特表 2017-506221 綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-506221(P2017-506221A)

(43)【公表日】2017年3月2日

(54)【発明の名称】綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/81 20060101AFI20170210BHJP

   A61K 38/55 20060101ALI20170210BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20170210BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20170210BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170210BHJP

   A61K 35/16 20150101ALN20170210BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/81ZNA

   A61K37/64

   A61K37/24

   A61P7/06

   A61P43/00 121

   A61K35/16 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2016-548248(P2016-548248)

(86)(22)【出願日】2014年1月27日

(85)【翻訳文提出日】2016年7月21日

(86)【国際出願番号】CN2014071586

(87)【国際公開番号】WO2015109604

(87)【国際公開日】20150730

(31)【優先権主張番号】201410036118.X

(32)【優先日】2014年1月24日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】516219587

【氏名又は名称】南京必▲優▼康生物技▲術▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110000659

【氏名又は名称】特許業務法人広江アソシエイツ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金以▲豊▼

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼奇

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼太平

(72)【発明者】

【氏名】▲馬▼▲暁▼▲艶▼

(72)【発明者】

【氏名】宣佶

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084CA36

4C084DB56

4C084DC34

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA55

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA04

4C087BB35

4C087DA25

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA55

4C087ZC75

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA56

4H045EA24

(57)【要約】

綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用を開示する。本発明は、α１−アンチトリプシン製剤（ヒト血漿由来）の不純物から該因子を単離・精製し、該因子がα１−アンチトリプシン分子の前駆体（ｐｒｅｃｕｓｏｒ）における断片であり、マウスにおいて強い綱赤血球生成促進機能を有することを確定した。本発明の綱赤血球増殖因子から、重症貧血を治療する薬物を調製することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列が、α１−アンチトリプシン前駆体の４１８個のアミノ酸中の断片であり、同一ファミリーに属し、
Ｎ端（バンド１−１；配列番号２）

【化1】

、又は
Ｎ端（バンド１−２；配列番号３）

【化2】

、又は
Ｎ端（バンド１−３；配列番号４）

【化3】

、又は
Ｎ端（バンド１−４；配列番号５）

【化4】

であり、
Ｃ端（配列番号６）

【化5】

であり、
上記配列と７０％の配列同一性を有する糖タンパク質及び非糖タンパク質がいずれもＲＧＦファミリーに属することを特徴とする、綱赤血球増殖因子。

【請求項2】

（１）０．０２ｍｏｌ／ＬのＰＢＳで、ヒト血漿由来のα１−アンチトリプシン製剤を２．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させる工程と、
（２）ＨＰＬＣ Ｃ_１８Ｆ逆相カラムで中性分離して３個のタンパク質ピーク群を得る工程と、ここで、活性測定により、第３ピーク群が綱赤血球の成長促進活性があり、
（３）第３ピーク群を更にＨＰＬＣ Ｃ_１８Ｆで二次分離し、溶離勾配を増加させることにより１０個のタンパク質収集部分を得る工程であって、ここで、活性測定により、第８収集部分により高い活性があり、
（４）第８収集部分に調製的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質を有することが明らかなゲルバンドを切り取ってすりつぶし、水で繰り返して抽出し、濃縮した後純度と活性を測定し、且つシークエンシングを行う工程と、
から構成される、請求項1に記載の綱赤血球増殖因子の調製方法。

