特表 2017-504808 アルツハイマー病の早期診断のためのバイオマーカーおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-504808(P2017-504808A)

(43)【公表日】2017年2月9日

(54)【発明の名称】アルツハイマー病の早期診断のためのバイオマーカーおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20170120BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20170120BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 D

   G01N37/00 102

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2016-549268(P2016-549268)

(86)(22)【出願日】2015年1月28日

(85)【翻訳文提出日】2016年9月23日

(86)【国際出願番号】EP2015051677

(87)【国際公開番号】WO2015113995

(87)【国際公開日】20150806

(31)【優先権主張番号】14152770.5

(32)【優先日】2014年1月28日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/932,307

(32)【優先日】2014年1月28日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】516225692

【氏名又は名称】プレデムテック・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106080

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 晶子

(72)【発明者】

【氏名】フォイアーヘルム−ハイデル，アンネグレート

(57)【要約】

本発明は、第１観点において、少なくとも４つの特異的バイオマーカーを測定することにより、対象におけるアルツハイマー病を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための、および重症ＡＤの存在を判定するための方法に関する。さらに、少なくとも４つの特異的バイオマーカーに対する検出手段、特に抗体を含む、キットおよびアレイを提供する。さらに、アルツハイマー病を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための、コンピュータープログラムプロダクトおよびコンピューター実装された方法を提供する。
【選択図】 図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための方法であって、
ａ）対象からの生体試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を測定し；そして
ｂ）そのバイオマーカーのレベルまたは量に基づいて、ＡＤの存在または発症リスクを高特異度で判定または診断する
ことを含み、
ＡＤバイオマーカーは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーであり、それによりＩＬ−１８および／またはＭＣＰ−１の増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ベータ１の減少はＡＤの存在または発症リスクの指標となる方法。

【請求項2】

対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）の状態を判定するための方法であって、
ａ）対象からの生体試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を測定し；そして
ｂ）そのバイオマーカーのレベルまたは量に基づいて、ＡＤの存在または状態を高特異度で判定する
ことを含み、
ＡＤバイオマーカーは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーであり、それによりＩＬ−１８および／またはＶＥＧＦの増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１および／またはＴＧＦ−ベータ１の減少は重症ＡＤの存在の指標となる方法。

【請求項3】

さらに、対象から生体試料を得る工程を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に定める少なくとも５つのＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を測定し、好ましくは請求項１に定める全部のバイオマーカーを測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

バイオマーカーがタンパク質またはペプチドの形態である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

バイオマーカーの組合わせ
ａ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータ１；
ｂ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１；
ｃ） ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１；
ｄ） ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１
ｅ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１
ｆ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＭＣＰ−１
ｇ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＭＣＰ−１
を測定する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ＡＤの診断またはそのリスクの予測および重症ＡＤの存在の判定の特異度が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の正確度を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

生体試料が組織、または血液を含めた体液から選択され、好ましくは末梢血から、特に血清から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

測定が、イムノアッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、多重イムノアッセイまたは免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット法、ラインアッセイ、ドットブロットアッセイを用いて実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量をそのバイオマーカーの基準レベルまたは量と比較し、その基準レベルは
ａ）ＡＤに罹患していない集団から得られた平均的なレベル；および／または
ｂ）ＡＤ患者を含む個体のグループからの平均または中間レベル
であり、
前決定した相対または絶対カットオフレベルまたは量をそれぞれ超えるかまたはそれ未満であれば、そのバイオマーカーのレベルまたは量はＡＤの存在もしくは発症リスクまたは重症ＡＤの存在の指標となる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

対象においてＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定し、または重症ＡＤの存在を判定する際に使用するためのキットであって、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに対する検出手段を含み、場合により、ＡＤの存在または発症リスクを診断するための、および重症ＡＤの存在を判定するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法にそのキットを使用する方法についての指示を含むキット。

【請求項12】

ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、多重イムノアッセイまたは免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット法、ラインアッセイ、ドットブロットアッセイである、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に使用するための、請求項１１または１２に記載のキット。

【請求項14】

請求項１に定める少なくとも４つのバイオマーカー、好ましくは少なくとも５つのバイオマーカーを検出するための手段を含む、または請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に使用するための、アレイ。

【請求項15】

検出手段が、請求項１に定めるＡＤバイオマーカーを特異的に指向する抗体、好ましくはモノクローナル抗体である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のキットまたはアレイ。

【請求項16】

個体の生体試料におけるバイオマーカーのレベルまたは量を決定し、そのＡＤバイオマーカーの基準レベルまたは量と比較した少なくとも４つ、たとえば少なくとも５つのＡＤバイオマーカーの増加または減少を決定することによりＡＤの診断、リスク査定または療法コントロールに使用するための、請求項１に定める少なくとも４つ、たとえば５つのＡＤバイオマーカーの組合わせの in vitro 使用；その際、基準レベルは
ａ）ＡＤに罹患していない集団から得られた平均的なレベル；および／または
ｂ）ＡＤ患者を含む個体のグループからの平均または中間レベル
であり、
前決定した相対または絶対カットオフレベルまたは量をそれぞれ超えるかまたはそれ未満であれば、そのバイオマーカーのレベルまたは量はＡＤの存在または発症リスクの指標となる。

【請求項17】

ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定する、コンピューター実装された方法であって、
ａ）対象の生体試料および場合により対照において、請求項１に定めるＡＤバイオマーカーのうち少なくとも４つの測定レベルまたは測定量のデータを取得し；
ｂ）試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を、データベースから得られるかあるいはカットオフ対照の測定レベルまたは測定量として得られるカットオフ値と比較することにより、工程ａ）のデータをコンピューター処理し；
ｃ）そのレベルまたは量がカットオフレベルを超えてまたはそれ未満に増加または減少しているＡＤバイオマーカーを分析および同定する
工程を含む方法。

【請求項18】

分析が主成分分析である、請求項１７に記載のコンピューター実装された方法。

【請求項19】

さらに、
ｄ）ＡＤマーカーの分析および同定のデータを出力ユニット上に示す、特にＡＤの診断またはリスクの結果を示す
工程を含む、請求項１７または１８に記載のコンピューター実装された方法。

【請求項20】

請求項１〜１０または請求項１７〜１９のいずれか１項に定める工程を実施するためのコンピューター実行可能な指示を有する、コンピューター可読媒体またはコンピュータープログラムプロダクト。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、第１観点において、少なくとも４つの特異的バイオマーカーの組合わせを測定することにより、対象におけるアルツハイマー病を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための、または重症アルツハイマー病の存在を判定するための方法に関する。さらに、少なくとも４つの特異的バイオマーカーに対する検出手段、特に抗体を含む、キットおよびアレイを提供する。さらに、アルツハイマー病を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための、または重症アルツハイマー病の存在を判定するための、コンピュータープログラムプロダクトおよびコンピューター実装された方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病（ＡＤ）はヒトの生活に対する多大なコストを伴なう進行性脳疾患である。この疾患の影響は、特にリスクを伴なう高齢の住民の数が増加しつつあるため、発展途上国の政府にとっての関心の高まりでもある。アルツハイマー病は最も一般的な形態の認知症（記憶喪失および他の認知障害についての一般用語）である。一般に、認知症には血管性認知症、およびアルツハイマー病もしくはアルツハイマー型認知症を含む変性性認知症の形態が含まれる。種々のタイプの認知症がアミロイドパシー(amyloidopathy)（アルツハイマー型認知症）、タウオパシー(tauopathy)（レビー小体病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ピック病）、およびシヌクレイノパシー(synucleinopathy)（パーキンソン病）として記載されている。

