特表 2017-520268 ＲＮＡを高収率で単離するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-520268(P2017-520268A)

(43)【公表日】2017年7月27日

(54)【発明の名称】ＲＮＡを高収率で単離するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20170630BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2017-502197(P2017-502197)

(86)(22)【出願日】2015年7月17日

(85)【翻訳文提出日】2017年2月23日

(86)【国際出願番号】EP2015066447

(87)【国際公開番号】WO2016009059

(87)【国際公開日】20160121

(31)【優先権主張番号】14177538.7

(32)【優先日】2014年7月17日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】507214038

【氏名又は名称】キアゲン ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】レーペル， ダヴィド

(72)【発明者】

【氏名】シュタイネルト， ケルシュティン

(57)【要約】

試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法は、ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、ｉｉｉ）緩衝剤を含み、ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、タンパク質を沈殿させるステップと、ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含むステップと、ｃ）上清から核酸を単離するステップとを含む。タンパク質沈殿ステップの間の請求項に記載の有機溶媒の規定された濃度で使用することは、小ＲＮＡに加えて大ＲＮＡも含む上清を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を前記試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、前記沈殿混合物が、
ｉ）前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）前記上清から核酸を単離するステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記沈殿混合物が、２％〜１５％の濃度で前記有機溶媒を含み、前記有機溶媒が、水混和性である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

単離される前記核酸が、ＲＮＡであり、ステップｃ）が、前記上清から少なくとも小分子および／または大ＲＮＡを単離することを含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ステップｃ）が、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを前記上清に添加して、濃度≧３５％または≧４０％の前記アルコールを含む結合混合物を提供することと、
ｂｂ）前記結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させることであって、このステップｂｂ）後に、少なくとも大分子および小ＲＮＡが、前記固相に結合される、ことと、
ｃｃ）任意選択で、前記結合されたＲＮＡを洗浄することと、
ｄｄ）前記固相からＲＮＡを溶出することと
を含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

次の特徴：
ｉ）前記金属カチオン沈殿剤が、Ｚｎ^２＋もしくはＡｌ^３＋、好ましくはＺｎ^２＋であること、および／または
ｉｉ）前記金属カチオン沈殿剤が、溶液の形態で添加され、ステップａ）において提供される前記沈殿混合物が、２００ｍＭ〜６７５ｍＭ、２５０ｍＭ〜６５０ｍＭ、３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭもしくは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、および／または
ｉｉｉ）前記金属カチオン沈殿剤が、前記金属カチオン沈殿剤の溶解された塩を含む溶液の形態で添加されること
のうち１種または複数を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

次の特徴：
ｉ）ステップａ）において提供される前記沈殿混合物が、３％〜１５％、５％〜１４．５％、６％〜１４％、７％〜１３．５％、８％〜１３％、９％〜１２．５％もしくは９．５％〜１２％から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、
ｉｉ）前記有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒であること、
ｉｉｉ）前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）およびジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群から選択される非プロトン性極性溶媒であること、
ｉｖ）前記有機溶媒が、アルコールであるプロトン性溶媒であること、ならびに／または
ｖ）前記有機溶媒が、好ましくはエタノールおよびイソプロパノールから選択される水混和性アルコールであるプロトン性溶媒であること
のうち１種または複数を有する、請求項１〜５のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項7】

沈殿の間のｐＨ値が、≦５．５、≦５．２５、≦５、≦４．７５、≦４．５または≦４．４である、請求項１〜６のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項8】

ステップａ）が、前記試料に沈殿バッファーを添加することを含み、前記沈殿バッファーが、前記金属カチオン沈殿剤、前記有機溶媒および前記緩衝剤を含む、請求項１〜７のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項9】

前記沈殿バッファーが、次の特徴：
ｉ）０．７５Ｍ〜３Ｍ、１Ｍ〜２．８Ｍ、１．２５Ｍ〜２．７Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍもしくは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、
ｉｉ）１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％もしくは４０％〜５２．５％から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、および／または
ｉｉｉ）３〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５もしくは３．７５〜４．４から選択されるｐＨ値を有すること
のうち１種または複数を有する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

単離される前記核酸が、ＲＮＡであり、ステップｃ）において、ＲＮＡが、核酸結合固相を使用して単離され、少なくとも１種のアルコールおよび／または少なくとも１種のカオトロピック塩を使用して、ＲＮＡ結合条件を確立する、請求項１〜９のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項11】

ステップｃ）が、前記上清に少なくとも１種のアルコールを添加して、前記ＲＮＡ結合条件を確立することを含み、ステップｃ）において添加される前記アルコールが、次の特徴：
ｉ）１〜５個の炭素原子を有する分枝状もしくは非分枝状脂肪族アルコールであること、
ｉｉ）メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールならびにこれらの混合物から選択されること、
ｉｉｉ）イソプロパノールおよびエタノールから選択されること、ならびに／または
ｉｖ）イソプロパノールであること
のうち１種または複数を有する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記試料を破壊し、試料破壊を、前記金属カチオン沈殿剤および前記有機溶媒の添加に先立ち、ならびに／または前記沈殿混合物が調製されるのと同じとき／段階に行う、請求項１〜１１のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項13】

ｘ）前記試料を破壊するステップと、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を破壊された試料に添加して、
ｉ）前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有する
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、タンパク質を沈殿させるステップと、
ｂ）前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）前記上清から核酸を単離するステップと
を含むか、あるいは
ａ）少なくとも１種の破壊試薬、少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を前記試料に添加して、前記試料を破壊し、
ｉ）前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
ｖ）前記破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
ｂ）前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）前記上清から核酸を単離するステップと
を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記沈殿混合物が、２％〜１５％の濃度で前記有機溶媒を含み、前記有機溶媒が、水混和性である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

次の特徴：
ｉ）前記上清から全ＲＮＡが単離されること、
ｉｉ）富化された画分の形態で小ＲＮＡが単離されること、
ｉｉｉ）小ＲＮＡおよび大ＲＮＡを含む前記上清が、ゲノムＤＮＡをさらに含むこと、
ｉｖ）前記上清から全核酸が単離されること、
ｖ）前記上清から、ＲＮＡとは別個にゲノムＤＮＡが単離されること、ならびに／または
ｖｉ）ステップｃ）において、ＲＮＡが、シリカ、ポリケイ酸材料、ホウケイ酸塩、ケイ酸塩もしくはガラス等、ケイ素含有材料である核酸結合固相に結合されること
のうち１種または複数を有する、請求項１〜１４のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項16】

ｘ）前記試料を破壊するステップと、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を前記破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、前記プロトン性溶媒が、水混和性アルコールであり、前記沈殿混合物が、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭもしくは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）６．５％〜１４．５％、７％〜１４％、８％〜１３．５％、９％〜１３％もしくは９．５％〜１２％から選択される濃度で前記有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３〜５．２５、３〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５もしくは３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）前記上清から少なくとも小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを前記上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％で前記アルコールを含む結合混合物を提供することと、
ｂｂ）前記結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、このステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、前記固相に結合される、ことと、
ｃｃ）任意選択で、前記結合されたＲＮＡを洗浄することと、
ｄｄ）前記固相からＲＮＡを溶出することと
を含む、ステップと
を含む、ＲＮＡを単離するための、請求項１〜１５のうち一項または複数に記載の方法。

【請求項17】

ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤と、
ｂ）非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒と、
ｃ）少なくとも１種の緩衝剤と
を含む、タンパク質を沈殿させるための沈殿バッファーであって、３〜５．５の範囲であるｐＨ値を有する沈殿バッファー。

【請求項18】

前記有機溶媒が、水混和性であり、前記沈殿バッファーが、請求項１に記載の方法における沈殿バッファーとしての使用に適している、請求項１７に記載の沈殿バッファー。

【請求項19】

次の特徴：
ｉ）前記金属カチオン沈殿剤が、Ｚｎ^２＋およびＡｌ^３＋から選択され、好ましくは、Ｚｎ^２＋であること、
ｉｉ）前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４ジオキサン、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）およびジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群から選択される非プロトン性極性溶媒であること、
ｉｉｉ）前記有機溶媒が、アルコール、好ましくは、エタノールまたはイソプロパノール等の水混和性アルコールであるプロトン性溶媒であること、
ｉｖ）前記緩衝剤が、カルボン酸またはリン酸塩であるまたはこれに由来すること
のうち１種または複数を有する、請求項１７または１８に記載の沈殿バッファー。

【請求項20】

次の特徴：
ｉ）０．７５Ｍ〜３Ｍ、１Ｍ〜２．８Ｍ、１．２５Ｍ〜２．７Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍもしくは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、
ｉｉ）１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％もしくは４０％〜５２．５％から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、
ｉｉｉ）３〜５、３．２５〜４．７５もしくは３．４〜４．５から選択される範囲であるｐＨ値を有すること、
ｉｖ）３００ｍＭ〜２Ｍ、４００ｍＭ〜１．７５Ｍ、４５０ｍＭ〜１．５Ｍ、５００ｍＭ〜１．４Ｍ、５５０ｍＭ〜１．３Ｍおよび６００ｍＭ〜１．２５Ｍから選択される濃度で前記緩衝剤を含むこと
ならびに／または
ｖ）
ａａ）１．２５Ｍ〜２．８Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍもしくは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤としてＺｎ^２＋もしくはＡｌ^３＋、好ましくはＺｎ^２＋を含み、
ｂｂ）１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％もしくは４０％〜５２．５％から選択される濃度で非プロトン性極性有機溶媒もしくはプロトン性溶媒を含み、
ｃｃ）３．２５〜４．７５もしくは３．４〜４．５の範囲であるｐＨ値を有すること
のうち１種または複数を有する、請求項１７〜１９のうち一項または複数に記載の沈殿バッファー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料からＲＮＡ等の核酸を単離するための方法に関し、特に、フェノールフリーのＲＮＡ単離方法を使用することにより、タンパク質に富んだ試料を含む様々な試料から高収率で小ＲＮＡおよび大ＲＮＡを効率的に単離するための手段を提供する。

【背景技術】

【0002】

様々な組織、体液および他の生物学的試料からのほぼ２００ヌクレオチド程度またはそれに満たない程度の小核酸の研究は、極めて興味深い分野であり、将来にわたってそうであり続ける見込みがある領域である。小さな核酸として、両者共に遺伝子の発現に強力な影響を有し得る、とりわけマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および小さな干渉ＲＮＡ分子等、制限されないで小さなＲＮＡが特に挙げられる。さらに、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡプロセシングに含まれる他の小さな核ＲＮＡおよび小さな核小体ＲＮＡ（例えば、ｓｎＲＮＡおよびｓｎｏＲＮＡ）が重要である。さらに、５００ヌクレオチドまたはそれに満たない長さを有するＲＮＡ等の核酸も、多くの場合、他の試料に分解産物として含有され、そこから効率的に捕捉される必要がある。それぞれの小ＲＮＡにおいて高まる関心に伴い、標準的な単離手順は、小核酸の単離を容易にし、小核酸の収率を改善するように改変されている。小ＲＮＡは多くの場合、標準的方法を使用して有効に結合されないことから、全ＲＮＡの単離に使用される標準的プロトコールは通常、小ＲＮＡの単離に理想的ではないため、このような改変が必要であった。したがって、標準的手順を使用して単離される全ＲＮＡは通常、その後の分析に十分な量の小さなＲＮＡを含まない。このような低収率は、小さなＲＮＡが、核酸単離手順中に結合しないか、または失われることに起因し得る。したがって、所望の小ＲＮＡを含む全ＲＮＡの効率的な単離を可能にするか、または試料から小ＲＮＡ（より大きなＲＮＡなしで）を選択的に単離する方法が開発された。

【0003】

ｍｉＲＮＡ等、特に小さな一本鎖ＲＮＡ等、小ＲＮＡを単離するために設計された一般的な方法は、核酸結合固相への小ＲＮＡの効率的な結合を確実にするために、結合の間に≧４５％または好ましくは≧５０％の幾分高いアルコール濃度を必要とする。結合効率は、アルコール濃度増加と共に増加する。しかし、固相への効率的なＲＮＡ結合を確実にするために必要とされるこのような高いアルコール濃度は、単離手順を妨害する問題を引き起こす。特に、血漿、血清または組織試料等、タンパク質に富んだ試料を処理する場合、ＲＮＡ結合ステップの間に必要とされる高いアルコール濃度は、タンパク質が沈殿される事態をもたらし得る。これらの沈殿物は、例えば、固相に非特異的に結合し、これにより固相をブロックするため、単離手順を妨害する夾雑物であり、そして／または溶出液中に夾雑物として持ち込まれる。

【0004】

したがって、タンパク質に富んだ試料から小ＲＮＡを単離するための確立された方法は、小ＲＮＡの結合を可能にする結合条件を確立する前に、タンパク質除去ステップを含む。タンパク質除去技法は、例えば、フェノール／クロロホルム抽出またはタンパク質沈殿ステップを含む。他の方法は、プロテイナーゼＫによる消化等、時間のかかる酵素によるタンパク質消化ステップを採用する。あるいは、試料が大幅に希釈されるか、または結合の間のアルコール濃度が低下され、これは、単離効率が低下されるという問題点がある。これらの公知の方法に伴う問題については、この後にさらに詳細に記載する。

【0005】

フェノール／クロロホルムに基づく有機抽出方法は、多くの場合、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ方法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７年：Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１６２巻）：１５６〜１５９頁）に従って行われる。前記方法によると、ＲＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出の間に水相に濃縮され、その後、例えば、水相にアルコールを添加し、ＲＮＡを核酸結合固相に結合させることによりそこから単離される。前記ＲＮＡ結合ステップにおいて、高いアルコール濃度等、特殊な条件が同様に、単離される全ＲＮＡにおける小ＲＮＡを効率的に結合させ、これにより捕捉するために必要とされる。それぞれのフェノール／クロロホルム方法に基づく商業的キットは、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）である。フェノール／クロロホルム抽出後に、プロトコールは、より大分子のＲＮＡ（２００ヌクレオチド超）が、中等度のアルコール濃度（典型的には２５％）で第１の結合ステップにおいて核酸結合固相に結合される分画戦略に従う。フロースルーは、小ＲＮＡを含む。アルコール濃度が５０％超（典型的には５５％）まで上昇され、小ＲＮＡが第２の固相に結合され、そこから溶出することができる第２の結合ステップによって、前記小ＲＮＡは、フロースルーから捕捉される。さらに、小さなＲＮＡを含む全ＲＮＡが、フェノール／クロロホルム抽出後に得られた水相から単離されるプロトコールが、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ単離キットにより提供される。それによると、１ステップにおいて小ＲＮＡの効率的な結合を可能にするのに要求される量（典型的には５５％）までアルコール濃度を増加させることにより、結合条件が確立される。同様の方法は、ＷＯ２００５／０１２５２３およびＷＯ２００５／０５４４６６にも記載されている。しかし、これらのプロトコールにおいても同様に、有機フェノール／クロロホルム抽出ステップが通常、予め行われる。別のフェノール／クロロホルムに基づく商品は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）である。これは、様々な異なる生物学的試料から、小ＲＮＡを含む高品質かつ高収率の全ＲＮＡを提供する。

【0006】

一般に、フェノールに基づく単離手順は、試料組成またはタンパク質含量に関して相対的に感度が低い。しかし、試料は通常、５〜１０容量のフェノール含有溶液と組み合わされる。これは、処理が必要となる試料容量を相対的に高くする。したがって、初期試料容量は多くの場合幾分少なく、１００μｌ〜２００μｌの範囲にあり、５００μｌまで行くことはめったにない。特に、標的小ＲＮＡが、初期試料において低濃度で存在する場合、これは不利益となる。さらに別の不利益は、フェノールが溶出液へと持ち込まれ得ることである。さらに、各試料は、手作業で処理される必要がある。これらの技術的困難および限界に加えて、特に、フェノールの強い毒性は、不利益として認知されている。したがって、高い収率および品質での様々な試料からの小ＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離を可能にする、フェノールフリーのＲＮＡ単離方法の大きな需要がある。

【0007】

小ＲＮＡを含むＲＮＡを単離するためのフェノールフリーの方法も、先行技術において公知である。核酸結合固相への小ＲＮＡを含む全ＲＮＡの結合を可能にするために、多くの場合、高濃度のカオトロピック塩およびアルコールが使用される。通常、使用される核酸結合固相は、シリカを含むか、またはシリカからなる。しかし、アルコールおよびカオトロピック物質の存在下におけるシリカ表面へのＲＮＡの結合に基づく方法におけるｍｉＲＮＡ等の小ＲＮＡ種の回収は、非常に高いアルコール濃度を必要とする。通常、およそ少なくとも５０％アルコールが、結合混合物において使用され、通常範囲は、結合混合物における５０〜８０％（ｖ／ｖ）アルコールを含む。しかし、結合の間に高いアルコール濃度を使用するそれぞれのフェノールフリーのプロトコールを使用する場合、タンパク質に富んだ試料を処理するときに、全ＲＮＡ収率、また、得られる小ＲＮＡ収率は多くの場合低下し、これは、破壊された試料に高濃度のアルコールが添加される際に誘導されるタンパク質沈殿の結果であり得る。したがって、一部の方法は、初期試料容量を限定するか、またはＲＮＡ結合の間に使用されるアルコール濃度を低下させている（上述を参照）。両方の手段が、単離がタンパク質沈殿により妨害されるリスクを低下させる。しかし、結合が、低効率であるか、および／またはインプット試料容量低下が、単離することができる小核酸の全体的な濃度を低下させるという問題点を有するため、小核酸単離効率は低下する。よって、一般に、これらのプロトコールの性能は、残念ながら、フェノール／クロロホルムに基づく単離方法に匹敵しない。問題は、カラムに基づく方法により特に観察される。

【0008】

他のフェノールフリーの方法は、実際のＲＮＡ単離ステップに先立ち行われるタンパク質沈殿ステップを含む。タンパク質沈殿は、金属カチオンによって開始され、これは、タンパク質を選択的に沈殿させるための確立された方法である（例えば、Ｌｏｖｒｉｅｎ，Ｒ．Ｅ．およびＭａｔｕｌｉｓ、２００１年「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ．７巻：４．５．１〜４．５．３６頁を参照）。それぞれの方法は、ＥＰ２１６３６２２に記載されている。そこでは、異なる試料型からの≦２００ｎｔの長さを有する小ＲＮＡの単離が開示されている。金属カチオンは、タンパク質の沈殿に使用され、さらに、より大きな核酸が、タンパク質沈殿ステップの前または最中のいずれかで除去される。次に、上清へと高濃度の無極性プロトン性有機溶媒、例えば、ＴＨＦ等の有機溶媒を添加することにより、小ＲＮＡが、得られた上清からその後に単離される。この方法は、小ＲＮＡを選択的に単離し、多量のより大きなＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）およびゲノムＤＮＡは失われ、したがって、その後分析に利用できない。一部の顧客は、小ＲＮＡおよびｍＲＮＡ等のより大きなＲＮＡに関心があり、したがって、より大きなＲＮＡも目的である場合に余分な別々の単離手順を行う必要があるため、これは、大きな問題点である。さらに、小ＲＮＡの分析後に、より大きなＲＮＡの分析が所望の場合、新たな試料または現存する試料の新たな部分が、処理される必要があるであろう。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】国際公開第２００５／０１２５２３号

