特表 2017-532060 フィコビリタンパク質の合成を誘導する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-532060(P2017-532060A)

(43)【公表日】2017年11月2日

(54)【発明の名称】フィコビリタンパク質の合成を誘導する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/00 20060101AFI20171006BHJP

   C07K 14/405 20060101ALI20171006BHJP

   A23L 33/17 20160101ALI20171006BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20171006BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20171006BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20171006BHJP

   A61K 8/9717 20170101ALI20171006BHJP

   A61K 8/9706 20170101ALI20171006BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20171006BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20171006BHJP

   A61K 35/748 20150101ALN20171006BHJP

   A61K 36/02 20060101ALN20171006BHJP

   A61K 36/04 20060101ALN20171006BHJP

   A61K 31/015 20060101ALN20171006BHJP

【ＦＩ】

   C12P21/00 B

   C07K14/405

   A23L33/17

   A61K38/02

   A61P17/00

   A61K8/64

   A61Q19/00

   A61K8/9717

   A61K8/9706

   A61Q19/08

   A61Q19/02

   A61K35/748

   A61K36/02

   A61K36/04

   A61K31/015

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2017-530439(P2017-530439)

(86)(22)【出願日】2015年8月28日

(85)【翻訳文提出日】2017年4月25日

(86)【国際出願番号】FR2015052294

(87)【国際公開番号】WO2016030644

(87)【国際公開日】20160303

(31)【優先権主張番号】14/01919

(32)【優先日】2014年8月28日

(33)【優先権主張国】FR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517067682

【氏名又は名称】アルゴビオテク

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ベン ウアダ， ハテム

(72)【発明者】

【氏名】アマル， ジヘン

【テーマコード（参考）】

4B018

4B064

4C083

4C084

4C087

4C088

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B018MD20

4B018MD89

4B018ME02

4B018MF01

4B064AG01

4B064BJ12

4B064CA08

4B064CC09

4B064CD12

4B064CE08

4B064DA10

4B064DA20

4C083AA082

4C083AA111

4C083AA112

4C083AA122

4C083AC122

4C083AC482

4C083AD352

4C083AD411

4C083AD412

4C083AD622

4C083CC01

4C083CC05

4C083DD31

4C083EE12

4C083EE16

4C083FF01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA06

4C084BA38

4C084BA44

4C084CA07

4C084DC50

4C084MA63

4C084NA14

4C084NA20

4C084ZA891

4C084ZC521

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC80

4C087CA10

4C087CA16

4C087CA47

4C087MA63

4C087NA14

4C087NA20

4C087ZA89

4C088AA12

4C088AA14

4C088BA06

4C088BA16

4C088BA37

4C088CA25

4C088MA63

4C088NA14

4C088ZA89

4C206AA10

4C206BA04

4C206NA05

4C206ZA89

4H045AA10

4H045AA20

4H045CA30

4H045EA01

4H045FA72

4H045GA01

(57)【要約】

【課題】フィコビリタンパク質の合成を誘導する方法の提供。
【解決手段】本発明は、光合成微細藻類のバイオマスを調製する方法に関し、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。また、本発明は、フィコビリタンパク質が豊富なバイオマス、並びに、サプリメントとして又は機能性食品製剤及び化粧用製剤の成分としてのその使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）のバイオマスを製造する方法であって、
上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有し、
上記方法は、増殖が阻害されたバイオマスにおいてフィコビリタンパク質の合成を誘導する工程を含む方法。

【請求項2】

上記微細藻類のバイオマスの増殖は、上記バイオマスを誘導槽で濃縮することによって阻害され、
上記槽内の上記バイオマスの濃度は、培養液中での微細藻類の最適増殖を許す密度である０．４ｇ／Ｌよりも３〜１３倍高いことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

上記バイオマスの濃度は１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

上記フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程は、
上記光合成微細藻類のバイオマスを光束に暴露する工程であって、上記光束は、実質的に１０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１以上であって実質的に１３μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１以下である光強度を有する、工程と、
上記バイオマス中のＮａＮＯ_３濃度が２．５ｇ／Ｌを超えるように窒素源を添加する工程
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項5】

上記誘導工程を３時間、４時間又は５時間行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ａ）上記バイオマスの増殖を阻害する工程と、
ｂ）フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程と
を含む請求項１に記載の方法。

