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特表2017-526725核酸一本鎖環状ライブラリを構築するための方法および試薬

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-526725(P2017-526725A)

(43)【公表日】2017年9月14日

(54)【発明の名称】核酸一本鎖環状ライブラリを構築するための方法および試薬

(51)【国際特許分類】

C40B 40/06 20060101AFI20170818BHJP

C12N 15/09 20060101ALN20170818BHJP

C12Q 1/68 20060101ALN20170818BHJP

【ＦＩ】

C40B40/06ZNA

C12N15/00 A

C12Q1/68 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2017-514335(P2017-514335)

(86)(22)【出願日】2014年10月14日

(85)【翻訳文提出日】2017年5月10日

(86)【国際出願番号】CN2014088543

(87)【国際公開番号】WO2016037394

(87)【国際公開日】20160317

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2014/086418

(32)【優先日】2014年9月12日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】512096768

【氏名又は名称】ビージーアイシェンチェンカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コン、チュンユイ

(72)【発明者】

【氏名】クオ、ロンロン

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ルオイン

(72)【発明者】

【氏名】ホー、リンユイ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、ウェンウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チアン、ホイ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QQ43

4B063QR08

4B063QR20

4B063QR42

4B063QR55

4B063QR62

4B063QR63

4B063QR82

4B063QS12

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、核酸一本鎖環状ライブラリを構築するための方法および試薬を提供する。上記方法は、トランスポサーゼ包埋複合体を用いることにより核酸をランダムに切断して第１のリンカーを接続させ、差異の部分に第２のリンカーを接続させ、第１のＰＣＲ反応を実施し、その際、一方のプライマーの５'末端が第１のアフィニティタグを有し、その結果、得られた産物の両末端に異なるリンカー配列が接続され、上記産物を第２のアフィニティタグを有する固体ベクターと結合させ、アフィニティタグを有さない一本鎖を変性して分離し、上記一本鎖を環化する工程を有する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための方法であって、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に前記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、前記断片化二本鎖核酸において３’末端と前記第１のアダプターとの間には差異ができており、
反応系から前記トランスポサーゼを除去した後、前記断片化二本鎖核酸の前記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、前記第２のアダプターの配列は前記第１のアダプターの配列とは異なり、
前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、前記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に第１のアフィニティマーカーを含み、
第２のアフィニティマーカーを有する固体担体に前記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、前記第１のアフィニティマーカーと前記第２のアフィニティマーカーとが結合し、
前記固体担体と結合した前記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、前記第１のアフィニティマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し、
前記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて前記一本鎖核酸を環化する
工程を有する方法。

【請求項2】

前記第１のＰＣＲ反応を実施する前に、前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に前記第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第２のｐｃｒ産物を取得する工程をさらに有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のＰＣＲ反応で用いる、エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、前記エクソン配列のプローブを用いて前記第２のｐｃｒ産物から捕獲する工程を、前記第２のＰＣＲ反応の後であって前記第１のＰＣＲ反応より前にさらに有し、前記エクソン配列の前記プローブは前記第１のアフィニティマーカーを含み、前記固体担体の前記第２のアフィニティマーカーと結合できる、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断する工程を、前記エクソン配列を含有する前記一本鎖核酸を前記エクソン配列の前記プローブを用いて前記第２のｐｃｒ産物から捕獲する前にさらに有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のアフィニティマーカーはビオチンマーカーであり、前記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンマーカーである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記トランスポサーゼの反応系からの除去は磁気ビーズ精製、カラム精製、または化学試薬処理によって行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記固体担体は磁気ビーズである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

請求項１に記載の方法であって、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に前記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、前記断片化二本鎖核酸において３’末端と前記第１のアダプターとの間には差異ができており、
反応系から前記トランスポサーゼを除去した後、前記断片化二本鎖核酸の前記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、前記第２のアダプターの配列は前記第１のアダプターの配列とは異なり、
前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第２のｐｃｒ産物を取得し、前記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有し、
前記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断し、
エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、前記エクソン配列のプローブを用いて前記第２のｐｃｒ産物から捕獲し、前記プローブはビオチンマーカーを含み前記固体担体のストレプトアビジンマーカーと結合でき、
前記エクソン配列をそれぞれ含有する前記一本鎖核酸の両末端をそれぞれ標的とするプライマーからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に異なるアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、前記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に前記ビオチンマーカーを含み、
前記ストレプトアビジンマーカーを有する前記固体担体に前記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、前記ビオチンマーカーと前記ストレプトアビジンマーカーとが結合し、
前記固体担体と結合した前記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、前記ビオチンマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し、
前記ビオチンマーカーを含まない前記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて、前記ビオチンマーカーを含まない前記一本鎖核酸を環化する
工程を有する方法。

【請求項10】

一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための試薬であって、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとからなるトランスポサーゼ包埋複合体であって、前記トランスポサーゼ包埋複合体は、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化して各末端に前記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、前記断片化二本鎖核酸において３’末端と前記第１のアダプターとの間に差異をつくるのに好適な、前記トランスポサーゼ包埋複合体、
第２のアダプターおよびリガーゼを含む成分であって、前記断片化二本鎖核酸の前記差異の部分に、リガーゼを用いて前記第２のアダプターをライゲーションさせるのに好適な、前記成分、
第１のＰＣＲ反応で用いる第１のプライマー対であって、前記第１のプライマー対は前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなり、前記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に第１のアフィニティマーカーを含む、前記第１のプライマー対、
第２のアフィニティマーカーを有し、前記第１のアフィニティマーカーとの結合に好適な、固体担体、
前記固体担体と結合したＰＣＲ産物を変性させる変性溶液であって、前記第１のアフィニティマーカーを有さない一本鎖核酸を単離するのに好適な前記変性溶液、および
前記一本鎖核酸の両末端に結合でき、前記一本鎖核酸を環化するのに好適な、一本鎖環化「架橋」配列
を含む試薬。