【特許文献2】国際公開第２００５／０５４４６６号

【特許文献3】欧州特許出願公開第２１６３６２２号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７年：Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１６２巻）：１５６〜１５９頁

【非特許文献2】Ｌｏｖｒｉｅｎ，Ｒ．Ｅ．およびＭａｔｕｌｉｓ、２００１年、Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ．７巻：４．５．１〜４．５．３６頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の目的は、先行技術方法の上述の不利益のうち少なくとも１種を克服する核酸単離方法、特に、ＲＮＡ単離方法を提供することである。特に、本発明の目的は、フェノールの使用を回避し、タンパク質に富んだ試料を含む異なる試料型で優れたＲＮＡ収率をもたらす、小さなＲＮＡと共に大きなＲＮＡの単離を可能にする方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

（発明の要旨）
本発明者らは、非プロトン性極性溶媒（例えば、ＤＭＳＯまたはＴＨＦ）およびプロトン性溶媒（例えば、イソプロパノールまたはエタノール）から選択される有機溶媒が、タンパク質沈殿ステップの間に１５％またはそれに満たない濃度で存在する場合、タンパク質枯渇上清から核酸を単離する前に金属カチオンで誘導されたタンパク質沈殿ステップを含む核酸単離方法が、有意に改善され得ることを見出した。沈殿物の除去後に、小さなＲＮＡ（２００ｎｔ未満）と共に大きなＲＮＡ（少なくとも１０００ｎｔ）と、試料に含有される場合は当然ながら中間サイズのＲＮＡを含むタンパク質枯渇上清が提供される。したがって、これらのＲＮＡ種は全て、例えば、全ＲＮＡの形態で、またはそれぞれがサイズ範囲である、所望のサイズのＲＮＡが富化された１種もしくは複数の別々の画分として、タンパク質枯渇上清から単離することができる。したがって、この方法は、ＲＮＡの単離に特に適する。さらに、実施例に示す通り、得られた上清からＤＮＡも単離され得る。これにより、単離しようとする核酸に関する柔軟性を使用者に与える、改善された核酸単離方法が提供される。

【0013】

第１の態様によれば、試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。

【0014】

方法は、試料からの標的核酸としてのＲＮＡの単離に特に適する。実施例は、本発明が、フェノールに基づく抽出ステップを含まない方法を使用して優れた収率でＲＮＡを単離することが特に困難な試料を含む様々な試料型から、ＲＮＡを単離するために高度に効率的な方法を提供することを示す。フェノールまたはクロロホルム等の水に不溶性の有機溶媒が、タンパク質の抽出に使用されない場合であっても、本方法は、匹敵する結果を提供する。方法は、金属カチオンで誘導される沈殿ステップ後に、小ＲＮＡ、大ＲＮＡおよび実施形態ではゲノムＤＮＡを含むタンパク質枯渇上清を提供する。次に、含有される核酸型のうち１種または複数は、上清から単離することができる。したがって、方法は、例えば、優れた収率による小および大ＲＮＡの単離を可能にし、これにより、使用者にさらなる柔軟性をもたらす方法を有利に提供する。フェノールの使用を回避しつつ匹敵するＲＮＡ収率をもたらす方法を提供することにより、本発明は、本技術分野に大いに寄与し、また、現存するフェノールフリーの、沈殿に基づくＲＮＡ単離方法を有意に改善する。さらに、本発明による核酸単離方法は、小および／または大ＲＮＡの単離を目指す、あるいは血液、血漿または血清等のタンパク質に富んだ試料を含む様々な試料からのかかるＲＮＡおよび同様にＤＮＡの並行単離を目指す、現存するプロトコールにおいて容易に実行することができる。

【0015】

第２の態様によれば、試料からタンパク質枯渇上清を提供するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、得られた上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと
を含む方法が提供される。

【0016】

第３の態様によれば、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤と、
ｂ）非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒と、
ｃ）少なくとも１種の緩衝剤と
を含む沈殿バッファーであって、３〜５．５の範囲であるｐＨ値を有する沈殿バッファーが提供される。

【0017】

前記沈殿バッファーは、例えば、破壊された生物学的試料からタンパク質を沈殿させ、これにより、沈殿物の分離後に、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡと、試料に含有される場合は中間サイズのＲＮＡも含むタンパク質枯渇上清を提供するために使用することができる。次に、含有されるＲＮＡは、例えば、全ＲＮＡの形態で、またはある特定のサイズ、それぞれサイズ範囲（例えば、２００ｎｔ未満または２００ｎｔよりも大きい）のＲＮＡが富化された１種もしくは複数の別々の画分として上清から単離することができる。前記沈殿バッファーは、特にＲＮＡ等の核酸を単離するためのキットに含まれてよい。

【0018】

本願の他の目的、特色、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者に明らかになるであろう。しかし、以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体的な実施例は、本願の好まれる実施形態を示しているが、単なる例示として提示されていることを理解されたい。開示されている発明の精神および範囲内の様々な変更および修正は、後述を読むことによって当業者に容易に明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１および図２は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイの定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。２種のプロトコール「沈殿」（ＸＰ）および「ｍｉＲＮｅａｓｙ」（ＱＩＡｚｏｌ）を使用したＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌにより（後者は、単離の間にフェノールを使用するプロトコールである）、血清および血漿から異なるｍｉＲＮＡ単離プロトコールを使用して得られた溶出液を分析した。標準偏差を含む８つの複製物から得られる平均値を示す。

【図2】図１および図２は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイの定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。２種のプロトコール「沈殿」（ＸＰ）および「ｍｉＲＮｅａｓｙ」（ＱＩＡｚｏｌ）を使用したＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌにより（後者は、単離の間にフェノールを使用するプロトコールである）、血清および血漿から異なるｍｉＲＮＡ単離プロトコールを使用して得られた溶出液を分析した。標準偏差を含む８つの複製物から得られる平均値を示す。

【図3】図３は、「ヒトｍｉＦｉｎｄｅｒ ３８４ＨＣ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲアレイ」分析のｑＲＴ−ＰＣＲ結果である。同じ試料材料から単離されたｍｉＲＮＡの６（ｍｉＲＮｅａｓｙ）および８（沈殿ＸＰ）つの複製物を分析した。このＰＣＲアッセイは、３７２種のｍｉＲＮＡを取り扱う。３５よりも小さい平均、正規化Ｃｔ値を互いに対して直接的にプロットした。示されている傾向線は、式ｙ＝１．００５１ｘに従い、決定の係数は、Ｒ^２＝８３．２％である。

【図4】図４は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果である。沈殿およびその後の結合の間に異なるＤＭＳＯおよびイソプロパノール濃度を使用した、血清からのＲＮＡ単離後に得られる溶出液に含有されるｍｉＲＮＡを分析した。条件毎に８つの複製物の平均値および対応する標準偏差が示されている。

【図5】図５は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＲＮＡ ６０００チップを使用した、溶出液の分析を示す。試料「ＲＮｅａｓｙ」、「ＱＩＡｚｏｌ」および「ＸＰ」を水で予め１：４に希釈した。

【図6】図６および図７は、ＲＴ^２ ＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果（図６）およびＮａｎｏｄｒｏｐ結果（図７）を示す。細胞溶解物から異なるＲＮＡ単離プロトコールを使用して得られる溶出液を分析した。個々の試料の得られたＣｔ値および対応する核酸濃度が示されている。

【図7】図６および図７は、ＲＴ^２ ＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果（図６）およびＮａｎｏｄｒｏｐ結果（図７）を示す。細胞溶解物から異なるＲＮＡ単離プロトコールを使用して得られる溶出液を分析した。個々の試料の得られたＣｔ値および対応する核酸濃度が示されている。

【図8A】図８ａおよび図８ｂは、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。追加的なオンカラムＤＮａｓｅ消化あり、またはなしで、プロトコール「沈殿」（ＸＰ）および「ｍｉＲＮｅａｓｙ」を使用して異なる組織型、ラット肝臓（Ａ）またはラット脳（Ｂ）から得られる同じ容量の溶出液を分析した。４つの複製物から得られる平均値および標準偏差が示されている。

【図8B】図８ａおよび図８ｂは、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。追加的なオンカラムＤＮａｓｅ消化あり、またはなしで、プロトコール「沈殿」（ＸＰ）および「ｍｉＲＮｅａｓｙ」を使用して異なる組織型、ラット肝臓（Ａ）またはラット脳（Ｂ）から得られる同じ容量の溶出液を分析した。４つの複製物から得られる平均値および標準偏差が示されている。

【図9】図９は、本発明による沈殿に基づく方法を使用して、また、ＤＭＳＯまたは水に加えて異なる水混和性有機溶媒を使用して得られた核酸含有溶出液のゲル電気泳動分離を示す。１．５μｌ溶出液を、未変性アガロースゲル（０．８％）において１２０Ｖで１時間分離した。図示されているマーカーは、ＤＮＡマーカーである。したがって、示されているｋｂ値は、図示されているｒＲＮＡバンドに直接的に転換できず、これは一般に、より高い分子量を有する。図９において、数字は次の意味を有する：１（マーカー）；２（ＤＭＳＯ）；３（アセトン）；４（ＴＨＦ）；５（１，４ジオキサン）；６（ＤＭＦ）；７（アセトニトリル）；８（ＮＭＰ）；９（イソプロパノール）；１０（エタノール）；１１（Ｈ_２Ｏ）；１２（ＤＭＳＯ）；１３（マーカー）。

【図10】図１０は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。沈殿バッファーにおいて異なる有機溶媒を使用した、血清からの異なるｍｉＲＮＡ調製物の溶出液を分析した。非プロトン性極性有機溶媒またはプロトン性溶媒のいずれかを使用して得られた全結果の平均値が示されている。

【図11】図１１は、本発明に従う沈殿方法を使用して得られた核酸含有溶出液のゲル電気泳動分離を示し、沈殿バッファーにおいて異なる酢酸ナトリウム代用物を検査した。核酸を細胞溶解物から単離した。１．５μｌの各溶出液を、未変性アガロースゲル（０．８％）において定常１２０Ｖで１時間分離した。酢酸ナトリウム代用物として、次の緩衝剤を同じ濃度で、同じｐＨ値にて検査した：クエン酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸アンモニウムおよび酢酸カリウム。さらに、ｉ）酢酸ナトリウムなしで（Ｈ_２Ｏ）、ｉｉ）沈殿後に酢酸ナトリウムが添加されたプロトコールにより（Ｈ_２Ｏ＋ＮａＯＡｃ）およびｉｉｉ）酢酸ナトリウムの代わりに塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が使用されたプロトコールにより、ＲＮＡを単離した。さらに、酢酸塩バッファーの緩衝剤代用物として沈殿バッファーにおける０．４Ｍ ＰＩＰＰＳ（ｐＨ４．３）を使用してＲＮＡを単離した。図１１において、数字は次の意味を有する：１（マーカー）；２（クエン酸塩）；３（ＭｇＯＡｃ）；４（ＮＨ_４ＯＡｃ）；５（ＫＯＡｃ）；６（ＮａＯＡｃ）；７（Ｈ_２Ｏ）；８（Ｈ_２Ｏ＋ＮａＯＡｃ）；９（ＮａＣｌ）；１０（ＮａＯＡｃ）；１１（ＸＰ（ＮａＯＡｃ））；１２（ＸＰ（ＰＩＰＰＳ））；１３（マーカー）。

【図12】図１２は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイの対照のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。沈殿バッファーにおける異なる酢酸ナトリウム代用物を使用した、血清からの異なるＲＮＡ単離物から得られる溶出液を分析した。

【図13】図１３は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイの対照のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。異なるｐＨ緩衝沈殿バッファーを使用した、血清からの異なるＲＮＡ単離プロトコールの溶出液を分析した。

【図14】図１４は、異なる濃度のＤＭＳＯおよび塩化亜鉛を含んだ沈殿バッファーを使用した、沈殿に基づくプロトコールにより得られた核酸含有溶出液のゲル電気泳動分離を示す。細胞溶解物からＲＮＡを単離した。１．５μｌの溶出液を、未変性アガロースゲル（０．８％）において定常１２０Ｖで１時間分離した。図１４において、数字は次の意味を有する：１（マーカー）；２（０％ＤＭＳＯ）；３（３．４％ＤＭＳＯ）；４（６．９％ＤＭＳＯ）；５（１０．４％ＤＭＳＯ）；６（１３．７％ＤＭＳＯ）；７（１７．２％ＤＭＳＯ）；８（２５．６％ＤＭＳＯ）；９（マーカー）；１０（５０ｍＭ ＺｎＣｌ_２）；１１（１４５ｍＭ ＺｎＣｌ_２）；１２（２９０ｍＭ ＺｎＣｌ_２）；１３（４３７ｍＭ ＺｎＣｌ_２）；１４（５８０ｍＭ ＺｎＣｌ_２）；１５（７３０ｍＭ ＺｎＣｌ_２）。

【図15】図１５および図１６は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。同じ容量の溶出液を分析した。異なるＤＭＳＯおよび亜鉛濃度を有する沈殿バッファーを使用して、血清から異なるＲＮＡ単離プロトコールから溶出液を得た。沈殿混合物における、したがって沈殿が生じた場合のこれらの構成成分の最終濃度を示す。

【図16】図１５および図１６は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイのｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。同じ容量の溶出液を分析した。異なるＤＭＳＯおよび亜鉛濃度を有する沈殿バッファーを使用して、血清から異なるＲＮＡ単離プロトコールから溶出液を得た。沈殿混合物における、したがって沈殿が生じた場合のこれらの構成成分の最終濃度を示す。

【図17】図１７は、有機溶媒としてＥｔＯＨまたはＤＭＳＯを使用した、異なるカオトロピック剤濃度を含む、破壊された試料からの沈殿に基づくプロトコールにより得られた核酸含有溶出液のゲル電気泳動分離を示す。Ｍ＝マーカー；沈殿混合物におけるカオトロピック剤濃度（Ｍ）をレーン毎に示す。

【図18】図１８は、異なる濃度のＤＭＳＯまたはＥｔＯＨを含んだ沈殿バッファーを使用した、沈殿に基づくプロトコールにより得られた核酸含有溶出液のゲル電気泳動分離を示す。Ｍ＝マーカー；レーン毎のパーセント値は、沈殿混合物におけるパーセントＤＭＳＯまたはＥｔＯＨを示す。

【図19】図１９は、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイの対照のｑＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。異なるｐＨ値の沈殿バッファーを使用した、血清からの異なるＲＮＡ単離物の溶出液を分析した。優れた収率でｍｉＲＮＡを単離した；ｍｉＲＴＣ＝逆転写対照；ＰＰＣ＝陽性ＰＣＲ対照。

【発明を実施するための形態】

【0020】

（発明の詳細な説明）
本発明は、沈殿後に、小および大ＲＮＡと、実施形態ではＤＮＡも含むタンパク質枯渇上清を提供する、ＲＮＡ含有試料を処理するための改善されたタンパク質沈殿に基づく方法を提供する。含有される核酸型のうち１種または複数はその後に、上清から単離することができる。タンパク質枯渇上清は、小および大ＲＮＡを含む異なる種類のＲＮＡ種を含み、したがって、単離される標的核酸に関するさらなる柔軟性を使用者にもたらすため、方法は、先行技術方法を上回る改善である。よって、異なる核酸の単離のために使用することができる一方法が提供される。

【0021】

Ａ．試料から核酸を単離するための方法
第１の態様によれば、試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清からＲＮＡを単離するステップと
を含む方法が提供される。

【0022】

続いて、各ステップおよびその好まれる実施形態について詳細に説明する。

【0023】

ステップａ） − タンパク質沈殿
ステップａ）において、試料を含有する沈殿混合物が調製され、タンパク質が沈殿される。試料は、好ましくは、生物学的試料であり、例えば、試料破壊が核酸放出に必要な場合は、破壊された試料であり得る。その後に記載される通り、試料破壊は、タンパク質沈殿ステップの間に行うこともできる。沈殿を開始するために、１種の（すなわち、少なくとも１種の）金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される１種の（すなわち、少なくとも１種の）有機溶媒が、試料に添加される。本明細書に記載されている濃度での、タンパク質沈殿ステップの間のかかる有機溶媒の取り込みは、その後に得られるタンパク質枯渇上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡ（先行技術方法と同様に）を含むのみならず、少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡをさらに含むという効果を有する。当然ながら、上清は、試料に含まれる場合は、中間サイズのＲＮＡ種を含むこともできる。方法の適用性が広がり、使用者は、異なる型のＲＮＡを単離することができるため、小さいのみならず、より大きなＲＮＡ種もタンパク質枯渇上清に含まれることが有利である。さらに、実施例において実証される通り、実施形態では、上清は、ＤＮＡも含む。

【0024】

タンパク質を沈殿させるための金属カチオン沈殿剤の使用は、先行技術において公知であり、適した金属カチオン沈殿剤についても記載されている（例えば、Ｌｏｖｒｉｅｎ，Ｒ．Ｅ．およびＭａｔｕｌｉｓ、２００１年「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ．７巻：４．５．１〜４．５．３６頁またはＥＰ２１６３６２２を参照）。タンパク質沈殿剤として作用することができるいずれかの金属カチオンは、本発明と併せて使用することができ、例として、Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ、ＺｎおよびＡｌのカチオンが挙げられるがこれらに限定されない。金属カチオン沈殿剤の組合せを使用することもできる。好ましくは、金属カチオン沈殿剤は、Ｚｎ^２＋またはＡｌ^３＋から選択される。実施例によって実証される通り、Ｚｎ^２＋およびＡｌ^３＋は、非常に迅速にタンパク質沈殿を開始し、低濃度であっても有効であるため、これらの金属カチオン沈殿剤は、利点を有する。Ｚｎ^２＋の使用が特に好まれる。

【0025】

金属カチオン沈殿剤は、好ましくは、金属カチオン沈殿剤の溶解された塩を含む溶液の形態で添加される。例えば、塩化物塩等、ハロゲン化物塩を使用することができる。ステップａ）において提供される沈殿混合物は、広範な濃度範囲で金属カチオン沈殿剤を含むことができる。実施例によって示される通り、沈殿混合物におけるおよそ５０ｍＭの濃度の塩化亜鉛は、すでにタンパク質の沈殿に既に十分である。２００ｍＭ〜６７５ｍＭ、２５０ｍＭ〜６５０ｍＭ、３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される、沈殿混合物における濃度が特に好まれる。実施例によって実証される通り、これらの濃度範囲は、多量の小および大ＲＮＡを含む上清を提供しつつ、タンパク質沈殿をもたらすのに特に適する。金属カチオン沈殿剤としてＺｎが使用される場合、これらの濃度範囲が、特に有用である。一実施形態によれば、２種またはそれを超える金属カチオン沈殿剤が、沈殿混合物に添加される場合、言及されている濃度は、沈殿混合物における金属カチオン沈殿剤の全体的な濃度を指す。一実施形態によれば、単一の金属カチオン沈殿剤、好ましくは、Ｚｎ^２＋を使用して、沈殿混合物を調製する。

