特表 2017-523772 液滴ソートによるヌクレオチド配列排除富化（ＮＥＥＤＬＳ）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-523772(P2017-523772A)

(43)【公表日】2017年8月24日

(54)【発明の名称】液滴ソートによるヌクレオチド配列排除富化（ＮＥＥＤＬＳ）

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20170728BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20170728BHJP

   C12N 15/00 20060101ALI20170728BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20170728BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12N15/00 A

   C12N15/00ZNA

   C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2016-572301(P2016-572301)

(86)(22)【出願日】2015年6月11日

(85)【翻訳文提出日】2017年2月8日

(86)【国際出願番号】EP2015063076

(87)【国際公開番号】WO2015189336

(87)【国際公開日】20151217

(31)【優先権主張番号】PA201400307

(32)【優先日】2014年6月11日

(33)【優先権主張国】DK

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】515166680

【氏名又は名称】サンプリクス ソシエテ ア レスポンサビリテ リミティー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】マリー ユスト ミッケルセン

(72)【発明者】

【氏名】トマス クビスト

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B050CC07

4B050KK07

4B050LL03

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR40

4B063QR56

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS34

4B063QS36

4B063QS39

(57)【要約】

本発明は、目的のDNA配列を含有する標的DNA分子が以下の工程によって富化されるインビトロの方法に関する：a）１つの液滴あたり平均で0.5未満の標的DNA分子を含む複数の液滴中のDNA分子を一般的な増幅にかけること（404）；b）前記液滴のそれぞれにおける標的DNA分子を特異的に検出すること（405）；及び、c）標的DNA分子を含有する液滴を物理的に選択すること（406）。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

混合DNA分子のサンプルから１つ又は複数の標的DNA分子を富化するためのインビトロの方法であって、以下の工程を含む方法：
a）１つまたは複数の特異的な標的DNA分子および一般的なDNA増幅用の試薬を含む混合DNA分子の液体サンプル設けること（401）；
b）前記液体サンプルから混合DNA分子をそれぞれ含有する複数の液滴を形成すること（403）；
c）複数の液滴における混合DNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の前記１つ又は複数の標的DNA分子を含有する（404）；
d）少なくとも１つの前記標的DNAを含有する液滴を特異的に検出すること（405）；並びに、
e）少なくとも１つの前記標的DNA分子を含有する液滴を物理的に選択すること（406）、ここで工程（a）における混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度に対し、標的DNA分子の頻度が、0.1×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1から10×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1の間に増加される。

【請求項2】

液滴の合計数が少なくとも10,000である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程c）における前記一般的な増幅の後、前記１つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬を、前記複数の液滴に添加する（505）、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬が、前記サンプル中に含まれる（401）、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記標的DNA分子は、１つまたは複数の少なくとも10ヌクレオチドの固有連続配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

工程（c）におけるDNAの一般的な増幅は、ランダム縮重プライム化PCR、リンカーライゲーションPCR、縮重オリゴヌクレオチドプライム化（DOP）PCR、及び多置換増幅の中から選択される技術によって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

特異的検出はPCRを用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

特異的検出用の試薬は、dUTPを含有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

（f）前記１つ又は複数の標的DNA分子を特異的に検出するために、生成されたDNAを不活性化、分解、又は除去すること、を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

不活性化は、ウラシルDNA Nグリコシラーゼを用いて行われる、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記方法は、
（g）工程（a）〜（e）を反復することを更に含み、
ここで、反復する工程（a）の前記液体サンプルにおける混合DNA分子は、工程（e）で選択された標的DNA分子を含む液滴由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

（h）工程（e）で得られた液滴中に含まれる標的DNA分子を増幅することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的DNA分子は、1,000〜100,000の核酸塩基対、好ましくは2,000〜70,000の核酸塩基対、より好ましくは2,500〜50,000の核酸塩基対を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的DNA分子は細胞のゲノムに由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

工程b）で形成された前記液滴は、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、更により好ましくは0.1未満の標的DNA分子を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、既知の塩基配列成分、つまり保存された活性部位又はドメインをコードする配列を含む複雑なヌクレオチド断片を富化又は単離するための方法であって、とりわけ、既知の配列成分を含むDNA断片のハイスループットスクリーニングに適用可能な方法に関する。

【背景技術】

【0002】

DNAシーケンシングは、遺伝学研究の主要な推進要因である。新しく堅牢なハイスループットシーケンシング機器が利用可能になってきているため、「次世代シーケンシング」技術革命の勢いはすさまじい。多様な範囲の適用を支援するために、遺伝的変異の解析を含む、新しく改良された方法およびプロトコルが開発されてきた。その一環として、標的癌パネルまたは完全ヒトエキソームといったゲノムサブ領域を標的として富化することを目指した方法が開発されている。目的のゲノム遺伝子座を選択的に回収することによって、全ゲノムシーケンシングに比べてコストと労力を非常に低減できる。

【0003】

標的を富化するための現在の技術は、三つのカテゴリー、つまり、ハイブリッドキャプチャー法、選択的環状化法、及びPCR増幅に分類される。ハイブリッドキャプチャー法では、短い断片ライブラリー（典型的には100〜250塩基対）が、相補的なDNA断片に特異的にハイブリダイズし、目的の配列を物理的に捕捉し単離できるようになっている。選択的環状化法は、標的配列を含む一本鎖DNA環を形成し、標的配列の選択的増幅のために使用される共通DNA要素を有する構造を作成する方法について記載される。最後に、PCR増幅ベースの富化は、複数のロングレンジPCR反応を並行して行うことにより、標的領域を増幅するものである。

【0004】

現在の一般的な富化法では、標的配列についてかなりの知識、比較的純粋なサンプル、及びかなりの量の標的配列を必要とする。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、混合DNA分子のサンプルから１つ又は複数の標的DNA分子を富化するためのインビトロの方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
a）１つまたは複数の標的DNA分子および一般的なDNA増幅用の試薬を含む混合DNA分子の液体サンプル設けること（401）；
b）前記液体サンプルから混合DNA分子をそれぞれ含有する複数の液滴を形成すること（403）；
c）複数の液滴における混合DNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の前記１つ又は複数の標的DNA分子を含有する（404）；
d）少なくとも１つの前記標的DNAを含有する液滴を特異的に検出すること（405）；並びに、
e）少なくとも１つの前記標的DNA分子を含有する液滴を選択すること（406）、ここで工程（a）における混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度に対し、標的DNA分子の頻度が、0.1×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1から10×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1の間に増加される。

【0006】

更なる実施形態では、本発明は、混合DNA分子のサンプルから１つまたは複数の標的DNA分子を富化するための装置であって、以下の要素を含む装置を提供する：
a）混合DNA分子のサンプルを含有する液滴の生成；
b）等温インキュベーション；
c）前記液滴と前記１つまたは複数の標的DNA分子を検出するための試薬との合体；並びに、
d）少なくとも１つの標的DNA分子を含む液滴の特異的検出および物理的選択。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図1は、液滴排除富化と現在の特異的なDNA富化方法との比較を示す。黒の実線は、約10kbのDNA標的を表す。点線は、富化を行うためにあらかじめ必要な標的配列に関する塩基配列情報を表す。NEEDLSに必要な塩基配列情報は、DNA標的配列上の任意の位置であり得る。

【0008】

【図2】図2は、標的配列あたり陽性液滴数が4つで、合計が20,000個の液滴と仮定して、１つの反応でマルチプレックス化された1、5、および20個の標的について示されたNEEDLSの1、2、3、及び4ラウンド後の標的DNAの富化度（倍）を示す。

【0009】

【図3】図3は、標的の数、陽性液滴の平均数、及び得られた標的富化間の相関を示す。1ラウンドのNEEDLSで１つの標的あたり陽性液滴数が10個で、20,000個の液滴である例を示す。

【0010】

【図4】図4は、NEEDLSを実行するためのスキームの概要を示す。401：１つまたは複数のDNA標的を含有するDNAサンプルと一般的な増幅用の試薬を混合する。402：液滴の生成に必要な成分を混合物に添加する。403：DNA及び試薬を含有する液滴を生成する。404：一般的なDNA増幅を全液滴に対し行う。405：１つまたは複数の標的DNA検出するための特異的な増幅を、各液滴で増幅したDNAに対し行う。406：液滴を物理的に選択するための装置を用いて、特異的な増幅が検出された液滴を検出し単離する。

【0011】

【図5】図5は、実施例1に記載のNEEDLSを実行するためのスキームの概要を示す。501：鋳型DNAと、一般的なDNA増幅用の試薬と、液滴の生成に必要な成分とを混合する。502：（501）から得た全材料をそれぞれ約1nLの液滴にする。503：全液滴を１つのチューブに収集する。504：それらの液滴を一般的なDNA増幅に適切な条件下でインキュベートする。505：液滴を並べて過剰量の液体と個々に合体させる。過剰量の液体は、選択的標的DNA増幅のための完全dUTP−PCR混合物を含む。全ての液滴をPCRチューブに収集する。506：PCRチューブをPCR反応条件下でインキュベートする。507：特異的な増幅が起こった液滴を収集し、液滴生成成分（例えば、油）を除去する。PCRにより生成した全DNAを、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）処理を用いてウラシルを組み込んだ形に不活性化できる。DNA分をエタノール沈殿により精製する。508：沈殿したDNA（507）を再増幅する。509：再増幅したDNA（508）を最終解析用の鋳型として用いる。510：（509）で生成したDNAのDNAシーケンシングを行う。511：シーケンシングの結果を（510）から得る。

【0012】

【図6】図6は、GAPクロージングに使用するプライマーとギャップの概略図である。水平の実線は5712bpのDNA配列を示す。GAPは、ペアエンドライブラリから得ることができなかった配列データの所望の配列を示す。プライマーをギャップの両側に配置し、各セットをGAPに近接して配置する。プライマーは、標的DNAに対し50〜100bpの断片を生成するように設計される。

