特表 2017-527563 細胞障害性ベンゾジアゼピン誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-527563(P2017-527563A)

(43)【公表日】2017年9月21日

(54)【発明の名称】細胞障害性ベンゾジアゼピン誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07D 519/00 20060101AFI20170825BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20170825BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20170825BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20170825BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20170825BHJP

   C07K 5/00 20060101ALI20170825BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20170825BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20170825BHJP

   A61K 38/19 20060101ALN20170825BHJP

   A61K 38/22 20060101ALN20170825BHJP

【ＦＩ】

   C07D519/00 311

   C07D519/00CSP

   A61P43/00 111

   A61P37/06

   A61P19/00

   A61P31/00

   A61P31/12

   A61P25/28

   A61P1/18

   A61P13/12

   A61K45/00

   A61P35/00

   A61P29/00 101

   A61P25/00

   A61P17/00

   A61P21/00

   A61P37/04

   A61P15/00

   A61P11/00

   A61P13/08

   A61P35/02

   A61K47/68

   C07K5/00ZNA

   C07K7/06

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61K38/19

   A61K38/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】240

(21)【出願番号】特願2017-512775(P2017-512775)

(86)(22)【出願日】2015年9月2日

(85)【翻訳文提出日】2017年4月25日

(86)【国際出願番号】US2015048059

(87)【国際公開番号】WO2016036801

(87)【国際公開日】20160310

(31)【優先権主張番号】62/149,370

(32)【優先日】2015年4月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/087,040

(32)【優先日】2014年12月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/045,248

(32)【優先日】2014年9月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/164,305

(32)【優先日】2015年5月20日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】504039155

【氏名又は名称】イミュノジェン・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100128750

【弁理士】

【氏名又は名称】廣瀬 しのぶ

(72)【発明者】

【氏名】チャリ，ラビ・ヴイ・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，マイケル・ルイス

(72)【発明者】

【氏名】シズカ，マナミ

【テーマコード（参考）】

4C072

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C072MM01

4C072UU01

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC09

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC35

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA44

4C084DA01

4C084DB01

4C084DB52

4C084NA05

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA25

4C085BB50

4C085DD51

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA12

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA51

4H045CA40

4H045EA28

4H045FA34

(57)【要約】

本発明は、抗増殖性活性を有する新規のベンゾジアゼピン誘導体に関し、より詳細には、式（Ｉ）〜（ＶＩ）の新規のベンゾジアゼピン化合物に関する。本発明はまた、細胞結合剤と連結したベンゾジアゼピン化合物のコンジュゲートを提供する。本発明はさらに、本発明の化合物またはコンジュゲートを使用する、哺乳類において異常細胞増殖を阻害するまたは増殖性障害を治療するのに有用な組成物及び方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式：

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

、
または

【化6】

[この文献は図面を表示できません]

、
のいずれか１つまたはその薬学上許容される塩により表される細胞障害性化合物であって、式中、
Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、以下：
−Ｚ_１−Ｐ−Ｚ_２−Ｒ_ｘ−Ｊ（Ａ）
の式により表され、かつその他の２つは、同じであるか異なっていて、かつ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、または環状のアルキニル、アルケニル、またはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、−ＳＯ_２Ｒ’、−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’から選択され、
Ｚ_１及びＺ_２のうち一方は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、かつ他方は−ＮＲ_５−であり、
Ｐは、アミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり、
Ｒ_ｘは、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、または環状のアルキニル、アルケニル、またはアルキニルであり、
Ｊは、前記細胞障害性化合物を細胞結合剤に共有結合で連結させることができる反応性基を含む部分であり、
ＮとＣの間の二重線

【化7】

[この文献は図面を表示できません]

は、単結合または二重結合を表すが、ただし、前記二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、かつＹは、−Ｈであるか、または炭素原子を１〜４個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、前記二重線が単結合である場合、Ｘは−Ｈであるか、またはアミン保護部分であり、
Ｙは、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯＯＲ’、−ＯＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＮＲ’ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環（例えば、窒素原子を介して結合した、ピペリジン、テトラヒドロピロール、ピラゾール、モルホリンなど）、−ＮＲ’（Ｃ＝ＮＨ）ＮＲ’Ｒ’’で表されるグアニジニウム、アミノ酸、または−ＮＲＣＯＰ’で表されるペプチド、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、ハロゲン、シアノ、アジド、−ＯＳＯ_３Ｈ、亜硫酸基（−ＳＯ_３Ｈまたは−ＳＯ_２Ｈ）、メタ重亜硫酸基（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_５）、モノ、ジ、トリ、及びテトラチオリン酸基（ＰＯ_３ＳＨ_３、ＰＯ_２Ｓ_２Ｈ_２、ＰＯＳ_３Ｈ_２、ＰＳ_４Ｈ_２）、チオリン酸エステル（Ｒ^ｉＯ）_２ＰＳ（ＯＲ^ｉ）、Ｒ^ｉＳ−、Ｒ^ｉＳＯ、Ｒ^ｉＳＯ_２、Ｒ^ｉＳＯ_３、チオ硫酸基（ＨＳ_２Ｏ_３）、亜ジチオン酸基（ＨＳ_２Ｏ_４）、ホスホロジチオアート（Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ^ｋ’）（Ｓ）（ＯＨ））、ヒドロキサム酸（Ｒ^ｋ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＯＨ）、及びホルムアルデヒドスルホキシル酸基（ＨＯＣＨ_２ＳＯ_２⁻）、またはそれらの混合物から選択される脱離基であり、式中、Ｒ^ｉは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、かつ−Ｎ（Ｒ^ｊ）_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、及びＰＯ_３Ｈから選択される少なくとも１つの置換基で置換され、Ｒ^ｉは随意に、本明細書中に記載されるアルキルの置換基でさらに置換することができ、Ｒ^ｊは、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ^ｋ’は、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルであるか、アリール、ヘテロシクリル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｐ’は、１つのアミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり、
Ｒは、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、またはＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環からなる群より選択され、
Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＣＯＲ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、及びＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択される１〜６個のヘテロ原子を有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ^ｃは、−Ｈであるか、あるいは炭素原子を１〜４個有する随意に置換される直鎖または分岐鎖のアルキルであり、
ｎは、１〜２４の整数であり、
Ｘ’は、−Ｈ、アミン保護基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ならびにＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、随意に置換される６員〜１８員のアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ヘテロ原子を１〜６個有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＣＯ、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、−ＳＯ_２Ｒ’、−ＳＯ_３⁻Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’からなる群より選択され、
Ｒ_６は、−Ｈ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、またはハロゲンであり、
Ｇは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ａ及びＡ’は、同じであるか異なっていて、かつ独立して、−Ｏ−、オキソ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、−ＣＲＲ’Ｏ−、−ＣＲＲ’−、−Ｓ−、−ＣＲＲ’Ｓ−、−ＮＲ_５、及びＣＲＲ’Ｎ（Ｒ_５）−から選択され、
Ｒ_５は、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈであるか、または炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである、
前記細胞障害性化合物。

【請求項2】

以下の構造式：

【化8】

[この文献は図面を表示できません]

、
またはその薬学上許容される塩により表される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、式（Ａ）により表され、かつその他の２つは、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖アルキル、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ、または−ＮＯ_２である、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項4】

Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、式（Ａ）により表され、かつその他の２つは−Ｈである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｌ’は、式（Ａ）により表され、かつＬ’’及びＬ’’’はいずれも、−Ｈである、請求項３に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ_ｘは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑで随意に置換される炭素原子を１〜６個有する、直鎖、分岐鎖、または環状のアルキルである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｊは、ＮＨＲ^ｃ１、−ＣＯＯＨ、及びＣＯＥからなる群より選択される反応性基を含む部分であり、式中、−ＣＯＥは、反応性エステルを表し、かつＲ^ｃ１は、−Ｈであるか、またはハロゲン、−ＯＨ、もしくは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシで随意に置換される炭素原子を１〜４個有する、直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

ＣＯＥは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

前記反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項７に記載の化合物。

【請求項10】

Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ（Ｂ１）、
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ（Ｂ２）、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ（Ｃ１）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ（Ｃ２）、
により表され、式中、
Ｊは、−ＣＯＥであり、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
ｍ’は、０であるか、または１〜６の整数であり、
Ｃｙは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、もしくはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルで随意に置換される、環炭素原子を５または６個有する環状アルキルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれもＨであり、式（Ｂ２）及び（Ｃ２）のＣｙは、シクロヘキサンであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅである、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

ｍ’は、０または１である、請求項１０または１１に記載の化合物。

【請求項13】

Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ（Ｂ３）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ（Ｃ３）、
により表され、式中、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚ^ｓは、−Ｈ、−ＳＲ^ｄ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ１であるか、または、以下の式：

【化9】

[この文献は図面を表示できません]

【化10】

[この文献は図面を表示できません]

のいずれか１つから選択され、
式中、
ｑは、１〜５の整数であり、
ｎ’は、２〜６の整数であり、
Ｕは、−ＨまたはＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、
Ｒ^ｄは、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであるか、または、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジル、もしくはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択され、
Ｒ^ｄ１は、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項14】

前記荷電置換基またはイオン化可能な基Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、またはその薬学上許容される塩、あるいは、ｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻または−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンである、請求項６〜１０及び１３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項15】

Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である、請求項１４に記載の化合物。

【請求項16】

Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれも−Ｈであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅである、請求項１３に記載の化合物。

【請求項17】

−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−は、−（ＣＨ_２）_ｍ’’−Ｃ（Ｍｅ_２）−であり、ｍ’’は、１〜５の整数である、請求項１３に記載の化合物。

【請求項18】

Ｐは、２〜１０のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項19】

Ｐは、２〜５のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項１８に記載の化合物。

【請求項20】

Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、ならびにＭｅｔ−Ａｌａから選択される、請求項１９に記載の化合物。

【請求項21】

Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項２０に記載の化合物。

【請求項22】

ＮとＣの間の前記二重線

【化10-2】

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は、二重結合を表す、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項23】

ＮとＣの間の前記二重線

【化10-3】

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は、単結合を表し、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護基であり、Ｙは、−Ｈ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２Ｈ、及びＯＳＯ_３Ｈから選択される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項24】

Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、または−ＮＨＯＨから選択され、式中、Ｍは、−Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項２３に記載の化合物。

【請求項25】

Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、または−ＯＨである、請求項２４に記載の化合物。

【請求項26】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、及びフェニルからなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項27】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはフェニルである、請求項２６に記載の化合物。

【請求項28】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、または−Ｍｅである、請求項２７に記載の化合物。

【請求項29】

Ｘ’は、−Ｈである、請求項２８に記載の化合物。

【請求項30】

Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルからなる群より選択される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項31】

Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルである、請求項３０に記載の化合物。

【請求項32】

Ｙ’は、−Ｈまたはオキソである、請求項３０に記載の化合物。

【請求項33】

Ｙ’は、−Ｈである、請求項３０に記載の化合物。

【請求項34】

Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、かつ−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、及びオキソ−（Ｃ＝Ｏ）−から選択される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項35】

Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、−Ｏ−及びＳ−から選択される、請求項３４に記載の化合物。

【請求項36】

Ａ及びＡ’は−Ｏ−である、請求項３５に記載の化合物。

【請求項37】

Ｒ_６は、−ＯＭｅである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項38】

Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＮＯ_２、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３-）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項39】

Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈである、請求項３８に記載の化合物。

【請求項40】

Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ_５は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項41】

ＮとＣの間の前記二重線

【化10-4】

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は、単結合または二重結合を表すが、ただし、前記二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり、前記二重線が単結合である場合には、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＯＨまたは−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈであり、
Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、
Ｘ’及びＹ’は、いずれも−Ｈであり、
Ａ及びＡ’は−Ｏ−であり、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項42】

以下の式：

【化11】

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【化12】

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【化13】

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【化14】

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【化15】

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【化16】

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【化17】

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【化18】

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【化19】

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【化20】

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【化21】

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【化22】

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【化23】

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【化24】

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【化25】

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【化26】

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のいずれか１つまたはその薬学上許容される塩から選択され、式中、
Ｒ_１００は、−ＯＨ、−ＯＭｅ、または

【化27】

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であり、
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、
Ｚ^ｓは、−Ｈ、−ＳＲ^ｄ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ１であるか、または以下の式：

【化28】

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【化29】

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のいずれか１つから選択され、式中、
ｑは、１〜５の整数であり、
ｎ’は、２〜６の整数であり、
Ｕは、−ＨまたはＳＯ_３Ｍであり、
Ｒ^ｄは、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであるか、またはフェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジル、及びニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択され、
Ｒ^ｄ１は、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルである、請求項１に記載の化合物。

【請求項43】

Ｙは、−ＳＯ_３Ｍである、請求項４２に記載の化合物。

【請求項44】

細胞障害性化合物及び細胞結合剤（ＣＢＡ）を含むコンジュゲートであって、前記細胞障害性化合物は、前記ＣＢＡに共有結合で連結しており、かつ前記細胞障害性化合物は、以下の式：

【化30】

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【化31】

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【化32】

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【化33】

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【化34】

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または

【化35】

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のいずれか１つ、またはその薬学上許容される塩により表され、式中、
Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、以下の式：
−Ｚ_１−Ｐ−Ｚ_２−Ｒ_ｘ−Ｊ’（Ａ’）
により表され、その他の２つは、同じであるか異なっていて、かつ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’で表されるスルホキシド、−ＳＯ_２Ｒ’スルホン酸基−ＳＯ_３Ｍ、硫酸基−ＯＳＯ_３Ｍ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’で表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’から選択され、
Ｚ_１及びＺ_２のうち一方は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、他方は−ＮＲ_５−であり、
Ｐは、１つのアミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり、
Ｒ_ｘは、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルであり、
Ｊ’は、前記細胞結合剤に共有結合で連結している連結基を含む部分であり、
ＮとＣの間の前記二重線

【化35-2】

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は、単結合または二重結合を表すが、ただし、前記二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、Ｙは、−Ｈ、または炭素原子を１〜４個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、前記二重線が単結合である場合、Ｘは−Ｈであるかアミン保護部分であり、
Ｙは、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯＯＲ’、−ＯＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＮＲ’ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環（例えば、ピペリジン、テトラヒドロピロール、ピラゾール、モルホリンなど）、−ＮＲ’（Ｃ＝ＮＨ）ＮＲ’Ｒ’’で表されるグアニジニウム、アミノ酸残基、または−ＮＲＣＯＰ’で表されるペプチド、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、ハロゲン、シアノ、アジド、−ＯＳＯ_３Ｈ、亜硫酸基（−ＳＯ_３Ｈまたは−ＳＯ_２Ｈ）、メタ重亜硫酸基（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_５）、モノ、ジ、トリ、及びテトラチオリン酸基（ＰＯ_３ＳＨ_３、ＰＯ_２Ｓ_２Ｈ_２、ＰＯＳ_３Ｈ_２、ＰＳ_４Ｈ_２）、チオリン酸エステル（Ｒ^ｉＯ）_２ＰＳ（ＯＲ^ｉ）、Ｒ^ｉＳ−、Ｒ^ｉＳＯ、Ｒ^ｉＳＯ_２、Ｒ^ｉＳＯ_３、チオ硫酸基（ＨＳ_２Ｏ_３）、亜ジチオン酸基（ＨＳ_２Ｏ_４）、ホスホロジチオアート（Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ^ｋ’）（Ｓ）（ＯＨ））、ヒドロキサム酸（Ｒ^ｋ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＯＨ）、及びホルムアルデヒドスルホキシル酸基（ＨＯＣＨ_２ＳＯ_２−）、あるいはそれらの混合物から選択される脱離基であり、式中、Ｒ^ｉは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、かつ−Ｎ（Ｒ^ｊ）_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、及びＰＯ_３Ｈから選択される少なくとも１つの置換基で置換され、Ｒ^ｉは随意に、本明細書中に記載されるアルキルの置換基でさらに置換することができ、Ｒ^ｊは、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ^ｋ’は、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルであるか、アリール、ヘテロシクリル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｐ’は、アミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり、
Ｒは、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個もしくは複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、またはＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環からなる群より選択され、
Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＣＯＲ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ならびにＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択される１〜６個のヘテロ原子を有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ^ｃは、−Ｈであるか、あるいは炭素原子を１〜４個有する置換もしくは未置換の直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、
ｎは、１〜２４の整数であり、
Ｘ’は、−Ｈ、アミン保護基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ならびにＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、随意に置換される６員〜１８員のアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ヘテロ原子を１〜６個有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＣＯ、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’で表されるスルホキシド、−ＳＯ_２Ｒ’で表されるスルホン、−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’からなる群より選択され、
Ｒ_６は、−Ｈ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、またはハロゲンであり、
Ｇは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ａ及びＡ’は、同じであるか異なっていて、かつ独立して、−Ｏ−、オキソ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、−ＣＲＲ’Ｏ−、−ＣＲＲ’−、−Ｓ−、−ＣＲＲ’Ｓ−、−ＮＲ_５、及びＣＲＲ’Ｎ（Ｒ_５）−から選択され、
Ｒ_５は、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈであるか、または炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖または分岐鎖のアルキルである、前記コンジュゲート。

【請求項45】

前記化合物は、以下の構造式：

【化36】

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またはその薬学上許容される塩で表される、請求項４４のコンジュゲート。

【請求項46】

Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、式（Ａ’）により表され、その他は、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖アルキル、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ、または−ＮＯ_２である、請求項４４〜４５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項47】

Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、式（Ａ’）により表され、その他は、−Ｈである、請求項４４〜４６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項48】

Ｌ’は、式（Ａ’）により表され、Ｌ’’及びＬ’’’は、いずれも−Ｈである、請求項４７に記載のコンジュゲート。

【請求項49】

Ｒ_ｘは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＯ_３Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑで随意に置換される、炭素原子を１〜６個有する直鎖、分岐鎖、または環状のアルキルである、請求項４４〜４８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項50】

Ｊ’は、前記ＣＢＡに共有結合で連結している部分を含み、かつ−ＮＲ^ｃ１または−Ｃ（＝Ｏ）−であり、式中、Ｒ^ｃ１は、−Ｈであるか、またはハロゲン、−ＯＨ、もしくは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシで随意に置換される、炭素原子を１〜４個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルである、請求項４４〜４９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項51】

Ｊ’は、−Ｃ（＝Ｏ）−である、請求項５２に記載のコンジュゲート。

【請求項52】

Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ’（Ｂ１’）、
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ’（Ｂ２’）、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ’（Ｃ１’）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ’（Ｃ２’）
により表され、式中、
Ｊ’は、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
ｍ’は、０であるか、または１〜６の整数であり、
Ｃｙは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、もしくはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルで随意に置換される、環炭素原子を５または６個有する環状アルキルである、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項53】

Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれもＨであり、式（Ｂ２’）及び（Ｃ２’）のＣｙは、シクロヘキサンであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅである、請求項５２に記載のコンジュゲート。

【請求項54】

ｍ’は、０または１である、請求項５２または５３に記載のコンジュゲート。

【請求項55】

Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ１（Ｂ３’）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ１（Ｃ３’）、
により表され、式中、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚ^ｓは、以下の式：

【化37】

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のいずれか１つから選択され、式中、
ｑは、１〜５の整数であり、
ｎ’は、２〜６の整数であり、
Ｕは、−ＨまたはＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項56】

前記荷電置換基またはイオン化可能な基Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、またはその薬学上許容される塩であるか、あるいは、ｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻もしくは−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンである、請求項４９〜５２及び５５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項57】

Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である、請求項５６に記載のコンジュゲート。

【請求項58】

Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれも−Ｈであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅである、請求項５５に記載のコンジュゲート。

【請求項59】

−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−は、−（ＣＨ_２）_ｍ’’−Ｃ（Ｍｅ_２）−であり、ｍ’’は、１〜５の整数である、請求項５５に記載のコンジュゲート。

【請求項60】

Ｐは、２〜１０のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項４４〜５９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項61】

Ｐは、２〜５のアミノ酸残基を含有するペプチドである、請求項６０に記載のコンジュゲート。

【請求項62】

Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、及びＭｅｔ−Ａｌａから選択される、請求項６０に記載のコンジュゲート。

【請求項63】

Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａである、請求項６２に記載のコンジュゲート。

【請求項64】

ＮとＣの間の前記二重線

【化37-2】

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は、二重結合を表す、請求項４４〜６３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項65】

ＮとＣの間の前記二重線

【化37-3】

[この文献は図面を表示できません]

は、単結合を表し、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護基であり、Ｙは、−Ｈ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２Ｈ、及びＯＳＯ_３Ｈから選択される、請求項４４〜６３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項66】

Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、または−ＮＨＯＨから選択され、式中、Ｍは、−Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項６５に記載のコンジュゲート。

【請求項67】

Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、または−ＯＨである、請求項６６に記載のコンジュゲート。

【請求項68】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、及びフェニルからなる群より選択される、請求項４４〜６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項69】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはフェニルである、請求項６８に記載のコンジュゲート。

【請求項70】

Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、または−Ｍｅである、請求項６９に記載のコンジュゲート。

【請求項71】

Ｘ’は、−Ｈである、請求項７０に記載のコンジュゲート。

【請求項72】

Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルからなる群より選択される、請求項４４〜７１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項73】

Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルである、請求項７２に記載のコンジュゲート。

【請求項74】

Ｙ’は、−Ｈまたはオキソである、請求項７２に記載のコンジュゲート。

【請求項75】

Ｙ’は、−Ｈである、請求項７２に記載のコンジュゲート。

【請求項76】

Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、かつ−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、及びオキソ−（Ｃ＝Ｏ）−から選択される、請求項４４〜７５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項77】

Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、かつ−Ｏ−及びＳ−から選択される、請求項７６に記載のコンジュゲート。

【請求項78】

Ａ及びＡ’は、−Ｏ−である、請求項７７に記載のコンジュゲート。

【請求項79】

Ｒ_６は、−ＯＭｅである、請求項４４〜７８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項80】

Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＮＯ_２、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３-）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシである、請求項４４〜７９のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項81】

Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈである、請求項８０に記載のコンジュゲート。

【請求項82】

Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ_５は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルである、請求項４４〜８１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項83】

ＮとＣの間の前記二重線

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は、単結合または二重結合を表すが、ただし、前記二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであり、前記二重線が単結合である場合には、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＯＨまたは−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈであり、
Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、
Ｘ’及びＹ’は、いずれも−Ｈであり、
Ａ及びＡ’は−Ｏ−であり、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項４４〜６３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項84】

前記化合物は、以下の式：

【化38】

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【化39】

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【化40】

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【化41】

[この文献は図面を表示できません]

【化42】

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【化43】

[この文献は図面を表示できません]

【化44】

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【化45】

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【化46】

[この文献は図面を表示できません]

【化47】

[この文献は図面を表示できません]

【化48】

[この文献は図面を表示できません]

【化49】

[この文献は図面を表示できません]

【化50】

[この文献は図面を表示できません]

【化51】

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【化52】

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【化53】

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【化54】

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【化55】

[この文献は図面を表示できません]

【化56】

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【化57】

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【化58】

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【化59】

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【化60】

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【化61】

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【化62】

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【化63】

[この文献は図面を表示できません]

【化64】

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【化65】

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【化66】

[この文献は図面を表示できません]

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

のいずれか１つまたはその薬学上許容される塩から選択され、式中、
ｒは、１〜１０の整数であり、
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋である、請求項４４に記載のコンジュゲート。

【請求項85】

Ｙは、−ＳＯ_３Ｍである、請求項８４に記載のコンジュゲート。

【請求項86】

前記細胞結合剤（ＣＢＡ）は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫性細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはメラニン細胞、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇ、ＣＡＬＬＡ、もしくはＨｅｒ−２抗原、Ｈｅｒ−３抗原を発現する細胞、またはインシュリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、及び葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞に結合する、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項87】

前記細胞結合剤は、抗体、一本鎖抗体、前記標的細胞と特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、もしくは標的細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、前記標的細胞と特異的に結合するキメラ抗体断片、ドメイン抗体、前記標的細胞と特異的に結合するドメイン抗体断片、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項88】

前記細胞結合剤は、抗葉酸受容体抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項89】

前記細胞結合剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項90】

前記細胞結合剤は、抗ＣＤ３３抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項91】

前記細胞結合剤は、抗ＣＤ１９抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項92】

前記細胞結合剤は、抗Ｍｕｃ１抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項93】

前記細胞結合剤は、抗ＣＤ３７抗体またはその抗体断片である、請求項４４〜８５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項94】

前記抗体は、表面再構成抗体、表面再構成一本鎖抗体、または表面再構成抗体断片である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項95】

前記抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、またはそのモノクローナル抗体断片である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項96】

前記抗体は、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、またはヒト化抗体断片である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。

【請求項97】

前記抗葉酸受容体抗体は、ｈｕＭＯＶ１９抗体である、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項98】

前記抗葉酸受容体抗体は、
ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３、ならびに
ｂ）配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項99】

前記抗葉酸受容体抗体は、
ａ）配列番号１１と少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び
ｂ）配列番号１２または配列番号１３と少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項100】

前記抗葉酸受容体抗体は、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
ｂ）配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項101】

前記抗葉酸受容体抗体は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖、及び
ｂ）配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項102】

前記抗葉酸受容体抗体は、
ａ）配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖、及び
ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項103】

前記抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＭＬ６６抗体である、請求項８９に記載のコンジュゲート。

【請求項104】

前記抗ＥＧＦＲ抗体は、
ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖、及び
ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖
を含む、請求項８９に記載のコンジュゲート。

【請求項105】

前記抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒである、請求項８９に記載のコンジュゲート。

【請求項106】

前記抗ＥＧＦＲ抗体は、
ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖；及び
ｂ）配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖
を含む、請求項８９に記載のコンジュゲート。

【請求項107】

前記抗ＣＤ３３抗体は、ｈｕＭｙ９−６抗体である、請求項９０に記載のコンジュゲート。

【請求項108】

前記抗ＣＤ３３抗体は、
ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、及び
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項９０に記載のコンジュゲート。

【請求項109】

前記抗ＣＤ１９抗体は、ｈｕＢ４抗体である、請求項９１に記載のコンジュゲート。

【請求項110】

前記抗ＣＤ１９抗体は、
ａ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、及び
ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項９１に記載のコンジュゲート。

【請求項111】

前記抗Ｍｕｃ１抗体は、ｈｕＤＳ６抗体である、請求項９２に記載のコンジュゲート。

【請求項112】

前記抗Ｍｕｃ１抗体は、
ａ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、及び
ｂ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項９２に記載のコンジュゲート。

【請求項113】

前記抗ＣＤ３７抗体は、ｈｕＣＤ３７−３抗体である、請求項９３に記載のコンジュゲート。

【請求項114】

前記抗ＣＤ３７抗体は、
ａ）配列番号２６または配列番号２７のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、及び
ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項９３に記載のコンジュゲート。

【請求項115】

前記抗ＣＤ３７抗体は、ｈｕＣＤ３７−５０抗体である、請求項９３に記載のコンジュゲート。

【請求項116】

前記抗ＣＤ３７抗体は、
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖、及び
ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項９３に記載のコンジュゲート。

【請求項117】

請求項４４〜１１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート及び薬学上許容されるキャリアを含む、医薬組成物。

【請求項118】

哺乳類における、異常細胞増殖の阻害方法または増殖性障害、自己免疫障害、破壊性骨障害、感染症、ウイルス性疾患、線維性疾患、神経変性疾患、膵炎、もしくは腎疾患の治療方法であって、前記哺乳類に、治療有効量の、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の化合物もしくは請求項４４〜１１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート治療有効量、及び任意選択で化学療法薬を投与することを含む、前記方法。

【請求項119】

癌、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、狼瘡、筋炎、感染症、及び免疫不全からなる群より選択される症状を治療するためのものである、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記方法は、癌を治療するためのものである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記癌は、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、黒色腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、乳癌、頭頸部の扁平上皮癌、前立腺癌、子宮内膜癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、腹膜癌、または白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性単球性白血病、前骨髄球性白血病、好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（例えば、Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））である、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１２０に記載の方法。

【請求項123】

前記癌は、非小細胞肺癌である、請求項１２０に記載の方法。

【請求項124】

前記癌は、卵巣癌である、請求項１２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１４年９月３日出願の米国仮出願第６２／０４５，２４８号、２０１４年１２月３日出願の米国仮出願第６２／０８７，０４０号、２０１５年４月１７日出願の米国仮出願第６２／１４９，３７０号、及び２０１５年５月２０日出願の米国仮出願第６２／１６４，３０５号の出願日の利益を主張する。これらの出願の全内容はそれぞれ、全ての図面、式、明細書、及び請求項を含めて、本明細書中に参照により援用される。

【0002】

本発明は、新規の細胞障害性化合物、ならびにこれら細胞障害性化合物及び細胞結合剤を含む細胞障害性コンジュゲートに関連する。より詳細には、本発明は、医薬、特に抗増殖剤として有用な、新規のベンゾジアゼピン化合物、それらの誘導体、それらの中間体、それらのコンジュゲート、及びそれらの薬学上許容される塩に関する。

【背景技術】

【0003】

ベンゾジアゼピン誘導体は、様々な障害の治療に有用な化合物であり、抗てんかん薬（イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３，５］ベンゾチアジアゼピン、米国特許第４，４４４，６８８号、米国特許第４，０６２，８５２号）、抗菌薬（ピリミド［１，２−ｃ］［１，３，５］ベンゾチアジアゼピン、ＧＢ１４７６６８４）、利尿薬及び降圧薬（ピロロ（１，２−ｂ）［１，２，５］ベンゾチアジアゼピン５，５ジオキシド、米国特許第３，５０６，６４６号）、脂質低下薬（ＷＯ０３０９１２３２）、抗うつ薬（米国特許第３，４５３，２６６号）、骨粗鬆症薬（ＪＰ２１３８２７２）などの医薬を含む。

【0004】

ベンゾジアゼピン誘導体、例えば、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、（Ｎ−２−イミダゾリルアルキル置換１，２，５−ベンゾチアジアゼピン−１，１−ジオキシド、米国特許第６，１５６，７４６号）、ベンゾピリドまたはジピリドチアジアゼピン（ＷＯ２００４／０６９８４３）、ピロロ［１，２−ｂ］［１，２，５］ベンゾチアジアゼピン及びピロロ［１，２−ｂ］［１，２，５］ベンゾジアゼピン誘導体（ＷＯ２００７／０１５２８０）、トマイマイシン誘導体（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン）、例えばＷＯ００／１２５０８、ＷＯ２００５／０８５２６０、ＷＯ２００７／０８５９３０、及びＥＰ２０１９１０４に記載されるものなどは抗腫瘍剤として作用することが、動物腫瘍モデルで示されている。ベンゾジアゼピンはまた、細胞増殖及び分化に影響することが既知である（Ｋａｍａｌ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８ Ａｕｇ １５；１６（１６）：７８０４−１０（及びその中で引用される参照文献）；Ｋｕｍａｒ Ｒ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊｕｎ；３（４）：３２３−３９（及びその中で引用される参照文献）；Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ Ｊ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｓｕｔｔｅｒ Ａ．Ｐ，ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｂｌａｔｔ Ｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，２００２），Ｋａｍａｌ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２；２；２１５−２５４，Ｗａｎｇ Ｊ−Ｊ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２２０６；４９：１４４２−１４４９，Ａｌｌｅｙ Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；６４：６７００−６７０６，Ｐｅｐｐｅｒ Ｃ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；７４：６７５０−６７５５，Ｔｈｕｒｓｔｏｎ Ｄ．Ｅ．ａｎｄ Ｂｏｓｅ Ｄ．Ｓ．，Ｃｈｅｍ Ｒｅｖ １９９４；９４：４３３−４６５、及びＴｏｚｕｋａ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，（１９８３）３６；１６９９−１７０８。ＰＢＤの一般構造は、米国公開番号第２００７００７２８４６号に記載されている。ＰＢＤは、それらの芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方における置換基の個数、種類、及び位置、ならびにＣ環の飽和度が様々である。ＰＢＤは、副溝で付加物を形成しＤＮＡを架橋することができるため、ＤＮＡプロセシングに干渉することが可能であり、したがって、抗増殖剤として使用される場合がある。

【0005】

臨床試験に入った最初のピロロベンゾジアゼピンであるＳＪＧ−１３６（ＮＳＣ６９４５０１）は、ＤＮＡ鎖間架橋を引き起こす強力な細胞障害性剤である（Ｓ．Ｇ Ｇｒｅｇｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４４：７３７−７４８；Ｍ．Ｃ．Ａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：６７００−６７０６；Ｊ．Ａ．Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：６６９３−６６９９；Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，４４：４１３５−４１４７；Ｓ．Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，５：１６０２−１５０９）。ＳＪＧ−１３６の第Ｉ相臨床評価の結果から、この薬物は、極めて低用量で毒性があることが明らかになった（最大耐量４５μｇ／ｍ^２、血管漏出症候群、末梢性浮腫、肝臓毒性、及び疲労をはじめとする複数の副作用が認められた）。全ての用量で、循環リンパ球におけるＤＮＡ損傷が認められた（Ｄ．Ｈｏｃｈｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１５：２１４０−２１４７）。したがって、毒性がより低く、さらに様々な増殖性疾患の状態、例えば癌の治療になお治療効果のある改善されたベンゾジアゼピン誘導体が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書中に記載される新規のベンゾジアゼピン化合物及びそれらのコンジュゲートは、様々な腫瘍細胞に対して驚くほど高い効力を有する。
本発明の１つの目的は、以下の式：

【0007】

【化1】

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【0008】

【化2】

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【0009】

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

【0010】

【化4】

[この文献は図面を表示できません]

【0011】

【化5】

[この文献は図面を表示できません]

【0012】

または

【0013】

【化6】

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【0014】

（式中、
Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、以下の式：
−Ｚ_１−Ｐ−Ｚ_２−Ｒ_ｘ−Ｊ（Ａ）
により表され、その他の２つは、同じであるか異なっていて、独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、−ＳＯ_２Ｒ’、−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’から選択され、
Ｚ_１及びＺ_２のうち一方は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、他方は−ＮＲ_５−であり、
Ｐは、アミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり；
Ｒ_ｘは、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルであり、
Ｊは、細胞障害性化合物を細胞結合剤に共有結合で連結させることができる反応性基を含む部分であり、
ＮとＣの間の二重線