【0003】

認知症に対する最大のリスク因子は年齢である。８５歳を超えた者はこの状態になる可能性がより大きいが、ある形態の認知症は５０歳未満の者に起きる。ある個体は遺伝的に特定の形態の認知症、たとえばアルツハイマー病およびハンチントン病をより発症しやすい。さらに、幾つかの要因、たとえば脳傷害（脳卒中により起きた損傷を含む）、栄養不良、感染症、医薬に対する反応、被毒、脳の腫瘍または病変が一次的または永続的な認知症を引き起こす可能性がある。

【0004】

アルツハイマー病は慢性進行性神経変性疾患であり、それは最も優勢なタイプの認知症である。神経イメージング法を含めて現在の診断手段は絶えず改善されている。それにもかかわらず、アルツハイマー病診断の感度および特異度を高めるのは依然として困難である。２つの診断領域が特に困難である：第１に、初期のアルツハイマー病を軽度の認知障害および普通の老化から鑑別すること；第２に、特に種々のタイプの認知症に類似の臨床症状が共通する場合に診断特異度を高めること。現在のところ、脳脊髄液（ＣＳＦ）からのベータ−アミロイド（１−４２）、総タウおよびホスホ−タウ−１８１の分析が、アルツハイマー病を高い信頼性および有効性で診断し、それを他の形態の認知症から鑑別するための最良の生物学的マーカーである。Marksteiner J. et al. (Drugs Today 43(6):423-31, 2007)は、ＣＳＦバイオマーカーおよび推定血液関連マーカーの使用を概説している。軽度認知障害のリスクがタウタンパク質遺伝子変異により影響を受けること、および軽度認知障害がアルツハイマー病と共通の遺伝的背景をもつことが示唆されている。これは、認知衰退の遺伝的リスクを解明して有効な臨床試験を設計するのに役立つ可能性がある。Welge V. et al. (J. Neural. Transm. 116(2):203-12, 2009)は、脳脊髄液 （ＣＳＦ）濃度について、比 Ａベータ１−４２／Ａベータ１−３８／ｐ−タウがアルツハイマー病（ＡＤ）患者を非アルツハイマー型認知症患者から強力に識別し、適用可能なスクリーニングおよび鑑別診断用のＡＤバイオマーカーについての正確度要求を満たすと報告した。

【0005】

Alzheimer’s associationは、疾患経過に際しての７つの病期を提唱している；すなわち、１：障害なし、２；ごく軽度の衰退（初期）３：軽度の衰退、４：中等度の衰退、５：軽度に重度の衰退、６：重度の衰退、および７：きわめて重度の衰退。

【0006】

神経変性障害の早期検出は、より効果的な患者の処置を可能にするであろう。最近の研究により、アルツハイマー病のような障害は、数年間続くと思われる発症前期(pre-symptomatic phase)を特徴とし、その間に神経変性が起きているが、臨床症状はその後に現われることが立証された。これは、挑戦 −この前臨床期間の個体をいかにして同定するか− と好機の両方を提供する。疾患症状が現われる前の前臨床期間に予防療法を開始することができるであろう。したがって、臨床研究の主な目標は、神経変性の時間経過において診断を逆行させるためのツールを開発することによりこれらの疾患の早期検出を改善することである。さらに、アルツハイマー病の発症リスクをもつ個体の早期同定はきわめて望ましい。神経変性障害を早期検出することおよびＡＤの最終進行を遅延させることによるＡＤの予防および治療は患者においてより効果的であると当技術分野で記載されている。

【0007】

凝集したアミロイド−ベータ（Ａベータ）ペプチドがアルツハイマー病の病原であることが示唆されている。in vitro および in vivo で、これらの凝集物は別個の生物活性をもつ球状オリゴマーおよび線状フィブリルを含めた多様な形態でみられる。散発性アルツハイマー病（ＡＤ）の診断およびモニタリングは長い間、末期疾患を伴なう個体の臨床検査に依存してきた。しかし、これからの抗ＡＤ療法は個体が神経変性のごく軽度の徴候を示した時点で開始するのが最適である。軽度認知障害段階のＡＤについてのコアバイオマーカーとして脳脊髄液アミロイド−ベータ（Ａベータ）について進展中のコンセンサスがある。ＡベータはＡＤの発病に直接関与し、あるいは他の一次病原因子と密接に相関する。それは、アミロイド前駆体タンパク質(amyloid precursor protein)（ＡＰＰ）から、ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１およびガンマ−セクレターゼ複合体に依存するタンパク質分解プロセシングにより産生され、広範囲のプロテアーゼにより分解される。

【0008】

脳脊髄液（ＣＳＦ）中の４０および４２アミノ酸残基形のアミロイド−ベータ（Ａベータ（１−４０）およびＡベータ（１−４２））がアルツハイマー病（ＡＤ）の有効なバイオマーカーとして提唱された。ＣＳＦ中のＡベータペプチドの定量分析は、ほぼ例外なくイムノソルベントベースのアッセイ、たとえば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法の使用に依存してきた。しかし、容易に自己凝集し、または他のタンパク質およびガラス器具に結合するというＡベータペプチドの特性のため、そのような分析はきわめて困難である。ペプチドが翻訳後修飾を受ける可能性およびＥＬＩＳＡアッセイにおける内因性ＣＳＦ成分との交差反応の可能性により、分析はさらに複雑である。最近の知見は、Ａベータ（１−４０）に対比して減少した血漿Ａベータ（１−４２）はＡＤのリスクを高める可能性があることを示唆している(Hampel H. et al., Alzheimers Dement. 4(1):38-48, 2008)。

【0009】

腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能炎症性サイトカインである。このサイトカインは主にマクロファージにより分泌される。それは、細胞の増殖、分化、アポトーシス、脂質代謝、および凝血を含めた広域の生物学的プロセスの調節に関与する。このサイトカインは、自己免疫疾患、インスリン抵抗性、および癌を含めた多様な疾患における関与が示唆されている。マウスにおけるノックアウト試験は、このサイトカインの神経保護機能も示唆した。

【0010】

アルツハイマー病（ＡＤ）における主因としての炎症の概念は、これまで、病変と関連する自己破壊的変化の死後所見を抗炎症性物質の保護効果の疫学的証拠と組み合わせたものに基づいていた。現在、ＡＤのリスクは炎症性物質インターロイキン１アルファ、インターロイキン１ベータ、インターロイキン６、腫瘍壊死因子アルファ、アルファ（２）−マクログロブリン、およびアルファ（１）−アンチキモトリプシンにおける合計１０の多型によって実質的に影響されるという証拠がある。それらの多型はすべて共通のものである。

【0011】

WO 2005/052292およびWO 2006/133423には、ＡＤおよび他の神経障害を体液において診断、層別化およびモニタリングするための方法および組成物が記載されている。たとえば上記WO出願に由来するEP 2 211 183 B1は、ＡＤを診断およびモニタリングするための方法を同定し、その際、バイオマーカーとしてインスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＥＧＦＢＰ−２）を測定している。引用したこの特許出願は、ＡＤを含めた神経障害を診断するのに適切なはずであるとされる多数の可能性のあるバイオマーカーを提示している。しかし、高い正確度でのＡＤの診断および予測を可能にする具体的なバイオマーカーのセットは開示されていない。さらに、Thambisetty, N., et al, biomarkers and medicine, future medicine, London, Volume 4, No. 1, pages 65 to 79には、血液ベースのＡＤバイオマーカー、すなわち困難ではあるが可能性はあるものが開示されている。WO 2009/149185は、二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用を同定している。

