特表 2017-519500 Ｈ１プロモーターを用いるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-519500(P2017-519500A)

(43)【公表日】2017年7月20日

(54)【発明の名称】Ｈ１プロモーターを用いるＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170623BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20170623BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20170623BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20170623BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20170623BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20170623BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20170623BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

   A61K35/76

   A61K48/00

   A61P27/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】100

(21)【出願番号】特願2016-573105(P2016-573105)

(86)(22)【出願日】2015年6月16日

(85)【翻訳文提出日】2017年2月8日

(86)【国際出願番号】US2015035964

(87)【国際公開番号】WO2015195621

(87)【国際公開日】20151223

(31)【優先権主張番号】62/012,802

(32)【優先日】2014年6月16日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】398076227

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ランガナサン， ビノッド

(72)【発明者】

【氏名】ザック， ドナルド

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA33

(57)【要約】

本明細書で開示される主題は、Ｈ１プロモーターを使用して、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを発現させるための組成物および方法を提供する。特に、５’ヌクレオチドの特異性を変更したＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現させるＨ１プロモーターの使用のほか、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとｇＲＮＡとを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーター配列の使用のための組成物および方法が提供される。また、ＲＮＡリボザイムおよび調節可能なアプタザイムの使用を介する、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｇＲＮＡの発現および発現の調節のための組成物および方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、前記系は、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、前記ｇＲＮＡが、細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子が、前記細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；
ｂ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む１または複数のベクターを含み、
構成要素（ａ）および（ｂ）が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記ｇＲＮＡが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、系。

【請求項2】

前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む、請求項１に記載の系。

【請求項3】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項１に記載の系。

【請求項4】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１に記載の系。

【請求項5】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１に記載の系。

【請求項6】

前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項５に記載の系。

【請求項7】

前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項５に記載の系。

【請求項8】

前記１または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項１に記載の系。

【請求項9】

前記１または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項１に記載の系。

【請求項10】

前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされている、請求項１に記載の系。

【請求項11】

細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、前記系が、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、前記ｇＲＮＡが、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーターと；
ｂ）前記細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む１または複数のベクターを含み、
構成要素（ａ）および（ｂ）が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記ｇＲＮＡが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。

【請求項12】

前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記１または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

前記１または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項１１に記載の方法。

【請求項20】

前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用して導入する、請求項１１に記載の方法。

【請求項21】

双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、前記双方向性Ｈ１プロモーターが、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記ｇＲＮＡが、細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子が、前記細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと；
ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記ｇＲＮＡが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。

【請求項22】

前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む、請求項２１に記載の系。

【請求項23】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項２１に記載の系。

【請求項24】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２１に記載の系。

【請求項25】

前記細胞が、真核細胞である、請求項２１に記載の系。

【請求項26】

前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項２５に記載の系。

【請求項27】

前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項２５に記載の系。

【請求項28】

前記１または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項２１に記載の系。

【請求項29】

前記１または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項２１に記載の系。

【請求項30】

前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項２１に記載の系。

【請求項31】

細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、前記双方向性Ｈ１プロモーターが、
ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記ｇＲＮＡが、前記ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと；
ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記ｇＲＮＡが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記細胞内の前記１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。

【請求項32】

前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞が、真核細胞である、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記１または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記１または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、請求項３１に記載の方法。

【請求項40】

前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用して導入する、請求項３１に記載の方法。

【請求項41】

アプタマー調節型リボザイムであって、前記アプタマー調節型リボザイムは、
ａ）触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、およびヘリックスＩＩＩの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、前記ヘリックスＩＩの二重鎖領域および前記ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域の各々が、前記触媒性コアの反対側にループ領域を含み、前記ヘリックスＩＩの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと；
ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、前記ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子が、前記真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードし、前記ヌクレオチド配列が、５’末端および３’末端を含み、前記ヌクレオチド配列の前記５’末端が、前記ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列と
を含み、
ここで、前記リボザイムが、前記ヌクレオチド配列の前記５’末端と、前記ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、前記リガンドの前記アプタマーへの結合により、前記リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、前記ｇＲＮＡが放出される、アプタマー調節型リボザイム。

【請求項42】

前記リガンドが、テオフィリンである、請求項４１に記載のアプタマー調節型リボザイム。

【請求項43】

（ａ）ＲＮＡに転写されると、請求項４１に記載のアプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と；
（ｂ）細胞内の前記ＲＮＡの転写を調節する、１または複数の転写調節配列と
を含む発現構築物。

【請求項44】

請求項４３に記載の発現構築物を含む真核細胞。

【請求項45】

細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、
前記細胞が、前記１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、
前記方法が、請求項４３に記載の発現構築物を前記細胞中に導入するステップと、前記リボザイムの活性を変更する量で前記細胞を前記リガンドと接触させるステップと、を含む方法。

【請求項46】

前記細胞が、真核細胞である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞が、被験体内にある、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

被験体が、ヒトである、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記リガンドが、テオフィリンである、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

眼の神経変性疾患を処置することを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、
（ａ）非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用意するステップであって、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、
ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、前記ｇＲＮＡが、前記被験体の細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子が、前記細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；
ｉｉ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む１または複数のベクターを含み、
ここで、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記ｇＲＮＡが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記ＤＮＡ分子を切断して、前記１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップと；
（ｂ）前記被験体に有効量の前記系を投与するステップと
を含む方法。

【請求項51】

網膜光受容体細胞の機能不全および／または死が、前記被験体において観察されている、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記眼の神経変性疾患が、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

前記眼の神経変性疾患が、色素性網膜炎（ＲＰ）である、請求項５０に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞が、網膜光受容体細胞である、請求項５０に記載の方法。

【請求項55】

前記１または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、請求項５０に記載の方法。

【請求項56】

前記Ｈ１プロモーターが、双方向性である、請求項５０に記載の方法。

【請求項57】

前記被験体に投与するステップの前に、前記系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする、請求項５０に記載の方法。

【請求項58】

前記被験体に投与するステップを、網膜下注射により行う、請求項５０に記載の方法。

【請求項59】

前記被験体が、ヒトである、請求項５０に記載の方法。

【請求項60】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である、請求項５０に記載の方法。

【請求項61】

前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項62】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記細胞内での発現についてコドンが最適化されている、請求項５０に記載の方法。

【請求項63】

請求項４３に記載の発現構築物および前記リガンドを、前記リボザイムの活性を変更する量で投与するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項64】

前記リガンドが、テオフィリンである、請求項６３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引用
本願は、２０１４年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／０１２，８０２号の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

【0002】

電子媒体により提出された素材の参照による組込み
本出願は、配列表を含有する。配列表は、「１１１２３２-００４０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称するＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介する電子媒体により提出された。配列表は、１４，８２７バイトのサイズであり、２０１５年６月２日に作成された。配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

背景
ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連：ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と併せたＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）は、細菌内および古細菌内の侵入性外来核酸に対する獲得性抵抗性をもたらす後天性免疫系を含む（Barrangouら（２００７年）、Science、３１５巻：１７０９〜１２頁）。ＣＲＩＳＰＲは、スペーサーと呼ばれる、同様のサイズの、固有の可変的ＤＮＡ配列であって、ファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来することが多いＤＮＡ配列を介在させた、一連の短い保存的リピート配列からなる（Barrangouら（２００７年）、Science、３１５巻：１７０９〜１２頁；Bolotinら（２００５年）、Microbiology、１５１巻：２５５１〜６１頁；Mojicaら（２００５年）、J. Mol. Evol.、６０巻：１７４〜８２頁）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ領域中に挿入され、マッチする配列を保有するファージおよびプラスミドへのその後の曝露に対する免疫をもたらす、外来ＤＮＡ（スペーサー）の短い断片を獲得することにより機能する（Barrangouら（２００７年）、Science、３１５巻：１７０９〜１２頁；Brounsら（２００８年）、Science、３２１巻：９６０〜６４頁）。外来核酸のｃｒＲＮＡ媒介型サイレンシングを可能とするのは、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ干渉／免疫である（HorvathおよびBarrangou（２０１０年）、Science、３２７巻：１６７〜７０頁；Deveauら（２０１０年）、Annu. Rev. Microbiol.、６４巻：４７５〜９３頁；MarraffiniおよびSontheimer（２０１０年）、Nat. Rev. Genet.、１１巻：１８１〜９０頁；Bhayaら（２０１１年）、Annu. Rev. Genet.、４５巻：２７３〜９７頁；Wiedenheftら（２０１２年）、Nature、４８２巻：３３１〜３３８頁）。

【0004】

合成のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングさせた、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依拠するＣＲＩＳＰＲ構築物（Makarovaら（２０１１年）、Nat. Rev. Microbiol.、９巻：４６７〜７７頁）の使用は近年、ゲノム操作を革命化し、ＤＮＡ配列の前例のない取扱いを可能としている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物は、合成が簡単かつ迅速であり、マルチプレックス化することもできる。しかし、それらの合成の相対的な容易さにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲには、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、ターゲティング可能なゲノム空間へのそれらのアクセスに関する技術的制限がある。

【0005】

ＣＲＩＳＰＲ系による切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列および標的部位の３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への、ｇＲＮＡの相補的塩基対合を要請する（Jinekら（２０１２年）、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論的には、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ゲノム内の、任意の固有のＮ_２０−ＰＡＭ配列をターゲティングすることができる。援用される具体的なＣａｓ９の由来する種に応じて変動する、ＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、１つの制約を課する。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用されているＣａｓ９タンパク質は、配列ＮＧＧを認識する、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、こうして、ゲノム内の任意の固有の２１ヌクレオチドの配列に続く２つのグアノシンヌクレオチド（Ｎ_２０ＮＧＧ）をターゲティングすることができる。タンパク質構成要素により付与される、利用可能なターゲティング空間の拡大は、ＰＡＭ要件を変更した新規のＣａｓ９タンパク質の発見および使用（Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または進行中の新規のＣａｓ９変異体の作出であって、突然変異誘発もしくは指向性進化を介する作出に限定される。

【0006】

ＣＲＩＳＰＲ系の第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドで開始されるｇＲＮＡの発現から生じる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスの使用は、これらの短い非コード転写物が、十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く、転写に必要な全てのエレメントが、上流のプロモーター領域内に含有されるため、ｇＲＮＡの発現に特に適している。しかし、一般に使用されるＵ６プロモーターは、転写の開始に、グアノシンヌクレオチドを要請するので、Ｕ６プロモーターの使用により、ゲノムのターゲティング部位は、ＧＮ_１９ＮＧＧにさらに制約される（Maliら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）、Cell Stem Cell、１２巻：３９３〜３９４頁）。Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写など、代替的な手法もまた、グアノシンヌクレオチドによる開始を要請するであろう（Adhyaら（１９８１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）、Nucleic Acids Res.、１２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）、RNA、４巻：１３１３〜１３１７頁）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Barrangouら（２００７年）、Science、３１５巻：１７０９〜１２頁

【非特許文献2】Bolotinら（２００５年）、Microbiology、１５１巻：２５５１〜６１頁

【非特許文献3】Mojicaら（２００５年）、J. Mol. Evol.、６０巻：１７４〜８２頁

【非特許文献4】Brounsら（２００８年）、Science、３２１巻：９６０〜６４頁

【非特許文献5】HorvathおよびBarrangou（２０１０年）、Science、３２７巻：１６７〜７０頁

【非特許文献6】Deveauら（２０１０年）、Annu. Rev. Microbiol.、６４巻：４７５〜９３頁

【非特許文献7】MarraffiniおよびSontheimer（２０１０年）、Nat. Rev. Genet.、１１巻：１８１〜９０頁

【非特許文献8】Bhayaら（２０１１年）、Annu. Rev. Genet.、４５巻：２７３〜９７頁

【非特許文献9】Wiedenheftら（２０１２年）、Nature、４８２巻：３３１〜３３８頁

【非特許文献10】Makarovaら（２０１１年）、Nat. Rev. Microbiol.、９巻：４６７〜７７頁

【非特許文献11】Jinekら（２０１２年）、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁

【非特許文献12】Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁

【非特許文献13】Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁

【非特許文献14】Maliら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁

【非特許文献15】Dingら（２０１３年）、Cell Stem Cell、１２巻：３９３〜３９４頁

【非特許文献16】Adhyaら（１９８１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７８巻：１４７〜１５１頁

【非特許文献17】Meltonら（１９８４年）、Nucleic Acids Res.、１２巻：７０３５〜７０５６頁

【非特許文献18】Pleissら（１９９８年）、RNA、４巻：１３１３〜１３１７頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

概要
本発明の実施は、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある従来の技法であって、細胞生物学、細胞の培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の技法を援用することが典型的であろう。これらの技法のうちのいくつかについての非限定的な記載は、以下の刊行物：Ausubel, F.ら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols in Protein Science、およびCurrent Protocols in Cell Biology、２００８年１２月現在の版では、全てJohn Wiley & Sons、N.Y.；Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、２００１年；Harlow, EおよびLane, D.、Antibodies - A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、１９８８年；Freshney, R. I.、「Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique」、第５版、John Wiley & Sons、Hoboken、N.J.、２００５年において見出される。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、第１１版、McGraw Hill、２００５年、Katzung, B.（編）、Basic and Clinical Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton & Lange、第１０版（２００６年）、または第１１版（２００９年７月）において見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKusick, V. A.、Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders、Baltimore: Johns Hopkins University Press、１９９８年（第１２版）、または２０１０年５月１日現在、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／で入手可能である、より近年のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ、ＯＭＩＭ（商標）、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）、ならびにＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ：ｈｔｔｐ：／／ｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌで入手可能である、動物種（ヒトおよびマウス以外）における遺伝子、遺伝性障害、および形質についてのデータベースである、Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ）において見出される。本明細書で言及される、全ての特許、特許出願、および他の刊行物（例えば、学術論文、書籍、ウェブサイト、およびデータベース）は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本明細書と組み込まれる参考文献のうちのいずれかとの間で利益相反が生じる場合は、本明細書（組み込まれる参考文献に基づきうる、その任意の修正を含む）により裁定するものとする。本明細書では、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野で許容される、用語の標準的な意味を使用する。本明細書では、多様な用語について、標準的な略号を使用する。

【0009】

本明細書で開示される主題は、Ｈ１プロモーターを使用して、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを発現させるための組成物および方法を提供する。本明細書で開示される主題は、１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；と、ｂ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。

【0010】

一部の態様では、本明細書で開示される主題は、非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、この非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0011】

本明細書で開示される主題はまた、細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法を提供し、この細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法が、細胞中に、非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、この非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更するも提供する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。

【0012】

一部の態様では、本明細書で開示される主題は、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法を提供し、この細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法が、細胞中に、非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、この非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含み、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0013】

本明細書で開示される主題はまた、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと；ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。

【0014】

一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ここで、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと；ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0015】

本明細書で開示される主題はまた、細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法を提供し、ここで、この細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法が、細胞中に、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと；ｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。

【0016】

本明細書で開示される主題はまた、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法を提供し、ここで、この細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法が、細胞中に、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含み、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと；ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0017】

本明細書で開示される主題はまた、アプタマー調節型リボザイムを提供し、このアプタマー調節型リボザイムは、ａ）触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、およびヘリックスＩＩＩの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、ヘリックスＩＩの二重鎖領域およびヘリックスＩＩＩの二重鎖領域の各々が、触媒性コアの反対側にループ領域を含み、ヘリックスＩＩの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと；ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードし、ヌクレオチド配列が、５’末端および３’末端を含み、ヌクレオチド配列の５’末端が、ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列とを含み、リボザイムが、ヌクレオチド配列の５’末端と、ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、リガンドのアプタマーへの結合により、リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、ｇＲＮＡが産生される。また、（ｉ）ＲＮＡに転写されると、アプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と；（ｉｉ）真核細胞内のＲＮＡの転写を調節する、１または複数の転写調節配列とを含む発現構築物も提供される。また、発現構築物を含む真核細胞も提供される。また、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、方法が、発現構築物を細胞中に導入するステップと、細胞をリガンドと、リボザイムの活性を変更する量で接触させるステップとを含み、特に、細胞が、哺乳動物被験体またはヒト被験体における細胞である方法も提供される。一態様では、リガンドは、テオフィリンである。

【0018】

本明細書で開示される主題はまた、眼の神経変性疾患を処置することを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法を提供し、この方法は、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、被験体の細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；ｉｉ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用意するステップと；（ｂ）被験体に有効量の系を投与するステップとを含む。一部の態様では、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死が、被験体において観察されている。一部の態様では、眼の神経変性疾患は、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される。一部の態様では、眼の神経変性疾患は、色素性網膜炎（ＲＰ）である。一部の態様では、細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、１または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、Ｈ１プロモーターは、双方向性である。一部の態様では、被験体に投与するステップの前に、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。一部の態様では、被験体に投与するステップを、網膜下注射により行う。一部の態様では、被験体は、ヒトである。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質である。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧ、ＧＮ_１９ＮＧＧ、ＣＮ_１９ＮＧＧ、またはＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、本明細書で開示される方法は、発現構築物およびリガンドを、リボザイムの活性を変更する量で投与するステップをさらに含む。一部の態様では、リガンドは、テオフィリンである。

【0019】

本明細書の上記では、本明細書で開示される主題のある特定の態様であって、本明細書で開示される主題により全体的または部分的に取り組まれる態様について言明してきたが、本明細書の下記において最良の形で記載される通り、記載が進むにつれて、付属の実施例および図との関連で理解される場合、他の態様も明らかとなろう。

【0020】

こうして、本明細書で開示される主題について一般的に記載してきたので、ここで、付属の図を参照するが、これらは、必ずしも原寸に比例して描図されているわけではない。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1A】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄは、Ｈ１プロモーターによるｇＲＮＡ合成を介してＣＲＩＳＰＲターゲティングを方向付ける能力の査定を示す。ｇＲＮＡの発現構築物について描示する例示的概略図を、図１Ａに示す。上図では、Ｕ６プロモーターは、＋１グアノシンヌクレオチドを伴うｇＲＮＡだけを発現させ、下図では、Ｈ１プロモーターは、プリン（アデノシンまたはグアノシン）ヌクレオチドで開始されるｇＲＮＡの発現を駆動しうる。下図には、ゲノム配列であるＡＮ_１９ＮＧＧをターゲティングするｇＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質についての、描画による描示を示す（示される配列は、配列番号３０である）。＋１Ａの場所が指し示される。ｅＧＦＰターゲティング妨害アッセイについての概観を、図１Ｂに示す。ｅＧＦＰ蛍光を、ＣＲＩＳＰＲターゲティングに続く、コード配列を妨害するフレームシフト突然変異を結果としてもたらす、エラープローンＮＨＥＪ媒介型修復により妨害する結果として、蛍光の喪失がもたらされる。図１Ｃは、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターから発現させる、ｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功を実証する顕微鏡画像を示す。核（左、マゼンタ）、ｅＧＦＰ蛍光（中、緑）、およびコロニー内のＧＦＰ蛍光モザイクエリアを指し示す融合図（右）を示すように、Ｈ７ ＥＳ細胞を染色し、コロニーを視覚化した。右側に、それぞれの構築物についてのフローサイトメトリーにより、ｅＧＦＰ蛍光喪失の定量化を示す。下図は、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡによりターゲティングされるＨ７コロニーであって、発現モザイクを示すＨ７コロニーについての高倍率の拡大図である。スケールバーは、５０μＭである。ＮＨＥＪの頻度についての、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイベースの定量化を、図１Ｄに示す。対照（第１のレーン）、Ｕ６から発現させるｇＲＮＡ（第２のレーン）、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡ（第３のレーン）、およびマーカー（第４のレーン）について描示するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲル画像である。インデル％（切り出されていない（ｕ）バンドの、切り出された（ｃ）バンドに対する割合により計算される）を、下図に指し示す。

【図1B-C】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄは、Ｈ１プロモーターによるｇＲＮＡ合成を介してＣＲＩＳＰＲターゲティングを方向付ける能力の査定を示す。ｇＲＮＡの発現構築物について描示する例示的概略図を、図１Ａに示す。上図では、Ｕ６プロモーターは、＋１グアノシンヌクレオチドを伴うｇＲＮＡだけを発現させ、下図では、Ｈ１プロモーターは、プリン（アデノシンまたはグアノシン）ヌクレオチドで開始されるｇＲＮＡの発現を駆動しうる。下図には、ゲノム配列であるＡＮ_１９ＮＧＧをターゲティングするｇＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質についての、描画による描示を示す（示される配列は、配列番号３０である）。＋１Ａの場所が指し示される。ｅＧＦＰターゲティング妨害アッセイについての概観を、図１Ｂに示す。ｅＧＦＰ蛍光を、ＣＲＩＳＰＲターゲティングに続く、コード配列を妨害するフレームシフト突然変異を結果としてもたらす、エラープローンＮＨＥＪ媒介型修復により妨害する結果として、蛍光の喪失がもたらされる。図１Ｃは、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターから発現させる、ｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功を実証する顕微鏡画像を示す。核（左、マゼンタ）、ｅＧＦＰ蛍光（中、緑）、およびコロニー内のＧＦＰ蛍光モザイクエリアを指し示す融合図（右）を示すように、Ｈ７ ＥＳ細胞を染色し、コロニーを視覚化した。右側に、それぞれの構築物についてのフローサイトメトリーにより、ｅＧＦＰ蛍光喪失の定量化を示す。下図は、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡによりターゲティングされるＨ７コロニーであって、発現モザイクを示すＨ７コロニーについての高倍率の拡大図である。スケールバーは、５０μＭである。ＮＨＥＪの頻度についての、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイベースの定量化を、図１Ｄに示す。対照（第１のレーン）、Ｕ６から発現させるｇＲＮＡ（第２のレーン）、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡ（第３のレーン）、およびマーカー（第４のレーン）について描示するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲル画像である。インデル％（切り出されていない（ｕ）バンドの、切り出された（ｃ）バンドに対する割合により計算される）を、下図に指し示す。

【図1D】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、および図１Ｄは、Ｈ１プロモーターによるｇＲＮＡ合成を介してＣＲＩＳＰＲターゲティングを方向付ける能力の査定を示す。ｇＲＮＡの発現構築物について描示する例示的概略図を、図１Ａに示す。上図では、Ｕ６プロモーターは、＋１グアノシンヌクレオチドを伴うｇＲＮＡだけを発現させ、下図では、Ｈ１プロモーターは、プリン（アデノシンまたはグアノシン）ヌクレオチドで開始されるｇＲＮＡの発現を駆動しうる。下図には、ゲノム配列であるＡＮ_１９ＮＧＧをターゲティングするｇＲＮＡを伴うＣａｓ９タンパク質についての、描画による描示を示す（示される配列は、配列番号３０である）。＋１Ａの場所が指し示される。ｅＧＦＰターゲティング妨害アッセイについての概観を、図１Ｂに示す。ｅＧＦＰ蛍光を、ＣＲＩＳＰＲターゲティングに続く、コード配列を妨害するフレームシフト突然変異を結果としてもたらす、エラープローンＮＨＥＪ媒介型修復により妨害する結果として、蛍光の喪失がもたらされる。図１Ｃは、Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターから発現させる、ｇＲＮＡによるＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功を実証する顕微鏡画像を示す。核（左、マゼンタ）、ｅＧＦＰ蛍光（中、緑）、およびコロニー内のＧＦＰ蛍光モザイクエリアを指し示す融合図（右）を示すように、Ｈ７ ＥＳ細胞を染色し、コロニーを視覚化した。右側に、それぞれの構築物についてのフローサイトメトリーにより、ｅＧＦＰ蛍光喪失の定量化を示す。下図は、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡによりターゲティングされるＨ７コロニーであって、発現モザイクを示すＨ７コロニーについての高倍率の拡大図である。スケールバーは、５０μＭである。ＮＨＥＪの頻度についての、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイベースの定量化を、図１Ｄに示す。対照（第１のレーン）、Ｕ６から発現させるｇＲＮＡ（第２のレーン）、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡ（第３のレーン）、およびマーカー（第４のレーン）について描示するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲル画像である。インデル％（切り出されていない（ｕ）バンドの、切り出された（ｃ）バンドに対する割合により計算される）を、下図に指し示す。

【図2】図２は、ＨＥＫ−２９３細胞内のＮＨＥＪについての、Ｓｕｒｖｅｙｏｒによる解析および定量化を示す。ｅＧＦＰの概略図を上図に示すが、矢印は、ターゲティング部位を指し示す。プラス鎖の標的部位は、右向きで指し示し、マイナス鎖の標的は、左向きで指し示し、青色の矢印は、Ｈ１プロモーターのｇＲＮＡを指し示し、橙色の矢印は、Ｕ６プロモーターのｇＲＮＡを指し示す。ＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによるＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲルを下図に示す。標的部位座標を上方に列挙し、インデル％の計算値を下方に指し示す。

【図3A】図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるターゲティングおよび相同組換えを示す。Ｈ１プロモーターにより発現させる３つのｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ１−１ａ〜ＡＡＶＳ−１−３ａ）、Ｕ６プロモーターにより発現させる３つのｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ−１−１〜ＡＡＶＳ−１−３）、および対照の非ターゲティングｇＲＮＡについてのＳｕｒｖｅｙｏｒ解析を、図３Ａに示す。図３Ｂは、ＡＡＶＳ−１ターゲティングドナーベクターについての概略図（ＡＡＶＳ１遺伝子座（「ＡＡＶＳ１」と表示する）の上方に示す）と、Ｈ１：：ＡＡＶＳ１−３ａ ｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ−１ターゲティングベクターによる電気穿孔に続くＧＦＰ陽性Ｈ７ ＥＳ細胞コロニーについての細胞イメージングとを示す。相同組換えによる適正な統合を指し示すターゲティング接合領域についてのサンガーシークェンシングを、図３Ｃに示す（示される配列は、配列番号３１である）。

【図3B-C】図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ＡＡＶＳ１遺伝子座におけるターゲティングおよび相同組換えを示す。Ｈ１プロモーターにより発現させる３つのｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ１−１ａ〜ＡＡＶＳ−１−３ａ）、Ｕ６プロモーターにより発現させる３つのｇＲＮＡ（ＡＡＶＳ−１−１〜ＡＡＶＳ−１−３）、および対照の非ターゲティングｇＲＮＡについてのＳｕｒｖｅｙｏｒ解析を、図３Ａに示す。図３Ｂは、ＡＡＶＳ−１ターゲティングドナーベクターについての概略図（ＡＡＶＳ１遺伝子座（「ＡＡＶＳ１」と表示する）の上方に示す）と、Ｈ１：：ＡＡＶＳ１−３ａ ｇＲＮＡおよびＡＡＶＳ−１ターゲティングベクターによる電気穿孔に続くＧＦＰ陽性Ｈ７ ＥＳ細胞コロニーについての細胞イメージングとを示す。相同組換えによる適正な統合を指し示すターゲティング接合領域についてのサンガーシークェンシングを、図３Ｃに示す（示される配列は、配列番号３１である）。

【図4A】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内のＣＲＩＰＳＲ部位の頻度について描示するＣｉｒｃｏｓプロットを、図４Ａに示す。外側の円は、ヒト染色体の表記記号を描示する。内側に移動して、ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、染色体に沿って指し示す。円の内側に、ヒトエクソン密度（黒）、およびＯＭＩＭ疾患遺伝子座（青）をプロットする。ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を、図４Ｂに示す。ゲノム内の、隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、ＲＮ_１９ＮＧＧ部位を含むプロット内に挿入する。図４Ｃは、ヒト遺伝子（左）またはＯＭＩＭ疾患遺伝子座（右）における、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度についての、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度と対比したバープロットによる定量化を示す。図４Ｄは、６つのゲノム：ヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、およびゼブラフィッシュにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧの頻度を、ＡＮ_１９ＮＧＧの頻度と対比させて定量化するバープロットを示す。

【図4B】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内のＣＲＩＰＳＲ部位の頻度について描示するＣｉｒｃｏｓプロットを、図４Ａに示す。外側の円は、ヒト染色体の表記記号を描示する。内側に移動して、ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、染色体に沿って指し示す。円の内側に、ヒトエクソン密度（黒）、およびＯＭＩＭ疾患遺伝子座（青）をプロットする。ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を、図４Ｂに示す。ゲノム内の、隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、ＲＮ_１９ＮＧＧ部位を含むプロット内に挿入する。図４Ｃは、ヒト遺伝子（左）またはＯＭＩＭ疾患遺伝子座（右）における、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度についての、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度と対比したバープロットによる定量化を示す。図４Ｄは、６つのゲノム：ヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、およびゼブラフィッシュにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧの頻度を、ＡＮ_１９ＮＧＧの頻度と対比させて定量化するバープロットを示す。

