特表 2017-528428 骨髄由来抑制細胞の抑制及び免疫チェックポイント阻害の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-528428(P2017-528428A)

(43)【公表日】2017年9月28日

(54)【発明の名称】骨髄由来抑制細胞の抑制及び免疫チェックポイント阻害の方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20170901BHJP

   A61K 31/4406 20060101ALI20170901BHJP

   A61K 31/706 20060101ALI20170901BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20170901BHJP

   A61K 35/742 20150101ALI20170901BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20170901BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20170901BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20170901BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20170901BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/06ZNA

   A61K31/4406

   A61K31/706

   A61K39/395 N

   A61K35/742

   A61P43/00 121

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   A61P31/04

   A61P31/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2017-502263(P2017-502263)

(86)(22)【出願日】2015年7月13日

(85)【翻訳文提出日】2017年2月16日

(86)【国際出願番号】US2015040107

(87)【国際公開番号】WO2016010879

(87)【国際公開日】20160121

(31)【優先権主張番号】62/024,731

(32)【優先日】2014年7月15日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/069,881

(32)【優先日】2014年10月29日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】398076227

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】チョウ シビン

(72)【発明者】

【氏名】ボーゲルステイン バート

(72)【発明者】

【氏名】キンズラー ケネス ダブリュー．

(72)【発明者】

【氏名】キム キベム

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA20

4C084MA52

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4C087MA66

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4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC20

4C087ZC75

(57)【要約】

チェックポイント阻害抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体で治療された患者において、印象的な応答が観察されている。しかしながら、免疫原性が低い癌に対する免疫療法は、未だ課題のままである。抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の両方による治療は、免疫原性が控えめな、大型ＣＴ２６腫瘍または転移性４Ｔ１腫瘍を根絶することができなかった。しかしながら、エピジェネティック修飾薬及びチェックポイント阻害薬での同時治療は、治療結果を著しく改善し、それらのうちの８０％超を治癒させた。機能研究は、エピジェネティック修飾薬の主要な標的は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）であることを明らかにした。循環ＭＤＳＣを減少させたＰＩ３Ｋ−阻害薬もまた、免疫チェックポイント阻害薬と組み合わされたとき、転移性４Ｔ１腫瘍を有するマウスのうちの８０％を治癒させた。故に、免疫チェックポイント阻害に対して抵抗性である癌は、ＭＤＳＣの除去によって治癒させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

担腫瘍哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤を投与する工程と、
免疫チェックポイントを阻害する少なくとも１つの第２の薬剤を投与する工程と
を含む、方法。

【請求項2】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニット、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシタジンである、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットであり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットが、Ｊ３２である、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせである、請求項３に記載の方法。

【請求項8】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項３に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記腫瘍が、非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）ではない、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）−ＮＴの胞子を投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

単一パッケージ内に、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤と
を含む、キット。

【請求項14】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニット、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記少なくとも２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１３に記載のキット。

【請求項16】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシタジンである、請求項１４に記載のキット。

【請求項18】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットであり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットが、Ｊ３２である、請求項１４に記載のキット。

【請求項19】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載のキット。

【請求項20】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項１５に記載のキット。

【請求項21】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項１３に記載のキット。

【請求項22】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、請求項１３に記載のキット。

【請求項23】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤と
を含む、組成物。

【請求項24】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニット、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記少なくとも２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項26】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシタジンである、請求項２４に記載の組成物。

【請求項28】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットであり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットが、Ｊ３２である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項29】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項30】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項31】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシタジンとの組み合わせである、請求項２３に記載の組成物。

【請求項32】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項33】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。

【請求項34】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のキット。

【請求項36】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項37】

前記腫瘍が、結腸直腸癌である、請求項１に記載の方法。

【請求項38】

前記腫瘍が、乳癌である、請求項１に記載の方法。

【請求項39】

前記腫瘍が、結腸直腸癌転移である、請求項１に記載の方法。

【請求項40】

前記腫瘍が、乳癌転移である、請求項１に記載の方法。

【請求項41】

前記第１の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である用量で投与される、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

前記第１の薬剤が、１つ以上の単位投与量中に、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である量で存在する、１つ以上の単位投与量を含む請求項１３に記載のキット。

【請求項43】

前記第１の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である単位投与量中に存在する、単位投与量である請求項２３に記載の組成物。

【請求項44】

担腫瘍哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤を投与する工程と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤を投与する工程と
を含む、方法。

【請求項45】

前記２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を投与する工程を更に含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項47】

細菌またはウイルス感染症を有する哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの薬剤を投与する工程を含み、該薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニット、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。

【請求項48】

前記薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシタジンである、請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットであり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニットが、Ｊ３２である、請求項４７に記載の方法。

【請求項51】

前記感染症が、慢性ウイルス感染症である、請求項４７に記載の方法。

【請求項52】

前記感染症が、関連する敗血症を伴う細菌性である、請求項４７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、米国政府からの資金によってなされた。米国政府は、米国国立衛生研究所からの助成金ＣＡ０６２９２４及びＣＡ０４３４６０の条件に従って、本発明において特定の権利を保持する。

【0002】

発明の技術分野
本発明は、癌治療の分野に関する。より具体的には、それは、難治性腫瘍を克服するための組み合わせ療法に関する。

【背景技術】

【0003】

哺乳動物の免疫系は細かく制御され、これにより、最小のバイスタンダー被害をもって、細菌及びウイルスなどの外来性の侵入物に対して効果的な攻撃を開始することが可能となっている。これは、安全性を確保するために、機能的に余剰の制御機構を必要とする（１〜３）。癌は、これらの機構を乗っ取って、免疫破壊を回避することができるようである。癌によって利用される制御機構のうちのいくつかは特定されている。これらには、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、循環ＭＤＳＣ、常在性腫瘍関連マクロファージ及び好中球、Ｔ−細胞上のチェックポイント阻害受容体、ならびに免疫抑制サイトカインが挙げられる（４〜８）。ごく最近では、ＰＤ−１受容体及びＣＴＬＡ−４受容体によって保護されるチェックポイントが、それらの機能を阻害することができる抗体の有効性のために、精力的に研究されている。抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）による最近の臨床試験は際立った治療的応答を示し（９〜１２）、免疫チェックポイントの破壊が治療的に有用であり得るという考えを強調した。しかし、客観的応答が観察されたのは、治療された患者及び腫瘍の種類のうちの少数においてであり、特定の腫瘍が応答し、他の腫瘍が応答しない理由は謎である。ＣＴ２６及び４Ｔ１はとりわけ、新規の治療的アプローチを評価するために使用される最も一般的な同系腫瘍モデルである。ＣＴ２６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＮ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタンの頻回直腸内滴下によって誘導された未分化の結腸直腸癌に由来し、免疫原性が控えめであることが示されており（１３、１４）、一方、４Ｔ１は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける自発性乳腺腫瘍に起源を持つ（１５）。４Ｔ１は、免疫原性が乏しく、非常に転移性であり、この特徴はヒトの進行癌と共有されるものである（１６）。癌研究におけるこれらの腫瘍細胞株の広範な使用にも関わらず、それらのうちのいずれについても、遺伝子的特徴付けはほとんど得られていない。

【0004】

当該技術分野において、寛解がより持続性となり、治療される集団においてより広範に広がり得るような、治療不応性癌の問題を克服する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【0005】

本発明の一態様に従うと、担腫瘍哺乳動物を治療する方法が提供される。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤が、哺乳動物に投与される。免疫チェックポイントを阻害する少なくとも１つの第２の薬剤が、哺乳動物に投与される。腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）であっても、非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）ではなくてもよい。

【0006】

本発明の別の態様に従うと、キットが提供される。キットは、単一のパッケージを含み、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤を含有する。それは、少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤を更に含有する。

【0007】

本発明の更に別の態様において、組成物が提供される。組成物は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤とを含む。

【0008】

本発明の別の態様に従うと、担腫瘍哺乳動物を治療する方法が提供される。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤が、哺乳動物に投与される。少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤が、哺乳動物に投与される。

【0009】

本発明の更に別の態様において、細菌またはウイルス感染症を有する哺乳動物を治療する方法が提供される。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの薬剤が、投与される。薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬のｐ１１０αサブユニット、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0010】

本明細書の閲読時に当業者に明らかになるであろう、これら及び他の実施形態は、当該技術分野に、治療困難な腫瘍を治療するための治療調製物及び方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】担腫瘍マウスの治療応答。異なる腫瘍を担時するＢＡＬＢ／ｃマウスを、示される様々な治療様式で治療した。ＩｇＧ、ＩｇＧ対照；Ｐ、抗ＰＤ−１抗体；Ｃ、抗ＣＴＬＡ−４抗体；ＡＺＡ、５−アザシチジン；ＥＮＴ、エンチノスタット。腫瘍体積（図１Ａ、図１Ｃ、及び図１Ｅ）ならびに動物生存率（図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｆ）を記録した。（図１Ａ及び図１Ｂ）中等度のサイズのＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス。（図１Ｃ及び図１Ｄ）大型ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス。（図１Ｅ及び図１Ｆ）転移性４Ｔ１腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス。（図１Ｇ）４Ｔ１担腫瘍マウスを、示されるように治療し、腫瘍移植の６週間後に安楽死させた。各マウスからの原発腫瘍を測定し、異なる器官の転移巣（転移）病変を計数した。平均及び標準偏差を示す。各実験群において使用された動物の数（ｎ）及びＰ値もまた示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ、有意ではない。

【図2】免疫チェックポイント阻害及びエピジェネティック修飾後の免疫細胞の応答。転移性４Ｔ１腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、示される治療様式で治療し、その後、ＦＡＣＳ分析及び免疫組織蛍光分析して、腫瘍浸潤細部及び循環免疫細胞を評価した。平均及び標準偏差を示し、Ｐ値が示される。（図２Ａ）腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ結果。（図２Ｂ）腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞の代表的な免疫組織蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。（図２Ｃ）腫瘍浸潤ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋ＴｒｅｇのＦＡＣＳ結果。（図２Ｄ）ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋依存性腫瘍浸潤細胞における、ＦｏｘＰ３及びＣＤ２５のダブル陽性細胞のパーセンテージを示す、代表的なＦＡＣＳデータ。（図２Ｅ）循環Ｇ−ＭＤＳＣのＦＡＣＳ結果。（Ｆ）ＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０⁻ＭＨＣ−ＩＩ⁻依存性循環細胞における、Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏ細胞のパーセンテージを示す、代表的ＦＡＣＳデータ。（図２Ｇ）腫瘍浸潤Ｇ−ＭＤＳＣのＦＡＣＳ結果。（図２Ｈ）腫瘍浸潤Ｌｙ６Ｇ^＋細胞の代表的な免疫組織蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。