【請求項7】

微細藻類のバイオマスを回収する事前工程を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。

【請求項8】

フィコビリタンパク質が豊富なバイオマスを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

ａ）微細藻類のバイオマスを回収する工程と、
ｂ）上記バイオマスの増殖を阻害する工程と、
ｃ）フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程と、
ｄ）上記フィコビリタンパク質が豊富なバイオマスを回収する工程と
を含む請求項１に記載の方法。

【請求項10】

上記光合成微細藻類は、シアノバクテリア、紅色植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅｓ）又はクリプト植物（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔｅｓ）から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

上記光合成微細藻類は、紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）及びアファニゾメノン・フロスアクア（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、特にクラマス藻類（Ｋｌａｍａｔｈ ａｌｇａ）から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

上記フィコビリタンパク質は、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン又はフィコエリスロシアニン又はこれらのフィコビリタンパク質の少なくとも２種からなる混合物から選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

上記窒素は、最終濃度が２．５ｇ／Ｌ超、５ｇ／Ｌ未満のＮａＮＯ_３を含有する培地、特にＺａｒｒｏｕｋ培地によって供給される、請求項４に記載の方法。

【請求項14】

請求項１〜１３に記載の方法によって得られる光合成微細藻類のバイオマスであって、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有するバイオマス。

【請求項15】

アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）である藻類から抽出される請求項１４に記載のバイオマス。

【請求項16】

請求項１〜１３に記載の方法によって得られる光合成微細藻類のバイオマスのサプリメントとして又は化粧用、皮膚科学的若しくは機能性食品製剤の成分としての使用であって、
上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する、使用。

【請求項17】

光合成微細藻類のバイオマスから製造された化粧用、皮膚科学的若しくは機能性食品組成物又はサプリメントとしての組成物であって、
上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する、組成物。

【請求項18】

アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）である藻類のバイオマスから製造された請求項１７に記載の化粧用、皮膚科学的若しくは機能性食品組成物又はサプリメントとしての組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、藻類バイオマスからフィコビリタンパク質の合成を誘導する方法に関する。

【0002】

より詳細には、本発明は、光合成微細藻類のバイオマスを製造する方法であって、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有し、上記方法は、上記バイオマスの増殖を阻害する工程と、フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程とを含む方法に関する。

【背景技術】

【0003】

フィコビリタンパク質は、紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）及びシアノバクテリア（藍藻類）の群の微細藻類に存在する光合成色素タンパク質である。これらは、赤色から青色の範囲の発色能を有するタンパク質色素である。

【0004】

フィコビリタンパク質は、フィコシアニン、フィコエリスリン、アロフィコシアニン及びフィコエリスロシアニンに分けられる。

【0005】

フィコシアニンは、藍藻類（シアノバクテリア）のみに見られる天然の青色タンパク質色素である。フィコシアニンは、フィコビリソームに位置する電子伝達系の成分であり、その役割は、可視スペクトルの赤い部分の光エネルギーを集めて光合成複合体の光化学系ＩＩの反応中心に伝達することである。光合成活動を阻害する特定のストレス条件下では、フィコシアニンは、蛍光によって過剰なエネルギーを散逸させる防御機構に関与する。このような条件では、該色素の合成が増加し、細胞の窒素貯蔵物質として蓄積される。

【0006】

シアノバクテリアのいくつかの種でのフィコシアニン合成を支配する必須要因は、窒素及び鉄の含量、光並びに温度である。シアノバクテリアは、それぞれの種に固有の変動範囲内で上記パラメータに応じてフィコシアニン含量を調節できることが明らかになっている（非特許文献１）。

【0007】

フィコシアニンは抗酸化特性及び蛍光特性を有するため、様々な医薬品及び医療用途で使用できる（非特許文献２及び３）。その治療特性及び独特な青色に加え、天然性であること、有機溶媒の非存在下、水溶液で抽出できることは全て利点であるため、食品及び治療市場に関する欧州及び米国規格の要求に対して容易に適合できる。

【0008】

また、フィコシアニンの水溶液中の安定性、高い光感受性及び保存の困難性に関する問題の解決によって、ここ数年にわたってフィコシアニン市場は世界的に好況を呈した。

【0009】

世界市場で販売されているフィコシアニンは、シアノバクテリアであるアルスロスピラ・プラテンシス（スピルリナ）のみから抽出される。スピルリナは、大規模に生産されるシアノバクテリアであり、文献によれば、特定の条件下ではその乾燥重量の最大２５％に及ぶフィコシアニンを合成できるという利点を有する。