【図4C】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内のＣＲＩＰＳＲ部位の頻度について描示するＣｉｒｃｏｓプロットを、図４Ａに示す。外側の円は、ヒト染色体の表記記号を描示する。内側に移動して、ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、染色体に沿って指し示す。円の内側に、ヒトエクソン密度（黒）、およびＯＭＩＭ疾患遺伝子座（青）をプロットする。ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を、図４Ｂに示す。ゲノム内の、隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、ＲＮ_１９ＮＧＧ部位を含むプロット内に挿入する。図４Ｃは、ヒト遺伝子（左）またはＯＭＩＭ疾患遺伝子座（右）における、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度についての、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度と対比したバープロットによる定量化を示す。図４Ｄは、６つのゲノム：ヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、およびゼブラフィッシュにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧの頻度を、ＡＮ_１９ＮＧＧの頻度と対比させて定量化するバープロットを示す。

【図4D】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内のＣＲＩＰＳＲ部位の頻度について描示するＣｉｒｃｏｓプロットを、図４Ａに示す。外側の円は、ヒト染色体の表記記号を描示する。内側に移動して、ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、染色体に沿って指し示す。円の内側に、ヒトエクソン密度（黒）、およびＯＭＩＭ疾患遺伝子座（青）をプロットする。ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を、図４Ｂに示す。ゲノム内の、隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、ＲＮ_１９ＮＧＧ部位を含むプロット内に挿入する。図４Ｃは、ヒト遺伝子（左）またはＯＭＩＭ疾患遺伝子座（右）における、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度についての、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位の頻度と対比したバープロットによる定量化を示す。図４Ｄは、６つのゲノム：ヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、およびゼブラフィッシュにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧの頻度を、ＡＮ_１９ＮＧＧの頻度と対比させて定量化するバープロットを示す。

【図5A】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図5B】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図5C】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図5D】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図5E】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図5F】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、ゲノム内のＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位についてのバイオインフォマティクス解析を示す。ヒトゲノム内の各ｇＲＮＡ部位の密度について描示する３つのパネル：ＧＮ_１９ＮＧＧ（図５Ａ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｂ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（図５Ｃ）を示す。各プロット内には、ＣＲＩＳＰＲ部位の密度を、各染色体に沿ってプロットする。滑らかなガウスカーネルとして計算される密度曲線を、半透明（橙、青、または紫）で重ね合わせる。点線は、３５ｂｐ（基準として述べると、平均で、ＴＡＬＥＮターゲティング部位は、３５塩基対ごとに生じ、ＺＦＮ部位は、数百塩基対ごとに生じると推定される（Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Cermakら（２０１１年）、Nucleic Acids Res.、３９巻（１２号）：ｅ８２頁））を指し示す。ヒト染色体１つ当たりの累加平均値ＣＲＩＳＰＲターゲティング密度についてのバープロットを、図５Ｄに示す。ＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（青）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ（紫）は、それぞれのＣＲＩＳＰＲ部位を指し示す。点線は、３５ｂｐの基準を指し示す。図５Ｅは、ゲノム内の隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の頻度およびこれらの間の距離を示す。ゲノム内で隣接するＧＮ_１９ＮＧＧ（橙）部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ（青）部位の頻度および距離についてのバープロットを示す。平均値および中央値を、プロット内に挿入する。ヒトゲノム内の全てのＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左上）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（右上）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（下）についてのＳｅｑＬｏｇｏを、図５Ｆに示す。

【図6A】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図6B】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図6C】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図6D】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図6E】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図6F】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆは、ＡＴ／ＧＣゲノム含量およびＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。ＡＴパーセント（青）、またはＧＣパーセント（橙）を、ヒトゲノム、ウシゲノム、マウスゲノム、ラットゲノム、ニワトリゲノム、およびゼブラフィッシュゲノムについて指し示す（図６Ａ）。ＡＴ／ＧＣ含量に照らして標準化されたＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を指し示す（図６Ｂ）。ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（左）、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位（中）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（右）についてのＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を、鎖ごとに、図６Ｃに示す。プラス鎖（左棒）を、青緑色で指し示し、マイナス鎖（右棒）を紫赤色で指し示す。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位（橙）およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位（青）の頻度を、図６Ｄに指し示す。図６Ｅは、ＡＴ含量パーセント（青）、またはＧＣ含量パーセント（橙）を示す図であり、図６Ｆは、標準化されたＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を示す。

【図7A-B】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、および図７Ｄは、ＣＲＩＳＰＲによる、Ｈ７ ＥＳ細胞内の内因性遺伝子（ＭＥＲＴＫ）における、ＡＮ_１９ＮＧＧのターゲティングを示す。ＭＥＲＴＫ遺伝子座および多様なタンパク質ドメインについての模式図を、図７Ａに示す。エクソン２内の標的部位を、下方に大縮尺で示し、ＣＲＩＳＰＲ ＡＮ_１９ＮＧＧ標的部位を指し示す（示される配列は、配列番号３２である）。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによる、エクソン２におけるＣＲＩＳＰＲターゲティングの定量化を、図７Ｂに示す。エクソン２内のＣＲＩＳＰＲ部位を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイで使用される多様なプライマー（矢印）と共に、上方に描示するが、Ｆ１：Ｒ１およびＦ２：Ｒ２のいずれもが標的部位にわたるのに対し、対照のＰＣＲ産物であるＦ３：Ｒ３は、標的部位のすぐ外側にある。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによるゲルを、左側に示される、３つの対照産物と共に、下方に示し、ターゲティングを、右側に示す。下方にインデル％頻度を指し示す。図７Ｃは、突然変異体細胞系についてのサンガーシークェンシングを示す。クローン細胞系を単離およびシークェンシングしたところ、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位におけるＣＲＩＳＰＲターゲティングは、この領域における突然変異誘発を結果としてもたらすことが指し示された。クロマトグラムアライメントは、クローニングされた６つの固有の突然変異を示す（ｗｔは、配列番号３３であり；Δ１２は、配列番号３４であり；Δ１は、配列番号３５であり；Δ２、＋２は、配列番号３６であり；Δ６は、配列番号３７であり；Δ７は、配列番号３８である）。図７Ｄは、Ｈ７由来ＲＰＥ細胞内のＭｅｒｔｋ発現についてのウェスタンブロット解析を示す。レーン１、３、および４は、ノックアウト細胞系を指し示し、レーン２は、ヘテロ接合性細胞系からの発現を指し示す。

【図7C-D】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、および図７Ｄは、ＣＲＩＳＰＲによる、Ｈ７ ＥＳ細胞内の内因性遺伝子（ＭＥＲＴＫ）における、ＡＮ_１９ＮＧＧのターゲティングを示す。ＭＥＲＴＫ遺伝子座および多様なタンパク質ドメインについての模式図を、図７Ａに示す。エクソン２内の標的部位を、下方に大縮尺で示し、ＣＲＩＳＰＲ ＡＮ_１９ＮＧＧ標的部位を指し示す（示される配列は、配列番号３２である）。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによる、エクソン２におけるＣＲＩＳＰＲターゲティングの定量化を、図７Ｂに示す。エクソン２内のＣＲＩＳＰＲ部位を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイで使用される多様なプライマー（矢印）と共に、上方に描示するが、Ｆ１：Ｒ１およびＦ２：Ｒ２のいずれもが標的部位にわたるのに対し、対照のＰＣＲ産物であるＦ３：Ｒ３は、標的部位のすぐ外側にある。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイによるゲルを、左側に示される、３つの対照産物と共に、下方に示し、ターゲティングを、右側に示す。下方にインデル％頻度を指し示す。図７Ｃは、突然変異体細胞系についてのサンガーシークェンシングを示す。クローン細胞系を単離およびシークェンシングしたところ、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位におけるＣＲＩＳＰＲターゲティングは、この領域における突然変異誘発を結果としてもたらすことが指し示された。クロマトグラムアライメントは、クローニングされた６つの固有の突然変異を示す（ｗｔは、配列番号３３であり；Δ１２は、配列番号３４であり；Δ１は、配列番号３５であり；Δ２、＋２は、配列番号３６であり；Δ６は、配列番号３７であり；Δ７は、配列番号３８である）。図７Ｄは、Ｈ７由来ＲＰＥ細胞内のＭｅｒｔｋ発現についてのウェスタンブロット解析を示す。レーン１、３、および４は、ノックアウト細胞系を指し示し、レーン２は、ヘテロ接合性細胞系からの発現を指し示す。

【図8A-B】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄは、Ｕ６またはＨ１から発現させるｇＲＮＡにより、オンターゲット部位およびオフターゲット部位において誘導される、オフターゲットヒットについての解析を示す。Ｈ１プロモーター（青）またはＵ６プロモーター（橙）の滴定量による、ＶＥＧＦＡ Ｔ１ ｇＲＮＡの発現レベルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を、図８Ａに示す。ＶＥＧＦＡ Ｔ１についてのオンターゲットおよびオフターゲット解析を、図８Ｂに示す。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析を、左図に指し示し、標的配列を、右図に、ミスマッチと共に、赤色で指し示す（Ｔ１、配列番号２０；ＯＴ１−３、配列番号２１；ＯＴ１−４、配列番号２２；ＯＴ１−６、配列番号２３；ＯＴ１−１１、配列番号２４）。図８Ｃも、図８Ｂと同じであるが、ＶＥＧＦＡ Ｔ３標的についての図である（ＶＥＧＦＡ Ｔ３、配列番号２５；ＯＴ３−１、配列番号２６；ＯＴ３−２、配列番号２７；ＯＴ３−４、配列番号２８；ＯＴ３−１８、配列番号２９）。ＶＥＧＦＡ Ｔ１の、オフターゲット特異性に対する、オンターゲット特異性を、図８Ｄに示す。Ｈ１プロモーター（青）またはＵ６プロモーター（橙）の、オンターゲット突然変異誘発／オフターゲット突然変異誘発の比を示す。１．０の点線を下回る値は、オフターゲット突然変異誘発が、オンターゲット突然変異誘発を超えることを指し示す。全ての部分について、オンターゲット部位およびオフターゲット部位を、Fuら（（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８２２〜６頁）およびChoら（（２０１４年）、Genome Research、２４巻：１３２〜１４１頁）における通りに標識する。

【図8C-D】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄは、Ｕ６またはＨ１から発現させるｇＲＮＡにより、オンターゲット部位およびオフターゲット部位において誘導される、オフターゲットヒットについての解析を示す。Ｈ１プロモーター（青）またはＵ６プロモーター（橙）の滴定量による、ＶＥＧＦＡ Ｔ１ ｇＲＮＡの発現レベルについてのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を、図８Ａに示す。ＶＥＧＦＡ Ｔ１についてのオンターゲットおよびオフターゲット解析を、図８Ｂに示す。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析を、左図に指し示し、標的配列を、右図に、ミスマッチと共に、赤色で指し示す（Ｔ１、配列番号２０；ＯＴ１−３、配列番号２１；ＯＴ１−４、配列番号２２；ＯＴ１−６、配列番号２３；ＯＴ１−１１、配列番号２４）。図８Ｃも、図８Ｂと同じであるが、ＶＥＧＦＡ Ｔ３標的についての図である（ＶＥＧＦＡ Ｔ３、配列番号２５；ＯＴ３−１、配列番号２６；ＯＴ３−２、配列番号２７；ＯＴ３−４、配列番号２８；ＯＴ３−１８、配列番号２９）。ＶＥＧＦＡ Ｔ１の、オフターゲット特異性に対する、オンターゲット特異性を、図８Ｄに示す。Ｈ１プロモーター（青）またはＵ６プロモーター（橙）の、オンターゲット突然変異誘発／オフターゲット突然変異誘発の比を示す。１．０の点線を下回る値は、オフターゲット突然変異誘発が、オンターゲット突然変異誘発を超えることを指し示す。全ての部分について、オンターゲット部位およびオフターゲット部位を、Fuら（（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８２２〜６頁）およびChoら（（２０１４年）、Genome Research、２４巻：１３２〜１４１頁）における通りに標識する。

【図9A-B】図９Ａおよび図９Ｂは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングのためのｇＲＮＡの発現における、Ｕ６プロモーターの特性とＨ１プロモーターの特性との対比を示す。図９Ａの上略図は、内因性ヒトＵ６プロモーターおよび転写開始部位（配列番号３９）を示す。図９Ａの下略図は、異なる＋１ヌクレオチドを伴うｇＲＮＡを駆動する、Ｕ６プロモーターの使用を指し示す。Ｕ６は、開始するのにＧ（左上）を要請するため、Ａ（右上）、Ｃ（左下）、またはＴ（右下）で始まるパネルは、下流の最初のＧで開始する可能性が高く、短縮型ｇＲＮＡをもたらすであろう（Ｕ６：ＧＮ１９ＮＧＧは、配列番号４０であり；Ｕ６：ＡＮ１９ＮＧＧは、配列番号４１であり；Ｕ６：ＣＮ１９ＮＧＧは、配列番号４２であり；Ｕ６：ＴＮ１９ＮＧＧは、配列番号４３である）。図９Ｂの上略図は、内因性ヒトＨ１プロモーターおよび転写開始部位（配列番号４４）を示す。図９Ｂの下略図は、異なる＋１ヌクレオチドを伴うｇＲＮＡを駆動する、Ｈ１プロモーターの使用を指し示す。Ｈ１は、Ｇ（左上）またはＡ（右上）で開始することが可能であり、全長ｇＲＮＡをもたらす。Ｈ１はまた、ＣヌクレオチドおよびＴヌクレオチドにおける転写の開始も可能とすることが報告されており、これは、Ｈ１プロモーターの下流の任意の＋１ヌクレオチドについて、全長転写物を可能とする（Ｈ１：ＧＮ１９ＮＧＧは、配列番号４５であり；Ｈ１：ＡＮ１９ＮＧＧは、配列番号４６であり；Ｈ１：ＣＮ１９ＮＧＧは、配列番号４７であり；Ｈ１：ＴＮ１９ＮＧＧは、配列番号４８である）。

【図10A-B】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、および図１０Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーターの使用を示す。双方向性Ｈ１プロモーターは、左へのｐｏｌ ＩＩ転写物としてのＣａｓ９（マイナス鎖）、および右へのｐｏｌ ＩＩＩ転写物としてのガイドＲＮＡ（プラス鎖）を発現させることが示されている（図１０Ａ）。発現カセットの全体は、およそ４．４ｋｂである。図１０Ｂは、双方向性Ｈ１構築物からのＣＲＩＳＰＲ媒介型切断を方向付ける能力について調べるために使用される構築物を示す。ｅＧＦＰをターゲティングするｇＲＮＡを使用する双方向性構築物を、プラスミド中にクローニングし、ＧＦＰを発現させるヒト幹細胞内で発現させた。ＧＦＰの喪失が目視により検出される（中パネル、矢印）ことから、発現構築物による発現およびＧＦＰのターゲティングの成功が指し示される（図１０Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功はまた、レーン２および３における２つのバンドの存在を伴うＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを介しても示される（図１０Ｄ）。約４．７５ｂのコンパクトターゲティングカセットを作出するのにＨ１プロモーターを使用する双方向性ＣＲＩＳＰＲ構築物であって、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある構築物を、図１０Ｅに示す。ＳＶ４０ターミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列で挟まれている。

【図10C-D】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、および図１０Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーターの使用を示す。双方向性Ｈ１プロモーターは、左へのｐｏｌ ＩＩ転写物としてのＣａｓ９（マイナス鎖）、および右へのｐｏｌ ＩＩＩ転写物としてのガイドＲＮＡ（プラス鎖）を発現させることが示されている（図１０Ａ）。発現カセットの全体は、およそ４．４ｋｂである。図１０Ｂは、双方向性Ｈ１構築物からのＣＲＩＳＰＲ媒介型切断を方向付ける能力について調べるために使用される構築物を示す。ｅＧＦＰをターゲティングするｇＲＮＡを使用する双方向性構築物を、プラスミド中にクローニングし、ＧＦＰを発現させるヒト幹細胞内で発現させた。ＧＦＰの喪失が目視により検出される（中パネル、矢印）ことから、発現構築物による発現およびＧＦＰのターゲティングの成功が指し示される（図１０Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功はまた、レーン２および３における２つのバンドの存在を伴うＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを介しても示される（図１０Ｄ）。約４．７５ｂのコンパクトターゲティングカセットを作出するのにＨ１プロモーターを使用する双方向性ＣＲＩＳＰＲ構築物であって、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある構築物を、図１０Ｅに示す。ＳＶ４０ターミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列で挟まれている。

【図10E】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、および図１０Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーターの使用を示す。双方向性Ｈ１プロモーターは、左へのｐｏｌ ＩＩ転写物としてのＣａｓ９（マイナス鎖）、および右へのｐｏｌ ＩＩＩ転写物としてのガイドＲＮＡ（プラス鎖）を発現させることが示されている（図１０Ａ）。発現カセットの全体は、およそ４．４ｋｂである。図１０Ｂは、双方向性Ｈ１構築物からのＣＲＩＳＰＲ媒介型切断を方向付ける能力について調べるために使用される構築物を示す。ｅＧＦＰをターゲティングするｇＲＮＡを使用する双方向性構築物を、プラスミド中にクローニングし、ＧＦＰを発現させるヒト幹細胞内で発現させた。ＧＦＰの喪失が目視により検出される（中パネル、矢印）ことから、発現構築物による発現およびＧＦＰのターゲティングの成功が指し示される（図１０Ｃ）。ＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功はまた、レーン２および３における２つのバンドの存在を伴うＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを介しても示される（図１０Ｄ）。約４．７５ｂのコンパクトターゲティングカセットを作出するのにＨ１プロモーターを使用する双方向性ＣＲＩＳＰＲ構築物であって、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある構築物を、図１０Ｅに示す。ＳＶ４０ターミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列で挟まれている。

【図11A】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ガイドＲＮＡの５’末端を作出するハンマーヘッド型リボザイムを示す。５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム（配列番号４９）およびｇＲＮＡ（配列番号５０）についての描示を、図１１Ａに示す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す（極めて重要なヌクレオチドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で）。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイムにより切断される（下）と、結果として得られるｇＲＮＡは、新たに形成された５’側位置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−ｇＲＮＡを発現させる構築物を、図１１Ｂに示す。一般に、Ｕ６、Ｈ１、またはＴ７などのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであるプロモーターを使用して、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、ｇＲＮＡを放出するであろう。２つの遺伝子座のターゲティングを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＨＨ１＝配列番号５１；ＨＨ２＝配列番号５２）、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断（矢印）の成功と共に示す（図１１Ｃ）。

【図11B】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ガイドＲＮＡの５’末端を作出するハンマーヘッド型リボザイムを示す。５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム（配列番号４９）およびｇＲＮＡ（配列番号５０）についての描示を、図１１Ａに示す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す（極めて重要なヌクレオチドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で）。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイムにより切断される（下）と、結果として得られるｇＲＮＡは、新たに形成された５’側位置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−ｇＲＮＡを発現させる構築物を、図１１Ｂに示す。一般に、Ｕ６、Ｈ１、またはＴ７などのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであるプロモーターを使用して、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、ｇＲＮＡを放出するであろう。２つの遺伝子座のターゲティングを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＨＨ１＝配列番号５１；ＨＨ２＝配列番号５２）、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断（矢印）の成功と共に示す（図１１Ｃ）。

【図11C】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ガイドＲＮＡの５’末端を作出するハンマーヘッド型リボザイムを示す。５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム（配列番号４９）およびｇＲＮＡ（配列番号５０）についての描示を、図１１Ａに示す。ハンマーヘッド型リボザイムの配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す（極めて重要なヌクレオチドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で）。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイムにより切断される（下）と、結果として得られるｇＲＮＡは、新たに形成された５’側位置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−ｇＲＮＡを発現させる構築物を、図１１Ｂに示す。一般に、Ｕ６、Ｈ１、またはＴ７などのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであるプロモーターを使用して、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、ｇＲＮＡを放出するであろう。２つの遺伝子座のターゲティングを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＨＨ１＝配列番号５１；ＨＨ２＝配列番号５２）、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断（矢印）の成功と共に示す（図１１Ｃ）。

【図12】図１２は、特異的アプタマーの存在下でｇＲＮＡをプロセシングするのにアプタザイムを使用する、調節可能なＣＲＩＳＰＲ構築物を示す。特に、図１２は、テオフィリンアプタザイムを形成する、ハンマーヘッド型リボザイムのヘリックスＩＩと融合させたテオフィリンアプタマー（橙）であって、ｇＲＮＡ（青）の５’側にあるテオフィリンアプタマーについて描示する。テオフィリンの結合は、ヘリックスＩＩを安定化させ、次いで、ハンマーヘッド型自己切断を可能とし、ｇＲＮＡ（配列番号５０）を遊離させる。ここで、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と共に、ＣＲＩＳＰＲ系による切断をターゲティングすることが可能である。ハンマーヘッド型リボザイム、配列番号５５。

【図13】図１３は、Ｈ１ＲＮＡ遺伝子座およびＰＡＲＰ−２遺伝子座のゲノム構成を示す。右に転写されるＰＡＲＰ−２遺伝子（青）および左に転写されるＨ１ＲＮＡ遺伝子（橙）についての描示であって、原寸に比例して描図される描示を上図に示す。下図は、両方の遺伝子のプロモーター領域の拡大領域である。

【図14】図１４は、Ｈ１ ｐｏｌ ＩＩ活性についてのｅＧＦＰレポーターを示す。ヒトＨ１プロモーター配列は、ｐｏｌ ＩＩによる、ｅＧＦＰの右への転写のために配向されている。最適化される３つの構成要素を、斜字体で指し示す。

【図15】図１５は、ｅＧＦＰレポーターの発現を示す。上パネルは、内因性Ｈ１プロモーターを指し示し、下パネルは、コザック配列による発現を指し示す。

【図16A-B】図１６Ａおよび図１６Ｂは、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの双方向性発現を示す。双方向性ターゲティング構築物についての模式図を、図１６Ａに示す。標準的な２つのベクター送達（レーン２および５）または単一のターゲティングプラスミドの送達（レーン３および６）を使用する、２つの異なる遺伝子座における切断の比較を、図１６Ｂに示す。Ｔ７ＥＩアッセイにより決定されるゲノム改変％を、各レーンの下方に指し示す。

【図17】図１７は、ｈＲｈｏ：ＧＦＰノックインマウスに由来するロドプシン遺伝子座を示す。上図には、それぞれのマウス配列およびヒト配列を、３’ＵＴＲの末端までのｒｈｏプロモーター領域についての概略図の上方に（原寸に比例して描図して）指し示す。下図には、Ｐ２３およびｇＲＮＡの場所を指し示す、拡大領域を示す（矢じり形）。

【図18A-B】図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰ２３Ｈ対立遺伝子の特異的ターゲティングを示す。図１８Ａは、Ｐ２３のターゲティング（ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、配列番号５６；Ｐ２３Ｈ（ＣＣＣ→ＣＡＣ）、配列番号５７；ＷＴ（ＣＡＳＴ／ＥｉＪ）、配列番号５８）を示す。図１８Ｂは、２つの野生型マウス株に由来するロドプシンについてのシークェンシングを示す図であり、ＳＮＰは、矢印で指し示す（Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＤＮＡ配列、配列番号５６；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのタンパク質配列、配列番号５９；ＣＡＳＴ／ＥｉＪ^＋／＋のＤＮＡ配列、配列番号５８；ＣＡＳＴ／ＥｉＪ^＋／＋のタンパク質配列、配列番号５９）。図１８Ｃは、Ｐ２３Ｈ交雑スキームを示す。Ｐ２３Ｈホモ接合性マウス（黒）を、ＷＴ Ｃａｓｔ（白）と交配させ、結果として得られるヘテロ接合性仔マウス（グレー）を、ＡＡＶ５の網膜下送達により処置する。

【図18C】図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰ２３Ｈ対立遺伝子の特異的ターゲティングを示す。図１８Ａは、Ｐ２３のターゲティング（ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、配列番号５６；Ｐ２３Ｈ（ＣＣＣ→ＣＡＣ）、配列番号５７；ＷＴ（ＣＡＳＴ／ＥｉＪ）、配列番号５８）を示す。図１８Ｂは、２つの野生型マウス株に由来するロドプシンについてのシークェンシングを示す図であり、ＳＮＰは、矢印で指し示す（Ｃ５７ＢＬ／６ＪのＤＮＡ配列、配列番号５６；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのタンパク質配列、配列番号５９；ＣＡＳＴ／ＥｉＪ^＋／＋のＤＮＡ配列、配列番号５８；ＣＡＳＴ／ＥｉＪ^＋／＋のタンパク質配列、配列番号５９）。図１８Ｃは、Ｐ２３Ｈ交雑スキームを示す。Ｐ２３Ｈホモ接合性マウス（黒）を、ＷＴ Ｃａｓｔ（白）と交配させ、結果として得られるヘテロ接合性仔マウス（グレー）を、ＡＡＶ５の網膜下送達により処置する。

【図19】図１９は、ロドプシン遺伝子座の対立遺伝子特異的ターゲティングを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｐ２３Ｈ）対立遺伝子の切断を、単一の塩基ミスマッチ（Ｃａｓｔ）の切断と対比する比較を示す。Ｔ７ＥＩアッセイにより決定されるゲノム改変％を、下方に指し示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

特許または出願ファイルは、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を伴う、本特許または特許出願公開の複製は、これを要望し、必要な手数料を支払えば、特許庁により提供される。

【0023】

詳細な説明
これより、本明細書の以下では、本明細書で開示される主題について、付属の図を参照しながら、より完全に記載するが、そこでは、本明細書で開示される主題の全てではなく、一部の実施形態が示される。同じ番号は、本明細書を通して、同じエレメントを指す。本明細書で開示される主題は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で記される実施形態に限定されるものとみなされるべきではなく、それどころか、これらの実施形態は、本開示が、関連法規の要件を満たすように提供される。実際、本明細書で開示される主題が関する技術分野の当業者であって、前出の記載および関連する図において提示される教示の利益を有する当業者は、本明細書に記される、本明細書で開示される主題の多くの改変、および他の実施形態に想到するであろう。したがって、本明細書で開示される主題は、開示される具体的実施形態に限定されるものではなく、改変、および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図するものであることを理解されたい。

【0024】

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（PorteusおよびBaltimore（２００３年）、Science、３００巻：７６３頁；Millerら（２００７年）、Nat. Biotechnol.、２５巻：７７８〜７８５頁；Sanderら（２０１１年）、Nature Methods、８巻：６７〜６９頁；Woodら（２０１１年）、Science、３３３巻：３０７頁）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Woodら（２０１１年）、Science、３３３巻：３０７頁；Bochら（２００９年）、Science、３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）、Science、３２６巻：１５０１頁；Christianら（２０１０年）、Genetics、１８６巻：７５７〜７６１頁；Millerら（２０１１年）、Nat. Biotechnol.、２９巻：１４３〜１４８頁；Zhangら（２０１１年）、Nat. Biotechnol.、２９巻：１４９〜１５３頁；Reyonら（２０１２年）、Nat. Biotechnol.、３０巻：４６０〜４６５頁）などのゲノム編集技術により、ターゲティングされたゲノム改変を作出する能力が強化され、疾患突然変異を精密に補正する潜在的可能性が供されている。これらの技術は、有効ではあるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの対のいずれも、所与のＤＮＡ標的部位についての、大型で固有の認識タンパク質を合成することを要請するので、実際的な限界に阻まれている。いくつかのグループが近年、操作されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用を介する高効率のゲノム編集であって、これらの鍵となる限界を回避するゲノム編集について報告している（Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinekら（２０１３年）、eLife、２巻：ｅ００４７１頁；Maliら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Choら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：２３０〜２３２頁；Hwangら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：２２７〜２２９頁）。制作に比較的時間がかかり、労力を要するＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと異なり、合成のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングさせた、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依拠するＣＲＩＳＰＲ構築物は、合成が簡単かつ迅速であり、マルチプレックス化することもできる。しかし、それらの合成の相対的な容易さにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲには、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、ターゲティング可能なゲノム空間へのそれらのアクセスに関する技術的制限がある。