【0015】

【化7】

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【0016】

は、単結合または二重結合を表すが、ただし、二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、Ｙは−Ｈであるか、または炭素原子を１〜４個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、二重線が単結合である場合、Ｘは−Ｈであるかアミン保護部分であり、
Ｙは、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＯＣＯＯＲ’、−ＯＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＮＲ’ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環（例えば、窒素原子を介して結合した、ピペリジン、テトラヒドロピロール、ピラゾール、モルホリンなど）、−ＮＲ’（Ｃ＝ＮＨ）ＮＲ’Ｒ’’で表されるグアニジニウム、アミノ酸残基、もしくは−ＮＲＣＯＰ’で表されるペプチド、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、ハロゲン、シアノ、アジド、−ＯＳＯ_３Ｈ、亜硫酸基（−ＳＯ_３Ｈまたは−ＳＯ_２Ｈ）、メタ重亜硫酸基（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_５）、モノ、ジ、トリ、及びテトラチオリン酸基（ＰＯ_３ＳＨ_３、ＰＯ_２Ｓ_２Ｈ_２、ＰＯＳ_３Ｈ_２、ＰＳ_４Ｈ_２）、チオリン酸エステル（Ｒ^ｉＯ）_２ＰＳ（ＯＲ^ｉ）、Ｒ^ｉＳ−、Ｒ^ｉＳＯ、Ｒ^ｉＳＯ_２、Ｒ^ｉＳＯ_３、チオ硫酸基（ＨＳ_２Ｏ_３）、亜ジチオン酸基（ＨＳ_２Ｏ_４）、ホスホロジチオアート（Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ^ｋ’）（Ｓ）（ＯＨ））、ヒドロキサム酸（Ｒ^ｋ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＯＨ）、及びホルムアルデヒドスルホキシル酸基（ＨＯＣＨ_２ＳＯ_２−）、またはそれらの混合物から選択される脱離基であり、式中、Ｒ^ｉは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、かつ−Ｎ（Ｒ^ｊ）_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、及びＰＯ_３Ｈから選択される少なくとも１つの置換基で置換され、Ｒ^ｉは随意に、本明細書中に記載されるアルキルの置換基でさらに置換することができ、Ｒ^ｊは、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ^ｋ’は、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくアルキニルか、アリール、ヘテロシクリル、もしくはヘテロアリールであり、
Ｐ’は、１つのアミノ酸残基であるか、アミノ酸残基を２〜２０含有するペプチドであり、
Ｒは、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、またはＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環からなる群より選択され、
Ｒ’及びＲ’’は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＣＯＲ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、及びＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択される１〜６個のヘテロ原子を有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ^ｃは、−Ｈであるか、炭素原子を１〜４個有する随意に置換される直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、
ｎは、１〜２４の整数であり、
Ｘ’は、−Ｈ、アミン保護基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、炭素原子を６〜１８個有する随意に置換されるアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ならびにＯ、Ｓ、Ｎ、及びＰから独立して選択されるヘテロ原子を１〜６個含有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、随意に置換される６員〜１８員のアリール、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する随意に置換される５員〜１８員のヘテロアリール環、ヘテロ原子を１〜６個有する随意に置換される３員〜１８員の複素環から選択され、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＣＯ、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’、−ＳＯ_２Ｒ’、−ＳＯ_３⁻Ｈ、−ＯＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’からなる群より選択され、
Ｒ_６は、−Ｈ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、またはハロゲンであり、
Ｇは、−ＣＨ−または−Ｎ−であり、
Ａ及びＡ’は、同じであるか異なっていて、かつ独立して、−Ｏ−、オキソ（−Ｃ（＝Ｏ）−）、−ＣＲＲ’Ｏ−、−ＣＲＲ’−、−Ｓ−、−ＣＲＲ’Ｓ−、−ＮＲ_５、及びＣＲＲ’Ｎ（Ｒ_５）−から選択され、
Ｒ_５は、存在する場合それぞれ、独立して、−Ｈであるか、あるいは炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖または分岐鎖のアルキルである）のいずれか１つ、またはその薬学上許容される塩により表される細胞障害性化合物を提供することである。

【0017】

１つの実施形態において、構造式（Ｉ）〜（ＶＩ）の化合物では、Ｇは、−ＣＨ−である。
本発明の第２の目的は、細胞結合剤と、本発明の新規のベンゾジアゼピン化合物またはそれらの誘導体とのコンジュゲートを提供することである。これらのコンジュゲートは、標的細胞に特異的に送達されかつ細胞障害性であり、治療薬として有用である。

【0018】

具体的には、本発明のコンジュゲートは、細胞障害性化合物及び細胞結合剤（ＣＢＡ）を含む場合があり、該細胞障害性化合物は、ＣＢＡに共有結合で連結しており、以下の式：

【0019】

【化8】

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【0020】

【化9】

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【0021】

【化10】

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【0022】

【化11】

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【0023】

【化12】

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【0024】

または

【0025】

【化13】

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【0026】

のいずれか１つ、またはその薬学上許容される塩により表され、式中、
Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうちの１つは、以下の式：
−Ｚ_１−Ｐ−Ｚ_２−Ｒ_ｘ−Ｊ’（Ａ’）
により表され、その他の２つは、同じであるか異なっていて、独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^ｃ、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＯ_２、−ＮＲ’ＣＯＲ’’、−ＳＲ、−ＳＯＲ’で表されるスルホキシド、−ＳＯ_２Ｒ’で表されるスルホン、スルホン酸基−ＳＯ_３Ｍ、硫酸基−ＯＳＯ_３Ｍ、−ＳＯ_２ＮＲ’Ｒ’’で表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ’、−ＯＣＯＲ’、及びＯＣＯＮＲ’Ｒ’’から選択され、
Ｊ’は、細胞結合剤に共有結合で連結している連結基を含む部分であり、
残りの可変要素は、式（Ｉ）〜（ＶＩ）について上述のとおりである。

【0027】

１つの実施形態において、構造式（Ｉ’）〜（ＶＩ’）のコンジュゲートでは、Ｇは、−ＣＨ−である。
別の実施形態において、構造式（Ｉ’）〜（ＶＩ’）のコンジュゲートでは、細胞結合剤は、抗葉酸受容体抗体またはその抗体断片である。より詳細には、抗葉酸受容体抗体は、ｈｕＭＯＶ１９抗体である。

【0028】

さらに別の実施形態において、構造式（Ｉ’）〜（ＶＩ’）のコンジュゲートでは、細胞結合剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗体断片である。１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１２０５８５９２に記載される抗体をはじめとする非アンタゴニスト抗体であり、ＷＯ２０１２０５８５９２は、本明細書中で参照により援用される。別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、非機能性抗体、例えば、ヒト化ＭＬ６６である。より詳細には、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＭＬ６６である。

【0029】

本発明は、新規のベンゾジアゼピン化合物、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、（ならびに／またはそれらの溶媒和物、水和物、及び／もしくは塩）、ならびにキャリア（薬学上許容されるキャリア）を含む組成物（例えば、医薬組成物）も含む。本発明はさらに、新規のベンゾジアゼピン化合物、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、（ならびに／またはそれらの溶媒和物、水和物、及び／もしくは塩）、ならびにキャリア（薬学上許容されるキャリア）を含み、さらに第２の治療薬を含む組成物（例えば、医薬組成物）も含む。本組成物は、哺乳類（例えば、ヒト）において、異常細胞増殖を阻害する、または増殖性障害を治療するのに有用である。本組成物は、哺乳類（例えば、ヒト）において、癌、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、狼瘡、筋炎、感染症、ＡＩＤＳなどの免疫不全、及び炎症性疾患などの疾患を治療するのに有用である。

【0030】

本発明は、哺乳類（例えば、ヒト）において異常細胞増殖を阻害するまたは増殖性障害を治療する方法を含み、本方法は、該哺乳類に、治療有効量の新規のベンゾジアゼピン化合物、それらの誘導体、もしくはそれらのコンジュゲート、（ならびに／またはそれらの溶媒和物及び塩）、またはそれらを含む組成物を、単独でまたは第２の治療薬と併用して、投与することを含む。

【0031】

本発明は、哺乳類細胞、生物、または関連する病態のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、及びｉｎ ｖｉｖｏ診断または治療のため、新規のベンゾジアゼピン化合物、それらの誘導体、及びそれらのコンジュゲートを合成及び使用する方法を含む。

【0032】

本発明の化合物、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、及びそれらを含む組成物は、障害、例えば細胞の異常増殖を特徴とするもの（例えば、癌）を治療するまたはその重篤度を低下させるのに有用である。本発明の化合物及びコンジュゲートの他の用途として、哺乳類（例えば、ヒト）における癌、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、狼瘡、筋炎、感染症、ＡＩＤＳなどの免疫不全、及び炎症性疾患などの疾患の治療が挙げられるが、これらに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】コンジュゲートされていない抗体ｈｕＭＯＶ１９と比較した、Ｔ４７Ｄ細胞に対するｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲートの結合親和性を示す。

【図2】ｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図3】ｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲートが、隣接する抗原陰性細胞に対して弱いバイスタンダー細胞障害性効果を発揮することを示す。

【図4A】様々な細胞株に対するｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性を示す。

【図4B】様々な細胞株に対するｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性を示す。

【図4C】様々な細胞株に対するｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性を示す。

【図5A】ｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートが、隣接する抗原陰性細胞に対してバイスタンダー細胞障害性効果を発揮することを示す。

【図5B】ｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートが、隣接する抗原陰性細胞に対してバイスタンダー細胞障害性効果を発揮することを示す。

【図6】ＮＣＩ−Ｈ２１１０を有するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−８０コンジュゲート及びｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図7A】本発明の代表的なコンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図7B】本発明の代表的なコンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図7C】本発明の代表的なコンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図7D】本発明の代表的なコンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図8】ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図9】ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図10】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図11】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図12】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図13】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートが、隣接する抗原陰性細胞に対して強いバイスタンダー細胞障害性効果を発揮することを示す。

【図14】ＮＣＩ−Ｈ２１１０を有するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図15A】コンジュゲートされていない抗体ｈｕＭＯＶ１９と比較した、Ｔ４７Ｄ細胞に対するｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートの結合親和性を示す。

【図15B】コンジュゲートされていない抗体ｈｕＭＯＶ１９と比較した、Ｔ４７Ｄ細胞に対するｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートの結合親和性を示す。

【図16】本発明の代表的なコンジュゲートの質量分析特性を示す。

【図17】ＮＣＩ−Ｈ１７０３ＮＳＣＬＣを有するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図18】ＣＤ−１マウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−９０の薬物動態を示す。

【図19】図１９Ａならびに１９Ｂは、ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートの構造（図１９Ａ）、ならびにＫＢ子宮頸癌細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されたｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートの代謝産物のインキュベーション、精製、及び単離のスキーム（図１９Ｂ）を示す。ＬＣ−ＭＳで同定された３種の代謝産物を、質量計算値とともに示す。

【図20】コンジュゲートされていない抗体ｈｕＭＯＶ１９と比較した、Ｔ４７Ｄ細胞に対するｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートの結合親和性を示す。

【図21A】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲート及びｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図21B】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲート及びｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図21C】ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲート及びｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性及び特異性を示す。

【図22】ＮＣＩ−Ｈ２１１０ＮＳＣＬＣ異種移植片を有する保有ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図23】Ｈｅｃ−１ｂ子宮内膜異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図24】Ｉｓｈｉｋａｗａ子宮内膜異種移植片を有するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図25】ＮＣＩ−Ｈ２１１０ＮＳＣＬＣ異種移植片を有する保有ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

【図26】未結合抗体と比較した、ＨＮＴ−３４細胞に対するｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７Ｓ３−９０コンジュゲートの結合親和性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0034】

次に、本発明のある特定の実施形態について詳細に説明を行い、それらの例を付随する構造及び式で例示する。本発明は、列挙される実施形態を参照しながら説明されるが、それらは本発明を限定することを意図するものではないことが理解されよう。むしろ、本発明は、特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれる場合がある全ての代替形態、修飾形態、及び等価形態を包含するものとする。当業者は、本発明の実施に使用可能な、本明細書中に記載される方法及び材料に類似するまたは相当する方法及び材料が多数あることを理解するであろう。

【0035】

本発明の異なる態様（例えば、化合物、化合物リンカー分子、コンジュゲート、組成物、作製法、及び使用法）及び本明細書の異なる部分（実施例においてのみ記載される実施形態を含む）の下で説明されるものを含む、本明細書中で説明される実施形態のいずれも、明白に否定されるかまたは不適切ものでない限り、本発明の１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることができる。実施形態の組み合わせは、多項従属請求項をよって特許請求される特定の組み合わせに限定されない。
定義
本明細書中で使用される場合、「細胞結合剤」または「ＣＢＡ」という用語は、細胞（例えば、細胞表面リガンドで）を、または細胞に付随するもしくは近接するリガンドを、好ましくは特定の様式で結合させることができる化合物を指す。ある特定の実施形態において、細胞とのまたは細胞上もしくは細胞近くのリガンドとの結合は特異的である。ＣＢＡは、ペプチド及び非ペプチドを含む場合がある。

【0036】

「直鎖または分岐鎖のアルキル」は、本明細書中で使用される場合、１〜２０個の炭素原子の飽和直鎖または分岐鎖の一価炭化水素ラジカルを指す。アルキルの例として、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル）、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、１−ヘプチル、１−オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アルキルは、炭素原子を１〜１０個有する。より好ましくは、アルキルは、炭素原子を１〜４個有する。

【0037】

「直鎖または分岐鎖のアルケニル」は、少なくとも１カ所の不飽和部位、すなわち炭素−炭素二重結合を有する、２〜２０個炭素原子の直鎖または分岐鎖の一価炭化水素ラジカルを指し、アルケニルラジカルは、「シス」及び「トランス」配向、代替として「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを含む。例として、エチレニルまたはビニル（−ＣＨ＝ＣＨ_２）、アリル（−ＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アルケニルは、炭素原子を２〜１０個有する。より好ましくは、アルキルは、炭素原子を２〜４個有する。

【0038】

「直鎖または分岐鎖のアルキニル」は、少なくとも１カ所の不飽和部位、すなわち炭素−炭素三重結合を有する、２〜２０個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の一価炭化水素ラジカルを指す。例として、エチニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、ヘキシニル、などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アルキニルは、炭素原子を２〜１０個有する。より好ましくは、アルキニルは、炭素原子を２〜４個有する。

【0039】

「炭素環」、「カルボシクリル」、及び「炭素環式環」という用語は、単環式環では３〜１２個の炭素原子、二環式環では７〜１２個の炭素原子を有する、一価の非芳香族、飽和もしくは部分不飽和環を指す。炭素原子を７〜１２個有する二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系として配置させることができ、環原子を９または１０個有する二環式炭素環は、ビシクロ［５，６］または［６，６］系として、あるいはビシクロ［２．２．１］ヘプタン、ビシクロ［２．２．２］オクタン、及びビシクロ［３．２．２］ノナンなどの架橋系として配置させることができる。単環式炭素環の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0040】

「環状アルキル」及び「シクロアルキル」という用語は、同義に使用することができる。これらの用語は、一価飽和炭素環式環ラジカルを指す。好ましくは、環状アルキルは、３員〜７員の単環式環ラジカルである。より好ましくは、環状アルキルは、シクロヘキシルである。

【0041】

「環状アルケニル」という用語は、環構造中に少なくとも１つの二重結合を有する炭素環式環ラジカルを指す。
「環状アルキニル」という用語は、環構造中に少なくとも１つの三重結合を有する炭素環式環ラジカルを指す。

【0042】

「アリール」は、親の芳香環系の単一の炭素原子から１個の水素原子を取り除くことによって得た、６〜１８個の炭素原子の一価芳香族炭化水素ラジカルを意味する。いくつかのアリール基は、「Ａｒ」という例示的な構造で表される。アリールには、飽和、部分不飽和環、または芳香族炭素環式もしくは複素環式環と縮合した芳香環を含む二環式ラジカルが含まれる。典型的なアリール基として、ベンゼン（フェニル）、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデニル、インダニル、１，２−ジヒドロナフタレン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルに由来するラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アリールは、フェニル基である。

【0043】

「複素環」、「ヘテロシクリル」、及び「複素環式環」という用語は、本明細書中において同義で使用され、３〜１８個の環原子の飽和または部分不飽和の（すなわち、環内に１つまたは複数の二重及び／または三重結合を有する）炭素環ラジカルを指す。この環原子の少なくとも１個は、窒素、酸素、リン、及び硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子はＣであり、１個または複数の環原子は、以下に記載される１つまたは複数の置換基で独立して随意に置換される。複素環は、３環員〜７環員（２〜６個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子）を有する単環、または環７員〜１０環員（４〜９個の炭素原子ならびにＮ、Ｏ、Ｐ、及びＳから選択される１〜６個のヘテロ原子）を有する二環、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、または［６，６］系であってよい。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．；‘‘Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ’’（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７、及び９章、‘‘Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ’’（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特に第１３、１４、１６、１９、及び２８巻、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載される。「複素環」には、複素環ラジカルが飽和、部分不飽和環、または芳香族炭素環式もしくは複素環式環と縮合したラジカルも含まれる。複素環式環の例として、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジノ、モルホリノ、チオモルホリノ、チオキサニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ホモピペリジニル、オキセパニル、チエパニル、オキサゼピニル、ジアゼピニル、チアゼピニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、インドリニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、ピラゾリニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、及びアザビシクロ［２．２．２］ヘキサニルが挙げられるが、これらに限定されない。スピロ部分も、この定義の範囲内に含まれる。環原子がオキソ（＝Ｏ）部分で置換されている複素環基の例として、ピリミジノニル及び１，１−ジオキソ−チオモルホリニルがある。

【0044】

「ヘテロアリール」という用語は、５員もしくは６員環の一価芳香族ラジカルを指し、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される１個または複数のヘテロ原子を含有する、５〜１８個の原子の縮合環系（そのうち少なくとも１つの環は芳香族である）も含む。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル（例えば、２−ヒドロキシピリジニルを含む）、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピリミジニル（例えば、４−ヒドロキシピリミジニルを含む）、ピラゾリル、チアゾリル、ピラジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プテリジニル、プリニル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、及びフロピリジニルがある。

【0045】

複素環またはヘテロアリール基は、可能な場合には、炭素で結合（炭素連結）していても、または窒素で結合（窒素連結）してもよい。制限ではなく例として、炭素結合した複素環またはヘテロアリールは、ピリジンの２、３、４、５、もしくは６位、ピリダジンの３、４、５、もしくは６位、ピリミジンの２、４、５、もしくは６位、ピラジンの２、３、５、もしくは６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、もしくはテトラヒドロピロールの２、３、４、もしくは５位、オキサゾール、イミダゾール、もしくはチアゾールの２、４、もしくは５位、イソキサゾール、ピラゾール、もしくはイソチアゾールの３、４、もしくは５位、アジリジンの２もしくは３位、アゼチジンの２、３、もしくは４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、もしくは８位、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、または８位で結合している。

【0046】

制限ではなく例として、窒素結合した複素環またはヘテロアリールは、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドールまたはイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾールまたはＯ−カルボリンの９位で結合している。

【0047】

ヘテロアリールまたはヘテロシクリルに存在するヘテロ原子には、ＮＯ、ＳＯ、及びＳＯ_２などの酸化型が含まれる
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを指す。

【0048】

上記のアルキル、アルケニル、アルキニル、環状アルキル、環状アルケニル、環状アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、及びヘテロアリールは、さらに１つ（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）の置換基で随意に置換することができる。

【0049】

置換基が「置換された」と記載される場合、その置換基の炭素、酸素、硫黄、または窒素に、水素置換基に代わって非水素置換基が存在する。したがって、例えば、置換されたアルキル置換基とは、少なくとも１つの非水素置換基が、アルキル置換基の水素置換基に代わって存在するアルキル置換基である。例えば、モノフルオロアルキルは、フルオロ置換基で置換されたアルキルであり、ジフルオロアルキルは、２つのフルオロ置換基で置換されたアルキルである。１つの置換基に１超の置換がある場合、各非水素置換基は同一でも異なっていてもよい（特に記載がない限り）ことを理解されたい。

【0050】

置換基が「随意に置換される」と記載される場合、置換基は、（１）置換されていなくても、または（２）置換されていてもよい。置換基の炭素が、列挙される置換基の１つまたは複数で随意に置換されると記載される場合、その炭素上の１個または複数の水素が（水素が存在する範囲内で）、別々にかつ／または一緒に、独立して選択された随意の置換基で置き換えられてもよい。置換基の窒素が、列挙される置換基の１つまたは複数で随意に置換されると記載される場合、その窒素上の１個または複数の水素が（水素が存在する範囲内で）、それぞれ、独立して選択された随意の置換基で置き換えられてもよい。１つの例示的な置換基は、−ＮＲ’Ｒ’’と示すことができるが、式中、Ｒ’及びＲ’’は、それらが結合した窒素原子と一緒になって、複素環式環を形成してもよい。Ｒ’及びＲ’’が、それらが結合した窒素原子と一緒になって形成した複素環式環は、部分飽和でも完全飽和でもよい。１つの実施形態において、複素環式環は、３〜７個の原子からなる。別の実施形態において、複素環式環は、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、及びチアゾリルからなる群より選択される。

【0051】

本明細書は、「置換基」、「ラジカル」、及び「基」という用語を同義で使用する。
置換基の群が、列挙される置換基のうちの１つまたは複数により随意に置換されると集合的に記載される場合、その群は、（１）置換不可能な置換基、（２）置換可能であるが随意の置換基によって置換されない置換基、及び／または（３）置換可能であり１つまたは複数の随意の置換基により置換される置換基を含む場合がある。

【0052】

置換基が、最大で特定の個数の非水素置換基で随意に置換されると記載される場合、その置換基は、（１）置換されない、または（２）最大でその特定の個数の非水素置換基もしくは最大で置換基上の最大数の置換可能な部位のいずれか少ない方により置換されている、のいずれかであってもよい。すなわち、例えば、置換基が、最大３つの非水素置換基で随意に置換されるヘテロアリールであると記載される場合、置換可能な位置が３つ未満である任意のヘテロアリールは随意に、最大でもそのヘテロアリールが有する置換可能な位置と同数の非水素置換基のみで置換されることになる。そのような置換基の非限定例は、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖または環状のアルキニル、アルケニル、またはアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ハロゲン、グアニジニウム［−ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ_２］、−ＯＲ^１００、ＮＲ^１０１Ｒ^１０２、−ＮＯ_２、−ＮＲ^１０１ＣＯＲ^１０２、−ＳＲ^１００、−ＳＯＲ^１０１で表されるスルホキシド、−ＳＯ_２Ｒ^１０１で表されるスルホン、スルホン酸基−ＳＯ_３Ｍ、硫酸基−ＯＳＯ_３Ｍ、−ＳＯ_２ＮＲ^１０１Ｒ^１０２で表されるスルホンアミド、シアノ、アジド、−ＣＯＲ^１０１、−ＯＣＯＲ^１０１、−ＯＣＯＮＲ^１０１Ｒ^１０２、及びポリエチレングリコール単位（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＲ^１０１から選択することができ、式中、Ｍは、Ｈまたはカチオン（Ｎａ^＋またはＫ^＋など）であり、Ｒ^１０１、Ｒ^１０２、及びＲ^１０３は、それぞれ独立して、Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖、または環状のアルキニル、アルケニル、またはアルキニル、ポリエチレングリコール単位（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ｒ^１０４（式中、ｎは、１〜２４の整数である）、炭素原子を６〜１０個有するアリール、炭素原子を３〜１０個有する複素環式環、及び炭素原子を５〜１０個有するヘテロアリールから選択され、Ｒ^１０４は、Ｈであるか、炭素原子を１〜４個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、式中、Ｒ^１００、Ｒ^１０１、Ｒ^１０２、Ｒ^１０３、及びＲ^１０４で表される基中のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクリルは、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）の置換基で随意に置換され、この置換基は、独立して、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、及び炭素原子を１〜４個有する未置換の直鎖または分岐鎖のアルキルから選択される。好ましくは、上記の随意に置換されるアルキル、アルケニル、アルキニル、環状アルキル、環状アルケニル、環状アルキニル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、及びヘテロアリールの置換基として、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＲ^１０２Ｒ^１０３、−ＣＦ_３、−ＯＲ^１０１、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−ＳＲ^１０１、−ＳＯＲ^１０１、−ＳＯ_２Ｒ^１０１、及びＳＯ_３Ｍが挙げられる。

【0053】

「化合物」または「細胞障害性化合物」、「細胞障害性二量体」及び「細胞障害性二量体化合物」という用語は、同義で使用される。これらの用語は、構造もしくは式もしくはその任意の誘導体が本発明において開示されているか、または構造もしくは式もしくはその任意の誘導体が参照により援用されている化合物を含むものとする。この用語はまた、本発明で開示される全ての式の化合物の立体異性体、幾何異性体、互変異性体、溶媒和物、代謝産物、塩（例えば、薬学上許容される塩）及びプロドラッグ、ならびにプロドラッグ塩も含む。この用語はまた、上記のいずれかのものの任意の溶媒和物、水和物、及び多形も含む。本出願で記載される本発明のある特定の態様における「立体異性体」、「幾何異性体」、「互変異性体」、「溶媒和物」、「代謝産物」、「塩」、「プロドラッグ」、「プロドラッグ塩」、「コンジュゲート」、「コンジュゲート塩」、「溶媒和物」、「水和物」、または「多形」についての具体的な記述は、「化合物」という用語がこれら他の形状の記述なしに使用される本発明の他の態様において、これらの形状を排除することを意図するものとは解釈されないものとする。

【0054】

「コンジュゲート」という用語は、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載される化合物またはその誘導体が細胞結合剤と連結したものを指す。
「細胞結合剤と連結可能な」という用語は、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載される化合物またはそれらの誘導体が、それら化合物またはそれらの誘導体を細胞結合剤に結合させるのに適切な結合基またはその前駆体を少なくとも１つ含むことを指す。

【0055】

所定の基の「前駆体」という用語は、任意の脱保護、化学修飾、またはカップリング反応によりその所定の基になることができる任意の基を指す。
「細胞結合剤と連結した」という用語は、コンジュゲート分子が、適切な結合基またはその前駆体を介して細胞結合剤と結合した、本明細書中に記載される化合物（例えば、本明細書中に記載される、式（Ｉ）〜（ＩＶ）及び（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩ）の化合物ならびに薬物−リンカー化合物）のうち少なくとも１種、またはその誘導体を含むことを指す。

【0056】

「キラル」という用語は、鏡像パートナーと重ね合わせできない性質を有する分子を示し、一方「アキラル」という用語は、鏡像パートナーと重ね合わせできる分子を指す。
「立体異性体」という用語は、同一の化学組成及び連結性を有するが、それらの原子の空間配置が異なり、単結合の回転により相互変換することができない化合物を指す。

【0057】

「ジアステレオマー」は、２つ以上のキラル中心を有し、分子が互いの鏡像ではない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、様々な物性、例えば融点、沸点、分光特性、及び反応性を有する。ジアステレオマー混合物は、結晶化、電気泳動、及びクロマトグラフィーなどの高分解能分析手法で分離することができる。

【0058】

「鏡像異性体」は、互いの重ね合わせできない鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。
本明細書中で使用される立体化学の定義及び観念は、全般的に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ（１９８４）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＥｌｉｅｌ，Ｅ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，‘‘Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，’’Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４に従うものである。本発明の化合物は、不斉中心またはキラル中心を有する場合があり、したがって、様々な立体異性体形で存在する場合がある。ジアステレオマー、鏡像異性体、及びアトロプ異性体、ならびにこれらの混合物、例えば、ラセミ混合物を含むがこれらに限定されない、本発明の化合物の立体異性体形は全て、本発明の一部を形成するものとする。多くの有機化合物が、光学活性な形態で存在する。すなわち、それらは、直線偏光の面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を説明する場合、Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳという接頭辞を使用して、そのキラル中心（複数化）の周りの分子の絶対配置を示す。ｄ及びｌまたは（＋）及び（−）という接頭辞は、化合物による直線偏光の回転の兆候を指称するのに使用し、（−）またはｌは、その化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄという接頭辞が付された化合物は、右旋性である。所定の化学構造では、これらの立体異性体は、それらが互いの鏡像であることを除いて、同一である。特定の立体異性体は、鏡像異性体と称される場合もあり、そのような異性体の混合物は、鏡像異性体混合物と呼ばれることが多い。鏡像異性体の５０：５０混合物は、ラセミ混合物またはラセミ体と称され、そのような混合物は、化学反応または処理において立体選択または立体特異性がない場合に生じる場合がある。「ラセミ混合物」及び「ラセミ体」という用語は、光学活性がない２種の鏡像異性体種の等モル混合物を指す。

【0059】

「互変異性体」または「互変異性体形」という用語は、低エネルギー障壁を介して相互変換可能である、異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、プロトン互変異性体（プロトトロピー互変異性体としても知られる）は、プロトンの移動を介した相互変換、例えばケト−エノール異性体化及びイミン−エナミン異性体化などを含む。原子価互変異性体は、結合電子のいくつかの再編成による相互変換を含む。

【0060】

「プロドラッグ」という用語は、本出願で使用される場合、酵素反応により、または加水分解により、さらに活性化されるかより活性な親型に変換させることが可能である、本発明の化合物の前駆体または誘導体形を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，‘‘Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ’’Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）、及びＳｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，‘‘Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，’’Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９８５）を参照のこと。本発明のプロドラッグとして、より活性の細胞傷害性遊離薬物に変換され得る、エステル含有プロドラッグ、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾化プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、随意に置換されるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、随意に置換されるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬の例として、本発明の化合物及び上記のもののような化学療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

「プロドラッグ」という用語は、生物学的条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）で加水分解、酸化、さもなければ反応して本発明の化合物を提供することができる化合物の誘導体を包含することも意味する。プロドラッグは、生物学的条件下でのそのような反応時にのみ活性となることができるか、またはそれらが未反応形態で活性を有することができる。本発明で企図されるプロドラッグの例として、生体加水分解が可能なアミド、生体加水分解が可能なエステル、生体加水分解が可能なカルバミン酸基、生体加水分解が可能な炭酸塩、生体加水分解が可能なウレイド、及び生体加水分解が可能なリン酸の類似体などの生体加水分解が可能な部分を含む、本明細書中に開示される式のいずれか１つの化合物の類似体または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグの他の例として、−ＮＯ、−ＮＯ_２、−ＯＮＯ、または−ＯＮＯ_２部分を含む、本明細書中に開示される式のいずれか１つの化合物の誘導体が挙げられる。プロドラッグは、典型的には、周知の方法、例えば、Ｂｕｒｇｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（１９９５）１７２−１７８，９４９−９８２（Ｍａｎｆｒｅｄ Ｅ．Ｗｏｌｆｆ ｅｄ．，５ｔｈ ｅｄ）に記載される方法などを用いて調製することができる。Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９２，‘‘Ｂｉｏｔｒａｎｓｏｆｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ．’’も参照のこと。

【0062】

本発明のプロドラッグの１つの好ましい形として、本発明の化合物／コンジュゲートのイミン結合とイミン反応性試薬との間で形成される付加物を含む、本発明の化合物及びコンジュゲート（任意のリンカー基の有無に関わらず）が挙げられる。本発明のプロドラッグの別の好ましい形として、式（Ｉ）〜（ＩＶ）などの化合物（式中、ＮとＣとの間の二重線
が単結合を表す場合に、ＸがＨまたはアミン保護基であり、化合物がプロドラッグになる）が挙げられる。本発明のプロドラッグは、本明細書中に記載されるプロドラッグの形態のうち一方または両方を含む場合がある（例えば、化合物／コンジュゲートのイミン結合とイミン反応性試薬の間に形成された付加物を含み、かつ／または、Ｘが−Ｈである場合に、脱離基Ｙを含む）。

【0063】

「イミン反応性試薬」という用語は、イミン基と反応することができる試薬を指す。イミン反応性試薬の例として、亜硫酸化合物（Ｈ_２ＳＯ_３、Ｈ_２ＳＯ_２、またはカチオンで形成されるＨＳＯ_３⁻、ＳＯ_３^２−、もしくはＨＳＯ_２⁻の塩）、メタ重亜硫酸化合物（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_５またはカチオンで形成されるＳ_２Ｏ_５^２−の塩）、モノ、ジ、トリ、及びテトラチオリン酸化合物（ＰＯ_３ＳＨ_３、ＰＯ_２Ｓ_２Ｈ_３、ＰＯＳ_３Ｈ_３、ＰＳ_４Ｈ_３、またはカチオンで形成されるＰＯ_３Ｓ^３−、ＰＯ_２Ｓ_２^３−、ＰＯＳ_３^３−、もしくはＰＳ_４^３−の塩）、チオリン酸エステル（（Ｒ^ｉＯ）_２ＰＳ（ＯＲ^ｉ）、Ｒ^ｉＳＨ、Ｒ^ｉＳＯＨ、Ｒ^ｉＳＯ_２Ｈ、Ｒ^ｉＳＯ_３Ｈ）、種々のアミン（ヒドロキシルアミン（例えば、ＮＨ_２ＯＨ）、ヒドラジン（例えば、ＮＨ_２ＮＨ_２）、ＮＨ_２Ｏ−Ｒ^ｉ、Ｒ^ｉ’ＮＨ−Ｒ^ｉ、ＮＨ_２−Ｒ^ｉ）、ＮＨ_２−ＣＯ−ＮＨ_２、ＮＨ_２−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ_２、チオ硫酸化合物（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_３またはカチオンで形成されるＳ_２Ｏ_３^２−の塩）、亜ジチオン酸化合物（Ｈ_２Ｓ_２Ｏ_４またはカチオンで形成されるＳ_２Ｏ_４^２−の塩）、ホスホロジチオ酸化合物（Ｐ（＝Ｓ）（ＯＲ^ｋ）（ＳＨ）（ＯＨ）またはカチオンで形成されるその塩）、ヒドロキサム酸（Ｒ^ｋＣ（＝Ｏ）ＮＨＯＨまたはカチオンで形成されるその塩）、ヒドラジド（Ｒ^ｋＣＯＮＨＮＨ_２）、ホルムアルデヒドスルホキシル酸化合物（ＨＯＣＨ_２ＳＯ_２Ｈまたはカチオンで形成されるＨＯＣＨ_２ＳＯ_２⁻の塩、例えばＨＯＣＨ_２ＳＯ_２⁻Ｎａ^＋など）、糖化ヌクレオチド（ＧＤＰ−マンノースなど）、フルダラビン、またはそれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されず、式中、Ｒ^ｉ及びＲ^ｉ’は、それぞれ独立して、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、−Ｎ（Ｒ^ｊ）_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＳＯ_３Ｈ、及びＰＯ_３Ｈから選択される少なくとも１つの置換基で置換され、Ｒ^ｉ及びＲ^ｉ’は随意で、本明細書中に記載されるアルキルの置換基でさらに置換することができ、Ｒ^ｊは、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、Ｒ^ｋは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニルであるか、アリール、ヘテロシクリル、もしくはヘテロアリールである（好ましくは、Ｒ^ｋは、炭素原子を１〜４個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、より好ましくは、Ｒ^ｋは、メチル、エチル、またはプロピルである）。好ましくは、カチオンは、Ｎａ^＋またはＫ^＋などの一価カチオンである。好ましくは、イミン反応性試薬は、亜硫酸化合物、ヒドロキシルアミン、尿素、及びヒドラジンから選択される。より好ましくは、イミン反応性試薬は、ＮａＨＳＯ_３またはＫＨＳＯ_３である。