【請求項3】

貧血治療薬物の調製における請求項１に記載の綱赤血球増殖因子の使用。

【請求項4】

エリスロポエチンと組み合わせて使用することにより、明らかな相乗効果を有することを特徴とする、請求項３に記載の貧血治療薬物の調製における綱赤血球増殖因子の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は医薬生物学の技術分野に属し、具体的には綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、臨床において重症貧血を治療するための最も効果的な薬物はエリスロポエチン（ｒｈｕ−ＥＰＯ）である。１９８９年に米国アムジェン社の組換えヒト（ｒｈｕ）ＥＰＯがＦＤＡに承認されて以来、ｒｈｕ−ＥＰＯは既に一般に受け入れられ、ＤＮＡ組換え薬物の最も成功した例に発展した。ＥＰＯは赤血球の生成において今まで発見した唯一の特定の赤血球増殖因子である。幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）及び様々なコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）もまた赤血球の生成促進作用を有すると報告されたが、それらの作用は多機能的であり、排他的でない。現在まで、新たな重症貧血を治療する薬物は未だ発見されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明が解決しようとする課題は、新たな綱赤血球増殖因子（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＲＧＦ）並びにその調製方法及び使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明の研究過程において、腎細胞培養液並びにヒト尿及び血漿にも赤血球の生成を促進する活性を有するタンパク質が存在し、その分子量、免疫原性、及び受容体でさえもＥＰＯと異なることが発見された。しかし、この活性タンパク質の含有量は非常に低く、十分な純品を取得して性質を研究することが困難であった。最後にヒト血漿由来のα１−アンチトリプシン（α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）製剤の不純物が高い綱赤血球生成促進活性を有することを見出した。本発明は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の生化学的精製手段により得られたいくつの高活性タンパク質であり、いずれもα１−アンチトリプシンの前駆体（ｐｒｅｃｕｓｏｒ）における長さの異なるペプチド断片であり、長さの異なる糖を有し、ある成分には糖が少なく、あるいは糖がないことが同定された。

【0005】

本発明の技術的手段
１．ＲＧＦの精製
ａ．シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製のα１−アンチトリプシン製剤（Ａ−９０２４）はヒト血漿由来であり、高い綱赤血球生成促進活性がある。活性の測定は程雅琴教授のマウス綱赤血球測定法を採用した。具体的な方法は以下の通りである。

【0006】

動物：ＩＣＲマウス、体重１８〜２２g、雄性

【0007】

サンプル：ＲＧＦの活性に応じて希釈し、一般的には５〜２０μｇ／ｍｌである。

【0008】

方法：３匹のマウスを１群として、０．０６ｍｌ、０．１２ｍｌ、及び０．２４ｍｌで３日間筋肉注射した。４日目に目の縁から採血し、１００Ｕ／ｍｌヘパリンナトリウムを２０μｌ投入した蓋付きチューブに７〜８滴添加して均一に混合し、５０μｌの血液を取り出し、これをスライドガラスの一端にプレコーティングされた、乾燥ブリリアントクレシルブルー染料に滴下し、十分に混合させ、湿気箱に３０分間放置した。第２のスライドガラスで単層細胞を押圧し、自然乾燥させた後、メタノールで固定し、その後ライト染色液で対比染色を行うと共に、乾燥させないように０．０２ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）を滴下し、３０分間後、ＰＢＳ又は蒸留水で染色液を洗浄した。

【0009】

高倍率油浸レンズで観察すると、綱赤血球中の核物質は、ブリリアントクレシルブルーにより濃紺色の点状、線状、鎖状又は集塊状に染色することができ、一方、赤血球は核物質を含まない。計測により、一般に５００〜１０００個の赤血球があり、ここから綱赤血球の百分率を算出する。各サンプルについて２枚のスライドガラスを観察して平均値を取り、各組の３匹のマウスについて更に平均値を取り、コントロール（０．１２μｌの生理食塩水）の綱赤血球百分率を引いて、綱赤血球の純増％を得た。１％増加する毎に１単位（Ｕ）と定義し、注射されたタンパク質の量（１回の注射量）から比活性を算出し、即ち１ｍｇあたりのタンパク質の刺激により増加した単位（Ｕ／ｍｇ）を比活性とした。

【0010】

生理食塩水を用いて、異なる濃度のα１−アンチトリプシン製剤を調製した。１５匹のＩＣＲマウス（体重１８〜２２ｇg、雄性）を３匹ずつ５組に分け、コントロール組のマウスには０．１２ｍｌの生理食塩水を筋肉注射し、他の組のマウスには、濃度の異なるアンチトリプシン製剤０．１２ｍｌを注射し、３日間連続的に注射した後、４日目に目の縁から採血し、ブリリアントクレシルブルーで染色し、油浸レンズで、赤血球中の綱赤血球の百分率をカウントした。その結果、該製剤における綱赤血球生成促進活性が強く、出発材料として更に単離・精製することができることが証明された。結果を以下の表に示す。

