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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2017-521101(P2017-521101A)
(43)【公表日】2017年8月3日
(54)【発明の名称】Ｔリンパ球へのベクター導入効率の改善方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20170707BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20170707BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 A
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】26
(21)【出願番号】特願2017-522459(P2017-522459)
(86)(22)【出願日】2015年7月10日
(85)【翻訳文提出日】2017年2月28日
(86)【国際出願番号】US2015039892
(87)【国際公開番号】WO2016007827
(87)【国際公開日】20160114
(31)【優先権主張番号】62/023,618
(32)【優先日】2014年7月11日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US
(71)【出願人】
【識別番号】517009051
【氏名又は名称】アントフロゲネシス コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】ビタオ リアング
(72)【発明者】
【氏名】ウェイ リウ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB25
4B065BC03
4B065BD25
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA60
(57)【要約】
細胞、例えば、初代ヒトＴリンパ球へのベクターの導入効率の亢進方法を本明細書に提供する。【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
初代Ｔリンパ球をｉ）核酸を含むウイルスベクター及びｉｉ）自然免疫系の阻害薬である化合物と接触させ、それにより前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入されることを含む、初代Ｔリンパ球の導入方法。
【請求項2】
前記初代Ｔリンパ球は、ヒト初代Ｔリンパ球である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記初代Ｔリンパ球を前記化合物と接触させることは、前記ウイルスベクターと前記接触させることの前に、前記接触させることと同時に及び／または前記接触させることの後に生じる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸は、長さ１０キロベース（ｋｂ）超である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記核酸は、長さ約９〜２０ｋｂである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸は、キメラ抗原受容体をコードする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記化合物は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記化合物は、ＢＸ７９５である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ＢＸ７９５は、４〜８μＭのＢＸ７９５である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記化合物は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記化合物は、２−アミノプリンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
２−アミノプリンは、２．５〜１０μＭの２−アミノプリンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクターと接触させる前に、前記初代Ｔリンパ球を、Ｔ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と接触させることをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記作用因子は、抗体または抗原結合フラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８へ特異的に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記作用因子は、前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクターと接触させる前に前記初代Ｔリンパ球を２４時間接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターは、１．５〜２．５の感染効率（ＭＯＩ）で前記初代Ｔリンパ球と接触する、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記初代Ｔリンパ球を前記化合物と接触させることは、前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクターと接触させる３時間前に生じる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記初代Ｔリンパ球を前記ウイルスベクター及び前記化合物と接触させることは、少なくとも６時間同時に生じる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記初代Ｔリンパ球を形質転換試薬及びサイトカインと接触させることをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記形質転換試薬は、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファートである、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項24】
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、及びｉｉ）ＢＸ７９５と接触させ、それにより前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入されることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法。
【請求項25】
前記ＢＸ７９５は、６μＭのＢＸ７９５である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ヒト初代Ｔリンパ球の前記接触することは、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記リンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターと前記接触させることの前に３時間生じる、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記化合物と前記接触させることは、少なくとも６時間同時に生じる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、及びｉｉ）６μＭのＢＸ７９５と接触させることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法であって、ヒト初代Ｔリンパ球を６μＭのＢＸ７９５と前記接触させることは、３時間生じ、次いで、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記６μＭのＢＸ７９５と同時に少なくとも６時間接触させ、それにより前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入される、前記方法。
【請求項29】
ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターと接触させ、それにより前記核酸が前記Ｔリンパ球中へと導入されることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法。
【請求項30】
前記２−アミノプリンは、２．５〜１０μＭの２−アミノプリンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ヒト初代Ｔリンパ球の前記接触は、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターと前記接触させることの前に９０分間生じる、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記化合物と前記接触させることは、少なくとも５時間同時に生じる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
ヒト初代Ｔリンパ球をジエチルアミノエチル−デキストラン及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及びｉｉ）２．５〜１０μＭの２−アミノプリンと接触させることを含む、ヒト初代Ｔリンパ球の導入方法であって、前記ヒト初代Ｔリンパ球と前記２．５〜１０μＭの２−アミノプリンとの接触は、９０分間生じ、それに次いで、前記ヒト初代Ｔリンパ球を前記前記レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター及び前記２．５〜１０μＭの２−アミノプリンとの少なくとも５時間の同時の接触があり、それにより、前記核酸は前記Ｔリンパ球中へと導入される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１４年７月１１日出願の米国仮特許出願第６２／０２３，６１８号の優先権の利益を請求する。