【0013】

【図7】図7は、実施例2に記載のNEEDLSを実行するためのスキームの概要を示す。701：DNAと、一般的な増幅用の試薬と、液滴油とを混合する。702：ボルテックスをかけて液体を混合し、様々なサイズの液滴を生成する。703：液滴をインキュベートする。704：大きな液滴を排除して廃棄する。705：液滴を、プライマーのサブセットを含むdUTP混合物と合体する。＃1−＃4は例示目的で図示するが、10種の異なる混合物が本実施例に含まれる。706：PCRを行う。707：陽性PCR反応が観察された液滴を混合物からソートする。液滴油を超音波処理により除去しその後DNA精製を行う。UDG処理によりウラシルを含む全DNAを破断する。DNAをエタノール沈殿により精製する。708：溶出したDNAの再増幅を行い、確実にヌクレオチドシーケンシング（例えば、NGS）に十分な量のDNAにする。709：増幅したDNAをシーケンシング用に調製する。710：完全混合物をシーケンシングし、結果物をアセンブリ用に調製する。711：受け取った配列のアライメントにより、ゲノム配列のギャップを埋める。

【0014】

【図8】図8は、NEEDLSにより同定された標的DNA断片を示す。ブドウ球菌属の16SrRNA及び23SrRNA遺伝子の配列［配列番号10］を含む。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、サンプル中の全DNAの濃度に対する特異的な標的DNA分子の濃度を以下の工程により増大するインビトロの方法に関する：1）サンプルを希釈して、液滴といった複数のサブコンパートメントにすること（分離）、2）液滴内のDNAを非特異的に増幅すること（一般的な増幅）、3）標的配列特異的検出用の試薬を液滴に添加すること、4）液滴内の特異的な標的配列を検出すること、並びに、5）標的配列を含有する液滴を物理的に選択すること（選択）。

【0016】

本発明は、一部の液滴のみが標的配列を含む場合、全DNAに対する標的の濃度は、これらの液滴における濃度のほうが元のサンプルにおける濃度に比べて高い、という原理に基づく。標的を含む一部の液滴の割合が富化度を決定する、つまり割合が低い場合、富化度は高い。

【0017】

本発明の文脈においては、全DNAのサンプル又はその希釈液又は液滴における標的DNA分子の有無は、使用したサンプル又はその希釈液又は液滴において選択された検出方法（例えば、PCR）を用いて検出可能な標的DNA分子の存在によって規定される。

【0018】

さらなる選択ラウンド（上記のような）により標的を更に富化して、その後サンガーシーケンシング又はパイロシーケンシング又は同様のDNA配列検出といった標準的な方法、あるいは、PCR、ハイブリダイゼーション又は他の検出アッセイにより配列決定し得る、あるいは、それを第1ラウンドの選択から直接使用し得る。

【0019】

本発明により増幅及びソートした液滴は、検出および同定に用いられるDNA配列を含む5〜100kbのDNA断片を含む。

【0020】

驚くべきことに、本発明に係る富化では、事前に必要なDNA配列情報がより少なくて済む。現在の富化技術と比較すると、本発明では特定の標的情報の約40ヌクレオチド塩基対のみが必要である一方、ハイブリダイゼーションに基づく方法だと少なくとも5〜8000塩基対、ロングレンジPCRに基づく方法だと300塩基対が必要である（図1）。断片が100〜250塩基対など短い場合、PCR反応は非常に敏感になることが当技術分野で知られている。従って、サンプルがバックグラウンドDNAを大量に含有する場合、250塩基対より長い、例えば500〜5000塩基対の長さといったDNA断片を増幅するように設計されたロングレンジPCRは、適用できない。また、ハイブリダイゼーションに基づく方法は、非特異的なハイブリダイゼーションを回避するために比較的純粋なサンプルを必要とする。従って、混合サンプルから配列情報を得るための唯一の方法は、例えば、次世代シーケンシング法によって全DNAサンプルの配列決定することであり得るが、しかし、次世代シーケンシングのコストは劇的に減少しているとはいえ数千ものゲノムをシーケンシングするコストは依然として高い。

【0021】

本発明の方法は驚くほど効率的である。本発明により、DNAシーケンシングの量は、3ラウンドのNEEDLSによる5マルチプレックスDNA標的では10億分の１、又は2ラウンドのNEEDLSによる１つの標的配列では2500万分の１に低減できる（図2）。

【0022】

I.ヌクレオチド配列の液滴排除富化（Droplet Exclusion Enrichment）
NEEDLS方法に必須の工程について更に下記に説明する。
a）１つまたは複数の特異的な標的DNA分子及び一般的なDNA増幅用の試薬を含むDNAサンプルを設けること（401）
NEEDLSを実施するために、標的DNA分子を含むことがわかっている混合DNA分子のサンプル（つまりDNA分子の混合集団）を選択する。PCR検出、ハイブリダイゼーションプローブによるDNA検出、又は同様の方法といった所望の方法でDNA分子をスクリーニングし検出するために、標的DNA分子内に位置する少なくとも10（または15）ヌクレオチドの１つ又は複数の固有の塩基配列を選択する。標的DNA分子は、各配列が、所定の遺伝子マーカー、例えば、感染性因子の診断用の第1遺伝子マーカー配列と、抗生物質耐性遺伝子の診断用の第2遺伝子マーカー、に対応する１つ以上の固有の塩基配列を含んでもよい。典型的には、混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度は10^-2未満、例えば、10^-3〜10^-9（標的配列の塩基対をサンプル中の全DNAの塩基対で除算した値として算出）である。増幅の前に、混合DNA分子の液体サンプルを所望の連続希釈数で連続希釈し、次の液滴形成工程で生成し処理される各液滴が混合DNA分子を含むが平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、より好ましくは0.1未満の特異的な標的DNA分子を含むようになるまで行う。つまり、混合DNA分子の液体サンプルがそれぞれ混合DNA分子を含む100滴の液滴に分離される場合、これらの液滴うち平均で50滴未満、好ましくは25滴未満、より好ましくは10滴未満に標的DNA分子が存在するということである。本明細書では、液滴中の標的DNA分子の有無を、本明細書で例示する標的DNA分子の特異的検出のために使用する方法を用いたときに検出可能な標的DNA分子の存在または不在として定義する。この希釈は、標的の富化を確実にするために行う。つまり、標的を含有する液滴の平均数が低い場合、液滴内の非標的分子に対する標的の頻度が高い。混合DNAサンプルにおける標的DNA分子の頻度及び存在量は、PCR、リアルタイムPCR、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、又は標的配列のRNAまたはタンパク質産物を検出するアッセイにより決定してもよい。

【0023】

b）前記DNAサンプルを含有する複数の液滴を形成すること（403）
希釈したサンプル混合DNA分子および一般的なDNA増幅に必要な試薬を含む液滴は、液滴を生成し標的DNA配列を閉じたコンパートメント内に単離する任意の方法により生成される。液滴生成のための適切な方法としては、能動的な方法、例えば、音響エネルギーにより液滴を吐出する方法、誘電泳動（DEP）、誘電体上のエレクトロウェッティング法（EWOD）、並びに受動的な方法、例えば、T字路フロー集束法などの受動方法が含まれる［1］。液滴に加え、マイクロ流体チップ内の反応チャンバなど他の微小量のコンパートメントでも一般的な増幅が起こり得る。

【0024】

c）複数の液滴におけるDNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、混合DNA分子と、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の特異的な標的DNA分子とを含有する（404）。
各サンプルにおけるDNAの存在量を増やすため全DNAを増幅する任意の方法により各液滴におけるDNAを増幅する。適切な増幅方法として、縮重オリゴヌクレオチドプライム化PCR（DOP−PCR）、多置換増幅（MDA）［4］、ランダムプライム化PCR又は類似の方法が挙げられる。

【0025】

d）前記特異的な標的DNAを含有する液滴を特異的に検出すること（405）
工程c）における全DNAの一般的な増幅に続き、所望の検出技術を用いて、標的DNA分子の存在について液滴をスクリーニングする。標的DNA分子を含有することが示された少なくとも１つまたは複数のスクリーニングされた液滴では、標的DNA分子の頻度は、工程（a）での混合DNA分子のサンプルにおける頻度に比べて高くなる。頻度の増加は、典型的には0.1×（標的を含まない液滴数）×（標的を含む液滴数）^-1〜10×（標的を含まない液滴数）×（標的を含む液滴数）^-1である。あるいは、頻度の増加は、0.1×（標的を含まない液滴数）×（DNAを含む液滴合計数）^-1〜10×（標的を含まない液滴数）×（DNAを含む液滴合計数）^-1であると算出される。標的を含む液滴数は典型的に１つの標的配列あたり2〜100である。全液滴数は少なくとも1,000であるが、典型的には10,000を超える。

【0026】

液滴中の標的DNA分子の存在は、qPCRなどのPCR、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、又は標的配列のRNAまたはタンパク質産物を検出するアッセイにより決定してもよい。特異的検出用の試薬は、UDGを使用する検出工程やその後の工程で増幅されたDNAの選択的な不活性化、分解、または除去を可能にするためにdUTPを含んでもよい。

【0027】

e）前記特異的な標的DNAを含有する液滴を物理的に選択すること（406）
工程d）における標的DNAの検出に基づいて、液滴は少なくとも2つの異なる流れにソートされる。工程d）において複数の特異的な標的が検出される場合、液滴は3、4、5又はそれ以上の流れにソートされてもよい。標的DNAが検出された液滴を含有する流れの中では、液滴内の非標的DNAに対する標的DNAの存在量が、工程a）における混合DNA分子のサンプルよりも富化される。

【0028】

以下の工程は任意である。
f）標的DNAの特異的検出のために生成されたDNAを不活性化、分解、又は除去すること、
NEEDLSの更なるラウンド又は検出産物の存在が更なる工程を妨害するような他の用途において富化された標的DNAを使用する場合、検出工程c）において、デオキシリボヌクレオチド（dNTPs）の１つの代わりにdUTPを用いて、DNAを増幅することができる。ここで、産物は任意選択的に、分解、不活性化又は除去され得る。この不活性化は、UNG又はUDGとしても知られるウラシルDNAグリコシラーゼといった酵素を用いて行ってもよい。

【0029】

g）工程（a）〜（e）を反復すること
（e）で得られた富化された標的DNAを含む液滴を用いて、新たな工程（a）で標的DNAをさらに富化してもよい。

【0030】

h）富化されたサンプルを増幅すること
（d）で得られた富化された標的DNAを含有する液滴を用いて、標的DNAを、MDA等の一般的な増幅又はPCR等の特異的な増幅により、さらに増幅してもよい。