【0011】

【表1】

【0012】

以上の表の結果は、α１−アンチトリプシン製剤には、高い綱赤血球生成促進活性が確実に含まれていることを示している。

【0013】

ｂ．α１−アンチトリプシン製剤を、０．０２ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ６．８）で濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させる。ＨＰＬＣ Ｃ_１８逆相カラムで中性分離して３個のタンパク質ピーク群を得た。活性測定により、第３ピーク群が活性を有することが分かる。Ｃ_１８逆相カラムの分離パターンを図１に示し、その結果を表２に示す。

【0014】

【表2】

【0015】

ｃ．更に第３ピーク群の溶離勾配を大きくして再度Ｃ_１８逆相カラムを用いて、１０個の収集部分を得た。活性測定の結果、第８収集部分の活性が最も高く、次いで第７及び９収集部分であり、他の７個の収集部部分はいずれも活性を有していない。分離パターンを図２に示し、活性測定の結果を以下の表に示す。

【0016】

【表3】

【0017】

ｄ．第８収集部分について調製的（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３に示す。）を行い、クマシーブリリアントブルー染色の表示位置に基づいて、未染色ゲルからバンド１〜４の４本のゲルを切り取り、それぞれすりつぶした後、水で２４時間、３回連続的に抽出し、上澄液を合わせ、凍結乾燥させた後活性測定を行った。その結果、バンド１、バンド２、及びバンド３の抽出液のみが活性を示し、バンド４は活性を示さなかった。結果を以下の表に示す。

【0018】

【表4】

【0019】

これらの抽出液を凍結乾燥した後、更にＳＤＳ−ＰＡＧＥ検査を行った結果、バンド１及び３にはいずれも明瞭な染色バンドがあり、バンド２は活性が高いが、バンド１のサンプルに近いので、汚染の恐れがあり、また、染色もぼやけており、明らかに単一のバンドではない。よって、バンド１及び３のサンプルを蘇州普泰生物技術公司に送ってシークエンシングを行った。同定の結果、バンド１及び３がいずれもα１−アンチトリプシンの前駆体（ｐｒｅｃｕｓｏｒ）であると確定した。我々はこのファミリーのペプチド断片を、いずれも綱赤血球増殖因子ファミリーＲＧＦｓと呼び、前駆体（ｐｒｅｃｕｓｏｒ）の配列は以下の通りである（配列番号１）。

【0020】

【化1】

【0021】

２、ＲＧＦの化学的性質
その化学性質を確定するために、調製的電気泳動で得られたバンド１及び３のＮ端とＣ端のアミノ酸配列を測定すべく、ＤＴＴでジスルフィド結合を開裂し、次いでヨードアセトアミドで−ＳＨ基を保護してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルのクマシーブリリアントブルー染色を行った後、現れたバンド１及び３のゲルを切り取って、蘇州普泰生物技術有限公司に送り、Ｎ端及びＣ端の配列を測定した。その結果、バンド１（即ち、蘇州普泰生物技術有限公司のシークエンシング報告におけるＲＧＦ−６））に含まれる４種の成分がいずれもα１−アンチトリプシン前駆体の長さの異なる断片であり、Ｎ端の部位がわずかに異なり、Ｃ端がいずれも前駆体のＣ端であることを示す。

【0022】

バンド３（即ち、蘇州普泰生物技術有限公司の報告におけるＲＧＦ−８））は単一の成分であり、Ｎ端及びＣ端がいずれもバンド１−２と完全に同じで、２５位〜４１８位の計３９４個のアミノ酸からなるが、バンド１の分子量は約５００００であり、バンド３の分子量よりも１００００以上大きい。バンド１には糖が含まれ、バンド１の成分が糖タンパク質であることが知られているため、分子量から、バンド３のタンパク質には糖が含まれない、あるいは糖の含有量が極めて少ないと推定した。

