特表 2017-528495 フェニルグリシンメチルエステルの塩

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-528495(P2017-528495A)

(43)【公表日】2017年9月28日

(54)【発明の名称】フェニルグリシンメチルエステルの塩

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/36 20060101AFI20170901BHJP

   C07C 227/18 20060101ALI20170901BHJP

【ＦＩ】

   C07C229/36CSP

   C07C227/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2017-515829(P2017-515829)

(86)(22)【出願日】2015年9月17日

(85)【翻訳文提出日】2017年4月18日

(86)【国際出願番号】EP2015071324

(87)【国際公開番号】WO2016046055

(87)【国際公開日】20160331

(31)【優先権主張番号】14185735.9

(32)【優先日】2014年9月22日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517091816

【氏名又は名称】デーエスエム シノケム ファーマシューティカルズ ネーデルランド ベースローテン フェンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＳＩＮＯＣＨＥＭ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＮＥＴＨＥＲＬＡＮＤＳ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100144048

【弁理士】

【氏名又は名称】坂本 智弘

(74)【代理人】

【識別番号】100107629

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 敏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100189186

【弁理士】

【氏名又は名称】大石 敏弘

(74)【代理人】

【識別番号】100186679

【弁理士】

【氏名又は名称】矢田 歩

(74)【代理人】

【識別番号】100204755

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 浩司

(72)【発明者】

【氏名】ドエス，ファン デル，トーマス

【テーマコード（参考）】

4H006

【Ｆターム（参考）】

4H006AA01

4H006AA02

4H006AA03

4H006AB84

4H006AC52

4H006AD15

4H006BB15

4H006BC31

4H006BC51

4H006BE03

(57)【要約】

本発明は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩、当該塩の調製方法、並びに抗生物質及びＤ−フェニルグリシンメチルエステル遊離塩基の酵素的合成における当該塩の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩。

【請求項2】

６．１±０．２°２θ、１２．１±０．２°２θ、１８．８±０．２°２θ及び２４．１±０．２°２θのピークを含む粉末ＸＲＤ回折パターンを有する、請求項１に記載のヘミ硫酸塩。

【請求項3】

７．９±０．２°２θ、１４．４±０．２°２θ、１５．６±０．２°２θ、１６．７±０．２°２θ、１９．５±０．２°２θ及び２５．６±０．２°２θのピークをさらに含む、請求項２に記載のヘミ硫酸塩。

【請求項4】

（ａ）Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの有機溶媒中の溶液を硫酸と接触させる工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物からＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩を単離する工程
を含む、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の調製方法であって、
工程（ａ）において、硫酸のモル量が、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのモル量に対して０．４〜０．６であることを特徴とする方法。

【請求項5】

工程（ａ）の後に水層を分離し、工程（ｂ）を前記水層で行う、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程（ａ）で得られた前記水層が結晶化に付される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記結晶化が、工程（ａ）で得られた前記水層の温度を低下させることによって行われる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記結晶化が−５〜１５℃の温度で行われる、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｂ）の前記単離の後に残る水層を、請求項４に記載の方法の工程（ａ）の混合物に加える、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記有機溶媒の水に対する溶解度が０％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）であり、前記有機溶媒の極性指数が１〜５である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記極性指数が２〜３である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記溶媒が、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

アンピシリン、セファクロール又はセファレキシンの調製における、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の使用であって、
ペニシリンアシラーゼの存在下、前記Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩をそれぞれ６−アミノペニシラン酸、７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレート又は７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸と接触させる工程を含む使用。

【請求項14】

Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル遊離塩基の調製における、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩、当該塩の調製方法、及び抗生物質の酵素的合成における当該塩の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アミノβ−ラクタムの母核を側鎖の酸誘導体、例えばアミド又はエステルでアシル化することによる半合成β−ラクタム抗生物質の酵素的製造は、広く特許文献：例えばＤＥ２１６３７９２、ＤＥ２６２１６１８、ＥＰ３３９７５１、ＥＰ４７３００８、ＵＳ３８１６２５３、ＷＯ９２／０１０６１、ＷＯ９３／１２２５０、ＷＯ９６／０２６６３、ＷＯ９６／０５３１８、ＷＯ９６／２３７９６、ＷＯ９７／０４０８６、ＷＯ９８／５６９４６、ＷＯ９９／２０７８６、ＷＯ２００５／００３６７、ＷＯ２００６／０６９９８４及びＷＯ２００８／１１０５２７に記載されている。当技術分野で用いられる酵素は、ほとんどの場合、大腸菌（Escherichia coli）から得られるペニシリンアシラーゼであり、様々な種類の水不溶性材料で固定化（例えば、ＷＯ９７／０４０８６）されている。