【0031】

NEEDLSを実施するためのスキーム
スキームを図4に概説する。混合DNA分子の元のDNAサンプルにおける標的DNA分子の濃度を決定する（401）。標的分子（陽性液滴）を含有する予想平均液滴数が0.5未満になるまで、サンプルを希釈する。１つの標的の存在量を液滴における非標的DNAに対し富化する場合、陽性液滴の平均数を少なくして富化度を高める必要がある。理想的には、液滴の全サンプルは、１つの標的あたり2〜100滴、好ましくは3〜50滴、より好ましくは5〜20滴の陽性液滴を含むべきである。標的の複数の配列変異体が存在する可能性がある場合、それぞれの変異体は、別個の標的DNA分子としてカウントする。標的数、陽性液滴の平均数、NEEDLSによる富化の間の相関を、1ラウンドのNEEDLSで１つの標的について20,000滴の液滴と10滴の陽性液滴を有する例を用いて図3に示す。

【0032】

増幅工程のバイアスのため、陽性液滴のぞれぞれが、一般的な増幅で増幅されたDNAを異なる量で含むことがあるので、観察された富化度は、図3の予想富化度よりも高いことがある。我々の経験では、結果として得られる富化度は少なくとも2倍高いことがある。また、より多くの別個のコンパートメントを得るように小さな液滴を使用する場合、富化度が高くなる。

【0033】

複数の置換増幅（MDA）用の試薬を希釈した元のサンプルに添加する。DNAを変性し、プライマーをアニールし、一般的な増幅用のDNAポリメラーゼ（例えば、Φ29DNAポリメラーゼ）を添加する。ポリメラーゼの添加後、標的分子を別個のコンパートメントに単離するために、MDAに使用可能な（MDA-ready）サンプルを含む液滴を生成する（403）。その後、MDAに適切な条件下でサンプルをインキュベートすることにより、液滴内の標的を増幅する（404）。

【0034】

標的配列又はサンプル内の標的配列を検出可能にするために、液滴に検出用の試薬を添加する。検出用の試薬は一般的な増幅用の試薬と一緒に加えてもよく（401）、あるいは一般的な増幅の後に加えてもよい（404と405の間）。PCRを用いて検出を行う場合、増幅した液滴サンプルをPCRユニットに移し、PCR増幅を行い、その後標的分子の存在（陽性）又は不存在（陰性）により液滴をソートする。蛍光標識したPCRプライマーを使用する場合、標的分子の存在は蛍光活性化液滴ソーターを用いてサンプルの蛍光により検出できる（405および406）。

【0035】

幾つかの陽性液滴は、より高い蛍光を示す。最も高い蛍光を示す液滴を選択するカットオフ値を用いると、対応してより高い富化度を有する液滴を選択することになる。標的DNA分子の存在量を決定し、その量がシーケンシングのような分析方法に十分であれば、選択されたサンプルを直接分析できる。そうでなければNEEDLSのさらなるラウンドを適用できる。

【0036】

富化の更なるラウンドを実施するのに必要な場合、検出工程で生成されたDNAを分解又は除去することが好ましいことがある。PCR試薬にdUTPを使用することが好ましいことがある。その後一般的なdNTPを用いてMDA反応を行う。液滴の検出および物理的選択の後、PCR内に生じたDNAを分解でき、処理したサンプルを富化の追加のラウンドに使用できる。追加のラウンドは、液滴内の希釈及び多置換増幅とともに開始する。

【0037】

NEEDLSを用いて十分な富化が達成されたら、液滴を融合する。融合された液滴における富化DNAを更に精製して、一般的又は特異的な増幅、例えばそれぞれMDA及びPCR等、を用いて更に増幅してもよい。

【0038】

II.マルチプレックスNEEDLS
NEEDLSを応用してマルチプレックスNEEDLSを実行できる。マルチプレックスNEEDLSは、解析した混合DNA分子のサンプルにおいて、第2の標的DNA分子を生成するための配列特異的なプライマーを用いて第2の連続配列を増幅することにより、少なくとも10（又は15）ヌクレオチドの第2の連続配列を検出するために設計された追加の特徴を利用する。幾つかの液滴が第1及び第2の連続配列の両方から特異的検出（例えば、蛍光シグナルにより）を示したら、それらは同じMDA増幅された標的DNA分子内に位置する。同様に、異なる特異的な標的DNA分子のそれぞれを検出するための特異的なプライマーを用いて、本発明の方法により、1〜20又はより様々な特異的標的DNA分子の固有の配列を、DNA分子の混合サンプルにおいて検出できると想定される。

【0039】

従って、標的の共局在化に関する情報を提供することに加えて、マルチプレックスNEEDLSは、それぞれが5000を超える塩基対を含む、異なる標的分子を数千まで同時に精製することを提供する。別個の検出分子を別個の液滴に設けること、あるいは混合物として添加することができる。

【0040】

III.NEEDLSおよびマルチプレックスNEEDLSにより解析されるサンプル
III.i混合DNA分子のサンプル
NEEDLSを、標的DNA分子を含むことがわかっている混合DNA分子のサンプルに適用してもよい。混合DNA分子のサンプルは、DNA分子の混合集団（例えば、染色体DNA分子又はプラスミドDNA分子）を含む。この集団における個々のDNA分子は、それらのDNAにおいて少なくとも10（又は15）の核酸塩基対の既知の連続配列において少なくとも1塩基異なり、既知の連続配列を含む標的分子がサンプルにおける非標的分子とは異なる又は差別化可能になっている。混合DNA分子のサンプルは、追加的に、一本鎖RNA又はDNAポリヌクレオチドを含んでもよい。混合DNA分子のサンプルにおけるDNA分子の集団は、標的DNA分子を含む。

【0041】

標的DNA分子は、線状または環状の形態であり得る。環状DNAは、天然に存在するか、またはプラスミド、フォスミド、コスミド、BACクローンにDNAをクローニングすることによって得られる、あるいははライゲーション又はCre／LoxPによる組換えにより生成できる。

【0042】

標的DNA分子は、少なくとも10（又は15）の核酸塩基対（又はヌクレオチド）の既知の固有の連続配列を１つまたは複数含む。少なくとも10の核酸塩基対（又はヌクレオチド）の当該固有の連続配列を含む標的DNA分子を選択することにより、標的DNA分子を混合DNA分子のサンプルから選択できる。また、少なくとも10（又は15）の核酸塩基対（又はヌクレオチド）の固有の連続配列を少なくとも2つ含む標的DNA分子を選択することによっても、標的DNA分子を混合DNA分子のサンプルから選択できる。ここで、2つの連続配列は、50〜100,000の核酸塩基対、好ましくは150〜3,000の核酸塩基対、より好ましくは150〜1500の核酸塩基対のDNA分子内に存在する。

【0043】

典型的に、混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度は10^-2未満であり、例えば、10^-3〜10^-9（標的配列の塩基対をサンプル中の全DNAの塩基対で除算した値として算出）であってもよい。

【0044】

混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度が10^-2未満である場合、本発明の方法は、特に好適である。混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度が10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、又はそれ以下である場合も、本発明の方法は好適である。多くの例では、混合DNA分子のサンプルはゲノムDNAを含む細胞集団に由来するであろうが、他の例として、かかるサンプルが、自然界から採取した試料など、多様な起源のDNA分子が存在する試料に由来することもある。その由来にかかわらず、標的DNA分子の頻度は、特定の標的DNA塩基対の数をサンプル中の全塩基対の数で除算した値として定義される。混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度は、三連で希釈系列を作製し、標的の有無を検出し、例えば、最確数法を使用して標的の数を決定することによって決定される。また、標的分子の頻度は、qPCRまたはデジタル液滴PCRを用いて決定することもできる[2]。DNAの濃度を測定し、この濃度をゲノムの平均分子量で除算することによって全ゲノム当量数を決定する。

【0045】

III.ii混合DNA分子のサンプルの由来
本発明の一実施形態によれば、標的DNA分子は、染色体または染色体外DNAのいずれであってもよい細胞のゲノムに由来する。さらに、標的DNA分子は、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、または哺乳動物細胞の中から選択される細胞に由来してもよい。哺乳動物細胞はヒト細胞であってもよい。微生物細胞は、細菌細胞、酵母細胞または真菌細胞であってもよい。さらに、標的DNA分子は、真菌の菌糸体または真菌胞子由来であってもよい。

【0046】

標的DNA分子が１つまたは複数の細胞に由来する場合、細胞（複数可）は、多細胞組織または多細胞生物の一部であってもよい。

【0047】

さらに、標的DNA分子は、RNAまたはDNAゲノムを有する１つまたは複数のウイルス粒子に由来してもよい。あるいは、標的DNA分子は、ウイルス由来DNAが組み込まれた宿主ゲノムに由来してもよい。標的DNA分子は、バクテリオファージに由来してもよい。

【0048】

標的DNA又はRNA分子の由来にかかわらず、標的DNAまたはRNA分子は混合DNA分子のサンプルに存在し、ここで、混合DNA分子は、自然界から採取した試料、例えば、土壌、水、空気の試料に由来してよい。あるいは、サンプルは、哺乳動物、例えば動物またはヒト対象といった多細胞生物に由来してもよい。サンプルが哺乳動物由来である場合、サンプル（例えば、生検）は、体液（例えば、血液、血漿、血清、リンパ液および尿）、糞便、または身体の組織もしくは器官に由来してもよい。サンプルが由来する多細胞生物は生きていてもよいし、死んだ生物であってもよい。

【0049】

III.iii混合DNA分子のサンプルの調製
標的DNA分子を含む混合DNA分子のサンプルは、自然界または生物（例えば、生検）から採取したサンプルから調製してもよい。DNA分子の選択的抽出のための方法は当該分野で知られている[3]。標的DNA分子が細胞に由来する場合、細胞破壊または細胞透過処理の工程は、通常、細胞から全核酸分子（DNA又はRNAを含む）を放出するために必要であり、この工程は、その後のDNA分子の選択的抽出工程の前に行われる。

【0050】

標的DNA分子がRNAゲノムに由来する場合、RNAゲノムまたはその一部はまず逆転写されcDNA分子を設ける、ここで、cDNAの塩基配列は、RNAゲノムに対応する（RNAゲノムの逆転写産物である）。

【0051】

III.iv液滴の生成
本発明の方法は、複数のサンプル液滴を形成することを含む、ここで各液滴は平均で0.5未満の特異的な標的分子を含む。好ましい実施形態では、特定の標的分子の分布はポアソン分布に従う。幾つかの液滴は、標的分子と比較して10倍以上の濃度で存在する非標的分子を含みうるが、標的分子のみを含む液滴もある。