【請求項11】

請求項１０に記載の試薬であって、第２のＰＣＲ反応で用いる第２のプライマー対をさらに含み、前記第２のプライマー対は、前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなり、
好ましくは、前記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有する試薬。

【請求項12】

請求項１０または１１に記載の試薬であって、エクソン配列のプローブをさらに含み、前記プローブは前記第１のアフィニティマーカーを有し、前記固体担体の前記第２のアフィニティマーカーと結合でき、前記エクソン配列を含有する一本鎖核酸を第２のＰＣＲ産物から捕獲するのに好適であり、
好ましくは、前記試薬は、前記第２のＰＣＲ産物の各末端に位置するプライマー配列を遮断するプライマー遮断配列をさらに含有する試薬。

【請求項13】

前記第１のアフィニティマーカーはビオチンマーカーであり、前記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンマーカーである、請求項１０に記載の試薬。

【請求項14】

前記固体担体は磁気ビーズである、請求項１０に記載の試薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は分子生物学分野に関し、特に、一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための方法および試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

エクソンシーケンシングはゲノム分析法の１つであり、標的エクソーム捕獲としても知られる。この方法では、エクソン領域を含む全ゲノムＤＮＡを配列領域捕獲技術によって捕獲し、濃縮し、続いてハイスループットシーケンシングに供する。エクソンシーケンシングによれば、ゲノムからコード配列を高効率で選択できる。この方法はゲノムリシーケンシングよりも安価であり、単一塩基多型や既知遺伝子の挿入および欠失を研究する上で非常に有利である。エクソンライブラリとして一般的に使用されるのは、イルミナプラットフォームまたはプロトンプラットフォームに用いる二本鎖ＤＮＡを含むライブラリである。こうしたライブラリは、次のようなプロトコールによって大まかに構築される。ゲノムＤＮＡをランダムに断片化して長さ１８０〜２８０ｂｐの断片とし、エンドリペアに供した後、得られた断片の各末端にアダプターをライゲーションさせ、アデニン（Ａ）テールを付加することによって、ライブラリを構築する。このライブラリを、ビオチン標識プローブを用いて１回目の液体ハイブリダイゼーションを行うことにより１回目の濃縮に供し、この１回目の濃縮により得たエクソンを、ストレプトマイシン被覆磁気ビーズを用いて捕獲し、次いで溶出により磁気ビーズから分離して、２回目の液体ハイブリダイゼーションを行うことにより２回目の濃縮に供する。２回の濃縮の後に得たライブラリをＰＣＲ反応によって直鎖方向に増幅し、適格であると確認されたら、シーケンシングに使用できる。

【0003】

ただ、ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）プラットフォームシーケンシングに使用されるエクソンライブラリについては、これを安定して構築できる方法はない。従来のライブラリ構築法はＣＧによるものであり、基本的に図１に示すプロトコールに従ってアダプターを１つ用いてライブラリを構築する。図１に示すプロトコールでは、ゲノムＤＮＡをランダムかつ物理的に断片化して、特定範囲内の長さを有する断片とし、エンドリペアに供した後、アダプターＡを指向的にライゲーションさせ、ビオチン被覆プローブとともに液体ハイブリダイゼーションに供し、ストレプトマイシン被覆磁気ビーズを用いてエクソンを捕獲し、ＰＣＲ増幅に供して一本鎖核酸を単離し、最後にこの一本鎖核酸を環化して、一本鎖環状核酸を含むライブラリを得る。この方法は複雑で時間がかかるため、大幅な改善の余地がある。

【0004】

Ｅｐｉｃｅｎｔｒａ社のＮｅｘｔｅｒａキットによるトランスポサーゼ断片化キット（購入元はＩｌｌｕｍｉｎａ）は、トランスポサーゼを用いて、完全なＤＮＡ断片化とアダプターライゲーションとを同時に実施できるため、サンプル調製にかかる時間が短い。こうした断片化およびアダプターライゲーション法をライブラリ構築に使用できる。

【0005】

トランスポサーゼ断片化は操作が簡便であるため、他の方法よりもスループットおよび操作の簡便さの点で大幅に優れていることは疑いない。しかし、この断片化法にも欠点がある。例えば、トランスポサーゼによる転位は特定の配列、すなわち１９ｂｐのＭｅ配列に依存する。従って、たとえトランスポサーゼが２種の全く異なるアダプター配列を包埋し、これによって異なるアダプター配列を標的配列の５’末端および３’末端にライゲーションできても、標的配列を断片化すると、トランスポサーゼのもつ特殊な機能のために、両末端に対称的にＭｅ配列を含有することになり、標的配列（断片化断片）とＭｅ配列との間に９ｎｔの差異が生じる。そして、標的配列の両末端に位置する同一のＭｅ配列は、以降の工程に悪影響を及ぼすことになる。例えば、このアダプターライゲーションを次世代シーケンシング技術と組み合わせた場合には、標的配列の鎖の両末端にあるＭｅ配列が互いに相補的であるために、１つの一本鎖分子の内部でアニーリングが起こりやすく、その結果、アンカリングプライマーとの結合に悪影響を及ぼす。