【0003】

生体触媒は高い感受性を有するために、酵素的方法は通常、汚染物質の存在に関して厳しい要件を有する。不必要な不純物が、しばしば酵素の適切な機能を妨害する。この理由から、アミノβ−ラクタムの母核を側鎖の酸誘導体、例えばアミド又はエステルでアシル化することによる半合成β−ラクタム抗生物質の酵素的製造においても、出発原料は可能な限り最高の純度であることが好ましい。これは、通常、出発原料を単離することによって、好ましくは結晶化によって達成される。例えば、アモキシシリン、セファドロキシル及びセフプロジル等の抗生物質の側鎖であるＤ−４−ヒドロキシフェニルグリシンについては、アミド又はエステル等の活性化誘導体の結晶化を容易に為すことができる。しかし、アンピシリン、セファクロール及びセファレキシン等の抗生物質の側鎖であるＤ−フェニルグリシンについては、これが大きな問題である。現在までに、アンピシリン、セファクロール及びセファレキシンの酵素的製造における最も好ましい出発原料の１つである結晶性Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの単離に関する報告はない。しかし、ＷＯ２００８／１１０５２７に記載されているように、微量のＤ−フェニルグリシンが存在すると酵素カップリング反応の収率が大きく悪影響を受けるため、高度に精製されたＤ−フェニルグリシンメチルエステルが必要である。これは、酵素カップリング反応条件下で遊離の側鎖の溶解度が低いために、酵素カップリング反応における遊離の側鎖の濃度に上限があるという事実に起因する。この上限は、遊離の側鎖が結晶化せず又は沈殿しないという要件で決定される。なぜなら、沈殿物が酵素カップリング反応のプロセシングに悪影響を及ぼすからである。さらに、半合成β−ラクタム化合物の下流プロセシングの最終工程で、混入するＤ−フェニルグリシンを、例えば半合成β−ラクタム化合物の最終結晶化工程の母液を用いて除去しなければならない。Ｄ−フェニルグリシン濃度がより高くなれば、Ｄ−フェニルグリシンを除去するためにより多くの母液が必要とされ、これによって、今度は半合成β−ラクタム化合物の損失がより大きくなる。側鎖エステルを固体形態で単離する単位操作は、半合成抗生物質の製造プロセスを複雑にし、その原価に著しく寄与する。従って、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル中の不必要なＤ−フェニルグリシンの量はできるだけ少なくすべきである。

【0004】

これを達成するために、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルを塩の形態で単離することができる。アルキルスルホン酸塩又はアリールスルホン酸塩及び塩酸塩等のいくつかの塩が報告されており、これらの単離プロセスによって不必要な微量のＤ−フェニルグリシンを除去することができる。しかし、これらの塩は、新たな有機不純物の塩を導入する等の一定の欠点を有する。塩酸塩は、大体において、精製されたＤ−フェニルグリシンメチルエステルの誘導体の単離のための魅力的な候補である。しかし、残念なことに、ペニシリンアシラーゼは、塩酸塩の存在によって悪影響を受ける種類の酵素であり、従って、酵素的合成におけるＤ−フェニルグリシンメチルエステルの塩酸塩の使用は、解決するために設定された当初の問題よりも大きい付加的な問題を伴う。この理由のために、単離することができ、十分な純度であり、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの塩酸塩に関連する問題を有していないＤ−フェニルグリシンメチルエステルの誘導体が依然として必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、単離することができ、十分な純度であり、アンピシリン、セファクロール及びセファレキシンをもたらす酵素プロセスにおいて副反応を阻害することなく用いることができるＤ−フェニルグリシンメチルエステルの誘導体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