【0002】
（１．分野）本明細書における開示は、細胞へのベクターの導入効率の改善方法に関する。
【背景技術】
【0003】
（２．背景）Ｔリンパ球は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原を含む、特異的抗原を認識して当該特異的抗原と相互作用する。Ｔリンパ球は、腫瘍細胞を殺滅することができるので、ここ２５年間は、抗原特異的Ｔリンパ球、または１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するよう遺伝的に修飾されたＴリンパ球のいずれかであるＴリンパ球を用いて腫瘍細胞を標的化することへかなり大きな関心が見られる（例えば、Ｅｓｈｈａｒ，米国特許第７，７４１，４６５号、Ｅｓｈｈａｒ，米国特許出願公開第２０１２／００９３８４２号を参照されたい）。Ｔリンパ球からのＣＡＲの誘導の効率を亢進するための新たな方法についての需要が当該分野にはある。
【発明の概要】
【0004】
（３．概要）遺伝的に修飾された細胞、例えば、Ｔリンパ球、例えばヒトＴリンパ球、例えば、初代Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）のような免疫細胞の作製効率の亢進方法を本明細書に提供する。任意の特定の機序または理論に結び付けられようとすることなく、自然免疫系は、ＣＡＲ Ｔ細胞作製のウイルス導入工程を阻害することがあると考えられ、したがって、自然免疫系の活性を阻害すること（例えば、ウイルス導入及び／またはその後のウイルスタンパク質産生を阻害する自然免疫系の能力を阻害すること）によって、ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター）を用いたＣＡＲ Ｔ細胞誘導は、改善することができる。
【0005】
本明細書に提供する方法は、任意の細胞タイプ、特に任意の哺乳類細胞、例えば、任意のヒト細胞、例えば、細胞治療薬、ヒト細胞治療薬に使用する細胞と共に使用してもよい。当該方法が使用してもよい細胞の非限定例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（例えば、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第８，２６３，０６５号においてまたは米国出願第２０１２／０１４８５５３号において開示される胎盤性中間型ナチュラルキラー細胞）、樹状細胞（ＤＣ）、胎盤性幹細胞（例えば、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第７，４６８，２７６号、第８，０５７，７８８号及び第８，２０２，７０３号に開示される胎盤性幹細胞）、羊膜由来接着細胞（ＡＭＤＡＣ）（例えば、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第８，３６７，４０９号に開示されるＡＭＤＡＣ）、腫瘍浸潤リンパ球、ウイルスパッケージング細胞（例えば、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞）、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄、歯髄、脂肪組織、骨軟骨性組織、及びこれらに類するものに由来の間葉様幹細胞（または間葉系幹細胞若しくは間葉系間質細胞）、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、神経堤幹細胞、神経幹細胞、ならびに分化細胞（例えば、線維芽細胞など）が挙げられるが、それらに限定しない。本方法は、例えば、動物モデルの実験目的のために腫瘍細胞株においても使用してもよい。
【0006】
ある実施形態において、本明細書に説明する方法には、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を導入すること（例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルスで導入すること）を含んでもよい。ある実施形態において、本明細書に説明する方法には、当該導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前、当該導入と同時に、または当該導入の後に、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を自然免疫系の阻害薬である化合物と接触させることを含んでもよい。特定の実施形態において、導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞へ、１０キロ塩基超の単離した核酸を導入する。さらに別の実施形態において、当該細胞へと（例えば、レトロウイルス導入、例えば、初代ヒトＴリンパ球へのレンチウイルス導入を介して）導入した当該単離した核酸、例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、１つ以上のタンパク質をコードし、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする。
【0007】
特定の実施形態において、導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）中に当該細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）と接触するよう本明細書に説明する方法において使用する化合物は、自然免疫系の阻害薬である。特定の実施形態において、自然免疫系の当該阻害薬は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）及び／またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の阻害薬である。具体的な実施形態において、当該化合物は、ＢＸ７９５である。具体的な実施形態において、自然免疫系の当該阻害薬は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬である。具体的な実施形態において、当該化合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）である。
【0008】
本明細書に説明する方法の一実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いた導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に、当該導入と同時に、または当該導入の後に、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分間、２時間または３時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）と同時に、かつその後２時間、４時間、または６時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させられる。別の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の前に３０分間、６０分間、２時間または３時間、かつ導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）と同時にその後２時間、４時間または６時間、本明細書に説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５ ２−ＡＰ）と接触させられる。具体的な実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、１〜２０μＭの濃度で使用する。別の実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、２．５〜１０μＭの濃度で使用する。さらに別の実施形態において、本明細書に説明する当該化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）は、４〜８μＭの濃度で使用する。
【0009】
一実施形態において、本明細書に提供する方法は、ベクター、例えばウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス、例えばレンチウイルス導入）の前にまたは当該導入と同時に、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を形質転換試薬（例えば、ジエチルアミノエチルデキストランまたはプロタミンスルファート）と接触させることを追加的に含む。
【0010】
本明細書に説明する方法の一実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、ベクター、例えばウイルスベクターによる導入（例えば、レトロウイルス導入、例えばレンチウイルス導入）の前に、Ｔ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と追加的に接触する。特定の実施形態において、当該作用因子は、抗体または抗原結合フラグメントである。特定の実施形態において、当該抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８を特異的に結合する。特定の実施形態において、当該抗体または抗原結合フラグメントは、固体基質（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））へカップリングする。別の特定の実施形態において、当該抗体若しくは抗原結合フラグメント（複数可）（例えば、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８）は、固体表面、例えば同じ固体表面上には存在しないが、代わりに、溶液中に存在し、または細胞への抗体若しくは抗原結合フラグメント（複数可）の提示を許容する別の化合物または組成物と複合体形成し、例えば、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、ポリマー、ヒドロゲル、アルブミン、及び／または疎水性分子と複合体形成する。ある実施形態において、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）が複合体形成する分子は、アジュバントではない。別の実施形態において、当該接触することは、ベクター、例えば、ウイルスベクターによる当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の少なくとも４８時間前、少なくとも４４時間前、少なくとも４０時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも３２時間前、少なくとも２８時間前、少なくとも２４時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも８時間前または少なくとも４時間前に生じる。