【図3】骨髄由来Ｌｙ６Ｇ^＋細胞は、免疫チェックポイント阻害に対する抵抗の原因である。（図３Ａ）４Ｔ１腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、示される様々な抗体または抗体の組み合わせで治療し、腫瘍体積を経時的に記録した。αＬｙ６Ｇ、抗Ｌｙ６Ｇ抗体；αＣＤ２５、抗ＣＤ２５抗体。（図３Ｂ）異なる抗体または抗体の組み合わせで治療した後の、循環Ｇ−ＭＤＳＣのＦＡＣＳ結果。（図３Ｃ）４Ｔ１担腫瘍マウスを、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラス親和性精製によって４Ｔ１担腫瘍動物から単離されたＭＤＳＣの養子移入を有するまたは有しないエピジェネティック修飾薬で治療した。治療後、腫瘍体積を記録した。平均及び標準偏差を示し、Ｐ値が示される。

【図4】培養細胞に対するエピジェネティック修飾薬の直接的効果。（図４Ａ及び図４Ｂ）４Ｔ１細胞、精製したＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはＧ−ＭＤＳＣを、異なる濃度のエンチノスタット（図４Ａ）あるいはＡＺＡ（図４Ｂ）で処理した。代謝に基づく比色アッセイを使用して、細胞生存能を評価した。（図４Ｃ）異なる割合のＧ−ＭＤＳＣ及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の共培養からのならし培地を、ＩＦＮ−γ濃度について分析した。（図４Ｄ）１：１の割合のＧ−ＭＤＳＣ対ＣＤ８^＋Ｔ細胞の共培養からのならし培地を、漸増用量のエンチノスタットで２４時間処理した後に採取し、ＩＦＮ−γ濃度について分析した。少なくとも３連のウェルからのデータの平均及び標準偏差を示す。Ｐ値が示される。

【図5】（Ｓ１）体重測定。４Ｔ１腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、示される治療様式で治療した。治療後、定期的にそれらの体重を測定し、記録した。データの平均及び標準偏差を示す。

【図6】（Ｓ２）ＭＨＣ−Ｉ提示に関与する遺伝子の発現。エピジェネティック修飾薬で処理した後、インビトロで培養された４Ｔ１腫瘍細胞及びＣＴ２６腫瘍細胞から、ＲＮＡを単離させた。ＭＨＣ−Ｉ提示に関与する異なる遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。β−アクチンをローディング対照として使用した。図６Ａ、未治療、図６Ｂ、ＡＺＡ治療、図６Ｃ、エンチノスタット治療、図６Ｄ、ＡＺＡ／エンチノスタット治療。

【図7】（Ｓ３）４Ｔ１腫瘍によって誘導される、Ｇ−ＭＤＳＣレベルの上昇。（図７Ａ）４Ｔ１腫瘍移植後の示される時点で末梢血液を採取し、ＦＡＣＳによってＧ−ＭＤＳＣのレベルについて分析した。（図７Ｂ）健康なマウスから、または４Ｔ１腫瘍移植後１８日目の担腫瘍マウスから、末梢血液、脾臓、及び腫瘍を回収し、ＦＡＣＳによってＧ−ＭＤＳＣのレベルについて分析した。データの平均及び標準偏差を示す。

【図8】（Ｓ４）ＰＩ３Ｋ阻害薬は、免疫チェックポイント阻害と組み合わされるとき、Ｇ−ＭＤＳＣを枯渇させることによって、４Ｔ１腫瘍を根絶する。（図８Ａ）Ｇ−ＭＤＳＣ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及び４Ｔ１腫瘍細胞を、様々な濃度のＪ３２によってインビトロで処理した。代謝に基づく比色アッセイを使用して、細胞生存能を評価した。３連のウェルからのデータの平均及び標準偏差を示す。（図８Ｂ）４Ｔ１腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、示される治療様式で治療した。ＦＡＣＳ分析を実行して、循環Ｇ−ＭＤＳＣを定量化した。（図８Ｃ）４Ｔ１腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊ３２、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体、または組み合わせで治療し、腫瘍体積を記録した。平均及び標準偏差を示し、Ｐ値が示される。

【図9】組み合わせ治療のマイヤー・カプラン曲線。最の下の曲線から最も上の曲線へ：クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）−ＮＴ単独；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４単独；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋クロストリジウム・ノビイ−ＮＴ；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＥＮＴ／ＡＺＡ；抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４＋ＥＮＴ／ＡＺＡ＋クロストリジウム・ノビイ−ＮＴ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
本発明者らは、ＭＤＳＣなどの免疫系における宿主細胞に作用して、それらを減少させる、かつ／または抑制する薬剤に関与する治療的アプローチを開発した。そのような薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬などのエピジェネティック修飾薬であり得る。免疫チェックポイント阻害と組み合わせて使用されるとき、エピジェネティック修飾薬は、腫瘍細胞をインビトロで死滅させるのに必要とされるよりもずっと低濃度で、ＭＤＳＣを死滅させる。エピジェネティック修飾薬は、その使用される用量では、インビボの腫瘍細胞に対してわずかな効果しか有しない。ＭＤＳＣを対象とする抗体を使用したＭＤＳＣの低減は、エピジェネティック修飾薬について観察される効果と類似した抗腫瘍効果を有する。養子移入実験において、未治療の担腫瘍マウスから精製されたＭＤＳＣは、エピジェネティック修飾の治療効果を無効にし得る。全く異なるクラスの薬剤（ＰＩＫ３阻害薬）でのＭＤＳＣの阻害は、エピジェネティック修飾薬の効果と類似した効果を有する。

【0013】

本発明の方法に従う治療、および／または本発明のキット及び／もしくは組成物を使用する治療に適している腫瘍の種類は、固形腫瘍及び血液がんの両方である。例示的な腫瘍としては、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人脳／中枢神経系腫瘍、小児脳／中枢神経系腫瘍、乳癌、男性乳癌、青年癌、小児癌、若年成人癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛病、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭及び下咽頭癌、白血病、成人急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部組織癌、皮膚癌、基底細胞及び扁平上皮細胞皮膚癌、黒色腫皮膚癌、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。

【0014】

本発明の方法に従って治療され得る細菌感染症の種類としては、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、及びエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（全般）、毒素原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ソネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、ならびにスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。

【0015】

本発明に従って治療され得るウイルス感染症の種類としては、慢性感染症及び急性感染症の両方が挙げられる。例示的な感染症としては、アデノウイルス、トリインフルエンザ、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、麻疹、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ＳＡＲＳ−ＣｏＶなどの呼吸器ウイルス；コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルスなどの胃腸ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス（サロゲート）などの肝炎ウイルス；単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、サルヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）などのレトロウイルス；トリインフルエンザ、デングウイルス、ハンタウイルス、出血熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、痘瘡ウイルスサロゲート、牛痘、サル痘、ウサギ痘、ワクチニアウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ウエストナイルウイルス、黄熱ウイルスなどのウイルス選択薬剤／新興ウイルス病原体が挙げられる。

【0016】

免疫チェックポイントまたはＭＳＤＣを標的化するのに使用され得る抗体の種類は、いかなるアイソタイプのものであってもよい。それらは、ヒト化されてもよく、キメラまたは他の哺乳動物もしくは動物のものであってもよい。それらは、毒素などの他の部分にコンジュゲートされ得る。それらは、モノクローナルであっても、ポリクローナルであってもよい。それらは、一本鎖抗体、断片、または抗体の一部であってもよい。

【0017】

治療薬剤の投与様式は、当該技術分野において使用されるものであり得る。例としては、経口、局所、吸入、及び注射が挙げられる。投与部位としては、皮膚上または局所、経鼻投与、動脈内、関節内、心臓内、筋肉内、皮内、病巣内、骨内注入、腹腔内、くも膜下腔内、子宮内、腟内投与、静脈内、膀胱内注入、硝子体内、皮下、経皮、経粘膜、硝子体外（ａｖｉｔｒｅａｌ）、皮下、経皮、及び経粘膜が挙げられる。

