特表 2017-514905 抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-514905(P2017-514905A)

(43)【公表日】2017年6月8日

(54)【発明の名称】抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/40 20060101AFI20170512BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170512BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170512BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170512BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20170512BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/40ZNA

   A61K39/395 L

   A61K39/395 P

   A61K37/02

   A61P1/04

   A61P1/16

   A61P1/18

   A61P11/00

   A61P13/12

   A61P13/08

   A61P15/00

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

   C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】133

(21)【出願番号】特願2017-509591(P2017-509591)

(86)(22)【出願日】2015年4月27日

(85)【翻訳文提出日】2016年12月26日

(86)【国際出願番号】US2015027791

(87)【国際公開番号】WO2015168019

(87)【国際公開日】20151105

(31)【優先権主張番号】61/986,520

(32)【優先日】2014年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(71)【出願人】

【識別番号】516324537

【氏名又は名称】アッヴィ・ステムセントリックス・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100163784

【弁理士】

【氏名又は名称】武田 健志

(72)【発明者】

【氏名】ダメリン，マーク・アイザック

(72)【発明者】

【氏名】サプラ，プジャ

(72)【発明者】

【氏名】バンコビッチ，アレクサンダー・ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ディラ，スコット・ジェイ．

【テーマコード（参考）】

4B064

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA10

4C084BA14

4C084BA23

4C084BA32

4C084BA41

4C084CA04

4C084DA42

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA591

4C084ZA661

4C084ZA751

4C084ZA811

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB271

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA21

4C085AA26

4C085BB36

4C085CC23

4C085CC32

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045BA10

4H045BA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートおよびその同じものを調製および使用するための方法を提供する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）
[式中：
（ａ）Ａｂは、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）に結合する抗体またはその抗原結合断片であり；そして
（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、Ｄはオーリスタチンである]
の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項2】

Ａｂがキメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、または組み換えヒト抗体である、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項3】

Ａｂが内在化抗体である、請求項１または２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項4】

Ａｂが中和抗体である、請求項１または２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項5】

Ａｂが、ヒトＰＴＫ７への結合に関して、以下：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域；または
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域；
を含む抗体と競合する、および／または該抗体と同一のエピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項6】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の重鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５として示される３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項7】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として示される３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項8】

Ａｂが、以下：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５として示される３個のＣＤＲを含むを重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として示される３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項５〜７のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項9】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項５〜８のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項10】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域を含む、請求項９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項11】

Ａｂが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項12】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖を含む、請求項１１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項13】

Ａｂが、カッパ軽鎖定常領域を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項14】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む、請求項１３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項15】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む、請求項１０〜１４のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項16】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の重鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１として示されている３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項17】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として示されている３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項18】

Ａｂが、以下：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１として示されている３個のＣＤＲを含むを重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項５及び１６〜１７のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項19】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項５及び１６〜１８のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項20】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域を含む、請求項１９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項21】

Ａｂが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項２０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項22】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖を含む、請求項２１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項23】

Ａｂが、カッパ軽鎖定常領域を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項24】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む、請求項２３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項25】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項26】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の重鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９として示されている３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項27】

Ａｂが、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含み、該少なくとも１個の軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として示されている３個のＣＤＲを含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項28】

Ａｂが、以下：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９として示される３個のＣＤＲを含むを重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として示される３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域；
を含む、請求項５及び２６〜２７のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項29】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項30】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項31】

Ａｂが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項３０に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項32】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖を含む、請求項３１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項33】

Ａｂが、カッパ軽鎖定常領域を含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項34】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む、請求項３３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項35】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項36】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、１、または４９として示されている重鎖可変領域を含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項37】

Ａｂが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、１５、または６３として示されている軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項38】

リンカーが、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）およびマレイミドカプロイル（ｍｃ）からなる群から選択される、請求項１〜３７のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項39】

リンカーが、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項40】

リンカーが、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である、請求項１〜３８のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項41】

オーリスタチンが、０１０１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である、請求項１〜４０のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項42】

リンカーおよびオーリスタチンが、ｖｃ０１０１（Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（２１Ｓ，２４Ｓ，２５Ｒ）−２４−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−２５−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−１８，１８，２３−トリメチル−３，１６，１９，２２−テトラオキソ−２１−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３，２６−ペンタオキサ−４，１７，２０，２３−テトラアザヘプタコサ−１−イル］フェニル｝−Ｎ〜５〜−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド）である、請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項43】

オーリスタチンが、８２６１ ２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドである、請求項１〜４０のいずれかに記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項44】

リンカーおよびオーリスタチンが、ｍｃ８２６１ Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドである、請求項４３に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項45】

式：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）
[式中：
（ａ）Ａｂは、以下：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片；ならびに
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片；
からなる群から選択される抗体またはその抗原結合断片であり；そして
（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここで、Ｌはリンカーであり、Ｄはオーリスタチンであり、ここで、該リンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、該オーリスタチンは、０１０１である]
の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項46】

請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む、医薬組成物。

【請求項47】

請求項１〜４５のいずれか１項に記載の複数の抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物であって、該組成物が、１〜８の範囲内の平均ＤＡＲを有する、前記組成物。

【請求項48】

以下の工程：
（ａ）該リンカーを該薬物に連結し；
（ｂ）該リンカー−薬物部分を該抗体にコンジュゲートさせ；そして
（ｃ）該抗体−薬物コンジュゲートを精製する；
を含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを製造するための方法。

【請求項49】

請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＰＴＫ７関連障害を処置する方法。

【請求項50】

ＰＴＫ７関連障害が過剰増殖性障害である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

過剰増殖性障害が新生物性障害である、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

新生物性障害が固形腫瘍である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

新生物性障害が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌のような乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝細胞癌（ＨＣＣ）のような肝臓癌；ならびに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

新生物性障害が血液悪性疾患である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

血液悪性疾患が白血病である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

白血病が成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

対象においてＰＴＫ７関連障害を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用。

【請求項58】

ＰＴＫ７関連障害が過剰増殖性障害である、請求項５７に記載の使用。

【請求項59】

過剰増殖性障害が新生物性障害である、請求項５８に記載の使用。

【請求項60】

新生物性障害が固形腫瘍である、請求項５９に記載の使用。

【請求項61】

固形腫瘍が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌のような乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝細胞癌（ＨＣＣ）のような肝臓癌；ならびに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌である、請求項６０に記載の使用。

【請求項62】

新生物性障害が血液悪性疾患である、請求項５９に記載の使用。

【請求項63】

血液悪性疾患が白血病である、請求項６２に記載の使用。

【請求項64】

白血病が成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項６３に記載の使用。

【請求項65】

ＰＴＫ７関連障害の処置における使用のための、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項66】

ＰＴＫ７関連障害が過剰増殖性障害である、請求項６５に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項67】

過剰増殖性障害が新生物性障害である、請求項６６に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項68】

新生物性障害が固形腫瘍である、請求項６７に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項69】

固形腫瘍が、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌のような乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝細胞癌（ＨＣＣ）のような肝臓癌；ならびに非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌である、請求項６８に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項70】

新生物性障害が血液悪性疾患である、請求項６９に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項71】

血液悪性疾患が白血病である、請求項７０に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項72】

白血病が成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）または急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項７１に記載の使用のための抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項73】

腫瘍細胞集団をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含み、該集団が、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含み；それにより、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞の頻度が低減する、腫瘍細胞集団において腫瘍開始細胞を低減する方法。

【請求項74】

接触がインビボで実施される、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

接触がインビトロで実施される、請求項７３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
２０１４年４月３０日に出願された米国仮出願第６１／９８６，５２０号に対して優先権が主張され、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0002】

配列リスト
この出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列リストを含む。．ｔｘｔファイルは、２０１４年４月３０日に作成された、５７．７ＫＢの大きさを有する“ＰＣ０７２０４５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ”と題された配列リストを含有する。この．ｔｘｔファイルに含有される配列リストは、本明細書の一部であり、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0003】

本発明は、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）抗体および抗体−薬物コンジュゲートに関する。本発明は、さらに癌の処置のためにそのような抗体および抗体−薬物コンジュゲートを用いる方法に関する。

【背景技術】

【0004】

結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）としても知られているタンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）は、正常なヒトメラニン形成細胞から最初にクローニングされ、別途結腸癌組織からクローニングされた受容体チロシンキナーゼである。ＰＴＫ７の高いレベルが、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、および肺癌ならびに黒色腫を含むいくつかの腫瘍細胞において同定されてきた。ＰＴＫ７の発現は、成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞においても観察されてきた。

【0005】

癌の処置は、過去１０年間にわたって一次療法選択肢としての手術、放射線療法、および化学療法により向上してきた。そのような処置は、多くの患者において生存を延長する、および／または症状を緩和することができるが、多くの患者に関して治癒をもたらしそうにない。結果的に、癌に関する追加の療法選択肢に関する重大な必要性が残っている。

【0006】

この目的のため、本発明は、ＰＴＫ７陽性癌を標的とする新規の抗体−薬物コンジュゲートを提供する。開示される抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、非ＰＴＫ７発現細胞に対して望ましくない作用を及ぼすことなくＰＴＫ７発現腫瘍細胞に対して臨床的に有用な細胞毒性作用を及ぼすことができる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートならびにＰＴＫ７関連障害の検出、予防、および療法におけるそれらの使用を提供する。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、式中、Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＰＴＫ７結合断片であり；そしてＬ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。

【0008】

開示された抗体−薬物コンジュゲートのＡｂは、あらゆるＰＴＫ７結合抗体であることができる。本発明のある側面において、Ａｂは、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、もしくは組み換えヒト抗体、またはそのＰＴＫ７結合断片である。本発明のある側面において、Ａｂは、内在化抗体および／または中和抗体である。

【0009】

本発明は、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートならびにＰＴＫ７関連障害の検出、予防、および療法におけるそれらの使用も提供する。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、式中、Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＰＴＫ７結合断片であり；そしてＬ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤはオーリスタチンである。

【0010】

本発明の特定の側面において、Ａｂは、ｈｕ２３、ｈｕ２４、もしくはｈｕ５８抗体、またはヒトＰＴＫ７への結合に関してｈｕ２３、ｈｕ２４、もしくはｈｕ５８と競合する抗体、および／またはｈｕ２３、ｈｕ２４、もしくはｈｕ５８抗体と同じエピトープに結合する抗体である。例えば、Ａｂは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域；または（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域を含む抗体と、ヒトＰＴＫ７への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合することができる。

【0011】

ヒトＰＴＫ７への結合に関してｈｕ２３と競合する、および／またはｈｕ２３と同じエピトープに結合するＡｂの中で、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用な代表的なＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１により定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む。

【0012】

本発明の他のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートにおいて、Ａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域を含む。

【0013】

ヒトＰＴＫ７への結合に関してｈｕ２４と競合する、および／またはｈｕ２４と同じエピトープに結合するＡｂの中で、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用な代表的なＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５により定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む。

【0014】

本発明の他のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートにおいて、Ａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域を含む。

【0015】

ヒトＰＴＫ７への結合に関してｈｕ５８と競合する、および／またはｈｕ５８と同じエピトープに結合するＡｂの中で、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用な代表的なＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９により定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として定められる３個のＣＤＲを含む。追加のＡｂは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９として示されている３個のＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として示されている３個のＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体を含む。

【0016】

本発明の他のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートにおいて、Ａｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域を含む。

【0017】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＩｇＧ１重鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、またはＩｇＧ１重鎖定常領域およびカッパ軽鎖定常領域を含むＡｂを含む。例えば、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するために有用なＡｂは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体を含む。追加の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体を含む。さらに他の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体を含む。

【0018】

本発明の他の側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２５または４９として示されている重鎖可変領域を有する抗体を含む。本発明の他の側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、３９または６３として示されている軽鎖可変領域を有する抗体を含む。

【0019】

本発明の特定の側面において、Ａｂは、ｈｕ２３、ｈｕ２４もしくはｈｕ５８抗体、またはヒトＰＴＫ７への結合に関してｈｕ２３、ｈｕ２４もしくはｈｕ５８抗体と競合する抗体、および／またはｈｕ２３、ｈｕ２４もしくはｈｕ５８抗体と同じエピトープに結合する抗体である。例えば、Ａｂは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の軽鎖可変領域；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９の軽鎖可変領域；または（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３の軽鎖可変領域を含む抗体と、ヒトＰＴＫ７への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合することができる。

【0020】

本発明の別の側面において、Ａｂは、ヒト化モノクローナル抗体、例えばｈｕ２３、ｈｕ２４またはｈｕ５８抗体である。
本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの全てが、切断可能または切断不能であるリンカーを用いて調製されることができる。一側面において、切断可能なリンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であることができる。別の側面において、切断可能なリンカーは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であることができる。別の側面において、切断不能なリンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であることができる。

【0021】

本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの全てが、オーリスタチンである薬物を用いて調製されることができる。一側面において、オーリスタチンは、０１０１ （２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）であることができる。別の側面において、オーリスタチンは、８２６１ ２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドであることができる。

【0022】

本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体薬物コンジュゲートの全てが、カリケアマイシンのＮアセチル誘導体、例えばＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンおよびＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＣＭ）を含め、カリケアマイシンである薬物を用いて調製されることができる。

【0023】

本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体の全てが、リンカー−薬物部分（Ｌ−Ｄ）を用いたコンジュゲーションによる抗体−薬物コンジュゲートにおいて用いられることができる。一側面において、Ｌ−Ｄは、ｖｃ０１０１ （Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（２１Ｓ，２４Ｓ，２５Ｒ）−２４−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−２５−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−１８，１８，２３−トリメチル−３，１６，１９，２２−テトラオキソ−２１−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３，２６−ペンタオキサ−４，１７，２０，２３−テトラアザヘプタコサ−１−イル］フェニル｝−Ｎ〜５〜−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド）であることができる。別の側面において、Ｌ−Ｄは、ｍｃ８２６１ （Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）であることができる。さらに別の側面において、Ｌ−Ｄは、ＡｃＢｕｔＣＭ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸 Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン ジメチルヒドラジド）であることができる。本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの全てが、１〜８の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有することができる。

【0024】

本発明の特定の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、ここで、薬物は、０１０１である。

【0025】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、ここで、薬物は、０１０１である。

【0026】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、ここで、薬物は、０１０１である。

【0027】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であり、ここで、薬物は、８２６１である。

【0028】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であり、ここで、薬物は、８２６１である。

【0029】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であり、ここで、薬物は、８２６１である。

【0030】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、ＡｃＢｕｔ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸）であり、ここで、薬物は、ＣＭ（Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド）である。

【0031】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、ＡｃＢｕｔ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸）であり、ここで、薬物は、ＣＭ（Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド）である。

【0032】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄ、式中、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である；を含み、ここで、リンカーは、ＡｃＢｕｔ（４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸）であり、ここで、薬物は、ＣＭ（Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド）である。

【0033】

本発明は、複数の本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、１〜８の範囲内の平均ＤＡＲを有する。本発明の特定の側面において、組成物は、３〜５の範囲内の平均ＤＡＲを有することができる。本発明の別の側面において、組成物は、３〜４の範囲内の平均ＤＡＲを有することができる。本発明の別の側面において、組成物は、約４の平均ＤＡＲを有することができる。

【0034】

本発明は、さらに、複数の本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートおよび場合により医薬用キャリヤーを含む組成物を提供し、ここで、組成物は、少なくとも５０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。本発明の別の側面において、組成物は、少なくとも６０％の３〜５のＤＡＲを有する抗体−薬物コンジュゲートを有する。

【0035】

本発明は、さらに、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＰＴＫ７結合断片であり；Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬは、ｖｃまたはｍｃまたはＡｃＢｕｔであり、そしてＤは、薬物である。

【0036】

本発明は、さらに、一般に式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片、またはそのＰＴＫ７結合断片であり；Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬは、リンカーであり、そしてＤは、オーリスタチン（例えば０１０１または８２６１）またはＣＭである。

【0037】

本発明は、さらに、本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するための方法を提供する。例えば、抗体−薬物コンジュゲートを生成するためのプロセスは、以下の工程を含むことができる：（ａ）リンカーを薬物に連結し；（ｂ）リンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートさせ；そして（ｃ）抗体−薬物コンジュゲートを精製する。

【0038】

本発明の別の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートを作製する方法、それを調製する方法、その合成の方法、そのコンジュゲーションの方法、およびその精製の方法、ならびに本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートの調製、合成、およびコンジュゲーションのための中間体を含む。

【0039】

さらに、本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物が提供される。
他の側面において、本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを含む療法上有効量の組成物を投与することによりＰＴＫ７関連障害を処置する方法が、提供される。代表的なＰＴＫ７関連障害は、過剰増殖性障害、例えば新生物性障害、例えば固形腫瘍（例えば、乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）等）および血液悪性疾患（例えば、白血病、例えば成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）等）を含む。対象におけるＰＴＫ７関連障害を処置するための医薬品の製造のための開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの使用も、提供される。ＰＴＫ７関連障害の処置における使用のためのＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートも、提供される。

【0040】

他の側面において、本発明は、本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを含む療法上有効量の組成物および化学療法剤を投与することにより対象におけるＰＴＫ７関連障害を処置する方法を提供する。

【0041】

本発明の別の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートにより患者におけるＰＴＫ７の過剰発現を特徴とする障害を処置する方法を含む。他の側面において、本発明は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲートにより患者におけるＰＴＫ７の過剰発現を特徴とする癌を処置する方法を提供する。

【0042】

さらに他の側面において、本発明は、腫瘍細胞集団において腫瘍開始細胞を低減する方法を提供する。例えば、その方法は、腫瘍細胞集団をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートと接触させることを含むことができ、ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含み；それにより、腫瘍細胞集団中の腫瘍開始細胞の頻度が低減する。接触工程は、インビトロまたはインビボで実施されることができる。

【0043】

本発明の別の側面は、本明細書で開示される化合物および組成物に関する診断的および療法的使用を含む。
本発明の他の側面は、本明細書で開示される抗体−薬物コンジュゲート、容器、および処置を示す添付文書またはラベルを含む製品、すなわちキットを含む。

【0044】

本発明のこれらの側面および他の側面は、本出願の全体としての概観により理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1】図１は、代表的な完全長ＰＴＫ７タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）を提供する。

【図2】図２Ａ〜Ｂは、ｈｕ２４結合がＰＴＫ７の細胞発現と相関していることを示す。（Ａ）抗ＰＴＫ７および抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた全細胞溶解物の免疫ブロット。免疫ブロット信号は、ＰＴＫ７遺伝子発現がｓｉＲＮＡにより阻害された場合の信号の喪失を実証することにより、予め検証されていた。（Ｂ）免疫ブロットにおけるものと同じ癌細胞株における抗ＰＴＫ７（ｈｕ２４）を用いたフローサイトメトリーからの平均蛍光強度値。点線は、一次抗体がｈｕ２４ではない陰性対照抗体であった場合の信号を表す。

【図3】図３は、免疫組織化学による７つのＰＤＸモデルからの組織試料におけるＰＴＫ７発現を示す。染色はＰＴＫ７を示す。代表的な顕微鏡写真が、それぞれのモデルに関して示されている。スケールバー、１００μＭ。

【図4-1】図４Ａ〜Ｃは、原発腫瘍におけるＰＴＫ７ ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。（Ａ）乳癌；（Ｂ）ＮＳＣＬＣ癌および（Ｃ）卵巣癌が示されている。

【図4-2】同上

【図5】図５は、ＮＳＣＬＣ患者におけるより高いＰＴＫ７ ｍＲＮＡ発現およびより悪い全生存率の間の相関を示すグラフである。

【図6】図６は、健康なヒトおよび８種類の異なる腫瘍型に相当する癌患者からの血清中のＰＴＫ７タンパク質レベルを示すグラフである。横線は、それぞれの群に関する平均値を示す。

【図7】図７は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）分析を提供する。

【図8】図８は、乳房−１３（ＢＲ１３）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸにおける抗ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図9】図９は、ＢＲ１３ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１および抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣの有効性を示すデータ表である。

【図10】図１０は、ＢＲ１３ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１および抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣの有効性を示す図９のデータのグラフである。

【図11】図１１は、乳房−２２（ＢＲ２２）ＴＮＢＣ ＰＤＸにおける抗ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図12】図１２は、ＢＲ２２ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２３−ｖｃ０１０１および抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣの有効性を示すデータ表である。

【図13】図１３は、ＢＲ２２ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２３−ｖｃ０１０１および抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣの有効性を示す図１２のデータのグラフである。

【図14】図１４は、乳房−３１（ＢＲ３１）ＴＮＢＣ ＰＤＸにおける抗ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図15】図１５は、乳房−６４（ＢＲ６４）ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図16】図１６は、ＢＲ５ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図17】図１７は、ＢＲ３６ ＰＲ＋ ＴＮＢＣ ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図18】図１８Ａ〜Ｂは、２種類の異なるＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（Ａ）Ｈ１０４８ ＰＤＸモデルおよび（Ｂ）ＳＣＬＣ ９５ ＰＤＸモデルにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１およびｈｕ２３−ＡｃＢｕｔ ＣＭの有効性を示すグラフである。

【図19】図１９Ａ〜Ｂは、２種類の異なるＳＣＬＣ ＰＤＸモデル（Ａ）ＳＣＬＣ １１７ ＰＤＸモデルおよび（Ｂ）ＳＣＬＣ １０２ ＰＤＸモデルにおけるｈｕ２４−ＡｃＢｕｔ ＣＭの有効性を示すグラフである。

【図20】図２０は、Ｌｕｎｇ−１３５（ＬＵ１３５）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図21】図２１は、Ｌｕｎｇ−１７６（ＬＵ１７６）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＰＤＸにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性を示すグラフである。

【図22】図２２は、４μｇ／ｍＬ ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ、４μｇ／ｍＬ未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂ、４μｇ／ｍＬ陰性対照ＡＤＣ、または０．１ｎＭ遊離０１０１オーリスタチンを用いた処置後の微小管構造の顕微鏡写真を示す。Ｈ６６１細胞は、４８時間処理され、次いで抗チューブリンおよびＤＮＡを可視化するためにＤＡＰＩに関して染色された。

【図23】図２３は、インビトロでの内皮細胞に対するｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの作用を示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

本発明は、ＰＴＫ７に結合する抗体−薬物コンジュゲート、ＰＴＫ７抗体、リンカー、および薬物を用いてコンジュゲートを調製するためのプロセスを提供する。本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７発現を特徴とする過剰増殖性障害の診断、予防、および／または処置において用いられることができる組成物、例えば医薬品の調製および製造に関して有用である。本発明のある側面において、開示される抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の頻度を低減することができ、それは腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）および高増殖性腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇ）の両方を包含する。

【0047】

Ｉ． ＰＴＫ７の生理学
結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）としても知られているタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ７）は、正常なヒトメラニン形成細胞から最初にクローニングされ(Lee et al., Oncogene 8(12):3403-3410, 1993)、別途結腸癌組織からクローニングされた(Mossie et al., Oncogene 11(10):2179-2184, 1995)受容体チロシンキナーゼである。ＰＴＫ７遺伝子は、６ｐ２１．１−ｐｌ２．２に位置している。ヒトＰＴＫ７の５種類のスプライスイソ型が、精巣のｃＤＮＡからクローニングされている(Jung, et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002)。イソ型の互いに関する相対存在度は、精巣および肝細胞癌または結腸癌株の間で異なるが、これらのイソ型の機能的重要性は、たとえあるとしても未知である。生物情報学分析は、マウスはオルタナティブスプライシングされたｍＲＮＡから可溶性のＰＴＫ７のイソ型を発現している可能性があることを示唆している(Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006)。

【0048】

完全長ＰＴＫ７タンパク質は、６７４アミノ酸の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、続いて短いＴＭ貫通部分および３４５アミノ酸の細胞質ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＴＫ７の代表的な完全長アミノ酸配列が、図１において示されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）。代表的なＰＴＫ７のイソ型のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＥＡＸ０４１５４．１（イソ型ａ）、ＥＡＸ０４１５５．１（イソ型ｂ）、ＥＡＸ０４１５６．１（イソ型ｃ）、ＥＡＸ０４１５７．１（イソ型ｄ）、ＥＡＸ０４１５８．１（イソ型ｅ）、ＥＡＸ０４１５９．１（イソ型ｆ）、およびＥＡＸ０４１６０．１（イソ型ｇ）において見付けられる。全てのイソ型は、同じ細胞内ドメインをコードしている。ヒトＰＴＫ７の代表的なイソ型（すなわち転写バリアントＰＴＫ７−１）の完全な核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＭ＿００２８２１を有する。

【0049】

成熟完全長ＰＴＫ７ ＥＣＤは、７個の免疫グロブリン様ドメインを含み、一方で様々なスプライスバリアントがそれらのＥＣＤ構造において異なるＰＴＫ７イソ型をコードしている。全てのイソ型は、チロシンキナーゼの一般的なクラスにおいて見られる細胞質ドメインに対して実質的な相同性を有する細胞質ドメインを含有する。しかし、ＰＴＫ７は、検出可能なチロシンキナーゼ活性を欠いており、従って、様々な保存されたキナーゼサブドメインにおけるいくつかのアミノ酸変化がＡＴＰの結合の欠陥をもたらす偽キナーゼのサブファミリーに属する(Boudeau, et al., Trends Cell Biol. 16, 2006)。特に、サブドメインＩおよびＶＩＩにおける重要な残基が、ＰＴＫ７において、ＡＴＰの移動不能なホスフェートとの直接的な相互作用ならびにこれらのホスフェートを橋渡しするＭｇ^２＋補因子のキレート形成が損なわれるであろうように変化している。

【0050】

ＰＴＫ７の機能の生物学的重要性は、ヒドラからドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を通してニワトリおよびヒトまでの保存されたオルソログの存在から推測されることができ、そのそれぞれが、配列分析により、キナーゼ活性を欠いていると予測されている。ヘリックス−ヘリックス会合に関する傾向と関係する特定のＴＭドメインモチーフの高度な保存に基づいて、ＴＭドメインは、ＰＴＫ７の２量体化を媒介している可能性があることが示唆されてきた。ＰＴＫ７の偽キナーゼドメイン自体は、信号を直接伝達するとは予想されていないが、それは、シグナル伝達経路における他の分子のための足場として相互作用する可能性があり、または他のチロシンキナーゼ（単数または複数）を動員する（ｒｅｃｒｕｉｔ）可能性もある。ＰＴＫ７は、胚発生を制御するための細胞接着、細胞移動、細胞極性、増殖、アクチン細胞骨格の再編成、およびアポトーシス、上皮組織の組織化、神経管閉鎖、神経堤形成、ならびに軸索誘導において機能している可能性があることが、示されている(Peradziryi, H. et al. Arch Biochem Biophys. 524, 2012)。

【0051】

ＰＴＫ７を発現することが報告されている正常な組織および細胞は、肺、甲状腺、卵巣、ＣＤ４＋新規胸腺移出（ｒｅｃｅｎｔ ｔｈｙｍｉｃ ｅｍｉｇｒａｎｔ）Ｔ細胞、ならびに正常な骨髄前駆細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−骨髄細胞を含む。癌組織に関して、ＰＴＫ７の発現は、結腸癌細胞、成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）試料、ＣＤ３４−プレＴＡＬＬ細胞、および胃癌においても見出されている。ＰＴＫ７は、染色体６ｐ２１の欠失を含有する特定の乳癌において失われている可能性があるが、発現は、乳癌細胞株において様々である。ＰＴＫ７は、肺腺癌においても発現している。骨肉腫における６ｐｌ ２−ｐ２１領域の増幅の細かいマッピングは、遺伝子コピー数における増大は、必ずしも結果としてｑＲＴ−ＰＣＲにより決定されるようなＰＴＫ７の過剰発現をもたらさないことを示している。

【0052】

ＰＴＫ７に関するリガンド（単数または複数）は、知られていないが、ＰＴＫ７は、様々な生物学的シグナル伝達経路および発生プロセスに結び付けられてきた。例えば、ＰＴＫ７は、（Ｗｎｔ／平面内細胞極性シグナル伝達としても知られている）非古典的および古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の両方において補助受容体の役目を果たす。非古典的Ｗｎｔ経路では、ＰＴＫ７は、ＲＡＣＫ１との直接的な相互作用およびＤＳＨの膜局在性受容体複合体への動員により、下流のシグナル伝達を活性化する。ＰＴＫ７は、古典的Ｗｎｔ経路のシグナル伝達に対して、膜表面におけるｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体結合に関する競合を通して阻害作用を及ぼす。ＰＴＫ７の遺伝子発現は、Ｃｄｘにより制御されており、一方でタンパク質の安定性は、膜結合型プロテイナーゼ分解により制御されている。ＰＴＫ７は、メタロプロテイナーゼＭＭＰ１４およびＡｄａｍ１７によりタンパク質分解および細胞外ドメインの脱落に関して標的とされており、これは、増大した細胞増殖、移動、および促進された癌細胞浸潤をもたらす(Peradziryi, et al. Arch Biochem Biophys. 524, 2012)。可溶性ＰＴＫ７（ｓＰＴＫ７）は、ＶＥＧＦに誘導される血管新生、ならびにヒト内皮細胞のインビトロでの管形成、移動および浸潤におけるＰＴＫ７に関する役割を示すために用いられた。

【0053】

癌組織内で、Ｗｎｔ経路の調節に関するその可能性に加えて、ＰＴＫは、ＨＣＴ１１６結腸癌株において増殖誘発（ｐｒｏ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および抗アポトーシス信号を伝えるようであり、それはＲＮＡｉに媒介されるＰＴＫ７のノックダウンにより逆転させることができた表現型である(Meng, et al., 2010, PLoS One 5(11):e14018)。ＰＴＫ７の抗アポトーシス信号は、成人骨髄性白血病（ＡＭＬ）芽球においてアントラサイクリンに媒介される細胞殺傷に対する耐性を伝え、それは、可溶性ＰＴＫ７−Ｆｃタンパク質を用いて逆転させることができた(Prebet, et al., 2010, Blood 116(13):2315-23)。特定の癌細胞によるＰＴＫ７の過剰発現は、ＰＴＫ７に結合し、続いて内在化するアプタマーを用いた培養状態のＴ−ＡＬＬ細胞へのダウノルビシンの送達を目標とする戦略において利用されてきた。

【0054】

ＩＩ． ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート
本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートを提供し、式中、（ａ）Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり、そして（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。そのような抗体−薬物コンジュゲートを調製および製造する方法、ならびにその同じ物の臨床適用における使用も、提供される。“抗体−薬物コンジュゲート”または“ＡＤＣ”は、ＰＴＫ７に結合する抗体誘導体を含む抗体またはその抗原結合断片を指し、本明細書において下記でさらに記載されるように、薬物、例えば細胞毒性、細胞増殖抑制、および／または療法剤にコンジュゲートされている。例えば、細胞毒性剤は、細胞毒性剤の腫瘍（例えばＰＴＫ７発現腫瘍）への標的化された局所送達のために、本明細書で記載されるように抗ＰＴＫ７抗体に連結またはコンジュゲートされることができる。

【0055】

本明細書で用いられる際、用語“ＰＴＫ７”は、バリアント、イソ型、ホモログ、オルソログおよびパラログを含む。ＰＴＫ７は、当該技術において、結腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４またはＣＣＫ−４）としても知られている。本出願の目的に関して、用語“ＰＴＫ７”および“ＣＣＫ４”は、互換的に用いられており、ヒトＰＴＫ７またはヒトＣＣＫ４のスプライスバリアント、イソ型、種オルソログおよびホモログを含む。さらに、その用語は、ＰＴＫ７抗体が特異的に結合することができるエピトープを含有するＰＴＫ７またはＣＣＫ４の天然またはバリアント形態のあらゆる派生物または断片も指すことができることは、理解されるであろう。