用語「核」は、半合成β−ラクタムのβ−ラクタム部分として本明細書で定義され、例えば６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノデアセトキシ−セファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）、７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）又は７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレート（７−ＡＣＣＡ）等の任意のペネム又はセフェムであってもよい。

【0007】

用語「側鎖」は、半合成β-ラクタム化合物において、本明細書で定義された核の６−アミノ又は７−アミノの位置に結合される部分として、すなわちアンピシリン、セファクロール及びセファレキシンの中のＤ−フェニルグリシンとして本明細書で定義される。

【0008】

用語「遊離の側鎖」は、側鎖の誘導化されていない形態、すなわちＤ−フェニルグリシンである。

【0009】

用語「側鎖エステル」は、遊離の側鎖のエステルの形態であり、遊離の側鎖のカルボキシル基が、アルコールとエステル化され、例えばＤ−フェニルグリシンメチルエステルにエステル化される。側鎖エステルは、遊離塩基の形態で、又は塩の形態で、例えば硫酸塩の形態であってもよい。

【0010】

用語「Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩」（略称：（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４）は、式：Ｃ_１８Ｈ_２４Ｎ_２ＳＯ_８を有する式（１）の化合物を指す。

【0011】

【化1】

【0012】

第１の態様では、本発明は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩（（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４）を単離された形態で提供する。好ましくは、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４は結晶である。１つの実施態様では、結晶性（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４は、図１に示す粉末ＸＲＤ回折パターンを有する。好ましくは、粉末ＸＲＤ回折パターンは、６．１±０．２°２θ、１２．１±０．２°２θ、１８．８±０．２°２θ及び２４．１±０．２°２θのピークを示す。より好ましくは、粉末ＸＲＤ回折パターンは、７．９±０．２°２θ、１４．４±０．２°２θ、１５．６±０．２°２θ、１６．７±０．２°２θ、１９．５±０．２°２θ及び２５．６±０．２°２θの追加のピークを示す。

【0013】

本発明の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４は有利に、安定な固体である。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの唯一の他の公知の安定な無機酸塩は、塩酸塩である。しかし、この塩酸塩は、酵素の性能への悪影響、及び副生成物としての腐食性の塩酸塩の放出等のいくつかの欠点を有する。塩酸塩の生成は、工業用反応容器に有害な影響を及ぼすことが知られており、本発明の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の使用に伴って生成される硫酸塩ではこの現象は起こらない。驚くべきことに、アンピシリン、セファクロール又はセファレキシン等の半合成Ｄ−フェニルグリシン含有β-ラクタム化合物の酵素的合成に本発明の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４を適用することで、ＵＳ８５４１１９９に提唱されたＤ−フェニルグリシンメチルエステルの硫酸塩の溶液を使用した場合と比較して、優れた結果がもたらされた。１つの実施態様では、本発明の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４を用いて、より高い収率で、より高い変換率で、及び不必要なＤ−フェニルグリシンの生成をより低く抑えて、７−ＡＤＣＡから酵素的に抗生物質セファレキシンを調製することができる。

【0014】

第２の態様において、本発明は、
（ａ）Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの有機溶媒中の溶液を硫酸と接触させる工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた混合物からＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩を単離する工程
を含む、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の調製方法を提供する。

【0015】

好ましくは、硫酸の量は、硫酸のモル量が、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４のモル量に対して０．４〜０．６であるように選択される。好ましい実施態様で、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４は、工程（ａ）で水層を分離し、そこから（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４を結晶化させることで単離される。結晶化は、当業者に公知の方法に従って、例えば温度を低下させることによって実施することができる。好ましい結晶化温度は、−５〜１５℃、より好ましくは０〜１０℃であることが判明した。

【0016】

１つの実施態様では、上記方法の工程（ｂ）の単離の後に残る水層をリサイクルすることによって全体の収率を改善することができることが見出された。従って、水性母液は、上記の方法の次のサイクルで、工程（ａ）の混合物に添加される。好ましくは、リサイクルは、工程（ａ）の混合物に添加される前に水性母液の一部が廃棄されるようにして実施される。好適な少量の一部は、１〜５０体積％、好ましくは２〜２５体積％、より好ましくは３〜１５体積％である。層分離の結果、このリサイクルは、不純物を蓄積せずに行うことができることが判明した。