【0010】

フィコシアニン生産は、一般的に様々な環境要因の影響を受ける（非特許文献４、５）。特に窒素と光が最も重要な要因である。前者は、タンパク質及びフィコシアニンを含む他の細胞性化合物を構成するアミノ酸の合成に必要であり（非特許文献５及び６）、光はあらゆる光合成活動のエネルギー源である。

【0011】

最適値を通る放物線の関係によってバイオマス生産性が培養液の密度に関連していることが当業者に知られている。最適密度では一次代謝が促進されるため、エネルギーが光合成から増殖及び生殖に向けられる。密度が高くなって一定の閾値を超えると、増殖が停止し、光合成によって集められたエネルギーが二次代謝、結果として防御（又はストレス）代謝産物の合成に向けられる。特定のストレス条件下（過剰窒素、低輝度）では、フィコシアニンが最も合成される防御代謝産物となる（非特許文献７、８）。

【0012】

また、従来技術において、フィコシアニン合成を最適化できる培養条件と、バイオマスの増殖を最適化できる培養条件とは極めて相反する。これは、最適な微細藻類の増殖条件が、通常は１００〜２００μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１（３３００〜６６００ルクス）の範囲であるからである。最適な光強度で得られた微細藻類培養液はバイオマスの急速な増殖が可能だが、フィコシアニンの合成量はかなり低い。逆に、より低い光強度（１０〜４０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）で得られた微細藻類培養液は増殖が遅いため、バイオマス生産性は低くなる。しかしながら、同様に光強度が低い条件下では、フィコシアニンの含量は２倍又は３倍の値になり得る。

【0013】

また、窒素が過剰な状態、つまり、窒素含量が工業用培養液に投与される量を超える場合にフィコシアニン合成量が最大となる。

【0014】

ラグーンや湖でのいわゆる自然開放系や、フォトバイオリアクターからなるいわゆる閉鎖系といった微細藻類を生産するための様々なシステムが存在する。

【0015】

開放系は一般的には浅い湖（最大３０ｃｍ）であり、使いやすくコストもあまり高くないため最も頻繁に利用される。しかしながら、気候条件の変化及び水分蒸発を受けるという欠点があり、培養液をかき混ぜても良好な光照射を行うには不充分であることが多い。したがって、開放系には、培養液の制御が欠如し、生産性が低いという２つの主な欠点がある。

【0016】

フォトバイオリアクターでの閉鎖系は、水や栄養素の面で制御された系である。しかしながら、非常にコストのかかる系であり、特に光へのアクセスに関して使いやすくない。

【0017】

異なる増殖培養液で得られた由来の異なるスピルリナ粉末又は新鮮なバイオマスについて本発明者らが行った分析によれば、湖又はフォトバイオリアクターのいずれであっても、得られたフィコシアニン最大含量はバイオマスの乾燥重量の１２％である。含量は試料によって異なるが、バイオマスの乾燥重量の３％〜１２％である。結果として、得られたフィコビリタンパク質含量はいずれも、バイオマスに元々存在するフィコビリタンパク質の最大値（乾燥重量の２０〜２５％）未満である。これらの最大値は長期増殖期間によってのみ達成可能である。

【0018】

フィコシアニン合成の増加を目的とした従来の研究は全て増殖期に行われてきた。また、フィコシアニン合成に関する科学文献全てにおいて、この合成を促進する様々なストレス要因がそれぞれ独立して研究されている。

【0019】

生産過程では、各要因はそれぞれの強さに応じてフィコシアニン合成に関して相乗的又は拮抗的に交互作用する。この代謝産物の合成を最大にするには、複数要因のプロセスにおいてストレス要因の重要なポイントを見つけることが必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Ｈｅｍｌａｔａ，２００９

【非特許文献2】Ｅｒｉｋｓｏｎ，２００８

【非特許文献3】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０００

【非特許文献4】Ｎｉｅｌｓ Ｔ． Ｅｒｉｋｓｅｎ， ２００８

【非特許文献5】Ｒｅｍｚｉｙｅ Ａｙｓｕｎ Ｋｅｐｅｋｃｉ＆Ｓａａｄｅｔ Ｄｅｍｉｒｏｒｓ Ｓａｙｇｉｄｅｇｅｒ，２０１２

【非特許文献6】Ｓａｍｙ Ｂｏｕｓｓｉｂａ ａｎｄ Ａｍｏｓ Ｅ．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，１９８０