【0006】

現時点では、特にエクソンシーケンシングに使用するための、一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築する簡便な方法が緊急に求められている。

【発明の概要】

【0007】

本開示の実施形態は、一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための方法および試薬を提供する。この方法は、簡便で、短時間で実施でき、一本鎖核酸の両末端にある同一トランスポサーゼ認識配列による悪影響を受けない。

【0008】

本開示の第１の態様の実施形態によれば、一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための方法が提供される。この方法は、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に上記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、上記断片化二本鎖核酸において３’末端と上記第１のアダプターとの間には差異ができており、
反応系から上記トランスポサーゼを除去した後、上記断片化二本鎖核酸の上記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、上記第２のアダプターの配列は上記第１のアダプターの配列とは異なり、
上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、上記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に第１のアフィニティマーカーを含み、
第２のアフィニティマーカーを有する固体担体に上記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、上記第１のアフィニティマーカーと上記第２のアフィニティマーカーとが結合し、
上記固体担体と結合した上記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、上記第１のアフィニティマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し、
上記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて上記一本鎖核酸を環化する
工程を有する。

【0009】

本開示の実施形態において、上記方法はさらに、上記第１のＰＣＲ反応を実施する前に、上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に上記第１のアダプター配列および上記第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第２のｐｃｒ産物を取得する工程を有する。

【0010】

本開示の実施形態において、上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有する。

【0011】

本開示の実施形態において、上記方法はさらに、上記第１のＰＣＲ反応で用いる、エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、上記エクソン配列のプローブを用いて上記第２のｐｃｒ産物から捕獲する工程を、上記第２のＰＣＲ反応の後であって上記第１のＰＣＲ反応より前に有し、上記エクソン配列の上記プローブは上記第１のアフィニティマーカーを含み、上記固体担体の上記第２のアフィニティマーカーと結合できる。

【0012】

本開示の実施形態において、上記方法はさらに、上記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断する工程を、上記エクソン配列を含有する上記一本鎖核酸を上記エクソン配列の上記プローブを用いて上記第２のｐｃｒ産物から捕獲する前に有する。

【0013】

本開示の実施形態において、上記第１のアフィニティマーカーはビオチンマーカーであり、上記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンマーカーである。

【0014】

本開示の実施形態において、上記トランスポサーゼの反応系からの除去は磁気ビーズ精製、カラム精製、または化学試薬処理によって行われる。

【0015】

本開示の実施形態において、上記固体担体は磁気ビーズである。

【0016】

本開示の実施形態において、上記方法はさらに、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に上記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、上記断片化二本鎖核酸において３’末端と上記第１のアダプターとの間には差異ができており、
反応系から上記トランスポサーゼを除去した後、上記断片化二本鎖核酸の上記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、上記第２のアダプターの配列は上記第１のアダプターの配列とは異なり、
上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第２のｐｃｒ産物を取得し、上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有し、
上記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断し、
エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、上記エクソン配列のプローブを用いて上記第２のｐｃｒ産物から捕獲し、上記プローブはビオチンマーカーを含み上記固体担体のストレプトアビジンマーカーと結合でき、
上記エクソン配列をそれぞれ含有する上記一本鎖核酸の両末端をそれぞれ標的とするプライマーからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に異なるアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、上記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に上記ビオチンマーカーを含み、
上記ストレプトアビジンマーカーを有する上記固体担体に上記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、上記ビオチンマーカーと上記ストレプトアビジンマーカーとが結合し、
上記固体担体と結合した上記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、上記ビオチンマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し、
上記ビオチンマーカーを含まない上記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて、上記ビオチンマーカーを含まない上記一本鎖核酸を環化する
工程を有する。

【0017】

本開示の第２の態様の実施形態によれば、一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための試薬が提供される。上記試薬は、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとからなるトランスポサーゼ包埋複合体であって、上記トランスポサーゼ包埋複合体は、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化して各末端に上記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、上記断片化二本鎖核酸において３’末端と上記第１のアダプターとの間に差異をつくるのに好適な、上記トランスポサーゼ包埋複合体、
第２のアダプターおよびリガーゼを含む成分であって、上記断片化二本鎖核酸の上記差異の部分に、リガーゼを用いて上記第２のアダプターをライゲーションさせるのに好適な、上記成分、
第１のＰＣＲ反応で用いる第１のプライマー対であって、上記第１のプライマー対は上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなり、上記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に第１のアフィニティマーカーを含む、上記第１のプライマー対、
第２のアフィニティマーカーを有し、上記第１のアフィニティマーカーとの結合に好適な、固体担体、
上記固体担体と結合したＰＣＲ産物を変性させる変性溶液であって、上記第１のアフィニティマーカーを有さない一本鎖核酸を単離するのに好適な上記変性溶液、および
上記一本鎖核酸の両末端に結合でき、上記一本鎖核酸を環化するのに好適な、一本鎖環化「架橋」配列
を含む。

【0018】

本開示の実施形態において、上記試薬は、第２のＰＣＲ反応で用いる第２のプライマー対をさらに含み、上記第２のプライマー対は、上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなり、
好ましくは、上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有する。

【0019】

本開示の実施形態において、上記試薬は、エクソン配列のプローブをさらに含み、上記プローブは上記第１のアフィニティマーカーを有し、上記固体担体の上記第２のアフィニティマーカーと結合でき、上記エクソン配列を含有する一本鎖核酸を第２のＰＣＲ産物から捕獲するのに好適であり、
好ましくは、上記試薬は、上記第２のＰＣＲ産物の各末端に位置するプライマー配列を遮断するプライマー遮断配列をさらに含有する。