【0025】

ＣＲＩＳＰＲ系による切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列および標的部位の３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への、ｇＲＮＡの相補的塩基対合を要請する（Jinekら（２０１２年）、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論的には、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ゲノム内の、任意の固有のＮ_２０−ＰＡＭ配列をターゲティングすることができる。援用される具体的なＣａｓ９の由来する種に応じて変動する、ＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、１つの制約を課する。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用されているＣａｓ９タンパク質は、配列ＮＧＧを認識する、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、こうして、ゲノム内の任意の固有の２１ヌクレオチドの配列に続く２つのグアノシンヌクレオチド（Ｎ_２０ＮＧＧ）をターゲティングすることができる。タンパク質構成要素により付与される、利用可能なターゲティング空間の拡大は、ＰＡＭ要件を変更した新規のＣａｓ９タンパク質の発見および使用（Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または進行中の新規のＣａｓ９変異体の作出であって、突然変異誘発もしくは指向性進化を介する作出に限定される。ＣＲＩＳＰＲ系の第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドで開始されるｇＲＮＡの発現から生じる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスの使用は、これらの短い非コード転写物が、十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く、転写に必要な全てのエレメントが、上流のプロモーター領域内に含有されるため、ｇＲＮＡの発現に特に適している。しかし、一般に使用されるＵ６プロモーターは、転写の開始に、グアノシンヌクレオチドを要請するので、Ｕ６プロモーターの使用により、ゲノムのターゲティング部位は、ＧＮ_１９ＮＧＧにさらに制約される（Maliら（２０１３年）、Science、３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）、Cell Stem Cell、１２巻：３９３〜３９４頁）。Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写など、代替的な手法もまた、グアノシンヌクレオチドによる開始を要請するであろう（Adhyaら（１９８１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）、Nucleic Acids Res.、１２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）、RNA、４巻：１３１３〜１３１７頁）。

【0026】

本明細書で開示される主題は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）を発現させるＨ１プロモーターの使用により、多くのゲノム内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の精度が、５’ヌクレオチドの特異性の変更に起因して、倍加を超えて増大するという発見に関する。ｇＲＮＡを発現させるＨ１プロモーターを使用して、内因性遺伝子を発現させ、改変する能力は、ＡＮ_１９ＮＧＧゲノム部位およびＧＮ_１９ＮＧＧゲノム部位のいずれをターゲティングするのにも使用することができる。ＡＮ_１９ＮＧＧ部位は、ヒトゲノム内では、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位を１５％超える高頻度で生じ、ターゲティング空間の増大はまた、ヒト遺伝子および疾患遺伝子座でも増進する。したがって、本明細書で開示される主題は、ヒトゲノム内、および他の真核動物種内のターゲティング空間を、倍加を超えて増大させることにより、ＣＲＩＳＰＲ技術の多用途性を増強する。さらに、この改変は、ヒトゲノムにおける、既存のＣＲＩＳＰＲ技術、ＴＡＬＥＮ技術、または亜鉛フィンガー技術より高分解度のターゲティングを可能とする。

【0027】

本明細書で開示される主題はまた、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーター配列の使用により、コンパクトであり、完全に機能的な発現カセットであって、ウイルスベクターにより挿入および送達されうる発現カセットの作出が可能となるという発見にも関する。

【0028】

本明細書で開示される主題はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｇＲＮＡを発現させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｇＲＮＡの発現を調節する、ＲＮＡリボザイムおよび調節可能なアプタザイムの使用にも関する。

【0029】

Ｉ．Ｈ１プロモーターを使用する、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの発現
Ａ．組成物

【0030】

一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。

【0031】

一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、Ｎ_２０ＮＧＧで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧまたはＧＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0032】

本明細書で開示される主題はまた、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと；ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、Ｎ_２０ＮＧＧで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧまたはＧＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0033】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞（例えば、真核細胞）の核内で検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を駆動するのに十分な長さの、１または複数の核局在化配列を含む。理論に束縛されることを望まずに述べると、核局在化配列は、真核生物におけるＣＲＩＳＰＲ複合体活性に必要ではないが、このような配列を含むことは、系の活性、とりわけ、核内の核酸分子のターゲティングに関する活性を増強することが考えられる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９を含みうる。酵素は、Ｃａｓ９の相同体またはオーソログでありうる。

【0034】

一般に、かつ、本明細書を通して、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖である核酸分子、二本鎖である核酸分子、または部分的に二本鎖である核酸分子；１または複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡを含む核酸分子、ＲＮＡを含む核酸分子、またはこれらの両方を含む核酸分子；および当技術分野で公知の、他の多種多様なポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。ベクターの１つの種類は、標準的な分子クローニング技法などにより、さらなるＤＮＡセグメントを挿入しうる、環状二本鎖ＤＮＡループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、ウイルスベクターであり、この場合、ウイルス由来のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）へのパッケージングのためにベクター内に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスにより保有されるポリヌクレオチドも含む。

【0035】

ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「発現ベクター」と称する。組換えＤＮＡ技法において有用な、一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。

【0036】

組換え発現ベクターは、本明細書で開示される主題の核酸であって、宿主細胞内の核酸の発現に適する形態の核酸を含みうるが、これは、組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づき選択されうる、１または複数の調節エレメントであって、発現させる核酸配列に作動的に連結される調節エレメントを含むことを意味する。

【0037】

組換え発現ベクター内で「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写／翻訳系内の発現、またはベクターを、宿主細胞中に導入する場合は、宿主細胞内の発現）を可能とする形で、調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。

【0038】

「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図する。このような調節エレメントは、例えば、Goeddel（１９９０年）、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.において記載されている。調節エレメントは、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を方向付ける調節エレメントと、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を方向付ける調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）とを含む。組織特異的プロモーターは、主に所望される目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特異的臓器（例えば、肝臓、膵臓）または特定の細胞型（例えば、リンパ球）内の発現を方向付けることが可能である。調節エレメントはまた、細胞周期依存的な形または発生段階依存的な形など、時間依存的な形の発現であって、また、組織型特異的の場合もあり、組織型特異的でない場合もあり、細胞型特異的の場合もあり、細胞型特異的でない場合もある発現も方向付けることが可能である。

【0039】

一部の実施形態では、ベクターは、１もしくは複数のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、１もしくは複数のｐｏｌ ＩＩプロモーター、１もしくは複数のｐｏｌ Ｉプロモーター、またはこれらの組合せを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例は、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターを含むがこれらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例は、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲプロモーター（任意選択で、ＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択で、ＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Boshartら（１９８５年）、Cell、４１巻：５２１〜５３０頁）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターを含むがこれらに限定されない。

【0040】

「調節エレメント」という用語にはまた、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ内のＲ−Ｕ５’セグメント（Takebeら（１９８８年）、Mol. Cell. Biol.、８巻：４６６〜４７２頁）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（O'Hareら（１９８１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、７８巻（３号）：１５２７〜３１頁）などのエンハンサーエレメントも包摂される。当業者は、発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。ベクターを、宿主細胞中に導入して、これにより、本明細書で記載される核酸によりコードされる融合タンパク質または融合ペプチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）転写物、ＣＲＩＳＰＲタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ酵素、その突然変異体形態、その融合タンパク質など）を含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを作製することができる。有利なベクターは、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含み、このようなベクターの種類はまた、特定の種類の細胞をターゲティングするために選択することもできる。

【0041】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、任意の公知または未知の機能を果たしうる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析により規定される複数の遺伝子座（単数の遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、１または複数の修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前に付与することもでき、ポリマーのアセンブリーの後で付与することもできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識用構成要素とのコンジュゲーションなど、多量体化の後でさらに修飾することもできる。

【0042】

本明細書で開示される主題の態様では、「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一のガイドＲＮＡ」および「合成ガイドＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、ガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を指定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、「ガイド」または「スペーサー」という用語と互換的に使用することができる。

【0043】

本明細書で使用される「野生型」という用語は、当業者により理解される、当技術分野の用語であり、天然で生じる、生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態であって、突然変異体形態または変異体形態から識別される形態を意味する。

【0044】

本明細書で使用される「変異体」（variant）という用語は、天然で生じるものから逸脱するパターンを有する性質の呈示を意味するように理解するものとする。

【0045】

「非自然発生の」または「操作された」という用語は、互換的に使用され、人為の関与を指し示す。核酸分子またはポリペプチドを指す場合の用語は、核酸分子またはポリペプチドが、それらが天然で会合し、天然で見出される、少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

【0046】

「相補性」とは、従来のワトソン−クリック型塩基対合または他の非従来型の塩基対合により、別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントとは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を形成しうる、核酸分子内の残基の百分率を指し示す（例えば、１０のうち５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０であれば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続残基が、第２の核酸配列内の同数の連続残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはこれを超えるヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指すか、または厳密な条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

【0047】

本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションのための「厳密な条件」とは、その下では、標的配列に対する相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズし、非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は一般に、配列依存的であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長いほど、配列が、その標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。厳密な条件の非限定的な例は、Tijssen（１９９３年）、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes、１部、２章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Y.において詳細に記載されている。

【0048】

「ハイブリダイゼーション」とは、１または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合により生じる場合もあり、フーグスティーン結合により生じる場合もあり、他の任意の配列特異的な形で生じる場合もある。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本もしくはこれを超える鎖、自己ハイブリダイズ型一本鎖、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範な工程内のステップを構成しうる。所与の配列とハイブリダイズさせることが可能な配列を、所与の配列の「相補体」と称する。

【0049】

本明細書で使用される「発現」とは、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡ鋳型から（ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物などに）転写される工程、および／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される工程を指す。転写物と、コードされたポリペプチドとを、総体として、「遺伝子産物」と称する。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞内のｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。

【0050】

本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語を互換的に使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含むことが可能であり、アミノ酸以外で中断されうる。用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識用構成要素とのコンジュゲーションなど、他の任意の取扱いを施されたアミノ酸ポリマーも包摂しうる。

【0051】

本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにＤ光学異性体およびＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸を含む。

【0052】

本明細書で開示される主題の実施は、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある従来の技法であって、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム学、および組換えＤＮＡの技法（Sambrook、FritschおよびManiatis（１９８９年）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版；Ausubelら編（１９８７年）、Current Protocols in Molecular Biology；MacPhersonら編（１９９５年）、Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）、PCR 2: A Practical Approach；HarlowおよびLane編（１９８８年）、Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney編（１９８７年）、Animal Cell Culture）を援用する。

【0053】

本明細書で開示される主題のいくつかの態様は、１もしくは複数のベクターを含むベクター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核細胞内または真核細胞内のＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のためにデザインすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞内、昆虫細胞内（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞内、または哺乳動物細胞内で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Goeddel（１９９０年）、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.においてさらに論じられている。代替的に、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写および翻訳することもできる。

【0054】

ベクターは、原核生物に導入し、原核生物内で繁殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物を、真核細胞中に導入されるベクターのコピーを増幅するのに使用するか、または真核細胞中に導入されるベクターの作製における中間体ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージング系の一部としてのプラスミドを増幅する）として使用する。一部の実施形態では、原核生物を、宿主細胞または宿主生物に送達するための１または複数のタンパク質の供給源を用意するなど、ベクターのコピーを増幅し、１または複数の核酸を発現させるのに使用する。原核生物内のタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を方向付ける、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターを含有するベクターを伴う、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ内で実行することが最も多い。

【0055】

融合ベクターは、組換えタンパク質のアミノ末端など、その中でコードされるタンパク質に、いくつものアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大させる目的；（ｉｉ）組換えタンパク質の可溶性を増大させる目的；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製の一助となる目的など、１または複数の目的に適いうる。融合発現ベクター内では、融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質の、融合部分からの分離を可能にするのに、タンパク質分解性切断部位を、融合部分と、組換えタンパク質との接合部に導入することが多い。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合性タンパク質、またはプロテインＡのそれぞれを、標的組換えタンパク質と融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；SmithおよびJohnson（１９８８年）、Gene、６７巻：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を含む。

【0056】

適切な誘導的非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Amrannら（１９８８年）、Gene、６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ １１ｄ（Studierら（１９９０年）、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、１８５巻、Academic Press、San Diego、Calif.）を含む。

【0057】

一部の実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ内の発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら（１９８７年）、EMBO J.、６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（KuijanおよびHerskowitz（１９８２年）、Cell、３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８７年）、Gene、５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を含む。

【0058】

一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞内の１または複数の配列の発現を駆動することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Seed（１９８７年）、Nature、３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７年）、EMBO J.、６巻：１８７〜１９５頁）を含む。哺乳動物細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、１または複数の調節エレメントによりもたらされることが典型的である。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、および本明細書で開示され、当技術分野で公知である、他のウイルスに由来する。原核細胞および真核細胞の両方に適する他の発現系については、例えば、Sambrookら（１９８９年）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.の１６および１７章を参照されたい。

【0059】

一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、核酸の発現を、特定の細胞型内で、優先的に方向付ける（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して、核酸を発現させる）ことが可能である。当技術分野では、組織特異的調節エレメントが公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（１９８７年）、Genes Dev.、１巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton（１９８８年）、Adv. Immunol.、４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞受容体（WinotoおよびBaltimore（１９８９年）、EMBO J.、８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリン（Baneijiら（１９８３年）、Cell、３３巻：７２９〜７４０頁；QueenおよびBaltimore（１９８３年）、Cell、３３巻：７４１〜７４８頁）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経線維プロモーター；ByrneおよびRuddle（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（１９８５年）、Science、２３０巻：９１２〜９１６頁）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）を含む。また、発生調節型プロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselおよびGruss（１９９０年）、Science、２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトタンパク質プロモーター（CampesおよびTilghman（１９８９年）、Genes Dev.、３巻：５３７〜５４６頁）も包摂される。

【0060】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１または複数のエレメントの発現を駆動するように、調節エレメントを、ＣＲＩＳＰＲ系の１または複数のエレメントに作動可能に連結する。一般に、ＳＰＩＤＲ（ｓｐａｃｅｒ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）としてもまた公知の、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）は、通例、特定の細菌種に特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ishinoら（１９８７年）、J. Bacteriol.、１６９巻：５４２９〜５４３３頁；およびNakataら（１９８９年）、J. Bacteriol.、１７１巻：３５５３〜３５５６頁）および関連する遺伝子内で認識された、散在型ＳＳＲ（ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）の顕著に異なるクラスを含む。類似の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ属、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいても同定されている（Groenenら（１９９３年）、Mol. Microbiol.、１０巻：１０５７〜１０６５頁；Hoeら（１９９９年）、Emerg. Infect. Dis.、５巻：２５４〜２６３頁；Masepohlら（１９９６年）、Biochim. Biophys. Acta、１３０７巻：２６〜３０頁；およびMojicaら（１９９５年）、Mol. Microbiol.、１７巻：８５〜９３頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＳＲＳＲ（ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）と名付けられたリピートの構造により、他のＳＳＲと異なることが典型的である（Janssenら（２００２年）、OMICS J. Integ. Biol.、６巻：２３〜３３頁；およびMojicaら（２０００年）、Mol. Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。一般に、リピートとは、長さが実質的に一定である固有の介在配列により規則的に隔てられたクラスター内で生じる短いエレメントである（Mojicaら（２０００年）、Mol. Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。リピート配列は、株の間で高度に保存的であるが、散在型リピートの数と、スペーサー領域の配列とは、株により異なることが典型的である（van Embdenら（２０００年）、J. Bacteriol.、１８２巻：２３９３〜２４０１頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物（例えば、Jansenら（２００２年）、Mol. Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；およびMojicaら（２００５年）、J. Mol. Evol.、６０巻：１７４〜８２頁）であって、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ属、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ属、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ａｑｕｉｆｒｅｘ属、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｚａｒｃｕｓ属、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｒｗｉｎｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属を含むがこれらに限定されない原核生物において同定されている。

【0061】

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、総体として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、もしくはこれらの活性を方向付ける転写物、および他のエレメント、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、「スペーサー」ともまた称する）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来する他の配列および転写物を指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１または複数のエレメントは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１または複数のエレメントは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓなど、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位における、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、プロトスペーサーともまた称する）により特徴付けられる。

【0062】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列が、それに対する相補性を有するようにデザインされる配列であって、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される配列を指す。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在するという条件で、完全な相補性が必ずしも要請されるわけではない。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態では、標的配列を、細胞の核内または細胞質内に配置する。一部の実施形態では、標的配列は、真核細胞の細胞小器官内、例えば、ミトコンドリア内またはクロロプラスト内に存在しうる。ターゲティングされる遺伝子座であって、標的配列を含む遺伝子座への組換えのために使用しうる配列または鋳型を、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称する。本明細書で開示される主題の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドを、編集鋳型と称することができる。本明細書で開示される主題の態様では、組換えは、相同組換えである。

【0063】

一部の実施形態では、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」ともまた称する）など、１または複数の挿入部位を含む。一部の実施形態では、１または複数の挿入部位（例えば、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、もしくはこれを超える挿入部位、またはこれらを超える挿入部位）を、１または複数のベクターの、１または複数の配列エレメントの上流および／または下流に配置する。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現構築物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ活性を、細胞内の、複数の異なる、対応する標的配列にターゲティングすることができる。例えば、単一のベクターは、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、もしくはこれを超えるガイド配列、またはこれらを超えるガイド配列を含みうる。一部の実施形態では、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、もしくはこれを超えるこのようなガイド配列含有ベクター、またはこれらを超えるガイド配列含有ベクターを提供し、任意選択で、細胞に送達することができる。

【0064】

一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結した調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としてもまた公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらの相同体、またはこれらの修飾形を含む。これらの酵素は、公知であり、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて、受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下に見出すことができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９などの非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するＣａｓ９でありうる。

【0065】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内など、標的配列の場所において、鎖の一方または両方の切断を方向付ける。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドに由来する、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはこれを超える塩基対内の、鎖の一方または両方の切断を方向付ける。一部の実施形態では、突然変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの鎖の一方または両方を切断する能力を欠くように、ベクターは、対応する野生型酵素に照らして突然変異させたＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。

【0066】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核細胞など、特定の細胞内の発現についてコドンが最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物など、特定の生物の細胞、またはこれらに由来する細胞でありうる。一般に、コドン最適化とは、目的の宿主細胞内の発現を増強するために、核酸配列を改変する工程であって、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはこれを超えるコドン、またはこれらを超えるコドン）を、その宿主細胞の遺伝子内で、より高頻度に、または最も高頻度に使用されるコドンで置きかえることにより、核酸配列を改変する工程を指す。多様な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて、特定のバイアスを呈示する。コドンバイアス（生物間のコドン使用の差違）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、これは、ひいては、他の事柄にもまして、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子のアベイラビリティーに依存すると考えられる。細胞内で選択されるｔＲＮＡの卓越は一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所与の生物における最適な遺伝子発現についてテーラリングすることができる。コドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」でたやすく入手可能であり、これらの表は、多数の方式で適合させることができる。Nakamuraら（２０００年）、Nucl. Acids Res.、２８巻：２９２頁を参照されたい。また、特定の宿主細胞内の発現のために、特定の配列のコドンを最適化するためのコンピュータアルゴリズムであって、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）などのアルゴリズムも利用可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列内の１または複数のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはこれを超えるコドン、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸に最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

【0067】

一般に、ガイド配列とは、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の、標的配列への配列特異的結合を方向付けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適に配列決定される場合の、ガイド配列と、その対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはこれを超えるか、またはこれらを超える。最適のアライメントは、配列決定に適する任意のアルゴリズムであって、その非限定的な例が、スミス−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ−ホイーラー変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）を含むアルゴリズムの使用により決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、もしくはこれを超えるヌクレオチドの長さ、またはこれらを超えるヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、もしくはこれより少ないヌクレオチドの長さ、またはこれら未満のヌクレオチドの長さである。

【0068】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の、標的配列への配列特異的結合を方向付けるガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイにより評価することができる。例えば、被験ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションに続く、本明細書で記載されるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイなどを介する、標的配列内の優先的切断の評価などにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に施すことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、被験ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素、および被験ガイド配列と異なる対照のガイド配列を用意し、被験ガイド配列反応物と対照ガイド配列反応物との間で、標的配列における結合または切断率を比較することにより、試験管内で査定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者は、これらに想到するであろう。

【0069】

ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標的ゲノム内で固有の標的配列を含む。

【0070】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１または複数の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の部分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、もしくはこれを超えるドメイン、またはこれらを超えるドメイン）である。ＣＲＩＳＰＲ酵素の融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列と、任意選択で、任意の２つのドメインの間のリンカー配列とを含みうる。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合させうるタンパク質ドメインの例は、限定なしに述べると、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性のうちの１または複数を有するタンパク質ドメインを含む。エピトープタグの非限定的な例は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含む。レポーター遺伝子の例は、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、または他の細胞内分子に結合する、タンパク質またはタンパク質の断片であって、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合性ドメイン融合体、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含むがこれらに限定されない、タンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の部分を形成しうる、さらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１００５９５０２において記載されている。一部の実施形態では、タグ付けされたＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して、標的配列の場所を同定する。

【0071】

本明細書で開示される主題の態様では、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子を、遺伝子産物の発現の変更または修飾を測定するためのマーカーとして用いられる遺伝子産物をコードするように、細胞中に導入することができる。本明細書で開示される主題のさらなる実施形態では、ＤＮＡ分子をコードする遺伝子産物を、ベクターを介して細胞中に導入することができる。本明細書で開示される主題の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ルシフェラーゼである。本明細書で開示される主題のさらなる実施形態では、遺伝子産物の発現が低減される。

【0072】

一般に、本明細書で開示される主題のプロモーターの実施形態は、１）ＴＡＴＡボックス、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、および遠位配列エレメント（ＤＳＥ）を含む、完全Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに２）ＤＳＥの５’末端とリバースの配向性で融合させたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む、第２の基本Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。そのヌクレオチド配列にちなんで名付けられたＴＡＴＡボックスは、Ｐｏｌ ＩＩＩ特異性の主要な決定基である。ＴＡＴＡボックスは通例、転写される配列と比べてｎｔ．−２３〜−３０の間の位置に配置され、転写される配列の始点の最重要の決定基である。ＰＳＥは通例、ｎｔ．−４５〜−６６の間に配置される。ＤＳＥは、基本Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの活性を増強する。Ｈ１プロモーターでは、ＰＳＥとＤＳＥとの間にギャップが存在しない。

【0073】

双方向性プロモーターは、１）３つの外部制御エレメント：ＤＳＥ、ＰＳＥ、およびＴＡＴＡボックスを含有する、従来の完全一方向性Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター；ならびに２）ＤＳＥの５’末端とリバースの配向性で融合させたＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む、第２の基本Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターからなる。ＴＡＴＡ結合性タンパク質により認識されるＴＡＴＡボックスは、Ｐｏｌ ＩＩＩを、プロモーター領域に動員するために不可欠である。ＴＡＴＡ結合性タンパク質の、ＴＡＴＡボックスへの結合は、ＳＮＡＰｃの、ＰＳＥとの相互作用により安定化する。まとめると、これらのエレメントは、それが、発現させる配列を転写しうるように、Ｐｏｌ ＩＩＩを適正に位置付ける。また、ＤＳＥも、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの完全な活性に不可欠である（Murphyら（１９９２年）、Mol. Cell Biol.、１２巻：３２４７〜３２６１頁；Mittalら（１９９６年）、Mol. Cell Biol.、１６巻：１９５５〜１９６５頁；FordおよびHernandez（１９９７年）、J.Biol.Chem.、２７２巻：１６０４８〜１６０５５頁；Fordら（１９９８年）、Genes Dev.、１２巻：３５２８〜３５４０頁；Hovdeら（２００２年）、Genes Dev.、１６巻：２７７２〜２７７７頁）。転写は、転写因子であるＯｃｔ−１および／またはＳＢＦ／Ｓｔａｆの、ＤＳＥ内のそれらのモチーフとの相互作用により、最大で１００倍に増強される（KunkelおよびHixon（１９９８年）、Nucl. Acid Res.、２６巻：１５３６〜１５４３頁）。フォワードおよびリバースに配向させた基本プロモーターは、二本鎖ＤＮＡ鋳型の逆行鎖上の配列の転写を方向付けるので、リバースに配向させた基本プロモーターのプラス鎖を、ＤＳＥのマイナス鎖の５’末端に付加する。Ｈ１プロモーターの制御下で発現させた転写物は、４つまたは５つのＴによる切れ目のない配列で終結させる。

【0074】

Ｈ１プロモーター内で、ＤＳＥは、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接する（Myslinskiら（２００１年）、Nucl. Acid Res.、２９巻：２５０２〜２５０９頁）。配列の反復を最小化するために、リバース方向の転写が、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付加することにより制御される、ハイブリッドプロモーターを創出することにより、このプロモーターを双方向性とした。双方向性Ｈ１プロモーターの構築を容易とするために、小型のスペーサー配列もまた、リバースに配向させた基本プロモーターとＤＳＥとの間に挿入することができる。

【0075】

Ｂ．方法
一部の実施形態では、本明細書で開示される主題はまた、細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、方法が、細胞中に、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含む方法も提供する。

【0076】

一部の実施形態では、本明細書で開示される主題はまた、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、方法が、細胞中に、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーターと；ｂ）真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ａ）および（ｂ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含む方法も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、Ｎ_２０ＮＧＧで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧまたはＧＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0077】

本明細書で開示される主題はまた、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、方法が、細胞中に、双方向性Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、双方向性Ｈ１プロモーターが、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、ｇＲＮＡが、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと；ｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断し、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入するステップを含む方法も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、Ｎ_２０ＮＧＧで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ_１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ_１９ＮＧＧまたはＧＮ_１９ＮＧＧを含む。別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらに別の態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、１または複数の遺伝子産物の発現が低減される。

【0078】

一部の態様では、本明細書で開示される主題は、本明細書で記載される１もしくは複数のベクターなど、１もしくは複数のポリヌクレオチド、１もしくは複数のその転写物、および／またはそこから転写される１もしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、本明細書で開示される主題はさらに、このような方法により作製される細胞、およびこのような細胞を含む生物（動物、植物、または真菌など）またはこのような細胞から作製される生物を提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（および任意選択でガイド配列と複合体化させた）ＣＲＩＳＰＲ酵素を、細胞に送達する。従来のウイルスベースの遺伝子導入方法および非ウイルスベースの遺伝子導入方法を使用して、哺乳動物細胞内または標的組織内に核酸を導入することができる。このような方法を使用して、ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素をコードする核酸を、培養物中または宿主生物内の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書で記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合体化させた核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含み、これらは、細胞への送達の後で、ゲノムをエピソームとするか、または統合する。遺伝子治療手順の総説については、Anderson（１９９２年）、Science、２５６巻：８０８〜８１３頁；NabelおよびFelgner（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：２１１〜２１７頁；MitaniおよびCaskey（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：１６２〜１６６頁；Dillon（１９９３年）、TIBTECH、１１巻：１６７〜１７５頁；Miller（１９９２年）、Nature、３５７巻：４５５〜４６０頁；Van Brunt（１９９８年）、Biotechnology、６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁；Vigne（１９９５年）、Restorative Neurology and Neuroscience、８巻：３５〜３６頁；KremerおよびPerricaudet（１９９５年）、British Medical Bulletin、５１巻（１号）：３１〜４４頁；Haddadaら（１９９５年）、Current Topics in Microbiology and Immunology、DoerflerおよびBohm（編）；ならびにYuら（１９９４年）、Gene Therapy、１巻：１３〜２６頁を参照されたい。

【0079】

核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ウィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、または脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強型取込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号において記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの、効率的な受容体認識型リポフェクションに適する、カチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒによるカチオン性脂質および中性脂質（ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４）を含む。送達は、細胞への送達（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ投与またはｅｘ ｖｉｖｏ投与）の場合もあり、標的組織への送達（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）の場合もある。

【0080】

イムノリピド複合体など、ターゲティング型リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal（１９９５年）、Science、２７０巻：４０４〜４１０頁；Blaeseら（１９９５年）、Cancer Gene Ther.、２巻：２９１〜２９７頁：Behrら（１９９４年）、Bioconjugate Chem.、５巻：３８２〜３８９頁；Remyら（１９９４年）、Bioconjugate Chem.、５巻：６４７〜６５４頁；Gaoら（１９９５年）、Gene Therapy、２巻：７１０〜７２２頁；Ahmadら（１９９２年）、Cancer Res.、５２巻：４８１７〜４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号）。