【0052】

一般的に、液滴は、［4−6］に記載のものといった種々の技術によって形成できる。本発明の方法は、非混和性のキャリア流体に囲まれた水性の液滴を含む二相系を形成することを含んでもよい。好ましい実施形態では、液滴内の水性サンプルは、サンプルDNA、ランダムヘキサマープライマー等のプライマー、およびバッファ液を含む混合物を調製することによって調製される。DNAの混合物は、約94℃の温度で1〜10分といった、DNAの変性をもたらす条件に供する。この混合物を急速に冷却し、dNTPおよびPhi29ポリメラーゼといった一般的な増幅に有用なポリメラーゼを含む混合物に添加する。得られた混合物を、2つの不混和性液相を含む二相の液滴形成のための水性サンプルとして使用する。水性の液滴は、制御された環境下で2つの不混和性液相を含むサンプルに渦／乱流を生成するための手段を有する装置内で生成され、物理的パラメーター、さらに、それぞれ生成された液滴の液体体積を制御することにより第2相の液体内に液体（第1相）を含む液滴を生成する、あるいは、第2の不混和性液体相内に第1液体相の液滴を押出する手段を用い、ここで形成された液滴は別個のままであり、液滴を押出する手段の直径によって液滴の体積を制御して液滴を形成する。

【0053】

キャリア流体は、サンプル流体と非混和性である。キャリア流体は、非極性溶媒、デカン、フッ素系オイル、シリコーンオイル、又は他の任意の油（例えば、鉱物油など）であってもよい。

【0054】

特定の実施形態において、キャリア流体は、例えば、非ニュートン表面張力を増加、低減、もしくは生成する薬剤（界面活性剤）、および／または自発的な融合または接触に対して液滴を安定化させる薬剤といった１つまたは複数の添加剤を含む。

【0055】

IV.NEEDLSに適するDNAの一般増幅方法
ランダム縮重プライム化PCR（randomly degenerate primed PCR）、リンカーライゲーションPCR、オリゴヌクレオチドプライム化（Degenerate Oligonucleotide Primed）（DOP）PCR、多置換増幅（Multiple Displacement Amplification）（MDA）等の様々なアプローチがDNAの一般的な増幅として提案されている。MDAは、DNAが非常に少量であっても全ゲノム増幅（WGA）を行うのに効率的であることが証明されている[7]。伝統的なPCRベースのWGA法と比較して、MDAは、より高分子量でより良好にゲノムをカバーするDNA分子を生成する。MDAは、二つの酵素活性、バクテリオファージphi29DNAポリメラーゼによって例示されるようなDNA合成活性（ポリメラーゼ）および、3'の5'方向に一本鎖DNAを分解するエキソヌクレアーゼ活性、を有する鎖置換ポリメラーゼを用いる。これは真核生物のB型DNAポリメラーゼに属するポリメラーゼUniProtKB／TrEMBL：Q38545）である。他の有用なポリメラーゼとしてBstlポリメラーゼが挙げられる。

【0056】

本発明による富化を得るために、一般的な増幅を液滴内で行う。液滴は、標的分子をコンパートメント内に単離し、標的DNAを含有しないコンパートメントから分離する役割を果たす。増幅は、例えば、上記の一般的なDNA増幅方法のいずれかを用いて、各液滴内で行う。幾つかの実施形態では、増幅は、約30℃で1時間、好ましくは30分未満、行う。

【0057】

V.検出試薬を液滴に添加する方法
一般的な増幅に続いて、標的DNA分子を検出するための試薬を液滴に添加してもよい。あるいは、検出用の試薬を液滴の生成前に添加してもい。試薬の液滴への添加は、水性液体のアリコート（例えば、PCR反応または他の検出混合物を含む）を設けるための手段や、第2の非混和性液体に懸濁された水性の液体の液滴（例えば、一般的な増幅工程から得た液滴）に前記アリコートを融合するための手段や、第二の非混和性液中に懸濁された前記液体液滴の融合物をさらにコンパートメントへ分けるための手段を有する装置を用いて行ってもよい。液滴融合または液滴噴射技術の例は、[5、8]に記載されている。本発明の特定の実施形態では、一般増幅されたDNAを含む液滴に添加する試薬は、検出対象の特定の標的DNAに相補的な特異的なプライマーまたは特異的なプローブを含む。特異的なプライマーを添加する場合、試薬は、TaqポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼおよびdNTPを含む。また、試薬は検出工程で生成されたDNAのその後の分解を可能にするためのdUTP、および／または蛍光による検出を可能にする核酸色素を含有してもよい。他の実施形態では、検出は、標識プローブまたはプライマーからの蛍光に基づく。

【0058】

VI.標的配列を検出する方法
本発明の方法は、一般的な増幅により増幅されたDNAを含む液滴内の標的核酸分子を検出することを更に含む。特定の実施形態において、検出は、標的分子の一部を増幅することを含む。核酸分子を増幅するのに適した増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応、またはネステッドポリメラーゼ連鎖反応が挙げられ、TaqManプローブ、スコーピオンプローブ、分子ビーコンプローブ、およびハイブリダイゼーションにより標的DNAが配列特異的に認識され標的配列の増幅により蛍光が増大するように機能する他の任意のプローブを含んでも含まなくてもよい。

【0059】

また、本発明の方法は、検出が、標的は一般的な増幅後に増幅されない蛍光標識プローブといった光学的に標識されたプローブからの蛍光に基づく方法も含む。この場合、DNAは、例えば約95℃まで温度を上昇させることによって変性し、続いてプローブを標的にアニールさせて、１つまたは複数のプローブを活性化させる。このように光学的に標識されたプローブは、一本鎖二重標識蛍光プローブが約4〜6ntの相補的なステム配列によって約20〜25ntのヘアピンループ立体構造に保持される分子ビーコンであり得る。ループ構造のため、配列の一端に付された所望の蛍光色素は、もう一方の端に付されたクエンチャーの近くにある。変性および再アニーリングの間に構造が開放されると、プローブは増幅した標的にアニールする。アニールしたら、ヘアピン構造はもはや維持されず、クエンチャーはもはや蛍光色素から発する光を消光しない。光学的に標識されたプローブもFRET（蛍光共鳴エネルギー転移）プローブであり得る。

【0060】

VII.標的配列の存在に基づき液滴を物理的に選択する方法
標的が検出されなかった液滴から、検出可能な標的DNA分子を含む液滴に選択的に分けるために、液滴を物理的に選択または液滴をソートするための様々な異なる方法、例えば、ステアリング、加熱、および音波などを用いる方法が挙げられる[5]。このような物理的選択は、第2の不混和性液体に懸濁された水性の液体の液滴（例えば、特異的検出工程から得た液滴）を受け取る手段；および、前記液滴内の検出可能な成分を検出することができる検出ユニットに各液滴を通過させるための手段；および、検出可能な成分の有無により決定される選択コンパートメントに送達するために、前記液滴を方向づける手段；および、前記液滴を選択コンパートメントに送達する手段を有する装置を用いて行いうる。

【0061】

VIII.液滴を物理的に選択した後に検出シグナル分子を除去する方法
特異的な標的配列の存在に基づいて液滴を物理的に選択した後、いくつかの場合では、PCR産物といった検出シグナルを除去する必要があることがある。このようなシグナルを除去するためのいくつかの方法が当該分野で知られている。dUTPが検出反応で使用された場合、検出分子は、ウラシルDNA Nグリコシラーゼを用いて除去してもよい[9]。あるいは、一般的な増幅により生成された分子は検出分子よりも非常に長いので、検出分子は、シリカ粒子に対する大きいDNAと小さいDNAの結合親和性の差異に基づくサイズ排除といったサイズ分離に基づく方法を用いて分離できる[10]。このようなシリカ表面は100bp未満のDNAへの結合効率が限られているので、シリカベースの精製を適用する場合100bp未満のDNAのみが効率的に除去される。しかし、検出分子を除去することが必要ではない場合もある。例えば、Phi29およびいくつかの他のポリメラーゼは1000bp未満のDNAに対する活性が低いので、続くNEEDLS富化後の工程が一般的な増幅である場合、検出分子を除去する必要が無いこともある。というのは、全部を増幅したとしても、検出分子が増幅されるのは、大きなDNA分子が実際の標的である場合と比較して限られた範囲のみだからである。

【0062】

IX.標的DNA分子の配列決定
NEEDLSによる標的DNA分子の富化は、前記DNA分子における少なくとも15ヌクレオチドの固有の連続配列の１つまたは複数の検出に基づく。検出が、１つまたは複数の固有の連続配列が増幅されて標的DNA分子を生成するPCRに基づく場合、この分子の塩基配列が決定できる。加えて、5’及び3’方向で標的DNA分子にフランキングする塩基配列は、ラピッドゲノムウォーキング（RGW）［11］により決定できる。RGWは、標的DNA分子といった既知の配列から出発する大きなDNA分子における上流又は下流の配列を決定するための簡便なPCRベースの方法である。RGWは、PCRを用いて大きなDNA分子における6kbまでの個々の増幅を可能にする。前回のサイクルにおいて得られた配列に基づく新しいプライマーを用いてRGWの複数のサイクルを行うことにより配列が簡便に延長できる。典型的には、4つの異なる制限酵素で別々にDNAを消化し、その産物を特別に設計されたアダプターにライゲーションすることによって、大きな標的DNA分子の精製サンプルからライブラリが構成される。次いで、ライゲーションしたDNAを、サンガーシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、ライゲーション、または2塩基コーディングシーケンシング、あるいは類似の方法によるシーケンシングといった、所望のDNAシーケンシング法を使用して、アダプターまたはDNA内の既知の配列にアニールするプライマーを用いてシーケンシングする［12］。

【0063】

また、富化された標的DNA配列は、例えば、サンガーシーケンシング、エマルジョンPCR、ショットガンシーケンシング、SOLiDシーケンシング、ブリッジPCR、イオントレントシーケンシング、（ポロニー（polony）シーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、Heliscopeシングル分子シーケンシング、ナノポアDNAシーケンシング、トンネリング電流DNAシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、質量分析によるシーケンシング、透過型電子顕微鏡によるDNAシーケンシング、RNAP（RNAポリメラーゼ）シーケンシング又はシングル分子リアルタイムシーケンシングを用いてシーケンシングすることもできる。