【0018】

治療され得る哺乳動物としては、腫瘍、血液がん、細菌感染症、またはウイルス感染症になりやすい任意のものが挙げられる。それらには、アグーチ−ミヨプロクタ・アグーチ（Ｍｙｏｐｒｏｃｔａ ａｃｏｕｃｈｙ）（前、プラッティ（ｐｒａｔｔｉ））、アルパカ−ラマ・パコス（Ｌａｍａ ｐａｃｏｓ）、オオアリクイ−ミルメコファガ・トリダクチラ（Ｍｙｒｍｅｃｏｐｈａｇａ ｔｒｉｄａｃｔｙｌａ）、マタコミツオビアルマジロ（前、ラプラタ（Ｌａ Ｐｌａｔａ））−トリピューテス・マタカス（Ｔｏｌｙｐｅｕｔｅｓ ｍａｔａｃｕｓ）、シママングース−マンゴス・マンゴ（Ｍｕｎｇｏｓ ｍｕｎｇｏ）、ナマケグマ−メラルサス・ウルシナス（Ｍｅｌｕｒｓｕｓ ｕｒｓｉｎｕｓ）、アンデスまたはメガネグマ−トレマルクトス・オルナタス（Ｔｒｅｍａｒｃｔｏｓ ｏｒｎａｔｕｓ）、アメリカビーバー−カスター・カナデンシス（Ｃａｓｔｏｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、アメリカバイソン−バイソン・バイソン（Ｂｉｓｏｎ ｂｉｓｏｎ）（スミソニアン保全生物学研究所（ＳＣＢＩ）、Ｆｒｏｎｔ Ｒｏｙａｌのみ）、カラカル−カラカル・カラカル（Ｃａｒａｃａｌ ｃａｒａｃａｌ）、スナドリネコ−プリオナイララス・ヴィヴェリナス（Ｐｒｉｏｎａｉｌｕｒｕｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｕｓ）、イワテンジクネズミ−ケロドン・ルペストリス（Ｋｅｒｏｄｏｎ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ）、チーター−アキノニュクス・ユバトゥス（Ａｃｉｎｏｎｙｘ ｊｕｂａｔｕｓ）、ウンピョウ−ネオフェリス・ネブローサ（Ｎｅｏｆｅｌｉｓ ｎｅｂｕｌｏｓａ）、ハナグマ−ナスア・ナリカ（Ｎａｓｕａ ｎａｒｉｃａ）、白黒またはゲレザコロブス−コロブス・ゲレザ（Ｃｏｌｏｂｕｓ ｇｕｅｒｅｚａ）、ヘレフォードウシ−ボース・タウルス・タウルスヘレフォード（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ｔａｕｒｕｓ ｈｅｒｅｆｏｒｄ）、ホルスタインウシ−ボース・タウルス・タウルスホルスタイン（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ｔａｕｒｕｓ ｈｏｌｓｔｅｉｎ）、ビルマ・ブロー（Ｂｕｒｍｅｓｅ ｂｒｏｗ）・アントラーシカ（ターミンジカ）−セルヴァス・エルディ・ターミン（Ｃｅｒｖｕｓ ｅｌｄｉ ｔｈａｍｉｎ）（ＳＣＢＩ、Ｆｒｏｎｔ Ｒｏｙａｌのみ）、マエガミジカ−エラフォダス・セファロファス（Ｅｌａｐｈｏｄｕｓ ｃｅｐｈａｌｏｐｈｕｓ）（ＳＣＢＩ、Ｆｒｏｎｔ Ｒｏｙａｌのみ）、デグー−オクトドン・デグー（Ｏｃｔｏｄｏｎ ｄｅｇｕｓ）、 ミニチュアロバ−エクウス・アシナス・アシナス・ミニチュレ（Ｅｑｕｕｓ ａｓｉｎｕｓ ａｓｉｎｕｓ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ）、アジアゾウ−エレファス・マキシマス（Ｅｌｅｐｈａｓ ｍａｘｉｍｕｓ）、コミミハネジネズミ−マクロセリデス・プロボシデウス（Ｍａｃｒｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｐｒｏｂｏｓｃｉｄｅｕｓ）、クロアシイタチ−マステラ・ニグリペス（Ｍｕｓｔｅｌａ ｎｉｇｒｉｐｅｓ）、ダマガゼル−ガゼラ・デマ（Ｇａｚｅｌｌａ ｄａｍａ）、ホオジロテナガザル−ノマスカス・レウコゲニス（Ｎｏｍａｓｃｕｓ ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ）、ナイジェリアコビトヤギ−キャプラ・ヒルカス・ヒルカス・ナイジェリアン・ドワーフ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ ｈｉｒｃｕｓ ｎｉｇｅｒｉａｎ ｄｗａｒｆ）、ヌビアヤギ−キャプラ・ヒルカス・ヒルカス・アングロ・ヌビアン（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ ｈｉｒｃｕｓ ａｎｇｌｏ ｎｕｂｉａｎ）、サンクレメンテ島ヤギ−キャプラ・ヒルカス・ヒルカス・サン・クレメンテ（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ ｈｉｒｃｕｓ ｓａｎ ｃｌｅｍｅｎｔｅ）、西洋低地ゴリラ−ゴリラ・ゴリラ・ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ）、オサボウ島ブタ−スス・スクロファ・スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｓｃｒｏｆａ）、プルツワルスキーウマ−エクウス・カバッルス・プルツワルスキーまたはエクウス・フェラス・プルツワルスキー（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ ｏｒ Ｅｑｕｕｓ ｆｅｒｕｓ ｐｒｚｅｗａｌｓｋｉｉ）、ロックハイラックス−プロカヴィア（Ｐｒｏｃａｖｉａ ｃａｐｅｎｓｉｓ）、ワオキツネザル−レマー・カッタ（Ｌｅｍｕｒ ｃａｔｔａ）、アカビタイキツネザル（チャイロキツネザルの亜種）−レムール・ファルヴァス・ルファス（Ｌｅｍｕｒ ｆｕｌｖｕｓ ｒｕｆｕｓ）、アカエリマキキツネザル−ヴァレシア・ヴァリエガタ・ルブラ（Ｖａｒｅｃｉａ ｖａｒｉｅｇａｔａ ｒｕｂｒａ）、アフリカライオン−パンセラ・レオ・レオ（Ｐａｎｔｈｅｒａ ｌｅｏ ｌｅｏ）、クロザル（前、スラウェシ）−マカカ・ニグラ（Ｍａｃａｃａ ｎｉｇｒａ）、シシオザル−マカカ・シレナス（Ｍａｃａｃａ ｓｉｌｅｎｕｓ）、ジェフロイマーモセット（シロビタイまたはシロミミマーモセット）−カリスリクス・ジェフロイイ（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｇｅｏｆｆｒｏｙｉ）、ミーアキャット−スリカータ・スリカッタ（Ｓｕｒｉｃａｔａ ｓｕｒｉｃａｔｔａ）、ダマラランドデバネズミ−クリプトミス・ダマレンシス（Ｃｒｙｐｔｏｍｙｓ ｄａｍａｒｅｎｓｉｓ）、ハダカデバネズミ−ヘテロセファラス・グラベル（Ｈｅｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｇｌａｂｅｒ）、クロホエザル−アルーアッタ・カラヤ（Ａｌｏｕａｔｔａ ｃａｒａｙａ）、コビトマングース−ヘロゲール・パーヴュラ（Ｈｅｌｏｇａｌｅ ｐａｒｖｕｌａ）、ペルシャオナガー−エクウス・ヘミオナス・オナガー（Ｅｑｕｕｓ ｈｅｍｉｏｎｕｓ ｏｎａｇｅｒ）（ＳＣＢＩ、Ｆｒｏｎｔ Ｒｏｙａｌのみ）、ボルネオオランウータン−ポンゴ・ピグメウス（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）、スマトラオランウータン−ボルネオ−ポンゴ・ピグメウス・アベリイ（Ｂｏｒｎｅａｎ−Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ ａｂｅｌｉｉ）、シロオリックス−ホーンド・オリックス・ダッマー（ｈｏｒｎｅｄ−Ｏｒｙｘ ｄａｍｍａｈ）、アジアコツメカワウソ−アオニクス・シネレア（Ａｏｎｙｘ ｃｉｎｅｒｅａ）、カナダカワウソ−ロントラ（Ｌｏｎｔｒａ）（前、ルトラ（Ｌｕｔｒａ））・カナデンシス（ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ジャイアントパンダ−アイルロポダ・メラノルカ（Ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ）、レッサーパンダ−アイララス・ファルゲンス（Ａｉｌｕｒｕｓ ｆｕｌｇｅｎｓ）、クビワペッカリー−タヤッス・タジャク（Ｔａｙａｓｓｕ ｔａｊａｃｕ）、オマキヤマアラシ−コエンドウ・プレヘンシリス（Ｃｏｅｎｄｏｕ ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｉｓ）、クロオプレーリードッグ−シノミス・ルドヴィジアナス（Ｃｙｎｏｍｙｓ ｌｕｄｏｖｉｃｉａｎｕｓ）、シルバーフォックスラビット−オリクトラガス・クニカラス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、ギアナサキ（ペール・ヘデット・サキ）−ピセチア・ピセチア（Ｐｉｔｈｅｃｉａ ｐｉｔｈｅｃｉａ）、ハイイロアザラシ−ハリコエラス・グリパス（Ｈａｌｉｃｈｏｅｒｕｓ ｇｒｙｐｕｓ）、フクロテナガザル−ヒロバテス・シンダクチラス（Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ ｓｙｎｄａｃｔｙｌｕｓ）、フタツユビナマケモノ−クロロエパス・ディダクチラス（Ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ ｄｉｄａｃｔｙｌｕｓ）、プレボーリス−カロシウラス・プレボスティ（Ｃａｌｌｏｓｃｉｕｒｕｓ ｐｒｅｖｏｓｔｉ）、ゴールデンライオンタマリン−レオントピセカス・ロサリア（Ｌｅｏｎｔｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｒｏｓａｌｉａ）、キンクロライオンタマリン−レオントピセカス・クリソメラス（Ｌｅｏｎｔｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ｃｈｒｙｓｏｍｅｌａｓ）グレートマダガスカルテンレック−センチフェル・セトサス（Ｓｅｔｉｆｅｒ ｓｅｔｏｓｕｓ）、スモールマダガスカルハリテンレック−エチノプス・テルファイリ（Ｅｃｈｉｎｏｐｓ ｔｅｌｆａｉｒｉ）、スマトラトラ−パンセラ・タイグリス・スマトラエ（Ｐａｎｔｈｅｒａ ｔｉｇｒｉｓ ｓｕｍａｔｒａｅ）、ダスキーティティ（オラバッス（Ｏｒａｂｕｓｓｕ）ティティ）−カリセバス・モノク（Ｃａｌｌｉｃｅｂｕｓ ｍｏｌｏｃｈ）、北部ツパイ−ツパイア・ベランゲリ（Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ）、タテガミオオカミ−クリソシオン・ブラキュラス（Ｃｈｒｙｓｏｃｙｏｎ ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）、及びグレビーシマウマ−エクウス・グレビー（Ｅｑｕｕｓ ｇｒｅｖｙｉ）が挙げられ、ヒトだけでなく、ペット、家畜、及び野生動物が治療されてもよい。

【0019】

キットは、典型的には、複数の構成成分をパッケージ化もしくは含有する、分割された、または分割されていない容器である。構成成分は、分離されても、混合されてもよい。それらは、薬剤及び／または送達デバイス及び／または説明書であり得る。それらは、混合容器またはデバイスを含んでもよい。

【0020】

嫌気性クロストリジウム・ノビイの胞子はまた、本明細書に記載される他の薬剤と組み合わせて使用されてもよい。クロストリジウム胞子の添加は、それ単独では他の治療よりも効果的ではないものの、担腫瘍個体において更に一層高レベルの生存率を達成する。投与される胞子の量は、例えば、１匹のマウス当たり１０^５〜１０^９個、１０^６〜１０^８個、または１×１０^７〜１０^８個であり得る。一実施形態において、胞子の量は、１匹のマウス当たり５．０×１０^７個である。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、平均約２０〜３０ｇである。胞子の量は、レシピエントの体重に従って調節され得る。