【非特許文献7】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６

【非特許文献8】Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0021】

したがって、本発明が解決しようとする技術的課題は、微細藻類の増殖及びフィコビリタンパク質の合成の最適条件を特定することによって、バイオマスの増殖に悪影響を及ぼすことなく、光合成微細藻類バイオマスからのフィコビリタンパク質の合成を最適化することである。

【課題を解決するための手段】

【0022】

上記技術的課題は、バイオマスの増殖を阻害する工程と、フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程とを含む本発明に係る方法によって解決される。微細藻類培養液の一部を取り除いた後に行うならば、該方法は、微細藻類を培養するための任意の従来の系に適用可能である。

【0023】

したがって、本発明の主要な主題は、光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）のバイオマスを製造する方法であって、増殖が阻害されたバイオマスにおいてフィコビリタンパク質の合成を誘導する工程を含む方法である。本発明の方法で得られるバイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0024】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）及びアファニゾメノン・フロスアクア（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、特にクラマス藻類（Ｋｌａｍａｔｈ ａｌｇａ）から選択される。

【0025】

誘導の際、上記増殖が阻害されたバイオマスは誘導培地、特に誘導溶液と接触している。

【0026】

本発明の方法で得られるバイオマスは、特に、その乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0027】

本発明の方法で得られるバイオマスは、特に、その乾燥重量の２０％〜２５％のフィコビリタンパク質含量を有する。

【0028】

本発明の方法は培養槽の外で行われるため、バイオマスの生産性に悪影響を及ぼさない。

【0029】

「バイオマス」とは、特定の時点での培養液中の生きた微細藻類の全質量を意味するものであり、ｇ／Ｌで表される。

【0030】

「フィコビリタンパク質」とは、特定の微細藻類又はシアノバクテリアから単離された水溶性光合成色素タンパク質、例えばアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコシアニン類（Ｃ−ＰＣ及びＲ−ＰＣ）、フィコエリスリン類（Ｒ−ＰＥ及びＣ−ＰＥ）及びフィコエリスロシアニン（ＰＥＣ）等を意味するものである。

【0031】

「合成を誘導する」とは、微細藻類バイオマスによるフィコビリタンパク質の産生を任意の手段で促すことを意味するものである。

【0032】

「誘導培地」とは、最適増殖に必要な塩の濃度と比較して１種以上の塩を過剰に含有する又は欠乏する任意の微細藻類培養培地を意味するものである。本発明において、この培地は窒素を過剰に含有するものであり、Ｚａｒｒｏｕｋ培地にＮａＮＯ_３を２．５ｇ／Ｌを超える濃度、好ましくは３〜４ｇ／Ｌの濃度で添加することで得られる。

【0033】

「増殖を阻害する」とは、微細藻類の増殖を停止することを意味するものである。増殖の阻害は可逆的である。増殖を阻害した後、バイオマスの一部を回収して濃度を低下させると、バイオマスは再び増殖できるからである。したがって、バイオマスに悪影響を及ぼすことはない。

【0034】

増殖の阻害（微細藻類の増殖の阻害）は、例えば、培養密度の関数として示した微細藻類の増殖速度の曲線によって判断される。微細藻類の増殖速度がゼロである場合、阻害が観察される。

【0035】

本発明の一実施形態において、本方法は、上記微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスの増殖の阻害を誘導槽で行い、上記槽内の上記バイオマスの濃度は、培養液中での微細藻類の最適増殖を許す濃度よりも３〜１３倍高いことを特徴とする。

【0036】

本発明の一実施形態において、本方法は、上記微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスの増殖の阻害を誘導槽で行い、上記槽内の上記バイオマスの濃度は、培養液中での微細藻類の最適増殖を許す濃度よりも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３倍高いことを特徴とする。

