特表 2017-505303 網膜炎症の治療において使用するための薬剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-505303(P2017-505303A)

(43)【公表日】2017年2月16日

(54)【発明の名称】網膜炎症の治療において使用するための薬剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20170127BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20170127BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170127BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170127BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   A61P27/02

   A61P29/00

   A61P43/00 111

   A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2016-547841(P2016-547841)

(86)(22)【出願日】2015年1月22日

(85)【翻訳文提出日】2016年9月7日

(86)【国際出願番号】EP2015051293

(87)【国際公開番号】WO2015110556

(87)【国際公開日】20150730

(31)【優先権主張番号】14152189.8

(32)【優先日】2014年1月22日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】516216287

【氏名又は名称】ユニバーシティ ピエレ エ マリー クリエ‐パリ ６（ユーピーエムシー）

(71)【出願人】

【識別番号】513297324

【氏名又は名称】センター ナショナル デ ラ リシェルシェ サイエンティフィック（シーエヌアールエス）

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】センラウブ，フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】ギロノー，ザビエル

(72)【発明者】

【氏名】レヴィー，オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】サヘル，ホセ‐アライン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084MA16

4C084MA58

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZC021

4C084ZC022

4C085AA14

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG01

(57)【要約】

本発明は、網膜炎症、より具体的には、加齢黄斑変性および網膜色素変性症の治療において使用するための予防および／または治療薬に関し、前記薬剤は、活性成分として、ＩＬ−６阻害剤、ＡＰＯＥ阻害剤および／またはＦａｓ活性化剤から選択される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

網膜炎症の治療において使用するための予防および／または治療薬であって、前記予防および／または治療薬が、活性成分としてＩＬ−６阻害剤を含む、予防および／または治療薬。

【請求項2】

前記網膜炎症が、萎縮型加齢黄斑変性および網膜色素変性症を含む、請求項１に記載の予防および／または治療薬。

【請求項3】

前記ＩＬ−６阻害剤が（ｉ）ＩＬ−６活性のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６を認識する抗体、可溶性ＩＬ−６受容体もしくはＩＬ−６翻訳の阻害剤、または（ｉｉ）ＩＬ−６受容体のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６Ｒを認識する抗体もしくはＩＬ−６Ｒ結合ペプチドを含む、請求項１または２に記載の予防および／または治療薬。

【請求項4】

前記予防および／または治療薬が、眼内に、好ましくは硝子体内注射により投与され、または、局所眼内投与により適用される、請求項１〜３のいずれかに記載の予防および／または治療薬。

【請求項5】

前記薬剤が、ＩＬ−６阻害剤を５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１〜４のいずれかに記載の予防および／または治療薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、網膜炎症、より具体的には加齢黄斑変性および網膜色素変性症の治療において使用するための予防および／または治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は先進国における法的盲および最も一般的な老人性眼障害の主因である。ＡＭＤは眼の黄斑部における神経上皮の変性を特徴とする。ＡＭＤの２つの主な進行型は識別することができる：血管新生型ＡＭＤおよび萎縮型ＡＭＤ。

【0003】

「滲出型」または「ウェット型」ＡＭＤとも呼ばれる血管新生型ＡＭＤは、異常な脈絡膜（または、時に網膜）血管の侵襲および網膜への流体漏出を特徴とし、これらの現象はまた「脈絡膜血管新生」または「ＣＮＶ」とも呼ばれる。血管新生型ＡＭＤは工業先進国の高齢者におけるの失明の主因であり、いくつかの治療が開発され、とりわけ血管新生および血管透過性の強力な刺激因子であるＶＥＧＦＡを標的にする療法により、処置患者の臨床状況を改善することが示されている。

【0004】

「地図状萎縮」または「ＧＡ」、「末期ドライ型」ＡＭＤまたは「ドライ型」ＡＭＤとも呼ばれる萎縮型ＡＭＤは、黄斑部に影響を与え、この疾患では網膜色素上皮は、大きいコンフルエント領域の自然変性により、もはや視細胞機能をサポートすることができない。萎縮型ＡＭＤおよび血管新生型ＡＭＤの発生率は同程度であるが、萎縮性病変の拡大および関連する視力障害は通常、より遅いプロセスである。今日に至るまで、主に、好適な分子標的が同定されていない結果として、地図状萎縮を予防または治癒するために利用できる現在承認された治療はない。いくつかの研究により、ビタミンＥおよびＣ、βカロテイノイドおよび亜鉛の消費は、萎縮型ＤＭＬＡの発症を遅らせることができるが、疾患の進行は残念なことに停止しないことが証明されている。

【0005】

いくつかの研究により、網膜色素上皮と視細胞外節の間に位置する網膜下腔は、免疫抑制性の網膜色素上皮シグナルにより媒介される免疫特権ゾーンであることが確立されている。それにもかかわらず、単核食細胞（ミクログリア細胞、単球およびマクロファージを含む細胞のファミリーを含む）は、進行型の失明の危機にあるＡＭＤ、すなわちＣＮＶおよび地図状萎縮において、網膜下腔内に蓄積することが示された。ミクログリア細胞の網膜下遊走は、視覚副産物を排除するため、および視覚を維持するために必要であると考えられるが、網膜下腔内でのミクログリアならびにマクロファージの蓄積により、ＡＭＤ発症におそらく関与する破壊的炎症が起こると主張された（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ａｎｄ Ｋｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

【0006】

さらに、インターロイキン６（ＩＬ−６）などの炎症メディエータータンパク質のレベルの増加がＡＭＤを患う患者の血清中で測定されている（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８ ａｎｄ Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。それにもかかわらず、これらの研究では、ＡＭＤ、より具体的には萎縮型ＡＭＤを予防および／または治療するための特定の分子標的を同定することができず、または示唆することもできなかった。ＥＰ１９９００６０号は、血管新生型のＡＭＤを治療するためにＩＬ−６アンタゴニストの使用を開示したが、この文書は、ＩＬ−６アンタゴニストが萎縮型のＡＭＤを患う患者に対して何らかの有益な効果を発揮するといういかなる表記または示唆も含んでいない。加えて、ＷＯ２００４／０４５５０７号は、病的な血管新生と関連する疾患／状態、例えば、例としてウェット型ＡＭＤが脈絡膜血管新生の異常な発症を特徴とすることから、この疾患を治療するためにＩＬ−６アンタゴニストの使用を開示している。ドライ型ＡＭＤは血管新生の欠如または異常に依存しないことから、ＷＯ２００４／０４５５０７号は、決して、ドライ型ＡＭＤの治療を記載していると見なすことはできない。同様に、ＥＰ２１１６５３０はＩＬ−６産生に対する阻害活性および／または脈絡膜血管新生に対する阻害効果を有する新規ピロール誘導体を開示するが、決して、血管新生を伴わない疾患、例えばドライ型ＡＭＤの治療に関するものではない。

【0007】

イマチニブメシル酸塩、ポナチニブ、ボスタニブ（ｂｏｓｕｔａｎｉｂ）、ＤＡＰＴおよびベキサロテンなどの活性成分を投与することを含むドルーゼンを治療するための方法もまた、ＷＯ２０１３／１４８１８３号において開示されている。ドルーゼンは網膜色素上皮とブルッフ膜の間に蓄積する細胞外沈着物である。それらは凝集した細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、および分泌タンパク質、ならびに脂質および細胞成分で構成される。ＷＯ２０１３／１４８１８３号において示されるように、ＡＰＯＥは顕著に、ヒトドルーゼンの主成分である。ＷＯ２０１３／１４８１８３号は、細胞を上記の活性成分で処理すると、とりわけ、ドルーゼン中のＡＰＯＥレベルが減少することを示唆しており、ドルーゼンの治療と萎縮型ＡＭＤの治療の間の関連性を確立している。それにもかかわらず、この文書は実際には、試験した活性成分の実際の効果がドルーゼンにおけるＡＰＯＥの発現および蓄積に関して得られることを明白に証明することができない。さらに、この文書において萎縮型ＡＭＤとドルーゼンの間で確立された因果関係は、この分野内のいくつかの刊行物により明確に無効にされている（例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７を参照されたい。これは、ドルーゼンが、単にＡＭＤを発症するリスクを増加させるものと見なされ得るにすぎず、決して萎縮型ＡＭＤの症状として考えるべきではないことを証明している）。

【0008】

これらの要素を考慮すると、そのため、依然として、網膜炎症、より特に萎縮型ＡＭＤを防予防および／または治療するための活性成分を同定することが継続して必要とされている。

【0009】

この目的は本発明により達成される。というのも、本発明者らは、意外にも、増加量のＡＰＯＥがＩＬ−６発現を誘導し、次にＩＬ−６が細網色素上皮発現ＦａｓＬをダウンレギュレートすることを証明したからである。本発明者らは、ＦａｓＬ発現の減少によって、その後、長期の網膜下単核食細胞の生存、年齢依存性の単核食細胞の蓄積、および関連する視細胞変性が起こり得ることを証明した。これらの知見は、ＡＰＯＥの炎症促進機能を明らかにしたが、これは、他の病的状況におけるそのよく知られた抗炎症の役割と、完全に対照をなしている。発明者らは、このように、意外にも、網膜炎症、より特にはドライ型ＡＭＤおよび網膜色素変性症における過剰のＡＰＯＥおよびＩＬ−６を阻害すると、炎症を予防および／または治癒させ、よって、視細胞変性を予防することになることを確立した。

【発明の概要】

【0010】

このように、本発明は、網膜炎症の治療において使用するための予防および／または治療薬に関し、前記予防および／または治療薬は、活性成分としてＩＬ−６阻害剤、ＡＰＯＥ阻害剤および／またはＦａｓ活性化剤を含む。

【0011】

本発明の特定の実施形態では、前記網膜炎症は、萎縮型加齢黄斑変性（萎縮型ＡＭＤ）および網膜色素変性症を含む。好ましい実施形態では、本発明は萎縮型加齢黄斑変性（萎縮型ＡＭＤ）の治療において使用するための予防および／または治療薬に関する。

【0012】

特定の実施形態では、発明において使用するための前記ＩＬ−６阻害剤は下記を含む：（ｉ）ＩＬ−６活性のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６を認識する抗体、可溶性ＩＬ−６受容体もしくはＩＬ−６翻訳の阻害剤、または（ｉｉ）ＩＬ−６受容体のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６Ｒを認識する抗体もしくはＩＬ−６Ｒ結合ペプチド。

【0013】

特定の実施形態では、本発明において使用するための前記ＡＰＯＥ阻害剤は、ＡＰＯＥに対する抗体、ＡＰＯＥ翻訳の阻害剤、または可溶性ＡＰＯＥ受容体もしくはその機能的断片を含む。

【0014】

本発明の一実施形態では、前記Ｆａｓ活性化剤は、Ｆａｓアゴニスト、例えばＦａｓＬもしくはその機能的断片、またはＦａｓＬ模倣ペプチドを含む。

【0015】

本発明の一実施形態では、前記予防および／または治療薬は硝子体内に送達される。

【0016】

本発明の一実施形態では、前記予防および／または治療薬は、ＩＬ−６阻害剤および／またはＡＰＯＥ阻害剤を、それぞれ、５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、網膜炎症の治療において使用するための予防および／または治療薬に関し、ここで、前記予防および／または治療薬は、活性成分としてＩＬ−６阻害剤、ＡＰＯＥ阻害剤および／またはＦａｓ活性化剤を含む。

【0018】

本発明の意味において、「網膜炎症」は、単核食細胞により媒介される網膜下腔の炎症を意味する。本発明の特定の実施形態では、前記網膜炎症は、萎縮型加齢黄斑変性（萎縮型ＡＭＤ）および網膜色素変性症を含む。本発明の別の実施形態によれば、「網膜炎症」という表現は、萎縮型加齢変性および網膜色素変性症を含むが、脈絡膜血管新生または血管新生型ＡＭＤを含まない。本発明の特定の実施形態では、前記予防および／または治療薬はこのように、萎縮型加齢黄斑変性および網膜色素変性症を治療するために使用されるが、脈絡膜血管新生のためには使用されない。別の実施形態では、本発明の前記予防および／または治療薬は、ウェット型ＡＭＤおよび血管新生に関連する疾患を治療するためには使用されない。発明の好ましい実施形態では、前記予防および／または治療薬は、萎縮型加齢黄斑変性を治療するために使用される。

【0019】

本発明の特定の実施形態では、予防および／または治療薬は、ＩＬ−６阻害剤を含む。

【0020】

ＩＬ−６は「Ｂ細胞刺激因子２」（ＢＳＦ２）またはインターフェロンβ２としても知られているサイトカインであり、これは、その特異的ＩＬ−６受容体（８０ＫＤａタンパク質）の結合によりその生物活性を発揮することが知られている。

【0021】

本発明の意味において、「ＩＬ−６阻害剤」は、このように、直接的なＩＬ−６の阻害、またはそのＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）活性の阻害のいずれかにより、ＩＬ−６によって媒介される伝達シグナルを遮断し、ＩＬ−６生物活性を阻害する物質を意味する。