【0021】

胞子の作用の正確な機構は未だに知られていないが、クロストリジウム・ノビイ−ＮＴ感染が、クロストリジウム・ノビイ−ＮＴが感染させた腫瘍に特異的に対するＣＤ８＋Ｔ細胞媒介適応免疫応答を誘発し得ることが既知である。更に、クロストリジウム・ノビイ−ＮＴを治癒したマウスからのＣＤ８^＋Ｔ細胞が、腫瘍特異的な様式で養子免疫を与え得ることが既知である。故に、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、有益な効果に関与する。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４ Ｏｃｔ １９；１０１（４２）：１５１７２−１５１７７を参照されたい。１つの仮説は、細菌感染によって誘導される頑強な炎症応答が一般に、（細菌細胞及び腫瘍細胞の両方に対する）適応免疫応答を増強することである。

【0022】

出願人らは、作用の機構に関するいかなる理論にも拘束されることを望まないが、強力な抗腫瘍免疫応答を生成するために、２つの重要な構成成分、つまり、（ａ）（クロストリジウム・ノビイ−ＮＴ感染により提供され得るような）強力な腫瘍抗原が存在しない場合、適応抗腫瘍免疫応答を増強するための強力な腫瘍抗原または頑強な炎症応答、及び（ｂ）（抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ／４抗体治療により提供され得るように）免疫チェックポイントにより不活化されていない、または（エンチノスタット／５−アザシチジンにより提供され得るように）ＭＤＳＣにより不活化されていない細胞傷害性Ｔ細胞、があるべきであると仮定することは合理的である。

【0023】

最近の臨床研究は、エピジェネティック修飾が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有するごく一部の患者に対して主要な治療効果をもたらすことを実証した（３６）。他の研究は、５−アザシチジンが、自然免疫及び適応免疫の両方に関する遺伝子及び経路、ならびにＮＳＣＬＣ株において免疫回避に関する遺伝子を上方制御することを示している（３５）。免疫チェックポイント阻害についてのこれらの重要な研究及び最近の臨床試験は、ＮＳＣＬＣ患者においてＰＤ−１抗体と、５−アザシチジンと、エンチノスタットとを組み合わせる臨床試験の開始につながっている（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１９２８５７６？ｔｅｒｍ＝ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ＋ｐｄ−１＆ｒａｎｋ＝１）。この試験において、腫瘍細胞における遺伝子発現の変化、及びＭＤＳＣの数及び機能の変化の両方の重要性を決定することは興味深い。本発明者らの観察は、いくつかの疑問点を提起した。例えば、エピジェネティック阻害薬及びＰＩ３Ｋ阻害薬によるＭＤＳＣの選択的抑制の根底にある機構は何なのか？免疫抑制細胞を標的化する他のアプローチ（例えば、骨髄抑制薬剤）は、免疫チェックポイント阻害と協同して、固形腫瘍及び転移の根絶をもたらすのか？免疫チェックポイント阻害前のエピジェネティック阻害薬によるプライミングは、現在の研究においてなされる２つの同時投与と同程度に良好に機能するのか？これらの疑問点に対処する実験は、免疫力を利用するより効果的な治療法の開発につながり得る。

【0024】

上記の開示は、全体として本発明を説明する。本明細書に開示される全ての参考文献は、参照によって明確に組み込まれる。説明のみの目的で本明細書に提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない、以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができる。

【実施例】

【0025】

実施例１
材料及び方法
試薬。Ｌ−グルタミンを有するＨｙＣｌｏｎｅ ＲＰＭＩ１６４０及びＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＩＶ型クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。以下の抗体及び試薬を、動物実験に使用した：ｍＣＤ１５２（ｍＣＴＬＡ−４）モノクローナル抗体（９Ｈ１０、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ｍＰＤ−１モノクローナル抗体（ＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ｍＣＤ２５モノクローナル抗体（ＰＣ６１．５．３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ｍＬｙ６Ｇモノクローナル抗体（ＲＢ６−８Ｃ５、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、ポリクローナルハンプスターＩｇＧ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）、エンチノスタット（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５−アザシチジン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）。

【0026】

細胞株。４Ｔ１（ＣＲＬ−２５３９、マウス乳腺腫瘍細胞）及びＣＴ２６（ＣＲＬ−２６３８、マウス結腸直腸腺癌）を、ＡＴＣＣから購入した。両方の腫瘍細胞株を、３７℃、１０％のウシ胎仔血清、５％のＣＯ２を補足したＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ中で増殖させた。

【0027】

ＩｌｌｕｍｉｎａゲノムＤＮＡライブラリの調製。Ｉｌｌｕｍｉｎａの（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）提案プロトコルに従い、以下の修正をもって、ゲノムＤＮＡライブラリを調製した。２〜３μｇのゲノムＤＮＡを、１００μｌの最終体積までＴＥで希釈し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器（Ｃｏｖａｒｉｓ）内で２００ｂｐの平均サイズに剪断した。その後、ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で精製し、５０μｌの溶出緩衝液で溶出させた。別段記述しない限り、以下の工程に使用された全ての試薬は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）からのものであった。その後、４５μｌの精製したＤＮＡを、４０μｌのｄｄＨ２Ｏ、１０μｌのエンドリペア緩衝液、及び５μｌのエンドリペア酵素と混合した。混合物を２０℃で３０分間インキュベートし、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、７０℃まで温めた４２μｌの溶出緩衝液（ＥＢ）で溶出させた。その後、エンドリペア反応物を、４２μｌのエンドリペアしたＤＮＡ、５μｌの１０Ｘ ｄＡテーリング反応緩衝液、及び５μｌのクレノウ断片（３’〜５’エキソ−）を使用してＡテーリングし、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製したＤＮＡを、２７μｌの６５℃のＥＢで溶出させた。２５μｌのＡテーリングしたＤＮＡ、１０μｌのＰＥ−アダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１０μｌの５Ｘ連結緩衝液、及び５μｌのＱｕｉｃｋ Ｔ４リガーゼによってアダプター連結を実行した。連結混合物を、２０℃で１５分間インキュベートした。５０μｌの連結混合物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの２００μｌのＮＴ緩衝液と混合することによって精製を行い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラム内に充填した。カラムを、卓上遠心機内、１４，０００ｇで１分間遠心分離し、６００μｌの洗浄緩衝液（ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＮＴ３）で１回洗浄し、再度２分間遠心分離して、完全に乾燥させた。キット内に含まれる５０μｌの溶出緩衝液中で、ＤＮＡを溶出させた。精製され、連結したＤＮＡを、以下の条件下、ＰＣＲ増幅した。３２．５μｌのＨ２Ｏ、２．５μｌ（ＤＭＳＯ）、１０μｌの５Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、１０ｍＭの各ｄＮＴＰを含有する１．０μｌのｄＮＴＰ混合物、０．５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＥプライマー番号１、０．５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＥプライマー番号２、０．５μｌのＨｏｔｓｔａｒｔ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、及び５μｌの連結したＤＮＡからなる、およそ１０の反応物を準備した。使用したＰＣＲプログラムは、９８℃で１分間；９８℃で２０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を１０〜１６サイクル；７２℃で５分間であった。その後、反応物を貯蔵し、ＰＣＲ生成物とＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキットからのＮＴ緩衝液との１：２混合物で精製し、キット内に含まれるプロトコルによって精製した。ライブラリＤＮＡを７０℃溶出で溶出させ、ＤＮＡ濃度を、ナノドロップで、２６０ｎｍでの吸光によって推定し、その後、試料をＳｕｒｅｓｅｌｅｃｔエキソーム単離へと進めた。

【0028】

エキソームキャプチャ。ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｅｘｏｍｅ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）からのプロトコルに従って、以下の修正をもって、マウスのエキソームをキャプチャした。（１）２５μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｙｂ番号１、１μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｙｂ番号２、１０μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｙｂ番号３、及び１３μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｙｂ番号４を含有するハイブリダイゼーション混合物を調製した。（２）上記の３．４μｌ（０．５μｇ）のＰＥ−ライブラリＤＮＡ、２．５μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ阻害剤番号１、２．５μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ阻害剤番号２、及び０．６μｌの阻害剤番号３を、３８４ウェルのダイヤモンドＰＣＲプレート（カタログ番号ＡＢ−１１１１、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内、１つのウェルに充填し、２層のｍｉｃｒｏＡｍｐ透明接着フィルム（カタログ番号４３０６３１１、ＡＢＩ）で密封し、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９７００サーモサイクラー（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）内に９５℃で５分間置き、その後、（加熱蓋を付けて）６５℃で保持した。（３）工程（１）からの２５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を、加熱蓋を付けた別の密封されたプレート内で、６５℃で少なくとも５分間加熱した。（４）５μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔオリゴキャプチャライブラリ、１μｌのヌクレアーゼを含まない水、及び１μｌの希釈したリボヌクレアーゼ阻害剤（１：１のリボヌクレアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼを含まない水の混合物）を、別の密封された３８４ウェルプレート内で混合し、６５℃で２分間加熱した。（５）全ての反応物を６５℃で維持しながら、工程（３）からの１３μｌのハイブリダイゼーション緩衝液、その後、工程（２）からのライブラリの全含有物（９μｌ）を、工程（４）からの７μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔキャプチャライブラリ混合物に素早く添加した。混合物をピペットで１０回上下させた。（６）３８４ウェルプレートを固く密封し、ハイブリダイゼーション混合物を、加熱蓋をして６５℃で２４時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、５つの工程を実行して、キャプチャされたＤＮＡライブラリを回収し、増幅した：（１）５０μｌのＤｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１磁気ビーズ（カタログ番号６５０．０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌ）を１．５ｍｌの微量遠心管内に置き、ボルテックス混合機上で勢いよく再懸濁させた。２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ結合緩衝液を添加し、ボルテクサー上で５秒間混合し、その後、管をＤｙｎａｌ磁気分離機内に置いてから、後で上清を除去することによって、ビーズを３回洗浄した。３回目の洗浄後、２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ結合緩衝液中にビーズを再懸濁させた。（２）キャプチャされたＤＮＡを結合させるため、上記の全ハイブリダイゼーション混合物（２９μｌ）をサーモサイクラーからビーズ溶液へと直接移動させ、直ちに４回反転させて、混合した。その後、ハイブリダイゼーション混合物／ビーズ溶液を、８５０ｒｐｍのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ熱混合機内、室温で３０分間インキュベートした。（３）ビーズを洗浄するために、Ｄｙｎａｌ磁気分離機を適用した後、ビーズから上清を除去し、ビーズを、ボルテックス混合機上で４秒間混合することによって、５００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ洗浄緩衝液番号１中に再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。その後、磁気分離の後、ビーズから洗浄緩衝液番号１を除去した。６５℃で１０分間インキュベートした後、それぞれ５００μｌの予熱したＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ洗浄緩衝液番号２で、ビーズを更に３回洗浄した。最終洗浄の後、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ洗浄緩衝液番号２を完全に除去した。（４）キャプチャされたＤＮＡを溶出させるために、ビーズを５０μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ溶出緩衝液中に再懸濁させ、ボルテックス混合し、室温で１０分間インキュベートした。磁気分離の後、上清を除去し、新たな１．５ｍｌの微量遠心管中に採取し、５０μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ中和緩衝液と混合した。ＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＭｉｎＥｌｕｔｅカラムによって精製し、１７μｌの６５℃の緩衝液ＥＢ中に溶出させて、１５μｌのキャプチャされたＤＮＡライブラリを得た。（５）キャプチャされたＤＮＡライブラリを以下の方法で増幅させた：９．５μｌのＨ_２Ｏ、３μｌの５Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液、０．３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．７５μｌのＤＭＳＯ、０．１５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＥプライマー番号１、０．１５μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ ＰＥプライマー番号２、０．１５μｌのＨｏｔｓｔａｒｔ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、及び１μｌのキャプチャされたエキソームライブラリをそれぞれ含むおよそ１５のＰＣＲ反応物を準備した。使用したＰＣＲプログラムは、９８℃で３０秒間；９８℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、７２℃で５分間を１４サイクルであった。ＰＣＲ生成物を精製するために、（１５のＰＣＲ反応物からの）２２５μｌのＰＣＲ混合物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキットからの４５０μｌのＮＴ緩衝液と混合し、上記のように精製した。最終ライブラリＤＮＡを３０μｌの６５℃溶出緩衝液で溶出させ、ＤＮＡ濃度を、ＯＤ_２６０測定によって推定した。

