特表 2017-508971 ３つの抗体を利用する発光酸素チャネリング免疫測定法並びにその製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-508971(P2017-508971A)

(43)【公表日】2017年3月30日

(54)【発明の名称】３つの抗体を利用する発光酸素チャネリング免疫測定法並びにその製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/536 20060101AFI20170310BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20170310BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/536 D

   G01N37/00 101

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2016-557105(P2016-557105)

(86)(22)【出願日】2015年3月24日

(85)【翻訳文提出日】2016年11月10日

(86)【国際出願番号】US2015022209

(87)【国際公開番号】WO2015148479

(87)【国際公開日】20151001

(31)【優先権主張番号】61/970,596

(32)【優先日】2014年3月26日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】507269175

【氏名又は名称】シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＥＭＥＮＳ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100075166

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 巖

(74)【代理人】

【識別番号】100133167

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 浩

(72)【発明者】

【氏名】リー、ジェイ ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】レッデン、デイヴィッド ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】カウデン、エリック スコット

(72)【発明者】

【氏名】ルゥ、ドーンライ

(57)【要約】

化学発光検出システム並びにこれを含有するキット及びマイクロ流体デバイスが開示される。また、このシステム、キット及び装置を用いる方法が開示される。第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片はこれらの抗体又は結合断片が本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能するものであれば如何なる形態で提供されてもよい。例えば、第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片のそれぞれは、ポリクローナル抗体／結合断片であってもモノクローナル抗体／結合断片であってもよい。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

特定の被検体のための化学発光検出システムを含有するキットであって、該キットが
（ａ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物であって、前記第一の抗体又はその結合断片が、被検体の第一のエピトープに特異的に結合し、それによって前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が前記第一の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体である組成物、
（ｂ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第二の抗体又はその結合断片を含有する第二組成物であって、前記第二の抗体又はその結合断片が、前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合し、それによって一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が前記第二の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体であり、且つ、前記第一及び第二のエピトープは、少なくとも部分的に重複して、この結果、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない組成物、及び
（ｃ）第三の抗体又はその結合断片を含有してなる第三組成物であって、前記第三の抗体又はその結合断片が、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができ、このとき、前記第三の抗体又はその結合断片は、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤と会合することができ、これによって、前記第三の抗体又はその結合断片の増感剤との会合により、前記増感剤の前記被検体との間接的な結合が可能になる組成物を
含有してなるキット。

【請求項2】

更に増感剤を含有してなり、第三組成物が前記第三の抗体又はその結合断片に会合した増感剤を更に含有してなる請求項１に記載のキット。

【請求項3】

前記第一及び第二組成物のうちの少なくとも１つが、前記活性化された化学発光化合物によって励起された少なくとも１つの蛍光分子を、更に含有してなる請求項１又は２に記載のキット。

【請求項4】

（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つが凍結乾燥された試薬の形態にあると更に定義される請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項5】

凍結乾燥された試薬の再構築のための賦形剤を更に含有してなる請求項４に記載のキット。

【請求項6】

マイクロ流体デバイスであって、
（ｉ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物であって、前記第一の抗体又はその結合断片が、特異的な被検体の第一のエピトープに特異的に結合し、それにより前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が、前記第一抗体又はその結合断片を介して、前記被検体に間接的に結合することができる検出抗体である第一組成物；
（ｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第二の抗体又はその結合断片を含有してなる第二組成物であって、前記第二の抗体又はその結合断片が、前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合し、それにより前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が、前記第二抗体又はその結合断片を介して、前記被検体に間接的に結合することができる検出抗体であり、且つ、前記第一及び第二のエピトープは、少なくとも部分的に重複して、この結果、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない第二組成物；及び
（ｉｉｉ）第三の抗体又はその結合断片を含有する第三組成物であって、前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができる第三組成物；及び
（ｉｖ）前記第三抗体又はその結合断片に会合することができる増感剤であって、励起状態で一重項酸素を発生することができ、前記第三抗体又はその結合断片の前記増感剤との会合により、前記増感剤の前記被検体への間接的結合が可能になる増感剤；を
含有する少なくとも１つの区画を含有してなるマイクロ流体デバイス。

【請求項7】

それを通して試料が配置される入口経路を更に含有してなり、前記少なくとも１つの区画が前記入口経路と流体連通することができる請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項8】

更に少なくとも２つの区画を含有してなるものであり、第一区画が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含有し、第二区画が（ｉｖ）を含有する請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項9】

それを通して試料が配置される入口経路を更に含有してなり、前記第一区画が前記入口経路と流体連通でき、前記第二区画が前記入口経路及び前記第一区画のうちの少なくとも１つと流体連通できる請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項10】

前記入口経路及び前記少なくとも１つの区画と流体連通できる少なくとも１つの追加の区画を更に含有してなり、前記少なくとも１つの追加の区画が希釈剤を含有する請求項６〜９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項11】

試料中の特定の被検体の存在及び／又は濃度を検出する方法であって、以下の工程を含有してなる方法。
（ａ）同時に又は、全てを若しくは一部分を、逐次的に、下記を合一する工程；
（ｉ）前記特定の被検体を含有していると推定される試料；
（ｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化合物及びそれに会合している第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物であって、前記第一の抗体又はその結合断片が特定の被検体の第一のエピトープに特異的に結合する検出抗体である組成物；
（ｉｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化合物及びそれに会合している第二の抗体又はその結合断片を含有してなる第二組成物であって、前記第二の抗体又はその結合断片が前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合する検出抗体であり、且つ、前記第一及び第二のエピトープが少なくとも部分的に重複し、これにより、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない組成物；
（ｉｖ）第三の抗体又はその結合断片を含有してなる第三組成物であって、前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができる組成物；及び
（ｖ）前記第三の抗体又はその結合断片と会合できる増感剤であって、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤。
（ｂ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）を、試料内の被検体に結合させる工程であって、
被検体分子、（ｉｉ）及び（ｉｖ）を含有してなる第一のサンドウィッチ錯体が形成され、もう１つの被検体分子、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含有してなる第二のサンドウィッチ錯体が形成され、且つ、（ｖ）が、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中の（ｉｖ）と会合し、斯くして、増感剤を、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の化学発光化合物に極めて接近させる工程；
（ｃ）増感剤を活性化して、一重項酸素を発生させる工程であって、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する増感剤の活性化により、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する化学発光化合物が活性化される工程；
（ｄ）前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する活性化された化学発光化合物により発生された化学発光の量を測定する工程；
（ｅ）所望により、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程；及び
（ｆ）このようにして生成された化学発光の量を分析することにより、前記被検体の存在及び／又は濃度を検出する工程であって、化学発光の量は、試料中の被検体の量に正比例する工程。

【請求項12】

前記増感剤が光増感剤であり、且つ、工程（ｃ）が光照射により光増感剤を活性化するものと更に定義される請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれかを合一するのに先立って前記試料を分離工程に付する工程を更に含有してなる請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第一及び第二組成物の一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が同一である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記第一及び第二組成物の一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が異なるものである請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、本出願とともにコンピュータ読み取り可能な形で提出された配列一覧（ファイル名：２０１４Ｐ０７１１４ＷＯ−Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ。６ＫＢ）を、参照により、組み入れる。

【0002】

（連邦政府の資金提供を受けた研究開発に関する記載）
該当せず。

【背景技術】

【0003】

免疫測定技術は、医学診断の分野において、広く用いられている。商業的に用いられる免疫測定法の１つの例は、ＬＯＣＩ（登録商標）：発光酸素チャネリング免疫測定技術（ニューヨーク州、タリータウン、シーメンス ヘルスケア ダイアグノスティクス インコーポレーテッド）のような−これに限定されないが−誘起発光免疫測定法である。誘起発光免疫測定法は、特許文献１に記載されている。現在利用可能なＬＯＣＩ（登録商標）技術には、数種の試薬を使用し、これらの試薬の２つ（センシビーズ（ｓｅｎｓｉｂｅａｄ）及びケミビーズ（ｃｈｅｍｉｂｅａｄ）と呼ばれる。）が互いに近接させられてシグナルを発する免疫測定法が関わっている。或る波長（これに限定するものではないが、例えば６８０ｎｍ）において光に曝されると、センシビーズは、一重項酸素を放出し、そして、もし２つのビーズが近接していれば、一重項酸素がケミビーズに移される。これにより、化学反応が起こり、ケミビーズが光を発し、これが異なる波長（これに限定するものではないが、例えば６１２ｎｍ）で測定される。

【0004】

しかしながら、この技術には、障害物がある。特に、免疫測定法は、被検体検出メカニズムとして用いられる１以上の抗体の感度及びダイナミックレンジに依存する。例えば、（中央検査室及び／又はポイントオブケア環境で用いられる免疫測定法を始めとする）免疫測定法で現在用いられている商業的に入手可能な抗体は、感度が限られている。更に、誘起発光免疫測定法が、マイクロ流体チップを利用するポイントオブケア（ＰＯＣ）測定法の過程で、限られた感度を有する抗体とともに適用されたとき、測定法の感度は、試料量のより少ない測定法の形態によって更に弱められる。かくして、ＰＯＣ測定法は、要求される測定法感度目標に合致しない。

【0005】

被検体検知免疫測定法の感度は、測定法の構成に採用される１又はそれ以上の抗被検体抗体の親和性に依存する。即ち、抗体の親和性が高いほど、免疫測定法の感度は高くなる。従って、被検体特異的誘起発光免疫測定法の過程で用いるための、高感度の抗被検体抗体が望まれている。残念なことに、現存する抗体よりも実質的に改善された感度を示す抗体は、典型的には、その現存する抗体に比較してダイナミック測定レンジが随分と狭い。

【0006】

特別な非限定的な例において、誘起発光免疫測定法（例えば、これに限定するものではないが、ＰＯＣ誘起発光免疫測定法）によるその検出が望まれている１つの特異的被検体は、心筋トロポニン Ｉ（ｃＴｎｌ）である。心筋トロポニンは、心筋損傷の検出のための最も鋭敏で特異的な生化学的マーカーであると考えられている。欧州心臓病学会及び米国心臓病学会（ＥＳＣ／ＡＣＣ）による急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の再定義は、心筋トロポニンの増加レベルを、参照群の９９ｔｈパーセンタイル値を超える測定値として、定義することを推奨している（非特許文献１）。更に、ＥＳＣ／ＡＣＣによる推奨では、９９ｔｈパーセンタイル決定限界における全不正確さは、１０％以下であることが要求されている（表１）。

【表1】

【0007】

心筋トロポニン測定法の性能に関するこれらの新基準は、軽症の又は初期の心筋損傷で見出される極めて低い水準のトロポニンの定量的で精確な測定を成し遂げるための免疫測定法の企画のための新しいアプローチを必要とする。これらの新しい性能基準を達成し超越するために、これまで、種々の免疫測定法構成、抗体及び検出技術が提案されている。

【0008】

抗体の選択が上述の新しい性能目標に合致させるための中心である。選択基準には、心筋トロポニンＩ結合の特異性ばかりでなく、検出限界及び測定時間を決定する結合親和性をも考慮しなければならない。他の心筋トロポニン及び骨格筋トロポニンに対する交差活性並びに他の心臓血管のバイオマーカーは、重要でない。

【0009】

更に、患者試料中の心筋特異性トロポニンＩの全量を測定することは、最大分析感度について、重要である。心筋トロポニンＩは、遊離して、そして、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）との複合体の形で、そして、程度はより低いが、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）との複合体の形で存在するので、他の心筋トロポニンとの複合体形成に無関係に発現されるｃＴｎＩエピトープと結合する抗体を選択することが重要である。遊離の及び複合体形のｃＴｎＩと結合する能力も、また、用いられる試料型がＥＤＴＡ血漿である状況では、重要である。ｃＴｎＩとｃＴｎＴとの間の会合定数は、Ｃａ^２＋の存在下では、より強くなる。ＥＤＴＡは、Ｃａ^２＋にキレートし、その結果、試料中の遊離ｃＴｎＩに比例して増加する。更に、遊離の及び複合体形のｃＴｎＩの比率は、或る程度、ｃＴｎＩ及びｃＴｎＣのタンパク分解の程度により調節される。

【0010】

壊死性心筋中に存在するタンパク質分解酵素及び患者の血漿中に存在するタンパク質分解酵素の両方によるタンパク質分解後のｃＴｎＩの回収の保証には、抗体の注意深い選択が必須である。分解の度合は、個々の患者により異なる。ｃＴｎＩタンパク質分解の出現により、市場で入手可能なｃＴｎＩ法の間の試料の安定性の明白な相違及び試料間の安定性の相違が生じる。ｃＴｎＩに対する試料安定性は、ｃＴｎＩ試験系中の抗体により認識される特異的なエピトープに依存する。

【0011】

ｃＴｎＩ誘起発光免疫測定法で用いられた市場で入手可能な抗ｃＴｎＩ抗体の初期のものは、その導入時には、十分な安定性を有していた。しかしながら、（上述のように）２０００年にＡＭＩの定義が変えられると、市場で入手可能な抗ｃＴｎＩ抗体は、今や、ｃＴｎＩ測定に対する増大した性能要求水準に対して、限られた感度しか示さない。従って、限られた感度しか示さないこれらの抗体は、（中央試験室及び／又はポイントオブケア方式の両方を含む）誘起発光免疫測定法において要求される測定感度目標を提供しない。更に、限られた感度しか有しない抗体は、ＰＯＣ測定方式で使用される試料量がより少ないために、測定法の感度が更に低下させられるので、マイクロ流体チップを利用するポイントオブケア（ＰＯＣ）測定方式の発展に対して大きな障害である。

【0012】

限られた感度しか有しない現存の抗体を置き換えるべく企図された新しく同定された抗体（即ち、高親和性のヒツジモノクローナル抗ｃＴｎＩ抗体）は、現存の抗体に対して十分に改善された感度を示した。しかしながら、この新しい抗体は、ダイナミック測定レンジが非常に狭い。２０ｎｇ／ｍＬを超えるｃＴｎＩ濃度で信号プラトーが観察され、この新しい高親和性抗体を用いる改良されたｃＴｎＩ測定法は、現在の市販ｃＴｎＩ測定法に要求されるダイナミックレンジを有しない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0013】

【特許文献1】米国特許第５，３４０，７１６号明細書（１９９４年８月２３日、ウルマンら）

【特許文献2】米国特許第４，８１６，５６７号明細書

【特許文献3】国際公開第９２／０２５５１号パンフレット

【特許文献4】国際公開第２０１３／０７８１３０Ａ１号パンフレット

【非特許文献】

【0014】

【非特許文献1】Ａｌｐｅｒｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，３６：９５９−６９（２０００）

【非特許文献2】Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，９：１２９−１３４（２００３）

【非特許文献3】Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕＮＯ：ｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＳ １９９１）