【0012】

最近の知見は、アルツハイマー病（ＡＤ）の発病における脳由来神経栄養因子(brain-derived neurotrophic factor)（ＢＤＮＦ）の関与を示唆している。ＢＤＮＦは、成体の脳においてニューロンの機能、シナプスの柔軟性および構造統合性の維持に関与する内因性タンパク質である。血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）のＢＤＮＦ濃度が、高感度ＥＬＩＳＡにより２７人のＡＤ患者において９人の正常圧水頭症(normal pressure hydrocephalus)（ＮＰＨ）患者および２８人の同齢健康対照と比較して査定された。ＡＤ患者（１８．６ｎｇ／ｍｌ）およびＮＰＨ患者（１８．１ｎｇ／ｍｌ）に、健康な対照（２１．３ｎｇ／ｍｌ；ｐ＝０．０４１／ｐ＝０．０１７）と比較して有意の血清ＢＤＮＦ濃度低下がみられた。ＢＤＮＦの血清濃度は、ＡＤ患者およびＮＰＨ患者の両方において、ＣＳＦレベル、年齢またはミニメンタルステート検査(mini mental state examination)（ＭＭＳＥ）スコアと相関しなかった。ＡＤおよびＮＰＨにおけるＢＤＮＦの血清レベルの低下は、栄養支持の欠如を反映し、よって両疾患における進行性変性に関与しているという可能性がある。

【0013】

慢性炎症はアルツハイマー病（ＡＤ）の特徴である。ＡＤのリスクと関連する相互作用が、炎症性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）および抗炎症性サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）に対する遺伝子の調節領域における多型間に報告されている。一部はこれら２遺伝子における遺伝子変異による、ある高齢者におけるＩＬ−６およびＩＬ−１０両方の調節異常が、ＡＤの発症に関与する可能性がある(Cambarros O. et al., J. Neuroinflammation 23(6):22, 2009)。

【0014】

ＩＬ−６（インターフェロン ベータ２とも命名されている）はアルツハイマー病（ＡＤ）において著しく増加し、糖尿病など他の疾患に対する強い相関性をもつ。ＩＬ−６は他の神経変性疾患およびうつ病に対する相関性ももつ。アルツハイマー病（ＡＤ）における役割は、インターロイキン類であるＩＬ−１０、ＩＬ−１８、および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）についても疑われている。Malaguera L. et al. (Neuropathology 26(4):307-12, 2006)は、ＡＤおよび血管性認知症を伴なう患者において非認知症の同齢対象と比較してＩＬ−１８のレベルが有意に増大したと判定した。

【0015】

Mateo et al. (Acta Neurol. Scand. 116(1):56-8, 2007)は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が重要な神経栄養および神経保護作用を決定すると記載している。低い血清ＶＥＧＦレベルはアルツハイマー病と関連する。

【0016】

神経保護の統合性は、認知障害およびＡＤの発症に対抗する重要な構成要素である。アルツハイマー病患者グループは、ベースラインにおいてインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）（３．７±１．２ｐｇ／ｍｌ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（６３±１８ｐｇ／ｍｌ）およびＴＧＦ−ベータ１（３３±１０ｐｇ／ｍｌ）の著しい減少を示した；健康な高齢者と比較（ＩＧＦ−１，９．５±２．４ｐｇ／ｍｌ；ＶＥＧＦ，１０５±３１ｐｇ／ｍｌ；およびＴＧＦ−ベータ１，６８±１８ｐｇ／ｍｌ）。ＩＧＦ−１とＶＥＧＦの濃度間の有意の正の相関性が、健康な対象（ｒ＝０．８７，ｐ＜０．００１）およびＡＤ対象の両方にみられた(Luppi C. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl. 1):173-84, 2009)。

【0017】

血漿ホモシステインの増加は、老化に伴なってみられる一般的問題、たとえば認知障害、認知症、うつ病、骨粗鬆症骨折、および機能衰退と関連する。ホモシステインレベルは血管性認知症患者においてアルツハイマー病（ＡＤ）患者または対照より高いことが知られている。高い血漿ホモシステイン濃度と低い血清葉酸濃度は、認知症およびＡＤの発症の独立予測子である。血漿ホモシステインレベルの正常範囲は５〜１５μｍｏｌ／Ｌ、ＡＤ患者については１５μｍｏｌ／Ｌを超える。

【0018】

単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球リッチ細胞浸潤物を特色とする多様な疾患、たとえばアテローム性硬化症、うっ血性心不全およびリウマチ様関節炎において著しく誘導される。

【0019】

血清におけるＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベル増大の検出は、いずれか特定の疾患に特異的ではない。それは炎症プロセスの有用な指標である。血漿ＣＲＰは、集団ベースの設定で非認知症の高齢者に広くみられる軽度認知障害(mild cognitive impqirment)（ＭＣＩ）および非健忘性ＭＣＩと関連する。これらの所見は、ＭＣＩの発病における炎症の関与を示唆する。高い血漿ＣＲＰレベルは、ＭＣＩを伴なう患者において認知衰退の加速、および認知症のリスク増大と関連する。ＡＤ患者は血管性認知症患者より高いＣＲＰレベルをもっていた（それぞれ、４．２±０．６ 対 １．７±０．２，ｐ＜０．００１）。ステップワイズ多重ロジスティック回帰分析(stepwise multiple logistic regression analysis)は、認知症（オッズ比＝ＯＲ＝４．９６５，５％信頼区間＝ＣＩ＝１．４０２−１３．２３，ｐ＝０．００４）、フィブリノーゲン（ＯＲ＝１．０１１，ＣＩ＝１．００７−１．０１５，ｐ＜０．００１）、および年齢（ＯＲ＝１．１５８，ＣＩ＝１．０６３−１．２６１，ｐ＜０．００１）が独立してＣＲＰのレベルと相関することを示した。この研究は、炎症がＡＤにおいて病原としての役割をもつ可能性があることを示唆する (Mancinella A. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl 1):185-94, 2009)。

【0020】

アルツハイマー病の治癒法は現在は無いが、それの治療のための薬物ベースおよび非薬物ベースの方法がある。一般にそれらの薬物治療は症状の進行を遅延させることを目標とする。幾つかのバイオマーカーが有効であることは大きな患者グループにおいて十分に証明されているが、成功は疾患キャリヤーをそれの初期に同定することと直接相関する。これは、分子手段による適時かつ正確な診断形態の診断が必要であることの正当な理由となる；Ray S. et al., Nat. Med. 13(11):1359-62, 2007。

【0021】

結論として、初期アルツハイマー病の改善された診断スクリーニングは多数の利点をもつ。早期診断により、疾患初期の者が薬物療法についての意思決定に関与できる。既存の薬物療法は、それらが多少とも作動するのであれば、疾患初期に最も良く作動する。早期判定は早期介入を可能にする。薬物療法が進展するのに伴なって、将来は、アルツハイマー病の進行に伴なって起きる脳に対する不可逆的損傷が早期検出によって阻止される可能性は十分にある。よって、ＡＤを初期に高い特異度で診断できる方法および検査システムが現在求められている。さらに、ＡＤを他のタイプの認知症から鑑別できるためには、新規な方法およびアッセイ法が必要である。すなわち、後期ＡＤを同定することは治療計画を決定するのに役立つ。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0022】