【0081】

核酸の送達のための、ウイルスＲＮＡベースの系またはウイルスＤＮＡのベースの系の使用では、ウイルスを、体内の特異的細胞にターゲティングし、ウイルスのペイロードを、核にトラフィッキングするための、高度に進化した工程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて）投与することもでき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて細胞を処置するのに使用することもでき、任意選択で、改変細胞を患者に投与する（ｅｘ ｖｉｖｏにおいて）こともできる。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含みうるであろう。レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法では、宿主ゲノム内の統合が可能であり、挿入されたトランス遺伝子の長期にわたる発現を結果としてもたらすことが多い。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織における形質導入効率の増大も観察されている。

【0082】

レトロウイルスの向細胞性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を拡大することにより変更することができる。レンチウイルスベクターとは、非分裂細胞に形質導入するか、またはこれらに感染し、典型的には、高ウイルス力価をもたらすことが可能なレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルスの遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、外来配列のパッケージング容量を最大で６〜１０ｋｂとするシス作用型ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含む。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用型ＬＴＲで十分であり、次いで、これを使用して、治療用遺伝子を、標的細胞中に組み込んで、恒久的なトランス遺伝子発現をもたらす。広く使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組合せに基づくレトロウイルスベクター（例えば、Buchscherら（１９９２年）、J. Virol.、６６巻：２７３１〜２７３９頁；Johannら（１９９２年）、J. Virol.、６６巻：１６３５〜１６４０頁；Sommnerfeltら（１９９０年）、J. Virol.、１７６巻：５８〜５９頁；Wilsonら（１９８９年）、J. Virol.、６３巻：２３７４〜２３７８頁；Millerら（１９９１年）、J. Virol.、６５巻：２２２０〜２２２４頁；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）を含む。一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスのベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型における極めて高度な形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要請しない。このようなベクターにより、高力価および高発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純な系により大量に作製することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸およびペプチドの産生において、細胞に標的核酸を形質導入するのにも使用することができ、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子治療手順にも使用することができる（例えば、Westら（１９８７年）、Virology、１６０巻：３８〜４７頁；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin（１９９４年）、Human Gene Therapy、５巻：７９３〜８０１頁；Muzyczka（１９９４年）、J. Clin. Invest.、９４巻：１３５１頁）。組換えＡＡＶベクターの構築については、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら（１９８５年）、Mol. Cell. Biol.、５巻：３２５１〜３２６０頁；Tratschinら（１９８４年）、Mol. Cell. Biol.、４巻：２０７２〜２０８１頁；HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８１巻：６４６６〜６４７０頁；ならびにSamulskiら（１９８９年）、J. Virol.、６３巻：０３８２２〜３８２８頁を含む多数の刊行物において記載されている。

【0083】

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞への感染が可能なウイルス粒子を形成することが典型的である。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通例、核酸ベクターを、ウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を作製することにより作出する。ベクターは、パッケージングおよびその後の宿主への統合に要請される、最小限のウイルス配列を含有することが典型的であり、他のウイルス配列は、ポリヌクレオチドを発現させるための発現カセットで置きかえられる。逸失するウイルス機能は、パッケージング細胞系により、トランスで供給されることが典型的である。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムに由来するＩＴＲ配列であって、パッケージングおよび宿主ゲノムへの統合に要請されるＩＴＲ配列だけを有することが典型的である。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐはコードするが、ＩＴＲ配列を欠く、ヘルパープラスミドを含有する細胞系内にパッケージングされる。細胞系にはまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染させることができる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびＡＡＶ遺伝子の、ヘルパープラスミドからの発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、著明量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は、例えば、ＡＡＶよりアデノウイルスの感受性が高い熱処理により低減することができる。当業者には、核酸を細胞に送達するためのさらなる方法が公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００３００８７８１７を参照されたい。

【0084】

一部の実施形態では、宿主細胞に、本明細書で記載される１または複数のベクターを、一過性で、または恒久的にトランスフェクトする。一部の実施形態では、被験体における自然発生の細胞にトランスフェクトする。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞を、被験体から採取する。一部の実施形態では、細胞は、細胞系など、被験体から採取された細胞に由来する。当技術分野では、組織培養のための多種多様な細胞系が公知である。細胞系の例は、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽；１０．１マウス線維芽、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−ＭｅＩ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびこれらのトランスジェニック亜種を含むがこれらに限定されない。細胞系は、当業者に公知の様々な供給源（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ、Ｖａ．）を参照されたい）から入手可能である。一部の実施形態では、本明細書で記載される１または複数のベクターをトランスフェクトされた細胞を使用して、１または複数のベクター由来配列を含む、新たな細胞系を確立する。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＲＩＳＰＲ系の構成要素を一過性にトランスフェクトされ（１もしくは複数のベクターの一過性トランスフェクション、またはＲＮＡのトランスフェクションなどにより）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して改変された細胞を使用して、改変を含有するが、他の任意の外因性配列を欠く細胞を含む、新たな細胞系を確立する。一部の実施形態では、本明細書で記載される１もしくは複数のベクターを、一過性に、もしくは恒久的にトランスフェクトされた細胞、またはこのような細胞に由来する細胞系を、１または複数の被験化合物の評価において使用する。

【0085】

一部の実施形態では、本明細書で記載される１または複数のベクターを使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製する。一部の実施形態では、トランスジェニック動物は、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳動物である。ある特定の実施形態では、生物または被験体は、植物である。当技術分野では、トランスジェニック動物を作製するための方法が公知であり、一般に、本明細書で記載される細胞トランスフェクション方法などの細胞トランスフェクション方法で始める。

【0086】

一態様では、本明細書で開示される主題は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法であって、ｉｎ ｖｉｖｏ方法の場合もあり、ｅｘ ｖｉｖｏ方法の場合もあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法の場合もある方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、細胞または細胞集団を、ヒトまたは非ヒト動物からサンプリングするステップと、１または複数の細胞を改変するステップとを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、任意の段階で生じうる。１または複数の細胞はなお、非ヒト動物中に再導入することもできる。

【0087】

一態様では、本明細書で開示される主題は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を、標的ポリヌクレオチドに結合させ、標的ポリヌクレオチドの切断を果たさせ、これにより、標的ポリヌクレオチドを改変するステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させた、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むステップを含む。

【0088】

一態様では、本明細書で開示される主題は、真核細胞内のポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、結合が、ポリヌクレオチドの発現の増大または減少を結果としてもたらすように、ＣＲＩＳＰＲ複合体を、ポリヌクレオチドに結合させるステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させた、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むステップを含む。

【0089】

一態様では、本明細書で開示される主題は、ＣＲＩＳＰＲ系の１または複数のエレメントを使用するための方法を提供する。本明細書で開示される主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本明細書で開示される主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多数の細胞型内の標的ポリヌクレオチドを改変すること（例えば、欠失させること、挿入すること、転座させること、不活化させること、活性化させること）を含む、多種多様な有用性を有する。したがって、本明細書で開示される主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患の診断、および予後診断において広範に適用される。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させたＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。

【0090】

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性または外因性である、任意のポリヌクレオチドでありうる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドでありうる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列の場合もあり、非コード配列（例えば、調節的ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）の場合もある。理論に束縛されることを望まずに述べると、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列と関連すると考えられる。ＰＡＭの正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて異なるが、ＰＡＭは、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列であることが典型的である。ＰＡＭ配列の例は、下記の実施例節で与えられるが、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素を伴う使用のための、さらなるＰＡＭ配列を同定することも可能であろう。

【0091】

標的ポリヌクレオチドの例は、シグナル伝達のための生化学経路と関連する配列、例えば、シグナル伝達のための生化学経路に関連する遺伝子またはポリヌクレオチドを含む。標的ポリヌクレオチドの例は、疾患関連遺伝子または疾患関連ポリヌクレオチドを含む。「疾患関連」遺伝子または「疾患関連」ポリヌクレオチドとは、罹患した組織に由来する細胞内で、非疾患対照の組織または細胞と比較して、異常なレベルまたは異常な形態の転写産物または翻訳産物をもたらす、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。「疾患関連」遺伝子は、異常な高レベルで発現する遺伝子の場合もあり、異常な低レベルで発現する遺伝子の場合もあり、この場合、発現の変更は、疾患の発症および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、直接疾患の病因をなすか、または疾患の病因をなす遺伝子と連鎖不均衡の関係にある突然変異または遺伝的変異を所持する遺伝子も指す。転写または翻訳される産物は、公知の産物の場合もあり、未知の産物の場合もあり、正常なレベルの場合もあり、異常なレベルの場合もある。

【0092】

本明細書で開示される主題の実施形態はまた、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅、ならびにＤＮＡリピートの不安定性および神経障害と関連する特定の突然変異の修復に関する方法および組成物（Robert D. Wells、Tetsuo Ashizawa、Genetic Instabilities and Neurological Diseases、第２版、Academic Press、２０１１年１０月１３日（Medical））にも関する。タンデムリピート配列の特異的な態様は、２０を超えるヒト疾患の一因となることが見出されている（McIvorら（２０１０年）、RNA Biol.、７巻（５号）：５５１〜８頁）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用して、ゲノムの不安定性によるこれらの欠損を補正することができる。

【0093】

本明細書で開示される主題のさらに別の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、Traboulsi編（２０１２年）、Genetic Diseases of the Eye、第２版、Oxford University Pressにおいてさらに記載されている、いくつかの遺伝子突然変異から生じる眼の欠損を補正することができる。

【0094】

本明細書で開示される主題のいくつかのさらなる態様は、広範にわたる遺伝性疾患と関連する欠損を補正することに関する。例えば、遺伝性脳疾患は、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、エカルディ症候群、アルパース病（Alpers’ Disease）、アルツハイマー病（Alzheimer’s Disease）、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病、および他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパシー、ならびにＮＩＮＤＳコルポセファリーを含みうるがこれらに限定されない。

【0095】

一部の実施形態では、状態は、新生物でありうる。一部の実施形態では、状態は、加齢黄斑変性でありうる。一部の実施形態では、状態は、統合失調症でありうる。一部の実施形態では、状態は、トリヌクレオチドリピート障害でありうる。一部の実施形態では、状態は、脆弱Ｘ症候群でありうる。一部の実施形態では、状態は、セクレターゼ関連障害でありうる。一部の実施形態では、状態は、プリオン関連障害でありうる。一部の実施形態では、状態は、ＡＬＳでありうる。一部の実施形態では、状態は、薬物中毒でありうる。一部の実施形態では、状態は、自閉症でありうる。一部の実施形態では、状態は、アルツハイマー病でありうる。一部の実施形態では、状態は、炎症でありうる。一部の実施形態では、状態は、パーキンソン病でありうる。

【0096】

パーキンソン病と関連するタンパク質の例は、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、Ｐａｒｋｉｎ、ＵＣＨＬ１、シンフィリン１、およびＮＵＲＲ１を含むがこれらに限定されない。

【0097】

中毒関連タンパク質の例は、例えば、ＡＢＡＴを含みうる。

【0098】

炎症関連タンパク質の例は、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＣＤ３２ともまた呼ばれるＦＣＧＲ２ｂ）、またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を含みうる。

【0099】

心血管疾患関連タンパク質の例は、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）メンバー８）、またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を含みうる。

【0100】

アルツハイマー病関連タンパク質の例は、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる極低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、またはＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒性サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を含みうる。

【0101】

自閉症スペクトラム障害と関連するタンパク質の例は、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２ともまた呼ばれる）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされるＦＸＲ１（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ １）タンパク質、またはＦＸＲ２遺伝子によりコードされるＦＸＲ２（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）タンパク質を含みうる。

【0102】

黄斑変性と関連するタンパク質の例は、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、またはＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を含みうる。

【0103】

統合失調症と関連するタンパク質の例は、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびこれらの組合せを含みうる。

【0104】

腫瘍抑制に関与するタンパク質の例は、例えば、ＡＴＭ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）、ＡＴＲ（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ３ ｒｅｌａｔｅｄ）、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２ ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ４）、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ ３、またはＮｏｔｃｈ ４を含みうる。

【0105】

セクレターゼ障害と関連するタンパク質の例は、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２相同体（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｐｈａｒｙｎｘ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ １ ｈｏｍｏｌｏｇ Ｂ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、またはＢＡＣＥ１（ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １）を含みうる。

【0106】

筋委縮性側索硬化症と関連するタンパク質の例は、ＳＯＤ１（スーパーオキシドディスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋委縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。

【0107】

プリオン病と関連するタンパク質の例は、ＳＯＤＩ（スーパーオキシドディスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋委縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、およびＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。

【0108】

プリオン障害における神経変性状態に関するタンパク質の例は、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体に代わる、アルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を含みうる。

【0109】

免疫不全症と関連するタンパク質の例は、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー３］を含みうる。

【0110】

トリヌクレオチドリピート障害と関連するタンパク質の例は、例えば、ＡＲ（アンドロゲン 受容体）、ＦＭＲ１（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ １）、ＨＴＴ（ハンチンチン）、またはＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィータンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）を含む。

【0111】

神経伝達障害と関連するタンパク質の例は、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプトアミン（セロトニン）受容体２Ｃ）を含む。

【0112】

神経発生に関連する配列の例は、例えば、Ａ２ＢＰ１（アタキシン２結合性タンパク質１）、ＡＡＤＡＴ（アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＡＮＡＴ（アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＡＢＡＴ（４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１）、またはＡＢＣＡ１３（ＡＴＰ結合性カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３）を含む。

【0113】

本系により処置可能な好ましい状態のさらなる例は、エカルディ−グティエール症候群；アレクサンダー病；アラン−ハーンドン−ダドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩ型およびＩＩＩ型）；アルストレーム症候群；アンゲルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−サラセミア；両側視神経萎縮および（乳児性）１型視神経萎縮；網膜芽細胞腫（両側）；カナバン病；脳眼顔骨格症候群１（ＣＯＦＳ１）；脳腱黄色腫症；コルネリアデランゲ症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早発性家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ＩＩ型ムコリピドーシス；乳児性遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合部型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（乳児性）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連脳回欠損；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；Ｉ型ムコ多糖症、ＩＩ型ムコ多糖症、またはＩＩＩ型ムコ多糖症；ツェルウェガー症候群スペクトルのペルオキシソーム生合成障害；脳内鉄蓄積障害を伴う神経変性；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；Ｃ型ニーマン−ピック病；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル障害；ＣＯＬ１Ａ １／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーミド症候群；ＩＩ型糖原病（ポンぺ病）（乳児性）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；１型肢根型点状軟骨異形成症；ロバート症候群；サンドホフ病；１型シンドラー病；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋委縮症；乳児期発症型脊髄小脳性運動失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；１型タナトフォリック骨異形成症；ＶＩ型コラーゲン関連障害；Ｉ型アッシャー症候群；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；ライソゾーム酸性リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症から選択することができる。

【0114】

ＩＩ．ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｇＲＮＡを発現させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｇＲＮＡの発現を調節する、ＲＮＡリボザイムおよび調節可能なアプタザイム

【0115】

本明細書で開示される主題はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｇＲＮＡを発現させ、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｇＲＮＡの発現を調節する、ＲＮＡリボザイムおよび調節可能なアプタザイムの使用、特に、第１の非制限型ヌクレオチド特異性を伴う、ガイドＲＮＡのシス型プロセシングのための、５’側ハンマーヘッド型リボザイム、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＲＮＡアプタザイムを介するｇＲＮＡ機能の調節の使用にも関する。

【0116】

したがって、本明細書で開示される主題はまた、ａ）触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、およびヘリックスＩＩＩの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、ヘリックスＩＩの二重鎖領域およびヘリックスＩＩＩの二重鎖領域の各々が、触媒性コアの反対側にループ領域を含み、ヘリックスＩＩの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと；ｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であって、ｇＲＮＡが、真核細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、真核細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードし、ヌクレオチド配列が、５’末端および３’末端を含み、ヌクレオチド配列の５’末端が、ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列とを含むアプタマー調節型リボザイムであって、リボザイムが、ヌクレオチド配列の５’末端と、ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、リガンドのアプタマーへの結合により、リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、ｇＲＮＡが産生される、アプタマー調節型リボザイムも提供する。また、（ｉ）ＲＮＡに転写されると、アプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と；（ｉｉ）真核細胞内のＲＮＡの転写を調節する、１または複数の転写調節配列とを含む発現構築物も提供される。また、発現構築物を含む真核細胞も提供される。また、真核細胞内の１または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、１または複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、方法が、発現構築物を細胞中に導入するステップと、細胞をリガンドと、リボザイムの活性を変更する量で接触させるステップとを含み、特に、細胞が、哺乳動物被験体またはヒト被験体における細胞である方法も提供される。一態様では、リガンドは、テオフィリンである。

【0117】

リボザイムとは、自己切断またはライゲーションなど、様々な化学反応を触媒するＲＮＡ分子である（LongおよびUhlenbeck（１９９３年）、FASEB J.、７巻：２５〜３０頁）。多様な自然発生のリボザイムは、ウイルス、ウィロイド、および原虫において同定されている。最初の触媒性ＲＮＡのうちの１つは、タバコリングスポットウィロイド（ｓＴＲＳＶ）のサテライトＲＮＡにおいて発見された（De la Penaら（２００３年）、EMBO J.、２２巻：５５６１〜７０頁）。ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、この病原性ウィロイドは、シスにおいて作用し、複製時に自己切断することが示された。最初のリボザイムの発見以来、ヘアピン型リボザイムおよびハンマーヘッド型リボザイムを含む、天然リボザイムの多様なクラスが同定され、広範に特徴付けられている。

【0118】

ハンマーヘッド型リボザイム（ｈＲｚ）は、最も広範に研究されたリボザイムのうちの１つである（LongおよびUhlenbeck（１９９３年）、Faseb J.、７巻：２５〜３０頁；Pleyら（１９９４年）、Nature、３７２巻：６８〜７４頁；Hammannら（２００１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９８巻：５５０３〜８頁；BlountおよびUhlenbeck（２００５年）、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、３４巻：４１５〜４０頁）。ｈＲｚは、１１ヌクレオチド（ｎｔ）の、高度に保存的な触媒性コアに収束する、３つのヘリックス領域を含む（Khvorovaら（２００３年）、Nat. Struct. Biol.、１０巻：７０８〜１２頁；Salehi-AshtianiおよびSzostak（２００１年）、Nature、４１４巻：８２〜４頁）。切断は、配列特異的であり、５’−ＮＵＸ−３’トリプレット［配列中、Ｎは、任意の塩基であり、Ｕは、ウラシルであり、Ｘは、グアニン以外の任意の塩基である］をターゲティングする。効率的で迅速な切断に最適なＮＵＸは、ＧＵＣである。リボザイムによる切断は、Ｘに由来する２’ヒドロキシル基であって、切断部位のすぐの３’側にある２’ヒドロキシル基が、脱プロトン化されると触媒される。次いで、この求核剤が、切断可能なリン酸を攻撃し、五配位三方両錘形遷移状態を介して、５’生成物および３’生成物を生成させる（BlountおよびUhlenbeck（２００５年）、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、３４巻：４１５〜４０頁）。

【0119】

ｈＲｚの、活性のコンフォメーションへのフォールディングは、二重の二価イオン結合イベントを介して進行すると仮定されている。高アフィニティーの結合イベントは、５００μＭで生じ、三次相互作用の第１のセットをもたらす。第２の低アフィニティーによるイオンの付加は、１０ｍＭで生じ、ヘリックスＩが、フォールドしてヘリックスＩＩＩから遠ざかり、ヘリックスＩＩと相互作用するように、ｈＲｚステムの配向性を再構築する（Hammannら（２００１年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９８巻：５５０３〜８頁）。保存的触媒性コアを伴うｈＲｚであって、特異的ステムループを維持しないｈＲｚを、ミニマルハンマーヘッド型リボザイム（ｍｈＲｚ）と呼ぶ。ｍｈＲｚは、二価イオン濃度が高濃度（１０ｍＭ）のときは活性であるが、低濃度では、事実上不活性である（De la Penaら（２００３年）、EMBO J.、２２巻：５５６１〜７０頁；Khvorovaら（２００３年）、Nat. Struct. Biol.、１０巻：７０８〜１２頁）。天然ｈＲｚの結晶構造では、ステムループのうちの２つが、「キッシングループ」として相互作用する、「Ｙ」字型分子が描示される（Pleyら（１９９４年）、Nature、３７２巻：６８〜７４頁）。ステムループ内の、非対合塩基の間の、これらの三次相互作用は、触媒的に活性のコンフォメーションを安定化させ、高二価イオン状態を不要とすることが提案されている。研究者らは、ループを、ｍｈＲｚデザイン中に再組込みすることにより、１００〜５００μＭの間の、生物学的に関与性の二価イオン濃度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける触媒活性が回復されることを実証している（De la Penaら（２００３年）、EMBO J.、２２巻：５５６１〜７０頁；Khvorovaら（２００３年）、Nat. Struct. Biol.、１０巻：７０８〜１２頁；Cannyら（２００４年）、J. Am. Chem. Soc.、１２６巻：１０８４８〜９頁；Penedoら（２００４年）、RNA、１０巻：８８０〜８頁；Saksmerpromeら（２００４年）、RNA、１０巻：１９１６〜２４頁；WeinbergおよびRossi（２００５年）、FEBS Lett.、５７９巻：１６１９〜２４頁）。ここで、ｉｎ ｖｉｖｏにおける触媒活性のためのデザイン規則を解明することにより、ｈＲｚを、遺伝子発現の有効な調節因子とする準備が整う。

【0120】

したがって、ハンマーヘッド型リボザイムは、コア、コアから伸長する３本のステムを含有する。本明細書では、「ステム」および「ヘリックス」という用語を互換的に使用する場合がある。したがって、本明細書では、コアから伸長する３本のステムを、ステムＩ、ステムＩＩ、およびステムＩＩＩ（またはヘリックスＩ、ヘリックスＩＩ、およびヘリックスＩＩＩ）と称し、少なくとも１つのループを、コアからのステムの反対の末端に配置する。シス作用型リボザイムの実施形態では、リボザイムは、一方は、ステムＩＩ（またはヘリックスＩＩ）の末端に配置され、他方は、ステムＩＩＩ（またはヘリックスＩＩＩ）の末端に配置される、２つのループを含有する。

【0121】

本明細書で使用される「シス切断型ハンマーヘッド型リボザイム」とは、切断部分の前に単一のポリヌクレオチドを含む、ハンマーヘッド型リボザイムである。シス切断型ハンマーヘッド型リボザイムは、自己切断が可能である。

【0122】

ステム（またはヘリックス）とは、リボザイムコアから伸長する核酸モチーフであって、その少なくとも一部が二本鎖である核酸モチーフである。ある特定の実施形態では、リボザイムコアからのステムの反対の末端にループを置き、このループにより、二本鎖ステムの２つの鎖を接続する。ある特定の実施形態では、ステムは、２つ〜２０の相補的塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ステムは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの相補的塩基対を含む。

【0123】

ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも３０％は、相補的塩基対の部分である。残りの塩基対は、ミスマッチした非相補的塩基対の場合もあり、バルジの部分の場合もある。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも４０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも５０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも６０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも７０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも８０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも９０％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも９５％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも９９％は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの１００％が、相補的塩基対の部分である。

【0124】

ループとは、別の鎖と対合しないヌクレオチドの配列であり、コアの反対側である、ステムの遠位末端に配置される。ある特定の実施形態では、ループは、１〜２０ヌクレオチドの間の長さである。ある特定の実施形態では、ループは、２〜１０ヌクレオチドの間の長さである。ある特定の実施形態では、ループは、３〜８ヌクレオチドの間の長さである。ループは、それが接合するステムに従い番号付けされる。したがって、ループＩは、コアの反対側である、ステムＩの末端に配置され、ループＩＩは、コアの反対側である、ステムＩＩの末端に配置され、ループＩＩＩは、コアの反対側である、ステムＩＩＩの末端に配置される。

【0125】

本明細書で使用される「ステム／ループ」とは、そのステム内の任意のバルジ、およびステムの末端におけるループと共に、ステム（またはヘリックス）の全体を指す。例えば、ステム／ループＩＩは、ステムＩＩ内に任意のバルジを含むステムＩＩと、ループＩＩとを含む。ステムが、ループを欠く場合、ステム／ループは、そのステム内の任意のバルジと共に、ステムを指す。本明細書で使用される「バルジ」とは、別の鎖と対合しないヌクレオチドの配列であり、両側を二本鎖核酸配列で挟まれている。ある特定の実施形態では、バルジは、ステム内に配置される。バルジが、ステム内に配置される場合、バルジのヌクレオチドは、ステムの部分であると考えられる。ある特定の実施形態では、ハンマーヘッド型リボザイムは、１つを超えるバルジを含む。ある特定の実施形態では、ステム内のバルジは、コアから２塩基対に配置される。ある特定の実施形態では、ステムの鎖の一方または両方は、バルジを含有する。

【0126】

本明細書で使用される、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、５’末端および３’末端を含み、ヌクレオチド配列の５’末端が、ヘリックスＩＩＩの二重鎖領域と直接カップリングしている。「直接カップリングしている」とは、ループが、アプタマーの非存在下にある活性のリボザイム構造と比べて、ループの２つの残基の間の一方の骨格ホスホジエステル結合だけにおいて中断され、骨格ホスホジエステル結合が、アプタマーの５’末端および３’末端へのホスホジエステル結合で置きかえられることを意味する。アプタマー調節型リボザイムの活性形態では、そうでなければ中断されるループの構造を保存するために、情報伝送ドメインの５’側残基および３’残基を、互いと塩基対合させて、二重鎖領域を形成する。

【0127】

本明細書では、「リガンド」または「解析物」または文法的同等物とは、検出される任意の分子または化合物であり、本明細書で記載される通りにデザインおよび／または選択されるアプタマーと相互作用しうる、分子または化合物を指すことが意図される。適切なリガンドまたは解析物は、農薬、殺虫剤、毒素、治療薬、および乱用される薬物、ホルモン、抗生剤、抗体、有機材料などを含むがこれらに限定されない、環境的化学物質もしくは臨床的化学物質、汚染物質、または生体分子など、低分子の化学物質を含むがこれらに限定されない。適切な生体分子は、タンパク質（酵素、免疫グロブリン、および糖タンパク質を含む）、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞（原核細胞（病原性細菌など）および哺乳動物の腫瘍細胞を含む真核細胞を含む）、ウイルス、胞子などを含むがこれらに限定されない。タンパク質である例示的な解析物は、酵素；薬物；細胞；抗体；抗原；細胞膜抗原および細胞膜受容体（神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体、および細胞表面受容体）またはこれらの天然リガンドを含むがこれらに限定されない。

【0128】

ハンマーヘッド型リボザイム（ｈＲｚ）とは、ホスホジエステル結合のトランスにおける切断またはシスにおける切断を持続することが可能なＲＮＡモチーフである。シス作用型ハンマーヘッド型リボザイム（ｃｈＲｚ）とは、それ自身の骨格の自己切断を経て、２つのＲＮＡ生成物を生成させる、触媒性ＲＮＡである。シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムは、３つの塩基対合型ステムと、切断に要請される残基の高度に保存的コアとを含有する。切断反応は、触媒性部位であるシトシンの２’ヒドロキシル酸素による、同じ残基の３’炭素に接合したリン原子に対する攻撃を介して進行する。これにより、糖リン酸骨格が破壊され、２’，３’環状リン酸が生成する。

【0129】

自己切断反応に要請される、ミニマルハンマーヘッド型配列は、それらの大半がカノニカルのワトソン−クリック塩基対の形成に関与しない、およそ１３の保存的「コア」ヌクレオチドまたは不変の「コア」ヌクレオチドを含む。コア領域には、一般に、カノニカルのワトソン−クリック塩基対を含むが、その他の点では、配列に関して制約されない、ステムＩ、ステムＩＩ、およびステムＩＩＩが隣接する。

【0130】

トランス作用型ハンマーヘッド型リボザイム（ｔｈＲｚ）の切断特異性は、基質と相補的な様式でアニールし、切断可能なホスホジエステル結合の切断を方向付けるリボザイムのハイブリダイジングアームにより制御される。この活性は、切断部分トリプレットの第３のヌクレオチドの後で生じるように、特異的に方向付けられる。

【0131】

本明細書で開示される主題は、アプタマー調節型トランス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと、アプタマー調節型シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムとを提供する。対象のアプタマー調節型ｔｈＲｚおよびアプタマー調節型ｃｈＲｚは、様々なリガンドに対して応答性となるようにたやすく操作することができ、多くの適用において有用な多用途のリボザイムクラスである。例えば、アプタマー調節型ｔｈＲｚおよびアプタマー調節型ｃｈＲｚは、ターゲティングされる遺伝子の活性を、リガンド依存的な形でモジュレートするようにデザインすることができ、したがって、内因性遺伝子または異種遺伝子の発現をモジュレートするのに有用である。