【0026】

ステップａ）において提供される沈殿混合物は、１５％またはそれに満たない濃度で、非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される有機溶媒を含む。使用される有機溶媒は、水溶性有機溶媒である。２種またはそれを超えるそれぞれの有機溶媒が、沈殿混合物に含まれる場合、この濃度は、沈殿混合物における前記有機溶媒の全体的な濃度を指す。実施例によって実証される通り、本明細書に定義されている濃度で、タンパク質沈殿ステップの間にかかる有機溶媒を含むことは、タンパク質枯渇上清において、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡのみならず、少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡも含まれるという技術的な効果を有する。当然ながら、上清は、試料に含まれる場合、中間サイズのＲＮＡ種も含む。したがって、ｍＲＮＡも上清中に大量に保持され、先行技術方法（例えば、ＥＰ２１６３６２２に記載）とは対照的に、タンパク質と共に枯渇されず、よって、必要に応じて、得られた上清からその後に単離することができる。したがって、本方法は、タンパク質枯渇上清からの、異なるサイズ、それぞれサイズ範囲のＲＮＡの単離を可能にし、これは、方法の使用者に柔軟性をもたらす。しかし、実施例によって実証される通り、本明細書に定義されている有機溶媒が、正しい濃度で沈殿混合物に含まれることが重要である。既に少量の請求項に記載の請求項に記載の有機溶媒は本明細書に記載されている有利な技術的効果の達成に有効であり、よって、小および大ＲＮＡを含む上清をもたらす。しかし、沈殿混合物における例えば１７％または２５％等、より高い濃度で請求項に記載されている有機溶媒は、このような条件下では、大ＲＮＡは上清から再度枯渇されてしまうため、マイナスの効果を有する。

【0027】

ステップａ）において提供される沈殿混合物は、２％〜１５％、３％〜１５％、５％〜１４．５％、６％〜１４％、７％〜１３．５％、８％〜１３％、９％〜１２．５％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含むことができる。実施例に示す通り、これらの濃度範囲は、大量の小および大ＲＮＡを含むタンパク質枯渇上清をもたらすのに適する。当然ながら、上清は、試料に含まれる場合、中間サイズのＲＮＡ種も含む。上述の通り、請求項に記載の２種またはそれを超える異なる有機溶媒をステップａ）において使用することもできる。この場合、上に示されている濃度範囲は、沈殿混合物における前記有機溶媒の全体的な濃度を指す。一実施形態によれば、本明細書に定義されている単一の有機溶媒が、沈殿混合物を調製するために使用される。

【0028】

好まれる実施形態によれば、有機溶媒は、非プロトン性極性溶媒である。かかる有機溶媒の例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等のスルホキシド、アセトン等のケトン、アセトニトリル等のニトリル、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎｅ）（ＴＨＦ）および１，４ジオキサン等の環状エーテル、１−メチル−２−ピロリドン（ｐｙｒｏｌｉｄｏｎｅ）（ＮＭＰ）等のラクタム（ｌａｃｔａｍｅ）ならびにジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）等の三級カルボン酸アミドが挙げられるがこれらに限定されない。かかる非プロトン性極性溶媒は、水に混和性である。よって、非プロトン性極性溶媒は、スルホキシド、ケトン、ニトリル、環状エーテル、ラクタムおよび三級カルボン酸アミドから選択することができ、好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４ジオキサン、１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）およびジメチル−ホルムアミド（ＤＭＦ）から選択される。実施例によって実証される通り、これらの非プロトン性極性有機溶媒は全て、本方法の目的に適しており、小ＲＮＡ、大ＲＮＡ、さらに、特にゲノムＤＮＡ等の高分子量核酸を含むタンパク質枯渇上清をもたらす。したがって、小ＲＮＡ、大ＲＮＡ、中間サイズのＲＮＡ種およびゲノムＤＮＡを、これらの種類の核酸が初期試料に含有される場合、そこから単離することができるため、極性非プロトン性有機溶媒の使用は、広範囲の下流の応用に使用することができるタンパク質枯渇上清をもたらす。これは、方法の使用者に多くの柔軟性をもたらす。ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦおよびＮＭＰにより特に優れた結果が達成され、したがって、これらは、好まれる非プロトン性極性有機溶媒である。ＤＭＳＯ、そしてＮＭＰが特に好まれ、これらは、毒性低下に関する利点も有する。

【0029】

さらに、実施例によって実証される通り、有機溶媒は、プロトン性溶媒であることもできる。使用することができる極性プロトン性溶媒は、直鎖状または分枝状Ｃ１〜Ｃ５アルコールを含む。イソプロパノールおよびエタノール等、水混和性アルコールが好まれ、有機溶媒として使用することができる。メタノールもまた、水に混和性のアルコールである。これらの有機溶媒も、本明細書に記載されている濃度範囲で使用される場合、大量の小ＲＮＡおよび大ＲＮＡ、ならびに当然ながら試料に含有される場合は中間サイズのＲＮＡも含むタンパク質枯渇上清をもたらす。上述の通り、かかる有機溶媒のうち２種またはそれ超を使用することもでき、沈殿混合物におけるこれらの有機溶媒の全体的な濃度は、上述の範囲（単数または複数）内にある。

【0030】

ステップａ）において提供される沈殿混合物は、酸性ｐＨ値を有する。酸性ｐＨ値は、実施例に示す通り、有益な効果を有する。沈殿混合物のｐＨ値は、≦６、≦５．７５、≦５．５、≦５．２５、好ましくは、≦５、≦４．７５、≦４．５または≦４．４であり得る。適した範囲は、３〜５．５、３〜５．２５、３．２５〜５、好ましくは３．２５〜４．７５、３．５〜４．５または３．７５〜４．４を含む。

【0031】

酸性ｐＨ値を達成および／または維持するために、沈殿混合物は、少なくとも１種の緩衝剤を含む。実施例によって実証される通り、異なる緩衝剤が適しており、使用することができる。緩衝剤の組合せを使用することもできる。一実施形態によれば、緩衝剤は、カルボン酸であるまたはこれに由来する。カルボン酸は、モノ、ジまたはトリカルボン酸を含む。好ましくは、緩衝剤は、酢酸またはクエン酸であり、それぞれ、酢酸塩またはクエン酸塩である。実施例によって実証される通り、酢酸塩およびクエン酸塩は、異なる塩の形態で添加することができる。例えば、ナトリウムまたはカリウム塩等、アルカリ金属塩を使用することができる。一実施形態によれば、酢酸ナトリウムが緩衝剤として使用される。さらに、ＰＩＰＰＳ等、リン酸塩バッファーを使用することもできる。緩衝剤は、沈殿混合物のｐＨ値を上述の範囲内に維持することができる濃度で使用される。一実施形態によれば、沈殿混合物は、６０ｍＭ〜４００ｍＭ、７５ｍＭ〜３７５ｍＭ、１００ｍＭ〜３５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜３００ｍＭおよび１５０ｍＭ〜２７５ｍＭから選択される範囲である濃度で緩衝剤を含む。実施例によって実証される通り、これらの濃度範囲は、カルボン酸、それぞれ、酢酸ナトリウム等のカルボン酸の塩に特に適する。１２５ｍＭ〜３００ｍＭまたは１５０ｍＭ〜２７５ｍＭの範囲である濃度は、特に優れた結果を達成する。

【0032】

好まれる実施形態によれば、ステップａ）は、試料に沈殿バッファーを添加するステップであって、前記沈殿バッファーが、少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤、上に定義されている少なくとも１種の有機溶媒および少なくとも１種の緩衝剤を含む、ステップを含む。金属カチオン沈殿剤、有機溶媒および緩衝剤に関する詳細は、上に記載されている。上清に小および大ＲＮＡを維持しつつタンパク質沈殿、したがってタンパク質枯渇を達成するのに必要とされる作用剤が、試料に添加される１つのバッファーに含有されているため、本実施形態は簡便である。試料は、一実施形態では、破壊された試料である。

【0033】

沈殿バッファーの組成は、意図される容量の沈殿バッファーをある特定の容量の破壊された試料であり得る試料に添加する場合、上述の濃度の金属カチオン沈殿剤および有機溶媒を含む沈殿混合物がもたらされるようなものである。ある特定の実施形態では、破壊された試料であり得る試料は、１：１〜１：２０（沈殿バッファー：試料）の範囲の比で沈殿バッファーと混合される。特に、比は、１：１．５〜１：１２、好ましくは１：２〜１：８、より好ましくは１：２．５〜１：５、最も好ましくは１：３〜１：４（沈殿バッファー：試料）の範囲であることができる。特異的な実施形態では、沈殿バッファーは、約１：３．３７（沈殿バッファー：試料）の比で、破壊された試料であり得る試料に添加される。

【0034】

沈殿混合物の条件を確立するために、一実施形態によれば破壊された試料である試料に添加される沈殿バッファーは、好ましくは、溶解された塩の形態で金属カチオン沈殿剤を含む。例えば、塩化物塩等のハロゲン化物塩を使用することができる。金属カチオン沈殿剤塩は、０．７５Ｍ〜３Ｍ、１Ｍ〜２．８Ｍ、１．２５Ｍ〜２．７Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍまたは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で沈殿バッファーに含まれてよい。実施例によって実証される通り、それぞれの濃度で金属カチオン沈殿剤を含む沈殿バッファーの使用は、優れた結果をもたらす。適した金属カチオン沈殿剤については、上に記載されており、好ましくは、Ｚｎ^２＋およびＡｌ^３＋から選択される金属カチオン沈殿剤が使用される。例えば、塩化亜鉛として添加され得るＺｎ^２＋が最も好まれる。

【0035】

沈殿バッファーは、１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％または４０％〜５２．５％から選択される濃度で有機溶媒を含むことができる。有機溶媒の適切な例は、上に記載されており、実施例からも明らかである。有機溶媒は、水混和性である。好ましくは、有機溶媒は、ＤＭＳＯ等、非プロトン性極性溶媒である。プロトン性有機溶媒のうち、エタノールおよびイソプロパノール等、水混和性アルコールが好まれる。

【0036】

沈殿バッファーは、３〜５．５、３〜５．２５、３．２５〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５および３．７５〜４．４から選択されるｐＨ値を有することができる。３〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５または３．７５〜４．４のｐＨが特に適している。沈殿バッファーは、好ましくは、沈殿混合物におけるそれぞれのｐＨ値の確立および／または維持に適している。実施例によって実証される通り、それぞれの酸性ｐＨ値を有するおよび維持する沈殿バッファーの使用は、特に、血漿または血清等のタンパク質に富んだ試料を処理する場合に、有利な結果をもたらす。沈殿混合物におけるそれぞれのｐＨ値の維持に使用することができる緩衝剤の適切な例は、上に記載されており、実施例からも明らかである。一実施形態によれば、沈殿バッファーは、３００ｍＭ〜２Ｍ、４００ｍＭ〜１．７５Ｍ、４５０ｍＭ〜１．５Ｍ、５００ｍＭ〜１．４Ｍ、５５０ｍＭ〜１．３Ｍおよび６００ｍＭ〜１．２５Ｍから選択される濃度で緩衝剤を含む。先に言及された濃度範囲において使用することができる酢酸塩またはクエン酸塩等のカルボン酸塩、例えば、アルカリ金属塩が特に好まれる。５５０ｍＭ〜１．３Ｍ、６００ｍＭ〜１．２５Ｍまたは６５０ｍＭ〜１．２Ｍの範囲である濃度が特に好まれる。

【0037】

沈殿混合物が提供されると、試料に含有されるタンパク質が沈殿する。沈殿は、例えば、撹拌によって支援することができる。撹拌として、ボルテックス、振盪、反転およびピペッティングで出し入れが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、試料は、冷却する、例えば、実施例にも記載されている通り、氷上で貯蔵することができる。

【0038】

上述の通り、沈殿混合物は、上に定義されている金属カチオン沈殿剤および有機溶媒を核酸含有試料に添加することにより調製される。適したＲＮＡ含有生物学的試料の非限定的な例についても後述する。本方法は、タンパク質に富んだ試料からのＲＮＡの単離に特に適している。必要であれば、試料を破壊する。したがって、一実施形態によれば、方法は、試料を破壊するステップを包含する。これにより、特にＲＮＡ等の核酸が放出され、その後の核酸単離ステップに利用し易くなる。

【0039】

試料を破壊するために、種々の方法を使用することができる。用語「破壊する」または「破壊」は、本明細書において広義で使用され、試料の溶解を特に包含する。それぞれの溶解ステップにおいて、特にＲＮＡ等の生体分子が、細胞から放出されるか、または例えば、タンパク質等、他の試料構成成分から解放されて、これにより、ＲＮＡを単離のために利用し易くすることができる。特に核酸等の生体分子が、細胞から放出されるか否か、または溶解が、例えば、試料に含まれるタンパク質もしくは他の物質から核酸等の生体分子を放出するために行われるか否かとは無関係に、本明細書において、これはそれぞれの破壊ステップ、一般に、溶解ステップとも称される。したがって、試料は、細胞を含むことができるか、または例えば血漿の場合と同様に、細胞を全く含まないもしくはごく少量の細胞を含むことができる。

【0040】

試料を溶解するために、種々の方法を使用することができ、適した溶解方法が、先行技術において周知である。好ましくは、試料は、破壊、それぞれ、溶解のために、１種または複数の溶解剤と接触させる。これらは、溶解バッファー等、破壊試薬に含有され得る。ＲＮＡは、溶解の間にヌクレアーゼによる分解から保護される必要がある。選択された溶解条件は、処理するべき試料の種類に応じて変動することもできる。一般に、溶解手順として、試料における機械的、化学的、物理的および／または酵素的作用を挙げることができるがこれらに限定されない。例として、ビーズミルにおけるもしくはガラスビーズの存在下での試料の粉砕、試料のホモジナイズ、超音波の適用、加熱、１種もしくは複数の洗剤の添加、および／または例えばタンパク質分解酵素もしくは塩等のタンパク質分解化合物の添加が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ベータ−メルカプトエタノールまたはＤＴＴ等の還元剤を溶解のために添加して、例えば、ヌクレアーゼの変性を支援することができる。一実施形態によれば、好ましくは少なくとも１種のカオトロピック塩等、少なくとも１種のカオトロピック剤が、試料の溶解、したがって破壊に使用される。適したカオトロピック剤および特に適したカオトロピック塩は、当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。本明細書に記載されている通り、溶解のためのカオトロピック塩の使用は、ステップｃ）における適した核酸結合条件の確立をさらに支持することができるカオトロピック塩の導入を可能にするという利点を有する。

【0041】

実施例によって実証される通り、試料破壊は、金属カチオン沈殿剤および有機溶媒の添加に先立ち行うことができるが、沈殿混合物が調製されるのと同じときにそれぞれの段階で行うこともできる。処理されるべき試料に依存して、溶解／結合組成物は、沈殿混合物の調製後に添加することもできる。しかし、血液または血清等、複雑な試料を処理する場合、ＲＮＡ収率を低下し得るため、本実施形態は、あまり好まれない。

【0042】

よって、一実施形態によれば、試料は、ステップａ）において金属カチオン沈殿剤および有機溶媒が添加されるのと同じときにそれぞれの段階で破壊する。本実施形態において、試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の破壊試薬、少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加して、試料を破壊し、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
ｖ）破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。

【0043】

使用することができる溶解バッファー等の適した破壊試薬は、当業者に周知であり、本明細書にも記載されている。かかる破壊試薬は、例えば、沈殿バッファーとは別々に添加することができるか、またはその後に沈殿バッファーおよび破壊試薬の混合物をステップａ）において試料に添加するように、予め沈殿バッファーと混合することができる。一実施形態によれば、破壊試薬は、カオトロピック塩を含む。適切な例は公知であり、本明細書にも記載されている。

【0044】

好まれる実施形態によれば、試料は、ステップａ）において金属カチオン沈殿剤および有機溶媒を添加する前に破壊する。本実施形態によれば、試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
ｘ）試料を破壊するステップと、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を破壊された試料に添加して、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有する
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。

【0045】

一実施形態によれば、試料を破壊するため、破壊しようとする試料と、これに加えて、０．５Ｍ〜飽和、０．７５Ｍ〜５Ｍ、１Ｍ〜４．５Ｍおよび１．２５Ｍ〜４．２５Ｍからなる群から選択される濃度のカオトロピック剤、好ましくはカオトロピック塩とを含む破壊組成物が提供される。カオトロピック塩として、グアニジウム塩酸塩、グアニジウムチオシアン酸塩（またはグアニジウムイソチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ））等のグアニジウム塩、またはチオシアン酸塩、ヨウ化物、過塩素酸塩、トリクロロ酢酸塩もしくはトリフルオロ酢酸塩（ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔａｔｅ）その他を含むカオトロピック塩が挙げられるがこれらに限定されない。かかるカオトロピック塩は、例えば、ナトリウムまたはカリウム塩として提供することができる。好ましくは、カオトロピック塩は、ＧＴＣ（ＧＩＴＣ）または等しく強いカオトロピック塩である。組成物に含まれるＲＮＡを酵素による分解から効率的に保護することもできるため、それぞれの強いカオトロピック塩が有利である。尿素を使用して、試料の破壊を支持することもできる。一実施形態によれば、破壊組成物は、ステップｘ）において、したがって、ステップａ）において金属カチオン沈殿剤および有機溶媒を前記破壊組成物に添加する前に提供される。

【0046】

さらに、溶解の間に、キレート剤、ヌクレアーゼ阻害剤、特に、ＲＮａｓｅ阻害剤またはＤＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡおよびＤＮＡの並行単離が企図される場合）その他等、他の添加物を添加することもできる。試料の溶解の支持および放出された核酸、特に、放出されたＲＮＡの保護に使用することができるそれぞれの添加物は、先行技術において周知であり、よって、本明細書において詳細に記載する必要はない。

【0047】

ステップｘ）において試料から得られる破壊された試料は、任意選択で、ステップａ）において沈殿混合物を調製する前にさらに処理することもできる。例えば、溶解物をホモジナイズすることができる；ホモジナイゼーションは、破壊／溶解プロセスそれ自体中に行うこともできる。さらに、細胞デブリを除去するために、溶解物を清澄化することができる。溶解物清澄化方法は、細胞デブリおよび他の夾雑物の濾過および／または例えば、イオン性基、特に、カルボキシル基等のアニオン性基を保有する表面等の適切な表面への結合を含むことができる。