【0056】

本発明のある側面において、抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、ヒト以外の種からのＰＴＫ７、例えばマウス、ラット、または霊長類のＰＴＫ７、ならびにＰＴＫ７の異なる形態（例えばグリコシル化されたＰＴＫ７）と交差反応する。他の側面において、抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、ヒトＰＴＫ７に完全に特異的であることができ、種または他のタイプの交差反応性を示さない可能性がある。本明細書で用いられる際、用語ＰＴＫ７は、別途文脈的に指示されない限り、天然存在のヒトＰＴＫ７を指す。従って、“ＰＴＫ７抗体”もしくは“抗ＰＴＫ７抗体”または他の類似の名称は、ヒトＰＴＫ７、またはその断片もしくは誘導体と会合する、結合する、または反応する（本明細書で定義されるような）あらゆる抗体を意味する。さらに、“ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート”または“抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート”は、ヒトＰＴＫ７、またはその断片もしくは誘導体と会合する、結合する、または反応する（本明細書で定義されるような）あらゆる抗体−薬物コンジュゲートまたはＡＤＣを意味する。

【0057】

“リンカー（Ｌ）”は、抗体の薬物への直接または間接的連結を記載する。リンカーの抗体への結合は、様々な方法で、例えば表面のリジン、酸化された炭水化物への還元カップリング、鎖間ジスルフィド結合を還元することにより遊離したシステイン残基、特定の部位に設計された反応性システイン残基、ならびにトランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのアシル供与体グルタミン含有タグまたはポリペプチド工学により反応性にされた内在性のグルタミンにより成し遂げられることができる。ヒドラゾン連結、ジスルフィド連結、およびペプチドベースの連結を含む様々なＡＤＣ連結系が、当該技術で既知である。

【0058】

“薬物（Ｄ）”は、生物学的活性または検出可能な活性を有するあらゆる物質、例えば、療法剤、検出可能な標識、結合剤等、およびインビボで代謝されて有効薬剤になるプロドラッグである。薬物、ペイロードおよび化合物という用語は、互換的に用いられている。

【0059】

“Ｌ−Ｄ”は、リンカー（Ｌ）に連結された薬物（Ｄ）の結果生じるリンカー−薬物部分である。
本発明と関連して用いられている追加の科学用語および技術用語は、本明細書で別途示されない限り、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、別途文脈により要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。一般に、本明細書で記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションと関連して用いられている命名法およびその技法は、当該技術で周知であり、一般的に用いられている命名法および技法である。

【0060】

本発明の特定の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0061】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0062】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0063】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0064】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0065】

本発明の別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含む抗体、またはその抗原結合断片、Ａｂ；ならびに（ｂ）リンカー−薬物部分、Ｌ−Ｄを含み、ここでＬはリンカーであり、Ｄは薬物であり、ここでそのリンカーはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、かつここでその薬物は０１０１である。

【0066】

抗体あたりのコンジュゲートした薬物分子の数を示すＤＡＲ（薬物対抗体比）または薬物装填（ｄｒｕｇ ｌｏａｄｉｎｇ）は、１〜８であることができる。複数の抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、様々な従来の手段、例えば紫外分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣにより決定されることができる。

【0067】

本発明の特定の側面において、精製された抗ＰＴＫ７ ＡＤＣには未コンジュゲート抗体（遊離の抗体）が存在しないことができる。本発明の他の側面において、精製された抗ＰＴＫ７ ＡＤＣは、単量体性ＡＤＣであることができ、凝集体および２量体は存在しない。本発明の他の側面において、精製された抗ＰＴＫ７ ＡＤＣには、遊離の薬物が存在しないことができる。本発明のさらなる側面において、精製された抗ＰＴＫ７ ＡＤＣは、単量体性ＡＤＣであることができ、遊離の薬物が存在しないことができる。

【0068】

ＩＩＡ． ＰＴＫ７抗体
本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの調製に関して、抗体、またはその抗原結合断片は、ＰＴＫ７に特異的に結合するあらゆる抗体、またはその抗原結合断片であることができる。本発明の抗体は、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号においてさらに開示され、特性付けられており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。より詳細には、その中で開示されているＰＴＫ７抗体の配列は、完全な重鎖および軽鎖、その可変領域、ならびにそのＣＤＲを含め、本明細書に参照により援用される。ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの調製における使用のために、抗体、またはその抗原結合断片は、単離、精製、または誘導体化されることができる。

【0069】

“抗体”または“Ａｂ”は、特異的な標的または抗原、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等に、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１個の抗原認識部位を通して認識および結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる際、用語“抗体”は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、所与の抗原（例えばＰＴＫ７）に特異的に結合する能力を保持している完全な抗体の“抗原結合断片”（または部分）、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｃ等、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、二特異性抗体、ヘテロコンジュゲート（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体、その変異体、抗体を有する融合タンパク質、またはその抗原結合断片（例えばドメイン抗体）、単鎖（ＳｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（例えばサメおよびラクダ抗体）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、細胞内抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ＳｃＦｖ（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136を参照）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含む要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の改変された形態を含むがそれらに限定されないあらゆるタイプの抗体を包含することができる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または（キメラまたはヒト化抗体を含む）あらゆる他の由来であることができる。本発明のある側面において、開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは組み換えヒト抗体、またはそのＰＴＫ７結合断片である。

【0070】

標的または抗原（例えばＰＴＫ７タンパク質）に“特異的に結合する”または“優先的に結合する”（本明細書において互換的に用いられている）抗体、抗体−薬物コンジュゲート、またはポリペプチドは、当該技術で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を決定するための方法も、当該技術で周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、それが代わりの細胞または物質と反応または会合するよりも頻繁に、より急速に、より大きな持続時間で、および／またはより大きな親和性で反応または会合する場合、“特異的結合”または“優先的結合”を示すと言われる。抗体は、それが、それが他の物質に結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、および／またはより大きな持続時間で結合する場合、標的または抗原に“特異的に結合する”または“優先的に結合する”。例えば、ＰＴＫ７エピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、このエピトープに、それが他のＰＴＫ７エピトープまたは非ＰＴＫ７エピトープに結合するよりも大きい親和性、結合力で、より容易に、および／またはより大きな持続時間で結合する抗体である。

【0071】

用語“結合親和性”または“Ｋ_Ｄ”は、本明細書で用いられる際、特定の抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を指すことが意図されている。Ｋ_Ｄは、会合の速度（または“オン速度”もしくは“Ｋ_ａ”）に対する解離の速度（“オフ速度”または“Ｋ_ｄ”とも呼ばれる）の比率である。従って、Ｋ_Ｄは、Ｋ_ｄ／Ｋ_ａと等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。Ｋ_Ｄがより小さいほど、結合親和性はより強いことになる。従って、１μＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して弱い結合親和性を示す。抗体に関するＫ_Ｄ値は、当該技術で十分に確立された方法を用いて決定されることができる。抗体のＫ_Ｄを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、典型的にはバイオセンサーシステム、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムを用いることによる。

【0072】

開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの特異的結合は、多数の異なる抗原を有する不均質な試料中のヒトＰＴＫ７抗原に対する抗体−薬物コンジュゲートの優先的結合を指す。典型的には、特異的結合は、結合親和性が、少なくとも約１０^−７Ｍ以上、例えば少なくとも約１０^−８Ｍ以上（少なくとも約１０^−９Ｍ以上、少なくとも約１０^−１０Ｍ以上、少なくとも約１０^−１１Ｍ以上、または少なくとも約１０^−１２Ｍ以上を含む）である場合に起こる。例えば、本発明の抗体−薬物コンジュゲート、またはその抗体部分（Ａｂ）のヒトＰＴＫ７抗原に対する特異的結合は、少なくとも約１×１０^−７Ｍ〜約１×１０^−１２Ｍの範囲の、例えば約１×１０^−８Ｍ〜約１×１０^−１２Ｍの範囲内、または約１×１０^−８Ｍ〜約１×１０^−１１Ｍの範囲内、または約１×１０^−８Ｍ〜約１×１０^−１０Ｍの範囲内、または約１×１０^−９Ｍ〜約１×１０^−１０Ｍの範囲内の結合を含む。特異的結合は、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート、またはその抗体部分（Ａｂ）の、その抗体の対象への投与後のＰＴＫ７発現細胞への選択的標的化も指す。

【0073】

第１標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２標的に特異的または優先的に結合する可能性もしない可能性もあることも、理解されている。従って、“特異的結合”または“優先的結合”は、排他的結合を必ずしも必要としない（が、それは排他的結合を含むことができる）。一般に、結合への言及は、優先的結合を意味するが、必ず意味するわけではない。

【0074】

本明細書で用いられる際、“エピトープ”は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、または他の方法で分子と相互作用することができるあらゆるタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、化学的に活性な表面の分子、例えばアミノ酸または炭水化物または糖側鎖の群化（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）からなり、一般に特異的な三次元構造の特徴ならびに特異的な電荷の特徴を有する。エピトープは、‘線状’または‘立体構造的’であることができる。線状エピトープでは、タンパク質および相互作用する分子（例えば抗体）の間の相互作用の点の全部が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体構造的エピトープでは、相互作用の点は、互いに隔てられているタンパク質上のアミノ酸残基を含む。一度抗原上の望ましいエピトープが決定されたら、そのエピトープに対する抗体を、例えば本発明において記載される技法を用いて生成することが可能である。あるいは、発見プロセスの間に、抗体の生成および特性付けが、望ましいエピトープに関する情報を明らかにする可能性がある。次いで、この情報から、同じエピトープへの結合に関して抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体（すなわちその抗体は、その抗原への結合に関して競合する）を見付けるための交差競合試験を実施することである。抗体をそれらの交差競合に基づいて‘棚入れする（ｂｉｎｎｉｎｇ）’ための高スループットプロセスが、ＰＣＴ国際公開第０３／４８７３１号において記載されている。本明細書で用いられる際、用語‘棚入れする’は、抗体をそれらの抗原結合特徴および互いとの競合に基づいてグループ分けするための方法を指す。
“単離された抗体”は、本明細書で用いられる際、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＰＴＫ７に特異的に結合する単離された抗体は、ＰＴＫ７以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含まないことができる。しかし、ＰＴＫ７に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種からのＰＴＫ７分子（すなわちオルソログ）に対する、またはＰＴＫ７の１より多くのイソ型との交差反応性を有し得る。

【0075】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されている軽鎖可変領域；または（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されている軽鎖可変領域；または（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されている軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片と、ヒトＰＴＫ７への結合に関して競合する、および／または同じエピトープに結合する抗体を含む。

【0076】

用語“競合する”は、本明細書で抗体に関して用いられる際、第１抗体、またはその抗原結合断片が、エピトープに、第１抗体のその同族のエピトープとの結合の結果が、第２抗体の存在下で、第２抗体の非存在下での第１抗体の結合と比較して検出可能であるほどに低下するように、第２抗体、またはその抗原結合断片の結合に十分に類似した様式で結合することを意味する。しかし、第２抗体のそのエピトープへの結合も、第１抗体の存在下で検出可能であるほどに低下するという代替（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）は、必ずしも当てはまらない可能性がある。すなわち、第１抗体は、第２抗体のそのエピトープへの結合を、第２抗体が第１抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他方の抗体のその同族のエピトープまたはリガンドとの結合を、同程度、より大きい程度、またはより低い程度までのいずれであれ、検出可能であるほどに阻害する場合、その抗体は、それらのそれぞれのエピトープ（単数または複数）の結合に関して互いと“交差競合する”と言われる。競合する、および交差競合する抗体は、両方とも本発明に包含される。そのような競合または交差競合が起こる機序（例えば立体障害、立体構造変化、または共通のエピトープもしくはその一部への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書で提供される教示に基づいて、そのような競合する、および／または交差競合する抗体は、本明細書で開示される方法に包含され、そのために有用であり得ることを理解するであろう。

【0077】

天然抗体または天然存在抗体、および天然免疫グロブリンは、典型的には、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンのイソ型の重鎖の間で異なる。それぞれの重鎖および軽鎖は、規則的に間隔の空いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれの重鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶＨ）、続いていくつかの定常ドメインを有する。それぞれの軽鎖は、一方の末端において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１定常ドメインと並んでおり、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並んでいる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の接触面を形成していると信じられている。用語“可変”は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列において大規模に異なっている事実を指す。

【0078】

抗体および上記で特筆した抗体ドメインは、“ポリペプチド”、“オリゴペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”、すなわち、あらゆる長さの、好ましくは比較的短い（例えば１０〜１００アミノ酸）アミノ酸の鎖として記載されることができる。その鎖は、線状または分枝状であることができ、それは、改変されたアミノ酸を含むことができ、および／または非アミノ酸により遮られることができる。さらに、ポリペプチドは単一の鎖または会合した鎖として存在し得ることが、理解されている。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌにより推奨される１文字記号により（どちらでもよい）言及されることができる。用語“ポリペプチド”、“オリゴペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、天然に、または介入により改変されているアミノ酸鎖も包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは改変、例えば標識構成要素とのコンジュゲーション。例えば、１個以上のアミノ酸の類似体（例えば非天然アミノ酸等が含まれる）、ならびに当該技術で既知の他の改変を含有するポリペプチドも、その定義内に含まれる。アミノ酸改変は、当該技術で既知のあらゆる方法によりなされることができ、多くのそのような方法が、周知であり、当業者にとってルーチン的である。例えば（限定としてではないが）、アミノ酸の置換、削除および挿入は、あらゆる周知のＰＣＲベースの技法を用いて成し遂げられることができる。アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発によりなされることができる（例えば、Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500;およびKunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488を参照）。

【0079】

抗体の“定常領域”は、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指し、単独または組み合わせのどちらでもよい。キメラおよびヒト化ＰＴＫ７抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、それらのあらゆるイソ型（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型）、ならびにそれらの下位クラスおよび変異版のいずれか１つの定常領域に由来することができる。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられることができる。免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、下位クラス（イソ型）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。

【0080】

定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関わらないが、様々なエフェクター機能、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体の抗体依存性細胞傷害への参加、オプソニン化、補体依存性細胞傷害の開始、およびマスト細胞の脱顆粒を示す。当該技術で既知であるように、用語“Ｆｃ領域”は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。“Ｆｃ領域”は、天然配列のＦｃ領域またはバリアントのＦｃ領域であることができる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、位置Ｃｙｓ２２６におけるアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶように定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、国立衛生研究所公衆衛生局、メリーランド州ベセスダ、1991）におけるような、ＥＵ指針の番号付けである。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を有する。

【0081】

当該技術で用いられる際、“Ｆｃ受容体”および“ＦｃＲ”は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩ下位クラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよびオルタナティブスプライシングされた形態を含めて含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（“活性化受容体”）およびＦｃγＲＩＩＢ（“阻害受容体”）を含み、それは、主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994;およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995において総説されている。“ＦｃＲ”は、新生児型受容体ＦｃＲｎも含み、それは、母親のＩｇＧの胎児への移動の原因である(Guyer et al., J. Immunol., 117:587-593 (1976);およびKim et al., European J. Immunol., 24:2429-2434 (1994))。

【0082】

以前に、抗体の重鎖のＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインの表面上に、または軽鎖の定常ドメイン上におそらく存在する特定の残基が、天然存在の野生型アミノ酸の例えばシステインによる置換に適しており、従って様々な薬剤へのコンジュゲーションが可能な部位を設計するために有用であることが、報告されている。

【0083】

“設計されたＦｃポリペプチド”、“設計されたＦｃ領域”および“設計されたＦｃ”（その用語は本明細書で互換的に用いられている）により、コンジュゲーションのための部位を導入する少なくとも１個の変異、例えばアミノ酸置換を含むＦｃポリペプチド、またはその一部が意味される。その変異は、その位置の天然存在アミノ酸残基の代わりにシステインを導入し、そこでその変異は、ある部分のＦｃへのコンジュゲーションのための反応性部位（例えば反応性スルフヒドリル基）を作り出す。

【0084】

用語“アシル供与体グルタミン含有タグ”または“グルタミンタグ”は、本明細書で用いられる際、トランスグルタミナーゼのアミン受容体の役目を果たす１個以上のＧｌｎ残基（単数または複数）を含有するポリペプチドまたはタンパク質を指す。

【0085】

抗体の“可変領域”は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指し、それは単独または組み合わせのどちらでもよい。当該技術で既知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ超可変領域としても知られている３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された４個のフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖中のＣＤＲは、ＦＲにより近接して一緒に保持されており、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技法が存在する：（１）異種間の配列の変動性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (第5版, 1991, 国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ))；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-Lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997))。本明細書で用いられる際、ＣＤＲは、どちらかのアプローチにより、または両方のアプローチの組み合わせにより定められたＣＤＲを指すことができる。

【0086】

可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方の蓄積、ＶＢＡＳＥ２、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造的定義または当該技術で周知のあらゆるＣＤＲ決定の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより最初に定義された超可変領域として同定されることができる。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、ＮＩＨ公衆衛生局、ワシントンＤ．Ｃを参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより最初に記載された構造的ループ構造として同定されることもできる。例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989)を参照。ＣＤＲの位置は、ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られることもできる。(例えば、Retter et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33(データベース特集号):D671-D674を参照)。

【0087】

ＣＤＲ同定への他のアプローチは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの間の折衷案であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在ＡＣＣＥＬＲＹＳ（登録商標））を用いて得られる“ＡｂＭ定義”、またはMacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996)において述べられている観察された抗原接触に基づくＣＤＲの“接触定義”を含む。本明細書においてＣＤＲの“立体構造的定義”と呼ばれる別のアプローチでは、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定されることができる。例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008を参照。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のアプローチの１つに厳密には従わない可能性があるが、それでもなおＫａｂａｔＣＤＲの少なくとも一部と重複するであろうが、それらは、特定の残基もしくは残基の群またはさらにはＣＤＲ全体が抗原結合に著しくは影響をおよぼさないという予測または実験的発見を考慮して、短く、または長くなっている可能性がある。本明細書で用いられる際、ＣＤＲは、アプローチの組み合わせを含め、当該技術で既知のあらゆるアプローチにより定められたＣＤＲを指すことができる。本明細書で用いられる方法は、これらのアプローチのいずれかに従って定められたＣＤＲを利用することができる。本明細書で記載されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートに関して、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＶＢＡＳＥ２、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造的定義のいずれに従って定められることもできる。

【0088】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体、またはその抗原結合断片は、抗体の１個以上のＣＤＲ（単数または複数）（例えば１個、２個、３個、４個、５個、または６個全部のＣＤＲ）を含む。

【0089】

本発明に関して、下記の表１において示されているｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８のＣＤＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜７２）は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａを用いて得られた。参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号の図６において示されているＣＤＲは、ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた。従って、全てのそのような命名法により定められたＣＤＲを有する抗体は、本発明の範囲内に明確に含まれる。より広く言えば、用語“可変領域ＣＤＲアミノ酸残基”は、上記で述べられたようなあらゆる配列または構造ベースの方法を用いて同定されるようなＣＤＲ中のアミノ酸を含む。

【0090】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕ２３抗体のＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１として示されている３個のＣＤＲを有する。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として示されている３個のＣＤＲを有する。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、７、および１１として示されている３個のＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、１９、および２１として示されている３個のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む抗体、またはその抗原結合断片を含むこともできる。

【0091】

本発明のさらに他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた、またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた１個以上のｈｕ２３ ＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（表１参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む。別の例として、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（表１参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（表１参照）を有する重鎖可変領域；および（ｂ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（表１参照）を有する軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む重鎖可変領域；および（ｂ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２３ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。

【0092】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕ２４抗体のＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３１、および３５として示されている３個のＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１、４３、および４５として示されている３個のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含むこともできる。

【0093】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた、またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた１個以上のｈｕ２４ ＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（表１参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む。別の例として、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（表１参照）またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（表１参照）を有する重鎖可変領域；および（ｂ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（表１参照）を有する軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む重鎖可変領域；および（ｂ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２４ ＣＤＲ（ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号参照）を含む軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。

【0094】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕ５８抗体のＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含み、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として示されている３個のＣＤＲを含む。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１、５５、および５９として示されている３個のＣＤＲを有する重鎖可変領域；ならびに（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、６７、および６９として示されている３個のＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含むこともできる。

【0095】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた、またはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた１個以上のｈｕ５８ ＣＤＲを有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の重鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ５８ ＣＤＲまたはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ５８ ＣＤＲを含む。別の例として、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、少なくとも１個の重鎖可変領域および少なくとも１個の軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができ、ここで、その少なくとも１個の軽鎖可変領域は、Ｃｈｏｔｈｉａにより定められた３個のｈｕ５８ ＣＤＲまたはＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ５８ ＣＤＲを含む。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ５８ ＣＤＲを有する重鎖可変領域；および（ｂ）Ｃｈｏｔｈｉａに従って定められた３個のｈｕ５８ ＣＤＲを有する軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ５８ ＣＤＲを含む重鎖可変領域；および（ｂ）ＶＢＡＳＥ２データベースの分析から得られた３個のｈｕ２４ ＣＤＲを含む軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含むことができる。

【0096】

本発明のある側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられる抗体は、モノクローナル抗体であろう。用語“モノクローナル抗体”または“ｍＡｂ”は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量存在し得る可能な自然発生変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられている。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。修飾語“モノクローナル”は、抗体の実質的に均質な集団から得られたものとしての抗体の性質を示し、いずれかの特定の方法によるその抗体の生成を必要するものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製されることができ、または例えば米国特許第４，８１６，５６７号において記載されている組み換えＤＮＡ法により作製されることもできる。モノクローナル抗体は、例えばMcCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)において記載された技法を用いて生成されたファージライブラリーから単離されることもできる。

【0097】

本発明のある側面において、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられる抗体は、一価、すなわち分子あたり１個の抗原結合部位を有するであろう（例えばＩｇＧまたはＦａｂ）。一部の場合において、一価抗体は、１個より多くの抗原結合部位を有し得るが、その結合部位は異なる抗原からのものである。本発明のある側面において、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、“二価抗体”、すなわち分子あたり２個の抗原結合部位を有する抗体（例えばＩｇＧ）を含み得る。一部の場合において、２個の結合部位は、同じ抗原特異性を有する。あるいは、二価抗体は、二特異性であることができる。“二特異性”、“二重特異性”または“二機能性”抗体は、２個の異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二特異性抗体の２個の抗原結合部位は、２つの異なるエピトープに結合し、それは同じタンパク質標的上にある可能性も異なるタンパク質標的上にある可能性もある。

【0098】

用語“キメラ抗体”は、可変領域配列の一部または全部が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図されている。

【0099】

本明細書で用いられる際、“ヒト化”または“ＣＤＲ移植”抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または抗体の他の抗原結合部分配列）である非ヒト（例えばマウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、受容抗体の１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（供与抗体）、例えばマウス、ラット、またはウサギの１個以上のＣＤＲからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（受容抗体）である。

【0100】

一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体中にも導入されるＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも存在しないが抗体の性能をさらに改良および最適化するために含められる残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むと考えられ、ここで、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むであろう。本発明のある側面において、抗体は、ＰＣＴ国際公開第９９／５８５７２号において記載されているように改変されたＦｃ領域を有する。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して変更されていることができる１個以上のＣＤＲ（ＣＤＲ Ｌ１、ＣＤＲ Ｌ２、ＣＤＲ Ｌ３、ＣＤＲ Ｈ１、ＣＤＲ Ｈ２、またはＣＤＲ Ｈ３）を有し、それは、元の抗体からの１個以上のＣＤＲ“に由来する”１個以上のＣＤＲとも呼ばれる。

【0101】

ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法(Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988))に従って、齧歯類または変異体齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることにより実施されることができる。米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号も参照；それは参照により本明細書にそのまま援用される。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンの１個以上の可変領域のフレームワーク領域内の残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；および第６，１８０，３７０号を参照）。さらに、ヒト化抗体は、受容抗体中にも供与抗体中にもない残基を含むことができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改良するため（例えば所望の親和性を得るため）に行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むと考えられ、ここで、超可変領域の全部または実質的に全部は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、フレームワーク領域の全部または実質的に全部は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含むであろう。さらなる詳細に関しては、Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988);およびPresta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照；それは参照により本明細書にそのまま援用される。従って、そのような“ヒト化”抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列により置き換えられている抗体を含むことができる。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のフレームワーク残基が、齧歯類抗体中の類似の部位からの残基により置き換えられているヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，８５９，２０５号を参照。予め決定された抗原に関する向上した親和性を有するヒト化抗体およびヒト化抗体を生成するための技法が開示されている、米国特許第６，１８０，３７０号、およびＰＣＴ国際公開第０１／２７１６０号も参照。

【0102】

“組み換えヒト抗体”または“完全ヒト抗体”は、ヒトにより産生された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、および／または当業者に既知の、もしくは本明細書で開示されるヒト抗体を作製するための技法のいずれかを用いて作製された抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも１個のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１種類のヒト軽鎖ポリペプチドを有する抗体を含む。１つのそのような例は、マウスの軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを有する抗体である。ヒト抗体は、当該技術で既知の様々な技法を用いて生成されることができる。例えば、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、ここで、そのファージライブラリーは、ヒト抗体を発現している(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227(2):381-388 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222(3):581-597 (1991))。ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン座位が内在性座位の代わりに遺伝子導入されている動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスの免疫処置により作製されることもできる。このアプローチは、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号において記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化することにより調製されることができる（そのようなＢリンパ球は、個人から、もしくはｃＤＮＡの単一細胞クローニングから回収されることができ、またはインビトロで免疫されていることもできる）。例えば、Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991);および米国特許第５，７５０，３７３号を参照。

【0103】

本発明の抗体は、当該技術で周知の技法、例えば組み換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術もしくはそのような技術の組み合わせまたは当該技術で容易に知られている他の技術を用いて生成されることができる（例えば、Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999)およびFellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40 (2007)を参照）。追加の手引きが、Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(1998);およびColigan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)において見付けられることができる。代表的な方法は、本明細書における下記の実施例１においても記載されている。

【0104】

一般に、ハイブリドーマ細胞株の産生に関して、宿主動物の免疫処置の経路およびスケジュールは、一般に抗体刺激および産生に関する確立された従来の技法と一致する。ヒトを含むあらゆる哺乳類の対象またはそれからの抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳類およびハイブリドーマの細胞株の生成のための基礎の役目を果たすために操作されることができることが意図されている。典型的には、宿主動物は、本明細書で記載されるような免疫原を含むある量の免疫原を、腹腔内に、筋内に、経口で、皮下に、足底内に、および／または皮内に接種される。

【0105】

ハイブリドーマは、リンパ球および不死化された骨髄腫細胞から、Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975の一般的な体細胞ハイブリッド形成技法、またはBuck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982により修正されたような体細胞ハイブリッド形成技法を用いて調製されることができる。Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびソーク研究所細胞流通センター（米国カリフォルニア州サンディエゴ）からの骨髄腫株を含むがそれらに限定されない利用可能な骨髄腫株が、ハイブリッド形成において用いられることができる。一般に、その技法は、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を、融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、または当業者に周知の電気的手段により融合させることを含む。融合後、細胞を融合媒体から分離し、ハイブリッド形成しなかった親細胞を排除するために、選択増殖媒体、例えばヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）媒体中で増殖させる。血清を補われた、または補われていない本明細書で記載された媒体の全てが、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために用いられることができる。細胞融合技法に対する別の代替案として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞が、本発明のＰＴＫ７モノクローナル抗体を生成するために用いられることができる。ハイブリドーマは、所望であれば、拡張およびサブクローニングされ、上清が、従来の免疫アッセイ手順（例えば放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）により抗免疫原活性に関してアッセイされる。抗体の源として用いられることができるハイブリドーマは、ＰＴＫ７またはその一部に特異的なモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての派生物、子孫細胞を包含する。

【0106】

そのような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の手順を用いてインビトロまたはインビボで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、所望であれば、培地または体液から、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過により単離されることができる。望まれない活性は、存在する場合、例えば、調製物を固相に結合した免疫原から作られた吸着剤上を流し、所望の抗体を免疫原から溶離する、または遊離させることにより除去されることができる。免疫される予定の種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターに、二官能性薬剤または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通したコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通したコンジュゲーション）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、またはＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ^１は異なるアルキル基である）を用いてコンジュゲートさせたヒトＰＴＫ７または標的アミノ酸配列を含有する断片を用いた宿主動物の免疫処置は、抗体（例えばモノクローナル抗体）の集団をもたらし得る。

【0107】

所望であれば、対象のＰＴＫ７抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）は、配列決定されることができ、次いでそのポリヌクレオチド配列は、発現または増殖のためにベクター中にクローニングされることができる。対象の抗体をコードしている配列は、宿主細胞においてベクター中で維持されることができ、次いで宿主細胞は拡張され、将来の使用のために凍結されることができる。細胞培養における組み換えモノクローナル抗体の生成は、当該技術で既知の手段による抗体遺伝子のＢ細胞からのクローニングにより実施されることができる。例えば、Tiller et al., J. Immunol. Methods 329:112-124 (2008);米国特許第７，３１４，６２２号を参照。

【0108】

“宿主細胞”は、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのためのベクター（単数または複数）のための受容者であることができる、または受容者であった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、天然、偶発的、または故意の変異のため、必ずしも元の親細胞と（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）完全に同一ではない可能性がある。宿主細胞は、インビボで本発明のポリヌクレオチド（単数または複数）をトランスフェクションされた細胞を含む。

【0109】

用語“ベクター”は、宿主細胞において対象の１以上の遺伝子（単数または複数）または配列（単数または複数）を送達する、好ましくは発現することができるコンストラクトを意味する。ベクターの例は、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性凝縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞を含むが、それらに限定されない。

【0110】

用語“発現制御配列”は、核酸の転写を方向付ける核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば構成的もしくは誘導性プロモーター、またはエンハンサーであることができる。発現制御配列は、転写されるべき核酸配列に作動的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されている。

【0111】

あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を“ヒト化する”ための、または抗体の親和性もしくは他の特徴を向上させるための遺伝子操作のために用いられることができる。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および処置において用いられる場合、免疫応答を避けるために、ヒトの定常領域により近く似るように操作されることができる。ＰＴＫ７に対するより大きな親和性およびＰＴＫ７の阻害におけるより大きな有効性を得るために、抗体配列を遺伝子操作することが望ましい可能性がある。

【0112】

モノクローナル抗体をヒト化するために用いられることができる４つの一般的な工程が存在する：（１）出発する抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を決定する、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、どの抗体フレームワーク領域をヒト化プロセスの間に用いるかを決定する、（３）実際のヒト化方法論／技法、ならびに（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，８０７，７１５号；第５，８６６，６９２号；第６，３３１，４１５号；第５，５３０，１０１号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；第５，５８５，０８９号；および第６，１８０，３７０号を参照。

【0113】

ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、移植、短縮されたＣＤＲの移植、特異性決定領域（ＳＤＲ）の移植、および下記で記載されるようなフランケンシュタイン組み立て（Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を含む様々な方法のいずれか１つを用いて調製されることができる。ヒト化抗体は、１以上の変化がＣＤＲ中に導入されている超ヒト化抗体（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）も含む。例えば、ヒトの残基が、ＣＤＲにおいて非ヒト残基の代わりに用いられることができる。これらの一般的なアプローチは、あらゆる所望の配列の抗ＰＴＫ７抗体を生成するために標準的な変異誘発および合成技法と組み合わせられることができる。

【0114】

ベニヤリングは、齧歯類または他の非ヒト抗体中の免疫原性である可能性のあるアミノ酸配列を、その抗体の溶媒が接近し得る外側をヒトのアミノ酸配列で再表面形成する（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）ことにより低減する概念に基づいている。従って、ベニヤリングされた抗体は、未改変の非ヒト抗体よりもヒト細胞に対して異質ではないように見える。Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98を参照。非ヒト抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域中の同じ位置の残基とは異なる非ヒト抗体中の露出した外側のフレームワーク領域残基を同定し、同定された残基をヒト抗体中のこれらの同じ位置を典型的に占めているアミノ酸で置き換えることによりベニヤリングされる。

【0115】

ＣＤＲの移植は、受容抗体（例えば所望のフレームワーク残基を有するヒト抗体または他の抗体）の１個以上のＣＤＲを供与抗体（例えば非ヒト抗体）のＣＤＲで置き換えることにより実施される。受容抗体は、候補受容抗体および供与抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択されることができる。例えば、フランケンシュタインアプローチに従って、ヒトのフレームワーク領域は、関連する非ヒト抗体のそれぞれのフレームワーク領域に対する実質的な配列相同性を有するものとして同定され、非ヒト抗体のＣＤＲが、異なるヒトフレームワーク領域の複合物上に移植される。やはり本発明の抗体の調製のために有用である関連する方法が、米国特許第７，３２１，０２６号において記載されている。