【0011】
本明細書に説明する方法の特定の実施形態において、細胞（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、１．５〜３．０の感染効率（ＭＯＩ）でウイルス（例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス）により導入される。
【0012】
具体的な実施形態において、本明細書に提供されるのは、初代Ｔリンパ球をｉ）核酸を含むウイルスベクター（例えば、レトウイルス（ｒｅｔｏｖｉｒａｌ）ベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）自然免疫系の阻害薬である化合物と接触させ、それにより核酸がＴリンパ球中へと導入されることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。別の具体的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ球を当該化合物と当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触させることの前（例えば、３０分前、１時間前、２時間前、３時間前、４時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前または１０時間前）及び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ウイルスベクターは、１つ以上のタンパク質、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む。
【0013】
別の具体的な実施形態において、当該化合物は、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する。別の具体的な実施形態において、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の活性を阻害する当該化合物は、ＢＸ７９５（例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭまたは１０μＭのＢＸ７９５）である。別の具体的な実施形態において、当該化合物は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する。別の具体的な実施形態において、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の活性を阻害する当該化合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）（例えば、１μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭまたは１０μＭの２−ＡＰ）である。
【0014】
別の具体的な実施形態において、初代Ｔリンパ球の導入方法はさらに、当該初代Ｔリンパ球を、初代Ｔリンパ球をウイルスベクターと接触させることの前にＴ細胞受容体複合体を刺激することのできる作用因子と接触させることを含む。具体的な実施形態において、当該作用因子は、抗体または抗原結合フラグメント、例えば、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８へ特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントである。別の具体的な実施形態において、初代Ｔリンパ球の導入方法はさらに、初代Ｔリンパ球を形質転換試薬（例えば、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート）及び任意にサイトカイン（例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）またはインターロイキン２１（ＩＬ−２１））と接触させることを含む。
【0015】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ヒト初代Ｔリンパ球をｉ）１つ以上のタンパク質、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及び核酸がＴリンパ球に導入される、ｉｉ）ＢＸ７９５（例えば、６μＭのＢＸ７９５）と接触させることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。具体的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ球をＢＸ７９５と当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触させることの前（例えば、３時間前、６時間前）及び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【0016】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクター、及びｉｉ）６μＭのＢＸ７９５と接触させることを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法であり、この中でヒト初代Ｔリンパ球を６μＭのＢＸ７９５と接触させることは約３時間生じ、次いでヒト初代Ｔリンパ球をウイルスベクター及び６μＭのＢＸ７９５と同時に少なくとも６時間接触させ、それにより核酸はＴリンパ球中へと導入される。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【0017】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２−ＡＰ（例えば、２．５〜１０μＭの２−ＡＰ）と接触させ、それにより核酸をＴリンパ球中へと導入することを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法である。具体的な実施形態において、当該初代Ｔリンパ球を２−ＡＰと当該接触させることは、当該Ｔリンパ球を当該ウイルスベクターと接触させることの前に（例えば、９０分前、２時間前、または３時間前に）及び／または同時に生じる。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【0018】
別の具体的な実施形態において、本明細書に提供するのは、ヒト初代Ｔリンパ球を、ジエチルアミノエチル−デキストランまたはプロタミンスルファート及びインターロイキン２の存在下で、ｉ）キメラ抗原受容体をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、及びｉｉ）２．５〜１０μＭの２−ＡＰを含む、初代Ｔリンパ球（例えば、ヒト初代Ｔリンパ球）の導入方法であり、この中で、ヒト初代Ｔリンパ球を２．５〜１０μＭの２−ＡＰと接触させることは、９０分間生じ、それに次いで、ヒト初代Ｔリンパ球をウイルスベクター及び２．５〜１０μＭの２−ＡＰと同時に５時間接触させ、それにより核酸はＴリンパ球中へと導入される。別の具体的な実施形態において、当該ベクターは、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１Ａ及び図１Ｂは、キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスを用いた初代Ｔリンパ球の導入効率に及ぼす、ＤＥＡＥ−デキストラン単独の同時処理（図１Ａ）またはＤＥＡＥ−デキストランの存在下でのＢＸ７９５による同時処理（１μＭ、２μＭ、４μＭ、６μＭ、８μＭ及び１０μＭの濃度における図１Ｂ）の効果を示す。
【0020】
【図2】レンチウイルス導入効率に及ぼすＢＸ７９５処理の効果を示す。キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスを用いて導入した初代Ｔリンパ球の導入効率は、種々の条件、すなわち（ｉ）ＢＸ７９５前処理、（ｉｉ）ＢＸ７９５同時処理、（ｉｉｉ）ＢＸ７９５前処理及び同時処理の併用ならびに（ｉｖ）対照処理について評価した。
【0021】
【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、初代ヒトＴリンパ球の生存率に及ぼす形質転換試薬ＤＥＡＥ−デキストラン及びプロタミンスルファートの効果（図３Ａ）ならびにレンチウイルスにより導入された初代ヒトＴリンパ球の生存率に及ぼすＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファートの存在下での種々の濃度の２−ＡＰの効果を示す。
【0022】
【発明を実施するための形態】
【0023】
（５．詳細な説明）（５．１．導入方法）
（５．１．１．細胞）
本明細書に説明する方法において使用することのできる細胞の非限定例としては、Ｔリンパ球、樹状細胞（ＤＣ）、胎盤幹細胞（例えば、それらの開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第７，４６８，２７６号、第８，０５７，７８８号及び第８，２０２，７０３号において開示される胎盤幹細胞）、臍帯血由来の間葉様幹細胞、胎盤血、末梢血、骨髄、歯髄、脂肪組織、骨軟骨性組織、及びこれらに類するもの、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、神経堤幹細胞、神経幹細胞、ならびに分化細胞（例えば、線維芽細胞など）が挙げられる。本方法は、例えば、動物モデルの実験目的のために腫瘍細胞株においても使用してもよい。特定の実施形態において、本明細書に説明する方法の細胞は、初代細胞であり得る。初代細胞は、当該技術分野において周知であり、細胞老化の開始に至らない量についてインビトロで培養または増殖される、及び細胞の不死化に至る様式で培養または増殖されていない、対象（例えば、ヒト）から抽出した細胞を含み得る。具体的な実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する細胞は、ヒトＴリンパ球である。別の具体的な実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する細胞は、ナチュラルキラー細胞ではない。別の具体的な実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する細胞は、Ｔリンパ球細胞株ではない。