【0048】

本発明の方法は、タンパク質分解性消化と組み合わせることができる。タンパク質分解性消化が行われる場合であっても、本発明の沈殿に基づく方法は、残渣タンパク質を枯渇させることにより、結果をさらに改善することができる。用語「タンパク質」は、本明細書において、ペプチドも包含する。しかし、本発明の利点は、時間のかかるタンパク質分解性酵素による消化ステップを必要としないことである。したがって、一実施形態によれば、試料の破壊は、タンパク質分解性酵素の使用を含まない。タンパク質分解性酵素は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドにおけるペプチド結合の切断を触媒する酵素を指す。例示的なタンパク質分解性酵素として、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特に、スブチリシン、スブチラーゼ、アルカリセリンプロテアーゼその他が挙げられるがこれらに限定されない。スブチラーゼは、セリンプロテアーゼ、すなわち、活性部位におけるセリン残基による酵素のファミリーである。スブチリシンは、広範な基質特異性を有する細菌セリンプロテアーゼである。スブチリシンは、尿素および塩酸グアニジン等のカオトロピック剤ならびにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等のアニオン性洗剤による変性に対して相対的に抵抗性である。例示的なスブチリシンとして、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、スブチリシン、スブチリシンＡ、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼその他が挙げられるがこれらに限定されない。

【0049】

ステップｂ） − 沈殿物の除去

【0050】

ステップｂ）において、形成された沈殿物は、本明細書において「上清」と称される残る試料から分離される。分離は、例えば、沈降、遠心分離または濾過等、様々な手段によって支援することができる。用語「上清」は、特に、形成された沈殿物が除去された沈殿混合物を記載するために、本明細書において使用される。したがって、用語「上清」は、沈殿物分離のある特定のモードによって得られた、特異的な沈殿物が枯渇された沈殿混合物に限定されない。よって、用語「上清」は、例えば、槽の底に沈殿物が収集され、残る試料が上清として除去される実施形態と共に、沈殿混合物がフィルターに通されて、形成された沈殿物を除去し、フロースルーの形態で残る試料を回収する実施形態を包含する。

【0051】

実施例によって実証される通り、本発明による方法において使用される沈殿条件によって、得られる上清は、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡと、これに加えて、少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む。当然ながら、本来の試料に含まれる場合、中間サイズのＲＮＡも、前記上清に含まれる。一実施形態によれば、得られる上清は、本来の試料に含有される少なくとも１０００ｎｔの長さを有するＲＮＡ分子の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％を含む。大ＲＮＡ回収率も同様に高いことも判明した。よって、先行技術の沈殿に基づく方法とは対照的に、本方法は、優れた収率での大ＲＮＡ分子の回収および単離を可能にする。さらに、ゲノムＤＮＡ等、高分子量核酸は、使用される沈殿条件に応じて前記上清に含まれ得る。

【0052】

ステップｃ） − 上清からの核酸の単離

【0053】

ステップｃ）において、核酸は、得られた上清から単離される。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはその両方であり得る。得られた上清から目的の１種または複数の標的核酸（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）を単離するため、先行技術で公知の方法を使用することができる。適した単離方法の例として、シリカに基づく精製方法、磁性粒子に基づく精製方法、クロマトグラフィーに基づく精製手順、アニオン交換クロマトグラフィー（カラムまたは磁性粒子等、アニオン交換表面を使用）、沈殿およびこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ等、標的核酸のうち１種または複数は、適切な結合条件を使用して核酸を固相に結合させることにより、上清から単離される。固相は、例えば、シリカ結合表面を提供することができる、または目的の核酸に結合することができるアニオン交換官能基を保有することができる。後者の実施形態に関して、例えば、電荷スイッチ原理に基づく単離方法を使用することができる。

【0054】

好ましくは、少なくともＲＮＡが、上清から単離される。得られた上清からＲＮＡを単離するために、先行技術で公知の方法を使用することができる。本発明による方法は、上清が、小および大ＲＮＡを含むという利点を有する。したがって、使用者は、目的の標的ＲＮＡに応じて、上清から小ＲＮＡ、大ＲＮＡまたはその両方のいずれかを単離することができる。小および大ＲＮＡは、別々の画分において単離することができるか、または上清から全ＲＮＡもしくは全核酸の形態で単離することができる。当然ながら、試料に含まれる場合、中間サイズのＲＮＡも上清に含まれ、例えば、大ＲＮＡおよび／または小ＲＮＡと共に単離することができる。

【0055】

好ましくは、ＲＮＡは、これをアルコール等の有機溶媒の存在下で核酸結合固相に結合させることにより単離される。固相への結合は、結合混合物におけるカオトロピック塩の存在下で増強され得る。非限定的な実施形態について後に記載する。

【0056】

一実施形態によれば、全ＲＮＡが上清から単離され、前記全ＲＮＡは、小および大ＲＮＡと、中間サイズのＲＮＡを含む。本実施形態では、ステップｃ）は、好ましくは、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、≧３５％、好ましくは≧４０％、より好まれる≧４５％の濃度でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡを核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）任意選択で、結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む。

【0057】

大ＲＮＡおよび小ＲＮＡならびに当然ながら中間サイズのＲＮＡが、高濃度のアルコールの存在下で核酸結合固相に結合することができることは、十分に確立された原理である。したがって、本方法は、本実施形態では、小ＲＮＡ、大ＲＮＡおよび中間サイズのＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離を可能にする。それぞれの方法は、本発明の背景においても記載されている。

【0058】

結合ステップの間の結合混合物における少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、より好まれる少なくとも４５％または少なくとも５０％のアルコール濃度の使用は、核酸結合固相への小ＲＮＡの結合を可能にするＲＮＡ結合条件が確立されるという効果を有する。ここで、驚くべきことに、先行技術で一般的に使用されるよりも低いアルコール濃度を本方法と併せて使用して、固相への小ＲＮＡの結合を達成することもできることが判明した。理論に制約されることは望まないが、これは、沈殿混合物において使用される有機溶媒が、適した結合条件の確立に寄与するせいであると考えられる。当然ながら、より長いＲＮＡ分子も、このような条件下で結合することができ、よって、全ＲＮＡにおいて捕捉される。

【0059】

アルコールは、１〜５個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状脂肪族アルコールであり得、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールならびにこれらの混合物から選択することができる。アルコールの混合物を使用することもできる。好ましくは、イソプロパノールおよび／またはエタノールは、結合条件を確立するためのアルコールとして使用される。これらのアルコールは、破壊された試料から小および大ＲＮＡを単離するために一般的に使用される。イソプロパノールが特に好まれる。予め行われるタンパク質沈殿ステップのおかげで、結合ステップの間にタンパク質が沈殿するリスクおよび例えば、核酸結合固相の詰りまたはＲＮＡ結合への他の仕方での干渉が低下するため、結合混合物において高いアルコール濃度を使用することができる。これは、収率に関して有益である。結合混合物におけるアルコール濃度は、≧５０％（ｖ／ｖ）、≧５５％（ｖ／ｖ）または≧６０％（ｖ／ｖ）であり得る。結合混合物におけるアルコール濃度に適した範囲として、≧４０％（ｖ／ｖ）〜≦８０％（ｖ／ｖ）、≧４５％（ｖ／ｖ）〜≦７５％（ｖ／ｖ）、≧５０％（ｖ／ｖ）〜≦７０％（ｖ／ｖ）および≧５５％（ｖ／ｖ）〜≦６５％（ｖ／ｖ）が挙げられるがこれらに限定されない。ステップａａ）においてそれぞれのアルコール濃度を使用することができる。論じられている通り、エタノールおよびイソプロパノールが好まれる。

【0060】

一実施形態によれば、核酸結合固相へのＲＮＡの結合は、結合混合物においてカオトロピック塩を取り込むことにより増強される。カオトロピック塩に適した濃度は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている。

【0061】

一実施形態によれば、ステップａａ）の結合混合物は、０．１Ｍから飽和限界までの範囲である濃度でカオトロピック塩を含む。濃度は、０．２Ｍ〜５Ｍ、０．２５Ｍ〜４．５Ｍ、０．３Ｍ〜４．２５Ｍ、０．３５〜４Ｍおよび０．４Ｍ〜３．７５Ｍから選択することができる。より高濃度のカオトロピック塩は、ＲＮＡの収率を増加させるのに好都合であり得る。カオトロピック塩として、グアニジウム塩酸塩、グアニジウムチオシアン酸塩（またはグアニジウムイソチオシアン酸塩（ＧＩＴＣ））等のグアニジウム塩、またはチオシアン酸塩、ヨウ化物、過塩素酸塩、トリクロロ酢酸塩もしくはトリフルオロ酢酸塩その他を含むカオトロピック塩が挙げられるがこれらに限定されない。カオトロピック塩の混合物を使用することもできる。かかるカオトロピック塩は、例えば、ナトリウムまたはカリウム塩として提供することができる。好ましくは、カオトロピック塩は、ＧＴＣもしくはＧＩＴＣまたは等しく強いカオトロピック塩である。溶解のためのカオトロピック剤、特にカオトロピック塩の使用は、試料の破壊に好まれるため、結合混合物中に存在するカオトロピック塩は、溶解の間に導入されていてよい。詳細は上に記載されている。この手順は、実施例においても使用した。カオトロピック塩を結合混合物に導入するため、またはＲＮＡ結合ステップの間にカオトロピック塩の濃度を増加させるために、カオトロピック塩は、ステップｃ）の間に添加してもよい。よって、ＲＮＡ単離ステップｃ）においてさらなる量のカオトロピック塩を添加することにより、結合のためのカオトロピック塩の濃度を増加させることも本発明の範囲内である。さらに、例えば、洗剤等、追加的な添加物を添加して、ＲＮＡ結合を改善することができる。

【0062】

ステップｂｂ）において、ステップａａ）から得られる結合混合物に含有される小および大ＲＮＡならびに中間サイズのＲＮＡは、核酸結合固相に結合される。ＲＮＡ結合に適した固相は、当業者に公知である；例示的な適した核酸結合固相については後にも記載する。一実施形態によれば、ステップａａ）から得られる結合混合物は、ステップｂｂ）において固相と接触させる。本実施形態は、カラムに含まれる核酸結合相が使用される場合に特に適する。カラムに基づく手順が使用される場合、小ＲＮＡを含む全ＲＮＡを固相に結合させるために、ステップｂｂ）において核酸結合固相を使用することができる。粒子が使用される場合、粒子は、ステップａａ）において既に存在していても、ステップｂｂ）において導入されてもよい。

【0063】

小ＲＮＡを含むＲＮＡが、ステップｂｂ）において核酸結合固相に結合された後に、結合されたＲＮＡをステップｃｃ）において任意選択で洗浄することができる。この目的のため、一般的な洗浄溶液を使用することができる。一実施形態によれば、洗浄に使用される溶液は、少なくとも１種のカオトロピック剤および／または少なくとも１種のアルコールを含む。洗浄溶液において使用することができるカオトロピック剤として、グアニジウム塩酸塩、グアニジウムチオシアン酸塩、グアニジウムイソチオシアン酸塩およびヨウ化ナトリウム等、カオトロピック塩が挙げられるがこれらに限定されない。他のカオトロピック塩は、上にも記載されている。アルコールとして、好ましくは１〜５個の炭素原子を有する短鎖分枝状または非分枝状アルコールを、それぞれ洗浄溶液において洗浄のために使用することができる。例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールである。好ましくは、イソプロパノールおよび／またはエタノールが使用される。しかし、カオトロピック剤を含まない洗浄溶液を使用することもできる。

【0064】

上に記載されている洗浄溶液に代えてまたはさらにこれに加えて使用することができる適した洗浄溶液の例は、アルコールおよびバッファーを含む。適したアルコールは、上に記載されている。好ましくは、イソプロパノールまたはエタノール、最も好まれるエタノールがこの洗浄ステップに使用される。好ましくは、少なくとも６０％（ｖ／ｖ）、少なくとも７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールが使用される。一実施形態によれば、洗浄に使用される溶液は、少なくとも１種のカオトロピック剤、少なくとも１種のアルコール、少なくとも１種の洗剤および／または少なくとも１種の緩衝剤を含む。Ｔｒｉｓまたはクエン酸塩等、適した緩衝剤を使用することができる；適した緩衝剤は、当業者にも公知である。

【0065】

上に記載されている任意選択の１回または複数の洗浄ステップに先立ちまたはその後のいずれかに、ＤＮａｓｅ消化を行うことができる。かかるＤＮａｓｅ消化は、例えば、ＲＮＡが、核酸結合固相に結合されている間に行うことができる。ＲＮＡのみが目的の核酸である場合、これにより、単離されたＲＮＡにおけるゲノムＤＮＡ混入の量を低下させることができる。それぞれのＤＮａｓｅ消化の実行に適した実施形態は、本明細書に記載されており、先行技術においても公知である。それぞれのＤＮａｓｅ消化ステップは、任意選択である。ＲＮＡが核酸結合固相に結合されている間のＤＮａｓｅ消化の実行に使用される条件は、ＲＮＡおよび特に小ＲＮＡが、核酸結合固相から部分的に放出されるという結果をもたらす場合がある。したがって、潜在的に放出される小ＲＮＡが、核酸結合固相に再結合されることを確実にして、小ＲＮＡの高回収を確実にすることが好まれる。使用される核酸結合固相の種類、例えば、カラムに基づくまたは粒子に基づくアプローチが使用されるかに応じて、異なる手順が実行可能である。磁性粒子等、粒子が核酸結合固相として使用される場合、任意選択のＤＮａｓｅ消化を行った後に、カオトロピック剤およびアルコールを添加し、これにより、粒子への小ＲＮＡの再結合を可能にする結合条件を確立することができる。この目的のため、例えば、カオトロピック塩および／またはアルコールを含む溶液を使用することができる。それぞれの溶液は、洗浄溶液として用いることもできる。再結合のためにアルコール濃度を増加させるために、追加的なアルコールを別々に添加することもできる。適したアルコール、アルコール濃度、カオトロピック塩およびカオトロピック濃度は、ステップｃ）と併せて上に記載されている。同じ条件を再結合のために使用することができる。カラムに基づく核酸結合固相が使用される場合、ＲＮＡが固相に結合されている間に任意選択のＤＮａｓｅ消化（多くの場合、オンカラムＤＮａｓｅ消化とも称される）を行った後に、次のステップを行うことが好まれる：
− ＤＮＡａｓｅ消化の間にフロースルーとして核酸結合固相から放出された可能性がある小ＲＮＡを収集するステップ、
− 前記核酸結合固相へと含有される小ＲＮＡを再結合させるために、回収溶液と混合された小ＲＮＡを含む前記フロースルーを、核酸結合固相と接触させるステップ。

【0066】

オンカラムＤＮａｓｅ消化の間に部分的に放出された可能性があるＲＮＡが、核酸結合固相に再結合することを確実にするために、また、放出された小ＲＮＡをフロースルーとして収集するために、ＤＮａｓｅ消化が完了した後に回収溶液をカラムに通すことが好まれる。回収溶液によって確立された条件下で再結合することができるＲＮＡは、核酸結合固相に緊密に再結合され、「エスケープされた」小ＲＮＡは、フロースルーとして収集することができ、よって、再アプライすることができ、したがって、核酸固相に再結合させることができる。これは、オンカラムＤＮａｓｅ消化が行われる場合であっても、小ＲＮＡが失われることを防止する。オンカラムＤＮａｓｅ消化後のそれぞれの再結合ステップに関する詳細は、本明細書に参照によって組み込まれるＷＯ２０１２／０２８７３７に記載されている。潜在的にエスケープされた小ＲＮＡを核酸結合固相に再結合させた後に、再度１回または複数の洗浄ステップを行うことができる。適した条件は、上に記載されている。

【0067】

固相からＲＮＡを溶出するために溶出ステップを行うことが所望の場合、溶出は、例えば、水、溶出バッファー、特に低塩溶出バッファー等、古典的な溶出溶液により達成することができる。溶出バッファーは、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンその他等、生物学的バッファーを含むことができる。それぞれの溶出ステップは、ステップｄｄ）において行うことができる。好ましくは、意図される下流の応用に干渉しない溶出溶液が使用される。溶出後に、溶出液を熱変性させることができる。しかし、例えば、加熱等、他のまたは支援的な溶出手段によって固相から核酸を放出、よって溶出することも本発明の範囲内である。

【0068】

続いて、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む試料からの小ＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離を可能にする、適した実施形態について記載する。そこで、小ＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離を可能にする、あるいはより大きいＲＮＡからおよび／またはＤＮＡと並行して別々の画分としての小ＲＮＡの単離を可能にする実施形態について記載する。よって、本発明の方法に従ってもたらされるタンパク質枯渇上清からＲＮＡと共にＤＮＡを単離することができる。しかし、必要に応じて、ＤＮＡは、精製プロセスにおいて選択的に枯渇させ、これにより、ＤＮＡを実質的に含まない、ゲノムＤＮＡを特に含まない、単離されたＲＮＡをもたらすことができる。そこで、ＤＮＡを除去するための異なる選択肢が存在する。非限定的な実施形態について続いて記載する。

【0069】

一実施形態によれば、ステップｂ）において得られる上清は、ＲＮＡと共にＤＮＡを含み、ＲＮＡおよびＤＮＡは、両方の種類の核酸を核酸結合固相に結合させることにより、ステップｃ）において単離される。ＲＮＡおよびＤＮＡは、全核酸の形態で溶出することができる。ＲＮＡおよびＤＮＡが両者共に核酸結合固相に結合される場合に実行可能な一実施形態によれば、差次的溶出プロセスを続いて行うことができ、大および小ＲＮＡを含む全ＲＮＡから別々にＤＮＡを単離することを可能にする。例えば、ＤＮＡは、結合されたＲＮＡを溶出させる前に選択的に溶出させることができ、逆もまた同じである。それぞれの差次的溶出条件は、例えば、ＷＯ９５／２１８４９またはＥＰ１６９３４５３に記載されている。

【0070】

一実施形態によれば、ＤＮＡは、適切な条件下で核酸固相にＤＮＡを選択的に結合させ、続いて小および大ＲＮＡを依然として含む残る上清から、核酸結合固相に結合されたＤＮＡを分離することにより除去される。これは、例えば、ＲＮＡではなく主にＤＮＡが固相に結合される条件下で、上清を適した核酸結合固相と接触させることにより達成することができる。ＤＮＡの結合を可能にする適した核酸結合固相は、先行技術で周知であり、これにおいても望まれる。一般に、ＲＮＡ結合ステップのための本明細書に記載されている核酸結合固相、特に、ケイ素含有固相をＤＮＡ結合に使用することもできる。ＤＮＡを選択的に結合させ、これにより除去するために適した方法は、例えば、本明細書に参照によって組み込まれるＥＰ０８８０５３７およびＷＯ９５／２１８４９に記載されている。例えば、カオトロピック塩等、カオトロピック剤を使用して試料を溶解する場合、ＤＮＡに選択的な、エタノールまたはイソプロパノール等、短鎖アルコールの非存在下で結合条件を確立することができる。必要に応じて、結合されたＤＮＡをさらに使用すること、例えば、さらに処理することができ、例えば、任意選択で洗浄し、核酸結合固相から溶出し、これにより、ＲＮＡを実質的に含まないＤＮＡ画分をもたらすことができる。続いて、それぞれのＤＮＡ画分を分析に利用することができる。よって、本発明は、先行技術方法とは対照的に、小および大ＲＮＡに加えてゲノムＤＮＡ等のＤＮＡも含むタンパク質枯渇上清をもたらすことができるため、同じ試料からＲＮＡおよびＤＮＡを単離することができる方法も提供する。しかし、ＤＮＡが目的でない場合、別々の画分における、または全ＲＮＡの形態での（これが好まれる）ＲＮＡ、例えば、小および大ＲＮＡ（のみ）の単離を企図するのであれば、結合されたＤＮＡを単純に廃棄することもできる。この場合においても、精製されたＲＮＡにおけるＤＮＡ混入の量を低下させるため、かかるＤＮＡ結合および除去ステップが好都合である。