【0029】

配列分析のためのｃＤＮＡの調製。製造者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＤｙｎａｌオリゴ−ｄＴ磁気ビーズを使用するポリ−Ａ選択を２回使用して、５〜１０μｇの全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製し、１３μｌの溶出緩衝液で２回目を溶出させた。以下の修正をもって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｄｓ−ｃＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを調製した。１２μｌの単離されたｍＲＮＡを２μｌの５０ｎｇ／μｌランダムヘキサマーに添加し、７０℃で１０分間インキュベートし、その後、氷上に置いた。４．４μｌの５Ｘ第１鎖緩衝液、２．２μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、及び１．１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰの混合物を管に添加し、４５℃で２分間インキュベートし、その上に１．５μｌのＳＳＩＩ酵素を添加し、全混合物を更に１時間インキュベートし、その後、氷上に置いた。第１鎖反応物に、９０μｌのｄｄＨ_２Ｏ、３０μｌの５Ｘ第２鎖緩衝液、３μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、４μｌのＤＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、１μｌのリボヌクレアーゼＨ、及び１μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼを添加することによって、第２鎖ｃＤＮＡを作製した。その後、混合物を１６℃で２時間インキュベートし、その上に２μｌのＴ４リガーゼを添加し、更に５分間インキュベートした。その後、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを製造者の説明書に従って使用して、得られたｃＤＮＡを精製し、各回５０μｌの７０℃の溶出緩衝液で２回溶出させた。１００μｌのｃＤＮＡを使用し、ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを有するゲノムＤＮＡライブラリプロトコルに従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリを構築した。

【0030】

体細胞突然変異の特定。ライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩｘまたはＨｉＳｅｑ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ上で配列決定した。配列決定の読み取りデータを分析し、ＣＡＳＡＶＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってマウスゲノムｍｍ９に整列させた。（ｉ）不適正塩基が、順配向に少なくとも２つの読み取りデータ、及び逆配向に２つの読み取りデータを含有する、４つ以上の異なる対によって特定された場合、（ｉｉ）特定の不適正塩基を含有する異なるタグの数が、全ての異なるタグの少なくとも３０％である場合のみ、不適正塩基を突然変異として特定した。

【0031】

推定発現Ｈ２−（ｄ）エピトープの特定。特定された体細胞突然変異を、ＲＮＡｓｅｑデータに対して相互参照して、どの突然変異が発現されたのかを決定した。その後、正の突然変異に対応するアミノ酸変化を使用して、突然変異残基の上流及び下流の８個のアミノ酸を単離させることによって、突然変異エピトープを特定した。その後、この１７個のアミノ酸配列を、Ｈ２−ｋ（ｄ）、Ｈ２−Ｌ（ｄ）、及びＨ２−Ｄ（ｄ）に対する潜在的な９個のアミノ酸バインダーについて、ｎｅｔＭＨＣエピトープ特定アルゴリズム（ｎｅｔＭＨＣ ｖ３．４）を使用してプロセシングした。使用されたカットオフは、中等度から高度の親和性バインダーに対応する、５００ｎＭ以上の親和性であった。ＲＮＡｓｅｑデータの正規化計数（１００万の読み取りデータ当たり長さに対して正規化）が０．５を超える場合、遺伝子が発現されると決定した。

【0032】

動物モデル。動物研究は、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、監督された。全ての動物実験に、生後６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。５×１０^６個の４Ｔ１腫瘍細胞または５×１０^６個のＣＴ２６腫瘍細胞を、各マウスの右側腹部の皮下に植え付けた。無作為化及び治療前に、腫瘍を１１日間増殖させた。腫瘍移植の１１、１３、１５、１７、２０、２３、及び２６日後、ＣＴ２６を担持するマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体及び／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を腹腔内に与え、腫瘍移植の１１、１３、１５、及び１７日後、４Ｔ１を担持するマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体及び／または抗ＣＴＬＡ−４抗体を腹腔内に与えた。細胞枯渇研究のため、腫瘍移植の１２日後、４Ｔ１担腫瘍マウスに、単回用量の１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２５抗体または１０ｍｇ／ｋｇの抗Ｌｙ６Ｇ抗体を腹腔内に与えた。１００μｌのｐＨ７．４無菌ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、全ての抗体を適切な濃度に希釈した。腫瘍移植の１２日後、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇ及び０．８ｍｇ／ｋｇの用量でエンチノスタット及び５−アザシチジン治療を開始した。１２、１４、１６、及び１８日目、４Ｔ１を担持するマウスに腹腔内注射した。Ｊ３２は、４Ｔ１腫瘍移植の１２、１４、１６、及び１８日後、腹腔内注射によって２２ｍｇ／ｋｇで与えた。治療開始から３０日間、結果の節に示される間隔で、腫瘍を測定した。腫瘍体積を、長さ×幅^２×０．５として計算した。

【0033】

転移分析。腫瘍移植の４６日後、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って、４Ｔ１担腫瘍マウスを安楽死させた。肺、肝臓、及び脾臓を回収し、１０％の中性緩衝液ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に固定し、１群当たり少なくとも３匹のマウスからの転移小結節を計数した。

【0034】

フローサイトメトリー。以下の抗体及び試薬をフローサイトメトリーに使用した：ＣＤ１６／３２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３ｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１４−Ｃ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１（ＧＫ１．５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８ａ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（５３−６．７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２５ＰＥ（ＰＣ６１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆｏｘｐ３Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（ＭＦ２３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１１ｂ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００（Ｍ１／７０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｍ５／１１４．１５．２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｙ−６Ｃ ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＡＬ−２１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ１１ｃ ＰＥ（ＨＬ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆ４／８０ＡＰＣ（ＢＭ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｌｙ−６Ｇ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（１Ａ８、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ（３０−Ｆ１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。フローサイトメトリーをＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって実行し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってデータを分析した。循環Ｇ−ＭＤＳＣ集団のレベルを評価するために、５−ＡＺＡ／エンチノスタットを有するか、または有しない抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体治療開始から７日後のマウスから血液試料を採取した。右または左の顔面静脈から、１５０μｌの血液をＫ_２ＥＤＴＡ ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に採取した。抗凝固血液試料からのＲＢＣを、２ｍｌの１Ｘ ＢＤ ＦＡＣＳ Ｌｙｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して直ちに３分間溶解させ、試料を氷冷ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で２回洗浄した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｄｅａｄ細胞染色とともに５分間インキュベートし、氷冷ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、試料を適切な抗体で染色した。分析のために、本発明者らは、これらの細胞の既に確立された表現型基準をＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＦ４／８０⁻ＭＨＣＩＩ⁻細胞として使用し、全ＣＤ４５陽性細胞を共通因子として使用した。腫瘍内ＣＤ８^＋集団及び制御Ｔ細胞集団のレベルを評価するために、５−ＡＺＡ／エンチノスタットを有するか、または有しない抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体治療の開始から７日後に、マウスから切除した腫瘍試料から、リンパ球をまず精製した。簡潔には、原発腫瘍組織を回収し、秤量し、微細断片へと分割した。ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、２００ｍｇの腫瘍組織当たり１ｍｌの割合で各試料に添加した。試料を、回転型振盪機上、３７℃で、３０分間インキュベートした。得られた組織破砕物を、０．４μｍで濾過し、氷冷ＢＤ ＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３回洗浄し、１試料当たり５×１０^６個の細胞を抗体標識に使用した。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋の既に確立された表現型基準を使用して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞レベルを評価し、全ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋細胞を共通因子として使用した。ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋の既に確立された表現型基準を使用して、Ｔｒｅｇ細胞レベルを評価し、全ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞を共通因子として使用した。

【0035】

細胞単離。Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、４Ｔ１担腫瘍動物からのＭＤＳＣを脾臓から単離させた。ＣＤ８ａ^＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＩＩ、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４抗体で治療された４Ｔ１を担持する動物の脾臓から、ＣＤ８^＋細胞を単離させた。製造者のプロトコル及び公開されるプロトコルに従って、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ、及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離させ、培養した（３８、３９）。Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＦ４／８０⁻ＭＨＣ−ＩＩ⁻）集団及びＣＤ８^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）集団の純度は、フローサイトメトリーによって決定されるところによると、９５％超であり、これらの集団について、生存能は、トリパンブルー染色によって決定されるところによると、９５％超であった。