【0024】
具体的な実施形態において、本明細書に提供する方法において使用する細胞は、初代Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）である。本明細書に提供する方法において使用する初代Ｔリンパ球は、天然のＴリンパ球またはＭＨＣの制限されたＴリンパ球であってもよい。ある実施形態において、当該Ｔリンパ球は、ＣＤ４＋である。他の実施形態において、当該Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋である。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球は、腫瘍生検から単離されており、または腫瘍生検から単離されたＴリンパ球から増殖されている。ある実施形態において、当該初代Ｔリンパ球は、末梢血、臍帯血、またはリンパから単離され、またはそれらから単離されたＴリンパ球から増殖されている。ある実施形態において、当該Ｔリンパ球は、特定の個体、例えば、当該Ｔリンパ球の被移植者に関して同種である。ある他の実施形態において、当該Ｔリンパ球は、ある個体、例えば、当該Ｔリンパ球の被移植者に関して同種である。ある実施形態において、当該Ｔリンパ球は、特定の個体、例えば、当該Ｔリンパ球の被移植者に関して自己である。
【0025】
一実施形態において、初代Ｔリンパ球は、個体から得られ、任意に増殖され、次に１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を使用する本明細書に説明する方法を用いて導入され、次に任意に増殖される。第５．２節を参照されたい。Ｔリンパ球は、例えば、培養物中のＴリンパ球を、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８に対する抗体、例えば、ビーズへまたは細胞培養プレートの表面へ付着した抗体と接触させることによって増殖することができ、例えば、米国特許第５，９４８，８９３号、第６，５３４，０５５号、第６，３５２，６９４号、第６，６９２，９６４号、第６，８８７，４６６号、及び第６，９０５，６８１号を参照されたい。具体的な実施形態において、当該抗体は、抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８であり、当該抗体は、固体表面へは結合しない（例えば、当該抗体は、溶液中のＴリンパ球と接触する）。他の具体的な実施形態において、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体のいずれかは、固体表面（例えば、ビーズ、組織培養皿プラスチック）へ結合し、もう１つの抗体は、固体表面へ結合していない（例えば、溶液中に存在する）。
【0026】
ある実施形態において、本明細書に説明する方法において使用する初代Ｔリンパ球は、腫瘍から単離され、例えば、腫瘍浸潤リンパ球である。特定の実施形態において、このようなＴリンパ球は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して特異的である。第５．２．２節を参照されたい。
【0027】
（５．１．２．形質転換試薬）本明細書において使用する場合、「導入」、「形質転換」、及び「トランスフェクション」のような用語は、別段の記載がない限り、相互交換可能に使用する。細胞の導入方法は、当該技術分野で周知である。導入中、小分子及び／またはポリマーは、例えば、細胞培養物へ添加されて、関心対象のタンパク質及び／または核酸の結合及び／または取り込みを容易にし得る。特に、小さな極性化合物は、培養条件へ付加して、その中にあるウイルス及び核酸（複数可）の結合及び導入を容易にすることができる。例示的な形質転換試薬としては、リポフェクタミン（登録商標）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）、リン酸カルシウム、ジエチルアミノエチルセルロース−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストランまたはＤＤ）、及びプロタミンスルファートが挙げられるが、これらに限定しない。本明細書に説明する方法に関するある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、ＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファートの存在下で生じる。本明細書に説明する方法の特定の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、ＤＥＡＥ−デキストラン、例えば、１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファート、例えば、１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で生じる。
【0028】
（５．１．３．培養条件及びＴリンパ球の活性化）本明細書に説明する細胞は、導入（例えば、ウイルス導入）を容易にするまたは亢進するために特異的な培養条件下で維持することができる。特定の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、導入の前にまたは同時に、Ｔリンパ球共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ３及び／またはＣＤ４５）へ特異的に結合する抗原または抗原結合フラグメントによって活性化される。別の実施形態において、当該抗体または抗原結合フラグメントは、固体基質（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））へカップリングされる。特定の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、導入（例えば、ウイルス導入）の２４時間前に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）へカップリングされた抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び／または抗ＣＤ４５抗体によって刺激される。別の特定の実施形態において、（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び／若しくは抗ＣＤ４５抗体または他派これらの抗原結合フラグメント（複数可）の）当該抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、固体表面上には存在しないが、代わりに、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）の提示を許容する別の化合物または組成物と複合体形成し、例えば、抗体または抗原結合フラグメント（複数可）は、ポリマー、ヒドロゲル、アルブミン、及び／または疎水性分子と複合体形成する。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントと複合体形成したこのような分子（複数可）は、アジュバントではない。別の実施形態において、当該接触することは、ウイルスベクターによる当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の少なくとも４８時間前、少なくとも４４時間前、少なくとも４０時間前、少なくとも３６時間前、少なくとも３２時間前、少なくとも２８時間前、少なくとも２４時間前、少なくとも２０時間前、少なくとも１６時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも８時間前または少なくとも４時間前に生じる。さらに別の実施形態において、当該接触することは、ウイルスベクターによる当該細胞の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）の少なくとも４８時間〜４０時間前、４４時間〜３６時間前、４０時間〜３２時間前、３６時間〜２８時間前、３２時間〜２４時間前、２８時間〜２０時間前、２４時間〜１６時間前、２０時間〜１２時間前、１６時間〜８時間前、１２時間〜４時間前または少なくとも８時間〜１時間前に生じる。
【0029】
別の実施形態において、Ｔリンパ球の活性化及び／または増殖を刺激するサイトカイン及び／または増殖因子は、導入の前にまたは同時に添加することができる。特定の実施形態において、インターロイキン２（ＩＬ−２）、例えば、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２は、導入（例えば、ウイルス導入）の前または同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。別の実施形態において、インターロイキン７（ＩＬ−７）、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７は、導入（例えば、ウイルス導入）の前にまたは同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。別の実施形態において、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２は、導入（例えば、ウイルス導入）の前にまたは同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。別の実施形態において、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、例えば、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５は、導入（例えば、ウイルス導入）の前または同時にＴリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。さらに別の実施形態において、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、例えば、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１は、導入（例えば、ウイルス導入）の前または同時に、Ｔリンパ球培養物（例えば、初代ヒトＴリンパ球培養物）へ添加される。