【特許文献1】WO 2005/052292

【特許文献2】WO 2006/133423

【特許文献3】EP 2 211 183 B1

【非特許文献】

【0023】

【非特許文献1】Marksteiner J. et al. (Drugs Today 43(6):423-31, 2007)

【非特許文献2】Welge V. et al. (J. Neural. Transm. 116(2):203-12, 2009)

【非特許文献3】Hampel H. et al., Alzheimers Dement. 4(1):38-48, 2008

【非特許文献4】Thambisetty, N., et al, biomarkers and medicine, future medicine, London, Volume 4, No. 1, pages 65 to 79

【非特許文献5】Cambarros O. et al., J. Neuroinflammation 23(6):22, 2009

【非特許文献6】Malaguera L. et al. (Neuropathology 26(4):307-12, 2006)

【非特許文献7】Mateo et al. (Acta Neurol. Scand. 116(1):56-8, 2007)

【非特許文献8】Luppi C. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl. 1):173-84, 2009

【非特許文献9】Mancinella A. et al., Arch. Gerontol. Geriatr. 49(Suppl 1):185-94, 2009

【非特許文献10】Ray S. et al., Nat. Med. 13(11):1359-62, 2007

【発明の概要】

【0024】

本発明は、第１観点において、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）を診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための方法であって、
ａ）対象からの生体試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を測定し；そして
ｂ）そのバイオマーカーのレベルまたは量に基づいて、ＡＤの存在または発症リスクを判定または診断する
ことを含み、
ＡＤバイオマーカーは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーであり、第１態様において、それによりＩＬ−１８および／またはＭＣＰ−１の増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ベータ１の減少はＡＤの存在または発症リスクの指標となる方法に関する。さらに、ホモシステインを診断の検証のためのさらなるバイオマーカーとして使用できる。ＡＤ患者において、ホモシステインのレベルまたは量は低減する。

【0025】

さらに、対象においてアルツハイマー病（ＡＤ）の状態を判定するための方法であって、
ａ）対象からの生体試料におけるＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を測定し；そして
ｂ）そのバイオマーカーのレベルまたは量に基づいて、ＡＤの存在または状態を高特異度で判定する
ことを含み、
ＡＤバイオマーカーは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーであり、それによりＩＬ−１８および／またはＶＥＧＦの増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１および／またはＴＧＦ−ベータ１の減少は重症ＡＤの存在の指標となる方法を提供する。

【0026】

すなわち、他の態様において、認知症患者において重症ＡＤから開始する後期ＡＤに罹患していることの検証は、ＩＬ−１８および／またはＶＥＧＦの増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１および／またはＴＧＦ−ベータ１の減少を特徴とする。

【0027】

前記マーカーのうち少なくとも４つの組合わせは、一方では少なくとも９０％の高い特異度でＡＤの早期診断および発症リスクの検出を可能にし、他方では少なくとも９０％の高い特異度で重症型を判定する。

【0028】

バイオマーカーＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１のうち少なくとも４つ、たとえば少なくとも５つ、または全部を測定することが好ましい。

【0029】

前記に定めた少なくとも４つのバイオマーカーを含むバイオマーカー分子シグネチャは、臨床ＡＤの予測において平均して９０％、たとえば９５％、特に９６％の正確度、たとえば感度を達成する。少なくとも、それらのバイオマーカー分子シグネチャはアルツハイマー病のリスクを早期に検出して適切な療法を早期に開始でき、かつ重症ＡＤの存在を判定できる。

【0030】

さらに、第２観点において、本発明は、対象においてアルツハイマー病を診断し、またはそれの発症リスクを予測し、または重症ＡＤの存在を判定する際に使用するためのキットであって、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ならびに場合によりホモシステイン（ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定する際に使用するための）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに対する検出手段を含み、場合により、ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定するための、および重症ＡＤの存在を判定するための本発明による方法にそのキットを使用する方法についての指示を含むキットに関する。

【0031】

さらに、本発明は、個体の生体試料におけるバイオマーカーのレベルまたは量を決定し、そのバイオマーカーの基準レベルまたは量と比較した少なくとも４つ、たとえば少なくとも５つのバイオマーカーの増加または減少を決定することにより、ＡＤの診断、査定または療法コントロールに使用するための、本発明において定める少なくとも４つ、たとえば少なくとも５つのバイオマーカーのうち組合わせの in vitro 使用に関する。そのバイオマーカーは、レベルまたは量がその特異的バイオマーカーのカットオフよりそれぞれ高いかまたは低い場合にはＡＤの指標となる。さらに、本発明は、本発明による少なくとも４つのバイオマーカーに対する検出手段を含むアレイ、特に検出手段が抗体であり、それらのバイオマーカーの検出が免疫学的に行なわれる、アレイまたはキットに関する。

【0032】

さらに、本発明は、ＡＤを診断するための、またはそれの発症リスクを判定するための、コンピューター実装された方法であって、
ａ）対象の生体試料および場合により対照において、本発明によるＡＤバイオマーカーのうち少なくとも４つの測定レベルまたは測定量のデータを取得し；
ｂ）試料におけるバイオマーカーのレベルまたは量を、データベースから得られるかあるいはカットオフ対照の測定レベルまたは測定量として得られるカットオフ値と比較することにより、工程ａ）のデータをコンピューター処理し；
ｃ）そのレベルまたは量がカットオフレベルを超えてまたはそれ未満に増加または減少しているバイオマーカーを同定する
工程を含む方法に関する。

【0033】

最後に、本発明は、本発明による方法を実施するためのコンピューター実行可能な指示を有する、コンピューター媒体またはコンピュータープログラムプロダクトに関する。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１には、各プローブの配置を示すマイクロタイタープレートのスキームを提示する。各試料を二重に測定する。さらに、陽性対照、陰性対照およびカットオフ対照が存在し、プレート上に内部標準が得られる。この場合、５つの患者試料を検査する。

【図2】図２には、表５に示すマーカー組合わせの特異度を示す。立証されるように、６つのマーカーのうち少なくとも４つのマーカーの使用により９０％を超える特異度が得られる。

【発明を実施するための形態】

【0035】

本明細書中で用いる用語“アルツハイマー病”は、大脳の前頭葉および側頭葉の大脳皮質の神経細胞を死滅させて脳回（大脳皮質上の隆起部）を壊死または減少させる変性性脳疾患、特にＮＩＮＣＤＳ−ＡＲＤＡ基準(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke, and Alzheimer's Disease and Related Disorders Association)により定義されるものを意味する。

【0036】

本明細書中で用いる用語“診断”は、病的状態の存在または特色を同定することを意味する。本発明の目的に関して、“診断”は、体液の ex vivo 分析に基づいてアルツハイマー病を発症するリスクを判定することを意味する。

【0037】

本明細書中で用いる用語“バイオマーカー”は、疾患状態を指示できる物質を意味する。アルツハイマー病の診断を目的とする本発明に関して、“バイオマーカー”は、脳細胞が正常状態であるか、あるいはアルツハイマー病により攻撃されているかを指示する物質を意味する。“バイオマーカー”には、正常な健康対象と比較してアルツハイマー病に罹患しているかまたはアルツハイマー病により冒される傾向のある患者においてその量が増加または減少するポリペプチドおよび糖タンパク質が含まれる。

【0038】

本明細書中で用いる用語“血液”には、全血、血清および血漿が含まれる。
本明細書中で用いる用語“抗体”は、生体分子の抗原性領域に特異的に結合する免疫グロブリンを意味する。本発明の目的に関して、抗体はバイオマーカーに特異的に結合するものであり、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および組換え抗体を含む。さらに、本発明の抗体には、２つの全長軽鎖および２つの全長重鎖をもつ完全形態だけでなく、抗体分子の機能性フラグメントが含まれる。抗体分子の機能性フラグメントは、少なくとも抗原結合機能を保持するフラグメントを意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどのフラグメントを含む。