【0020】

【0021】

本開示の実施形態において、上記固体担体は磁気ビーズである。

【0022】

本開示の実施形態において提供される技術上の解決策によれば、本方法は、二本鎖核酸サンプルをトランスポサーゼによって断片化し、さらに得られた断片化二本鎖核酸に第２のアダプターをライゲーションさせて、その結果、二本鎖核酸の両末端に２種の異なるアダプター配列がそれぞれライゲーションした二本鎖を得る工程を含む。これをもとに、本方法はさらに、一本鎖核酸を単離し次いで環化して、一本鎖環状核酸を含むライブラリを得る工程を含む。従来の方法と比較して、本開示の方法は、簡便で、短時間で実施でき、一本鎖核酸の両末端にある同一トランスポサーゼ認識配列による悪影響を受けない。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、アダプター１つを用いてＧＣによりライブラリを構築する先行技術の方法を示すフローチャートである。

【図2】図２は、トランスポサーゼとアダプター１つとを用いた本開示の一実施形態のエクソンライブラリ構築方法を示す簡潔なフローチャートである。

【図3】図３は、トランスポサーゼとアダプター１つとを用いた本開示の一実施形態のエクソンライブラリ構築方法を示す詳細なフローチャートである。

【図4】図４は、本開示の一実施形態の一本鎖環状核酸を含むライブラリの検出を行った際の電気泳動図である。レーン１はこの実施形態で得た環状一本鎖産物を示し、Ｍ１およびＭ２は環状一本鎖ＤＮＡのマーカー２種を示す。

【図5】図５は、本開示の一実施形態の一本鎖環状核酸を含むライブラリのシーケンシングにより得た塩基１個の読み深度累積値の分布を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本開示を、特定の実施形態を参照してさらに詳細に記載する。以下の実施形態において用いられる技術は、特記しない限り、当業者に知られる従来の技術である。本明細書中で用いられる装置、機器、および試薬は、当業者であれば、市販品を購入する等といった周知の方法により入手できる。

【0025】

本明細書中で用いられる用語に関し、特定の実施形態において、第１のアダプターはアダプターＮｏ．１、第２のアダプターはアダプターＮｏ．２と称する。

【0026】

本開示中の「第１」および「第２」等の概念はすべて、あるものをそれ以外のものと区別する目的のみにおいて記載されるものであり、相対的な順序や技術を示したり示唆したりするものではない。

【0027】

本開示の一実施形態の一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築するための方法は、トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に上記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、上記断片化二本鎖核酸において３’末端と上記第１のアダプターとの間には差異ができており；反応系から上記トランスポサーゼを除去した後、上記断片化二本鎖核酸の上記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、上記第２のアダプターの配列は上記第１のアダプターの配列とは異なり；上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、上記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に第１のアフィニティマーカーを含み；第２のアフィニティマーカーを有する固体担体に上記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、上記第１のアフィニティマーカーと上記第２のアフィニティマーカーとが結合し；上記固体担体と結合した上記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、上記第１のアフィニティマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し；上記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて上記一本鎖核酸を環化する工程を有する。

【0028】

一本鎖環状核酸を含む上記ライブラリは、エクソンまたはイントロンに関係なく、上述の方法によって作成できる。イントロンを含まない細菌ゲノムの場合、上述の方法によって一本鎖環状核酸を含むライブラリを構築でき、このライブラリを以降の操作（シーケンシング等）で使用できることが知られている。

【0029】

本開示の実施形態において提供される上記方法は、上記トランスポサーゼ包埋複合体を用いて上記核酸の断片化と上記アダプターのライゲーションとを同時に実施できる。従って、従来の方法にあるエンドリペア、アダプターライゲーション、および中間体精製の工程を要しないため、工程が簡潔であり時間がかからない。

【0030】

本開示において、上記第１のアダプターは上記トランスポサーゼ認識配列、典型的には既知の１９ｂｐのＭｅ配列を含有し、二本鎖の状態で存在する。この二本鎖は、一方の鎖の３’末端がジデオキシ修飾されているため（すなわちジデオキシヌクレオチド）、自己ライゲーションも内部ライゲーションもしない。「自己ライゲーション」とは、同種のアダプター２つの間で生じるライゲーションを指し、例としては、第１のアダプター２つの間で生じるライゲーションや第２のアダプター２つの間で生じるライゲーションが挙げられる。「内部ライゲーション」は異なるアダプター２つの間で生じるライゲーションを指し、例としては、上記第１のアダプターと上記第２のアダプターの間で生じるライゲーションが挙げられる。上記トランスポサーゼ包埋複合体により上記二本鎖核酸サンプルを断片化し、その後、上記第１のアダプターの第１の鎖を上記断片化二本鎖核酸の鎖の一方とライゲーションさせる。この際、上記第１のアダプターのもう一方の鎖と上記断片化二本鎖核酸のもう一方の鎖との間に９ｎｔの差異が形成される。この差異は、従来の方法においてはニックトランスレーションによって埋める必要があるが、本開示の方法においては上記第２のアダプターのライゲーション部位となる。