【0022】

ＩＬ−６の直接阻害剤としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＩＬ−６もしくはその断片に対する抗体もしくは抗体断片、ＩＬ−６がもはやＩＬ−６受容体に結合することができない状況でＩＬ−６に結合することができるタンパク質もしくはペプチド、またはＩＬ−６遺伝子および／または転写物に対するｓｉＲＮＡもしくはＡＳＯ。ＩＬ−６直接阻害剤は、可溶性ＩＬ−６受容体、またはＩＬ−６に結合して天然ＩＬ−６受容体と競合する能力が保存されたその断片をさらに含み得る。

【0023】

ＩＬ−６受容体の阻害剤としては、ＩＬ−６受容体に対する抗体またはその断片、ＩＬ−６バリアント、ＩＬ−６断片またはＩＬ−６ペプチド模倣化合物が挙げられるが、それらに限定されず、それらは、ＩＬ−６受容体に結合する能力および／またはＩＬ−６受容体との結合に対してＩＬ−６と競合する能力が保存されているが、ＩＬ−６受容体の結合によりシグナル伝達を促進する能力を喪失している。ＩＬ−６受容体の阻害剤は、遺伝子および／またはＩＬ−６受容体遺伝子の転写物に対するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯをさらに含み得る。

【0024】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−６に対する抗体としては、好ましくはＭＨ１６６抗体（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔａｌ．，１９８８）、ＳＫ２抗体またはそのヒト化誘導体（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９６）、シルツマブ（Ｓｉｌｔｕｍａｂ）（Ｊａｎｓｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）ＴＭ Ｃ３２６ （Ａｖｉｄｉａ）、シルクマブおよびシルツキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ Ｉｎｃ．）、オロキズマブ（ＵＶＢＩｎｃ．）、ＡＬＤ５１８（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＶＸ３０（Ｖａｘｉｎｅｘ）、ＡＲＧＸ−１０９（ａｒＧｅｎ−ＸＢＶ）およびＦＭ１０１（Ｆｅｍｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。好ましくは、抗ＩＬ−６抗体ＭＡＢ４０６は本発明で使用するために企図される（Ｍａ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。

【0025】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−６受容体に対する抗体としては、好ましくはＭＲ１６−１抗体（Ｔａｍｕｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， １９９３）；ＰＭ−１抗体（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８９）；ＡＵＫ１２−２０抗体、ＡＵＫ６４−７抗体およびＡＵＫ１４６−１５抗体（ＷＯ９２／１９７５９号）が挙げられる。

【0026】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−６バリアントとしては、好ましくはＢｒａｋｅｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｓａｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９４、ＷＯ９６／１８６４８号およびＷＯ９６／１７８６９号で記載されるもの、ならびにサリルマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、トシリズマブ（Ｃｈｕｇａｉ、Ｒｏｃｈｅ）およびＦＥ３０１（Ｃｏｎａｒｉｓ／Ｆｅｒｒｉｎｇ）の名称で知られている抗体が挙げられる。

【0027】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＩＬ−６部分ペプチドおよびＩＬ−６受容体部分ペプチドとしては、好ましくはＪＰ−Ａ（公開）Ｈ０２−１８８６００号、ＪＰ−Ａ（公開）Ｈ０７−３２４０９７号、ＪＰ−Ａ（公開）Ｈ０８−３１１０９８号、およびＵＳ５２１００７５で記載されるものが挙げられる。

【0028】

特定の実施形態では、本発明で使用するための可溶性ＩＬ−６受容体は、好ましくは本質的に細胞膜結合型ＩＬ−６受容体の細胞外領域からなり、細胞膜結合型受容体とは、膜貫通領域および細胞内領域を欠くという点で異なる。

【0029】

本発明の特定の実施形態では、予防および／または治療薬は、ＡＰＯＥ阻害剤を含む。

【0030】

アポリポタンパク質Ｅ（または「ＡｐｏＥ」）は、トリグリセリドリッチリポタンパク質構成要素の通常の異化にとって必須であるカイロミクロンおよび中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）において見出される、２９９アミノ酸長のアポリポタンパク質のクラスである。ＡｐｏＥは多型であり、１つまたは２つのアミノ酸のみが互いに異なる３つの主なアイソフォーム、すなわちＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４が同定されている。それにもかかわらず、これらの差異はＡＰＯＥ構造および機能の両方を変化させると考えられる。

【0031】

本発明の意味において、「ＡＰＯＥ阻害剤」は、このように、ＡＰＯＥを直接阻害することで、または受容体を介する、、もしくは受容体が存在するコレステロールリッチ脂質ラフトとのその相互作用を介するその活性の阻害により、ＡＰＯＥ生物活性を阻害する物質を意味する。

【0032】

ＡＰＯＥ直接阻害剤としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：ＡＰＯＥに対する抗体もしくはその断片、ＡＰＯＥがもはや脂質（例えばコレステロール）および／もしくはＡＰＯＥ受容体に結合することができない状況でＡＰＯＥに結合することができるタンパク質もしくはペプチド、またはＡＰＯＥ遺伝子および／もしくは転写物に対するｓｉＲＮＡもしくはＡＳＯ。ＡＰＯＥ直接阻害剤は、ＡＰＯＥに結合して天然のＡＰＯＥ受容体と競合する能力、または脂質に結合するその能力が保存された可溶性ＡＰＯＥ受容体またはその断片をさらに含み得る。

【0033】

ＡＰＯＥ受容体の阻害剤としては、ＡＰＯＥ受容体に対する抗体またはその断片、ＡＰＯＥバリアント、ＡＰＯＥ断片またはＡＰＯＥペプチド模倣化合物が挙げられるが、それらに限定されず、それらは、ＡＰＯＥ受容体に結合する能力および／または脂質および／またはＡＰＯＥ受容体との結合に対してＡＰＯＥと競合するそれらの能力が保存されているが、ＡＰＯＥ受容体結合を介してシグナル伝達を促進するそれらの能力を欠いている。ＡＰＯＥ受容体の阻害剤は、ＡＰＯＥ受容体遺伝子の遺伝子および／または転写物に対するｓｉＲＮＡまたはＡＳＯをさらに含み得る。

【0034】

本発明の意味において、「ＡＰＯＥ」は、ＡＰＯＥのアイソフォームの全体または一部、すなわちＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の群から選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらにいっそう好ましくは少なくとも３つのＡＰＯＥアイソフォームを意味する。

【0035】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＡＰＯＥ阻害剤は抗ＡＰＯＥ抗体、例えばＡＢ９４７（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＮＢ１１０−６０５３１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ＬＳ−Ｂ６７８０／４３３５６（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＥＰ１３７３Ｙ（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）である。

【0036】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＡＰＯＥ４−特異的抗体としては、好ましくは、ＡｐｏＥ４抗体（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ）、アポリポタンパク質Ｅ４抗体（ＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ａｐｏ−Ｅ４（５Ｇ７）モノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ａｐｏ−Ｅ４（９Ｄ１１）モノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）、およびＡｐｏＥ４（５Ｂ５）抗ヒトマウスＩｇＧ ＭｏＡｂ（ＩＢＬ−Ａｍｅｒｉｃａ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））の名称で市販されているものが挙げられる。

【0037】

さらに、本発明の特定の実施形態では、ＡＰＯＥ阻害剤は、ＬＤＬに対する可溶性受容体（ＬＤＬＲ）、例えば組換えヒトＬＤＬ Ｒ２１４８−ＬＤ／ＣＦ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ）である。

【0038】

本発明の特定の実施形態では、予防および／または治療薬はＦａｓ活性化剤を含む。

【0039】

Ｆａｓは、ＦＡＳ受容体（またはＦａｓＲ）、アポトーシス抗原１（ＡＰＯ−１またはＡＰＴ）、表面抗原分類９５（ＣＤ９５）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）としても知られており、細胞の表面上に位置する細胞死受容体に対応し、これは、活性化されると、プログラム細胞死（アポトーシス）を引き起こすことができる。Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）の結合によるＦａｓの活性化は、細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成を著しく誘導する。

【0040】

本発明の意味において、「Ｆａｓ活性化剤」は、Ｆａｓ生物活性を活性化する、例えばアポトーシス経路の開始を誘導することができる物質を意味する。

【0041】

Ｆａｓ活性化剤としては下記が挙げられるが、それらに限定されない：Ｆａｓに結合してＤＩＳＣの形成を活性化することができるタンパク質およびペプチド、ならびにＦａｓに結合して対応する細胞のアポトーシスを誘発するＦａｓＬの能力を保持しているＦａｓＬバリアント、断片またはペプチド模倣薬。

【0042】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＦａｓ活性化剤としては、好ましくはＦａｓＬリガンドまたはその任意の機能的断片または誘導体が挙げられる。

【0043】

特定の実施形態では、本発明で使用するためのＦａｓ活性化剤としては、好ましくはＦａｓ受容体アゴニストＡＰＯ０１０（ＴｏｐｏＴａｒｇｅｔ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が挙げられ、これは、アポトーシス促進性および抗悪性腫瘍活性の可能性を有するヒトアディポネクチンの二量体形成コラーゲンドメインに融合した３つのヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）細胞外ドメインからなる組換え型の可溶性六量体融合タンパク質である。Ｆａｓ受容体アゴニストＡＰＯ０１０はＦａｓ受容体を活性化し、それによって感受性の腫瘍細胞集団においてカスパーゼ依存的アポトーシスが起こる（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅ ｅｔ ａｌ， ２００９）。特定の実施形態では、本発明で使用するためのＦａｓ活性化剤としては、好ましくはＦａｓ−アゴニストであるＭｅｇａ ＦａｓＬ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）が挙げられる。さらに、本発明で使用するための追加のＦａｓ活性化剤としては、好ましくは、ＵＳ６，００１，９６２号およびＵＳ６，８４６，６３７号で開示されるＦａｓアゴニストペプチドが挙げられる。

【0044】

本発明の意味において、「抗体断片」は、抗体から得られる任意の結合タンパク質を意味し、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片ならびに一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）（ＨおよびＬ鎖上のＦｖが適切なリンカーにより連結される）、ダイアボディ、トリアボディ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域、などが挙げられるがそれらに限定さない。

【0045】

本発明の意味において、「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ」は、約１５〜約５０塩基対、例えば約２１〜約２５塩基対を含み、細胞内の発現された標的遺伝子またはＲＮＡと同一の、またはほぼ同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖構造を意味する。ｓｉＲＮＡは、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成相互作用により共にアニールされたセンスＲＮＡ鎖および相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、標的ｍｉＲＮＡ分子に含まれる核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。標的ｍｉＲＮＡに含まれる標的配列と「実質的に同一」は、標的配列と約３％以下しか異ならない核酸配列を意味する。ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または２つの相補的部分が塩基対を形成して、一本鎖「ヘアピン」領域により共有結合により連結された単一分子を含むことができる。ｓｉＲＮＡは化学的もしくは生物学的に生成させることができ、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから当業者によく知られた方法により発現させることができる。

【0046】

本発明の意味において、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（または「ＡＳＯ」）は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な配列を有する小さなデオキシ−オリゴヌクレオチドを意味する。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的塩基対形成により標的ｍＲＮＡに結合し、二本鎖ＲＮＡを分解して、よって標的ｍＲＮＡを破壊する酵素であるＲＮアーゼＨの結合を誘引する。

【0047】

本発明の一実施形態では、予防および／または治療薬は眼内に送達される。本発明の意味において、「眼内投与」は、目の内部への薬剤の直接の注射を意味し、ここで、目の内部は、眼球内に存在する任意の領域を意味し、これは、一般に、眼球内で見出される任意の機能的（例えば、視覚に関して）もしくは構造的組織、または眼球の内側を部分的もしくは完全に覆う組織もしくは細胞層を含むが、それらに限定されない。そのような領域の具体例としては、前房、後房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑、および網膜、ならびに後眼領域または部位に血管形成または神経支配する血管および神経が挙げられる。１つの実施形態では、目の内部は、後房、硝子体腔、脈絡膜、黄斑、および網膜、ならびに後眼領域または部位に血管形成または神経支配する血管および神経を含む後眼部を意味する。この実施形態によれば、眼内投与は後眼部内、好ましくは硝子体内の投与を意味し、眼内投与は好ましくは硝子体内注射である。

【0048】

別の実施形態によれば、投与経路は局所眼内投与、例えば、例として、点眼薬の投与とすることができ、または本発明の一部の組成物またはキットを含む眼科用溶液に目を浸すことによることができる。

【0049】

一実施形態によれば、予防および／または治療薬は、好ましくは、溶液、例えば、例として、滅菌水溶液、分散液、エマルジョン、懸濁液、使用前に液体の添加で溶液または懸濁液を調製するために使用するのに好適な固体剤形、例えば、例として、粉末、リポソーム剤形などを含む群から選択される、注射のために適した剤形で製剤化される。

【0050】

本発明の一実施形態では、予防および／または治療薬は、ＩＬ−６阻害剤および／またはＡＰＯＥ阻害剤を、５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの個々の濃度で含む。

【0051】

本発明の別の実施形態では、予防および／または治療薬は、ＩＬ−６阻害剤および／またはＡＰＯＥ阻害剤を１μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの個々の濃度で含む。