【0064】

本明細書中で使用される場合、かつ別途特に記載がない限り、「生体加水分解が可能なアミド」、「生体加水分解が可能なエステル」、「生体加水分解が可能なカルバミン酸基」、「生体加水分解が可能な炭酸塩」、「生体加水分解が可能なウレイド」、及び「生体加水分解が可能なリン酸類似体」という用語は、アミド、エステル、カルバミン酸基、炭酸塩、ウレイド、またはリン酸類似体がそれぞれ、（１）化合物の生物活性を損なわず、かつ、その化合物にｉｎ ｖｉｖｏで有利な性質、例えば、取込、作用期間、または作用の発現を付与するか、または（２）それ自体は生物学的に不活性であるが、ｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に活性な化合物に変換させるかのいずれかであることを意味する。生体加水分解が可能なアミドの例として、低級アルキルアミド、α−アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、及びアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。生体加水分解が可能なエステルの例として、低級アルキルエステル、アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステル、及びコリンエステルが挙げられるが、これらに限定されない。生体加水分解が可能なカルバミン酸基の例として、低級アルキルアミン、置換エチレンジアミン、アミノ酸、ヒドロキシアルキルアミン、複素環アミン及び複素芳香族アミン、ならびにポリエーテールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましいプロドラッグ及びプロドラッグの塩とは、本発明の化合物が哺乳類に投与されたときに、その化合物の生物利用能を増大させるものである。

【0065】

「薬学上許容される塩」という語句は、本明細書中で使用される場合、本発明の化合物の薬学上許容される有機もしくは無機塩を指す。塩の例として、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸）塩）、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学上許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子の包含を伴ってもよい。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であってよい。さらに、薬学上許容される塩は、その構造中に１超の荷電原子を有してもよい。複数の荷電原子が薬学上許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学上許容される塩は、１つまたは複数の荷電原子及び／または１つまたは複数の対イオンを有することができる。

【0066】

本発明の化合物が塩基である場合、所望の薬学上許容される塩は、当該分野で利用可能な任意の適切な方法により、例えば、遊離塩基を、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸などで、または有機酸、例えば酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、グルクロン酸もしくはガラクツロン酸のようなピラノシジル酸、クエン酸もしくは酒石酸のようなαヒドロキシ酸、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸のようなアミノ酸、安息香酸もしくはケイ皮酸のような芳香族酸、ｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸のようなスルホン酸などで処理することにより、調製することができる。

【0067】

本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学上許容される塩は、任意の適切な方法により、例えば、遊離酸を、無機塩基または有機塩基、例えばアミン（第１級、第２級、または第３級）、アルカリ金属水酸化物、またはアルカリ土類金属水酸化物などで処理することにより調製することができる。適切な塩の代表的な例として、グリシン及びアルギニンのようなアミノ酸、アンモニア、第１級、第２級、及び第３級アミン、ならびにピペリジン、モルホリン、及びピペラジンのような環状アミンから得られる有機塩、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム、及びリチウムから得られる無機塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

本明細書中で使用される場合、「溶媒和物」という用語は、非共有結合性分子間力により結合した、化学量論的または非化学量論的な量の溶媒、例えば、水、イソプロパノール、アセトン、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、及びエタノールアミン、ジクロロメタン、２−プロパノールなどをさらに含む化合物を意味する。本化合物の溶媒和物または水和物は、少なくとも１モル当量のヒドロキシル溶媒、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、または水を化合物に添加して、イミン部分を溶媒和または水和させることによって、容易に調製される。

【0069】

本出願において、「異常な細胞増殖」及び「細胞増殖障害」という用語は、同義で使用される。「異常な細胞増殖」は、本明細書中で使用される場合、特に記載がない限り、正常な調節機構から独立した（例えば、接触阻害を喪失した）細胞増殖を指す。異常な細胞増殖として、例えば、（１）変異型チロシンキナーゼの発現または受容体型チロシンキナーゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）、（２）異常なチロシンキナーゼの活性化が生じている他の増殖性疾患の良性細胞及び悪性細胞、（３）受容体型チロシンキナーゼにより増殖する任意の腫瘍、（４）異常なセリン／トレオニンキナーゼの活性化により増殖する任意の腫瘍、ならびに（５）異常なセリン／トレオニンキナーゼの活性化が生じている他の増殖性疾患の良性細胞及び悪性細胞の異常増殖が挙げられる。

【0070】

「癌」及び「癌性」という用語は、細胞増殖が制御されていないことを典型的な特徴とする、哺乳類での生理状態を指すかまたは説明する。「腫瘍」は、１つまたは複数の癌細胞及び／または良性細胞もしくは前癌細胞を含む。

【0071】

「治療薬」は、抗体、ペプチド、タンパク質、酵素などの生物学的作用剤、または化学療法薬の両方を包含する。
「化学療法薬」は、癌の治療に有用な化学合成物である。

【0072】

「代謝産物」は、特定の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲート、またはその塩が体内で代謝することにより産生される産物である。化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートの代謝産物は、当該分野において既知の常用技術を用いて特定することができ、それらの活性は、本明細書中に記載されるものなどの試験を用いて決定することができる。そのような産物は、例えば、投与した化合物の酸化、ヒドロキシル化、還元、加水分解、アミド化、脱アミド化、エステル化、脱エステル化、酵素切断などから得られる場合がある。したがって、本発明は、本発明の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートの代謝物を包含する。それらには、本発明の化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートを、それらの代謝産物を得るのに十分な期間、哺乳類と接触させることを含む処理により産生される化合物、その誘導体、またはその複合体が含まれる。

【0073】

「薬学上許容される」という語句は、その物質または組成物が、製剤に含まれる他の成分及び／またはそれで処理される哺乳類と、化学的にかつ／または毒物学的に適合しなければならないことを示す。

【0074】

「保護基」または「保護部分」という用語は、化合物、その誘導体、またはそのコンジュゲートの他の官能基が反応している間、特定の官能基をブロックまたは保護するために一般的に使用される置換基を指す。例えば、「アミン保護基」または「アミノ保護部分」は、化合物のアミノ官能基をブロックまたは保護する、アミノ基に結合した置換基である。そのような基は、当技術分野で周知であり（例えば、Ｐ．Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅ，２００７，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ７，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＪを参照）、代表的なものとして、メチルカルバミン酸基及びエチルカルバミン酸基などのカルバミン酸基、ＦＭＯＣ、置換エチルカルバミン酸基、１，６−β−脱離で切断されるカルバミン酸基（「自壊（ｓｅｌｆｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）型」とも称される）、尿素、アミド、ペプチド、アルキル、及びアリール誘導体がある。適切なアミノ保護基として、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、及び９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）が挙げられる。保護基の全般的な説明及びそれらの使用については、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ ＆ Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７を参照のこと。

【0075】

「脱離基」という用語は、置換または転置の間に分離する荷電部分または非荷電部分の基を指す。そのような脱離基は、当該分野において周知であり、そのような脱離基として、ハロゲン、エステル、アルコキシ、ヒドロキシル、トシラート、トリフラート、メシラート、ニトリル、アジド、カルバマート、ジスルフィド、チオエステル、チオエーテル、及びジアゾニウム化合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0076】

「二官能性架橋剤」、「二官能性リンカー」、または「架橋剤」という用語は、２つの反応性基（そのうちの一方は、細胞結合剤と反応することができ、他方は細胞傷害性化合物と反応して２つの部分を１つに連結する）を有する修飾剤を指す。そのような二官能性架橋剤は、当技術分野において周知である（例えば、Ｉｓａｌｍ ａｎｄ Ｄｅｎｔ ｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｃｈａｐｔｅｒ ５，ｐ２１８−３６３，Ｇｒｏｖｅｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。例えば、チオエーテル結合を介した連結を可能にする二官能性架橋剤として、マレイミド基を導入するためのＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、またはヨードアセチル基を導入するためのＮ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）が挙げられる。マレイミド基またはハロアセチル基を細胞結合剤に導入する他の二官能性架橋剤は、当該分野において周知であり（米国特許出願第２００８／００５０３１０号、同第２００５０１６９９３３号を参照、これらはＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １１７，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ ６１１０５，ＵＳＡから入手可能）、そのような二官能性架橋剤として、ビス−マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）_２、ＢＭ（ＰＥＯ）_３、Ｎ−（β−マレイミドプロピルオキシ）スクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、５−マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）−酪酸ヒドラジドまたは塩酸塩（ＭＰＢＨ）、Ｎ−スクシンイミジル＝３−（ブロモアセトアミド）プロピオナート（ＳＢＡＰ）、Ｎ−スクシンイミジル＝ヨードアセタート（ＳＩＡ）、κ−マレイミドウンデカノイン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、Ｎ−スクシンイミジル＝４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチラート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、スクシンイミジル−（４−ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ジチオビス−マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４ビスマレイミジル−２，３−ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス−マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス−マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、スルホスクシンイミジル＝４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル＝（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（スルホ−ＳＩＡＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（κ−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＫＭＵＳ）、及びスルホスクシンイミジル＝４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0077】

ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる反応性基を有する二官能性架橋剤である。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）及びカルボニル反応性ヒドラジン基の両方を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた、本明細書中に記載される細胞傷害性化合物と細胞結合剤（例えば、抗体）とを連結するために使用することができる。そのようなヘテロ二官能性架橋剤の市販品の例として、スクシンイミジル＝６−ヒドラジノニコチンアミド＝アセトン＝ヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル＝４−ヒドラジドテレフタラート塩酸塩（ＳＨＴＨ）、及びスクシンイミジル＝ヒドラジニウムニコチナート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が挙げられる。酸不安定性結合を有するコンジュゲートも、本発明のヒドラジンを有するベンゾジアゼピン誘導体を用いて調製することができる。使用可能な二官能性架橋剤の例として、スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾアート（ＳＦＢ）及びスクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）が挙げられる。

【0078】

ジスルフィド結合を介した細胞結合剤と細胞傷害性化合物との結合を可能にする二官能性架橋剤は、当該分野において既知であり、そのような二官能性架橋剤として、ジチオピリジル基を導入するための、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられる。ジスルフィド基を導入するために使用可能な他の二官能性架橋剤は、当該分野において既知であり、米国特許第６，９１３，７４８号、同第６，７１６，８２１号、ならびに米国特許出願公開第２００９０２７４７１３号、及び同第２０１００１２９３１４号に記載される。これらは全て、本明細書中に参照により援用される。代替として、チオール基を導入する、２−イミノチオラン、ホモシステインチオラクトン、またはＳ−アセチルコハク酸無水物などの架橋剤もまた使用可能である。

【0079】

本明細書中で定義される「リンカー」、「リンカー部分」、または「結合基」は、２つの基、例えば細胞結合剤と細胞傷害性化合物とを１つに連結する部分を指す。典型的には、リンカーが連結する２つの基が結合する条件下ではそのリンカーは実質的に不活性である。二官能性架橋剤は、リンカー部分の各末端に１つずつ、２つの反応性基を含んでもよく、それによって、１つの反応性基がまず細胞傷害性化合物と反応して、リンカー部分及び第２の反応性基を有する化合物をもたらすことができ、次にそれを細胞結合剤と反応させることができる。代替として、二官能性架橋剤の１つの末端がまず細胞結合剤と反応して、リンカー部分及び第２の反応性基を有する細胞結合剤をもたらすことができ、次にそれを細胞傷害性化合物と反応させることができる。連結部分は、特定の部位での細胞傷害性部分の放出を可能にする化学結合を含有してもよい。適切な化学結合は当該分野で周知であり、そのような結合として、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、及びエステラーゼ不安定性結合が挙げられる（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４７５，０９２号、同第６，４４１，１６３号、同第６，７１６，８２１号、同第６，９１３，７４８号、同第７，２７６，４９７号、同第７，２７６，４９９号、同第７，３６８，５６５号、同第７，３８８，０２６号、及び同第７，４１４，０７３号を参照）。ジスルフィド結合、チオエーテル結合、及びペプチダーゼ不安定性結合が好ましい。本発明で使用可能な他のリンカーとして、米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号に詳細が記載されているものなどの非開裂リンカー、または米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号、米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４０号、及びＷＯ２００９／１３４９７６に記載される荷電リンカーまたは親水性リンカーが挙げられ、これらはそれぞれ、参照により本明細書中で参照により明白に援用される。これらはそれぞれ、参照により本明細書中で参照により明白に援用される。

【0080】

１つの実施形態において、反応性エステルなどの反応性基が一方の端に結合した結合基は、以下から選択される。
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２６＝ＣＲ_２７）_ｍ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（アルキニル）_ｎ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピペラジノ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピロロ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｏ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍＡ’’_ｍ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２６＝ＣＲ_２７）_ｍ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（アルキニル）_ｎ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピペラジノ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピロロ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−Ｓ（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍＡ’’_ｍ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２６＝ＣＲ_２７）_ｍ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（アルキニル）_ｎ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ’’（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピペラジノ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピロロ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ⁻（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−ＮＲ_３３（Ｃ＝Ｏ）_ｐ’’（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍＡ’’_ｍ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２６＝ＣＲ_２７）_ｍ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（アルキニル）_ｎ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ピペラジノ）_ｔ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍＡ’’_ｍ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２９＝Ｎ−ＮＲ_３０）_ｎ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２９＝Ｎ−ＮＲ_３０）_ｎ’’（ＣＲ_２６＝ＣＲ_２７）_ｍ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２９＝Ｎ−ＮＲ_３０）_ｎ’’（アルキニル）_ｎ’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ⁻（ＣＯ）_ｔＸ’’、
−（ＣＲ_２０Ｒ_２１）_ｍ（ＣＲ_２９＝Ｎ−ＮＲ_３０）_ｎ’’Ａ’’_ｍ’’（ＣＲ_２２Ｒ_２３）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＲ_４０Ｒ_４１）_ｐ’’Ｙ’’（ＣＲ_２４Ｒ_２５）_ｑ（ＣＯ）_ｔＸ’’（式中、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｍ’、ｎ’、ｔ’は、１〜１０の整数であるか、あるいは随意に０であり、
ｔ、ｍ’’、ｎ’’、及びｐ’’は、０または１であり、
Ｘ’’は、ＯＲ_３６、ＳＲ_３７、ＮＲ_３８Ｒ_３９から選択され、式中、Ｒ_３６、Ｒ_３７、Ｒ_３８、Ｒ_３９は、Ｈであるか、または炭素原子を１〜２０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、またはポリエチレングリコール単位−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎであり、Ｒ_３７は、ｔ＝１の場合に、随意にチオール保護基であり、ＣＯＸ’’は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、及びそれらの誘導体から選択される反応性エステルを形成し、該誘導体はアミド結合形成を促進し、
Ｙ’’は存在しないか、またはＯ、Ｓ、Ｓ−Ｓ、もしくはＮＲ_３２から選択され、式中、Ｒ_３２は、Ｒについて以上で与えられたものと同じ定義を有するか、または
Ｙ’’がＳ−Ｓではなく、かつｔ＝０の場合、Ｘ’’は、マレイミド基、ハロアセチル基、またはＳＲ_３７から選択され、式中、Ｒ_３７は上記と同じ定義を有し、
Ａ’’は、１つのアミノ酸残基であるか、２〜２０のアミノ酸残基を含有するポリペプチドであり、
Ｒ_２０、Ｒ_２１、Ｒ_２２、Ｒ_２３、Ｒ_２４、Ｒ_２５、Ｒ_２６、及びＲ_２７は、同一であるかまたは異なっていて、かつ−Ｈであるか、または炭素原子を１〜５個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、
Ｒ_２９及びＲ_３０は、同一であるかまたは異なっていて、かつ−Ｈであるか、または炭素原子を１〜５個有するアルキルであり、
Ｒ_３３は、Ｈ、または炭素原子を１〜１２個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニル、ポリエチレングリコール単位Ｒ−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎであるか、または、Ｒ_３３は、−ＣＯＲ_３４、−ＣＳＲ_３４、−ＳＯＲ_３４、もしくは−ＳＯ_２Ｒ_３４であり、式中、Ｒ_３４は、Ｈ、または炭素原子を１〜２０個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキル、アルケニル、もしくはアルキニルか、またはポリエチレングリコール単位−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎであり、
Ｒ_４０及びＲ_４１の一方は、随意に、負に荷電した、または正に荷電した官能基であり、他方は、Ｈ、または炭素原子を１〜４個有するアルキル、アルケニル、アルキニルである。

【0081】

上記の結合基のいずれも、本発明の化合物、薬物リンカー化合物、またはコンジュゲートのいずれにも存在する場合があり、本明細書に記載される式のいずれかの結合基を置換することを含む。

【0082】

「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸を指す。１つの実施形態において、アミノ酸は、ＮＨ_２−Ｃ（Ｒ^ａａ’Ｒ^ａａ）−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨで表され、式中、Ｒ^ａａ及びＲ^ａａ’は、それぞれ独立して、Ｈ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキル、アルケニル、またはアルキニルであるか、アリール、ヘテロアリール、もしくはヘテロシクリルであるか、あるいは、Ｒ^ａａ及びＮ末端窒素原子は、一緒になって複素環式環（例えば、プロリンにおけるように）を形成することができる。「アミノ酸残基」という用語は、アミノ酸のアミノ末端及び／またはカルボキシ末端から１つの水素原子が除去された場合に相当する残基、例えば、−ＮＨ−Ｃ（Ｒ^ａａ’Ｒ^ａａ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−を指す。

【0083】

「カチオン」という用語は、正の電荷を有するイオンを指す。カチオンは、一価（例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋など）、二価（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋など）、または多価（例えば、Ａｌ^３＋など）であってよい。好ましくは、カチオンは、一価である。

【0084】

「治療有効量」という用語は、対象において所望の生物学的反応を誘発する、活性化合物またはコンジュゲートの量を意味する。そのような反応として、治療されている疾患もしくは障害の症状の緩和、疾患の症状もしくは疾患自体の予防、阻害、もしくは再発遅延、治療が行われない場合と比較した対象の寿命の延長、または疾患の症状もしくは疾患自体の進行の予防、阻害、もしくは遅延が挙げられる。有効量は、特に本明細書中提供される詳細な開示を考慮して、十分な当業者の能力の範囲内で決定される。化合物Ｉの毒性及び治療効力は、細胞培養物及び実験動物での標準薬学的手順によって決定することができる。対象に投与される本発明の化合物もしくはコンジュゲートまたは他の治療薬の有効量は、多発性骨髄腫のステージ、分類及び状態、ならびに対象の特質、例えば、全般的な健康状態、年齢、性別、体重、及び薬品耐性などによって決定されることになる。また、投与される本発明の化合物もしくはコンジュゲートまたは他の治療薬の有効量は、投与経路及び剤形によって決定されることになる。投与量及び投与間隔は個々に調節されて、所望の治療効果を維持するのに十分な活性化合物の血漿中レベルをもたらすことができる。
細胞障害性化合物
第１の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される細胞障害性化合物（例えば、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）の化合物、またはその薬学上許容される塩）に関する。ある特定の実施形態において、細胞障害性化合物は、構造式（Ｉ）またはその薬学上許容される塩により表される。

【0085】

ある特定の実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうち１つは、式（Ａ）により表され、その他は、それぞれ独立して、−Ｈ、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキル、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ、または−ＮＯ_２である。特には、Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうち１つは、式（Ａ）により表され、その他は、−Ｈである。

【0086】

第１の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｌ’は、式（Ａ）により表され、Ｌ’’及びＬ’’’は、いずれも−Ｈであり、残りの可変要素は、第１の実施形態で上記したとおりである。

【0087】

第２の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｒ_ｘは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、もしくは荷電置換基、もしくはイオン化可能な基Ｑで随意に置換される、炭素原子を１〜６個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１の特定実施形態で上記したとおりである。

【0088】

ある特定の実施形態において、Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、またはその薬学上許容される塩、あるいは、ｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻もしくは−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンであり、残りの可変要素は、第２の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である。

【0089】

第３の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｊは、ＮＨＲ^ｃ１、−ＣＯＯＨ、及びＣＯＥからなる群より選択される反応性基を含む部分であり、式中、−ＣＯＥは、反応性エステルを表し、Ｒ^ｃ１は、−Ｈであるか、またはハロゲン、−ＯＨ、もしくは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシで随意に置換される、炭素原子を１〜４個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態、または第１もしくは第２の特定実施形態で上記したとおりである。

【0090】

ある特定の実施形態において、Ｊは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）エステル、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（例えば、４−スルホ−２，３，５，６−テトラフルオロフェニル）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択されるＣＯＥであり、残りの可変要素は、第３の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、ＣＯＥは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

【0091】

第４の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）にでは、Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ（Ｂ１）、
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ（Ｂ２）、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ（Ｃ１）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ（Ｃ２）、
により表され、式中、
Ｊは、−ＣＯＥであり、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
ｍ’は、０であるか、または１〜６の整数であり、
Ｃｙは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、もしくはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルで随意に置換される、環炭素原子を５または６個有する環状アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２もしくは第３の特定実施形態で上記したとおりである。

【0092】

ある特定の実施形態において、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれもＨであり、式（Ｂ２）及び（Ｃ２）では、Ｃｙは、シクロヘキサンであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅであり、残りの可変要素は、第４の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、式（Ｂ２）及び（Ｃ２）のｍ’は、０または１である。

【0093】

第５の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ （Ｂ３）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ （Ｃ３）、
により表され、式中、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚ^ｓは、−Ｈ、−ＳＲ^ｄ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ１、または以下の式：

【0094】

【化14】

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【0095】

のいずれか１つから選択され、式中、
ｑは、１〜５の整数であり、
ｎ’は、２〜６の整数であり、
Ｍは、カチオン（例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋）であり、
Ｒ^ｄは、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであるか、または、フェニル、ニトロフェニル（例えば、２または４−ニトロフェニル）、ジニトロフェニル（例えば、２，４−ジニトロフェニル）、カルボキシニトロフェニル（例えば、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）、ピリジル、またはニトロピリジル（例えば、４−ニトロピリジル）から選択され、
Ｒ^ｄ１は、炭素原子を１〜６個有する直鎖または分岐鎖のアルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、もしくは第４の特定実施形態で上記したとおりである。

【0096】

１つの実施形態において、Ｚ^ｓは、−Ｈである。別の実施形態において、Ｚ^ｓは、−ＳＭｅまたは−ＳＰｙである（Ｐｙは、ピリジルである）。
さらに別の実施形態において、Ｚ^ｓは、以下の式：

【0097】

【化15】

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【0098】

【化16】

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【0099】

のいずれか１つから選択され、式中、Ｕは、−Ｈまたは−ＳＯ_３Ｍであり、残りの可変要素は、式（ａ１’）〜（ａ１５’）について上記したとおりである。
ある特定の実施形態において、荷電置換基またはイオン化可能な基Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくはその薬学上許容される塩、またはｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻もしくは−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンであり、かつ、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である。

【0100】

ある特定の実施形態において、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれも−Ｈであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅであり、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。
ある特定の実施形態において、−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−は、−（ＣＨ_２）_ｍ’’−Ｃ（Ｍｅ_２）−であり、ｍ’’は、１〜５の整数であり、、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。

【0101】

第６の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｐは、２〜１０のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、もしくは第５の特定実施形態で上記したとおりである。

【0102】

ある特定の実施形態において、Ｐは、２〜５のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。
ある特定の実施形態において、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、ならびにＭｅｔ−Ａｌａから選択され、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0103】

ある特定の実施形態において、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａであり、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0104】

第７の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、ＮとＣの間の二重線

【0105】

【化17】

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【0106】

は、二重結合を表し、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の特定実施形態で上記したとおりである。
第８の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、ＮとＣの間の二重線

【0107】

【化18】

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【0108】

は、単結合を表し、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護基であり、Ｙは、−Ｈ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２Ｈ、及びＯＳＯ_３Ｈから選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、もしくは第７の特定実施形態で上記したとおりである。

【0109】

ある特定の実施形態において、Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、または−ＮＨＯＨから選択され、式中、Ｍは、−Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、残りの可変要素は、第８の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、または−ＯＨである。

【0110】

第９の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキニル、アルケニル、もしくはアルキニル、及びフェニルからなる群より選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、もしくは第８の特定実施形態で上記したとおりである。

【0111】

ある特定の実施形態において、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはフェニルであり、残りの可変要素は、第９の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、または−Ｍｅである。さらにより詳細には、Ｘ’は、−Ｈである。

【0112】

第１０の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、もしくは第９の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｙ’は、−Ｈまたはオキソである。さらにより詳細には、Ｙ’は−Ｈである。

【0113】

第１１の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、及びオキソ−（Ｃ＝Ｏ）−から選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、もしくは第１０の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、−Ｏ−及びＳ−から選択される。さらにより詳細には、Ａ及びＡ’は−Ｏ−である。

【0114】

第１２の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、もしくは第１１の特定実施形態で上記したとおりである。

【0115】

第１３の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＮＯ_２、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３-）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、もしくは第１２の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈである。

【0116】

第１４の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ_５は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、もしくは第１３の特定実施形態で上記したとおりである。

【0117】

第１５の特定実施形態において、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、及び（ＶＩ）では、ＮとＣの間の二重線

【0118】

【化19】

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【0119】

は、単結合または二重結合を表すが、ただし、二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、かつＹは−Ｈであり、二重線が単結合である場合には、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＯＨまたは−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈであり、
Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、
Ｘ’及びＹ’は、いずれも−Ｈであり、
Ａ及びＡ’は−Ｏ−であり、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0120】

第１６の特定実施形態において、本発明の細胞障害性化合物は、以下の式：

【0121】

【化20】

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【0122】

【化21】

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【0123】

【化22】

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【0124】

【化23】

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【0125】

【化24】

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【0126】

【化25】

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【0127】

【化26】

[この文献は図面を表示できません]

【0128】

【化27】

[この文献は図面を表示できません]

【0129】

【化28】

[この文献は図面を表示できません]

【0130】

【化29】

[この文献は図面を表示できません]

【0131】

【化30】

[この文献は図面を表示できません]

【0132】

【化31】

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【0133】

【化32】

[この文献は図面を表示できません]

【0134】

【化33】

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【0135】

【化34】

[この文献は図面を表示できません]

【0136】

【化35】

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【0137】

またはその薬学上許容される塩から選択され、式中、
Ｒ_１００は、−ＯＨ、−ＯＭｅ、または

【0138】

【化36】

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【0139】

であり、
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、薬学上許容されるカチオン（例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋）であり、
Ｚ^ｓは、−Ｈ、−ＳＲ^ｄ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｄ１であるか、または上記の式（ａ１’）〜（ａ１５’）から選択される。

【0140】

特定の実施形態において、Ｚ^ｓは、上記の式（ａ１）〜（ａ１５）から選択される。
より特定の実施形態において、Ｚ^ｓは、式（ａ７）、（ａ８）、（ａ９）、及び（ａ１５）から選択される。さらにより特定の実施形態において、Ｚ^ｓは、式（ａ９）により表される。代替として、Ｚ^ｓは、式（ａ７）により表される。

【0141】

別の特定の実施形態において、Ｚ^ｓは、−Ｈである。
別の特定の実施形態において、Ｙは、−ＳＯ_３Ｍである。代替として、Ｙは、−ＯＨである。

【0142】

また、本発明に包含されるのは、本明細書中に記載される任意の細胞障害性化合物または細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートの代謝産物である。
細胞障害性化合物の合成
本発明の細胞障害性化合物は、米国特許第８，７６５，７４０号及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８７３１号に記載の方法に従って調製することができる。

【0143】

本発明の細胞障害性二量体化合物を調製する代表的なプロセスを実施例１〜１０に示す。
細胞結合剤
本発明のコンジュゲートの治療薬としての有効性は、適切な細胞結合剤を注意深く選択することによって決定される。細胞結合剤は、ペプチド及び非ペプチドをはじめ、現在知られている、またはこれから知られる任意の種類のものであってよい。一般に、細胞結合剤は、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体など、特にモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン（例えば、ビタミンの細胞表面受容体、例えば、葉酸受容体に結合することができる葉酸など）、栄養輸送分子（例えば、トランスフェリン）、または他の任意の細胞結合分子もしくは物質が可能である。

【0144】

適切な細胞結合剤の選択は、自由選択によるものであり、部分的に、標的となる予定の特定細胞集団によって決定される。しかし、多くの場合（全てではないが）、適切なヒトモノクローナル抗体が利用可能な場合には、それを選択することが好適である。例えば、モノクローナル抗体ＭＹ９は、ＣＤ３３抗原に特異的に結合するマウスＩｇＧ_１抗体であり（Ｊ．Ｄ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓ．，８：５２１（１９８４））、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のように標的細胞がＣＤ３３を発現する場合に、利用可能である。

【0145】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、タンパク質ではない。例えば、ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、細胞表面受容体などのビタミン受容体と結合するビタミンであってもよい。これに関して、ビタミンＡは、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）と結合して複合体を形成し、次いでこの複合体は、高い親和性でＳＴＲＡ６受容体と結合して、ビタミンＡ取り込みを増加させる。別の例では、葉酸／葉酸化合物／ビタミンＢ_９が、高い親和性で細胞表面葉酸受容体（ＦＲ）、例えば、ＦＲαと結合する。ＦＲαと結合する葉酸または抗体は、卵巣腫瘍及び他の腫瘍で発現する葉酸受容体を標的とするのに利用することができる。また、ビタミンＤ及びその類似体は、ビタミンＤ受容体と結合する。

【0146】

他の実施形態において、細胞結合剤は、タンパク質もしくはポリペプチドであるか、またはタンパク質もしくはポリペプチドを含む化合物であり、これには、抗体、非抗体タンパク質、またはポリペプチドが含まれる。好ましくは、タンパク質またはポリペプチドは、側鎖−ＮＨ_２基を有する１つまたは複数のＬｙｓ残基を含む。Ｌｙｓ側鎖−ＮＨ_２基は、二官能性架橋剤と共有結合で連結することができ、次いで、二官能性架橋剤は、本発明の二量体化合物と連結することで、細胞結合剤と本発明の二量体化合物とをコンジュゲートさせることができる。各タンパク質系細胞結合剤は、二官能性架橋剤によって本発明の化合物を連結させるのに利用可能な複数のＬｙｓ側鎖−ＮＨ_２基を含有することができる。

【0147】

１つの実施形態において、骨髄細胞と結合するリガンド／増殖因子であるＧＭ−ＣＳＦを、急性骨髄性白血病の患部細胞に対して細胞結合剤として使用することができる。活性化Ｔ細胞と結合するＩＬ−２は、移植片移植拒絶の予防用、移植片対宿主病の治療及び予防用、ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療用に使用することができる。メラニン細胞と結合するＭＳＨは、抗体に黒色腫を対象とさせることができるため、黒色腫の治療用に使用することができる。上皮増殖因子は、扁平上皮癌、例えば肺及び頭頸部を標的とするのに使用することができる。ソマトスタチンは、神経芽細胞腫及び他の型の腫瘍を標的とするのに使用することができる。エストロゲン（またはエストロゲン類似体）は、乳癌を標的とするのに使用することができる。アンドロゲン（またはアンドロゲン類似体）は、精巣を標的とするのに使用することができる。

【0148】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子であってよい。
ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、抗体模倣物、例えば、アンキリン反復タンパク質、センチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、またはアドネクチン／モノボディなどである。

【0149】

他の実施形態において、細胞結合剤は、抗体、一本鎖抗体、標的細胞と特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、標的細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体断片（すなわち「抗原結合部分」）、キメラ抗体、標的細胞と特異的に結合するキメラ抗体断片（すなわち「抗原結合部分」）、ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ）、または標的細胞と特異的に結合するドメイン抗体断片である。

【0150】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、またはヒト化抗体断片（すなわち「抗原結合部分」）である。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、ｈｕＭｙ９−６または別の関連抗体であり、この抗体は、米国特許第７，３４２，１１０号及び同第７，５５７，１８９号に記載されている。別の特定の実施形態において、ヒト化抗体は、米国仮出願第６１／３０７，７９７号、同第６１／３４６，５９５号、及び同第６１／４１３，１７２号、ならびに米国出願第１３／０３３，７２３号（ＵＳ２０１２／０００９１８１ Ａ１として公開）に記載される抗葉酸受容体抗体である。これら出願の教示は全て、参照によりその全体が、本明細書中に援用される。

【0151】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、表面再構成抗体、表面再構成一本鎖抗体、表面再構成抗体断片（すなわち「抗原結合部分」）、または二重特異性抗体である。
ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、ミニボディ、アビボディ（ａｖｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ナノボディ、プロボディ（ｐｒｏｂｏｄｙ）、ドメイン抗体、またはユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）である。

【0152】

言い換えると、細胞結合剤の例として、抗体、一本鎖抗体、標的細胞と特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、標的細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、標的細胞と特異的に結合するキメラ抗体断片、二重特異性抗体、ドメイン抗体、標的細胞と特異的に結合するドメイン抗体断片、インターフェロン（例えば、α、β、γ）、リンホカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、及びＩＬ−６）、ホルモン（例えば、インシュリン、サイロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、及びステロイドホルモン（例えば、アンドロゲン及びエストロゲン）など）、ビタミン（例えば、葉酸化合物）、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ）、コロニー刺激因子、栄養輸送分子（例えば、トランスフェリン、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：９３２−９３７を参照、参照により本明細書中に援用される）、センチリン（フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復の共通配列に基づく足場タンパク質、米国特許公開第２０１０／０２５５０５６号、同第２０１０／０２１６７０８号、及び同第２０１１／０２７４６２３を参照、参照により本明細書中に援用される）、アンキリン反復タンパク質（例えば、ＤＡＲＰｉｎとして知られる設計されたアンキリン反復タンパク質、米国特許公開第２００４／０１３２０２８号、同第２００９／００８２２７４号、同第２０１１／０１１８１４６号、及び同第２０１１／０２２４１００（参照により本明細書中に援用される）を参照、また、Ｃ．Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１０）７０：１５９５−１６０５；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１（４６）：３５１６７−３５１７５、及びＢｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３：１２５７−１２６８（参照により本明細書中に援用される）を参照）、アンキリン様反復タンパク質または合成ペプチド（例えば、米国特許公開第２００７／０２３８６６７号、米国特許第７，１０１，６７５号、ＷＯ２００７／１４７２１３、及びＷＯ２００７／０６２４６６を参照、参照により本明細書中に援用される）、アドネクチン（フィブロネクチンドメイン足場タンパク質、米国特許公開第２００７／００８２３６５号、同第２００８／０１３９７９１号を参照、参照により本明細書中に援用される）、アビボディ（ダイアボディ、トリボディ、及びテトラボディを含む、米国出願公開第２００８／０１５２５８６号及び同第２０１２／０１７１１１５号を参照）、二重受容体再標的指向化（ＤＡＲＴ）分子（Ｐ．Ａ．Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１；１１７（１７）：４５４２−４５５１；Ｖｅｒｉ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，２０１０ Ｍａｒ ３０；６２（７）：１９３３−４３；Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１０ Ａｐｒ ９；３９９（３）：４３６−４９）、細胞透過性超荷電タンパク質（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０２，２９３−３１９（２０１２）、及び他の細胞結合分子または物質を挙げることができる。

【0153】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、標的細胞のある部分、例えば細胞表面受容体などと結合するリガンドであってもよい。例えば、リガンドは、増殖因子または増殖因子受容体と結合するその断片であってもよく、またはサイトカインまたはサイトカイン受容体と結合するその断片であってもよい。ある特定の実施形態において、増殖因子受容体またはサイトカイン受容体は、細胞表面受容体である。