【0030】
（５．１．４．自然免疫の阻害薬）自然免疫系は、合成ウイルスを含むウイルスの遺伝子の発現を抑圧することができる。自然免疫系が、二本鎖ＲＮＡ及び他の病原性巨大分子によって惹起することができかつ、自然免疫活性が容易に測定できる（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンδ、インターフェロンζ、インターフェロンκ及びインターフェロンτを含むがこれらに限定しないインターフェロンタンパク質の分泌レベル）タンパク質（例えば、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１））を含むことは、当該技術分野で周知である。したがって、本明細書に説明する方法の特定の実施形態において、培養細胞は自然免疫の阻害薬と接触する。別の実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、自然免疫シグナル伝達を阻害する化合物、例えば、小分子（例えば、ＢＸ７９５、ピセタノール、ゲフィチニブ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、グリベンクラミド、Ｐｅｐｉｎｈ−ＭｙＤ、ＯｘＰＡＰＣ、ＣＬＩ−０９５、ポリミキシンＢ、Ｈ−８９、２−アミノプリン（２−ＡＰ）、クロロキン、バフィロマイシンＡ１またはこれらに類するもの）の添加によって亢進することができる。
【0031】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、Ｔリンパ球を自然免疫応答の阻害薬と接触させることによって亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、ＩκＢキナーゼε（ＩＫＫε）及び／またはＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）の阻害薬を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の導入の前、同時または後のいずれかで、ＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。
【0032】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１７μＭ、１８μＭ、１９μＭ、２０μＭ、またはそれより高い濃度のＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５μＭ〜１μＭ、１μＭ〜３μＭ、２μＭ〜４μＭ、３μＭ〜５μＭ、４μＭ〜６μＭ、５μＭ〜７μＭ、６μＭ〜８μＭ、７μＭ〜９μＭ、８μＭ〜１０μＭ、９μＭ〜１１μＭ、１０μＭ〜１２μＭ、１１μＭ〜１３μＭ、１２μＭ〜１４μＭまたは１３μＭ〜１５μＭ、１０μＭ〜２０μＭ、１０μＭ〜１５μＭまたは１０μＭ〜１２μＭの濃度のＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。
【0033】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の導入の前にＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。例えば、本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入前の５時間超、導入前の５時間、導入前の４時間、導入前の３時間、導入前の２時間、導入前の１時間、導入前の３０分間、導入前の１５分間、導入前の５分間または導入と同時に、ＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、形質転換の４〜５時間前、導入の３〜４時間前、導入の２〜３時間前、導入の１〜２時間前、導入の３０分間〜１時間前または導入と同時〜３０分間前に、ＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、本明細書に説明する時点のうちのいずれかにおける導入の前及び同時の両方で、ＢＸ７９５を用いた処理の際に亢進することができる。
【0034】
具体的な実施形態において、天然免疫系の当該阻害薬は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬である。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬を用いた処理の際に亢進することができる。具体的な実施形態において、当該化合物は、２−アミノプリン（２−ＡＰ）である。
【0035】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかで、天然免疫応答の阻害薬を用いたＴリンパ球の処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の前、同時または後のいずれかにおいて、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害薬を用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の前、同時または後のいずれかで、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。
【0036】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭまたはそれより高い濃度の２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の別の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．５μＭ〜１μＭ、１μＭ〜３μＭ、２μＭ〜４μＭ、３μＭ〜５μＭ、４μＭ〜６μＭ、５μＭ〜７μＭ、６μＭ〜８μＭ、７μＭ〜９μＭ、８μＭ〜１０μＭ、９μＭ〜１１μＭ、１０μＭ〜１２μＭ、１１μＭ〜１３μＭ、１２μＭ〜１４μＭまたは１３μＭ〜１５μＭの濃度の２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。
【0037】
本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、当該細胞の導入の前に、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。例えば、本明細書に説明する方法のある実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入前の５時間超、導入前の５時間、導入前の４時間、導入前の３時間、導入前の２時間、導入前の１時間、導入前の３０分間、導入前の１５分間、導入前の５分間または同時に、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、導入の４〜５時間前に、導入の３〜４時間前に、導入の２〜３時間前に、導入の１〜２時間前に、導入の３０分間〜１時間前にまたは導入と同時〜３０分間前に、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、本明細書に説明する時点のうちのいずれかにおける導入の前及び同時の両方で、２−ＡＰを用いた処理の際に亢進することができる。
【0038】
（５．１．５．ウイルス導入）本明細書に説明する方法の一実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、種々の感染効率（ＭＯＩ）のウイルスを用いて生じることができる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０またはそれより高いウイルス感染効率（ＭＯＩ）で生じる。本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）の導入（例えば、レトロウイルス導入、例えば、レンチウイルス導入）は、０．１〜０．３、０．２〜０．４、０．４〜０．６、０．６〜０．８、０．８〜１．０、１．０〜１．２、１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２、２．２〜２．４、２．４〜２．６、２．６〜２．８または２．８〜３．０のウイルス感染効率（ＭＯＩ）で生じる。
【0039】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）と接触させて、導入効率（例えば、レンチウイルス導入効率）を高めることは、単離した核酸配列（例えば、キメラ抗原受容体をコードするベクター）の導入を改善する。例えば、長さ９キロベース（ｋｂ）、長さ１０ｋｂ、長さ１１ｋｂ、長さ１２ｋｂ、長さ１３ｋｂ、長さ１４ｋｂ、長さ１５ｋｂ、長さ１６ｋｂ、長さ１７ｋｂ若しくは長さ１８ｋｂまたはそれより長い核酸配列は、本明細書に説明する方法の結果として（すなわち、説明する化合物（例えば、ＢＸ７９５または２−ＡＰ）の非存在下での導入の効率と比較して）、より高い効率で細胞中へと導入することができる。ある実施形態において、本明細書に説明する方法は結果的に、核酸分子（例えば、１つ以上のタンパク質、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードするベクターを含むベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターのようなウイルスベクター）の改善された導入を生じ、この中で、当該核酸分子は、長さ９キロベース（ｋｂ）〜長さ１０ｋｂ、長さ１０ｋｂ〜長さ１１ｋｂ、長さ１１ｋｂ〜長さ１２ｋｂ、長さ１２ｋｂ〜長さ１３ｋｂ、長さ１３ｋｂ〜長さ１４ｋｂ、長さ１４ｋｂ〜長さ１５ｋｂ、長さ１５ｋｂ〜長さ１６ｋｂ、長さ１６ｋｂ〜長さ１７ｋｂ、長さ１７ｋｂ〜長さ１８ｋｂ、または長さ９〜１８ｋｂまたは長さ１０〜１５ｋｂである。