【非特許文献4】Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７（１９８９）

【非特許文献5】Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）

【非特許文献6】Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）

【非特許文献7】Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１−５９７（１９９１）

【非特許文献8】Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８））

【非特許文献9】Ｂａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７８４３−７８４８（１９９６）

【非特許文献10】Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０７：５８４４−５８４９（１９８５）

【非特許文献11】Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４：７２６−７２８（１９８９）

【非特許文献12】Ｂoｈｍｅ及びＢｒａｕｅｒ、ＩＮＯ：ｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３１：３４６８−３４７１（１９９２）

【非特許文献13】Ｎｉｕ及びＦｏｏｔｅ、ＩＮＯ：ｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３１：３４７２−３４７６（１９９２）

【非特許文献14】Ｎａｒｄｅｌｌｏら、ＩＮＯ：ｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３４：４９５０−４９５７（１９９５）

【非特許文献15】Ａｕｂｒｙ及びＢｏｕｔｔｅｍｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１９：５２８６−５２９４（１９９７）

【非特許文献16】Ａｌｍｅｉｄａら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、４８２：９９−１０４（２００３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

従って、大きなダイナミックレンジに亘って高感度を示す新規で改善された抗体に基づく誘起発光免疫測定法及び測定方式が求められている。が指向するのは、そのような測定並びにそれに関連する組成物、キット、装置及び方法である。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明の概念の少なくとも１つの実施態様を、典型的な図面、実験、結果及び実験手順により詳細に説明する前に、本発明の概念が、その適用において、以下の記述において説明され又は図面、実験及び／又は結果に図示された構成要素の構造又は配列の詳細に、限定されないことを理解すべきである。本発明の概念は、他の実施態様を採ることもでき、或いは、種々の方法で実行し又は実施することができる。従って、本明細書で用いられた言語は、可能な限り広範な範囲及び意味を有することが意図されている。そして、実施態様は、典型的なものであって、完全なものを意図していない。また、本明細書で採用した表現法及び専門用語は、説明のためであって限定と見做されるべきではないということも理解されるべきである。

【0017】

本明細書中で他の定義をしない限り、本明細書に開示し特許請求する発明概念に関連して用いられる科学用語及び技術用語には、当業者に一般的に理解されている意味を与えている。更に、文脈が逆の要求をしない限り、単数の用語は、複数を包含し、複数の用語は、単数をも包含する。酵素反応及び純化技術は、製造者の仕様に従って又は当業界で一般的に遂行されるように又は本明細書で記述するように、実行する。前述の技法及び手順は、全般的に、当業界で周知の慣用法に従って、また、本明細書を通して引用し議論している種々の一般的なそしてより特定の参照文献に記述されているように、実行する。本明細書で記述する分析化学、合成有機化学並びに医薬品化学及び薬化学に関連して用いられる命名法並びに実験手順及び技法は、当業界において周知で一般的に用いられるものである。

【0018】

本明細書において言及されている全ての特許、刊行された特許出願及び非特許刊行物は、ここで開示し特許請求する発明の概念に関連する分野の熟練者の技術水準を示す。この出願の如何なる部分であれ、参照されている全ての特許、刊行された特許出願及び非特許刊行物は、参照により、あたかも個々の特許又は刊行物が明確に個別に参照により導入されると指示されていたかのように、同程度に、そっくりそのまま、本明細書に明白に導入される。

【0019】

本明細書に開示し特許請求する全ての組成物及び／又は方法は、本明細書の開示を考慮して過重な実験なしに製造し実行することができる。本明細書に開示し特許請求する発明概念の組成物及び方法は、好ましい実施態様に基づいて記述されているけれども、ここで記述している組成物及び／又は方法に、そして工程に又は一連の工程に、本明細書に開示し特許請求する発明概念の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、変形を加えてもよいことが、当業者には明らかである。当業者に明らかなそのような同様の置換及び修飾は、全て、付随する請求項によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の中にあるとみなされる。

【0020】

本明細書の開示に一致して用いられるように、以下の用語は、反対の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。

【0021】

語“ａ”又は“ａｎ”の使用は、請求項及び／又は明細書において用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含有してなる）とともに用いられたときは、「１つの」を意味するが、「１つ又はそれ以上」、「少なくとも１つ」及び「１又は１より多く」の意味とも矛盾しない。単数形“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈に明らかに反しない限り、複数の指示物を包含する。従って、例えば、「１つの化合物」への言及は、１以上の、２以上の、３以上の、４以上の又はより大きな数の化合物への言及であってよい。用語「複数の」は、「２以上」に言及している。請求項における用語「又は」の使用は、代替物のみを参照することが明示されていない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために用いられている。尤も、開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を参照する定義を支持している。この出願を通して、用語「約」は、或る数値が装置、その数値を決定するために用いられる方法の固有の誤差変動、又は研究対象中に存在する変動を含むことを示す。例えば、これには限定する意図はないが、用語「約」が用いられたとき、指示された値は、そのような変化が開示された方法を実行するのに適切であるように、そして、当業者に理解されるように、指定された値から±２０％、又は±１０％、又は±５％、又は±１％、又は±０．１％変化し得る。用語「少なくとも１つ」は、１並びにこれらに限定されるわけではないが、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００等を含む１より大きい任意の量、と理解される。用語「少なくとも１つ」は、それが結びつけられている用語に応じて、１００又は１，０００又はそれ以上に拡張し得る。更に、量１００／１，０００は、制限的なものと考えてはならない。というのは、より大きな限界値も、また、満足な結果を生じるからである。更に、用語「Ｘ、Ｙ及びＺのうちの少なくとも１つ」は、Ｘのみ、Ｙのみ及びＺのみのほか、Ｘ、Ｙ及びＺの任意の組合せを包含すると解される。序数用語（例えば、「第１の」、「第２の」、「第３の」、「第４の」等々）の使用は、２以上の項目を区別する目的のためだけであり、例えば、如何なる連続、順序、或る項目の他の項目に対する重要性又は添加の順序をも、示唆することを意図していない。

【0022】

本明細書及び請求項で用いられているように、用語「含有してなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”及び“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”といった“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”の任意の形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに“ｈａｖｅ”及び“ｈａｓ”といった“ｈａｖｉｎｇ”の任意の形）、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”及び“ｉｎｃｌｕｄｅ”といった“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”の任意の形）、又は“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”（並びに“ｃｏｎｔａｉｎｓ”及び“ｃｏｎｔａｉｎ”といった“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”の任意の形）は、包括的なものであるか終わりがないものであり、列挙されていない追加の要素又は方法段階を排除しない。

【0023】

本明細書で用いられる用語「又はこれらの組合せ」は、この用語に先立って列挙された項目の全ての順列及び組合せに言及する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はこれらの組合せ」は、少なくとも、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの１つを、そして、特定の文脈において順序が重要であるならば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢをも、包含することを意図している。この例に引き続いて、特に、１つ又はそれ以上の用語の繰り返しを含む組合せ、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等々といった、組み合わせも含まれる。当業者は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、典型的には、如何なる組合せにおいても用語の数に制限がないことを理解するであろう。

【0024】

本明細書で用いられる用語「実質的に」は、それに引き続いて記述される出来事又は状況が完璧に起きるか又はそれに引き続いて記述される出来事又は状況が大いに又はかなりの程度起きることを意味する。例えば、用語「実質的に」は、それに引き続いて記述される出来事又は状況が時間の９０％以上、又は９５％以上、又は９８％以上に起きることを意味する。

【0025】

本明細書で用いられる句「と会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」は、２つの部分が互いに直接会合すること及び２つの部分が互いに間接的に会合することを含む。会合の非限定的な例には、１つの部分がもう１つの部分に直接結合により又はスペーサー基を介して共有結合すること、１つの部分がもう１つの部分に直接又はその部分に結合している特定の結合対メンバーにより非共有的に結合すること、１つの部分を他の部分に、１つの部分をもう１つの部分に溶解することにより又は合成により、導入すること、及び１つの部分をもう１つの部分に被着させることが含まれる。

【0026】

本明細書で用いられる用語「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」は、出発材料又は天然材料に比べて、少なくとも１桁の純化、例えば、これは限定するものではないが、２、３、４又は５桁の純化、が達成されることを意味する。従って、本明細書で用いられる用語「純化された」は、必ずしも、材料が１００％純化されたこと意味するものではなく、従って、そのような用語は、純化された組成物中に他の材料が存在することを排除しない。

【0027】

用語「類似体」又は「誘導体」は、ここでは、交換可能に用いられ、所与の化合物と同一の基本炭素骨格及びその構造中における同一の炭素官能性を含有してなる物質を指すが、それらの１つ以上の置換をも包含する。本明細書で用いられる用語「置換」は、１つの化合物の少なくとも１つの置換基の残基Ｒによる置き換えを指すと理解される。非限定的な具体例では、Ｒは、以下のものを含む。即ち、Ｈ、ヒドロキシル、チオール、フッ化物、塩化物、臭化物又は沃化物から選ばれるハロゲン化物、以下の１つから選ばれるＣ１−Ｃ４化合物：直鎖状の、分岐状の又は環状の、置換されていてもよいアルキル、直鎖状の、分岐状の又は環状のアルケニル、ここで、任意の置換基は、１以上のアルケニルアルキル、アルキニルアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルケニルアルキル、アリールシクロアルキル及びアリールヘテロシクロアルキルから選ばれ、これらのそれぞれは、１つ以上のアルケニルアルキル、アルキニルアルキル、シクロアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクロアルケニルアルキル、アリールシクロアルキル、及びアリールヘテロシクロアルキル、フェニル、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）_２、カルボキシ及び−Ｃ（Ｏ）−アルキルから選ばれる任意の置換基で置換されていてもよい。

【0028】

本明細書で用いる用語「試料」は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って用いられる全ての型の生物学的試料を包含すると理解される。用いることができる生物学的試料の例は、これらに限定するものではないが、全血又はその部分（即ち、血漿又は血清）、唾液、喀痰、脳脊髄液（ＣＦＳ）、皮膚、間質液、涙、粘液、尿、綿棒、組合せ等を包含する。

【0029】

本明細書で用いる用語「結合パートナー」は、他の分子と会合し得る任意の分子をいうと理解される。例えば、これは限定を意図するものではないが、結合パートナーは、（ポリクローナル又はモノクローナル抗体を始めとする）抗体、抗体断片（例えば、これらに限られないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、二重特異性抗体、単鎖抗体及び無傷の抗体の可変領域の少なくとも一部を保持している他の抗体断片）、受容体、配位子、アプタマー、抗体代替タンパク質若しくはペプチド（即ち、改変結合タンパク質／ペプチド）、分子認識ポリマー（即ち、無機マトリクス）、これらの結合若しくは誘導体、並びに、被検体に特異的に結合できるあらゆる他の分子であってよい。

【0030】

用語「抗体」は、最も広い意味で用いられており、その範囲は、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む。）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、更に、所望の生物的活性を有する限り抗体断片にも、及ぶ。従って、用語「抗体」又は「抗体ペプチド」は、全長免疫グロブリン分子（即ち、無傷抗体）、又は特定の抗原結合について該無傷抗体と競合するその結合断片を意味する。結合断片は、リコンビナントＤＮＡ技術又は無傷抗体の酵素的若しくは化学的な切断により、製造することができる。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィドに結合したＦｖ、Ｆｄ、二重特異性抗体、単鎖抗体、（例えば、これに限られるわけではないが、ＮＡＮＯ：ＢＯＤＩＥＳ（登録商標（ベルギー、ズウェイナールデ、アブリンクス社）等の）単一ドメイン抗体、及び、無傷抗体の可変領域の少なくとも一部を保持している他の抗体断片が包含される。非特許文献２を参照されたい。

【0031】

本明細書で用いる用語：抗体の「抗体結合断片」又は「抗体結合部分」は、抗原に結合する能力を保持している抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷抗体の断片により達成される。用語：抗体の「抗原結合断片」に包含される結合断片の例には、これらに限られるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィドに結合したＦｖ、Ｆｄ、二重特異性抗体、単鎖抗体、（例えば、これに限られるわけではないが、ＮＡＮＯ：ＢＯＤＩＥＳ（登録商標（ベルギー、ズウェイナールデ、アブリンクス社）等の）単一ドメイン抗体、単離ＣＤＲＨ３、及び、無傷抗体の可変領域の少なくとも一部を保持している他の抗体断片が包含される。これらの抗体断片は、通常のリコンビナント手法及び／又は酵素的手法を用いて得ることができ、無傷抗体と同様の方法で、抗原結合について選別される。

【0032】

用語「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲ’ｓ」は、抗体又は抗体軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在断片の結合特性を決定する抗体又は抗体断片の相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。ほとんどの例において、重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）が存在する。これらのＣＤＲは、抗体分子の機能活性に貢献し、足場領域又は枠組み領域を有するアミノ酸配列により分離される。種々のＣＤＲのうち、ＣＤＲ３配列、特にＣＤＲＨ３、は、最も多様であり、従って、抗体特異性に最も強力に貢献する。ＣＤＲの決定には、少なくとも２つの手法、即ち、（１）交差種配列変異性に基づいたアプローチ（非特許文献３）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいたアプローチ（非特許文献４）がある。

【0033】

用語「エピトープ」は、本明細書で用いる場合、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を指す。幾つかの実施態様において、エピトープは、抗体によって特異的に結合される抗原の領域である。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸、糖側鎖、フォスフォリル及び／又はスルフォニル基等の分子の、これらに限られるわけではないが、化学的に活性な表面基を含む。幾つかの実施態様においては、エピトープは、特異的な３次元構造特性及び特異的な電荷特性を有していてもよい。

【0034】

本明細書で用いる用語「エピトープ」は、直鎖状エピトープ及び立体配座エピトープの両方を含むと理解される。直鎖状エピトープは、抗原からのアミノ酸の連続配列で形成され、従って、抗原の第一級／直鎖状ペプチド／タンパク質構造を含有する。立体配座エピトープは、抗原アミノ酸配列の不連続部分からなり、三次元表面特性及び／又は抗原の第三級構造の形態に基づく。

【0035】

エピトープは、特定の抗体がもう一つのエピトープに特異的に結合するならば、両エピトープは「同一である」と定義される。幾つかの実施態様において、異なる第一級アミノ酸配列を有するポリペプチドが、同一のエピトープを含有していてもよい。幾つかの実施態様において、同一のエピトープが異なる第一級アミノ酸配列を有していてもよい。異なる抗体は、それらが同じエピトープに対する特異的結合において競合するならば、同じエピトープに結合すると言われる。