【0023】

このため、ＲＧＦファミリーは、α１−アンチトリプシン前駆体に由来する、長さ及び糖含有量が異なるタンパク質断片群である。そのアミノ酸配列は以下の通りである。

【0024】

N端（バンド１−１；配列番号２）

【化2】

【0025】

N端（バンド１−２；配列番号３）

【化3】

【0026】

N端（バンド１−３；配列番号４）

【化4】

【0027】

N端（バンド１−４；配列番号５）

【化5】

【0028】

C端（配列番号６）

【化6】

【0029】

３．ＲＧＦの生物学的性質
ａ．再生不良性貧血マウスに対するＲＧＦの治療作用。本実験は江蘇省中医学院薬理教研室に委託することにより実施した。

【0030】

モデリング：１８〜２２ｇの雄性マウスに対して、１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを３日間連続して腹腔内注射（ｉｐ）した。

【0031】

試験：マウスを５組に分けた。中国国内生産品（寧紅欣）のＥＰＯを用いた。ＲＧＦは本実験室で調製された製品であり、８日間連続的に筋肉注射した後採血して、ＲＢＣ及びＷＢＣを検査した。その結果を以下の表に示す。

【0032】

【表5】

【0033】

明らかにシクロホスファミドによりマウス貧血を引き起こすことができ、ＥＰＯ又はＲＧＦの注射によりいずれも赤血球の生成を促進することができる。また、半分のＥＰＯと半分のＲＧＦの組み合わせによりマウス赤血球生成の治療する場合、単独での全量による治療効果よりも良く、明らかな相乗効果が示された。尚、注意すべきのは、ＲＧＦ及びＥＰＯは白血球の生成にも促進効果があり、且つ相乗効果も同じである。

【0034】

ｂ．マウス綱赤血球の生成に対するＲＧＦとＥＰＯとの相乗効果
動物：ＩＣＲマウス３０匹（雄性、体重１８〜２２ｇ）を３匹ずつ１０組に分けた。

【0035】

実験：ＲＧＦ及びＥＰＯを以下の３種の濃度：（ａ）ＲＧＦ ５μｇ／ｍｌ、（ｂ）ＥＰＯ（アムジェン社製ｒｈｕＥＰＯ）１８Ｕ／ｍｌ、（ｃ）ＲＧＦとＥＰＯとの等量混合、に配合した。（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を各組のマウスにそれぞれ０．０６ｍｌ、０．１２ｍｌ、０．２４ｍｌの３種の用量で３日間連続的に注射した。４日目に目の縁から採血し、スライドガラスに塗り、染色させ、顕微鏡で綱赤血球の増加百分率を検査した。結果を以下の表に示す。

【0036】

【表6】

【0037】

ＲＧＦ及びＥＰＯはいずれも優れた綱赤血球生成促進活性があり、１８Ｕ／ｍｌのＥＰＯ及び５μｇ／ｍｌのＲＧＦの活性は非常に近似し、等量のＥＰＯとＲＧＦとを混合した後、明らかな相乗効果が示され、特に０．２４ｍｌを注射した試験組は、同様に０．２４ｍｌのＥＰＯ又はＲＧＦを注射した組よりも、綱赤血球増加百分率が５０％程度高い。そして、このような現象はＲＧＦが生体内（インビボ）でマウスＥＰＯの生成を促進することにより発生した見せかけである可能性があるかどうかを調べるため、異なる用量のＲＧＦをマウスに３日間注射した後、マウス血液中のＥＰＯレベルをモノクローナル抗体で測定し、生理食塩水コントロール群と比較した。その結果、ＥＰＯレベルが上昇していなかったことから、この可能性は排除された。よって、ＥＰＯ及びＲＧＦが赤血球の異なる発育段階に作用し、両者のリレー作用により、自然に赤血球の生成速度を増速させると推定した。この仮説は以下の蛍光標識実験で確認された。