【0116】

短縮されたＣＤＲの移植は、関連するアプローチである。短縮されたＣＤＲは、特異性決定残基および隣接するアミノ酸を含み、それは軽鎖中の２７ｄ〜３４位、５０〜５５位および８９〜９６位、ならびに重鎖中の３１〜３５ｂ位、５０〜５８位、および９５〜１０１位（(Kabat et al. (1987)の番号付けの慣習）の特異性決定残基および隣接するアミノ酸を含む。(Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9)を参照。特異性決定残基（ＳＤＲ）の移植は、抗体結合部位の結合特異性および親和性が、相補性決定領域（ＣＤＲ）のそれぞれの内部の最も高度に可変性の残基により決定されるという理解を前提としている。抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、入手可能なアミノ酸配列データの分析と合わせて、ＣＤＲ内のそれぞれの位置において生じるアミノ酸残基の構造的相違に基づいて配列の変動性をモデル化する（ｍｏｄｅｌ）ために用いられることができる。ＳＤＲは、接触残基からなる最小限の免疫原性ポリペプチド配列として同定される。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照。

【0117】

一般に、ヒトの受容フレームワークは、それらが供与抗体のフレームワーク領域に実質的に類似している、またはそれが可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に最も類似していることに基づいて選択される。移植後に、フレームワーク領域中への非ヒト残基の導入を含む追加の変更が、抗体の結合、機能性、コドン使用率、発現レベル等を最適化するために、供与および／または受容配列中になされることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号を参照。

【0118】

ＣＤＲの重鎖可変フレームワーク領域上への移植に関して、有用なフレームワーク配列は、ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）に由来することができる。ＣＤＲの軽鎖可変フレームワーク領域上への移植に関して、有用なフレームワーク配列は、ＤＰＫ２４下位群ＩＶ生殖細胞系列クローン、Ｗｉｌｌ下位群（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩ下位群生殖細胞系列クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）に由来することができる。

【0119】

抗原結合断片または抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解により、上記のような組み換え的方法（すなわち単一のポリペプチドまたは融合ポリペプチド）により、または化学合成により生成されることができる。抗体のポリペプチド、特に約５０アミノ酸までのより短いポリペプチドは、化学合成により好都合に作製される。化学合成の方法は、当該技術で既知であり、商業的に入手可能である。例えば、抗体または抗体断片は、固相法を用いる自動化されたポリペプチド合成装置により生成されることができるであろう。米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第６，３３１，４１５号も参照。

【0120】

本発明の他の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ｈｕ２３、ｈｕ２４、もしくはｈｕ５８重鎖および／または軽鎖可変領域、またはｈｕ２３、ｈｕ２４、もしくはｈｕ５８重鎖もしくは軽鎖可変領域に実質的に類似した可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。

【0121】

ポリペプチドに適用される際、用語“実質的同一性”または“実質的類似性”は、２つのアミノ酸配列が、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、プログラムに供給されているような初期設定のギャップウェイトを用いて最適に整列させた場合に、少なくとも７０％、７５％または８０％の配列の同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列の同一性、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。一部の実質的に類似のアミノ酸配列において、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている。

【0122】

実質的に類似のポリペプチドは、１個以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されている保存的に置換されたバリアントも含む。保存的置換の例は、ある非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの、別の非極性（疎水性）残基に関する置換；ある極性（親水性）残基の別の極性（親水性）残基に関する置換、例えばアルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、グリシンおよびセリン間での置換；ある塩基性残基、例えばリジン、アルギニンもしくはヒスチジンの別の塩基性残基に関する置換；またはある酸性残基、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の別の酸性残基に関する置換を含む。

【0123】

２つのタンパク質が実質的に同一であることのさらなる指標は、それらが全体の三次元構造を共有していること、または生物学的機能的均等物であることである。
本発明のある側面において、ＰＴＫ７に結合する抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２５、または４９のいずれか１つとして示されている重鎖可変領域および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、３９、または６３のいずれか１つとして示されている軽鎖可変領域を有する抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５として示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片を含むことができる。別の例として、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９として示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片を含むことができる。別の例として、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９として示されている重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３として示されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片を含むことができる。

【0124】

抗体は、例えば重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて、例えば抗体の結合特性を変化させるために改変されることもできる。例えば、ＣＤＲ領域の１個以上において、その抗体のＰＴＫ７に関するＫ_Ｄを増大もしくは低下させるために、ｋ_ｏｆｆを増大もしくは低下させるために、またはその抗体の結合特異性を変化させるために、変異がなされることができる。部位特異的変異誘発における技法は、当該技術で周知である。例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.（上記）を参照。

【0125】

改変または変異は、ＰＴＫ７抗体の半減期を増大させるためにフレームワーク領域または定常領域においてなされることもできる。例えば、ＰＣＴ国際公開第００／０９５６０号を参照。フレームワーク領域または定常領域中の変異は、抗体の免疫原性を変化させるために、別の分子への共有結合的もしくは非共有結合的結合のための部位を提供するために、または補体結合、ＦｃＲ結合および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のような特性を変化させるためになされることもできる。本発明によれば、単一の抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域のあらゆる１個以上において、または定常領域において変異を有することができる。

【0126】

“生殖細胞系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）”として知られるプロセスにおいて、ＶＨおよびＶＬ配列中の特定のアミノ酸を、生殖細胞系列のＶＨおよびＶＬ配列中に天然に存在するアミノ酸と一致するように変異させることができる。特に、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を、その抗体が投与される際の免疫原性の危険性を低減するために、生殖細胞系列の配列と一致するように変異させることができる。本明細書で用いられる際、用語“生殖細胞系列”は、抗体遺伝子および遺伝子断片の、それらが親から子に生殖細胞を介して渡された際のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。この生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程の間に組み替えおよび超変異事象により変化している成熟Ｂ細胞中の抗体をコードしているヌクレオチド配列とは区別される。特定の生殖細胞系列を“利用する”抗体は、生殖細胞系列のヌクレオチド配列と、またはそれが指定するアミノ酸配列と最も近く整列するヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有する。そのような抗体は、しばしば、生殖細胞系列の配列と比較して変異している。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子に関する生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、当該技術で既知である（例えば、“Ｖｂａｓｅ”ヒト生殖細胞系列配列データベースを参照；Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992;およびCox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994も参照）。

【0127】

なされることができる別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去するためのものである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中または定常領域中に存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物における不均質性の危険性を低下させ、従ってその均質性を増大させることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的な脱アミド部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、その残基の一方または両方を変更することにより排除することである。別の例において、本発明のＰＴＫ７抗体の重鎖のＣ末端リジンは、切断されることができる。本発明の様々な側面において、ＰＴＫ７抗体の重鎖および軽鎖は、場合によりシグナル配列を含むことができる。

【0128】

本発明のＰＴＫ７抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片が、まず上記の方法のいずれかを用いて得られることができる。当該技術で既知であるように、“ポリヌクレオチド”、“核酸／ヌクレオチド”、および“オリゴヌクレオチド”は、本明細書において互換的に用いられており、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのどちらでもよい）、その類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖中に組み込まれることができるあらゆる基質を含む。ポリヌクレオチドは、あらゆる三次元構造を有することができ、既知または未知のあらゆる機能を実施することができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、天然存在ポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、組み換えポリヌクレオチド、またはそれらのあらゆる組み合わせであることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する改変は、鎖の組み立ての前または後に与えられることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素により遮られることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば標識構成要素とのコンジュゲーションによりさらに改変されることができる。他のタイプの改変は、例えば、“キャップ”、天然存在ヌクレオチドの１個以上の類似体による置換、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電連結（例えばメチルホスホネート類、ホスホトリエステル類、ホスホルアミデート類、カルバメート類等）による、および荷電した連結（例えばホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類等）による改変、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リジン等）のようなペンダント部分を含有する改変、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレン等）による改変、キレーター（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有する改変、アルキル化剤を含有する改変、改変された連結（例えばアルファアノマー核酸等）による改変、ならびにポリヌクレオチド（単数または複数）の非改変形態を含む。さらに、糖中に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えばホスホネート基、ホスフェート基により置き換えられる、標準的な保護基により保護される、もしくは追加のヌクレオチドへの追加の連結を用意するために活性化されることができ、または固体支持体にコンジュゲートされることもできる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化されていることができ、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機性キャッピング基部分により置換されていることもできる。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化されることができる。ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、アルファまたはベータアノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース類、非環式類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドを含む、当該技術で一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもできる。１個以上のホスホジエステル結合が、代替の連結基により置き換えられることができる。これらの代替の連結基は、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（“チオエート”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ジチオエート”）、（Ｏ）ＮＲ_２（“アミデート”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（“ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）”）により置き換えられている特徴を含むが、それに限定されず、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は、独立してＨ、または場合によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルキルを含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全部の結合が同一である必要はない。先行する記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。

【0129】

抗ＰＴＫ７抗体重鎖および軽鎖可変領域をコードする代表的なＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ｈｕ２３ ＶＨ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６（ｈｕ２３ ＶＬ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６（ｈｕ２４ ＶＨ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（ｈｕ２４ ＶＬ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０（ｈｕ５８ ＶＨ ＤＮＡ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４（ｈｕ５８ ＶＬ ＤＮＡ）として示されている。抗ＰＴＫ抗体重鎖および軽鎖をコードする代表的なＤＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４（ｈｕ２３ ＨＣ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４（ｈｕ２３ ＬＣ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８（ｈｕ２４ ＨＣ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８（ｈｕ２４ ＬＣ ＤＮＡ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ｈｕ５８ ＨＣ ＤＮＡ）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２（ｈｕ５８ ＬＣ ＤＮＡ）として示されている。

【0130】

様々な改変、例えば変異、置換、欠失、および／または付加が、当業者に既知の標準的な方法を用いてｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８ ＤＮＡ配列中に導入されることもできる。例えば、変異誘発、例えば、変異したヌクレオチドが、ＰＣＲ産物が所望の変異を含有するようにＰＣＲプライマー中に組み込まれる、ＰＣＲに媒介される変異誘発、または部位特異的変異誘発が、標準的な方法を用いて実施されることができる。

【0131】

従って、本出願の開示に基づいて、当業者は、ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８ ＤＮＡに実質的に類似したＤＮＡの配列を容易に認識するであろう。用語“実質的類似性”または“実質的配列類似性”は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させた際に、あらゆる周知の配列同一性のアルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐにより測定した場合にヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを意味する。

【0132】

核酸配列の文脈における用語“パーセント配列同一性”は、最大一致に関して整列させた際に同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８またはより多くのヌクレオチドにわたることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いられることができる、当該技術で既知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較されることができ、それはＷｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン中のプログラムである。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、クエリー配列および検索配列の間の最高の重複の領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998);それは参照により本明細書にそのまま援用される)。別途明記されない限り、個々のプログラムまたはアルゴリズムに関する初期設定のパラメーターが用いられる。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＦＡＳＴＡをその初期設定のパラメーター（６のワードサイズおよびスコア行列に関してＮＯＰＡＭ因子（ＮＯＰＡＭ ｆａｃｔｏｒ））と共に用いて、またはＧａｐをＧＣＧバージョン６．１において提供されているようなその初期設定のパラメーターと共に用いて決定されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0133】

２つの核酸配列が実質的に同一であるというさらなる指標は、その核酸によりコードされるタンパク質が実質的に同一であること、全体的な三次元構造を共有していること、または生物学的機能的均等物であることである。これらの用語は、本明細書において下記でさらに定義される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が遺伝子コードにより許容されるような保存的に置換されたバリアントを含む場合に起こり得る。

【0134】

保存的に置換されたバリアントは、１以上の選択された（または全部の）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換される、縮重コドン置換を有する核酸配列である。Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およびRossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98を参照。

【0135】

例えば、なされることができる１つのタイプの置換は、化学的に反応性であり得る抗体中の１個以上のシステインを、別の残基、例えば（限定ではなく）アラニンまたはセリンに変更することである。例えば、非カノニカル（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）システインの置換が存在することができる。その置換は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域中で、または定常領域中でなされることができる。別の例として、そのシステインは、カノニカルであることができる。

【0136】

一度本発明のＶＨおよびＶＬ区間をコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組み換えＤＮＡ技法により、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換するためにさらに操作されることができる。これらの操作において、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば抗体定常領域または柔軟なリンカーをコードする別のＤＮＡ断片に、作動的に連結される。用語“作動的に連結される”は、この文脈において用いられる際、２個のＤＮＡ断片が、その２個のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように繋がれることを意味することが意図されている。

【0137】

ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換されることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術で既知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であることができるが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体間で生じることが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプ、例えばＧｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）のいずれであることもできる。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の自然発生アミノ酸置換に相当する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結されることができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれに由来することもできる。

【0138】

ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動的に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術で既知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省、NIH公開番号91-3242を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得られることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であることができる。カッパ定常領域は、異なる個体間で生じることが知られている様々な対立遺伝子、例えばＩｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）のいずれであることもできる。ラムダ定常領域は、３つのラムダ遺伝子のいずれに由来することもできる。

【0139】

ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片は、柔軟なリンカーをコードする別の断片に、ＶＨおよびＶＬ配列が連続した一本鎖のタンパク質として発現されることができ、ＶＬおよびＶＨ領域が柔軟なリンカーにより繋がれるように、作動的に連結される（例えば、Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554を参照）。一本鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが用いられる場合は一価、２つのＶＨおよびＶＬが用いられる場合は二価、または２つより多くのＶＨおよびＶＬが用いられる場合は多価であることができる。ＰＴＫ７に、および別の分子に特異的に結合する二特異性または多価抗体が生成されることができる。

【0140】

本発明の別の側面において、別のポリペプチドに連結された本発明のＰＴＫ７抗体の全部または一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンが、作製されることができる。別の側面において、ＰＴＫ７抗体の可変ドメインのみが、ポリペプチドに連結される。別の側面において、ＰＴＫ７抗体のＶＨドメインが、第１ポリペプチドに連結され、一方でＰＴＫ７抗体のＶＬドメインが、第１ポリペプチドと会合する第２ポリペプチドに、ＶＨおよびＶＬドメインが互いと相互作用して抗原結合部位を形成することができるような様式で連結される。別の側面において、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いと相互作用することができるように、リンカーによりＶＬドメインから分離されている。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象のポリペプチドに連結される。加えて、２個（またはより多く）の一本鎖抗体が互いに連結されている融合抗体が、作製されることができる。これは、単一のポリペプチド鎖上に二価または多価抗体を作製したい場合、または二特異性抗体を作製したい場合に有用である。

【0141】

他の改変された抗体が、ＰＴＫ７抗体をコードする核酸分子を用いて調製されることができる。例えば、“カッパボディ（Ｋａｐｐａ ｂｏｄｉｅｓ）”(Ill et al., Protein Eng. 10:949-57, 1997)、“ミニボディ”(Martin et al., EMBO J., 13:5303-9, 1994)、“ダイアボディ”(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993)、または“ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）”(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991およびTraunecker et al., Int. J. Cancer (補遺) 7:51-52, 1992)が、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学の技法を用いて調製されることができる。

【0142】

二特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む様々な方法により生成されることができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990, Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992を参照。加えて、二特異性抗体は、“ダイアボディ”または“ジャヌシン”として形成されることができる。本発明のある側面において、二特異性抗体は、ＰＴＫ７の２つの異なるエピトープに結合する。他の側面において、上記の改変された抗体は、本明細書で提供されるＰＴＫ７抗体からの可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１個以上を用いて調製される。

【0143】

抗体−薬物コンジュゲートの調製における使用に関して、本明細書で記載されるＰＴＫ７抗体は、実質的に純粋である、すなわち少なくとも５０％純粋である（すなわち汚染物質を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋である、より好ましくは少なくとも９５％純粋である、さらにもっと好ましくは少なくとも９８％純粋である、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であることができる。

【0144】

表１は、本発明のヒト化坑ＰＴＫ７抗体のアミノ酸（タンパク質）配列および関係する核酸（ＤＮＡ）配列を提供する。Ｋａｂａｔにより、およびＣｈｏｔｈｉａにより定められたｈｕ２３ ＶＨ、ｈｕ２３ ＶＬ、ｈｕ２４ ＶＨ、ｈｕ２４ ＶＬ、ｈｕ５８ ＶＨ、およびｈｕ５８ ＶＬのＣＤＲは、別々の配列として示されている。

【0145】

【表1-1】

【0146】

【表1-2】

【0147】

【表1-3】

【0148】

【表1-4】

【0149】

【表1-5】

【0150】

【表1-6】

【0151】

【表1-7】

【0152】

ＩＩ．Ｂ． リンカー
本発明の抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、薬物を抗ＰＴＫ７抗体に連結またはコンジュゲートするためのリンカーを用いて調製されることができる。リンカーは、薬物および抗体を連結して抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために用いられることができる二官能性化合物である。そのようなコンジュゲートは、例えば、腫瘍関連抗原に対して向けられた免疫コンジュゲートの形成において有用である。そのようなコンジュゲートは、細胞毒性薬物の腫瘍細胞への選択的送達を可能にする。適切なリンカーは、例えば、切断可能および切断不能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、典型的には細胞内条件の下で切断を受けやすい。コンジュゲートされた薬物が抗体から切断される主な機序は、リソソームの酸性ｐＨにおける加水分解（ヒドラゾン類、アセタール類、およびシス−アコニテート様アミド類）、リソソーム酵素（カテプシン類および他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元を含む。切断に関するこれらの様々な機序の結果として、薬物を抗体に連結する機序も広く異なり、あらゆる適切なリンカーが用いられることができる。

【0153】

適切な切断可能なリンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼ、例えばリソソーム性プロテアーゼまたはエンドソーム性プロテアーゼにより切断されることができるペプチドリンカーを含む。本発明の側面において、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えばバリン-シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーであることができる。別の側面において、リンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｍｃｃ）であることができる。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して起こり、一方でそのスルホ−ＮＨＳエステルは、（リジンおよびタンパク質またはペプチドのＮ末端にあるような）第一級アミンに対して反応性である。さらに、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）であることができる。

【0154】

他の適切なリンカーは、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えばヒドラゾンリンカーを含む。追加の適切な切断可能なリンカーは、ジスルフィドリンカーを含む。リンカーは、薬物が遊離されるために抗体が細胞内で分解されなければならないような程度まで、抗体に共有結合していることができる（例えばｍｃリンカー等）。

【0155】

本発明の特定の側面において、本発明のＰＴＫ抗体−薬物コンジュゲートのリンカーは、マレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）、マレイミドカプロイル（ｍｃ）またはＡｃＢｕｔであることができる。

【0156】

適切なコンジュゲーション手順の一例は、ヒドラジドおよび他の求核種の、抗体上に天然に存在する炭水化物の酸化により生成されるアルデヒドへのコンジュゲーションに頼っている。ヒドラゾンを含有するコンジュゲートは、所望の薬物放出特性を提供する導入されたカルボニル基を用いて作製されることができる。コンジュゲートは、一方の末端にジスルフィド、中央にアルキル鎖、そして他方の末端にヒドラジン誘導体を有するリンカーを用いて作製されることもできる。アントラサイクリン類は、この技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる細胞毒素の一例である。

【0157】

ヒドラゾン類以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境中で切断される可能性を有する。例えば、コンジュゲートは、細胞内で切断可能であるヒドラゾン以外の部位、例えばエステル、アミド、および／またはアセタール／ケタールを含有するチオール反応性リンカーから作られることができる。カンプトテシンは、これらのリンカーを用いてコンジュゲートさせることができる１つの細胞毒性剤である。５〜７員環ケトンから作られ、細胞毒性剤に結合した酸素の一方および抗体の結合のためのリンカーに結合した酸素の他方を有するケタールも、用いられることができる。アントラサイクリン類は、これらのリンカーと共に用いられるための適切な細胞毒素の一例でもある。

【0158】

ｐＨ感受性リンカーのクラスの別の例は、シス−アコニテート類であり、それは、アミド結合に並列されたカルボン酸を有する。カルボン酸は、酸性リソソームにおけるアミド加水分解を加速する。いくつかの他のタイプの構造により類似のタイプの加水分解速度の加速を達成するリンカーも、用いられることができる。メイタンシノイド類は、Ｃ−９において結合したリンカーとコンジュゲートさせることができる細胞毒素の一例である。

【0159】

薬物コンジュゲートに関する別の可能性のある遊離法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素的加水分解である。一例において、ペプチドは、アミド結合を介してパラ−アミノベンジルアルコールに結合し、次いでカルバメートまたはカーボネートが、ベンジルアルコールおよび細胞毒性剤の間で作られる。ペプチドの切断は、アミノベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊、または自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｏｎ）をもたらす。この戦略を用いて例示される細胞毒性剤は、アントラサイクリン類、タキサン類、マイトマイシンＣ、およびオーリスタチン類を含む。一例において、フェノールも、カルバメートの代わりにリンカーの崩壊により遊離されることができる。別のバリエーションにおいて、ジスルフィド還元が、パラ−メルカプトベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊を開始するために用いられる。

【0160】

抗体にコンジュゲートした細胞毒性剤の多くは、水中での可溶性を、たとえあるとしてもほとんど有さず、それは、コンジュゲートの凝集のため、コンジュゲートへの薬物装填を制限し得る。これを克服するための１つのアプローチは、リンカーに可溶性の基を付加することである。抗体に結合したＰＥＧ二酸、チオール−酸、またはマレイミド−酸、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはデュオカルマイシン類似体のアミンに対するアミド結合を有するリンカーを含む、ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作られたコンジュゲートが、用いられることができる。別の例は、細胞毒性剤に結合したＰＥＧ含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を組み込むアプローチは、薬物装填における凝集および制限の克服において有益である可能性がある。

【0161】

参照により本明細書にそのまま援用される米国特許第５，７７３，００１号は、カリケアマイシン類から調製された求核性薬物、特にヒドラジド類および関連する求核種と共に用いられることができるリンカーを開示している。これらのリンカーは、薬物およびリンカーの間で形成される結合が加水分解可能である際によりよい活性が得られる場合に特に有用である。これらのリンカーは、（１）抗体との反応のための基（例えばカルボン酸）、および（２）薬物との反応のためのカルボニル基（例えばアルデヒドまたはケトン）を含む２個の官能基を含有する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成することができる。この結合は、切断可能、加水分解可能であり、標的細胞への結合後の療法剤のコンジュゲートからの遊離を可能にする。本発明の特定の側面において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートのリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）であることができる。本発明の他の側面において、抗体−薬物コンジュゲートは、（３−アセチルフェニル）酢酸（ＡｃＰＡｃ）または４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（アミド）をリンカー分子として用いて調製されることができる。

【0162】

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステル類または他の比較可能なほどに活性化されたエステル類は、活性化された加水分解可能なリンカー−薬物部分を生成するために用いられることができる。他の適切な活性化エステル類の例は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ−ＮＨＳ（スルホン化ＮＨＳ）、ＰＦＰ（ペンタフルオロフェニル）、ＴＦＰ（テトラフルオロフェニル）、およびＤＮＰ（ジニトロフェニル）を含む。

【0163】

本発明のある側面において、抗体−薬物コンジュゲートは、カリケアマイシンまたはその誘導体、ＡｃＢｕｔリンカーおよび本発明の抗ＰＴＫ７抗体を反応させることにより調製される。例えば、米国特許第５，７７３，００１号を参照。ＡｃＢｕｔリンカーは、循環中で実質的に安定であるコンジュゲートを生成し、インビトロでヒト血漿中で３７℃においてアッセイされた際に１日あたりカリケアマイシンの推定２％を遊離する。そのコンジュゲートは、酸性リソソーム中でカリケアマイシンを遊離する。

【0164】

本発明のある側面において、ＡｃＢｕｔＣＭ部分は、当該技術で、例えばＰＣＴ国際公開第０８／１４７７６５号および米国特許第８，２７３，８６２号において記載されている方法およびプロセスを用いて生成されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。本発明のある側面において、ＡｃＢｕｔＣＭ部分は、米国仮出願第６１／８９９，６８２号において記載されているような向上した合成プロセスを用いて生成されることができ、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0165】

放射性同位体のコンジュゲーションに有用な代表的なリンカーは、ジエチレントリアミンペンタアセテート（ＤＴＰＡ）−イソチオシアネート、スクシンイミジル ６−ヒドラジニウム ニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）、およびヘキサメチルプロピレンアミンオキシム（ＨＭＰＡＯ）を含む(Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270;米国特許第６，０２４，９３８号)。あるいは、標的化分子は、放射性同位体が直接それに結合し得るように誘導体化されることができる(Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300)。ヨウ素化法も、当該技術で既知であり、代表的なプロトコルは、例えばKrenning et al. (1989) Lancet 1:242-4において、およびBakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9において見付けられることができる。

【0166】

ＩＩ．Ｃ． 薬物
開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの調製において有用な薬物は、生物学的または検出可能な活性を有するあらゆる物質、例えば療法剤、検出可能な標識、結合剤等、およびインビボで代謝されて有効薬剤になるプロドラッグを含む。薬物は、薬物誘導体であることもでき、ここで、薬物は、本発明の抗体とのコンジュゲーションを可能にするように官能化されている。開示される方法によれば、薬物は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられ、式中、（ａ）Ａｂは、ＰＴＫ７に結合する抗体、またはその抗原結合断片であり；そして（ｂ）Ｌ−Ｄは、リンカー−薬物部分であり、ここでＬはリンカーであり、そしてＤは薬物である。薬物対抗体比（ＤＡＲ）または薬物装填は、抗体あたりにコンジュゲートしている薬物（Ｄ）分子の数を示す。本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、１〜８の範囲内であるＤＡＲを有する。従って、本発明の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、１個の薬物分子（１のＤＡＲ）、または２個の薬物分子（２のＤＡＲ）、または３個の薬物分子（３のＤＡＲ）、または４個の薬物分子（４のＤＡＲ）、または５個の薬物分子（５のＤＡＲ）、または６個の薬物分子（６のＤＡＲ）、または７個の薬物分子（７のＤＡＲ）、または８個の薬物分子（８のＤＡＲ）を含むことができる。ＤＡＲは、様々な従来の手段、例えばＵＶ分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣにより決定されることができる。

【0167】

式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の組成物、バッチおよび／または配合物は、複数の抗体を含むことができ、それぞれの抗体は、特定の数の薬物分子にコンジュゲートしている（ＤＡＲ１〜８）。組成物、バッチおよび／または配合物は、平均ＤＡＲを有する。

【0168】

本発明の特定の側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約１〜約８の範囲の平均ＤＡＲ、例えば約２〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約３〜約６の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、または約５〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約６〜約８の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。ある側面において、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、約１の平均ＤＡＲ、または約２の平均ＤＡＲ、または約３の平均ＤＡＲ、または約４の平均ＤＡＲ、または約５の平均ＤＡＲ、または約６の平均ＤＡＲ、または約７の平均ＤＡＲ、または約８の平均ＤＡＲを有することができる。前記の平均ＤＡＲの範囲において用いられる際、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。

【0169】

さらに、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、約３〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。さらに、抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば３〜５の範囲の平均ＤＡＲ、３〜４の範囲の平均ＤＡＲ、または４〜５の範囲の平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。

【0170】

式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物は、ＤＡＲ分布により特性付けられることができる。ＤＡＲ分布は、ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物中に存在し得る様々なＡＤＣ種（例えばＤＡＲ１〜８）のパーセントまたは割合を提供する。ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、当該技術で既知の方法、例えばキャピラリー等電点分画法（ｃＩＥＦ）により決定されることができる。

【0171】

本発明の一側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般にＤＡＲ１〜８を有する広い範囲のＡＤＣ種を含有する広いＤＡＲ分布を有する高度に不均質なＡＤＣの混合物として特性付けられることができる。

【0172】

本発明の別の側面において、ＡＤＣの組成物、バッチ、および／または配合物のＤＡＲ分布は、一般に特定のＤＡＲ、例えばＤＡＲ３〜５を有する狭い範囲のＡＤＣ種を含有する狭いＤＡＲ分布を有する高度に均質な混合物として特性付けられることができる。

【0173】

例えば、療法剤は、癌細胞または活性化された免疫細胞に対して細胞毒性、細胞増殖抑制性、および／または免疫調節性作用を及ぼす薬剤である。療法剤の例は、細胞毒性剤、化学療法剤、細胞増殖抑制剤、および免疫調節剤を含む。化学療法剤は、癌の処置において有用な化合物である。

【0174】

療法剤は、それを必要とする対象において障害を処置または予防するために用いられることができる組成物である。本発明において有用な療法剤は、抗癌剤、すなわちＰＴＫ７発現細胞、例えば乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌；卵巣癌；結腸直腸癌；白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からの癌細胞において抗癌活性を有する薬剤を含む。

【0175】

代表的な療法剤は、細胞毒素、細胞毒性剤、および細胞増殖抑制剤を含む。細胞毒性作用は、標的細胞（単数または複数）の枯渇、排除および／または殺傷を指す。細胞毒性剤は、細胞に対して細胞毒性および／または細胞増殖抑制作用を有する薬剤を指す。細胞増殖抑制作用は、細胞増殖の阻害を指す。細胞増殖抑制剤は、細胞に対して細胞増殖抑制作用を有し、それにより細胞の特定の部分集合の増殖および／または拡張を阻害する薬剤を指す。

【0176】

追加の代表的な療法剤は、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、および細胞溶解性酵素（例えばＲＮアーゼ）を含む。薬剤は、療法的核酸、例えば免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤をコードする遺伝子を含むこともできる。これらの薬物の記述語は、互いに排他的ではなく、従って療法剤は、上記の用語の１以上を用いて記載されることができる。例えば、選択される放射性同位体は、細胞毒素でもある。療法剤は、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸、または誘導体として調製されることができる。一般に、放射性同位体を薬物として有するコンジュゲートは、放射性免疫コンジュゲートと呼ばれ、化学療法剤を薬物として有するコンジュゲートは、化学免疫コンジュゲートと呼ばれる。

【0177】

細胞毒性剤の例は、アントラサイクリン、オーリスタチン、ＣＣ−１０６５、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ヘミアステリン、およびそれらの立体異性体、同配体、類似体または誘導体を含むが、それらに限定されない。化学療法剤、植物毒素、他の生理活性タンパク質、酵素（すなわちＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光増感剤（すなわち光力学療法のためのもの）が用いられることもできる。一態様において、細胞毒性剤は、リボソーム不活性化タンパク質ではない。より具体的な態様において、細胞毒性剤は、サポリンではない。

【0178】

アントラサイクリン類は、細菌ストレプトマイセスに由来し、広い範囲の癌、例えば白血病、リンパ腫、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および肺癌を処置するために用いられてきた。典型的なアントラサイクリン類は、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわちアドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンを含むが、それらに限定されない。

【0179】

ドラスタチン類ならびにそれらのペプチド性類似体および誘導体であるオーリスタチン類は、抗癌および抗真菌活性を有することが示されている非常に強力な有糸分裂阻害剤である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号およびPettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, (1998)を参照。典型的なドラスタチン類およびオーリスタチン類は、ドラスタチン１０、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）を含むが、それらに限定されない。

【0180】

本発明のある側面において、参照により本明細書にそのまま援用されるＰＣＴ国際公開第２０１３／０７２８１３号において記載されているオーリスタチン類およびそれらのオーリスタチン類を製造する方法が、本明細書において用いられる。

【0181】

例えば、オーリスタチンは、次の構造を有する０１０１（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である：

【0182】

【化1】

【0183】

。
別の例において、オーリスタチンは、次の構造を有する８２６１（８２６１ ２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）である：

【0184】

【化2】

【0185】

。
デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞毒性効力を有するＤＮＡアルキル化剤である。Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995を参照。典型的なドラスタチン類およびオーリスタチン類は、（＋）−デュオカルマイシンＡおよび（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、ならびに（＋）−ＣＣ−１０６５を含むが、それらに限定されない。