【0039】

本明細書中で用いる用語“抗原−抗体複合体”は、バイオマーカーを認識する抗体へのそのバイオマーカーの結合生成物を意味する。
本明細書中で用いる用語“含む（compriseまたはcomprising）”および用語“含有する（containまたはcontaining）”には、“からなる（consistおよびconsisting of）”の態様が含まれる。

【0040】

本明細書中で用いる用語“カットオフレベル”は、ＡＤに罹患しているかまたはＡＤの発症リスクをもつ個体を区別できる相対レベルまたは絶対レベルを表わす。カットオフレベルは、相対レベルの場合は相違倍率(fold difference)として得られ、あるいは絶対値の場合は特定の数値、たとえばタンパク質の場合はｎｇもしくはｐｇ／ｍｌとして表わされるレベルとして得られる。本明細書に示すようにカットオフレベルよりそれぞれ低いかまたは高い値は、ＡＤを診断できる、またはＡＤの発症リスクを判定できる、または重症ＡＤの存在、そして結果的にＡＤ患者における療法コントロールを判定できるとみなされる。

【0041】

本明細書中で用いる用語“ＡＤバイオマーカー”は、ＡＤ診断バイオマーカーであるバイオマーカーを表わす。
本明細書中で用いる用語“予測する”は、ある個体が生体疾患を発症する有意に高い確率をもつという知見を得ることを表わす。

【0042】

本明細書中で用いる用語“生体試料”は、個体から得られた、診断またはモニタリングアッセイに使用できる多様な試料タイプを包含する。体液(biological fluid)試料は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、および生体由来の他の液体試料を包含する。必要であれば、たとえば濃縮または分離のために試料を予め処理することができる。

【0043】

“個体”は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり、個体または対象という用語は互換性をもって用いられる。
本明細書中で用いる“基準値”は、絶対値、相対値、上限もしくは下限をもつ値、ある範囲の値、平均的な値(average value)、中央値(median value)、平均値(mean value)、または特定の対照値もしくはベースライン値と比較した値である可能性がある。基準値は個体の試料値、たとえば検査すべき個体からそれ以前の時点で得た試料から得られた値、または検査される個体以外のＡＤ患者、もしくは正常個体、すなわちＡＤを伴なうと診断されなかった個体からの試料から得られた値に基づくことができる。基準値は多数の試料、たとえばＡＤ患者または正常個体からの試料に基づくことができ、あるいは検査すべき試料を含む試料のプールに基づくことができる。

【0044】

本明細書中で用いる“a”、“an”および“the”は、別に指示しない限り単数または複数を意味することができる。
本明細書中で用いる相違倍率(fold difference)は、ＡＤバイオマーカーについての測定値と基準値の相違規模(magnitude difference)の数値表示を表わす。相違倍率は、測定数値を基準数値で割ることにより数学的に計算される。たとえば、ＡＤバイオマーカーについての測定値が２０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）であり、基準値が１０ｎｇ／ｍｌであれば、相違倍率は２である。あるいは、ＡＤバイオマーカーについての測定値が１０ｎｇ／ｍｌであり、基準値が２０ｎｇ／ｍｌであれば、相違倍率は５０％である。

【0045】

本発明者らは、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ならびに場合によりホモシステインから選択される少なくとも４つのバイオマーカーの組合わせのレベルまたは量を測定し、第１態様では、それにより対象の生体試料中のＩＬ−１８、ＭＣＰ−１および／またはホモシステインの増加、および／またはＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ベータ１の減少を判定すると、１、２または３つのマーカーのみの組合わせを用いるより高い特異度で、初期ＡＤを診断し、またはアルツハイマー病の発症リスクを判定できることを認めた。特に、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の発症リスクは、本明細書に明記する６つのマーカーの発現レベルの変化、すなわち、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１および／またはホモシステインの増加、並びにＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよび／またはＴＧＦ−ベータ１の減少と関連することが同定された。さらに、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のうち少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、たとえば６つ全部のバイオマーカーを組み合わせた場合、特異度および感度がＡＤの診断または予後を可能にするのに十分なほど高く、それに対し各バイオマーカー単独はＡＤ以外の種々の疾患および状態で変化する可能性があることが認められた。さらに、結果を確認するためにホモシステインの量またはレベルを使用できる。

【0046】

さらなる観点において、本発明による方法はＡＤを他の形の樹立した認知症から鑑別し、後期、すなわち重症期および極度重症期のＡＤを判定することができる。すなわち、樹立したＡＤは、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＭＣＰ−１および／またはＴＧＦ−ベータ１の減少、および／またはＶＥＧＦおよび／またはＩＬ−１８の増加を特徴とする。表２は、正常健康対照グループおよび重症アルツハイマー病患者グループの血清試料中の前記タンパク質の測定量を示す。これに関して、用語“重症(severe)”と“樹立した(established)”は、本明細書中で互換性をもって用いられることを明記する。

【0047】

【表1】

【0048】

特に、本発明において定める６つのバイオマーカーのうち少なくとも４つのバイオマーカーがそれぞれ増加または減少している場合、ＡＤの診断またはＡＤの発症リスクの判定および重症ＡＤの存在の判定の正確度はきわめて高く、療法をモニターすることが可能である。特に、正確度は少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、ある例では少なくとも９６％である。たとえば、この方法の感度は少なくとも９０％、たとえば少なくとも９５％、たとえば少なくとも９６％の範囲である。さらに、本発明による方法の特異度は少なくとも８５％、たとえば少なくとも９０％、たとえば少なくとも９２％または少なくとも９５％である。よって、本発明によるバイオマーカーの特定の組合わせによりＡＤを高い正確度で、特に先行技術と比較して高い正確度で、診断または判定することができる。

【0049】

所望により、本発明によるバイオマーカーを、当技術分野で既知であって適切なＡＤバイオマーカーであると記載されている他のバイオマーカーと組み合わせてもよい。本発明において定めるバイオマーカーと組み合わせることができる適切なバイオマーカーは当業者に周知である。

【0050】

一群のバイオマーカーのレベルまたは量がＡＤに罹患している対象において対照グループと比較して変化すると当技術分野で記載されている。しかし、特に単一バイオマーカーはそれの発現レベルまたは量が他の疾患においても変化する可能性があるという事実からみて、その特異度および感度、すなわち正確度は、ＡＤの診断またはそれの発症リスクの判定のために十分または満足できるものではない。

【0051】

これに対し、本発明によるバイオマーカーのセット、すなわち本発明によるバイオマーカーのうち少なくとも４つであるバイオマーカーは、高い正確度および特異度でＡＤを初期に診断し、かつ重症ＡＤの存在を判定することができる。

【0052】

さらに、測定、判定または診断という用語はＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を物理的に測定し、物理的に判定し、または物理的に診断する工程を含むことを明記する。すなわち、本方法は、ＡＤバイオマーカーのレベルまたは量をレベルまたは量の測定に有用な既知の方法で測定し、その測定したレベルまたは量を用いてそれに応じて判定または診断する工程を含む。

【0053】

好ましい態様において、バイオマーカーはそれのペプチドまたはタンパク質の形で測定される。しかし、ＡＤバイオマーカーのレベルまたは量を核酸レベルで、たとえば生体試料中のｍＲＮＡのレベルまたは量に基づいて測定することもできる。