【0052】

本発明の別の実施形態では、予防および／または治療薬は、ＩＬ−６阻害剤および／またはＡＰＯＥ阻害剤を、１〜１０μｇ／ｍＬヒト眼内投与液、好ましくは５μｇ／ｍＬヒト眼内投与液の眼内濃度で含む。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】２ヶ月および１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの眼における、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してβ−アクチンｍＲＮＡにより標準化したＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝６／群、^＊Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵ検定（ＭＷｔ） １２ヶ月 ｐ＝０．００４３）。

【図2】２ヶ月および１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−、およびＡｐｏＥ^−／−マウスにおける網膜下ＩＢＡ−１＋単核食細胞（ＭＰ）の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝１０〜２２／群、^＊１２ヶ月での一元配置ＡＮＯＶＡボンフェローニ多重比較検定（ＡＮＯＶＡＢ）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対任意の他の群、ｐ＜０．０００１）。

【図3】１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−、およびＡｐｏＥ^−／−マウスにおける、視神経（０μｍ）から離れた距離での視細胞核の列を示すグラフである（−３０００μｍ：下極、＋３０００μｍ：上極）。

【図4】２および１２ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−、およびＡｐｏＥ^−／−マウスの視細胞核の列数の曲線下面積の定量を示すヒストグラムである（ｎ＝７〜１２、^＊ＭＷｔ Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／− ｐ＝０．０２６；^＊１２ヶ月でのＡＮＯＶＡＢ Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−、ｐ＜０．０００１）。

【図5】対照条件において、および上層の網膜外植片のＰＯＳと接触させて２４時間培養したＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＢＭＭの、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化した、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝４／群、^＊＋網膜外植片（＋Ｒ）群間のＭＷｔ ｐ＝０．０２８６）。

【図6】対照条件において、およびＣＸ３ＣＬ１と共に２４時間培養したＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＰＥＭの、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化したＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝４／群、^＊ＣＸ３ＣＬ１の存在下および非存在下でのＭＷｔ ＷＴ、ｐ＝０．０２８６；‡ＭＷｔ ＣＸ３ＣＬ１群ｐ＝０．０２８）。

【図7】ＣＸ３ＣＬ１に曝露されたＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＰＥＭからの２４時間目での同等量の上清タンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。

【図8】成体脳から新たに抽出した、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＦＡＣＳソートミクログリア細胞（ＭＣ）の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化したＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである。

【図9】ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣの網膜下注射後の異なる時点でのＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（ｎ＝６、^＊一元配置ＡＮＯＶＡダネット多重比較検定（ＡＮＯＶＡＤ） 各群対１２時間群 ｐ＜０．０００１）。

【図10】Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＣＦＳＥ^＋ＴＰＣの注射後２４時間で調製した眼細胞浮遊液のＳＳＣ−Ａ／ＣＦＳＥおよびＣＤ１１ｂ／Ｆ４／８０でゲートを設定した分析、ならびにＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊへの注射後２４時間での眼細胞浮遊液のサイトメトリー定量の代表的なサイトメトリー画像を示す写真である（ｎ＝１６〜２０／群、^＊ＭＷｔ ｐ＝０．００２４）。

【図11】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−、およびＡｐｏＥ^−／−マウス由来のＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの網膜下注射、およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣの、ＡＰＯＥ３を外から添加したＣ５７ＢＬ／６Ｊへの網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値；ｎ＝８〜２０／群、^＊ＡＮＯＶＡＢ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／− ｐ＜０．０００１；^＊ＭＷｔ Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ｐ＝０．０００６；‡ＡＮＯＶＡＤ 各群対Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ｐ＜０．０００１）。

【図12】２ヶ月および１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}網膜色素上皮／脈絡叢の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してβ−アクチンｍＲＮＡによって標準化したＦａｓＬ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝６／群、^＊１２ヶ月でのＭＷｔ ｐ＝０．０１２９）。

【図13】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＦａｓ^{ｇｌｄ／ｇｌｄ}マウスへの、ならびにＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}およびＦａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ} ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（ｎ＝１１〜２０／群、^＊ＡＮＯＶＡＤ 全ての群対Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＴＰＣ注射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスｐ＜０．０００１）。

【図14】脂質を含まないＡＰＯＡ−Ｉ（５μｇ／ｍＬ；８時間）、ＡＰＯＥ３（５μｇ／ｍＬ；８、２４時間）および熱変性ＡＰＯＥ３（ｄＡＰＯＥ３、５μｇ／ｍＬ；２４時間）と共に、ＬＰＳ（２５ｎｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でインキュベートした、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ休止期腹腔マクロファージ由来の上清のマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡの結果を示すヒストグラムである（ｎ＝４／群、ＭＷｔ：^＊８時間 ＡＰＯＡ−Ｉ／ＬＰＳおよびＡＰＯＥ／ＬＰＳ対ＬＰＳ ｐ＝０．０２８４；†８時間ＡＰＯＡ−ＩおよびＡｐｏＥ対ＣＴＬ ｐ＝０．０２８４；＃２４時間ＡＰＯＥ対ＣＴＬ ｐ＝０．００５；‡２４時間ｄＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ３群 ｐ＝０．００２２）。

【図15】ＣＸＣＬ１と共に２４時間培養した、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−ＰＥＭの、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化した、ＩＬ−６ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝５／群、ＭＷｔ：^＊Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ｐ＝０．０１５９；‡Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／− ｐ＝０．００７９）。

【図16】ＣＸＣＬ１と共に２４時間培養した、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−ＰＥＭの上清のマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡレベルのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝５／群、ＭＷｔ：^＊Ｃ５７対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ｐ＝０．０１５９；‡Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／− ｐ＝０．００７９）。

【図17】Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＴＰＣの網膜下注射後３時間での、１２ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜色素上皮／脈絡叢の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してβ−アクチンｍＲＮＡによって標準化したＦａｓＬ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝７〜９／群、^＊１２ヶ月でのＭＷｔ ｐ＝０．０１２９）。

【図18】ＩＬ−６およびＡｐｏＥ３の網膜下注射後３時間での、１２ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ網膜色素上皮／脈絡叢の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してβ−アクチンｍＲＮＡによって標準化した、ＦａｓＬ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（眼内濃度の計算値、それぞれ、５０μｇ／ｍＬおよび１０μｍ；ｎ＝１７〜２１／群、^＊ＭＷｔ ＩＬ−６対対照（ＣＴＬ）ｐ＝０．０１４８）。

【図19】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊへの、ＩＬ−６の存在下または非存在下での網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の、網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５０ｎｇ／ｍＬの；ｎ＝７〜１２／群、^＊ＭＷｔ ｐ＜０．０００１）。

【図20】対照抗体または抗ＩＬ−６抗体と共に、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに網膜下注射した後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５０μｇ／ｍＬの；ｎ＝８〜１２／群、^＊ＭＷｔ ｐ＝０．００３６）。

【図21】Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊへの、ＦａｓアゴニストＭｅｇａＦａｓＬの存在下または非存在下での網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値１０ｎｇ／ｍＬ；ｎ＝７〜８／群、^＊ＭＷｔ ｐ＝０．０１４）。

【図22A】ＣＸ３ＣＬ１と共に２４時間培養したＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＰＥＭの、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化した、ＦＡＳ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝４／群）。

【図22B】対照のパーセンテージとして表される、ＭｅｇａＦａｓＬ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびスタウロスポリンと共に２４時間培養した、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＰＥＭのＴＵＮＥＬ＋定量化によるアポトーシス細胞死のレベルを示すヒストグラムである。

【図23】２４時間培養したＢＭＭ、マクロファージおよびＰＥＭに関する、トランスジェニックヒト化ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化した、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝６／群、ＢＭＭ^＊ＭＷｔ ε２対ε３ ｐ＝０．００４７；常在マクロファージ^＊ＭＷｔ ε２対ε３ ｐ＝０．００２２）。

【図24】ＰＯＳの存在下および非存在下で３日間（３ｄ）培養したＢＭＭに関する、トランスジェニックヒト化ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４の、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定してＳ２６ｍＲＮＡによって標準化した、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡのレベルを示すヒストグラムである（ｎ＝６／群、ＢＭＭ^＊ＭＷｔ ε２対ε３ ｐ＝０．００２２）。

【図25】ヒト化ＡＰＯε３、ＡＰＯε２ａおよびＡＰＯε４マクロファージ由来の２４時間上清のヒトＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡの結果を示すヒストグラムである（ｎ＝６、^＊ＭＷｔ ε２対ε３ ｐ＝０．００４１）。

【図26】対照条件においてまたはＡＰＯＥ３、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ４と共に２４時間培養した、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマクロファージの上清のマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡの結果を示すヒストグラムである（５μｇ／ｍＬ、ｎ＝１０〜１２、^＊ＭＷｔ ＣＴＬ対ＡＰＯＥ３ ｐ＜０．００１；‡ＭＷｔ ＣＴＬ対ＡＰＯＥ２ ｐ＜０．０００１）。

【図27】ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４マウス由来のマクロファージの上清のマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡの結果を示すヒストグラムである（ｎ＝１２／群、^＊ＭＷｔ ε２対ε３ ｐ＜０．０００１）。

【図28】ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４マウス由来のＣＦＳＥ染色ＲＰＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの眼への網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝８〜１２／群、^＊ＭＷｔｐ＜０．０００１）。

【図29】ＡＰＯε２ ＣＦＳＥ^＋ＲＰＣ由来のＣＦＳＥ染色ＲＰＣの、対照抗体または抗ＩＬ−６抗体と共に（ｎ＝１６−２０／群、^＊ＭＷｔ ｐ＝０．００２４）、ＭｅｇａＦａｓＬの存在下または非存在下で網膜下注射後２４時間での、網膜色素上皮および網膜フラットマウント上の網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝７〜１２／群、^＊ＭＷｔ ｐ＝０．０１５）。

【図30】２ヶ月および１２ヶ月齢のＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４マウスにおける網膜下ＩＢＡ−１＋単核食細胞の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝１２／群、^＊ＡＮＯＶＡＢ １２ヶ月でのε２対ε３およびε４ ｐ＜０．００３）。

【図31A】１２ヶ月齢ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４マウスにおける視神経（０μｍ）から離れた距離の（−３０００μｍ：下極、＋３０００μｍ：上極）視細胞核の列を示すグラフである。

【図31B】２および１２ヶ月齢ＡＰＯε３、ＡＰＯε２およびＡＰＯε４マウスの視細胞核の列数の曲線下面積の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝６、^＊ＭＷｔ １２ヶ月でのε２対ε３、ｐ＝０．０１６；^＊ＡＮＯＶＡＢ ε２は１２ヶ月でε３およびε４マウスと異なる ｐ＝０．００２９）。

【図32】表記の系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−およびＡｐｏＥ^−／−の２ヶ月（左）および１２ヶ月（右）齢マウスにおける網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝１０〜２５／群 ＡＮＯＶＡ／ダネット検定：Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対任意の他の群 ^＊ｐ＜０．０００１；Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−のＭａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙｔ検定 ^＊ｐ＜０．０００１）。

【図33】Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＳＦＥ^＋Ｍφの網膜下注射後の異なる時点での、ＣＳＦＥ^＋Ｆ４／８０^＋Ｍφの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝５／群（１２時間）およびその後、ｎ＝６／群；Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定、^＊Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} １日 ｎ＝２０／群 ｐ＜０．０００１；２日 ｎ＝６／群 ｐ＝０．０３１７）。

【図34】Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウス由来のＣＳＦＥ^＋磁気ビーズソート骨髄由来単球（Ｍｏ）のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの網膜下注射後２４時間での、ＲＰＥおよび網膜フラットマウント上の網膜下ＣＳＦＥ^＋細胞の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝８〜１２／群；Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：ｐ＝０．０００６）。

【図35】Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウス由来のＣＳＦＥ^＋ＣＤ１１ｂＦＡＣＳソート脳ＭＣのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスへの網膜下注射後２４時間での、ＲＰＥおよび網膜フラットマウント上の網膜下ＣＳＦＥ^＋細胞の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝９〜１２／群；Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：ｐ＝０．００８７）。

【図36】Ｃ５７ＢＬ／６ＪＣＳＦＥ＋Ｍφの、ＡＰＯＥ３の１、１０または１００μｇ／ｍＬの眼内濃度計算値を外から加えたＣ５７ＢＬ／６Ｊへの網膜下注射後２４時間での、ＲＰＥおよび網膜フラットマウント上の網膜下ＣＳＦＥ＋Ｆ４／８０＋Ｍφの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝６〜７／群；一元配置ＡＮＯＶＡ／ダネット検定：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対１０μｇ ｐ＝０．０４８８；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対１００μｇ ｐ＝０．００６。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対１０μｇ ｐ＝０．００１２；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対１００μｇ ｐ＝０．００１３）。

【図37】表記の系統の対照（左）および４日間光チャレンジされた（右）２ヶ月齢マウスにおける網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝６〜１０／群 ４日間光チャレンジでのＡＮＯＶＡ／ダネット検定：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対ＦａｓＬ^{ｇｌｄ／ｇｌｄ}およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ対Ｆａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ}両方とも^＊ｐ＜０．０００１；４日間光チャレンジでのＭａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対ＦａｓＬ^{ｇｌｄ／ｇｌｄ＊}ｐ＜０．０００１；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対Ｆａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ＊}ｐ＜０．０００１）。