【0037】

「濃度」は「密度」と置き換えることができる。「バイオマス密度」、「バイオマス濃度」は区別せずに使用する。密度及び濃度はいずれもｇ／Ｌで表す。

【0038】

培養液中での微細藻類の最適増殖を許す密度／濃度は約０．４ｇ／Ｌであると認められる。

【0039】

本発明において阻害は、濃度が１〜５ｇ／Ｌの範囲のバイオマスを誘導槽に導入して行われるが、本発明においてこの手段に限定されず、バイオマスの増殖を阻害できる任意の手段を用いることができる。阻害時の上記バイオマス濃度は、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ又は５ｇ／Ｌに等しくてもよい。

【0040】

バイオマスの密度／濃度は様々な方法によって測定できる。

【0041】

・セッキ板：水培地で培養した細胞の密度を迅速に推定できる簡単な装置である。長さ３０ｃｍの目盛り付き定規からなり、ゼロの目盛りの付いた下端に直径５ｃｍの白い円盤を備える。円盤を培地に浸してから該円盤を識別できなくなった深さ（センチメートル）を記録する。

【0042】

・顕微鏡でのカウント：この方法は時間がかかるが、フィラメント数とフィラメント当たりの巻数を推定できる。目盛り付きピペットを用いて一滴の試料をくぼみスライドに滴下して顕微鏡で観察し、一滴中のフィラメント数を評価する。我々のピペットで滴下した１７滴の体積は１ｍＬとなることが分かっている。培養液の濃度が非常に高い場合は試料を希釈する。ランダムに採取した３０本のフィラメントから平均巻数を計算する。

【0043】

・６６５ｎｍでの光学密度：この方法では、クロロフィルの吸収波長の一つである６６５ｎｍの吸光度を用いてバイオマスを迅速に推定できる。一般的に、このインビボ吸収はクロロフィル濃度との相関性が高い。平行面を有する２５ｃＬ容キュベットを備えた分光光度計を使用する。未接種の培地でゼロ調整を行う。

【0044】

誘導槽は、中間培養槽、回収槽等、生きた微細藻類を保管するための任意の閉鎖系であってもよい。本発明の好ましい一実施形態において、誘導槽内の上記バイオマス濃度は、実質的に１ｇ／Ｌ以上であって実質的に５ｇ／Ｌ以下である。この濃度は、誘導媒体を誘導槽に添加することで得られる。

【0045】

１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの濃度は、回収時（すなわち、濃度が約０．４ｇ／Ｌとなる最適増殖時）に増殖中のバイオマスの密度よりも３〜１３倍高い密度に相当する。この濃度では、増殖が阻害されて微細藻類の防御代謝が促進される。

【0046】

バイオマスの増殖、例えば最適増殖、特に約０．４ｇ／Ｌの濃度での増殖を阻害するには、上記バイオマスを濾過、デカンテーション又は遠心分離などによって１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの濃度にすればよい。

【0047】

また、誘導槽に入れる前にバイオマスを洗浄してもよい。洗浄によって、培地に由来する過剰の塩を除去できる。これにより、誘導培地、特に誘導溶液の窒素濃度をより良好に制御できる。

【0048】

この場合、バイオマスは、生理食塩水又は新たに調製した誘導培地溶液を用いて３回洗浄する。

【0049】

これらの条件下では、元のバイオマスは上記方法の影響を受けず、フィコシアニン合成の誘導はバイオマスの培養条件に依存しない。

【0050】

上記手順は、従来のスピルリナ培養農場の生産ラインに容易に組み込むことができる点で有利である。中間培養槽又は回収槽で３時間、４時間又は最大５時間行うことができる。

【0051】

本発明の特定の一実施形態において、フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程は、
１）上記光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスを光束に暴露する工程であって、上記光束は、実質的に１０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１以上であって実質的に１３μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１以下である光強度を有する、工程と、
２）上記誘導培地中のＮａＮＯ_３濃度が２．５ｇ／Ｌを超えるように窒素源を添加する工程
を含む。

【0052】

１平方メートル当たり１秒当たりの光子数（μｍｏｌ）で表される光強度は、例えば、光合成に有効な放射量を測定する光度計を用いて求められる。

【0053】

なお、特に照明が蛍光灯、例えば「植物育成蛍光灯」タイプである場合、１０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１は３３０ルクスに相当し、１３μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１は４２９ルクスに相当する。この場合、１平方メートル当たり１秒当たりの光子数１μｍｏｌは３３ルクスに等しい。