【0031】

本開示において、上記第２のアダプターの配列は、上記第１のアダプターの配列と異なる配列であれば任意の配列であってよい。その理由として、本開示で用いる上記第２のアダプターの主な目的は、上記二本鎖核酸の両末端に同一トランスポサーゼ認識配列がくるのを避けることだからである。上記第２のアダプターが上記差異の部分にライゲーションされた後、上記第１のアダプターおよび上記第２のアダプターをそれぞれ標的とするプライマーを用いて上記第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に上記第１のアダプター配列および上記第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた上記第１のｐｃｒ産物を得ることができる。

【0032】

本開示において、上記第１のＰＣＲで用いる第１のプライマー対のうち一方のプライマーは５’末端に第１のアフィニティマーカーを含む。上記第１のアフィニティマーカーは、生物学的結合反応に一般的に用いられるもの、例えば抗原または抗体、二本短鎖ＤＮＡ断片の一方の鎖、ビオチンまたはストレプトアビジン等であってよい。上記第１のアフィニティマーカーとして抗原を選択する場合、この抗原に結合できる抗体を上記第２のアフィニティマーカーとして選択する。逆の場合も同じである。二本短鎖ＤＮＡ断片の一方の鎖を上記第１のアフィニティマーカーとして選択する場合、これに相補的な、その二本短鎖ＤＮＡ断片のもう一方の鎖を上記第２のアフィニティマーカーとして選択する。逆の場合も同じである。上記第１のアフィニティマーカーとしてビオチンを選択する場合、ビオチンに結合できるストレプトアビジンを上記第２のアフィニティマーカーとして選択する。逆の場合も同じである。本開示の一実施形態において、上記第１のアフィニティマーカーはビオチン、上記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンであり、いずれも強い結合能力を有する。

【0033】

本開示において、上記一本鎖環化「架橋」配列は、上記一本鎖核酸の両末端に相補的な配列であり、そのため、上記一本鎖核酸の末端同士を架橋する。これにより、上記一本鎖核酸が環化される。

【0034】

本開示のさらなる一実施形態において、上記方法はさらに、上記第１のＰＣＲ反応を実施する前に、上記第１のアダプターを標的とするプライマーと上記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施する工程を有する。上記第２のＰＣＲ反応の目的のひとつは、両末端に上記第１のアダプター配列および上記第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた上記断片化二本鎖核酸を大量に増幅することである。上記第２のプライマー対の配列は上記第１のプライマー対の配列と同じであってよいが、上記第２のプライマー対は上記第１のアフィニティマーカーを含まない。上記第２のプライマー対は上記第１のプライマー対と同じでなくてもよく、例えば、上記第２のプライマー対の５’末端に上記第１のプライマー対にない塩基が付加されていてもよい。上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有するのが典型的であるが、これに限定されない。上記サンプルタグ配列は、異なるサンプルを区別するためのランダムな配列であってよい。これにより、各サンプルの断片化核酸がそれぞれ特定のサンプルタグ配列を含有することになるため、複数のサンプルを同時に断片化工程、ライブラリ構築工程、およびこれに続くシーケンシング用混合工程で処理した後でも、異なるサンプルの配列を区別することができる。そのため、ハイスループットシーケンシングにおけるシーケンシング効率が大幅に改善される。従って、上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーがサンプルタグ配列を含有する場合に、上記第２のＰＣＲ反応のもうひとつの目的は、上記断片化二本鎖核酸断片をこのサンプルタグ配列にライゲーションさせることである。

【0035】

本開示のさらなる一実施形態において、上記方法はさらに、エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、上記エクソン配列のプローブを用いて上記第２のｐｃｒ産物から捕獲する工程を、上記第２のＰＣＲ反応の後であって上記第１のＰＣＲ反応より前に有する。この実施形態で用いるエクソン捕獲技術は、こうしたエクソン配列を取得するための既知の技術である。エクソン中および／またはエクソンとイントロンの間に存在するコンセンサス配列は保存配列であるものがあり、このコンセンサス配列に結合できる配列を上記エクソン配列のプローブとして設計することができる。このプローブを用いれば、エクソンシーケンシングで使用するための、上記エクソン配列を含有する上記一本鎖核酸を、多数のゲノムＤＮＡサンプルを断片化した後で得る種々の断片化核酸から単離することができる。上記プローブを用い、上記アフィニティマーカーと上記ストレプトアビジンマーカーを有する固体担体との組み合わせによって、上記エクソン配列を含有する断片を単離するために、本開示の特定の一実施形態において、上記エクソン配列の上記プローブはビオチン等のアフィニティマーカーを含む必要がある。

【0036】

本開示のさらなる一実施形態において、上記方法はさらに、上記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断する工程を、上記エクソン配列を含有する上記一本鎖核酸を上記エクソン配列の上記プローブを用いて上記第２のｐｃｒ産物から捕獲する前に有する。上記プライマー遮断配列は、上記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置する上記プライマー配列に特異的に結合できるため、このプライマー配列に上記エクソン配列のプローブが結合できないことになり、従って偽陽性結果が生じない。

【0037】

本開示において、上記エクソン配列を含有する上記断片を上記第２のｐｃｒ産物から捕獲するための上記固体担体および上記第１のｐｃｒ産物と結合する上記固体担体は、チップまたは磁気ビーズであってもよい。具体的に、上記チップまたは磁気ビーズは、上記第１のアフィニティマーカーと結合できる上記第２のアフィニティマーカーで被覆されている。本開示の一実施形態において、上記ストレプトアビジンマーカーで被覆された磁気ビーズが使用される。

