特表 2017-532289 突然変異タンパク質アミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列に基づく免疫原性産物およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-532289(P2017-532289A)

(43)【公表日】2017年11月2日

(54)【発明の名称】突然変異タンパク質アミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列に基づく免疫原性産物およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20171006BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20171006BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20171006BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20171006BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20171006BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20171006BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20171006BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20171006BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/47ZNA

   A61K39/00 H

   A61K39/39

   A61P25/28

   A61P25/00

   G01N33/53 D

   G01N33/53 N

   C12P21/08

   C07K7/08

   C07K16/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

【全頁数】109

(21)【出願番号】特願2017-500952(P2017-500952)

(86)(22)【出願日】2015年7月6日

(85)【翻訳文提出日】2017年3月2日

(86)【国際出願番号】EP2015065362

(87)【国際公開番号】WO2016005328

(87)【国際公開日】20160114

(31)【優先権主張番号】62/021,308

(32)【優先日】2014年7月7日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】513144626

【氏名又は名称】アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】バルクホルン，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】ヒレン，ハインツ

(72)【発明者】

【氏名】シュトリービンガー・アンドレーアス

(72)【発明者】

【氏名】ギアイジ，ジモーネ

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CA20

4B064CC24

4B064DA01

4C085AA03

4C085AA38

4C085CC21

4C085EE01

4C085FF02

4C085FF20

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA17

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA10

4H045FA16

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、突然変異タンパク質アミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列に基づく免疫原性産物に関し、とりわけＡβ突然変異タンパク質のオリゴマーに関し、またアミロイド症のような状態の診断、治療および防止における、ならびに前記産物に結合することができる作用物を同定するための前記産物の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列
Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３（配列番号２）と６２．５％以上の同一性を有するアミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列を含む免疫原性産物であって、
ｉ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４０により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体７Ｃ６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７４０５により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体４Ｄ１０またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４１により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体５Ｆ７からなる群から選択されるモノクローナル抗体と反応性であり、
ｉｉ）血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる
免疫原性産物。

【請求項2】

Ａβアミノ酸配列が、異なるアミノ酸によって置換されている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸によりアミノ酸配列Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３（配列番号２）と異なっている、請求項１に記載の産物。

【請求項3】

ポリクローナル抗血清が、マウスまたはウサギに由来するポリクローナル抗血清である、請求項１または２に記載の産物。

【請求項4】

ポリクローナル抗血清が、産物に結合する抗体が富化された親和性精製抗血清である、請求項１から３のいずれか一項に記載の産物。

【請求項5】

ＰＦ−４に対するポリクローナル抗血清の交差反応性が、ＰＦ−４に対する参照抗ＰＦ−４抗体の交差反応性より少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍小さい、請求項１から４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項6】

血小板因子４が、カニクイザル血漿中のＰＦ−４またはヒト血漿中のＰＦ−４である、請求項１から５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項7】

交差反応性が、血漿ＰＦ−４に対する、固定化されているポリクローナル抗血清の結合である、請求項１から６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項8】

固定化ポリクローナル抗血清が、固定化抗ＩｇＧ抗体に結合したポリクローナル抗血清である、請求項７に記載の産物。

【請求項9】

結合ＰＦ−４が、ＰＦ−４に結合した抗ＰＦ−４抗体として検出される、請求項７または８に記載の産物。

【請求項10】

抗ＰＦ−４抗体が、標識抗体であり、検出が、標識によって発せられたシグナルを測定することである、請求項９に記載の産物。

【請求項11】

結合ＰＦ−４が、抗ＰＦ−４抗体に結合した標識抗ＩｇＧ抗体として検出され、検出が、標識によって発せられたシグナルを測定することである、請求項７または８に記載の産物。