【0036】

インビトロ生存率アッセイ。ＭＤＳＣ及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中、２×１０^６個の細胞／ｍｌで９６ウェルプレート上にプレーティングした。ＣＤ８^＋Ｔ細胞培養物に、２０００Ｕ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足した。１０％のＦＢＳを補足したＭｃＣｏｙ５Ａ中の４Ｔ１細胞を、９６ウェルプレート上にプレーティングし、それらが７０％超コンフルエンスに達するまで培養した。０μＭ〜５０μＭの範囲の濃度のエンチノスタット、５−アザシチジン、またはＪ３２とともに、３７℃、５％のＣＯ_２で細胞を２４時間培養した。生細胞の比率を、細胞を１０％（ｖ／ｖ）の細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、３７℃で３時間インキュベートし、得られたホルマザン生成物のＯＤ_４５０吸光度を測定することによって評価した。

【0037】

ＩＦＮ−γアッセイ。新たに単離した４Ｔ１担腫瘍動物からのＭＤＳＣ及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を、２０００Ｕ／ｍＬの組み換えＩＬ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）の存在下、５：１、２：１、１：１、１：２、及び１：５のＭＤＳＣ対ＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合で培養した。ＭＤＳＣ及びＣＤ８^＋Ｔ細胞を１：１の割合で、０μＭ〜０．２５μＭの範囲の濃度のエンチノスタットとともに培養した。３７℃で２４時間インキュベートした後、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ ＤｕｏＳｅｔ Ｅｌｉｓａ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の説明書に従って使用して、細胞を含まない上清を採取しＩＦＮ−γレベルをアッセイした。

【0038】

ＭＤＳＣ枯渇及び養子移入。ＭＤＳＣのインビボ枯渇のため、４Ｔ１担腫瘍マウスを、腫瘍移植の１１日後に腹腔内投与される、１０ｍｇ／ｋｇのｍＬｙ６Ｇモノクローナル抗体の単回ボーラスで治療した。ＭＤＳＣの養子移入のため、４Ｔ１を担持するマウスから脾臓を採取し、Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によってＭＤＳＣを精製した。２回の連続カラム精製後、細胞を氷冷１Ｘ ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２回洗浄し、細胞濃度を１×１０^８個の細胞／ｍｌに調節した。細胞生存能は、トリパンブルー染色によって確認されるところによると、９５％超であり、細胞純度は、フローサイトメトリーによって決定されるところによると、９０％超であった。単離の直後、１×１０^８個の細胞／ｍｌの１００μｌのＭＤＳＣを、４Ｔ１腫瘍移植の１１、１３、及び１５日後に、尾静脈注射によって投与した。

【0039】

免疫蛍光。ＪＨＵ ＩＵＣＡＣガイドラインに従って、マウスを安楽死させ、無菌使い捨て手術用メス（Ｂａｒｄ−Ｐａｒｋｅｒ）を使用して、４Ｔ１担腫瘍マウスから原発腫瘍を切除した。切除した組織を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＣＲＹＯ−ＯＣＴ（Ａｎｄｗｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を充填したベース型内に置き、使用するまで−８０℃で保管した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０ Ｓ Ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して凍結した組織を切開し、１Ｘ ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、４％のパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で組織を１０分間固定した。１Ｘ ＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でスライドを３回洗浄し、その後、１Ｘ ＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で５分間３回洗浄した。１Ｘ ＰＢＳ中、３％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で組織を３０分間ブロッキングし、その後、１０％の正常ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で更に３０分間ブロッキングした。ブロッキングした組織を、１：５０、１：１００、及び１：２００濃度の抗ＣＤ８（ＹＴＳ１６９．４、Ａｂｃａｍ）または抗Ｌｙ６Ｇ（ＲＢ６−８Ｃ５、Ａｂｃａｍ）中で、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体で一晩染色した後、スライドを、１Ｘ ＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、１：５００のヤギ抗ラットＡＦ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはヤギ抗ラットＡＦ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）二次抗体とともに２０℃で１時間インキュベートした。スライドを、１Ｘ ＰＢＳ中、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、カバーガラスを置く前に、組織試料に１滴のＧｏｌｄ／ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、スライドを、暗所に４℃で保管した。撮像には、ＥＣＬＩＰＳＥ ＴＥ２０００−Ｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ及びＥＺ−ＬＩＭＯ ｆｏｒ Ｎｉｋｏｎ Ｃ１ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｖ．２．３０を含むＮｉｋｏｎ Ｃ１ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍを使用した。

【0040】

逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）。５×１０^６個のＣＴ２６細胞または４Ｔ１細胞を、０．７５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．２５ｍｌのクロロホルム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に再懸濁させた。試料を１５秒間ボルテックスし、２０℃で１０分間インキュベートした。４℃で１５分間、１２０００ｇで遠心分離した後、上部水相を採取し、０．５ｍｌの１００％イソプロパノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。試料を２０℃で１０分間インキュベートした後、４℃で１０分間、１２０００ｇで遠心分離した。得られたペレットを１０分未満空気乾燥させ、リボヌクレアーゼを含まない水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で再懸濁させて、５００ｎｇ／μｌの最終濃度をもたらした。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＰＣＲを実行した。アニーリング温度を、Ｈ−２Ｄ（ｄ）、β２ｍ、及びＴＡＰ１について５５℃に設定し、β−アクチンについて６０℃に設定した。試料を１％のアガロースゲル上で分析した。ＲＴ−ＰＣＲには、以下のプライマーを使用した：

【0041】

統計。全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）によって実行した。原発腫瘍増殖曲線を、まず２元配置分散分析によって分析し、個々の群を、両側のウィルコクソン順位和検定と比較した。カプラン・マイヤー生存曲線をログランク検定によって分析した。転移巣の統計的有意性、フローサイトメトリー分析、及びインビトロアッセイを、両側のウィルコクソン順位和検定によって評価した。

【0042】

実施例２
遺伝子分析。本発明者らはまず、ＣＴ２６細胞及び４Ｔ１細胞の両方のエキソーム（２４，３０６個の遺伝子）を配列決定した。生成された配列のうちの８０億塩基及び３５億塩基を、ＣＴ２６及び４Ｔ１のゲノムにそれぞれマッピングした。標的領域内の塩基のうちの８３．５％（ＣＴ２６）及び７２．３％（４Ｔ１）は、腫瘍ＤＮＡ中の少なくとも１０個の特有な読み取りデータによって網羅された。エキソームの配列決定は、ＣＴ２６及び４Ｔ１それぞれにおいて、６８３個及び４７個の体細胞突然変異を明らかにした（データセットＳ１）。

【0043】

ヒト結腸直腸癌及び乳癌において、体細胞突然変異によって作製される突然変異アミノ酸のうちの約１０％が、患者のＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子によって認識されることが予想されるエピトープをもたらすことが示されている（１７）。マウス結腸直腸腫瘍（ＣＴ２６）及び乳腺腫瘍（４Ｔ１）についてこれが真であるかどうかを決定するために、本発明者らは、確立されたアルゴリズムを使用して、体細胞突然変異エピトープをＢＡＬＢ／ｃ ＭＨＣ−Ｉにマッピングした。そのような予想は、突然変異遺伝子が発現される場合にのみ有意義であるため、本発明者らは、ＲＮＡ−Ｓｅｑを使用して、２つの細胞株のトランスクリプトームを決定した。ＣＴ２６において検出された６８３個の突然変異のうちの３１４個は、発現された遺伝子中に生じ、２８個の突然変異したエピトープが、少なくとも中等度の親和性で、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて見られるＨ２−（ｄ）ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子に結合することが予想された（データセットＳ１及び表１）。４Ｔ１細胞は、発現された遺伝子中に２７個の突然変異を内部に持っており、１個のみがＨ２−（ｄ）ＭＨＣ−Ｉ対立遺伝子に結合することが予想された。これらのデータは、ＣＴ２６は４Ｔ１よりも免疫原性であり、これは前者がより多くの突然変異エピトープを有するためであるという提案と一貫する。それはまた、環境突然変異原（ＵＶ光及びタバコの煙など）に関連するヒト腫瘍は他の腫瘍よりも多くの突然変異を有するという観察とも一貫する（１８）。

【0044】

（表１）ゲノム分析及びトランスクリプトーム分析から予想される、突然変異ＭＨＣ−Ｉエピトープ

【0045】

実施例３
免疫チェックポイント阻害の効果。その後、本発明者らは、マウスにおいて、これらの細胞に由来する腫瘍に対する免疫チェックポイント阻害抗体の効果を試験した。中等度のサイズ（約４００ｍｍ^３）の皮下ＣＴ２６腫瘍を担持するＢＡＬＢ／ｃマウスを初期実験に使用した。単一薬剤としての抗ＣＴＬＡ−４抗体または抗ＰＤ−１抗体による頻回治療は腫瘍増殖を遅延させたが、腫瘍根絶は観察されなかった（図１Ａ及びＢ）。両方の抗体による組み合わせ療法は、大多数のマウスにおける腫瘍の根絶をもたらした。逆に、６００ｍｍ^３よりも大きい腫瘍は、組み合わせ抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ４治療にも応答せず（図１Ｃ）、１１匹のうちの４匹の動物のみが長期の生存率を示した（図１Ｄ）。

【0046】

次に、よく確立された４Ｔ１腫瘍（約４００ｍｍ^３）を有するＢＡＬＢ／ｃマウスを評価し、これらの腫瘍は、肺及び他の器官へと自然転移した。４Ｔ１腫瘍モデルは、免疫療法を含むほとんどの治療薬剤に対して高度に不応性である（１６）。原発腫瘍が手術により除去された場合ですら、動物は一般に、転移性疾患に屈する（１９）。少数の原発腫瘍は、抗体治療に対する持続応答を示した。大型ＣＴ２６腫瘍を有するマウスと類似して、１０匹のうちの３匹の動物のみが、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体の両方で治療されたとき、それらの原発腫瘍の退縮を示し、これらが、唯一の長期生存者であった（図１Ｅ及びＦ）。