【図38】２４時間培養した表記の遺伝子型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−およびＡｐｏＥ^−／−）のＭｏおよびＭφのインビトロＭｅｇａＦａｓＬ誘導アポトーシスの定量結果を示すヒストグラムである。ＴＵＮＥＬ＋定量は、非ＭｅｇａＦａｓＬ曝露対照のパーセンテージとして表される。

【図39】対照培地、脂質を含まないＡＰＯＥ３（５μｇ／ｍＬ）、ＡＰＯＥ３（５μｇ／ｍＬ）およびポリミキシンＢ（２５μｇ／ｍＬ）、熱変性ＡＰＯＥ３（ｄＡＰＯＥ３、５μｇ／ｍＬ）、ＡＰＯＥ３（５μｇ／ｍＬ）およびラットＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩｇＧ１、１００μｇ／ｍＬ）、またはＡＰＯＥ３（５μｇ／ｍＬ）およびラット抗ＣＤ１４抗体（ａＣＤ１４Ａｂ、１００μｇ／ｍＬ）中で２４時間インキュベートした、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ腹腔Ｍφ由来の上清のマウスＩＬ−６ ＥＬＩＳＡの定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝５〜６／群；一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ多重比較検定：^＊ＡＰＯＥ３対ＣＴＬ ｐ＜０．０００１；＃ｄＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ ｐ＜０．０００１；ＡＰＯＥ３ ＩｇＧ対ＣＴＬ ｐ＜０．０００１；ＡＰＯＥ３ ＩｇＧ対ＡＰＯＥ３ ａＣＤ１４ Ａｂ ｐ＜０．０００１。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：^＊ＡＰＯＥ３対ＣＴＬ ｐ＝０．００４３；＃ｄＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ３ ｐ＝０．０１１７；ＡＰＯＥ３ ＩｇＧ対ＣＴＬ ｐ＝０．００８０；ＡＰＯＥ３ＩｇＧ対ＡＰＯＥ３ ａＣＤ１４ Ａｂ ｐ＝０．０１１７。実験を２回繰り返し、同様の結果を得た。

【図40】対照ＩｇＧ、ＩＬ−６遮断抗体またはＣＤ１４遮断抗体で処置したＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの病変周囲ＲＰＥ上に存在する網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰ／照射の定量結果を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５μｇ／ｍｌ；ｎ＝１３〜１４／群。ＩｇＧ対任意の他の群の一元配置ＡＮＯＶＡ／ダネット事後検定^＊ｐ＜０．００１。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ検定^＊ＩｇＧ対抗ＩＬ−６ ｐ＝０．００２１；ＩｇＧ対抗ＣＤ１４ ｐ＝０．００２８）。

【図41】レーザー損傷後７日での、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ｎ＝８眼）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}（ｎ＝８）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−（ｎ＝１０）およびＡｐｏＥ^−／−（ｎ＝１０）マウスのＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント上のＣＤ１０２^＋ＣＮＶ面積の定量結果を示すヒストグラムである（ｎ＝８〜１０／群；一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−＊ｐ＜０．０００１。Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}対Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−の独立Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙｔ検定：ｐ＜０．０００１）。スケールバー＝５０μｍ。ＣＤ１０２染色の定量により、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおける過剰ＣＮＶが確認され、ＣＮＶはＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスにおいて著しく少ないことが示される。

【図42】対照ＩｇＧ、ＩＬ−６遮断抗体またはＣＤ１４遮断抗体で処置されたＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスのＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント上のＣＤ１０２＋ＣＮＶ面積の定量結果を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５μｇ／ｍＬ；ｎ＝８〜１０眼／群。ＩｇＧ対任意の他の群の一元配置ＡＮＯＶＡ／ダネット事後検定^＊ｐ＝０．０１９７。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定^＊ＩｇＧ対抗ＩＬ−６ ｐ＜０．０００１；ＩｇＧ対抗ＣＤ１４ ｐ＝０．０１５）スケールバー＝５０μｍ。ＣＤ１０２染色の定量により、ＣＤ１４遮断抗体、およびＩＬ−６遮断抗体で処置されたＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおけるＣＮＶは、対照のＩｇＧ処置Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおけるＣＮＶに比べると、著しく少ないことが示される。

【図43】１日細胞培養後の、追跡可能なヌクレオチドＥｄＵ^＋核の定量結果を示すヒストグラムである。ＷＴ−およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マクロファージの増殖速度は低く、互いに有意差はない。ＡＰＯＥ３またはＩＬ−６は増殖速度を増加させない。ＡＰＯＥ３もＩＬ−６もどちらも増殖速度を増加させない。

【図44】レーザー損傷後７日でのＡＰＯＥ３、ＡＰＯＥ２およびＡｐｏＥ４マウスの病変周囲ＲＰＥに局在する、網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰ／照射の定量を示すヒストグラムである（ｎ＝８〜９／群、一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ事後検定^＊ＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ２ ｐ＝０，０００４．Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定^＊ＡＰＯＥ２対ＡＰＯＥ３ ｐ＝０．０００４）。

【図45】対照ＩｇＧ、またはＩＬ−６およびＣＤ１４遮断抗体を注射したＡＰＯＥ２マウスの病変周囲ＲＰＥに局在する、網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰ／照射のレーザー損傷後７日目での定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５μｇ／ｍｌ；ｎ＝１３〜１４／群。ＩｇＧ対任意の他の群の一元配置ＡＮＯＶＡ／ダネット事後検定^＊ｐ＜０．００１。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定^＊ＩｇＧ対抗ＩＬ−６ ｐ＝０．００２８；ＩｇＧ対抗ＣＤ１４ｐ＝０．００２１）。

【図46】ＡＰＯＥ３、ＡＰＯＥ２およびＡｐｏＥ４マウスのレーザー損傷後７日目での、ＣＤ１０２＋ＣＮＶの定量を示すヒストグラムである（ｎ＝８〜９／群、一元配置ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ事後検定^＊ＡＰＯＥ２対ＡＰＯＥ３ ｐ＝０．０００１。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定：^＊１２ヶ月でのＡＰＯＥ２対ＡＰＯＥ３ ｐ＝０．０００４）。

【図47】対照ＩｇＧまたはＩＬ−６遮断抗体およびＣＤ１４遮断抗体を注射したＡＰＯＥ２マウスのレーザー損傷後７日目での、ＣＤ１０２＋ＣＮＶの定量を示すヒストグラムである（眼内濃度計算値５μｇ／ｍｌ；ｎ＝１３〜１４／群。ＩｇＧ対任意の他の群の一元配置ＡＮＯＶＡ／ダネット事後検定^＊ｐ＜０．０１。Ｍａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定^＊ＩｇＧ対抗ＩＬ−６ ｐ＝０．００２９；ＩｇＧ対抗ＣＤ１４ ｐ＝０．００１２）。

【図48】表記の系統の２ヶ月齢マウスの４日の光チャレンジ後の網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰの定量を示すヒストグラムである（ｎ＝６／群 ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニ^＊ＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ２ ｐ＝０．０００７；ＡＰＯＥ３対ＡＰＯＥ２のＭａｎｎ＆Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔ検定 ｐ＝０．００２２）。

【0054】

実施例
本発明をさらに下記実施例により説明する。

【0055】

材料および方法
動物
Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、ＡｐｏＥ^−／−、Ｆａｓ^ｌｐｒ、ＦａｓＬ^ｇｌｄ、ＡＰＯε２、ＡＰＯε３およびＡＰＯε４−ＴＲマウスを購入し（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔａｃｏｎｉｃ）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスを作製した（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。Ｃｒｂ１ｒｄ８突然変異が混入したマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと戻し交配し、突然変異を排除した。全てのマウスはこのように、Ｃｒｂ１^ｒｄ８、Ｐｄｅ６ｂ^ｒｄ１およびＧｎａｔ２^{ｃｐｆｌ３}突然変異に関して陰性であった。マウスを、動物施設において、特定の病原体を含まない条件下で、１２／１２時間明／暗（１００−５００ｌｕｘ）サイクルで収容し、水および標準飼料を自由に与えた。全ての動物実験はその地域の動物実験倫理委員会「Ｃｏｍｉｔe ｄ’eｔｈｉｑｕｅ ｅｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｄａｒｗｉｎ」（Ｎｏ．ｐ３／２００８／５４）により認可された。

【0056】

ドナー試料に関するＡＰＯＥ、ＩＢＡ−１、ＣＤ１８免疫組織化学的検査
ＡＭＤの既知の病歴を有するドナーの眼および対照を、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｌｉｏｎｓアイバンクを介して収集した。死後眼底写真を撮り、後眼部を４時間、４％ＰＦＡ中で固定し、ＰＢＳ中で輸送し、解剖し、パラフィンに包埋し、および切片を作製した（５つの対照黄斑；５つのＧＡドナー黄斑）。ドナーはアイバンクの倫理委員会に従ってインフォームドコンセントを提出した。再発性急性扁桃炎のために切除された５つの扁桃切除術外科的試料を、Ｆｏｎｄａｔｉｏｎ Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄで扁桃切除術から回復させ、その後、固定し、同じように切片を作製した。フラットマウント免疫組織化学検査のために、視認可能な萎縮領域（５眼）を有するドナーの眼、ＲＰＥフラットマウント上の視認可能な大きなドルーゼン（５眼）を有するドナーの目、および対照（３眼）を、およそ５×５ｍｍの組織部分に切断し、液浸した試料について免疫組織化学的検査を実施した。ＡＰＯＥ（Ｍ０６８−３マウス抗ヒト、パラフィン切片のクエン酸緩衝液熱抗原賦活化、ＭＢＬ）、ＩＢＡ−１（ウサギ−抗ヒト、ギ酸抗原賦活化、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、およびＣＤ１８（ＭＣＡ５０３、ラット−抗ヒト、クエン酸緩衝液熱抗原賦活化、Ａｂｄ Ｓｅｒｏｔｅｃ）免疫組織化学分析を、ＦａｓｔＲｅｄ基質キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて、適切な蛍光またはアルカリ性−ホスファターゼ結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を使用して実施し、明らかにした。

【0057】

免疫組織化学的検査、単核食細胞定量、および組織学的検査
ヒトおよびマウス網膜色素上皮（ＲＰＥ）および網膜フラットマウントならびにヒトおよびマウス切片を、既に記載されたように（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、ポリクローナルヤギ抗ヒトＡＰＯＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ポリクローナルウサギ抗ＩＢＡ−１（Ｗａｋｏ）、ポリクローナルウサギ抗ラットＦＡＳＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、モノクローナルラット抗マウスＩＬ−６（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５ファロイジン（Ｍｏｌ ｐｒｏｂｅｓ）、およびラット抗マウスＣＤ１０２（クローン３Ｃ４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の適切な二次抗体を使用して染色して定量し、必要であればＨｏｅｃｈｓｔで対比染色した。蛍光顕微鏡（ＤＭ５５００、Ｌｅｉｃａ）またはＦＶ１０００（Ｏｌｙｍｐｕｓ）共焦点顕微鏡を用いて標本を観察した。

【0058】

マウス眼の組織学的検査および視細胞定量を、既に記載されたように実施した（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

【0059】

細胞調製物および細胞培養
常在およびチオグリコレート誘発腹腔細胞、腹腔マクロファージ、ＢＭＭ（骨髄由来単球）、脳ミクログリア細胞、およびＰＯＳ（視細胞節）の単離を、ＢＭＭ、ＴＰＭ（チオグリコレート誘発腹腔マクロファージ）、ＲＰＭ（常在腹腔マクロファージ）、ならびにＭＰ−およびＢＭＭ−網膜外植片共培養物（全て血清を含まないＸ−Ｖｉｖｏ１５培地中）として、既に記載されたように実施した（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。特定の実験では、細胞を、組換えヒトＣＸ３ＣＬ１、ＡＰＯＡ−Ｉ、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＰＯＥ（５μｇ／ｍｌ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡＰＯＥ（５μｇ／ｍｌ）とポリミキシンＢ（２５μｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、熱変性ＡＰＯＥ（５μｇ／ｍｌ、９５℃、９０分）、ラット抗ＩｇＧアイソタイプ対照（１００μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ラット抗マウスＣＤ１４（１００μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、ラット抗マウスＴＬＲ２（１００μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）および既に記載されたように調製されたＰＯＳ（（Ｍｏｌｄａｙ ｅｔ ａｌ， １９８７）により刺激した。インビトロアポトーシス実験では、異なる遺伝子型を有するＭｏまたはＭφ１０００００個を、ＭｅｇａＦａｓＬ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）の存在下または非存在下で２４時間培養した。ＴＵＮＥＬ染色（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造元の指示に従い実施した；ＴＵＮＥＬ^＋およびＨｏｅｃｈｓｔ^＋核を、Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて自動計数した。