【請求項12】

ＰＦ−４が、ヒトＰＦ−４である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項13】

抗ＰＦ−４抗体が、モノクローナル抗体である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項14】

抗ＰＦ−４抗体が、ポリクローナル抗血清である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項15】

抗ＰＦ−４抗体が、アミノ酸配列

【化1】

を有するＰＦ−４と反応性である、請求項９から１４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項16】

ポリクローナル抗血清が、モノマーＡβ（１−４２）、モノマーＡβ（１−４０）、フィブリロマーＡβ（１−４２）およびフィブリロマーＡβ（１−４０）からなる群から選択される少なくとも１つのＡβ形態に対する抗血清の親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいＡβグロブロマーに対する親和性を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項17】

Ａβグロブロマーが、Ａβ（１−４２）グロブロマーである、請求項１６に記載の産物。

【請求項18】

Ａβグロブロマーが、Ａβ（１２−４２）グロブロマーである、請求項１６に記載の産物。

【請求項19】

Ａβグロブロマーが、Ａβ（２０−４２）グロブロマーである、請求項１６に記載の産物。

【請求項20】

ポリクローナル抗血清が、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（１２−４２）グロブロマーからなる群から選択される少なくとも１つのＡβグロブロマーに対する抗血清の親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する親和性を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の産物。

【請求項21】

モノクローナル抗体７Ｃ６が、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄまたはより大きい親和性で産物に結合する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の産物。

【請求項22】

モノクローナル抗体４Ｄ１０が、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄまたはより大きい親和性で産物に結合する、請求項１から２１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項23】

モノクローナル抗体５Ｆ７が、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄまたはより大きい親和性で産物に結合する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項24】

Ａβアミノ酸配列が、アミノ酸配列
Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３（配列番号２）と６８．７５％以上、７５％以上、８１．２５％以上、８７．５％以上または９３．７５％以上の同一性を有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載の産物。

【請求項25】

アミノ酸配列の少なくとも一部がループ、好ましくは、βヘアピンループを形成する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項26】

Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１（配列番号８）およびＡ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２（配列番号９）に対応する産物のアミノ酸配列部分が、逆平行に配向している、請求項１から２５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項27】

ループが、Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７（配列番号１０）およびＤ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８（配列番号１１）から選択される配列を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項28】

可溶性である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項29】

前記Ａβアミノ酸配列を複数含むオリゴマーである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の産物。

【請求項30】

複数が、２から２８個のＡβアミノ酸配列である、請求項２９に記載の産物。

【請求項31】

オリゴマーが、切断型オリゴマーである、請求項２９または３０に記載の産物。

【請求項32】

（ａ）前記Ａβアミノ酸配列を含むＡβペプチドを溶媒に溶解するステップ、
（ｂ）両親媒性物質をＡβペプチドの溶液に加えるステップ、および
（ｃ）得られた混合物をインキュベートして、オリゴマーを形成するステップ
を含む方法により得られる、請求項１から３１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項33】

溶媒が、水素結合切断剤である、請求項３２に記載の産物。

【請求項34】

水素結合切断剤が、ＨＦＩＰである、請求項３３に記載の産物。

【請求項35】

水素結合切断剤に溶解させたＡβペプチドの濃度が、２ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌである、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項36】

Ａβペプチドを水素結合切断剤に溶解するステップが、２２から３７℃で１５分間から５時間振とうすることを含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項37】

両親媒性物質が、ＳＤＳ、ラウリン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ｔｅｒｔ−オクチルフェノールｘ９−１０ＥＯ、ノニルフェノールｘ２０ＥＯ、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート、ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネートまたはドデシルアミンである、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項38】

インキュベーションの時間が、５分間から４８時間である、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項39】

インキュベーションの温度が、１５から５０℃である、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の産物。

【請求項40】

方法が、
（ｄ）オリゴマーをタンパク質分解的に切断するステップ
をさらに含む、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の産物。

【請求項41】

オリゴマーが、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパインおよびエンドプロテイナーゼＧｌｕＣからなる群から選択される酵素により切断される、請求項４０に記載の産物。