【0054】

誘導培地中のＮａＮＯ_３濃度は、特に３〜４ｇ／Ｌ又は３〜５ｇ／Ｌである。

【0055】

１０〜１３μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１の範囲の光強度と、ＮａＮＯ_３（窒素源）を３〜５ｇ／Ｌ含有する培養溶液とを併用することによって、フィコシアニンを２０％〜２５％含有するバイオマスが得られる。この含量は、本発明の方法を適用せずに行う実験で得られる３％〜１２％の範囲の含量と比較すると非常に高い。

【0056】

上記光は、単純な４０Ｗ出力の白熱灯又は蛍光灯によって供給できる。

【0057】

誘導培地は、Ｚａｒｒｏｕｋ培地で作製するのが好ましいが、スピルリナに適した他の任意の培地を使用できる。いずれにせよ、誘導培地、特に誘導溶液の窒素濃度は、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ_３）を過剰に添加することで変更できる。最終濃度は、ＮａＮＯ_３が３〜５ｇ／Ｌの範囲でなければならない。これは、元のＺａｒｒｏｕｋ培地中の濃度（２．５ｇ／ＬのＮａＮＯ_３）よりも１．２〜２倍高い濃度である。

【0058】

上記培養条件下、誘導工程は３時間、４時間又は最大５時間行われるが、これにより、乾燥バイオマスの２０％〜２５％の含量を安定して得られるフィコビリタンパク質合成を充分に誘導できる。

【0059】

本発明の方法は、光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスを製造する方法であって、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する、方法であるが、上記バイオマスの増殖を阻害する工程と、フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程とを含む。

【0060】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しい。

【0061】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の２０％〜２５％である。

【0062】

特定の一実施形態において、本発明の方法は、微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスを回収する事前工程を含んでもよい。培養液が指数増殖期にあるとき、すなわちバイオマス生産性が最大であるとき、バイオマスを通常の培養槽に回収する。回収分をガーゼで濾過（又はデカンテーション又は遠心分離）して新鮮なバイオマスを得る。得られたバイオマスを誘導槽に移す。

【0063】

また、本発明の方法は、濃縮バイオマスを回収する最終工程を含んでもよい。

【0064】

したがって、本発明の方法は下記工程を含んでもよい。
・ａ）微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスを回収する工程
・ｂ）上記バイオマスの増殖を阻害する工程
・ｃ）フィコビリタンパク質の合成を誘導する工程
・ｄ）上記フィコビリタンパク質が豊富なバイオマスを回収する工程

【0065】

本発明の方法は、シアノバクテリア、紅色植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔｅｓ）又はクリプト植物（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔｅｓ）から選択される光合成微細藻類を用いる。

【0066】

本発明の方法を実施するために使用する光合成微細藻類は、アルスロスピラ・プラテンシス（スピルリナとも呼ばれる）であるのが好ましい。

【0067】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱、クリプト藻綱及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス及びアファニゾメノン・フロスアクア、特にクラマス藻類から選択される。

【0068】

本発明において合成されたフィコビリタンパク質は、フィコシアニン、アロフィコシアニン、フィコエリスリン又はフィコエリスロシアニン又はこれらのフィコビリタンパク質の少なくとも２種からなる混合物であってもよい。

【0069】

また、本発明は、上述の方法によって得られる光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスに関し、該バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0070】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しい。

【0071】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の２０％〜２５％である。

【0072】

とりわけ、本発明の光合成微細藻類のバイオマスは、アルスロスピラ・プラテンシスである藻類から抽出されるバイオマスである。

【0073】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱、クリプト藻綱及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス及びアファニゾメノン・フロスアクア、特にクラマス藻類から選択される。

【0074】

本発明の方法によって得られる光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマスは、機能性食品の製造においてサプリメントとして使用したり、化粧用製剤の成分として使用したりできる。

【0075】

機能性食品とは、食品物質を用いて製造された製品であるが、従来から食品に関連しない錠剤、散剤、飲料等の任意の医薬品形態で利用でき、病気に対する有益な生理学的効果又は保護効果を示すことが証明されている任意の製品を意味するものである。

【0076】

また、本発明は、光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマス又はこれらのバイオマスの混合物から製造された化粧用若しくは機能性食品組成物又はサプリメントとしての組成物に関し、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0077】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しい。

【0078】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の２０％〜２５％である。

【0079】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱、クリプト藻綱及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス及びアファニゾメノン・フロスアクア、特にクラマス藻類から選択される。