【0047】

実施例４
エピジェネティック修飾。本発明者らは、動物内の治癒していない腫瘍が、腫瘍細胞におけるエピジェネティックサイレンシングを通して、ＭＨＣ−Ｉ関連遺伝子の発現を下方制御している可能性があると仮定した。実際、この仮説は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）のいずれかの阻害薬を使用する、エピジェネティック修飾（２０）に関与する治療法の基礎を形成する。この可能性を評価するために、本発明者らは、上記の大型ＣＴ２６腫瘍（６００ｍｍ^３超）を担持する動物を、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体、ならびに５−アザシチジン（ＡＺＡ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬）及びエンチノスタット（ＥＮＴ、クラスＩ ＨＤＡＣ阻害薬）で治療した。腫瘍は、このレジメンに際立って良好に応答し、１１匹のうちの１０匹のマウスにおいて原発腫瘍が根絶され、腫瘍移植の６０日後の生存率は１００％であった（図１Ｄ）。同様に、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４プラスＡＺＡ／ＥＮＴ治療に応答して、４Ｔ１腫瘍（約４００ｍｍ^３）を有するマウスは、治療開始の３週間後、全ての原発腫瘍の完全な退縮、及び腫瘍移植の１００日後に８０％の生存率を示した（図１Ｅ及びＦ）。エンチノスタットが使用されたとき、体重変化によって示される一時的な自己制御毒性が観察された（図３７）。しかしながら、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体の添加は、毒性を加えることはなかった。

【0048】

平行実験において、本発明者らは、４Ｔ１担腫瘍マウスを上記のように治療したが、それらを腫瘍移植の６週間後に屠殺した。その後、本発明者らは、それらの原発腫瘍ならびに肺及び他の器官を転移について検査した。原発腫瘍は、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラスＡＺＡ／エンチノスタットで治療した５匹全てのマウスにおいて根絶され、それらのうちのいずれも、いかなる転移も示さなかった（図１Ｇ及び表２）。対照的に、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４治療を単独で受けた５匹全てのマウスは、依然として大型の原発腫瘍及び平均で１１個の肺転移を有した。本発明者らはまた、担腫瘍マウスを抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラスエンチノスタットまたはＡＺＡのいずれかでも治療した。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラスエンチノスタットで治療したマウスのうちのいずれにおいても、原発腫瘍または転移は見出されず、ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４二重阻害と組み合わされるとき、（ＤＮＡメチル化阻害薬を有しない）単独でのクラスＩ ＨＤＡＣ阻害薬が、原発腫瘍及び転移の両方を根絶するのに十分であることを示した（図１Ｇ及び表２）。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラスＡＺＡで治療したマウスにおいて、転移は観察されなかったものの、原発腫瘍は根絶されなかった。ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４阻害なしでは、エンチノスタットおよびＡＺＡは単独または組み合わせであるかに関わらず、原発腫瘍または転移のいずれも根絶することができなかった（図１Ｇ及び表２）。ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４阻害が適用されなかった場合、転移巣は、肺内のものに加えて複数の器官において観察された。

【0049】

（表２）４Ｔ１原発腫瘍及び転移巣

【0050】

実施例５
機構研究。上記の通り、本発明者らは、エピジェネティック修飾薬はＭＨＣ−Ｉ関連遺伝子の発現を増加させ、それにより癌細胞をＴ細胞によってより死滅させやすくしていると予想した。この予想を試験するために、本発明者らは、ＡＺＡ、エンチノスタット、またはこれら２つの組み合わせで治療したＣＴ２６細胞及び４Ｔ１細胞における逆方向転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＭＨＣ−Ｉ提示に関与する遺伝子の発現を分析した。ＭＨＣ−Ｉ、β−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及び抗原プロセシング１（ＴＡＰ１）遺伝子に関連する輸送体の発現が、治療の不在下で、両方の腫瘍細胞株において検出された。しかしながら、エピジェネティック修飾薬に対する曝露は、有意には発現を増加させなかった（図Ｓ２）。

【0051】

その後、本発明者らは、エピジェネティック修飾薬が腫瘍内のＴ細胞蓄積に影響を与えるのかを決定した。フローサイトメトリーによって評価されるように、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４阻害後、およそ４倍だけ増加した（図２Ａ及びＢ）。ＡＺＡ及びエンチノスタットの添加は、腫瘍浸潤ＣＤ８^＋Ｔ細胞を更には増加させなかった。しかしながら、治療レジメンにＡＺＡ及びエンチノスタットを含めると、未治療腫瘍または抗ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４抗体で治療した腫瘍のいずれと比較しても、腫瘍浸潤ＦｏｘＰ３^＋Ｔｒｅｇの有意な低下がもたらされた（図２Ｃ及びＤ）。

【0052】

次に、本発明者らは、フローサイトメトリーによってＭＤＳＣを分析したが、これは、これらの骨髄由来未熟細胞がしばしば担腫瘍宿主において増加し、強力な免疫抑制活性を有するためである（２１、２２）。本発明者らは、４Ｔ１担腫瘍マウスが、非担腫瘍動物と比較して、循環顆粒球ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^＋Ｌｙ６Ｃ^ｌｏＭＨＣ−ＩＩ⁻として定義される、Ｇ−ＭＤＳＣ）において５〜７倍の増加を有することを見出した（図２Ｅ、図Ｓ３Ａ、及びＢ）。多数のＧ−ＭＤＳＣもまた、脾臓及び腫瘍において観察された（図Ｓ３Ｂ）。ＰＤ−１／ＣＴＬＡ−４阻害にエンチノスタットまたはＡＺＡ／エンチノスタットを追加すると、循環Ｇ−ＭＤＳＣの数の著しい減少がもたらされ、それらは非担腫瘍マウスにおいて観察されるレベルと類似するレベルとなった（図２Ｅ及びＦ）。興味深いことに、エピジェネティック修飾薬単独またはＡＺＡプラス抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体は、Ｇ−ＭＤＳＣを減ずることはできなかった。エピジェネティック修飾薬は、免疫チェックポイント阻害と組み合わされるとき、腫瘍浸潤Ｇ−ＭＤＳＣの数も実質的に減少させた（図２Ｇ及びＨ）。

【0053】

これらのデータは、免疫チェックポイント阻害が細胞傷害性エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増大につながるという仮説と一貫するが、Ｔｅｆｆは、エピジェネティック修飾薬での治療によって免疫抑制性細胞が減少しない限り、完全には機能しない。この仮説を更に試験するために、本発明者らは、４Ｔ１腫瘍を担持するマウスにおいて、ＣＤ２５またはＬｙ６Ｇに対する中和抗体を使用して、ＴｒｅｇまたはＧ−ＭＤＳＣをそれぞれ枯渇させた（２３〜２５）。本発明者らは、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせで使用されるとき、抗Ｌｙ６Ｇが、エピジェネティック修飾薬と同等に効果的であることを見出した（図３Ａ）。フローサイトメトリーは、抗Ｌｙ６Ｇ治療後、Ｇ−ＭＤＳＣレベルの実質的減少を示した（図３Ｂ）。対照的に、抗ＣＤ２５治療は、免疫チェックポイント阻害と組み合わされるとき、有効性のわずかな改善しか示さなかった（図３Ａ）。しかしながら、抗ＣＤ２５治療はまた、ＣＤ２５を過渡的に発現させ得る活性化Ｔｅｆｆにも影響を与え得ることに留意されたい。予想通り、免疫チェックポイント阻害なしでは、抗ＣＤ２５及び抗Ｌｙ６Ｇは両方とも非効果的であった（図３Ａ）。

【0054】

腫瘍誘導Ｇ−ＭＤＳＣが免疫チェックポイント阻害の効果に干渉する能力を直接評価するために、本発明者らは、親和性精製によってそれらを４Ｔ１担腫瘍マウスから単離させた。その後、本発明者らは、精製されたＧ−ＭＤＳＣを、抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体プラスＡＺＡ／エンチノスタットで治療した４Ｔ１担腫瘍マウスに注射した。Ｇ−ＭＤＳＣの養子移入は、組み合わせ療法に対する応答を有意に減弱させた（図３Ｃ）。上記の結果に基づいて、本発明者らは、エピジェネティック修飾の効果は、Ｔｒｅｇの直接枯渇の結果であるよりも、Ｇ−ＭＤＳＣの枯渇の結果である可能性が高いと結論付けた。

【0055】

エピジェネティック修飾がＧ−ＭＤＳＣに直接影響を与えるのかを研究するために、本発明者らは、４Ｔ１担腫瘍マウスからのこれらの細胞を上記のように精製し、それらをインビトロでエンチノスタットまたはＡＺＡで処理した。Ｇ−ＭＤＳＣは、エンチノスタット治療後、用量依存的様式で、著しく減少した生存能を示した（図４Ａ）。逆に、ＡＺＡは、同等の濃度では効果を有しなかった（図４Ｂ）。本発明者らはまた、４Ｔ１腫瘍細胞を同一の濃度のエンチノスタットまたはＡＺＡでも処理し、それらが非応答性であることを見出した（図４Ａ及びＢ）。重要なことに、エンチノスタットは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して控えめな効果しか有さず（図４Ａ）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を残しながらＧ−ＭＤＳＣを枯渇させ得る大きな治療機会を作り出す。最後に、本発明者らは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＧ−ＭＤＳＣとともに共培養し、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でのＴ細胞活性化後、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、培養培地におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の濃度を分析した。Ｇ−ＭＤＳＣは、ＩＦＮ−γ分泌を阻害した（図４Ｃ）一方で、培養培地にエンチノスタットを含めると、用量依存的様式で阻害が逆転した（図４Ｄ）。これらのデータは、Ｇ−ＭＤＳＣがＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能を直接阻害し、エンチノスタットがＧ−ＭＤＳＣを直接抑制することによって阻害を緩和するという考えを支持した。

【0056】

この結論を更に確認するため、ならびに同一の目的を達成するための更なる治療的アプローチを提供するために、本発明者らは、Ｇ−ＭＤＳＣ機能を抑制し得る他の治療薬剤を探索した。ホスファチジルイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、造血細胞生物学において重要な役割を果たすことが知られており、Ｇｒ１^＋／ＣＤ１１ｂ^＋骨髄細胞を活性化することができる（２６）。本発明者らは、ＰＩ３Ｋ阻害薬の多様なアレイを以前に開発しており、高い細胞効能を有する１つ（Ｊ３２）を選択して、試験した（２７〜２９）。Ｊ３２は、ナノモル濃度でＧ−ＭＤＳＣに対して細胞傷害性（１４．３ｎＭのＥＣ_５０）であり、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（９４．６ｎＭのＥＣ_５０）に対してずっと毒性が低いことが証明された（図Ｓ４Ａ）。抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた、比較的低用量のＪ３２（２２ｍｇ／ｋｇ）での４Ｔ１担腫瘍マウスの治療は、循環Ｇ−ＭＤＳＣの著しい減少（図Ｓ４Ｂ）、及び動物のうちの８０％において４Ｔ１腫瘍の根絶（図Ｓ４Ｃ）をもたらした。単独では、Ｊ３２は、４Ｔ１腫瘍増殖に対する明らかな効果は有しなかった。