【0040】
本明細書に説明する方法の特定の態様において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）は、２つ以上の異なる単離された核酸、例えば、非同一配列の２、３、４または５個の核酸を用いて導入する（例えば、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスを導入する）ことができる。具体的な実施形態において、Ｔリンパ球（例えば、初代ヒトＴリンパ球）を化合物と接触させて導入効率（例えば、レトロウイルス導入効率、例えば、レンチウイルス導入効率）を高めることは、１、２、３、４または５個の異なる単離した核酸（例えば、１つ以上のタンパク質をコードする、例えば、１つ以上のキメラ抗原受容体をコードするベクターを含むベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターのようなウイルスベクター）の導入を改善する。
【0041】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在下で抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて２４時間刺激され、それに次いで当該リンパ球のＢＸ７９５を用いた３時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつ当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に６μＭのＢＸ７９５を用いてさらに６時間処理される。
【0042】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体、あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在下で、２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の２−ＡＰを用いた５時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に２．５〜１０μＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。
【0043】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて２４時間刺激され、それに次いで、ＢＸ７９５による当該リンパ球の６時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に６μＭのＢＸ７９５を用いてさらに６時間処理される。
【0044】
本明細書に説明する方法の具体的な実施形態において、初代ヒトＴリンパ球は、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及び１０μｇ／ｍｌのプロタミンスルファートの存在下で、抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体あるいはこれらの抗原結合フラグメント（複数可）を用いて２４時間刺激され、それに次いで、当該リンパ球の５時間の処理、それに次いで、当該リンパ球のレンチウイルス導入が続き、この中で、当該ウイルスは、１．８の感染効率（ＭＯＩ）にあり、かつこの中で、当該ヒトＴリンパ球は、レンチウイルスの添加と同時に２．５〜１０μＭの２−ＡＰを用いてさらに５時間処理される。
【0045】
（５．２．キメラ抗原受容体）ある実施形態において、本明細書に提供する方法を使用して、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を細胞、例えば、Ｔリンパ球（例えば、初代Ｔリンパ球）中へ導入する。ＣＡＲは、Ｔリンパ球を抗原へ方向づけ、Ｔリンパ球を刺激して、抗原を提示する細胞を殺滅する、人工膜結合型タンパク質である。例えば、Ｅｓｈｈａｒ，米国特許第７，７４１，４６５号を参照されたい。概して、ＣＡＲは、抗原、例えば、細胞上の抗原へ結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び免疫細胞へ一次性活性化シグナルを伝達する細胞内（細胞質）シグナル伝達ドメインを含む。他の条件がすべて満たされた場合、ＣＡＲが例えばＴリンパ球の表面上に発現し、かつＣＡＲの細胞外ドメインが抗原へ結合すると、細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナルをＴリンパ球へ伝達して、活性化及び／または増殖させ、抗原が細胞表面上に存在すれば、当該抗原を発現する細胞を殺滅する。Ｔリンパ球は、最大に活性化させるために、一次性活性化シグナル及び共刺激シグナルの２つのシグナルを必要とするので、ＣＡＲは、刺激性ドメイン及び共刺激ドメインを含むことができ、それにより、細胞外ドメインへの抗原の結合は結果的に、一次性活性化シグナル及び共刺激シグナルの両方の伝達を生じる。
【0046】
（５．２．１．一般的なＣＡＲ構造細胞内ドメイン）ある実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、Ｔリンパ球の表面上に発現しかつ当該Ｔリンパ球の活性化及び／または増殖を惹起するタンパク質の細胞内ドメインまたはモチーフであり、あるいは当該ドメインまたはモチーフを含む。このようなドメインまたはモチーフは、ＣＡＲの細胞外部分への抗原の結合に応じて、Ｔリンパ球の活性化に必要な一次抗原結合シグナルを伝達することができる。典型的には、このドメインまたはモチーフは、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン系活性化モチーフ）を含み、または当該ＩＴＡＭである。ＣＡＲに適したＩＴＡＭ含有ポリペプチドには例えば、ゼータＣＤ３鎖（ＣＤ３ζ）またはそのＩＴＡＭ含有部分である。具体的な実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインである。他の具体的な実施形態において、細胞内ドメインは、リンパ球受容体鎖、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体タンパク質、Ｆｃ受容体サブユニットまたはＩＬ−２受容体サブユニットに由来する。
【0047】
ある実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の共刺激ドメインまたはモチーフを、例えば、当該ポリペプチドの細胞内ドメインの一部として追加的に含む。当該１つ以上の共刺激ドメインまたはモチーフは例えば、共刺激ＣＤ２７ポリペプチド配列、共刺激ＣＤ２８ポリペプチド配列、共刺激ＯＸ４０（ＣＤ１３４）ポリペプチド配列、共刺激４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）ポリペプチド配列、若しくは共刺激誘導性Ｔ細胞共刺激（ＩＣＯＳ）ポリペプチド配列、または他の共刺激ドメイン若しくはモチーフ、あるいはこれらの任意の組み合わせであることができ、あるいはそれらを含む。
【0048】
膜貫通領域は、機能的ＣＡＲ中へと組み込むことのできる任意の膜貫通領域、例えば、ＣＤ４分子またはＣＤ８分子に由来する膜貫通領域であることができる。
【0049】
ある実施形態において、細胞内ドメインは、検出可能な、例えば、蛍光性の、タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）またはその公知の任意のバリアントをコードするようさらに修飾することができる。
【0050】
（５．２．２．ＣＡＲ細胞外ドメイン）ある実施形態において、本明細書に説明する方法を用いて細胞中へ導入される核酸は、ポリペプチドをコードする配列を含み、この中で、当該ポリペプチドの細胞外ドメインは、関心対象の抗原へ結合する。ある実施形態において、細胞外ドメインは、当該抗原へ結合する受容体、または受容体の一部を含む。ある実施形態において、当該細胞外ドメインは、抗体若しくはその抗原結合部分を含みまたは当該抗体若しくはその抗原結合部分である。具体的な実施形態において、当該細胞外ドメインは、一本鎖Ｆｖドメインを含みまたは当該一本鎖Ｆｖドメインである。当該一本鎖Ｆｖドメインは例えば、可撓性リンカーによってＶＨへ連結されたＶＬを含むことができ、この中で、当該ＶＬ及びＶＨは、当該抗原を結合する抗体に由来する。
【0051】
ポリペプチドの細胞外ドメインが関心対象の任意の抗原であることができる抗原は、例えば、腫瘍細胞上にある抗原であることができる。腫瘍細胞は、例えば、固形腫瘍中の細胞、または血液癌の細胞であることがある。当該抗原は、任意の腫瘍または癌のタイプの細胞、例えば、リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、上咽頭癌、黒色腫、例えば、悪性黒色腫、皮膚癌、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、末梢原始神経外胚葉性腫瘍、固形胚細胞腫瘍、肝芽腫、神経芽腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ウィルムス腫瘍、膠芽腫、粘液腫、線維腫、脂肪腫、またはこれらに類するものの細胞上に発現する任意の抗原であることができる。より具体的な実施形態において、当該リンパ腫は、慢性リンパ性白血病（小リンパ球性リンパ腫）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、脈管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔリンパ球性前リンパ性白血病、Ｔリンパ球性大顆粒リンパ球性白血病、侵襲性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔリンパ球性白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔリンパ球性リンパ腫、鼻型、腸疾患型Ｔリンパ球性リンパ腫、肝脾性Ｔリンパ球性リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞性リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔリンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔリンパ球性リンパ腫（不特定）、未分化大細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫であることができる。具体的な実施形態において、当該癌が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である場合、ＣＬＬのＢ細胞は正常な核型を有する。他の具体的な実施形態において、当該癌が慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である場合、ＣＬＬのＢ細胞は、１７ｐ欠失、１１ｑ欠失、１２ｑトリソミー、１３ｑ欠失またはｐ５３欠失を保有する。