【0017】

第２の態様の方法は、様々な有機溶媒を用いて行うことができる。好ましい溶媒は、０％（ｗ／ｗ）〜２５％（ｗ／ｗ）の水への溶解度を有し、１〜５の極性指数（polarity index）を有する溶媒であることが見出された。好ましくは、極性指数は２〜３であり、この範囲は一般に最良の結果をもたらす。好ましい溶媒は、酢酸ブチル、ジエチルエーテル、酢酸エチル、メチルイソブチルケトン及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。

【0018】

第３の態様では、本発明は、アンピシリン、セファクロール又はセファレキシンの調製における（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の使用であって、ペニシリンアシラーゼ、好ましくは固定化ペニシリンアシラーゼの存在下、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４をそれぞれ６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）、７−アミノ−３−クロロ−３−セフェム−４−カルボキシレート（７−ＡＣＣＡ）又は７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）と接触させる工程を含む使用を提供する。この酵素反応は、当技術分野で知られた、先に引用した任意の方法に従って行うことができる。例えば、アンピシリンの合成は、ＥＰ３３９７５１又はＷＯ９８／５６９４６に記載されているようにして行うことができる。同様に、セファレキシンの合成は、ＷＯ９６／２３７９６に記載されているようにして行うことができる。セファクロールの合成は、ＷＯ２００６／０６９９８４に記載されているようにして行うことができる。

【0019】

酵素カップリングの後、半合成β−ラクタム抗生物質は、公知の方法を用いて回収することができる。例えば、酵素反応容器から、上向きに攪拌しながら底部の篩を通して内容物を排出してもよい。その後、得られた半合成β−ラクタム系抗生物質の懸濁液をガラスフィルターで濾過してもよい。

【0020】

酵素カップリング反応後に存在する少量の遊離の側鎖のために、最終の半合成β−ラクタム抗生物質の結晶化を、高いβ−ラクタム抗生物質の濃度で行うことができ、その結果、高収率がもたらされる。

【0021】

別の実施態様において、本発明の第３の態様は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル遊離塩基の調製におけるＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の使用を提供する。この使用は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのメチル硫酸塩についてのＷＯ２００８／１１０５２７に概説された手順に従って順調に達成することができる。ＷＯ２００８／１１０５２７に記載されているＤ−フェニルグリシンメチルエステル遊離塩基の調製と比較して、本発明のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の使用は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル遊離塩基の母液の損失が減少するため、この点で優れた結果を与えることが見出された。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩のＸＲＤスペクトルである。Ｘ軸：２θ値（°）。Ｙ軸：強度（ｃｐｓ）。以下の明確なピークを識別することができる。

【表1】

【発明を実施するための形態】

【0023】

一般
粉末Ｘ線回折分析
内部ナイフ（バックグラウンド散乱を最小にするため）及び空洞（直径２ｃｍ）を備えた密閉サンプルホルダーに試料を載せた。試料調製中の粉塵生成を最小限に抑えるために、粉砕することなくヒュームフード内で充填を行った。Ｂｒｕｋｅｒ社の粉末Ｘ線回折装置Ｄ２ Ｐｈａｓｅｒで試料を分析した。この粉末Ｘ線回折装置は、１°の開き角度、０．１ｍｍの受光スリット、及びニッケルフィルターを有するＬｙｎｘＥｙｅ検出器を使用する。回折角２θは２°〜６０°の範囲であり、ステップ幅（２θ内）は約０．００８°であり、カウント時間は４秒／ステップである。測定中、（良好な統計のために）試料を１５ｒｐｍで回転させ、データはバックグラウンドをほぼ取り除いたものである。