【0186】

エンジイン類は、９および１０員環またはコンジュゲートした三重−二重−三重結合の環系の存在のどちらかにより特性付けられる抗腫瘍細菌製品のクラスである。典型的なエンジイン類は、カリケアマイシン、エスペラミシン、およびダイネミシンを含むが、それらに限定されない。

【0187】

本発明のある側面において、細胞毒性剤は、抗生物質、例えばカリケアマイシン（ＬＬ−Ｅ３３２８８錯体とも呼ばれる）、例えばβ−カリケアマイシン、γ−カリケアマイシンまたはＮ−アセチル−γ−カリケアマイシン（ガンマ−カリケアマイシン（γ_１））である。本発明における使用に適したカリケアマイシン類の例は、例えば、米国特許第４，６７１，９５８号、第４，９７０，１９８号、第５，０５３，３９４号、第５，０３７，６５１号、第５，０７９，２３３号および第５，１０８，９１２号において開示されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。これらの化合物は、メチルトリスルフィドを含有し、それは適切なチオール類と反応してジスルフィドを形成し、同時に官能基、例えばヒドラジドまたはカリケアマイシンを抗ＰＴＫ７抗体にコンジュゲートさせるために有用である他の官能基を導入することができる。カリケアマイシンのジスルフィド類似体、例えば米国特許第５，６０６，０４０号および第５，７７０，７１０号において記載されている類似体が用いられることもでき、それは参照により本明細書にそのまま援用される。本発明のある側面において、ジスルフィド類似体は、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（以下“ＣＭ”）である。

【0188】

ゲルダナマイシン類は、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合するベンゾキノンアンサマイシン系抗生物質であり、抗腫瘍薬として用いられてきた。典型的なゲルダナマイシン類は、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）を含むが、それらに限定されない。

【0189】

メイタンシン類またはそれらの誘導体であるメイタンシノイド類は、有糸分裂の間に微小管の形成をチューブリンの重合の阻害により阻害することにより、細胞の増殖を阻害する。Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975を参照。典型的なメイタンシン類およびメイタンシノイド類は、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体ならびにアンサミトシンを含むが、それらに限定されない。

【0190】

タキサン類は、抗チューブリン剤または有糸分裂阻害剤として作用するジテルペン類である。典型的なタキサン類は、パクリタキセル（例えばＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））を含むが、それらに限定されない。

【0191】

ビンカアルカロイド類も、抗チューブリン剤である。典型的なビンカアルカロイド類は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンを含むが、それらに限定されない。

【0192】

本発明のある側面において、薬剤は、免疫調節剤である。免疫調節剤の例は、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、グルココルチコイドおよびその類似体、サイトカイン類、キサンチン類、幹細胞増殖因子、リンホトキシン類、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、“Ｓ１因子”と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチン、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。

【0193】

本発明において有用な免疫調節剤は、腫瘍に対するホルモンの作用を遮断する抗ホルモン薬、およびサイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現を下方制御し、またはＭＨＣ抗原を覆い隠す免疫抑制剤も含む。代表的な抗ホルモン薬は、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェンを含む抗エストロゲン薬；ならびに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ ａｇｅｎｔｓ）を含む。代表的な免疫抑制剤は、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に関する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド類、例えば糖質コルチコステロイド類、サイトカインまたはサイトカイン受容体拮抗薬（例えば、抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、ならびにＴ細胞受容体抗体を含む。

【0194】

本発明のある側面において、薬物は、毒素、ホルモン、酵素、および増殖因子を含むがそれらに限定されない療法的タンパク質である。
毒素タンパク質（またはポリペプチド）の例は、ジフテリア（例えばジフテリアＡ鎖）、シュードモナス属の外毒素および内毒素、リシン（例えばリシンＡ鎖）、アブリン（例えばアブリンＡ鎖）、モデッシン（例えばモデッシンＡ鎖）、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、スタフィロコッカス属の腸毒素Ａ、ヨウシュヤマゴボウの抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、トリコテセン類（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えばセラトトキシン類（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎｓ））、ならびにコノトキシン（例えばＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）を含むが、それらに限定されない。

【0195】

ホルモンの例は、エストロゲン類、アンドロゲン類、プロゲスチン類およびコルチコステロイド類を含むが、それらに限定されない。
本発明のある側面において、細胞毒性薬剤は、リポソームまたは生体適合性ポリマーを用いて作られることができる。本明細書で記載されるような抗ＰＴＫ７抗体は、血清半減期および生理活性を増大させるために、および／またはインビボでの半減期を延長するために、生体適合性ポリマーにコンジュゲートさせることができる。生体適合性ポリマーの例は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体および双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えばホスホリルコリン含有ポリマー）を含む。

【0196】

本発明のある側面において、薬物は、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明において有用な追加の薬物は、血管形成を阻害する抗血管新生剤、例えばファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（例えば２−メトキシエストラジオールビス−スルファメート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスＩインターフェロン類、インターロイキン１２、プロタミン、アンジオスタチン、ラミニン、エンドスタチン、およびプロラクチン断片を含む。

【0197】

抗増殖剤およびアポトーシス促進剤は、ＰＰＡＲ−ガンマの活性化物質（例えばシクロペンテノンプロスタグランジン類（ｃｙＰＧ））、レチノイド類、トリテルペノイド類（例えばシクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリーデラン（ｆｒｉｅｄｅｌａｎｅ）、ダンマラン、ククルビタシン、およびリモノイドトリテルペノイド類）、ＥＧＦ受容体（例えばＨＥＲ４）の阻害剤、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（登録商標）（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾン（ｌｅｔｒｏｚｏｎｅ）））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレート剤（例えば３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（トリアピン））、アポプチン（ニワトリ貧血ウイルスからのウイルスタンパク質３−ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナル伝達の活性化物質、ならびにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル伝達の阻害剤（例えばＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）を含む。

【0198】

代表的な化学療法剤は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン類、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ；エチレンイミン類およびメチルアメラミン類（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含む）；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばアクラシノマイシン類、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン類、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＥＵ；アンドロゲン類、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ニュージャージー州プリンストンのＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、フランス、アントニーのＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類；ならびにカペシタビンを含む。

【0199】

本発明に従って用いられることができる追加の療法剤は、光力学療法のための光増感剤、例えば参照により本明細書にそのまま援用される米国特許第７，４９８，０２９号および米国特許第５，９５２，３２９号；温熱療法のための磁性粒子、例えば参照により本明細書にそのまま援用される米国特許第６，９９７，８６３号；結合剤、例えばペプチド、リガンド、細胞接着リガンド等、ならびにより活性な細胞毒性遊離薬物に変換されることができるプロドラッグ、例えばホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。

【0200】

抗ＰＴＫ７抗体を用いる診断法に関して、薬物は、ＰＴＫ７発現細胞の存在をインビトロまたはインビボで検出するために用いられる検出可能な標識を含むことができる。インビボで検出可能である放射性同位体、例えばシンチグラフィー、磁気共鳴画像化、または超音波を用いて検出可能であるそれらの標識は、臨床診断適用において用いられることができる。有用なシンチグラフィー標識は、陽電子放出体およびγ放出体を含む。磁気共鳴画像化のための代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤である。超音波検出に関して、ガスまたは液体が、多孔性の無機粒子中に捕捉されることができ、それは微小な泡の造影剤として放出される。インビトロ検出に関して、有用な検出可能な標識は、蛍光体、検出可能なエピトープまたは結合剤、および放射性標識を含む。

【0201】

従って、本発明のある側面において、薬物は、画像化剤（例えば蛍光体またはＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）標識、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピューター断層撮影）標識）、またはＭＲＩ（磁気共鳴画像化）標識である。

【0202】

用語“標識”は、本明細書で用いられる際、“標識された”抗体を生成するように抗体に直接または間接的にコンジュゲートされている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であることができ（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、または、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学変化を触媒することができる。検出可能な標識の役目を果たすことができる放射性核種は、例えばＩ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、およびＰｄ−１０９を含む。標識は、検出不能な実体、例えば毒素であることもできるであろう。

【0203】

蛍光体の例は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えばＡｌｅｘａ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば５−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えばＳＲ１０１）を含むが、それらに限定されない。

【0204】

療法用または診断用の放射性同位体または他の標識（例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ標識）が、本明細書で記載されるような抗ＰＴＫ７抗体へのコンジュゲーションのために薬剤中に組み込まれることができる。同位体は、抗体に直接、例えば抗体中に存在するシステイン残基において結合させることができ、または抗体および放射性同位体の結合を媒介するためにキレーターが用いられることができる。放射線療法に適した放射性同位体は、α−放出体、β−放出体、およびオージェ電子を含むが、それらに限定されない。診断適用に関して、有用な放射性同位体は、陽電子放出体およびγ−放出体を含む。本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、さらに、抗体の検出または療法作用を促進するために、例えば抗体のチロシン残基上でヨウ素化されることができる。

【0205】

放射性同位体または他の標識の例は、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７５Ｓｅ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９４Ｔｃ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１２１Ｔｅ、^１２２Ｔｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１２５Ｔｅ、^１２６Ｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^１３３Ｉ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１５３Ｐｂ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｔｍ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^１９７Ｐｔ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｈｇ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２４Ａｃ、および^２２５Ａｃを含むが、それらに限定されない。

【0206】

ＩＩ．Ｄ． ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法
本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製するための方法も、提供される。例えば、本明細書で開示されるようなＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを生成するためのプロセスは、（ａ）リンカーを薬物に連結し；（ｂ）そのリンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートさせ；そして（ｃ）その抗体−薬物コンジュゲートを精製することを含むことができる。ｖｃ０１０１およびｍｃ８２６１の合成のための代表的な方法が、実施例９において記載されており、抗ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１、抗ＰＴＫ７−ｍｃ８６２１ ＡＤＣおよび抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣのコンジュゲーションのための代表的な方法が、実施例１０において記載されている。

【0207】

一側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）リンカー−薬物部分（例えばｖｃ０１０１またはｍｃ８２６１）を抗ＰＴＫ７抗体またはその抗原結合断片に添加することにより調製されることができ、ここで、抗ＰＴＫ７抗体は、２〜１０モル過剰量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、６〜９のｐＨを有する１００ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤（ＨＥＰＥＳ）、および１ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含有する溶液中で、約０〜３７℃の範囲の温度において約３０分間〜１６時間の範囲の期間の間、部分的に還元されることができる。次いで、ｖｃ０１０１またはｍｃ８２６１のリンカー−ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）が、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）と共に約４〜１０のリンカー−ペイロード／抗体モル比で、約０〜３７℃の範囲の温度において約３０分間〜１６時間の範囲のインキュベーション期間の間、添加されることができる。続いて、未反応のチオールが、Ｎ−エチルマレイミドによりキャップされることができ、未反応のリンカー−ペイロードが、Ｌ−Ｃｙｓにより停止される（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）ことができる。

【0208】

別の側面において、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体−薬物コンジュゲートは、（ａ）リンカー−薬物部分（例えばＡｃＢｕｔＣＭ）を抗ＰＴＫ７抗体またはその抗原結合断片に添加し、ここで、抗体の濃度は、１〜２５ｍｇ／ｍｌの範囲であることができ、リンカー−薬物部分は、約１〜１５対１の抗ＰＴＫ７抗体の範囲のモル比であり；（ｂ）リンカー−薬物部分および抗ＰＴＫ７抗体を、非求核性、タンパク質適合性の約７〜９の範囲のｐＨを有する緩衝溶液中でインキュベートして単量体性抗体−薬物コンジュゲートを生成し、ここで溶液は、さらに（ｉ）適切な有機性共溶媒、および（ｉｉ）少なくとも１種類のＣ_６〜Ｃ_１８カルボン酸またはその塩を有する添加剤を含有し、ここで、そのインキュベーションは、約０℃〜約４５℃の範囲の温度で、約１分間〜約２４時間の範囲の期間の間実施され；そして（ｃ）工程（ｂ）において生成されたコンジュゲートに、クロマトグラフィー分離プロセスを施して、ＤＡＲ１〜８を有する抗体−薬物コンジュゲートを分離することにより調製されることができ；そして未コンジュゲート抗ＰＴＫ７抗体、リンカー−薬物部分、および凝集したコンジュゲートからの１０％未満の低コンジュゲート率（ｌｏｗ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＦ）を提供する。

【0209】

コンジュゲートの形成に関する最適な反応条件は、温度、ｐＨ、リンカー−ペイロード部分の入力、および添加剤の濃度のような反応変数の変動により経験的に決定されることができる。他の薬物のコンジュゲーションに適した条件は、当業者により、過度の実験操作なしで決定されることができる。

【0210】

ある側面において、薬物は、抗体上のコンジュゲーション箇所と反応する基を含むように修飾されることができる。例えば、薬物は、（例えばリジンのイプシロンアミノ基または抗体のＮ末端における）アルキル化、酸化された炭水化物の還元的アミノ化、ヒドロキシルおよびカルボキシル基間のエステル転移反応、アミノ基またはカルボキシル基におけるアミド化、ならびにチオールへのコンジュゲーションにより、結合することができる。ある態様において、抗体分子あたりにコンジュゲートする薬物（Ｄ）分子の数は、１〜８；１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、または１〜２の範囲である。他の態様において、抗体分子あたりにコンジュゲートする薬物（Ｄ）分子の数は、１、２、３、４、５、６、７または８である。ある態様において、複数の抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物は、平均ＤＡＲにより特性付けられることができる。平均ＤＡＲは、約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６、約１〜約５、約１〜約４；約１〜約３、約１〜約２の範囲である。ある態様において、複数の抗体−薬物コンジュゲートの組成物、バッチ、および／または配合物に関する平均ＤＡＲは、約２〜約８、約２〜約７、約２〜約６、約２〜約５、約２〜約４、約２〜約３または約３〜約５の範囲である。前記の平均ＤＡＲの範囲において用いられる際、用語“約”は、＋／−０．５％を意味する。コンジュゲーションのために用いられることができる化学の例に関して、例えばCurrent Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.)第１５章(Chemical Modifications of Proteins)を参照。

【0211】

抗体−薬物コンジュゲートを調製するための他の方法は、様々な刊行物において記載されてきた。例えば、化学修飾が、抗体において、リジン側鎖のアミンにより、またはコンジュゲーション反応が起こるために鎖間ジスルフィド結合を還元することにより活性化されたシステインのスルフヒドリル基により（どちらでもよい）なされることができる。例えば、Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005およびGentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004を参照。さらに、定められた化学量論を有する特定の薬物コンジュゲーションに関する抗体の特定の部位において設計された反応性システイン残基も、記載されてきた。例えば、Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008を参照。

【0212】

さらに、国際公開第２０１３／０９３８０９号において記載されているように、抗体の重鎖のＣＨ２もしくはＣＨ３ドメインの表面上に、もしくは軽鎖の定常ドメイン上におそらく存在する、または他の様式で利用可能である特定の残基が、天然存在の野生型アミノ酸の例えばシステインによる置換に適しており、従って様々な薬剤へのコンジュゲーションが可能な部位を設計するために有用である。

【0213】

ある側面において、本発明の設計されたＦｃポリペプチドは、抗体またはその断片がそれにより設計された残基（すなわち、野生型の未改変のＦｃと比較して置換されたアミノ酸）において多種多様な薬剤をコンジュゲートさせるために用いられることができる設計されたＦｃ領域を含むように、ＰＴＫ抗体または抗体−薬物コンジュゲートを調製するために用いられることができる。

【0214】

本発明のＰＴＫ抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、親、天然、または野生型抗体の抗体重鎖（ＨＣ）の３４７、３９２、３９８、４２２および４４３位から選択される１個、２個、またはより多くのアミノ酸が別のアミノ酸（天然および非天然／合成アミノ酸を含む）で置換されている設計されたＦｃポリペプチドを包含することができ、ここで、定常領域の番号付けシステムは、Ｋａｂａｔに従うＥＵ指針の番号付けである。

【0215】

Ｆｃポリペプチド中の単一の置換、例えばシステイン残基の置換は、通常は、ＩｇＧ抗体分子のホモ２量体の性質のため、結果として生じるＩｇＧ抗体における２個の対応する残基の提示をもたらすことは、特筆されるべきである。従って、結果として生じる本発明の設計されたＩｇＧ抗体は、薬物または化合物へのコンジュゲーションの目的のための少なくとも１個、２個、３個、４個、またはより多くの反応性の基を示し得る。一側面において、置換の１以上は、システイン残基により、結果として生じる設計された抗体は、薬物または化合物へのコンジュゲーションの目的のための少なくとも１個、２個、３個、４個、またはより多くのチオール基を示し得る。

【0216】

別の側面において、本開示の設計されたＦｃポリペプチドは、抗体の重鎖（ＨＣ）の３４７、３９２、３９８、４２２および４４３位から選択される１個以上の置換を含むことができ、ここで、定常領域の番号付けシステムは、Ｋａｂａｔにおいて述べられているＥＵ指針の番号付けであり、ここで、重鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１からなる群から選択される。

【0217】

本発明のＰＴＫ抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、設計された抗体軽鎖定常領域（ＬＣ）、またはその一部を含むことができ、ここで、親、天然、または野生型抗体の抗体軽鎖の１１１、１８３、または１８８位（ここで軽鎖定常領域の番号付けシステムは、Ｋａｂａｔの番号付けシステムである）から選択される１個、２個、または３個のアミノ酸は、別のアミノ酸（天然および非天然／合成アミノ酸を含む）で置換されている。

【0218】

ある側面において、本開示の設計されたＬＣポリペプチドは、抗体軽鎖の１１１、１８３、または１８８位からの１個以上の置換を含み、ここで、軽鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１からなる群から選択される。

【0219】

他の側面において、多くの抗体の２量体の性質のため（例えば、ＩｇＧは２個の軽鎖および２個の重鎖を含み、それぞれの重鎖はＦｃポリペプチドを含む）、本発明の抗体は、少なくとも１個の設計されたＦｃポリペプチドを含むことができ、さらに少なくとも１個の設計された軽鎖定常ポリペプチドを含むことができ、それにより少なくとも２個の部位特異的コンジュゲーション部位（１個はＦｃポリペプチド中、別の部位はＬＣポリペプチド中）を提供することができる。

【0220】

本発明のある側面において、開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１重鎖定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されているｈｕ２３重鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されているｈｕ２４重鎖、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されているｈｕ５８重鎖を含む。他の側面において、開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの抗体またはその抗原結合断片は、カッパ軽鎖定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されているｈｕ２３軽鎖、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されているｈｕ２４軽鎖、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されているｈｕ５８軽鎖を含む。本発明の特定の側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＩｇＧ１重鎖定常領域およびカッパ軽鎖定常領域、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３として示されている軽鎖；または別の例としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７として示されている軽鎖；または別の例としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１として示されている重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１として示されている軽鎖を含むことができる。

【0221】

また、国際公開第２０１２／０５９８８２号において記載されているように、コンジュゲーション法は、トランスグルタミナーゼおよびアミン（例えば反応性アミンを含む、またはそれに結合した細胞毒性剤）の存在下でのアシル供与体グルタミン含有タグまたはポリペプチド工学により反応性にされた内在性のグルタミン（すなわち、アシル供与体として共有結合を形成する能力）の使用を含む。

【0222】

ある側面において、ＰＴＫ７抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７抗体の抗体の特定の部位（例えばカルボキシル末端、アミノ末端、または別の部位）において設計されたアシル供与体グルタミン含有タグを含むことができる。ある側面において、タグは、アミノ酸グルタミン（Ｑ）またはアミノ酸配列ＧＧＬＬＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）、ＬＬＱＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）、ＧＧＬＬＱＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、ＬＬＱ、ＬＬＱＧＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＬＬＱＧＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、ＬＬＱＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、ＬＬＱＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＬＬＱＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＬＬＱＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、ＬＬＱＧＡＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）、ＬＬＱＧＡＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、ＬＬＱＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、ＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５（ここで、Ｘ_１はＧまたはＰであり、ここでＸ_２はＡ、Ｇ、Ｐであるかまたは存在せず、ここでＸ_３はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｐであるかまたは存在せず、ここでＸ_４はＧ、Ｋであるかまたは存在せず、ここでＸ_５はＫであるかまたは存在しない（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６））、またはＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５（ここで、Ｘ_１はあらゆる天然存在アミノ酸であり、ここでＸ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、およびＸ_５はあらゆる天然存在アミノ酸であるかまたは存在しない（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７））を含む。ある態様において、ＰＴＫ７抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７抗体の２９７位においてアスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）へのアミノ酸置換を含むことができる。

【0223】

別の側面において、ＰＴＫ７抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、アシル供与体グルタミン含有タグおよび抗体の２２２、３４０、または３７０位（ＥＵ番号付けスキーム）におけるアミノ酸改変を含むことができ、ここで、その改変は、アミノ酸の削除、挿入、置換、変異、またはそれらのあらゆる組み合わせである。従って、ある側面において、ＰＴＫ７抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７抗体の特定の部位において（例えば重鎖もしくは軽鎖のカルボキシル末端において、または別の部位において）コンジュゲートしたアシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、Ｑ、ＧＧＬＬＱＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）、ＬＬＱＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）、ＧＧＬＬＱＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、ＬＬＱ、ＬＬＱＧＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）、ＬＬＱＧＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）、ＬＬＱＧＰＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、ＬＬＱＧＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＬＬＱＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＬＬＱＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、ＬＬＱＧＡＰＧＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）、ＬＬＱＧＡＰＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）、ＬＬＱＧＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、ＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５（ここで、Ｘ_１はＧまたはＰであり、ここでＸ_２はＡ、Ｇ、Ｐであるかまたは存在せず、ここでＸ_３はＡ、Ｇ、Ｋ、Ｐであるかまたは存在せず、ここでＸ_４はＧ、Ｋであるかまたは存在せず、ここでＸ_５はＫであるかまたは存在しない（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６））、またはＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５（ここで、Ｘ_１はあらゆる天然存在アミノ酸であり、ここでＸ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、およびＸ_５はあらゆる天然存在アミノ酸であるかまたは存在しない（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）））および抗体の２２２、３４０、または３７０位（ＥＵ番号付けスキーム）におけるアミノ酸改変を含むことができる。

【0224】

抗体−薬物コンジュゲートあたりの薬物分子の数をさらに増大させるために、薬物は、直鎖または分枝状ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされることができる。ＰＥＧ単量体は、式：−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）−のものである。薬物および／またはペプチド類似体は、ＰＥＧに直接または間接的に、すなわち適切なスペーサー基、例えば糖類を通して結合していることができる。ＰＥＧ−抗体−薬物組成物は、インビボでの薬物安定性および標的部位への送達を促進するために、追加の親油性および／または親水性部分を含んでいることもできる。ＰＥＧ含有組成物を調製するための代表的な方法は、取り分け米国特許第６，４６１，６０３号；第６，３０９，６３３号；および第５，６４８，０９５号において見付けられることができる。

【0225】

例えば、本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート中のオーリスタチンまたはカリケアマイシンの量を増大させるために、抗体は、薬物とのコンジュゲーションの前に、例えばＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＢＡ、またはＰＥＧ−ビス−マレイミドを用いてＰＥＧにコンジュゲートされることができる。ＰＥＧを用いて調製された抗体−薬物コンジュゲートは、標的抗原に関する低減した結合親和性を示す可能性があるが、なお増大した薬物装填の結果として有効である。

【0226】

コンジュゲーションの後、コンジュゲートは、従来法により、未コンジュゲート反応物および／またはコンジュゲートの凝集形態から分離および精製されることができる。これは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／透析濾過、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、クロマトフォーカシング（ＣＦ）ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグラフィーのようなプロセスを含むことができる。分離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって成し遂げられることもできる。適切なＨＩＣ媒体は、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ ＨＩＣ媒体を含む。

【0227】

本発明のある側面において、分離は、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体を用いて実施されることができる。カスタマイズされた勾配を用いる場合、カラムに結合したままであるより高いＤＡＲの種が除去される。ある側面において、精製プロセスは、濃縮および配合のための、遠心分離細胞除去工程、場合によりプロテインＡ親和性捕捉工程、続いて１つまたは２つの直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）クロマトグラフィー仕上げ工程、ウイルス濾過工程、および接線流濾過工程を含むことができる。

【0228】

ＩＩＩ． ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ
本発明はさらに、ＰＴＫ７結合活性、細胞表面上に存在するＰＴＫ７抗原への結合後の細胞内在化、および対象中のＰＴＫ７発現細胞に対する標的化を含む、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの活性を特性付けるためのインビトロおよびインビボのアッセイを開示する。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、抗体またはその抗原結合断片の側面を中和する、または枯渇させることにより特性付けられる。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、代替の薬物の有効性の欠如と比較した場合の特定の薬物の予想外の有効性により特性付けられる。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、その薬物と同じ作用様式を有する標準治療の療法剤より性能が優れていることとして特性付けられる。

【0229】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートのＰＴＫ７抗原または他のＰＴＫ７抗原への結合を検出するための技法は、当該技術で既知であり、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイを含む。追加の代表的な技法は、遠心分離、親和性クロマトグラフィーおよび他の免疫化学的方法を含む。例えば、Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, 米国ニュージャージー州トトワ; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, アムステルダム/ニューヨークを参照。抗原結合アッセイは、単離されたＰＴＫ７抗原またはＰＴＫ７発現細胞を用いて実施されることができる。

【0230】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの結合特異性は、結合エピトープの定義、すなわち、抗原結合に参加する非隣接残基を含む残基の同定、および／または抗原結合に影響を及ぼす残基の定義によりさらに記載されることができる。

【0231】

ＰＴＫ７発現細胞によるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの内在化は、ＰＴＫ７発現細胞の表面に結合した抗体またはコンジュゲートの量を時間の経過にわたって観察することによりアッセイされることができる。例えば実施例７を参照。選択されたＰＴＫ７リガンドまたはそれらのイソ型は、可溶性形態で存在することができ、少なくとも一部のＰＴＫ７は、おそらく細胞表面と会合したままであり、それにより本明細書で開示される抗体の内在化を可能にする。従って、本発明の抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７を発現する細胞により内在化されることができる。例えば、腫瘍開始細胞の表面上のＰＴＫ７に結合する抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞により内在化されることができる。内在化されるＡＤＣ分子の数は、ＰＴＫ７発現細胞、特にＰＴＫ７発現腫瘍細胞を殺すために十分または適切であることができる。ＡＤＣの効力に応じて、ある場合では、単一のＡＤＣ分子の細胞中への取り込みは、ＡＤＣが結合している標的細胞を殺すために十分である。例えば、特定の毒素は、抗体にコンジュゲートしたその毒素の１分子の内在化が腫瘍細胞を殺すために十分であるように、殺傷において非常に強力である。

【0232】

ＰＴＫ７抗体の内在化は、細胞がＰＴＫ７抗体およびサポリン毒素にコンジュゲートしている二次抗体Ｆａｂ断片と共にインキュベートされる機能的アッセイを用いて評価されることができる。次いで、細胞の生存度が、あらゆる適切な方法により、抗体内在化を示す細胞性細胞毒性を用いて測定される。実施例７を参照。

【0233】

本発明のある側面において、開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの抗体、またはその抗原結合断片は、最も広い意味で用いられる際の“拮抗薬”、すなわち、本明細書で開示される天然の標的の生物学的活性またはその転写もしくは翻訳を部分的にまたは完全に遮断、阻害、または中和するあらゆる分子である。用語“阻害する”または“中和する”は、本明細書で本発明の抗体の生理活性に関して用いられる際、生物学的活性を含むがそれに限定されない阻害されているものの例えば進行または重症度に実質的に拮抗する、それを禁じる（ｐｒｏｈｉｂｉｔ）、予防する、抑制する、遅くする、混乱させる、排除する、停止する、低減する、または逆行させる抗体の能力を意味する。例えば、本発明のある側面において、抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲートの内在化の際に細胞の殺傷を促進する。例えば、中和抗体または拮抗薬は、好ましくはＰＴＫ７の機能を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはより大きく減少させるであろう。

【0234】

本発明の他の側面において、本発明の抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、枯渇化抗体（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）であることができる。枯渇化抗体という用語は、細胞表面上またはその付近のＰＴＫ７に結合して、またはそれと会合して、（例えば補体依存性細胞傷害または抗体依存性細胞性細胞傷害により）細胞の死または排除を誘導する、促進する、または引き起こす抗体を指す。好ましくは、枯渇化抗体は、定められた細胞集団中の腫瘍永続化細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％を除去する、排除する、または殺すことができるであろう。

【0235】

機能的アッセイは、抗体−薬物コンジュゲートの抗癌活性、例えば、既存の癌細胞を破壊する能力、または癌細胞の増殖を遅くする、もしくは妨げる能力を評価するための方法も含む。本発明の抗体−薬物コンジュゲートにより標的化される癌は、癌腫ならびに造血器悪性疾患、例えば白血病およびリンパ腫を含め、対象中のあらゆる組織の原発および転移腫瘍および癌腫の両方を含む。

【0236】

増殖阻害活性を有するＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＰＴＫ７発現細胞を排除する、またはＰＴＫ７発現癌細胞の増殖を予防もしくは低減することができる。細胞増殖阻害の迅速なインビトロ評価のための代表的な方法は、Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98において記載されている。

【0237】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、核ＤＮＡ分解、核分解および凝縮、膜の完全性の喪失、および食作用により特性付けられる細胞死、例えばプログラム細胞死を誘導する能力を含むこともできる。細胞を評価するための代表的なアッセイは、Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885において記載されている。

【0238】

例えば、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの細胞毒性をインビトロで評価するため、ＰＴＫ７発現癌細胞および対照細胞をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの存在下で培養し、別に遊離薬物と共に培養する。それぞれの薬剤の細胞毒性は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として報告され、それは、未処理の対照と比較して細胞培養物の５０％低減を引き起こすコンジュゲートとしてまたは遊離薬物として与えられた薬物の量である。培養物中の細胞の数は、薬物暴露後に生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて決定される。実施例１２を参照。

【0239】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの細胞毒性をインビボで評価するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）または他の免疫無防備マウスの系統において様々な癌細胞の皮下注射により腫瘍が用意される。ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートおよび対照化合物は、例えば週２回２週間（ｑ４ｄｘ４）の腹腔内注射により腫瘍を有するマウスに投与されることができる。測定可能な療法成績は、腫瘍細胞増殖の阻害を含む。実施例１３参照。

【0240】

さらに、本発明は、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）を含む腫瘍細胞および／または関係する新生物の増殖、伝播または生存を、例えば抗ＰＴＫ７抗体または投与および送達の方法に応じて、選択された経路を作動させる、もしくはそれに拮抗する、または特定の細胞を排除することを含む様々な機序により、枯渇させる、静める、中和する、排除する、または阻害することができるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを提供する。

【0241】

本明細書で用いられる際、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）という用語は、腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ；すなわち、癌幹細胞またはＣＳＣ）および高増殖性腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）の両方を包含し、それは共に、一般にバルク腫瘍または塊の独特の亜集団（すなわち０．１〜４０％）を含む。本開示の目的に関して、腫瘍永続化細胞および癌幹細胞という用語は均等であり、本明細書において互換的に用いられることができる。逆に、ＴＰＣは、それらが腫瘍内に存在する腫瘍細胞の組成を完全に再現し、少数の分離された細胞の累代移植（マウスを通した２回以上の継代）により実証されるような無限の自己再生能力を有することができる点で、ＴＰｒｏｇとは異なる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によっては特性付けられない。