【0071】

例えば、シリカ含有固相等、核酸結合固相にＤＮＡを結合させ、残る試料から結合されたＤＮＡを分離する場合、小ＲＮＡおよび大ＲＮＡおよび中間サイズのＲＮＡを単離することができるＤＮＡ枯渇ＲＮＡ含有上清がもたらされる。

【0072】

単離されたＲＮＡにおけるＤＮＡの量をさらに低下させるために、上述の通り核酸固相にＤＮＡを結合させることによりタンパク質枯渇上清からＤＮＡが除去された後に、適した酵素を使用してＤＮＡを分解するための中間ステップを行うことができる。ＤＮａｓｅ消化の実行は、残る微量のＤＮＡの除去を可能にする。ＲＮＡが核酸結合固相に結合された後に、例えば、オンカラムＤＮａｓｅ消化として、ＤＮａｓｅ処理を行うことができる。詳細は上に記載されている。さらに、ＤＮａｓｅ消化は、得られたＲＮＡ含有溶出液において行うこともできる。

【0073】

さらに、別々の画分の形態で大ＲＮＡおよび小ＲＮＡを単離することは、本発明の範囲内である。これは、例えば、第１のステップにおいて、長さ＞２００ｎｔを有するＲＮＡを、かかるより大きなＲＮＡ種に選択的な条件を使用して第１の核酸結合固相に結合させることにより達成することができる。これにより、かかるより大きなＲＮＡの主要な部分が、固相に結合される一方、残る上清は、小ＲＮＡを含む。第２の結合ステップにおいて、次に、２００ｎｔまたはそれに満たない長さを有する小ＲＮＡが、大ＲＮＡが除去された残る上清から単離される。それぞれの選択的結合条件は、先行技術で周知であり、したがって、詳細に記載する必要はない。これらは、背景においても記載されている。通常、第１の結合ステップにおいて大ＲＮＡを選択的に結合させるために、好ましくは、カオトロピック塩の存在下で、４０％未満、例えば、１０％〜３７％、１５％〜３５％または２０％〜３０％の範囲である濃度でアルコール濃度が結合混合物において使用される。固相に結合された大ＲＮＡを分離した後に、上清残部は依然として、小ＲＮＡを含む。続いて、第２の結合ステップにおいて、例えば、≧４０％、好ましくは≧４５％、より好ましくは≧５０％までアルコール濃度を増加させ、核酸結合固相に小ＲＮＡを結合させることにより、小ＲＮＡを単離することができる。結合されたＲＮＡを洗浄し、溶出することができる。さらに、全ＲＮＡを同じ固相に結合させることができ、例えば、差次的溶出プロトコールに従って、より大きなＲＮＡとは別々の富化された画分として小ＲＮＡを得ることができる。しかし、かかる手順は、使用者にとって非常に簡便であり、全サイズ（小、中および大）のＲＮＡが回収されることから、単離されたＲＮＡの下流の応用に関して柔軟であるため、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡと共により大きなＲＮＡ種を含む全ＲＮＡを単離することが好まれる。

【0074】

本発明の特殊な沈殿条件を使用してもたらされるタンパク質枯渇上清からＲＮＡを単離するために、他のＲＮＡ単離方法を使用することもできる。ＲＮＡ単離方法は、例えば、ＥＰ２１６３６２２およびＷＯ２００９／０７０５５８にも記載されており、上清からＲＮＡを単離するために、記載されている結合条件を使用することができる。一般に、核酸結合固相への小ＲＮＡの結合に適した条件下で、より大きなＲＮＡも結合する。

【0075】

さらに、上清からＤＮＡを単離することができる。適した方法は、当業者に公知であり、本開示からも明らかである。一実施形態によれば、上清から全核酸が単離される。そこで、単離された核酸は、小ＲＮＡ、大ＲＮＡ、中間サイズのＲＮＡおよびＤＮＡを含む。適した結合条件は、当業者に公知であり、本開示からも明らかである。

【0076】

次に、単離された核酸は、適したアッセイおよび／または分析方法を使用して分析および／またはさらに処理することができる。例えば、小、大および／または中間サイズのＲＮＡ等、ＲＮＡならびに上清から単離される場合は、ＤＮＡは、同定、修飾、少なくとも１種の酵素と接触、増幅、逆転写、配列決定、プローブと接触、検出（その存在または非存在を）および／または定量化することができる。それぞれの方法は、先行技術で周知であり、ＲＮＡを分析するための医学、診断および／または予後分野において一般的に適用される。よって、回収された核酸を分析して、例えば、多数の新生物疾患、特に種々の形態の腫瘍またはがん等、前悪性および悪性病変が挙げられるがこれらに限定されない、病状の存在、非存在または重症度を同定することができる。例えば、単離された核酸は、非侵襲的出生前遺伝子検査、それぞれ、スクリーニング、疾患スクリーニング、病原体スクリーニング、腫瘍学、がんスクリーニング、早期がんスクリーニング、がん治療法モニタリング、遺伝子検査（遺伝子型判定）、感染性疾患検査、傷害診断、外傷診断、移植医学または多くの他の疾患、したがって、診断および／または予後関連性があるものが挙げられるがこれらに限定されない、多くの応用分野において、診断および／または予後マーカー（例えば、胎児または腫瘍由来細胞外核酸）を検出するために分析することができる。よって、上で論じられている通り、本方法は、核酸分析および／または処理のさらに別のステップを含むことができる。

【0077】

したがって、一実施形態によれば、特に、単離されたＲＮＡ等、単離された核酸を分析して、疾患および／または少なくとも１種の胎児特徴を同定、検出、スクリーニング、モニタリングまたは除外する。分析方法は、目的の核酸種に依存する。単離された核酸の分析／さらなる処理は、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、蛍光検出、紫外分光測定、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＲＮＡもしくはＤＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング、制限分析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、非対称的ポリメラーゼ連鎖反応、指数関数後線形ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、インバースポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応またはこれらの任意の組合せが挙げられるがこれらに限定されない、任意の核酸分析／処理方法を使用して行うことができる。

【0078】

特に、本方法は、ＲＮＡの単離が一般的に望まれる任意の目的のため、ＲＮＡの単離のために使用することができる。非限定的な例として、その後のｃＤＮＡ合成のためのＲＮＡの単離、ｃＤＮＡライブラリー構築、逆転写ＰＣＲ等の増幅に基づく方法、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、ＳＡＧＥ技術、発現分析、発現アレイおよび発現チップ分析、マイクロアレイ分析、ＲＮＡｓｅおよびＳ１ヌクレアーゼ保護、ＲＮＡノーザン、ドットおよびスロットブロッティング、マイクロインジェクションならびにさらに、シークエンシング適用のためが挙げられるがこれらに限定されない。それぞれの技術は、当業者に周知であるため、ここでさらに記載する必要はない。本発明の方法は、効率的であり、柔軟であり、フェノール化合物の使用を必要としない。

【0079】

（詳細な実施形態）

【0080】

本発明の方法の非限定的な特異的な実施形態について、次に記載する。

【0081】

一実施形態によれば、方法は、
ａ）溶解された塩の形態の少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤、ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、好ましくは、プロトン性溶媒が、水混和性アルコールであり、より好まれることには、エタノールおよびイソプロパノールから選択され、沈殿混合物が、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ｉｉ）６．５％〜１４．５％、７％〜１４％、８％〜１３．５％、９％〜１３％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３〜５．２５、３．２５〜５．０、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から少なくとも小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）任意選択で、結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む、ステップと
を含む。

【0082】

上述の通り、一実施形態によれば、ステップａ）に先立ち、試料が破壊されるステップｘ）が行われる。しかし、記載されている通り、また、実施例からも明らかなように、試料破壊（必要であれば）は、沈殿混合物の調製と同時に行ってもよい。好ましくは、適した濃度で、適したｐＨを有する、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤、本明細書に定義されている有機溶媒および緩衝剤を含む沈殿バッファーが、ステップａ）において添加されて、定義された沈殿混合物をもたらす。

【0083】

一実施形態によれば、方法は、ＲＮＡを単離するためのものであり、
ｘ）試料を破壊するステップと、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、プロトン性溶媒は、好ましくは、水混和性アルコールであり、沈殿混合物が、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）６．５％〜１４．５％、７％〜１４％、８％〜１３．５％、９％〜１３％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３〜５．２５、３〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から少なくとも小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）任意選択で、結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。

【0084】

一実施形態によれば、方法は、
ｘ）試料を破壊するステップと、
ａ）溶解された塩の形態のＺｎ^２＋およびＡｌ^３＋から選択される少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤、好ましくは塩化亜鉛、ならびに非プロトン性極性溶媒である少なくとも１種の有機溶媒を破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ｉｉ）８％〜１３．５％、９％〜１３％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％でアルコールを含む結合混合物を提供するステップであって、結合混合物が、カオトロピック塩をさらに含む、ステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素＋含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。

【0085】

上述の通り、好ましくは、適した濃度で、適したｐＨを有する、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤、有機溶媒および緩衝剤を含む沈殿バッファーが、ステップａ）において添加されて、定義された沈殿混合物をもたらす。

【0086】

記載されている通り、一実施形態によれば、試料は、ステップａ）において金属カチオン沈殿剤および有機溶媒が添加されるのと同じときにそれぞれの段階で破壊する。一実施形態によれば、方法は、ＲＮＡを単離するためのものであり、方法は、
ａ）少なくとも１種の破壊試薬、少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、プロトン性溶媒は、好ましくは、試料を破壊し、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）６．５％〜１４．５％、７％〜１４％、８％〜１３．５％、９％〜１３％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３〜５．２５、３〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
ｖ）破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製するための水混和性アルコールであり、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から少なくとも小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）任意選択で、結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。

【0087】

一実施形態によれば、前記方法は、
ａ）少なくとも１種の破壊試薬、溶解された塩の形態のＺｎ^２＋およびＡｌ^３＋から選択される少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤、好ましくは塩化亜鉛、ならびに非プロトン性極性溶媒である少なくとも１種の有機溶媒を添加して、試料を破壊し、
ｉ）３００ｍＭ〜６２５ｍＭ、３５０ｍＭ〜６００ｍＭまたは４００ｍＭ〜５５０ｍＭから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ｉｉ）８％〜１３．５％、９％〜１３％または９．５％〜１２％から選択される濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲である酸性ｐＨ値を有し、
ｖ）破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと、
ｃ）上清から小および大ＲＮＡを単離するステップであって、
ａａ）少なくとも１種のアルコールを上清に添加して、濃度≧４０％、≧４５％または≧５０％でアルコールを含む結合混合物を提供するステップであって、結合混合物が、カオトロピック塩をさらに含む、ステップと、
ｂｂ）結合混合物に含有される全ＲＮＡをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップｂｂ）後に、少なくとも大および小ＲＮＡが、固相に結合される、ステップと、
ｃｃ）結合されたＲＮＡを洗浄するステップと、
ｄｄ）固相からＲＮＡを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。

【0088】

上述の通り、好ましくは、適した濃度で、適したｐＨを有する、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤、有機溶媒および緩衝剤を含む沈殿バッファーが、ステップａ）において添加されて、定義された沈殿混合物をもたらす。

【0089】

用語「試料」は、本明細書において広義で使用されており、核酸を含有する種々の供給源を含むことが意図される。試料は、生物学的試料であり得るが、用語は、その他、例えば、ＲＮＡを含む人工的な試料も含む。例示的な試料として、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、脳、心臓、筋肉、脂肪、膵臓、細胞培養物、体液が一般に挙げられるがこれらに限定されない、組織；全血；血清；血漿；赤血球；白血球；バフィーコート、腫瘍細胞、胎児細胞、宿主および移植片細胞；頬側スワブ、咽頭スワブ、腟スワブ、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、咽頭スワブ、直腸スワブ、病変スワブ、膿瘍（ａｂｃｅｓｓ）スワブ、鼻咽頭スワブその他が挙げられるがこれらに限定されない、スワブ；尿；痰；唾液；精液；リンパ液；液（liquor）；羊水；脳脊髄液；腹膜滲出液；胸水貯留；嚢胞由来の液体；滑液；硝子体液；眼房水；滑液包液；眼洗浄液；眼吸引液；肺洗浄物；肺吸引液；骨髄吸引液、懸濁下の細胞、ならびに任意の細胞から得られる溶解物、抽出物または材料、ならびに試料の上にまたはその中に存在し得る微生物およびウイルスその他が挙げられるがこれらに限定されない。ＲＮＡを含有するまたは含有すると疑われる臨床または法医学設定から得られる材料も、用語、試料に意図される意味の中に入る。さらに、当業者であれば、上述の例示的な試料のいずれかから得られる溶解物、抽出物もしくは材料またはこれらの部分も、用語、試料の範囲内であることを認める。好ましくは、試料は、ヒト、動物、植物、細菌または真菌に由来する生物学的試料である。好ましくは、試料は、細胞、組織、例えば血液等の体液、バフィーコート、血漿および血清等の血液製剤、尿、液、痰、糞便、ＣＳＦおよび精子、上皮スワブ、生検、骨髄試料ならびに多様な組織試料からなる群から選択される。上述の通り、試料は、好ましくは、沈殿混合物を調製する前に破壊する。本発明による方法は、血漿または血清等、タンパク質に富んだ試料からのＲＮＡの単離に特に適している。実施例によって示されている通り、本発明による方法は、精製の間にフェノールが使用されない場合であっても、それぞれの試料から小および大ＲＮＡを効率的に単離することを可能にする。

【0090】

本発明による方法は、血液試料、特に、例えば抗凝固薬を使用して安定化された血液試料および血漿または血清等のかかる血液試料に由来する試料の処理にも適している。血液試料の安定化に使用される典型的な抗凝固薬として、ＥＤＴＡおよびクエン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。方法は、血漿または血清試料から等、それぞれの安定化された試料に由来する試料からのＲＮＡの単離にも適している。さらに、ＲＮＡは、活性化因子を含む血清試料を含む血清試料から単離することができる。

【0091】

用語「核酸（単数または複数）」は、本明細書において、典型的には、サブユニット間をホスホジエステル連結によって、ただし場合によってはホスホロチオエート、メチルホスホネートその他によって共有結合されたリボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシドを含むポリマーを特に指す。ＤＮＡとして、あらゆる種類のＤＮＡ、例えば、ｇＤＮＡ；環状ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび循環ＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。ＲＮＡとして、ｈｎＲＮＡ；ｍＲＮＡ；細胞外ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）、ｌｉｎｃＲＮＡ（長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低干渉ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低ＲＮＡ）およびｓｔＲＮＡ（一時的小ＲＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＰＡＳＲ（プロモーター関連ＲＮＡ）、ＣＵＴ（潜在性不安定転写物（ｃｒｙｐｔｉｃ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ））が挙げられるがこれらに限定されない。小ＲＮＡまたは用語、小ＲＮＡ種は、２００ｎｔもしくはそれに満たない、１７５ｎｔもしくはそれに満たない、１５０ｎｔもしくはそれに満たない、１２５ｎｔもしくはそれに満たない、１００ｎｔもしくはそれに満たないまたは７５ｎｔもしくはそれに満たない鎖の長さを有するＲＮＡを特に指し、その例として、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、他の短干渉核酸、ｓｎｏＲＮＡその他が挙げられるがこれらに限定されない。大ＲＮＡおよび同様の表現は、本明細書において、少なくとも１２５０ｎｔ、少なくとも１５００ｎｔまたはさらに大きい等、少なくとも１０００ｎｔの長さを有するＲＮＡ種を指す。大ＲＮＡは、ｍＲＮＡを特に含む。ＲＮＡが二本鎖である場合、「ｎｔ」として示される鎖の長さは、「ｂｐ」を指す。本方法により単離することができるＲＮＡは、当然ながら中間サイズのＲＮＡであることもでき、例えば、試料から全ＲＮＡを単離する際に単離される。

【0092】

ＲＮＡ等の核酸の結合に使用することができる核酸結合固相として、目的の核酸と結合することができるいかなる材料を使用してもよい。これは、核酸と結合することができる種々の材料を含む。本発明と併せて使用することができる例示的な固相として、シリカ粒子、シリカファイバー、ガラス繊維、二酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウムおよびホウケイ酸塩等、シリカ材料が挙げられるがこれらに限定されない、ケイ素を含む化合物；ニトロセルロース；ジアゾ化ペーパー；ヒドロキシアパタイト（ヒドロキシルアパタイトとも称される）；ナイロン；金属酸化物；ミネラル、ジルコニア；アルミナ；ポリマー型支持体、有機ポリマー、ジエチルアミノエチルおよびトリエチルアミノエチル誘導体化支持体、疎水性クロマトグラフィー樹脂その他が挙げられるがこれらに限定されない。用語、固相は、その形態または設計に関するいかなる限定の暗示も意図しない。よって、用語、固相は、多孔性または非多孔性、透過性または不透過性の適切な材料を包含し、その例として、膜、フィルター、シート、粒子、磁性粒子、ビーズ、ゲル、粉末、繊維その他が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態によれば、タンパク質枯渇上清由来の目的の核酸と結合するために、アニオン交換リガンドで官能化した固相が使用される。例えば、アニオン交換リガンドで官能化した、カラムまたは磁性粒子等の粒子を使用することができる。別の実施形態によれば、例えば、シリカ固相等、固相の表面は、修飾されず、例えば、官能基により修飾されない。

【0093】

固相として、シリカおよびポリケイ酸材料、ホウケイ酸塩、ケイ酸塩ならびに有機ガラス等、ケイ素含有材料の使用が特に好まれる。そこで、固相は、好ましくは、沈殿および／または吸着によって結合され得るＲＮＡとの相互作用のためのシリカ表面を提供する。用語「シリカ表面」は、本明細書において、二酸化ケイ素および／または他の酸化ケイ素、珪藻土、ガラス、ゼオライト（ｚｅｏｌｉｔｈｅ）、ベントナイト、アルキルシリカ、ケイ酸アルミニウムならびにホウケイ酸塩を含むまたはからなる表面を含む。シリカ表面は、好ましくは、未修飾である。したがって、表面は、核酸結合リガンドまたは他の核酸結合基により修飾されない。例えば、固相は、その結合表面に、イオン交換基を含むいかなるリガンドも保有せず、特に、固相の表面は、官能リガンドにより修飾されない。特に、これは、例えば、アミン基またはカルボキシル基等、アニオン性またはカチオン性交換基を含むリガンドにより修飾されない。一実施形態によれば、シリカ表面は、そのシラノール基または酸化物等、他の酸化型のケイ素に加えていかなる官能基も含まない。本発明と併せて使用することができる例示的な固相として、シリカ粒子、シリカファイバー、例えば、ガラス粉末、ガラス繊維、ガラス粒子またはコントロールドポアガラス等のガラス材料、二酸化ケイ素、粉末、ビーズまたはフリット等の粒子状形態のガラスまたはシリカが挙げられるがこれらに限定されない、シリカ表面を含む固相が挙げられるがこれらに限定されない。本発明によれば、カラムに基づく固相の使用または粒子、特に磁性粒子の使用が好まれる。