【0038】

本開示において、上記二本鎖核酸サンプルを断片化した後、続いて行う酵素反応に上記トランスポサーゼが影響を及ぼすことを避けるため、通例、磁気ビーズ精製、カラム精製、または化学試薬処理によって、上記トランスポサーゼを反応系から除去する必要がある。従来の精製方法として、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ等を用いた磁気ビーズ精製およびＱＩＡＧＥＮＰＣＲ等から入手した精製カラム等を用いたカラム精製が挙げられ、こうした方法は当該技術分野において既知である。当然のことながら、磁気ビーズ精製およびカラム精製に類似する任意の製品を本開示において使用してもよい。この精製により反応系からトランスポサーゼを完全に除去できるが、その分の操作と費用が増える。ここで、トランスポサーゼはタンパク質であるため、化学試薬処理による変性または消化を行えば標的配列から分離することができ、こうした処理の後は生物学的活性を失うため、続いて行う反応に悪影響を及ぼすことがない。この場合、トランスポサーゼは系内に残存していてもよい。

【0039】

本開示において、上記化学試薬処理において、吸着しているトランスポサーゼと標的核酸配列とを分離するために、プロテアーゼ溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液、ＮＴバッファー（Ｓ５シリーズのＴｒｕｐｒｅｐキットに同梱されるＮＴバッファー）等をまず選択できる。次いで、上記試薬が次の酵素反応に及ぼす悪影響を緩和するため、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有する溶液を使用する。この方法を用い、従来の、手順が複雑で費用もかかる磁気ビーズ精製やカラム精製に置き換えれば、下流工程であるＰＣＲ増幅を問題なく実施できる。

【0040】

本開示において、上記固体担体により捕獲される上記ＰＣＲ産物を、熱、または水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム等のアルカリ、好ましくはアルカリによって変性させてもよい。本開示の一実施形態においては水酸化ナトリウムが使用される。

【0041】

図２は、トランスポサーゼとアダプター１つとを用いた本開示の一実施形態のエクソンライブラリ構築方法を示す簡潔なフローチャートである。上記方法は、ゲノムＤＮＡサンプルをトランスポサーゼで断片化して断片化断片を取得し、上記断片化断片を第２のＰＣＲ反応により増幅して、エクソン配列を含有する断片をエクソン捕獲技術により捕獲し、第１のＰＣＲ反応を実施して一本鎖核酸を単離し、上記一本鎖核酸を環化して一本鎖環状核酸を含むライブラリを取得する工程を有する。

【0042】

図３は、トランスポサーゼとアダプター１つとを用いた本開示の一実施形態のエクソンライブラリ構築方法を示す詳細なフローチャートである。上記方法は、ゲノムＤＮＡサンプルをトランスポサーゼ包埋複合体で断片化して、各末端に第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖ＤＮＡを取得し、上記断片化二本鎖ＤＮＡにおいて３’末端と上記第１のアダプターとの間に９ｎｔの差異が形成され、上記トランスポサーゼを除去し、第２のアダプターをライゲーションさせ、第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ増幅を実施し、上記第２のプライマー対のうち一方のプライマーがタグ配列を含有し、その結果、上記タグ配列を含有する第２の増幅産物を取得し、エクソン配列を含有する断片を、（ビオチンマーカーを含む）上記エクソン配列のプローブを用いて捕獲し、第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ増幅を実施し、上記第１のプライマー対のうち一方のプライマーがビオチンマーカーを含有し、その結果、一方の鎖に上記ビオチンマーカーを含む第１の増幅産物を取得し、上記ビオチンマーカーを含む産物をストレプトマイシン被覆磁気ビーズを用いて単離し、変性により、上記ビオチンマーカーを含まない一本鎖核酸を取得し、上記ビオチンマーカーを含まない一本鎖核酸を一本鎖環化「架橋」配列を用いて環化して、一本鎖環状核酸を含むライブラリを取得する工程を有する。

【0043】

以下に、実施形態に関連して本開示を詳細に記載する。

【0044】

本開示の実施形態において使用される試薬は以下の通りである。リガーゼはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮより購入した。トランスポサーゼ（ＰＣＲ酵素を含む）は、ＶａｚｙｍｅＢｉｏｔｅｃｈより購入したＴｒｕｅＰｒｅｐＡｄｖａｎｃｅｄＤＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅｐＫｉｔに同梱されているものを使用した。エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩはＮＥＢより購入した。

【0045】

本実施形態において、技術開発のためにトランスポサーゼキットを使用した。このキットは、ゲノムＤＮＡを５ｎｇと５０ｎｇの２通りの量で含有するが、本実施形態においては後者の量を選択した。

【0046】

１．１９ｂｐのＭｅ配列を含有するプライマー配列対（アダプターＮｏ．１の配列Ａおよび配列Ｂ）を設計して購入し、包埋するアダプターＮｏ．１を調製した。配列Ｂに含有されるジデオキシチミン（Ｔ）塩基は、アダプターの自己ライゲーションを高い効率で避けることができる。
アダプターＮｏ．１の配列Ａ：ＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号１）；
アダプターＮｏ．１の配列Ｂ：ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣｄｄＴ（配列番号２）。

【0047】

２．アダプターＮｏ．１の配列Ａおよび配列Ｂを１００μＭに希釈し、十分に混合した後で遠心分離し、次いで下記手順（表１）に従ってＰＣＲ機器内においてアニールさせることにより、アダプターＮｏ．１を得た。得たアダプターＮｏ．１を−２０℃で保管して、トランスポサーゼ包埋複合体の調製に備えた。