【0038】

以上の２つの実験ではいずれも、ＲＧＦとＥＰＯとの相乗効果が示され、この現象は重症貧血症の治療に非常に重要な意義があり、貧血症をより合理的且つ効果的に治療することができることを示している。

【0039】

ｃ．蛍光標識試験
蛍光染料ローダミン（ＲＢ２００）でＥＰＯを標識した。蛍光顕微鏡で観察すると、ＥＰＯは赤色であった。また、蛍光染料ＦＩＴＣでＲＧＦを標識した。蛍光顕微鏡で観察すると、ＲＧＦは緑色である。４匹のマウスの長骨から約２０ｍｌの骨髄細胞サンプルを採取し、１０００ｒ／ｍで４分間遠心し、上澄液を除去し、６ｍｌのハンクス液に再度懸濁し、リンパ細胞分離液で分離し、界面細胞を採取して遠心した。細胞をＲＰＭＩ１６４０培養液で１．８×１０^６／ｍｌの細胞懸濁液へと希釈し、５ｍｌを取って遠心し、０．３ｍｌのＰＢＳに再度懸濁し、ＦＩＴＣ−ＲＧＦ６０μｌ及びＲＢ２００−ＥＰＯ６０μｌを添加し、冷蔵庫で３０分間放置し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、細胞の大部分は二重標識で、少数の細胞がＦＩＴＣ−ＲＧＦ単一標識であったが、最終までＲＢ２００−ＥＰＯ単一標識の細胞は見つからなかった。この現象は、赤血球の発育過程の初期段階においてＲＧＦが作用し、ＲＧＦの促進により細胞が次の発育段階に達してからＥＰＯの受容体が現れ、従って、ＲＧＦとＥＰＯの受容体が共に発現した二重受容体細胞が現れたことを示している。

【発明の効果】

【0040】

本発明の有益な効果
赤血球の分化成熟は多段階で多因子が関与する複雑な過程であるが、赤血球の生成を促進する第２因子は２０年以上発見されていなかったため、綱赤血球増殖因子の発見は非常に重要な意義がある。綱赤血球増殖因子とＥＰＯとを組み合わせて使用すると、単独で使用した場合と比べて効果がより優れる。赤血球の異なる発育段階には異なる因子の誘導及び促進が必要であると証明され、これは赤血球発育の全過程を知り、重症貧血を治療することに対して新たな始まりとなる。本発明は、正常のマウスと再生不良性貧血マウスに現れたＲＧＦとＥＰＯとの相乗効果を解釈することに寄与した。それらは赤血球の異なる発育段階に役割を果たすことから、骨髄細胞はＲＧＦの作用でより多くのＥＰＯ受容体を生成し、それにより二重受容体細胞に発育し、ＥＰＯが続いて役割を果たし、そのリレー促進により、より良い効果があることを理解することができる。本発明は重症貧血の治療に新たな薬物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】ＨＰＬＣ Ｃ_１８逆相カラムによるα１−アンチトリプシン製剤の第１次分離のクロマトグラムであり、第２次分離により３個の収集部分が得られ、そのうちの第３部分が活性を有する。

【図2】第１次分離よりも分離勾配を大きくしたＨＰＬＣ Ｃ_１８逆相カラムによる第２次分離であり、１０個の収集部分が得られ、そのうちの矢印で示す第８ピークの収集部分の活性が高い。

【図3】第２次ＨＰＬＣ分離で得られた１０個の収集部分中の第８収集部分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図であり、そのうち，分子量が５００００程度で最深染色部分がバンド１（ＲＧＦ−Ｐ１）と呼ばれ、分子量が４００００程度である部分がバンド３（ＲＧＦ−Ｐ３）と呼ばれ、Ｐ１とＰ３との間の部分がＲＧＦ−Ｐ２と呼ばれ、P１以上の部分には活性がない。