【0242】

本発明は、腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）、および特に腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）を標的とし、それにより新生物性障害および過剰増殖性障害の処置、管理または予防を促進するＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを提供する。より具体的には、特定の腫瘍細胞亜集団は、ＰＴＫ７を発現し、おそらく癌幹細胞の自己再生および細胞生存に重要なモルフォゲンシグナル伝達の局所的な協調を修正している。従って、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、対象への投与の際にＴＩＣの頻度を低減するために用いられることができる。腫瘍開始細胞の頻度における低減は、ａ）腫瘍開始細胞の排除、枯渇、高感度化、沈静化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）もしくは阻害；ｂ）腫瘍開始細胞の増殖、拡張もしくは再発を制御すること；ｃ）腫瘍開始細胞の開始、伝播、維持、もしくは増殖を阻止すること；またはｄ）他の方法により、腫瘍形成細胞の生存、再生および／または転移を妨げることの結果として起こり得る。本発明のある側面において、腫瘍開始細胞の頻度における低減は、１以上の生理的経路における変化の結果として起こる。経路における変化は、腫瘍開始細胞の低減もしくは排除によるものであれ、またはそれらの可能性を改変すること（例えば誘導された分化、ニッチの混乱（ｎｉｃｈｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ））もしくは腫瘍環境もしくは他の細胞に作用を及ぼすそれらの能力に他の方法で干渉することによるものであれ、今度は、腫瘍形成、腫瘍維持および／または転移および再発を阻害することにより、ＰＴＫ７関連障害のより有効な処置を可能にする。

【0243】

腫瘍開始細胞の頻度におけるそのような低減を評価するために用いられることができる方法の中には、インビトロまたはインビボ（どちらでもよい）での限界希釈分析、好ましくは続いてポアソン分布統計を用いた数え上げ、またはインビボもしくはインビボではなく腫瘍を生成する能力のような予め定められた決定的事象の頻度を評価することがある。周知のフローサイトメトリーまたは免疫組織化学的手段により頻度の値の低減を決定することも可能である。全ての前記の方法に関して、例えばDylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402およびHoey et al. 2009, PMID: 19664991を参照、そのそれぞれは、参照により本明細書にそのまま援用される。腫瘍開始細胞の頻度を計算するために用いられることができる、本発明と適合可能な他の方法は、定量化可能なフローサイトメトリーの技法および免疫組織化学染色手順を含む。

【0244】

上記で言及された方法のいずれかを用いて、次いで、本明細書の教示に従って、開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートにより提供されるＴＩＣ（またはその中のＴＰＣ）の頻度の低減を定量化することが可能である。一部の例において、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ＴＩＣの頻度を、（排除、誘導された分化、ニッチの混乱、沈静化等を含む上記で特筆された様々な機序により）１０％、１５％、２０％、２５％、３０％またはさらには３５％低減することができる。本発明の他の側面において、ＴＩＣの頻度における低減は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％であることができる。本発明の特定の側面において、開示された化合物は、ＴＩＣの頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらに９５％低減することができる。ＴＩＣの頻度のあらゆる低減は、おそらく結果として新生物の腫瘍形成性、持続性、再発および侵攻性における対応する低減をもたらすことは、理解されるであろう。

【0245】

集まりつつある証拠が、腫瘍の成長、療法への抵抗性、および障害の再燃がＴＰＣにより制御されているという仮説を支持している。ＴＰＣの頻度は、腫瘍型において、または同じ腫瘍型を有する患者間で、障害の病期および／または腫瘍内の分化の程度の産物として異なり得る。ＴＰＣは、特定のタイプの癌を有する患者間でそれらの発現においてしばしば重複する細胞表面マーカーのパネル（ｐａｎｅｌｓ）を用いて同定および富化され得る。ＴＰＣは、累代移植の際に腫瘍を開始するそれらの機能的能力により最もよく定められ、一方で非腫瘍形成（ＮＴＧ）細胞は、これらの能力を欠いている。それらの独特の腫瘍開始能力に富む固形腫瘍細胞は、最初に乳癌において同定された；しかし、乳癌は、ある範囲の悪性病変を含む。現在までに、科学コミュニティは、特定のＴＰＣの同一性を特定の障害の亜型と関連付けることができておらず、それは群をまたいだ、および群内の両方での矛盾した結果の基礎となっている可能性があり、臨床に対する橋渡しの失敗の可能性を増大させている可能性もある。

【0246】

本発明は、ＴＰＣの富化を向上させる新規の細胞表面マーカーの組み合わせを提供する。特定の側面において、本発明は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＴＰＣの富化を促進する新規の細胞表面マーカーの組み合わせを提供する。本発明はさらに、ＴＮＢＣ中の新規のＴＰＣ関連療法標的としてのＰＴＫ７の同定を提供し；その発現レベルは、他の乳癌亜型および正常組織中よりも有意に高い。

【0247】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの薬物動態が、様々な動物において評価されることができ、未コンジュゲート抗体の薬物動態と比較されることができる。例えば、これは、メスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）または他の免疫無防備マウスの系統、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット、およびメスのカニクイザルにおける一回の静脈内大量瞬時投与後に行われることができる。ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの薬物動態は、一般に様々な種における低いクリアランス、低い分布容積、および長い見かけの終末相半減期により特性付けられる。未コンジュゲートオーリスタチン誘導体の血清濃度は、定量化限界未満であることが予想される。１回量毒性範囲試験におけるこれらのコンジュゲートに関する毒性プロフィールは、比較可能な用量における他の抗体−薬物コンジュゲートに関して得られる毒性プロフィールと類似していることが予想される。

【0248】

“アポトーシスを誘導する”抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは他の薬剤は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成により決定されるようなプログラム細胞死を誘導する抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは他の薬剤である。細胞は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵巣、結腸直腸、前立腺、肝臓および肺腫瘍細胞である。様々な方法が、アポトーシスと関係する細胞事象を評価するために利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の転位置は、アネキシン結合により測定されることができ；ＤＮＡの断片化は、ＤＮＡのラダリングにより評価されることができ；そしてＤＮＡの断片化に伴う核／クロマチンの凝縮は、低二倍体細胞におけるあらゆる増大により評価されることができる。

【0249】

本明細書で用いられる際、“抗体依存性細胞媒介性細胞傷害”または“ＡＤＣＣ”は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞に媒介される反応を指す。対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号において記載されているインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて評価されることができる。そのようなアッセイに関する有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞を含む。あるいは、または加えて、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば動物モデル、例えばClynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998)において開示されている動物モデルにおいて評価されることができる。

【0250】

“補体依存性細胞傷害”または“ＣＤＣ”は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の同族抗原と複合体形成した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体活性化を評価するため、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163-171 (1997)において記載されているようなＣＤＣアッセイが実施されることができる。

【0251】

“ヒトエフェクター細胞”は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を発揮する白血球である。その細胞は、ＦｃγＲＩＩＩを発現し、抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を実行することができる。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好酸球、および好中球を含むが、それらに限定されず、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。ＡＤＣＣ活性を有する抗体は、典型的にはＩｇＧ１またはＩｇＧ３イソ型のものである。そのようなＡＤＣＣ媒介性抗体は、非ＡＤＣＣ抗体からの可変領域または可変領域断片をＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３イソ型の定常領域に対して操作することにより作製されることもできる。

【0252】

ＩＶ． ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの使用
本発明の抗体および抗体−薬物コンジュゲートは、療法処置法および診断処置法を含むがそれらに限定されない様々な適用において有用である。

【0253】

ＩＶ．Ａ． インビトロ適用
本発明は、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いるインビトロの方法を提供する。例えば、開示される抗体は、単独または細胞毒性薬剤もしくは他の薬物との組み合わせのどちらにおいても、ＰＴＫ７陽性癌細胞に特異的に結合してそのような細胞を細胞試料から枯渇させるために用いられることができる。ＰＴＫ７発現細胞をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートと接触させることにより、アポトーシスおよび／または細胞増殖の阻害を誘導するための方法も、提供される。代表的なインビトロの方法は、本明細書において上記で“ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ”の見出しの下で記載されている。

【0254】

本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、それらのＰＴＫ７抗原に特異的に結合する能力に基づくインビトロでのＰＴＫ７陽性細胞の検出においても有用性を有する。ＰＴＫ７発現細胞を検出するための方法は、以下の工程を含むことができる：（ａ）細胞を有する生物学的試料を調製し；（ｂ）ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートをその生物学的試料とインビトロで接触させ、ここで、その薬物は、検出可能な標識であり；そして（ｃ）ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの結合を検出する。

【0255】

本明細書で開示されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍試料中の腫瘍開始細胞の頻度を低減するためにも有用である。例えば、その方法は、以下の工程：インビトロで腫瘍細胞集団（ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む）をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートと接触させ；それにより、その細胞集団中の腫瘍開始細胞の百分率が低減する；を含むことができる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によって特性付けられない。代表的な腫瘍試料は、腫瘍細胞を含有するあらゆる生物学的試料または臨床試料、例えば、組織試料、生検、血液試料、血漿、唾液、尿、精液等を含む。

【0256】

ＩＶ．Ｂ． 療法的適用
ＰＴＫ７関連障害は、中皮腫、肝胆道（肝臓および胆管）癌、肝細胞癌、原発性または続発性ＣＮＳ腫瘍、原発性または続発性脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸の癌（例えば胃癌、結腸直腸癌、および十二指腸癌）、乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌）、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、白血病（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病）、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、ならびに表８および９において示されているＰＴＫ７を発現する細胞型により表される全ての癌または本明細書で開示された癌の１種類以上の組み合わせを含むが、それらに限定されない。

【0257】

句“有効量”、“有効投与量”は、本明細書で用いられる際、あらゆる１以上の有益な、または所望の療法的結果を達成するために必要な薬物、化合物または医薬組成物の量を指す。予防的使用に関して、有益な結果または所望の結果は、障害の生化学的、組織学的および／または行動上の症状、障害の発現の間に存在するその合併症および中間的な病理学的表現型を含む、障害の危険性を排除もしくは低減すること、その重症度を低下させること、またはその開始を遅らせることを含む。療法的使用に関して、有益な結果または所望の結果は、患者の様々なＰＴＫ７関連障害の１以上の症状の発生率の低減もしくは改善、障害を処置するために必要とされる他の薬物療法の用量の減少、別の薬物療法の作用の増進、および／またはＰＴＫ７関連障害の進行の遅延のような臨床的結果を含む。

【0258】

一側面において、本発明は、対象におけるＰＴＫ７発現と関係する障害を処置するための方法を提供する。本発明は、対象におけるＰＴＫ７発現と関係する障害を処置するための方法における使用のための、本明細書で記載される抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物も提供する。本発明はさらに、対象におけるＰＴＫ７発現と関係する障害を処置するための医薬品の製造における、本明細書で記載される抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する。

【0259】

本発明のある側面において、対象におけるＰＴＫ７発現と関係する障害を処置する方法は、それを必要とする対象に、本明細書で記載されるＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む。ＰＴＫ７発現と関係する障害は、異常なＰＴＫ７発現、変化した、または異所性ＰＴＫ７発現、ＰＴＫ７過剰発現、および増殖性障害（例えば癌）を含むが、それらに限定されない。

【0260】

本発明の一側面において、障害は、以下の癌を含むがそれらに限定されない癌である：中皮腫、肝胆道（肝臓および胆管）癌、肝細胞癌、原発性または続発性ＣＮＳ腫瘍、原発性または続発性脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸の癌（例えば胃癌、結腸直腸癌、および十二指腸癌）、乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌）、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、精巣癌、白血病（例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病）、リンパ球性リンパ腫、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、ならびに表８および９において示されているＰＴＫ７を発現する細胞型により表される全ての癌または本明細書で開示された癌の１種類以上の組み合わせ。

【0261】

別の態様において、抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いた標的化に適した癌は、ＰＴＫ７を発現している原発癌および転移癌、例えば乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌）；卵巣癌；結腸直腸癌；食道癌；胃癌；黒色腫；肉腫；腎臓癌；膵臓癌；前立腺癌；肝臓癌、例えば肝細胞癌（ＨＣＣ）；ならびに肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含む。

【0262】

より具体的な態様において、抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いた標的化に適した癌は、ＰＴＫ７を発現している原発癌および転移癌、例えば乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、プロゲステロン受容体陽性乳癌（ＰＲ＋）、エストロゲン受容体陽性乳癌（ＥＲ＋）およびダブルポジティブ乳癌）、ＮＳＣＬＣ、前立腺癌および食道癌を含む。より具体的な態様において、抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いた標的化に適した癌は、ＰＴＫ７を発現している原発癌および転移癌、例えば乳癌（例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ））およびＮＳＣＬＣを含む。

【0263】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７発現腫瘍を有する対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。本発明の他の側面において、対象においてＰＴＫ７発現癌細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。本発明の他の側面において、対象においてＰＴＫ７発現腫瘍の退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを有する有効量の組成物を投与することを含む方法が提供される。他の側面において、本発明は、上記の方法における使用のための、本明細書で記載された抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物を提供する。他の側面において、本発明は、上記の方法における使用のための医薬品の製造における、本明細書で記載された抗体−薬物コンジュゲートまたは医薬組成物の使用を提供する。

【0264】

従って、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いて処置されるべき患者は、バルク腫瘍試料のｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）およびＰＴＫ７抗原の高められた発現を含むがそれらに限定されないバイオマーカー発現に基づいて選択されることができ、それは結果として、腫瘍の由来または組織学ではなく富化された標的発現に関して選択された患者集団をもたらす。標的発現は、細胞染色の強度と組み合わせられた細胞染色の数の関数として測定されることができる。例えば、ＰＴＫ７の高発現の分類は、免疫組織化学染色により試験された細胞の３０％より多く（すなわち４０％、５０％または６０％）が（１〜４の尺度における）３＋のレベルでＰＴＫ７に関して陽性である患者を含み、一方でＰＴＫ７の中程度の発現は、細胞の２０％より多くが１＋〜２＋で染色される患者を含むことができる。標的発現は、本明細書で記載されたような腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）上のＰＴＫ７発現を検出することにより測定されることもできる。

【0265】

ＰＴＫ７の発現以外のバイオマーカーも、例えば多剤耐性（ＭＤＲ）に基づく腫瘍の特性付けを含め、患者の選択のために用いられることができる。ヒトの癌のほぼ５０％は、化学療法に完全に耐性であるか、または一過性にしか応答せず、その後それらはもはや一般的に用いられる抗癌薬による影響を受けないかのどちらかである。この現象は、ＭＤＲと呼ばれ、一部の腫瘍型により生得的に発現され、一方で他の腫瘍型は化学療法処置への暴露後にＭＤＲを獲得する。薬物排出ポンプであるＰ−糖タンパク質は、細胞毒性化学療法と関係するＭＤＲの大部分を媒介している。癌患者の腫瘍標本中に存在するＭＤＲ機序の表現型および機能分析が、特定のＭＤＲの機序（単数または複数）を特定の腫瘍型における化学療法への耐性と関連付けるために実施されることができる。

【0266】

癌の成長または異常増殖は、より発達した癌の形態または障害の状態への細胞内の変化を示唆するいくつかの指標のいずれか１つを指す。癌細胞または非新生物性増殖性障害の細胞の増殖の阻害は、当該技術で既知の方法、例えば遅延した腫瘍成長および転移の阻害によりアッセイされることができる。癌の成長の阻害を測定するための他の指標は、癌細胞生存における減少、（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像化法を用いて決定されるような）腫瘍体積または形態における減少、腫瘍脈管系の破壊、遅延型過敏性皮膚試験における向上した性能、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性における増大、および腫瘍特異的抗原のレベルにおける低下を含む。

【0267】

開示された療法的方法の所望の結果は、一般に対照またはベースライン測定と比較した場合の定量化可能な尺度である。本明細書で用いられる際、相対的な用語、例えば“向上させる”、“増大させる”または“低減する”は、対照、例えば本明細書で記載された処置の開始前の同じ個人における測定、または本明細書で記載された処置の非存在下での対照の個人（または多数の対照の個人）における測定と比較した値を示す。代表的な対照の個人は、処置されている個人と同じ形態の過剰増殖性障害に苦しんでいる個人であって、（処置される個人および対照の個人における障害の病期が比較可能であることを確実にするために）処置されている個人とおおよそ同じ年齢である個人である。

【0268】

療法に応答した変化または改善は、一般に統計的に有意である。本明細書で用いられる際、用語“有意性”または“有意な”は、２以上の実体間にランダムではない関係が存在する確率の統計分析に関する。関係が“有意”である、または“有意性”を有するか否かを決定するため、データの統計学的操作は“ｐ値”であることができる。使用者に定義されたカットオフ点より下に入るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされることができる。

【0269】

本明細書において上記で見出し“ＩＩＩ．ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの特性付けのための機能的アッセイ”の下で記載されたように、本発明は、腫瘍開始細胞を標的化するための方法も提供する。より詳細には、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍開始細胞を含め、腫瘍細胞の増殖、伝播または生存を、枯渇させる、静める、中和する、排除する、または阻害することができる。

【0270】

従って、本明細書で開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、腫瘍試料中の腫瘍開始細胞の頻度を低減するためにも有用である。例えば、その方法は、以下の工程：腫瘍細胞集団（ここで、その集団は、腫瘍開始細胞および腫瘍開始細胞以外の腫瘍細胞を含む）をＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートと接触させ；それにより、その細胞集団中の腫瘍開始細胞の百分率が低減する；を含むことができる。本明細書で用いられる際、用語“腫瘍開始細胞”は、様々な血液悪性疾患の癌幹細胞も指し、それは腫瘍自体によって特性付けられない。接触工程は、インビトロで実施されることもでき、ここで、本明細書において上記で記載されたように、腫瘍細胞集団が、生物学的試料中に含有される。あるいは、接触工程は、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの対象への投与後に起こるように、インビボで実施されることができる。

【0271】

ＩＶ．Ｃ． インビボ検出および診断
別の側面において、ＰＴＫ７発現と関係する障害を検出、診断、および／またはモニターする方法が提供される。例えば、本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体は、検出可能部分、例えば画像化剤および酵素−基質標識で標識されることができる。本明細書で記載された抗体は、インビボ診断アッセイ、例えばインビボ画像化（例えばＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）または染色試薬のために用いられることもできる。

【0272】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの対象への投与後（ここで薬物は検出可能標識である）および結合のために十分な時間の後、抗体により結合されたＰＴＫ７発現細胞の生体内分布が可視化されることができる。開示された診断法は、処置法との組み合わせで用いられることができる。加えて、本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、検出および療法の二重の目的のために投与されることができる。

【0273】

代表的な非侵襲性検出法は、シンチグラフィー（例えばＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピューター断層撮影）、ＰＥＴ（陽電子放射断層撮影）、ガンマカメラ画像化、および直線形スキャン）、磁気共鳴画像化（例えば従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、光子磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ））、および超音波を含む。

【0274】

ＩＶ．Ｄ． 形成
本発明はさらに、本明細書で開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートのいずれかおよび薬学的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物を提供する。さらに、組成物は、１種類より多くのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート（例えば、ＰＴＫ７の異なるエピトープを認識するＰＴＫ７抗体の混合物）を含むことができる。他の典型的な組成物は、ＰＴＫ７（例えばヒトＰＴＫ７）の同じエピトープ（単数または複数）を認識する１種類より多くのＰＴＫ７抗体もしくはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート、または異なるエピトープに結合するＰＴＫ７抗体もしくはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの異なる種を含む。

【0275】

本発明において用いられる組成物は、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で、さらに薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤を含むことができる(Remington: The Science and practice of Pharmacy 第21版, 2005, Lippincott Williams and Wilkins, 編者K. E. Hoover)。許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストラン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。“薬学的に許容可能な塩”は、本明細書で用いられる際、分子または高分子の薬学的に許容可能な有機または無機塩類を指す。薬学的に許容可能な賦形剤は、本明細書においてさらに記載される。

【0276】

ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの様々な配合物が、投与のために用いられることができる。本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、ニートで（ｎｅａｔ）投与されることができる。ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容可能な賦形剤は、様々な配合物中にあることができる。薬学的に許容可能な賦形剤は、当該技術で既知であり、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは粘稠性を与える、または希釈剤の役目を果たすことができる。適切な賦形剤は、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩類、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透増進剤を含むが、それらに限定されない。非経口および非経口ではない薬物送達のための賦形剤ならびに配合物が、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版. Mack Publishing, 2000において述べられている。

【0277】

本発明のある側面において、これらの薬剤は、（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋内等での）注射による投与のために配合されている。従って、これらの薬剤は、薬学的に許容可能なビヒクル、例えば生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液等と組み合わせられることができる。個々の投与計画、すなわち用量、タイミングおよび反復は、特定の個人およびその個人の病歴に依存するであろう。

【0278】

本発明に従って用いられるＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの療法配合物は、所望の程度の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容可能なキャリヤー、賦形剤または安定剤(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版 Mack Publishing, 2005)と、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で混合することにより、貯蔵のために調製される。許容可能なキャリヤー、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度において受容者に非毒性であり、緩衝剤、例えばホスフェート、シトレート、および他の有機酸；塩類、例えば塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストラン類を含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことができる。

【0279】

ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを含有するリポソームは、当該技術において既知の方法、例えばEppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980);ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号において記載されている方法により調製される。増進された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号において開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成されることができる。リポソームは、定められた孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生成する。

【0280】

有効成分は、コロイド状薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション技法により、または界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に捕捉されることもできる。そのような技法は、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第21版 Mack Publishing, 2005において開示されている。

【0281】

持続放出製剤が、調製されることができる。持続放出製剤の適切な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスは、形作られた物、例えば薄膜またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメート（７ ｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ）のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフェア）、スクロース酢酸イソブチル、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。

【0282】

インビボ投与のために用いられる予定の配合物は、無菌でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により容易に成し遂げられる。療法用ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。

【0283】

本発明に従う組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与のための単位剤形、例えば錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐剤であることができる。

【0284】

固体組成物、例えば錠剤を調製するため、主要な有効成分が、医薬用キャリヤー、例えば従来の打錠用成分、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の医薬用希釈剤、例えば水と混合されて、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容可能な塩の均質な混合物を含有する固体前配合（ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）組成物を形成する。これらの前配合組成物が均質であると言及する場合、その組成物が等しく有効な単位剤形、例えば錠剤、丸剤およびカプセル中にすぐに細分されることができるように、有効成分が組成物全体にわたって均等に分散していることが意味されている。次いで、この固体前配合組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記のタイプの単位剤形中に細分される。新規組成物の錠剤または丸剤は、延長された作用の利点を与える剤形を提供するために、コートされるか、または他の方法で調合されることができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬構成要素および外部投薬構成要素を含むことができ、後者は前者を覆う外膜の形態である。２つの構成要素は、胃における崩壊に耐える役目を果たし、内部の構成要素が完全な状態で十二指腸中へと通過することまたはその放出が遅延することを可能にする腸溶層により隔てられていることができる。様々な材料が、そのような腸溶層またはコーティングのために用いられることができ、そのような材料は、いくつかのポリマー性の酸ならびにポリマー性の酸のシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。

【0285】

適切な表面活性剤は、特に非イオン性薬剤、例えばポリオキシエチレンソルビタン類（例えばＴｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン類（例えばＳｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）を含む。表面活性剤を含む組成物は、好都合には０．０５〜５％の表面活性剤を含むと考えられ、それは０．１〜２．５％であることができる。他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容可能なビヒクルが、必要に応じて添加されることができることは、理解されるであろう。

【0286】

適切なエマルジョンは、商業的に入手可能な脂肪エマルジョン、例えばＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を用いて調製されることができる。有効成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中で溶解させることができ、あるいはそれは油（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）中で溶解させることもでき、リン脂質（例えば卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水との混合の際にエマルジョンが形成される。エマルジョンの張性を調節するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースが添加されることができることは、理解されるであろう。適切なエマルジョンは、典型的には２０％までの、例えば５〜２０％の油を含有するであろう。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの脂肪液滴を含むことができ、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有することができる。

【0287】

エマルジョン組成物は、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートをＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されたエマルジョン組成物であることができる。

【0288】

吸入またはガス注入のための組成物は、薬学的に許容可能な水性もしくは有機性溶媒中の溶液および懸濁液、またはそれらの混合物、ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上記で述べられたような適切な薬学的に許容可能な賦形剤を含有することができる。本発明のある側面において、組成物は、局所または全身作用のために、経口または経鼻呼吸経路により投与される。好ましくは無菌の薬学的に許容可能な溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧されることができる。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸されることができ、または噴霧デバイスは、フェイスマスク、テントもしくは断続的陽圧呼吸模擬装置に取り付けられることができる。溶液、懸濁液または粉末組成物は、好ましくは経口または経鼻で、配合物を適切な方法で送達するデバイスから投与されることができる。

【0289】

本発明は、本方法における使用のためのキットも提供する。本発明のキットは、本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを含む１個以上の容器および本明細書で記載された本発明の方法のいずれかに従う使用のための説明書を含む。一般に、これらの説明書は、上記の療法処置のためのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの投与の記載を含む。

【0290】

本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの使用に関する説明書は、一般に、意図される処置に関する投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば多数回用量包装）または小単位用量であることができる。本発明のキット中に供給される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えばキット中に含まれる紙シート）上に書かれた説明書であるが、機械で読み取り可能な説明書（例えば磁気または光学記憶ディスク上に保持された説明書）も許容可能である。

【0291】

本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装は、バイアル、ボトル、広口瓶、柔軟な包装（例えば密封されたマイラまたはプラスチックの袋）等を含むが、それらに限定されない。特定のデバイス、例えば吸入器、経鼻投与デバイス（例えばアトマイザー）またはミニポンプのような注入デバイスとの組み合わせでの使用のための包装も、意図されている。キットは、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、その容器は、皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであることができる）。容器も、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針により突き刺し可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも１種類の有効薬剤は、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートである。容器は、さらに第２の薬学的に有効な薬剤を含むことができる。

【0292】

キットは、場合により追加の構成要素、例えば緩衝剤および判断情報を提供することができる。通常は、キットは、容器およびその容器上のまたはその容器と関係するラベルまたは添付文書（単数または複数）を含む。

【0293】

ＩＶ．Ｅ． 用量および投与
インビトロおよびインビボ適用に関して、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、有効投与量で提供または投与される。臨床的状況では、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的にのどちらかで予防的または療法的処置を成し遂げるために十分な量である。有効投与量は、１回以上の投与において投与されることができる。薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と合わせて達成される可能性があり、またはそうでない可能性もある。従って、“有効投与量”は、１種類以上の療法剤を投与する文脈において考えられることができ、単剤は、１種類以上の他の薬剤と合わせて望ましい結果が達成され得る、または達成される場合に、有効量で与えられていると考えられることができる。開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを用いたＰＴＫ７陽性細胞の検出に関して、本発明の組成物の検出可能な量、すなわちコンジュゲートの存在がインビトロまたはインビボで決定され得るようなコンジュゲートの用量が、対象に投与される。

【0294】

例えば、癌を有する対象に投与される場合、有効量は、癌細胞の細胞溶解、癌細胞の増殖の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、癌細胞抗原の低減、遅延された腫瘍成長、および／または転移の阻害を含む抗癌活性を引き出すために十分な量を含む。腫瘍の縮小は、有効性に関する臨床代用マーカーとして十分に受け入れられている。有効性に関する別の十分に受け入れられているマーカーは、無増悪生存である。

【0295】

ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、あらゆる適切な経路により個人に投与されることができる。当業者には、本明細書で記載される実施例は、限定的であることが意図されているのではなく、利用可能な技法を説明することが意図されていることは、理解されるべきである。従って、本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体コンジュゲートは、個人に、既知の方法に従って、例えば静脈内投与、例えば大量瞬時投与としての静脈内投与またはある期間にわたる連続注入による静脈内投与で、筋内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液包内、ガス注入経由、髄腔内、経口、吸入または局所的経路により投与される。投与は、全身的、例えば静脈内投与、または局所的であることができる。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体配合物のための商業的に入手可能な噴霧器は、投与のために有用である。液体配合物は、直接噴霧されることができ、凍結乾燥された粉末は、再構成後に噴霧されることができる。あるいは、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、フルオロカーボン配合物および計量吸入器を用いてエアロゾル化されることができ、または凍結乾燥および製粉された粉末として吸入されることもできる。

【0296】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、部位特異的または標的化された局所送達技法により投与される。部位特異的または標的化された局所送達技法の例は、ＰＴＫ７抗体もしくはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの様々な埋め込み式のデポー源、または局所送達カテーテル、例えば注入カテーテル、留置カテーテル、もしくは針カテーテル、人工移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み式のデバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用を含む。例えば、ＰＣＴ国際公開第２０００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照。

【0297】

本明細書で記載されたＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、注射（例えば腹腔内、静脈内、皮下、筋内等）による投与を含め、あらゆる適切な方法を用いて投与されることができる。ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、本明細書で記載されたように、吸入により投与されることもできる。一般に、ＰＴＫ７抗体およびＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの投与に関して、最初の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇであることができる。本発明の目的に関して、典型的な一日投与量は、上記で言及された要因に応じて、約３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまたはより多い量までのいずれの範囲である可能性もある。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの投与量が用いられることができる。数日またはより長い期間にわたる反復投与に関して、障害に応じて、処置は、症状の所望の抑制が起こるまで、または例えば腫瘍成長／進行もしくは癌細胞の転移を阻害するもしくは遅延させるための十分な療法レベルが達成されるまで持続する。典型的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの初期用量を投与し、続いて約１ｍｇ／ｋｇの毎週維持用量を投与すること、または続いて約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を隔週で投与することを含む。他の典型的な投与計画は、増大する容量（例えば１ｍｇ／ｋｇの初期用量および毎週またはより長い期間での１以上のより高い容量への徐々の増大）を投与することを含む。他の投与計画も、従事者が達成することを望む薬物動態的減衰のパターンに応じて有用である可能性がある。例えば、本発明のある側面において、週に１〜４回の投与が意図されている。他の側面において、月１回または２ヶ月ごとに１回または３ヶ月ごとに１回、ならびに毎週、２週間ごとおよび３週間ごとに１回の投与が意図されている。この療法の進行は、従来の技法およびアッセイにより容易にモニターされることができる。投与計画（用いられるＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを含む）は、時間の経過に伴い変動することができる。

【0298】

本発明の目的に関して、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの適切な投与量は、用いられるＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート（またはその組成物）、処置されるべき症状のタイプおよび重症度、薬剤が療法的目的のために投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴および薬剤への応答、投与される薬剤に関する患者のクリアランス速度、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。臨床医は、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートを、所望の結果を達成する投与量およびそれ以上に達するまで投与することができる。用量および／または頻度は、処置の過程にわたって変動することができるが、一定のままであることもできる。経験的な考慮すべき事柄、例えば半減期は、一般に投与量の決定に寄与するであろう。例えば、ヒト免疫系と適合可能である抗体、例えばヒト化抗体または完全なヒト抗体は、抗体の半減期を延長するためおよび抗体が受容者の免疫系により攻撃されるのを防ぐために用いられることができる。投与の頻度は、療法の過程にわたって決定および調節されることができ、一般に、症状の処置および／または抑制および／または改善および／または遅延、例えば腫瘍成長の阻害または遅延等に基づくが、必ずそうであるわけではない。あるいは、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの持続的連続放出配合物が、適切である可能性がある。持続放出を達成するための様々な配合物およびデバイスが、当該技術で既知である。

【0299】

本発明のある側面において、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートに関する投与量は、そのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの１回以上の投与（単数または複数）を与えられてきた個人において経験的に決定されることができる。個人は、ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの増加する投与量を与えられる。有効性を評価するため、障害の指標が追跡されることができる。

【0300】

本発明の方法に従うＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの投与は、例えば受容者の生理的障害、投与の目的が療法的か予防的か、および当業者に既知の他の要因に応じて連続的または断続的であることができる。ＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であることができ、または一連の間隔の空いた用量におけることもできる。

【0301】

ＩＶ．Ｆ． 併用療法
本発明のある側面において、本明細書で記載される方法は、さらに対象を療法の追加の形態により処置する工程を含む。ある側面において、療法の追加の形態は、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、および／または追加の免疫療法を含むがそれらに限定されない追加の抗癌療法である。

【0302】

開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、最初の処置として、または従来の療法に非応答性である障害の処置のために投与されることができる。加えて、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、他の療法（例えば外科的切除、放射線、追加の抗癌薬等）との組み合わせで、それにより追加のもしくは増強された療法作用を引き出す、および／または一部の抗癌剤の肝細胞毒性を低減するために用いられることができる。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、追加の薬剤と同時投与もしくは同時配合されることができ、または追加の薬剤とのあらゆる順序での連続投与のために配合されることができる。