【0052】
ある実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。種々の具体的な実施形態において、制限なく、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、癌抗原１２５（ＣＡ−１２５）、ＣＡ１９−９、カルレチニン、ＭＵＣ−１、上皮系膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮系腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、粗嚢胞疾患液体タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５抗原、タンパク質ｍｅｌａｎ−Ａ（Ｔリンパ球によって認識される黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１））、ｍｙｏ−Ｄ１、筋特異的アクチン（ＭＳＡ）、神経細線維、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィシス（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｓ）、チログロブリン、甲状腺転写因子１、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、ピルビン酸キナーゼイソ酵素Ｍ２型（腫瘍Ｍ２−ＰＫ）の二量体形態、異常なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質である。
【0053】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、癌／精巣（ＣＴ）抗原、例えば、ＢＡＧＥ、ＣＡＧＥ、ＣＴＡＧＥ、ＦＡＴＥ、ＧＡＧＥ、ＨＣＡ６６１、ＨＯＭ−ＴＥＳ−８５、ＭＡＧＥＡ、ＭＡＧＥＢ、ＭＡＧＥＣ、ＮＡ８８、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＳＡＲ−３５、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＰＡＮＸＢ１、ＳＰＡ１７、ＳＳＸ、ＳＹＣＰ１、またはＴＰＴＥである。
【0054】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、炭水化物またはガングリオシド、例えば、ｆｕｃ−ＧＭ１、ＧＭ２（癌胎児性抗原免疫原性１（ＯＦＡ−Ｉ−１））、ＧＤ２（ＯＦＡ−Ｉ−２）、ＧＭ３、ＧＤ３、及びこれらに類するものである。
【0055】
ある実施形態において、ＴＡＡまたはＴＳＡは、アルファアクチニン４、Ｂａｇｅ−１、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、ベータカテニン、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、Ｃａｓｐ−８、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ＣＥＡ、ｃｏａ−１、ｄｅｌ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＢＮＡ、ＥＦ２、エプスタイン・バーウイルス抗原、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２、及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースリン酸イソメラーゼ、Ｇａｇｅ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ１／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２、ＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＲＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＲＡＧＥ、、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、１３−カテニン、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ＼７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（表皮増殖因子バリアントＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、メソテリン、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、プロステイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替読み枠タンパク質）、Ｔｒｐ−ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺１の６回膜貫通上皮抗原）、異常なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質である。別の具体的な実施形態において、当該腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、インテグリンαｖβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ−Ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子）、またはＲａｌ−Ｂである。他の腫瘍関連抗原及び腫瘍特異的抗原は、当業者に公知である。
【0056】
ＴＳＡ及びＴＡＡへ結合する抗体及びｓｃＦｖには、当該技術分野で公知の抗体及びｓｃＦＶを、これらをコードするヌクレオチド配列と同様に含む。
【0057】
ある具体的な実施形態において、抗原は、ＴＳＡまたはＴＡＡであるとみなされない抗原であるが、それにもかかわらず、当該抗原は、腫瘍細胞、または腫瘍に起因する損傷と関連している。ある実施形態において、例えば、当該抗原は、例えば、増殖因子、サイトカインまたはインターロイキン、例えば、血管新生または脈管形成と関連する増殖因子、サイトカインまたはインターロイキンである。このような増殖因子、サイトカイン、またはインターロイキンには、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、またはインターロイキン８（ＩＬ−８）を含むことができる。腫瘍は、腫瘍に対して局所的な低酸素性環境も作ることができる。このようなものとして、他の具体的な実施形態において、抗原は、低酸素症関連因子、例えば、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−１β、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−２β、ＨＩＦ−３α、またはＨＩＦ−３βである。腫瘍は、正常組織に対する限局的な損傷も引き起こすことができ、損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ、アラーミンとしても公知）として公知の分子の放出を引き起こす。ある他の具体的な実施形態において、それゆえ、抗原は、ＤＡＭＰ、例えば、熱ショックタンパク質、染色質結合タンパク質高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８、カルグラニュリンＡ）、Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４、カルグラニュリンＢ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）であり、またはデオキシリボ核酸、アデノシン三リン酸、尿酸、若しくはヘパリンスルファートであることができる。
【0058】
本明細書に説明するポリペプチドのある実施形態において、細胞外ドメインは、当該膜貫通ドメインへ直接的に、あるいはリンカー、スペーサーまたはヒンジポリペプチド配列、例えば、ＣＤ２８由来の配列若しくはＣＴＬＡ４由来の配列によって結合する。
【0059】
（５．３．単離された核酸）当業者は、本明細書に説明する方法が任意の特定のタイプのベクターの導入に限定されるものではないこと、及び導入されたベクターが当該ベクターの含む核酸の特定のタイプに関して限定されるものではないことを認識するであろう。したがって、本明細書に説明する方法に従って細胞へ導入するために使用する核酸を含むベクターが、例えば、関心対象の任意のタンパク質またはポリペプチド（例えば、ＣＡＲ）をコードする任意の核酸を含み得ることは理解されるべきである。
【0060】
ある実施形態において、当該核酸は、免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球の導入に適した任意のポリヌクレオチドベクター内に含有され得る。例えば、Ｔリンパ球は、関心対象のポリペプチド（例えば、キメラ受容体）をコードするポリヌクレオチドを含有する合成ベクター、レトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、またはこれらに類するものを用いて形質転換または導入され得る。
【0061】