【0054】

本発明によれば、本明細書に開示する方法は、それぞれin vitro 法および／または in vivo 法に関する。好ましくは、本方法は個体から得られた in vitro で提供される試料に基づく in vitro 法である。

【0055】

本発明者らは、特定のＡＤバイオマーカー、すなわち脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のレベルまたは量の測定および判定により、ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを予測でき、またＡＤを他のタイプの認知症から鑑別し、また後期ＡＤを判定できることを立証するのを目標とした。

【0056】

好ましい態様において、下記に定める組合わせのバイオマーカーを測定する：
ａ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータ１；
ｂ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１；
ｃ） ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１；
ｄ） ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１。

【0057】

他の好ましい態様には下記の組合わせが含まれる：
ｅ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦおよびＭＣＰ−１
ｆ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＭＣＰ−１
ｇ） ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータ１、ＭＣＰ−１。

【0058】

本発明のある態様において、本方法は本発明において定める全部のバイオマーカーのレベルまたは量を測定することを含む。さらに、ホモシステインのレベルまたは量も測定する。

【0059】

前記のように、本発明によるバイオマーカーのバイオマーカーシグネチャ、すなわちレベルまたは量は、臨床アルツハイマー病の予測において平均して９６％の正確度を可能にする。これを用いて、認知症の明白な徴候をもつ患者がＡＤを反映することを確認でき、さらにそれを用いて不明瞭な症状または軽度の認知障害を伴なう患者を診断してそのような患者が実質的またはよりいっそう高いＡＤ罹患リスクをもつと診断することができる。ＡＤ診断の技術水準と比較して、本発明のバイオマーカーは実質的利点をもつ。たとえば、すべてのバイオマーカーが血液中に存在する。それらは血液または血清試料において標準的装置で容易に信頼性をもって測定でき、組織または脳脊髄液を分析する必要がない。

【0060】

本発明のある態様において、生体試料は血液、組織または体液から選択される。好ましい態様において、生体試料は血液、特に血清である。
前記のように、ある態様において、バイオマーカーＩＬ−１８，およびＭＣＰ−１ならびにホモシステインは、対照対象として用いた非疾患ヒトのグループにおけるそのバイオマーカーのレベルまたは量と比較して、特に疾患初期のＡＤ患者の試料において、たとえばＡＤ患者グループの血液において増加する。樹立した（重症）ＡＤについては、バイオマーカーＩＬ−１８およびＶＥＧＦが増加する。

【0061】

さらに、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１およびＶＥＧＦは、非疾患ヒトのグループの試料における量と比較して特に疾患初期のＡＤ患者グループの試料中にはより低い量で存在する。樹立した（重症）ＡＤについては、バイオマーカーＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１およびＭＣＰ−１が増加する。

【0062】

すなわち、単一バイオマーカーについては対照グループまたは基準グループと比較した量またはレベルの変化はＡＤグループにおいて最大７０％の範囲であるが、本発明において定めるバイオマーカーの組合わせ、すなわち少なくとも４つのバイオマーカーのレベルまたは量の変化または変異の決定は、ＡＤの診断またはそれの発症リスクの判定の正確度を９０％以上に高めることができる。

【0063】

たとえば、ＢＤＮＦはＡＤ患者の血液において対照対象と対比してほぼ７０％減少する。このサイトカインは年齢との高い有意の関係を示す。
表１は、バイオマーカータンパク質、ならびに正常な健康対照グループおよび初期アルツハイマー病患者グループの血清試料におけるそのタンパク質の測定量を示す。

【0064】

【表2】

【0065】

本発明によるバイオマーカーのレベルまたは量の測定は既知の方法により行なわれる。たとえば、レベルまたは量をタンパク質レベルで決定する場合、イムノアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ラジオ免疫拡散法、ウェスタンブロット法、オークターロニー免疫拡散法(Ouchterlony immunodiffusion)、ロケット免疫電気泳動(rocket immunoelectrophoresis)、免疫組織染色法(immunohistostaining)、免疫沈降アッセイ、補体固定アッセイ、ＦＡＣＳ、およびプロテインチップアッセイ、ならびに免疫蛍光アッセイ、多重イムノアッセイ、ラインアッセイ、またはドットブロットアッセイを実施する。

【0066】

好ましい態様において、ＥＬＩＳＡを実施する。バイオマーカーのレベルまたは量を測定するための測定手段の代表例には、タンパク質特異的抗体が含まれる。特異的分子である抗体は当技術分野で既知であり、あるいは当技術分野で記載されている方法に基づいて容易に調製できる。タンパク質レベルの測定は、タンパク質に特異的に結合する測定手段、たとえば抗体を用いて、タンパク質の量を測定することを意味する。その測定法は上記方法のいずれかに定めることができる。一般にその方法には抗原−抗体複合体の形成、および既知方法によるその複合体の測定が含まれる。

【0067】

抗原−抗体複合体の形成量は、バイオマーカータンパク質の検出標識または発現標識の信号サイズを測定することにより決定できる。すなわち、抗体を当技術分野で既知の検出標識で標識することができ、それには酵素、蛍光性マーカー、リガンド、発光体、マイクロ粒子、および酸化還元分子の群が含まれるが、これらに限定されない。検出標識として使用できる酵素の例にはＤ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、ＧＤＰアーゼ、ＲＮアーゼ、ルシフェラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびホスホエノールピルビン酸デカルボキシラーゼが含まれるが、これらに限定されない。蛍光性マーカーの例にはイソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびフルオレスカミン(fluorescamin)が含まれるが、これらに限定されない。リガンドの例にはビオチン、アビジン、ならびにビオチンおよびアビジンの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

【0068】

前記のように、前記のタンパク質バイオマーカーからなる群から選択される種類のタンパク質のレベルを測定するために、本発明はそれらのバイオマーカータンパク質に対して特異的な作用剤、たとえば抗体、好ましくはモノクローナル抗体、組換え抗体または抗体フラグメントの形のものを含む組成物を提供する。

【0069】

ある態様において、本発明による方法は、生体試料において測定したＡＤバイオマーカーのレベルまたは量をそのバイオマーカーの基準レベルまたは量と比較する工程を含む。基準レベルは
ａ）ＡＤに罹患していない集団から得られた平均的なレベル；および／または
ｂ）ＡＤ患者を含む個体のグループからの平均または中間レベル
である。特に、バイオマーカーのレベルまたは量がカットオフレベルをそれぞれ超えるかまたはそれ未満であるかを判定する。

【0070】

たとえば、表３および４は血液試料、たとえば血清試料におけるバイオマーカータンパク質のレベルまたは量を測定した際のカットオフレベルを提示する；早期診断の場合（表３）。

【0071】

【表3】

【0072】

たとえば、ＢＮＤＦについて、その量は、たとえば正常な健康対照グループにおける２０ｎｇ／ｍｌからＡＤ患者グループにおける約１０ｎｇ／ｍｌ以下にまで、少なくとも５０％減少する。ＩＧＦ−１について、変化は、たとえば約７０ｎｇ／ｍｌから６０ｎｇ／ｍｌ以下にまで約４０％を超える減少である。ＶＥＧＦについて、減少は、たとえば３０９ｐｇ／ｍｌから２５０ｐｇ／ｍｌ以下にまで約１８％以上である。ＴＧＦ−ベータ１について、減少は、たとえば３７０ｐｇ／ｍｌから３００ｐｇ／ｍｌ以下にまで少なくとも２０％である。ＭＣＰ−１について、増加は、たとえば１６０ｐｇ／ｍｌから３００ｐｇ／ｍｌ以上にまで４０％以上である。ＩＬ−１８について、増加は、たとえば２００ｐｇ／ｍｌ以上にまで少なくとも１５％である。さらに、本発明において定めるバイオマーカーを用いて得られる結果を検証または確認するためにホモシステインのレベルまたは量を測定することができる。