【発明を実施するための形態】

【0042】

１．２瓶のα１−アンチトリプシン（α１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）製剤を、０．０２ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．０）で濃度が２．５ｍｇ／ｍｌとなるように溶解させる。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｃ_１８カラムで中性分離して３個のタンパク質ピーク群を得た。図１に示すように、そのうちの第３ピーク群が強いマウス綱赤血球生成促進作用を示す

【0043】

２．第３ピーク群の溶離勾配を大きくして再度分離した。その結果、１０個の収集部分が得られ、図２及び表３に示すように、そのうち、第７、８及び９収集部分のみが綱赤血球生成促進活性を示し、第８収集部分の活性が最も高かった。

【0044】

３．第8収集部分について調製的ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、1本のゲルを縦方向に切り取って、クマシーブリリアントブルー染色で染色することにより、タンパク質バンドの位置を確定した。分子量約５００００の位置では比較的深色で幅広いバンドが現われ、対応するゲル塊を切り取ってバンド１とした。分子量約４００００の位置における明瞭なバンドを切り取り、バンド３とした。バンド１と３との間の３〜４本の染色体はぼやけており、そのうちのバンド１に近いものをバンド２とし、分子量５００００〜６８０００の間のバントをバンド４とした。これらの４部分のバンドのゲルをそれぞれガラス棒ですりつぶし、水で２４時間抽出して上澄液を吸引し、更に３回繰り返した。５日目に、４回の抽出により得られた抽出液を合わせて凍結乾燥させ、更に少量の水に溶解させた後、活性を測定した。その結果、バンド１、２及び３の抽出液にはいずれも高い活性があり、バンド４には活性が認められなかった。この結果を表３に示す。

【0045】

４．バンド１、２及び３の抽出液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。バンド１及びバンド３には明瞭な染色帯があり、一方、バンド２の染色帯がぼやけており、一部のバンドの位置がバンド１に近すぎることから、バンド１及び３の染色ゲルのみを蘇州普泰生物技術有限公司に送って配列を測定した。測定結果により、バンド１及び３のサンプルがいずれもα１−アンチトリプシンの前駆体（ｐｒｅｃｕｓｏｒ）の一部であることが証明された。結果はアミノ酸配列として示す。

【0046】

５．バンド１及び３の化学性質を確定するために、Ｎ端とＣ端のアミノ酸配列を測定すべく、ゲル抽出液をＤＴＴ処理してジスルフィド結合を開裂し、次いでヨードアセトアミドで−ＳＨ基を保護してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、バンド１及び３の染色ゲルを蘇州普泰生物技術有限公司に送って配列を測定した。結果を付属書類２に示す。Ｎ端とＣ端の配列測定の結果から、バンド１に含まれる４種の成分がいずれも、４１８個のアミノ酸からなるα１−アンチトリプシン前駆体の、長さが異なる断片であり、これらの断片のＮ端の開始点は異なり、それぞれ２４位、２５位、２７位及び３０位のアミノ酸であり、Ｃ端がいずれも同じ前駆体の末端であった。バンド３は単一の成分であり、その構造はバンド１−２と完全に同じであり、即ち２５位〜４１８位の計３９４個のアミノ酸からなる。しかし、分子量が糖を含むバンド１よりも小さいため、分子量に基づいて、バンド３は糖が含まないか、あるいは糖の含有量が極めて少ないと推定された。

【0047】

６．α１−アンチトリプシンの前駆体の配列は知られており、また、その分子量が４６８７８であることも知られている。バンド１及び３の分子量はいずれも前駆体の分子量よりも小さく、且つ分子量４００００〜５００００の間の更にいくつかの成分も活性を示した。アンチトリプシンの前駆体は、長さの異なる複数のペプチド断片の群に分解することができ、これらのペプチド断片もまた、長さの異なる糖鎖を有するか、あるいは糖鎖がないと推定された。ペプチド断片により構成された活性タンパク質群が異なる作用部位を有するか否かはまだ不明であるが、ＥＰＯと共に生物体における赤血球生成の調整作用に関与することは明らかである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2017506221000001.app

【国際調査報告】