【0303】

併用療法に有用な代表的な薬剤は、本明細書において上記で副見出し“薬物”の下でＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの調製に有用であるものとして記載された薬物の全てを含む。本発明のＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、開示された抗ＰＴＫ７抗体以外の抗ＰＴＫ７抗体ならびに異なる抗原を標的とする抗体およびコンジュゲートを含め、他の療法用抗体および抗体−薬物コンジュゲートとの組み合わせで用いられることもできる。単独でまたは抗体−薬物コンジュゲートとして用いられることができる代表的な抗体は、抗５Ｔ４抗体（例えばＡ１、Ａ２、およびＡ３）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えばＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３３抗体（例えばＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、抗ＣＤ３３抗体−薬物コンジュゲート、抗ルイスＹ抗体（例えばＨｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗ＨＥＲ−２抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（ペルツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４））、抗ＣＤ５２抗体（例えばＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ））、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ））、抗ＤＮＡ／ヒストン複合体抗体（例えばｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗ＣＥＡ抗体（例えばＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗ＣＤ４７抗体（例えば６Ｈ９）、抗ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体、ＫＤＲ）抗体（例えばＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（例えばＩＮＧ−１）、抗ＦＡＰ抗体（例えばシブロツヅマブ）、抗ＤＲ４抗体（例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗プロゲステロン受容体抗体（例えば２Ｃ５）、抗ＣＡ１９．９抗体（例えばＧＩＶＡＲＥＸ（登録商標））および抗フィブリン抗体（例えばＭＨ−１）を含む。

【0304】

開示されたＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、処置計画の一部として細胞毒性薬剤の１以上の組み合わせと一緒に投与されることもできる。この目的のための有用な細胞毒性製剤は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシンおよびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）；ＡＢＶ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン）と交互のＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）と交互のＭＯＰＰ（メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニゾン）；ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビンおよびシスプラチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、およびシスプラチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾンおよびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニゾン）；およびＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）；ＤＨＡＰ（シスプラチン、高用量シタラビンおよびデキサメタゾン）；ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、シスプラチン）；ＰＶ（シスプラチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）；ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）；ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）；ＩＭ（イホスファミド、マイトマイシン）；ＩＥ（イホスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イホスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イホスファミド、シスプラチン）；ＩＣＥ（イホスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イホスファミド、エトポシド）；ビノレルビンおよびシスプラチン；カルボプラチンおよびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン）；ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ならびにＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）を含む。

【0305】

ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、全身性抗癌薬、例えばエポチロン類（ＢＭＳ−２４７５５０、Ｅｐｏ−９０６）、タキサン類の再配合物（Ａｂｒａｘａｎｅ、Ｘｙｏｔａｘ）、微小管阻害剤（ＭＳＴ−９９７、ＴＴＩ−２３７）と、または標的化された細胞毒素、例えばＣＭＤ−１９３およびＳＧＮ−１５との組み合わせで用いられることができる。追加の有用な抗癌剤は、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、５−ＦＵ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、ＴＲＯＶＡＸ（登録商標）、アナツモマブマフェナトキス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、レトロゾール、ドセタキセル、およびアントラサイクリン類を含む。

【0306】

併用療法に関して、ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートおよび／または１種類以上の追加の療法剤もしくは診断剤は、意図される療法または診断の性能に適したあらゆる時間フレーム内で投与される。従って、単剤は、実質的に同時に（すなわち、単一の配合物として、または数分もしくは数時間以内に）、またはあらゆる順序で連続的に投与されることができる。例えば、単剤処置は、互いに約１年以内、例えば約１０、８、６、４、もしくは２ヶ月以内、または４、３、２もしくは１週間以内、または約５、４、３、２もしくは１日以内に施されることができる。第２の療法剤との組み合わせでのＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの投与は、好ましくはどちらか単独の投与よりも大きい作用を引き出す。

【0307】

本発明のある側面において、療法の追加の形態は、１種類以上の療法剤を、本明細書で記載されたようなＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートに加えて投与することを含む。その療法剤は、第２抗体（例えば抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＣＤ２５抗体、および／または抗ＣＤ２０抗体）、血管新性阻害剤、細胞毒性剤、抗炎症剤（例えばパクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ドキソルビシン、プレドニゾン、マイトマイシン、プロゲステロン、タモキシフェン、またはフルオロウラシル）を含むが、それらに限定されない。

【0308】

本発明のある側面において、１種類より多くのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートが存在していることができる。少なくとも１種類、少なくとも２種類、少なくとも３種類、少なくとも４種類、少なくとも５種類の異なる、またはより多くのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートが存在していることができる。一般に、それらのＰＴＫ７抗体またはＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有することができる。例えば、以下のＰＴＫ７抗体の１種類以上が用いられることができる：ＰＴＫ７上のあるエピトープに向けられた第１ＰＴＫ７抗体およびＰＴＫ７上の異なるエピトープに向けられた第２ＰＴＫ７抗体。

【0309】

開示された併用療法は、相乗的療法作用、すなわち、それらの個々の作用または療法成績の合計よりも大きい作用を引き出すことができる。測定可能な療法成績は、本明細書において記載されている。例えば、相乗的療法作用は、単剤により引き出される療法作用または所与の組み合わせの単剤により引き出される療法作用の合計よりも少なくとも約２倍大きい、または少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい、または少なくとも約２０倍大きい、または少なくとも約５０倍大きい、または少なくとも約１００倍大きい作用であることができる。相乗的療法作用は、単剤により引き出される療法作用または所与の組み合わせの単剤により引き出される療法作用の合計と比較した少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％の、またはより大きい療法作用における増大として観察されることもできる。相乗作用は、それらが組み合わせで用いられた際に療法剤の低減した投与を可能にする作用でもある。

【0310】

別途示されない限り、詳細な記載全体を通して用いられた際に、用語“約”は、用語“約”の後の値の＋／−１％の値を意味する。

【実施例】

【0311】

以下の実施例は、説明目的でのみ提供されており、本発明の範囲を限定することは一切意図されていない。実際、本明細書で示された、および記載された本発明に加えた本発明の様々な修正が、当業者には前記の記載から明らかになると考えられ、それは添付された特許請求の範囲内に入る。

【0312】

実施例１
抗ＰＴＫ７抗体の生成およびヒト化
マウス抗体の形態のＰＴＫ−７抗体が、当該技術で既知の、およびＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号において記載されているような手順に従って生成された。生成されたマウス抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を用いてヒト化された。重鎖および軽鎖に関するヒトのフレームワークは、機能性ヒト生殖細胞系列遺伝子に関する配列および構造類似性に基づいて選択された。構造類似性は、Chothia et al.（上記）において記載されているように、マウスのカノニカルＣＤＲ構造を同じカノニカル構造を有するヒトの候補に対して比較することにより評価された。

【0313】

より詳細には、ＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号において記載されている、本明細書においてｍｕ２３、ｍｕ２４、およびｍｕ５８と呼ばれるマウス抗体が、コンピューターに支援されたＣＤＲ移植法（Ａｂｙｓｉｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＰＩｃ．）および標準的な分子工学技法を用いてヒト化され、ヒト化ｍｕ２３、ｍｕ２４、およびｍｕ５８（以下ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８）をそれぞれ提供した。可変領域のヒトのフレームワーク領域は、マウスのフレームワーク配列に対するそれらの最高の配列相同性およびそのカノニカル構造に基づいて選択された。分析の目的のため、ＣＤＲドメインのそれぞれに対するアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔらの番号付けに従った。いくつかのヒト化抗体バリアントが、最適なヒト化抗体を生成するために作製され、そのヒト化抗体は一般に、ヒトのフレームワーク領域を伴うマウスのハイブリドーマからの抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を保持していた。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムを用いて測定された際に、ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８ ｍＡｂは、ヒトＰＴＫ７抗原に、それらのマウスの対応物に対する親和性と類似の親和性で結合した。

【0314】

分子工学手順が、当該技術で認められている技法を用いて実施された。総ｍＲＮＡが、ハイブリドーマから、製造業者のプロトコル（ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って抽出された。それぞれのハイブリドーマを増幅するように設計された配列特異的５’リーダー配列プライマーが、それぞれのヒト化抗体の可変領域を増幅およびクローニングするために、３’ヒトＣγ１プライマーとの組み合わせで用いられた。同様に、ヒトカッパ定常領域に特異的な単一の逆方向プライマーと組み合わせられた、特異的にＶｋ領域のそれぞれを増幅するように設計された５’Ｖｋリーダー配列が、カッパ軽鎖を増幅およびクローニングするために用いられた。増幅された断片は、キメラヒトガンマ１／カッパ鎖としてクローニングされ、それぞれのヒト化ｍＡｂに関するベンチマークの役目を果たした。

【0315】

ヌクレオチド配列情報から、マウス抗体ｍｕ２３、ｍｕ２４、およびｍｕ５８の重鎖および軽鎖のＶ、ＤおよびＪ遺伝子区画に関するデータが得られた。その配列データに基づいて、抗体のＩｇ ＶＨおよびＶｋ鎖のリーダー配列に特異的な新規のプライマーセットが、組み換えモノクローナル抗体のクローニングのために設計された。続いて、Ｖ−（Ｄ）−Ｊ配列が、マウスＩｇの生殖細胞系列配列とアラインメントされた。

【0316】

ｍｕ２３の重鎖遺伝子が、ＶＨ３６０９（Ｖ）、ＤＳＰ２．３（Ｄ）およびＪＨ３として同定された。ｍｕ２４の重鎖遺伝子が、ＶＨＪ５５８（Ｖ）、ＤＳＰ２．７（Ｄ）およびＪＨ４として同定された。ｍｕ５８の重鎖遺伝子が、ＩＧＨＶ ４−１（Ｖ）、ＤＦＬ １６．１（Ｄ）およびＪＨ４として同定された。全ての３つの軽鎖は、κクラスであった。軽鎖遺伝子が、ｍｕ２３に関してＩＧＫＶＩ４−１１１およびＪＫ５、ｍｕ２４に関してＩＧＫＶ３−５およびＪＫ１、そしてｍｕ５８に関してＩＧＫＶ１７−１２１およびＪＫ４生殖細胞系列配列として同定された。これらの結果が、下記の表２において要約されている。

【0317】

【表2】

【0318】

全ての３つのクローンからの得られた重鎖および軽鎖配列が、機能性ヒト可変領域配列に対してアラインメントされ、相同性およびカノニカル構造に関して再調査された。ヒト化抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８に関するヒト化重鎖および軽鎖の分析の結果が、下記で表３および４においてそれぞれ示されている。

【0319】

【表3】

【0320】

【表4】

【0321】

ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８のアミノ酸配列および関係する核酸配列が、上記の表１において示されている。ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８に関するＶＨ領域のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９において示されており、対応する核酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０において示されている。ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８のカッパＶＬ領域のアミノ酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３において示されており、対応する核酸配列が、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４において示されている。

【0322】

下記の実施例において実証されるように、前記のヒト化抗体は、本明細書における教示に従って有効な抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートとして機能する。
実施例２
ヒト化抗体の発現
抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８を、当該技術で認められている技法を用いて、そしてＰＣＴ国際公開第２０１２／１１２９４３号において記載されているように発現させ、単離した。重鎖の合成ヒト化可変ＤＮＡ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ヒトＩｇＧ１発現ベクター中にクローニングした。可変軽鎖断片を、ヒトＣ−カッパ発現ベクター中にクローニングした。それぞれの抗体を、対応する重鎖および軽鎖のＣＨＯ細胞中への同時トランスフェクションにより発現させた。

【0323】

より詳細には、抗体産生のために、ヒト化可変遺伝子のＰＣＲ産物のヒト免疫グロブリン発現ベクター中への方向性クローニングを行った。Ｉｇ遺伝子特異的ＰＣＲにおいて用いられた全てのプライマーは、ヒトＩｇＧ１およびＩｇｋ定常領域をそれぞれ含有する発現ベクター中への直接的なクローニングを可能にする制限部位（ＩｇＨに関してＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ、Ｉｇｋに関してＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ）を含んでいた。簡潔には、ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて精製し、続いてそれぞれＡｇｅＩおよびＸｈｏＩ（ＩｇＨ）、ＸｍａＩおよびＤｒａＩＩＩ（Ｉｇｋ）で消化した。消化したＰＣＲ産物を精製した後、発現ベクター中にライゲーションした。ライゲーション反応は、２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化および精製された遺伝子特異的ＰＣＲ産物および２５ｎｇの線状ベクターＤＮＡを含む１０μＬの総体積で実施された。コンピテント大腸菌ＤＨｌ０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３μＬのライゲーション産物を用いた４２℃での熱ショックにより形質転換し、アンピシリンプレート（１００μｇ／ｍＬ）上に蒔いた。次いで、ＶＨ領域のＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１（Ｌｏｎｚａ ＡＧ）発現ベクターの同じ部位中に挿入し、一方で合成ＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩＶκ挿入断片を、それぞれのｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクターのＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ部位中にクローニングした。

【0324】

ヒト化抗体を産生する細胞を、適切なプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞の２９３ｆｅｃｔｉｎを用いたトランスフェクションにより生成した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１１２６８）細胞を、１５０ｍｍプレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）において、標準的な条件下で、１０％熱非働化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを補ったダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのもの）中で培養した。

【0325】

一過性トランスフェクションのために、細胞を８０％コンフルエントまで増殖させた。等量のＩｇＨおよび対応するＩｇＬ鎖ベクターＤＮＡ（１２．５μｇのそれぞれのベクターＤＮＡ）を、１．５ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭに添加し、１．５ｍＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中の５０μＬのＨＥＫ２９３トランスフェクション試薬と混合した。その混合物を、室温で３０分間インキュベートし、培養プレートに均等に分布させた。上清をトランスフェクションの３日後に回収し、１０％ＦＢＳを補った２０ｍＬの新しいＤＭＥＭにより置き換え、トランスフェクションの６日後に再び回収した。培養上清から細胞破砕片を、８００×ｇで１０分間の遠心分離により取り除き、４℃で保管した。組み換えキメラおよびヒト化抗体を、プロテインＧビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ｈｕ２３およびｈｕ２４のイオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製が、ｖｃ０１０１およびｍｃ８２６１に対する一貫した再現性のあるバイオコンジュゲーションを達成するために必要とされた。追加の精製工程を用いない場合、チオール還元の効率、従って結果として生じるＡＤＣの薬物対抗体比（ＤＡＲ）（実施例１０で記載される）は劇的かつ予測不能に変動した。追加の精製に関する必要性は、予想されなかったが、経験的に決定された。

【0326】

実施例３
ｈｕ２４結合の特性付け
キメラおよびヒト化クローン２４ ｍＡｂの比較を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＳＰＲにより決定した。抗ヒト抗体捕捉キットを用いて、捕捉ｍＡｂをＣＭ５バイオセンサーチップ上に固定した。それぞれの抗原注入サイクルの前に、２μｇ／ｍＬの濃度のヒト化ｍＡｂを表面上に、２分間の接触時間および５μＬ／分の流速で捕捉させた。捕捉されたｍＡｂのベースラインからの装填（ｌｏａｄｉｎｇ）は、８０〜１２０応答単位で一定であった。試験物の捕捉および１分間のベースラインの後、単量体性ヒトＰＴＫ７タンパク質を、２分間の会合相の間に表面上を５μＬ／分の流速で５０、２５、および１２．５ｎＭの濃度で流し、続いて２分間の解離相を行った。それぞれのサイクルの後、抗ヒト捕捉表面を、１０μＬ／分で３０秒間の接触時間の３Ｍ ＭｇＣｌ_２で再生させた。

【0327】

Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）のデータを、最初に特異的ｍＡｂ結合表面から対照ＩｇＧ表面を減算することにより処理した。次いで、応答データを会合および解離相まで切り詰めた。結果として得られた３つの異なる抗原濃度による応答曲線を用いて、１：１ラングミュア結合モデルに当てはめ、計算されたＫ_ｏｎおよびＫ_ｏｆｆ速度論定数により見かけの親和性を、Ｋｄ＝Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎとして定義される平衡解離定数により生成した。全てのデータ分析工程は、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において完了された。

【0328】

計算された親和性および速度定数は、キメラおよびヒト化ｍＡｂの間で２倍以内であることが決定された（表５）。

【0329】

【表5】

【0330】

ｈｕ２４ ｍＡｂにより認識されるエピトープを決定するために、ＰＴＫ７外部ドメインのいくつかのバリアントへのその結合を評価した。ＰＴＫ７外部ドメインは、７個のＩｇドメインからなり、バリアントは、２個以上の連続するＩｇドメインを含むように設計された。バリアントをＦｃ融合タンパク質として発現させ、ｈｕ２４結合をＥＬＩＳＡにより決定した。

【0331】

構造的相同性により予測されるような様々な連続するＰＴＫ７ Ｉｇドメインを増幅するプライマーを用いて、コンストラクトを設計した。結果として得られた配列を、標準的な分子生物学の技法を用いて、ヒト免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）Ｆｃドメインとインフレームで上流に融合させた。そのＦｃ融合タンパク質を、哺乳類細胞中にトランスフェクションし、上清を７２時間後に回収した。抗ＰＴＫ７ ｍＡｂ ｈｕ２４を、定められたＩｇドメインを有するＰＴＫタンパク質バリアントに結合するその能力に関してＥＬＩＳＡにより試験した。

【0332】

結果は、Ｉｇドメイン１〜４がｈｕ２４のＰＴＫ７への結合に必要であることを示しており（表６）、ｍＡｂはＰＴＫ７の三次構造的特徴を認識することを暗示している。

【0333】

【表6】

【0334】

抗ＰＴＫ７ ｍＡｂ ｈｕ２４の細胞結合特製を特性付けるために実験を実施した。抗原特異性を確かめるため、免疫ブロット法により決定されるような実質的なＰＴＫ発現を有する細胞株または無視できる程度のＰＴＫ７発現を有する細胞株の両方において、結合を評価した。

【0335】

全細胞抽出物を、ゲル電気泳動により分解し、ニトロセルロース膜に転写した。その膜を、５％重量／体積の脱脂乳を含む０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中のｈｕ６Ｍ０２４と共にインキュベートし、次いでＴＢＳＴで洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒト抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 商品番号ｓｃ−２４５３）と共にインキュベートし、広範囲にわたって洗浄した後、化学発光物質に暴露させた。

【0336】

免疫ブロット法は、細胞株ＢｘＰＣ３およびＭＤＡＭＢ４３６におけるＰＴＫ７の実質的発現ならびに細胞株ＡＳＰＣ１におけるＰＴＫ７の無視できる程度の発現を示した（図２Ａ）。フローサイトメトリーに基づくｈｕ２４を用いた細胞結合の結果は、免疫ブロット法のデータと完全に一致しており（図２Ｂ）、それはｈｕ２４の抗原特異性を実証した。

【0337】

ＰＴＫ７の内因性発現を有する癌細胞株に対するｈｕ２４ ｍＡｂの結合を評価するために、追加のフローサイトメトリー実験を実施した。簡潔には、接着細胞をＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）商品番号１２６０４−０２１）で解離させ、次いでそれを培地で中和した。懸濁細胞は、遠心分離により回収された。細胞を、記載された濃度のｍＡｂを含む染色緩衝液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を染色緩衝液中で洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ 商品番号１０９−１１５−０９８）を含む染色緩衝液中で再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、７−ＡＡＤ死細胞染色試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ 商品番号５１−６８９８１Ｅ）を含む染色緩衝液中で再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。生存可能な細胞集団のＰＥチャンネルにおける平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれの試料に関して決定した。

【0338】

ｈｕ２４ ｍＡｂは、試験された最低濃度（０．１μｇ／ｍｌ）において様々な癌細胞株への結合を示した。対照的に、対照抗体は、試験された最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）でも感知できるほどの結合を示さなかった（表７）。

【0339】

【表7】

【0340】

実施例４
様々な癌細胞株におけるＰＴＫ７の発現
抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３およびｈｕ２４は、固形および血液学的適応症を含む広い範囲の腫瘍型から確立された培養された癌細胞株への特異的結合を示した（下記の表８参照）。接着細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ）を用いて解離させ、細胞培養培地で中和し、計数した。細胞をＵ底９６ウェルプレート中に５×１０^５細胞／１００μＬ培地／ウェルでまいた。プレートを３００×ｇで４℃において５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄した。それぞれのペレットをＰＢＳ中３％ＢＳＡ中１０μｇ／ｍＬのｈｕ２３、ｈｕ２４または非結合対照抗体中で再懸濁し、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞のペレットを２００μＬの氷冷ＰＢＳ３％ＢＳＡ中で洗浄した。それぞれの細胞のペレットを、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で１：５０希釈したＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片１００μＬ中で再懸濁し、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞のペレットを４℃において２００μＬのＰＢＳ３％ＢＳＡ中で洗浄した。それぞれのペレットを１００μＬのＰＢＳ３％ＢＳＡ中で再懸濁し、２５０μＬのＰＢＳ３％ＢＳＡを含有する５ｍＬのポリカーボネートチューブに移した。試料を、死細胞染色試薬として試料あたり５μＬの７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色溶液を用いてフローサイトメトリーにより分析した。生存不能細胞は、分析から除外された。

【0341】

表８におけるデータは、フローサイトメトリーによる癌細胞株への抗体結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ヒト化抗体ｈｕ２３およびｈｕ２４による細胞結合は、数多くの細胞株におけるＰＴＫ７発現を示している。ＰＴＫ７発現は、様々な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸癌、乳癌、膵臓癌、および赤血白血病の癌細胞株において顕著である。ＰＴＫ７に結合しない陰性対照抗体が、比較のために用いられた。

【0342】

【表8-1】

【0343】

【表8-2】

【0344】

表９において示されている２９のＰＤＸ腫瘍株に関するマイクロアレイデータは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ ＧＥ ８ｘ６０ ｖ２アレイを用いて、ＰＤＸ腫瘍細胞から単離された総ＲＮＡを用いて生成された。単色を用いて収集された生マイクロアレイデータの処理は、バックグラウンド減算およびクオンタイル正規化を含んでいた。正規化されたデータは、２を底として対数変換され、下流の分析における使用のための遺伝子発現値を生成した。このデータは、示されたＰＤＸ細胞株と関係するＰＴＫ７発現の相対量を反映している。ＢＲ＝乳房、ＬＵ＝肺、ＯＶ＝卵巣、ＳＫ＝黒色腫、ＣＲ＝結腸直腸、ＬＩＶ＝肝臓。

【0345】

【表9】

【0346】

ＰＴＫ７の発現を、免疫無防備マウスにおける７つのＰＤＸモデル：４つのトリプルネガティブ乳癌ＰＤＸ（ＢＲ１３、ＢＲ２２、ＢＲ３１およびＢＲ５）；１つのプロゲステロン受容体陽性（ＰＲ＋）乳癌ＰＤＸ（ＢＲ３６）；および２つのＮＳＣＬＣ ＰＤＸ（ＮＳＣＬＣ１３５およびＮＳＣＬＣ１７６）における免疫組織化学によっても評価した。

【0347】

簡潔には、標準的な組織学的手順を用いてそれぞれの異種移植片からの組織断片をホルマリン固定し、処理し、パラフィン包理した（ＦＦＰＥ）。５ミクロンの切片を装填されたスライドガラス上に切り、乾燥させ、キシレン中で脱パラフィンし、段階的なアルコール類〜蒸留水を用いて再水和させた。熱誘導エピトープ賦活化法を、Ｂｏｒｇ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中で、Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ２１００加圧調理器（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施し、室温（ＲＴ）まで２０分間（ｍｉｎ）冷却した。内在性ペルオキシダーゼを、Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ １（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を室温で１０分間用いて停止した。非特異的なタンパク質相互作用を、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｐｕｎｉｓｈｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を室温で１０分間用いて阻止した。組織切片を、０．５μｇ／ｍＬの一次抗体と共に室温で一時間インキュベートした。一次抗体は、ウサギ抗ＰＴＫ７クローン（Ｓｔｅｍ ＣｅｎｔＲｘ（商標）Ｉｎｃ）またはウサギイソ型対照（ＤＡ１Ｅ）ｍＡｂ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）ＸＰ（登録商標）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 商品番号３９００）のどちらかであった。一次抗体の結合を、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ（登録商標）Ｂｏｏｓｔ ＩＨＣ検出試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 商品番号８１１４）を室温で３０分間用いて検出した。染色を、ＤＡＢ＋（３’，３’−ジアミノベンジジン；ＤＡＫＯ）を室温で５分間用いて発色させた。スライドガラスをＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中で短時間対比染色し、水中で洗浄し、段階的なアルコール類中で脱水し、キシレン中で透徹し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（商標）封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と一緒にカバーガラスをかぶせた。

【0348】

ＰＴＫ７は、ＰＤＸモデルの全部において、形質膜上で観察された（図３）。
実施例５
様々な腫瘍組織におけるＰＴＫ７の発現
ＰＴＫ７のｍＲＮＡ発現を、原発ヒト腫瘍において決定した。簡潔には、凍結された腫瘍および正常組織を断片化し、ｍＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０６）を用いて単離した。ＲＮＡの定量化および質の評価を、ＨＴ ＲＮＡ微小流体ＬａｂＣｈｉｐアッセイおよびＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ微小流体キャピラリー電気泳動機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施した。試料のそれぞれに関するＲＮＡを、量が機器の線形範囲（２５〜２５０ｎｇ／μＬ）内に入るように希釈した。単離されたＲＮＡ試料を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（カタログ番号４３８７４０６）を製造業者の指示において概説されているプロトコルに従って用いて逆転写してｃＤＮＡにした。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎプローブベース遺伝子発現分析およびＡＢＩ ＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。標的遺伝子および内因性対照を、予め製作された（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）ＴａｑＭａｎ低密度アレイカード上に配置されたそれぞれのプローブに関して４通りで運転した。ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｉｔｅソフトウェアｖ１．０．３（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、試料の大部分に関する信号増幅に関する自動化された閾値を生成した。自動化された閾値を手作業で調整することは稀にしかなかった。結果として３５より大きいＣｔ値をもたらす増幅プロットは破棄され、Ｃｔ値を生成したが対数増幅の傾向を示さなかったプロットも破棄された。全てのＣｔ値は、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｉｔｅソフトウェアから送出され、相対的定量化計算がＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ）において実施された。

【0349】

図４Ａ〜Ｃは、（Ａ）乳癌、（Ｂ）ＮＳＣＬＣおよび（Ｃ）卵巣癌におけるＰＴＫ７のレベルを示している。ＰＴＫ７発現の定量化を、相対的倍率差（ｆｏｌｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＲＱ）または比較Ｃｔ法、（２^{−ΔΔＣｔ}）法を用いて、方程式ＲＱ＝２^{−ΔΔＣｔ}を用いて評価した。ＲＱデータは、対照ＲＮＡ試料と比較した倍率差ＰＴＫ７発現を表す。乳癌試料に関して、ＢｉｏＣｈａｉｎから購入された正常乳房ＲＮＡ試料（カリフォルニア州ニューアーク、カタログ番号Ｒ１２３４０８６−５０、ロット番号Ｂ６１０１８９、７５歳女性）を用いてＲＱデータを生成した。肺癌に関して、報告されたＲＱデータは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入された正常肺ＲＮＡ（カタログ番号ＡＭ７９６８、ロット番号１３０８０１７、８０歳女性）と比較したＰＴＫ発現における倍率差を表す。卵巣癌試料に関して、報告されたＲＱデータは、クリーブランド診療所（オハイオ州クリーブランド）により提供された正常卵巣組織（組織ＩＤ番号０２０４Ｃ０１１Ｃ）から単離されたＲＮＡと比較したＰＴＫ発現における倍率差を表す。全ての腫瘍に関するＲＱ値は、正常ヒト組織からのＲＮＡプール（ＢｉｏＣｈａｉｎ、カタログ番号Ｒ４２３４５６５、ロット番号Ｂ６１１０４３）と、ならびにユニバーサルヒト参照ＲＮＡプール（Ａｇｉｌｅｎｔ、カタログ番号７４００００）とも比較して計算され、それは１０種類の独特の癌細胞株からの等分のＲＮＡで構成されている。

【0350】

乳房、ＮＳＣＬＣおよび卵巣腫瘍は、対応する正常組織と比較して増大したＰＴＫ７のｍＲＮＡ発現を示した（図４Ａ〜Ｃ）。ＴＮＢＣにおける過剰発現は、最も顕著であり、一方で、卵巣腫瘍における過剰発現は、中程度であった。

【0351】

図５は、ＮＳＣＬＣ患者におけるより高いＰＴＫ７のｍＲＮＡ発現およびより悪い全生存の間の相関を示す。ＰＴＫ７発現が肺癌における生存エンドポイントと関係しているかどうかを決定するため、カプラン・マイヤー分析を、フリーウェアhttp://kmplot.com/analysis(Gyorffy et al., 2013, PloS One. 18;8(12):e82241)を用いて生物情報学データセットに適用した。ＰＴＫ７のｍＲＮＡレベルおよび患者の生存データを、７１９人のＮＳＣＬＣ腺癌患者に関してツールの自動選択による最高カットオフを用いてプロットした。高いＰＴＫ７発現は、より短い生存と関係していた（ハザード比ＨＲ＝４．０６、対数順位Ｐ＝１．１Ｅ−１６）。

【0352】

ＰＴＫ７のタンパク質発現を、食道癌において観察した。組織マイクロアレイ（ＵＳ ＢｉｏｍａｘからのＥＳ１５０２）を免疫組織化学のために用いた。簡潔には、ホルマリン固定されたパラフィン包理された腫瘍ブロックからの切片を、５ミクロンで切断し、スライドガラス上に載せた（ｂａｋｅｄ）。そのスライドガラスをキシレン中で透徹し、脱イオン水で終了する段階的なアルコール類での洗浄で再水和させた。スライドガラスを、Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒ ２１００（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）においてｐＨ６のクエン酸ＨＩＥＲ緩衝液中で賦活化した。過酸化された過酸化水素ブロッキング溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を、スライドガラスに１０分間適用した。スライドガラスをＴＢＳＴで２回洗浄し、続いてＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｐｕｎｉｓｈｅｒ、タンパク質ブロッキング試薬（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋ）（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で１０分間洗浄した。一次抗体であるＨ．２３５（ロット番号：１１０３２５ＭＭ、ストック濃度：１２．７ｍｇ／ｍＬ）を、２ｕｇ／ｍＬの濃度で６０分間適用した。ＴＢＳＴによる洗浄（２回）後、二次抗体であるＤＡＫＯ抗マウスＥｎｖｉｓｉｏｎ＋を３０分間適用した。ＴＢＳＴにより再度洗浄（２回）した後、スライドガラスをＢｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ＋（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を５分間用いて発色させた。次いで、スライドガラスをＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で３０秒間対比染色し、カバーガラスをかぶせた。

【0353】

７０の腫瘍試料の内の４０は、細胞膜上のＰＴＫ７発現に関して陽性と採点された。ＰＴＫ７陽性であった４０の試料の内で、１つは高い発現を示し、１１は中程度の発現を示し、２８は低い発現を示した。

【0354】

ＰＴＫ７タンパク質発現が前立腺癌において見られた。組織マイクロアレイ（ＢｉｏｍａｘからのＢＣ１９０１３）を、上記で食道癌に関して記載されたような免疫組織化学に関して用いた。２６の腫瘍試料の内の１１が、ＰＴＫ７発現に関して陽性と採点された。ＰＴＫ７陽性であった１１の試料の内で、２つは中程度の発現を示し、９つは低い発現を示した。

【0355】

実施例６
血清中のＰＴＫ７タンパク質の測定
文献における報告は、結果として細胞外ドメインの一部の脱落をもたらす形質膜におけるＰＴＫ７の切断を特性付けている(Golubkov et al., 2010, J Biol Chem 285(46):35740-9; Golubkov et al., 2012, J Biol Chem 287(50):42009-18; Na et al., 2012, J Biol Chem 287(30):25001-9)。循環する抗原は、ＰＴＫ７ ＡＤＣのような療法化合物の薬物動態に影響を及ぼし得る。脱落したＰＴＫ７の循環レベルを、様々な血清の源から評価した。ＰＴＫ７タンパク質レベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ（登録商標））プラットフォームを用いる定量アッセイにより測定した。