【0057】

実施例５
４Ｔ１腫瘍細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍細胞注射の１０、１２、１４、及び１６日後、抗ＰＤ−１（１０ｍｇ／ｋｇ）抗体及び抗ＣＴＬＡ−４（１０ｍｇ／ｋｇ）抗体を、第２、３、４、及び５群のマウスに腹腔内注射した。１１、１３、１５、及び１７日目、エンチノスタット（ＥＮＴ、２０ｍｇ／ｋｇ）及び５−アザシチジン（ＡＺＡ、０．８ｍｇ／ｋｇ）を、第４及び５群のマウスに腹腔内注射した。１３及び１５日目、クロストリジウム・ノビイ−ＮＴ胞子（１匹のマウス当たり５０００万個）を、第１、３、及び５群のマウスの４Ｔ１腫瘍皮下に直接注射した。その後、腫瘍細胞注射の１００日後まで、マウス生存率を詳しく経過観察した。生存率曲線を、図９に示す。病理学的評価のために解剖した死亡マウスは、広範な肺転移を一定に有した。

【0058】

この実験において示されるチェックポイント阻害（抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４）プラスエピジェネティック阻害（ＥＮＴ／ＡＺＡ）の有効性（５０％の治癒率）は、前の実施例において示された有効性（８０％の治癒率）よりもいくらか低かった。しかしながら、この実験における抗ＰＤ−１／抗ＣＴＬＡ−４単独の有効性もまた低かった（前の実施例における３０％の治癒率に対して、ここでは１０％の治癒率）。組み合わせ療法において観察された有効性の増強は、減少していない。有効性の変動は、異なる製造ロットからの抗体の質によるものである可能性が高い。

【0059】

参考文献
引用される各参考文献の開示は、本明細書に明確に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【手続補正書】

【提出日】2017年2月16日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2017年7月7日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
免疫チェックポイントを阻害する少なくとも１つの第２の薬剤と
を含む、担腫瘍哺乳動物を治療するための薬学的組成物。

【請求項2】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項3】

前記第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項4】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシチジンである、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬が、Ｊ３２である、請求項２に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４抗体との組み合わせである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項9】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項３に記載の薬学的組成物。

【請求項10】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項11】

前記腫瘍が、非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）ではない、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項12】

クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）−ＮＴの胞子と併用される、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項13】

単一パッケージ内に、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤と
を含む、キット。

【請求項14】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記少なくとも２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項１３に記載のキット。

【請求項16】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシチジンである、請求項１４に記載のキット。

【請求項18】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬が、Ｊ３２である、請求項１４に記載のキット。

【請求項19】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１５に記載のキット。

【請求項20】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項１５に記載のキット。

【請求項21】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項１３に記載のキット。

【請求項22】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、請求項１３に記載のキット。

【請求項23】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤と
を含む、組成物。

【請求項24】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記少なくとも２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項26】

前記第１の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

前記第１の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシチジンである、請求項２４に記載の組成物。

【請求項28】

前記第１の薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬が、Ｊ３２である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項29】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の組成物。

【請求項30】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項31】

前記第１の薬剤が、エンチノスタットと５−アザシチジンとの組み合わせである、請求項２３に記載の組成物。

【請求項32】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項33】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項７に記載の薬学的組成物。

【請求項34】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項35】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のキット。

【請求項36】

前記第１の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項37】

前記腫瘍が、結腸直腸癌である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項38】

前記腫瘍が、乳癌である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項39】

前記腫瘍が、結腸直腸癌転移である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項40】

前記腫瘍が、乳癌転移である、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項41】

前記第１の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である用量を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。

【請求項42】

前記第１の薬剤が、１つ以上の単位投与量中に、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である量で存在する、１つ以上の単位投与量を含む請求項１３に記載のキット。

【請求項43】

前記第１の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である単位投与量中に存在する、単位投与量である請求項２３に記載の組成物。

【請求項44】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの第１の薬剤と、
少なくとも２つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも２つの第２の薬剤と
を含む、担腫瘍哺乳動物を治療するための薬学的組成物。

【請求項45】

前記２つの第２の薬剤が、抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項４４に記載の薬学的組成物。

【請求項46】

クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子と併用される、請求項４４に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの薬剤を含む、細菌またはウイルス感染症を有する哺乳動物を治療するための薬学的組成物であって、該薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記薬学的組成物。

【請求項48】

前記薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、請求項４７に記載の薬学的組成物。

【請求項49】

前記薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、５−アザシチジンである、請求項４７に記載の薬学的組成物。

【請求項50】

前記薬剤が、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬が、Ｊ３２である、請求項４７に記載の薬学的組成物。

【請求項51】

前記感染症が、慢性ウイルス感染症である、請求項４７に記載の薬学的組成物。

【請求項52】

前記感染症が、関連する敗血症を伴う細菌性である、請求項４７に記載の薬学的組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0009】

本発明の更に別の態様において、細菌またはウイルス感染症を有する哺乳動物を治療する方法が提供される。骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも１つの薬剤が、投与される。薬剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）ｐ１１０αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0010】

本明細書の閲読時に当業者に明らかになるであろう、これら及び他の実施形態は、当該技術分野に、治療困難な腫瘍を治療するための治療調製物及び方法を提供する。
[本発明1001]
担腫瘍哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも1つの第1の薬剤を投与する工程と、
免疫チェックポイントを阻害する少なくとも1つの第2の薬剤を投与する工程と
を含む、方法。
[本発明1002]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第2の薬剤が、抗ＰＤ−1抗体、抗ＣＴＬＡ−4抗体、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、本発明1002の方法。
[本発明1005]
前記第1の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、5−アザシタジンである、本発明1002の方法。
[本発明1006]
前記第1の薬剤が、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬が、Ｊ32である、本発明1002の方法。
[本発明1007]
前記第2の薬剤が、抗ＰＤ−1抗体と抗ＣＴＬＡ−4抗体との組み合わせである、本発明1003の方法。
[本発明1008]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1003の方法。
[本発明1010]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記腫瘍が、非小細胞肺癌（ＮＳＬＣ）ではない、本発明1001の方法。
[本発明1012]
クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）−ＮＴの胞子を投与する工程を更に含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
単一パッケージ内に、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも1つの第1の薬剤と、
少なくとも2つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも2つの第2の薬剤と
を含む、キット。
[本発明1014]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1013のキット。
[本発明1015]
前記少なくとも2つの第2の薬剤が、抗ＰＤ−1抗体及び抗ＣＴＬＡ−4抗体である、本発明1013のキット。
[本発明1016]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、本発明1014のキット。
[本発明1017]
前記第1の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、5−アザシタジンである、本発明1014のキット。
[本発明1018]
前記第1の薬剤が、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬が、Ｊ32である、本発明1014のキット。
[本発明1019]
前記抗体が、モノクローナル抗体である、本発明1015のキット。
[本発明1020]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1015のキット。
[本発明1021]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1013のキット。
[本発明1022]
クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、本発明1013のキット。
[本発明1023]
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも1つの第1の薬剤と、
少なくとも2つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも2つの第2の薬剤と
を含む、組成物。
[本発明1024]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
前記少なくとも2つの第2の薬剤が、抗ＰＤ−1抗体及び抗ＣＴＬＡ−4抗体である、本発明1023の組成物。
[本発明1026]
前記第1の薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、本発明1024の組成物。
[本発明1027]
前記第1の薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、5−アザシタジンである、本発明1024の組成物。
[本発明1028]
前記第1の薬剤が、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬が、Ｊ32である、本発明1024の組成物。
[本発明1029]
前記抗体が、モノクローナル抗体である、本発明1025の組成物。
[本発明1030]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1025の組成物。
[本発明1031]
前記第1の薬剤が、エンチノスタットと5−アザシタジンとの組み合わせである、本発明1023の組成物。
[本発明1032]
クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を更に含む、本発明1023の組成物。
[本発明1033]
前記抗体が、モノクローナル抗体である、本発明1007の方法。
[本発明1034]
前記第1の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1035]
前記第1の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、本発明1013のキット。
[本発明1036]
前記第1の薬剤が、ＭＤＳＣの表面上に発現されるマーカーに結合するモノクローナル抗体である、本発明1023の組成物。
[本発明1037]
前記腫瘍が、結腸直腸癌である、本発明1001の方法。
[本発明1038]
前記腫瘍が、乳癌である、本発明1001の方法。
[本発明1039]
前記腫瘍が、結腸直腸癌転移である、本発明1001の方法。
[本発明1040]
前記腫瘍が、乳癌転移である、本発明1001の方法。
[本発明1041]
前記第1の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である用量で投与される、本発明1001の方法。
[本発明1042]
前記第1の薬剤が、1つ以上の単位投与量中に、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である量で存在する、1つ以上の単位投与量を含む本発明1013のキット。
[本発明1043]
前記第1の薬剤が、単独では腫瘍細胞増殖を阻害するのに不十分である単位投与量中に存在する、単位投与量である本発明1023の組成物。
[本発明1044]
担腫瘍哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも1つの第1の薬剤を投与する工程と、
少なくとも2つの免疫チェックポイントを阻害する少なくとも2つの第2の薬剤を投与する工程と
を含む、方法。
[本発明1045]
前記2つの第2の薬剤が、抗ＰＤ−1抗体及び抗ＣＴＬＡ−4抗体である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
クロストリジウム・ノビイ−ＮＴの胞子を投与する工程を更に含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
細菌またはウイルス感染症を有する哺乳動物を治療する方法であって、
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制する少なくとも1つの薬剤を投与する工程を含み、該薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
[本発明1048]
前記薬剤が、ヒストンデアセチラーゼ阻害薬であり、該ヒストンデアセチラーゼ阻害薬が、エンチノスタットである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記薬剤が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬であり、該ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害薬が、5−アザシタジンである、本発明1047の方法。
[本発明1050]
前記薬剤が、ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬であり、該ホスホイノシトール3キナーゼ（ＰＩ3Ｋ）ｐ110αサブユニット阻害薬が、Ｊ32である、本発明1047の方法。
[本発明1051]
前記感染症が、慢性ウイルス感染症である、本発明1047の方法。
[本発明1052]
前記感染症が、関連する敗血症を伴う細菌性である、本発明1047の方法。

【国際調査報告】