【0154】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤が、抗体もしくはその抗原結合部分（抗体誘導体を含む）、またはある特定の抗体模倣物である場合、ＣＢＡは、標的細胞上のリガンド、例えば、細胞表面受容体をはじめとする細胞表面リガンドと結合することができる。

【0155】

抗原またはリガンドの具体例として、レニン、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン）、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（例えば、ｖｍｃ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びヴォン・ヴィレブランド因子）、抗凝固因子（例えば、プロテインＣ）、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性物質、プラスミノーゲン活性化因子（例えば、ウロキナーゼ、ヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子）、ボンベシン、トロンビン、造血性増殖因子、腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（すなわち、正常T細胞の発現及び分泌の活性化を制御する物質）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質−１−α、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン）、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、微生物性タンパク質（ベータ−ラクタマーゼ）、ＤＮＡ分解酵素、ＩｇＥ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４）、インヒビン、アクチビン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子の受容体、プロテインＡまたはＤ、リウマチ因子、神経栄養因子（例えば、骨由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６）または神経成長因子（例えば、ＮＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子受容体２、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、及びＴＧＦ−β５）、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子結合タンパク質、メラノトランスフェリン、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト、アルファ_ｖベータ_６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５、ＣＤタンパク質（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、及びＣＤ１５２）、１種または複数の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体（米国公開第２００８／０１７１０４０号または米国公開第２００８／０３０５０４４号を参照、そのまま全体が参照として援用される）、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質、インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータ、及びガンマ）、コロニー刺激因子（例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原（例えば、ＨＩＶの外被の一部）、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、及びＶＣＡＭ）、腫瘍関連抗原（例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４受容体）、エンドグリン、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−ｋｉｔ、１ＧＦ１Ｒ、ＰＳＧＲ、ＮＧＥＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＬＧＲ５、Ｂ７Ｈ４、ならびに前述のポリペプチドのいずれかの断片を挙げることができる。

【0156】

本明細書中で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、ジスルフィド結合により相互接続した４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲまたはＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲまたはＶＬ）及び軽鎖定常領域からなり、軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分化することができる。そのような領域が散在しているのは、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）である。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配列されている。

【0157】

ある特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭである。ある特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４であるか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２である。

【0158】

ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、モノクローナル抗体の「抗原結合部分」であり、この部分は、抗体と、抗原結合に不可欠な配列を共有している（例えば、米国特許第７，３４２，１１０号及び同第７，５５７，１８９号に記載のｈｕＭｙ９−６またはその関連抗体、これらは参照により本明細書中に援用される）。

【0159】

本明細書中で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」（場合によっては、同義で、「抗体断片」とも呼ぶ）という用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のある特定の断片によって発揮可能であることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例として、以下（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片（例えば、抗体をパパインで消化すると３つの断片、すなわち２つの抗原結合Ｆａｂ断片、及び抗原に結合しない１つのＦｃ断片が得られる：）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片（例えば、抗体をペプシンで消化すると２つの断片、すなわち二価の抗原結合Ｆ（ａｂ’）_２断片、及び抗原に結合しないｐＦｃ’断片が得られる）ならびにその関連Ｆ（ａｂ’）一価単位、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片（すなわち、Ｆａｂに含まれる重鎖の部分）、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片ならびに関連するジスルフィド連結したＦｖ、（ｖ）ｄＡｂ（ドメイン抗体）またはｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）（この断片は、ＶＨドメインからなる）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる（これらに限定されない）。ある特定の実施形態において、抗原結合部分は、ｓｄＡｂ（単一ドメイン抗体）である。

【0160】

ある特定の実施形態において、抗原結合部分はまた、ある特定の操作された誘導体または組換え誘導体（または「誘導体抗体」）も含む。この誘導体も、抗原と特異的に結合する能力を保持した、抗体の１つまたは複数の断片を含むものであるが、それだけでなく、天然に存在する抗体では見出され得ない要素または配列を含む。

【0161】

例えば、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によりコードされるが、標準的な組換え方法を用いて、それらを一本のタンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーにより１つにすることができ、そのタンパク質鎖においてＶＬ領域及びＶＨ領域は対になって一価分子を形成することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８を参照）。

【0162】

本明細書中に記載される全ての実施形態において、ｓｃＦｖのＮ末端は、ＶＨドメイン（すなわち、Ｎ−ＶＨ−ＶＬ−Ｃ）であっても、ＶＬドメイン（すなわち、Ｎ−ＶＬ−ＶＨ−Ｃ）であってもよい。

【0163】

二価（または二価）一本鎖可変断片（ジ−ｓｃＦｖ、ビ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結させることにより操作することができる。これにより、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖が生成されて、タンデムｓｃＦｖｓ（ｔａｓｃＦｖ）をもたらす。より多いタンデム反復、例えばトリ−ｓｃＦｖは、３つ以上のｓｃＦｖをヘッドトゥテール様式で連結することにより、同様に生成することができる。

【0164】

ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が折りたたまれて一緒になるには短すぎる（約５つのアミノ酸）リンカーペプチドを介して連結させることにより、ｓｃＦｖが二量体化させて、ダイアボディを形成させてもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８，１９９３；Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−１１２３，１９９４を参照）。ダイアボディは、二重特異性であっても一重特異性であってもよい。ダイアボディは、対応するｓｃＦｖより最大で４０倍低い解離定数を有する、すなわち、標的に対してさらにより高い親和性を有することが示されている。

【0165】

さらに短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）によって、三量体、いわゆるトリアボディまたはトリボディが形成される。テトラボディもまた、同様に生成されている。これらは、標的に対して、ダイアボディよりもさらに高い親和性を示す。ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディは、併せて、「ＡＶＩＢＯＤＹ（商標）」細胞結合剤（または簡単に「ＡＶＩＢＯＤＹ」）と呼ばれることもある。すなわち、２つ、３つ、または４つの標的結合領域（ＴＢＲ）を有するＡＶＩＢＯＤＹは、一般に、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディとして知られる。例えば、詳細については米国公開第２００８／０１５２５８６号及び同第２０１２／０１７１１１５号を参照されたい。これらの全教示は、参照により本明細書中に援用される。

【0166】

これらの形式の全てが、２種以上の異なる抗原に対する特異性をもつ可変性断片から構成することが可能であり、そのような場合、それらは、二重または多重特異性抗体の種類のものである。例えば、ある特定の二重特異性タンデムジ−ｓｃＦｖ、は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）として知られる。

【0167】

ある特定の実施形態において、タンデムｓｃＦｖまたはダイアボディ／トリアボディ／テトラボディの各ｓｃＦｖは、同一のまたは異なる結合特性を有してもよく、また、それぞれ独立して、Ｎ末端ＶＨを有してもＮ末端ＶＬを有してもよい。

【0168】

また、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）はまた、ヒトＩｇＧＦｃ部分などのＦｃ部分と融合して、ＩｇＧ様性質を有することができるが、それでもなお、それらは単一の遺伝子によりコードされたままである。そのようなｓｃＦｖ−Ｆｃタンパク質を哺乳類で一時的に産生することにより、容易にミリグラム量をもたらすことができるため、この誘導体抗体形式は、多くの研究用途に特に適している。

【0169】

Ｆｃａｂは、抗体のＦｃ定常領域から操作された抗体断片である。Ｆｃａｂは、可溶性タンパク質として発現することができるか、またはＦｃａｂは、操作してＩｇＧなどの全長抗体に戻すことにより、ｍＡｂ２を作製することができる。ｍＡｂ２は、正常Ｆｃ領域の代わりにＦｃａｂを有する全長抗体である。これらの追加結合部位を用いて、ｍＡｂ２二重特異性モノクローナル抗体は、同時に異なる２つの標的と結合することができる。

【0170】

ある特定の実施形態において、操作された抗体誘導体では、機能には必須ではないと考えられるドメインを除去することにより生成された抗原結合Ｉｇ由来組換えタンパク質の大きさが縮小している（全長ｍＡｂの「小型化」）。その最も好適な例の１つは、ＳＭＩＰである。

【0171】

小モジュール式免疫薬剤、すなわちＳＭＩＰは、主に抗体部分（免疫グロブリン）から構築された人造タンパク質であり、医薬品としての使用を対象とするものである。ＳＭＩＰは、抗体と同様の生物学的半減期を有するが、抗体よりも小さく、したがって、より良い組織透過性質を有し得る。ＳＭＩＰは、１つの結合領域、コネクターとしての１つのヒンジ領域、及び１つのエフェクタードメインを含む一本鎖タンパク質である。結合領域は、修飾された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、タンパク質の残りの部分は、抗体のＦｃ（ＣＨ２、及びエフェクタードメインとしてのＣＨ３など）、及びヒンジ領域、例えばＩｇＧ１から構築することができる。遺伝子修飾された細胞は、実際の抗体より約３０％小さいＳＭＩＰを抗体様二量体として産生する。

【0172】

そのように操作された小型化抗体の別の例は、「ユニボディ」であり、ユニボディでは、ヒンジ領域がＩｇＧ４分子から取り除かれている。ＩｇＧ４分子は、不安定であり、軽鎖重鎖ヘテロ二量体を互いに交換することができる。ヒンジ領域の削除により、重鎖重鎖対形成が完全に阻止され、Ｆｃ領域が保持されてｉｎ ｖｉｖｏでの安定性及び半減期が確保されながら、高度に特異的な一価軽鎖／重鎖ヘテロ二量体が残される。

【0173】

単一ドメイン抗体（Ａｂｌｙｎｘによりナノボディと呼ばれるものが挙げられるが、これらに限定されないｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。単一ドメイン抗体は、全抗体と同様、特定の抗原に選択的に結合することが可能であるが、その分子量がわずか１２〜１５ｋＤａであるため、さらにより小さい。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、重鎖抗体（ｈｃＩｇＧ）から操作されたものである。第１のそのようなｓｄＡｂは、ラクダで見出されたｈｃＩｇＧに基づき操作されたもので、Ｖ_ＨＨ断片と呼ばれる。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、Ｖ_ＮＡＲ断片を用いて、ＩｇＮＡＲ（「免疫グロブリン新規抗原受容体」、以下を参照）から操作されたものである。軟骨魚類（サメなど）は、そのような重鎖ＩｇＮＡＲ抗体を有する。ある特定の実施形態においてｓｄＡｂは、共通免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の二量体可変ドメイン、例えばヒトまたはマウス由来のものを、単量体へと分割することにより操作されたものである。ある特定の実施形態において、ナノボディは、重鎖可変ドメインに由来する。ある特定の実施形態において、ナノボディは、軽鎖可変ドメインに由来する。ある特定の実施形態において、ｓｄＡｂは、標的抗原に対する結合剤について、単一ドメイン重鎖配列（例えば、ヒト単一ドメインＨＣ）のライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。

【0174】

単一可変新規抗原受容体ドメイン抗体断片（Ｖ_ＮＡＲ、またはＶ_ＮＡＲドメイン）は、軟骨魚類（例えば、サメ）免疫グロブリン新規抗原受容体抗体（ＩｇＮＡＲ）に由来する。既知の免疫グロブリン系足場タンパク質の中でもっとも小さなものの１つであることから、そのような単一ドメインタンパク質は、望ましい大きさ及び潜在的なエピトープを認識する性質を示す。成熟ＩｇＮＡＲ抗体は、１つの可変新規抗原受容体（Ｖ_ＮＡＲ）ドメイン及び５つの定常新規抗原受容体（Ｃ_ＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなる。この分子は安定性が高く、効率的な結合特性をもつ。その固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体で見出されれる従来の抗体ＶＨドメイン及びＶＬドメインと比較して相当数の荷電した親水性表面露出残基を提供する基礎のＩｇ足場、ならびに（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋及びループ内水素結合のパターンを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ中の構造的な安定化特性の両方に起因する可能性が高い。

【0175】

ミニボディは、ＣＨドメイン、例えば、ＣＨ３γ１（ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン）またはＣＨ４ε（ＩｇＥのＣＨ４ドメイン）と連結したｓｃＦｖを含む操作された抗体断片である。例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的なｓｃＦｖをＣＨ３γ１に連結させて、ミニボディを作製する。このミニボディはすでに、ｉｎ ｖｉｖｏでの急速クリアランスに加え、優れた腫瘍標的指向性を有することが実証されている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１，１９９６）。ｓｃＦｖは、Ｎ末端ＶＨまたはＶＬを有してもよい。連結は、非共有結合性の無ヒンジミニボディをもたらす短いペプチド（例えば、ＶａｌＧｌｕなど２つのアミノ酸のリンカー）であってもよい。代替として、連結は、共有結合性のヒンジミニボディを生成するＩｇＧ１ヒンジ及びＧｌｙＳｅｒリンカーペプチドであってもよい。

【0176】

天然の抗体は、単一特異性であるが、２つの同一の抗原結合ドメインを発現する点で、二価である。対照的に、ある特定の実施形態において、ある特定の操作された抗体誘導体は、２つ以上の異なる抗原結合ドメインを有する二重特異性分子または多重特異性分子であり、抗原結合ドメインはそれぞれ異なる標的特異性を有する。二重特異性抗体は、それぞれ異なる特異性をもつ２つの抗体産生細胞を融合させることにより生成することができる。これらの「クアドローマ」は、２本の別個の軽鎖及び２本の別個の重鎖が、クアドローマ中の多様な配置で自由に組換えを行うことから、複数の分子種を産生した。それ以来、二重特異性Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、及びフルサイズｍＡｂは、様々な技術を用いて産生されてきた（上記参照）。

【0177】

二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ）タンパク質は、２つの抗原／エピトープを同時に標的とする二重特異性ＩｇＧの１種である（ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．８９９：１４５−５６，２０１２）。この分子は、従来のＩｇＧと同様な配置でＦｃ領域及び定常領域を含有する。しかしながら、ＤＶＤ−Ｉｇタンパク質は、分子の各アームが、２つの可変ドメイン（ＶＤ）を含有する点で、独特である。アームの中のＶＤは、タンデムで連結されており、異なる結合特異性をもつことが可能である。

【0178】

三重特異性抗体誘導体分子もまた、例えば、２つの異なるＦａｂ及び１つのＦｃを有する二重特異性抗体を発現させることにより、産生させることができる。１つの例は、ＢｉＵＩＩと呼ばれる、マウスＩｇＧ２ａ抗Ｅｐ−ＣＡＭ、ラットＩｇＧ２ｂ抗ＣＤ３クアドローマであり、これは、Ｅｐ−ＣＡＭ発現腫瘍細胞、ＣＤ３発現Ｔ細胞、及びＦＣγＲＩ発現マクロファージの共存を可能にし、したがって免疫細胞の同時刺激及び抗腫瘍機能を増強すると考えられる。

【0179】

プロボディは、健康な組織中では不活性な状態であるあるが、特に疾患微小環境で活性化する（例えば、疾患微小環境に豊富なまたは特異的なプロテアーゼによるプロテアーゼ切断によって）完全な組換えのマスクされたモノクローナル抗体である。Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ５：２０７ｒａ１４４，２０１３を参照。同様なマスキング技法を、本明細書中に記載される任意の抗体またはその抗原結合部分に使用することができる。

【0180】

イントラボディは、細胞内で活動して細胞内抗原に結合するために、細胞内に局在するよう修飾されている抗体である。イントラボディは、細胞質にとどまっていてもよく、または核局在化シグナルを有していてもよく、またはＥＲ標的指向化のためのＫＤＥＬ配列を有していてもよい。イントラボディは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよく、超安定性をもつ修飾された免疫グロブリンＶＬドメインであってもよく、より還元性の高い細胞内環境に対して耐性のある選択された抗体であってもよく、またはマルトース結合タンパク質もしくは他の安定細胞内タンパク質との融合タンパク質として発現されてもよい。そのような最適化は、イントラボディの安定性及び構造を改善しているものであり、本明細書中に記載される任意の抗体またはその抗原結合部分に対して概して応用可能である。

【0181】

本発明の抗原結合部分または誘導体抗体は、それらの由来元／操作元である抗体と比較して、実質的に同じまたは同一の（１）軽鎖及び／もしくは重鎖ＣＤＲ３領域、（２）軽鎖及び／もしくは重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域、または（３）軽鎖及び／もしくは重鎖領域を有してもよい。これらの領域内の配列には、保存的アミノ酸置換が含有されていてもよく、そのような置換として、ＣＤＲ領域内の置換が挙げられる。ある特定の実施形態において、１、２、３、４、または５つ以下の保存的置換が存在する。代替として、抗原結合部分または誘導体抗体は、それらの由来元／操作元である抗体と少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一である軽鎖領域及び／または重鎖領域を有する。これらの抗原結合部分または誘導体抗体は、抗体と比較して、標的抗原に対して実質的に同じ結合特異性及び／または親和性を有する場合がある。ある特定の実施形態において、抗原結合部分または誘導体抗体のＫ_ｄ及び／またはｋ_ｏｆｆ値は、本明細書中に記載される抗体の、１０倍（高いまたは低い）、５倍（高いまたは低い）、３倍（高いまたは低い）、または２倍（高いまたは低い）の範囲内のものである。

【0182】

ある特定の実施形態において、抗原結合部分または誘導体抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体に由来／から操作されてもよく、当該分野で認識された任意の方法に従って産生されてよい。

【0183】

モノクローナル抗体技法によって、特異的モノクローナル抗体の形で非常に特異的な細胞結合剤を生成することができる。当該分野で特によく知られているのは、マウス、ラット、ハムスター、または他の任意の動物を、目的の抗原、例えば無傷の標的細胞、標的細胞から単離した抗原、全ウイルス、弱毒化全ウイルス、及びウイルスコートタンパク質などのウイルスタンパク質などで免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体を作製する技法である。感作されたヒト細胞も使用することができる。モノクローナル抗体を作製する別の方法は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）、特にヒトｓｃＦｖのファージライブラリの使用である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８８５，７９３号及び同第５，９６９，１０８号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、Ｌｉｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／０６５８７を参照）。また、米国特許第５，６３９，６４１号に開示される表明再構成抗体もまた、キメラ抗体及びヒト化抗体として使用することができる。

【0184】

また、細胞結合剤は、ファージディスプレイ（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１１）１０８（１７），６９０９−６９１４を参照）またはペプチドライブラリ技法（例えば、Ｄａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．（２００９）８（５）：１３１２−１３１８を参照）に由来するペプチドであってもよい。

【0185】

ある特定の実施形態において、本発明のＣＢＡは、抗体模倣物、例えば、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アフィリン、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎ）、アンチカリン、アビマー、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、またはナノフィチン（ｎａｎｏｆｉｔｉｎ）なども含む。

【0186】

本明細書中で使用される場合、「ＤＡＲＰｉｎ」及び「（設計された）アンキリン反復タンパク質」という用語は、同義で使用され、優先的（場合によっては特異的）標的結合を典型的に示す遺伝子操作されたある特定の抗体模倣タンパク質を指す。標的は、タンパク質、炭水化物、または他の化学成分でもよく、結合親和性は、かなり高い可能性がある。ＤＡＲＰｉｎは、天然のアンキリン反復含有タンパク質に由来するものでもよく、好ましくは、これらタンパク質の少なくとも３つ、通常は４つまたは５つのアンキリン反復モチーフ（典型的には、各アンキリン反復モチーフに３３の残基がある）からなる。ある特定の実施形態において、ＤＡＲＰｉｎは、約４または５反復を含有し、それぞれ、約１４または１８ｋＤａの分子量を有する場合がある。ピコモル親和性及び特異性で所望の標的と結合する（例えば、受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、インバースアゴニスト、酵素阻害剤、または単純標的タンパク質結合剤として作用する）ＤＡＲＰｉｎを選択する際に使用する目的で、リボソームディスプレイまたはシグナル認識粒子（ＳＲＰ）ファージディスプレイなど様々な技法を用いて、１０^１２を超える変異体の多様性を有する標的候補との相互作用残基がランダム化されたＤＡＲＰｉｎのライブラリーをＤＮＡレベルで作成することができる。例えば、ＤＡＲＰｉｎ調製については、米国特許公開第２００４／０１３２０２８号、同第２００９／００８２２７４号、同第２０１１／０１１８１４６号、及び同第２０１１／０２２４１００、ＷＯ０２／２０５６５、及びＷＯ０６／０８３２７５（これらの全教示は、参照により本明細書中に援用される）、またＣ． Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７０：１５９５−１６０５； Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１（４６）：３５１６７−３５１７５、及びＢｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１２５７−１２６８（全てが参照により本明細書中に援用される）を参照。また、関連するアンキリン様反復タンパク質または合成ペプチドについて、米国特許公開第２００７／０２３８６６７号、米国特許第７，１０１，６７５号、ＷＯ２００７／１４７２１３、及びＷＯ２００７／０６２４６６を参照（これらの全教示は、参照により本明細書中に援用される）。

【0187】

アフィボディ分子は、多数の標的タンパク質またはペプチドに高い親和性で結合し、したがってモノクローナル抗体を模倣するように操作された小タンパク質である。アフィボディは、５８のアミノ酸を有する３本のアルファ螺旋からなり、分子量が約６ｋＤａである。アフィボディは、高温（９０℃）または酸性及びアルカリ性条件（ｐＨ２．５もしくはｐＨ１１）に耐えることが示されており、サブナノモル範囲まで低下した親和性をもつ結合剤はナイーブライブラリー選択から得られており、またピコモル親和性をもつ結合剤は、親和性成熟後に得られている。ある特定の実施形態において、アフィボディは、標的と共有結合するために、弱い求電子剤とコンジュゲートしている。

【0188】

モノボディ（アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）としても知られる）は、抗原と結合することができる遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。ある特定の実施形態において、モノボディは、９４のアミノ酸からなり、分子量が約１０ｋＤａである。モノボディは、ヒトフィブロネクチン、より詳細にはヒトフィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造に基づいており、このドメインは、抗体可変ドメインと同様な構造を有しており、バレルを形成する７つのベータシートを有し、かつ３つの相補性決定領域に対応して各側に３つの露出したループを有する。ＢＣループ（第２ベータシートと第３ベータシートとの間）及びＦＧループ（第６ベータシートと第７ベータシートとの間）を修飾することにより、様々なタンパク質に対する特異性をもつモノボディを調整することができる。

【0189】

トリボディは、マウス及びヒトの軟骨基質タンパク質（ＣＭＰ）のＣ末端コイルドコイル領域に基づいて設計された自己集合化抗体模倣物であり、自己集合して平行三量体複合体になる。トリボディは、特定の標的結合部分とＣＭＰ由来の三量体化ドメインとを融合させることにより作製された高度に安定な三量体標的指向リガンドである。得られる融合タンパク質は、効率的に自己集合して、明確に定義された高い安定性の平行ホモ三量体になることができる。三量体標的指向リガンドの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析から、対応する単量体と比較して標的結合強度が顕著に向上していることが実証された。細胞結合試験から、そのようなトリボディは、それらの受容体それぞれに対して優れた結合強度を有することが確認された。

【0190】

センチリンは、コンセンサスＦＮ３ドメイン配列のフレームワークに構築されたライブラリーを使用して得ることができる別の抗体模倣物である（Ｄｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．，２０１４）。このライブラリーは、ＦＮ３ドメインのＣ鎖、ＣＤループ、Ｆ鎖、及びＦＧループ内の様々な位置を利用し、高親和性センチリン変異体を特定の標的に対して選択することができる。

【0191】

１つの実施形態において、細胞結合剤は、抗葉酸受容体抗体である。より詳細には、抗葉酸受容体抗体は、ヒト葉酸受容体１（葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）としても知られる）と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片である。「ヒト葉酸受容体１」、「ＦＯＬＲ１」、または「葉酸受容体アルファ（ＦＲ−α）」という用語は、本明細書中で使用される場合、別途特に記載がない限り、任意の天然のヒトＦＯＬＲ１を指す。すなわち、これらの用語全てが、本明細書中で示されるタンパク質または核酸配列いずれかを指すことができる。「ＦＯＬＲ１」という用語は、「全長」未処理ＦＯＬＲ１、及び細胞内でのプロセシングにより得られた任意の形態のＦＯＬＲ１を包含する。ＦＯＬＲ１抗体は、（ａ）ＧＹＦＭＮ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＸａａ_１ＦＸａａ_２Ｘａａ_３（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＹＤＧＳＲＡＭＤＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、ならびに（ｂ）ＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＡ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＱＱＳＲＥＹＰＹＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３（式中、Ｘａａ_１は、Ｋ、Ｑ、Ｈ、及びＲから選択され、Ｘａａ_２は、Ｑ、Ｈ、Ｎ、及びＲから選択され、Ｘａａ_３は、Ｇ、Ｅ、Ｔ、Ｓ、Ａ、及びＶから選択される）を含む。好ましくは、重鎖ＣＤＲ２配列は、ＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号７）を含む。

【0192】

別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、以下のアミノ酸配列

【0193】

【化37】

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【0194】

を有する重鎖を含む。
別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、２０１０年４月７日付でＡＴＣＣに寄託された、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされるヒト化抗体またはその抗原結合断片である。

【0195】

別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、以下のアミノ酸配列：

【0196】

【化38】

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【0197】

または

【0198】

【化39】

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【0199】

を有する軽鎖を含む。
別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましくは、抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む（ｈｕＦＯＬＲ１）。

【0200】

別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、２０１０年４月７日付でＡＴＣＣに寄託された、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７７２及びＰＴＡ−１０７７３または１０７７４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされるヒト化抗体またはその抗原結合断片である。

【0201】

別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、ヒト葉酸受容体１と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合断片であり、
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＦＭＮＷＶＫＱＳＰＧＱＳＬＥＷＩＧＲＩＨＰＹＤＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＮＴＡＨＭＥＬＬＳＬＴＳＥＤＦＡＶＹＹＣＴＲＹＤＧＳＲＡＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１１）と少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一である重鎖可変ドメイン、及び
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＮＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１２）、または
ＤＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＡＶＳＬＧＱＰＡＩＩＳＣＫＡＳＱＳＶＳＦＡＧＴＳＬＭＨＷＹＨＱＫＰＧＱＱＰＲＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＡＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＫＴＤＦＴＬＴＩＳＰＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＳＲＥＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号１３）と少なくとも約９０％、９５％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変ドメインを含む。

【0202】

別の実施形態において、抗葉酸受容体抗体は、ｈｕＭｏｖ１９またはＭ９３４６Ａである（例えば、米国特許第８，７０９，４３２号、米国特許第８，５５７，９６６号、及びＷＯ２０１１１０６５２８を参照、参照により全て本明細書中に援用される）。

【0203】

別の実施形態において、細胞結合剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗体断片である。１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１２０５８５９２（参照により本明細書中に援用される）に記載される抗体をはじめとする非アンタゴニスト抗体である。別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、非機能性抗体、例えば、ヒト化ＭＬ６６またはＥＧＦＲ−８である。より詳細には、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＭＬ６６である。

【0204】

さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。本明細書中で使用される場合、二重線を引いた配列は、重鎖配列または軽鎖配列の可変領域（すなわち、重鎖可変領域すなわちＨＣＶＲ、及び軽鎖可変領域すなわちＬＣＶＲ）を表し、太字の配列は、ＣＤＲ領域（すなわち、重鎖または軽鎖配列のＮ末端からＣ末端に向かって、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を表す。

【0205】

【表1-1】

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【0206】

さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくは、ＥＧＦＲと特異的に結合する。

【0207】

さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１４と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号１５と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＥＧＦＲと特異的に結合する。

【0208】

別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、８，７９０，６４９及びＷＯ２０１２／０５８５８８に記載される抗体であり、これらは参照により援用される。１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＥＧＦＲ−７Ｒ抗体である。

【0209】

１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、

【0210】

【化40】

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【0211】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び

【0212】

【化41】

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【0213】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域、または

【0214】

【化42】

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【0215】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。
別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。

【0216】

別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。

【0217】

さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３及び／または、配列番号１７または１８の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＥＧＦＲと特異的に結合する。

【0218】

さらに別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号１６と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号１７または１８と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＥＧＦＲと特異的に結合する。

【0219】

別の実施形態において、細胞結合剤は、抗ＣＤ１９抗体、例えば米国特許第８，４３５，５２８号及びＷＯ２００４／１０３２７２（参照により援用される）に記載されるものなどである。１つの実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、

【0220】

【化43】

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【0221】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び

【0222】

【化44】

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【0223】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。
別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、ｈｕＢ４抗体である。
さらに別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＣＤ１９と特異的に結合する。

【0224】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１９と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号２０と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＣＤ１９と特異的に結合する。

【0225】

さらに別の実施形態において、細胞結合剤は、抗Ｍｕｃ１抗体、例えば米国特許第７，８３４，１５５号、ＷＯ２００５／００９３６９、及びＷＯ２００７／０２４２２２（参照により本明細書中に援用される）に記載されるものなどである。１つの実施形態において、抗Ｍｕｃ１抗体は、

【0226】

【化45】

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【0227】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び

【0228】

【化46】

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【0229】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。
別の実施形態において、抗Ｍｕｃ１抗体は、ｈｕＤＳ６抗体である。
さらに別の実施形態において、抗Ｍｕｃ１抗体は、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＭｕｃ１と特異的に結合する。

【0230】

さらに別の実施形態において、抗Ｍｕｃ１抗体は、配列番号２１と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号２２と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＭｕｃ１と特異的に結合する。

【0231】

別の実施形態において、細胞結合剤は、抗ＣＤ３３抗体またはその断片、例えば米国特許第７，５５７，１８９号、同第７，３４２，１１０号、同第８，１１９，７８７号、及び同第８，３３７，８５５号、ならびにＷＯ２００４／０４３３４４（参照により本明細書中に援用される）に記載される抗体またはその断片などである。別の実施形態において、抗ＣＤ３３抗体は、ｈｕＭｙ９−６抗体である。

【0232】

１つの実施形態において、抗ＣＤ３３抗体は、

【0233】

【化47】

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【0234】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、及び以下

【0235】

【化48】

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【0236】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域を含む。
さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号２３の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＣＤ３３と特異的に結合する。

【0237】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号２３と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号２４と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＣＤ３３と特異的に結合する。

【0238】

別の実施形態において、細胞結合剤は、抗ＣＤ３７抗体またはその断片、例えば米国特許第８，７６５，９１７号及びＷＯ２０１１／１１２９７８（参照により本明細書中に援用される）に記載される抗体またはその抗体断片などである。１つの実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、ｈｕＣＤ３７−３抗体である。

【0239】

１つの実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、

【0240】

【化49】

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【0241】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域、及び

【0242】

【化50】

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【0243】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域、または

【0244】

【化51】

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【0245】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域を含む。
別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域を含む。

【0246】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域、及び配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域を含む。

【0247】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２６または２７の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＣＤ３７と特異的に結合する。

【0248】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２６または２７と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号２５と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＣＤ３７と特異的に結合する。

【0249】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、

【0250】

【化52】

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【0251】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン軽鎖領域、及び

【0252】

【化53】

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【0253】

のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖領域を含む。
さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３、及び／または配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１−ＣＤＲ３を含み、好ましくはＣＤ３７と特異的に結合する。

【0254】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、配列番号２９と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列、及び／または配列番号２８と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一である軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列を含み、好ましくはＣＤ３７と特異的に結合する。

【0255】

さらに別の実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、ｈｕＣＤ３７−５０抗体である。
細胞結合剤薬物コンジュゲート
本発明はまた、様々なリンカーを介して１つまたは複数の本発明の細胞障害性化合物と連結した細胞結合剤を含む、細胞結合剤薬物コンジュゲートも提供し、リンカーとしてジスルフィドリンカー、チオエーテルリンカー、アミド結合リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、酸不安定性リンカー、エステラーゼ不安定性リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0256】

第２の実施形態において、本発明は、細胞障害性化合物及び細胞結合剤（ＣＢＡ）以下を含むコンジュゲートを提供する。この細胞障害性化合物は、ＣＢＡと共有結合で連結しており、かつ構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、または（ＶＩ’）（式中、可変要素は上記のるとおりである）で表される。

【0257】

ある特定の実施形態において、細胞障害性化合物は、構造式（Ｉ’）またはその薬学上許容される塩で表される。
ある特定の実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうち１つは、式（Ａ’）：
−Ｚ_１−Ｐ−Ｚ_２−Ｒ_ｘ−Ｊ’（Ａ’）、
で表され、その他のは、−Ｈ、炭素原子を１〜６個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキル、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_６）アルコキシ、または−ＮＯ_２である。詳細には、Ｌ’、Ｌ’’、及びＬ’’’のうち１つは、式（Ａ’）で表され、その他は−Ｈである。

【0258】

第１の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｌ’は、式（Ａ’）により表され、Ｌ’’及びＬ’’’は、いずれも−Ｈであり、残りの可変要素は、第１の実施形態で上記したとおりである。

【0259】

第２の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｒ_ｘは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑで随意に置換される、炭素原子を１〜６個有する直鎖、分岐鎖、もしくは環状のアルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１の特定実施形態で上記したとおりである。

【0260】

ある特定の実施形態において、Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、またはその薬学上許容される塩、あるいは、ｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻もしくは−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンであり、残りの可変要素は、第２の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である。

【0261】

第３の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｊ’は、ＣＢＡと共有結合で連結した部分を含み、かつ−ＮＲ^ｃ１または−Ｃ（＝Ｏ）−であり、式中、Ｒ^ｃ１は、−Ｈであるか、またはハロゲン、−ＯＨ、もしくは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシで随意に置換される、炭素原子を１〜４個有する直鎖もしくは分岐鎖のアルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１もしくは第２の特定実施形態で上記したとおりである。

【0262】

ある特定の実施形態において、Ｊ’は、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、残りの可変要素は、第３の特定実施形態で上記したとおりである。
第４の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ’（Ｂ１’）、
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ’（Ｂ２’）、
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｊ’（Ｃ１’）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−Ｃｙ−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ’−Ｊ’（Ｃ２’）、
により表され、式中、
Ｊ’は、−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
ｍ’は、０であるか、または１〜６の整数であり、
Ｃｙは、ハロゲン、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシ、またはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルで随意に置換される、環炭素原子を５または６個有する環状アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態、または第１、第２もしくは第３の特定実施形態で上記したとおりである。

【0263】

ある特定の実施形態において、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれもＨであり、式（Ｂ２’）及び（Ｃ２’）では、Ｃｙは、シクロヘキサンであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅであり、残りの可変要素は、第４の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、式（Ｂ２’）及び（Ｃ２’）のｍ’は、０または１である。

【0264】

第５の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｌ’は、以下の式：
−ＮＲ_５−Ｐ−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ１（Ｂ３’）、または
−Ｃ（＝Ｏ）−Ｐ−ＮＲ_５−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−Ｓ−Ｚ^ｓ１（Ｃ３’）、
により表され、式中、
Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、それぞれ存在する場合、それぞれ独立して、−Ｈ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または荷電置換基もしくはイオン化可能な基Ｑであり、
ｍは、１〜６の整数であり、
Ｚ^ｓ１は、以下の式：