【0356】

健康なヒトからの血清試料を、スタンフォード大学血液銀行から購入した。癌患者からの血清試料を、Ａｓｔｅｒａｎｄ ＩｎｃおよびＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃから購入した。カニクイザルの血清試料を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ Ｉｎｃから購入した。

【0357】

マウス血清試料を、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫無防備マウスから得た。メスの非肥満糖尿病−重症複合免疫不全（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ）マウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標）から購入し、施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って収容した。患者由来異種移植片（ＰＤＸ）を、新しく摘除されたヒト腫瘍試料の直接移植により確立し、異種移植片を未処置の動物中に継代することにより繁殖させた。異種移植片は、被験者保護に関する施設内審査委員会の承認に従って、そして医療保険の携行性と責任に関する法律（ＨＩＰＡＡ）の規制に従って臨床現場から調達された原発腫瘍摘除試料に由来していた。

【0358】

ＰＴＫ７タンパク質のレベルを測定するためのアッセイは、ハイブリドーマ技術により生成された２種類の特異的な抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を利用した。そのｍＡｂは、ヒトおよびカニクイザルのＰＴＫ７に結合するが、マウスのＰＴＫ７には結合しない。そのアッセイは、ＭＳＤ（登録商標）プラットフォーム上で開発され、線形応答に関して最適化された。ＭＳＤ（登録商標）高結合プレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１μｇ／ｍｌのＰＴＫ７特異的ｍＡｂ Ｈ２．３５でコートした。プレートを４℃で一夜インキュベートした。次の日に、プレートを洗浄し、第２のｍＡｂを添加した。ヒトおよびサルの試料に関して、２５μｌのスルホタグ化ＰＴＫ７特異的ｍＡｂ ６Ｍ３８をＭＳＤ（登録商標）希釈液２（ＭＳＤ 商品番号Ｒ５１ＢＢ−４）中０．５μｇ／ｍｌで添加し、腫瘍を有するマウス試料に関して、ビオチン化６Ｍ３８をＭＳＤ（登録商標）希釈液２（ＭＳＤ 商品番号Ｒ５１ＢＢ−４）中０．５μｇ／ｍｌで添加し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンを添加した。プレートを振盪しながら３０分間インキュベートした。インキュベーション後、洗浄せずに、血清試料または様々な量の組み換えＰＴＫ７タンパク質をウェルに添加し、プレート振盪機上で２時間インキュベートした。血清試料をＭＳＤ（登録商標）希釈液２中で４倍希釈して終濃度２５％にした。プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。ＭＳＤ（登録商標）１×読み取り緩衝液（ＭＳＤ 商品番号Ｒ９２ＴＣ−３）をプレートに添加し（ウェルあたり１５０μｌ）、プレートをＭＳＤ（登録商標）Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ上で読み取った。血清試料に関する値は、組み換えタンパク質に基づく標準曲線から内挿された。

【0359】

ヒト血清中のＰＴＫ７タンパク質のレベルを、健康なヒトおよび８種類の腫瘍型を代表する癌患者からの試料において測定した。結果が表１０において要約されている。それぞれのカテゴリーにおける報告された値は、全ての個々の試料の平均を示す。健康なヒトからの血清中のＰＴＫ７の平均値は、１２．４±３．３ｎｇ／ｍＬであった。一般に、癌患者に関する平均値はわずかに高く、２４．６±３．８ｎｇ／ｍＬまでの範囲であり、より広い個々の値の分布を有していた（図６）。

【0360】

【表10】

【0361】

未処置のカニクイザルの血清中のＰＴＫ７タンパク質のレベルを、２９匹の動物からの試料において測定した。平均値は、３５．８±１３．４ｎｇ／ｍＬであり（表１１）、それは健康なヒトおよび癌患者に関する対応する値よりも高い。

【0362】

【表11】

【0363】

マウス血清試料を、ヒト腫瘍異種移植片を有する免疫無防備マウスから得た。具体的には、異種移植片は、典型的にはそれらが由来するヒト腫瘍の構造および遺伝子型を保っているＰＤＸであった(DeRose et al, 2011, Nat Med 17(11):1514-20)。全ての１１の腫瘍型に関する血清中のＰＴＫ７タンパク質の平均値は、全ての腫瘍型に関して１ｎｇ／ｍＬ未満であり（表１２）、従ってヒトおよびサルに関して得られた値より有意に低かった。アッセイで用いられたｍＡｂはマウスのＰＴＫ７と交差反応しないため、その値は腫瘍異種移植片から脱落したヒトＰＴＫ７タンパク質であり、正常なマウス組織ではないと解釈される。

【0364】

【表12】

【0365】

実施例７
内在化
抗体の内在化は、ＡＤＣをＰＴＫ７発現細胞における細胞毒性のために送達するための重要な特徴である。抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２４は、癌細胞中に内在化することが観察され、それは、その抗体が毒素を細胞中に送達するための適切なビヒクルであることを示唆している。接着細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて解離させ、細胞培養培地で中和し、次いで計数した。細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中にウェルあたり５×１０^５細胞／１００μＬ培地で分割した（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）。プレートを３００×ｇで４℃において５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を吸引した。全ての試薬は、その後の工程のために氷上で保たれた。

【0366】

それぞれの細胞のペレットを、１００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中３μｇ／ｍｌのｈｕ２４または非結合抗体（Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で再懸濁した。プレートを氷上で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離し、細胞のペレットを２００μＬのＰＢＳ３％ＢＳＡ中で洗浄した。細胞のペレットを、１００μＬの３７℃で予め温めた細胞培養培地中で再懸濁し、３７℃のインキュベーター中に１〜４時間置いた。４℃でインキュベートされるべき細胞のペレットは、同様に再懸濁され、次いで氷上に置かれた。インキュベーション後、試料を遠心分離し、上清を吸引し、２００μＬ／ウェルの氷冷ＰＢＳ中３％ＢＳＡで洗浄し、１００μＬ／ウェルの氷冷ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で再懸濁し、氷上に置いた。次いで、全ての試料を遠心分離し、上清を吸引し、それぞれの細胞のペレットを、１００μＬの氷冷ＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で１：５０希釈されたアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片中で再懸濁した。プレートを氷上で３０分間インキュベートし、次いで遠心分離し、細胞のペレットを２００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で洗浄し、１００μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡ中で再懸濁し、２５０μＬのＰＢＳ中３％ＢＳＡを含有する５ｍＬのポリカーボネートチューブに移した。試料を、死細胞染色試薬として試料あたり５μＬの７−ＡＡＤを用いてフローサイトメトリーにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、それぞれの試料に関して、生存不能細胞を分析から除外して測定した。“％内在化”に関する値を、（１００％−［インキュベーション後のＭＦＩ／インキュベーション前のＭＦＩ］）として計算した。表１３における結果は、ｈｕ２４抗体が試験された全ての細胞株中に内在化したこと、そして内在化は温度依存性であり、従って細胞による能動的な（受動的ではない）内在化を反映していたことを示している。

【0367】

【表13】

【0368】

実施例８
サポリンコンジュゲート抗ヒトＦａｂ断片により媒介される細胞毒性
ｈｕ２３またはｈｕ２４抗体が細胞株への細胞毒性剤の送達を媒介することができるかどうかを決定するため、インビトロ細胞毒性アッセイを実施した。これに関して、サポリン毒素に共有結合した抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ断片（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を未標識のｈｕ２３、ｈｕ２４または８．８４ Ａｂ（結合しない陰性対照抗体）と組み合わせ、次いで細胞と一緒に４日間（ＰＴＫ発現細胞Ｈ４４６およびＤＭＳ１１４）または７日間（ＯＥ１９非ＰＴＫ７発現細胞；ＯＥ２１ ＰＴＫ７発現細胞）インキュベートし、その後細胞生存度を測定した。

【0369】

ある実験において、Ｈ４４６またはＤＭＳ１１４癌細胞株を、透明な平底組織培養プレート中に、１００μｌの細胞培養培地中でウェルあたり９６００細胞（Ｈ４４６）またはウェルあたり６４００細胞（ＤＭＳ１１４）でまいた。細胞を５％ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃で一夜インキュベートした。次の日に、５０μｌの、サポリンコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ（Ｆａｂ−ＺＡＰ；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と１：２のモル比で予め混合されたｈｕ２３、ｈｕ２４または８．８４ Ａｂを、１μｇ／ｍｌで出発して細胞培養培地中で１：３希釈する３通りの試料での１０点濃度曲線において細胞に添加した。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で４日間インキュベートした。細胞生存度を測定するため、ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ 水性非放射性細胞増殖アッセイ）を供給業者の説明書に従って用いた。３０μＬの組み合わせたＭＴＳ試薬をそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２時間インキュベートした。光学密度（ＯＤ）を、９６ウェルプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおいて決定した。培地のみを含むウェルからの平均の読みを、バックグラウンドＯＤに関して対照するために細胞を含むウェルの読みから減算した。細胞生存度が５０％阻害される一次抗体の濃度（ＩＣ５０）を決定するため、データに対してロジスティック非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を行った。

【0370】

表１４におけるデータは、抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３およびｈｕ２４の両方がＨ４４６およびＤＭＳ１１４細胞にサポリンに媒介される細胞毒性を与え、一方で８．８４陰性対照抗体はサポリンに媒介される細胞毒性を与えなかったことを示している。その結果は、ｈｕ２３およびｈｕ２４の活性はＰＴＫ７発現細胞に特異的であったことを実証している。

【0371】

【表14】

【0372】

別の実験において、サポリンアッセイを食道癌由来の２種類の細胞株であるＯＥ１９およびＯＥ２１（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に対して実施した。その細胞株におけるＰＴＫ７発現を決定するため、細胞を培養し、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一細胞懸濁液を分離した。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で洗浄し、５μｇ／ｍＬの濃度のｈｕ２４抗体またはＨｕＩｇＧ１（イソ型対照）と共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ ＦＣＳ中で再度洗浄し、次いで１：２００でヒトＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に２０分間インキュベートした。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩ中で再懸濁し、次いでＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ上で分析して平均蛍光強度における変化（ΔＭＦＩ）を決定した。ＯＥ１９細胞は、イソ型対照を上回る染色蛍光を示さず（ΔＭＦＩ＝０）、一方でＯＥ２１細胞は、蛍光強度におけるほぼ２ログの増大を示し（ΔＭＦＩ＝５９７６）、それは、ＯＥ２１（食道扁平上皮癌）の表面上のＰＴＫ７の発現を示した。

【0373】

ｈｕ２４が細胞毒性剤の送達を媒介し得るかどうかを決定するため、ＯＥ２１またはＯＥ１９のどちらかからの２５００細胞/ウェルの解離した単一細胞懸濁液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に培地中でまいた。まいた１日後、様々な濃度の精製されたｈｕ２４および一定濃度の４ｎＭのサポリンに共有結合した抗ＨｕＩｇＧ Ｆａｂ断片（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、培養物に添加した。７日間のインキュベーション後、生存可能な細胞の数を、ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ ＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の説明書通りに用いて数えた。サポリンＦａｂ断片を含む細胞を含有する培養物を用いた生発光計数を１００％参照値として設定し、全ての他の計数をそれに従って計算した（“標準化されたＲＬＵ”と呼ばれる）。このアッセイを用いて、表１５において示されているように、ｈｕ２４はＯＥ２１細胞に対して細胞毒性を媒介するが、ＯＥ１９細胞に対しては細胞毒性を媒介せず、そしてイソ型対照は細胞計数に影響を及ぼさないことが実証された。これらの結果は、抗体ｈｕ２４の細胞結合はＰＴＫ７発現細胞に対するサポリンに媒介される細胞毒性を引き出すために必要であるが、非ＰＴＫ７発現細胞には作用を有しないことを示している。

【0374】

【表15】

【0375】

実施例９
ｖｃ０１０１およびｍｃ８２６１の合成
ｖｃ０１０１（ｖｃはリンカーであり、０１０１は薬物である）およびｍｃ８２６１（ｍｃはリンカーであり、８２６１は薬物である）の合成は、国際公開第２０１３／０７２８１３号において記載されている方法に従って調製され、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0376】

Ａ．ｖｃ０１０１の合成に関する実験法
Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（２１Ｓ，２４Ｓ，２５Ｒ）−２４−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−２５−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−１８，１８，２３−トリメチル−３，１６，１９，２２−テトラオキソ−２１−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３，２６−ペンタオキサ−４，１７，２０，２３−テトラアザヘプタコサ−１−イル］フェニル｝−Ｎ〜５〜−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミド（ｖｃ０１０１）の調製。

【0377】

【化3】

【0378】

工程１．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５３）の合成。化合物＃３２（２．０５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（２０ｍＬ、０．１Ｍ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中における溶液に、アミン＃１９（２．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）およびトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。その混合物を室温で撹拌し、一方で反応の進行をＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣによりモニターした。一度完了したら、反応を真空中で濃縮し、残留物をヘプタン類と共に３回共沸させ、結果として得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中０％〜５５％アセトン）により精製すると、化合物＃５３（２．４２ｇ、７４％）が固体として生成された。LC-MS: m/z 965.7 [M+H⁺]、987.6 [M+Na⁺]、保持時間＝1.04分(プロトコルH-下記)；HPLC (プロトコルA-下記)：m/z 965.4 [M+H⁺]、保持時間＝11.344分(純度＞97%)；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)（回転異性体の混合物であると推定される）、特徴的な信号：δ7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79 (d, J=3.2 Hz), 総1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 総1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Hz), 総1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 総1H], 3.13, 3.17, 3.18および3.24 (4 s, 総6H), 2.90および3.00 (2 br s, 総3H), 1.31および1.36 (2 br s, 総6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 総3H]。

【0379】

工程２．０１０１：２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４）の合成。

【0380】

化合物＃５３（７０１ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン中における溶液（１０ｍＬ、０．０７Ｍ）に、ジエチルアミン（１０ｍＬ）を添加し、反応混合物を室温で攪拌し、一方で反応の進行をＬＣ−ＭＳおよびＴＬＣによりモニターした。一度完了したら、反応を真空中で濃縮し、残留物をヘプタン類と共に３回共沸させ、結果として得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン０％〜１０％メタノール）により精製した。残留物をジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、真空中で濃縮すると、＃５４（４０６ｍｇ、７５％）が白色固体として得られた。LC-MS: m/z 743.6 [M+H⁺]、保持時間＝0.70分(プロトコルF-下記)；HPLC (プロトコルA-下記): m/z 743.4 [M+H⁺]、保持時間＝6.903分、(純度＞97%)；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)（回転異性体の混合物であると推定される）、特徴的な信号：δ[8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7 Hz), 総1H], [8.04 (br d, J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 総1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.80 (d, J=3.2 Hz), 総1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 総1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Hz), 総1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 総1H], 3.16, 3.20, 3.21および3.25 (4 s, 総6H), 2.93および3.02 (2 br s, 総3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 総3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7 Hz), 総3H], 0.73-0.80 (m, 3H)。

【0381】

工程３．ｖｃ０１０１：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ−｛４−［（２１Ｓ，２４Ｓ，２５Ｒ）−２４−［（２Ｓ）−ブタン−２−イル］−２５−（２−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−２−オキソエチル）−１８，１８，２３−トリメチル−３，１６，１９，２２−テトラオキソ−２１−（プロパン−２−イル）−２，７，１０，１３，２６−ペンタオキサ−４，１７，２０，２３−テトラアザヘプタコサ−１−イル］フェニル｝−Ｎ〜５〜−カルバモイル−Ｌ−オルニチンアミドの合成。

【0382】

化合物０１０１（＃５４）のリンカーｖｃ（Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド）（ＭａｌｃＶａｌＣｉｔＰＡＢＣ−ＰＮＰ）へのカップリングは、一般手順Ｅ（下記）に従って、適切な量のＤＭＡを溶媒として、ならびにＨＯＡＴおよび２，６−ルチジンを添加剤として用いて成し遂げられ、結果として得られた粗製の所望の物質を、方法Ｄ（下記）に従って精製すると、３３ｍｇ（３６％）の所望の生成物が得られた。４５℃で維持されたカラムを用いるプロトコルＡ（下記）において明記されている条件下で、この物質は、9.114分のHPLC保持時間(プロトコルA-下記)；LC-MS: m/z 1342.6 [M+H⁺]、保持時間3.48分(プロトコルH-下記)を与えた。

【0383】

Ｂ．ｍｃ８２６１の合成に関する実験法
Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（ｍｃ８２６１）の調製。

【0384】

【化4】

【0385】

工程１．メチル Ｎ−｛（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−３−［（２Ｓ）−ピロリジン−２−イル］プロパノイル｝−Ｌ−フェニルアラニネート塩酸塩（＃６７）の合成。一般手順Ｃ（下記）に従って、ジオキサン中の＃３７（２．３９ｇ、５．３３ｍｍｏｌ、１当量）（１０ｍＬ、０．５３Ｍ）およびジオキサン中４Ｍ塩酸溶液（１０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ、７．５当量）から、＃６７（２．２１ｇ）が白色固体として合成され、それをそれ以上精製せずに次の工程において用いた。LC-MS: m/z 349.2 [M+H⁺]、保持時間＝0.53分；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ9.45-9.58 (br m, 1H), 8.63 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.51-8.62 (br m, 1H), 7.25-7.33 (m, 4H), 7.18-7.25 (m, 1H), 4.50 (ddd, J=10.8, 8.1, 4.5 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.54 (dd, J=6.8, 4.5 Hz, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.11 (dd, J=13.8, 4.5 Hz, 1H), 2.99-3.14 (br m, 3H), 2.89 (dd, J=13.8, 10.9 Hz, 1H), 2.44-2.50 (m, 1H, 推定；溶媒のピークにより部分的に不明瞭である), 1.77-1.89 (m, 1H), 1.60-1.73 (m, 2H), 1.46-1.57 (m, 1H), 1.05 (d, J=6.8 Hz, 3H)。

【0386】

工程２．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃６８）の合成。一般手順Ｄ（下記）に従って、ジクロロメタン中の＃３２（３５３ｍｇ、０．４８８ｍｍｏｌ、１当量）（１０ｍＬ、０．０４Ｍ）

【0387】

【化5】

【0388】

、アミン＃６７（２７１ｍｇ、≦０．５８８ｍｍｏｌ、１．３当量）、ＨＡＴＵ（２２３ｍｇ、０．５８６ｍｍｏｌ、１．２当量）およびジイソプロピルエチルアミン（２３８μＬ、１．７１ｍｍｏｌ、３．５当量）から、粗製の所望の物質を合成し、それをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中０％〜４０％アセトン）により精製すると、＃６８（２工程かけて４０４ｍｇ、８８％）が固体として得られた。LC-MS: m/z 940.7 [M+H⁺]、962.7 [M+Na⁺]、保持時間＝1.04分；HPLC(プロトコルC-下記):保持時間＝9.022分；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)（回転異性体の混合物であると推定される）、特徴的な信号：δ[8.25 (br d, J=8 Hz)および8.48 (br d, J=8 Hz), 総1H], 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.31-7.36 (m, 2H), 7.14-7.24 (m, 5H), 4.43-4.69 (m, 3H), 4.17-4.26 (m, 3H), 3.91-3.99 (br m, 1H), 3.63および3.65 (2 s, 総3H), 3.19および3.24 (2 s, 総3H), 3.14および3.15 (2 s, 総3H), 2.90および2.99 (2 br s, 総3H), 1.36および1.37 (2 br s, 総3H), 1.30および1.32 (2 s, 総3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz)および1.06 (d, J=6.6 Hz), 総3H]。

【0389】

工程３Ａ．８２６１：２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドトリフルオロ酢酸塩（＃６９）の合成
＃６８（１４３ｍｇ、０．１５２ｍｍｏｌ、１当量）のテトラヒドロフラン中における溶液（５ｍＬ、０．０２Ｍ）に、水酸化リチウム（９．１０ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ、２．５当量）の水（３ｍＬ）中における溶液を添加した。５時間後、反応を真空中で濃縮し、ヘプタンと共に３回共沸させ、ジメチルスルホキシド（２．２ｍＬ）中で溶解させ、逆相クロマトグラフィー（方法Ｃ−下記）により精製すると、＃６９（５６ｍｇ、５２％）が得られた。HPLC (45℃におけるプロトコルA-下記): 704.4 [M+H⁺]、保持時間＝6.623分；¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)（回転異性体の混合物であると推定される）、特徴的な信号：δ8.08-8.22および8.37-8.49 (2 m, 総5H), 7.12-7.28 (m, 5H), 3.18, 3.20および3.24 (3 s, 総6H), 2.95および3.04 (2 br s, 総3H), 1.52および1.53 (2 s, 総3H), 1.39および1.41 (2 s, 総3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz)および1.05 (d, J=6.6 Hz), 総3H], 0.74-0.81 (m, 3H)。

【0390】

工程４：ｍｃ８２６１：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドの合成。

【0391】

【化6】

【0392】

化合物８２６１（＃６９）のリンカーマレイミドカプロイル（ｍｃ）：

【0393】

【化7】

【0394】

へのカップリングは、一般手順Ｄ（下記）に従って成し遂げられ、結果として得られた粗製の所望の物質を方法Ｃ（下記）に従って精製すると、３０．２ｍｇ（２４％）の所望の生成物が得られた。４５℃で維持されたカラムを用いるプロトコルＡ（下記）において明記されている条件下で、この物質は、9.058分(プロトコルA-下記)のHPLC保持時間；LC-MS: m/z 897.7 [M+H⁺]、保持時間0.81分(プロトコルH-下記)を与えた。

【0395】

Ｃ．一般手順、方法およびプロトコル
一般手順Ｃ：ジオキサン中の塩酸を用いるＢｏｃ除去またはｔｅｒｔ−ブチルエステル（ｔ−Ｂｕエステルとも呼ばれる）の切断。Ｂｏｃ含有化合物またはｔｅｒｔ−ブチルエステル含有化合物のどちらかのジオキサン（またはある場合には溶液なし、または他の適切な溶媒）中における溶液に、塩酸のジオキサン中における４Ｍ溶液を添加した。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳ（またはＨＰＬＣまたはＴＬＣ）によりモニターした。反応を真空中で濃縮し、ある場合にはヘプタン類と共に１〜４回共沸させた。

【0396】

一般手順Ｄ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）を用いたカップリング。アミン（１．０当量）および酸（１．０〜２．０当量）のジクロロメタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦとも呼ばれる）、または両方の混合物中における攪拌溶液に、ＨＡＴＵ（１．０〜２．０当量）を添加し、続いてトリエチルアミン（２．０〜４．０当量）またはジイソプロピルエチルアミン（２．０−４．０当量、ヒューニッヒ塩基とも呼ばれる）を添加した。反応の進行を、ＬＣ−ＭＳ（またはＨＰＬＣまたはＴＬＣ）によりモニターし；反応は通常は３時間以内に完了した。溶媒を真空中で除去した。残留物を、シリカゲルもしくは逆相クロマトグラフィーにより精製し、またはある場合にはヘプタン類と共に３回共沸させ、少量の酢酸エチルで希釈した後、低減して（ｒｅｄｕｃｅｄ ｄｏｗｎ）シリカもしくはＣ１８結合シリカ上に載せ、シリカゲルまたは逆相クロマトグラフィーにより精製した。

【0397】

一般手順Ｅ：Ｎ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（ＭａｌｃＶａｌＣｉｔＰＡＢＣ−ＰＮＰ）を用いたカップリング。ペイロードであるアミン（１当量）およびＮ−［６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサノイル］−Ｌ−バリル−Ｎ^５−カルバモイル−Ｎ−［４−（｛［（４−ニトロフェノキシ）カルボニル］オキシ｝メチル）フェニル］−Ｌ−オルニチンアミド（ＭａｌｃＶａｌＣｉｔＰＡＢＣ−ＰＮＰ、Eur. Pat. Appl. (1994)、EP624377、１．０〜２．０当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはジメチルアセトアミド（ＤＭＡとも呼ばれる）中における混合物に、ピリジン（０．０〜４．０当量）、ジイソプロピルエチルアミン（０．０〜４．０当量）、２，６−ジメチルピリジン（０．０〜４．０当量、２，６−ルチジンとも呼ばれる）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．０１〜１．１当量、ＨＯＢＴとも呼ばれる）または３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｂ］ジメチルピリジン−３−オール（０．０１〜１．１当量、ＨＯＡＴとも呼ばれる）を添加した。４０℃〜５０℃で１〜４８時間攪拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、ヘプタンと共に３回共沸させた。粗製の物質を、明記された方法に従う逆相クロマトグラフィーにより精製すると、所望の物質が得られた。

【0398】

方法Ｃ：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８、１００×３０ｍｍ、１０μｍ；移動相Ａ：水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：メタノール中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）；勾配：２０分間かけて１０％〜９０％Ｂ；流速：２０ｍＬ／分。温度：制御されない；検出：ＤＡＤ ２１０ｎｍ、２５４ｎｍ；注入体積：可変；機器：Ｇｉｌｓｏｎ。

【0399】

方法Ｄ：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ−ＲＰ、１５０×２１．２ｍｍ、４ｐｍ；移動相Ａ：水中０．１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸；勾配：１．５分間３０％Ｂ、８．５分間かけて３０％〜６０％Ｂ、０．５分間かけて６０〜１００％Ｂ、次いで２分間かけて１００％Ｂ；流速：２７ｍＬ／分；検出：ＤＡＤ ２１０〜３６０ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲１５０〜２０００５ダルトン；機器：Ｗａｔｅｒｓ ＦｒａｃｔｉｏｎＬｙｎｘ。

【0400】

プロトコルＡ：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）、１５０×３．０ｍｍ、５μｍ；移動相Ａ：水中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；勾配：１．５分間かけて５％Ｂ、８．５分間かけて５％〜１００％Ｂ、次いで１分間１００％Ｂ；流速：０．７５ｍＬ／分。温度：２５℃；検出：ＤＡＤ ２１５ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲１５０〜２０００ダルトン；注入体積：１０μＬ、機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＬＣＭＳ。

【0401】

プロトコルＣ：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）、１５０×３．０ｍｍ、５μｍ；移動相Ａ：水中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：メタノール中０．０２％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）；勾配：１０分間かけて５０％〜１００％Ｂ；流速：０．７５ｍＬ／分。温度：制御されない；検出：ＤＡＤ ２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；注入体積：１０μＬ；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ。

【0402】

プロトコルＦ：カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ、Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ；移動相Ａ：水中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；勾配：０．１分間かけて５％Ｂ、０．７分間かけて５％〜９５％Ｂ、０．１分間かけて９５％Ｂ；流速：１．２５ｍＬ／分、温度：６０℃；検出：２００〜４５０ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲１００〜１２００ダルトン；注入体積：５μＬ；機器：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ。

【0403】

プロトコルＨ：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ、Ｃ１８、４．６×５０ｍｍ、３μｍ、１１０Å；移動相Ａ：水中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）；勾配：４．１０分間かけて０％〜１００％Ｂ、線形、次いで０．４分間かけて１００％Ｂ；流速：１．５ｍＬ／分、温度：６０℃；検出：ＤＡＤ ２００〜４５０ｎｍ；ＭＳ（＋）範囲１００〜２０００ダルトン；注入体積：５μＬ；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ。

【0404】

実施例１０
抗ＰＴＫ７抗体のバイオコンジュゲーション
Ａ．抗ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１抗体−薬物コンジュゲート
本発明において、抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８をｖｃ０１０１にコンジュゲートさせて、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣおよびｈｕ５８−ｖｃ０１０１ ＡＤＣを生成し、またはｍｃ８２６１にコンジュゲートさせて、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１ ＡＤＣ、ｈｕ２４−ｍｃ８２６１ ＡＤＣおよびｈｕ５８−ｍｃ８２６１ ＡＤＣを生成した。ｈｕ２３、ｈｕ２４、およびｈｕ５８のｖｃ０１０１、ｍｃ８２６１へのコンジュゲーションは、システイン残基の側鎖の誘導体化により達成された。これらのシステインは、通常は鎖間ジスルフィド架橋として対になっており、ＩｇＧ１抗体上には４個のその保存された対（８個のシステイン残基を含む）が存在する。これらのジスルフィド結合の部分的還元は、ｖｃリンカー上のマレイミドハンドルを用いて官能化されることができる遊離のチオールの分布を提供する。具体的には、本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ｐＨ７．０および１ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）中の２．４モル過剰量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の３７℃で２時間の添加により部分的に還元された。次いで、ｖｃ０１０１またはｍｃ８２６１リンカー−ペイロードを反応混合物に７のリンカー−ペイロード／抗体モル比で添加し、１５％ｖ／ｖのジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）の存在下で２５℃でさらに１時間反応させた。１時間のインキュベーション期間の後、未反応のチオールをキャップするために３倍過剰量のＮ−エチルマレイミドを添加し、１５分間反応させた後、６倍過剰量のＬ−Ｃｙｓを添加して全ての未反応のリンカー−ペイロードを停止させた（ｑｕｅｎｃｈ）。

【0405】

反応混合物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中で４℃で一夜透析し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）により精製した。最終的なＡＤＣ薬物物質を、２０ｍＭヒスチジン、８５ｍｇ／ｍＬスクロース、ｐＨ５．８緩衝液中で配合した。

【0406】

抗ＰＴＫ抗体−薬物コンジュゲートは、純度に関してＳＥＣ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ならびに薬物抗体比（薬物装填）を計算するために用いられた液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ ＭＳ）によりさらに特性付けられた。タンパク質濃度は、紫外（ＵＶ）分光光度法により決定された。この方法は、抗体−薬物コンジュゲートを、おおよそ４ｍｏｌ／ｍｏｌの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を含有する官能化された抗体の不均質な混合物として提供する。

【0407】

薬物分布プロフィールを、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１に関してＨＩＣにより評価し、図７においてクロマトグラムで示した。簡潔には、分析的ＨＩＣをＴＳＫゲルブチル−ＮＰＲカラム上で実施した。ＡＤＣを、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウム、ｐＨ７中でカラムに結合させ、５０ｍＭリン酸水素二カリウムおよび２０％イソプロパノール（ＩＰＡ）、ｐＨ７で溶離させた。

【0408】

Ｂ．抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔ ＣＭ抗体−薬物コンジュゲート
本発明において、抗ＰＴＫ７抗体ｈｕ２３、ｈｕ２４およびｈｕ５８を、ＡｃＢｕｔ−Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジド（ＡｃＢｕｔＣＭ） ＯＳｕエステルにコンジュゲートさせて、下記に示されるようなｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣ、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣおよびｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣを生成し、ここで、Ｘはいずれかの抗体、例えばｈｕ２３、ｈｕ２４およびｈｕ５８であることができる。

【0409】

【化8】

【0410】

反応混合物は、１０ｍｇ／ｍｌ以下の抗ＰＴＫ７抗体およびＡｃＢｕｔＣＭ ＯＳｕエステルを４〜４．５対１のモル比で含んでいた。高い攪拌が、ＡｃＢｕｔＣＭの混合渦への添加の間に実施された。反応ｐＨは８．３であり、他の反応構成要素の濃度は以下の通りであった：１８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、４１ｍＭデカン酸ナトリウム、および８％（ｖ／ｖ）エタノール。反応は、３３℃で５分間実施された。コンジュゲーション反応が完了した後、反応混合物を混合しながら１．３体積のｐＨ８．５に調節された１Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４でゆっくりと希釈した。

【0411】

精製するため、希釈された上記の反応混合物を、予め５カラム体積（ｃｖ）の０．５２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）において平衡化されたＢｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ＨＩＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に２バッチで装填した。カラム上に装填されたタンパク質は、３．５ｍｇ／ｍｌのベッド体積であった。流速は、試料装填を通して１５ｍｌ／分、クロマトグラフィーの洗浄および溶離相全体を通して２２ｍｌ／分であった。この向上した勾配は、カラムに結合していたより高いＤＡＲのＡＤＣを取り外す。