【0132】

リボザイムドメイン（本明細書ではまた、エフェクタードメイン）は、「オフ」状態および「オン」状態という、少なくとも２つのコンフォメーション状態であって、ｃｈＲｚの場合における自己切断またはｔｈＲｚの場合における標的配列の切断を経るために、その活性レベル（例えば、反応速度）により規定されるコンフォメーション状態を有しうる。本明細書で開示される主題のエフェクタードメインは、アプタマードメインへのリガンドの結合に応答して、それらの「オン」コンフォメーション状態と「オフ」コンフォメーション状態との間で切り換えることができる。したがって、本明細書で開示される主題のアプタマー調節型リボザイムは、リガンドの結合に応答して、その活性が「オン」および「オフ」とされる、スイッチとして作用する。ある特定の実施形態では、リボザイムドメインの機能は、リガンドの存在もしくは非存在に顕著に依存的であるか、またはアプタマードメインへの結合に利用可能なリガンドの濃度に対するより大きな用量反応様の依存性を示しうる。

【0133】

アプタマーが結合し、したがって、これによりリボザイムが調節されるリガンドの選択は、広範にわたる。ある特定の場合、リガンドは、分子量が２５００ａｍｕ未満の低分子である。これらは、例示だけを目的として述べると、ペプチド、有機低分子（薬物ならびにある特定の代謝物および中間体、共因子などを含む）、および金属イオンを含む、自然発生の分子の場合もあり、非自然発生の分子の場合もある。アプタマーに結合する例示的なリガンドは、限定なしに述べると、薬物、代謝物、中間体、共因子、遷移状態類似体、イオン、金属、核酸、および毒素などの低分子を含む。アプタマーはまた、タンパク質、ペプチド、核酸、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ならびに細胞壁および細胞膜などの細胞表面を含む、天然ポリマーおよび合成ポリマーにも結合しうる。典型的にはＲＮＡであるアプタマーへのリガンドの結合は、情報伝送ドメインとの塩基対合を変更し、これは、リボザイムドメインの構造的変化として持ち越され、ホスホジエステル結合の切断（自己切断または標的配列の切断）を媒介するその能力を変更する。したがって、リガンドの結合は、例えば、遺伝子の不活化、転写、翻訳を媒介するか、または、他の点で、標的遺伝子もしくは標的ｍＲＮＡの正常な活性に干渉する、エフェクタードメインの能力に影響を及ぼす。

【0134】

アプタマーは、最も典型的には、標的分子の結合についてのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択により得られているであろう。しかし、また、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるアプタマーの選択も可能である。アプタマーは、環境内で、意図される標的分子との複合体を形成することが可能な特異的結合領域であって、同じ環境内で、他の物質は、核酸と複合体化しない特異的結合領域を有する。結合の特異性は、アプタマーの、環境内の他の材料または非類縁分子一般に対する解離定数と比較した、アプタマーの、そのリガンドに対する比較解離定数（Ｋ_ｄ）との関係で規定される。リガンドとは、非類縁材料に対する場合より大きなアフィニティーでアプタマーに結合するリガンドである。典型的には、アプタマーの、そのリガンドに関するＫ_ｄは、アプタマーの、非類縁材料または環境内に付属する材料に対するＫ_ｄの、少なくとも約１０分の１であろう。なおより好ましくは、Ｋ_ｄは、少なくとも約５０分の１、より好ましくは、少なくとも約１００分の１であり、最も好ましくは、少なくとも約２００分の１であろう。アプタマーは典型的に、約１０〜約３００ヌクレオチドの間の長さであろう。より一般的に、アプタマーは、約３０〜約１００ヌクレオチドの間の長さであろう。

【0135】

多種多様な分子に結合するアプタマーを、たやすく制作することができる。本明細書で開示される主題の方法を使用して、これらの分子の各々を、関連するリボザイムのモジュレーターとして使用することができる。例えば、有機分子、ヌクレオチド、アミノ酸、ポリペプチド、細胞表面上の標的特徴、イオン、金属、塩、糖は全て、それぞれのリガンドに特異的に結合しうるアプタマーを単離するのに適することが示されている。例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８などの有機色素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるアプタマー選択のための標的リガンドとして使用されて成功している（WerstuckおよびGreen（１９９８年）、Science、２８２巻：２９６〜２９８頁）。また、ドーパミン、テオフィリン、スルホローダミンＢ、およびセルロースなど、他の有機低分子も、アプタマーの単離において、リガンドとして使用されている。また、カナマイシンＡ、リビドマイシン、トブラマイシン、ネオマイシンＢ、ビオマイシン、クロラムフェニコール、およびストレプトマイシンなどの抗生剤に対するアプタマーも単離されている。低分子を認識するアプタマーの総説については、Famulok（１９９９年）、Science、９巻：３２４〜９頁を参照されたい。

【0136】

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される主題のアプタマー調節型リボザイムのアプタマーのリガンドは、細胞透過性の有機低分子である。翻訳に対する一般的な阻害効果を有さない有機低分子が、リガンドとして好ましい。低分子はまた、所望レベルの翻訳の阻害を達成するのに十分な、ｉｎ ｖｉｖｏにおける存続を呈示することも好ましい。また、分子をスクリーニングして、例えば、経口投与の後で、バイオアベイラビリティーを示す分子を同定することもできる。本明細書で開示される主題のある特定の実施形態では、リガンドは、非毒性である。リガンドは任意選択で、例えば、ステロイドを含む薬物でありうる。しかし、遺伝子発現を制御する方法の一部では、リガンドは、薬理学的に不活性であることが好ましい。一部の実施形態では、リガンドは、細胞内のその存在が、疾患または病理学的状態を指し示すポリペプチドである。他の実施形態では、アプタマーのリガンドは、クロラムフェニコールなどの抗生剤である。代替的な実施形態では、アプタマーのリガンドは、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ色素３３２５８などの有機色素である。さらに別の実施形態では、リガンドは、金属イオンでありうる。具体的な実施形態では、アプタマー調節型核酸のアプタマードメインは、カフェインへの結合に応答する。

【0137】

ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（最も典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における、ＳＥＬＥＸとして公知の選択技法（Ellingtonら（１９９０年）、Nature、３４６巻、８１８〜２２頁；およびTuerkら（１９９０年）、Science、２４９巻、５０５〜１０頁）を援用することにより、特定のリガンドに結合するアプタマーを開発することが典型的である。アプタマーを制作する方法はまた、例えば、米国特許第５，５８２，９８１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２００４０号；米国特許第５，２７０，１６３号；LorschおよびSzostak（１９９４年）、Biochemistry、３３巻：９７３頁；Mannironiら（１９９７年）、Biochemistry、３６巻：９７２６頁；Blind（１９９９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９６巻：３６０６〜３６１０頁；HuizengaおよびSzostak（１９９５年）、Biochemistry、３４巻：６５６〜６６５頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４５０６号、同第ＷＯ９９／２７１３３号、同第ＷＯ９７／４２３１７号；ならびに米国特許第５，７５６，２９１号においても記載されている。

【0138】

一般に、それらの最も基本的な形態において、アプタマーを同定するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択技法は、まず、所望の長さのオリゴヌクレオチドの大規模なプールであって、ランダム化または突然変異誘発された少なくとも一部の領域を含有するプールを調製するステップを伴う。例えば、アプタマー選択のための一般的なオリゴヌクレオチドプールは、２０〜１００のランダム化されたヌクレオチドの領域であって、両方の末端が、約１５〜２５ヌクレオチド長の領域であり、ＰＣＲプライマーの結合に有用な、規定された配列の領域で挟まれた領域を含有しうるであろう。選択された核酸配列の、信頼できる、効率的な増幅を可能とする、任意の手段を援用しうるが、オリゴヌクレオチドプールは、標準的なＰＣＲ技法を使用して増幅する。次いで、ＤＮＡプールを、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて転写して、ＲＮＡ転写物を作製する。次いで、別の分子（例えば、タンパク質または任意の標的分子）に特異的に結合するそれらの能力に基づく核酸の選択を可能とする、任意のプロトコールを使用しうるが、ＲＮＡ転写物を、アフィニティークロマトグラフィーにかけることができる。アフィニティークロマトグラフィーの場合、転写物は、カラムに通すか、または標的リガンドを固定化させた磁気ビーズなどと接触させることが最も典型的である。プール内のＲＮＡ分子であって、リガンドに結合したＲＮＡ分子は、カラム上またはビーズ上に保持されるが、結合しなかった配列は、洗い流される。次いで、リガンドに結合するＲＮＡ分子を逆転写させ、ＰＣＲにより再度増幅する（通例、溶出の後で）。次いで、選択されたプール配列を、同じ種類の選択の別のラウンドにかける。プール配列は、選択手順の、のべ約３つ〜１０の反復ラウンドにかけることが典型的である。次いで、標的リガンドのアプタマーとして作用することが可能なＲＮＡ分子の配列を同定する標準的な手順を使用して、ｃＤＮＡを、増幅、クローニング、およびシークェンシングする。アプタマー配列の同定に成功したら、突然変異誘発されたアプタマー配列を含むオリゴヌクレオチドのプールから始まる、選択のさらなるラウンドを実施することにより、アプタマーをさらに最適化することができる。本明細書で開示される主題における使用のために、アプタマーは、正常な生理学的状態を模倣する塩濃度および温度の存在下で、リガンドへの結合について選択することが好ましい。

【0139】

一般に、アプタマーがなおも入手可能であるのかどうかについて言及せずに、適切なリガンドを選択することができる。大半の場合において、当業者は、えり抜きのリガンドに結合するアプタマーを得ることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択工程の固有の性格は、どのような種類の構造が、所望のリガンドに結合しうるのかについての先行の知見が全く不足しているにもかかわらず、所望のリガンドに結合する、適切なアプタマーの単離を可能とする。

【0140】

アプタマーが、本明細書で開示される主題における使用に適するためには、本明細書で開示される主題のアプタマー調節型リボザイムを、「オン」状態と「オフ」状態との間で切り換えるか、またはアプタマー調節型リボザイムの機能レベルをチューニングするように、アプタマーの、リガンドに対する結合アフィニティーは、十分に大きくなければならず、そのリガンドに結合した場合に、アプタマーにより形成される構造も、十分に有意義でなければならない。

【0141】

アプタマーと、会合するリガンドとについての会合定数は、リガンドが機能して、アプタマーに結合し、リガンドを投与したときに得られるリガンドの濃度で、所望の効果を及ぼすような会合定数であることが好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用では、例えば、会合定数は、結合が、血清中または他の組織内で達成されうるリガンドの濃度を十分に下回る濃度で生じるような会合定数であるものとする。好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける使用に要請されるリガンド濃度はまた、生物に対して所望されない効果を及ぼしうる濃度を下回る濃度でもある。

【0142】

したがって、ある特定の実施形態は、１または複数のあらかじめ選択されたリガンドまたは所定のリガンドに対して応答性であるアプタマーまたはアプタマードメインをデザインし、選択する方法を提供する。対象のアプタマー調節型リボザイムはまた、それらの切換え挙動が、リガンドへの結合に対して概ね応答性となるようにも「チューニング」することができる。アプタマー調節型リボザイムはまた、アプタマードメインの結合アフィニティーが、そのリガンドに対して概ね感受性となるようにも「チューニング」することができる。例えば、アプタマー調節型リボザイム内の分子内二重鎖形成、ならびに他の二次構造および三次構造についての熱力学特性は、アプタマードメインが、リガンドへの結合に概ね適するように、すなわち、解離定数（Ｋ_ｄ）または他の反応速度パラメータ（Ｋ_ｏｎ速度およびＫ_ｏｆｆ速度など）に顕示されうる通りに変更することができる。代替的に、ハイブリダイゼーション、ならびにリボザイムドメインの二次構造および三次構造をもたらしうる、他の分子内相互作用が変更されても、リボザイムドメインのアロステリック変化は、リガンドへの結合に対して概ね応答性でありうる。当技術分野では、核酸構造の熱力学特性を変更するためのフォワードエンジニアリング戦略が周知である。例えば、相補的な核酸対合の増大は、リボザイムドメインまたはアプタマードメインの安定性を増大させうる。

【0143】

ＩＩＩ．神経変性疾患を処置するための方法
本明細書で開示される主題はまた、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態を処置するための方法も提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、それを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、ｇＲＮＡが、被験体の細胞内のＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、ＤＮＡ分子が、細胞内で発現する１または複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーターと；ｉｉ）細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む１または複数のベクターを含む非自然発生のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、ｇＲＮＡが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Ｃａｓ９タンパク質が、ＤＮＡ分子を切断して、１または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用意するステップと；（ｂ）被験体に有効量の系を投与するステップとを含む方法を提供する。

【0144】

「神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態」とは、ニューロンまたは網膜光受容体細胞など、他の神経細胞の変性または機能不全と関連する疾患、障害、または状態（ニューロパシーを含む）を意味する。神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態は、ニューロンの機能の低下もしくは機能不全、またはニューロンもしくは他の神経細胞の喪失が生じうる、任意の疾患、障害、または状態でありうる。

【0145】

このような疾患、障害、または状態は、緑内障、ならびに筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋委縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、偽性延髄麻痺、進行性延髄麻痺、脊髄性筋委縮症、遺伝性筋委縮症、椎間板症候群、頚椎症、神経叢障害、胸郭出口症候群、末梢神経障害、ポルフィリン症（prophyria）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス疾患、多系統委縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脱髄疾患、ギラン−バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー−マリー−トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ピック病、てんかん、およびＡＩＤＳ認知症複合など、神経系の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態、またはこれらと関連する神経系の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態を含むがこれらに限定されない。

【0146】

また、アルコール依存症、アレクサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病としてもまた公知である）、カナバン病、コケイン症候群、糖尿病性ニューロパシー、前頭側頭葉変性症、ＨＩＶ関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、神経ボレリア症、マシャド−ジョゼフ病（３型脊髄小脳性運動失調症）、ウェット型黄斑変性またはドライ型黄斑変性、ニーマンピック病、ペリツェウス−メルツバッハー病、色素性網膜炎および関連疾患などの光受容体変性疾患、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、シュピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病（バッテン病としてもまた公知である）、脊髄小脳性運動失調症（多様な特徴を伴う複数の種類）、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー病、ならびに脊髄癆など、神経系の他の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態、またはこれらと関連する神経系の他の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態も含まれる。

【0147】

眼関連神経変性の例は、緑内障、格子状ジストロフィー、色素性網膜炎、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、ウェット型ＡＭＤまたはドライ型ＡＭＤと関連する光受容体変性、色素性網膜炎（ＲＰ）など、他の網膜変性、視神経ドルーゼン、視神経症、および多発性硬化症から生じる視神経炎などの視神経炎を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、眼の神経変性疾患は、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される。一部の実施形態では、眼の神経変性疾患は、色素性網膜炎（ＲＰ）である。

【0148】

本明細書で開示される主題に従い防止または処置されうる、異なる種類の緑内障の非限定的な例は、原発性緑内障（原発性開放隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障、慢性単性緑内障、および単性緑内障としてもまた公知である）、低眼圧緑内障、原発性閉塞隅角緑内障（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｇｌｅ−ｃｌｏｓｕｒｅ ｇｌａｕｃｏｍａ）（原発性閉塞隅角緑内障（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｓｅｄ−ａｎｇｌｅ ｇｌａｕｃｏｍａ）、狭隅角緑内障、瞳孔ブロック緑内障、および急性うっ血緑内障としてもまた公知である）、急性閉塞隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障、間欠性閉塞隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障（chronic open-angle closure glaucoma）、色素性緑内障、落屑緑内障（偽落屑緑内障または水晶体嚢緑内障としてもまた公知である）、発達緑内障（例えば、原発性先天性緑内障および乳児緑内障）、続発性緑内障（例えば、炎症性緑内障（例えば、ブドウ膜炎およびフックス虹彩毛様体炎））、水晶体性緑内障（例えば、成熟白内障を伴う閉塞隅角緑内障、水晶体嚢の破嚢に続発する水晶体過敏性緑内障、水晶体中毒による線維柱帯の目詰まりに起因する水晶体融解緑内障、および水晶体亜脱臼）、眼内出血に続発する緑内障（例えば、前房出血および溶血緑内障（ｅｒｙｔｈｒｏｃｌａｓｔｉｃ ｇｌａｕｃｏｍａ）としてもまた公知の溶血緑内障（ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｇｌａｕｃｏｍａ））、外傷性緑内障（例えば、隅角後退緑内障、前房隅角の外傷性後退、術後緑内障、無水晶体性瞳孔ブロック、および毛様体ブロック緑内障）、血管新生緑内障、薬物誘導性緑内障（例えば、コルチコステロイド誘導性緑内障およびアルファ−キモトリプシン緑内障）、中毒性緑内障、ならびに眼内腫瘍、網膜剥離、重度の眼化学火傷、および虹彩萎縮と関連する緑内障を含む。ある特定の実施形態では、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態は、過剰な血管新生と関連しない疾患、障害、または状態、例えば、血管新生緑内障ではない緑内障である。

【0149】

本明細書で使用される「障害」という用語は一般に、同定される標的または経路のうちの１つに対する化合物による処置から利益を得る任意の状態であって、同定される標的または経路のうちの１つに対する有効量の化合物、または薬学的に許容されるその塩により処置されうる、任意の疾患、障害、または状態を含む状態を指す。

【0150】

本明細書で使用される「〜を処置すること」という用語は、このような用語が適用される疾患、障害、もしくは状態、またはこのような疾患、障害、もしくは状態の、１もしくは複数の症候もしくは症状（例えば、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を引き起こす疾患または障害）を転導するか、緩和するか、その進行を阻害するか、これを防止するか、またはその可能性を低減することを含みうる。一部の実施形態では、処置により、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を低減する。例えば、処置により、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を、処置を受ける前の被験体または処置を受けない被験体における、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超えて低減することができる。一部の実施形態では、処置により、被験体における網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を完全に阻害する。本明細書で使用される「網膜光受容体細胞」とは、網膜内で見出される、特化した種類のニューロンであって、光情報伝達が可能なニューロンである。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子産物は、ロドプシンである。

【0151】

一部の実施形態では、被験体へ投与するステップの前に、系を、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングする。一部の実施形態では、被験体へ投与するステップを、網膜下注射により行う。処置、投与、または治療は、連続的な場合もあり、間欠的な場合もある。連続的処置、連続的投与、または連続的治療とは、少なくとも毎日のベースで、処置中に１日または複数日の中断を伴わない処置を指す。間欠的処置もしくは間欠的投与、または間欠式の処置もしくは投与とは、連続的ではなく、周期的な処置を指す。本明細書で開示される方法に従う処置は、疾患、障害、または状態からの完全な軽快または治癒を結果としてもたらす場合もあり、疾患、疾患、または状態の１または複数の症候の部分的な改善を結果としてもたらす場合もあり、一時的な処置の場合もあり、恒久的な処置の場合もある。「処置」という用語はまた、予防、治療、および治癒を包摂することも意図する。

【0152】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益な結果または所望の結果を果たすのに十分な薬剤量を指す。治療有効量は、当業者がたやすく決定しうる、処置される被験体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などのうちの１または複数に応じて変動しうる。用語はまた、本明細書で記載されるイメージング方法のうちのいずれか１つによる検出のための画像をもたらす用量にも適用される。具体的用量は、選択される特定の薬剤、従う投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与するのかどうか、投与回数、イメージングされる組織、および保有される物理的送達系のうちの１または複数に応じて変動しうる。

【0153】

本明細書では、「被験体」および「患者」という用語を互換的に使用する。それらの多くの実施形態における、本明細書で開示される方法により処置される被験体は、ヒト被験体であることが所望されるが、本明細書で記載される方法は、「被験体」という用語に含まれることが意図される、全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解されたい。したがって、「被験体」は、既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発症を防止するための予防的処置などの医療目的のヒト被験体を含む場合もあり、医療目的、獣医療目的、または開発目的の動物被験体を含む場合もある。適切な動物被験体は、霊長動物、例えば、ヒト、サル、類人猿など；ウシ科動物、例えば、畜牛、役牛など；ヒツジ科動物、例えば、ヒツジなど；ヤギ科動物、例えば、ヤギなど；ブタ科動物、例えば、ブタ、成豚など；ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど；野猫、飼い猫を含むネコ科動物；イヌを含むイヌ科動物；ウサギ、野兎などを含むウサギ目動物；およびマウス、ラットなどを含む齧歯動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物を含む。動物は、トランスジェニック動物でありうる。一部の実施形態では、被験体は、胎児被験体、新生児被験体、乳児被験体、青少年被験体、および成人被験体を含むがこれらに限定されないヒト被験体である。さらに、「被験体」は、状態もしくは疾患に罹患している患者、または状態もしくは疾患に罹患していることが疑われる患者を含みうる。

【0154】

ＩＶ．一般的定義
本明細書では、特殊な用語を援用するが、それらは、総称的意味および記載的意味だけで使用されるものであり、限定を目的とするものではない。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本明細書で記載される主題が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。

【0155】

年来の特許法の慣行に従い、「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１または複数の」を指す。こうして、例えば、「対象」に対する言及は、文脈により反対のことが明らかにされない限りにおいて（例えば、複数の対象）、複数の対象などを含む。

【0156】

本明細書および特許請求の範囲を通して、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「〜を含むこと」という用語は、文脈によりそうでないことが要請される場合を除き、非除外的な意味で使用される。同様に、リスト内の項目の列挙が、他の類似の項目であって、列挙される項目を代替する場合もあり、これらに付加される場合もある、類似の項目の除外とはならないように、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語、およびその文法的変化形も、非限定的であることを意図する。

【0157】

本明細書および添付の特許請求の範囲の目的では、そうでないことが指示されない限りにおいて、量（ａｍｏｕｎｔｓ）、サイズ、寸法、比率、形状、処方、パラメータ、百分率、パラメータ、量（ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）、特徴を表す全ての数、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、「約」という用語が、値、量、または範囲と共に明示的に現れない場合であってもなお、全ての場合に、「約」という用語により修飾されていると理解するものとする。したがって、反対のことが指し示されない限りにおいて、以下の明細書および付随の特許請求の範囲で記される数値パラメータは、正確な数値ではなく、そうでなくてもよく、本明細書で開示される主題により得ようとする所望の特性に応じて、公差、換算係数、丸め誤差、測定誤差など、および当業者に公知の他の因子を反映して、所望の通りに、概数の場合もあり、かつ／またはより大きい場合もあり、より小さい場合もある。例えば、値に言及する場合の「約」という用語は、このような変動は、開示される方法を実施するか、または開示される組成物を援用するのに適切であるので、指定された量からの、一部の実施形態では、±１００％、一部の実施形態では、±５０％、一部の実施形態では、±２０％、一部の実施形態では、±１０％、一部の実施形態では、±５％、一部の実施形態では、±１％、一部の実施形態では、±０．５％、一部の実施形態では、±０．１％の変動を包摂することを意図しうる。

【0158】

さらに、１または複数の数または数値範囲との関連で使用される場合の「約」という用語は、範囲内の全ての数を含む、全てのこのような数を指すと理解すべきであり、記される数値の上限および下限を拡張することにより、その範囲を改変する。端点による数値範囲の列挙は、その範囲内およびその範囲内の任意の範囲に包含される全ての数、例えば、それらの分数を含む全整数を含む（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４、および５のほか、その分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１なども含む）。

【実施例】

【0159】

以下の実施例は、本明細書で開示される主題の代表的な実施形態を実施するための指針を、当業者に提供するために組み入れる。本開示および当技術分野における技術の一般的な水準に照らして、当業者は、以下の実施例が、例示的であることだけを意図するものであり、本明細書で開示される主題の範囲から逸脱しない限りにおいて、数値的な変化、改変、および変更を援用しうることを察知することができる。以下の合成についての記載および具体例は、例示だけを目的とすることを意図するものであり、本開示の化合物が他の方法でも制作されるように、いかなる形でも限定的とはみなさないものとする。

【0160】

（実施例１）
方法
プラスミドの構築：Ｈ１ ｇＲＮＡ発現構築物（下記の表１、２、および３を参照されたい）を作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアセンブルして、７６ｂｐのｇＲＮＡ足場およびｐｏｌ ＩＩＩ終結シグナルと融合させたＨ１プロモーターを創出した。Ｈ１プロモーターとｇＲＮＡ足場との間に、ＢａｍＨＩ部位を組み込んで、ターゲティング配列の挿入を可能とした。次いで、Ｈ１：：ｇＲＮＡ足場：：ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列を、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にＴＯＰＯクローニングし、シークェンシングおよび検証した。結果として得られるベクターは、リバース配向性である（下記を参照されたい）。本研究で使用される多様なｇＲＮＡを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、２ステップ増幅用のＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲにより増幅し、その後、２倍容量の２５％のＰＥＧおよび１．５ＭのＮａＣｌと混合した、Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｅｒａ−Ｍａｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、精製した。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、Ｈ_２Ｏ中に再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物は、Ｕ６発現のための、ＡｆｌＩＩで消化するプラスミド（＃４１８２４、Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、またはＨ１発現のための、直前で記載したＢａｍＨＩによるプラスミドの消化について若干改変した、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）を使用して作出した。総反応容量は、２０μｌから２μｌに低減された。

【0161】

細胞培養物：ｈＥＳＣ細胞系Ｈ７およびＩＭＲ−９０ ｉＰＳ細胞（ＷｉＣｅｌｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、既に記載されたプロトコール（Walkerら（２０１０年）、Nat. Commun.、１巻：７１頁；Maruottiら（２０１３年）、Stem Cells Translational Medicine、２巻：３４１〜３５４頁）に従う、１０％のＣＯ_２／５％のＯ_２によるインキュベーター内、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）中、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上のクローン繁殖により維持した。継代培養のために、ｈＥＳＣコロニーを、まず、ｍＴｅｓＲ１中に５μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共にインキュベートし、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による５〜１０分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離させ、遠心分離によりペレット化した。その後、ｈＰＳＣを、ブレビスタチンを伴うｍＴｅＳＲ１中に再懸濁させ、１ｃｍ^２当たりの細胞およそ１，０００〜１，５００個で播種した。継代の２日後、培地を、ｍＴｅＳＲ１（ブレビスタチンを伴わない）で置きかえ、毎日交換した。

【0162】

ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％のＣＯ_２／２０％のＯ_２を伴う３７℃で維持した。

【0163】

Ｈ７細胞の遺伝子ターゲティング：ｈＥＳＣ細胞を、電気穿孔の２４時間前に、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤（ＤＤＤ０００３３３２５、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、Ｎｅｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当日、ｈＥＳＣを、コロニーがリフトするまで、１〜２分間にわたり、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で１５分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下：電圧：１４００ｍｓ；間隔：３０ミリ秒；１パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ１培地にゆっくりと移し、次いで、室温で２０分間にわたり保ってから、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたディッシュに播種し、さらに培養した。

【0164】

クローンから導出されたコロニーについて解析するために、電気穿孔されたｈＥＳＣを、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞５００個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手作業の採集により単離し、さらに培養した。

【0165】

２９３Ｔ細胞のトランスフェクションのために、ウェル１つ当たりの細胞約１００，０００個を、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）内に播種した。細胞は、製造元の推奨するプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、四連でトランスフェクトした。２４ウェルプレートの各ウェルには、４００ｎｇのＣａｓ９プラスミドおよび２００ｎｇのｇＲＮＡプラスミドを、０．５μｌのＰｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔおよび１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬と混合した。