【0265】

【化54】

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【0266】

のいずれか１つから選択され、式中、
ｑは、１〜５の整数であり、
ｎ’は、２〜６の整数であり、
Ｕは、−ＨまたはＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、薬学上許容されるカチオン（例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋）であり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、もしくは第４の特定実施形態で上記したとおりである。

【0267】

ある特定の実施形態において、荷電置換基またはイオン化可能な基Ｑは、ｉ）−ＳＯ_３Ｈ、−Ｚ’−ＳＯ_３Ｈ、−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＯＰＯ_３Ｈ_２、−ＰＯ_３Ｈ_２、−Ｚ’−ＰＯ_３Ｈ_２、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｚ’−ＣＯ_２Ｈ、−ＮＲ_１１Ｒ_１２、もしくは−Ｚ’−ＮＲ_１１Ｒ_１２、またはその薬学上許容される塩、あるいは、ｉｉ）−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻もしくは−Ｚ’−Ｎ^＋Ｒ_１４Ｒ_１５Ｒ_１６Ｘ⁻であり、Ｚ’は、随意に置換されるアルキレン、随意に置換されるシクロアルキレン、または随意に置換されるフェニレンであり、Ｒ_１４〜Ｒ_１６は、それぞれ独立して、随意に置換されるアルキルであり、Ｘ⁻は、薬学上許容されるアニオンであり、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｑは、−ＳＯ_３Ｈまたはその薬学上許容される塩である。

【0268】

ある特定の実施形態において、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、いずれも−Ｈであり、Ｒ_５は、ＨまたはＭｅであり、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。
ある特定の実施形態において、−（ＣＲ_ａＲ_ｂ）_ｍ−は、−（ＣＨ_２）_ｍ’’−Ｃ（Ｍｅ_２）−であり、ｍ’’は、１〜５の整数であり、残りの可変要素は、第５の特定実施形態で上記したとおりである。

【0269】

第６の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｐは、２〜１０のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、もしくは第５の特定実施形態で上記したとおりである。

【0270】

ある特定の実施形態において、Ｐは、２〜５のアミノ酸残基を含有するペプチドであり、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。
ある特定の実施形態において、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｌｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｍｅｔ−Ａｌａから選択され、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0271】

ある特定の実施形態において、Ｐは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａであり、残りの可変要素は、第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0272】

第７の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ）について、ＮとＣの間の二重線

【0273】

【化55】

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【0274】

は、二重結合を表し、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の特定実施形態で上記したとおりである。
第８の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、ＮとＣの間の二重線

【0275】

【化56】

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【0276】

は、単結合を表し、Ｘは、−Ｈまたはアミン保護基であり、Ｙは、−Ｈ、−ＯＲ、−ＯＣＯＲ’、−ＳＲ、−ＮＲ’Ｒ’’、随意に置換される５員もしくは６員の窒素含有複素環、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯ_２Ｈ、及びＯＳＯ_３Ｈから選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、もしくは第７の特定実施形態で上記したとおりである。

【0277】

ある特定の実施形態において、Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＯＥｔ、または−ＮＨＯＨから選択され、式中、Ｍは、−Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、残りの可変要素は、第８の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｙは、−Ｈ、−ＳＯ_３Ｍ、または−ＯＨである。

【0278】

第９の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、炭素原子を１〜１０個有する随意に置換される直鎖、分岐鎖、または環状のアルキニル、アルケニル、またはアルキニル、及びフェニルからなる群より選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、もしくは第８の特定実施形態で上記したとおりである。

【0279】

ある特定の実施形態において、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはフェニルであり、残りの可変要素は、第９の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｘ’は、−Ｈ、−ＯＨ、または−Ｍｅである。さらにより詳細には、Ｘ’は、−Ｈである。

【0280】

第１０の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｙ’は、−Ｈ、オキソ基、（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、またはハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、もしくは第９の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｙ’は、−Ｈまたはオキソである。さらにより詳細には、Ｙ’は−Ｈである。

【0281】

第１１の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ_５−、及びオキソ−（Ｃ＝Ｏ）−から選択され、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、もしくは第１０の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ａ及びＡ’は、同一であるか異なっていて、−Ｏ−及びＳ−から選択される。さらにより詳細には、Ａ及びＡ’は−Ｏ−である。

【0282】

第１２の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、もしくは第１１の特定実施形態で上記したとおりである。

【0283】

第１３の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、独立して、−Ｈ、ハロゲン、−ＮＯ_２、−ＯＨ、（Ｃ_１−Ｃ_３-）アルキル、ハロ（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキル、または（Ｃ_１−Ｃ_３）アルコキシであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、もしくは第１２の特定実施形態で上記したとおりである。より詳細には、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈである。

【0284】

第１４の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ_５は、それぞれ独立して、−Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_３）アルキルであり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、もしくは第１３の特定実施形態で上記したとおりである。

【0285】

第１４の特定実施形態において、構造式（Ｉ’）、（ＩＩ’）、（ＩＩＩ’）、（ＩＶ’）、（Ｖ’）、及び（ＶＩ’）では、ＮとＣの間の二重線

【0286】

【化57】

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【0287】

は、単結合または二重結合を表すが、ただし、二重線が二重結合である場合、Ｘは存在せず、かつＹは−Ｈであり、二重線が単結合である場合には、Ｘは−Ｈであり、Ｙは−ＯＨまたは−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_１’、Ｒ_２’、Ｒ_３’、及びＲ_４’は、全て−Ｈであり、
Ｒ_６は、−ＯＭｅであり、
Ｘ’及びＹ’は、いずれも−Ｈであり、
Ａ及びＡ’は、−Ｏ−であり、
Ｍは、Ｈ、Ｎａ^＋、またはＫ^＋であり、残りの可変要素は、第１の実施形態または第１、第２、第３、第４、第５、もしくは第６の特定実施形態で上記したとおりである。

【0288】

第１５の特定実施形態において、本発明のコンジュゲートは、以下の構造式：

【0289】

【化58】

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【0290】

【化59】

[この文献は図面を表示できません]

【0291】

【化60】

[この文献は図面を表示できません]

【0292】

【化61-1】

[この文献は図面を表示できません]

【0293】

【化61-2】

[この文献は図面を表示できません]

【0294】

【化62】

[この文献は図面を表示できません]

【0295】

【化63】

[この文献は図面を表示できません]

【0296】

【化64】

[この文献は図面を表示できません]

【0297】

【化65】

[この文献は図面を表示できません]

【0298】

【化66】

[この文献は図面を表示できません]

【0299】

【化67】

[この文献は図面を表示できません]

【0300】

【化68】

[この文献は図面を表示できません]

【0301】

【化69】

[この文献は図面を表示できません]

【0302】

【化70】

[この文献は図面を表示できません]

【0303】

【化71】

[この文献は図面を表示できません]

【0304】

【化72】

[この文献は図面を表示できません]

【0305】

【化73】

[この文献は図面を表示できません]

【0306】

【化74】

[この文献は図面を表示できません]

【0307】

【化75】

[この文献は図面を表示できません]

【0308】

【化76】

[この文献は図面を表示できません]

【0309】

【化77】

[この文献は図面を表示できません]

【0310】

【化78】

[この文献は図面を表示できません]

【0311】

【化79】

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【0312】

【化80】

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【0313】

【化81】

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【0314】

【化82】

[この文献は図面を表示できません]

【0315】

【化83】

[この文献は図面を表示できません]

【0316】

【化84】

[この文献は図面を表示できません]

【0317】

【化85】

[この文献は図面を表示できません]

【0318】

【化86】

[この文献は図面を表示できません]

【0319】

【化87】

[この文献は図面を表示できません]

【0320】

【化88】

[この文献は図面を表示できません]

【0321】

のうちのいずれか１つまたはその薬学上許容される塩により表され、式中、
ｒは、１〜１０の整数であり、
Ｙは、−Ｈ、−ＯＨ、または−ＳＯ_３Ｍであり、
Ｍは、薬学上許容されるカチオン（例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋）であり、
より詳細には、Ｙは、−ＳＯ_３Ｍである。代替として、Ｙは、−ＯＨである。

【0322】

ある特定の実施形態において、本明細書中に記載されるコンジュゲート、例えば、第２の実施形態または第１〜第１５の特定実施形態に記載されるものなどは、１〜１０の細胞障害性化合物、２〜９の細胞障害性化合物、３〜８の細胞障害性化合物、４〜７の細胞障害性化合物、または５〜６の細胞障害性化合物を含んでいてもよく、各細胞障害性化合物は、細胞障害性化合物とＣＢＡとを連結する結合基を含み、コンジュゲートの各細胞障害性化合物は同一である。

【0323】

コンジュゲートの実施形態、例えば、第２の実施形態または第１〜第１５の特定実施形態のいずれにおいても、細胞結合剤は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生虫感染細胞、自己免疫性細胞、活性化細胞、骨髄細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはメラニン細胞、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇ、ＣＡＬＬＡ、もしくはＨｅｒ−２抗原を発現する細胞、Ｈｅｒ−３抗原、またはインシュリン増殖因子受容体、上皮増殖因子受容体、及び葉酸受容体を発現する細胞から選択される標的細胞と結合することができる。

【0324】

コンジュゲートの実施形態、例えば、第２の実施形態または第１〜第１５の特定実施形態のいずれにおいても、細胞結合剤は、抗体、一本鎖抗体、標的細胞と特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、もしくは標的細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、標的細胞と特異的に結合するキメラ抗体断片、ドメイン抗体、標的細胞と特異的に結合するドメイン抗体断片、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、増殖因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子であってよい。

【0325】

抗体は、表面再構成抗体、表面再構成一本鎖抗体、または表面再構成抗体断片であってよい。
抗体は、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、またはそれらのモノクローナル抗体断片であってよい。

【0326】

抗体は、ヒト化抗体、ヒト化一本鎖抗体、またはヒト化抗体断片であってよい。
上記のコンジュゲートの実施形態、例えば、第２の実施形態または第１〜第１５の特定実施形態のいずれにおいても、細胞結合剤は、抗葉酸受容体抗体またはその抗体断片であってよい。より詳細には、抗葉酸受容体抗体は、ｈｕＭＯＶ１９抗体である。

【0327】

代替として、上記のコンジュゲートの実施形態、例えば、第２の実施形態または第１〜第１５の特定実施形態のいずれにおいても、細胞結合剤は、抗ＥＧＦＲ抗体またはその抗体断片であってよい。１つの実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、非アンタゴニスト抗体であり、例えば、ＷＯ２０１２０５８５９２（参照により本明細書中に援用される）に記載される抗体が挙げられる。別の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、非機能性抗体、例えば、ヒト化ＭＬ６６である。より詳細には、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｈｕＭＬ６６である。

【0328】

本発明は、さらに、本明細書中に記載されるコンジュゲート、及び薬学上許容されるキャリアのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
本発明は、さらに、細胞結合剤と連結した本対象化合物のいずれかを含むコンジュゲートを提供する。

【0329】

本発明は、さらに、哺乳類において異常細胞増殖を阻害する方法、あるいは増殖性障害、自己免疫障害、破壊性骨障害、感染症、ウイルス性疾患、線維性疾患、神経変性疾患、膵炎、または腎疾患を治療する方法を提供し、本方法は、治療有効量の本発明の化合物（任意のリンカー基の有無に関わらず）またはコンジュゲートのいずれかを、及び任意選択で第２の化学療法薬を哺乳類に投与することを含む。

【0330】

ある特定の実施形態において、第２の化学療法薬は、哺乳類に、順次または継続的に投与される。
ある特定の実施形態において、本方法は、癌、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植片拒絶、狼瘡、筋炎、感染症、及び免疫不全から選択される症状を治療するためのものである。

【0331】

ある特定の実施形態において、本方法またはコンジュゲートは、癌を治療するためのものである。
ある特定の実施形態において、癌は、血液癌または固形腫瘍である。より詳細には、癌は、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、黒色腫、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳癌、頭頸部の扁平上皮癌、前立腺癌、子宮内膜癌、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、腹膜癌、または白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性単球性白血病、前骨髄球性白血病、好酸球性白血病、急性リンパ芽球性白血病（例えば、Ｂ−ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））である。
細胞結合剤薬物コンジュゲートの生成
本発明の細胞障害性化合物またはその誘導体と細胞結合剤とを連結する目的で、細胞障害性化合物は、化合物１４（実施例１）、２３（実施例２）、３５（実施例３）、４９（実施例４）、８０（実施例５）、９０（実施例６）、６３（実施例７）、または７０（実施例８）など、反応性基が結合している連結部分を含むことができる。これらの化合物は、細胞結合剤と直接連結させることができる。反応性基が結合した細胞障害性化合物と細胞結合剤とを連結させて細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートを生成する代表的なプロセスを、実施例１１、１３、１４〜１７、１９、及び２０に記載する。

【0332】

１つの実施形態において、二官能性架橋剤を、まず細胞障害性化合物と反応させて、１つの反応性基が結合する連結部分を有する化合物（すなわち、薬物リンカー化合物）をもたらすことができ、次いでこれを細胞結合剤と反応させることができる。代替として、二官能性架橋剤の一端を最初に細胞結合剤と反応させて、１つの反応性基が結合した連結部分を有する細胞結合剤をもたらすことができ、次いでこれを細胞障害性化合物と反応させることができる。連結部分は、特定部位で細胞障害性部分を放出することを可能にする化学結合を有することができる。適切な化学結合は、当該分野で周知であり、そのような結合として、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、ペプチダーゼ不安定性結合、及びエステラーゼ不安定性結合が挙げられる（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４７５，０９２号、同第６，４４１，１６３号、同第６，７１６，８２１号、同第６，９１３，７４８号、同第７，２７６，４９７号、同第７，２７６，４９９号、同第７，３６８，５６５号、同第７，３８８，０２６号、及び同第７，４１４，０７３号を参照）。好適であるのは、ジスルフィド結合、チオエーテル、及びペプチダーゼ不安定性結合である。本発明で使用可能な他のリンカーとして、非開裂リンカー、例えば米国公開番号第２００５／０１６９９３３号に詳細が記載されるものなど、または荷電リンカーもしくは親水性リンカーが挙げられ、これらはＵＳ２００９／０２７４７１３、ＵＳ２０１０／０１２９３１４０、及びＷＯ２００９／１３４９７６に記載されており、その内容は、本明細書中参照として明白に援用され、その内容は、本明細書中参照として明白に援用される。

【0333】

１つの実施形態において、細胞結合剤（例えば、抗体）を水性緩衝液に溶解させた溶液を、モル過剰量の二官能性架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）などとともにインキュベートして、ジチオピリジル基を導入することができる。次いで、修飾された細胞結合剤（例えば、修飾された抗体）を、本明細書中に記載されるチオール含有細胞障害性化合物、例えば化合物９８または９９と反応させて（実施例９及び１０）、本発明のジスルフィド結合した細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートを生成する。

【0334】

別の実施形態において、明細書中に記載されるチオール含有細胞障害性化合物、例えば化合物９８または９９を、二官能性架橋剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）などと反応させて、細胞障害性剤リンカー化合物を形成することができ、次いで、これを細胞結合剤と反応させて、本発明のジスルフィド結合した細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートを生成させる。細胞障害性剤リンカー化合物は、精製すことなくｉｎ ｓｉｔｕで調製し、その後細胞結合剤と反応させることができる。代表的なプロセスを、実施例１２及び１８に記載する。代替として、細胞障害性剤リンカー化合物を精製してから、細胞結合剤と反応させることができる。

【0335】

細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートは、当該分野で既知の任意の精製方法、例えば米国特許第７，８１１，５７２号及び米国公開第２００６／０１８２７５０号（これらはいずれも参照により本明細書中に援用される）に記載のものなどを使用して、精製してよい。例えば、細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートは、タンジェント流濾過、吸着クロマトグラフィー、吸着濾過、選択沈殿、非吸収濾過、またはそれらの組み合わせを用いて精製することができる。好ましくは、コンジュゲートを精製するために、タンジェント流濾過（ＴＦＦ、これは十字流濾過、限外濾過、及びダイアフィルトレーションとしても知られる）及び／または吸着クロマトグラフィー樹脂を使用する。

【0336】

代替として、細胞結合剤（例えば、抗体）を、モル過剰量の抗体修飾剤、例えば２−イミノチオラン、Ｌ−ホモシステインチオラクトン（または誘導体）、またはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）とともにインキュベートして、スルフヒドリル基を導入してもよい。次いで、修飾された抗体を、適切なジスルフィド含有細胞障害性剤と反応させて、ジスルフィド結合した抗体細胞障害性剤コンジュゲートを生成する。抗体細胞障害性剤コンジュゲートは、その後、上記の方法で精製してもよい。また、細胞結合剤を操作してチオール部分を導入することができる。このようなものは、例えば、米国特許第７，７７２，４８５号及び同第７，８５５，２７５号に記載されるシステイン操作した抗体などである。

【0337】

別の実施形態において、細胞結合剤（例えば、抗体）を水性緩衝液に溶解させた溶解液を、モル過剰量の抗体修飾剤、例えばＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラートなどとともにインキュベートしてマレイミド基を導入する、またはＮ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）などとともにインキュベートしてヨードアセチル基を導入ことができる。次いで、修飾された細胞結合剤（例えば、修飾された抗体）を、チオール含有細胞障害性剤と反応させて、チオエーテル結合した細胞結合剤細胞障害性剤コンジュゲートを生成する。コンジュゲートは、その後、上記の方法で精製してもよい。

【0338】

抗体分子１つあたりに結合した細胞障害性分子の個数は、２８０ｎｍ及び３３０ｎｍでの吸光度の比を測定することにより、分光測定で決定することができる。本明細書中に記載される方法により、平均で１〜１０の細胞障害性化合物／抗体分子（複数可）を連結させることができる。抗体分子１つあたりに結合した細胞障害性化合物の好適な平均数は２〜５であり、最も好ましくは２．５〜４．０である。

【0339】

本発明の細胞結合剤薬物コンジュゲートを調製する代表的なプロセスは、８，７６５，７４０及び米国特許出願公開第２０１２／０２３８７３１号に記載される。これらの全教示は、参照により本明細書中に援用される。
化合物及びコンジュゲートの細胞障害性
本発明の細胞障害性化合物及び細胞結合剤薬物コンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで様々な癌細胞株の増殖を抑制する能力について評価することができる。例えば、ヒト子宮頸癌細胞株ＫＢ、ヒト急性単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１、ヒト前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＨＮＴ−３４などの細胞株を使用して、これらの化合物及びコンジュゲートの細胞障害性を評価することができる。評価対象の細胞を、化合物またはコンジュゲートに１〜５日間暴露し、細胞の生存率を既知の方法による直接アッセイで測定することができる。次いで、アッセイの結果から、ＩＣ_５０値を計算することができる。代替として追加として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株感受性スクリーニング法、例えば、米国国立癌研究所により説明される方法（Ｖｏｓｋｏｇｌｏｕ−Ｎｏｍｉｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：４２２２７−４２３９を参照、参照により本明細書中に援用される）を、本発明の化合物またはコンジュゲートを用いた治療に対して感受性であり得る癌の種類を判定する指針の１つとして使用することができる。

【0340】

本発明の抗体細胞障害性剤コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力及び標的特異性の例を、図２及び図４に示す。コンジュゲートは全て、抗原陽性癌細胞に対して非常に細胞障害性が高く、低ピコモル範囲のＩＣ_５０を有する。同じコンジュゲートに暴露させても、抗原陰性細胞株は依然として生存していた。

【0341】

１つの例では、細胞結合剤／細胞障害性剤コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を測定した。ＮＣＩ−Ｈ２１１０腫瘍細胞を有するＳＣＩＤマウスを、ｈｕＭｏｖ１９−８０コンジュゲート及びｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートで処置したところ、顕著な腫瘍退縮が複数の用量で観測されたが、未処置のマウスでは、腫瘍は急速に増殖した（図６）。ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートの活性は、わずか５μｇ／ｋｇの低用量で観測された。

【0342】

組成物及び使用方法
本発明は、本明細書中に記載される新規のベンゾジアゼピン化合物（例えば、インドリノベンゾジアゼピンまたはオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、（及び／またはそれらの溶媒和物、水和物、及び／または塩）、及びキャリア（薬学上許容されるキャリア）を含む組成物（例えば、医薬組成物）を含む。本発明はまた、本明細書中に記載される新規のベンゾジアゼピン化合物（例えば、インドリノベンゾジアゼピンまたはオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、（及び／またはそれらの溶媒和物、水和物、及び／または塩）、及びキャリア（薬学上許容されるキャリア）を含み、さらに第２治療薬を含む組成物（例えば、医薬組成物）を含む。本組成物は、哺乳類（例えば、ヒト）において、異常細胞増殖を阻害するまたは増殖性障害を治療するのに有用である。本組成物はまた、哺乳類（例えば、ヒト）において、抑うつ、不安、ストレス、恐怖、パニック、不快、精神障害、疼痛、及び炎症性疾患を治療するのに有用である。

【0343】

本発明は、哺乳類（例えば、ヒト）において、異常細胞増殖を阻害するまたは増殖性障害を治療する方法を含む。本方法は、該哺乳類に、治療有効量の本明細書中に記載される新規のベンゾジアゼピン化合物（例えば、インドリノベンゾジアゼピンまたはオキサゾリジノベンゾジアゼピン）、それらの誘導体、またはそれらのコンジュゲート、（ならびに／またはそれらの溶媒和物及び塩）、またはそれらの組成物を、単独でまたは第２治療薬と併用して投与することを含む。

【0344】

本発明はまた、治療方法も提供する。本方法は、治療を必要としている対象に、有効量の上記コンジュゲートのいずれかを投与することを含む。
同様に、本発明は、選択された細胞集団で細胞死を誘導する方法を提供する。本方法は、標的細胞または標的細胞を含有する組織と、本発明の細胞障害性化合物細胞結合剤（例えば、細胞結合剤と連結したインドリノベンゾジアゼピンまたはオキサゾリジノベンゾジアゼピン二量体）、それらの塩または溶媒和物のいずれかを含む有効量の細胞障害性剤とを接触させることを含む。標的細胞は、細胞結合剤が結合可能な細胞である。

【0345】

所望の場合、他の活性作用剤、例えば他の抗腫瘍剤などを、コンジュゲートと一緒に投与してもよい。
適切な薬学上許容されるキャリア、希釈剤、及び賦形剤は、周知であり、臨床状況が許容する場合、当業者により決定することができる。

【0346】

適切なキャリア、希釈剤、及び／または賦形剤の例として、（１）ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ｐＨ約７．４、これは約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有する場合としない場合がある）、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖのＮａＣｌ）、及び（３）５％（ｗ／ｖ）ブドウ糖が挙げられ、また、それらは、トリプタミンなどの抗酸化剤及びＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤も含有してよい。

【0347】

選択された細胞集団で細胞死を誘導する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで行うことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途の例として、疾患細胞または悪性細胞を殺傷する目的で行う同一患者に移植する前の自家骨髄の処理、コンピテントＴ細胞を殺傷し移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防する目的で行う移植前の骨髄の処理、標的抗原を発現しない所望の変異体以外の全ての細胞を殺傷する目的で行う細胞培養物の処理、または望ましくない抗原を発現する変異体の殺傷が挙げられる。

【0348】

非臨床ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途の条件は、当業者により容易に決定される。
臨床ｅｘ ｖｉｖｏ用途の例は、癌治療において、または自己免疫疾患の治療において自家移植の前に骨髄から腫瘍細胞またはリンパ球を除去するためのもの、あるいは、ＧＶＨＤを予防する目的で移植前に自家もしくは同種骨髄または組織からＴ細胞及び他のリンパ球を除去するためのものである。処理は、次とおりに行うことができる。骨髄を、患者または他の個体から採取し、次いで、本発明の細胞障害性剤を約１０μＭ〜１ｐＭの濃度範囲で添加した血清を含有する媒体中で、約３０分〜約４８時間約３７℃でインキュベートする。インキュベーションの濃度及び時間、すなわち用量についての正確な条件は、当業者により容易に決定される。インキュベーション後、既知の方法に従って、骨髄細胞を血清含有媒体で洗浄し、静脈から患者に戻す。患者が、骨髄の採取時から処理済細胞の再注入時までの間に、他の治療、例えば一連の切除化学療法または全身照射などを受ける場合は、処理した骨髄細胞を、標準医療器具を用いて液体窒素中に凍結保存する。

【0349】

臨床ｉｎ ｖｉｖｏ用途では、本発明の細胞障害性剤は、無菌性及びエンドトキシンレベルについて検査された溶液または凍結乾燥粉末として供給されることになる。コンジュゲート投与の適切なプロトコルの例は、次のとおりである。コンジュゲートを、４週間にわたって毎週、静脈内ボーラスとして投与する。ボーラス用量は、通常の生理食塩水５０〜１０００ｍＬで付与され、この生理食塩水に対してヒト血清アルブミン５〜１０ｍＬを添加することができる。投薬量は、静脈内投与１回あたり１０μｇ〜２０００ｍｇになる（１日あたり１００ｎｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲）。４週間の投与後、患者は、１週間単位で投与を受け続けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、時間などに関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況が許容する場合、当業者により決定することができる。

【0350】

選択された細胞集団で細胞死を誘導するｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ方法に従って処置することができる病状の例として、例えば癌をはじめとするあらゆる種類の悪性病変、自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、リウマチ様関節炎、及び多発性硬化症など、移植片拒絶、例えば、腎臓移植片拒絶、肝臓移植片拒絶、肺移植片拒絶、心臓移植片拒絶、及び骨髄移植片拒絶など、移植片対宿主病、ウイルス感染症、例えば、ＣＭＶ感染症、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳなど、ならびに、寄生虫感染症、例えば、ジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症など、ならびにその他当業者が定めるものが挙げられる。

【0351】

癌治療薬、ならびにそれらの投薬量、投与経路、及び推奨される用法は、当該分野で既知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）などの文献に記載されている。ＰＤＲでは、様々な癌の治療に使用されている作用剤の投薬量を開示する。治療上有効なこうした前述の化学療法薬の投薬レジメン及び投薬量は、治療される特定の癌、疾患の程度、及び当業者には既知である他の要因によって決定されることになり、また、医師によって決定され得る。ＰＤＲの内容は、参照によりその全体が本明細書中で援用される。当業者は、以下のパラメーターの１つまたは複数を用いることでＰＤＲを検討し、本発明の教示に従って使用可能な化学療法薬及びコンジュゲートの投薬レジメン及び投薬量を決定することができる。そうしたパラメーターとして、以下が挙げられる。
総合索引
製造者による
製品（企業名または登録商標である薬名）
カテゴリー索引
一般名／化学物質索引（登録商標ではない一般薬名）
薬剤のカラー画像
ＦＤＡ標示に一致した製品情報
化学情報
機能／作用
適応症＆禁忌症
臨床研究、副作用、警告
類似体及び誘導体
本明細書中に記載される細胞障害性剤はそれぞれ、得られる化合物が出発化合物の特異性及び／または活性をなおも保持するように修飾可能であることを、細胞障害性剤業界の当業者は容易に理解するであろう。こうした化合物の多くは、本明細書中に記載される細胞障害性剤の代わりに使用可能であることも、当業者は理解するであろう。すなわち、本発明の細胞障害性剤は、本明細書中に記載される化合物の類似体及び誘導体を含む。

【0352】

本明細書中及び以下の実施例において引用される参照は全て、参照によりその全体が援用される。

【実施例】

【0353】

次に、本発明を、非限定実施例を参照して例示する。別途記載がない限り、全てのパーセント、比率、部などは、重量基準である。全ての試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）または他の商業的供給源から購入したものである。核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ装置で取得した。質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００装置で取得し、ＬＣＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣとＡｇｉｌｅｎｔ ６１２０シングル四重極ＭＳを併用して、エレクトロスプレーイオン化を用いて測定した。

【0354】

以下の溶媒、試薬、保護基、部分、及び他の記号は、括弧内のそれらの略号により示される場合がある。
Ｍｅ＝メチル、Ｅｔ＝エチル、Ｐｒ＝プロピル、ｉ−Ｐｒ＝イソプロピル、Ｂｕ＝ブチル、ｔ−Ｂｕ＝ｔｅｒｔ−ブチル、Ｐｈ＝フェニル、及びＡｃ＝アセチル
ＡｃＯＨまたはＨＯＡｃ＝酢酸
ＡＣＮまたはＣＨ_３ＣＮ＝アセトニトリル
Ａｌａ＝アラニン
ａｑ＝水性
ＢＨ_３・ＤＭＳ＝ボランジメチルスルフィド錯体
Ｂｎ＝ベンジル
ＢｏｃまたはＢＯＣ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
ＣＢｒ_４＝四臭化炭素
ＣｂｚまたはＺ＝ベンジルオキシカルボニル
ＤＣＭまたはＣＨ_２Ｃｌ_２＝ジクロロメタン
ＤＣＥ＝１，２−ジクロロエタン
ＤＭＡＰ＝４−ジメチルアミノピリジン
ＤＩ水＝脱イオン水
ＤＩＢＡＬ＝水素化ジイソブチルアルミニウム
ＤＩＥＡまたはＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＥＤＱ＝Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン
ＥＳＩまたはＥＳ＝エレクトロスプレーイオン化
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
Ｇｌｙ＝グリシン
ｇ＝グラム
ｈ＝時間
ＨＡＴＵ＝Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム＝ヘキサフルオロホスファート
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ＨＯＢｔまたはＨＯＢＴ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＬＡＨ＝水素化リチウムアルミニウム
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ＝液体クロマトグラフィー質量分析
ｍｉｎ＝分
ｍｇ＝ミリグラム
ｍＬ＝ミリリットル
ｍｍｏｌ＝ミリモル
μｇ＝マイクログラム
μＬ＝マイクロリットル
μｍｏｌ＝マイクロモル
Ｍｅ＝メチル
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＭｅＩ＝ヨウ化メチル
ＭＳ＝質量分析
ＭｓＣｌ＝塩化メタンスルホニル（塩化メシル）
Ｍｓ_２Ｏ＝メタンスルホン酸無水物
ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３＝トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム
ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド
ＮＭＲ＝核磁気共鳴分光法
ＰＰｈ_３＝トリフェニルホスフィン
ＰＴＬＣ＝分取薄層クロマトグラフィー
ｒａｃ＝ラセミ混合物
Ｒ_ｆ＝遅延係数
ＲＰＨＰＬＣまたはＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＴまたはｒｔ＝室温（常温、約２５℃）
ｓａｔまたはｓａｔ’ｄ＝飽和
ＳＴＡＢ＝トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３）
ＴＢＳＣｌまたはＴＢＤＭＳＣｌ＝塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＢＳ＝ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＣＥＰ・ＨＣｌ＝トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＥＡ＝トリエチルアミン（Ｅｔ_３Ｎ）
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
Ｖａｌ＝バリン
実施例１．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（２−（（２−（（２−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート（化合物１４）の合成

【0355】

【化89】

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【0356】

工程１：Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ化合物１（５．０ｇ、１８．７８ｍｍｏｌ）及びＨ−Ｇｌｙ−Ｏｔ−Ｂｕ・ＨＣｌ化合物２（３．４６ｇ、２０．６６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３７．６ｍＬ）に溶解させた。反応フラスコに、ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．９６ｇ、２０．６６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２．８８ｇ、１８．７８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（８．１８ｍＬ、４６．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、Ａｒ下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、続いて水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、勾配、０％〜５％）により精製して、純粋な化合物３を白色固体として得た（６．３５ｇ、収率８９％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１８−８．１３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ７．３７−７．３６ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３４−７．３２ （ｍ， １Ｈ）， ５．０４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．０９ （ｑ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ）， ３．７４ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ）， ３．６７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ３．１７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．２ Ｈｚ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ４．２８分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：３２４．１５ （Ｍ−ｔ−Ｂｕ＋Ｈ）．

【0357】

【化90】

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【0358】

工程２：化合物３（６．３ｇ、１６．６０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（５２．７ｍＬ）及び水（２．６４ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、Ａｒでパージし、５分間脱気した。Ｐｄ／Ｃ（湿潤、１０％）（０．８８４ｇ、０．８３０ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。次いで、バルーンからＨ_２を１分間吹き込んだ。反応物を、バルーンのＨ_２下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、濾過ケーキをＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。残渣にＣＨ_３ＣＮ（２０ｍＬ）を添加し、濃縮した。これをさらに２回繰り返して、粘着固体を得た。残渣をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（２：１、５０ｍＬ）に添加してスラリーとし、濾過し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１、３０ｍＬ）ですすいだ。固体を、真空／Ｎ_２下で１時間乾燥させて、化合物４を白色固体として得た（３．６６ｇ、収率９０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．２１−８．１８ （ｍ， １Ｈ）， ８．１２ （ｂｓ， １Ｈ）， ３．７６ （ｂｓ， ２Ｈ）， ３．７３ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ３．１３ （ｓ， ２Ｈ）， １．９３ （ｂｓ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）．

【0359】

【化91】

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【0360】

工程３：アミン化合物４（１．０ｇ、４．０８ｍｍｏｌ）及びアジピン酸モノメチル（６６４μＬ、４．４８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１３．５９ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（８６０ｍｇ、４．４８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（６２４ｍｇ、４．０８ｍｍｏｌ）を添加して、続いてＤＩＥＡ（１．４２４ｍＬ、８．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、室温で一晩攪拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（２０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（勾配、０％〜２０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、純粋な化合物５を白色固体として得た（１．５ｇ、収率９５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１７−８．０６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７４−３．７１ （ｍ， ６Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２ （ｂｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）， ２．１４ （ｂｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）， １．５２−１．４９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）．

【0361】

【化92】

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【0362】

工程４：化合物５（１．５ｇ、３．８７ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（５．９７ｍＬ、７７．０ｍｍｏｌ）及び脱イオン水（３００μＬ）中、室温で一晩攪拌した。反応混合物にＣＨ_３ＣＮ（１０ｍＬ）を添加し、５分間攪拌した。混合物は濃厚になり、白色沈殿物が大量に生じた。追加のＣＨ_３ＣＮ（３０ｍＬ）を添加し、さらに５分間攪拌した。混合物を濾過し、真空／Ｎ_２下で１時間乾燥させて、純粋な化合物６を白色固体として得た（０．７ｇ、収率５５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．５６ （ｓ， １Ｈ）， ８．１６−８．０６ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７３ （ｄｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ８．６， ６．１ Ｈｚ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２−２．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６−２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， １．５１ （ｂｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ）．

【0363】

【化93】

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【0364】

工程５：アニリン化合物７（１００ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）及び酸化合物６（２２７ｍｇ、０．６８５ｍｍｏｌ）を、室温で、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（４．３５ｍＬ／２．２ｍＬ）に懸濁させた。ＥＥＤＱ（３２３ｍｇ、１．３０６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に添加してスラリーとし、濾過した。固体をＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、真空／Ｎ_２下で乾燥させて、化合物８を白色固体として得た（２６０ｍｇ、収率８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１−８．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１１−８．０８ （ｍ， １Ｈ）， ７．４５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９６ （ｓ， １Ｈ）， ５．１７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ）， ４．４５ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ３．８７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ）， ３．７５ （ｄｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．７， １３．４ Ｈｚ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３１−２．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６−２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， １．５２−１．４８ （ｍ， ４Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ０．８８６分 （１５分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：４８９．３ （Ｍ＋Ｎａ）．