【0036】

抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中の抗原を優先的に認識するとき、その抗原に「特異的に結合」する。幾つかの実施態様において、抗原は、特定のエピトープに特異的に結合する抗原結合部位を含む。そのような幾つかの実施態様において、抗体は、異なる抗原に、この異なる抗原が特定の又は密接に関連するエピトープを含有する限り、結合することができる。幾つかの実施例において、例えば、異なる種からの相同タンパク質は、同一のエピトープを含有し得る。幾つかの実施態様において、抗体は、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ、１０^−１２Ｍ又は１０^−１３Ｍ以下の解離定数で、抗原に特異的に結合する。

【0037】

「単離された」抗体は、それが製造された環境の一成分から分離され及び／又は回収された抗体である。その製造環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療のための使用に干渉し得る材料であり、酵素、ホルモン及びタンパク質性の又は非タンパク質性の他の溶質を含み得る。幾つかの実施態様において、抗体は、少なくとも３つの方法によって、（１）Ｌｏｗｒｙ法による測定で抗体の５０重量％超、例えば７５重量％超、又は８５重量％超、又は９５重量％超、又は９９重量％超に、（２）スピニングカップ配列決定装置を使用して、Ｎ−末端又は内部アミノ酸配列の１０残基以上、例えば１５残基以上、を得るのに十分な程度に、又は（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を使用して還元又は非還元条件下のＳＰＤ−ＰＡＧＥによって均質に、測定可能なものとして純化される。抗体がその中で製造される環境成分の少なくとも１つが存在しないので、単離された抗体は、リコンビナントセル内に元の位置で抗体を含んでいる。しかしながら、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの生成工程により調製される。更に、「単離された抗体」は、実質的に、異なる抗原特異性を有する他の抗体を含まない。しかしながら、単離された抗体は、他の関連する抗原に対する幾分かの交差反応性を有している。

【0038】

本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、同じエピトープに特異的に結合する実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生的な突然変異を除いて、（個々の抗体の糖化パターンには、多様性があるけれども）同一である。典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含有する伝統的な（ポリクローナル）抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、１つの製法において、それがハイブリドーマ培養により合成され、従って、他の免疫グロブリンによって汚染されないという点において有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集合から得られたという意味の抗体の特性を示すものであり、抗体を何らかの特定の方法で生産することを必要とすると解してはならない。例えば、或る実施態様において、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って製造されたモノクローナル抗体は、第一に非特許文献５に記載されたハイブリドーマ法により作製してもよい。

【0039】

本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って利用されるモノクローナル抗体は、これらに限られないが、慎重な免疫プロトコルの結果；病気又は癌の過程で自然に抗体の製造を生じる免疫応答の結果；ファージ由来の抗体；等々を始めとする当技術分野で公知の如何なる方法によって製造してもよい。上記にリストしたハイブリドーマ製造法に加えて、本明細書に開示し特許請求する発明概念のモノクローナル抗体は、他の種々の方法、例えば、これらに限られないが、リコンビナントＤＮＡ法（特許文献２を参照。）、ファージディスプレイライブラリからの抗体断片の単離（非特許文献６を参照。）、及び非特許文献７、並びに種々のその他のモノクローナル抗体製造技法（非特許文献８を参照。）によって製造することができる。

【0040】

一旦、抗体が得られれば、例えば、個別のＢ−セルが同定されれば及び／又はモノクローナル抗体が製造されれば、これらの抗体の可変領域をコードする配列を得ることができる。可変領域配列は、例えば、先ず、ハイブリドーマ、Ｂ−セル又はファージにより製造される抗体タンパク質を配列し、コードする核酸配列を決定することにより、得ることができる。或る実施態様では、免疫グロブリン可変領域（ＶＨ及びＶＬ）ＤＮＡ又はｃＤＮＡを代わりに配列してもよい。抗体がハイブリドーマセルライン又は単離Ｂ−セルから誘導される場合は、種々の領域をコードするｃＤＮＡを、例えば非特許文献９及び特許文献３に記載された方法により、ＰＣＲを用いて増幅してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、既知の先行技術による心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）免疫測定法の感度及びダイナミックレンジを、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された免疫測定法の感度及びダイナミックレンジと、比較するグラフである。

【図2】図２は、先行技術の誘起発光免疫測定法方式の２つの実施態様である。

【図3】図３は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式を説明する図である。

【図4】図４は、ｃＴｎＩの種々のエピトープ領域のマップである。

【図5】図５は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造の第一の実施態様を図示する。

【図6】図６は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造のもう１つの実施態様を図示する。

【図7】図７は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造のもう１つの実施態様を図示する。

【図8】図８は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造のもう１つの実施態様を図示する。

【図9】図９は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造のもう１つの実施態様を図示する。

【図10】図１０は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造の更にもう１つの実施態様を図示する。

【図11】図１１は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造の更なる実施態様を図示する。

【図12】図１２は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された誘起発光免疫測定法方式に従って構築されたマイクロ流体装置用の基本構造の更にもう１つの実施態様を図示する。

【図13】図１３は、図６に示された基本装置構造に従って構築されたマイクロ流体装置の写真画像である。

【図14】図１４は、図１１に示された基本装置構造に従って構築されたマイクロ流体装置の写真画像である。

【図15】図１５は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたｃＴｎＩ免疫測定法で用いられる３つの抗体のセットによって認識されるエピトープの第１の例を説明するｃＴｎＩエピトープのマップである。

【図16】図１６は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたｃＴｎＩ免疫測定法で用いられる３つの抗体のセットによって認識されるエピトープの第二の例を説明するｃＴｎＩエピトープのマップである。３つの抗体のセットは、３つのエピトープ：即ち、２つの検出抗体により認識される重複する２つのエピトープ及び捕捉抗体によって認識される第三のエピトープを、認識する。ここで、第三のエピトープは、他の２つのエピトープと重複しない。

【図17】図１７は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたｃＴｎＩ免疫測定法で用いられる３つの抗体のセットによって認識されるエピトープの第三の例を説明するｃＴｎＩエピトープのマップである。

【図18】図１８は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたＢＮＰ免疫測定法で用いられる３つの抗体のセットによって認識されるエピトープの第一の例を説明するＢＮＰエピトープのマップである。

【発明を実施するための形態】

【0042】

本明細書に開示し特許請求する発明概念は、従来技術の測定法のダイナミックレンジを維持しながら、従来技術の誘起発光免疫測定法に比べて改善された感度を有する新規な誘起発光免疫測定法構成に向けられている。この新規な免疫測定法構成は、（これに限られないが、ｃＴｎＩを始めとする）種々の被検体についての新規な誘導発光免疫測定の発展に用いられ、中央試験室及び／又はＰＯＣ用途に採用可能である。この新しい測定法構成においては、現在のｃＴｎＩアッセイ構成において用いられる単一検出抗体を置き換えて、２つの検出抗体がサンドウィッチアッセイに用いられる。一つの高親和性抗体と、この高親和性抗体に比べて感度はより低いがダイナミックレンジの広い他の抗体との組み合わせにより、現在のアッセイ構成における感度及びダイナミックレンジの問題を解決することができる。

【0043】

図１は、本明細書に開示し特許請求する発明概念の、従来技術に比べて、増強された感度及びダイナミックレンジを示す。図１において、容量応答曲線が２つの従来技術免疫測定法について描かれ、本明細書に開示し特許請求する発明概念の、特定の非限定的被検体ｃＴｎＩについての、アッセイと比較されている。丸印のデータ点で表わされる容量応答曲線は、現在商用のｃＴｎＩアッセイを示し、他方、四角のデータ点で表わされる容量応答曲線は、より高感度の抗ｃＴｎＩ抗体を用いたアッセイを表わす。これから明らかなように、高感度抗ｃＴｎＩ抗体を用いたアッセイについて、高ダイナミックレンジにおいて、高原部分が観察され、他方、現在商用のｃＴｎＩアッセイにおいては、低ダイナミックレンジにおいて、感度が失われている。これと対照的に、三角のデータ点で表わされる容量応答曲線は、本明細書に開示し特許請求する、二元検出抗体を利用する、ｃＴｎＩアッセイ構成から導かれるものである。単一検出抗体を利用する従来技術のｃＴｎＩアッセイ構成の容量応答曲線に比較して、新規なｃＴｎＩ構成は、要求されるｃＴｎＩアッセイ感度だけではなく、要求されるｃＴｎＩダイナミックレンジをも提供する。

【0044】

図２及び図３は、本明細書に開示し特許請求する発明概念の誘起発光免疫測定法構成と従来技術の測定法構成との比較を示す。図２Ａは、単一の検出抗体（被検体を含有する試料とのインキュベーションに先立ってケミビーズ（ＣＢ）に会合した状態で示されている）及び単一の捕捉抗体（インキュベーション段階においてセンシビーズ（ＳＢ）と会合し得るものとして示されている）を含有する先行技術の測定法構成を図示する。図２Ｂにおいて、もう１つの先行技術による免疫測定法構成が図示されている；この構造においては、図２Ａ（ここでは、両検出抗体が単一ＣＢと会合できる。）における単一検出抗体に代えて二元検出抗体が使用されている。しかしながら、この測定法構成においては、単一の被検体の検出のために、３つの抗体全て（即ち、２つの検出抗体及び１つの捕捉抗体）がこの被検体に結合することが必要である。

【0045】

対照的に、図３に示されるように、本明細書に開示し特許請求する発明概念の測定法構成は、被検体との結合において互いに競合する２つの検出抗体（Ａｂ１及びＡｂ２。それぞれ、ＣＢ１及びＣＢ２と会合とした状態で図示されている。）を利用する。即ち、２つの検出抗体は、少なくとも部分的に重複するエピトープに結合し、これにより、２つの検出抗体は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない。検出抗体の１つ（Ａｂ１）は、高感度と限られたダイナミックレンジを有しており、もう一方の検出抗体（Ａｂ２）は、より広いダイナミックレンジとより低い感度を示す。これら２つの検出抗体をこのように使用することにより、図１に示すように、十分なダイナミックレンジ及び検出限界に亘って、所望の感度水準を示す免疫測定法が得られる。

【0046】

本明細書に開示し特許請求する発明概念の特定の実施態様に戻ると、測定法の構成、並びにこれを含有するキット及び装置並びにその製造及び使用方法が開示される。測定法の実施態様の幾つかにおいては、信号生成系（ｓｐｓ）部材は、例えば感光剤のような増感剤、及び化学発光組成物を含有してなり、感光剤の活性化により、化学発光組成物を活性化する生成物が生じる。１つのｓｐｓ部材は、通常、結合した又は結合していないｓｐｓ部材の量、即ち、検出すべき被検体に又は検出すべき被検体の量を反映する試薬に結合した又は結合していないｓｐｓ部材の量、に関連する検出可能な信号を発生する。本明細書に開示し特許請求する発明概念が拠りどころとする測定法プラットフォームの実施例は、誘起発光免疫測定法（ＬＯＣＩ（登録商標））である。誘起発光免疫測定法は、特許文献１に記載されている。

【0047】

本明細書に開示し特許請求する発明概念は、化学発光検出系を含有する組成物を含む。幾つかの実施態様において、組成物は、少なくとも３つの成分を含む。第一の成分は、一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第一の抗体又はその結合断片を含有する組成物を含有してなり、この第一の抗体又はその結合断片は、被検体の第一のエピトープに特異的に結合し、それによって一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が第一の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体である。第二の成分は、一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第二の抗体又はその結合断片を含有する組成物を含有してなり、この第二の抗体又はその結合断片は、前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合し、それによって一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が前記第二の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体であり、ここで第一及び第二のエピトープは、少なくとも部分的に重複して、このため、第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない。第三の成分は、第三の抗体又はその結合断片を含有する組成物を含有してなり、ここで前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができ、このとき、前記第三の抗体又はその結合断片は、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤と会合することができ、これによって、前記第三の抗体又はその結合断片の増感剤との会合により、前記増感剤の前記被検体との間接的な結合が可能になる。

【0048】

前記第一、第二及び第三のエピトープは、全てが直鎖状エピトープであって、被検体のアミノ酸配列の直鎖状部分を認識するものであってよい。或いは、前記第一、第二及び第三のエピトープは、全てが立体配座エピトープであっても、直鎖状及び立体配座エピトープの混合物であってもよい。即ち、前記第一のエピトープが直鎖状エピトープであって、他方、前記第二のエピトープが立体配座エピトープ（或いは、この逆）であってよい。このようにして、前記第一及び第二の抗体／結合断片は、必ずしも、被検体の直鎖状アミノ酸配列の重複部分を認識する必要はない。代わりに、前記２つの抗体／結合断片が、被検体のアミノ酸配列の第三級構造の部分的な重複を認識してもよい。

【0049】

幾つかの実施態様において、第三の成分は、更に、第三の抗体又はその結合断片と会合した増感剤を含有していてよい。代わりに、組成物は、更に、増感剤を含有する第四成分を含有していてもよい。

【0050】

増感剤は、化学発光化合物の活性化のための、例えば一重項酸素のような、活性中間体を発生するための分子であり、通常、化合物である。幾つかの実施態様において、増感剤は、光増感剤である。化学的に（例えば、酵素及び金属塩によって）活性化し得る他の増感剤には−これは例示であって、限定のためではないが−外部光源による活性化により又はより好ましくないが活性化なしに、一重項酸素を生成し得る他の物質及び組成物が含まれる。例えば、過酸化水素の一重項酸素及び水への転換を触媒するいくつかの化合物が知られている。他の増感剤物質及び組成物の例には、−限定的なものではないが−、アルカリ土類金属Ｃａ、Ｓｒ及びＢａの酸化物；ｄ０配座の３Ａ、４Ａ、５Ａ及び６Ａ族の元素の誘導体；アクチニド元素及びランタニド元素の酸化物；酸化剤のＣｌＯ⁻、ＢｒＯ⁻、Ａｕ^３＋、ＩＯ_３⁻及びＩＯ_４⁻；並びに、特に、モリブデン酸イオン、パーオキソモリブデン酸イオン、タングステン酸イオン及びパーオキソタングステン酸イオン、並びにアセトニトリルが含まれる。以下の参照文献には、増感剤物質及び組成物について更に記載があるが、これらも、また、本明細書に開示し特許請求する発明概念の範囲に含まれる（非特許文献１０〜１６）。

【0051】

光増感剤の範囲には、本来の増感剤ではないが、熱、光、イオン化放射線又は化学的活性化により、一重項酸素分子を放出する化合物も、また、包含される。この種の化合物には、例えば、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレン エンドパーオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドパーオキシド及び５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン−５，１２−エンドパーオキシドが含まれる。これらの化合物の加熱又は光の直接吸収により、一重項酸素が放出される。