【0094】

シリカに基づく核酸単離方法は、先行技術において広範に使用されており、結合のために高いアルコール濃度を使用して、好ましくは、少なくとも１種のカオトロピック塩と組み合わせて、小ＲＮＡを含むＲＮＡを単離するときに特によく役立つ。

【0095】

一実施形態によれば、ビーズの形態を有し得るシリカ粒子が使用される。好ましくは、前記粒子は、約０．０２〜３０μｍ、より好まれる０．０５〜１５μｍおよび最も好まれる０．１〜１０μｍのサイズを有する。核酸結合固相の処理を容易にするために、好ましくは、磁性シリカ粒子が使用される。磁性粒子は、磁場に応答する。磁性シリカ粒子は、例えば、フェリ磁性、強磁性、常磁性または超常磁性であり得る。適した磁性シリカ粒子は、例えば、ＷＯ０１／７１７３２、ＷＯ２００４／００３２３１およびＷＯ２００３／００４１５０に記載されている。他の磁性シリカ粒子も先行技術から公知であり、例えば、ＷＯ９８／３１８４０、ＷＯ９８／３１４６１、ＥＰ１２６０５９５、ＷＯ９６／４１８１１およびＥＰ０３４３９３４に記載されており、例えば磁性シリカガラス粒子も含む。結合されたＲＮＡを含む磁性粒子は、磁場の助けにより、例えば、永久磁石を使用することにより容易に処理することができるため、磁性粒子の使用は簡便である。本実施形態は、磁性粒子を処理することができる確立されたロボットシステムと適合性である。そこで、本発明と併せて、核酸が結合された磁性粒子の処理に使用することができる種々のロボットシステムが、先行技術において存在する。一実施形態によれば、磁性粒子は、反応槽の底または側面に収集され、残る液体試料は、反応槽から除去され、核酸が結合されている収集された磁性粒子を後に残す。残る試料の除去は、デカンテーションまたは吸引によって行うことができる。かかるシステムは、先行技術で周知であり、よって、ここで詳細な説明は必要ない。磁性粒子の処理のための公知の代替システムにおいて、カバーまたはエンベローププランジで通常覆われている磁石を反応槽内に入れて、磁性粒子を収集する。それぞれのシステムは、先行技術で周知であり、市販もされている（例えば、ＱＩＡＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）；ＱＩＡＧＥＮ）ため、ここではいかなる詳細な説明も必要ない。磁性粒子の処理のための公知のさらに別の代替システムにおいて、磁性粒子を含む試料は、ピペットチップ内に吸引することができ、例えば、ピペットチップの側面に磁石を適用することにより、ピペットチップにおいて磁性粒子を収集することができる。続いて、結合された核酸を保有する収集された磁石粒子を、ピペットチップ内に磁石によって残しながら、残る試料をピペットチップから放出することができる。続いて、収集された磁性粒子をさらに処理することができる。かかるシステムも、先行技術で周知であり、市販もされており（例えば、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＥＺ１、ＱＩＡＧＥＮ）、よって、ここではいかなる詳細な説明も必要ない。

【0096】

好まれる実施形態によれば、固相がカラムに含まれた、カラムに基づく核酸単離手順が行われる。用語「カラム」は、本明細書において、少なくとも２個の開口部を有する容器を特に記載する。これにより、溶液および／または試料は、前記カラムを通過することができる。用語「カラム」は、特に、容器の形状に関していかなる制限も暗示せず、これは例えば、円形または角形であり得、好ましくは、円柱状である。しかし、特に、マルチカラムを使用する場合、他の形状を使用することもできる。カラムは、ＲＮＡ結合のために使用される固相を含む。カラムに含まれる前記固相は、カラムにアプライされる際の溶液、それぞれ、結合混合物の通過を可能にする必要がある。これは、例えば、遠心力がカラムに加えられる場合、溶液および／または結合混合物に、遠心力の方向でのカラムの通過が可能になることを意味する。上で論じられている通り、それぞれのカラムに基づくＲＮＡ単離手順を使用する場合、結合混合物は通常、例えば、遠心分離または真空に支援されつつカラムを通過し、ＲＮＡ分子は、前記通過の間に含まれた固相に結合する。いずれのＲＮＡ種（小分子および／または大ＲＮＡ）が結合されるかは、使用される結合条件に依存する。カラムは、シングルフォーマットまたはマルチフォーマットで使用することができる。マルチウェルプレートとして同様のフォーマットを有し、シリカ膜またはガラス繊維等の固相を含むかかるマルチカラムは、先行技術で周知であり、市販もされている。好ましくは、カラムは、スピンカラムである。好ましくは、ＲＮＡ結合膜またはＲＮＡ結合繊維が固相として使用される。例として、ＲＮＡ結合のためのケイ素含有表面を提供する、シリカ膜、ガラス繊維膜またはフィルターが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、膜は多孔性である。実施例によって示されている通り、カラムに含まれた固相の使用は、いくつかの利点を有する。スピンカラム等、カラムの使用は、ＲＮＡ精製のために広く確立されているため、カラムの使用は、使用者にとって非常に簡便である。カラムに基づく方法は、速くもあり、さらに、試料の自動化された処理を可能にする自動化されたシステムが存在する（例えば、ＱＩＡｃｕｂｅ、ＱＩＡＧＥＮを参照）。これにより、面倒な手動の取扱い手順を回避することができる。さらに、ＲＮＡを単離するためのスピンカラムに基づくアプローチの使用は、洗浄溶液（例えば、アルコール等）またはビーズからの潜在的阻害性構成成分のキャリーオーバーのリスクがないという利点を有する。カラムにおいてシリカを含むまたはからなる固相として膜または繊維を使用することが好まれる。ＲＮＡ結合に適した、シリカ表面を提供する適した好まれるシリカに基づく材料は、上にも記載されている。カラムに含まれるさらに一般的な固相は、シリカ粒子の充填またはシリカ材料（例えば、シリカゲル）の層である。例えば、シリカ粒子を不活性フィルターまたは膜上に層として配置し、これにより、ＲＮＡ結合固相を形成することができる。カラムに含まれた固相を通る結合混合物の通過を軽減するために、例えば、遠心分離、あるいは例えば、カラム、それぞれ固相を通して試料に圧力をかけるか、または真空にかけることにより固相を通して吸い込む圧力差を発生する器具の使用等、適した手段を使用することができる。それぞれの手段は、先行技術で周知であるため、ここではさらなる説明の必要はない。

【0097】

当業者に公知の通り、上に記載されている核酸結合固相は、一般に、ＤＮＡの結合にも適している。

【0098】

Ｂ．タンパク質枯渇上清を提供するための方法

【0099】

第２の態様によれば、試料からタンパク質枯渇上清を提供するためのフェノールフリーの方法であって、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
ｉ）金属カチオン沈殿剤を含み、
ｉｉ）１５％またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
ｉｉｉ）少なくとも１種の緩衝剤を含み、
ｉｖ）酸性ｐＨ値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
ｂ）上清から沈殿物を分離するステップであって、得られた上清が、２００ｎｔ未満の長さを有する小ＲＮＡおよび少なくとも１０００ｎｔの長さを有する大ＲＮＡを含む、ステップと
を含む方法が提供される。

【0100】

個々のステップａ）およびｂ）に関する詳細、金属カチオン沈殿剤および有機溶媒の適した種類および濃度、ならびにタンパク質枯渇上清を調製することができる種々の試料型は、第１の態様に係るおよび特許請求の範囲における方法と併せて上に記載されており、これは、ここにも適用されるそれぞれの開示に参照される。記載されている通り、ステップａ）における試料は、一実施形態によれば、破壊された試料である。試料破壊は、沈殿混合物が調製されるのに先立ちまたはこれと同時に行うことができる。一実施形態によれば、第２の態様に係る方法は、ステップａ）に先立ち試料が破壊されるステップｘ）を含む。かかる破壊ステップの詳細は、上に記載されており、これは、上述の開示に参照される。好ましくは、沈殿混合物における沈殿条件を確立するために、金属カチオン沈殿剤、有機溶媒および緩衝剤を含む沈殿バッファーが、ステップａ）において添加される。前記沈殿バッファーの詳細は、上に記載されている。例えば、特許請求の範囲にも定義されている通り、第３の態様に係る沈殿バッファーは、この目的のために使用することができる。沈殿バッファーは、好ましくは、破壊された試料に添加される。

【0101】

方法は、先行技術方法とは対照的に、小および大ＲＮＡ（および中間サイズのＲＮＡ）、ならびに実施形態では、ゲノムＤＮＡ等の高分子量核酸も含む、タンパク質枯渇上清を提供する。詳細は、上に記載されており、これは、上述の開示に参照される。次に、目的の核酸種は、様々な核酸単離方法を使用して、タンパク質枯渇上清から単離することができる。使用される方法は、目的の標的核酸にも依存する。ＲＮＡと共にＤＮＡの単離に適した例示的な非限定的な実施形態は、上に記載されており、これは、上述の開示に参照される。

【0102】

Ｃ．沈殿バッファー

【0103】

第３の態様によれば、
ａ）少なくとも１種の金属カチオン沈殿剤と、
ｂ）非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも１種の有機溶媒と、
ｃ）少なくとも１種の緩衝剤と
を含む沈殿バッファーであって、３〜５．５の範囲であるｐＨ値を有する沈殿バッファーが提供される。

【0104】

様々な生物学的試料、特に、破壊された生物学的試料からタンパク質を沈殿させるために、それぞれの沈殿バッファーを有利に使用することができる。したがって、これは、タンパク質を沈殿させるために、本発明の第１および第２の態様に係る方法において特異的に使用することができる。前記沈殿バッファーの詳細は、第１の態様に係る方法と併せて既に上に記載されており、これは、ここにも適用されるそれぞれの開示に参照される。非限定的な実施形態について、次に再度簡単に説明する。

【0105】

金属カチオン沈殿剤は、０．７５Ｍ〜３Ｍ、１Ｍ〜２．８Ｍ、１．２５Ｍ〜２．７Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍまたは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で、溶解された塩の形態で沈殿バッファーに含まれ得る。例えば、塩化物塩等、ハロゲン化物塩を使用することができる。２種またはそれを超える金属カチオン沈殿剤が含まれる場合、これらの濃度は、一実施形態によれば、含まれている金属カチオン沈殿剤の全体的な濃度を指す。実施例によって実証される通り、それぞれの濃度で金属カチオン沈殿剤を含む沈殿バッファーの使用は、優れた結果をもたらす。適した金属カチオン沈殿剤は、上に記載されており、好ましくは、金属カチオン沈殿剤は、Ｚｎ^２＋およびＡｌ^３＋から選択される。Ｚｎ^２＋が特に好まれる。これは、塩化亜鉛として沈殿バッファーに含まれ得る。

【0106】

沈殿バッファーは、１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％または４０％〜５２．５％から選択される濃度で、非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される有機溶媒を含むことができる。２種またはそれを超えるそれぞれの有機溶媒が、沈殿バッファーに含まれる場合、これらの濃度は、一実施形態によれば、含まれている有機溶媒の全体的な濃度を指す。非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される適した有機溶媒の適切な例は、第１の態様に係る方法と併せて上に記載されており、実施例からも明らかである。有機溶媒は、水に混和性である。好ましくは、有機溶媒は、ＤＭＳＯ等、非プロトン性極性溶媒である。さらに、水混和性アルコール等、プロトン性有機溶媒を使用することができる。好ましくは、プロトン性有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロパノール等、低級脂肪族アルコールである。

【0107】

沈殿バッファーは、３〜５．５、３〜５．２５、３．２５〜５、３．２５〜４．７５、３．５〜４．５および３．７５〜４．４から選択されるｐＨ値を有することができる。３〜５、好ましくは３．２５〜４．７５、より好まれる３．５〜４．５または３．７５〜４．４の範囲のｐＨが特に好まれる。実施例によって実証される通り、それぞれの酸性ｐＨ値を有する沈殿バッファーの使用は、特に、血漿または血清等、タンパク質に富んだ試料を処理する場合、有利な結果をもたらす。

【0108】

酸性ｐＨ値を維持するため、沈殿バッファーは、少なくとも１種の緩衝剤を含む。実施例によって実証される通り、異なる緩衝剤を使用することができる。緩衝剤の組合せを使用することもできる。一実施形態によれば、緩衝剤は、カルボン酸であるまたはこれに由来する。カルボン酸は、モノ、ジまたはトリカルボン酸を含む。好ましくは、緩衝剤は、酢酸またはクエン酸であり、それぞれ、酢酸塩またはクエン酸塩である。実施例によって実証される通り、酢酸塩およびクエン酸塩は、異なる塩の形態で添加することができる。さらに、ＰＩＰＰＳ等、リン酸塩バッファーを使用することができる。一実施形態によれば、沈殿バッファーは、３００ｍＭ〜２Ｍ、４００ｍＭ〜１．７５Ｍ、４５０ｍＭ〜１．５Ｍ、５００ｍＭ〜１．４Ｍ、５５０ｍＭ〜１．３Ｍおよび６００ｍＭ〜１．２５Ｍから選択される濃度で緩衝剤を含む。先に言及した濃度範囲で使用することができる、酢酸塩またはクエン酸塩等、カルボン酸塩、例えば、アルカリ金属塩が特に好まれる。５５０ｍＭ〜１．３Ｍ、６００ｍＭ〜１．２５Ｍまたは６５０ｍＭ〜１．２Ｍの範囲である濃度が特に好まれる。２種またはそれを超える緩衝剤が使用される場合、それぞれの濃度は、一実施形態によれば、沈殿バッファーにおける緩衝剤の全体的な濃度を指す。

【0109】

一実施形態によれば、沈殿バッファーは、
ａａ）１．２５Ｍ〜２．８Ｍ、１．５Ｍ〜２．６Ｍまたは１．７Ｍ〜２．５Ｍから選択される濃度で、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤として、Ｚｎ^２＋またはＡｌ^３＋、好ましくはＺｎ^２＋を含み、
ｂｂ）１３％〜６５％、２０％〜６３％、２５％〜６２．５％、３０％〜６０％、３３％〜５７．５％、３７．５％〜５５％または４０％〜５２．５％から選択される濃度で好ましくは非プロトン性極性有機溶媒である有機溶媒を含み、
ｃｃ）３．２５〜４．７５または３．４〜４．５の範囲であるｐＨ値を有する。

【0110】

上述の通り、Ｚｎ^２＋が好まれ、例えば、塩化亜鉛として含まれ得る。

【0111】

第３の態様に係る沈殿バッファーは、キットに含まれてもよい。したがって、本開示は、キットも提供する。キットは、試料から核酸、好ましくは少なくともＲＮＡを単離するためのものである。キットは、一実施形態によれば、好ましくは、少なくともＲＮＡである核酸の単離に必要なあらゆる試薬を含む。一実施形態によれば、かかるキットは、第３の態様に係る沈殿バッファーと、次の構成成分：
− 少なくとも１種の破壊試薬；
− 少なくとも１種の核酸結合固相；
− 少なくとも１種の結合溶液；
− 少なくとも１種の洗浄溶液；および／または
− 少なくとも１種の溶出溶液
のうち１種または複数とを含む。

【0112】

キットは、一実施形態によれば、沈殿バッファーと、カオトロピック塩を含む破壊試薬と、核酸結合固相とを含む。それぞれの破壊試薬および核酸結合固相に適した実施形態は、第１の態様に係る方法と併せて上に記載されており、これは、ここにも適用される上述の開示に参照される。キットは、結合溶液をさらに含むことができる。結合溶液は、核酸結合固相への好ましくはＲＮＡ等の核酸の結合の促進に適したアルコールを含むまたはからなることができる。適したアルコールは、上に記載されており、エタノールおよびイソプロパノールが好まれる。本実施形態は、例えば、核酸結合固相としてケイ素含有材料が使用される場合に適している。結合溶液は、好ましくは、カオトロピック塩等、カオトロピック剤を含むことができる。これは、破壊バッファーがカオトロピック塩を含まない場合に特に有利である。

【0113】

本発明は、本明細書に開示されている例示的な方法および材料によって限定されず、本発明の実施形態の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは同等な任意の方法および材料を使用することができる。数値的範囲は、範囲を定義する数の包括的なものである。本明細書に提示されている見出しは、本明細書をまとめて参照することにより読み取ることができる、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。

【0114】

対象明細書および特許請求の範囲において使用されている通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数形の態様を含む。よって、例えば、「単数の（a）金属カチオン沈殿剤」への言及は、単一の種類の金属カチオン沈殿剤と共に、２種またはそれを超える金属カチオン沈殿剤を含む。同様に、単数の（an）「アルコール」、単数の（an）「有機溶媒」、単数の（a）「カオトロピック塩」、単数の（a）「緩衝剤」その他への言及は、単一実体およびかかる実体の２種またはそれ超の組合せを含む。「本（the）開示」および「本（the）発明」その他への言及は、本明細書に教示されている単一または複数の態様を含む；等々。本明細書に教示されている態様は、用語「発明」によって包含される。

【0115】

用語「溶液」は、本明細書において、液体組成物、好ましくは、水性組成物を特に指す。これは、１相のみの均質な混合物であり得るが、溶液が、例えば、沈殿物等の固体構成物を含むことも本発明の範囲内である。

【0116】

一実施形態によれば、方法の場合はある特定のステップを含むものとして、あるいは組成物、溶液および／またはバッファーの場合はある特定の成分を含むものとして本明細書に記載されている対象物は、それぞれのステップまたは成分からなる対象物を指す。本明細書に記載されている好まれる実施形態を選択および組み合わせることが好まれ、好まれる実施形態のそれぞれの組合せから生じる特異的な対象物も、本開示に属する。

【実施例】

【0117】

Ｉ．材料および方法
他に断りがなければ、全ＲＮＡは、次の標準プロトコールに従って血清、血漿または組織から単離した：

【0118】

１．材料
沈殿バッファーＸＰ（４５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ；ＺｎＣｌ_２（１．９０９Ｍ）；ＮａＯＡｃ；ｐＨ４〜４．５）
− シリカカラム（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）スピンカラム）
− 収集チューブ（１．５ｍｌおよび２ｍｌ）
− 洗浄バッファーＲＷＴ（ＱＩＡＧＥＮ；ＧＴＣを含有、２容量エタノール（９６％〜１００％）を使用前にバッファー濃縮物ＲＷＴに添加）
− 洗浄バッファーＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮ；４容量エタノール（９６％〜１００％）を使用前にバッファー濃縮物ＲＰＥに添加）
− 溶解バッファーＲＬＴ Ｐｌｕｓ（ＱＩＡＧＥＮ；カオトロピック塩および洗剤を含有）
− ＲＮａｓｅフリー水
− Ｃｅ＿ｍｉＲ−３９＿１ ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）プライマーアッセイ