【0365】

【化94】

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【0366】

工程６：ジオール化合物８（２６０ｍｇ、０．５５７ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（５５５ｍｇ、１．６７２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５．５７ｍＬ）に溶解させた。トリフェニルホスフィン（４３９ｍｇ、１．６７２ｍｍｏｌ）を添加し、褐色混合物をＡｒ下、室温で４時間攪拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１、３０ｍＬ）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、０％〜１０％、勾配）により精製して、化合物９を黄色固体として得た。生成物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ（１：１０、３０ｍＬ）に添加してスラリーとし、次いで濾過した。固体をＥｔＯＡｃで洗浄し、真空／Ｎ_２下で乾燥させて、純粋な化合物９をオフホワイト色固体として得た（１７０ｍｇ、収率５２％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．９５ （ｓ， １Ｈ）， ８．２５−８．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ８．１２−８．１０ （ｍ， １Ｈ）， ７．６５ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ４．６８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．８９ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．８ Ｈｚ）， ３．７７ （ｄｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．７， ７．４ Ｈｚ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３１−２．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６−２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， １．５１−１．４９ （ｍ， ４Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ３．３３５分 （１５分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：５９３．２ （Ｍ＋Ｈ）．

【0367】

【化95】

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【0368】

工程７：ジブロミド化合物９（１０９ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）及びＩＧＮ単量体化合物１０（１１９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．８４ｍＬ）に溶解させた。炭酸カリウム（６３．６ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩攪拌した。反応混合物に水（２０ｍＬ）を添加して、生成物を沈殿させた。スラリーを室温で５分間攪拌し、次いで濾過し、真空／Ｎ_２下で１時間乾燥させた。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、勾配、０％〜５％）により精製して、化合物１１を黄色固体として得た（１６０ｍｇ、収率６０％、純度７０％）。ＬＣＭＳ＝５．２４０分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０１９．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0369】

【化96】

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【0370】

工程８：ジイミン化合物１１（１４０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（１．１ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＮａＢＨ（ＯＡｃ）_３（２３．２９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間攪拌した。反応物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１５ｍＬ）でクエンチした。層を分離させ、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、勾配、３５％〜５５％）により精製してモノイミン化合物１２を白色綿状固体として得たて（３３ｍｇ、収率２９％）、また、出発物質化合物１１を回収した（２５ｍｇ）。ＬＣＭＳ＝７．０９１分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０２１．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0371】

【化97】

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【0372】

工程９：メチルエステル化合物１２（３３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０９ｍＬ）及び水（３６４μＬ）に溶解させた。ＬｉＯＨ（６．９７ｍｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１．５時間攪拌した。反応混合物をＨ_２Ｏ（５ｍＬ）で希釈し、０．５Ｍ水性ＨＣｌでｐＨ約４まで酸性にした。水層をＣＨ_-２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（３：１、３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗化合物１３を黄色固体として得た（２９ｍｇ、収率９９％）。ＬＣＭＳ＝５．３５６分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１００７．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0373】

【化98】

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【0374】

工程１０：酸化合物１３（２９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンアミド（２１．２１ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２（２．３ｍＬ）に溶解させて攪拌した溶液に、室温でＥＤＣ・ＨＣｌ（２２．０８ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、水（１×１５ｍＬ）及びブライン（１×１５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、勾配、３５％〜５５％）により精製した。生成物含有画分を合わせて凍結乾燥させ、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（２−（（２−（（２−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート、化合物１４を、白色綿状固体として得た（８ｍｇ、収率３１％）。ＬＣＭＳ＝５．８６７分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１１０４．７（Ｍ＋Ｈ）．
実施例２．
（１ｒ，４ｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝４−（（２−（（２−（（２−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）カルバモイル）シクロヘキサン−カルボキシラート（化合物２３）の合成

【0375】

【化99】

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【0376】

工程１：アミン化合物４（２００ｍｇ、０．８１５ｍｍｏｌ）及び１，４−ｔｒａｎｓ−シクロヘキサンジカルボン酸モノメチルエステル化合物１５（１８２ｍｇ、０．９７８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２．７２ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＥＤＣ・ＨＣｌ（１８８ｍｇ、０．９７８ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１２５ｍｇ、０．８１５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（２８５μＬ、１．６３１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブライン、及び水で洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、粘着な残渣とした。残渣にＣＨ_３ＣＮ（１５ｍＬ）を添加し、濃縮した。これをさらに２回繰り返して、化合物１６を乾燥白色粉末として得た（３００ｍｇ、収率８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１６ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ）， ８．０４ （ｄｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６， １４．８ Ｈｚ）， ３．７４−３．６９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３１−２．２５ （ｍ， １Ｈ）， ２．２０−２．１３ （ｍ， １Ｈ）， １．９４−１．９１ （ｍ， ２Ｈ）， １．８２−１．７９ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．３４ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ １１．７ Ｈｚ）．

【0377】

【化100】

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【0378】

工程２：未希釈の化合物１６（３００ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）に、室温で、ＴＦＡ（１．４０ｍＬ、１８．１４ｍｍｏｌ）及びＤＩ水（６７．８μＬ）を添加し、３時間攪拌した。反応混合物にＣＨ_３ＣＮ（２０ｍＬ）を添加し、濃縮した。これをさらに２回繰り返して、化合物１７を白色固体として得た（２３０ｍｇ、収率８９％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１６−８．１３ （ｍ， １Ｈ）， ８．０７−８．０１ （ｍ， ２Ｈ）， ３．７６−３．７３ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７０ （ｂｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３１−２．２５ （ｍ， １Ｈ）， ２．１９−２．１４ （ｍ， １Ｈ）， １．９４−１．９１ （ｍ， ２Ｈ）， １．８２−１．７９ （ｍ， ２Ｈ）， １．４２−１．２６ （ｍ， ４Ｈ）．

【0379】

【化101】

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【0380】

工程３：アニリン化合物７（１３５ｍｇ、０．８８１ｍｍｏｌ）及び酸化合物１７（３３１ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）を、室温で、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（２．９ｍＬ／１．５ｍＬ）に懸濁させた。ＥＥＤＱ（４３６ｍｇ、１．７６３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に添加してスラリーとし、濾過した。固体をＥｔＯＡｃ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、真空／Ｎ_２下で乾燥させて、化合物１８を白色固体として得た（３３０ｍｇ、収率６１％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｄｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０， １９．２ Ｈｚ）， ８．０９−８．０１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９６ （ｓ， １Ｈ）， ５．１７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ）， ４．４５ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ３．８８−３．８４ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７７−３．６９ （ｍ， ８Ｈ）， ３．６３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．５９ （ｓ， ６Ｈ）， ２．３０−２．２２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１９−２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， １．９４−１．９０ （ｍ， ４Ｈ）， １．８２−１．７８）ｍ， ４Ｈ）， １．４１−１．２６ （ｍ， ８Ｈ）．

【0381】

【化102】

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【0382】

工程４：化合物１８（３３０ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ）及びＣＢｒ_４（５３３ｍｇ、１．６０８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．３６ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＰＰｈ_３（４２２ｍｇ、１．６０８ｍｍｏｌ）を添加したところ、この時点で反応物は黄色に変色し、わずかに発熱した。反応物をＡｒ下で４時間攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、勾配、０％〜１０％）により精製して、化合物１９を白色固体として得た（２３４ｍｇ、収率６４％）。ＬＣＭＳ＝４．４５３分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：６１７．１０（Ｍ＋Ｈ）．

【0383】

【化103】

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【0384】

工程５：化合物２０を、実施例１の化合物１１と同様に調製した。精製後、化合物２０を黄色固体として得た（２６４ｍｇ、収率６０％）。ＬＣＭＳ＝４．８３１分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０４５．２０（Ｍ＋Ｈ）．

【0385】

【化104】

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【0386】

工程６：化合物２１を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。Ｃ１８の精製後、化合物２１を白色固体として得た（５１ｍｇ、収率３１％）。ＬＣＭＳ＝５．１２７分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０４７．３０（Ｍ＋Ｈ）．

【0387】

【化105】

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【0388】

工程７：メチルエステル化合物２１（４８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロロエタン（３．０６ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にトリメチルスタンナノール（１２４ｍｇ、０．６８８ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水（１５ｍＬ）で希釈した。水層を１ＭのＨＣｌでｐＨ約４まで酸性にした。混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（１０：１、３×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣をシリカゲルのショートパッドに詰めてＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（１０：１、次いで５：１、２×３０ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。酸化合物２２を黄色固体として得て、さらに精製することなく次の工程で使用した（４８ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ＝５．３３８分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０３３．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0389】

【化106】

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【0390】

工程８：化合物２３を、実施例１の化合物１３と同様に調製した。Ｃ１８精製後、（１ｒ，４ｒ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝４−（（２−（（２−（（２−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）カルバモイル）シクロヘキサンカルボキシラート、化合物２３を、白色固体として得た（８ｍｇ、収率１９％）。ＬＣＭＳ＝６．００７分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１１３０．８（Ｍ＋Ｈ）．
実施例３．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート（化合物３５）の合成

【0391】

【化107】

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【0392】

工程１：Ｚ−Ｖａｌ−ＯＨ化合物２４（３．０ｇ、１１．９４ｍｍｏｌ）及びＬ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ化合物２５（１．９０７ｇ、１３．１３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２３．８８ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．５２ｇ、１３．１３ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（２．０１１ｇ、１３．１３ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（４．５９ｍＬ、２６．３ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、Ａｒ下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、水、及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜５０％）により精製して、化合物２６を白色固体として得た（３．６８ｇ、収率８１％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３９−７．２９ （ｍ， ５Ｈ）， ６．２９ （ｂｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）， ５．３４ （ｂｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ）， ５．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４５ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ４．０２−３．９８ （ｍ， １Ｈ）， ２．１８−２．０９ （ｍ， １Ｈ）， １．５６ （ｓ， ９Ｈ）， １．３７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ０．９８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．９３ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．ＬＣＭＳ ＝ ５．５７１分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：３２３．２５ （Ｍ−ｔＢｕ＋Ｈ）．

【0393】

【化108】

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【0394】

工程２：化合物２６（３．６８ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３０．９ｍＬ）及び水（１．５４３ｍＬ）に溶解させた。溶液をＡｒでパージし、５分間脱気した。反応混合物に、Ｐｄ／Ｃ（１０％、湿潤、０．５１７ｇ）を緩徐に添加した。次いで、Ｈ_２を１分間吹き込んだ。吹き込みを中断し、次いで反応物をＨ_２バルーン下で一晩攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、濾過ケーキをＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、濃縮して、化合物２７を白色固体として得た（２．３５ｇ、収率９９％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７９−７．７７ （ｍ， １Ｈ）， ４．５０ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ３．２７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ）， ２．３４−２．２６ （ｍ， １Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．４０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， １．０１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ０．８６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）．

【0395】

【化109】

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【0396】

工程３：アミン化合物２７（２．３５ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）及びアジピン酸モノメチル（１．６９ｇ、１０．５８ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させた（３２．１ｍＬ）。反応混合物にＥＤＣ・ＨＣｌ（１．９４ｇ、１０．１０ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１．４７ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（３．３６ｍＬ、１９．２４ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（２０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜５０％）により精製して、化合物２８を白色固体として得た（２．７７ｇ、収率７５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ６．２９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ６．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ）， ４．４３ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ４．２７ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．４， ８．６ Ｈｚ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３５−２．３１ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２６−２．２３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１２−２．０３ （ｍ， １Ｈ）， １．７０−１．６３ （ｍ， ４Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）， １．３６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ０．９５ （見かけ上ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）．

【0397】

【化110】

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【0398】

工程４：未希釈の化合物２８（２．７７ｇ、７．１７ｍｍｏｌ）に、室温で、ＴＦＡ（８．２８ｍＬ、１０８．０ｍｍｏｌ）及び水（０．５６ｍＬ）を添加し、２．５時間攪拌した。反応混合物にＣＨ_３ＣＮ（３０ｍＬ）を添加し、濃縮した。これをさらに２回繰り返して、化合物２９を淡黄色固体として得た（２．０ｇ、収率８４％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ８．１１ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．２９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ）， ７．１４ （ｄ， １Ｈ， ６．８ Ｈｚ）， ４．５８ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ４．３７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ）， ３．６８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３７−２．３２ （ｍ， ４Ｈ）， ２．０３−１．９９ （ｍ， ２Ｈ）， １．６９−１．６３ （ｍ， ４Ｈ）， １．４９ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ０．９７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）， ０．９６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）．

【0399】

【化111】

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【0400】

工程５：アニリン化合物７（１５０ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）及び酸化合物２９（３４０ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）を、室温で、ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（３．２６ｍＬ、１．６２ｍＬ）に懸濁させた。ＥＥＤＱ（４８４ｍｇ、１．９６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ_２Ｏ（１５ｍＬ、１５ｍＬ）に添加してスラリーとし、濾過した。固体をＥｔ_２Ｏ（２×１５ｍＬ）で洗浄し、真空／Ｎ_２下で乾燥させて、化合物３０を白色固体として得た（１５０ｍｇ、収率３３％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．６１ （ｓ， ２Ｈ）， ７．４７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ７．１４ （ｓ， １Ｈ）， ６．６４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．８２−４．７５ （ｍ， １Ｈ）， ４．４５−４．４０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．６４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３６−２．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．１６−２．０７ （ｍ， １Ｈ）， １．６８−１．５９ （ｍ， ４Ｈ）， １．４７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ０．９８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ）， ０．９５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４．８ Ｈｚ）．ＬＣＭＳ ＝ ３．０７３分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：４６６．２５ （Ｍ＋Ｈ）．

【0401】

【化112】

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【0402】

工程６：ジオール化合物３０（１５０ｍｇ、０．３２２ｍｍｏｌ）及びＣＢｒ_４（３２１ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３２２２μｌ）に溶解させた。反応混合物にＰＰｈ_３（２５４ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ）を添加すると、この時点で反応物は赤桃色に変色し、わずかに発熱した。反応物をＡｒ下で４時間攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜１００％）により精製して、化合物３１をオフホワイト色固体として得た（４７３ｍｇ、収率７５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， ７．８５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ７．６４ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２１ （ｓ， １Ｈ）， ４．６８ （ｓ， ３Ｈ）， ４．３７ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ４．１８ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２， ８．４ Ｈｚ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２−２．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３３−２．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０１−１．９１ （ｍ， １Ｈ）， １．５３−１．４９ （ｍ， ４Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ）， ０．８９ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ０．８５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．ＬＣＭＳ ＝ ５．２５９分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：５９２．０５ （Ｍ＋Ｈ）．

【0403】

【化113】

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【0404】

工程７：化合物３２を、実施例１の化合物１１と同様に調製した。精製後、化合物３２を黄色固体として得た（１６２ｍｇ、収率５７％、純度７０％）。ＬＣＭＳ＝６．４６１分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０１８．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0405】

【化114】

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【0406】

工程８：化合物３３を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。Ｃ１８精製後、化合物３３を白色固体として得た（４０ｍｇ、収率３１％）。ＬＣＭＳ＝５．５２８分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０２０．３０（Ｍ＋Ｈ）．

【0407】

【化115】

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工程９：化合物３４を、実施例２の化合物２２と同様に調製した。シリカプラグ後、化合物３４を黄色固体として得た（３８ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ＝５．２１１分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１００６．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0408】

【化116】

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【0409】

工程１０：化合物３５を、実施例１の化合物１４と同様に調製した。Ｃ１８精製後、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート、化合物３５を、白色固体として得た（８ｍｇ、収率２０％）。ＬＣＭＳ＝７．０３１分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１１０３．７（Ｍ＋Ｈ）．
実施例４．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝２−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３，６，９，１２−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザヘプタデカン−１７−オアート（化合物４９）の合成

【0410】

【化117】

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【0411】

工程１：（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール化合物７（５．０ｇ、３２．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６５．３ｍＬ）に溶解させた。ＴＢＳＣｌ（１２．３０ｇ、８２ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（６．６７ｇ、９８ｍｍｏｌ）を添加し、Ａｒ下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ及びブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜３０％）により精製して、化合物３７を黄色油状物として得た（１３ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ６．７１ （ｓ， １Ｈ）， ６．６０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｓ， ４Ｈ）， ０．９４ （ｓ， １８Ｈ）， ０．１０ （ｓ， １２Ｈ）．

【0412】

【化118】

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【0413】

工程２：アニリン化合物３７（１０ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５２．４ｍＬ）に溶解させて攪拌した溶液に、Ｃｓ_２ＣＯ_３（８．５４ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）を添加した。ヨウ化メチル（１．４７４ｍＬ、２３．５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で３時間攪拌した。反応混合物に水（１０ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）を添加した。層を分離させ、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。有機層を水（４×）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜１０％）により精製して、所望のモノメチル化生成物である化合物３８を得た（３．８ｇ、収率３７％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ６．６３ （ｓ， １Ｈ）， ６．５２ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６７ （ｓ， ４Ｈ）， ２．８４ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９４ （ｓ， １８Ｈ）， ０．１０ （ｓ， １２Ｈ）．

【0414】

【化119】

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【0415】

工程３：アニリン化合物３８（１．０ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）及びＺ−Ｇｌｙ−ＯＨ（０．５８２ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８．４２ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２１ｇ、６．３２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（３４０ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で一晩加熱した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３及び水（２×）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、０％〜３０％〜１００％）により精製して、化合物３９を黄色粘着固体として得た（７８０ｍｇ、収率５３％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．２７ （ｍ， ６Ｈ）， ６．９０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６２ （ｓ， ４Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．１６ （ｓ， ３Ｈ）， ０．８３ （ｓ， １８Ｈ）， ０．００ （ｓ， １２Ｈ）．

【0416】

【化120】

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【0417】

工程４：化合物３９（１．２６ｇ、２．１４７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（６．８２ｍＬ）及びＴＨＦ（６．８ｍＬ）に溶解させ、溶液をＮ_２でパージした。Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．２２８ｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）を添加し、Ｈ_２を数分間吹き込んだ。反応物を、Ｈ_２バルーン下、一晩攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、濃縮して、純粋な化合物４０を得た（１ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．４１−７．３０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２７−７．２１ （ｍ， １Ｈ）， ７．０６ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６５ （ｓ， ４Ｈ）， ３．２３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１２ （ｓ， ２Ｈ）， ０．８２ （ｓ， １８Ｈ）， ０．００ （ｓ， １２Ｈ）．

【0418】

【化121】

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【0419】

工程５：アミン化合物４０（１．０ｇ、１．９８８ｍｍｏｌ）及びＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ（６６２ｍｇ、２．３８５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（６．６３ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（４５７ｍｇ、２．３８５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢＴ（３０４ｍｇ、１．９８８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（６９４μＬ、３．９８ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３、ブライン、及び水（２×）で洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、勾配、０％〜１０％）により精製して、化合物４１を白色粘着発泡体として得た（９９４ｍｇ、収率７１％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３８−７．３２ （ｍ， ７Ｈ）， ７．３１−７．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．０１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１３ （ｓ， ２Ｈ）， ４．７４ （ｓ， ４Ｈ）， ３．９７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ４．６ Ｈｚ）， ３．９２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．３ Ｈｚ）， ３．７４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ３．７ Ｈｚ）， ３．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ０．９４ （ｓ， １８Ｈ）， ０．１１ （ｓ， １２Ｈ）．

【0420】

【化122】

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【0421】

工程６：化合物４１（９９４ｍｇ、１．４１８ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（６．６５ｍＬ）及び水（４４３μＬ）に懸濁させ、Ｎ_２でパージした。Ｐｄ／Ｃ（１０％湿潤、３０２ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を添加し、Ｈ_２を数分間吹き込んだ。反応物を、Ｈ_２バルーン下、一晩攪拌した。溶液をセライト濾過し、ＭｅＯＨで洗浄し、濃縮して、純粋な化合物４２を得た（７２５ｍｇ、収率９０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１０−７．９７ （ｍ， １Ｈ）， ７．９１−７．８５ （ｍ， １Ｈ）， ７．３１−７．２３ （ｍ， １Ｈ）， ７．０５ （ｓ， ２Ｈ）， ７．６５ （ｓ， ４Ｈ）， ３．６８−３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５６−３．４５ （ｍ， １Ｈ）， ３．０９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０８−３．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０６−３．０３ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８２ （ｓ， １８Ｈ）， ０．００ （ｓ， １２Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ５．５７４分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：５６７．３０ （Ｍ＋Ｈ）．

【0422】

【化123】

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【0423】

工程７：アミン化合物４２（７２５ｍｇ、１．２７９ｍｍｏｌ）及びアジピン酸モノメチル（２４６ｍｇ、１．５３５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＥＤＣ・ＨＣｌ（２９４ｍｇ、１．５３５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１９６ｍｇ、１．２７９ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（４４７μＬ、２．５６ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩攪拌した。反応混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、及びブラインで洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、勾配、０％〜１０％）により精製して、化合物４３を得た（４２５ｍｇ、収率３３％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３０ （ｓ， １Ｈ）， ７．０１ （ｓ， ２Ｈ）， ６．８９−６．８５ （ｍ， １Ｈ）， ６．７５−６．７２ （ｍ， １Ｈ）， ６．４１−６．４０ （ｍ， １Ｈ）， ４．７３ （ｓ， ４Ｈ）， ３．９８−３．９６ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７４ （ｂｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ３．５ Ｈｚ）， ３．６６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３３ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ２．２８ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ）， ０．９４ （ｓ， １８Ｈ）， ０．１１ （ｓ， １２Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ７．７０９分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：７０９．３５ （Ｍ＋Ｈ）．

【0424】

【化124】

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【0425】

工程８：化合物４３（４２２ｍｇ、０．４１７ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１．８９ｍＬ）及び水（１８９μＬ）に溶解させた。ＨＣｌ（水性、５Ｍ）（８３３μＬ、４．１７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２．５時間攪拌した。反応混合物を濃縮した。残渣にＡＣＮ（約１５ｍＬ）を添加し、濃縮した。これを、さらに２回繰り返して、化合物４４を白色発泡体として得た（２００ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ ＝ ０．３８９分 （８分方式）．^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０９−８．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９３−７．９０ （ｍ， １Ｈ）， ７．３０ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．５２ （ｓ， ４Ｈ）， ３．７１−３．６８ （ｍ， ４Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．１７ （ｂｓ， ３Ｈ）， ２．２２−２．１８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１５−２．１２ （ｍ， ２Ｈ）， １．５３−１．４７ （ｍ， ４Ｈ）．

【0426】

【化125】

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【0427】

工程９：ジオール化合物４４（１１０ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）及びＣＢｒ_４（２２８ｍｇ、０．６８７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．２９ｍＬ）に溶解させた。反応混合物にＰＰｈ_３（１８０ｍｇ、０．６８７ｍｍｏｌ）を添加すると、この時点で反応物は赤桃色に変色し、わずかに発熱した。反応物を、Ａｒ下、６時間攪拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（１０：１）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濃縮した。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＣＨ_２Ｃｌ_２、勾配、０％〜１０％）により精製して、化合物４５を得た（３０ｍｇ、収率２２％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．４６ （ｂｓ， １Ｈ）， ７．３２−７．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２６−７．１９ （ｍ， ２Ｈ）， ６．８９−６．８５ （ｍ， １Ｈ）， ４．６０ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ）， ４．４８ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ）， ３．９８ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ）， ３．７６ （ｂｓ， １Ｈ）， ３．６７ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３０ （ｂｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｂｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ）， ２．３０ （ｂｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ）， １．７０−１．６４ （ｍ， ４Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ４．３２６分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：６０５．１０ （Ｍ＋Ｈ）．

【0428】

【化126】

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【0429】

工程１０：化合物４６を、実施例１の化合物１１と同様に調製した。精製後、化合物４６を黄色固体として得た（４０ｍｇ、収率５９％）。ＬＣＭＳ＝４．７５１分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０３３．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0430】

【化127】

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【0431】

工程１１：化合物４７を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。Ｃ１８精製後、化合物４７を白色固体として得た（１４ｍｇ、収率３２％）。ＬＣＭＳ＝５．８５７分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０３５．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0432】

【化128】

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【0433】

工程１２：化合物４８を、実施例２の２２と同様に調製した。シリカプラグ後、化合物４８を黄色固体として得た（７ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ＝４．８１７分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０２１．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0434】

【化129】

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【0435】

工程１３：化合物４９を、実施例１の化合物１４と同様に調製した。Ｃ１８精製後、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝２−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−３，６，９，１２−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザヘプタデカン−１７−オアート、化合物４９を、白色固体として得た（６．５ｍｇ、収率７４％）。ＬＣＭＳ＝５．８０５分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１１１８．７（Ｍ＋Ｈ）。

【0436】

実施例５．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート（化合物８０）の合成

【0437】

【化130】

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【0438】

工程１：（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）及び（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル＝２−アミノプロパノアート塩酸塩（４．４８ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（４４．８ｍｌ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．７２ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．４３ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）、次いでＤＩＰＥＡ（９．７５ｍｌ、５６．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、化合物７１を得た（５．６ｇ、収率７１％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３９−７．３４ （ｍ， ５Ｈ）， ６．５４ （ｓ， １Ｈ）， ５．２８ （ｓ， １Ｈ）， ５．１５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４７−４．４３ （ｍ， １Ｈ）， ４．４８ （ｓ， １Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．４２−１．３７ （ｍ， ６Ｈ）．

【0439】

【化131】

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【0440】

工程２：化合物７１（５．６ｇ、１５．９８ｍｍｏｌ）を、メタノール（５０．７ｍＬ）及び水（２．５４ｍＬ）に溶解させた。溶液を、アルゴンで５分間パージした。パラジウム炭素（湿潤、１０％）（０．８５０ｇ、０．７９９ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。反応物を、水素雰囲気下、一晩攪拌した。溶液をセライト濾過し、メタノールですすぎ、濃縮した。残渣を、メタノール及びアセトニトリルとともに共沸させ、得られた油状物を高真空中に直接置いて、化合物７２を得た（３．５７ｇ、収率１００％）。これは次の工程で直接使用した。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．６７ （ｓ， １Ｈ）， ４．４９−４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ３．５４−３．４９ （ｍ， １Ｈ）， １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．４０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．３６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．

【0441】

【化132】

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【0442】

工程３：化合物７２（３．５７ｇ、１６．５１ｍｍｏｌ）及びアジピン酸モノメチル（２．６９ｍＬ、１８．１６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５５．０ｍＬ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．４８ｇ、１８．１６ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（（２．５３ｇ、１６．５１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（５．７７ｍＬ、３３．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で一晩攪拌した。反応物をジクロロメタン／メタノール（８０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、及びブラインで洗浄した。これを、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。化合物をアセトニトリル（５×）とともに共沸させ、次いで、３５℃にて、高真空でポンピングして、化合物７３を得た（５．９１ｇ、収率１００％）。粗物質は、精製することなく次の工程に用いた。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ６．６７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ６．２２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ４．５６−４．４９ （ｍ， １Ｈ）， ４．４６−４．３８ （ｍ， １Ｈ）， ３．６８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３７−２．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２７−２．２４ （ｍ， ２Ｈ）， １．７０−１．６８ （ｍ， ４Ｈ）， １．４７ （ｓ， ９Ｈ）， １．４０ （ｓ， ３Ｈ）， １．３８ （ｓ， ３Ｈ）．

【0443】

【化133】

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【0444】

工程４：化合物７３（５．９１ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（２５．４ｍＬ、３３０ｍｍｏｌ）及び脱イオン水（１．３ｍＬ）中、室温で３時間攪拌した。反応混合物をアセトニトリルとともに濃縮し、高真空中において乾固させ、粗化合物７４を得た（４．９９ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．４４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ，）， ６．９７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．８１−４．７３ （ｍ， １Ｈ）， ４．５９−４．５１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３９−２．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３１−２．２３ （ｍ， ２Ｈ）， １．７０−１．６１ （ｍ， ４Ｈ）， １．４８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．４０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）．

【0445】

【化134】

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【0446】

工程５：化合物７４（４．８ｇ、１５．８８ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１０１ｍＬ）及び無水メタノール（５０．４ｍＬ）に溶解させた。（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（２．３１６ｇ、１５．１２ｍｍｏｌ）及びＥＥＤＱ（７．４８ｇ、３０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去し、粗物質を、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）により精製して、化合物７５を得た（１．６５ｇ、収率２５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ８．１１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， ７．５２ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９７ （ｓ， １Ｈ）， ５．１５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４５ （ｓ， ４Ｈ）， ４．３９−４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ４．２８−４．２１ （ｍ， １Ｈ）， ３．５７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３０−２．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１７−２．１３ （ｍ， ２Ｈ）， １．５４−１．４５ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．２０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）．ＭＳ （ｍ／ｚ）：４６０．２ （Ｍ＋Ｎａ）^＋．

【0447】

【化135】

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【0448】

工程６：化合物７５（０．４８６ｇ、１．１１１ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（１．１０５ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１１．１１ｍＬ）に溶解させた。トリフェニルホスフィン（０．８７４ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で４時間攪拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で希釈し、水及びブラインで洗浄した。これを、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製して、化合物７６を得た（２５０ｍｇ、収率４０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ８．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）， ７．７６ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２２ （ｓ， １Ｈ）， ４．６６ （ｓ， ４Ｈ）， ４．３８−４．３１ （ｍ， １Ｈ）， ４．２５−４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ３．５６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３０−２．２７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１８−２．１５ （ｍ， ２Ｈ）， １．５３−１．５１ （ｍ， ４Ｈ）， １．３２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．２１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．

【0449】

【化136】

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【0450】

工程７：化合物７７を、実施例１の１１と同様に調製した。粗物質を、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）により精製して、化合物７７を得た（３４０ｍｇ、収率６０％、純度７７％）。ＬＣＭＳ＝５．８７分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９０．６（Ｍ＋１）^＋．

【0451】

【化137】

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【0452】

工程８：化合物７８を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。粗物質をＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水）で精製して、化合物７８を得た（１０３ｍｇ、収率３０％）。ＬＣＭＳ＝６．６５分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９２．７（Ｍ＋１）^＋．

【0453】

【化138】

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【0454】

工程９：化合物７８を、実施例２の２２と同様に調製した。粗物質を、シリカプラグに通して、化合物７９を得た（３８ｍｇ、収率５５％、純度７５％）。ＬＣＭＳ＝５．８３分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９７８．６（Ｍ＋１）^＋．

【0455】

【化139】

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【0456】

工程１０：化合物８０を、を、実施例１の化合物１４と同様に調製した。粗物質を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水）で精製して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｒ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート、化合物８０を得た（６．５ｍｇ、収率３０％）。ＬＣＭＳ＝６．５３分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０７５．７（Ｍ＋１）^＋及び１０９７．７（Ｍ＋Ｎａ）^＋．
実施例６．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート、化合物９０の合成

【0457】

【化140】

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【0458】

工程１：（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル＝２−アミノプロパノアート塩酸塩（４．４８ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（４４．８ｍＬ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（４．７２ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．４３ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（９．７５ｍＬ、５６．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を、アルゴン下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水、及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗油状物を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、化合物８１を得た（６．７ｇ、収率８５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．３８−７．３１ （ｍ， ５Ｈ）， ６．５３−６．４２ （ｍ， １Ｈ）， ５．４２−５．３３ （ｍ， １Ｈ）， ５．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．４８−４．４１ （ｍ， １Ｈ）， ４．３２−４．２０ （ｍ， １Ｈ）， １．４９ （ｓ， ９Ｈ）， １．４２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．３８ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）.