【0060】

網膜下単核食細胞クリアランス
ＲＰＣ（常在腹腔細胞）、ＴＰＣ（チオグリコレート誘発腹腔細胞、７０％Ｍφを含む）、ＢＭＭ（骨髄由来単球、約９５％純粋）およびミクログリア細胞（約９５％純粋）を１０μＭ ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で標識した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に浮遊させた。細胞１２０００個（４μｌ）を麻酔下の２ヶ月齢マウスの網膜下腔に、微量注入器およびガラスミクロキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて注射した。眼圧の増加を回避するために、網膜下注射の前にガラスキャピラリーで穴を開け、４μｌの溶液で網膜を剥離させた。網膜下注射を、眼底検査により確認した。特定の実験では、Ｍφ、ＲＰＣおよびＴＰＣを、ｒｈＡｐｏＥ３（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｒｍＩＬ−６、ラット抗マウスＩＬ−６、ラット抗マウスＣＤ１４アイソタイプ対照ラットＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＭｅｇａＦａｓＬ（ＡｄｉｐｏＧｅｎ）と同時注射した。注射された４μｌは眼内体積のおよそ１／１０に対応することから、眼内濃度は、注射された溶液の１０倍の希釈として計算した。眼を２４時間後摘出し、４％ＰＦＡ中で固定し、フラットマウントさせた。フラットマウントを抗Ｆ４／８０抗体で二重標識してＣＳＦＥ＋Ｆ４／８０Ｍφを同定し、それぞれの眼の網膜フラットマウントおよびＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントの網膜下局面で計数した）。網膜下出血を有する眼を廃棄した。網膜下腔内の二重標識単核食細胞を、網膜色素上皮フラットマウントおよび網膜フラットマウントの網膜下面で定量した。

【0061】

フローサイトメトリー
サイトメトリーを、抗ＣＤ１１ｂＰＥ、抗Ｆ４／８０ Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅまたはＡＰＣ、ＰＩ、アネキシンＶ−ビオチン、ストレプトアビジンＡＰＣ（全てＡｂｄＳｅｒｏｔｅｃ製）を用いて、既に記載されたように実施した（Ｃａｍｅｌｏ ｅｔａｌ．，２０１２）。ＬＳＲＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でデータを獲得して、データを、ＦｌｏｗＪｏ７．９を用いて分析した。

【0062】

ウエスタンブロット、逆転写およびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応およびＥＬＩＳＡ
ＷＢ分析は、ポリクローナルヤギ抗ＡｐｏＥ（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて既に記載されたように（Ｈｏｕｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８）実施した。Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＲＴ−ＰＣＲ、ならびにヒトＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡキット（Ｍａｂｔｅｃｈ）およびマウスＩＬ−６ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＥＬＩＳＡを、既に記載されたように実施した（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0063】

統計解析
Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５および６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）をデータ解析およびグラフ表示のために使用した。全ての値を平均±ＳＥＭとして報告する。実験設計に応じて平均値を比較するために、一元配置ＡＮＯＶＡ分散分析、続いてボンフェローニまたはダネット事後検定（多重比較）またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定（２群実験）により統計解析を実施した。ｎおよびｐ値を図の説明文に示す。網膜下ＭＰ注射を含む実験に関しては、予備研究により、網膜下注射に続発する重篤な出血がＭＰクリアランスを妨害することが明らかになり、出血を除外基準として使用した。

【0064】

フラットマウント上での末端デオキシデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）
４％ＰＦＡ固定網膜フラットマウントを凍結メタノール／酢酸（２：１）中、３０分間後固定して、ＰＢＳ中で洗浄した。フラットマウントを、ターミナルトランスフェラーゼおよび供給緩衝液（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。フラットマウントをその後、３７℃で９０分間インキュベートし、反応を、ＰＢＳで洗浄することにより停止させた。核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で対比染色した。フラットマウント画像を、ＤＭ５５００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて獲得した。

【0065】

光チャレンジおよびレーザー損傷モデル
２〜４ヶ月齢のマウスを、暗所に６時間順応させて瞳孔を散大させ、既に記載されたように、緑色ＬＥＤ光（２ＡＭに開始、４５００Ｌｕｘ、ＪＰ Ｖｅｚｏｎ機器）に４日間曝露した（Ｓｅｎｎｌａｕｂｅｔａｌ，２０１３）。レーザー凝固を、手術用顕微鏡に取り付けた５３２ｎｍ眼科用レーザーを用いて実施した（Ｖｉｔｒａ Ｌａｓｅｒ、５３２ｎｍ、４５０ｍＷ、５０ｍｓおよび２５０μｍ）。２μｌのＰＢＳ、アイソタイプ対照ラットＩｇＧ１、ラット抗マウスＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびラット抗マウスＣＤ１４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の硝子体内注射を、ガラスキャピラリー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）および微量注入器を用いて実施した。抗体の２μｌ溶液を５０μｇ／ｍｌで注射し、これは眼内体積においてそれらがおよそ１０倍希釈されたと仮定して、５μｇ／ｍｌの眼内濃度に対応した。

【0066】

実施例１：網膜下単核食細胞（ＭＰ）は初期ＡＭＤにおける軟性ドルーゼン中およびその周囲でクラスター形成し、ＡｐｏＥを発現する
生理的に、網膜下腔は、おそらく一部には免疫抑制性のＲＰＥシグナルのために、有意な数のＭＰを含まない（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，２００２）。

【0067】

単核食細胞は、それにもかかわらず、網膜下腔内に、および萎縮型ＡＭＤの病変に隣接する網膜色素上皮細胞の頂端側に存在することが知られている。

【0068】

中期ＡＭＤを有するドナー由来の軟性ドルーゼンの網膜色素上皮／脈絡膜フラットマウントについて実施した実験により、多くのＣＤ１８＋およびＩＢＡ−１^＋細胞が、軟性ドルーゼン内に含まれる（網膜色素上皮によって部分的に覆われる）が、周囲の自己蛍光網膜色素上皮上の軟性ドルーゼンにも隣接して存在することが証明される（データ示さず）。網膜下ＩＢＡ−１^＋単核食細胞の外側Ｚスタック投影を用いて高倍率で調べると、さらに、単核食細胞と自己蛍光網膜色素上皮との物理的に近い接触が証明される（データ示さず）。網膜色素上皮と接触する網膜下単核食細胞は、検査した全ての軟性ドルーゼンの近傍で観察される（５眼）。網膜下単核食細胞は、軟性ドルーゼンから離れると、および健康な黄斑では非常に希である（３眼）。上層の網膜の網膜下面のＡＰＯＥおよびＩＢＡ−１二重標識（網膜色素上皮の自己蛍光によるマスキングを回避するため）により、網膜下ＩＢＡ−１^＋単核食細胞が、ＡＰＯＥがＩＢＡ−１^＋高度分枝型ミクログリア細胞において観察される網膜内層の硝子体局面に比べると、ＡＰＯＥを強く発現することが示される。

【0069】

総合すれば、これらの結果により、網膜下単核食細胞は早期ＡＭＤにおいて存在し、ここで、それらは軟性ドルーゼン内およびその周囲でクラスターを形成することが証明される。それらは、網膜色素上皮と接触し、他の組織の炎症、例えばアテローム性動脈硬化病変におけるマクロファージと同様に、ＡＰＯＥを強く発現する。

【0070】

実施例２：網膜下単核食細胞（ＭＰ）は萎縮性病変および大きなドルーゼンの近傍のＲＰＥ上に蓄積する
後期ＡＭＤでは、切片に関する免疫組織化学的検研究により、萎縮型ＡＭＤの病変に隣接するＲＰＥ細胞上での網膜下ＭＰの存在が明らかになり（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３）、ＭＰが網膜下新生血管膜内で見出された（Ｏｈ ｅｔ ａｌ， １９９９）。小さく、分散したＭＰは、切片上で検出することが困難であるので、ＭＰ−マーカー−ＩＢＡ−１免疫組織化学的検査をこのように、健康なおよび罹患した黄斑ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント上で実施した（ＩＢＡ−１緑色蛍光、赤色および緑色チャンネルにおいてその自己蛍光のためにオレンジ色として視認可能なＲＰＥ自己蛍光）。共焦点顕微鏡法により、網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰは、健康な年齢をマッチさせたドナーの中心ＲＰＥでは非常に時折にしか観察されないことが確認された（データ示さず）。ＲＰＥが消失したＧＡ患者の萎縮性病変内では、ＭＰは多かったが、また、病変に隣接するＲＰＥの頂端側でも一定に観察された。さらに、解剖顕微鏡下、網膜の除去後の蒼白色病変として、および共焦点顕微鏡下ドーム形突起として視認可能な大きなドルーゼン（＞１２５μｍ）は、多くのＩＢＡ−１^＋細胞をドルーゼン内に含むことが示されたが、隣接するＲＰＥ上にも含むことを示した（データ示さず）。上層の網膜の網膜下面の二重標識（ＲＰＥ自己蛍光によるマスキングを回避するため）は、網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰが同様にｐａｎ−ＭＰマーカーＣＤ１８を発現することを示した。ＲＰＥと密に接触したＩＢＡ−１^＋ＭＰは、検査した全ての大きなドルーゼンおよび萎縮域の近傍で観察された。

【0071】

これらの観察結果を共に考慮すると、ＡＭＤにおける網膜下ＭＰの存在が確認され（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｐｅｎｆｏｌｄ ｅｔ ａｌ， １９８５； Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３）、大きなドルーゼンおよびＲＰＥと接触するＧＡ病変の周囲でのそれらの蓄積が示される。それらは健康なドナーでは非常に希である。これによりさらに、ＲＰＥ媒介免疫抑制が中期ＡＭＤ（大きなドルーゼン）および後期ＡＭＤ（ＧＡ）において障害されることが示唆される。

【0072】

実施例３：萎縮性病変および大きなドルーゼン近傍のＲＰＥ上に蓄積された網膜下ＭＰはＡＰＯＥを発現する
ＭＰは、ＡＰＯＥを高いレベルで発現することが報告されている（Ｂａｓｕ ｅｔ ａｌ， １９８２； Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ， １９９６； Ｐｅｒｉ ＆ Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ， ２００８； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ， １９９３）。陽性対照として使用する、ヒト扁桃のパラフィン切片上でのＰＯＥおよびＩＢＡ−１の免疫組織化学的検査により、ＩＢＡ−１^＋ＭＰは、ＡＰＯＥを強く発現することができることが確認された（データ示さず）。同様に、大きなドルーゼンを有するドナーの眼の網膜フラットマウント上では、ＡＰＯＥ染色が網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰ中およびその周囲で観察された（データ示さず）。ＲＰＥ自己蛍光によるマスキングを回避するために、網膜の網膜下面に二重標識を実施した。ＡＰＯＥ染色を、対照および地図状萎縮病変を有するドナーの眼のパラフィン切片上で実施した。ＲＰＥ自己蛍光との混同を回避するために、明視野において視認可能である基質顕色法（アルカリホスファターゼ／Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）を使用した。対照の眼由来の切片では、ＡＰＯＥシグナルはＲＰＥの基部に集中した（データ示さず）。ＧＡを有するドナーの眼では、強いＡＰＯＥシグナルが、萎縮領域に隣接するＲＰＥにおいて観察されたが、対照ほど基底面に限定されなかった。加えて、ＡＰＯＥ免疫染色がＲＰＥに隣接する細胞において観察された。ＩＢＡ−１による二重標識により、これらの細胞は網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰとして同定された。ＡＰＯＥ−抗体を省略し、同じ実験のプロトコルに従うと、有意な染色は生成されなかった。

【0073】

総合すれば、これらの結果により、ＲＰＥに加えて、ＡＭＤ患者における網膜下ＭＰは、他の炎症状況と同様にＡＰＯＥを強く発現することが示される（例えば：アテローム性動脈硬化病変（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ，１９９３））。

【0074】

実施例４：ＡＰＯＥはＣｘ３Ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおいて網膜下ＭＰ蓄積および視細胞変性を促進する
眼において、ＣＸ３ＣＬ１は網膜内層ニューロン（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３； Ｚｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）および網膜色素上皮における膜貫通タンパク質として構成的に発現され、ＣＸ３ＣＲ１を有する網膜ミクログリア細胞（ＭＣ）に、これらの細胞を生理的条件下で静止期監視モードに維持する持続性の阻害シグナルを提供することが知られている（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ、２００９）。マウスにおけるＣｘ３ｃｒ１の欠失または欠乏により、加齢による、光チャレンジまたはレーザー損傷後（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ， ２００７； Ｍａ ｅｔ ａｌ， ２００９； Ｒａｏｕｌ ｅｔ ａｌ， ２００８）、糖尿病における（Ｋｅｚｉｃｅｔａｌ，２０１３）、ならびにパラコート誘導網膜症モデルにおける（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ， ２０１３）網膜下単核食細胞蓄積の強い増加が引き起こされる。Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスは、ドルーゼンおよび網膜色素上皮萎縮を発症しないが、ＡＭＤに類似するＲＰＥ上での網膜下単核食細胞蓄積ならびにＡＭＤで観察される関連する視細胞変性および過剰なＣＮＶを示す（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７、Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスは、このように、ＡＭＤの根底にあるメカニズムを解読するのに役立ち得る。網膜下ＭＰ蓄積を示す１２ヶ月齢Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおけるＡＰＯＥ局在は評価された（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３）。

【0075】

１２ヶ月齢の野生型およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの両方の網膜切片および網膜フラットマウントの網膜下面でのＡＰＯＥの免疫組織化学的位置特定により、既に記載されるように、主にＲＰＥおよび網膜内層におけるＡＰＯＥの局在が明らかとなる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， ２００１）（データ示さず）。加えて、強いシグナルが、老化Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおける、網膜切片および網膜フラットマウントの網膜下面でＲＰＥに並列して存在する細胞内で検出され、それらは、ＡＭＤ患者と同様、ＩＢＡ−１発現ＭＰとして同定された。さらに、網膜下単核食細胞の蓄積が起こる、１２ヶ月齢のＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}（図１）マウスの眼において、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡは有意に増加する（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