【0166】

構成的に発現させたＧＦＰ ＥＳＣ細胞系の作出：Ｈ７ヒトＥＳＣ細胞系（ＷｉＣｅｌｌ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ基質上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによる短時間（＞５分間）の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Ａｃｃｕｔａｓｅで７分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のｍＴｅｓＲでクェンチングし、８０×ｇで５分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するｍＴｅｓＲ中に再懸濁させた。細胞１×１０^６個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、１０〜１５分間にわたり、氷上に置いた。ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座に対する相同性を含有する、１０μｇのＡＡＶ−ＣＡＧＧＳＥＧＦＰドナーベクター（＃２２２１２、Ａｄｄｇｅｎｅ）に加えて、Ｒ緩衝液中に５μｇずつのｈＡＡＶＳ１ １Ｒ＋Ｌ ＴＡＬＥＮ（＃３５４３１および３５４３２、Ａｄｄｇｅｎｅ）（Hockemeyerら（２００９年）、Nat. Biotechnol.、２７巻：８５１〜８５７頁；Sanjanaら（２０１２年）、Nature Protocols、７巻：１７１〜１９２頁）を、以下のパラメータ：１５００Ｖ、パルス１つ当たり２０ミリ秒、および１パルスで、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する、１００μｌ型のチップにより電気穿孔した。次いで、細胞を、１ｍｌの培地に静かに添加し、室温で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ｍＴｅＳＲおよび５μＭのブレビスタチンを含有する、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした３５ｍｍのディッシュに播種した。２日後、細胞を、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞１×１０^４個の密度で播種し、その後、時間的に安定なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Ｎｉｋｏｎ ＴＳ１００落射蛍光顕微鏡により、手作業で選択した。

【0167】

ゲノム改変のためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシークェンシング解析：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析のために、細胞を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させ、６５℃で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、９８℃で１０分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出物溶液は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清浄化させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位を取り囲むゲノム領域は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅した。複数の独立のＰＣＲ反応物をプールし、製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを使用して、精製した。１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６２．５ｍＭのＫＣｌ、および１．８７５ｍＭのＭｇＣｌ_２中に、４００ｎｇのＰＣＲ産物を含有する、８μｌの容量を変性させ、ゆっくりと：９５℃で１０分間、１秒当たり−１．０℃の勾配で９５℃から８５℃へ、８５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で８５℃から７５℃へ、７５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で７５℃から６５℃へ、６５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で６５℃から５５℃へ、５５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で５５℃から４５℃へ、４５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で４５℃から３５℃へ、３５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で３５℃から２５℃へ再アニールさせ、次いで、４℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーおよび１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を、各反応物に添加し、４２℃で６０分間にわたりインキュベートし、その後、１μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、反応物に添加した。ＤＮＡ １０００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、１μｌの反応物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で定量化した。ゲル解析のために、６倍濃度のローディング緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２μｌを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する３％のアガロースゲルにロードした。ゲルは、Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上で視覚化し、ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度は、二項式から導出される方程式：

【数1】

［式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等しく、「ｃ」は、バックグラウンド控除後における非切断ＰＣＲ産物の積分面積に等しい（Guschinら（２０１０年）、Methods in Molecular Biology、６４９巻：２４７〜２５６頁）］
を使用して計算した。

【0168】

フローサイトメトリー：ブレビスタチン処理に続き、サブコンフルエントのｈＥＳＣコロニーを、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理により採取し、単一細胞懸濁液に解離させ、ペレット化させた。次いで、細胞を、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ ｒｕｂｙ ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＬｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させ、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析した。

【0169】

定量的リアルタイムｑＰＣＲ：２９３Ｔ細胞は、トランスフェクションの２４時間前に、１２ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中にウェル１つ当たりの細胞２５０，０００個で播種した。細胞は、ｇＲＮＡプラスミドの６用量滴定：各ウェル内に０ｎｇ、３１．２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、１２５ｎｇ、２５０ｎｇ、または５００ｎｇを伴う、製造元の推奨するプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、三連でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、総ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏｌ ＲＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を使用して単離し、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ（Ｚｙｍｏ）を使用して精製した。５００ｎｇの総ＲＮＡを、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｔｉｃＺｙｍｅｓ；Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ ＵＳＡ）で処理して、残留ゲノムＤＮＡ夾雑物を除去し、製造元の推奨に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２０μｌの反応物中で逆転写した。各反応では、０．１μＭの以下のオリゴヌクレオチド；ｇＲＮＡ足場−

【化1】

を使用して、各反応物をプライミングした。下線を付した足場配列は、転写物の安定性のために付加されるアンカー配列を表す。各ｑＰＣＲ反応は、１０μｌの容量中で、２５０ｎＭのオリゴヌクレオチドプライマーを含有するＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）と、上記による１：１５の希釈率のＲＴ反応産物１マイクロリットルとを使用する、Ｂｉｏｒａｄ ＣＦＸ ９６リアルタイムＰＣＲマシンにより実行した。反応は、９５℃の変性ステップ、５４℃のアニーリングステップ、および６０℃の伸長ステップを伴う、４０サイクルにわたり実行した。以下のプライマー：Ｆ１ｆｏｒ−ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡ（配列番号３）およびｇｕｉｄｅＲＮＡｓｃａｆｆｒｅｖ−ＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣ（配列番号４）およびＵ６ｓｎＲＮＡＦ−ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＡＣＴ（配列番号５）およびＵ６ｓｎＲＮＡＲｅｖ−ＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣ（配列番号６）を、ガイドＲＮＡおよび参照遺伝子のそれぞれを検出するために使用した。各ガイドＲＮＡ試料についての相対標準化発現およびｓ．ｅ．ｍは、Ｂｉｏｒａｄ社製統合型ＣＦＸマネージャーソフトウェアを使用して計算した。

【0170】

バイオインフォマティクス：ヒトゲノム内の全ての潜在的なＣＲＩＳＰＲ部位を決定するために、特注のＰｅｒｌスクリプトを使用して、２３マーのＣＲＩＳＰＲ配列部位である、ＧＮ_１９ＮＧＧまたはＡＮ_１９ＮＧＧの両方の鎖および重複の発生を検索した。距離値の平均値および中央値を計算するために、予測されるＣＲＩＳＰＲによる切出し部位をまず、ＰＡＭ配列の上流の第３の塩基と第４の塩基との間で生じると規定した。配列を分取した後で、次いで、ゲノム内で隣接する、全てのｇＲＮＡの間の距離を計算した。このデータを、Ｒにインポートして、平均値および中央値の統計学的値を計算し、データをプロットした。平均値密度を計算するために、ｇＲＮＡによる切出し部位を、ゲノムにわたりビニングし、発生頻度について計算した。ｇｇｐｌｏｔ２パッケージまたはＣｉｒｃｏｓを使用して、このデータを、Ｒによりプロットし、環状プロットを生成した（Krzywinskiら（２００９年）、Genome Research、１９巻：１６３９〜１６４５頁）。ヒト遺伝子内または疾患遺伝子座における発生を計算するために、ＢＥＤＴｏｏｌｓのユーティリティーであるＩｎｔｅｒｓｅｃｔＢＥＤ（QuinlanおよびHall（２０１０年）、Bioinformatics、２６巻：８４１〜８４２頁）を使用して、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒから読み出されたＲｅｆＳｅｑ ＢＥＤファイルまたはＯＭＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ、ＯＭＩＭ、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、２０１３年）から読み出されたＢＥＤファイルとの重複の発生を見出した。本研究で使用されたゲノムは、ヒト（ｈｇ１９）、マウス（ｍｍ１０）、ラット（ｒｎ５）、ウシ（ｂｏｓＴａｕ７）、ニワトリ（ｇａｌＧａｌ４）、ゼブラフィッシュ（ｄｒ７）、ショウジョウバエ（ｄｍ３）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（ｃｅ１０）、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ｓａｃＣｅｒ３）であった。

【0171】

【表1】

【0172】

【表2】

【0173】

【表3】

【0174】

結果
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングの現時点での限界を拡張するために、Ｕ６ ｐｏｌ ＩＩＩではなく、Ｈ１ ｐｏｌ ＩＩＩを、代替的なプロモーターとして使用しうるのかどうかについて調べた（Baerら（１９９０年）、Nucleic Acids Res.、１８巻：９７〜１０３頁）。Ｈ１は、プリン（ヌクレオチドＲ）のいずれかを＋１位置に配置した転写物を発現させうるため、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９を伴い、ＡＮ_１９ＮＧＧおよびＧＮ_１９ＮＧＧ部位の両方における切断を可能とすることにより、ＣＲＩＳＰＲターゲティング空間を拡大しうることが仮定された（図１Ａ）。Ｈ１から発現させるｇＲＮＡによる部位特異的切断を実証するため、Ｈ７ヒト胚性幹細胞系（ｈＥＳＣ；図１Ｂ）内のＡＡＶＳ−１遺伝子座において統合されたＧＦＰ標的遺伝子の、ＣＲＩＳＰＲ媒介型切断を測定するレポーターアッセイを開発した（Hockemeyerら（２００９年）、Nat. Biotechnol.、２７巻：８５１〜８５７頁）。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の頻度に代わる代理指標として、コード配列の妨害に起因するＧＦＰ蛍光の喪失を測定した（ＧＦＰ蛍光を妨害しないインフレームの突然変異またはインデルは、検出されないので、アッセイが、ＮＨＥＪを過小評価することは注目に値する）（図１Ｂおよび図１Ｃ）。Ｈ７細胞を、等モル比のＣａｓ９発現プラスミドおよびｇＲＮＡ発現プラスミドで電気穿孔し、コロニー形成の後で、細胞を、ＧＦＰ蛍光について視覚化した。陰性対照の電気穿孔とは対照的に、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターからの、全ての被験ｇＲＮＡ構築物は、ターゲティングされた突然変異を経た細胞内のＧＦＰシグナルのモザイク喪失を示した（図１Ｃおよび不図示のデータ）。核染色による総細胞数の定量化は、フローサイトメトリーによる、ＧＦＰ蛍光についての、細胞ベースの解析を可能とした。ＧＦＰ蛍光の喪失により実証される通り、１００％の構築物が、ＮＨＥＪを結果としてもたらしたが、効率の範囲は、Ｕ６構築物およびＨ１構築物の両方で異なった（図１Ｃ、右および不図示のデータ）。Ｕ６プロモーターまたはＨ１プロモーターからｇＲＮＡを発現させることにより、これは、ＧＦＰ遺伝子の突然変異誘発が、ＧＮ_１９ＮＧＧまたはＡＮ_１９ＮＧＧ部位のそれぞれにおいて生じうることを実証する。

【0175】

これらの結果を確認し、別の細胞系によりこれを拡大するために、同じ遺伝子座においてＧＦＰを発現させるＨＥＫ−２９３細胞系を、上記と同じｇＲＮＡ構築物でターゲティングした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析（Qiuら（２００４年）、BioTechniques、３６巻：７０２〜７０７頁）により、プロモーターの種類およびターゲティングの場所により変動する、編集効率の範囲を検出した（図１Ｄおよび図２）。非改変ＩＭＲ９０．４人工多能性細胞（ｈｉＰＳＣ）を使用することにより、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子のイントロン領域内のＡＡＶＳ−１遺伝子座をターゲティングすることにより、内因性遺伝子を改変する能力もまた確認した。Ｈ１およびＵ６に駆動されるｇＲＮＡによるターゲティングされた切断が、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより測定された効率と同等の効率で観察された（図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃ）。

【0176】

ターゲティング空間の潜在的増大を決定するために、バイオインフォマティクス解析を実施して、ヒトゲノム内で利用可能なＣＲＩＳＰＲ部位を評価した。ＡＮ_１９ＮＧＧ部位は、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位とほぼ同じ頻度で生じると予測されうるが、実際には、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位は、１５％多いことが見出され（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆ）、こうして、特異性を、ＧＮ_１９ＮＧＧから、ＲＮ_１９ＮＧＧに変化させることにより、利用可能な部位の数が、倍加を超えて増大する（およそ１１５％の増大）。少数の例外（ｃｈｒ１６、ｃｈｒ１７、ｃｈｒ１９、ｃｈｒ２０、およびｃｈｒ２２）を除き、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位は、各染色体において、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位より高頻度で存在する。ゲノムワイドの平均ターゲティング密度を比較するために、ゲノム内で隣接するＣＲＩＳＰＲ部位の間の平均値距離を、ＧＮ_１９ＮＧＧ（５９ｂｐ）、ＡＮ_１９ＮＧＧ（４７ｂｐ）、およびＲＮ_１９ＮＧＧ部位（２６ｂｐ）（図４Ｂ）について計算した。加えて、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位は、ヒトゲノム内の関与性のターゲティング領域において、なおさらにエンリッチされた。ヒト遺伝子内のＡＮ_１９ＮＧＧ部位の２０％の増大、およびＯＭＩＭデータベースから得られる疾患遺伝子座におけるＡＮ_１９ＮＧＧ部位の２１％の増大が見出された（図４Ｃ）。また、ヒトゲノムに由来する１１６５のｍｉＲＮＡ遺伝子も検討したところ、これらの遺伝子のうちの２２１は、１または複数のＡＮ_１９ＮＧＧ部位を介してターゲティングしうるが、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位を介してはターゲティングしえないことが見出された（データは示さない）。相同組換えの効率が、切出し部位からの距離の増大と負に相関することを踏まえると、Ｈ１プロモーターの使用によるＣＲＩＳＰＲターゲティング部位の増大は、より正確なゲノムのターゲティングおよび突然変異の補正を容易とする（Ranら（２０１３年）、Cell、６巻：１３８０〜１３８９頁）。

【0177】

ＣＲＩＳＰＲ技術が、広範なモデル生物にわたるゲノムの操作のために、ますます活用されつつあるので、他のゲノムにおけるＨ１プロモーターの使用の潜在的影響を決定した。この解析は、Ｈ１プロモーターにおけるゲノム保存が高度である、他の５つの脊椎動物（マウス；ラット；ニワトリ；ウシ；およびゼブラフィッシュ）ゲノムにおいて実行した。全ての場合において、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位と比較して多数のＡＮ_１９ＮＧＧ部位：＋９％のウシ；＋１４％のニワトリ；＋１９％のラット；＋２１％のマウス；および＋３２％のゼブラフィッシュが見出された（図４Ｃ）。この夥多に対する１つの説明は、高ＡＴ含量に起因しうるであろう（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、および図６Ｆ）。ヒトゲノムでは、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位およびＡＮ_１９ＮＧＧ部位の発生を、ＡＴ含量に照らして標準化すると、頻度は同等に近づくが、これは、全てのゲノムには当てはまらない（図６Ａおよび図６Ｆ）。しかしながら、これは、ヒトゲノムにおいて現在利用可能なＣＲＩＳＰＲターゲティング空間を、倍加を超えて増大させ、他の全ての被験ゲノムにおいてもこれを同様に増大させる、Ｈ１プロモーターを使用することの有用性を実証する。

【0178】

次に、Ｈ１プロモーター構築物による、内因性遺伝子内のＡＮ_１９ＮＧＧ部位をターゲティングする能力を実証した。Ｈ７細胞を使用して、網膜色素上皮内およびマクロファージ内の食作用と関与し、突然変異すると、網膜変性を引き起こす遺伝子である、ＭＥＲＴＫ遺伝子座の第２のエクソンをターゲティングした（D'Cruzら（２０００年）、Human Molecular Genetics、９巻：６４５〜６５１頁）（図７Ａおよび図７Ｂ）。全体的なターゲティング効率を推定するために、ＤＮＡを、電気穿孔された細胞集団から採取し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実施した。標的部位を取り囲む領域を、２つの独立のＰＣＲ反応で増幅し、９．５％および９．７％のインデル頻度を計算した（図７Ｂ）。次に、４２のランダムに選択されたクローンを単離し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析により、突然変異について調べた（データは示さない）。シークェンシングにより、４２例中７例（１６．７％）が、標的ＰＡＭ部位の上流３〜４ヌクレオチド以内においてクラスターをなす突然変異を持することが明らかにされた。クローン７例中６例が、固有の突然変異を有し（クローン１例は、冗長であった）、これらのうちの３例は、予測されるＭＥＲＴＫヌル対立遺伝子を結果としてもたらす、二対立遺伝子性のフレームシフト突然変異であり、これは、ウェスタンブロット解析により確認された（図７Ｃおよび図７Ｄ）。まとめると、これらの結果は、内因性遺伝子座に配置されたＡＮ_１９ＮＧＧ部位を、有効にターゲティングする能力を実証する。

【0179】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系によるオフターゲット突然変異の発生は、ますます大きな懸念となりつつあるので、上記で記載したＧＦＰ ｇＲＮＡ構築物をモデル系として使用して、Ｈ１プロモーターの使用が、オフターゲティングにいかなる影響を及ぼすのかについて検討した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析を使用して、バイオインフォマティクスにより、オフターゲット部位であることが予測される、３つのゲノム遺伝子座（ＧＦＰ＿１１〜３３、ＧＦＰ＿２１９〜１９７、およびＧＦＰ＿３１５〜２９３）について検討した。これらの構築物のうちの２つ（ＧＦＰ＿２１９〜１９７、およびＧＦＰ＿３１５〜２９３）は、両方のプロモーターによる発現を可能とする、ＧＮ_１９ＮＧＧ標的部位であった。ＡＮ_１９ＮＧＧ部位である１つ（ＧＦＰ＿１１〜３３）は、５’−Ｇヌクレオチドを付加することにより、Ｕ６プロモーターから発現させた。検討される３つのオフターゲット遺伝子座のいずれにおいても、オフターゲット切断は検出できなかった（データは示さない）。しかし、検出可能なオフターゲットの欠如は、部位の選択が、他のゲノムの遺伝子座に対する相同性の低さに基づきなされる、ＧＦＰ ｇＲＮＡ標的の初期選択からも生じうるであろう。こうして、より厳密な課題は、高レベルのオフターゲットヒットを誘発することが具体的に公知であるターゲティング部位（Fuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：８２２〜８２６頁；Pattanayakら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３９〜４３頁；Choら（２０１４年）、Genome Research、２４巻：１３２〜１４１頁）において、Ｈ１プロモーターからのｇＲＮＡの発現と、Ｕ６プロモーターからのｇＲＮＡの発現とを比較することであろうと推論した。さらに、Ｈ１プロモーターの５’ヌクレオチドの柔軟性により、ＧＮ_１９ＮＧＧ部位をターゲティングする、同一なｇＲＮＡについての、Ｕ６プロモーターとＨ１プロモーターとの間の直接的な比較も可能となった。Fuら（２０１３年）により既に報告されている２つの部位：ＶＥＧＦＡ部位１（Ｔ１）およびＶＥＧＦＡ部位３（Ｔ３）について調べた（表４、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄ）（Fuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：８２２〜８２６頁；Choら（２０１４年）、Genome Research、２４巻：１３２〜１４１頁）。ｇＲＮＡ濃度およびＣａｓ９濃度の増大は、オフターゲットヒットの増大を結果としてもたらすことが示されている（Fuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：８２２〜８２６頁；Pattanayakら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３９〜４３頁；Hsuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８２７〜３２頁）ため、Ｈ１プロモーターからのｇＲＮＡの発現レベルを低下させる（Bodenら（２００３年）、Nucleic Acids Res.、３１巻：５０３３〜５０３８頁；Anら（２００６年）、Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy、１４巻：４９４〜５０４頁；Makinenら（２００６年）、The Journal of Gene Medicine、８巻：４３３〜４４頁）ことにより、オフターゲット効果もまた低減しうると推論した。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、Ｈ１プロモーターからのＶＥＧＦＡ Ｔ１ ｇＲＮＡおよびＵ６プロモーターからのＶＥＧＦＡ Ｔ１ ｇＲＮＡの相対レベルについて調べることから、Ｈ１プロモーターからの発現レベルの、予測される低減が確認された（図８Ａ）。ＶＥＧＦＡ Ｔ１部位については、オンターゲット遺伝子座のほか、４つのオフターゲット遺伝子座における切出しの効率も調べた。Ｕ６プロモーターと比較して、オンターゲット遺伝子座における切出しは、同等であるか、またはわずかに低減されたが、Ｈ１プロモーターから発現するｇＲＮＡが、検討したオフターゲット遺伝子座において、より厳密であり、より大きな特異性を指し示したことは注目に値する（オフターゲット１：２５％と対比した８％；オフターゲット２：２０％と対比した検出不能；およびオフターゲット４：２６％と対比した９％）（表４、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄ）。ＶＥＧＦＡ Ｔ３部位では、２つのプロモーター構築物の間の同等なターゲティング（２６％）が検出されたが、ここでもまた、Ｈ１プロモーターについては、オフターゲット切出しレベルの低下が観察された（表４、図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄ）。Ｈ１プロモーターから発現するｇＲＮＡおよびＵ６プロモーターから発現するｇＲＮＡについてのさらなる研究を実施する必要があるが、データは、Ｈ１から発現させるｇＲＮＡによる特異性が、おそらくはより大きいことを示唆する。

【0180】

Ｈ１プロモーター手法の使用による、さらなるオフターゲティング関連の利点は、近年記載されている有望な手法であって、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９突然変異体による協同作用的オフセットニッキングを援用して、潜在的オフターゲット効果を軽減する手法（Ranら（２０１３年）、Cell、６巻：１３８０〜１３８９頁；Maliら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３３〜８頁）に関する。この手法は、逆行鎖上に配向し、切出し部位からおよそ２０ｂｐ以内にある、２つのフランキングＣＲＩＳＰＲ部位の同定を要請するので、厳密なターゲティングを必要とする（Ranら（２０１３年）、Cell、１５４巻（６号）：１３８０〜９頁）。Ｈ１プロモーターの使用により、ターゲティング密度が増加すれば、適切なフランキング部位の同定の一助となることが予測されるであろう。

【0181】

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ターゲティングについての証拠の蓄積は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡによる認識は、２０塩基対のターゲティング部位の全体にわたり広がることを指し示す。第１に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｇＲＮＡの特異性について、＞１０^１２の顕著に異なる変異体を調べる中で、１つの研究は、＋１ヌクレオチドが、標的の認識において役割を果たすことを見出した。さらに、このデータによる位置特異性の計算は、５’ヌクレオチドが、標的の認識において、その３’側の隣接ヌクレオチドより大きな役割を寄与することを示すことから、ＣＲＩＳＰＲ特異性についての「シード」モデルは、ＰＡＭ近接ヌクレオチドの寄与を単純化し過ぎるきらいがあることが指し示される（Pattanayakら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３９〜４３２８頁）。第２に、ＣＲＩＳＰＲ系の目的を転写の抑制に転じる、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）などの代替的な使用により、ｇＲＮＡにおける５’側の短縮は、抑制を大幅に損ない、また、ミスマッチしたヌクレオチド（Ｕ６発現のためのＧ塩基のミスマッチなど）による５’側の伸長も、抑制効率を低減することが見出されたことから、長さ（２０ｎｔ）および５’ヌクレオチドのコンテキストの両方が、適正なＣａｓ９ターゲティングに重要であることが示唆される（Ranら（２０１３年）、Cell、１５４巻（６号）：１３８０〜９頁；Maliら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３３〜８頁；Larsonら（２０１３年）、Nature Protocols、８巻：２１８０〜２１９６頁；Qiら（２０１３年）、Cell、１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Shanら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：６８６〜６８８頁）。最後に、ｇＲＮＡの５’ヌクレオチドと、標的ＤＮＡの３’末端との有意義な接触がなされるので、結晶構造データもさらに、実験データおよびＣａｓ９内の５’ヌクレオチドの重要性を裏付ける（Jinekら（２０１４年）、Science、３４３巻：６１７６頁；Nishimasuら（２０１４年）、Cell、１５６巻：９３５〜９４９頁）。

【0182】

ターゲティング空間を増大させるためには、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓおよびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓにおける通り、代替的なＣａｓ９タンパク質の使用も有効であることが示されている（Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁；Esveltら（２０１３年）、Nature Methods、１０巻（１１号）：１１１６〜２１頁）。しかし、これらの代替的なタンパク質の潜在的可能性にもかかわらず、報告されている、他のＩＩ型系のＰＡＭによる制限は、厳密な要件を有する（データは示さない；Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）。これに対し、Ｈ１プロモーターの使用によるｇＲＮＡの発現の改変は、ＰＡＭの差違にかかわらず、任意のＣａｓ９タンパク質によるターゲティングレパートリーを大幅に拡大することが予測されるであろう。オーソログのＣａｓ９タンパク質について、それぞれのｇＲＮＡ標的（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓについてのＧＮ_２３ＮＮＮＮＧＡＴＴと対比したＡＮ_２３ＮＮＮＮＧＡＴＴ、およびＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓについてのＮ_１７ＮＮＡＧＡＡＷと対比したＡＮ_１７ＮＮＡＧＡＡＷ）を定量化したところ、５’−Ａヌクレオチドを伴うｇＲＮＡ部位において、６４％および６９％の増大が見出されたことから、代替的なＣａｓ９タンパク質を伴うＨ１プロモーターの使用を介する、ターゲティング空間の、なおより大幅な拡大が指し示される（表５）。植物において示唆される通り、異なるプロモーターの使用は、ＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を拡大しうる。Ｕ６プロモーターが、５’グアノシンヌクレオチドに制限されているのに対し、コメに由来するＵ３プロモーターは、５’アデノシンヌクレオチドに制約されていることから、異なる系において、ターゲティング空間を増大させるのに、異なるプロモーターに対する必要がさらに強調される（Shanら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：６８６〜６８８頁）。単一のプロモーター系を介して、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位およびＧＮ_１９ＮＧＧ部位（および、おそらく、ＣＮ_１９ＮＧＧ部位またはＴＮ_１９ＮＧＧ部位（Tuschl（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：４４６〜４４８頁））をターゲティングするのに、Ｈ１プロモーターの使用だけを利用しうることは簡便である（図９Ａおよび図９Ｂ）。ひいては、これを援用して、現行のＣａｓ９変異体および部位の制限を変更した将来のＣａｓ９変異体のいずれのターゲティング空間も拡大することができる。

【0183】

慎重な部位選択、Ｃａｓ９変異体の改善、ｇＲＮＡアーキテクチャーの最適化、またはさらなる共因子を介して、ＣＲＩＳＰＲターゲティングを増強する結果として、ターゲティング配列を通した特異性の増大がもたらされ、５’ヌクレオチドの同一性が重要となる可能性が高い。これは、調査用ツールとしては、交絡突然変異を最小化しながら、より大規模なゲノムの取扱いを可能とし、将来の臨床的適用のためには、高忠実度の標的認識とカップリングさせた高ターゲティング密度が、安全で有効な治療剤を送達するのに最重要となろう。

【0184】

【表4】

【0185】

【表5】

【0186】

考察
ＣＲＩＳＰＲターゲティング空間の増大およびオフターゲット効果の潜在的可能性の低減は、ゲノムの操作について、広範な含意を有する。ターゲティング空間を増大させるためには、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＮＮＡＧＡＡＷ）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）における通り、代替的なＣａｓ９タンパク質の使用も有効であることが示されているが、これまでに報告されている、他のＩＩ型系のＰＡＭによる制限は、厳密な要件を有し、したがって、単独で使用される場合、ターゲティングに利用可能な配列空間を低減する（データは示さないが、Congら（２０１３年）、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）。これに対し、Ｈ１プロモーターの使用によるｇＲＮＡの発現の改変は、任意のＣａｓ９タンパク質によるターゲティングレパートリーを大幅に拡大することが予測されるであろう。植物では、Ｕ６プロモーターが、５’グアノシンヌクレオチドに制限されているのに対し、コメに由来するＵ３プロモーターは、５’アデノシンヌクレオチドに制約されている。近年示唆されている通り、両方のプロモーターの使用は、植物ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ部位の頻度を拡大しうるであろう（Shanら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻：６８６〜６８８頁）。単一のプロモーター系を介して、脊椎動物ゲノム内のＡＮ_１９ＮＧＧ部位およびＧＮ_１９ＮＧＧ部位をターゲティングするのに、Ｈ１プロモーターの使用だけを利用しうることは簡便である。ひいては、これを援用して、現行のＣａｓ９変異体および部位の制限を変更した将来のＣａｓ９変異体のいずれのターゲティング空間も拡大することができる。