【0459】

【化141】

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【0460】

工程２：化合物８１（６．７ｇ、１９．１２ｍｍｏｌ）を、メタノール（６０．７ｍＬ）及び水（３．０３ｍＬ）に溶解させた。溶液をアルゴンで５分間パージした。パラジウム炭素（湿潤、１０％）（１．０１７ｇ、０．９５６ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。反応物を、水素雰囲気下、一晩攪拌した。溶液を、セライト濾過し、メタノールですすぎ、濃縮した。これを、メタノール及びアセトニトリルとともに共沸させ、得られた油状物を高真空中に直接置き、化合物８２を得た（４．０２ｇ、収率９７％）。これは次の工程で直接用いた。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．７８−７．６３ （ｍ， １Ｈ）， ４．４９−４．４２ （ｍ， １Ｈ）， ３．５５−３．５０ （ｍ， １Ｈ）， １．７３ （ｓ， ２Ｈ）， １．４８ （ｓ， ９Ｈ）， １．３９ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．３６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）．

【0461】

【化142】

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【0462】

工程３：化合物８２（４．０２ｇ、１８．５９ｍｍｏｌ）及びアジピン酸モノメチル（３．０３ｍＬ、２０．４５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６２．０ｍＬ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．９２ｇ、２０．４５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．８５ｇ、１８．５９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（６．４９ｍＬ、３７．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で一晩攪拌した。反応物を、ジクロロメタン／メタノール（１５０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、及びブラインで洗浄した。これを硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。化合物を、アセトニトリル（５×）とともに共沸させ、次いで３５℃にて、高真空でポンピングして、化合物８３を得た（６．６６ｇ、収率１００％）。粗物質は、精製することなく次の工程で用いた。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ６．７５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ６．４４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ４．５２−４．４４ （ｍ， １Ｈ）， ４．４３−４．３６ （ｍ， １Ｈ）， ３．６５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３５−２．２９ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２５−２．１８ （ｍ， ２Ｈ）， １．７１−１．６０ （ｍ， ４Ｈ）， １．４５ （ｓ， ９Ｈ）， １．３６ （ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ）．

【0463】

【化143】

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【0464】

工程４：化合物８３（５．９１ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（２８．６ｍＬ、３７２ｍｍｏｌ）及び脱イオン水（１．５ｍＬ）中、室温で３時間攪拌した。反応混合物をアセトニトリルとともに濃縮し、高真空中に置いて、粗化合物８４を粘着固体として得た（５．８８ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ_３）：δ ７．２１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ６．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ４．６９−４．６０ （ｍ， １Ｈ）， ４．５９−４．５１ （ｍ， １Ｈ）， ３．６９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４０−２．３３ （ｍ， ２Ｈ）， ２．３１−２．２４ （ｍ， ２Ｈ）， １．７２−１．６３ （ｍ， ４Ｈ）， １．５１−１．４５ （ｍ， ３Ｈ）， １．４２−１．３７ （ｍ， ３Ｈ）．

【0465】

【化144】

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【0466】

工程５：化合物８４（５．６ｇ、１８．５２ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１１８ｍＬ）及び無水メタノール（５８．８ｍＬ）に溶解させた。（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（２．７０ｇ、１７．６４ｍｍｏｌ）及びＥＥＤＱ（８．７２ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去して、酢酸エチルを添加した。得られたスラリーを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空／Ｎ_２下で乾燥させて、化合物８５を得た（２．７９ｇ、収率３６％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．０５， （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ）， ８．０１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ７．４６ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９５ （３， １Ｈ）， ５．２１−５．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ４．４７−４．４２ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４０−４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．３３−４．２４ （ｍ， １Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３３−２．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１６−２．０９ （ｍ， ２Ｈ）， １．５４−１．４６ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．２２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ４．４ Ｈｚ）．

【0467】

【化145】

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【0468】

工程６：化合物８５（０．５２ｇ、１．１８９ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（１．１８３ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１１．８９ｍＬ）に溶解させた。トリフェニルホスフィン（０．９３５ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴン下で４時間攪拌した。反応混合物を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製して、化合物８６を得た（２６２ｍｇ、収率３９％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．０１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ８．０３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ７．６７ （ｓ， ２Ｈ）， ７．２１ （ｓ， １Ｈ）， ４．７０−４．６４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４０−４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ４．３１−４．２３ （ｍ， １Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４−２．２６ （ｍ， ２Ｈ）， ２．１８−２．１０ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５−１．４５ （ｍ， ４Ｈ）， １．３１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．２１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）．

【0469】

【化146】

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【0470】

工程７：化合物８７を、実施例１の化合物１１と同様に調製した。粗物質を、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）により精製して、化合物８７を得た（３３６ｍｇ、収率７４％）。ＬＣＭＳ＝５．９１分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９０．６（Ｍ＋１）^＋．

【0471】

【化147】

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【0472】

工程８：化合物８８を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。粗物質を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水）で精製して、化合物８８を得た（８５．５ｍｇ、収率２５％）。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９２．６（Ｍ＋１）^＋．

【0473】

【化148】

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【0474】

工程９：化合物８８を、実施例２の２２と同様に調製した。粗物質を、シリカプラグに通して、化合物８９を得た（４８．８ｍｇ、収率８０％）。ＬＣＭＳ＝５．８９分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９７８．６（Ｍ＋１）^＋．

【0475】

【化149】

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【0476】

工程１０：化合物９０を、実施例１の１４と同様に調製した。粗物質を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、アセトニトリル／水）で精製して、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート、化合物９０を得た（８．２ｍｇ、収率３０％）。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０７５．４（Ｍ＋１）^＋．
実施例７．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝１−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザテトラデカン−１４−オアート（化合物６３）の合成

【0477】

【化150】

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【0478】

工程１：Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧｌｙＯＨ化合物５０（１．０ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）及びβ−アラニンメチルエステル・ＨＣｌ（４５３ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１２．３７ｍＬ）に溶解させた。反応混合物に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（６２３ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４９７ｍｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＥＡ（１．０８ｍＬ、６．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩攪拌した。翌日、白色沈殿物が大量に生じていた。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ（５：１、３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、及びブラインで洗浄した。有機層は濁った。有機層にＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を添加したところ、生成物が沈殿した。混合物を濾過し、固体を水（１０ｍＬ）及びＣＨ_３ＣＮ（２×１５ｍＬ）で洗浄して、精製することなく純粋な化合物５１を白色粉末として得た（８８０ｍｇ、収率７０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１６ （ｂｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ）， ８．１１ （ｂｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ７．８８−７．８５ （ｍ， １Ｈ）， ７．４９ （ｂｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ）， ７．４０−７．３１ （ｍ， ５Ｈ）， ５．０４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．５ Ｈｚ）， ３．６７ （ｔ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ）， ３．６０ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２９ （ｑ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）， ２．４７ （ｔ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）．

【0479】

【化151】

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【0480】

工程２：化合物５１（８７６ｍｇ、２．１４５ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２０．４ｍＬ）及び水（１．０２ｍＬ）に溶解させ、Ａｒでパージした。溶液を５分間脱気した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、５０％水で湿潤、２２８ｍｇ）を緩徐に添加した。バルーンからＨ_２を１分間吹き込んだ。反応物を、Ｈ_２バルーン下、一晩攪拌した。反応混合物にＨ_２Ｏ（約３ｍＬ）を添加して、生じた白色固体を全て溶解させた。次いで、溶液をセライト濾過し、濾過ケーキをＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。残渣をＣＨ_３ＣＮ（２０ｍＬ）に溶解させ、濃縮した。これを、さらに２回繰り返した。得られたガム状固体にＣＨ_３ＣＮ（約１５ｍＬ）を添加して、固体を沈殿させた。濃厚白色スラリーを１０分間攪拌し、濾過し、ＣＨ_３ＣＮで洗浄した。固体を真空／Ｎ_２下で１．５時間乾燥させ、化合物５２を白色固体として得た（４５０ｍｇ、収率７６％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１８−８．１２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．８８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ）， ３．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．６５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ）， ３．６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３３−３．２７ （ｍ， ４Ｈ）， ２．４７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， １．９４ （ｂｓ， １Ｈ）．

【0481】

【化152】

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【0482】

工程３：トリメチルベンゼン−１，３，５−トリカルボキシラート化合物５３（５ｇ、１９．８２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（６６．１ｍＬ）及び水（１３．２２ｍＬ）に溶解させて攪拌した溶液に、ＮａＯＨ（１．６６５ｇ、４１．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、Ａｒ下、３時間還流させた。大量の白色沈殿物が生じた。溶液を室温に冷却し、固体が全て溶解するまでＨ_２Ｏで希釈した。混合物を水性５ＮのＨＣｌでｐＨ約２〜３まで酸性にし、ＥｔＯＡｃ（３×）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物を温ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解させ、室温まで緩徐に冷却した。沈殿物を濾過した（沈殿物は副生成物であり生成物ではなかった）。母液を濃縮して、化合物５４を白色固体として得た（３．４５ｇ、収率７８％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．６２ （ｂｓ， ２Ｈ）， ８．６５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．９３ （ｓ， ３Ｈ）．ＬＣＭＳ ＝ ３．２０９分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：２４４．９０ （Ｍ＋Ｈ）．

【0483】

【化153】

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【0484】

工程４：二酸化合物５４（１．０ｇ、４．４６ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１７．８４ｍＬ）に溶解させた。溶液を０℃に冷却し、Ａｒ下、ＢＨ_３・ＤＭＳ（ＴＨＦ中２Ｍ）（８．９２ｍＬ、１７．８４ｍｍｏｌ）を緩徐に添加した。反応物を０℃で５分間攪拌し、次いで室温まで昇温させて、一晩攪拌した。反応物を空気にさらし、ＭｅＯＨで緩徐にクエンチし、続いて、気体の発生が観測されなくなるまでＨ_２Ｏを緩徐に添加した。混合物をＥｔＯＡｃ（２×）で抽出し、層を分離させた。有機層を、約３％Ｈ_２Ｏ_２水、クエン酸水溶液、及びブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、２０％〜１００％）により精製して、ジオール化合物５５を白色固体として得た（３８５ｍｇ、収率４４％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００Ｍ Ｈｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８１ （ｓ， ２Ｈ）， ７．５２ （ｓ， １Ｈ）， ５．３３ （ｂｓ， ２Ｈ）， ４．５６ （ｓ， ４Ｈ）， ３．８６ （ｓ， ３Ｈ）．

【0485】

【化154】

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【0486】

工程５：ジオール化合物５５（３２０ｍｇ、１．６３１ｍｍｏｌ）を、Ａｒ下、ＤＣＭ（１０．９ｍＬ）に溶解させた。溶液を−５℃に冷却し、ＴＥＡ（０．５６８ｍＬ、４．０８ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＭｓＣｌ（０．２９２ｍＬ、３．７５ｍｍｏｌ）を緩徐に添加したが、この時点で、添加すると直ちに色が黄色く変色し、次いで暗赤色／褐色に変色した。反応混合物を、Ａｒ下、−５℃で１．５時間攪拌した。反応混合物を氷水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２×）で抽出した。有機層を、水（２×）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、粗ジメシラート化合物５６を得た（４３５ｍｇ、収率７６％）。

【0487】

【化155】

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【0488】

工程６：ジメシラート化合物５６（４３５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦに溶解させた（５．５５ｍＬ）。ＩＧＮ単量体化合物１０（７１９ｍｇ、２．４４４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＫ_２ＣＯ_３（３８４ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を添加し、Ａｒ下、室温で一晩攪拌した。水（２０ｍＬ）を添加したところ、生成物が沈殿した。スラリーを５分間攪拌し、濾過し、真空／Ｎ_２下、１．５時間乾燥させた。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、勾配、５０％〜１００％、次いで５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、化合物５７を黄色固体として得た（５３５ｍｇ、収率６４％、２工程）。ＬＣＭＳ＝６．９７３分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：７４９．４（Ｍ＋Ｈ）．

【0489】

【化156】

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【0490】

工程７：化合物５７（１００ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＥ（１．３４ｍＬ）に溶解させた。トリメチルスタンナノール（３６２ｍｇ、２．００３ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で一晩加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水で希釈した。水層を１ＭのＨＣｌでｐＨ約４まで酸性にし、ＤＣＭ（３×）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物をショートシリカプラグに詰めて、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１、５０ｍＬ）で洗浄し、濃縮して、化合物５８を淡黄色固体として得た（１００ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ＝５．８７２分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：７３５．３（Ｍ＋Ｈ）．

【0491】

【化157】

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【0492】

工程８：酸化合物５８（８０ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）及びアミン化合物５２（３６ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦに溶解させた（８７１μＬ）。ＥＤＣ・ＨＣｌ（２５ｍｇ、０．１３１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１０．６ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で４時間攪拌した。水（４ｍＬ）を添加したところ、生成物が沈殿した。スラリーを５分間攪拌し、濾過し、真空／Ｎ_２下で乾燥させた。粗残渣を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、勾配、０％から２０％へ）により精製して、化合物６０を黄色固体として得た（３７ｍｇ、収率４３％）。ＬＣＭＳ＝４．６０５分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９９１．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0493】

【化158】

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【0494】

工程９：化合物６１を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。Ｃ１８精製後、化合物６１を白色固体として得た（８ｍｇ、収率２５％）。ＬＣＭＳ＝５．４２１分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９９３．７（Ｍ＋Ｈ）．

【0495】

【化159】

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【0496】

工程１０：化合物６２を、実施例２の化合物２２と同様に調製した。ショートシリカプラグに詰めた後、粗化合物６２を黄色固体として得た（１３ｍｇ、収率９０％）。ＬＣＭＳ＝４．６９３分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９７９．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0497】

【化160】

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【0498】

工程１１：化合物６３を、実施例１の化合物１４と同様に調製した。Ｃ１８精製後、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝１−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）−１，４，７，１０−テトラオキソ−２，５，８，１１−テトラアザテトラデカン−１４−オアート、化合物６３を、白色固体として得た（４ｍｇ、収率３１％）。ＬＣＭＳ＝５．４９５分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０７６．７（Ｍ＋Ｈ）．
実施例８．
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル＝３−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンズアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）プロパノアート（化合物７０）の合成

【0499】

【化161】

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【0500】

工程１：Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ化合物６４（３．０ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ）及びβ−アラニンメチルエステル・ＨＣｌ（１．５６５ｇ、１１．２１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦに溶解させた（２０．３９ｍＬ）。ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．１５０ｇ、１１．２１ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１．５６１ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（４．４４ｍＬ、２５．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をＡｒ下、室温で一晩攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ_３、及びブラインで洗浄した。有機層にヘキサンを添加したところ、この時点で溶液は濁り、沈殿が生じた。スラリーを数分間攪拌し、濾過し、固体をＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）で洗浄した。固体を真空／Ｎ_２下で乾燥させて、純粋な化合物６５を白色固体として得た（３．１１ｇ、収率８０％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ７．９１ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ７．４６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ）， ６．３９−７．３０ （ｍ， ５Ｈ）， ５．０２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ）， ４．２０ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， ４．０４ （ｐ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ）， ３．５９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３０−３．２２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４５ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．１８ （見かけ上ｔ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）．ＬＣＭＳ ＝ ３．９４２分 （８分方式）．質量観測値 （ＥＳＩ^＋）：３８０．１０ （Ｍ＋Ｈ）．

【0501】

【化162】

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【0502】

工程２：化合物６５（１．０ｇ、２．６４ｍｍｏｌ）を、メタノール（１２．５５ｍＬ）、水（０．６２８ｍＬ）、及びＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解させた。溶液をＡｒでパージし、次いで５分間脱気した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、５０％水で湿潤、０．１４０ｇ）を緩徐に添加した。溶液にＨ_２を１分間吹き込み、反応物をＨ_２バルーン（１ａｔｍ）下で一晩さらに攪拌した。反応混合物をセライト濾過し、ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）で洗浄し、濃縮した。残渣にＣＨ_３ＣＮ（１５ｍＬ）を添加し、濃縮した。これをさらに２回繰り返して、化合物６６をオフホワイト色固体として得た（６５０ｍｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．０３−７．９９ （ｍ， ２Ｈ）， ４．２４−４．１８ （ｍ， １Ｈ）， ３．６０ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３１−３．２２ （ｍ， ５Ｈ）， ２．４６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， １．１７ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， １．１２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．９ Ｈｚ）．

【0503】

【化163】

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【0504】

工程３：化合物６７を、実施例７の６０と同様に調製した。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー後、化合物６７を黄色固体として得た（６９ｍｇ、収率５３％）。ＬＣＭＳ＝４．８４３分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９６２．２５（Ｍ＋Ｈ）．

【0505】

【化164】

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【0506】

工程４：化合物６８を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。Ｃ１８精製後、化合物６８を白色固体として得た（１１．５ｍｇ、収率１９％）。ＬＣＭＳ＝５．１３６分（８分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９６４．３５（Ｍ＋Ｈ）．

【0507】

【化165】

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【0508】

工程５：化合物６９を、実施例２の化合物２２と同様に調製した。ショートシリカプラグに詰めた後、粗化合物６９を黄色固体として得た（１３ｍｇ、収率１００％）。ＬＣＭＳ＝５．６４０分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：９５０．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0509】

【化166】

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【0510】

工程６：化合物７０を、を、実施例１の化合物１４と同様に調製した。Ｃ１８精製後、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル−３−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンズアミド）プロパンアミド）プロパンアミド）プロパノアート、化合物７０を白色固体として得た（５ｍｇ、収率３５％）。ＬＣＭＳ＝６．１３８分（１５分方式）．質量観測値（ＥＳＩ^＋）：１０４７．４（Ｍ＋Ｈ）．
実施例９．
（１２Ｓ，１２ａＳ）−９−（（３−（２−（２−（２−（４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド）アセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンジル）オキシ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−１２−スルホン酸（化合物９８）の合成

【0511】

【化167】

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【0512】

工程１：化合物４（２．０ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）及び４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタン酸（１．７４３ｇ、８．９７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２７．２ｍＬ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．７１９ｇ、８．９７ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１．２４９ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＤＩＰＥＡ（２．８５ｍＬ、１６．３１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。反応物をジクロロメタン／メタノール（５：１）で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、及びブラインで洗浄した。これを、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗油状物を、アセトニトリル（３×）とともに共沸させ、次いで３５℃で、高真空でで約１．５時間ポンピングして、化合物９１を得た。これを、さらに精製することなく使用した（３．４４ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１８−８．０９ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７６−３．６８ （ｍ， ６Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８−２．２１ （ｍ， ２Ｈ）， １．８４−１．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６Ｈ）．

【0513】

【化168】

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【0514】

工程２：化合物９１（３．４４ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（１２．５６ｍＬ、１６３ｍｍｏｌ）及び脱イオン水（０．６５ｍＬ）中、室温で３．５時間攪拌した。反応物をアセトニトリルで希釈し、乾固するまで蒸発させた。粗固体を酢酸エチルに添加してスラリーとし、濾過し、酢酸エチル、次いでジクロロメタン／メタノール（１：１）ですすいで、化合物９２を得た（２．９８ｇ、収率１００％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．１９−８．０８ （ｍ， ３Ｈ）， ３．８０−３．６８ （ｍ， ６Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８−２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， １．８５−１．７６ （ｍ， ２Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６Ｈ）．

【0515】

【化169】

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【0516】

工程３：化合物９２（１．７４ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３０．２ｍＬ）及びメタノール（１５．１１ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（２．２４３ｇ、９．０７ｍｍｏｌ）及び（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（０．６９５ｇ、４．５３ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去し、酢酸エチルを添加した。固体をセライト濾過し、酢酸エチル、次いでメタノールで洗浄した。濾液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）により精製して、化合物９３を得た（５６９ｍｇ、収率２５％）。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ９．７４ （ｓ， １Ｈ）， ８．２４−８．１５ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４５ （ｓ， ２Ｈ）， ６．９６ （ｓ， １Ｈ）， ５．１７ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ）， ４．４５ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ，）， ３．８７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ，）， ３．７７ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ，）， ３．７３ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ５．６ Ｈｚ，）， ２．４０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８−２．２１ （ｍ， ２Ｈ）， １．８３−１．７６ （ｍ， ２Ｈ）， １．２４ （ｓ， ６Ｈ）．

【0517】

【化170】

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【0518】

工程４：化合物９３（３０５ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）を、無水ＤＣＭ（５．９９２ｍＬ）に懸濁させた。溶液が均質になるまで、無水ＤＭＦを添加した（約２．５ｍＬ）。溶液を、アセトン／ドライアイス浴で−１０℃に冷却した。トリエチルアミン（０．４２５ｍＬ、３．０５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてメタンスルホン酸無水物（２７４ｍｇ、１．５２３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を−１０℃で１時間攪拌した。反応物を氷水でクエンチし、冷酢酸エチル／メタノール（２０：１）で抽出した。有機層を氷水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を高真空で乾燥させ、化合物９４を得た（３８０ｍｇ、収率９５％）。ＬＣＭＳ＝４．２分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：６５５．０（Ｍ−１）⁻．

【0519】

【化171】

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【0520】

工程５：化合物９５を、実施例７の化合物５７と同様に調製した。粗固体を、ジクロロメタン／メタノール（１０：１）に溶解させ、水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）により精製して、化合物９５を得た（４４５ｍｇ、収率４２％、純度５４％）。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０５３．４（Ｍ＋１）^＋及び１０５１．３（Ｍ−１）⁻．

【0521】

【化172】

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【0522】

工程６：化合物９５（４４５ｍｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）を、１，２−ジクロロエタン（２．８２ｍＬ）に溶解させた。室温でトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（８０ｍｇ、０．３５９ｍｍｏｌ）を添加し、１時間攪拌した。反応物をジクロロメタンで希釈し、飽和塩化アンモニウムで洗浄した。有機層を、ブラインで洗浄し、乾燥させて、化合物９５、９６、及び９６ａの混合物を得た（４９６ｍｇ）。この粗混合物を、２−プロパノール（３９．１７ｍＬ）及び水（１９．５９ｍＬ）に溶解させた。重亜硫酸ナトリウム（２４５ｍｇ、２．３５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３．５時間攪拌した。混合物を凍結乾燥させて、綿状白色固体を得て、これをＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８、アセトニトリル／水）により精製して、化合物９７（５４ｍｇ、収率１０％）及び化合物９６ａ（２４ｍｇ、収率５％）を得た。ＬＣＭＳ（化合物９７）＝４．８３分（１５分方式）及びＬＣＭＳ（化合物９６ａ）＝８．０５分（１５分方式）．

【0523】

【化173】

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【0524】

工程７：化合物９７（５４ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＣＮ（３．８５ｍＬ）に溶解させて攪拌した溶液に、調製したばかりのＴＣＥＰ／ｐＨ６．５緩衝溶液（ＴＣＥＰ・ＨＣｌ（４６．７ｍｇ）添加し、脱イオン水数滴を溶解させ、続いてｐＨ約６．５になるまで飽和重炭酸ナトリウムを滴下した。この溶液を、ｐＨ＝６．５の１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液０．５５ｍＬ及びメタノール（２．７５ｍＬ）で希釈した。混合物を、室温で３時間攪拌し、次いで凍結乾燥させた。固体をＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８、アセトニトリル／水）により精製して、（１２Ｓ，１２ａＳ）−９−（（３−（２−（２−（２−（４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド）アセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）−５−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンジル）オキシ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−１２−スルホン酸、化合物９８（２ｍｇ、収率４％）を得た。ＬＣＭＳ＝４．３２分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０８９．３（Ｍ−１）⁻．
実施例１０．
Ｎ−（２−（（２−（（２−（（３，５−ビス（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド（化合物９９）の合成

【0525】

【化174】

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【0526】

化合物９９を、実施例９の化合物９８と同様に調製した。Ｃ１８精製後、Ｎ−（２−（（２−（（２−（（３，５−ビス（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−２−オキソエチル）−４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド、化合物９９を白色固体として得た（６．３ｍｇ、収率２７％）。ＬＣＭＳ＝７．２６分（１５分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０３３．５（Ｍ＋Ｎａ）^＋．
実施例１１．ｈｕＭＯＶ１９−１４の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び８モル当量の化合物１４（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で６時間にわたって、コンジュゲートさせた。

【0527】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、２０時間透析を行った。

【0528】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して３．０のＩＧＮ９１分子が結合しており（化合物１４に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９０％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物１４が＜０．１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が０．７８ｍｇ／ｍｌであることがわかった。コンジュゲートした抗体は、ゲルチップ分析により、＞８７％インタクトであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ａに示す。

【0529】

実施例１２．ｈｕＭＯＶ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−９８の調製
最終濃度３．９ｍＭの化合物９８及び３ｍＭのスルホ−ＳＰＤＢリンカーを含有するｉｎ ｓｉｔｕ混合物を含む、１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有するＤＭＡを６０分間インキュベートした後、得られた化合物９８−スルホ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳを２０倍過剰量で、４ｍｇ／ｍｌのｈｕＭＯＶ１９抗体を含有する反応物を含む１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５（９０：１０の水：ＤＭＡ）に添加した。溶液を２５℃で一晩かけてコンジュゲートさせた。

【0530】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、１００ｍＭアルギニン、２０ｍＭヒスチジン、２％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０，０００ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、一晩透析を行った。

【0531】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して３．７分子の化合物９８が結合しており（化合物９８に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＳＥＣによるもの）、９９％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、かつ最終タンパク質濃度が０．１８ｍｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ａに示す。

【0532】

実施例１３．ｈｕＭＯＶ１９−３５の調製
２．５ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び５モル当量の化合物３５（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で６時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0533】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、室温で、８時間透析を行った。

【0534】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．９分子の化合物３５が結合しており（ＩＧＮ１２８に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９７％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物３５が＜１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．４ｍｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ａに示す。
実施例１４．ｈｕＭＯＶ１９−６３の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び７モル当量の化合物６３（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で６時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0535】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、２０時間透析を行った。

【0536】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．７分子の化合物６３が結合しており（ＩＧＮ１３１に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９９％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物６３が＜０．１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．６ｍｇ／ｍｌであることがわかった。コンジュゲートした抗体は、ゲルチップ分析により、＞９０％インタクトであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ｂに示す。
実施例１５．ｈｕＭＯＶ１９−８０の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び７モル当量の化合物８０（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で６時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0537】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、２０時間透析を行った。

【0538】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．５分子の化合物８０が結合しており（化合物８０に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９９％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物８０が＜０．１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が２．４ｍｇ／ｍｌであることがわかった。コンジュゲートされた抗体は、ゲルチップ分析により、＞９０％インタクトであることがわかった。
実施例１６．ｈｕＭＯＶ１９−９０の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び３．９モル当量の化合物９０（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９５：５のＤＭＡ：５０ｍＭコハク酸、ｐＨ５．５を用いて、２５℃で４時間前処理したもの）を含有する反応物を含む１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で４時間インキュベートした。反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、１０ｍＭコハク酸化合物、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ｗ／ｖスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウムｐＨ６．２配合緩衝液へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液で、室温で４時間、次いで４℃で一晩、透析を行った。

【0539】

精製したコンジュゲートは、最終タンパク質濃度が１．８ｍｇ／ｍｌであり、１抗体あたり平均して２．７分子の化合物９０が結合しており（ＩＧＮ１５２に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９８．３％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、かつコンジュゲートされていない化合物９０が＜１．１％（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）であることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ｂに示す。
実施例１７．ｈｕＭＯＶ１９−４９の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び５モル当量の化合物４９（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で４時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0540】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、室温で、４時間透析を行った。

【0541】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．８分子の化合物４９が結合しており（化合物４９に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９４％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物４９が＜０．１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．５ｍｇ／ｍｌであることがわかった。コンジュゲートした抗体は、ゲルチップ分析により、＞９５％インタクトであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ｃに示す。
実施例１８．ｈｕＭＯＶ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−９９の調製
最終濃度１．９５ｍＭの化合物９９及び１．５ｍＭのスルホ−ＳＰＤＢリンカーを含有するｉｎ ｓｉｔｕ混合物を含む、１０ｍＭのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を含有するＤＭＡを２０分間インキュベートしてから、４ｍＭのマレイミドプロピオン酸ＭＰＡでキャップした。得られた９９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳを６倍過剰量で、２．５ｍｇ／ｍｌのｈｕＭＯＶ１９抗体を含有する反応物を含有する１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５（８２：１８の水：ＤＭＡ）に添加した。溶液を２５℃で一晩かけてコンジュゲートさせた。

【0542】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液で、４℃で、一晩透析を行った。

【0543】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して１．６分子の化合物９９が結合しており（化合物９９に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９９％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、かつ最終タンパク質濃度が０．５９ｍｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ｃに示す。
実施例１９．ｈｕＭＯＶ１９−７０の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び５モル当量の化合物７０（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で４時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0544】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭアルギニン、２％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。精製後、Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、１８時間透析を行った。

【0545】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して３．０分子の化合物７０が結合しており（化合物７０に対するε_{３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対するε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９４％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物７０が＜０．１％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．３ｍｇ／ｍｌであることがわかった。

【0546】

実施例２０．ｈｕＭＯＶ１９−２３の調製
２．５ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＯＶ１９抗体及び４モル当量の化合物２３（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：水で前処理したもの）を含有する反応物を含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で６時間にわたってコンジュゲートさせた。

【0547】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２５０ｍＭグリシン、１０ｍＭヒスチジン、１％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウム配合緩衝液（ｐＨ６．２）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、室温で、８時間透析を行った。

【0548】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．８分子の化合物２３が結合しており（化合物２３に対してε_{３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及びε_{２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対してε_{２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いたＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９８％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、コンジュゲートされていない化合物２３が＜３％であり（アセトン沈殿、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．３ｍｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図７Ｄに示す。

【0549】

実施例２１．ｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲート、ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲート、及びｈｕＭＯＶ１９−１０７コンジュゲートの結合親和性についてのフローサイトメトリーアッセイ
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、丸底）中、１００μｌ／ウェルのコンジュゲートｈｕＭＯＶ１９−１４、ｈｕＭＯＶ１９−９０、もしくはｈｕＭＯＶ１９−１０７、または抗体ｈｕＭＯＶ１９を、開始濃度３×１０^−８ＭでＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ、１×ＰＢＳ）で希釈してそれを２回繰り返し、続けて４℃にて、ＦＡＣＳ緩衝液で３倍に系列希釈した。熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び０．２ＩＵのウシインシュリン／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させたＴ４７Ｄ細胞（ヒト乳腺腫瘍）を、ＰＢＳで１回洗浄し、ヴェルセン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）で取り出した。Ｔ４７Ｄ細胞を増殖培地（上記参照）に再懸濁させて、ヴェルセンを中和し、コールターカウンターで計数した。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、その洗浄の間に１２００ｒｐｍで５分間遠心した。１００μｌ／ｍｌの２×１０^４細胞／ウェルを、コンジュゲート、抗体、またはＦＡＣＳ緩衝液のみを含んだウェルに添加し、４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を上記のように遠心し、２００μｌ／ウェルの冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次いで、細胞を、２００μｌ／ウェルのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃγ二次抗体（対照に含まれるのは、未染色細胞及び二次抗体のみで染色されたものであった）を用いて４℃で４０分間染色し、遠心し、２００μｌ／ウェルの冷ＰＢＳ−Ｄで１回洗浄した。細胞を２００μｌ／ウェルの１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ−Ｄで固定し、４℃で保存した。保存後、コンジュゲートまたは抗体の細胞表面染色を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーを用いて検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、幾何平均をコンジュゲートまたは抗体の対数濃度に対してプロットし、ＥＣ_５０を非線形４−パラメーターロジスティック回帰分析で計算した。

【0550】

ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートについての結合アッセイを繰り返した。データを図１５Ｂに示す。
図１、図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図２０に示すとおり、コンジュゲートは、未結合抗体と同様に、フローサイトメトリーにおいて、標的抗原を発現するＴ４７Ｄ細胞の表面に結合し、これにより、結合が、コンジュゲート形成プロセスにより影響されないことが実証される。
実施例２２．ｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲートの細胞障害性アッセイ
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、丸底）中、１００μｌ／ウェルのｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲートを、開始濃度３．５×１０^−９Ｍ〜３．５×１０^−８Ｍで、熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈してそれを３回繰り返し、周辺温度にて、この培地で３倍に系列希釈した。熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中で増殖させたＫＢ細胞（頬側上皮性腫瘍）を、ＰＢＳで１回洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）で取り出した。ＫＢ細胞を増殖培地（上記参照）に再懸濁させて、トリプシンを中和し、コールターカウンターで計数した。１００μｌ／ｍｌの１×１０^３細胞／ウェルを、コンジュゲートまたは培地のみを含有するウェルに添加し、１μＭのブロッキング抗ＦＯＬＲ１抗体（ｈｕＭＯＶ１９）とともに、またはなしで、５％ＣＯ_２の３７℃インキュベーター中で５日間インキュベートした。合計体積は、２００μｌ／ウェルである。インキュベーション後、２０μｌ／ウェルのＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加して、２時間発現させることにより、細胞生存度を分析した。プレートリーダーで、４５０及び６２０ｎｍの吸光度を読み取った。４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を差し引いた。補正した吸光度から、培地のみを含有するウェルのバックグラウンドをさらに差し引き、未処理細胞の生存率（ＳＦ）をエクセルで計算した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、ＡＤＣ濃度（Ｍ）対ＳＦのＸＹグラフを作成した。

【0551】

図２に示すとおり、コンジュゲートは、ＫＢ細胞に対して非常に強力であり、ＩＣ_５０が４×１０^−１２Ｍである。コンジュゲートされていない抗体を過剰に添加すると細胞障害性効果が顕著に低下する。このことにより、抗原特異性が実証される。
実施例２３．ｈｕＭＯＶ１９−１４コンジュゲート及びｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートのバイスタンダー細胞障害性アッセイ
９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、丸底）中、１００μｌ／ウェルのｈｕＭＯＶ１９−１４またはｈｕＭＯＶ１９−９０を、１ｅ−１０Ｍ〜４ｅ−１０Ｍの濃度で、熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びβＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈してそれを６回繰り返した。組換えＦＯＬＲ１（ＦＲ１＃１４）を発現する、または発現ベクター（親）を発現しない３００．１９細胞（マウス）の両方を、コールターカウンターで計数した。コンジュゲートまたは培地のみを含有するあるウェルには５０μｌ／ｍｌの１０００個のＦＲ１＃１４細胞／ウェルを添加し、コンジュゲートまたは培地のみを含有するあるウェルには５０μｌ／ｍｌの２０００個の親細胞／ウェルを添加し、さらにコンジュゲートまたは培地のみを含有するあるウェルにはＦＲ１＃１４及び親細胞の両方を一緒に添加した。全てのプレートを５％ＣＯ_２の３７℃インキュベーター中で４日間インキュベートした。合計体積は、１５０μｌ／ウェルであった。インキュベーション後、７５μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し４５分間発現させることにより、細胞生存度を分析した。発光をルミノメーターで読み取り、培地のみを含有するウェルのバックグラウンドを全ての値から差し引いた。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、各細胞処理の平均の棒グラフを作成した。

【0552】

図３に示すとおり、コンジュゲートｈｕＭＯＶ１９−１４は、隣接する抗原陰性細胞に対して弱いバイスタンダー細胞障害性効果を発揮する。
図１３に示すとおり、コンジュゲートｈｕＭｏｖ１９−９０は、強力なバイスタンダー殺傷活性を発揮する。
実施例２４．ｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートのＩｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性アッセイ
適切な培地中、１ウェルあたり２×１０^３〜１×１０^４の細胞を含有する９６ウェルプレートの各ウェルに、コンジュゲートの希釈液を添加した。細胞及び培地を含有するが、試験化合物を含んでいない対照ウェル、ならびに培地のみを含有するウェルを、各アッセイプレートに含ませた。プレートを、６％ＣＯ_２含有加湿雰囲気中、３７℃で、４〜６日間、インキュベートした。次いで、ＷＳＴ−８試薬、１０％ｖ／ｖ、（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をウェルに添加し、プレートを３７℃で２〜６時間インキュベートした。次いで、プレートリーダー分光光度計で、二重波長モード４５０ｎｍ／６５０ｎｍにて吸光度を測定し、６５０ｎｍでの吸光度（細胞による非特異的光散乱）を差し引いた。最初に培地バックグラウンド吸光度を補正し、次いで各値を対照ウェル（未処理細胞）での値の平均で除算することにより、各ウェルの細胞の見かけ上生存率を計算した。

【0553】

図３に示すとおり、コンジュゲートは、種々の抗原陽性癌細胞に対して非常に強力であり、一方、抗原陰性Ｌ−５４０細胞は、同じコンジュゲートに暴露された場合なおも生存し続ける。
実施例２５．ｈｕＭｙ９−６−１４コンジュゲートのバイスタンダー細胞障害性アッセイ
予備試験を行って、抗原陰性ＲＡＤＡ−１細胞に対しては細胞障害性ではないが、抗原陽性ＫＡＲＡ細胞を全て殺傷するｈｕＭｙ９−６−１４濃度を求めた。ＲＡＤＡ−１（１ウェルあたり５００個の細胞）及びＫＡＲＡ（１ウェルあたり５００、１０００、２０００、４０００個の細胞）を、９６ウェル丸底プレートに播種した。ｈｕＭｙ９−６−１４の希釈液を、細胞培養培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清及び５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）で調製し、細胞に添加した。プレートを、３７℃で４日間インキュベートし、各ウェルの細胞生存度を、ＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて測定した。コンジュゲートのバイスタンダー効力を試験するため、ＲＡＤＡ−１及びＫＡＲＡ細胞を、様々な比（５００個のＲＡＤＡ−１細胞＋０個のＫＡＲＡ細胞、５００個のＲＡＤＡ−１細胞＋５００個のＫＡＲＡ細胞、５００個のＲＡＤＡ−１細胞＋１０００個のＫＡＲＡ細胞、５００個のＲＡＤＡ−１細胞＋２０００個のＫＡＲＡ細胞、５００個のＲＡＤＡ−１細胞＋４０００個のＫＡＲＡ細胞）を一緒に混合して、９６ウェル丸底プレートに播種した。次いで、１．０ｅ−９Ｍまたは５．０ｅ−１０ＭのｈｕＭｙ９−６−１４（ＲＡＤＡ−１細胞に対しては細胞障害性ではないが、ＫＡＲＡ細胞を全て殺傷する濃度）を、細胞混合物に添加した。プレートを３７℃で、４日間インキュベートし、各ウェルのＲＡＤＡ−１細胞生存度を、ＷＳＴ−８試薬（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて測定した。プレートリーダー分光光度計で、二重波長モード４５０ｎｍ／６５０ｎｍにて吸光度を測定し、６５０ｎｍでの吸光度（細胞による非特異的光散乱）を差し引いた。