【0119】

２．全ＲＮＡ単離
２．１．手動手順

【0120】

試料調製
１２０μｌ溶解バッファー（ＲＬＴ Ｐｌｕｓ、ＱＩＡＧＥＮ）を、血清または血漿等の２００μｌ試料に添加する。溶解混合物を５秒間ボルテックスにかけ、３分間室温でインキュベートして、試料を破壊する。

【0121】

タンパク質沈殿
破壊された試料に９５μｌ沈殿バッファーＸＰを添加し、３秒間ボルテックスにかける。任意選択で、３．５μｌ ｍｉＲＮｅａｓｙ血清スパイクイン対照（１．６×１０^８コピー／μｌ）を添加し、再度３秒間ボルテックスにかける。次に、試料を３分間氷上でインキュベートする。任意選択で、試料は、数時間４℃で貯蔵することもできる。得られた沈殿物を＞１１，０００ｒｐｍで３分間の遠心分離により除去する。核酸含有上清を新たな収集チューブに移す。

【0122】

ＲＮＡ結合
１容量（３６０μｌ）アルコール（例えば、イソプロパノール）を上清に添加し、結合混合物を５秒間ボルテックスにかける。次に、結合混合物をシリカスピンカラムにアプライし、室温で２分間インキュベートする。その後、カラムを３０秒間＞１１．０００ｒｐｍで遠心分離する。

【0123】

洗浄ステップ
結合されたＲＮＡをさらに精製するために、数回の洗浄ステップを行った：７００μｌ ＲＷＴ、１５秒間＞８０００×ｇで遠心分離、フロースルーを廃棄；８００μｌ ＲＰＥ、１５秒間＞８０００×ｇで遠心分離、フロースルーを廃棄；７００μｌ ＲＰＥ、１５秒間＞８０００×ｇで遠心分離、フロースルーを廃棄。最後に、３００μｌ １００％エタノールをカラムに添加し、２分間＞８０００×ｇで遠心分離；フロースルーを廃棄する。次に、洗浄されたＲＮＡの入ったカラムを新たな２ｍｌ収集チューブに移す。次に、蓋を開けたカラムを５分間、最大ｒｐｍで遠心分離して、残る微量のエタノールを除去する。

【0124】

溶出
カラムを新たな１．５ｍｌ反応槽に移す。２０μｌ ＲＮａｓｅフリー水をカラム中央にアプライする。カラムを閉じ、１分間、最大ｒｐｍで遠心分離する。任意選択で、例えば、既に得られた溶出液を使用して、第２の溶出ステップを行うことができる。

【0125】

２．２．マルチウェル（９６）アプローチ
ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌロボットシステムまたは例えば、ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴシステムにおいて９６ウェルプレートを使用して、複数の試料を同時に処理して、手動プロトコールを行うこともできる。ＣＭＴＲ（収集マイクロチューブラック）ブロックにおいて試料調製を行うことができる：

【0126】

試料調製
２００μｌ血清または血漿をＣＭＴＲブロックに添加する。１２０μｌ溶解バッファー（ＲＬＴ Ｐｌｕｓ、ＱＩＡＧＥＮ）を添加し、混合する。溶解のため、溶解混合物を３分間、室温でインキュベートする。

【0127】

タンパク質沈殿
９５μｌ沈殿バッファーＸＰを溶解混合物に添加し、試料を混合する。任意選択で、３．５μｌ ｍｉＲＮｅａｓｙ血清スパイクイン対照（１．６×１０^８コピー／μｌ）を添加し、混合する。上述の通り、この段階で、数時間４℃で試料を貯蔵することも可能である。沈殿物を４℃、＞５．０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により除去する。続いて、ＢｉｏＲｏｂｏｔ ＵｎｉｖｅｒｓａｌシステムにおいてＣＭＴＲブロックをさらに処理する。このさらなるＢｉｏＲｏｂｏｔプロトコールは、血清／血漿試料のための現存するｍｉＲＮｅａｓｙ ＢｉｏＲｏｂｏｔプロトコールに相当する。唯一の適応は、試料から得られる上清の容量である。ＲＮＡ単離は、ＲＮｅａｓｙ ９６プレートを使用して行われる。洗浄ステップは、手動調製のために記載されているステップに相当する。溶出容量は、２×５５μｌである。

【0128】

ＩＩ．実験

【0129】

（実施例１）
ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプロトコールを使用した、血清および血漿からのｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの単離

【0130】

本発明による方法の効率は、異なる試料型を使用して実証される。試料材料として、（プールされた）異なるヒト血清および血漿試料を使用した（表１を参照）：

【表1】

【0131】

１）確立されたＱＩＡｚｏｌ調製方法（血漿／血清のためのｍｉＲＮｅａｓｙ；フェノールの使用を含む）または２）本発明によるフェノールフリーの方法を使用して、同じプールされた試料からＲＮＡを単離した。同じプールされた試料からＲＮＡを得たため、方法のＲＮＡ単離効率を直接的に比較することができる。

【0132】

各プールされた試料から、ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌシステムにおいて両方の方法により８つの複製物を処理した。ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲアレイｍｉＲＮＡ ＱＣ（ＭＩＨＳ−９８９Ｚ）を使用して、各溶出液の６μｌをその後に分析した。図１（血清）および図２（血漿）は、３種の定量化されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１９１）およびスパイクイン対照Ｃｅｌ−ｍｉＲ−３９のＣｔ値を示す。本発明による方法は、殆どの場合、確立された先行技術単離プロトコール（ｍｉＲＮｅａｓｙ）よりも優れた結果（すなわち、より低いＣｔ値）を達成した。したがって、本発明によるフェノールフリーの方法は、確立されたフェノールに基づくＲＮＡ単離方法に等しいまたはそれよりもさらに優れた結果をもたらす。

【0133】

（実施例２）
単離されたｍｉＲＮＡのスペクトル

【0134】

本発明による方法が、確立されたｍｉＲＮｅａｓｙ単離プロトコールと同じ試料からのｍｉＲＮＡの比較スペクトルの単離を可能にするか分析した。ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（６つの複製物）または本発明による方法（８つの複製物）のいずれかを使用して、プールされた血清試料からＲＮＡを手作業で単離した。「ヒトｍｉＦｉｎｄｅｒ ３８４ＨＣ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲアレイ」を使用して、得られた溶出液を分析した。定量化された３７２種のｍｉＲＮＡの平均Ｃｔ値および両方の方法の平均値を、図表において互いに対して直接的にプロットした。結果を図３に示す。８３％超の達成された相関係数は、本発明による方法が、豊富な標的と共に稀少な標的を匹敵する効率で、分析されたｍｉＲＮＡの大部分の単離を可能にすることを示す。

【0135】

（実施例３）
ｍｉＲＮＡ単離における非プロトン性極性溶媒の影響

【0136】

非プロトン性極性有機溶媒が、ＲＮＡ単離にどのように影響を与えるか分析するために、上述の手動プロトコールを使用して、プールされた血清試料（６名のドナー、凝固活性化因子なしの収集チューブ）からＲＮＡを単離した。標準沈殿バッファーＸＰに加えて、ＤＭＳＯなしの、したがって、非プロトン性極性有機溶媒なしの修飾された沈殿バッファーを比較目的のため使用した。結合混合物における異なるイソプロパノール（アルコール）濃度および異なるＤＭＳＯ濃度を使用して、ｍｉＲＮＡ単離効率を分析した。ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲアレイｍｉＲＮＡ ＱＣ（ＭＩＨＳ−９８９Ｚ）を使用して、定量化を行った。

【0137】

表２は、異なる沈殿バッファー（ｗ／ｏ＝なし）のセットアップを示し、沈殿混合物におけるＤＭＳＯ濃度を示し、結合混合物における最終アルコール（イソプロパノール）およびＤＭＳＯ濃度も示す：

【表2】

【0138】

図４は、結果を示す。図からわかる通り、ＸＰ（ｗ／ｏ ＤＭＳＯ）および５０％〜５５％イソプロパノールの使用は、結合混合物（ＤＭＳＯは、タンパク質沈殿ステップ後にここに添加された）におけるＸＰ（ｗ／ｏ ＤＭＳＯ）および４５％イソプロパノール＋１０％ＤＭＳＯの使用と本質的に同じ結果をもたらしたため、小ＲＮＡを含むＲＮＡを固相に結合させるために、結合混合物におけるＤＭＳＯの存在は、必須の役割を果たさない。ここでは明らかに、結合の間に全体的な溶媒濃度は関連性があった。しかし、驚くべきことに、得られた結果は、非プロトン性極性溶媒（ここでは：ＤＭＳＯ）が、沈殿ステップの間に既に存在しており、そこで、小ＲＮＡにおける安定化効果を明らかに有することが重要であることを実証する。より低いＣＴ値からわかる通り、本発明による標準沈殿バッファーＸＰ（ＤＭＳＯを含む）は、他の沈殿バッファー（ＤＭＳＯを含まない）よりも有意に優れた結果をもたらした。さらに、バッファーＸＰ（ｗ／ｏ ＤＭＳＯ）４５％イソプロパノール＋１０％ＤＭＳＯにより実証される通り、沈殿ステップ後だがＲＮＡ結合前におけるＤＭＳＯのその後の添加も、結果を改善しない。理論に制約されることは望まないが、沈殿の間のｍｉＲＮＡにおける安定化効果の発揮に加えて、ｍｉＲＮＡを含むタンパク質複合体が、沈殿ステップの間にＤＭＳＯによって溶解され、したがって、続いてその後の結合ステップにおいてより効率的に回収され得る、小ＲＮＡの放出を支持することも可能である。これは、沈殿の間にＤＭＳＯが使用されなかった方法と比較して、本発明による方法を使用した場合、ｍｉＲ−１９１のＣｔ値が、有利に有意に低下されたという観察と一致する（図４を参照）。

【0139】

（実施例４）
全ＲＮＡ単離における非プロトン性極性有機溶媒の影響

【0140】

本発明による方法は、例えば、全ＲＮＡの形態で、試料から小および大ＲＮＡを単離できることを目標とする。より大分子のＲＮＡ分子の単離効率を分析するために、細胞培養物から全ＲＮＡを単離した。試料材料として、８ｍｌ溶解バッファー（ＲＬＴ、ＱＩＡＧＥＮ）に溶解された４×１０^７個のジャーカット細胞のプールされた溶解物を使用した。２００μｌ溶解物（６つの複製物）からＲＮＡを単離した。比較のため、ＲＮＡは、実施例３に従った異なる沈殿に基づく方法も使用して単離した。いずれの場合も、シリカ含有カラム（ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉカラム）を使用し、５０μｌ ＲＮａｓｅフリー水を使用してＲＮＡを溶出した。対照として、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（マニュアルに従う）およびｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（ＱＩＡｚｏｌ；マニュアルに従う）を使用してＲＮＡを単離した。

【0141】

分光光度測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を使用して、得られた溶出液のＲＮＡ含量を分析した。さらに、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒおよびＲＮＡ ６０００チップにより個々の試料を分析した。試料「ＲＮｅａｓｙ」、「ＱＩＡｚｏｌ」および「ＸＰ」は、Ａｇｉｌｅｎｔ分析に先立ち１：４に希釈した。沈殿バッファーにおけるＤＭＳＯなしで単離した試料の溶出液（「ＸＰ５０」、「ＸＰ５５」および「ＸＰ４５＋１０」）は、希釈なしで分析した。

【0142】

結果を図５に示す。ＲＮｅａｓｙ単離から得られた溶出液は、予想通り、１８Ｓおよび２８Ｓ ＲＮＡの間の優れた比、したがって、効率的に単離された大ＲＮＡを示した。しかし、小ＲＮＡ≦２００ｎｔは、得られた溶出液において本質的に失われていた。ＱＩＡｚｏｌに基づくｍｉＲＮｅａｓｙ単離手順を使用して得られた溶出液は、より低濃度のＲＮＡを示したが、溶出液は、大ＲＮＡに加えて小ＲＮＡも含んだ。ＤＭＳＯが沈殿バッファー（ＸＰ）に含まれる本発明による沈殿に基づく方法により得られた溶出液は、ＲＮｅａｓｙ方法と同様に、有意な量の１８Ｓおよび２８Ｓ ＲＮＡ（したがって大ＲＮＡ）を含むが、さらに、小ＲＮＡを含んだ。広範な２８Ｓピークの構造は、溶出液におけるＤＮＡに起因し得る、またはＡｇｉｌｅｎｔチップの測定アーチファクトである可能性がある。沈殿バッファーにおけるＤＭＳＯなしで調製された溶出液は、有意に少ないＲＮＡを含み、さらに、大分子１８Ｓおよび２８Ｓ ＲＮＡの大部分を欠いた。このことは、沈殿混合物において非プロトン性極性有機溶媒を含むことの利点を強調する。

【0143】

ＲＴ^２ ＲＮＡ ＱＣ ＰＣＲアレイを使用して、各セットアップの４種の溶出液をさらに分析した。このアレイは、２種のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡと共に潜在的に存在するｇＤＮＡをとりわけ定量化する。より良い比較のため、図６および図７も、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して決定された試料のＲＮＡ含量を示す。

【0144】

ＲＮｅａｓｙ方法および本発明による沈殿に基づく方法（ＸＰ）の溶出液におけるｍＲＮＡ含量（２種のハウスキーピング遺伝子に基づき決定）は、実質的に同じであり、このことは、ｍＲＮＡが、先行技術方法とは対照的に、タンパク質沈殿ステップの間に除去されないが、本方法を使用すると回収することができることを明らかに実証する。ＲＮｅａｓｙ調製と比較して、本発明による方法を使用して得られる溶出液におけるより高い全体的な核酸量は、「ＲＴ対照なし」値からわかる通り、より高いＤＮＡ含量に起因し得る。ＱＩＡｚｏｌに基づくアプローチは、ハウスキーピング遺伝子１の最低濃度を示す。全体的な核酸含量もより低い。これは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒデータによって確認される。予想通り、ゲノムＤＮＡの量は、ＱＩＡｚｏｌに基づく調製物において最低である。ＤＭＳＯなしの沈殿バッファーにより得られる３種のＲＮＡ調製物は、比較してより悪い結果（より高いＣｔ値、低い全体的な核酸濃度）を示した。ＤＭＳＯなしの沈殿バッファーにより、得られたＣｔ値は、含有される核酸濃度に基づき予想されるものよりも２〜３Ｃｔ単位高い。核酸収率（６００ｎｇと比較して２００ｎｇ）に基づき、予想される最大差は、およそ１．５Ｃｔ前後にある。これは、Ａｇｉｌｅｎｔ分析と共に、タンパク質沈殿ステップにおけるＤＭＳＯ等の非プロトン性極性有機溶媒の使用の利点を実証する。沈殿ステップの間の非プロトン性極性有機溶媒の使用は、タンパク質枯渇上清からの大ＲＮＡの効率的な精製を可能にする。

【0145】

（実施例５）
組織試料からのｍｉＲＮＡ単離

【0146】

本発明による方法を使用して、異なる組織試料からもＲＮＡを単離した。この目的のため、ラット脳およびラット肝臓を破壊して、バッチ溶解物を用意した。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓスパイクイン対照を、バッチ溶解物に直接的に添加した。ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（マニュアルに従う）または本発明による沈殿に基づく方法のいずれかを使用して、溶解物からＲＮＡを並行して単離した。ＱＩＡｚｏｌにおいて直接的に、あるいは溶解バッファーＲＬＴ ｐｌｕｓ（ベータ−メルカプトエタノールを含む）において、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒを使用して、得られた溶解物をホモジナイズした。全体的に見て、調製物につきおよそ１０ｍｇ組織試料を処理した。予想される高いＲＮＡ含量のため、固相として、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムの代わりにＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎカラムを使用した。５０μｌ ＲＮａｓｅフリー水を使用して溶出を行った。方法および組織型につき６つの複製物を調製した。さらに、条件につき４つのさらなる複製物を調製し、追加的なオンカラムＤＮａｓｅ消化を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、各条件由来の溶出液をその後に分析した。ただし、肝臓から得た溶出液は、高いＲＮＡ含量のため、水で予め希釈した（１：１０）。

【0147】

結果を図８に示す。図からわかる通り、確立されたＱＩＡｚｏｌに基づく方法または本発明による方法を使用して、分析されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−１９１）と共に３種の分析されたｓｎｏＲＮＡ（ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６ａ）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析の間に基本的に同じＣｔ値が得られた。このことは、両方の方法が、異なる試料型を処理する場合であっても、同様の小ＲＮＡ単離効率を達成することを実証する。スパイクイン対照Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｍｉＲ−３９の単離効率において観察された差は、おそらく、溶解物における添加されたスパイクイン対照の異なる安定性に起因し得る。行われたＤＮＡｓｅ消化は、行われたｑＲＴ−ＰＣＲ分析の品質に、僅かな程度でしか寄与しない。これは、ＤＮａｓｅ消化を行う際に使用された、変化された洗浄プロトコールの結果である可能性があり（１×７００μｌ ＲＷＴの代わりに２×３５０μｌ ＲＷＴバッファー）、オンカラムＤＮａｓｅ消化ステップの間のカラムのより長い停留時間に潜在的に起因し得る。しかし、一般に、ＤＮａｓｅ消化の実行は可能であるが、特に、ｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ ＰＣＲシステムを使用してｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行う場合は必要ない。

【0148】

（実施例６）
沈殿の間に使用される有機溶媒の役割

【0149】

上述の通り、ＤＭＳＯ等、非プロトン性極性有機溶媒は、本発明による単離方法における小分子および大ＲＮＡの安定化に寄与し、ここで、タンパク質は、ＲＮＡを単離する前に沈殿される。実施例６において、相当する結果が、他の非プロトン性極性有機溶媒またはエタノールおよびイソプロパノール等のプロトン性有機溶媒を使用した場合に同様に達成されることが確認された。比較のため、水を検査した。次の溶媒を検査した：

【表3】

【0150】

表示されている異なる有機溶媒を含有した異なる沈殿バッファー変種を使用して、細胞溶解物（試料当たり１×１０^６個のジャーカット細胞、２００μｌ ＲＬＴバッファーに溶解）から全核酸を調製した。得られた溶出液の１．５μｌアリコートを０．８％アガロースゲルにおいて分離した。結果を図９に示す。