【表1】

【0048】

反応後、アニールした２つの群のアダプターを体積１：１の割合で混合して、トランスポサーゼ包埋複合体の調製に備えた。

【0049】

３．下記系（表２）に示す成分を上下に２０回穏やかに振って混合し、次いで３０℃で１時間インキュベートすることにより、アダプターＮｏ．１をトランスポサーゼの中に包埋した。こうして得たトランスポサーゼ包埋複合体を−２０℃で保管した。

【表2】

【0050】

４．高質のゲノムＤＮＡを５０ｎｇ、上記トランスポサーゼ包埋複合体および表３中に示す他の成分と上下に２０回穏やかに振って混合し、続いて５５℃で１０分間インキュベートした後、４℃に冷却した。こうして、ゲノムＤＮＡを断片化した。

【表3】

【0051】

５．以下の２通りの方法により精製した。
方法１：上記で得た断片化ゲノムをまず、最終濃度０．０４％〜０．１％となるようにＳＤＳと混合して均一とし、次いでＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．３倍に濃縮することにより精製した。
方法２：上記で得た断片化ゲノムをまず、等倍体積のＰＢＩ（ＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キット）を用いて混合して均一とし、次いでＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．３倍に濃縮することにより精製した。
方法３（精製せず）：上記で得た断片化ゲノムに最終濃度０．０４％〜０．１％となるようにＳＤＳを添加し、次の酵素反応において０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加した。

【0052】

６．前の工程で得た精製物を表４に示す成分と共に２５℃で６０分間インキュベートすることによって、アダプターＮｏ．２をライゲーションさせた。

【表4】

【0053】

注：アダプターＮｏ．２の配列を以下に示す。
アダプターＮｏ．２の配列Ａ：ＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣ（配列番号３）；
アダプターＮｏ．２の配列Ｂ：ＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣｄｄＴ（配列番号４、ｄｄは３’末端におけるジデオキシ修飾を表す）。

【0054】

７．以下の手順を実施した。
方法１（精製）：ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．３倍に濃縮することにより精製した。
方法２（精製せず）：次のＰＣＲ反応のために１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を補充した。

【0055】

８．０．１％〜２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、本実施形態においては好ましくは０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を下記成分（表５）と混合し、得られた混合物を表６に示す条件の下で第１のＰＣＲ増幅に供した。精製の直後に領域（タグ）捕獲のための異なるタグを含むプライマーを設計し、ＰＣＲ産物に混合した。

【表5】

【0056】

注：タグ付プライマー１〜８を以下に示す。下線を付した配列はタグ配列（ランダム配列）を表す。
タグ付プライマー１（配列番号５）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー２（配列番号６）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー３（配列番号７）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー４（配列番号８）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー５（配列番号９）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー６（配列番号１０）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー７（配列番号１１）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
タグ付プライマー８（配列番号１２）：
ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣ
プライマー２（配列番号１３）：ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ

【表6】

【0057】

上記第２のＰＣＲの後、異なるタグを含むサンプル８個を混合し、次いでＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．３倍に濃縮することにより精製した。

【0058】

９．前の工程で得たサンプル７５０ｎｇを濃縮して乾燥粉末とした。

【0059】

反応混合物１を以下工程で調製した。
（１）以下の反応溶液（表７）を調製した。

【表7】

【0060】

注：
プライマー遮断配列＃１（配列番号１４）：
５’−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴ−３’；
プライマー遮断配列＃２（配列番号１５）：
５’−ＡＡＧＴＣＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＧＡ−３’。

【0061】

遮断配列＃１および遮断配列＃２は、Ａｇｉｌｅｎｔ社から購入した、ヒトゲノムのタンデム反復の一部を遮断する際に使用されるキットに同梱されていたオリゴヌクレオチド配列（Ｏｌｉｇｏ）を使用した。

【0062】

（２）（１）で得た反応溶液を上記乾燥粉末サンプルと混合し，得られた均一な反応混合物１をＰＣＲ装置にて９５℃で５分間インキュベートし、次いで６５℃で保持した。

【0063】

（３）表８に従って反応混合物２を調製し、次いでＰＣＲ装置にて６５℃で少なくとも５分間インキュベートした。

【表8】

【0064】

（４）表９に従って反応混合物３を調製し、次いでＰＣＲ装置にて６５℃で少なくとも２分間インキュベートした。

【表9】

【0065】

注：ビオチン・ハイブリダイゼーション・プローブ（本開示の他の箇所ではエクソン配列のプローブとも称する）を使用して、エクソン配列を含有する一本鎖断片を捕獲した。

【0066】

（５）反応混合物１〜３をいずれも６５℃で保持した。反応混合物２を１３μＬ、反応混合物１に添加し、得られた均一な混合物を反応混合物３中に移し、フィルムで密閉した後、２４時間ハイブリダイゼーションさせた。

【0067】

１０．２４時間のハイブリダイゼーション後に得たサンプルをＭ２８０磁気ビーズ（すなわちストレプトマイシン被覆磁気ビーズ）を用いて溶出に供した後、Ｍ２８０磁気ビーズを分離することなく、以下の成分（表１０）を用いて表１１に示す反応条件の下で第１のＰＣＲに供した。これにより、最大量６００ｎｇまで増幅し、アダプターＮｏ．２が結合している末端にビオチンを導入して、次の一本鎖単離工程に備えた。

【表10】

【0068】

注：
ユニバーサルプライマー１：５’−ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ−３’（配列番号１６）；
ビオチンを含むプライマー２：
５’−ｂｉｏ−ＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴ−３’（配列番号１７）。