【0064】

IX.i NEEDLSの研究開発応用
自然界から回収されたサンプル又は臨床サンプルから抽出されたDNA分子の混合サンプルにおける標的DNAを単離又は富化するためのNEEDLSの使用により、サンプルの複雑さのため他の方法によって分析できないゲノム又はその一部への直接アクセスがもたらされる。NEEDLSは特に、遺伝病、癌、および感染症に関与するDNA分子を単離又は富化するのに有用である。

【0065】

マルチプレックスNEEDLSは特に、複数のウイルス、複数の遺伝病、または複数の癌関連遺伝子のDNA配列を解析するためのサンプルといったいくつかの標的DNA配列を含むサンプルから複数のDNA分子を単離又は富化するのに有用である。

【0066】

NEEDLSは、富化する前は、配列のわずかな一部しか既知ではなかった標的DNAの配列情報を得るのに特に有用である、というのは、この技術は、検出工程を実行するために標的DNA配列のわずかな一部分のみが既知であることを必要とし、更に、最大100,000bpの大きな増幅DNA分子を生成するために、MDA増幅において（Phi29などの）ポリメラーゼが高忠実度であることを利用するからである。

【0067】

IX.iiシーケンシング用のサンプル調製
ゲノム等の大きなDNA分子のシーケンシングを行うとき、得られる配列情報には、シーケンシングした分子が重複していないか又は組み立てることができないようなギャップが含まれることが多い。NEEDLSは、小さな検出領域の周囲100,000bpまでの配列を取得し、これにより、未知のギャップ領域をカバーするように設計できるので、NEEDLSはDNA配列のギャップを閉じるのに特に有用である。

【0068】

また、NEEDLSは、１つの遺伝子に二つの対立遺伝子（alleles）を含む染色体DNA等の標的DNA配列の変異体（variant）を複数含有するサンプルをシーケンシングするときにも特に有用である。この場合、配列のコピーが１つしか存在しないことを確実にするために、各検出配列を含む液滴は別個のコンパートメントに収集される。液滴は、その後、標的DNA配列の各々の変異体を別個にシーケンシングできるようにするために別々のバーコードを付してもよい。

【0069】

IX.iii NEEDLSの診断への応用
NEEDLSは、医学的な兆候または疾患を診断またはその進行度をモニタリングするために、生検または対象（例えば、ヒトまたは動物対象）から得られる体液や排泄物のサンプルなどの多細胞生物に由来するサンプルにおける標的DNAを分析するのに使用してもよい。

【0070】

感染性因子（例えば、微生物またはウイルス）により引き起こされる疾患といった対象における広範な医学的兆候の診断は、生検または対象から得られる体液のサンプルに由来する混合DNA分子のサンプルにおける標的DNAを検出するNEEDLS又はマルチプレックスNEEDLSにより、感染性因子のゲノムに由来する標的DNAまたはRNA分子を単離または富化して検出することによって支援できる。

【0071】

標的DNA分子の単離におけるNEEDLSの使用により、追加的な機能が付与され、さらなる疾患の診断機能を決定できる。例えば、感染性因子のゲノムが、特定の治療剤に対する耐性を付与するという耐性遺伝子を含む場合、耐性遺伝子の富化により、耐性遺伝子の周辺領域を取得し、耐性を担持する特定の感染性因子についての情報を提供し得る。

【0072】

NEEDLSは、原核生物といった感染性因子および抗生物質耐性の存在の検出などの診断に適用できる。かかる場合とは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus；SA）におけるメチシリン耐性（MR）の存在であってもよい。（MRSA）の組み合わせは、病院および類似の施設でよく知られた問題であるが、一方MRがSAに存在しない場合、かかる問題を引き起こさないことがある。二重検出のような方法が適用される場合、NEEDLSはMRおよびSAの共存在の検出に使用することができる。このような二重検出はデュアルレポーター検出系であり得る、ここで、一つの検出系は、MR等の一つの事象の存在を監視するために使用され、他の検出系は、同じ液滴内のSAの存在といった他の事象の存在を監視するために使用される。MRとSAのいずれもが同じ液滴内に存在する場合、2つの遺伝子座は同じDNA断片上に局在化している可能性がある。また、NEEDLSは、MRまたはSAといった遺伝子の存在に基づいて、宿主ゲノムから追加的なDNA配列を選択的に取得するために適用できる。したがって、NEEDLSは、感染性生物のゲノムから追加的な配列情報を得るために使用し得る。

【0073】

また、NEEDLSは、対象におけるウイルス因子によって引き起こされるまたはその存在に由来する疾患の診断を補助するために使用してもよい。マルチプレックスNEEDLSを使用し、ウイルスDNAおよび組込み部位のDNA配列の同時富化を追跡することによって、既知の組み込み部位におけるウイルスDNAの有無が決定できる。

【0074】

NEEDLSは、任意の適切な分子検出法によって検出することができる単一ゲノム内または複数のゲノム内の複数の遺伝子に適用してもよい。必要に応じて、一連のマルチプレックスPCR反応を実施し得て、これらは各反応に特異的な染料を使用して差別化できる。これは、例えば、TaqManプローブ、スコーピオンプローブ、分子ビーコンプローブ、または類似のプローブといった検出系を導入することによって行うことができる。また、NEEDLSは、検出点で差別化する必要が無い一連の遺伝子にも適用し得る。差別化は、バーコード化されたPCRまたは類似の方法を使用して、配列の取得後に適用し得る。

【0075】

X. NEEDLSと増幅におけるバイアス
NEEDLSは、複雑な混合DNAサンプルから所望のDNA領域の増幅が発生したサンプルを特異的に選択することに基づく。Phi29ベースの増幅（MDA）が、現在利用可能な最も信頼性の高いゲノム増幅として、繰り返し説明されてきたが、かなりのバイアスを含むことが知られている。Pan et al.［18］は、一般事項として、増幅バイアスを回避する複雑なDNAプールの非常に特異的な全ゲノム増幅（WGA）には課題が残っていると述べている。また、同様の事項が、DOP−PCRおよびランダムプライミングPCRなどの代替的な増幅法でも観察される。これら2つの増幅法は、座位表現（locus representation）を再現するにそれほど効率的ではないと記載されており［19］、多くのバイアス増幅産物が得られるという結果となる。存在する反応の鋳型の量にかからわす、バイアスは一見不可避なようであるが［20］、鋳型独立産物（template independent product；TIP）または増幅中に導入されたバイアスの量は、反応におけるDNA鋳型の量と負の相関するようであり、いくつかの研究では総収量の70〜75％を表すとされている［18］。全ゲノム増幅はNEEDLS過程でDNAを増幅するために適用され、それゆえ、ゲノム増幅のバイアスに関連するこれらの一般的な課題もNEEDLSに当てはまると予想される。よって、WGAを含む手順としては、標的DNA分子に対して多大なバイアスが観察されるだろうと予想される。したがって、WGAを採用するNEEDLSなどの手順は、混合サンプルにおけるDNAの特定の領域を富化できる方法として考慮されてこなかった。

【0076】

驚くべきことに、NEEDLS技術を適用した場合、標的DNA分子の初期濃度が非常に低い場合であってもTIP／バイアスの課題は見られない。NEEDLS系で観察される最小の陰性TIP／バイアスは、増幅プロセスから得られる全体的な収量より著しく低く、したがって、正味の結果が、標的DNA分子の実質的な富化である。

【0077】

この方法は、高濃度のDNAが効率的にNEEDLSに供されるので、希釈初期DNA鋳型を必要としない。この場合、WGA法による増幅のわずか数倍を必要とする。

【0078】

XI.NEEDLSは解析の負担を低減する
NEEDLSは、例えば、生検のヒトゲノムといった生物学的サンプルの大きなゲノムにおけるDNA標的を検出し特徴付けるのに非常に効率的な解析ツールを提供する。これは、以下の例で説明することができる。

【0079】

解析タスクは、平均サイズが30kbである100,000個のDNA分子を含む混合DNA断片のサンプルにおける標的DNA分子の塩基配列を検出し決定することであり、このうち1分子が標的DNAである。混合DNA断片のこのサンプルは、30億塩基対の約1ヒトゲノムに相当し、このDNA断片の平均長は30kbである。30kbの標的DNAのうちわずか200塩基対の塩基配列しか解析手順の開始時に知られていない。

【0080】

本発明の方法を実施する際、
1.各液滴が混合DNA断片を含有し、かつ、１つの液滴当たり5個のDNA断片が平均で存在するように、DNAを複数の液滴に分ける。したがって、液滴数は100,000／5＝20,000液滴となる。20,000個の液滴のうちたった１つの液滴のみに標的DNA分子が含まれる（つまり、各液滴は、0.1コピー未満の標的DNA分子を含むだろう）。

【0081】

2.その後、一般的な増幅によって全液滴中のDNAがコピーされ、これにより、20,000個の液滴内のDNAが増幅され、同じ液滴内で標的DNA分子が（例えば、PCRによって）特異的に検出される。標的DNAを含む液滴を物理的に選択（ソート）し、DNAをシーケンシングする。１つの標的DNA分子と（平均で）4つの非標的DNA分子を含む液滴の選択は、2×10³〜100×10³［つまり0.1×（標的を含まない液滴数）×（標的を含む液滴数）^-1〜10×（標的を含まない液滴数）×（標的を含む液滴数）^-1］の範囲の頻度（富化）の増加に相当することに留意する。

【0082】

3.したがって、本発明のNEEDLS方法を使用する場合、合計20,000個の液滴を増幅試薬（および検出試薬）を用いて調製しなくてはならず、それぞれ（平均で）30kbである（平均で）5個のDNA分子の増幅産物（＝150,000塩基対）を含む検出された液滴は、1個の標的DNA分子を検出し解析するために個々にシーケンシングしなくてはならない。

【0083】

混合DNAサンプルを解析するために従来の方法をこの解析タスクに使用すると、解析の負担が何倍にも増加する。というのは、混合DNAサンプルは、クローニングされたDNA断片または増幅されたDNA断片のライブラリに変換しなければならず、ここで以下に記載の古典的なプロトコルによって示されるように各メンバーを解析しなければならないからである。

【0084】

1.例えば、p＝0.001以下の統計的に控えめな（statistically conservative）確率に対応する0.1％など、液滴が2つのDNA分子を含む可能性が低い条件下で混合DNAサンプルを液滴に等分する。この方法のために必要な液滴数は、DNA分子の数及び１つのアリコート中に＜1分子を発見する確率に基づく。これは、同じ液滴内に2つのDNA分子を見出す確率の平方根として、（近似値）を算出できる（つまり0.03162）。