具体的な実施形態において、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターは、本明細書に説明する方法に従って使用する。Ｔリンパ球の形質転換または導入に適したレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターには、それらの開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号、第６，１６５，７８２号、第６，４２８，９５３号、第７，０８３，９８１号、及び第７，２５０，２９９号において説明されるレンチウイルスベクターを含むが、これらに限定しない。
【0062】
別の具体的な実施形態において、ＨＩＶベクターは、本明細書に説明する方法に従って使用する。Ｔリンパ球の導入に適したＨＩＶベクターには、その開示が全体として参照により本明細書により組み込まれる米国特許第５，６６５，５７７号において説明されるベクターを含むが、これらに限定しない。
【0063】
例えば、Ｔリンパ球内でのポリペプチドの産生に有用な核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体を含む。核酸類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において修飾することができ、デオキシチミジンへのデオキシウリジン置換、デオキシシチジンへの５−メチル−２’−デオキシシチジンまたは５−ブロモ−２’−デオキシシチジン置換を含むことができる。糖部分の修飾には、２’−Ｏ−メチル糖または２’−Ｏ−アリル糖を形成するためのリボース糖の２’ヒドロキシルの修飾を含むことができる。デオキシリボースリン酸骨格は、モルホリノ核酸を生成するために修飾することができ、この中で、各塩基部分が６員のモルホリノ環へ連結されたモルホリノ核酸、またはデオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置き換えられかつ４つの塩基が保有されるペプチド核酸を生じるよう修飾することができる。例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７：１８７〜１９５、ならびにＨｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈａｉｎ．４：５〜２３を参照されたい。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオアート骨格若しくはホスホロジチオアート骨格、ホスホロアミダイト骨格、またはアルキルホスホトリエステル骨格と置き換えることができる。
【実施例】
【0064】
（６．実施例）（６．１．実施例１：ＢＸ７９５への同時曝露を伴う初代Ｔリンパ球導入）
（６．１．１．ＤＥＡＥ−デキストランを用いた初代ヒトＴリンパ球の同時処理は、レンチウイルス導入を容易にする）
初代ヒトＴリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養し、３：１のＤｙｎａｂｅａｄ：Ｔリンパ球比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて活性化した。活性化の２４時間後、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を培地へ、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＤ）とともにまたはなしで添加した。ＶＥＧＦＲ２及びＧＦＰタンパク質から構成されるキメラ抗原受容体をコードするベクターＪＬ２８．２（ＶＥＧＦＲ２−ＣＤ２８ＴＭ−ＣＤ２８ＩＣ−Ｐ２Ａ−ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスを、活性化したＴリンパ球培地へ１．８の感染効率（ＭＯＩ）で添加した。蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）を用いて、上手く導入された細胞についてのマーカーとしてのＶＥＧＦＲ２を発現するＴリンパ球の比を判定した。図１Ａに示すように、ニセ処理した細胞（すなわち、ウイルスを受容しなかった細胞）の２．６１％はＶＥＧＦＲ２＋であり、レンチウイルスとともにインキュベートされたがＤＤを有さない細胞の３．９９％はＶＥＧＦＲ２＋であったのに対し、レンチウイルス及びＤＤとともにインキュベートした細胞の９．８０％はＶＥＧＦＲ２＋であった。したがって、ＤＥＡＥ−デキストランを用いた初代ヒトＴリンパ球の処理が、レンチウイルス導入を容易にすることが判定された。
【0065】
（６．１．２．ＢＸ７９５を用いた同時処理は、初代ヒトＴリンパ球の導入効率を亢進する）初代ヒトＴリンパ球を第６．１．１節にあるように培養及び活性化し、レンチウイルスと同時に添加して６時間インキュベートしておくＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＤ）及びある範囲の濃度のＢＸ７９５の存在下で、ベクターＪＬ２８．２を用いて導入した。次に、導入したリンパ球をＦＡＣＳによって分析して、上手く導入した細胞の比を判定した。図１Ｂに示すように、増大した濃度のＢＸ７９５と相関するウイルス伝達効率の増加があった（１μＭのＢＸ７９５を用いて処理した場合、導入した細胞の７．６３％はＶＥＧＦＲ２＋であり、１０μＭのＢＸ７９５を用いて処理した場合、導入した細胞の１０．５％はＶＥＧＦＲ２＋であった）。したがって、高用量（１０μＭ）におけるレンチウイルス及びＢＸ７９５を用いたＴリンパ球の同時処理は結果的に、レンチウイルスベクターによる細胞の導入効率の増大を生じることが判定された。
【0066】
（６．２．実施例２：ＢＸ７９５を用いた前処理は、初代ヒトＴリンパ球の導入効率の増大に必要とされる。）初代ヒトＴリンパ球を実施例１において説明するとおり培養及び活性化したが、１つの細胞集団は、ＤＤのみを用いて処理し（「ＤＤのみの対照」）、１つの細胞集団は、レンチウイルス導入と同時に６μＭのＢＸ７９５を用いて６時間処理し（「同時」）、１つの細胞集団は、レンチウイルス導入前に３時間、６μＭのＢＸ７９５を用いて処理し（「前処理」）、１つの細胞集団は、レンチウイルス導入の前及び同時の両方で６μＭのＢＸ７９５を用いて合計９時間処理した（「前処理＋同時」）。
【0067】
Ｔリンパ球を導入後８日間培養し、ＶＥＧＦＲ２発現を導入３日後及び８日後にモニターした。図２に示すように、Ｔリンパ球培養物へレンチウイルスと同時に添加したＢＸ７９５は、ＤＤのみの対照培養物と比較して、３日後及び８日後のいずれにおけるＶＥＧＦＲ２発現における改善も示さなかった。ＢＸ７９５を用いたＴリンパ球の前処理は、ＤＤのみの対照培養物と比較して、３日後及び８日後の両方において、ＶＥＧＦＲ２発現の亢進をもたらした。レンチウイルス導入の前及び間の両方においてＢＸ７９５を用いて処理したＴリンパ球培養物は、ＤＤのみの培養物のほぼ２倍の高さでかつその他の２つのＢＸ７９５処理したリンパ球のうちのいずれかよりも高いレベルでＶＥＧＦ２を発現した（細胞の９．８０％は、３日後の前処理＋同時群における１８．４％のＶＥＧＦＲ２＋細胞と比較して、３日後にＤＤのみの対照におけるＶＥＧＦＲ２＋であり、細胞の４．９５％は、前処理＋同時群における１０．６％のＶＥＧＦＲ２＋細胞と比較して、８日後にＤＤのみの対照におけるＶＥＧＦＲ２＋であった）。
【0068】
（６．３．実施例３：２−アミノプリンを用いた初代ヒトＴリンパ球の処理）（６．３．１．２−アミノプリンは細胞生存率を変化させない）
初代ヒトＴリンパ球を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養し、３：１のＤｙｎａｂｅａｄ：Ｔリンパ球の比において抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて２４時間活性化した。２−アミノプリン（２−ＡＰ）を培養物へ添加し、３７Ｃで９０分間培養した。ＤＥＡＥ−デキストラン（ＤＤ）またはプロタミンスルファート（ＰＳ）を、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２及びＪＬ２８．２レンチウイルスベクターの存在下で培養物へ３のＭＯＩで添加した。細胞をＦＡＣＳによって生存率について分析した。
【0069】
２−ＡＰの非存在下で、ＤＤ及びＰＳのいずれも用いずに処理した細胞の８４％は、レンチウイルス導入後に生存していたのに対し、細胞の７３．６％は、ＤＤの存在下で導入した場合生存しており、細胞の８４．９％は、ＰＳの存在下で導入した場合、生存していた。（図３Ａ）初代Ｔリンパ球を、２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭのいずれかで２−ＡＰを添加して先のとおり培養した場合、生存率は、２−ＡＰの非存在下で培養した細胞と比較して低下しておらず（図３Ｂ）、２−ＡＰが、培養物中の活性化した初代ヒトＴリンパ球の生存率を変化させないことを示した。
【0070】
（６．３．２．２−アミノプリンを用いた処理は、初代ヒトＴリンパ球のレンチウイルス導入効率を亢進する）初代ヒトＴリンパ球を第６．３．１節にあるように培養し、ＶＥＧＦＲ２の発現についてＦＡＣＳによって分析した。図４Ａに示すように、ＤＤまたはＰＳのいずれかの非存在下でレンチウイルスを用いて導入した細胞の４．４９％は、ＶＥＧＦＲ２について陽性であるのに対し、ＤＤ単独を用いて処理した細胞の１．２５％は、ＶＥＧＦＲ２＋であり、ＰＳ単独を用いて処理した細胞の０．５６５％は、ＶＥＧＦＲ２＋であった。
【0071】
ＤＤまたはＰＳのいずれかの存在下で、レンチウイルス導入は、初代ヒトＴリンパ球を２−ＡＰを用いて９０分間前処理して、培養物中でレンチウイルス及び種々の濃度の２−ＡＰとともに５時間維持した場合、亢進した（図４Ｂ）。全濃度の２−ＡＰ（すなわち、２．５ｍＭ、５ｍＭまたは１０ｍＭ）は、２−ＡＰへ曝露されていない細胞（対照）と比較して、導入効率を亢進した。これらの結果は、２−ＡＰを用いた処理が、ＤＥＡＥ−デキストランまたはプロタミンスルファートのいずれかの存在下で初代ヒトＴリンパ球の導入効率を亢進することを示す。
【0072】
（等価物）本開示は、本明細書に説明する具体的な実施形態による範囲に制限されることになってはいない。実際、本明細書に提供する対象の種々の改変は、上述の明細書から当業者に明らかとなるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に収まるよう企図される。
【0073】
種々の公開物、特許及び特許出願は、本明細書に引用されており、それらの開示は全体として参照により組み込まれる。
【国際調査報告】