【0073】

さらに、表４は重症ＡＤを伴なう患者の場合のカットオフレベルを示す。

【0074】

【表4】

【0075】

さらなる観点において、本発明は、ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定し、および重症ＡＤの存在を判定する際に使用するためのキットであって、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）から選択される少なくとも４つのバイオマーカーに対する検出手段を含み、場合により、ＡＤの存在または発症リスクを診断するための、また重症ＡＤの存在を判定するための本発明による方法にそのキットを使用する方法についての指示を含むキットに関する。

【0076】

診断バイオマーカーを検出するための本発明のキットは、前記タンパク質に対して特異的な抗体を含み、さらに、標識（たとえば基質との発色反応に有用な酵素）にコンジュゲートした二次抗体；標識との発色反応を誘導するための発色基質溶液；洗浄溶液；および酵素反応停止溶液を含むことができる。それはさらに、適切なマイクロプレート、標準溶液およびプロトコルを含むことができる。標識にコンジュゲートした二次抗体の代わりに、前記および後記バイオマーカーに対して特異的な（一次）抗体自体が標識にコンジュゲートしていてもよい。

【0077】

診断バイオマーカーを検出するための本発明のキットは、抗原−抗体結合反応により抗原を定量または定性分析し、その抗原−抗体結合反応を常法、たとえばＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）またはサンドイッチアッセイにより測定することにより、アルツハイマー病を診断することができる。たとえば、前記または後記の診断バイオマーカーを検出するためのキットは、被検体および対照でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレート表面を用いて組換えモノクローナル抗体タンパク質と反応させるためのＥＬＩＳＡを実施する様式で提供できる。抗原−抗体結合反応のレセプターとして、ポリビニルもしくはポリスチレン樹脂のウェルプレート、ニトロセルロース膜、またはスライドガラスを使用できる。

【0078】

発色反応を行なう一般的標識、たとえばＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、コロイド金、蛍光標識、たとえばフルオレセイン、ＦＩＴＣ（ポリＬ−リジン−イソチオシアン酸フルオレセイン）もしくはＲＩＴＣ（イソシアン酸ローダミン−Ｂ）、または色素を、好ましくは二次抗体コンジュゲートの標識として、または一次抗体コンジュゲートの標識として使用できる。

【0079】

発色反応を生じる基質は、標識に応じて選択される。特に好ましい基質は、ペルオキシダーゼと共に、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼと共に用いるものであり、たとえばＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチオゾリン−６−スルホン酸））、またはＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）である。好ましくは、発色基質は緩衝液（たとえば、０．１Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．５）に溶解した状態で調製される。抗体コンジュゲートとして用いられるＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）は、過酸化水素の存在下で発色基質、たとえばＴＭＢを分解して、発色沈殿を生成する。発色沈殿の沈降度を肉眼で検査することにより、タンパク質バイオマーカーの存在または非存在を検出する。ＴＭＢの色は４５０ｎｍ、ＡＢＴＳの色は４２０ｎｍ、ＯＰＤの色は４９２ｎｍで測定される。好ましくは、硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）溶液をペルオキシダーゼ酵素停止溶液として使用できる。

【0080】

あるいは、酵素標識としてアルカリホスファターゼを、発色基質としてＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニルホスフェート）を使用できる。ニトロフェノールの黄色を４０５ｎｍで測定することができる。この反応は、水酸化ナトリウムの添加により停止される。

【0081】

洗浄溶液は、好ましくはリン酸緩衝液、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎ ２０を含み、より好ましくは０．０２Ｍのリン酸緩衝液、０．１３ＭのＮａＣｌ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含む緩衝液である。抗原−抗体結合反応を実施して抗原−抗体複合体を形成した後、その抗原−抗体複合体を二次抗体コンジュゲートと反応させ、次いで適量の洗浄溶液を反応器に添加することにより３〜６回洗浄する。

【0082】

バイオマーカーの量を決定する他の方法、特にＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ポリアクリルアミドゲル上でのウェスタンブロッティング、イムノブロッティング、および免疫組織染色法も考慮される。当技術分野で周知のように、バイオマーカーの定量決定のために考慮される特定の方法にキットを適合させる。

【0083】

本発明の好ましい態様において、バイオマーカータンパク質の量をＥＬＩＳＡにより、西洋わさびペルオキシダーゼ、ならびにＴＭＢ、ＡＢＴＳおよびＯＰＤから選択される発色基質を用いて測定する。

【0084】

前記に定めたように、バイオマーカーのレベルまたは量をタンパク質レベルで決定する場合、検出手段はたとえば抗体である。あるいは、核酸レベルでレベルまたは量を測定する場合、検出手段は核酸分子であってもよい。

【0085】

たとえば、キットは当業者に既知のＥＬＩＳＡまたは他の適切なイムノアッセイである。
さらに、本発明は本発明において定めるバイオマーカーのうち少なくとも４つを検出するための、たとえばそれらのバイオマーカーのうち少なくとも５つ、特に本発明において定めるバイオマーカーのうち少なくとも６つを検出するための検出手段を含む、アレイを提供する。

【0086】

本発明によるキットまたはアレイは、本発明による方法を実施するために特に有用である。キットまたはアレイの態様において、検出手段は本発明において定めるバイオマーカーに特異的に結合する抗体、たとえばモノクローナル抗体である。

【0087】

たとえば、本発明によるアレイはマイクロタイタープレートであってもよい。
マイクロタイタープレートは、陽性対照、陰性対照および／またはカットオフ対照のレベルまたは量を決定すると共に、バイオマーカーのレベルまたは量を決定することができる。よって、そのアレイはそのバイオマーカーの増加または減少、特にそのバイオマーカーのカットオフレベル未満またはそれを超える増加または減少を決定し、そのバイオマーカーのレベルまたは量に基づいてＡＤの存在または発症リスクを容易に判定または診断し、また重症ＡＤの存在を判定することができる。図１に、適切なマイクロタイタープレートを示すスキームを提示する。定めたように、患者試料１〜５を、本発明による７つのバイオマーカーから選択される６つの被検体、すなわち被検体１〜６で試験する。それに加えて、陽性対照および陰性対照が備えられている。さらに、試料中のバイオマーカーのレベルまたは量がＡＤを判定または診断できるのに適切であるかどうかを判定するために、カットオフ対照が備えられている。よって、同一アレイ上のこの対照により、測定したＡＤバイオマーカーのレベルまたは量が診断に適切であるか否かを容易に判定できる。これは、コンピューター実装された方法またはシステムに特に有用である。

【0088】

すなわち、本発明は他の観点において、本発明において定めるバイオマーカーのうち少なくとも４つ、たとえば５つ、たとえば６つ、または全部の in vitro 使用であって、個体の生体試料におけるバイオマーカーのレベルまたは量を決定し、そのバイオマーカーの基準レベルまたは量と比較した、バイオマーカーのうち少なくとも４つ、たとえば５つ、たとえば６つ、または全部の増加または減少を判定することによる、アルツハイマー病の診断、リスク査定または療法コントロールにおける使用に関する；その際、基準レベルはＡＤに罹患していない集団から得られた平均的なレベル；および／またはＡＤ患者を含む個体グループからの中間レベルであり、その際、増加または減少をそれに応じて同定できるようにその個々のバイオマーカーのカットオフレベルを使用する。本発明のある態様において、カットオフレベルは、たとえば本発明によるアレイに記載したように、本発明による方法に対照として存在する適切なカットオフ対照により反映される。