【0076】

網膜下単核食細胞（ＭＰ）蓄積におけるＡＰＯＥの役割を評価するために、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスを分析した。１２ヶ月齢のＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスの網膜および網膜色素上皮／脈絡膜フラットマウント上での網膜下ＩＢＡ−１^＋単核食細胞の定量は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおいて観察された有意な年齢依存性網膜下単核食細胞蓄積が（Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＡｐｏＥ^−／−マウスと比較して）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスにおいてほぼ完全に阻害されたことを示した（図２）。これらの結果により、ＡＰＯＥはＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおける年齢依存性網膜下単核食細胞蓄積に必須であることが示される。

【0077】

次に、１２ヶ月齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＡｐｏＥ^−／−、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}、およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスの組織切片上の視細胞核を含む外顆粒層（ＯＮＬ）を検査して、視細胞変性に及ぼすＡＰＯＥ欠乏の影響を評価した。視神経から等しい距離で、ＡｐｏＥ^−／−マウスは、薄化したが規則正しい外顆粒層を提供し、これは既に記載されたように、全身性ＡＰＯＥの欠乏および全身脂質輸送障害および網膜コレステロール輸送障害に起因する（Ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）。興味深いことに、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスの外顆粒層はＡｐｏＥ^−／−マウスに類似し、Ｃｘ３ｃｒ１^−／−マウスで観察されるものと同様の炎症関連視細胞変性が起こるＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスよりも厚く、より規則正しい（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。視神経（０μｍ）からの距離が離れた視細胞核の列数（図３）および曲線下面積の計算（図４）により、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−マウスは、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスと比べた場合、年齢依存性視細胞の喪失に対し有意に保護され、ＡｐｏＥ^−／−マウスとは有意差がないことが示された。

【0078】

要約すると、上記実験により、ＡｐｏＥ欠失が、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおいて観察される、年齢依存性視細胞変性（図３および４）および過剰なＣＮＶ（図４１）を有意に阻害したことが証明される。ＡＰＯＥ発現はこのように増加して、Ｃｘ３ｃｒ１欠失マウスにおける年齢依存性蓄積および炎症関連視細胞変性が起こるために必要である。

【0079】

同様に、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスは、４日間の光チャレンジ後Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスにおいて観察された網膜下ＭＰ蓄積から有意に保護されることが見出された（図３２）。本明細書で使用される光チャレンジモデルの強度は、Ｃｘ３ｃｒ１^−／−マウスにおいて網膜下炎症を誘導するのに十分であったが、ＷＴマウスにおいて有意な網膜下炎症も変性も引き起こさなかったことに注意すべきである（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３）。その上、レーザー照射後７日目に、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスにおいてＣＤ１０２^＋ＣＮＶに対して０〜５００μｍの距離のＲＰＥ上で計数された網膜下ＩＢＡ−１^＋ＭＰは、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスで有意に阻害された（データ示さず）。

【0080】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウスは近交系でありＰｄｅ６ｂ^ｒｄ１（網膜変性症１）、Ｃｒｂ１^ｒｄ８（網膜変性症８）、Ｇｎａｔ２^{ｃｐｆｌ３}（錐体視細胞機能喪失３）突然変異を、比較的一般的に有する（Ｃｈａｎｇｅｔａｌ，２０１３）。これらの突然変異により、原発性網膜変性症に続発する網膜下炎症が引き起こされ得る（Ｌｕｈｍａｎｎｅｔａｌ，２０１２）。実施した実験では、使用した全てのマウス系統は、これらの３つの突然変異に対し、検査陰性であった。さらに、１２ヶ月齢Ｃｘ３ｃｒ１^{＋／ＧＦＰ}、およびＣｘ３ｃｒ１^{＋／ＧＦＰ}種畜のＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}同腹仔における網膜下ＭＰ蓄積は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウス系統に特異的な未知の寄与遺伝子が影響するという証拠を示さなかった（データ示さず）。Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスを、独立して購入したＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}およびＡｐｏＥ^−／−−マウスを用いて２回作製したところ（１回はＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｉｍｍｕｎｉｔe ｅｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎで、１回は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ ｌａ Ｖｉｓｉｏｎｓｗ）、両方のＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウス系統の世代が、２つの場所の２つのＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウス系統において観察された網膜下ＭＰ蓄積に対して保護された。総合すれば、これらの結果から、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおけるＭＰ蓄積およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−マウスにおける保護が、Ｃｘ３ｃｒ１およびＡｐｏＥ以外の遺伝子による可能性は極めて低い。

【0081】

要約すると、上記実験により、ＡＰＯＥは網膜下ＭＰにおいて強く発現され、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＭＰにおいてより強く発現されること、ならびにＡｐｏＥ欠失は、Ｃｘ３ｃｒ１欠失マウスで観察される網膜下ＭＰの加齢による、光による、およびレーザ誘起蓄積を非常に有意に阻害したことが証明される。

【0082】

実施例５：ＣＸ３ＣＲ１により制御されたＡｐｏＥは網膜下単核食細胞クリアランスを調節する
Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスでは、網膜下単核食細胞は、一部には単球（Ｍｏ）およびミクログリア細胞（Ｍｃ）に由来し（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、全てがＣｘ３ｃｒ１プロモーター−制御ＧＦＰを発現する。ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達が単核食細胞におけるＡＰＯＥ発現を直接制御するかを試験するために、ならびにＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＭＰがそれらのＡＰＯＥ発現に差があるかどうかを評価するために、上層の網膜外植片の視細胞節（ＰＯＳ）（ＣＸ３ＣＬ１を発現）と接触させて２４時間培養したＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍｏ（骨髄から調製）を、網膜下腔内での単核食細胞の分化条件を模倣することにより調べた。ＲＴ−ＰＣＲにより、ＡｐｏＥ ｍＲＮＡが、上層の網膜外植片のＰＯＳの存在下、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍｏ−において有意に高い速度で誘導されることが示された（図５）。したがって、ＡＰＯＥおよびＣＸ３ＣＲ１を発現するＷＴチオグリコレート誘発腹腔マクロファージ（ＴＰＭ）のＡｐｏＥ ｍＲＮＡ転写はＣＸ３ＣＬ１により阻害され、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＴＰＭと比べると有意に低い（図６）。

【0083】

ＣＸ３ＣＬ１に曝露されたＴＰＭ由来の同等量の上清タンパク質のウエスタンブロット分析もまた、培養マクロファージから構成的に放出され（Ｓａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、ローディングコントロールとして機能する（データ示さず）可溶性Ｍｅｒ受容体チロシンキナーゼと比べると、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}試料においてＡＰＯＥ分泌の増加を示す（図７）（ＡｐｏＥ^−／−血清について試験したマウスＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡキットが信頼できないことが示されたので、ウエスタンブロットを使用する）。対照と比べて有意に増加した量のＡｐｏＥ ｍＲＮＡもまた、成体Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}脳から新たに抽出したＦＡＣＳソートミクログリア細胞において観察される（図８）。

【0084】

網膜下ＭＰがＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおいて蓄積する理由は完全には理解されていない。理論的には、網膜下ＭＰの数は以下により決定される：ｉ）動員、ｉｉ）インサイチュー増殖、ｉｉｉ）遊走（放出）、および／またはｉｖ）アポトーシスによるクリアランス。Ｃｘ３ｃｒ１欠失マウスにおけるＭＰの蓄積は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＭＰによるＣＣＬ２の過剰発現に起因し、それによって血液からのＣＣＲ２^＋Ｍｏ動員の増加を引き起こすことが示された（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３）。光チャレンジされたＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−マウスに追跡可能なヌクレオチドＥｄＵを局所注射したが、網膜下ＭＰに取り込ませることができず、インサイチュー増殖は、蓄積の重要な一因とはならないことが示唆される（Ｓｅｎｎｌａｕｂ ｅｔ ａｌ， ２０１３の補足材料）。網膜下ＭＰが網膜下腔から放出されるか、またはアポトーシスを受けるかを評価するために、１２，０００個のＣＦＳＥ染色ＷＴ−およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−チオグリコレート誘発腹腔ｓ細胞（７０％Ｍφを含む）を、ＷＴマウスの網膜下腔に養子移入させ、網膜剥離が鎮静するとすぐに（８〜１２時間）、ＲＰＥ−および網膜−フラットマウント上のＣＦＳＥに関して共染色したＦ４／８０発現Ｍφの数を計数した。

【0085】

定量により、注射されたマクロファージは、網膜下腔から急速に排除され（図９）、両方の遺伝子型のマクロファージのクリアランスが４日間で達成されたことが示された。眼の細胞浮遊液におけるＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋ＣＤ１１ｂ^＋マクロファージのサイトメトリー定量により、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マクロファージは、注射後２４時間で、眼の中に、有意に多くの数で存在することが示された（図１０）。網膜色素上皮／脈絡膜および網膜フラットマウント上のＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージ細胞数により、網膜下腔におけるこの違いが確認された（図１１）。サイトメトリー分析におけるＦ４／８０^＋ＣＤ１１ｂ^＋−ＭφのＣＦＳＥ蛍光強度は強く、均一であり（図１０）、宿主細胞による、ＣＦＳＥの取り込み（多様なＣＦＳＥ強度をもたらす）、または増殖（半減したＣＦＳＥ蛍光強度を有する細胞集団となる）が有意な程度に起こらなかったことが示唆された。それにもかかわらず、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφのクリアランスは、有意に遅く、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφは１目および２日目では有意に高い数で存続した（図３３）。網膜下腔からの放出の徴候は、ＷＴ−またはＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφ注射動物において検出できなかった。というのも、ＣＦＳＥ^＋細胞が網膜内層および脈絡膜、血液、局所リンパ節、肺、肝臓、または脾臓において、組織学的検査またはサイトメトリーにより観察されなかったからである（データ示さず）。しかしながら、多数の網膜下ＣＦＳＥ^＋細胞の核がＴＵＮＥＬ^＋であることが見出され、アポトーシス、例えば核濃縮および分割核の徴候を示し、アネキシン−Ｖ陽性であったが、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は陰性であった。実験を実施し、観察された違いが腹腔Ｍφに特異的か、または他の起源のＭＰにより共有されるかを評価した。ＷＴおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウス由来の、ＣＦＳＥ−標識、磁気ビーズソート骨髄由来Ｍｏ（約９５％純粋、図３４）、およびＣＤ１１ｂＦＡＣＳソート脳ＭＣ（約９５％純粋、図３５）を、ＷＴ−マウスの網膜下腔中に養子移入させた。腹腔Ｍφのように、両方の起源のＣｘ３ｃｒ１欠失ＭＰは、注射後１日目に網膜およびＲＰＥ／脈絡膜フラットマウント上で計数した場合、数が有意に多かった。さらに、ＷＴ−およびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφはインビトロでの増殖に差異を示さず（図４３）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφの迅速な増殖は、養子移入実験において観察される差異の原因ではないことが示唆される。

【0086】

ＭＰ ＡＰＯＥ発現が網膜下ＭＰのクリアランス速度に影響するかどうかを評価するために、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−Ｍφを、ＷＴ−レシピエントに養子移入した。際だったことに、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−Ｍφの網膜下クリアランスに対する抵抗性の増加は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−Ｍφでは完全に消失した（図１１）。さらに、、主なヒトＡＰＯＥアイソフォームである脂質を含まない外因性のＡＰＯＥ３を、ＷＴ−ＣＦＳＥ^＋−Ｍφに添加すると、網膜下クリアランスに対する抵抗性を増加させるのに十分であった（図３６）。

【0087】

総合すれば、これらの結果により、免疫特権部位で予測されるように、および末梢組織における炎症消散の観察（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）に従って、特に、網膜下の免疫抑制環境の状況での白血球クリアランス（Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００２）に従って、網膜下マクロファージクリアランスは主にアポトーシスにより媒介されることが示される。さらに、これらの結果により、試験した全ての起源（腹腔、骨髄、および脳）のＣｘ３ｃｒ１欠失ＭＰは、網膜下クリアランスに対してより抵抗性を有することが示される。このクリアランスに対する抵抗性の増加はＡＰＯＥ依存性であり、その局所の組換えＡＰＯＥは、網膜下腔からのＷＴ−Ｍφの排除を阻害するのに十分である。

【0088】

実施例６：ＡｐｏＥは、ＦａｓＬを介して網膜下マクロファージ生存を制御する
ＣＸ３ＣＬ１／ＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達は走化性におけるその役割でよく知られている。そのため、非効率的な放出がＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおける網膜下単核食細胞蓄積の原点ではないかと疑うことができる。しかしながら、本結果により、単核食細胞放出は、網膜下腔から測定可能に起こらないことが示され、これは免疫特権部位のため驚くにはあたらない。