【0080】

上記化粧用若しくは機能性食品組成物又はサプリメントとしての組成物は、アルスロスピラ・プラテンシスである藻類のバイオマスから製造されることが好ましい。

【0081】

本発明の化粧用組成物は強力なシワ防止特性を有し、深いシワ、肌の弛み及び肌のくすみに対処することができる。

【0082】

本発明の化粧用組成物は、抗酸化化合物が豊富であり、フリーラジカルに対して作用し、細胞の酸素化を促す。継続的な使用により、顔の輪郭が変わり、深いシワが減り、肌の色がより均一になる。また、本発明の化粧用組成物は、目袋及び目のクマを軽減することができ、乾燥を防いでより快適にできる。

【0083】

また、本発明の化粧用組成物は、シミ消し効果を有し、細胞の解毒を促し、太陽及び汚染の影響を防ぎ、過剰メラニンを特徴とするシミに対処する能力を高める。

【0084】

シミの濃さに応じて、１日当たり２〜４回投与する必要がある。薄く広がったシミは数週間で消えるが、輪郭がはっきりした濃いシミは完全に消えるまでに６〜１２ヶ月かかることもある。また、本発明の化粧用組成物は、重度のニキビの発症による痕跡に対しても推奨される。また、しなやかで柔らかい肌となるよう保湿効果を示す。

【0085】

本発明の方法によるバイオマス処理の終了時に、上記フィコビリタンパク質が豊富なバイオマスを濾過し、洗浄してもよい。生産ラインの脱水・乾燥回路に組み込んでもよい。例えば幼児の免疫系を強化するためのサプリメントや抗酸化力の高い化粧品等の準医薬製剤（ｐａｒａ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）として販売することもできる。

【0086】

また、上記バイオマスを利用して１種以上のフィコビリタンパク質の抽出及び清澄化を行うことができる。例えば、得られたフィコシアニンを濃縮及び安定化して、食品、化粧用又は医薬製剤に導入することもできる。

【0087】

また、本発明は、有効成分として上述の光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマス又はこれらのバイオマスの混合物と、薬学的に許容される担体とを含む皮膚科学的組成物に関し、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0088】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しい。

【0089】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の２０％〜２５％である。

【0090】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱、クリプト藻綱及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス及びアファニゾメノン・フロスアクア、特にクラマス藻類から選択される。

【0091】

また、本発明は、上述の光合成微細藻類、特にシアノバクテリア、より具体的にはアルスロスピラ・プラテンシスのバイオマス又はこれらのバイオマスの混合物の抗酸化剤としての使用に関し、上記バイオマスは、その乾燥重量の少なくとも２０％に等しいフィコビリタンパク質含量を有する。

【0092】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の少なくとも２１％、２２％、２３％、２４％又は２５％に等しい。

【0093】

有利な一実施形態において、バイオマスのフィコビリタンパク質含量は、該バイオマスの乾燥重量の２０％〜２５％である。

【0094】

上記光合成微細藻類は、特に、紅藻綱、クリプト藻綱及びシアノバクテリア、とりわけシアノバクテリア、更により具体的にはアルスロスピラ・プラテンシス及びアファニゾメノン・フロスアクア、特にクラマス藻類から選択される。

【図面の簡単な説明】

【0095】

【図1】誘導時間が３時間の場合の光強度（μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）及び窒素濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてフィコシアニン合成の等収率曲線を表す。

【図2】誘導時間が２４時間の場合の光強度（μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）及び窒素濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてフィコシアニン合成の等収率曲線を表す。

【図3】誘導時間が３日間の場合の光強度（μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）及び窒素濃度（ｇ／Ｌ）の関数としてフィコシアニン合成の等収率曲線を表す。

【図4】表１は本発明において使用できる誘導溶液の組成を表す。該溶液は４ｇ／ＬのＮａＮＯ_３を含有する。

【図5】表２は実験マトリックスを表す。すなわち、２要因（輝度及び窒素濃度）に対応する３水準の組み合わせと、得られたフィコビリタンパク質収率（乾燥重量に対する％で表す）を示す。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0096】