【0024】

ＨＰＬＣ分析
カラム：ＨＰＬＣカラムＣｒｏｗｎｐａｋ ＣＲ（−）（ダイセル社），長さ１５０ｍｍ，直径４ｍｍ，粒子の直径５μｍ。
溶離液：ＨＣｌＯ_４，ｐＨ＝２．０の溶液。１．４３ｇのＨＣｌＯ_４（７０％，１．４３ｇ）を秤量し、これをクロマトグラフィー用の水で１０００ｍＬに希釈し、溶液のｐＨを確認した。
クロマトグラフィー条件：
・溶離液：ＨＣｌＯ_４，ｐＨ＝２
・アイソクラティックな条件
・流量：１．０ｍＬ／分
・注入量：２０μＬ
・波長：２２０ｎｍ
・カラムの温度：室温、２０〜２５℃
・クロマトグラムの時間：３０分間
・保持時間（約）：
Ｌ−フェニルグリシン：２．７分
Ｄ−フェニルグリシン：８．７分
Ｌ−フェニルグリシンメチルエステル：９．３分
Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル：２１．０分

【0025】

Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルの水溶液の調製
（参照、ＷＯ２００８／１１０５２７。同じ生成物は、ＵＳ８５４１１９９の実施例８と同様の手順で異なる量を用いても得られ、実施例４で用いられた。）
Ｄ−フェニルグリシン（ＰＧ；１３５ｇ）をメタノール（２５２ｍＬ）に懸濁し、濃硫酸（９８％，１０７ｇ）を加えた。混合物を約７３℃で２時間、還流させ、真空ポンプを用いて減圧下で濃縮した。圧力を大気圧から２０ｍｂａｒに減圧し、同時に反応混合物の温度を４０℃から８０℃に上昇させた。メタノール（１２６ｍＬ，１００ｇ）を加え、混合物を約８１℃で１時間、還流させ、前記と同様に濃縮した。この操作（メタノールの添加、還流及び濃縮）をさらに４回繰り返した。最後に、メタノール（１２６ｍＬ）を加え、溶液をさらに１時間還流させ、室温に冷却した。アンモニア（１５ｍＬ）を３５分間でｐＨ２．３〜２．４までで一定速度で滴下した。水（７５ｍＬ）を加え、メタノールを５０℃以下の温度で減圧下、留去した。最終のＤ−フェニルグリシンメチルエステル（ＰＧＭ）溶液のｐＨは２．０であり、変換率は９９．０％であった。

【実施例】

【0026】

実施例１
（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の種の調製
一般セクションの記載のようにして得られたＤ−フェニルグリシンメチルエステルの水溶液（１８００ｇ）を、８Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを９．２に維持しながら、５〜１０℃でメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（９００ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）の混合物に加えた。層を分離した。水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６００ｍＬ）で抽出した。両方の有機層を合わせ、４８％（ｗ／ｗ）のＨ_２ＳＯ_４の添加によってｐＨを４．２に維持しながら、水（５ｍＬ）に添加した。層を分離した。粘稠で油状の水層（混濁）を得た。混合物の一部を、真空（２ｍｂａｒ）下、２０℃で、重量がもはや減少しなくなるまで蒸発させた。粘稠な油状物が得られた。２０℃で数日間、貯蔵している間に、結晶が油中に生成した。これらの結晶の一部は、残りの水層に播種（その間、３℃で保存）するために用いた。３℃で非常に遅い結晶化が観察された。結晶の懸濁液を濾過した。結晶をＨＰＬＣで分析した。その結果、結晶がＤ−フェニルグリシンで汚染されていることが判明した。濾液中で、室温で一晩放置すると再び結晶が生成した。これらの結晶を単離し、その後の実験で種として用いた。

【0027】

実施例２
（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の調製
一般セクションの記載のようにして得られたＤ−フェニルグリシンメチルエステルの水溶液（１８００ｇ）を、８Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを９．２に維持しながら、５〜１０℃でメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（９００ｍＬ）及び水（２５ｍＬ）の混合物に加えた。層を分離した。水層をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６００ｍＬ）で抽出した。両方の有機層を合わせた。有機層がＤ−フェニルグリシンメチルエステル３５０．４ｇを含有することをＨＰＬＣで測定した。４８％（ｗ／ｗ）のＨ_２ＳＯ_４の添加によってｐＨを４．２に維持しながら、水（５ｍＬ）に添加した。４８％（ｗ／ｗ）のＨ_２ＳＯ_４の消費量は２０１．７ｇであった。Ｄ−フェニルグリシンメチルエステル（３５０．４ｇ，２．１モル）と、添加したＨ_２ＳＯ_４（２０１．７×０．４８＝９６．８ｇ，１．０モル）のモル比は２：１であった。層を分離した。粘稠で油状の水層（混濁）を得た。実施例１の記載のようにして得られた種を水層に添加した。大規模な結晶化が開始し、１分未満で混合物は白色結晶の固体ケーキとなった。結晶のウェットケーキを真空中、２０℃で乾燥させた。結晶中のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのアッセイ（assay）は７３％（ｗ／ｗ）であり、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩中のＤ−フェニルグリシンメチルエステルの理論的アッセイ（assay）は、１００×２×１６５．２／(２×１６５．２＋９８）＝７７％である。