【0089】

網膜色素上皮の免疫抑制環境の変化が網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}単核食細胞の蓄積と関連するかどうかを試験するために、ＦａｓＬ発現を最初にインビボで分析する。ＲＰＥは、一部にはその免疫抑制性を媒介するＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）を構成的に発現する（Ｗｅｎｋｅｌ＆Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ， ２０００）。２ヶ月および１２ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの網膜色素上皮／脈絡膜抽出物について実施したＲＴ−ＰＣＲにより、ＦａｓＬ ｍＲＮＡ発現は、若いマウスでは同等であり、Ｃｘ３ｃｒ１^＋／＋マウスでは年齢に伴い増加するが、網膜下ＡＰＯＥ発現単核食細胞が蓄積する年齢をマッチさせたＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスでは著しく低いことが示された（図１２）。同様に、２ヶ月齢の光チャレンジした、網膜下ＭＰ蓄積を有するＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスは、ＷＴと比べて有意に少ないＦａｓＬ ｍＲＮＡを発現した（データ示さず）。

【0090】

ＷＴマウスおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの網膜切片および網膜色素上皮フラットマウント上での免疫組織化学的検査により、１２ヶ月で網膜下ＩＢＡ−１^＋単核食細胞を有するＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの網膜色素上皮におけるＦａｓＬ発現の減少が確認され（データ示さず）、よって、Ｃｘ３ｃｒ１欠失ＭＰはＲＰＥ−ＦａｓＬ転写を阻害することが示唆された。これは、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−ＭφをＷＴ−マウスの網膜下腔に注射することにより確認され、これにより、ＲＰＥ／脈絡膜抽出物のＦａｓＬ転写は、ＷＴ−Ｍφを注射した眼と比べると、３時間後に著しく阻害されたことが示された（図１７）。

【0091】

ＦａｓＬは、活性化単球および活性化マクロファージのアポトーシスをインビトロで誘導することが知られているが、網膜下単核食細胞のクリアランスにおけるその役割はわからないままである。ＦＡＳ−ＦＡＳＬシグナル伝達がＭＰクリアランスに関与するかどうかを評価するために、網膜下ＭＰ数を、光チャレンジしたＷＴ−、ＦＡＳＬ−欠損−（ＦａｓＬ^{ｇｄｌ／ｇｄｌ}−マウス）およびＦＡＳ−欠損−（Ｆａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ}−マウス）において比較した（ＦａｓＬ^{ｇｄｌ／ｇｄｌ}−およびＦａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ}−マウスは、年齢と共にリンパ節腫脹および全身性自己免疫疾患を発症し、１２ヶ月で年齢依存性ＭＰ蓄積を評価することは困難である）。網膜およびＲＰＥ／脈絡膜−フラットマウントで網膜下ＩＢＡ１^＋−ＭＰを定量すると、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスと同様に、２ヶ月齢ＦａｓＬ^{ｇｄｌ／ｇｄｌ}−およびＦａｓ^{ｌｐｒ／ｌｐｒ}−マウスにおいて４日間の光チャレンジにより網膜下ＭＰの著しい増加が誘導されることが明らかになった（図３７）。

【0092】

ＷＴ ＣＦＳＥ^＋ＴＰＣを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）またはＦａｓＬ−欠損マウス（ＦａｓＬ^{ｇｌｄ／ｇｌｄ}マウス）に、およびＦａｓ−欠損ＣＦＳＥ^＋ ＴＰＣ（チオグリコレート誘発腹腔炎のＦａｓ^{ｌｐｒ−ｌｐｒ}マウスから調製）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに網膜下注射する養子移入実験により、網膜下ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージは、ＦａｓまたはＦａｓＬ機能が障害される注射後２４時間で有意に多数となり、ＷＴレシピエントにおける２４時間でのＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋マクロファージの数と類似であることが明らかになる（図１３）。

【0093】

ＦＡＳＬ誘導ＭＰ死に対する感受性の違いが網膜下ＭＰ蓄積におけるＡｐｏＥ−欠失の保護効果の一因となるかどうかを試験するために、異なるマウス系統由来の単球（Ｍｏ）およびチオグリコレート誘発Ｍφを、ＭｅｇａＦａｓＬに曝露し、ＴＵＮＥＬ^＋細胞を２４時間目にインビトロで定量した（図３８）。結果は、ＦＡＳＬが、インビトロでのＦＡＳＬ誘導アポトーシスに対してむしろ抵抗性があるＭφと比べて、Ｍｏのアポトーシスをインビトロで誘導するのに十分であることを示している（Ｋｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ， １９９７； Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ， ２００３； Ｕｍ ｅｔ ａｌ， １９９６）。野生型−とＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−細胞のＭｏまたはＭφのいずれかの間で違いは観察されなかったが、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−−およびＡｐｏＥ^−／−−細胞の両方のＭｏにおいて感受性の増加傾向があり、これは、インビボで観察されるクリアランスの差に貢献するであろう。養子移入した腹腔Ｍφの網膜下クリアランスに及ぼすＭｅｇａＦａｓＬの効果（図２１）はインビトロでのＭｅｇａＦａｓＬ誘導アポトーシスよりもはるかに強かったことから（図３８）、これらの結果はまた、ＦＡＳＬが、他の因子と共にインビボで作用して、網膜下腔においてＭφアポトーシスを誘導することも強調する。

【0094】

これらの結果は、網膜色素上皮Ｆａｓ−ＦａｓＬシグナル伝達が、インビボでの網膜下マクロファージのクリアランスに関与すること、網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−ＭＰは、ＲＰＥ ＦＡＳＬ発現のダウンレギュレーションと関連すること、およびＭｅｇａＦａｓＬによる置換が網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}−ＭＰのクリアランスを回復させることが示す。

【0095】

実施例７：ＡＰＯＥはＩＬ−６を介して網膜下マクロファージ生存を促進する
ＩＬ−６は、リンパ球におけるＦａｓＬ転写をダウンレギュレートすることが知られている。さらに、ＡＰＯＥおよびＡＰＯＡ−Ｉは、ＴＬＲシグナル伝達を活性化する、またはＬＰＳ／ＴＬＲ４により誘導されるＩＬ−６誘導を阻害するそれらの能力で知られている。ＡＰＯＥおよびＡＰＯＡ−Ｉはいずれも、ＴＬＲ−２および−４を含むＣＤ１４依存性自然免疫受容体クラスターを、ＴＬＲリガンドの非存在下で活性化することができる（Ｓｍｏａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。この活性化は、ＡＰＯＡ−Ｉの場合、数あるサイトカインの中でも、ＩＬ−６を誘導することが示されている。本発明の結果により、ＡＰＯＡ−ＩおよびＡｐｏＥ３は、刺激後８時間での上清のＥＬＩＳＡにより測定される、インビトロでのマクロファージのＬＰＳ誘導ＩＬ−６分泌を著しく阻害することが確認される（図１４）。同様に、ＷＴ−腹腔−Ｍφを、脂質を含まない組み換え型ＡＰＯＥ３と共に２４時間インキュベートすると、ＩＬ−６が非常に有意に誘導された（図３９）。ＬＰＳ阻害剤ポリミキシンＢは誘導を阻害しなかったが、一方、９０分間の熱変性は誘導を無効にし、ＡＰＯＡ−Ｉに対して複数のアプローチを使用して示されるように、ＡＰＯＥ３のＬＰＳ混入が、その効果の原因ではないことが確認される（Ｓｍｏａｋ ｅｔ ａｌ， ２０１０）。中和抗体は、対照ＩｇＧと比較してこの効果を阻害したことから、ＡＰＯＡ−Ｉに対して示されるように、この誘導は主にＣＤ１４およびＴＬＲ２依存性であった（図３９）。

【0096】

しかしながら、脂質を含まないＡＰＯＥ３およびＡＰＯＡ−Ｉをまた、ＬＰＳなどのＴＬＲアゴニストの非存在下で投与すると、ＡＰＯＡ−Ｉに対して既に報告されたように、マクロファージにおいて８時間でＩＬ−６を著しく誘導する（図１４）。２４時間では、ＩＬ−６分泌はＡＰＯＥ３刺激マクロファージにおいてさらに増加するが、９０分間の熱変性（９５℃）は誘導を無効にし、ＡＰＯＡ−Ｉに対して複数のアプローチを使用して示されるように、ＡＰＯＥ３のＬＰＳ混入がその効果の原因ではないことが確認される。

【0097】

それに対応して、ＣＸ３ＣＬ１と共に２４時間培養した場合、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＴＰＭは、ＷＴ ＴＰＭと比較して有意に高い量のＩＬ−６を発現して分泌する（図１５および１６）。この効果は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＡｐｏＥ^−／−ＴＰＭにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ（図１５）およびＥＬＩＳＡ（図１６）により観察されるように有意に阻害される。ＩＬ−６はインビボでは眼全体のｍＲＮＡ抽出物においてＲＴ−ＰＣＲにより検出できないが、ＩＬ−６染色は、１２ヶ月齢Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスおよび光チャレンジされたＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスでは、ＩＢＡ−１^＋網膜下単核食細胞において再現性良く検出される（データ示さず）。これらの結果から、外因性ＡＰＯＥおよびＡＰＯＥを過剰発現するＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マクロファージは増加した量のＩＬ−６を産生することが示される。

【0098】

ＡｐｏＥ−ＩＬ−６分泌マクロファージが網膜色素上皮ＦａｓＬ発現に直接影響するかどうかを試験するために、ＷＴおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＴＰＣをＷＴレシピエントに網膜下注射して、３時間後に網膜色素上皮ＦａｓＬ ｍＲＮＡ発現を網膜色素上皮／脈絡膜抽出物においてＲＴ−ＰＣＲにより評価する。実際、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＴＰＣは、ＷＴ ＴＰＣを注射した眼と比較すると、ＦａｓＬ転写を有意に阻害する（図１７）。

【0099】

実際、組換えＩＬ−６の網膜下注射は、ＰＢＳと比較して、網膜色素上皮ＦａｓＬ転写をインビボで有意に阻害するのに十分である。対照的に、増加した網膜下マクロファージ生存を誘導するのに十分な用量で注射された、脂質を含まないＡＰＯＥ３（図１８）は、マクロファージの非存在下で注射される場合、ＦａｓＬ発現を直接変化させない。これらの結果により、マクロファージＩＬ−６が網膜色素上皮ＦａｓＬ発現を調節するが、ＡＰＯＥは調節しないことが示唆される。

【0100】

加えて、ＣＦＳＥ^＋ＴＰＣに添加される組換え型ＩＬ−６は、網膜下ＷＴ ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージ（図１９）の数を２倍以上にし、ＩＬ−６遮断抗体は、注射後２４時間で、それらの対照と比較して網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージを有意に減少させる（図２０）。さらに、ＣＤ１４−およびＩＬ−６遮断抗体は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの病変周囲ＲＰＥに局在する網膜下ＩＢＡ−１＋ＭＰ／衝撃を減少させる（図４０）。さらに、六量体ＦａｓアゴニストＭｅｇａＦａｓＬ（Ｇｒｅａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００６）をＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋ＴＰＣに同時共投与すると、観察されたＦａｓＬのダウンレギュレーションを効率よく代償し（図２１）、ＩＬ−６遮断抗体と同様に、網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージの数を有意に低減させる。インビトロで、ＷＴおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マクロファージに対して実施された、Ｆａｓ ＲＴ−ＰＣＲおよびＦａｓ誘導アポトーシスは、遺伝子型によるいかなる差も明らかにせず（図２２Ａおよび２２Ｂ）、よって、網膜下マクロファージ生存の相違は、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マクロファージのＦａｓＬ／Ｆａｓ誘導アポトーシスに対する感受性の変化のためではないことが示される。

【0101】

ＣＤ１４依存性ＩＬ−６誘導が実際、インビボでの網膜下ＭＰ蓄積に関与するかどうかを試験するために、対照ＩｇＧおよびＩＬ−６−またはＣＤ１４−中和抗体を、レーザー損傷（これもまた網膜下腔への抗体浸透を促進する）による網膜下炎症の誘導後に、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスの硝子体に注射した。レーザー衝撃後７日目にＣＤ１０２＋ＣＮＶに隣接するＲＰＥ上で観察される網膜下ＩＢＡ１＋ＭＰの蓄積は、関連するＣＮＶと同様に、ＣＤ１４またはＩＬ−６が中和されると有意に阻害された（図４２）。

【0102】

要約すると、本データは、マクロファージＡＰＯＥがマクロファージＩＬ−６発現を調節すること、ＩＬ−６により調節される網膜色素上皮ＦａｓＬが、網膜下マクロファージクリアランスの重要なメディエーターであることを示す。このメカニズムは、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マクロファージの内在性ＡＰＯＥおよびＷＴマクロファージに外から添加されたＡＰＯＥが、網膜下腔内での単核食細胞の生存をどのように増加させるのかを説明する。このように、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＭＰは、増加した量のＡＰＯＥを発現する。ＡＰＯＥはＭＰにおいてＩＬ−６の発現を誘導し、次にＩＬ−６がＲＰＥにおいてＦａｓＬ転写をダウンレギュレートする。ＦＡＳＬ発現の減少は網膜下Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ} ＭＰの生存時間の増加に関与する。