実施例１：フィコシアニン合成
様々な窒素濃度及び光強度でフィコシアニン合成収率の変化を調べる。

【0097】

この試験は、交互作用のある３水準の要因計画（Ｇｏｕｐｙ，２００１）を用いて実験計画法に従って行う。

【0098】

光合成シアノバクテリアであるアルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）の指数増殖期の培養液から新鮮なバイオマスを得て、５倍に濃縮する。使用した誘導溶液はＺａｒｒｏｕｋ培地を改変したものであり、窒素源としてのＮａＮＯ_３濃度は１〜４ｇ／Ｌである。誘導培地で濃縮されたバイオマスを１０〜５０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１の範囲の様々な光強度に晒す。

【0099】

実験を１１回行う。そのうち９回は、両要因に対応する３水準（最小、最大、中央）の組み合わせである。残りの３回は中心点であり、実験誤差を評価できる。実験マトリックスを表２に示す。

【0100】

各条件下、異なる処理時間（３時間、１日、３日）で３つの試料を採取する。

【0101】

１１の実験条件のそれぞれの終了時にフィコシアニンを抽出する。全てのフィコシアニンが抽出されるように抽出を２回繰り返す。次に、フィコシアニン収率（乾燥物１グラム当たりのフィコシアニン％）を算出する。

【0102】

ＮａＮＯ_３窒素濃度（Ｎ）及び光強度（Ｌｕｍ）の関数としてフィコシアニン合成収率（ＲｅｎＰｈｙ）をモデル化する。

【0103】

様々な処理を行った結果、３時間の誘導によって最も高い収率が得られることが分かる。これらの条件で得られたモデルは下記式で表される。
ＲｅｎＰｈｙ％^（２）＝６５−４５^＊Ｌｕｍ＋４５８^＊Ｎ＋１．０２^＊Ｌｕｍ^２−５１^＊Ｎ^２−３．１４^＊Ｌｕｍ^＊Ｎ

【0104】

上記モデルの有効性は９５％、相関係数（Ｒ^２）は９５％、標準誤差は１５％である。

【0105】

本発明の方法に従って３時間処理した後に得られたフィコシアニン合成の等収率曲線（ｉｓｏ ｙｉｅｌｄ ｃｕｒｖｅｓ）を光強度（μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）及びＮａＮＯ_３濃度（ｇ／Ｌ）の関数として図１に示す。光強度が１０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１、ＮａＮＯ_３濃度が４ｇ／Ｌである場合、乾燥物１グラム当たり２２％〜２４％のフィコシアニン収率を得ることができる。

【0106】

合成の誘導を１日に延長すると、フィコシアニン収率は最大でも１８％以下となる（図２）。３日間の処理では、１２％未満の最大収率しか得られない（図３）。

【0107】

実施例２：シワ防止クリーム
下記組成を有するシワ防止クリームが得られる。
水：５９％
甘扁桃油：１８％
グリセリンに溶解したフィコビリタンパク質：７％
パーム油：５％
ヒマシ油：３％
藻類抽出物：３％（β−カロチン）
蜜蝋：２％
キサンタンガム：１．７％
香料：１％
エチルパラベン：０．１％
メチルパラベン：０．１％
ベンジルパラベン：０．１％

【0108】

実施例３：シミ消しクリーム
下記組成を有するシミ消しクリームが得られる。
シミ消しクリーム：
水：５９％
甘扁桃油：１９．５％
グリセリンに溶解したフィコビリタンパク質：７％
パーム油：５％
ヒマシ油：３％
藻類抽出物：１．５％（β−カロチン）
蜜蝋：２％
キサンタンガム：１．７％
香料：１％
エチルパラベン：０．１％
メチルパラベン：０．１％
ベンジルパラベン：０．１％

【0109】

引例
Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｎ．Ｔ，２００８，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ａ ｐｉｇｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，８０，１−１４．
Ｈｅｍｌａｔａ Ｔ．Ｆ，２００９，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｉｔｓ ｙｉｅｌｄ．Ｂｕｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｃｏｎｔａｍ Ｔｏｘｉｃｏｌ，８３，５０９−５１５．
Ｌｉｕ Ｙ，Ｘｕ Ｌ，Ｃｈｅｎｇ Ｎ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｚｈｅｎｇ Ｃｈ，２０００，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｋ５６２ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｐｐｌｉｅｄ ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ，１２，１２５−１３０．
Ｃｈｅｎ Ｆ，Ｚｈａｎｇ Ｙ ａｎｄ Ｇｕｏ Ｓ，１９９６．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１８，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐｐ６０３−６０８．
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】