【0089】

さらに、本発明は、ＡＤを診断し、またはそれの発症リスクを判定する、コンピューター実装された方法であって、
ａ）対象の生体試料および場合により対照において、本発明において定めるＡＤバイオマーカー、すなわち脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子ベータ１（ＴＧＦ−ベータ１）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のうち少なくとも４つの測定レベルまたは測定量のデータを取得し；
ｂ）試料におけるバイオマーカーのレベルまたは量を、データベースから得られるかあるいはカットオフ対照の測定レベルまたは測定量として得られるカットオフ値と比較することにより、工程ａ）のデータをコンピューター処理し；
ｃ）そのレベルまたは量がカットオフレベルを超えてまたはそれ未満に増加または減少しているバイオマーカーを分析および同定する
工程を含む方法に関する。

【0090】

場合により、本方法はさらに、バイオマーカーそれぞれについての結果を、または単純に陽性もしくは陰性の診断またはリスク査定を、たとえば着色及び強調提示した形で出力ユニット上に提示する工程を含む。

【0091】

たとえば、分析は主成分分析により実施される。分析はエラー分析を伴なうことができる。
最後に、本発明は、本発明による方法の工程を実施するためのコンピューター実行可能な指示を有する、コンピューター媒体またはコンピュータープログラムプロダクトに関する。

【0092】

ある態様において、測定値と基準値の比較には、測定値がカットオフレベルを超えるかまたはそれ未満であるかをそれに応じて同定できるように、測定値と基準値の相違倍率を計算することが含まれる。

【実施例】

【0093】

実施例１：変性性脳疾患を伴なう患者および正常な健康対象から採集した血液の定量タンパク質分析
アルツハイマー病を伴なう患者および健康なヒト対象の対照グループからの血液試料を、患者の同意を得て、適用できる倫理ガイドラインに従って採集する。

【0094】

血清分離チューブを用い、試料を室温で２時間または４℃で一夜凝固させた後、約１０００×ｇで２０分間遠心する。調製したばかりの血清を直ちにアッセイするか、あるいは試料をアリコートで−２０または−８０℃に保存する。反復凍結／融解サイクルは避けるべきである。

【0095】

採集した試料の下記のマーカータンパク質、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−１８の抗原に対して特異的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡ（試料抗原を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ）を実施する。

【0096】

実施例２：ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１についてのＥＬＩＳＡ
それぞれの抗原のＰＢＳ，ｐＨ７．４中における標準希釈液１．０ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）を調製する。それを室温に１０分間保持し、穏やかに振とうする。

【0097】

それぞれＩＬ−１８、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＣＰ−１、およびＩＧＦ−１に対する抗体でプレコートされたウェルを、Ｂ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、またはＧｅｎＳｃｒｉｐｔその他から購入する。

【0098】

上記１μｇ／ｍｌ標準抗原溶液のそれぞれ１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４希釈液１００μｌを調製し、それぞれ１つのウェル（７ウェル）に添加する。８番目のウェルはブランク用に残しておく。ウェルをプレートシーラーでシールし、室温で２時間、連続振とう（７００ｒｐｍ）しながらインキュベートする。インキュベーション後、プレートを吸引し、４００μｌの洗浄溶液で３回洗浄し、再び吸引する。次いで１００μｌのそれぞれの抗ＨＲＰ−コンジュゲート抗体をプレートの各ウェルに添加し、室温で２時間、７００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。各ウェルの内容物を吸引する。プレートを再び３回洗浄した後、２００μｌのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）基質溶液を添加する。ＯＰＤ基質溶液は、備え付けのＯＰＤ希釈剤に１０ｍｇのＯＰＤ錠２個を添加し、続いて５０μｌの３％ Ｈ_２Ｏ_２を添加することにより調製される。プレートを次いで暗所で２０〜２５分間インキュベートすると、その間に発色する。１００μｌの停止溶液（３Ｎ硫酸）の添加により発色を停止する。プレートをマイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍで読み取る。

【0099】

ＯＰＤの代わりに、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチオゾリン−６−スルホン酸））、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）、またはＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）を発色基質として使用できる。

【0100】

あるいは、酵素としてのアルカリホスファターゼと、ＰＮＰＰ（パラ−ニトロフェニルホスフェート）を使用できる。室温で１５分後にニトロフェノールの黄色を４０５ｎｍにおいて測定することができる。この反応は、等体積の０．７５Ｍ ＮａＯＨの添加により停止する。

【0101】

プレート上の標準品から標準曲線を作成し、これを用いて試料中の表題抗原の濃度を計算する。
実施例３：アルツハイマー病患者および正常な健康対象からの試料の試験
９６ウェル高結合型Ｓｔｒｉｐｗｅｌｌイムノアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＹ、またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、濃度１０μｇ／ｍｌのそれぞれＩＬ−１８、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＣＰ−１、およびＩＧＦ−１の抗体（特異的抗体の１：１００希釈溶液２０μｌ；抗体はＢ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｎｚｙｍｅ、ＩＢＬ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、またはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入）でプレコートし、そしてブロックする。ＰＢＳにより１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６および１：６４の比率で希釈した血漿試料１００μｌを、プレコートした各ウェルに添加する。プレートを室温で２時間、７００ｒｐｍで回転させながらインキュベートする。プレートをＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミンにより４℃で一夜ブロックする。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した後、ＢＤＮＦ、ＩＧＦ−１、ＴＧＦ−ベータ１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１８およびＭＣＰ−１の特異的抗体１００μｌを各ウェルに適用し、４℃で一夜インキュベートする。一次抗体に対して特異的なＨＲＰ連結二次抗体５０μｌを添加し、室温で２時間、７００ｒｐｍで回転させながらインキュベートする。プレートを０．１Ｍ ＰＢＳ（炭酸水素ナトリウム緩衝液，Ｓｉｇｍａ，ｐＨ９．６）で３回洗浄して、結合していない抗体−酵素コンジュゲートを除去する。１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）を添加すると、それはメタノール中３％ Ｈ_２Ｏ_２溶液の存在下で前記の酵素によって黄色に変化する。１００μｌの３Ｎ硫酸の添加により反応を停止する。プレートのウェルの吸光度を４５０ｎｍで測定して、抗原の存在および量を決定する。吸光度と濃度の相関性は被験試料についての標準（基準）曲線である。

【0102】

表５：本発明において定めるバイオマーカーの組合わせを示す；ナンバリングは下記のとおり：１＝ＢＤＮＦ、２＝ＩＧＦ−１、３＝ＶＥＧＦ、４＝ＴＧＦ−ベータ１、５＝ＭＣＰ−１、６＝ＩＬ−１８

【0103】

【表5】

【0104】

実施例４：ホモシステインの決定
Araki A. and Sako Y., J. Chromatogr. 422:43-52, 1987の方法に従って、ホモシステインを蛍光検出付き高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定する。

【0105】

結果：
図２に、特異度に対する本発明において定める６つのバイオマーカーのうち少なくとも４つの組合わせの関連性を示す。立証されるように、少なくとも４つのマーカーを組み合わせた場合にのみ少なくとも９０％の特異度が得られるが、少なくとも９０％の特異度を得るにはこれで十分である。

【図1】

【図2】

【国際調査報告】