【0103】

よって、本結果はＡＰＯＥおよびＩＬ−６がＡＭＤ発病に関与することを初めて証明する。ＩＬ−６がＲＰＥＦａｓＬ発現を抑制すること、網膜下ＭＰの生存を延長すること、ならびに慢性網膜下炎症を促進することが示されたことを考慮すると、ＣＤ１４またはＩＬ−６阻害はこのように、ＲＰＥ免疫抑制機能を再確立し、後期ＡＭＤにおける病原性炎症を阻害するのを助けることができる。

【0104】

実施例８：ＡＰＯε２アレル関連ＡｐｏＥ分泌は網膜下マクロファージの生存および網膜変性を促進する
上記で示されるように、ＣＸ３ＣＲ１は、単核食細胞におけるＡＰＯＥ転写を調節するが、ＡＰＯＥの転写調節は、複雑であり、転写因子と近位プロモーターおよび遠位エンハンサーとの相互作用を必要とすることが知られている。ε２／ε３／ε４アレルを規定する２つの多型、ｒｓ７４１２およびｒｓ４２９３５８が、近年、ＡＰＯＥ転写を後成的に、細胞タイプ依存的、アイソフォーム依存的およびＤＮＡメチル化依存的に調節する、明確に定義されたＣｐＧアイランドに埋め込まれていることが示された（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。ＡＭＤリスクの増加を与えるＡＰＯε２アレルは、他のアイソフォームと比較して、ｒｓ７４１２でＣｐＧ部位を欠如し、脳アストロサイトなどの特定の細胞タイプにおいてＡＰＯＥ転写の増加を引き起こす。単核食細胞におけるその転写に及ぼすＡＰＯＥアレルの影響を評価するために、ヒトＡＰＯＥアイソフォームと同一のＣｐＧアイランド構造を有するヒト化ＡＰＯＥマウスモデルを使用する。結果から、ＡＰＯε２ＢＭＭおよびＲＰＭは、２つの他のアイソフォームに比べて、２４時間の細胞培養後に、有意に多くのＡＰＯＥ ｍＲＮＡを発現することが示される（図２３、ＡＰＯε３ ＢＭＭと比較して計算）。ＴＰＭにおける発現はより変化しやすく、新たに抽出された脳ＭＣでは有意差は検出されていない（データ示さず）。同様に、網膜下単核食細胞の分化を模倣するために、ＰＯＳの存在下で３日間培養したＡＰＯε２ ＢＭＭのＲＴ−ＰＣＲは、ＡＰＯε３およびＡＰＯε４マウス由来のＢＭＭと比べると、有意に多くのＡＰＯＥ ｍＲＮＡを発現する（図２４）。

【0105】

興味深いことに、２４時間培養したＢＭＭとは異なり、ＰＯＳの非存在下で培養したＢＭＭでは３日目に有意差は検出されず、このことは、各ＡＰＯＥアイソフォームに対してホモ接合のヒトドナー由来の、インビトロで１４日目の単球由来マクロファージに関して既に知られている報告と類似である。ＡＰＯε２ ＲＰＭはまた、抗ヒトＡＰＯＥ ＥＬＩＳＡを使用して決定されるように、他のアイソフォームと比べると、有意に多くのＡＰＯＥを分泌する（図２５）。興味深いことに、Ｃｘ３ｃｒ１欠乏およびＡＰＯε２アレルは、同じ単核食細胞におけるＡＰＯＥ転写に影響を与えず、根底にある転写制御メカニズムは別々であることが示唆される。しかしながら、Ｃｘ３ｃｒ１欠乏およびＡＰＯε２アレルは、浸潤単球の網膜下単核食細胞分化をおそらく最もよく模倣するＰＯＳ−インキュベートＢＭＭにおいてＡＰＯＥ転写に影響する。

【0106】

ＡＰＯＥ依存的マクロファージＩＬ−６分泌は、網膜下マクロファージの生存が増加するための重要なメディエーターであることから、ＡＰＯＥアイソフォームがＩＬ−６を同様に誘導するかどうか、およびε２／ε３／ε４アレルを有するマクロファージがインビトロでのＩＬ−６放出に差があるかどうかを試験する。ＡＰＯＥ−インキュベートＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＲＰＭ由来の培地のＥＬＩＳＡ分析により、３つ全てのアイソフォームは、対照と比べるとＩＬ−６分泌を有意に誘導するが、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ４による誘導はＡＰＯＥ３より有意に劣ることが示される（図２６）。しかしながら、増加量のＡＰＯＥを分泌するＡＰＯε２ ＲＰＭはＡＰＯε３およびＡＰＯε４マクロファージと比べると、有意に多くのＩＬ−６を放出する（図２７）。

【0107】

これらの結果により、ＩＬ−６の誘導におけるＡＰＯＥ２の効率の減少は、ＡＰＯε２ ＲＰＭにおけるＡＰＯＥ分泌の増加による代償より大きいことが示される。

【0108】

ＡＰＯε２ ＲＰＭにおいて観察された、ＡＰＯＥおよびＩＬ−６分泌の増加により、網膜下マクロファージクリアランスが減少するかどうかを試験するために、ＣＦＳＥ−標識常在腹腔細胞（ＲＰＣ）を網膜下注射して、ＣＦＳＥ^＋Ｆ４／８０^＋マクロファージを、網膜および網膜色素上皮フラットマウント上で２４時間目に定量する。

【0109】

ＡＰＯε２ ＲＰＭはＡＰＯε３およびＡＰＯε４マクロファージよりも有意に多く（図２８）、ＩＬ−６遮断抗体またはＭｅｇａＦａｓＬを添加すると、注射後２４時間で、ＡＰＯε２マクロファージの存在を有意に低減させた（図２９）。

【0110】

ＡＰＯε２アレルが網膜下単核食細胞クリアランスに対するこの抵抗性をインビボで与えるかどうかを調べるために、本発明者らは１２ヶ月齢のＡＰＯε３−、ＡＰＯε２−、およびＡＰＯε４−マウスのＩＢＡ−１染色網膜および網膜色素上皮／脈絡膜フラットマウントにおける単核食細胞の蓄積を評価した。興味深いことに、網膜下ＩＢＡ−１^＋単核食細胞の定量は、他のアイソフォームを有するマウスに比べて、ＡＰＯε２マウスにおいて有意な年齢依存性網膜下単核食細胞の蓄積を示した（図３０）。さらに、網膜下ＭＰのこの有意な増加が、４５００ｌｕｘの光チャレンジ後４日目（図４８）およびレーザー熱傷による網膜下炎症の誘導後７日目（図４４）に、ＡＰＯε２−マウスにおいて観察された。

【0111】

その上、１２ヶ月齢のＡＰＯε３−、ＡＰＯε２−およびＡＰＯε４−マウスの組織学的分析およびそれらのＯＮＬ厚さの定量（図３１Ａおよび３１Ｂ）により、ＡＰＯε３−およびＡＰＯε４−マウスに比べて、１２ヶ月齢ＡＰＯε２マウスにおける視細胞の有意な年齢依存的喪失が明らかとなり、レーザー損傷後７日目でのＡＰＯε２−マウスにおける炎症の増加は、ＲＰＥ／フラットマウント上のＣＤ１０２陽性面積として定量される、脈絡膜血管新生の増加を伴った（図４６）。

【0112】

その上、１２ヶ月齢のＡＰＯε３−、ＡＰＯε２−およびＡＰＯε４−マウスの組織学的分析およびそれらのＯＮＬ厚さの定量（図３１Ａおよび３１Ｂ）により、ＡＰＯε３−およびＡＰＯε４−マウスに比べて、１２ヶ月齢ＡＰＯε２マウスにおける視細胞の有意な年齢依存的喪失が明らかとなる。

【0113】

ＣＤ１４依存的ＩＬ−６誘導が実際に、インビボでの網膜下ＭＰ蓄積に関与するかどうかを試験するために、対照ＩｇＧおよびＩＬ−６−またはＣＤ１４−中和抗体を、レーザー損傷（これもまた網膜下腔への抗体浸透を促進する）による網膜下炎症の誘導後、ＡＰＯε２−マウスの硝子体に注射した。レーザー照射後７日目に、ＣＤ１０２＋ＣＮＶに隣接するＲＰＥ上で観察された網膜下ＩＢＡ１＋ＭＰの蓄積は、ＣＤ１４またはＩＬ−６を中和すると（図４５）、関連するＣＮＶのように（図４７）、Ｃｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスと同様に、有意に阻害された。

【0114】

要約すると、上記結果により、ＡＭＤリスクを与えるＡＰＯε２アレルは、ある一定の状況下では、単核食細胞におけるＡＰＯＥ転写およびＩＬ−６分泌の増加と関連することが示される。上記実験により、ＡＰＯＥ−過剰発現ＡＰＯε２単核食細胞はＩＬ−６およびＦａｓＬ依存的に、網膜下クリアランスに対してより抵抗性であることが証明される。このように、これは、同様のメカニズムが網膜下でインビボで起こる、加齢ＡＰＯε２トランスジェニックマウスにおいてインビボで観察される、網膜下単核食細胞の年齢依存的蓄積および関連する視細胞変性から推論することができる。

【0115】

まとめて考えると、上記知見は上昇したＩＬ−６レベルとＡＭＤとのまだ未解明の関連に対する重要な病理的機序を提供し（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００８）、軟性ドルーゼン内およびその周囲での網膜下単核食細胞の蓄積が、早期中期ＡＭＤで観察される重要な病巣性炎症に関与することを証明する。これらの知見により、ＡＰＯＥは早期ＡＭＤにおいて網膜下単核食細胞で発現され、ＣＸ３ＣＲ１の持続性阻害シグナルを欠くマウスおよびＡＰＯε２トランスジェニックマウスにおいて増加することも証明される。上記結果により、ＡＰＯＥはＩＬ−６を誘導し、ＩＬ−６は、網膜色素上皮ＦａｓＬ発現をダウンレギュレートし、よって、長期の網膜下単核食細胞生存、単核食細胞蓄積、およびＣｘ３Ｃｒ１欠失マウスおよびＡＰＯε２マウスで観察される関連する視細胞変性を可能にすることが証明される。

【0116】

上記結果によりさらに、ＡＭＤリスクを与えるＡＰＯε２アレルは単核食細胞における増加したＡＰＯＥ転写と関連すること、このメカニズムはＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達とは独立していることが証明される。これらの結果により、ＡＰＯε２ ＴＲおよびＣｘ３ｃｒ１^{ＧＦＰ／ＧＦＰ}マウスにおいて観察されるＡＰＯＥ過剰発現網膜下単核食細胞は排除に対してより抵抗性があることも示される。これらの結果を考慮すると、ＡＰＯε２を有する患者における、軟性ドルーゼンの周りの、地図状病変に隣接する、ＣＮＶにおける、網膜色素上皮に隣接する増加した網膜下単核食細胞の蓄積は、このように、明らかにＡＭＤの進行および後期ＡＭＤに関与すると考えられる。そのため、前記から、意外にも、過剰量のＡＰＯＥおよびＩＬ−６の阻害、または網膜色素上皮ＦａｓＬ発現の回復は、早期ＡＭＤにおける網膜下炎症の制御を可能にし、後期ＡＭＤの発症を防止するという結果が得られる。

【0117】

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Ｗｅｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ−ｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ ｔｉｓｓｕｅ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ４１： ３４６７−３４７３。
Ｙｕ ｅｔ ａｌ． （２０１３）．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＡＰＯＥ ｇｅｎｅ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２２（２４）：５０３６−４７。
Ｚｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１４） ＣＸ３ＣＬ１ （Ｆｒａｃｔａｌｋｉｎｅ） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｔｉｎａ： Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｓｔｕｄｉｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ９： ｅ１０６５６２。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【手続補正書】

【提出日】2016年9月27日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

網膜炎症の治療において使用するためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項2】

前記網膜炎症が、萎縮型加齢黄斑変性および網膜色素変性症を含む、請求項１に記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項3】

前記ＩＬ−６阻害剤が、（ｉ）ＩＬ−６活性のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６を認識する抗体、可溶性ＩＬ−６受容体もしくはＩＬ−６翻訳の阻害剤、または（ｉｉ）ＩＬ−６受容体のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６Ｒを認識する抗体もしくはＩＬ−６Ｒ結合ペプチドを含む、請求項１または２に記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項4】

前記ＩＬ−６阻害剤が、眼内に、好ましくは硝子体内注射により投与され、または、局所眼内投与により適用される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項5】

前記ＩＬ−６阻害剤が、５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【手続補正書】

【提出日】2016年9月27日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

網膜炎症の治療において使用するためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項2】

前記網膜炎症が、萎縮型加齢黄斑変性および網膜色素変性症を含む、請求項１に記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項3】

前記ＩＬ−６阻害剤が、（ｉ）ＩＬ−６活性のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６を認識する抗体、可溶性ＩＬ−６受容体もしくはＩＬ−６翻訳の阻害剤、または（ｉｉ）ＩＬ−６受容体のアンタゴニスト、例えばＩＬ−６Ｒを認識する抗体もしくはＩＬ−６Ｒ結合ペプチドを含む、請求項１または２に記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項4】

前記ＩＬ−６阻害剤が、眼内に、好ましくは硝子体内注射により投与され、または、局所眼内投与により適用される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【請求項5】

前記ＩＬ−６阻害剤が、５ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６阻害剤。

【国際調査報告】