【0085】

混合DNAサンプルは100,000個のDNA分子を有しているので、（１つの液滴内に2つのDNA分子を含む可能性が統計的に有意でないことを確実にするために）必要な液滴数の控えめな推定値は、100,000×1／0.03162又は3.16×10⁶個の液滴（0.03162×0.03162＝0.001）である。次に、各液滴内のDNAを、1）一般的な増幅またはクローニングによってコピーする、および／または、2）標的DNAをPCRにより特異的に増幅する。

【0086】

2.その後、全ての3.16×10⁶個の液滴を一般的な増幅にかける。そこで、100,000個の液滴には増幅されたDNAが含まれる（そのうちの１つの液滴には標的DNAが含まれるだろう）。次いで、アンプリコンを含む100,000個の液滴が選択され、100,000個の選択された液滴を全て標的DNA分子を検出するために解析しなければならない、というのは、この手順では標的の富化（標的DNA／非標的DNA比の増加）が達成されないからである。

【0087】

200塩基対の既知の配列を増幅するように設計されたプライマーを用いたPCRにより、3.16×10⁶個の液滴を直接的かつ特異的に増幅する場合（断片の残りの部分は未知であるため、その部分は特異的に増幅することができないため）、標的DNAを含む１つの液滴が検出および選択されうる。しかし、ここで、30kbのうちわずか200塩基対しか増幅されず、それに隣接する（flanking）配列は不明のままである。

【0088】

従って、この古典的な方法を用いると、増幅試薬を用いて少なくとも3.16×10⁶個の液滴を調製する必要があり、１つの標的DNA分子を検出しシーケンシングするために、少なくとも100,000個のDNA含有液滴の増幅産物を個々にPCRによりスクリーニングしなくてはならない。

【0089】

【表1】

【実施例】

【0090】

実施例1.コンポストサンプルから得た標的酵素活性の完全なオペロンコーディング
本実施例では、標的リパーゼDNA分子を分離、増幅、同定、単離、および再増幅するためにデュアルチャネルマイクロ流体システムをどのように適用することができるかを実証する。隣接するDNAを含む標的DNAは、元々の宿主からシーケンシングに利用できるようになる。その手順を図5に概略的に示す。

【0091】

DNA抽出および初期PCR
堆積コンポスト（中心温度38℃）から得た混合サンプルを使用して初期DNAサンプルを回収した。他の文献［13］に記載のようにビーズビーティングを用いてDNAを5gのサンプルから抽出した。抽出されたDNAをまず標的リパーゼ遺伝子の存在について検査したところ、下記のPCRに十分な量のDNAを含有することがわかった。PCRは、プライマーLip−Fw: 5’ - CTG AAT GGG GGA ATA ATG ACA AGC C - 3’［配列番号1］及びLip−Re： 5’ - CTA TAC TCT TCT TTT AAT TCC TCA GC - 3’［配列番号2］を用い、約105bpのPCR産物を得た。PCR条件は94℃、62.1℃、72℃（15秒／15秒／90秒）のサイクルを合計40サイクル行った。

【0092】

液滴MDA／融合／ソーティング（物理的選択）
Pan et al.［14］に記載のように100μLのPhi29反応体積を得た。まだ反応混合物を低温で（最大＋4℃）保持しつつ、phi29混合物を、8チャネルの使い捨て液滴発生器のカートリッジ（BioRad）にウェルに載せた。同じ手順を他の追加のウェルについても行い液滴カートリッジの全容量を使用した。その後、残りのチャネルに、液滴油（BioRad）を充填した。完全に充填した液滴発生器のカートリッジを液滴発生器（BioRad）に入れ、カートリッジの全ての反応コンパートメントにおいて完全な反応体積の液滴を形成した（502）。

【0093】

液滴の形成が完了した後、手動で全ての液滴を1.5mlのエッペンドルフ回収チューブに移し、その後増幅反応物を30℃で16時間Eppendorf Thermoshakerに入れた（504）。インキュベーション後、10分間温度を65℃に上昇させることにより反応を停止させた。その後、全体の反応体積（まだエッペンドルフチューブ内で別個の液滴の形態である）を液滴融合デバイス（504）に移し、このデバイス内で、2つの別個の流れを融合して合体させ、元のSampliPhi液滴よりそれぞれ10倍大きい融合液滴を作成した。

【0094】

流れを合体させることにより体積を増加した（流れ1：増幅が起こったSampliPhi液滴、流れ2：PCR検出のための全反応成分が存在するdUTP−PCR）。2つの流れを合体し関連PCR反応を行うことにより、所望の標的を含有する合体した液滴を監視可能にした。上述のように、流れ1は1nLのsampliPhi反応の個々の液滴から構成され、一方、9nLの液滴（流れ2）は以下から構成される混合物より構成された：537μLの水、220μLのPCRバッファ＋Mg⁺⁺（x5）、110μLのdNTP／dUTPmix（2mM）、110μLの各プライマー（10pmol／μL）、110μLのBSA、1μLのSybrGreen（1：10.000）、22μLのDreamTaqポリメラーゼ（5U／μL）。

【0095】

dUTP−PCR増幅中におけるPCRの阻害を回避し、同時にその後のスクリーニングにおける徹底した検出ベースを確立すべく、MDA成分の適切な希釈を確実にするために10倍の体積の過剰量のdUTP−PCRを使用した。

【0096】

融合した液滴を１つのPCRチューブに回収し、標的の存在を検出するために一次スクリーニングについて記載したのと同じPCR条件に供した（506）。PCR終了後、10〜11nLの液滴を別個のマイクロ流体チャンバ内にアラインしたところ、正常に増幅された液滴が検出され、488nmのレーザービームで励起する際の525nmの蛍光シグナルの発光に基づいて選択的に分離した（507）。

【0097】

合計16個の液滴（19.836個中）が陽性であると検出され、一つのチャンバ内に全ての陽性液滴を組み合わせたマイクロチャネルソーティングカートリッジを使用して物理的に選択した。20μLの5mMトリスをマイクロチャネルソーティングカートリッジの回収コンパートメントに添加することにより、ソートされた液滴を手動で1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。SDSの添加により液滴浸潤油を除去し、増幅産物をエタノール沈殿により精製した。精製産物を5μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁した。

【0098】

初期鋳型を含む5μL体積の溶出したdUTP−PCR産物を、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）キットAmpErase（登録商標）（Life Technologies）を用い、25μLの反応体積内で選択的分解に供し、初期鋳型のみを無傷のまま残した。その後、SampliPhi増幅を用いて混合物を再増幅したところ（508）、20μLの全反応体積における最終産物濃度が200ng／μLであった。

【0099】

所望のDNA標的分子の存在を確認するために一次スクリーニングと同じPCRを用い、プロモーター領域、シャイン・ダルガノ配列、および停止コドンを含む完全遺伝子を記述するために、遺伝子の5’および3’の両方における遺伝子およびDNAの配列を得るべくRGWを用いた（510および511）。

【0100】

実施例2：ゲノムのギャップ閉鎖
本実施例は、古典的なプライマー設計により、目的の領域を選択的に選択することによってNEEDLSの単一パスを使用して、如何に未完成のゲノム配列が「ギャップ閉鎖」することができるかについて説明する。この実施例では、Thermoanaerobacter italicus（CP001936J）のゲノム内に57のギャップの存在が示すペアエンドライブラリに対しギャップ閉鎖を実施した。本実施例では、ギャップが422bp〜5,201bpのサイズの範囲である。NEEDLSの単一パスの後に次世代シーケンシング（NGS）による再シーケンシングを行い、さもなくば未完成になってしまうゲノム内の全てのギャップを効率的に閉じる。所望の領域の増幅が行われているこれらの液滴を特異的に選択しシーケンシングすることによってギャップが閉鎖される。そうすることにより、選択的に標的とされた再シーケンシングが達成され、全てのギャップが閉鎖され完全な環状ゲノムを生成した。

【0101】

DNAの調製
（BG10特許）に記載のように2mLの嫌気下で完全増殖した細菌培養物を調製し、抽出をThermo Scientific Gene Jet DNA精製キットを用いて業者の説明通りに行った。溶出および抽出したDNAは、100μLの最終体積中に20ng／μLの濃度を有していた。

【0102】

MDA液滴の生成及び液滴の増幅
サンプルDNAを5x10^-4に希釈し、1μLを、アニーリング緩衝液（SampliPhi）においてランダムエキソ耐性ヘプタマーおよびエキソ耐性ヘキサマープライマーと混合し、BioRad MyCycler PCR機を用いて温度を94℃に3分間上昇させ、その後、5℃／分の速度で温度を20℃まで徐々に減少させることにより、プライマーを鋳型にアニーリングさせた。20℃の温度に達した混合物を氷に移した。実施例1に記載のように、Phi29反応バッファ、dNTP、水、及びPhi29ポリメラーゼを混合物に加えた（701）。

【0103】

液滴生成油を反応チューブに添加し、3000RPMで2分間ボルテックス処理することにより、液滴を生成した（Velp Scientifica）（702）。マイクロ反応チャンバ内の漏斗に通して全体積をポンピングすることによって、巨大な液滴を排除し、5nLより小さい液滴のみを増幅工程に継続させた。サイズにより排除した液滴は廃棄した（704）。

【0104】

サイズによる排除検査に合格した液滴を2時間30℃でインキュベートし、その後、温度を65℃に5分間上昇させることにより増幅プロセスを停止させた。

【0105】

プライマー設計
プライマーは、ギャップの5’または3’方向のいずれかで約100bpの位置を標的とするように手動で設計されている。図6に示すように、5000bpよりも大きいギャップには、二組のプライマーを、一組のプライマーと一緒にギャップの各側に適用した。

【0106】

プライマー1−GAP−Fw：5’−GAAGGGTGACAGGATTGATAC［配列番号5］
プライマー1−GAP−Re：5’−CGGATTTCCTCCTTTCTATTCC［配列番号6］
プライマー2−GAP−Fw：5’−GCCTTGCAAATTCTACATTGACAG［配列番号7］
プライマー2−GAP−Re：5’-CCAAGAAAATCATGGGAGATAGTTC［配列番号8］