【0052】

光増感剤は、光活性化合物の活性化、例えば、光励起による一重項酸素の発生、のための増感剤である。光増感剤は、光により活性化可能であり、例えば、染料及び芳香族化合物を包含し、通常、共有結合した、通常、多重共役二重結合又は三重結合を有する、原子を含有してなる化合物である。これらの化合物は、２００〜１，１００ｎｍ又は３００〜１，０００ｎｍ又は４５０〜９５０ｎｍの波長範囲で光を吸収し、励起波長において、その吸収極大で５００Ｍ^−１ｃｍ^−１を超える又は５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１を超える又は５０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１を超える吸光係数を有する。光増感剤は、相対的に光安定性であり、好ましくは、一重項酸素と効率的な反応をしない。光増感剤の例には、これは説明のためであって限定ではないが、アセトン、ベンゾフェノン、９−チオキサントン、エオシン、９，１０−ジブロモアントラセン、メチレンブルー、例えばヘマトポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガル、バックミンスターフラーレン等のメタロ−ポルフィリン、並びにこれらの化合物の誘導体が含まれる。

【0053】

化学発光化合物（化学発光剤）は、化学的に活性化可能であって、そのような活性化の結果、或る波長の光を発生する化合物である。化学発光剤の例には、これは説明のためであって限定するものではないが、一重項酸素又は過酸化物と反応可能であってハイドロパーオキシド又はジオキセタン（これらは分解してケトン又はカルボン酸誘導体となる。）を生成するオレフィン；光の作用により分解し得る安定なジオキセタン；一重項酸素と反応してジケトンを生成し得るアセチレン；ルミノールのごときアゾ化合物又はアゾカルボニルを形成し得るヒドラゾン又はヒドラジド；並びに例えばエンドパーオキシドを生成し得る芳香族化合物が包含される。活性化反応の結果、化学発光剤は、直接的又は間接的に発光を引き起こす。

【0054】

いくつかの実施態様においては、一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素と化学反応して準安定な中間体種（このものは、分解して同時に又は引き続いて発光する。）を形成する化合物であってよい。一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物を含有する組成物は、当技術分野で公知の任意の方法によって、標的被検体を伴っていてよい。例えば、これは限定を目的としないが、組成物は、化学発光化合物の標的被検体への間接的会合を可能にする第二の被検体特異的な結合パートナーと会合していてよい。化学発光化合物を含有する組成物は、活性化された化学発光化合物によって直接励起されてもよい。或いは、組成物は、更に、活性化された化学発光分子により励起される少なくとも１つの蛍光分子を含有していてもよい。特に、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って使用し得る化学発光化合物又は光増感剤の非限定的な例は、特許文献１に記載されている。

【0055】

本明細書に開示し特許請求する組成物は、一重項酸素で活性化可能な２つの化学発光組成物の存在を包含し、上述の又はここで意図している一重項酸素で活性化可能な組成物のいずれも、第一の又は第二の一重項酸素で活性化可能な組成物として機能し得る。いくつかの実施態様では、一重項酸素で活性化可能な２つの化学発光組成物が、同一の一重項酸素で活性化可能な化学発光組成物であってよい。例えば、図１に図示した測定法において、同一の一重項酸素で活性化可能な化学発光組成物が検出抗体／結合断片の両方に会合していてもよく、従って、このとき、信号は単一の波長で検出される。他の実施態様において、２つの一重項酸素で活性化可能な組成物が互いに異なることが好ましい。組成物が互いに異なる場合、第一及び第二の抗体／結合断片の結合は、異なる波長で検出できる。例えば、第一の波長は、曲線の低末端を検出し、他の波長が曲線の高末端を検出するのに使用できる。

【0056】

本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って使用される増感剤は、ストレプトアヴィジンとの会合を介して間接的に標的被検体に結合できる。このようにして、ビオチンが第一の被検体特異的結合パートナーに会合し、ストレプトアヴィジンとビオチンとの結合は、第一の被検体特異的結合パートナーの標的被検体への結合と相俟って標的被検体への増感剤の間接的会合を生じる。１つの非限定的例では、増感剤は、光照射により活性化される光増感剤であってよい。

【0057】

幾つかの実施態様では、第一の抗体／結合断片と第二の抗体／結合断片とは、被検体に対する親和性が異なっていてもよい。例えば、２つの抗体／結合断片の一方は、被検体に対する親和性が相対的に低くてもよく、他方、他の抗体／結合断片被検体に対する親和性が相対的に高くてもよい。特別な非限定的な例において、第一の抗体／結合断片は１０^−６Ｍ〜１０^−１０Ｍの範囲の解離定数で被検体に特異的に結合する低親和性抗体であってよく、第二の抗体／結合断片は１０^−１０Ｍ〜１０^−１３Ｍの範囲の解離定数で被検体に特異的に結合する高親和性抗体であってよい。

【0058】

高親和性抗体／結合断片と低高親和性抗体／結合断片との比は、測定法が本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能し、所望の直線性及びダイナミックレンジが得られるものである限り、如何なるものであってもよい。特別の非限定的な例において、高親和性抗体／結合断片は、２つの検出抗体／結合断片の和の約５％から約２０％として存在してよく、他方、低親和性抗体／結合断片は、存在する全検出抗体／結合断片の約８０％から約９５％として存在してよい。低親和性抗体／結合断片に対する高親和性抗体／結合断片の比の使用可能な特別な非限定的な例には、約５％（高）対約９５％（低）、約１０％（高）対約９０％（低）、約２０％（高）対約８０％（低）が含まれる。

【0059】

第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片は、これらの抗体／結合断片が、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って、機能することができる限り、如何なる形態で提供されてもよい。例えば、第一、第二及び第三の抗体／結合断片のそれぞれは、ポリクローナル抗体／結合断片又はモノクローナル抗体／結合断片であってよい。更に、異なる型の抗体／結合断片の如何なる組み合わせも、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って、用いることができる。例えば、第一及び第二の抗体／結合断片がモノクローナル抗体／結合断片であり、第三の抗体／結合断片がポリクローナル抗体／結合断片であってよい。或いは、第一及び第二の抗体／結合断片がポリクローナル抗体／結合断片であり、第三の抗体／結合断片がモノクローナル抗体／結合断片であってよい。更なる代替態様では、第一及び第二の抗体／結合断片のうちの１つがポリクローナル抗体／結合断片であり、もう一方がモノクローナル抗体／結合断片であってよい。この例では、第三の抗体／結合断片は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。

【0060】

抗体は、このようにして検出を望む任意の被検体について特異的であってよい。ここで意図している被検体の非限定的な例としては、限定するものではないが、心筋トロポニン（ｃＴｎＩ）のようなトロポニン、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、β−ｈＣＧ、ＢＮＰ、ＮＴ−プロＢＮＰ、ＰＣＴ、ＣＲＰ及びｉＰＨＴ等が含まれる。

【0061】

検出すべき被検体がｃＴｎＩであるとき、３つの抗体は、ｃＴｎＩ分子中の任意の３つのエピトープを、これらのエピトープが上述のとおり配置されている限り、認識することができる。即ち、第一及び第二のエピトープは、第一及び第二の抗体又はその結合断片の両方ともが単一の被検体分子に結合できることがないように、少なくとも部分的に重複していなければならない。更に、第三のエピトープは、第一及び第二のエピトープのいずれとも重複してはならず、これにより、第三の抗体又は結合断片は第一及び第二の抗体又は結合断片のいずれかが既に結合している単一の被検体分子に結合することができる。ｃＴｎＩの全２１０アミノ酸配列が配列番号１に割り当てられている。

【0062】

図４は、ｃＴｎＩ配列における種々のエピトープ領域のマップを含んでいるが、このマップは、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って用いられる種々のエピトープの幾つかを図示している。本明細書に開示し特許請求する発明概念の非限定的な実施態様の幾つかにおいて、検出すべき被検体は、ｃＴｎＩであり、前記第一及び第二の抗体／結合断片は、図４の領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（即ち、それぞれ、配列番号２〜７）の１つにおいて、重複するエピトープに特異的に結合する。他方、前記第三の抗体／その結合断片は、異なる領域内のエピトープに特異的に結合する。例えば、これは、限定するものではないが、（ａ）前記第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ａ（即ち、配列番号２）内において、重複するエピトープに結合し、前記第三の抗体／結合断片は、領域Ｂ〜Ｆ（即ち、配列番号３〜７）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合し；（ｂ）第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ｂ（即ち、配列番号３）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ａ及びＣ〜Ｆ（即ち、配列番号２及び４〜７）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合し；（ｃ）第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ｃ（即ち、配列番号４）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ａ〜Ｂ及びＤ〜Ｆ（即ち、配列番号２〜３及び５〜７）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合し；（ｄ）第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ｄ（即ち、配列番号５）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ａ〜Ｃ及びＥ〜Ｆ（即ち、配列番号２〜４及び６〜７）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合し；（ｅ）第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ｅ（即ち、配列番号６）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ａ〜Ｄ及びＦ（即ち、配列番号２〜５及び７）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合し；（ｆ）第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ｆ（即ち、配列番号７）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ａ〜Ｅ（即ち、配列番号２〜６）のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合する。特別の非限定的な例において、第一及び第二の抗体／結合断片は、領域Ａ又は領域Ｂ（それぞれ、配列番号２及び３）内において、重複するエピトープに結合し、第三の抗体／結合断片は、領域Ｃ（配列番号４）内において、エピトープに特異的に結合する。

【0063】

本明細書に開示し特許請求する発明概念に従ってｃＴｎＩ免疫測定法において用いられるｃＴｎＩエピトープ／抗体の組み合わせの追加の非限定的な例には、以下のものが含まれる。（ｉ）第一及び第二の抗体／その結合断片が配列番号８、９及び１１のエピトープのいずれかに特異的に結合し、他方、第三抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合する。（ｉ）第一及び第二の抗体／その結合断片が配列番号８及び９のエピトープに特異的に結合し、他方、第三抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合する。（ｉｉ）第一及び第二の抗体／その結合断片が配列番号９及び１１のエピトープに特異的に結合し、他方、第三抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合する。（ｉｉｉ）第一及び第二の抗体／その結合断片が配列番号１２及び１３のエピトープに特異的に結合し、他方、第三抗体又はその結合断片が配列番号１４のエピトープに特異的に結合する。エピトープの特別の組み合わせが図１５〜１７に図示されているが、その詳細を以下の実施例で詳細に議論する。

【0064】

検出すべき被検体がＢ−型のナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）であるとき、３つの抗体は、エピトープが上述のとおり配置されている（即ち、第一及び第二のエピトープが少なくとも部分的に互いに重複し、第三のエピトープが第一及び第二のいずれとも重複しない）限り、ＢＮＰ分子中の任意の３つのエピトープを認識する。ＢＮＰの３２アミノ酸配列は、配列番号１５に割り当てられており、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って用いられ得るエピトープの組み合わせの非限定的な例とともに、図１８に示されている。図１８に図示された非限定的な例において（そして、以下の実施例部において詳細に記述するように）、第一及び第二の抗体／その結合断片は、配列番号１６及び１７のエピトープに特異的に結合してもよく、他方、第三抗体又はその結合断片が配列番号１８のエピトープに特異的に結合する。

【0065】

組成物／キット／方法の試薬は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能するものであれば、如何なる形態及び／又は方式で提供されてもよい。例えば、これは限定するものではないが、構成成分は、ビーズの形態又は類似の方式であってよい。更に、幾つかの実施態様において、試薬を単回使用の凍結乾燥試薬の形で配置することが望ましい。ミクロ流体装置中における乾燥試薬の使用は、特許文献４に詳細に記載されている。

【0066】

幾つかの実施態様において、多重成分が単一のビーズ又は方式で及び／又は単一粒子中に凍結乾燥されて一緒に配置されてもよい。例えば、これは限定を意図しないが、単一のビーズが第一及び第二の成分を含んでいてもよい。即ち、単一のビーズが第一及び第二の抗体／結合断片の両方並びに抗体と会合した一重項酸素で活性化し得る化学発光化合物を含んでいてもよい。両成分を含む単一ビーズは、その後、凍結乾燥されて単一粒子となり、又は、他の方式で配置される。

【0067】

更に、個別のビーズ／方式に配置された２以上の成分が一緒に凍結乾燥されてもよい。例えば、これは限定を意味しないが、（一重項酸素で活性化し得る化学発光化合物と会合した第一及び第二の抗体／結合断片を含む）第一及び第二の成分が一緒に凍結乾燥されてもよい。もう１つの非限定的な例において、（一重項酸素で活性化し得る化学発光化合物と会合した第一及び第二の抗体／結合断片を含む）第一及び第二の成分並びに（第三の抗体／結合断片を含む）第三の成分が単一粒子として一緒に凍結乾燥されてもよい。更に、単一の凍結乾燥された粒子が、多重の型のビーズ／方式の組み合わせを含んでいてもよい。即ち、単一の凍結乾燥された粒子は、（ａ）第一及び第二の成分の両方を含む単一のビーズ、（ｂ）第一の成分のみを含むビーズ並びに（ｃ）第二の成分のみを含むビーズの混合物を含んでいてもよい。

【0068】

上述の或いはここで意図されている如何なる組成物も、更に、例えば、これらに限定されないが、希釈剤、洗浄溶液及び／又は（凍結乾燥した試薬の再構成のために用いられる）賦形剤のような他の成分を含んでいてもよい。更に、上述の或いはここで意図されている如何なる組成物も、その中に一以上の上述の成分が配置されたマイクロ流体デバイスをも含んでいてもよい。

【0069】

本明細書に開示し特許請求する発明概念は、更に、被検体の決定のための測定法を都合よく実行するのに有用なキットを含む。このキットは、（上述の組成物のあらゆる実施態様を含む）上述の成分／試薬の任意の組み合わせを含んでいてもよい。更に、キットは、更に、上述の或いはここで意図されている任意の特別な測定法を実行するための他の試薬を含んでいてもよい。これらの追加の試薬の性質は、特別な測定法の形式に依存するが、その同定は、当業者の技能の範囲内にある。

【0070】

組成物／試薬は、それぞれ、個別の容器／区画内に配置してもよい。或いは、種々の組成物／試薬は、抗体結合定数／効率の競合的性質及び／又は組成物／試薬の安定性に依存して、１つ以上の容器／区画内で合一してもよい。キットは、更に、測定法を実施するための、例えば追加のｓｂｐメンバー、ｓｐｓメンバー及び補助試薬等の、他の別個包装された試薬を含んでいてもよい。更に、キットは、成分／試薬が配置されたミクロ流体デバイスを含んでいてもよい。

【0071】

キット中の種々の成分／試薬の相対的量は、測定法中に起きる必要がある反応を実質的に最適化する成分／試薬の濃度を提供し、更に測定法の感度を実質的に最適化するために、広範に変化し得る。適切な状況下では、キット中の１以上の成分／試薬は、（球、マイクロタブレット、粉末、マイクロスポット等−これらに限られないが−を始めとする）凍結乾燥粒子のような乾燥状態で提供してよく、また、キットは、乾燥試薬を溶解するための補助試薬を含んでいてもよい。このようにして、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従う方法又は測定法を実施するために適切な濃度を有する試薬溶液がこれらの成分から得られる。キットには、正負の制御が含まれていてよい。キットは、更に、そのキットの使用法を説明する記載された指示書のセットを含んでいてよい。この類のキットは、ここに記述し或いは意図されるいかなる方法において用いてもよい。