【0187】

ＺＦＮ技術またはＴＡＬＥＮ技術についてと同様に、潜在的オフターゲット効果を軽減する１つの手法は、Ｃａｓ９突然変異体（Ｄ１０Ａ）による協同作用的オフセットニッキングを援用することでありうるであろう（Maliら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３３〜８頁；Ranら（２０１３年）、Cell、１５４巻（６号）：１３８０〜９頁）。これは、逆行鎖上の２つのフランキングＣＲＩＳＰＲ部位の同定を要請し、ＡＮ_１９ＮＧＧ部位によりもたらされるターゲティング密度の増加は、この手法を強化することが予測されるであろう。Ｕ６プロモーターを凌駕するさらなる利益はまた、誤切断を低減することでもありうる（いくつかのグループが、ｇＲＮＡ濃度およびＣａｓ９濃度の増大は、オフターゲット突然変異への傾向の増大と相関することを報告している（Pattanayakら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３９〜４３頁；Hsuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８２７〜３２頁；Fuら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８２２〜６頁）通り、Ｈ１プロモーターによりもたらされる発現レベルの低下は、オフターゲット切出しの低減を結果としてもたらしうる）。加えて、Ｐａｔｔａｎａｙａｋらは、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡによる認識は、２０塩基対のターゲティング部位の全体にわたり広がることも報告した（Pattanayakら（２０１３年）、Nat. Biotechnol.、３１巻（９号）：８３９〜４３頁）。ｇＲＮＡの特異性について、＞１０^１２の顕著に異なる変異体を調べる中で、筆者らは、＋１ヌクレオチドが、標的の認識に寄与することを見出したが、これにより、ＣＲＩＳＰＲ特異性についての「シード」モデル（ＰＡＭ近接ヌクレオチド）は、単純化され過ぎるきらいがあることが指し示される。慎重な部位選択、Ｃａｓ９変異体の改善、ｇＲＮＡアーキテクチャーの最適化、またはさらなる共因子を介して、ＣＲＩＳＰＲターゲティングを増強する結果として、２３ｂｐのターゲティング配列を通した特異性の増大がもたらされ、５’ヌクレオチドの同一性が重要となる可能性が高い。これは、調査用ツールとしては、交絡突然変異を最小化しながら、より大規模なゲノムの取扱いを可能とし、将来の臨床的適用のためには、高忠実度の標的認識とカップリングさせた高ターゲティング密度が、安全で有効な治療剤を送達するのに最重要となろう。

【0188】

（実施例２）
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、および図１０Ｅは、Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのＨ１プロモーターの使用を示す。双方向性Ｈ１プロモーターは、左へのｐｏｌ ＩＩ転写物としてのＣａｓ９（マイナス鎖）、および右へのｐｏｌ ＩＩＩ転写物としてのガイドＲＮＡ（プラス鎖）を発現させることが示されている。発現カセットの全体は、およそ４．４ｋｂである（図１０Ａ）。双方向性Ｈ１構築物からのＣＲＩＳＰＲ媒介型切断を方向付ける能力について調べるために、ｅＧＦＰをターゲティングするｇＲＮＡを使用する双方向性構築物を、プラスミド中にクローニングし、ＧＦＰを発現させるヒト幹細胞内で発現させた（図１０Ｂ）。ＧＦＰの喪失が目視により検出された（図１０Ｃ；中パネル、矢じり形）ことから、発現構築物による発現およびＧＦＰのターゲティングの成功が指し示される。ＣＲＩＳＰＲターゲティングの成功はまた、レーン２および３における２つのバンドの存在を伴うＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを介しても示された（図１０Ｄ）。約４．７５ｂのコンパクトターゲティングカセットを作出するのにＨ１プロモーターを使用する双方向性ＣＲＩＳＰＲ構築物は、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある（図１０Ｅ）。ＳＶ４０ターミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列で挟まれている。

【0189】

方法
プラスミドの構築：Ｈ１双方向性構築物を作出するために、ヒトコドンが最適化されたＣａｓ９遺伝子と、ＳＶ４０ターミネーターとを、ｐｏｌ ＩＩ転写物が内因性で見出される（マイナス鎖）、２３０ｂｐのＨ１プロモーター（配列番号５４）と融合させた。Ｈ１プロモーターとｇＲＮＡ足場との間に、ＡｖｒＩＩ部位を操作して、ターゲティング配列の挿入を可能とした。次いで、ＳＶ４０［ｒｅｖ］：：ｈｃａｓ９［ｒｅｖ］：：Ｈ１：：ｇＲＮＡ足場：：ｐｏｌ ＩＩＩターミネーター配列を、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩによる消化物である、ｐＵＣ１９ベクター中にクローニングした。本研究で使用される多様なｇＲＮＡを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、２ステップ増幅用のＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲにより増幅し、その後、２倍容量の２５％のＰＥＧおよび１．５ＭのＮａＣｌと混合した、Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｅｒａ−Ｍａｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、精製した。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、Ｈ_２Ｏ中に再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物は、若干改変した、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）を使用して作出した。総反応容量は、２０μｌから２μｌに低減された。

【0190】

細胞培養物：ｈＥＳＣ細胞系Ｈ７およびＩＭＲ−９０ ｉＰＳ細胞（ＷｉＣｅｌｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、既に記載されたプロトコール（Walkerら（２０１０年）、Nat. Commun.、１巻：７１頁；Maruottiら（２０１３年）、Stem Cells Translational Medicine、２巻：３４１〜３５４頁）に従う、１０％のＣＯ_２／５％のＯ_２によるインキュベーター内、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）中、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上のクローン繁殖により維持した。継代培養のために、ｈＥＳＣコロニーを、まず、ｍＴｅｓＲ１中に５μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共にインキュベートし、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による５〜１０分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離させ、遠心分離によりペレット化した。その後、ｈＰＳＣを、ブレビスタチンを伴うｍＴｅＳＲ１中に再懸濁させ、１ｃｍ^２当たりの細胞およそ１，０００〜１，５００個で播種した。継代の２日後、培地を、ｍＴｅＳＲ１（ブレビスタチンを伴わない）で置きかえ、毎日交換した。

【0191】

ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％のＣＯ_２／２０％のＯ_２を伴う３７℃で維持した。

【0192】

Ｈ７細胞の遺伝子ターゲティング：ｈＥＳＣ細胞を、電気穿孔の２４時間前に、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤（ＤＤＤ０００３３３２５、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、Ｎｅｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当日、ｈＥＳＣを、コロニーがリフトするまで、１〜２分間にわたり、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で１５分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下：電圧：１４００ｍＳ；間隔：３０ミリ秒；１パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ１培地にゆっくりと移し、次いで、室温で２０分間にわたり保ってから、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたディッシュに播種し、さらに培養した。

【0193】

クローンから導出されたコロニーについて解析するために、電気穿孔されたｈＥＳＣを、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞５００個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手作業の採集により単離し、さらに培養した。

【0194】

構成的に発現させたＧＦＰ ＥＳＣ細胞系の作出：Ｈ７ヒトＥＳＣ細胞系（ＷｉＣｅｌｌ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ基質上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによる短時間（＞５分間）の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Ａｃｃｕｔａｓｅで７分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のｍＴｅｓＲでクェンチングし、８０×ｇで５分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するｍＴｅｓＲ中に再懸濁させた。細胞１×１０^６個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、１０〜１５分間にわたり、氷上に置いた。ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座に対する相同性を含有する、１０μｇのＡＡＶ−ＣＡＧＧＳＥＧＦＰドナーベクター（＃２２２１２、Ａｄｄｇｅｎｅ）に加えて、Ｒ緩衝液中に５μｇずつのｈＡＡＶＳ１ １Ｒ＋Ｌ ＴＡＬＥＮ（＃３５４３１および３５４３２、Ａｄｄｇｅｎｅ）（Hockemeyerら（２００９年）、Nat. Biotechnol.、２７巻：８５１〜８５７頁；Sanjanaら（２０１２年）、Nature Protocols、７巻：１７１〜１９２頁）を、以下のパラメータ：１５００Ｖ、パルス１つ当たり２０ミリ秒、および１パルスで、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する、１００μｌ型のチップにより電気穿孔した。次いで、細胞を、１ｍｌの培地に静かに添加し、室温で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ｍＴｅＳＲおよび５μＭのブレビスタチンを含有する、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした３５ｍｍのディッシュに播種した。２日後、細胞を、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞１×１０^４個の密度で播種し、その後、時間的に安定なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Ｎｉｋｏｎ ＴＳ１００落射蛍光顕微鏡により、手作業で選択した。

【0195】

ゲノム改変のためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシークェンシング解析：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析のために、細胞を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させ、６５℃で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、９８℃で１０分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出物溶液は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清浄化させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位を取り囲むゲノム領域は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅した。複数の独立のＰＣＲ反応物をプールし、製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを使用して、精製した。１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６２．５ｍＭのＫＣｌ、および１．８７５ｍＭのＭｇＣｌ_２中に、４００ｎｇのＰＣＲ産物を含有する、８μｌの容量を変性させ、ゆっくりと：９５℃で１０分間、１秒当たり−１．０℃の勾配で９５℃から８５℃へ、８５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で８５℃から７５℃へ、７５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で７５℃から６５℃へ、６５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で６５℃から５５℃へ、５５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で５５℃から４５℃へ、４５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で４５℃から３５℃へ、３５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で３５℃から２５℃へ再アニールさせ、次いで、４℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーおよび１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を、各反応物に添加し、４２℃で６０分間にわたりインキュベートし、その後、１μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、反応物に添加した。ＤＮＡ １０００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、１μｌの反応物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で定量化した。ゲル解析のために、６倍濃度のローディング緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２μｌを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する３％のアガロースゲルにロードした。ゲルは、Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上で視覚化し、ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度は、二項式から導出される方程式：

【数2】

［式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等しく、「ｃ」は、バックグラウンド控除後における非切断ＰＣＲ産物の積分面積に等しい（Guschinら（２０１０年）、Methods in Molecular Biology、６４９巻：２４７〜２５６頁）］
を使用して計算した。

【0196】

（実施例３）
図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、ガイドＲＮＡの５’末端を作出するハンマーヘッド型リボザイムを示す。５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム（配列番号４９）およびｇＲＮＡ（配列番号５０）を、図１１Ａに描示する。ハンマーヘッド型リボザイムの配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す（極めて重要なヌクレオチドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で）。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイムにより切断される（下）と、結果として得られるｇＲＮＡは、新たに形成された５’側位置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−ｇＲＮＡを発現させることが示されている構築物を、図１１Ｂに示す。一般に、Ｕ６、Ｈ１、またはＴ７などのｐｏｌ ＩＩＩプロモーターであるプロモーターを使用して、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、ｇＲＮＡを放出するであろう。２つの遺伝子座のターゲティングを、図１１Ｃに、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（ＨＨ１＋ＣＧＧ ＰＡＭ配列＝配列番号５１；ＨＨ２＋ＡＧＧ ＰＡＭ配列＝配列番号５２）、５’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断（矢印）の成功と共に示す。

【0197】

図１２は、特異的アプタマーの存在下でｇＲＮＡをプロセシングするのにアプタザイムを使用する、調節可能なＣＲＩＳＰＲ構築物を示す。特に、図１２は、テオフィリンアプタザイムを形成する、ハンマーヘッド型リボザイムのヘリックスＩＩと融合させたテオフィリンアプタマー（橙）であって、ｇＲＮＡ（青）の５’側にあるテオフィリンアプタマーを描示する。テオフィリンの結合は、ヘリックスＩＩを安定化させ、次いで、ハンマーヘッド型自己切断を可能とし、ｇＲＮＡを遊離させる。ここで、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９と共に、ＣＲＩＳＰＲ系による切断をターゲティングすることが可能である。

【0198】

方法
プラスミドの構築：Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、またはＴ７プロモーターにより駆動される５’側シス型ハンマーヘッド型構築物を作出するために、ハンマーヘッド型配列（ＧＴＡＣＧＴＴＴＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＡＡＡＴＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＧＴＣ；配列番号５３）を、プロモーターの下流であり、かつ、ｇＲＮＡ標的および足場の上流に置いた。ヘリックスＩを形成するために、ｇＲＮＡ標的配列と相補的な１０ヌクレオチドを、ハンマーヘッド型配列の５’側に置き、次いで、これを、ｇＲＮＡ内で見出される相補的な配列に結合させた（図１２）。本研究で使用される多様なｇＲＮＡを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、２ステップ増幅用のＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲにより増幅し、その後、２倍容量の２５％のＰＥＧおよび１．５ＭのＮａＣｌと混合した、Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｓｅｒａ−Ｍａｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、精製した。次いで、精製されたＰＣＲ産物を、Ｈ_２Ｏ中に再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物は、若干改変した、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）を使用して作出した。総反応容量は、２０μｌから２μｌに低減された。

【0199】

細胞培養物：ｈＥＳＣ細胞系Ｈ７およびＩＭＲ−９０ ｉＰＳ細胞（ＷｉＣｅｌｌ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を、既に記載されたプロトコール（Walkerら（２０１０年）、Nat. Commun.、１巻：７１頁；Maruottiら（２０１３年）、Stem Cells Translational Medicine、２巻：３４１〜３５４頁）に従う、１０％のＣＯ_２／５％のＯ_２によるインキュベーター内、ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）中、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）上のクローン繁殖により維持した。継代培養のために、ｈＥＳＣコロニーを、まず、ｍＴｅｓＲ１中に５μＭのブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共にインキュベートし、次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による５〜１０分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離させ、遠心分離によりペレット化した。その後、ｈＰＳＣを、ブレビスタチンを伴うｍＴｅＳＲ１中に再懸濁させ、１ｃｍ^２当たりの細胞およそ１，０００〜１，５００個で播種した。継代の２日後、培地を、ｍＴｅＳＲ１（ブレビスタチンを伴わない）で置きかえ、毎日交換した。

【0200】

ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、５％のＣＯ_２／２０％のＯ_２を伴う３７℃で維持した。

【0201】

Ｈ７細胞の遺伝子ターゲティング：ｈＥＳＣ細胞を、電気穿孔の２４時間前に、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤（ＤＤＤ０００３３３２５、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、Ｎｅｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当日、ｈＥＳＣを、コロニーがリフトするまで、１〜２分間にわたり、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で１５分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下：電圧：１４００ｍｓ；間隔：３０ミリ秒；１パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、１０μＭのＲｈｏ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤を含有するｍＴｅＳＲ１培地にゆっくりと移し、次いで、室温で２０分間にわたり保ってから、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングしたディッシュに播種し、さらに培養した。

【0202】

クローンから導出されたコロニーについて解析するために、電気穿孔されたｈＥＳＣを、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞５００個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手作業の採集により単離し、さらに培養した。

【0203】

構成的に発現させたＧＦＰ ＥＳＣ細胞系の作出：Ｈ７ヒトＥＳＣ細胞系（ＷｉＣｅｌｌ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ基質上のｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによる短時間（＞５分間）の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Ａｃｃｕｔａｓｅで７分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のｍＴｅｓＲでクェンチングし、８０×ｇで５分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するｍＴｅｓＲ中に再懸濁させた。細胞１×１０^６個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、１０〜１５分間にわたり、氷上に置いた。ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座に対する相同性を含有する、１０μｇのＡＡＶ−ＣＡＧＧＳＥＧＦＰドナーベクター（＃２２２１２、Ａｄｄｇｅｎｅ）に加えて、Ｒ緩衝液中に５μｇずつのｈＡＡＶＳ１ １Ｒ＋Ｌ ＴＡＬＥＮ（＃３５４３１および３５４３２、Ａｄｄｇｅｎｅ）（Hockemeyerら（２００９年）、Nat. Biotechnol.、２７巻：８５１〜８５７頁；Sanjanaら（２０１２年）、Nature Protocols、７巻：１７１〜１９２頁）を、以下のパラメータ：１５００Ｖ、パルス１つ当たり２０ミリ秒、および１パルスで、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する、１００μｌ型のチップにより電気穿孔した。次いで、細胞を、１ｍｌの培地に静かに添加し、室温で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、ｍＴｅＳＲおよび５μＭのブレビスタチンを含有する、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした３５ｍｍのディッシュに播種した。２日後、細胞を、３５ｍｍのディッシュ１枚当たりの細胞１×１０^４個の密度で播種し、その後、時間的に安定なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Ｎｉｋｏｎ ＴＳ１００落射蛍光顕微鏡により、手作業で選択した。

【0204】

ゲノム改変のためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイおよびシークェンシング解析：Ｓｕｒｖｅｙｏｒ解析のために、細胞を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中に再懸濁させ、６５℃で１５分間にわたりインキュベートし、次いで、９８℃で１０分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出物溶液は、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して清浄化させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量化した。ＣＲＩＳＰＲ標的部位を取り囲むゲノム領域は、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅した。複数の独立のＰＣＲ反応物をプールし、製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎを使用して、精製した。１２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、６２．５ｍＭのＫＣｌ、および１．８７５ｍＭのＭｇＣｌ_２中に、４００ｎｇのＰＣＲ産物を含有する、８μｌの容量を変性させ、ゆっくりと：９５℃で１０分間、１秒当たり−１．０℃の勾配で９５℃から８５℃へ、８５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で８５℃から７５℃へ、７５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で７５℃から６５℃へ、６５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で６５℃から５５℃へ、５５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で５５℃から４５℃へ、４５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で４５℃から３５℃へ、３５℃で１秒間、１秒当たり−１．０℃の勾配で３５℃から２５℃へ再アニールさせ、次いで、４℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーおよび１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｏｍａｈａ、ＮＥ）を、各反応物に添加し、４２℃で６０分間にわたりインキュベートし、その後、１μｌのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを、反応物に添加した。ＤＮＡ １０００チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、１μｌの反応物を、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で定量化した。ゲル解析のために、６倍濃度のローディング緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２μｌを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する３％のアガロースゲルにロードした。ゲルは、Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２００ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）上で視覚化し、ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．４６を使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度は、二項式から導出される方程式：

【数3】

［式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等しく、「ｃ」は、バックグラウンド控除後における非切断ＰＣＲ産物の積分面積に等しい（Guschinら（２０１０年）、Methods in Molecular Biology、６４９巻：２４７〜２５６頁）］
を使用して計算した。

【0205】

（実施例４）
概要
色素性網膜炎（ＲＰ）とは、網膜光受容体細胞（杆体および錐体）の機能不全および死が、視覚喪失をもたらし、潜在的に、失明をもたらす、遺伝性網膜変性疾患である。ＲＰには、常染色体劣性の遺伝形態および常染色体優性の遺伝形態の両方（それぞれ、ＡＲＲＰおよびＡＤＲＰ）が存在する。ＡＲＲＰでは、疾患の一因となる遺伝子のいずれのコピーにも（大半の遺伝子では、遺伝子の一方のコピーは、母親から受け継がれ、他方のコピーは、父親から受け継がれる）突然変異が見られる。ＡＲＲＰと関連する疾患原因突然変異は一般に、関与遺伝子の機能の喪失をもたらす、すなわち、網膜変性は、その正常な機能を果たす関与遺伝子の能力の喪失に起因する。このような症例では、少なくとも理論的には、適切な処置を開発するのに行う必要がある（喪失した遺伝子機能を置きかえる必要がある）ことが明白である。この手法の洗練された例は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）について進行中のヒト処置研究であり、この研究では、疾患を引き起こす欠損性ＲＰＥ６５遺伝子の機能を置きかえるのに、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）による遺伝子治療が使用されている。

【0206】

ＡＲＲＰと識別されるＡＤＲＰでは、疾患原因遺伝子の２つのコピーのうちの１つだけが突然変異している。大半の症例では、この単一の突然変異遺伝子は、機能を喪失しているために網膜変性を引き起こすのではなく、むしろ、杆体光受容体細胞および／または錐体光受容体細胞に対して毒性であるかまたは有害な機能である、新たな機能を獲得した遺伝子産物の産生を突然変異がもたらすために、疾患を引き起こす。機能的な遺伝子の導入では十分でないので、この状況は、遺伝子置換戦略をより複雑なものとする（有効な治療は、毒性の突然変異を伴う遺伝子から産生される「悪い」遺伝子産物の発現を取り除く手法を開発することと、遺伝学者が「野生型」（ＷＴ）遺伝子と称する、突然変異していない遺伝子コピーの機能を維持することとの両方を要請する）。

【0207】

現在のところ、ＡＤＲＰのための、ＦＤＡにより承認された処置は存在しない。進行中の実験室および動物による調査研究の大半は、２ステップの手法：１）突然変異した遺伝子コピーおよびＷＴの遺伝子コピーのいずれの機能も消失させ、次いで、２）通例、ＡＡＶ媒介型遺伝子治療を介して、ＷＴ遺伝子の、新たな「機能を喪失しにくい」形態であって、内因性ＷＴ遺伝子を破壊する第１のステップで使用された治療に対して抵抗性である形態を導入する手法を採用している。

【0208】

本明細書で開示される主題は、ＡＤＲＰ処置のための新規の戦略であって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集を活用して、生存生物のゲノムの情報の編集を正確にターゲティングする戦略を提供する、すなわち、本明細書で開示される主題は、生存生物の遺伝子の治療的モジュレーションを可能とする。本明細書で開示される方法は、ＷＴ遺伝子の発現に影響を及ぼさないようにしながら、疾患原因遺伝子の突然変異コピーが、その毒性遺伝子産物を発現させないように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集を使用して、疾患原因遺伝子の突然変異コピーを特異的に変更する。例えば、ロドプシン遺伝子の突然変異形であって、ＡＤＲＰ（Ｐ２３Ｈ）と関連する突然変異形を、特異的にターゲティングし、毒性遺伝子産物をもはや発現させないように、その配列を変化させることができる。一部の実施形態では、単一のＡＡＶウイルス粒子内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を、眼に送達することができる。この系は、ＡＤＲＰのＰ２３Ｈロドプシンマウス突然変異体モデルにおいて調べられている。これらの研究は、ＡＤＲＰを処置するために、網膜細胞の特別の遺伝的操作に基づく遺伝子治療のための新たな手法を検証するものである。本明細書で開示される主題は、ＡＤＲＰの多様な形態のほか、他の常染色体優性の遺伝性網膜ジストロフィーにも適用可能である。

【0209】

具体的な目標

【0210】

色素性網膜炎の常染色体優性形態（ＡＤＲＰ）は、ＲＰの全症例のうちのおよそ３０〜４０％を構成し、ＡＤＲＰ患者の中で、最も一般的に突然変異するＲＰ関連遺伝子は、杆体視物質であるロドプシンをコードする遺伝子である（Dryjaら（１９９０年）、The New England Journal of Medicine、３２３巻、１３０２〜１３０７頁；Dryjaら（１９９０年）、Nature、３４３巻、３６４〜３６６頁）。本明細書で開示される主題は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子編集技術を使用することにより、ＡＤＲＰを処置する手法（DoudnaおよびCharpentier（２０１４年）、Science、３４６巻、１２５８０９６頁；Hsuら（２０１４年）、Cell、１５７巻、１２６２〜１２７８頁）であって、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、カスタマイズ可能な低分子ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に使用して、突然変異体ロドプシン対立遺伝子をターゲティングし、切断する手法を提供する。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、正常対立遺伝子に影響を及ぼさずに、突然変異体対立遺伝子の発現を特異的にノックアウトする。必要とされる構成要素は、哺乳動物の杆体における性能が記録されているＡＡＶ血清型である、単一のＡＡＶ５により、光受容体に送達することができる。野生型レベルのわずか５０％のロドプシンの発現が生じさえすれば、臨床的に有用な杆体機能をもたらすのに十分であることを、動物データは示唆している（Liangら、The Journal of Biological Chemistry、２７９巻、４８１８９〜４８１９６頁）。

【0211】

マウス研究および他の動物研究を介して、疾患突然変異のＣＲＩＳＰＲターゲティングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効であることが示されているが、全ての現行の手法は、大部分が送達上の制約に起因して、いまだ臨床使用からは程遠い。ＡＡＶベクターは、眼の遺伝子治療において最もしばしば使用されるウイルスベクターである（DalkaraおよびSahel（２０１４年）、Comptes Rendus Biologies、３３７巻、１８５〜１９２頁；Dayら（２０１４年）、Advances in Experimental Medicine and Biology、８０１巻、６８７〜６９３頁；WillettおよびBennett（２０１３年）、Frontiers in Immunology、４巻、２６１頁；Dinculescuら（２００５年）、Human Gene Therapy、１６巻、６４９〜６６３頁）。非病原性のウイルスであり、分裂細胞および非分裂細胞のいずれにも感染し、発現が長期間にわたり持続し、特に、臨床試験における、その安全性、有効性、および一般的な毒性の欠如の履歴が注目に値する、いくつかの特徴は、ＡＡＶを魅力的な選択としている。加えて、硝子体内注射の後に光受容体細胞をターゲティングするのに有効な、変異体ＡＡＶ血清型とプロモーターとの組合せも開発されている。しかし、それらの現行の状態において、これらのベクターは、免疫応答を誘発し、ヒトサイズの眼における、光受容体への、効率的な、汎網膜的向細胞性を欠く（Kottermanら（２０１５年）、Gene Therapy、２２巻、１１６〜１２６頁；Mowatら（２０１４年）、Gene Therapy、２１巻、９６〜１０５頁；Dalkaraら（２０１３年）、Science Translational Medicine、５巻、１８９ｒａ１７６頁）ので、焦点は既に、網膜下注射により投与される、ＡＡＶ５ベクターの、十分に特徴付けられた使用に絞られているであろう。

【0212】

ＡＡＶゲノムは、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡ分子であり、最大で５．２ｋｂの組換えＤＮＡを保有するように改変しうるが、この限界を押し広げると、パッケージング効率の低減およびインサートの欠失がもたらされる（Bernsら（１９８６年）、Fundamental Virology、B.N. FieldsおよびKnipe, D.M.編、５４５〜５６２頁、Raven Press）。一般に使用されるＣａｓ９タンパク質（４．１ｋｂ）をコードする遺伝子自体のサイズが大きいために、ｇＲＮＡを伴う送達であって、単一のウイルスベクターを介する発現に必要な、プロモーター配列、ターミネーター配列、ウイルスＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列を含む送達は、現在のところ、このＡＡＶのパッケージング容量により限定されている。実際、活性ＣＲＩＳＰＲ複合体の再構成は、共形質導入を必須とするが、これは、単一の形質導入より効率性が低い。加えて、これは、ウイルス用量の増大も要請し、免疫応答および関連する毒性の増大も、潜在的に誘導しうるであろう。また、ヒト試験における第２のウイルスベクターの送達は、ＦＤＡによる承認へのさらなる難題をもたらしうる可能性も高い。

【0213】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術の開発は、遺伝子編集の分野を革命化している。亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などのゲノム編集技術の初期の方法により、ターゲティングされたゲノム改変を作出する能力が強化され、疾患突然変異を精密に補正する潜在的可能性が供されている。これらの技術は、有効ではあるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの対のいずれも、所与のＤＮＡ標的部位についての、大型で固有の認識タンパク質を合成することを要請するので、実際的な限界に阻まれている。多数のグループが近年、操作されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用を介する高効率のゲノム編集であって、これらの鍵となる限界を回避するゲノム編集について報告している（Jinekら（２０１２年）、Science、３３７巻、８１６〜８２１頁；Congら（２０１３年）、Science、３３９巻、８１９〜８２３頁；Maliら（２０１３年）、Science、３３９巻、８２３〜８２６頁）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、配列特異的ＤＮＡにターゲティングする、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）から構成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集は、ゲノムターゲティングのために、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮで要請される、ヌクレアーゼ内のＤＮＡ結合性ドメインの固有の組合せではなく、短鎖合成ｇＲＮＡに依拠するので、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの発現に必要な構築物を制作する、時間がかかり、労力を要する作業が解消される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のための構築物の作出は、簡単かつ迅速であり、標的をマルチプレックス化することができる。ＣＲＩＳＰＲ系による切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列および標的部位の３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）への、ｇＲＮＡの相補的塩基対合を要請する。理論的には、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して、ゲノム内の、任意の固有のＮ_２０−ＰＡＭ配列をターゲティングすることができる。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用されているＣａｓ９タンパク質は、配列ＮＧＧを認識する、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、こうして、ＣＲＩＳＰＲターゲティング配列は、Ｎ_２０ＮＧＧとなる。

【化2】

【0214】

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるロドプシン遺伝子のターゲティングでは、要請されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９エフェクター分子を、適切に操作されたＡＡＶ５ベクターの網膜下投与により、杆体細胞に送達する。血清５型ベクターは、非ヒト霊長動物（Mancusoら（２００９年）、Nature、４６１巻、７８４〜７８７頁）の光受容体およびイヌ科動物（Beltranら（２０１２年）、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、１０９巻、２１３２〜２１３７頁）の光受容体のいずれへの形質導入においても、極めて効率的であり、網膜の治療を媒介することが可能であることが示されている。カプシドを修飾されたＡＡＶベクターは、マウスでは、硝子体から光受容体に浸透しうる（Petrs-Silvaら（２０１１年）、Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy、１９巻、２９３〜３０１頁）が、これまでのところ、イヌまたは非ヒト霊長動物では、同様な浸透性が可能となっていない（観察は公表されていない）。