【0107】

液滴融合
ギャップが埋められたペアエンドゲノム配列により、それぞれ5〜6対の設計されたプライマー（各10pmol／μL）を含む10通りの組み合わせのdUTP反応混合物（＃1〜＃10）をインシリコで作成した。各組み合わせには、10〜12個のプライマーが含まれていた。プライマーの組み合わせは、別個の液体溶液内で保持し、連続的にアラインさせ、その後[15]に記載されるように液滴とPCR液体サイズを合体させることによりそれぞれのMDA液滴と組み合わせた（705）。得られた最終的な液滴サイズは、10〜20nLの範囲であった。その後、全ての合体した液滴を１つの反応チューブに回収し、以下に記載されるようにdUTP−PCR反応を開始した。

【0108】

dUTP−PCR
単一のチューブ内の全ての合体された液滴について、MyCyclerPCR装置（BioRad社）にて以下のサイクリングパラメータを用いる二段階PCRとしてPCR増幅を実施した：94℃（15秒）、94℃で15秒の変性および72℃で15秒の伸長から成るサイクルを25サイクル（706）。PCR増幅の後、測定および単離のために［15］に記載されるようなマイクロ流体デバイスを用いて50,087個の液滴を解析し、1,807個を選択的にソートした（707）。

【0109】

UDG処理
反応物にSDSを添加して最終濃度を10％（w／w）にすることにより液滴油を除去し、その後、酢酸アンモニウムを添加して最終濃度を2Mにした。溶液を5分間氷上に置き、その後4℃で10分間16.000Gで遠心分離することによって沈殿させた。2倍体積の7MグアニジンHCIを添加し、クリーンアップスピンカラム（GeneJet DNA抽出、Thermo Scientific）を使用して混合物をクリーンアップした。DNA抽出キットに含まれる洗浄バッファを用いて1回の洗浄手順を施した。その後、20μLの溶出したDNAを、業者の説明通りにUDG（Thermo Scientific）で処理し、10分間95℃で熱不活化することによって反応を停止させた。得られた産物を、遠心分離によってエタノール沈殿させ、その後DNAペレットを5μL（5mM）のトリスバッファに再懸濁した。

【0110】

前シーケンシング増幅およびゲノムアセンブリ
全体積が5μLの（UDG処理および沈殿した）DNA鋳型を、全体積が50μLの SampliPhi再増幅における鋳型として用い、合計1μgの増幅DNAを生成した（708）。合計体積をEurofins Genomic （Ebersberg、Germany）によってヌクレオチドシーケンシングし（710）、初期のギャップが埋められたゲノムと得られたGAPゲノムデータのアセンブリを、デフォルトパラメータでゲノムアセンブリするためのCLC Genomics Workbench version 6.0.4を用いて行った。最終結果により、ゲノムの完全アセンブリが示され、最終的な環状ゲノム配列が、合計2,451,061のヌクレオチドを有することがわかった。閉鎖GAP配列をGAPとして［配列番号9］に表す。

【0111】

実施例3：混合物（Staphylococcus）中の特定の亜集団の増幅
本実施例では、液滴ベースのSampliPhを使用してサンプル中の元の多様性を維持しながら、混合試料の標的亜集団から特異的にDNAを単離する方法を示す。この実施例では特異的なプライマーによりStaphylococciが標的とされる。これらのプライマーを用いて選択的に増幅された液滴を単離し、最後に、完全な16SrRNA保存配列、16Sと23SrRNAとの間の遺伝子間転写スペーサー（ITS）、および保存23SrRNA遺伝子領域にわたるPCRを分類に使用して高分解系系統解析を作成した。

【0112】

特異的なプライマー設計
Staphylococciの16SリボソームDNAを標的とするプライマーを、Primroseプライマー設計ソフトウェア［16］を用いて設計した。16S遺伝子の保存領域は、特異的プライマーStaph−Fw：5’- AGA CTG GGA TAA CTT CGG GA −3’［配列番号3］、とStaph−Re：5’- CGT CTT TCA CTT TTG AAC CAT GC -3’［配列番号4］により標的化し、76bpのPCR産物を生成した。

【0113】

サンプルの調製
ボランティアから得た感染が疑われる組織の綿棒サンプルを鋳型として用い、GeneJet Genomic DNA purification（Thermo Scientific）を用いてDNAを抽出した。標的DNA配列（Staphylococcus aureus）の存在を確認するために、予備PCRを用いた。10倍希釈系列を使用し、融解曲線特性と共にRT−PCR解析から得たCq値に基づいて量を確認した。Garcia−Armisen et al.［17］に記載のMPNを用いて、得られたPCR結果を推定標的量に変換した。各細菌標的が平均5.5コピーの16SrRNA遺伝子を有すると推定されることより、総量約8,300個の16SrRNA遺伝子コピーを再計算したところ、μLあたり1,709個の標的化ブドウ球菌であると計算された（701）。

【0114】

液滴の形成
1μLのDNA鋳型を含有する20μLのSampliPhi混合物を調製し、実施例1に記載したように液滴発生器に添加し、それぞれ1nLのSampliPhi Phi29反応混合物を有する液滴を約20,000滴生成した（502）。反応物を30℃で2時間インキュベートし（504）、続いて温度を＋4℃に下げて反応を停止させた。

【0115】

液滴融合
最終増幅の直後に、RT混合物（SSO Advance Supermix、BioRad）を用いて、各液滴を9nLのRT−PCR混合物と合体させて10nLの反応容積を確立し、すべての必要なPCR反応成分を有するようにした。SSO Advance supermixを製造業者による説明通りに調製し、特異的プライマー（Staph−F［配列番号3］＋Staph−R［配列番号4］）を補充した（505）。

【0116】

合体した液滴（約10nl／液滴）の全回収物を5本のPCRチューブに分離し、各チューブに5,000滴に相当する約40μLの反応容量を含ませた。次に、PCR装置（BioRad Connect）内で、5本のPCRチューブのそれぞれにおいて、Staphylococcus aureus特異的プライマーを用いて特異的増幅を行った。ここで、このPCR機のサイクル条件は、（94℃、60℃、72℃）を30サイクル行い、各温度のインターバルを15秒間維持した（506）。増幅後、［18］に記載のように、蛍光活性化液滴選別法（FADS）を用いて液滴をうまく反応させるためにスクリーニングした（507）。解析された合計20,238個の液滴中のうち陽性反応の数は1,562であり、陽性反応（SybrGreen蛍光）がモニターされた全ての液滴を別個の反応チューブに回収した。

【0117】

クリーンアップおよび再増幅
ソートされたSampliPhi増幅液滴を、Yu et al.［19］によって記載されたスピンカラムDNA抽出手順を用いて抽出した。この手順により、クリーンアップ中に用いたシリカ膜のサイズ依存性結合効率により、主に、100bpより大きい産物が精製される結果になる。よって、主にサイズが100bpより大きいDNA産物がクリーンアップにより精製される。従って、PCR産物の略全部が増幅から除去される一方、Phi29増幅されたDNAは容易に回収された。全量を50μLのSampliPhi反応に添加することにより、溶出した10μLのDNA（PCR産物のサイズのためPCR産物が減少）を再増幅した（508）。最終産物は、220ng／μLの濃度を有すると測定され、これは総量11μgのDNAに対応する。最終産物の塩基配列を決定した。

【0118】

結果：実施例3
得られたDNAの配列の16SrRNAクローンライブラリー研究により、すべての16SrRNA遺伝子が同一であり、それらがブドウ球菌属に属するだろうことが判明したので、研究対象の感染は単一のブドウ球菌（Staphylococcus）株由来であったと結論付けた（図8）［配列番号10］。さらに、この研究の間に得られた配列データの解析により、得られた配列の系統学的類似性が強化され、得られた配列の全てが100％同一であったので、マルチプレックス感染培養よりむしろクローン分布であることが示される。16SrRNAおよび23SrRNA遺伝子の両方が存在する組み合わせ解析の結果により、距離を持って関連する（distantly related）細菌が解析されたサンプル中に存在する場合であっても、系統分類の精度が高くなる。さらに、16SrRNAと23SrRNA遺伝子との間の高度に可変なITS領域も解析に含まれていたので、記載の実施例は、非常に緊密に関連する株であっても区別する情報も提供する。我々は、クローン起源の感染の発生を複数の株起源の感染とを区別するためにもこの情報を用いた。

【0119】

配列のアセンブリにより、生成PCR産物を液滴スクリーニング手順からほぼ完全に排除することが示された。小さなサイズのPCR産物はシリカベースの精製に影響を与えるが、おそらく十分に大きなサイズの鋳型がないために、Phi29反応が置換増幅を開始しないだろうことも驚くべきことである。Phi29増幅は、大きなDNA片を増幅する場合に効率的であるが、76bpのDNA分子の増幅が事実上不可能であることが知られている。

【0120】

実施例4：E.coliとHeLa DNAの混合物から特異的なE.coli遺伝子の増幅
本実施例は、非標的バックグラウンド（HeLa）DNAが元々豊富であるサンプルにおいて、液滴ベースのSampliPhiを用いて、特異的に標的化されたDNA配列（E.coli由来のThrA遺伝子）からDNAを単離する方法を示す。液滴生成チップを用いてPhi29（酵素）反応成分を有する液滴を生成し、フルオロカーボンキャリア油中に約800〜900plのモノ分散液滴を生成した。各液滴にPCR成分を加え、標的配列が存在する液滴をPCRで増幅した後、蛍光液滴として検出し、ソーティング用のマイクロ流体デバイスを用いて収集した。

【0121】

総量20μl（x1 Phi29反応バッファ、0.05mMのdNTP、1μl（即使用可能）のx1ランダムヘキサマープライマー（Thermo Scientific）、0.25μlのPhi29ポリメラーゼ（Enzymatics））に1μLのDNA鋳型を添加することによってPhi反応を設定した。次いで、マイクロ流体液滴デバイスを用いてPhi反応物をフルオロカーボン油で分離することにより、混合物を、約700〜800plの水性液滴アリコートに分注した。その後液滴を30℃で4時間インキュベートした。

【0122】

液滴形成およびその後のインキュベーションの後、PCR成分の混合物を合体させ各液滴にし、レポーター分子として使用される分子ビーコンを用いた最適化PCRシステムを用いて特異的検出を行った。この例では、特異的プライマー（MB8fw1およびMB8Re1）並びにこれらの2つの特異的プライマーの間のDNA配列にアニールするように設計された特異的分子ビーコン（MB8.9）により、E.colアスパルトキナーゼ（ThrA）を標的とした。特異的な増幅が観察されなかった液滴は、その後、マイクロ流体デバイスを用いて選択的に除去し、収集した液滴の内容物を再増幅し、シーケンシングを可能にするのに十分な量のDNAに達するようにした。