【0072】

本明細書に開示し特許請求する発明概念は、更に、上述の組成物がその中に配置されているマイクロ流体デバイスに向けられている。マイクロ流体デバイスは、それに会合した１以上の手動機能（即ち、そこでは、１以上の試薬及び／又は２つの成分間の混合物の移動のためのピペッティングが必要である。）を有していてもよい。或いは、マイクロ流体デバイスは、（種々の区画が流体連通している（又は連続的に流体連通できる））マイクロ流体デバイスの構築の間に種々の区画内に必要な試薬が配置されていて、従って、試料がマイクロ流体デバイスに添加されたのちは、測定法の遂行のために試料及び／又は試薬の手動操作が全く必要でない、完全に自動で、密閉された系であってもよい。マイクロ流体は、上述の３又は４成分（即ち、増感剤を含み又は含まない３つの抗体含有組成物）を含有する１以上の区画からなる。増感剤が存在するときは、それは単独で供給されてもよく、第三の抗体含有組成物を伴っていてもよい。デバイスは、デバイスが本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能することができる限り、幾つの区画を有していてもよく、区画の配置は任意でよく、３又は４の成分の分布も任意である。デバイスの構造の非限定的な例は、説明だけを目的として、図中に示されている。多重の区画を与えられたとき、区画は、お互いに完全に分離していてもよく、或いは、１以上の区画が互いに流体連通できてもよい。

【0073】

マイクロ流体デバイスは、更に、試料が適用され／配置される試料適用室及び／又は入口経路を含んでいてもよい。試料適用室／入口経路は、マイクロ流体デバイスの１以上の区画と流体連通が可能であってもよい。更に、マイクロ流体デバイスが試料適用室と入口経路の両方を備えているとき、試料適用室は、入口経路と流体連通が可能であってもよく、一方、入口経路は、試薬が配置された１以上の区画と流体連通が可能であってもよい。

【0074】

試料は、測定試薬を含有する区画に直接適用してもよく、或いは試料は、測定試薬を含有する区画に入る前に試料適用室／入口経路を通過してもよい。試料が、測定区画に到達する前に１以上の成分中を通過するとき、実質的に全ての試料が通過してもよく、測定区画に到達したときに実質的に無傷のままに残る。或いは、試料の一部のみが、測定室に到達してもよい。１つの実施態様において、このことは、測定区画の上流の区画におけるサイズ、重量及び／又は体積の制約だけが原因で起こり得る。もう１つの実施態様において、マイクロ流体デバイスは、試料適用室、入口経路、測定区画の上流の区画、及び／又はこれらの間の接続中に存在し、試料の或る成分の全試料からの分離及び／又はこの試料の測定区画への伝達を可能にする１以上の構造を含有していてもよい。

【0075】

１つの実施態様において、３つ又は４つの試薬がマイクロ流体デバイスの単一の区画に配置される。もう１つの実施態様において、マイクロ流体デバイスは、２以上の区画を有してもよい。
ここで、第一の区画は、第一の３つの組成物（即ち、一重項酸素で活性化可能な組成物と会合した第一及び第二の抗体／結合断片並びに第三の抗体／結合断片）を含有してもよく、第二の区画は、増感剤を含有する。更に、２つの区画を含有するこのマイクロ流体デバイスは、更に、それを通って試料が適用されうる入口経路を含有していてもよい。この配置において、第一の区画は、入口経路と流体連通することができてもよく、第二の区画は、入口経路及び第一の区画の少なくとも一方と流体連通することができてもよい。もう１つの実施態様において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも３つの区画を含有してもよく、第一、第二及び第三の区画は、それぞれ、第一、第二及び第三の成分を含有していてもよい。更に、（第一の成分中に存在する）第一の抗体／結合断片が高度の親和性で標的被検体に結合することが望ましく、他方、（第二の成分中に存在する）第二の抗体／結合断片が低い親和性で標的被検体に結合することが望ましい。このようにして、より高い親和性を有する抗体／結合断片が、より低い親和性を有する抗体／結合断片よりも前に、被検体と接触する。

【0076】

マイクロ流体デバイスの任意の区画は、それが使用されるまで、その中に配置された試薬を維持するために実質的に気密な環境に封止されてよい。入口経路及び区画は、同様に２つの区画は、お互いに「流体連通できる」と記述することができる。このフレーズは、区画が封止されていてもよいが、そこにある又はそれらの間の封止が破れたときに、形成された２つの区画がそれらの間で流体を流れさせることができることを意味する。

【0077】

本明細書に開示し特許請求する発明概念のマイクロ流体デバイスは、当業界で公知の或いはここで意図されている他の任意の所望の特徴を有していてもよい。例えば、これは限定を意図しないが、本明細書に開示し特許請求する発明概念のマイクロ流体デバイスは、更に、読み取り室を含んでいてもよい。この読み取り室は、１以上の測定成分を含有する区画であってもよく、又は、読み取り室は、測定試薬を含有する１以上の区画と流体連通していてもよい。マイクロ流体デバイスは、更に、例えば、これは限定を意図しないが、洗浄溶液、希釈剤、賦形剤、正の制御、負の制御、品質制御、これらの任意の組合せ、等の、他の溶液を含有する１以上の区画を含んでいてもよい。例えば、マイクロ流体デバイスは、希釈剤を含有する１以上の区画を含有していてもよく、これらの区画は、デバイスの他の任意の区画と流体連通が可能であってよい。もう１つの例では、マイクロ流体デバイスは、１以上の凍結乾燥試薬の再構築のための少なくとも１つの賦形剤を含有する１以上の区画を更に含有して、これらの区画が（凍結乾燥試薬を含有する区画のような）デバイスの他の任意の区画と流体連通できるものであってよい。更に、マイクロ流体デバイスは、洗浄溶液を含有する１以上の区画を更に含有していて、これらの区画がデバイスの他の任意の区画と流体連通できるものであってもよい。

【0078】

更に、本明細書で開示し或いは意図されているキット／マイクロ流体デバイスは、如何なるものも、単一のキット／デバイスに複合化した多重測定法を含んでいてもよい。もし、多重測定法が存在するとき、両方の測定法が、上述のように、構築され機能してもよい。或いは、ここに述べた測定法が当技術分野で知られている他の任意の型の誘起発光免疫測定法（例えば、特許文献１並びに米国仮出願第６１／７８７，７３５号、第６１／７８８，１９４号及び第６１／７８８，６９２号；これらは全て２０１３年３月１５日に出願されたが、本明細書に開示し特許請求する発明概念のキット／マイクロ流体デバイスの範囲内に包含することができる。）に記載されているＬＯＣＩ（登録商標）免疫測定技術）と複合化されてもよい。単一のキット／マイクロ流体デバイスの中に多重の測定法が存在するとき、２以上の測定法を同時に及び／又は連続して（全体を連続し又は部分的に連続することを含む）実行することができる。２以上の測定法が同時に実行されるとき、２つの異なる一重項酸素で活性化し得る化学発光化合物を使用することが望ましい。２以上の測定法が（全体的にであれ部分的にであれ）並行して実行されるとき、両測定法において同一の一重項酸素で活性化し得る化学発光化合物を用いてもよく、２つの測定法は、異なる時間点で読み取られる。

【0079】

単一のマイクロ流体デバイスの中に多重測定法が存在するとき、多重の入り口経路が同一の適用室（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）に連結されていてよい。幾つかの実施態様では、試料の一部が、制御を考慮せずに、同一の適用室から多重入口経路へ通過してよい。或いは、試料適用室、入口経路、及び／又はそれらの間の連結の内部に、全試料からの或る成分の分離及びその成分の他の測定法への移送を可能にする構造が存在してもよい。本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って使用し得る試料分配装置の非限定的な例は、２０１３年３月１５日に出願された「ミクロ流体分配装置」という名称の米国仮出願第６１／７９０，５８０号に記載されている。

【0080】

本明細書に開示し特許請求する発明概念は、更に、試料（例えば、限定を意図するものではないが、全血、溶解した全血細胞又は赤血球）中の標的被検体の存在及び／又は濃度を検出する方法に向けられている。１つの実施態様において、方法は、一斉に又は全体若しくは一部分を逐次的に、特定の被検体を含むと推定される試料；第一及び第二の抗体／結合断片と会合した一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物を含有する２つの組成物；第三の抗体／結合断片を含有する第三組成物、及び増感剤を合一する工程を含む。混合物は、３つの抗体／結合断片が試料内部で被検体に結合することができる条件下で、インキュベートされ、この結果、２つのサンドウィッチ錯体：第一の抗体／結合断片を含有する組成物及び第三の抗体／結合断片を含有する組成物と結合している被検体分子を含有する第一のサンドウィッチ錯体、及び、第二の抗体／結合断片を含有する組成物及び第三の抗体／結合断片を含有する組成物と結合しているもう１つの被検体分子を含有する第二のサンドウィッチ錯体が形成される。もし、増感剤が、未だ第三の抗体／結合断片含有組成物と会合していないならば、混合物のインキュベーションにより、また、サンドウィッチ錯体中の第三の抗体／結合断片含有組成物を介した第一及び第二のサンドウィッチ錯体と増感剤との会合が生じ、これにより、増感剤が、第一及び第二の抗体／結合断片含有組成物の化学発光化合物に極めて接近する。

【0081】

増感剤は、これにより、活性化されて一重項酸素を発生し、このとき、第一及び第二の錯体中に存在する増感剤の活性化により、第一及び第二のサンドウィッチ錯体中に存在する化学発光化合物の活性化を引き起こす。かくして、第一及び第二のサンドウィッチ錯体中に存在する活性化された化学発光化合物によって発生された化学発光の量が測定される。結合／インキュベーション、活性化及び／又は測定工程は、所望の回数に亘って任意に繰り返してよい。被検体の存在及び／又は濃度は、このようにして製造された化学発光の量を分析することによって検出される。ここで、化学発光の量は、試料中の被検体の量に正比例する。

【0082】

上述のように、試料及び測定法の種々の成分は、（一斉にであれ逐次的にであれ）合一して提供される。試料及び測定法の種々の成分が逐次的に添加されるとき、試料／成分の添加の順序は、可変である。当業者は、測定法への試料／種々の成分の所望の特定の添加順序を決定できる。勿論、最も簡単な添加順序は、全ての材料を同時に添加し、それから生じる信号を測定することである。或いは、使用及び各成分又は成分の群を順次合一してもよい。幾つかの実施態様においては、インキュベーション工程は、試料及び／又は各成分の添加に引き続いて行なってもよい。

【0083】

増感剤が光増感剤であるとき、活性化工程は、更に、光照射による光増感剤の活性化と定義することができる。第一及び第二組成物は、更に、活性化化学発光化合物により励起される少なくとも１つの蛍光分子を含有していてもよく、本発明の方法は、蛍光分子により発せられる光の量を測定して試料中の被検体の量を決定する工程を有していてもよい。

【0084】

試料は、任意の測定試薬との合一の前に分離工程に付してもよい。例えば、これは限定を意味しないが、全血試料中に存在する成分が測定法の感度、ダイナミックレンジ及び／又は検出限界に影響しないように、測定を開始する前に、全血試料から血漿、血清又は（例えば、これは限定を意味しないが、赤血球のような）特定の細胞型を分離することが望ましい。

【0085】

センサの活性化に先立って、インキュベーション／結合工程から形成される混合物を希釈することが望ましく、従って、本発明の方法は、更に、試料及び試薬のインキュベート混合物に希釈剤を添加する工程を含んでいてもよい。バックグラウンドシグナルに貢献する多重の要素が存在し、それには、例えば、（１）２つの測定組成物の相互の非特異的結合及び（２）単に互いに極めて近接しているに過ぎない、非付着の２つの測定組成物の存在がある。これらの理由により、光照射に先立って最終反応混合物を希釈して、非特異的に結合している組成物を解離させ、非結合組成物間の平均粒子間距離を増大させることが望ましい。

【0086】

さて、図に示した特定の実施態様に戻ると、図５及び６は、「オープンシステム」マイクロ流体デバイスを示しており、ここでは、測定法の実行には、１以上の手動機能が必要とされる（例えば、１以上の試薬及び／又は２つの区画間の混合物の移動には、ピペッティングが必要とされる）。

【0087】

図５は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたマイクロ流体デバイスを描写する。マイクロ流体デバイスは、一般参照番号１０で示され、区画１４を含むハウジング１２を含む。区画１４は、（第一の抗体／結合断片と会合した、一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物を含有する）第一組成物１６、（第二の抗体／結合断片と会合した、一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物を含有する）第二組成物１８及び（第三の抗体／結合断片を含有する）第三組成物２０のそれぞれの所定量を含有する。第三組成物２０は、更に、第三の抗体／結合断片と会合した増感剤を含有してもよく、又は区画１４は、更に、第三組成物２０から分離した所定量の増感剤２２を含有していてもよい。更に、４つの組成物１６、１８、２０及び２２は、独立した成分として描写されているが、これらの独立した成分の２つ以上は、凍結乾燥して一緒に単一の粒子にしてもよい。

【0088】

図５のマイクロ流体デバイス１０を使用するとき、試料は手動で区画１４に直接適用される（即ち、ピペットで加えられる）。もし、希釈剤が使用されるなら、希釈剤も、また、例えば、これに限定されないが、試料の添加及び／又は混合物のインキュベーションに続いて、手動で区画１４に直接適用される（即ち、ピペットで加えられる）。区画１４は、混合／インキュベーション室として及び読み取り室として機能する。このとき、増感剤は、区画１４内で活性化され、発生された化学発光は、区画１４から直接測定される。或いは、区画１４は、単に混合及び／又はインキュベーション室として機能するだけでもよく、反応混合物は、区画１４から移されて、活性化及び／又は読み取り工程が実行される他の装置に添加される。即ち、測定法は、２つの装置（チップ）：装置１０並びに装置１０と連結していない別個の装置、の使用を必要としてもよい。このようにして、反応混合物はインキュベートされて装置１０の区画１４から出て、別個の装置に移送される。