【0028】

実施例３
温度の関数としての水中の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の溶解度
実施例２に記載の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の調製において、（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４が過飽和である間に、ｐＨ＝４．２で有機層が分離される。有機層を水層から分離する前にある時点で、結晶化が始まることがある。有機溶媒の存在下での（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の結晶化を回避するプロセス、及び有機層の分離後の制御された結晶化を設計するために、温度の関数としての（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の溶解度を調べた。実施例２の記載のようにして得られたＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩（１ｇ）を水（２ｇ）と２０℃で混合し、固体物質を溶解させた。追加のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩（１ｇ）を加え、混合物を２０℃で２５分間撹拌した。全ての固体は溶解しなかった。約０．５ｍＬの一定分量の上清を濾過し、濾液中のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の濃度をＨＰＬＣで測定した。残りの混合物を３℃で撹拌した。水（２ｍＬ）を加えて混合した。追加のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩（０．５ｇ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。全ての固体は溶解しなかった。約０．５ｍＬの一定分量の上清を濾過し、濾液中のＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩の濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析の結果を表１に示す。

【0029】

【表2】

【0030】

２０℃の溶解度は、Ｄ−フェニルグリシンメチルエステルを有機溶媒及びＨ_２ＳＯ_４水溶液の中に２０℃でｐＨ４．２で混合した後の層分離を可能にしなければならない。続く水層を３℃に冷却することで、混合物１ｋｇあたり４７８−２６８＝約２１０ｇのＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩が結晶化する。結晶の懸濁液からＤ−フェニルグリシンメチルエステルのヘミ硫酸塩を３℃で単離した後、水／Ｈ_２ＳＯ_４／母液を用いてＤ−フェニルグリシンメチルエステルを有機溶媒中に抽出するために母液を再利用することができる。

【0031】

実施例４
（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４とＰＧＭ溶液を用いたセファレキシンの調製
７−アミノデアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ，５５．４ｇ）を水（２３７ｍＬ）に懸濁し、温度を２０℃に制御した。混合物をアンモニア水溶液（２５％）の添加によってｐＨを７．０に維持しながら、５分間撹拌した。固定化酵素（ＵＳ８５４１１９９に記載の変異体１を１８．７ｇ含む）を水（２５ｍＬ）と共に加えた。次に、固体の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４（６１．５ｇ）を２００分間、一定速度で添加し、全ての（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４を添加した時、アンモニア水溶液（２５％）又は硫酸水溶液（３０％）を添加してｐＨを７．０に維持した。２３０分の後、硫酸水溶液（３０％）の添加によってｐＨを５．８に調整した。反応の過程で、試料を採取し、ＨＰＬＣで分析した。その結果を表２に示す。

【0032】

【表3】

【0033】

比較のために、固体の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４に代えてＰＧＭ溶液（ＵＳ８５４１１９９の実施例８で得られたもの；１００．７ｇ；アッセイＰＧＭ：４４％）を用いて上記のセファレキシンの調製方法を繰り返した。さらに、７−ＡＤＣＡの最初の懸濁液中の水量は、２３７ｍＬではなく１８７ｍＬであった。反応の過程で、試料を採取し、ＨＰＬＣで分析した。その結果を表３に示す。

【0034】

【表4】

【0035】

表２及び表３を検証することで、最大のセファレキシンの生成、最大の変換率及び全体のＳ／Ｈの比の観点で、固体の（ＰＧＭＨ）_２ＳＯ_４の使用は、ＰＧＭ溶液の使用よりも有意により良好な結果を与えたことが明らかになった。

【図1】

【国際調査報告】