【0123】

特異的プライマーの設計
E.coliのthrA領域を標的とするプライマーおよびビーコンを手動で設計した。ビーコン折りたたみ構造は、mFoldソフトウェア［20］を用いて確認した。
MB8fw1：5’-GACGGTAGATTCGAGGTAATGC-3’［配列番号11］
MB8Re1：5’-TATGGCCGGCGTATTAGAAG-3’［配列番号12］
MB8.9：5’（HEX）−CGTTTGTGTTTTCGACCGGATCGATAACAGTAACG-3’（BHQ）［配列番号13］

【0124】

サンプルの調製
E.coli（Life Technologies）およびHeLa（Promega）由来のDNAを、1μg／μlのE.coliおよび4μg／μlのHelaの最終濃度で混合した。ゲノムサイズに基づく計算から、この混合物は約200コピーの標的遺伝子（ThrA）prを含む。μlおよびリアルタイムPCR測定により、標的の初期量が200コピー／pgであることが確認された。

【0125】

液滴の形成
1μLのDNAサンプルを含む15μLのPhi29混合物を調製し、実施例1に記載したように液滴発生器に添加した。この手順により、それぞれ約800〜900μLのPhi29反応混合物を有する液滴を約16,500滴を生成した。液滴生成は、液滴生成の前に系内で増幅が起こらないように4℃で実施した。次いで、反応物を30℃で4時間インキュベートした。

【0126】

液滴融合
最終増幅の直後に、合体用x接合チップを用いて各Phi29液滴を、（x1 PCRバッファ、0.1mMのdNTP、0.2mMのMg＋、0.05UのGoTaq2、0.025pmol／μlのMB8−Fw1、0.025pmol／μlのMB8-Re1、0.018pmol／μlのMB8.9−BHQ−HEX）を含む4nLのPCR混合物と合体させた。合体した液滴（約5nl／液滴）の全回収物を、2試薬液滴チップ（ゲートサイズ：50μm）にポンプで注入し、平均サイズ80plの液滴を合計210,000個生成した。標準的なPCR装置（MyCycler、BioRad）において95℃（2分）＋35サイクルの94℃（3秒）＋56℃（15秒）の2段階増幅プロトコルを使用し、それぞれ合体させ再液滴で形成された液滴におけるPCR増幅を行った。標的鋳型が最初に増幅されたそれらの液滴は、特異的な標的が存在しない液滴と容易に区別できる強い蛍光シグナルを生成した。陽性液滴と陰性液滴との区別は、HEX蛍光発光源および検出フィルターを備えた標準蛍光顕微鏡（Nikon）を用いて行った。

【0127】

増幅された液滴は、ソーティングに使用する液滴生成チップ（100μm X−ゲート、2試薬液滴チップ）の検出／回収セクションにポンプで送り込まれ、空のチャネルに十分な吸引力を加えることで合計50個の液滴を回収し、陰性の液滴を廃棄しつつ陽性の液滴の単離を確実に行った。

【0128】

クリーンアップおよび再増幅
集めた液滴を、重力流によってマイクロ流体装置から回収し、200μlのPCRチューブ内の50μlのフルオロカーボン油に回収した。10μlの水をチューブに添加して、混合物の水相の単離に使用した。次いで、10μlのサンプルを回収し、10μlの全容量を鋳型として使用し、最初のPhi増幅（Enzymatics）で上述した条件と同一の条件を用いて、再増幅した。

【0129】

最終産物を20μlの総反応容量中で330ng／μLの濃度まで測定した。RT−PCR（SSO Advance、BioRad）および全DNA定量（Promega、BioFluorometer）を使用し富化を決定したところ、最終量は3160標的コピー／pgであり、これは標的増加量が79倍であることに対応する。

【0130】

増幅された標的化塩基配列（97bp）：GACGGTAGATTCGAGGTAATGCCCCACTGCCAGCAGTTTTTCGACCGGATCGATAACAGTAACGTTGTGACCGCGCGCTTCTAATACGCCGGCCATA［配列番号14］

【0131】

富化された産物から次世代シーケンシング（Illumina、150bpペアエンド末端ライブラリー）が生成され、結果は12.258bpで、x4からx63までの範囲をカバーしていることを示した。最も高いカバレッジは、標的配列（増幅および標的化ヌクレオチド配列、上記参照）に位置し、最も低いカバレッジは、アセンブリの最も遠い5’末端であった。得られた配列は、アセンブリの全範囲にわたって参照ゲノム（受託番CP011324)と100%アラインした。

【0132】

参考文献
1. Sharma, S., et al., Droplet-based microfluidics. Methods in Molecular Biology, 2013. 949: p. 207-30.
2. Hindson, B.J., et al., High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem, 2011. 83(22): p. 8604-10.
3. Sambrook, J. and D.W. Russell, Molecular Cloning a laboratory manual2001: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
4. Walter, N.G., Single molecule tools: fluorescence based approaches, part A. Preface. Methods in Enzymology, 2010. 472: p. xxi-xxii.
5. Kintses, B., et al., Microfluidic droplets: new integrated workflows for biological experiments. Current Opinion in Chemical Biology, 2010. 14(5): p. 548-55.
6. Rinke, C., et al., Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nat. Protocols, 2014. 9(5): p. 1038-1048.
7. Raghunathan, A., et al., Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and Environmental Microbiology, 2005. 71(6): p. 3342-3347.
8. Day, P., Manz, A., Zhang, Y., Microdroplet Technology: Principles and Emerging Applications in Biology and Chemistry. Integrated analytical systems, ed. R.A. Potyrailo2012.
9. Longo, M.C., M.S. Berninger, and J.L. Hartley, Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 1990. 93(1): p. 125-8.
10. Prodelalova, J., et al., Isolation of genomic DNA using magnetic cobalt ferrite and silica particles. Journal of Chromatography A, 2004. 1056(1-2): p. 43-48.
11. Kilstrup, M. and K.N. Kristiansen, Rapid genome walking: a simplified oligo-cassette mediated polymerase chain reaction using a single genome-specific primer. Nucleic Acids Res, 2000. 28(11): p. e55.
12. Liu, L., et al., Comparison of next-generation sequencing systems. J Biomed Biotechnol, 2012. 2012: p. 251364.
13. Kvist, T., et al., Diversity of thermophilic and non-thermophilic crenarchaeota at 80 degrees C. FEMS Microbiol.Lett., 2005. 244(1): p. 61-68.
14. Pan, X., et al., A procedure for highly specific, sensitive, and unbiased whole-genome amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008. 105(40): p. 15499-15504.
15. Brouzes, E., et al., Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009. 106(34): p. 14195-14200.
16. Ashelford, K.E., A.J. Weightman, and J.C. Fry, PRIMROSE: a computer program for generating and estimating the phylogenetic range of 16S rRNA oligonucleotide probes and primers in conjunction with the RDP-II database. Nucleic Acids Res., 2002. 30(15): p. 3481-3489.
17. Garcia-Armisen, T. and P. Servais, Enumeration of viable E. coli in rivers and wastewaters by fluorescent in situ hybridization. J Microbiol.Methods, 2004. 58(2): p. 269-279.
18. Baret, J.C., et al., Fluorescence-activated droplet sorting (FADS): efficient microfluidic cell sorting based on enzymatic activity. Lab Chip, 2009. 9(13): p. 1850-8.
19. Yu, Z. and W. Mohn, Killing two birds with one stone: simultaneous extraction of DNA and RNA from activated sludge biomass Canadian Journal of Microbiology, 1999. 45(3): p. 269-272.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2016年4月8日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

混合DNA分子のサンプルから１つ又は複数の標的DNA分子を富化するためのインビトロの方法であって、以下の工程を含む方法：
a）１つまたは複数の特異的な標的DNA分子および一般的なDNA増幅用の試薬を含む混合DNA分子の液体サンプル設けること（401）；
b）前記液体サンプルから混合DNA分子をそれぞれ含有する複数の液滴を形成すること（403）；
c）複数の液滴における混合DNA分子を一般的な増幅にかけること、ここで、各液滴は、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、あるいは更により好ましくは0.1未満の前記１つ又は複数の標的DNA分子を含有する（404）；
d）少なくとも１つの前記標的DNAを含有する液滴において前記１つ又は複数の標的DNA分子を特異的に検出すること（405）；並びに、
e）少なくとも１つの前記標的DNA分子を含有する液滴を物理的に選択すること（406）、ここで工程（a）における混合DNA分子のサンプルにおける標的DNA分子の頻度に対し、標的DNA分子の頻度が、0.1×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1から10×（標的DNAを有さない液滴数）×（標的DNAを有する液滴数）^-1の間に増加される。

【請求項2】

液滴の合計数が少なくとも10,000である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程c）における前記一般的な増幅の後、前記１つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬を、前記複数の液滴に添加する（505）、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つまたは複数の標的DNA分子の特異的検出用の試薬が、前記サンプル中に含まれる（401）、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記標的DNA分子は、１つまたは複数の少なくとも10ヌクレオチドの固有連続配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

工程（c）におけるDNAの一般的な増幅は、ランダム縮重プライム化PCR、リンカーライゲーションPCR、縮重オリゴヌクレオチドプライム化（DOP）PCR、及び多置換増幅の中から選択される技術によって行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

特異的検出はPCRを用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

特異的検出用の試薬は、dUTPを含有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

（f）前記１つ又は複数の標的DNA分子を特異的に検出するために、生成されたDNAを不活性化、分解、又は除去すること、を更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

不活性化は、ウラシルDNA Nグリコシラーゼを用いて行われる、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記方法は、
（g）工程（a）〜（e）を反復することを更に含み、
ここで、反復する工程（a）の前記液体サンプルにおける混合DNA分子は、工程（e）で選択された標的DNA分子を含む液滴由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

（h）工程（e）で得られた液滴中に含まれる標的DNA分子を増幅することを更に含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的DNA分子は、1,000〜100,000の核酸塩基対、好ましくは2,000〜70,000の核酸塩基対、より好ましくは2,500〜50,000の核酸塩基対を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的DNA分子は細胞のゲノムに由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

工程b）で形成された前記液滴は、１つの液滴あたり平均で0.5未満、好ましくは0.25未満、更により好ましくは0.1未満の標的DNA分子を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

【国際調査報告】