD8Tリンパ球（CTL）およびTh1CD4T細胞が、最も強力なエフェクター細胞（Vesely、Kershaw et al.2011）（Braumuller、Wieder et al.2013）として同定されている。
【0312】
hTERT特異的CD8T細胞の細胞傷害性活性を、INVAC-1、pUTScramおよびpUTInvによるワクチンID投与/エレクトロポレーションの後、インビボで調べた。DNA免疫化によって誘発されたhTERT特異的CD8＋T細胞応答のインビボでの細胞溶解性の強度を測定するために、カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（CFSE）で標識した、ペプチドパルスした脾細胞を標識細胞として使用して、インビボ細胞傷害性アッセイを行った。DNA構築物（またはコントロールとしてPBS）によって上述のようにID経路で一回のワクチン投与を受けたHLA-B7遺伝子導入マウスに対し、107個の標的細胞を静脈内に注射した。標的細胞は、3つの異なる濃度のCFSEでそれぞれ標識し、HLA-B7拘束性のhTERTペプチド（免疫優性のペプチドp351、または準優位なペプチドp1123）でパルスした、あるいは内部標準としてパルスしないままの、抗原刺激を受けていない類遺伝子性マウスの脾細胞由来であった。15〜18時間後、免疫化したマウスの脾臓を回収し、脾細胞懸濁液をフローサイトメトリーで解析した。特異的溶解の割合は、コントロールマウスに対するワクチン投与マウスでの、非パルスCFSE標識細胞に対するパルス細胞の割合を比較することで評価した。
【0313】
結果は、種々の構築物で免疫化した全てのマウスが、一回の免疫化後に、hTERT特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を発生させたことを示す。
【0314】
予想通り、3つのグループで、免疫優勢のペプチドp351に対する細胞傷害性は、準優位のペプチドp1123に対する細胞傷害性よりも強かった（図26）。
【0315】
INVAC-1およびpUTInvによる免疫化は、テロメラーゼ免疫優勢の（p351）エピトープを有する標的細胞のうち、それぞれ37％および35％の特異的溶解を引き起こした（図26、黒点）。比較すると、pUTScramによる免疫化は、20％の特異的溶解を引き起こした。準優位のペプチドp1123に対しては、INVAC-1免疫化マウスで5匹中2匹、および、pUTScram免疫化マウスで6匹中1匹が、特異的CTLを発生させた（図26、灰色点）。
【0316】
上述の通り、複数の注射サイクルが、免疫優勢のペプチドおよび準優位のペプチドの両方に対して、特異的CTL溶解を発生させるマウス数の増加を可能にすることが期待できる。実際、上述の結果（実施例1参照）は、二回目の免疫化が、準優位のエピトープに対する免疫応答の幅を広げることを示した。
【0317】
結論として、INVAC-1と同様に、人工的に組換えた（shuffled）、ScrambledのまたはInvertedのhTERTが媒介する免疫化は、インビボで細胞溶解性活性を示すhTERT特異的CD8T細胞を産生することができる。
【0318】
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【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【図27E】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【図28D】
【図28E】
【図28F】
【図29A】
【図29B】
【図29C】
【図29D】
【図29E】
【図29F】
【配列表】
【国際調査報告】