【0151】

図からわかる通り、検査した非プロトン性極性有機溶媒により、小ＲＮＡだけではなく大ＲＮＡも、タンパク質枯渇上清からの単離に成功した。さらに、高分子量ＤＮＡを単離することができた。したがって、検査した非プロトン性極性有機溶媒は、タンパク質枯渇上清からの小ＲＮＡ、大ＲＮＡおよび必要に応じて同様にゲノムＤＮＡの単離を可能にした。プロトン性有機溶媒イソプロパノールおよびエタノールを使用して、同様に小分子と共に大ＲＮＡ（単離されたｒＲＮＡからわかる通り）を単離することができた。したがって、本発明による沈殿条件の使用は、大ＲＮＡが、タンパク質沈殿ステップの間に失われたという結果をもたらさなかったが、そのような結果は先行技術方法に当てはまる。しかし、ゲノムＤＮＡ等、高分子量核酸は、沈殿ステップの間に有機溶媒としてエタノールまたはイソプロパノールを使用する場合、タンパク質沈殿ステップの間に、あるいはその後の単離の間に明らかに失われた。さらに、２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡの収率が有意に低下するため、代わりに水を使用しても、容認できる結果をもたらさない。

【0152】

数回の複製によって結果を確認した。さらに、溶出液において異なるｍｉＲＮＡを検出して、小ＲＮＡ収率を分析した。次表は、結果および２回の複製の標準偏差を示す：

【表4】

【0153】

上述の結果および図１０から明らかなように、実施例６は、小ＲＮＡの単離が、請求項に記載の有機溶媒の存在によってマイナスに影響されないという、上に記載されている観察を確認する。小ＲＮＡは、優れた収率での回収に成功する。さらに、非プロトン性極性有機溶媒を使用する場合、ｍｉＲＮＡ収率はさらに改善された。

【0154】

しかし、小ＲＮＡに加えて大ＲＮＡを単離するため、このような大ＲＮＡが、タンパク質沈殿ステップの間に失われることを防止し、これにより、その後のＲＮＡ単離ステップにおいてタンパク質枯渇上清から回収できることを確実にするために、請求項に記載の有機溶媒が、タンパク質沈殿ステップの間に存在することが必須である。さらに、結果が示すように、非プロトン性極性有機溶媒の使用は、特に、より大分子のＲＮＡと、同様に高分子量ＤＮＡの単離に関してより優れた結果をもたらす。

【0155】

（実施例７）
緩衝剤およびｐＨ値

【0156】

沈殿バッファーＸＰは、酢酸ナトリウムを含む。酢酸ナトリウムは、２種の重要な機能を果たすことができる。第１に、酢酸塩化合物は、ｐＨ緩衝効果をもたらすことができる。さらに、一価ナトリウムイオンは、核酸の電荷の中和を支持することができ、したがって、固相への核酸の結合を支持することができる。第２の効果は、実際のタンパク質沈殿ステップに関連性がない。したがって、酢酸ナトリウムを他の酢酸塩、特に、二価酢酸マグネシウムに交換することができるか検査した。結果は、沈殿バッファーからの酢酸塩、したがって、緩衝剤の省略が、単離された核酸のスペクトルに有意差をもたらしたことを実証する。さらに、沈殿ステップの完了後の酢酸ナトリウムのその後の添加も、本来のスペクトルを回復することができなかった。これは、酢酸ナトリウムの主要効果が、ｐＨ値の緩衝であり、優れたＲＮＡ単離結果をもたらすためにはこの緩衝が有利であるという結論を支持する。これは、酢酸ナトリウムの代わりに、クエン酸塩バッファーまたはピペラジン−１，４−ビス（プロパンスルホン酸）バッファー（ＰＩＰＰＳ）等、他の緩衝剤を代替として使用してもよいことが示された、追加的な実験によってさらに確認される。これらの代替緩衝剤も同様に、図１１に示す通り、高分子核酸の単離を可能にした。

【0157】

ｐＨ緩衝剤なしで調製された試料は、タンパク質沈殿ステップ後に、緩衝剤含有沈殿バッファー（ｐＨ４．３）により調製された試料よりも高いｐＨ値（ｐＨ５．５）を示した。さらに、細胞溶解物の代わりに血清試料からＲＮＡを単離する場合、ＲＮＡ結合ステップの間のイソプロパノールの添加後に、試料は混濁した。したがって、固相の混入および／または詰りを防止するために、沈殿混合物の、したがって、沈殿ステップの間のｐＨ値の緩衝が有利であることが判明し、これは、血清等、複雑な試料が処理される場合およびカラムが使用される場合に特に当てはまる。さらに、緩衝剤を含有しない沈殿溶液により調製された試料（「水」を参照）は、その後に行われたｍｉＳｃｒｉｐｔ ｍｉＲＮＡ分析における逆転写反応の阻害を有意により多く示した。結果を図１２に示す（ｍｉＲＴＣ＝逆転写対照；ＰＰＣ＝陽性ＰＣＲ対照）。

【0158】

さらに、ＸＰ沈殿バッファーにおける異なるｐＨ値を使用して調製されたｍｉＲＮＡの分析は、上述の観察を確認した。タンパク質に富んだ複雑な試料（ここでは：血清試料）を処理する場合、沈殿バッファーのより低いｐＨ値は、ＲＮＡ結合ステップにおけるアルコールの添加後の沈殿を防止し、これにより、使用されているカラムの混入または詰りの防止を支持した。結果を図１３に示す。

【0159】

さらに、異なる濃度の緩衝剤を検査した。結果は、広範な濃度範囲にわたる緩衝剤を使用できることを確認する。標準沈殿バッファーＸＰを使用した（上述を参照）が、この場合は酢酸ナトリウムの濃度を変動させた。沈殿バッファーＸＰにおける次の濃度で酢酸ナトリウムを検査した：２２７ｍＭ、４５５ｍＭ、６８２ｍＭ、９０９ｍＭ、１１３６ｍＭおよび１５９１ｍＭ（沈殿混合物における５２ｍＭ、１０４ｍＭ、１５６ｍＭ、２０８ｍＭ、２６０ｍＭおよび３６４ｍＭ酢酸ナトリウムに相当）。次の２表は、２回の複製から得られる異なるｍｉＲＮＡの検出の結果および標準偏差（ｓｔｄ）を示す：

【表5】

【0160】

沈殿混合物における１２５ｍＭ〜３００ｍＭまたは１５０ｍｍ〜２７５ｍＭの濃度が特に好まれる。

【0161】

（実施例８）
沈殿バッファーにおいて使用される金属カチオン

【0162】

上述の通り、沈殿バッファーにおいて、亜鉛は、タンパク質を沈殿させるための機能を果たす。血清代用物としてＰＢＳにおけるＢＳＡ（４０ｇ／ｌ）を使用した人工的なセットアップにおいて、亜鉛の代わりに三価アルミニウムイオンを使用して、タンパク質を同様に沈殿させることができた。二価カルシウムまたはマンガンイオンも、タンパク質を沈殿させたが、検査した条件（ｐＨ値、濃度、溶媒）下ではゆっくりでしかなく、したがって、Ｚｎ^２＋およびＡｌ^３＋ほど適していない。したがって、一実施形態によれば、かかるゆっくりした金属カチオン沈殿剤は使用されない。亜鉛が好まれる。

【0163】

（実施例９）
有機溶媒および金属カチオン沈殿剤の濃度範囲

【0164】

さらに、異なる濃度の有機溶媒および金属カチオン（亜鉛）を分析した。細胞溶解物および血清試料から核酸を単離した。図１４は、沈殿混合物（試料、溶解バッファーおよび沈殿バッファーＸＰを含む）におけるそれぞれの構成成分の濃度を示す。

【0165】

有機溶媒の濃度の結果
図１４によって実証される通り、大ＲＮＡも効率的に単離するために、既に、沈殿バッファーにおける１５％ＤＭＳＯ（沈殿混合物における最終濃度３．４％）が適している。沈殿バッファーＸＰにおける３０％ＤＭＳＯ（沈殿混合物における最終濃度６．９％）を使用する場合、さらに、ゲノムＤＮＡ等、高分子核酸を単離することができた。したがって、有機溶媒の濃度の選択は、どの種類の核酸が、上清に存在し続けるか、したがって、単離することができるかに影響する。しかし、沈殿バッファーにおけるより高濃度の７５％ＤＭＳＯの使用（沈殿混合物における最終濃度１７．２％）は、大ＲＮＡの収率を低下させたが、高分子ＤＮＡは、上清から依然として単離することができた。さらにより高濃度のＤＭＳＯは、小ＲＮＡのみを単離することができる結果をもたらした。しかし、この場合、ゲル分析によると、小ＲＮＡの全体的な収率も低下されると思われた（図１４、２５．６％ＤＭＳＯを参照）。したがって、沈殿混合物における本発明に従って使用される有機溶媒の濃度は、重要であり、好まれる濃度範囲は、沈殿混合物における３．４〜１５％の間にある。これらの濃度は、例えば、本発明に従って１５％〜６０％の間の有機溶媒を含む沈殿バッファーを使用して達成することができる。それぞれの濃度範囲は、沈殿物の除去後に、小分子と共に大ＲＮＡを含むタンパク質枯渇上清をもたらすのに特に適しており、続いてこのＲＮＡは、前記上清から単離することができる。単離されたｍｉＲＮＡの分析は、濃度が高すぎない限り、ＤＭＳＯが存在するか存在しないかにかかわらず、同様に十分に小分子核酸が単離されたことを示した。例えば、図４および図１４によって実証される通り、数種類のｍｉＲＮＡに関して、有機溶媒が存在する場合、結果はさらに改善された。例えば、ＤＭＳＯが存在する場合（沈殿混合物における少なくとも３．４％最終濃度）、ｍｉＲ−１９１をより効率的に単離することができる。大ＲＮＡの単離を可能にするために、本明細書において実証される通り、有機溶媒は非常に重要である。有機溶媒が存在しない場合、または濃度が高すぎて、特許請求される範囲の外側にある場合、大ＲＮＡは、上清に存在しない、それぞれ、ごく少量存在する。

【0166】

沈殿剤、塩化亜鉛の結果
結果を図１４および図１６に示す。沈殿剤、塩化亜鉛の場合、タンパク質を沈殿させるために、既に最小の検査した量の塩化亜鉛（沈殿バッファーにおける０．２１２Ｍ、これは、沈殿混合物における４８ｍＭ最終濃度に相当）で十分である。沈殿バッファーにおける最大２．５５Ｍの塩化亜鉛濃度（沈殿混合物における最終濃度５８２ｍＭ）は、細胞溶解物から全核酸調製物をもたらすのに同様に適している。さらにより高濃度（沈殿バッファーＸＰにおける３．１８Ｍ、これは沈殿混合物における７２８ｍＭ最終濃度に相当）を使用する場合、図１４から明らかな通り、高分子核酸（ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｃｉｄ）の単離は妨害される。血清からのｍｉＲＮＡ単離に関して、沈殿バッファーにおける０．２１２Ｍおよび０．６３Ｍ塩化亜鉛の濃度（最終濃度それぞれ４８ｍＭ、１４５ｍＭ）が、検査されたより高濃度ほど効率的に、ｍｉＲＮＡの単離に寄与しないことが示された。したがって、金属カチオン沈殿剤の好まれる範囲は、例えば、沈殿混合物における２９０〜５８０ｍＭである。これは、例えば１．２７〜２．５５Ｍ塩化亜鉛を含む沈殿バッファーを使用することにより達成することができる。

【0167】

（実施例１０）
破壊試薬の添加

【0168】

実施例１０において、沈殿混合物を調製する前に、したがって、沈殿バッファーを添加する前に試料が破壊されることが、血清試料等の複雑な試料に決定的であるか検査した。参照として、上に記載されている標準手順に従った。先ず、１２０μｌ破壊試薬（溶解バッファーＲＬＴ Ｐｌｕｓ）を血清試料に添加し、インキュベートし、続いて９５μｌ ＸＰバッファーを添加する。この標準方法の変形において、９５μｌ ＸＰバッファーを１２０μｌ ＲＬＴ Ｐｌｕｓと混合し、次にそれぞれの混合物を血清試料に添加した。したがって、本実施形態では、沈殿混合物の調製および試料の破壊を同時に行った。結果をその後の表に示す：

【表6】

【0169】

表からわかる通り、沈殿混合物の調製の前に、あるいはその最中に溶解バッファーが添加されたかは、本質的な差を生じなかった。したがって、沈殿バッファーが添加される前に試料を先ず破壊することは必須ではない。しかし、沈殿プロセス中に破壊剤、好ましくは、カオトロピック塩が存在することが有益であることが判明した。

【0170】

（実施例１１）
破壊試薬により溶解された試料の沈殿

【0171】

異なるより高いカオトロピック剤濃度の存在下での沈殿も検査するために、１％ベータ−メルカプトエタノールの存在下で５．８Ｍ ＧＴＣ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含む５ｍｌ溶解バッファーにおいて８００ｍｇ組織を溶解することにより、ラット肝臓組織からバッチ溶解物を調製した。溶解物をホモジナイズし、残る固体粒子を除去するためにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを通して濾過した。沈殿の間にカオトロピック塩（ＧＴＣ）の濃度を変動させるために、次に、溶解バッファーと同じ組成を有するがカオトロープを欠く異なる量の希釈バッファー（３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０）で、また、溶解バッファーで、得られた溶解物を希釈した。使用した溶解物、希釈バッファーおよび溶解バッファーの量を下表に示す。表は、得られた希釈溶解物におけるカオトロピック剤濃度および沈殿混合物に存在する最終カオトロピック塩濃度も示す。

【表7】

【0172】

次に、希釈した溶解物（３００μｌ）を、沈殿バッファーＸＰとまたは同じ組成を有するがＤＭＳＯの代わりにプロトン性溶媒エタノールを含む沈殿バッファーと混合した。沈殿後に、試料を遠心分離し、得られた上清から核酸を単離した。そのような目的のため、上清を等容量（３４０μｌ）のイソプロパノールと混合した。混合物をＲＮｅａｓｙカラムにアプライした。核酸を結合させた後に、カラムを７００μｌバッファーＲＷ１で洗浄し、続いて７００μｌ ＲＰＥで２回洗浄し、５０μｌ Ｈ_２Ｏで溶出させた。その後、ゲルにおいて核酸を分離した。

【0173】

結果
図１７は、得られた結果を示す。プロトン性（ＥｔＯＨ、左ゲル）および非プロトン性（ＤＭＳＯ、右ゲル）有機溶媒を使用した。Ｍ＝マーカー；沈殿混合物におけるカオトロピック塩濃度（４．０〜２．５Ｍに及ぶ）をレーン毎に示す。結果は、ある範囲のカオトロピック剤濃度にわたって、プロトン性および非プロトン性有機溶媒の存在下で、大ＲＮＡを含む大分子核酸を単離することができることを実証する。検査した４．０〜２．５Ｍの例示的な範囲は、優れた結果を生じた。

【0174】

（実施例１２）
非プロトン性およびプロトン性有機溶媒の濃度範囲

【0175】

さらに、さらに別の濃度の有機溶媒を分析した。例示的な非プロトン性およびプロトン性溶媒としてそれぞれＤＭＳＯおよびＥｔＯＨを使用した。核酸を単離し、ゲルを泳動して、異なる濃度のＤＭＳＯまたはＥｔＯＨを含んだ沈殿バッファーを使用した、沈殿に基づくプロトコールにより得た溶出液に含有される核酸を分離した。

【0176】

結果
結果を図１８に示す。図は、ＤＭＳＯ（上パネル）およびＥｔＯＨ（下パネル）の結果を示す。Ｍ＝マーカー；レーン毎のパーセント値は、沈殿混合物におけるパーセントＤＭＳＯまたはＥｔＯＨを示す。図１８によって実証される通り、沈殿混合物における２％非プロトン性またはプロトン性有機溶媒の最終濃度は、大ＲＮＡを効率的に単離するために既に適している。この知見は、僅かにより高濃度の３％ＤＭＳＯまたはＥｔＯＨを使用して同様に確認された。ゲノムＤＮＡ等、高分子核酸をさらに別の検査した濃度において単離することもでき、これにより、最終有機溶媒濃度６．９％でゲノムＤＮＡを単離することができたという実施例９の知見を確認した。比較的高い有機溶媒濃度１４％を使用した場合でも、大ＲＮＡを溶出液から依然として回収することができた。

【0177】

したがって、２％もの低さの非プロトン性またはプロトン性有機溶媒の濃度は、沈殿物の除去後に、小ＲＮＡに加えて大ＲＮＡを含む大分子核酸を依然として含むタンパク質枯渇上清をもたらすのに適している。したがって、小分子および大分子核酸は、前記上清から単離することができる。本実施例は、濃度が高すぎない限り、例えば１４％等、本明細書に定義されている範囲内のより高濃度の有機溶媒においても大ＲＮＡを単離することができることを確認する（上述の実施例９を参照）。さらに、実施例は、タンパク質沈殿の間の大分子核酸の安定化に対するプロトン性および非プロトン性有機溶媒の適合性を確認する。

【0178】

（実施例１３）
異なる酸性ｐＨ値の沈殿バッファーを使用した大分子核酸の単離

【0179】

１％ベータ−メルカプトエタノールの存在下で２．７８Ｍ ＧＴＣ、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０を含む６ｍｌ溶解バッファーにおいて４００ｍｇ組織を溶解することにより、ラット肝臓組織からバッチ溶解物を調製した。溶解物をホモジナイズし、残る固体粒子を除去するために、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを通して濾過した。酢酸でｐＨを調整することにより、異なるｐＨ値を有するＸＰバッファーを調製した。

【0180】

検査するｐＨ値毎に、３００μｌの溶解物を９０μｌのそれぞれのＸＰバッファーと組み合わせた。遠心分離により沈殿物を除去し、清澄な上清（およそ３６０μｌ）を４４０μｌのイソプロパノールと組み合わせて、５５％の最終イソプロパノール濃度を得た。混合物をＲＮｅａｓｙカラムにアプライした。遠心分離後に、カラムを７００μｌのバッファーＲＷ１で１回洗浄し、続いて７００μｌ ＲＰＥで２回洗浄し、５０μｌ Ｈ_２Ｏで溶出させた。単離された核酸の濃度および純度を決定した。

【0181】

結果
異なる検査したｐＨ値３．３０〜４．７５の結果を下表に示す：

【表8】

【0182】

これらの結果は、異なる酸性ｐＨ値の沈殿バッファーを使用したタンパク質沈殿後に、上清から大ＲＮＡを優れた収率で単離することができることを再度実証する。

【0183】

（実施例１４）
異なるｐＨ値の沈殿バッファーを使用した小ＲＮＡの単離

【0184】

さらに別の実験において、標準プロトコールに記載されている通りに、沈殿バッファーＸＰを使用して血清試料からＲＮＡを単離した。沈殿バッファーのｐＨ値を酢酸で調整して、異なる酸性ｐＨ値のバッファーを得た。

【0185】

結果
追加的なｐＨ値に関して実施例７の結果を確認した。ｐＨ３．３〜ｐＨ４．７５に及ぶｐＨ値により、複雑なタンパク質に富んだ血清試料においても、ＲＮＡ結合ステップの間のイソプロパノールの添加後の濁りを回避することが可能であった。カラムの混入および詰りを回避した。ｍｉＲＮＡを優れた収率で単離した；ｍｉＳｃｒｉｐｔアッセイを使用したｍｉＲＮＡ分析の結果を図１９に示す（ｍｉＲＴＣ＝逆転写対照；ＰＰＣ＝陽性ＰＣＲ対照）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】