【0215】

ＡＡＶを介するＣａｓ９およびガイドＲＮＡの送達における重要な課題は、両方の構成要素を発現させるのに要請されるＤＮＡが、従来の方法では、５ｋｂ（プロモーター、約５００ｂｐ；ｓｐＣａｓ９、４，１４０ｂｐ；Ｐｏｌ ＩＩターミネーター、約２５０ｂｐ；Ｕ６プロモーター、約３１５ｂｐ；およびｇＲＮＡ、約１００ｂｐ）を超え、したがって、ＡＡＶのパッケージング限界である、およそ４．７〜４．９ｋｂを超えることである。Swiechら（２０１５年、Nature Biotechnology、３３巻、１０２〜１０６頁）は、２ベクター手法：Ｃａｓ９を送達する１つのＡＡＶベクターと、ｇＲＮＡを送達するための別のＡＡＶベクターとを使用することにより、この課題に取り組んだ。しかし、この研究における二重ＡＡＶ手法は、網膜細胞内では発現するが、杆体内では発現しない特に低分子のプロモーターである、マウスＭｅｃｐ２プロモーターを利用した（Songら（２０１４年）、Epigenetics & Chromatin、７巻、１７頁；Jainら（２０１０年）、Pediatric Neurology、４３巻、３５〜４０頁）。こうして、この系は、構築されても、ＡＤＲＰの大半の症例には適さないであろう。本明細書で開示される主題は、網膜の遺伝子編集のための単一ベクター手法であって、効率を増大させ、光受容体を特異的にターゲティングし、ウイルスロードの送達に由来する潜在的毒性を低減する単一ベクター手法を提供する。

【0216】

結果
ｇＲＮＡの転写を方向付け、利用可能なＣＲＩＳＰＲ遺伝子ターゲティング空間をほぼ倍化することを可能とするのに、従来使用されたＵ６プロモーターではなく、Ｈ１プロモーターが使用されている（Ranganathanら（２０１４年）、Nature Communications、５巻、４５１６頁）。とりわけ、オフターゲットの切出しへの傾向の低下が検出されたことから、Ｈ１プロモーターは、治療手法により好適であることが示唆される。これらの研究では、内因性Ｈ１ＲＮＡ遺伝子とゲノム内で近接するタンパク質コード遺伝子（ＰＡＲＰ−２）の存在が注目された（Baerら（１９９０年）、Nucleic Acids Research、１８巻、９７〜１０３頁；Myslinskiら（２００１年）、Nucleic Acids Research、２９巻、２５０２〜２５０９頁）。Ｈ１ＲＮＡ（ｐｏｌ ＩＩＩ ＲＮＡ転写物）の始点と、ＰＡＲＰ−２遺伝子（ｐｏｌ ＩＩ転写物）の始点との間の配列は、２３０ｂｐ（図１３）であることから、この比較的小さな配列は、コンパクト双方向性プロモーターとして機能しうることが指し示される。これは、ｐｏｌ ＩＩ転写物およびｐｏｌ ＩＩＩ転写物の両方を方向付けうる、哺乳動物ゲノム内で唯一の双方向性プロモーター配列であり、両方のＣＲＩＳＰＲ構成要素を、単一のＡＡＶ中にパッケージングする場合のサイズのハードルを克服するのに使用しうると考えられる。

【0217】

Ｃａｓ９／ｇＲＮＡを二重に発現させるための、双方向性ｐｏｌ ＩＩ／ＩＩＩプロモーターとしてのＨ１の使用を開発するため、かつ、そのｐｏｌ ＩＩＩ活性は、既に十分に特徴付けられているため、そのｐｏｌ ＩＩ活性をより良好に最適化するように、ｅＧＦＰレポーター構築物を創出した（図１４）。ヒト（ＨＥＫ２９３）内およびマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）内の最初の結果により、弱いが、明確に検出可能なＧＦＰ蛍光が実証されたことから、Ｈ１プロモーターにより、弱くではあるが、ｐｏｌ ＩＩ発現を方向付けうることが指し示される。このＧＦＰレポーター系を使用して、系内の３つの可変的構成要素：プロモーター配列、５’ＵＴＲ、およびターミネーター配列を査定することにより、プロモーターのコンパクト性を維持しながら、ｐｏｌ ＩＩ発現を増大させた。異なる生物に由来するＨ１プロモーター配列について調べたところ、マウス（１７６ｂｐ）配列およびラット（２０７ｂｐ）配列のいずれも、ヒトＨ１プロモーターより強いＧＦＰ発現を駆動することが可能であることが指し示された（それぞれ、約７倍および約６倍）。しかし、目標は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト細胞と共に使用するための系を導出することであるので、可能な場合は、ヒトプロモーター配列を使用した。異なるターミネーター配列を査定するために、７つの異なる配列について調べたところ、ＳＶ４０（２４０ｂｐ）ターミネーター配列および４９ｂｐの合成ポリ（Ａ）配列（ＳＰＡ）（Levittら（１９８９年）、Genes & Development、３巻、１０１９〜１０２５頁）はいずれも、ＧＦＰ発現のために機能的であることが見出された。５’ＵＴＲの修飾を介して翻訳効率を最適化して、レポーターの発現を改善したところ、ベータ−グロビンの５’ＵＴＲ配列から取り出される５０ｂｐの配列の挿入により、レポーター発現を著明に改善しうることが見出された。強力なコザック配列をコードする９塩基（Kozak（１９８７年）、Nucleic Acids Research、１５巻、８１２５〜８１４８頁）（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’）を挿入するだけで、これらのレベルを近似するのに十分であった（図１５）ことは、この考えと符合する。

【0218】

これらのＧＦＰベースの最適化実験から導出された情報に基づき、Ｃａｓ９タンパク質およびターゲティングｇＲＮＡを同時に発現させるのに、ヒトＨ１プロモーター配列を使用して、ターゲティング構築物を作出した。これらの双方向性構築物が、細胞内の切断を方向付ける能力について調べるために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、標準的な２プラスミド手法（ｐＣＡＡＧＳ：Ｃａｓ９およびＨ１：ｇＲＮＡ）または両方の構成要素を発現させる単一プラスミド系で電気穿孔した。マウスゲノム内の２つの異なる遺伝子座をターゲティングした。電気穿孔の４８時間後、ゲノムＤＮＡを採取し、Ｔ７ Ｅｎｄｏ Ｉ（Ｔ７ＥＩ）アッセイ（Ranら（２０１３年）、Nature Protocols、８巻、２２８１〜２３０８頁）を実施して、ゲノム改変のレベルを定量化した。欠失の検出においてより感受性であることが報告されている（Vouillotら（２０１５年））ため、従来のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイではなく、Ｔ７ＥＩアッセイを使用した。およそ４．７ｋｂで、十分にＡＡＶのパッケージング容量内にある、コンパクト双方向性系を使用して、ＣＲＩＳＰＲ切断を、これらの２つの遺伝子座に有効にターゲティングしうることが見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。ヒト細胞における、このターゲティング戦略の適用可能性および関与性をさらに実証するように、ヒトＨ７胚性幹細胞系内のＣａｓ９ターゲティングについてのデータが存在する。ヒト配列ではなくて、マウスＨ１プロモーターを使用し、ＳＶ４０ターミネーター配列ではなくて、ＳＰＡターミネーターを使用することにより、理論的には、ターゲティング構築物のサイズを、さらに２００ｂｐ低減することができる。これらの配列の低減により、より効率的なパッケージングを可能とすることもでき、Ｃａｓ９系の発現をブーストする場合もあり、低減する場合もあり、なおさらに調節する場合もある配列の改変；潜在的なオフターゲット効果を低減するために重要でありうる改変のためのさらなる空間を潜在的にもたらすこともできる。ＡＡＶ Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるＩＴＲ含有ベクター中に容易にクローニングされうるフランキングＮｏｔＩ部位と共に、Ｇｉｂｓｏｎクローニング方法（ＮＥＢ）を使用して、簡単な標的の挿入を可能とする、固有の制限部位を伴う双方向性プラスミドが作出されている。

【0219】

Ｃａｓ９およびｇＲＮＡのプロモーター、ＲＮＡのプロセシング、ならびに構造的エレメントを、単一のＡＡＶベクター系から有効に発現させ、適切なＧＭＰ様前臨床ベクターを作出するように、デザインし、最適化する

【0220】

Ｃａｓ９およびｇＲＮＡの発現を同時に駆動する双方向性Ｈ１プロモーターの組合せ、ならびに最適化の取組みにより、ＣＲＩＳＰＲ送達のサイズを、ＡＡＶパッケージング容量未満に低減することの実質的な進展が、既になされている。代替的なプロモーター配列、５’／３’ＵＴＲ修飾、および異なるｇＲＮＡによる多様な組合せは、ターゲティング効率の潜在的スペクトルについて調べるためのツールキットを提供する。

【0221】

構築物を、サイズ、発現、および切出し効率との関係でさらに最適化したら、それらを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける試験のためのＡＡＶベクターを作出することができる。最適化研究のために使用される構築物は、ＡＡＶ産生のためのＩＴＲ含有ベクタープラスミドへのクローニングを可能とするフランキングＮｏｔＩ部位と共に、簡単な標的の挿入を可能とする固有の制限部位を含有する。細胞培養研究およびマウス研究のための、高力価ＧＭＰ様前臨床ＡＡＶ５ベクターを、独立のベクター作製施設において、ヘルパーフリーのプラスミドトランスフェクション方法を使用して作出し、既に開発した技法（Dryjaら（１９９０年）、The New England Journal of Medicine、３２３巻、１３０２〜１３０７頁；Dryjaら（１９９０年）、Nature、３４３巻、３６４〜３６６頁）により精製することができる。各ウイルスの調製は、最終的なベクター内のＷＴアデノウイルスおよび複製コンピテントＡＡＶ夾雑物を消失させる、ｐＤＧ ｍｉｎｉ−ＡｄプラスミドＤＮＡヘルパー系を使用して行うことができる。ベクターは、イオジキサノール勾配遠心分離に続く、ＱカラムＦＰＬＣクロマトグラフィーにより精製する。ＧＭＰ様純度のＡＡＶベクター原液を確立するために、各ベクターを、標準化された物理的アッセイおよび生物学的アッセイのバッテリーであって、純度、バイオバーデン、無菌性、ＤＮＡ含有粒子の力価、感染力価、粒子対感染性比、および複製コンピテントＡＡＶによる夾雑可能性についての評価を含むバッテリーにかけることができる。

【0222】

最新のＨ１プロモーターによる研究では、低レベルのオフターゲット効果が指し示されている（Ranganathanら（２０１４年）、Nature Communications、５巻、４５１６頁）が、構築物は、最終的な臨床使用を目標として開発されつつあるので、潜在的なオフターゲット活性について注意深くモニタリングすべきである（Wuら（２０１４年）、Quantitative Biology、２巻、５９〜７０頁）。この目的で、いくつかの相補的な手法を追求することができる。バイオインフォマティクス手法を取り、２３マーのＣＲＩＳＰＲ配列部位の両方の鎖および重複の発生を検索するように書かれた特注のＰｅｒｌスクリプトを使用して、ヒトゲノム内およびマウスゲノム内の全ての潜在的ＣＲＩＳＰＲ部位が決定された（Ranganathanら、準備中の草稿、２０１５年）。例えば、ヒトゲノム内では、反復配列をフィルタリングにより除外した後で、１３７，４０９，５６２のＣＲＩＳＰＲ部位による初期セットが同定された。次いで、３’末端またはＰＡＭ末端（シード領域）へのバイアスがかかった、２３塩基の配列の固有性に基づき、値を割り当てる特注のアルゴリズム（Jinekら（２０１２年）、Science、３３７巻：８１６〜８２１頁）に従い、各部位をスコア付けした。最後に、ターゲティング配列を通して最大で３つの塩基ミスマッチを許容しながら、各ＣＲＩＳＰＲ部位をゲノムに戻して再配列決定する、Ｂｏｗｔｉｅ（Langmeadら（２００９年）、Genome Biology、１０巻、Ｒ２５頁）を使用することにより、各部位がオフターゲット効果を呈示する傾向を計算した。コンピュータによるオフターゲットの予測を使用して、各ｇＲＮＡを、任意の誤ターゲティングについて調べることができる。予測される潜在的なオフターゲット部位を挟むＰＣＲプライマーを使用して、ゲノム配列を増幅することができ、次いで、これを、Ｔ７ＥＩアッセイにより、切断効率について調べることができる。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における最適化実験のための、ターゲティング精度のモニタリングを可能とするであろう。オフターゲット切出し０．５％未満を目指すが、５％未満は許容可能とする。

【0223】

標準的なＣａｓ９ターゲティングに焦点が絞られているが、また、代替的なＰＡＭ配列のターゲティングを含む、代替的な手法も検討される。Ｃａｓ９は、標準的なＮＧＧ配列に加えて、ＮＡＧを伴うＰＡＭモチーフもターゲティングすることが報告されている（Hsuら（２０１３年）、Nature Biotechnology、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７）。ヒト配列内の２つのＣＲＩＳＰＲ配列と、マウスゲノム内の３つのターゲティング配列との重複であって、Ｐ２３Ｈ突然変異が同定された重複により、さらなるターゲティング部位がもたらされうるであろう。ＮＡＧ ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ部位よりターゲティング効率が低いと予測されている（Zhangら（２０１４年）、Scientific Reports、４巻、５４０５頁）が、これにより、投与量を滴定する機構が提示される可能性があり、構築物が著明なオフターゲット効果を及ぼすことを決定する場合、この機構は貴重でありうる。まず、ＮＡＧ ＰＡＭ部位を使用する５つの配列を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（ＮＥＢ）を使用するｐＨ１ｖ１２６中にクローニングすることができる。２つのヒト配列を、Ｃａｓ９プラスミドと共に、２９３細胞中に共トランスフェクト（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００）しうる一方、マウスプラスミドは、Ｃａｓ９プラスミドと共に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中に電気穿孔（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｏｎ）することができる。ｇＲＮＡ活性を検出するために、カノニカルのＮＧＧのほか、非カノニカルのＮＡＧ部位の間でも、Ｃａｓ９切断部位においてＮＨＥＪにより導入される、インデル突然変異の比率を定量化することができる。

【0224】

また、ＣＲＩＳＰＲｉとして公知の代替的な治療手法であって、Ｃａｓ９のヌクレアーゼデッド形（ｄＣａｓ９）を活用して、Ｐ２３Ｈ対立遺伝子の発現を特異的に抑制する治療手法も、使用することができる（Qiら（２０１３年）、Cell、１５２巻、１１７３〜１１８３頁；Gilbertら（２０１３年）、Cell、１５４巻、４４２〜４５１頁；Larsonら（２０１３年）、Nature Protocols、８巻、２１８０〜２１９６頁；Fullerら（２０１４年）、Advances in Experimental Medicine and Biology、８０１巻、７７３〜７８１頁）。切断を誘導する代わりに、ｄＣａｓ９は、ＤＮＡ配列への緊密な結合を保ち、活性状態で転写される遺伝子の内側をターゲティングする場合、立体障害機構を介するｐｏｌ ＩＩ進行の阻害により、効率的な転写の抑制をもたらしうる。ＤＮＡの破断を誘導せずに、Ｐ２３Ｈの治療的抑制を達成することにより、かつ、ＡＡＶの構成的な発現が与えられることにより、ＡＡＶ５による転写阻害剤の送達は、遺伝子治療および調節ハードルの両方の観点から好適でありうるであろう。ＣＲＩＳＰＲｉによる転写の抑制は、ロドプシンの対立遺伝子特異的発現を測定するｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、最適化することができる。

【0225】

Ｐ２３Ｈマウスに由来する、初代光受容体培養物を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、開発されたＡＡＶ５ベクターが、突然変異体ロドプシン対立遺伝子を切り出し、その発現をノックアウトする能力を検証する

【0226】

初代マウス光受容体細胞培養物を使用して、動物研究に進む前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ターゲティング構築物を検証することができる。生後２〜１０日目の動物を使用して、ターゲティングアッセイのための細胞を単離するために、マウス網膜を採取および解離することができる。構築物を、ヒト（ｈ）Ｒｈｏ：ＧＦＰマウス（Chanら（２００４年）、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、１０１巻、９１０９〜９１１４頁）内で調べることにより、ロドプシンターゲティングのさらなる最適化を可能とすることができる。ｈＲｈｏ−ＧＦＰノックインマウスは、マウスロドプシンのオープンリーディングフレームにノックインされたヒトロドプシン−ＧＦＰ融合体を含有する（図１７）。この部分的なヒト化マウスは、光受容体細胞内のヒト特異的配列のターゲティングを可能とする。ヒトｒｈｏ配列をターゲティングすることができ、次いで、光受容体からのＧＦＰの喪失を定量化することができる。ロドプシンをターゲティングしつつあるが、ＧＦＰレポーターをインフレームで融合させて、こうして、蛍光の喪失を、標的部位の上流における、エラープローンＮＨＥＪの簡便な代理指標として用いる。網膜細胞の電気穿孔により、１０〜２０％のトランスフェクション効率が日常的に達成されるが、ＣＲＩＳＰＲ改変細胞の集団について濃縮するために、トランスフェクトされた集団を、Ｃａｓ９蛍光レポーターの強度に基づき分取することができる。多様なＰ２Ａ：レポータータンパク質と融合させた、いくつかのＣａｓ９構築物であって、Ｃａｓ９活性を損なわずに、蛍光活性のモニタリングを可能とするＣａｓ９構築物を作出した。Ｒｈｏ：ＧＦＰマウスに由来する網膜培養物を使用して、Ｃａｓ９：Ｐ２Ａ：ｍＣｈｅｒｒｙレポーターおよびターゲティングｇＲＮＡを電気穿孔することができる。次いで、２４時間の培養後、二重陽性細胞を分取することができ、これにより、トランスフェクトされた光受容体について濃縮することができる。４８時間後、細胞を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）中に再懸濁させて、ゲノムＤＮＡを採取し、Ｔ７ＥＩアッセイによりゲノムの改変についてアッセイすることができる。同様に、ロドプシン突然変異のターゲティングは、Ｐ２３Ｈマウスに由来する、初代光受容体培養物を使用して検証することができる。構築物のターゲティング効率が１０％を超え、初期の結果と符合する場合は、トランスフェクションのレベルが低レベル（１０％）であってもなお、Ｔ７ＥＩアッセイを使用して、ゲノム編集を検出することができる。加えて、ＡＡＶ５ベクターの使用は、著明に高度な形質導入効率をもたらすはずである。

【0227】

また、オンターゲット部位およびオフターゲット部位についての、高分解度で、かつ、高感度の、部位特異的ディープシークェンシング解析も実施する。高忠実度のポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｐｈｕｓｉｏｎ）を使用して、ＣＲＩＳＰＲ標的部位と予測されるオフターゲット部位とを挟むゲノム配列を、１５サイクルにわたり増幅し、次いで、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５（Ｚｙｍｏ）を使用して、精製することができる。精製されたＰＣＲ産物は、５サイクルにわたり増幅して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５アダプターおよび試料特異的バーコードを接合し、再度精製し、次いで、ＳＹＢＲグリーン蛍光により定量化し、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で解析し、最後に等モル比でプールしてから、ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒでシークェンシングすることができる。シークェンシングデータを解析するためには、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｒｅｐｏｒｔｅｒソフトウェアを使用して、３００ｂｐのペアドエンドＭｉＳｅｑリードを脱マルチプレックス化するのに続いて、生リードに、アダプター／品質トリミングを施す。アライメントは、野生型配列に照らして、全てのリード上で実施し、ＮＨＥＪ頻度は、１００×（インデルリードの数／インデルリードの数＋ＷＴリードの数）により計算する。

【0228】

Ｐ２３Ｈマウスへの網膜下注射に続いて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＳＡ２に由来する改善されたベクターが、突然変異体ロドプシン対立遺伝子を切り出し、その発現をノックアウトする能力を検証する

【0229】

次のステップは、マウスにおけるＰ２３Ｈロドプシン突然変異のｉｎ ｖｉｖｏターゲティングを実証することになるであろう。バイオインフォマティクスの取組みにより、マウスＰ２３コドンと重複する、高スコアリングのＣＲＩＳＰＲターゲティング部位が同定されている。Ｎ_２０ＮＧＧの形態のＣＲＩＳＰＲ部位は、リバース鎖：

【化3】

残念ながら、ＣＲＩＳＰＲ部位内のマウスＰ２３Ｈ突然変異の場所は、ターゲティング部位内の、ｂｐ同一性を知りえない唯一の場所である、ＮＧＧ ＰＡＭモチーフのＮに当たる。これは、Ｐ２３Ｈ配列を指向するＣＲＩＳＰＲが、野生型配列とＰ２３Ｈ配列とを弁別することは不可能であり、したがって、ターゲティングは、いずれの対立遺伝子も切り出すと予測されることを意味するので、一塩基多型（ＳＮＰ）の発生に基づく代替的な手法が開発されている。

【0230】

ヒトゲノム内には、約１７００万のＳＮＰ（単一の塩基変異、インデル、ＳＴＲ、ＭＮＰなどを含む）（１８０ｂｐごとに約１つ）が報告されており、個別化ゲノム薬の文脈では、この変異は、極めて重要である。天然の遺伝子変異を活用することにより、マウスモデルにおけるＰ２３Ｈロドプシン対立遺伝子を、特異的にターゲティングする方法をもたらしうるだけでなく、また、将来のゲノム操作および治療手法になおより関与性となる可能性が高い概念実証手法も実証しうることが推論された。ｃａｓｔａｎｅｕｓ（Ｃａｓｔ）マウスは、ロドプシン遺伝子のプロリン２３コドン内のＳＮＰであって、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ配列と異なるＳＮＰを含有することが見出され、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝子バックグラウンドにおける、Ｐ２３Ｈ突然変異体マウスを、解析のために得た。ＳＮＰは、Ｐ２３Ｈ内の原因Ｃ→Ａトランスバージョンにじかに隣接しており、これにより、野生型ロドプシン対立遺伝子のターゲティングを伴わずに、優性Ｐ２３Ｈ対立遺伝子をターゲティングするための手法がもたらされる。Ｐ２３Ｈ突然変異のバックグラウンドは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊであるので、一世代のＣａｓｔ／Ｐ２３Ｈ交配の後で、ＣＲＩＳＰＲによりターゲティング可能なロドプシンＰ２３Ｈ対立遺伝子、および、緊密に連関するＳＮＰ差違に起因して、ｇＲＮＡ標的の「シード」領域内の２０位に配置された単一のミスマッチで異なる、野生型のＣＲＩＳＰＲ抵抗性ロドプシン対立遺伝子の両方を含有する、ヘテロ接合性マウスを得た（図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃ）。

【0231】

戦略の実行可能性を検証するために、Ｐ２３Ｈ突然変異体対立遺伝子内に存在する配列である、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊプロリン２３コドン配列をターゲティングするＨ１双方向性構築物、またはヘテロ接合性Ｐ２３Ｈ／Ｃａｓｔ動物のＷＴロドプシン対立遺伝子内に存在する配列である、Ｃａｓｔマウスにおけるプロリン２３コドン配列をターゲティングするＨ１双方向性構築物を作出した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ ＳＮＰを含有する）を、両方の構築物で独立に電気穿孔し、ゲノムＤＮＡを単離し、次いで、Ｔ７ＥＩアッセイを実施して、ゲノム改変のレベルを定量化した。特異的なロドプシンターゲティングを観察した：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（すなわち、Ｐ２３Ｈ）指向性構築物だけが、著明な切出しをもたらし、ゲノム改変のレベルは、５０％近くであったが、全体の電気穿孔効率が８０％を下回ったことを踏まえると、これは、ターゲティングの潜在的可能性の過小評価である可能性が高い（図１９）。単一の塩基ミスマッチを含有する、Ｃａｓｔロドプシン配列に基づくｇＲＮＡは、検出可能なＣａｓ９切断をもたらさなかったので、ロドプシンターゲティング部位、およびコンパクト双方向性構築物が切断を方向付ける能力の検証に加えて、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける切出しが、ＳＮＰ／突然変異体配列において特異的に生じることも実証した。

【0232】

ＣＲＩＳＰＲターゲティングを限界付ける因子は、有効な送達であると一般に考えられるが、ＡＡＶ５媒介型送達は、大きな眼であってもなお、大部分の光受容体への形質導入が可能であることが示されている。この形質導入率の高さ、形質導入された細胞のうちの５０％またはこれ超において遺伝子編集が生じること、およびＮＨＥＪイベントの３例中２例が、フレームシフト突然変異を結果としてもたらすことを踏まえると、多数の杆体内では、Ｐ２３Ｈ対立遺伝子の発現のノックアウトが達成されるはずであり、大部分の杆体内では、さらなる最適化も達成されるはずである。研究は、このレベルのターゲティングならば、杆体の直接的な保存および錐体の生存に対する二次効果の両方を介して、光受容体の生存を支援し、妥当なレベルの視覚を維持するのに十分であることを示唆する（Leveillardら（２００４年）、Nature Genetics、３６巻、７５５〜７５９頁；LeveillardおよびSahel（２０１０年）、Science Translational Medicine、２巻、２６ｐｓ１６；Sahelら（２０１３年）、Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie、２５１巻、１６６９〜１６７７頁）。既に記載されている通り、最適化されたウイルスを、Ｐ１５におけるマウス１０匹の一方の眼に網膜下注射することができる（Maoら（２０１２年）、Advances in Experimental Medicine and Biology、７２３巻、１９９〜２０５頁；Maoら（２０１２年）、Human Gene Therapy、２３巻、３５６〜３６６頁；Maoら（２０１１年）、Human Gene Therapy、２２巻、５６７〜５７５頁）。パートナーの対照眼と対比した、処置眼についての、ＥＲＧ解析およびＳＤＯＣＴ（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ）解析を、処置の２、６、および１２週間後に実施することができる。処置された眼では、１２週間後に、機能的および構造的改善が観察されることを仮定して、長期生存研究を後続させることもできる。屠殺時には、ＯＮＬ厚、外側部内の適正な局在化についてのスパイダーグラムおよび免疫組織学的ロドプシンアッセイ、ならびにロドプシンレベルについてのウェスタンブロットを含む、組織学的解析を実施することができる。

【0233】

ＡＡＶ５／ＣＲＩＳＰＲ処置のオフターゲット効果を、評価することができる。全ゲノムシークェンシングは、オフターゲット突然変異を評価するために、最もバイアスのかからない方法であり、標的部位を確認するために理想的であろう。ＡＡＶで処置された眼に由来するマウス網膜およびＡＡＶで処置されていない眼に由来するマウス網膜を採取し、解離させることができ、ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出することができ、ＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ ＡＦＡでせん断処理することができる。ＤＮＡ断片は、末端修復し、Ａテール処理し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のバーコード処理シークェンシングアダプターにライゲーションすることができる。ライゲーションされた産物は、バーコード処理全ゲノムシークェンシングライブラリーを作出するように、ＰＣＲにより増幅し、ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で、１５倍の平均値カバレッジまでシークェンシングすることができる。次いで、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒを、デフォルトパラメータによる「ｍｅｍ」モード（「ｂｗａ ｍｅｍ」）で使用して、シークェンシングリードを、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９／ＧＲＣｈ３７）に照らして配列決定することができる。ＣＲＩＳＰＲ切断イベントごとに、固有の突然変異が結果としてもたらされるため、ＤＮＡ二本鎖破断部位は、同じデノボの突然変異を結果としてもたらさないことが仮定される。こうして、複数の試料により共有される全ての変異体を棄却することにより、その後のバイオインフォマティクス解析におけるフィルタリングが可能となるであろう。

【0234】

参考文献
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本明細書で開示される主題が関する技術分野の当業者のレベルを指し示す。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各個別の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では、多数の特許出願、特許、および他の参考文献が言及されるが、このような参考文献は、これらの文献のうちのいずれかが、当技術分野における共通の一般的な知見の部分を形成することの容認を構成しないことが理解されるであろう。

【0235】

前出の主題について、理解の明確さを目的とする例示および例として、ある程度詳細に記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で、いくつかの変化および改変を実施しうることを理解するであろう。

【図1A】

【図1B-C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B-C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A-B】

【図7C-D】

【図8A-B】

【図8C-D】

【図9A-B】

【図10A-B】

【図10C-D】

【図10E】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A-B】

【図17】

【図18A-B】

【図18C】

【図19】

【配列表】

2017519500000001.app

【国際調査報告】