【0412】

装填の間の未結合の画分は、主に反応試薬および未コンジュゲート抗体のほとんどであり、それは廃棄された。次いで、カラムを０．３ｃｖの０．５２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄して全ての残っている試薬を除去した。次いで、１ｃｖの０．５２Ｍから０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）までの段階勾配を用いて、あらゆる緩く結合した未コンジュゲート抗体を、存在する場合は低装填抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭと一緒に溶離させた。次いで、主な画分を、１ｃｖの０．４Ｍから５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）までの段階勾配を用いて溶離して、勾配の終了付近で３〜５の範囲のＤＡＲを有する抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭを提供した。より高いＤＡＲを有する抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭコンジュゲートが存在する場合、その画分は、２ｃｖの５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）の勾配、次いで純粋な脱イオン水の溶離を用いて溶離された。脱イオン水での溶離後に結合したままであったより高いＤＡＲを有するあらゆる抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭコンジュゲートは、２ｃｖの２０％エタノールを含有する１０ｍＭ水酸化ナトリウムを用いて溶離された。精製されたバッチは、３〜５のＤＡＲを有する抗ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭコンジュゲートを含有していた。

【0413】

この向上したコンジュゲーションおよび精製プロセスは、６未満である、ある側面において３〜５の範囲のＤＡＲを有するＡＤＣを生成した。さらに、そのプロセスは、より狭い装填の分布、例えば製品内でのより低い不均質性を生成した。コンジュゲーションおよび精製プロセスに対する向上は、さらに以下のものを含んでいた：１）ＡｃｔＢｕｔＣＭ対抗ＰＴＫ７抗体比を４〜４．５対１まで低下させて、より低いＤＡＲを有するＡＤＣを生成し、２）ＡｃｔＢｕｔＣＭの抗ＰＴＫ７抗体への添加の間に高い撹拌を実施して、低い量の未コンジュゲート抗体（遊離抗体）を有するＡＤＣを生成し、３）インキュベーション時間を６０〜９０分間と比較して５分間に低減して、少ない凝集体を提供し、そして４）エタノール量を６〜８％に低減して、少ない凝集体を提供する。両方のバッチからの精製されたプールされたピークを、凍結状態での保管を促進するため、配合された緩衝液に対して２回透析した。配合された緩衝液の組成は、２０ｍＭトリス、７．５％スクロース、０．０１％ポリソルベート８０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。

【0414】

実施例１１
ｈｕ２４ ｍＡｂおよびｈｕ２４ ＡＤＣの結合特徴
ｈｕ２４ ｍＡｂおよびｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣがＰＴＫ７のカニクイザルのオルソログに結合するかどうかを決定するため、カニクイザルのＰＴＫ７タンパク質をクローニングし、発現させた。配列分析は、そのタンパク質がヒトのＰＴＫ７タンパク質に９７．９％同一であることを明らかにした。

【0415】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施して、ヒトおよびカニクイザルのＰＴＫ７タンパク質の外部ドメインに対するｍＡｂおよびＡＤＣの結合特徴を特性付けた。結合は、ＳＰＲ分析により比較可能であると決定された。ヒトまたはカニクイザルのＰＴＫ７タンパク質に関するｍＡｂおよびＡＤＣの間の親和性における有意差はなかった（表１６）。全てのＫ_ｏｎ測定結果は、３倍の範囲内であり、全てのＫ_ｏｆｆ測定結果は、２倍の範囲内であり、その範囲は、当該分野において、典型的な系統的誤差の範囲内であり、従って生理学的に有意ではありそうにないと考えられる。

【0416】

【表16】

【0417】

抗ＰＴＫ７ ｍＡｂのＰＴＫ７オルソログに結合する能力を、サンドウィッチＥＬＩＳＡによっても評価した。簡潔には、ヒト、カニクイザル、ラットまたはマウスのＰＴＫ７−Ｈｉｓタグ化タンパク質を、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングにより捕捉させた。全ての抗原を、１μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェルで捕捉させた。ｈｕ２４ ｍＡｂおよびｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣを、８１０ｎｇ／ｍｌで出発して系列希釈し、洗浄およびブロッキングされたウェルに添加して、抗原への結合に関して試験した。ｍＡｂおよびＡＤＣの結合を、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートにより検出し、ＴＭＢ基質を用いて読み取った。

【0418】

ｍＡｂおよびＡＤＣは、両方ともＥＬＩＳＡにより比較可能なほどにヒトおよびカニクイザルのＰＴＫ７タンパク質に結合した（表１７）。ＳＰＲの結果と合わせて、これらの結果は、カニクイザルのＰＴＫ７への交差反応性を確証し、バイオコンジュゲーションプロセスがｍＡｂの観察された結合特徴を変化させないことを実証した。しかし、ｍＡｂもＡＤＣも、ヒトＰＴＫ７への結合を観察するために必要な抗原濃度よりも１００倍高い抗原濃度において、ラットまたはマウスのＰＴＫ７タンパク質への検出可能な結合を示さなかった（表１７）。ラットおよびマウスの抗原は、既知の交差反応する抗体への結合により、正しく折り畳まれていることが確証された（データは示されていない）。

【0419】

【表17】

【0420】

未コンジュゲートｈｕ２４およびｖｃ０１０１にコンジュゲートしたｈｕ２４を、ＰＴＫ７発現細胞に結合するそれらの能力に関して、フローサイトメトリーにより、実施例３において記載された方法を用いて比較した。簡潔には、培養されたＨ１９７５またはＥＫＶＸ細胞を回収し、４℃においてｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣまたは未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂと共にインキュベートした後、蛍光体にコンジュゲートした二次ｍＡｂおよび死細胞染色試薬と共にインキュベートし、次いでフローサイトメトリーにより分析した。

【0421】

表１８は、生存可能な細胞集団の平均チャンネル蛍光を提供する。比較可能なデータが、独立した複製実験において得られ、従って、ｈｕ２４のリンカーペイロードへのコンジュゲーションは、そのＰＴＫ７発現細胞への結合を変化させない。

【0422】

【表18】

【0423】

実施例１２
インビトロ細胞毒性アッセイ
抗体−薬物コンジュゲートｈｕ２４−ｖｃ０１０１の細胞毒性を、標的ＰＴＫ７を発現する細胞株において評価した。操作されたＨＥＫ２９３Ｔ−ＰＴＫ７過剰発現細胞株を、透明な平底組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中に、ウェルあたり１８０μＬの細胞培養培地あたり５００細胞でまいた。ヒト癌細胞株もこのアッセイで試験し、以前にそれらの増殖速度に従ってそれぞれの細胞株に最適であることが決定された密度でまいた（１５０μｌ中でＨ６６１は１５００細胞／ウェル、Ｈ４４６は９６００細胞／ウェル）。細胞を３７℃において５％ＣＯ_２インキュベーター中で一夜培養した。次の日に、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣおよび８．８４ Ａｂ−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ（陰性対照）を、細胞に、３または１０μｇ／ｍＬで出発して細胞培養培地中で１：３希釈する３通りの試料での１０点濃度曲線において添加した。プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で４日間インキュベートした。ＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ 水性非放射性細胞増殖アッセイ）を、供給業者の説明書に従って用いた。３０μＬ（Ｈ４４６、Ｈ６６１）または４０μＬ（ＨＥＫ２９３Ｔ−ＰＴＫ７）の組み合わせられたＭＴＳ試薬をそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター中で２時間インキュベートした。ＯＤを、９６ウェルプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおいて決定した。培地のみを含むウェルからの平均の読みを、バックグラウンドＯＤに関して対照するために細胞を含むウェルの読みから減算した。細胞生存度が５０％阻害される抗体−薬物コンジュゲートの濃度（ＩＣ５０）を決定するため、データに対してロジスティック非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を行った。

【0424】

表１９は、細胞毒性アッセイにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣに関するＩＣ５０値を提供する。全ての３種類の細胞株において、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、強力な細胞毒性を引き出し、一方で結合しない８．８４ Ａｂ−ｖｃ０１０１は、細胞毒性を引き出さなかった；これらのデータは、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１の強力な細胞毒性が、抗ＰＴＫ７抗体に依存していたことを実証している。

【0425】

【表19】

【0426】

実施例１３
抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートのインビボ有効性
抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲートの作用を、ヒト腫瘍患者由来異種移植片（ＰＤＸ）のインビボ成長においてさらに評価した。原発腫瘍摘除試料を、被験者保護に関する施設内審査委員会の承認に従って、そしてＨＩＰＡＡの規制に従って臨床現場から調達した。腫瘍断片は、氷上でＨｙｐｏｔｈｅｒｍａｓｏｌ（Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で保管および輸送され、成長因子の専売の混合物を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ）中に包理され、摘除の２４時間以内にメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体中に皮下移植された。マウスを、健康状態に関して毎日、そして腫瘍増殖に関して最初に目視検査により週２回モニターした。一度腫瘍が触知可能になったら、腫瘍体積の測定を始めて腫瘍成長を追跡し、細胞の倍加時間を概算した。腫瘍体積は、方程式Ｖ＝（Ａ^＊Ｂ^２）／２を用いて概算され、ここでＡは長軸であり、Ｂは短軸である。腫瘍が５００ｍｍ^３〜１，５００ｍｍ^３の体積に達した際に、それらを研究のためおよび患者由来異種移植片（ＰＤＸ）としての再移植のために回収した。系統に応じて、機械的および／または化学的解離を用いて個々の細胞を継代のために分離することができる。生きた細胞を、実験を受けていない（ｎａｉｖｅ）動物中に、動物あたり１０，０００〜５０，０００細胞で接種した。

【0427】

有効性試験のため、腫瘍を継代試験から回収し、細胞を解離させて単一細胞懸濁液にした。調製物を、トリパンブルー排除試験を用いて生きた細胞に関して計数し、マウスあたり１０，０００〜５０，０００細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ中で接種した。ＰＤＸの差次的成長速度を説明するため、ランダム化における最小限の腫瘍体積の分散を許容するために少なくとも２５％多い動物で開始した。腫瘍成長は、最初は触知可能性により追跡され、一度腫瘍体積が約３０ｍｍ^３に達したら測定を開始した。研究は、一度腫瘍を有するマウスのコホートが１４０ｍｍ^３〜１８０ｍｍ^３に達したら腫瘍サイズに基づいてランダム化された。動物に、腹腔内注射により、週２回２週間（ｑ４ｄｘ４）投与した。試験群を、ＩＡＣＵＣプロトコルに従って屠殺の必要が示された際に個々のマウスまたは群全体の腫瘍の測定結果が１２００ｍｍ^３に達するまで追跡した。選択された投与試験に関して、薬物動態学的顎下採血を、２時間、３６時間および７２時間の時点で実施した。１０μＬの量の血液を、すぐにピペットで９０μＬのＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中に入れた。試料を分析の前に−８０℃で保管した。それぞれの腫瘍の測定に関して、腫瘍体積±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が提供された。ＧＴ＝大きい腫瘍サイズにより終了した群。全ての試験は、分析されているものと同じリンカー−ペイロードにコンジュゲートした非結合性ｈＩｇＧ１抗体からなり、比較可能な薬物対抗体比（ＤＡＲ）および装填分布を有する対照抗体薬物コンジュゲートを含んでいた。

【0428】

表２０〜３７は、抗体−薬物コンジュゲートｈｕ２３−ｖｃ０１０１、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１、ｈｕ５８−ｖｃ０１０１、ｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭ、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭおよびｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭの、低い、中程度または高いことが決定された相対的ＰＴＫ７発現を有する様々なヒト腫瘍細胞を用いて確立されたＰＤＸモデルにおける有効性を実証している。

【0429】

Ａ．乳癌（ＢＲ）
表２０および図８は、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１、およびｈｕ５８−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが全て、ヒト乳房−１３（ＢＲ１３）トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）を用いたＰＤＸモデルにおいて、ビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であることを示している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、ＢＲ１３ ＰＤＸモデルにおいてｈｕ２３−ｖｃ０１０１およびｈｕ５８−ｖｃ０１０１の両方よりも有効であった。試験されたＰＴＫ７ ＡＤＣの全ては、ＴＮＢＣに関する標準治療処置であるドキソルビシンよりも有効であった。

【0430】

【表20】

【0431】

図９および１０は、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１、ｈｕ２４−ｍｃ８２６１、およびｈｕ５８−ｍｃ８２６１ ＡＤＣのＢＲ１３ ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）におけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１と比較した有効性を示している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１による処置は、２００日間を越える持続的な腫瘍退縮をもたらし、抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣと比較してより大きい腫瘍成長の阻害を実証した。

【0432】

表２１および図１１は、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１、およびｈｕ５８−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが全て、ヒト乳房−２２（ＢＲ２２）ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）を用いたＰＤＸモデルにおいて、ビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であることを示している。このモデルにおいて、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、ｈｕ５８−ｖｃ０１０１よりも有効であり、これは同じ標的（ＰＴＫ７）に対する類似の抗体が様々な程度の有効性を有することを実証している。試験されたＰＴＫ７ ＡＤＣの全てが、ＴＮＢＣに関する標準治療処置であるドセタキセルよりも有効であった。特に、ドセタキセルおよびＡＤＣの薬物構成要素であるオーリスタチン０１０１は、それらがチューブリン重合を阻害する点で類似の作用機序を有する。

【0433】

【表21】

【0434】

表２２は、ｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭ、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ、およびｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣが全て、ＢＲ２２ ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）においてビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であったことを示している。しかし、ｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭは、ｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭおよびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭの両方よりも有効であり、これは、同じ標的に対する類似の抗体を有する様々なペイロードの使用の予測不能な性質を説明している。ｈｕ２３−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、ｈｕ５８−ｖｃ０１０１よりも有効であり、一方でｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭは、ｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭおよびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣの両方よりも有効であった。試験されたＰＴＫ７ ＡＤＣの全ては、ＴＮＢＣに関する標準治療処置であるドキソルビシンよりも有効であった。

【0435】

【表22】

【0436】

図１２および１３は、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１、ｈｕ２４−ｍｃ８２６１、およびｈｕ５８−ｍｃ８２６１ ＡＤＣのＢＲ２２ ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）におけるｈｕ２３−ｖｃ０１０１と比較した有効性を示す。ｈｕ２３−ｖｃ０１０１を用いた処置は、２００日間を越える持続的な腫瘍退縮をもたらし、抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣと比較してより大きい腫瘍成長の阻害を実証した。

【0437】

表２３〜２５および図１４は、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１、ｈｕ５８−ｖｃ０１０１、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１およびｈｕ２４−ｍｃ８２６１、ｈｕ５８−ｍｃ８２６１ならびにｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭ、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ、ｈｕ５８−ＡｃＢｕｔＣＭの乳房−３１（ＢＲ３１）ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）における有効性を示している。このモデルにおいて、ｖｃ０１０１リンカー−ペイロードを有する全ての３種類のＡＤＣは、ＡｃＢｕｔＣＭまたはｍｃ８２６１を有するＡＤＣよりも有効であった。この結果は、ＡｃＢｕｔＣＭリンカーペイロードは試験されたインビボＰＤＸモデルにおいて一般にｖｃ０１０１リンカーペイロードよりも強力であったため、意外であった。加えて、ＰＴＫ７−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、ドセタキセルよりも有効であり、ＰＴＫ７−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣは、ドキソルビシンよりも有効であった。ドセタキセルおよびドキソルビシンは、両方ともＴＮＢＣに関する標準治療である。

【0438】

【表23】

【0439】

【表24】

【0440】

【表25】

【0441】

表２６および図１５は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが、ヒト乳房−６４（ＢＲ６４）ＴＮＢＣ ＰＤＸモデル（中程度のＰＴＫ７発現）においてビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であったことを示している。そのデータは、ＰＴＫ７標的の中程度の発現を有するＰＤＸモデルがｈｕ２４−ｖｃ０１０１により有効に標的とされたことを実証している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、ＴＮＢＣに関する標準治療であるドセタキセルよりも有効であった。

【0442】

【表26】

【0443】

図１６は、ＢＲ５ ＴＮＢＣ ＰＤＸモデルにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１の有効性、および未コンジュゲートｈｕ２４の有効性の欠如を示している。ＢＲ５ヒト乳癌異種移植片を有するマウスに、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ、未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂまたはビヒクルを４日ごとに４サイクル（Ｑ４Ｄｘ４）投与した。腫瘍の測定結果は、デジタルキャリパーを用いて週２回記録され、平均±ＳＥＭとして示されている。３ｍｇ／ｋｇ用量のｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、４９日目を通して腫瘍成長のない腫瘍退縮を引き起こした。対照的に、未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂは、腫瘍成長を阻害しなかった（図１６）。従って、観察された有効性は、リンカー−ペイロードの送達に依存している。

【0444】

図１７は、ＢＲ３６ ＰＲ＋ ＴＮＢＣ ＰＤＸモデルにおけるパクリタキセルと比較したｈｕ２４−ｖｃ０１０１の有効性を示している。ＢＲ３６ヒト乳癌異種移植片を有するマウスに、Ｑ４Ｄｘ４でｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ、パクリタキセル、陰性対照ＡＤＣまたはビヒクルを投与した。腫瘍の測定結果は、デジタルキャリパーを用いて週２回記録され、平均±ＳＥＭとして示されている。３ｍｇ／ｋｇ用量のｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、１０３日目を通して腫瘍成長のない腫瘍退縮を引き起こした。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、ＭＴＤで投与されたパクリタキセルより性能が優れていた。陰性対照のＡＤＣは、中程度の活性しか示さなかった（図１７）。

【0445】

Ｂ．小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）
表２７〜２８におけるデータは、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣの小細胞肺癌−６４（ＬＵ６４）ＰＤＸモデル（低ＰＴＫ７発現）における有効性を説明している。このモデルにおいて、両方のＡＤＣは、この低ＰＴＫ７発現のＰＤＸにおいて有効であることが示されたが、ＡｃＢｕｔＣＭリンカーペイロードを有するＡＤＣは、ｖｃ０１０１リンカーペイロードを有するＡＤＣよりも有効であった。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭは両方とも、ＳＣＬＣに関する標準治療（シスプラチンおよびエトポシドである）よりも有効であった。

【0446】

【表27】

【0447】

【表28】

【0448】

表２９は、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１、ｈｕ２４−ｍｃ８２６１、およびｈｕ５８−ｍｃ８２６１ ＡＤＣのＬＵ６４ ＰＤＸモデル（低ＰＴＫ７発現）における有効性を示している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１を用いた処置は、このモデルにおいて抗−ｍｃ８２６１ ＡＤＣよりも大きい腫瘍成長の阻害を実証した。

【0449】

【表29】

【0450】

表３０〜３１は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１、ｈｕ２３−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣの小細胞肺癌−８６（ＬＵ８６）ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）における有効性を示している。このモデルにおいて、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１およびｈｕ２３−ｖｃ０１０１は両方とも腫瘍成長の抑制において有効であった。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、対照−ｖｃ０１０１ ＡＤＣよりも有効であった。しかし、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣは、ｖｃ０１０１リンカーペイロードを有するＡＤＣの両方よりも強力であり（表２２）、これは、ＳＣＬＣモデルにおけるｖｃ０１０１と比較したＡｃＢｕｔＣＭの一般的なより大きい効力のさらなる例を提供している。ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭは、ＳＣＬＣに関する標準治療であるシスプラチン＋エトポシドよりも有効であった。

【0451】

【表30】

【0452】

【表31】

【0453】

表３２は、ｈｕ２３−ｍｃ８２６１、ｈｕ２４−ｍｃ８２６１、およびｈｕ５８−ｍｃ８２６１ ＡＤＣのＬＵ８６ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）における有効性を示している。ｈｕ２３−ｖｃ０１０１を用いた処置は、ＬＵ８６ ＰＤＸモデルにおいて持続的な腫瘍退縮をもたらし、抗ＰＴＫ７−ｍｃ８２６１ ＡＤＣと比較してより大きい腫瘍成長の阻害を実証した。

【0454】

【表32】

【0455】

図１８Ａ〜Ｂは、０１０１またはＣＭのどちらかにコンジュゲートしたＰＴＫ７ ＡＤＣの、２つの異なるＳＣＬＣ ＰＤＸモデルであるＨ１０４８ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）およびＳＣＬＣ ９５ ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）それぞれにおける有効性を示している。

【0456】

図１９Ａ〜Ｂは、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭの、２つの異なるＳＣＬＣ ＰＤＸモデルであるＳＣＬＣ １１７ ＰＤＸモデル（中程度のＰＴＫ７発現）およびＳＣＬＣ １０２ ＰＤＸモデル（低ＰＴＫ７発現）それぞれにおける有効性を示している。その結果は、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭまたはｈｕ２３−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣは、ＳＣＬＣに対してｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣよりも有効であることを実証している。この発見は、他の腫瘍タイプ、例えばＴＮＢＣおよびＮＳＣＬＣのＰＤＸモデルにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１の強い抗腫瘍活性を考慮すると、意外である。加えて、その結果は、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣは低いＰＴＫ７発現を有するＳＣＬＣ１０２において最も弱い応答を引き出したため、ＡＤＣの活性がＰＴＫ７の発現と相関していることを示唆している。

【0457】

Ｃ．非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）
表３３および図２０は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが、ヒト非小細胞肺癌−１３５（ＬＵ１３５）ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）において、ビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であったことを示している。このデータは、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１のＮＳＣＬＣ ＰＤＸにおける腫瘍成長の抑制における有効性を実証している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、ＮＳＣＬＣにおける標準治療であるパクリタキセルよりも有効であった。

【0458】

【表33】

【0459】

表３４および図２１は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが、ヒト非小細胞肺癌−１７６（ＬＵ１７６）ＰＤＸモデル（高ＰＴＫ７発現）において、ビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であったことを示している。このデータは、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１のＮＳＣＬＣ ＰＤＸにおける腫瘍成長の抑制における有効性を実証している。ｈｕ２４−ｖｃ０１０１は、ＮＳＣＬＣにおける標準治療であるシスプラチンよりも有効であった。

【0460】

【表34】

【0461】

Ｄ．卵巣癌（ＯＶ）
表３５は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１およびｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣの卵巣−５５（ＯＶ５５）ＰＤＸモデル（中程度のＰＴＫ７発現）におけるビヒクルおよび薬物対照と比較した有効性を示している。このデータは、ＰＴＫ７標的の中程度の発現を有する卵巣ＰＤＸモデルが両方のＡＤＣにより有効に標的とされることを実証している。驚くべきことに、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１で処置された動物は、実験が終了した際に腫瘍を有さず、ｈｕ２４−ＡｃＢｕｔＣＭ ＡＤＣは、このモデルにおいて有効性がより低かった。

【0462】

【表35】

【0463】

Ｅ．黒色腫（ＳＫ）
表３６は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが、ヒト黒色腫−２３（ＳＫ２３）ＰＤＸモデル（中程度のＰＴＫ７発現）においてビヒクルおよび薬物対照と比較して有効であったことを示している。このデータは、ＰＴＫ７標的の中程度の発現を有する黒色腫ＰＤＸモデルにおけるｈｕ２４−ｖｃ０１０１の有効性を実証しており、ＡＤＣの使用に関する可能性のある適応症を提供している。

【0464】

【表36】

【0465】

Ｆ．乳房およびＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルにおける腫瘍成長阻害
動物は、同じスケジュールでの静脈内注射によるものであったＢＲ５試験を除いて、４日ごとに４サイクル（Ｑ４Ｄｘ４）、腹腔内注射により投与された。腫瘍の測定結果は、１週間につき１または２回、デジタルキャリパーを用いて記録され、腫瘍体積は、方程式Ｖ＝（Ａ×Ｂ^２）／２を用いて概算され、ここでＡは長軸であり、Ｂは短軸である。動物の体重が、少なくとも週１回測定および記録された。試験群は、個々のマウスまたは群全体の腫瘍の測定結果が１２００ｍｍ^３に達するまで追跡され、その時点でＩＡＣＵＣプロトコルに従って屠殺の必要が示された。ＢＲ５試験に関して、動物は、ＩＡＣＵＣプロトコルに従って病期分類において一度腫瘍体積が体重の１５％に近付いたら屠殺された。

【0466】

腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）は、方程式％ＴＧＩ＝［１−（処置されたものの平均腫瘍体積）／（ビヒクルの平均腫瘍体積）］を用いて計算された。ＴＧＩは、最も遅い可能な時点において計算され、それは、典型的には上記のように対照群が中止される前の最後の測定であった。腫瘍退縮は、投与後の平均腫瘍体積における低減として定義された。腫瘍が退縮した場合、増殖停止時間（ＴＴＰ）は、初回投与および平均腫瘍体積が前の測定から統計的に有意な程度まで増大した時点の間の日数を示す。腫瘍が実験の過程の間に再成長しなかった場合、ＴＴＰは、初回投与および実験の終了の間の日数である。

【0467】

ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの有効性試験における暴露を確証するため、ＡＤＣおよび総抗体の血漿濃度を、２つのＰＤＸモデルＢＲ１３ ＰＤＸおよびＢＲ２２ ＰＤＸに関して決定した。試料を、ＡＤＣの３回目の投与後に３つの時点において集め、濃度をリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）（データは示されていない）により測定した。そのデータは、薬物暴露がこれらの腫瘍モデルにおいて比較可能であったことを示している。

【0468】

ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、乳癌およびＮＳＣＬＣ腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を引き出した。腫瘍は、処置において退縮し、典型的にはＡＤＣの最後の投与後数ヵ月間再成長しなかった。未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂは、試験されたモデルにおいて抗腫瘍活性を引き出さず、それは、オーリスタチン依存性の作用機序を実証した。結果が表３７において要約されている。

【0469】

【表37】

【0470】

実施例１４
０１０１の作用機序
ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの作用機序を研究するため、細胞をＡＤＣで処理し、次いでそれらの微小管構造を評価した。オーリスタチンは、完全に合成によるドラスタチンベースの５ペプチドのチューブリン重合阻害剤であり、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止および細胞死を低ピコモル濃度の細胞内濃度で誘導する(Sapra et al., 2011, Expert Opin Investig Drugs 20(8):1131-49およびTurner et al., 1998, Prostate 34(3):175-81)。

【0471】

Ｈ６６１肺癌細胞を、ＣＣ２コートされた増殖表面を有する４ウェルチャンバースライドシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にまき、０〜４μｇ／ｍＬのｈｕ２４−ｖｃ０１０１、陰性対照ＡＤＣ、未コンジュゲートｈｕ２４ｍＡｂ、または０．１〜１０ｎＭの遊離の０１０１オーリスタチンで４８時間処理した。次いで、細胞を３％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で透過処理し、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清および０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０）と共にインキュベートした。細胞を、ブロッキング緩衝液中の一次抗αチューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ 商品番号Ｔ９０２６、クローンＤＭ１Ａ）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８コンジュゲート二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ）およびＤＮＡを染色するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共に３０分間インキュベートした。細胞を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５１０ Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡上で可視化した。

【0472】

細胞の遊離の０１０１またはｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣによる処理は、微小管構造を崩壊させ、Ｇ２／Ｍ細胞周期停止をもたらした。対照的に、未コンジュゲートｈｕ２４ ｍＡｂも陰性対照ｍＡｂも、これらの応答を引き出さなかった（図２２）。これらの結果は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、細胞毒性を、抗原依存性の様式で、微小管構造を崩壊させ、Ｇ２／Ｍ停止を引き起こすことにより引き出すことができることを実証している。この機序は、未コンジュゲートオーリスタチンに関する以前の研究と一致している。

【0473】

実施例１５
内皮細胞に対するｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣの作用
図２３は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣが標準的なインビトロＨＵＶＥＣ出芽（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）アッセイにおいて血管新生を阻害することを示している。簡潔には、ＨＵＶＥＣ細胞（Ｌｏｎｚａ−商品番号ＣＣ−２５１７）を用いてＣｙｔｏｄｅｘビーズ（Ｓｉｇｍａ 商品番号Ｃ０６４６−５Ｇ）をおおよそ１×１０^６細胞／２５００ビーズの比率でコートし、次いで内皮細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ 商品番号ＣＣ−３１６２）と共に３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中に一夜置いた。次の日に、ビーズを内皮細胞増殖培地で洗浄し、２．０ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンＩ型（フィルター滅菌済み）のＤＰＢＳおよび０．１５単位／ｍｌアプロチニン中における溶液中で再懸濁した。２４ウェルプレートのそれぞれのウェル中に、０．３１２５単位のトロンビンを添加した後、５００ｕｌのビーズ溶液を添加した。凝固を促進するため、プレートを３７℃のインキュベーター中に１５分間置いた。最後に、内皮細胞増殖培地中で懸濁された皮膚線維芽細胞（Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１ − ＡＴＣＣ 商品番号ＣＣＬ−１１０）を、形成されたフィブリノーゲン凝塊の上に注意深く置いた。その細胞に、それらのそれぞれの薬物処理を１日おきに与え、８日間成長させた。ＨＵＶＥＣ出芽および分枝している血管の形成の程度を観察した。

【0474】

ｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、このアッセイにおいて出芽血管新生を１μｇ／ｍＬで阻害したが、陰性対照のＡＤＣは阻害しなかった。この結果は、抗ＰＴＫ７ ＡＤＣは血管新生を標的特異的な様式で阻害することができることを実証している。

【0475】

実施例１６
腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の低減
抗ＰＴＫ７抗体−薬物コンジュゲート処置が腫瘍中の腫瘍開始細胞（ＴＩＣ）の頻度を低減するかどうかを決定するため、ＢＲ１３ ＴＮＢＣ乳房腫瘍を、４ｍｇ／ｋｇのｈｕ２４−ｖｃ０１０１ ＡＤＣ、４ｍｇ／ｋｇの対照ＩｇＧ ＡＤＣ、または２０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル化学療法で週２回、合計３用量（０、３および７日目）で処置した。生きた残留するヒト腫瘍細胞（すなわちｈＥＳＡ^＋ ｍＣＤ４５⁻ ｍＨ−２Ｋｄ⁻）を、１０日目に分離された腫瘍から単離し、限界希釈分析（ＬＤＡ）において未処置の動物中に再移植した。結果として生じた腫瘍の発生率を、移植後４０週までの間モニターした。腫瘍回収の日（１０日目）および累代移植の日は、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１曝露後にいつ腫瘍が退縮し始めたかに基づいて選択された。腫瘍を分離し、抗ヒトＥＳＡ、抗マウスＣＤ４５、および抗マウスＨ−２Ｋｄ抗体により染色した。処置群あたり３個の腫瘍をプールし、生きたヒト腫瘍細胞をフローサイトメトリーにより選別した。１０匹のマウスの群に、対照ＩｇＧ ＡＤＣで処置された腫瘍から選別された２９３、７３、３７もしくは１５個の腫瘍細胞；ｈｕ２４−ｖｃ０１０１で処置された腫瘍から選別された１５９、９０、４０、もしくは１０個の腫瘍細胞；またはドセタキセルで処置された腫瘍から選別された２５７、３３もしくは１５個の腫瘍細胞のいずれかを注入した。受容マウス中の腫瘍を毎週測定し、受容マウス中の２００ｍｍ^３を超える腫瘍を陽性と採点した。Ｌ−Ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）によるポアソン分布統計を用いて、移植後４０週までに腫瘍を有した、および有しない受容マウスの注入された細胞の用量を用いてそれぞれの処置後のＴＩＣの頻度を計算した。

【0476】

ｈｕ２４−ｖｃ０１０１で処置された腫瘍におけるＴＩＣの頻度は、対照のＩｇＧ ＡＤＣで処置された腫瘍におけるよりも５．５倍低かった（ｐ＝０．００１３；表３８）。ドセタキセルで処置された腫瘍におけるＴＩＣの頻度は、対照のＩｇＧ ＡＤＣで処置された腫瘍におけるよりも２．１倍低かった（ｐ＝０．０９；表３８）。要約すると、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１で処置された腫瘍細胞を注入されたマウスは、類似の数の対照のＩｇＧ ＡＤＣで処置された腫瘍細胞を注入されたマウスよりも少ない腫瘍をもたらし、それは、ｈｕ２４−ｖｃ０１０１処置がＴＩＣを特異的に低減することを示した。

【0477】

【表38】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【国際調査報告】