【0554】

図５に示すとおり、コンジュゲートは、隣接する抗原陰性細胞に対してバイスタンダー殺傷効果を発揮する。
実施例２６．メスＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ２１１０ ＮＳＣＬＣ異種移植片に対するｈｕＭＯＶ１９−８０及びｈｕＭＯＶ１９−９０の単回投与での抗腫瘍活性
６週齢のメスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。１×１０^７のＮＣＩ−Ｈ２１１０腫瘍細胞を５０％マトリゲル／無血清培地０．１ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射によりマウスの右側腹部に播種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に到達した時点で（播種後７日目）、マウスを、腫瘍体積に基づいて、５つの群（各群６匹）に無作為化した。マウスには、１日目（播種後８日目）に、ビヒクル対照（０．２ｍｌ／マウス）、ｈｕＭＯＶ１９−８０、またはｈｕＭＯＶ１９−９０をｈｕＭＯＶ１９−８０またはｈｕＭＯＶ１９−９０濃度に基づいて５及び２５μｇ／ｋｇで、単回ＩＶ投与した。ｈｕＭＯＶ１９は、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）と選択的に結合するヒト化モノクローナル抗体である。

【0555】

腫瘍の大きさを、週に２〜３回、ノギスを用いて三次元計測した。腫瘍体積は、式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用いて、ｍｍ^３で表した。マウスで腫瘍体積が５０％以上減少した場合は部分退縮（ＰＲ）が発生したと判断し、触知できる腫瘍を検出することができなかった場合に完全腫瘍退縮（ＣＲ）が発生したと判断した。腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアで求めた。腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）は、以下の式：
Ｔ／Ｃ（％）＝処置マウスの腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００
を用いて求めた。

【0556】

ビヒクル対照の腫瘍体積が所定の大きさの１０００ｍｍ^３に到達した時点で、処置群（Ｔ）及びビヒクル対照群（Ｃ）の腫瘍体積を同時に求めた。腫瘍を持たないマウス（０ｍｍ^３）を含む各処置群の毎日の腫瘍体積中央値を求めた。ＮＣＩ基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が、抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％の場合は、抗腫瘍活性レベルが高いと判断される。

【0557】

図６に示すとおり、ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートは、５及び２５μｇ／ｋｇの用量両方で活性が高く、一方、ｈｕＭＯＶ１９−８０コンジュゲートは、２５μｇ／ｋｇの用量で活性が高い。
実施例２７．ｈｕＭＬ６６−９０の調製
２．０ｍｇ／ｍＬのｈｕＭＬ６６抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（ＷＯ２０１２／０５８５９２参照、参照によりその全体が本明細書中に援用される）、及び３．５モル当量の化合物９０（５倍過剰量の重亜硫酸ナトリウムを含む９０：１０のＤＭＡ：５０ｍＭコハク酸化合物ｐＨ５．５で、２５℃で４時間前処理したもの）を含有する反応物を含む１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）ｐＨ８．５緩衝液及び１５％ｖ／ｖＤＭＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド）共溶媒を、２５℃で４時間インキュベートした。反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％ｗ／ｖスクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ重亜硫酸ナトリウムｐＨ６．２配合緩衝液へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、室温で４時間、次いで４℃で一晩、透析を行った。

【0558】

精製したコンジュゲートは、最終タンパク質濃度が０．９ｍｇ／ｍｌであり、１抗体あたり平均して２．７分子の化合物９０が結合しており（化合物９０に対して_{ε３３０ｎｍ}＝１５，２８０ｃｍ−１Ｍ−１及び_{ε２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ−１Ｍ−１、ならびにｈｕＭＬ６６抗体に対して_{ε２８０ｎｍ}＝２０５，５２０ｃｍ−１Ｍ−１のモル吸光係数を用いてＵＶ−Ｖｉｓによるもの）、９９．１％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、かつコンジュゲートされていないＩＧＮ１４９が＜１％である（二重カラム、逆相ＨＰＬＣ分析によるもの）であることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図８に示す。
実施例２８．ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性アッセイ
ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートが細胞増殖を阻害する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性アッセイを用いて測定した。標的細胞を、１００μＬの完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、全ての試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手したもの）中、１ウェルあたり１〜２，０００個の細胞で播種した。抗体を、３倍系列希釈で完全ＲＰＭＩ培地に希釈し、１ウェルあたり１００μＬを添加した。最終濃度は、典型的には、３×１０−８Ｍ〜４．６×１０−１２Ｍの範囲であった。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、５〜６日間インキュベートした。残存細胞の生存度を、比色ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳ）により求めた。ＷＳＴ−８は、生細胞中、デヒドロゲナーゼにより橙色のホルマザン産物に還元される。この産物は組織培養培地に可溶性である。産生されたホルマザンの量は、生細胞数と直接比例する。ＷＳＴ−８を、最終体積の１０％に添加し、プレートを、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でさらに２〜４時間インキュベートした。マルチウェルプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を測定することにより、プレートを分析した。培地及びＷＳＴ−８のみを含むウェルのバックグラウンドＡ４５０吸光度を、全ての値から差し引いた。処理した試料値それぞれを、未処理細胞を含むウェルの平均値で除算することにより、生存度パーセントを計算した。生存度パーセント＝１００^＊（処理した試料のＡ４５０−バックグラウンドのＡ４５０）／（未処理試料のＡ４５０−バックグラウンドのＡ４５０）。各処理では、片対数プロットで、生存度パーセントの値を抗体濃度に対してプロットした。非線形回帰により用量反応曲線を作成し、各曲線のＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で計算した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性活性
未結合抗体が過剰に存在する場合及び存在しない場合のｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性を評価し、ＥＧＦＲ発現細胞における非特異的ｈｕＩｇＧ−９０コンジュゲートの活性と比較した。典型的な細胞障害性アッセイの結果を図９に示す。ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートは、１６ｐＭのＥＣ_５０値でＤｅｔｒｏｉｔ−５６２ ＳＣＣ−ＨＮ細胞の特異的細胞殺傷をもたらした。コンジュゲートされていない抗体が過剰に存在する場合、活性は顕著に低下し、その結果ＥＣ_５０値が約２ｎＭとなった。同様に、ｈｕＩｇＧ−９０コンジュゲートを未結合ｈｕＩｇＧ対照抗体とともに用いると、約８ｎＭのＥＣ_５０値での細胞殺傷がもたらされた。

【0559】

同様に、ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートは、１２ｐＭのＥＣ_５０値で、ＮＣＩ−Ｈ２９２ ＮＳＣＬＣ細胞の特異的細胞殺傷をもたらした。コンジュゲートされていない結合抗体が過剰に存在する場合、活性が顕著に低下し、ＥＣ_５０値が約２ｎＭとなった。同様に、ｈｕＩｇＧ−９０コンジュゲートを未結合ｈｕＩｇＧ対照抗体とともに用いると、約８ｎＭのＥＣ_５０値で細胞殺傷をもたらした。

【0560】

同様に、ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞の特異的細胞殺傷も観測された。

【0561】

【表1-2】

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【0562】

実施例２９．ｈｕＭＯＶ１９−９０のＩｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性活性
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、平底）中、１００μｌ／ウェルのｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートを、開始濃度３．５ｅ−９Ｍ及び〜３．５ｅ−８Ｍで、熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でそれぞれ希釈してそれを３回繰り返し、周辺温度にて、この培地で３倍に系列希釈した。ＫＢ細胞（頬側上皮性腫瘍）を、熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ）で増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ）を用いて取り出した。試験した他の細胞は、ＮＣＩ−Ｈ２１１０（ＮＳＣＬＣ）及びＴ４７Ｄ（乳房上皮）であり、これらは、熱不活性化１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で増殖させた。Ｔ４７Ｄ培地には、０．２ＩＵ／ｍｌウシインシュリンも補充した。全ての細胞を、増殖培地（上記参照）に再懸濁させて、トリプシンを中和し、血球計数器を用いて計数した。１００μｌ／ｍｌの１０００個のＫＢ細胞／ウェルまたは２０００個のＴ４７Ｄ及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞／ウェルを、コンジュゲートまたは培地のみを含有するウェルに添加し、１μＭのブロッキング抗ＦＯＬＲ１抗体（ｈｕＭＯＶ１９）とともにまたはこれを用いずに、５％ＣＯ_２の３７℃インキュベーター中で５日間インキュベートした。合計体積は２００μｌ／ウェルである。ＫＢ細胞に対する各コンジュゲートの開始濃度は、３．５ｅ−９Ｍであり、Ｔ４７Ｄ及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞では、各コンジュゲートの開始濃度は、３．５ｅ−８Ｍであった。インキュベーション後、２０μｌ／ウェルのＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を添加し、２時間発現させることにより、細胞生存度を分析した。プレートリーダーで、４５０及び６２０ｎｍの吸光度を読み取った。４５０ｎｍの吸光度から６２０ｎｍの吸光度を差し引いた。補正した吸光度から、培地のみを含有するウェルのバックグラウンドをさらに差し引き、未処理細胞の生存率（ＳＦ）をエクセルで計算した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、ＡＤＣ濃度（Ｍ）対ＳＦのＸＹグラフを作成した。

【0563】

図１０〜１２及び表２に示すとおり、ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートは、ＫＢ細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、及びＮＣＩ−Ｈ２１１０細胞に対して非常に強力である。コンジュゲートされていない抗体を過剰に添加すると、細胞障害性効果が顕著に低下する。このことにより、抗原特異性が実証される。

【0564】

【表2】

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【0565】

別の実験では、コンジュゲートが細胞増殖を阻害する能力を、ＷＳＴ−８を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性アッセイを用いて測定した。９６ウェルプレート中の細胞（典型的には、１ウェルあたり１×１０^３）を、適切な細胞培養培地における、合計体積０．２ｍｌの様々な濃度のコンジュゲートで処理した。細胞及び培地を含有するが、試験化合物を含有しない対照ウェル、ならびに培地のみを含有するウェルを、各アッセイプレートに含ませた。プレートを、６％ＣＯ_２含有加湿雰囲気中、３７℃で、４〜６日間インキュベートした。次いで、ＷＳＴ−８試薬（１０％体積／体積、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をウェルに添加し、プレートを細胞株に応じて３７℃で２〜６時間インキュベートした。次いで、プレートリーダー分光光度計で、二重波長モード４５０ｎｍ／６２０ｎｍにて吸光度を測定し、６２０ｎｍでの吸光度（細胞による非特異的光散乱）を差し引いた。得られたＯＤ_４５０値を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）で細胞の見かけ上生存率を計算した。最初に培地バックグラウンド吸光度を補正し、次いで各値を対照ウェル（未処理細胞）での値の平均で除算することにより、各ウェルの細胞の見かけ上生存率を計算した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで様々な傾きを用いてシグモイド曲線当てはめを使用する非線形回帰により用量反応曲線を作成した。ＩＣ_５０（５０％阻害濃度）を、このソフトウェアで計算した。

【0566】

コンジュゲートは、図２１及び表３に示すとおり、試験した細胞株である、Ｉｓｈｉｋａｗａ（子宮内膜癌）、ＫＢ（子宮頸癌）、及びＮＣＩ−Ｈ２１１０（非小細胞肺癌）に対して活性であった。未修飾ｈｕＭＯＶ１９抗体が過剰である（１μＭ）と、コンジュゲートの効力が顕著に低下した（２０〜２００倍）ことから、細胞殺傷活性は、ＦＯＬＲ１依存性であった。

【0567】

【表3】

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【0568】

実施例３０．メスＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ２１１０ ＮＳＣＬＣ異種移植片に対するｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートの単回用量での抗腫瘍活性
６週齢のメスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。１×１０７のＮＣＩ−Ｈ２１１０腫瘍細胞を５０％マトリゲル／無血清培地０．１ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射によりマウスの右側腹部に播種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に到達した時点で（播種後７日目）、マウスを、腫瘍体積に基づいて、４つの群（各群６匹）に無作為化した。マウスには、１日目（播種後８日目）に、化合物９０の濃度に基づいて、ビヒクル対照（０．２ｍｌ／マウス）またはｈｕＭＯＶ１９−９０を、１、３、もしくは５μｇ／ｋｇで単回ＩＶ投与した。

【0569】

腫瘍の大きさを、週に２〜３回、ノギスを用いて三次元計測した。腫瘍体積は、式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用いて、ｍｍ^３で表した。マウスで腫瘍体積が５０％以上減少した場合は部分退縮（ＰＲ）が発生したと判断し、触知できる腫瘍を検出するこができなかった場合は完全腫瘍退縮（ＣＲ）が発生したと判断した。腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアで求めた。

【0570】

腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）は、以下の式：
Ｔ／Ｃ（％）＝処置マウスの腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００
を用いて求めた。ビヒクル対照の腫瘍体積が所定の大きさの１０００ｍｍ３に到達した時点で、処置群（Ｔ）及びビヒクル対照群（Ｃ）の腫瘍体積を同時に求めた。腫瘍を持たないマウス（０ｍｍ３）を含む各処置群の毎日の腫瘍体積中央値を求めた。ＮＣＩ基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が、抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％の場合は、抗腫瘍活性レベルが高いと判断される。

【0571】

図１４に示すとおり、ｈｕＭＯＶ１９−９０コンジュゲートは、３μｇ／ｋｇ用量で活性であり、５μｇ／ｋｇ用量では活性が高い。
実施例３１．化合物１０７の合成

【0572】

【化175】

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【0573】

工程１：化合物８２（５００ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタン酸（４４９ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（４６５ｍｇ、２．４３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３５４ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（０．８１ｍＬ、４．６２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（７．７ｍＬ）に溶解させ、反応が完了するまで一晩攪拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム、飽和塩化アンモニウム、及び水で２回洗浄した。有機物を乾燥させ、減圧濃縮して、化合物１００を得た（８７５ｍｇ、収率９６％）。これを次の工程で直接用いた。^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ ， ＤＭＳＯ）：δ ８．１５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ８．０２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ４．２６−４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３−４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ２．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１８−２．２２ （ｍ， ２Ｈ）， １．７６−１．８０ （ｍ， ２Ｈ）， １．３９ （ｓ， ９Ｈ）， １．２４ （ｓ， ６Ｈ）， １．２４ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．１９ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）．

【0574】

【化176】

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【0575】

工程２：未希釈の化合物１００（８７５ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（２．６ｍｌ）及び水（０．１７ｍｌ）を添加し、反応が完了するまで、室温で攪拌した。反応物をアセトニトリルで希釈して共沸させ、粘着油状物を得た。次いでこれをアセトニトリル及び水で希釈し、凍結乾燥させて、化合物１０１（１ｇ、収率１００％）をオフホワイト色固体として得た。これをさらに精製することなく用いた。ＬＣＭＳ＝３．９９分（８分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：３３７．０（Ｍ＋１）^＋．

【0576】

【化177】

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【0577】

工程３：化合物１０１（９２３ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）及び（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（２４０ｍｇ、１．５７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５．２ｍｌ）に溶解させた。ＥＤＣ・ＨＣｌ（６０１ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（９６ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を、室温で添加し、反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、水で３回洗浄した。有機層を乾燥させ、減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製して、化合物１０２を得た（１５０ｍｇ、収率２０％）。ＬＣＭＳ ＝ ３．９１分 （８分方式）．ＭＳ （ｍ／ｚ）：４７２．２ （Ｍ＋１）^＋．^１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＭｅＯＤ）：δ ９．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．２１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ８．１８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ）， ７．５２ （ｓ， ２Ｈ）， ７．１２ （ｓ， １Ｈ）， ４．５８ （ｓ， ４Ｈ）， ４．４４−４．４８ （ｍ， １Ｈ）， ４．２９−４．３２ （ｍ， １Ｈ）， ３．３４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４−２．４０ （ｍ， ２Ｈ）， １．９０−１．９５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４３ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．３６ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．３０ （ｓ， ６Ｈ）．

【0578】

【化178】

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【0579】

工程４：化合物１０２を、実施例９の化合物９４と同様に調製した。粗物質を高真空で乾燥させて、化合物１０３を得た（１７４ｍｇｓ、収率１０１％）。これを、さらに精製することなく次の工程で直接用いた。ＬＣＭＳ＝４．９５分（８分方式）．

【0580】

【化179】

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【0581】

工程５：化合物１０３を、実施例７の化合物５７と同様に調製した。粗固体は、化合物１０４を含んでいた（２０３ｍｇ、収率４４％、純度６０％）。これを、さらに精製することなく使用した。ＬＣＭＳ＝５．６８分（８分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０２４．３（Ｍ＋１）^＋．

【0582】

【化180】

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【0583】

工程６：化合物１０４を、実施例１の化合物１２と同様に調製した。粗残渣をＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、勾配、５０％か〜６５％）により精製して、モノイミン化合物１０５を固体として得た（２２ｍｇ、収率１６％、純度９０％）。ＬＣＭＳ＝６．００分（８分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０２７．３（Ｍ＋１）^＋．

【0584】

【化181】

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【0585】

工程７：化合物１０６を、室温で、ＴＨＦ（０．５ｍＬ）及びＡＣＮ（０．２３ｍＬ）に溶解させた。次いで、これを実施例９の化合物９８と同様に調製した。混合物を反応が完了するまで攪拌し、次いでＤＣＭ及びＤＩ水で希釈した。有機層を、ブラインで洗浄し、乾燥させ、濾過した。濾液を濃縮して、粗チオール、化合物１０６を得た（２１ｍｇ、収率１００％）これを、次の工程で直接用いた。ＬＣＭＳ＝５．６７分（８分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：９８０．４（Ｍ＋１）^＋．

【0586】

【化182】

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【0587】

工程８：化合物１０６（２１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）を、２−プロパノール（１４２８μｌ）及び水（７１４μｌ）に懸濁させた。メタ重亜硫酸ナトリウム（２２．３０ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を、室温で、反応が完了するまで攪拌した。反応混合物をアセトニトリル／水で希釈し、凍結乾燥させた。得られた白色粉末を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ１８カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、勾配、２０％〜４０％）により精製し、所望の画分を集めて凍結乾燥させて、化合物１０７を得た（５．３ｍｇ、収率２３％）。ＬＣＭＳ＝５．６７分（８分方式）．ＭＳ（ｍ／ｚ）：１０６０．２（Ｍ−１）⁻．
実施例３２．ｈｕＭＯＶ１９−スルホ−ＳＰＤＢ−１０７（またはｈｕＭＯＶ１９−１０７）コンジュゲートの調製
最終濃度１．９５ｍＭの化合物１０７及び最終濃度１．５ｍＭのスルホ−ＳＰＤＢリンカーを含有するｉｎ ｓｉｔｕ混合物を含むコハク酸緩衝液（ｐＨ５）：ＤＭＡ（３０：７０）を、６時間インキュベートしてから、７倍過剰量の１０７−スルホ−ＳＰＤＢ−ＮＨＳを、４ｍｇ／ｍｌのｈｕＭＯＶ１９抗体を含有する反応物を含む１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５（８７：１３の水：ＤＭＡ）に添加した。溶液を２５℃で一晩コンジュゲートさせた。

【0588】

反応後、コンジュゲートを精製し、ＮＡＰ脱塩カラム（Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、緩衝液を、１０ｍＭトリス、８０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｕＭ重亜硫酸化合物、３．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０配合緩衝液（ｐＨ７．６）へと交換した。Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １０，０００ ＭＷＣＯ）を用いて、同一緩衝液中、４℃で、一晩透析を行った。

【0589】

精製したコンジュゲートは、１抗体あたり平均して２．７分子の化合物１０７が結合しており（化合物１０７に対して_{ε３３０ｎｍ}＝１５，４８４ｃｍ^−１Ｍ^−１及び_{ε２８０ｎｍ}＝３０，１１５ｃｍ^−１Ｍ^−１、ならびにｈｕＭＯＶ１９抗体に対して_{ε２８０ｎｍ}＝２０１，４００ｃｍ^−１Ｍ^−１のモル吸光係数を用いてＵＶ／Ｖｉｓ及びＳＥＣによるもの）、９５％単量体を有し（サイズ排除クロマトグラフィーによるもの）、かつ最終タンパク質濃度が１．１ｍｇ／ｍｌであることがわかった。ＭＳスペクトル測定データを図１６に示す。
実施例３３．メスＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ１７０３ ＮＳＣＬＣ異種移植片に対するｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートの単回用量での抗腫瘍活性
６週齢のメスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。５×１０^６のＮＣＩ−Ｈ１７０３腫瘍細胞を５０％マトリゲル／無血清培地０．２ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射によりマウスの右側腹部に播種した。腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に到達した時点で（播種後１６日目）、マウスを、腫瘍体積に基づいて、４つの群（各群６匹）に無作為化した。マウスには、１日目（播種後１７日目）に、ビヒクル対照（０．１ｍｌ／マウス）、またはｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートを化合物９０濃度に基づいて、５、２０、または５０μｇ／ｋｇで、単回ＩＶ投与した。

【0590】

腫瘍の大きさを、週に２〜３回、ノギスを用いて三次元計測した。腫瘍体積は、式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用いて、ｍｍ^３で表した。マウスで腫瘍体積が５０％以上減少した場合、部分退縮（ＰＲ）が発生したと判断し、触知できる腫瘍を検出することができなかった場合は完全腫瘍退縮（ＣＲ）が発生したと判断した。腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアで求めた。

【0591】

腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）は、以下の式：
Ｔ／Ｃ（％）＝処置マウスの腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００
を用いて求めた。ビヒクル対照の腫瘍体積が所定の大きさの１０００ｍｍ^３に到達した時点で、処置群（Ｔ）及びビヒクル対照群（Ｃ）の腫瘍体積を同時に求めた。腫瘍を持たないマウス（０ｍｍ^３）を含む各処置群の毎日の腫瘍体積中央値を求めた。ＮＣＩ基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％である場合は、抗腫瘍活性レベルが高いと判断される。

【0592】

図１７に示すとおり、ｈｕＭＬ６６−９０コンジュゲートは、２０μｇ／ｋｇ及び５０μｇ／ｋｇで活性が高く、２０μｇ／ｋｇが最小有効用量である（ＭＥＤ）。
実施例３４．メスＣＤ−１マウスにおけるｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートの単回用量の薬物動態
７週齢のメスＣＤ−１マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。マウスには、ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートを、外側尾静脈を介する単回静脈内ボーラス注射で単回ＩＶ投与した。各マウスに、Ａｂに基づき２．５ｍｇ／ｋｇの用量を投与した。用量及び注射体積は、各マウスの体重に基づいて個別化した。２７ゲージ、１／２インチの針を装着した１．０ｍＬシリンジを使用して注射を行った。ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートの投与から２及び３０分後、ならびに２、４、及び８時間後、ならびに１、２、３、５、７、１０、１４、２１、及び２８日後、マウスをイソフルラン吸入により麻酔して、約１５０μＬの血液をマウスの右後眼窩血液洞から採取してヘパリン化毛細管へ入れた。各時点（０〜２１日）において、血液を、１つの群の３匹のマウス全てから収集した。群は順番に採血して、セットに含まれるマウスが２４時間以内２回を超えて採血されることがないようにした。最後の時点、投与後２８日目において、全てのマウスから、試料採取した。血液試料を遠心して血漿を分離した。血漿３０μｌを、各時点の試料用に個別標識したマイクロ遠心管に移し、次いで−８０℃で凍結保存して、その後ＥＬＩＳＡ分析を行い、抗インドリノベンゾジアゼピン抗体を使用して全Ａｂ（コンジュゲートされていないＡｂ及びインタクトなコンジュゲートの両方）及びインタクトなコンジュゲートの濃度を求めた。

【0593】

図１８に示すとおり、ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートは、抗体のクリアランスと同様なクリアランスを有する。
実施例３５．タンパク質Ａ樹脂を用いた親和性捕獲による分解産物濃縮
葉酸受容体α（ＦＲα）を発現するＫＢ細胞を、５×Ｔ１５０組織培養プレートで培養した。飽和量のＦＲα標的指向ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートを、５％ＣＯ_２で緩衝した加湿インキュベーター中３７℃で２４時間、ＫＢ細胞とともにインキュベートした。２４時間後、細胞から排出された分解産物を含有する培地を採取し、その後のアッセイのためにプールした。

【0594】

４℃で一晩インキュベーションすることにより、飽和量の抗インドリノベンゾジアゼピン抗体をタンパク質Ａ樹脂のスラリーと結合させた。前結合させたタンパク質Ａ／抗インドリノベンゾジアゼピン抗体複合体１ｍＬを、培地２５ｍＬとともに、エンドツーエンド回転器で数時間インキュベートした。樹脂を１０００ｒｐｍで緩徐に遠心し、上清をデカントした。分解産物と結合したタンパク質Ａ／抗インドリノベンゾジアゼピン抗体樹脂をＰＢＳで洗浄した。分解産物を、アセトン抽出により有機相に放出させた。有機溶液が完全に蒸発するまで、分解産物を一晩真空乾燥させた。分解産物を２０％アセトニトリル含有水で再構成し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。
ＭＳ分析
細胞代謝産物を、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ高分解能質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＵＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより同定した。抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を用いて、標的細胞代謝産物を同定して特性決定した。特徴的なインドリノベンゾジアゼピン（２８６ｍ／ｚ）質量特性を含む全ての代謝産物種を同定した（図１９Ａ及び図１９Ｂを参照）。
実施例３６．メスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ２１１０ ＮＳＣＬＣ異種移植片、Ｈｅｃ−１ｂ子宮内膜異種移植片、及びＩｓｈｉｋａｗａ子宮内膜異種移植片に対するｈｕＭｏｖ１９−９０の単回用量での抗腫瘍活性
６週齢のメスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。第１のコホートのマウスに、１×１０^７のＮＣＩ−Ｈ２１１０腫瘍細胞を５０％マトリゲル／無血清培地０．１ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射により右側腹部に播種した。第２のコホートのマウスに、１×１０^７のＨｅｃ−１ｂ腫瘍細胞を無血清培地０．１ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射により右側腹部に播種した。第３のコホートのマウスに、１×１０^７のＩｓｈｉｋａｗａ腫瘍細胞を５０％マトリゲル／無血清培地０．１ｍｌに懸濁させたものを、皮下注射により右側腹部に播種した。

【0595】

腫瘍体積が約１００ｍｍ^３に到達した時点で（ＮＣＩ−Ｈ２１１０は播種後７日目、Ｈｅｃ−１ｂは播種後７日目、Ｉｓｈｉｋａｗａは播種後１７日目）、マウスを、腫瘍体積に基づいて、複数の群（各群６匹のマウス）に無作為化した。

【0596】

ＮＣＩ−Ｈ２１１０異種移植片実験のマウスには、１日目（播種後８日目）に、ビヒクル対照（０．２ｍｌ／マウス）、または薬物濃度に基づいてｈｕＭｏｖ１９−９０を１、３、または５μｇ／ｋｇ単回ＩＶ投与した。

【0597】

Ｈｅｃ−１ｂ異種移植片実験のマウスには、１日目（播種後８日目）に、ビヒクル対照（０．２ｍｌ／マウス）、または薬物濃度に基づいてｈｕＭｏｖ１９−９０を１０もしくは３０μｇ／ｋｇで、もしくは非標的指向性対照コンジュゲートｃｈＫＴＩ−９０を３０μｇ／ｋｇで単回ＩＶ投与した。

【0598】

Ｉｓｈｉｋａｗａ異種移植片実験のマウスには、１日目（播種後１８日目）に、ビヒクル対照（０．２ｍｌ／マウス）、または薬物濃度に基づいてｈｕＭｏｖ１９−９０を１０もしくは３０μｇ／ｋｇで、もしくは非標的指向性対照コンジュゲートｃｈＫＴＩ−９０を３０μｇ／ｋｇで単回ＩＶ投与した。

【0599】

全ての実験では、腫瘍の大きさを、週に２〜３回、ノギスを用いて三次元計測した。腫瘍体積は、式Ｖ＝長さ×幅×高さ×１／２を用いて、ｍｍ^３単位で表した。マウスで腫瘍体積が５０％以上減少した場合、部分退縮（ＰＲ）が発生したと判断し、触知できる腫瘍を検出することができなかった場合は完全腫瘍退縮（ＣＲ）が発生したと判断した。腫瘍体積は、ＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアで求めた。

【0600】

腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ値）は、以下の式を用いて求めた。
Ｔ／Ｃ（％）＝処置マウスの腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００。
ビヒクル対照の腫瘍体積が所定の大きさの１０００ｍｍ^３に到達した時点で、処置群（Ｔ）及びビヒクル対照群（Ｃ）の腫瘍体積を同時に求めた。腫瘍を持たないマウス（０ｍｍ^３）を含む各処置群の毎日の腫瘍体積中央値を求めた。ＮＣＩ基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最低レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％である場合、抗腫瘍活性レベルが高いと判断される。

【0601】

図２２に示すとおり、ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートは、ＮＣＩ−Ｈ２１１０異種移植片モデルにおいて、１μｇ／ｋｇの用量では不活性であり、３μｇ／ｋｇの用量では活性で、Ｔ／Ｃ１３％かつＰＲ１／６であり、５μｇ／ｋｇの用量では活性が高く、Ｔ／Ｃ２％、６／６ＰＲ、かつ４／６ＣＲであった。

【0602】

図２３に示すとおり、ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートは、Ｈｅｃ−１ｂ異種移植片モデルにおいて、１０μｇ／ｋｇの用量で活性であり、Ｔ／Ｃ１５％かつ１／６ＰＲであり、３０μｇ／ｋｇの用量では活性が高く、Ｔ／Ｃ９％、６／６ＰＲ、かつ６／６ＣＲであった。非標的指向性対照コンジュゲートｃｈＫＴＩ−９０は、３０μｇ／ｋｇの用量では活性であり、Ｔ／Ｃが３４％であった。

【0603】

図２４に示すとおり、ｈｕＭｏｖ１９−９０コンジュゲートは、Ｉｓｈｉｋａｗａ異種移植片モデルにおいて、１０μｇ／ｋｇの用量で活性であり、Ｔ／Ｃ２７％、６／６ＰＲ、かつ６／６ＣＲであり、３０μｇ／ｋｇの用量で活性であり、Ｔ／Ｃ１５％、６／６ＰＲ、かつ６／６ＣＲであった。非標的指向性対照コンジュゲートｃｈＫＴＩ−９０は、３０μｇ／ｋｇの用量で活性であり、Ｔ／Ｃ２４％かつ４／６ＰＲであった。
実施例３７．メスＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＮＣＩ−Ｈ２１１０ ＮＳＣＬＣ異種移植片に対するｈｕＭｏｖ１９−１０７の単回用量での抗腫瘍活性
ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＭＯＶ１９−１０７のＩｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、上記の実施例３０に記載したプロトコルに従って行った。図２５に示すとおり、ｈｕＭｏｖ１９−１０７コンジュゲートは、１０μｇ／ｋｇの用量で活性が高く、６／６ＣＲであった。
実施例３８．ＣＤ１２３−９０コンジュゲートの結合親和性
例示的なヒト化抗ＣＤ１２３抗体であるｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７Ｓ３抗体のＡＤＣコンジュゲートの結合親和性を、ＨＮＴ−３４細胞を用いてフローサイトメトリーによりアッセイして対応するコンジュゲートされていない抗体と比較した。ＨＮＴ−３４細胞（１試料あたり５×１０^４個の細胞）を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％正常ヤギ血清を補充したＤＭＥＭ培地）２００μＬ中、様々な濃度のＡＤＣ及びコンジュゲートされていないｈｕＣＤ１２３−６Ｇｖ４．７Ｓ３抗体とともにインキュベートした。次いで、細胞をペレット化し、２回洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１００μＬとともに１時間インキュベートした。細胞を再度ペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ２００μＬに再懸濁させた。ＨＴＳマルチウェルサンプラーを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター、またはＦＡＣＳアレイフローサイトメーターを使用して試料を取得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ（すべてＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＵＳから入手）を用いて分析した。各試料では、ＦＬ２の幾何平均蛍光強度を計算し、片対数プロットで、抗体濃度に対してプロットした。非線形回帰により用量反応曲線を作成し、各抗体の見かけ上解離定数（Ｋｄ）に相当する各曲線のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ４（ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて計算した。

【0604】

図２６に示すとおり、コンジュゲートが例示的抗ＣＤ１２３抗体の結合親和性に及ぼした影響は中程度にすぎなかった。
実施例３９．ｈｕＣＤ１２３−９０のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性活性
抗ＣＤ１２３抗体であるｈｕＣＤ１２３−６の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が細胞表面でＣＤ１２３を発現する細胞を殺傷する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性アッセイを用いて測定した。細胞株を、細胞供給元（ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺ）が推奨するとおりに培養培地で培養した。培養培地１００μＬ中２，０００〜１０，０００個の細胞を、平底９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。細胞表面のＦｃ受容体をブロックするため、培養培地に、１００ｎＭのｃｈＫＴＩ抗体（同じアイソタイプの抗体）を補充した。コンジュゲートを、３倍系列希釈で、培養培地に希釈し、１ウェルあたり１００μＬを添加した。ＣＤ１２３非依存性細胞障害性の寄与を判定するために、ＣＤ１２３ブロック剤（例えば、１００ｎＭのｃｈＣＤ１２３−６抗体）をいくつかのウェルに添加してから、コンジュゲートを添加した。細胞及び培地を含むが、コンジュゲートを含まない対照ウェル、ならびに培地のみを含むウェルを、各アッセイプレートに含ませた。アッセイは、各データの時点で３回繰り返して行った。プレートを加湿６％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で４〜７日間インキュベートした。次いで、各ウェルの生細胞の相対数を、ＷＳＴ−８を利用した細胞計数キット−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて求めた。最初に培地バックグラウンド吸光度を補正し、次いで各値を対照ウェル（未処理細胞）での値の平均で除算することにより、各ウェルの細胞の見かけ上生存率を計算した。細胞の生存率を、片対数プロットで、コンジュゲート濃度に対してプロットした。

【0605】

起源の異なる（ＡＭＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、及びＮＨＬ）１５種のＣＤ１２３陽性細胞株を、この試験で使用した（表４）。細胞株の大半は、少なくとも１つの負の予後因子（例えば、Ｐ糖タンパク質の過剰発現、ＥＶＩ１過剰発現、ｐ５３変異、ＤＮＭＴ３Ａ突然変異、ＦＬＴ３遺伝子内縦列重複）を持つ悪性腫瘍を保有する患者に由来した。コンジュゲートはこれらの細胞株に対する効力が高く、ＩＣ５０値は、サブｐＭ〜低ｎＭの範囲であったことが実証された（表４）。

【0606】

【表4】

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【0607】

本明細書中に記載される全ての文献、特許、特許出願、インターネットサイト、及び寄託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、あらゆる目的で、個々の文献、特許、特許出願、インターネットサイト、または寄託番号／データベース配列が、具体的にかつ個別に、参照により援用されるのと同程度で、参照によりその全体が本明細書中に援用される。

【図1】

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【図2】

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【図3】

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【図4A】

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【図4B】

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【図4C】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6】

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【図7A】

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【図7B】

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【図7C】

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【図7D】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15A】

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【図15B】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【図20】

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【図21A】

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【図21B】

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【図21C】

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【図22】

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【図23】

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【図24】

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【図25】

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【図26】

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【国際調査報告】

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