【表11】

【0069】

ＰＣＲの後、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．３倍に濃縮することにより増幅産物を精製した。

【0070】

１１．精製物６００ｎｇをＭ２８０ストレプトマイシン被覆磁気ビーズと共に１５分間インキュベートし、次いで磁気セパレータで２回洗浄し、最後に０．１ＭＮａＯＨ溶液７８μＬで変性させた。ＮａＯＨ溶液はその後再使用し、残留ＮａＯＨ溶液は０．３ＭＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、ＳＩＧＭＡ）バッファー３７．５μＬで中和した。

【0071】

１２．一本鎖核酸の環化
表１２に従って反応系を調製し、３７℃で１．５時間インキュベートした。

【表12】

【0072】

注：「架橋」配列：５’−ＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＣＧＣ−３’（配列番号１８）。

【0073】

１３．非環化一本鎖核酸の消化
表１３に従って混合物を調製して、前の工程で得た反応系を少し遠心分離したものに添加した。続いて、３７℃で３０分間インキュベートした。

【表13】

【0074】

１４．非環化一本鎖核酸を消化して得た生成物（すなわち一本鎖環状核酸）を、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いて１．８倍に濃縮することにより精製した。精製物の溶解度が十分であると確認されたら、上記精製物をシーケンシングに供することができる。この実施形態においては上記精製物を０．６５ｐｍｏｌ得た。この量は、全ゲノムシーケンシングに用いるＤＮＡナノ球体とするのに十分な量である。少量の上記精製物を電気泳動検出に供した。その結果を図４に示す。図中、レーン１からわかるように、この実施形態で得た一本鎖環状核酸は予期した通りサイズが６００〜８００ｎｔで分散したバンドであり、一本鎖環状核酸を含むライブラリを作製する条件を満たしている。

【表14】

【0075】

１５．上記ライブラリをＣＧシーケンサーでシーケンシングした。シーケンシング結果を表１５に示す。

【表15】

【0076】

図５は、塩基１個の読み深度累積値の分布を示す図である。上記結果から、本開示の上記実施形態で構築した一本鎖環状核酸を含むライブラリをシーケンシングに使用でき、望ましい結果が得られることが示される。

【0077】

上記内容は、本開示を特定の実施形態と組み合わせてさらに詳細に記載したものである。ただし、本開示の特定の実施形態は上記記載に限定されるものではない。当業者には、上記実施形態において要素の一部を単純に除外したり置き換えたりしても本開示の理念および範囲を外れないということが理解される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【手続補正書】

【提出日】2017年5月10日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

【請求項2】

【請求項3】

前記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

【請求項5】

【請求項6】

前記第１のアフィニティマーカーはビオチンマーカーであり、前記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンマーカーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記トランスポサーゼの反応系からの除去は磁気ビーズ精製、カラム精製、または化学試薬処理によって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記固体担体は磁気ビーズである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、
トランスポサーゼとトランスポサーゼ認識配列を含有する第１のアダプターとを含むトランスポサーゼ包埋複合体を用いて、二本鎖核酸サンプルをランダムに断片化することにより、各末端に前記第１のアダプターがライゲーションされた断片化二本鎖核酸を取得し、前記断片化二本鎖核酸において３’末端と前記第１のアダプターとの間には差異ができており、
反応系から前記トランスポサーゼを除去した後、前記断片化二本鎖核酸の前記差異の部分に、リガーゼを用いて第２のアダプターをライゲーションさせ、前記第２のアダプターの配列は前記第１のアダプターの配列とは異なり、
前記第１のアダプターを標的とするプライマーと前記第２のアダプターを標的とするプライマーとからなる第２のプライマー対を用いて第２のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に第１のアダプター配列および第２のアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第２のｐｃｒ産物を取得し、前記第２のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端にサンプルタグ配列を含有し、
前記第２のｐｃｒ産物の一本鎖の各末端に位置するプライマー配列を、プライマー遮断配列を用いて遮断し、
エクソン配列を含有する一本鎖核酸を、前記エクソン配列のプローブを用いて前記第２のｐｃｒ産物から捕獲し、前記プローブはビオチンマーカーを含み前記固体担体のストレプトアビジンマーカーと結合でき、
前記エクソン配列をそれぞれ含有する前記一本鎖核酸の両末端をそれぞれ標的とするプライマーからなる第１のプライマー対を用いて第１のＰＣＲ反応を実施することにより、両末端に異なるアダプター配列がそれぞれライゲーションされた第１のｐｃｒ産物を取得し、前記第１のプライマー対のうち一方のプライマーが５’末端に前記ビオチンマーカーを含み、
前記ストレプトアビジンマーカーを有する前記固体担体に前記第１のｐｃｒ産物を接触させることにより、前記ビオチンマーカーと前記ストレプトアビジンマーカーとが結合し、
前記固体担体と結合した前記第１のｐｃｒ産物を変性させることにより、前記ビオチンマーカーを含まない一本鎖核酸を単離し、
前記ビオチンマーカーを含まない前記一本鎖核酸の両末端に結合できる一本鎖環化「架橋」配列を用いて、前記ビオチンマーカーを含まない前記一本鎖核酸を環化する
工程を有する方法。

【請求項10】

【請求項11】

【請求項12】

【請求項13】

前記第１のアフィニティマーカーはビオチンマーカーであり、前記第２のアフィニティマーカーはストレプトアビジンマーカーである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の試薬。

【請求項14】

前記固体担体は磁気ビーズである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の試薬。

【手続補正書】

【提出日】2017年6月23日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表