【0089】

図６は、後述する点を除いて図５のマイクロ流体デバイスに類似するマイクロ流体デバイス１０ａを描写する。マイクロ流体デバイス１０ａは、第一区画１４ａを含むハウジング１２ａを含む。しかしながら、ハウジング１２ａは、更に、第二区画２４及び第三区画２６を含有する。第一組成物１６ａ、第二組成物１８ａ、第三組成物２０ａ及び増感剤２２ａは、３つの区画１４ａ、２４及び２６の間に分散されてもよい。これは説明のために過ぎないが、第一及び第二組成物１６ａ及び１８ａは、第一区画１４ａに配置されるように描写されており、他方、第三組成物２０ａは、第二の区画２４に配置され、増感剤２２ａは、第三区画２６に配置されている。しかしながら、組成物１６ａ、１８ａ、２０ａ及び２２ａ（又は１６ａ、１８ａ又は２０ａ。ここで、増感剤２２ａは、第三組成物２０ａに含まれている。）の区画１４ａ、２４及び２６間の分散は、測定法が本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能し得る限り、任意の順序でよいことが理解されるであろう。更に、４つの組成物１６ａ、１８ａ、２０ａ及び２２ａが別個の成分であるとして描写されているが、２以上の別個の成分が凍結乾燥されて単一粒子となっていてもよい。

【0090】

図６のマイクロ流体デバイス１０ａを使用するとき、試料は手動で区画１４に直接適用され（即ち、ピペットで加えられ）、そこに配置された組成物１６ａ及び１８ａとインキュベートすることが許される。区画１４ａからの反応混合物は、その後、区画１４ａから除去され、区画２４に直接適用され、組成物２０ａとインキュベートすることが許される。区画２６からの反応混合物は、その後、区画２６から除去され、読み取り室２８に直接適用される。ここでは、増感剤２２ａが読み取り室２８内で活性化され、発生された化学発光が読み取り室２８から直接測定される。

【0091】

図５及び６に描写された開放系のマイクロ流体デバイス内でのインキュベーション及び／又は混合区画の数並びに測定試薬の配置の順序は、説明の目的のものにすぎず、限定的なものと理解すべきでないことは理解されるであろう。図５及び６は、測定試薬が配置された１つ又は３つのインキュベーション／混合区画を含有するマイクロ流体デバイスを描写しているが、測定試薬が配置された１つ、２つ、３つ又は４つのインキュベーション／混合区画を含有する装置が、本明細書に開示し特許請求する発明概念の範囲内で十分に予期されていることが理解されるであろう。更に、装置が２以上のインキュベーション／混合区画を含有するとき、測定試薬は、測定法が上述のように機能する限り、任意の所望の順序で、２以上のインキュベーション／混合区画間に分散されてもよい。更に、存在するインキュベーション／混合区画の数に関係なく、最終のインキュベーション／混合区画は、読み取り室であってよい。或いは、読み取り室は、１つ、２つ、３つ又は４つのインキュベーション／混合区画に加えて、マイクロ流体デバイスに存在してもよい。また、マイクロ流体デバイスは、更に、例えば、これは限定をするものではないが、１以上の区画への添加に先立って賦形剤及び／又は希釈剤が配置されてもよい追加の区画のような、１以上の追加の構造を含有してもよい。

【0092】

図７〜１２は、必要な測定試薬が、その構築の間に、マイクロ流体デバイスの種々の区画に配置される閉鎖系マイクロ流体デバイスを描写する。これらのマイクロ流体デバイスは、試料がマイクロ流体デバイスに添加された後は、測定の実行のために全く手動機能が必要とされない完全自動の閉鎖系を含有する。

【0093】

図７は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されるマイクロ流体デバイスのもう１つの実施態様を描写する。マイクロ流体デバイス４０は、第一組成物４６、第二組成物４８及び第三組成物５０を含有する区画４４を含有するハウジング４２を含む。第三組成物５０は、第三の抗体／結合断片に会合した増感剤を含んでいてもよく、又は、区画４４は、更に、第三組成物５０とは別個に所定量の増感剤５２を含有していてもよい。更に、４つの組成物４６、４８、５０及び５２が別個の成分であるとして描写されているが、任意の別個の成分が凍結乾燥されて単一粒子となっていてもよい。

【0094】

ハウジング４２は、更に、試料適用室５４及び試料適用室４４と区画４４とを連結する入口経路５６を含む。試料（例えば、これに限定されないが、血液試料）は、入口経路５６に流体連通している（又は流体連通可能な）試料適用室５４に適用されてもよい。入口経路５６は、区画４４と流体連通している（又は流体連通可能である）。区画４４は、更に、混合／インキュベーション室として及び読み取り室として機能してもよい。

【0095】

入口経路５６は、単に、試料の一部を区画４４に移送するか又は入口経路５６は、全試料からの或る成分の分離（即ち、試料適用室５４に適用された全血試料からの血漿、血清又は血球の分離を可能にする分離フィルター）及び／又は試料中の劣化（例えば、これに限られないが、溶血）の検出を可能にする１以上の構造を含有していてもよい。

【0096】

本明細書に記載した或いは意図されているマイクロ流体デバイスのいずれも、他の試薬／溶液を含有する追加の区画を備えていてもよい。例えば、図８は、マイクロ流体デバイス４０ａが、更に、入口経路５６ａ及び／又は第一区画４４ａと流体連通している第二区画５８を含有することを除いて、図７のマイクロ流体デバイス４０に類似するマイクロ流体デバイス４０を描写する。第二区画５８は、（例えば、賦形剤、希釈剤、洗浄溶液等の）少なくとも１つの試薬６０の所定量を含有する。例えば、これは限定のためではないが、組成物５０ａ、５２ａ、５４ａ及び／又は５６ａが乾燥試薬の形態であるとき、試料そのものが乾燥試薬の再構築に用いられてよい。或いは、マイクロ流体デバイスは、そのような試薬を含有する区画と流体連通していてもよい（又は流体連通することができる）１以上の賦形剤含有区画を備えていてよい。

【0097】

本明細書に記載した或いは意図されているマイクロ流体デバイスのいずれも、それに配置されている試薬を保持するために、それが使用されるまで、実質的に気密に及び／又は実質的に遮光環境に封止されてよい。例えば、凍結乾燥された試薬を含有する区画は、如何なる意図せざる試薬の再構築及び／又は如何なる試薬の露光を防止するために封止してよい。入口経路及び第一区画は、２つの区画と同様に、お互いに「流体連通できる」と記述されてよい。この語句は、区画が封止されてもよいが、それらに形成された封が破られたときは、それらの間に流体を流すことができることを示す。

【0098】

更に、本明細書に記載した或いは意図されているマイクロ流体デバイスのいずれも、更に、追加の室及び／又は流体回路を備えていてよいと理解されるべきである。例えば、これは限定を意図しないが、マイクロ流体デバイスのいずれも、追加的に、２つの試薬室の間に配置された混合室及び／又は流体回路を含有していてもよい。

【0099】

図９は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されるマイクロ流体デバイスのもう１つの実施態様を描写する。マイクロ流体デバイスは、一般参照番号８０で示され、マイクロ流体デバイス８０が２つの区画を含有すること及び測定試薬がこれら２つの間で分配されてもよいことを除いて、図５〜８のマイクロ流体デバイス１０、１０ａ、４０及び４０ａに類似している。

【0100】

マイクロ流体デバイス８０は、試料適用室８４、入口経路８６、第一区画８８及び第二区画９０を含むハウジング８２を含む。試料（例えば、これは限定を意味しないが、血液試料）は、入口経路８６と流体連通している（又はできる）試料適用室８４に適用される。入口経路８６は、第一区画８８と流体連通している（又はできる）。第一区画８８は、第一組成物９２及び第二組成物９４のそれぞれの所定量を含有するように描写されており、また、第三組成物９６の所定量を含有していてもよい。第二区画９０は、第一区画８８と流体連通している（又はできる）。第二区画９０は、所定量の増感剤９８を含有するように図示されている。第三組成物９６は、図９において、第一区画８８の中に配置されるように描写されているが、第三組成物９６は、代替的に、第二区画９０に配置されてもよいことが理解されるべきである。更に、第三組成物９６及び増感剤９８は、図９において、２つの別個の成分として描写されているが、第三組成物９６及び増感剤９８の両方を含有する単一の組成物が第二区画９０中に存在してもよいことが理解されるべきである。

【0101】

区画８８及び９０における試薬９２、９４、９６及び９８の配置の順序は、例示のためだけであって、限定的なものと解されるべきではない。試薬９２、９４、９６及び９８は、区画８８及び９０内において、任意の順序で配置されてよい。更に、４つの組成物９２、９４、９６及び９８は、別個の成分として描写されているが、別個の成分のいずれも、一緒に凍結乾燥して単一の粒子としてもよく、区画８８及び９０のいずれに配置してもよい。

【0102】

マイクロ流体デバイス８０は、更に、（例えば、これは限定ではないが、希釈剤、賦形剤、洗浄溶液等のような）追加の試薬を含有する１以上の追加的な区画を備えていてよい。１以上の追加的な区画が備えられるとき、区画は、第一区画８８及び／又は第二区画９０と流体連通していて（又はできるものであって）よい。

【0103】

幾つかの実施態様において、（例えば、図９のマイクロ流体デバイス８０の第二区画９０のような）増感剤を含有するマイクロ流体デバイスの区画は、読み取り室として機能してもよい。或いは、追加的な区画は、増感剤含有区画と流体連通していて（又はできるものであって）よく、この追加的な区画は、読み取り室として作用する。例えば、図１０は、試料適用室１１４、入口経路１１６、第一区画１１８、第二区画１２０、読み取り室１２２及び追加の区画１３２を含むハウジング１１２を含有するマイクロ流体デバイス１１０を図示する。（例えば、これに限定されないが、血液試料のような）試料を、入口経路１１６に流体連通している（又は、できる）試料適用室１１４に適用してもよい。第一区画１１８は、入口経路１１６と流体連通している（又は、できる）が、他方、第二区画１２０は、第一区画１１８と流体連通している（又は、できる）。第一及び第二区画１１８及び１２０は、以下に詳細に説明するように、測定組成物１２４、１２６、１２８及び１３０を含有するように図示されている。読み取り室１２２は、第二区画１２０と流体連通している（又は、できる）。追加の区画１３２は、入口経路１１６、第一区画１１８、第二区画１２０及び／又は読み取り室１２２の１以上と流体連通している（又は、できる）。追加の区画１３２は、賦形剤、希釈剤、洗浄溶液等の少なくとも１つの所定量を含有している。

【0104】

例示だけの目的で、第一区画１１８は、第一組成物１２４、第二組成物１２６及び第三組成物１２８のそれぞれの所定量を含有するように図示されており、第二区画１２０は、増感剤の所定量を含有するように図示されている。しかしながら、４つの組成物１２４、１２６、１２８及び１３０は、マイクロ流体デバイス１１０が本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能することができる限り、マイクロ流体デバイス１１０内に任意の順序で配置されてよい。例えば、これは限定のためではないが、第三組成物１２８は、代わりに、第二区画１２０に配置されてもよい。更に、第三組成物１２８及び増感剤１３０が２つの別個の成分であるように描写されているが、第三組成物１２８及び増感剤１３０が、マイクロ流体デバイス１１０内での配置に先立って、相互に会合してもよいことが理解されるべきである。更に、４つの組成物１２４、１２６、１２８及び１３０が別個の成分であるように図示されているが、これら別個の成分の２以上を一緒に凍結乾燥して単一の粒子としてもよく、区画１１８及び１２０のいずれに配置してもよい。

【0105】

図７〜９のマイクロ流体デバイス４０、４０ａ及び８０は、単一の区画内の４つの測定組成物の配置を図示する。他方、図１０のマイクロ流体デバイス１０は、４つの測定混合物の２つの区画への分散を図示する。しかしながら、４つの測定混合物が３以上の区画に分散されてもよいことが理解されるべきである。例えば、図１１は、以下に述べる点を除いて図１０のマイクロ流体デバイス１１０に類似するマイクロ流体デバイス１１０ａを図示する。マイクロ流体デバイス１１０ａは、試料適用室１１４ａ、入口経路１１６ａ、第一区画１１８ａ、第二区画１２０ａ、第三区画１３６、読み取り室１２２ａ及び追加の区画１３２ａを含有するハウジング１１２ａを含有する。第一、第二及び第三の区画１１８ａ、１２０ａ及び１３６は、図に示されるように、互いに流体連通しており（又は、でき）、区画１１８ａ、１２０ａ及び１３６は、測定組成物１２４ａ、１２６ａ、１２８ａ及び１３０ａを含有するように図示されているが、この点については以下により詳細に記述する。第３区画１３６は、読み取り室１２２ａと流体連通している（又は、できる）。追加の区画１３２ａは、入口経路１１６ａ、区画１１８ａ、１２０ａ及び１３６並びに／又は読み取り室１２２ａと流体連通している（又は、できる）。追加の区画１３２ａは、賦形剤、希釈剤、洗浄溶液等の少なくとも１つの試薬１３４ａの所定量を含有する。

【0106】

例示だけの目的で、第一区画１１８ａは、第一及び第二組成物１２４ａ及び１２６ａのそれぞれの所定量を含有するように図示されており、第二区画１２０ａは、第三組成物１２８ａの所定量を含有するように図示されており、第三区画１３６は、所定量の増感剤１３０ａを含有するように図示されている。しかしながら、４つの組成物１２４ａ、１２６ａ、１２８ａ及び１３０ａは、マイクロ流体デバイス１１０ａが本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って機能することができる限りにおいて、マイクロ流体デバイス１１０ａ内に任意の順序で配置されてよいことを理解すべきである。更に、第三組成物１２８ａ及び増感剤１３０ａは、２つの別個の成分として図示されているが、第三組成物１２８ａ及び増感剤１３０ａは、マイクロ流体デバイス１１０内での配置に先立って、互いに会合してもよいことが理解されるであろう。更に、４つの組成物１２４ａ、１２６ａ、１２８ａ及び１３０ａは、別個の成分として図示されているけれども、別個の成分の２以上が一緒に単一粒子に凍結乾燥されて区画１１８ａ、１２０ａ及び１３６の任意の区画に配置されてよい。

【0107】

上述のとおり、上述の測定構造のいずれも、単一のマイクロ流体デバイス中で追加の測定構造と多重化してもよい。図１２は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築されたマイクロ流体デバイスのもう１つの実施態様を図示する。マイクロ流体デバイスは、一般参照番号２００で示されており、マイクロ流体デバイス２００が多重測定様式を提供する多重区画を含有することを除けば、図５〜１１のマイクロ流体デバイス１０、１０ａ、４０、４０ａ、８０、１１０及び１１０ａに類似している。マイクロ流体デバイス２００は、試料適用室２０４、第一入口経路２０６、第二入口経路２０８、第一区画２１０及び第二区画２１２を含有するハウジング２０２を含有している。試料（例えば、これに限定するわけではないが、血液試料）は、入口経路２０６及び２０８と流体連通している（又は、できる）試料適用室２０４に適用されてもよい。第一入口経路２０６は、第一区画２１０と流体連通している（又は、できる）。第一入口経路２０６及び第一区画２１０は、ここに詳細に記載する測定構造を代表し、図１２は、その最も簡単な実施態様を図示する（即ち、この態様において、第一区画２１０は、第一、第二及び第三組成物２１４、２１６及び２１８並びに増感剤２２０を含有する）。ここに図示された測定構造は、図７に図示されたそれと類似しているが、ここに記載され或いは意図されているその他の測定構造のいずれも、多重測定マイクロ流体デバイスにおいて用いられ得ることを理解すべきである。

【0108】

マイクロ流体デバイス２００は、また、第二区画２１２と流体連通している（又は、できる）第二入口経路２０８を備えている。第二入口経路及び第二区画は、第二の測定構造の存在を図示するために簡単に描写されている。任意の測定構造／構成がここに記載され或いは意図されている任意の測定と多重化し得ることを理解すべきであり、かくして、第二測定に伴う必要な構造を供するのに必要なものとして、多重区画が存在する。更に、第二区画２１２は第一区画２１０において存在する試薬に類似する試薬を備えていてもよい。これにより、同一の測定機構により種々の被検体を検出する多重測定が同一マイクロ流体デバイス中に存在する。或いは、第二区画２１２は、完全に異なる測定フォーマットを示すものであってもよい。唯一要求されることは、第二の測定フォーマットがここで述べる測定の１つと多重化し得ることである。

【実施例】

【0109】

実施例を以下に述べる。しかしながら、本明細書に開示し特許請求する発明概念は、その適用において、特定の実験、結果及び実験手順に、限定されるものではないことが理解されるべきである。むしろ、実施例は、種々の実施態様の１つとして提供されるにすぎず、例示的なものであって包括的なものではないことを意図している。

【0110】

（実施例１）
図１３は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された開放系マイクロ流体デバイスの一実施態様の写真を含む。図１３に示されたマイクロ流体デバイスは、図６に図示されたマイクロ流体デバイス１０ａのそれと類似する基本的な構造を含む。図１３において「光学的セル」と標識された区画は、マイクロ流体デバイス１０ａの読み取り室２８を表わし、他方、「凍結乾燥した試薬を含有する反応ウエル」は、マイクロ流体デバイス１０ａの第一、第二及び第三区画１４ａ、２４及び２６を表わす。

【0111】

試料は、手動で第一反応ウエルに添加され、そこに含有されている測定成分とともにインキュベートされる。次いで、その結果生じる反応／インキュベーション混合物は、手動で、もう１つのウエルに移され、そこに含有されている測定成分とともにインキュベートされる。最終的な反応／インキュベーション混合物は、次いで、手動で、増感剤の活性化のために光学的セルに移される。希釈剤を、任意の時点で（又は任意の複数の時点で）反応／インキュベーション混合物に添加してもよい。即ち、希釈剤は、任意の反応ウエル及び／又は光学セルに添加してよい。

【0112】

（実施例２）
図１４は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って構築された閉鎖系マイクロ流体デバイスの一実施態様の写真を含む。図１４に示されたマイクロ流体デバイスは、図１１に図示されたマイクロ流体デバイス１１０ａのそれと類似する基本的な構造を含む。図１４において「光学的セル」と標識された区画は、マイクロ流体デバイス１１０ａの読み取り室１２２ａを表わし、他方、「反応ウエルに包装された凍結乾燥試薬領域」は、マイクロ流体デバイス１１０ａの第一、第二及び第三区画１１８ａ、１２０ａ及び１３６に配置された組成物１２４ａ、１２６ａ、１２８ａ及び１３０ａを表わす。更に、「希釈剤」と標識された区画は、試薬１３４ａを含有する追加の区画１３２ａを表わす。

【0113】

更に、図１４は、測定試薬の上流に配置され全試料からのある成分の分離及び／又は測定区画へのその成分の移送を可能にする追加の構造の存在を図示する。これらの成分には、血漿分離室（これは、図１１における試料適用室１１４ａの一部として含まれていてもよい。）及び測定チャンネル（これは、図１１における入口経路１１６ａの一部として含まれていてもよい。）が含まれる。

【0114】

（実施例３）
この実施例は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従ってｃＴｎＩ免疫測定法に用いるための、３つの抗体／結合断片を利用するエピトープの組合せを提供する。ｃＴｎＩ分子のＮ−末端及びＣ−末端が壊死性心筋中に存在するタンパク分解酵素及び患者の血漿中に存在するタンパク分解酵素の両方によってタンパク分解されるので、いくつかの実施態様において、３つのエピトープがｃＴｎＩ配列の内部（コア部分）に位置することが望ましい。

【0115】

図１５に図示するｃＴｎＩ免疫測定において、第一及び第二の抗体／結合断片は、図４の領域Ｂ（即ち、配列番号３）内の重複エピトープに結合し、他方、第三の抗体／結合断片は、図４の領域Ｃ（即ち、配列番号４）内のエピトープに結合する。特に、第一の抗体／結合断片は、配列番号８のエピトープに特異的に結合し、第二の抗体／結合断片は、配列番号９のエピトープに特異的に結合する。配列番号８及び配列番号９のエピトープは、共に、それぞれ、ｃＴｎＩの連続アミノ酸配列から形成された直鎖状アミノ酸エピトープである。配列番号８及び配列番号９は、直鎖状の観点から、互いに重複し、配列番号９に特異的に結合する抗体／結合断片は、配列番号８を特異的に認識する抗体／結合断片がｃＴｎＩに結合しているときは、そのｃＴｎＩに結合することができない。同様に、配列番号８に特異的に結合する抗体／結合断片は、配列番号９を特異的に認識する抗体／結合断片がｃＴｎＩに結合しているときは、そのｃＴｎＩに結合することができない。第三の抗体又はその結合断片は、配列番号１０の直鎖状エピトープに特異的に結合する。配列番号１０は、配列番号８及び配列番号９のいずれとも重複しない。従って、配列番号８及び配列番号９のいずれかのエピトープに結合している抗体／結合断片は、配列番号１０のエピトープへの他の抗体／結合断片の結合に干渉しない。かくして、第三の抗体／結合断片と第一及び第二の抗体／結合断片の一方とは、両方とも、単一のｃＴｎＩ分子に結合することができる。

【0116】

（実施例４）
この実施例は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って、３つの抗体／結合断片を利用するｃＴｎＩ免疫測定法に用いるもう一つのエピトープの組合せを提供する。図１６に図示するｃＴｎＩ免疫測定において、第一及び第二の抗体／結合断片は、図４の領域Ｂ（即ち、配列番号３）内の重複エピトープに結合し、他方、第三の抗体／結合断片は、図４の領域Ｃ（即ち、配列番号４）内のエピトープに結合する。特に、第一の抗体／結合断片は、配列番号９のエピトープに特異的に結合し、第二の抗体／結合断片は、配列番号１１のエピトープに特異的に結合する。配列番号９及び配列番号１１のエピトープは、共に、それぞれ、ｃＴｎＩの連続アミノ酸配列から形成された直鎖状アミノ酸エピトープである。配列番号９及び配列番号１１は、直鎖状の観点から、互いに重複し、配列番号１１に特異的に結合する抗体／結合断片は、配列番号９を特異的に認識する抗体／結合断片がｃＴｎＩに結合しているときは、そのｃＴｎＩに結合することができない。同様に、配列番号９に特異的に結合する抗体／結合断片は、配列番号１１を特異的に認識する抗体／結合断片がｃＴｎＩに結合しているときは、そのｃＴｎＩに結合することができない。第三の抗体又はその結合断片は、配列番号１０の直鎖状エピトープに特異的に結合する。配列番号１０は、配列番号９及び配列番号１１のいずれとも重複しない。従って、配列番号９及び配列番号１１のいずれかのエピトープに結合している抗体／結合断片は配列番号１０のエピトープへの他の抗体／結合断片の結合に干渉しない。かくして、第三の抗体／結合断片と第一及び第二の抗体／結合断片の一方とは、両方とも、単一のｃＴｎＩ分子に結合することができる。

【0117】

（実施例５）
この実施例は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って、３つの抗体／結合断片を利用するｃＴｎＩ免疫測定法に用いるもう一つのエピトープの組合せを提供する。図１７に図示されたｃＴｎＩ免疫測定法において、第一の抗体／結合断片は、図４のエピトープ領域Ａ（配列番号２）内の配列番号１２のエピトープと特異的に結合し、第二の抗体／結合断片は、図４のエピトープ領域Ｆ（配列番号７）内の配列番号１３のエピトープと特異的に結合し、第三の抗体又はその断片は、図４のエピトープ領域Ｂ（配列番号３）内の配列番号１４のエピトープと特異的に結合する。配列番号１２及び配列番号１３のエピトープは、直鎖状構造の観点から重複しなくてもよいが、これら２つのエピトープは、ｃＴｎＩ分子の三次元立体配座構造において重複してもよい。

【0118】

エピトープの組合せは、ｃＴｎＩ免疫測定のためのより高い感度を得る代替方法を提供する。この場合、一つの捕捉抗体／結合断片は、ｃＴｎＩ分子の不安定な処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）Ｎ−末端部分内に位置する配列番号１２のエピトープと特異的に結合する。他方、もう一つの捕捉抗体／結合断片は、前記ｃＴｎＩ分子の不安定な処理された（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）Ｃ−末端部分内に位置する配列番号１３のエピトープに特異的に結合する。しかしながら、検出抗体／結合断片は、前記分子の安定な核部分内に位置する配列番号１４のエピトープに結合する。

【0119】

（実施例６）
この例は、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って３つの抗体／結合断片を利用するＢＮＰ免疫測定における使用のためのエピトープの組合せを提供する。図１８は、ＢＮＰの３２アミノ酸配列（配列番号１７を割り当てられている）及びこの非限定的な例の３つのエピトープを描写する。

【0120】

特に、第一の抗体／結合断片は、配列番号１６のエピトープに特異的に結合し、第二の抗体／結合断片は、配列番号１７のエピトープに特異的に結合する。配列番号１６及び配列番号１７のエピトープは、いずれも、ＢＮＰの連続的アミノ酸配列で形成された直鎖状エピトープである。配列番号１６と配列番号１７とは、互いに重複し、配列番号１６を特異的に認識する抗体／結合断片がＢＮＰに結合しているとき、配列番号１７に特異的に結合する抗体／結合断片は、ＢＮＰに結合することができない。同様に、配列番号１７を特異的に認識する抗体／結合断片がＢＮＰに結合しているとき、配列番号１６に特異的に結合する抗体／結合断片は、ＢＮＰに結合することができない。第三の抗体又はその結合断片は、配列番号１８の直鎖状エピトープに特異的に結合する。配列番号１８は、配列番号１６及び配列番号１７のいずれとも重複しない。これにより、配列番号１６及び配列番号１７のいずれかのエピトープに結合した抗体／結合断片は、他の抗体／結合断片の配列番号１８のエピトープへの結合に干渉しない。斯くして、第三の抗体／結合断片並びに第一の抗体／結合断片及び第二の抗体／結合断片の１つは、両方とも、単一のＢＮＰ分子に結合できる。

【0121】

従って、本明細書に開示し特許請求する発明概念に従って、化学発光系を含有する組成物並びにこの組成物を含有するキット及びマイクロ流体デバイス並びにその使用方法が提供された。これらは、上述の目的及び利点を完全に満足する。本明細書に開示し特許請求する発明概念は、上述の特定の図面、実験、結果及び言語とともに記述されているが、多くの代替物、修飾物及び変形物が当業者には明らかであることが明白である。従って、本明細書に開示し特許請求する発明概念の精神及び広い範囲に入るそのような代替物、修飾物及び変形物を全て包含することを意図している。

【0122】

（例示的実施態様）
以下に例示的な実施態様を示す。しかしながら、本明細書に開示し特許請求する発明概念は、その適用において、特定の実験、結果及び実験手順に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、例示的実施態様は、単に、種々の実施態様の１つとして提供されるにすぎず、例示的であり、完全なものでないことを意図している。

【0123】

例示的実施態様１：特異的な被検体のための化学発光検出系を含有するキットであって、以下のものを含有するキット。
（ａ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物、それに会合した第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物。ここで、前記第一の抗体又はその結合断片は、被検体の第一のエピトープに特異的に結合し、それによって前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が前記第一の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体である。
（ｂ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第二の抗体又はその結合断片を含有する第二組成物。ここで、前記第二の抗体又はその結合断片は、前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合し、それによって一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が前記第二の抗体又はその結合断片を介して前記被検体に間接的に結合できる検出抗体であり、ここで前記第一及び第二のエピトープは、少なくとも部分的に重複して、この結果、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない。
及び
（ｃ）第三の抗体又はその結合断片を含有してなる第三組成物。ここで、前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができ、このとき、前記第三の抗体又はその結合断片は、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤と会合することができ、これによって、前記第三の抗体又はその結合断片の増感剤との会合により、前記増感剤の前記被検体との間接的な結合が可能になる。

【0124】

例示的実施態様２：更に前記増感剤を含有してなる例示的実施態様１のキット。

【0125】

例示的実施態様３：前記第三組成物が更に前記第三抗体又はその結合断片と会合した前記増感剤を含有してなる例示的実施態様２のキット。

【0126】

例示的実施態様４：前記第三の抗体又はその結合断片がビオチン化されており、且つ、前記増感剤にはストレプトアヴィジンが会合している例示的実施態様２又は３のキット。

【0127】

例示的実施態様５：更に（ａ）〜（ｃ）が配置されているマイクロ流体デバイスを含有してなる例示的実施態様４のキット。

【0128】

例示的実施態様６：更に希釈剤を含有してなる例示的実施態様１〜５のいずれかのキット。

【0129】

例示的実施態様７：前記第一及び第二組成物の前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が同一である例示的実施態様１〜６のいずれかのキット。

【0130】

例示的実施態様８：前記第一及び第二組成物の前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が異なるものである例示的実施態様１〜６のいずれかのキット。

【0131】

例示的実施態様９：前記第一及び第二組成物の少なくとも１つが、更に、活性化された化学発光化合物によって励起される少なくとも１つの蛍光分子を含有してなる例示的実施態様１〜８のいずれかのキット。

【0132】

例示的実施態様１０：（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つが、更に、凍結乾燥試薬の形態であると定義される例示的実施態様１〜９のいずれかのキット。

【0133】

例示的実施態様１１：（ａ）及び（ｂ）が一緒に凍結乾燥されている例示的実施態様１０のキット。

【0134】

例示的実施態様１２：凍結乾燥試薬の再構築のための賦形剤を更に含有してなる例示的実施態様１０又は１１のキット。

【0135】

例示的実施態様１３：前記第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片の少なくとも１つがポリクローナル抗体である例示的実施態様１〜１２のいずれかのキット。

【0136】

例示的実施態様１４：前記第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片の少なくとも１つがモノクローナル抗体である例示的実施態様１〜１３のいずれかのキット。

【0137】

例示的実施態様１５：前記被検体がトロポニンＩである例示的実施態様１〜１４のいずれかのキット。

【0138】

例示的実施態様１６：下記のいずれか１つである例示的実施態様１５のキット。
（ａ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号２内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号３〜７のうちの１つの内部でエピトープに特異的に結合する。
（ｂ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号３内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号２及び４〜７のうちの１つの内部でエピトープに特異的に結合する。
（ｃ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号４内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号２〜３及び５〜７のうちの１つの内部でエピトープに特異的に結合する。
（ｄ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号５内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号２〜４及び６〜７のうちの１つの内部でエピトープに特異的に結合する。
（ｅ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号６内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号２〜５及び７のうちの１つの領域内でエピトープに特異的に結合する。
（ｆ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、配列番号７内において、重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片は、配列番号２〜６のうちの１つの内部でエピトープに特異的に結合する。

【0139】

例示的実施態様１７：下記の少なくとも１つである例示的実施態様１５又は１６のキット。
（ｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１の１つのエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１の１つのエピトープに特異的に結合し、前記第三抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合する。
及び、
（ｉｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号１２及び１３のエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号１２及び１３のエピトープに特異的に結合し、前記第三抗体又はその結合断片が配列番号１４のエピトープに特異的に結合する。

【0140】

例示的実施態様１８：下記を含有する少なくとも１つの区画を含有してなるマイクロ流体デバイス。
（ｉ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物。ここで、前記第一の抗体又はその結合断片は、特異的な被検体の第一のエピトープに特異的に結合し、それにより前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が、前記第一抗体又はその結合断片を介して、前記被検体に間接的に結合することができる検出抗体である。
（ｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物及びそれに会合した第二の抗体又はその結合断片を含有してなる第二組成物。ここで、前記第二の抗体又はその結合断片は、前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合し、それにより前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が、前記第二抗体又はその結合断片を介して、前記被検体に間接的に結合することができる検出抗体であり、そして、前記第一及び第二のエピトープは、少なくとも部分的に重複して、この結果、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない。
（ｉｉｉ）第三の抗体又はその結合断片を含有する第三組成物であって、前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができる。
及び、
（ｉｖ）前記第三抗体又はその結合断片に会合することができる増感剤であって、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤。ここで、前記第三抗体又はその結合断片の前記増感剤との会合により、前記増感剤の前記被検体への間接的結合が可能になる。

【0141】

例示的実施態様１９：（ｉ）〜（ｉｖ）が同一の区画内に配置されている例示的実施態様１８のマイクロ流体デバイス。

【0142】

例示的実施態様２０：前記増感剤が第三の抗体又はその結合断片に会合している例示的実施態様１９のマイクロ流体デバイス。

【0143】

例示的実施態様２１：更に試料が配置される入口経路を含有してなり、前記少なくとも１つの区画が前記入口経路と流体連通できる例示的実施態様１８〜２０のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0144】

例示的実施態様２２：少なくとも２つの区画を含有し、第一の区画が（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を含有し、且つ、第二の区画が（ｉｖ）を含有する例示的実施態様１８のマイクロ流体デバイス。

【0145】

例示的実施態様２３：試料が配置される入口経路を更に含有し、前記第一の区画が前記入口経路と流体連通可能であり、且つ、前記第二の区画が前記入口経路及び前記第一の区画のうちの少なくとも１つと流体連通可能である例示的実施態様２２のマイクロ流体デバイス。

【0146】

例示的実施態様２４：前記第三の抗体又はその結合断片がビオチン化されており、前記増感剤にはストレプトアヴィジンが会合している例示的実施態様１８〜２３のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0147】

例示的実施態様２５：前記第一及び第二組成物の、前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が同一である例示的実施態様１８〜２４のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0148】

例示的実施態様２６：前記第一及び第二組成物の、前記一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が異なるものである例示的実施態様１８〜２４のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0149】

例示的実施態様２７：前記第一及び第二組成物の少なくとも１つが、更に、前記活性化された化学発光化合物により励起される少なくとも１つの蛍光分子を含有してなる例示的実施態様１８〜２５のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0150】

例示的実施態様２８：（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のうちの少なくとも１つが更に凍結乾燥試薬の形態を有していると定義される例示的実施態様１８〜２７のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0151】

例示的実施態様２９：（ａ）及び（ｂ）が一緒に凍結乾燥されている例示的実施態様２８のマイクロ流体デバイス。

【0152】

例示的実施態様３０：前記入口経路及び前記少なくとも１つの区画と流体連通できる少なくとも１つの追加の区画を含有してなり、前記少なくとも１つの追加の区画が前記少なくとも１つの凍結乾燥試薬の再構築のための賦形剤を含有する例示的実施態様２８又は２９のマイクロ流体デバイス。

【0153】

例示的実施態様３１：更に、少なくとも１つの前記入口経路及び前記少なくとも１つの区画と流体連通可能な少なくとも１つの追加の区画を含有してなり、前記少なくとも１つの追加の区画が希釈剤を含有する例示的実施態様１８〜３０のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0154】

例示的実施態様３２：（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかとのインキュベーションに先立って、試料の成分の分離を可能にする少なくとも１つの追加の区画を更に含有してなる例示的実施態様１８〜３０のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0155】

例示的実施態様３３：少なくとも第一、第二及び第三抗体又はその結合断片がポリクローナル抗体である例示的実施態様１８〜３２のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0156】

例示的実施態様３４：少なくとも第一、第二及び第三抗体又はその結合断片がモノクローナル抗体である例示的実施態様１８〜３３のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0157】

例示的実施態様３５：前記被検体がトロポニンである例示的実施態様１８〜３３のいずれかのマイクロ流体デバイス。

【0158】

例示的実施態様３６：少なくとも下記の１つである例示的実施態様３５のマイクロ流体デバイス。
（ａ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号２内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号３〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｂ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号３内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２及び４〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｃ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号４内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜３及び５〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｄ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号５内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜４及び６〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｅ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号６内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜５及び７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｆ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号７内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜６のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合する。

【0159】

例示的実施態様３７：例示的実施態様３５又は３６のマイクロ流体デバイスであって、
（ｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１のうちの１つのエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１のうちの１つのエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合し、
（ｉｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号１２又は１３のエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号１２又は１３のエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号１４のエピトープに特異的に結合する、
マイクロ流体デバイス。

【0160】

例示的実施態様３８：以下の工程を含んでなる試料中の特定の被検体の存在及び／又は濃度を検出する方法。
（ａ）同時に又は全てを若しくは一部分を逐次的に、下記を合一する工程。
（ｉ）前記特定の被検体を含有していると推定される試料。
（ｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化合物及びそれに会合している第一の抗体又はその結合断片を含有してなる第一組成物。ここで、前記第一の抗体又はその結合断片が特定の被検体の第一のエピトープに特異的に結合する検出抗体である。
（ｉｉｉ）一重項酸素で活性化可能な化合物及びそれに会合している第二の抗体又はその結合断片を含有してなる第二組成物。ここで、前記第二の抗体又はその結合断片が前記被検体の第二のエピトープに特異的に結合する検出抗体であり、且つ、前記第一及び第二のエピトープが少なくとも部分的に重複し、これにより、前記第一及び第二の抗体又はその結合断片は、両方ともが、単一の被検体分子に結合することはできない。
（ｉｖ）第三の抗体又はその結合断片を含有してなる第三組成物。ここで、前記第三の抗体又はその結合断片は、前記第一及び第二エピトープに重複しない前記被検体の第三のエピトープに特異的に結合する捕捉抗体であり、これにより、単一の被検体分子が前記第三の抗体又はその結合断片並びに前記第一及び第二の抗体又はその結合断片の一つに結合することができる。
（ｖ）前記第三の抗体又はその結合断片と会合できる増感剤であって、励起状態で一重項酸素を発生することができる増感剤。
（ｂ）（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び／又は（ｉｖ）を、試料内の被検体に結合させる工程。ここで、被検体分子、（ｉｉ）及び（ｉｖ）を含有してなる第一のサンドウィッチ錯体が形成され、もう１つの被検体分子、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を含有してなる第二のサンドウィッチ錯体が形成され、且つ、（ｖ）は、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中の（ｉｖ）と会合し、斯くして、増感剤を、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の化学発光化合物に極めて接近させる。
（ｃ）増感剤を活性化して、一重項酸素を発生させる工程。ここで、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する増感剤の活性化により、前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する化学発光化合物が活性化される。
（ｄ）前記第一及び第二サンドウィッチ錯体中に存在する活性化された化学発光化合物により発生された化学発光の量を測定する工程。
（ｅ）所望により、工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程。
（ｆ）このようにして生成された化学発光の量を分析することにより、前記被検体の存在及び／又は濃度を検出する工程。ここで、化学発光の量は、試料中の被検体の量に正比例する。

【0161】

例示的実施態様３９：例示的実施態様３８の方法であって、増感剤が光増感剤であり、工程（ｃ）が、光照射により光増感剤を活性化するものである方法。

【0162】

例示的実施態様４０：例示的実施態様３８又は３９の方法であって、前記試料が、全血、血漿、血清、唾液、喀痰、脳脊髄液（ＣＦＳ）、皮膚、間質液、涙、粘液、尿、綿棒及びこれらの組合せからなる群から選ばれる方法。

【0163】

例示的実施態様４１：例示的実施態様４０の方法であって、試料を、（ｉｉ）〜（ｖ）のいずれかと合一するに先立って、前記試料を分離工程に処する工程を、更に、含有する方法。

【0164】

例示的実施態様４２：例示的実施態様３８〜４１のいずれかの方法であって、前記第三の抗体又はその結合断片がビオチン化されており、且つ、前記増感剤にはストレプトアヴィジンが会合している。

【0165】

例示的実施態様４３：例示的実施態様３８〜４２のいずれかの方法であって、前記第一及び第二組成物の一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が同一である方法。

【0166】

例示的実施態様４４：例示的実施態様３８〜４３のいずれかの方法であって、前記第一及び第二組成物の一重項酸素で活性化可能な化学発光化合物が異なるものである方法。

【0167】

例示的実施態様４５：例示的実施態様３８〜４４のいずれかの方法であって、前記第一及び第二組成物のうちの少なくとも１つが、更に、前記活性化された化学発光化合物によって励起される少なくとも1つの蛍光分子を含有してなる方法。

【0168】

例示的実施態様４６：例示的実施態様４５の方法であって、更に、前記蛍光分子によって発せられた光の量を測定し、前記試料中の被検体の量を決定する工程を含んでなる方法。

【0169】

例示的実施態様４７：例示的実施態様３８〜４６のいずれかの方法であって、更に、工程（ｃ）に先立って、（ｉ）〜（ｖ）の混合物を希釈する工程を含んでなる方法。

【0170】

例示的実施態様４８：例示的実施態様３８〜４７のいずれかの方法であって、前記第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片の少なくとも１つがポリクローナル抗体である方法。

【0171】

例示的実施態様４９：例示的実施態様３８〜４８のいずれかの方法であって、前記第一、第二及び第三の抗体又はその結合断片の少なくとも１つがモノクローナル抗体である方法。

【0172】

例示的実施態様５０：例示的実施態様３８〜４９のいずれかの方法であって、前記被検体がトロポニンＩである方法。

【0173】

例示的実施態様５１：例示的実施態様５０の方法であって、
（ａ）前記第一及び第二の抗体又はその結合断片が配列番号内の重複するエピトープに特異的に結合し、第三の抗体又はその結合断片が配列番号３〜７のうちの１つのエピトープに特異的に結合し；
（ｂ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号３内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２及び４〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｃ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号４内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜３及び５〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｄ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号５内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜４及び６〜７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；
（ｅ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号６内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜５及び７のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合し；そして、
（ｆ）前記第一及び第二抗体又はその結合断片が配列番号７内の重複するエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号２〜６のうちの１つの内部のエピトープに特異的に結合する；
方法。

【0174】

例示的実施態様５２：例示的実施態様５０又は５１の方法であって、
（ｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１のうちの１つのエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号８、９及び１１のうちの１つのエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号１０のエピトープに特異的に結合し；そして、
（ｉｉ）前記第一の抗体又はその結合断片が配列番号１２又は１３のエピトープに特異的に結合し、前記第二の抗体又はその結合断片が配列番号１２又は１３のエピトープに特異的に結合し、前記第三の抗体又はその結合断片が配列番号１４のエピトープに特異的に結合する；
方法。

【符号の説明】

【0175】

ＣＢ：ケミビーズ
ＳＢ：センシビーズ
Ａｂ１：検出抗体
Ａｂ２：検出抗体
１０：マイクロ流体デバイス
１２：ハウジング
１４：区画
１６：第一組成物
１８：第二組成物
２０：第三組成物
２２：増感剤
１０ａ：マイクロ流体デバイス
１２ａ：ハウジング
１４ａ：第一区画
１６ａ：第一組成物
１８ａ：第二組成物
２０ａ：第三組成物
２２ａ：増感剤
２４：第二区画
２６：第三区画
２８：読み取り室
４０：マイクロ流体デバイス
４２：ハウジング
４４：区画
４６：第一組成物
４８：第二組成物
５０：第三組成物
５２：増感剤
５４：試料適用室
５６：入口経路
４０ａ：マイクロ流体デバイス
４２ａ：ハウジング
４４ａ：第一区画
４６ａ：第一組成物
４８ａ：第二組成物
５０ａ：第三組成物
５２ａ：増感剤
５４ａ：試料適用室
５６ａ：入口経路
５８：第二区画
６０：試薬
８０：マイクロ流体デバイス
８２：ハウジング
８４：試料適用室
８６：入口経路
８８：第一区画
９０：第二区画
９２：第一組成物
９４：第二組成物
９６：第三組成物
９８：増感剤
１１０：マイクロ流体デバイス
１１２：ハウジング
１１４：試料適用室
１１６：入口経路
１１８：第一区画
１２０：第二区画
１２２：読み取り室
１２４：第一組成物
１２６：第二組成物
１２８：第三組成物
１３０：増感剤
１３２：追加の区画
１３４：試薬
１１０ａ：マイクロ流体デバイス
１１２ａ：ハウジング
１１４ａ：試料適用室
１１６ａ：入口経路
１１８ａ：第一区画
１２０ａ：第二区画
１２２ａ：読み取り室
１２４ａ：第一組成物
１２６ａ：第二組成物
１２８ａ：第三組成物
１３０ａ：増感剤
１３２ａ：追加の区画
１３４ａ：試薬
１３６：第三区画
２００：マイクロ流体デバイス
２０２：ハウジング
２０４：試料適用室
２０６：第一入口経路
２０８：第二入口経路
２１０：第一区画
２１２：第二区画
２１４：第一組成物
２１６：第二組成物
２１８：第三組成物
２２０：増感剤

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

2017508971000001.app

【国際調査報告】