【請求項42】

Ａβアミノ酸配列が、アミノ酸配列
Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９（配列番号３）と７２％以上の同一性を有する、請求項１から４１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項43】

Ａβアミノ酸配列が、アミノ酸配列
Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９（配列番号３）と７７％以上、８１％以上、８６％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する、請求項１から４２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項44】

第１のアミノ酸配列Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８（配列番号５）が、第２のアミノ酸配列Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８（配列番号５）と平行に配向している、請求項４２または４３に記載の産物。

【請求項45】

Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＮＨ）、Ｇ^Ａ_３７（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３８（ＮＨ）、Ｌ^Ａ_３４（ＮＨ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＣγＨ_３）からなる群から選択される少なくとも１つの原子対のプロトン間距離が、１．８から６．５オングストロームである、請求項４４に記載の産物。

【請求項46】

第１のアミノ酸配列Ｇ^Ａ_３３Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８Ｖ^Ａ_３９（配列番号６）が、第２のアミノ酸配列Ｇ^Ｂ_３３Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８Ｖ^Ｂ_３９（配列番号６）と平行に配向している、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項47】

Ｇ^Ａ_３３（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３４（ＮＨ）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＮＨ）、Ｇ^Ａ_３７（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３８（ＮＨ）、Ｌ^Ａ_３４（ＮＨ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＣγＨ_３）、Ｇ^Ａ_３８（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３９（ＣγＨ_３）およびＶ^Ａ_３９（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３９（ＣγＨ_３）からなる群から選択される少なくとも１つの原子対のプロトン間距離が、１．８から６．５オングストロームである、請求項４６に記載の産物。

【請求項48】

２つのＡβアミノ酸配列間の分子間平行βシートを含む、請求項４２から４７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項49】

分子間平行βシートが、第１のアミノ酸配列Ｇ^Ａ_３３Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８Ｖ^Ａ_３９（配列番号７）および第２のアミノ酸配列Ｇ^Ｂ_３３Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８Ｖ^Ｂ_３９（配列番号７）を含む、請求項４２から４８のいずれか一項に記載の産物。

【請求項50】

原子対Ｇ^Ａ_３３（ＣＯ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｎ）、Ｌ^Ｂ_３４（ＣＯ）−Ｍ^Ａ_３５（Ｎ）、Ｍ^Ａ_３５（ＣＯ）−Ｖ^Ｂ_３６（Ｎ）、Ｖ^Ｂ_３６（ＣＯ）−Ｇ^Ａ_３７（Ｎ）およびＧ^Ｂ_３７（ＣＯ）−Ｇ^Ａ_３８（Ｎ）が３．３±０．５Åの距離にあり、ＣＯが主鎖酸素原子を示し、残基のファイ（φ）角度が−１８０から−３０の範囲にあり、残基のプサイ（ψ）角度が約６０から１８０までまたは約−１８０から−１５０までの範囲にある、請求項４９に記載の産物。

【請求項51】

Ａβアミノ酸配列が、アミノ酸配列
Ｖ_１２Ｈ_１３Ｈ_１４Ｑ_１５Ｋ_１６Ｌ_１７Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９（配列番号４）の一部（Ｘ−Ｙ）と６２．５％以上、６４％以上、６７％以上、７１％以上、７５％以上、７８％以上、８２％以上、８５％以上、８９％以上、９２％以上または９６％以上の同一性を有し、Ｘが数１２．．１８からなる群から選択され、Ｙが数３３．．３９からなる群から選択される、請求項１から５０のいずれか一項に記載の産物。

【請求項52】

アミノ酸配列の少なくとも２つの非隣接残基が互いに共有結合している、請求項５１に記載の産物。

【請求項53】

Ｖ_１２、Ｈ_１３、Ｈ_１４、Ｑ_１５、Ｋ_１６、Ｌ_１７、Ｖ_１８、Ｆ_１９、Ｆ_２０、Ａ_２１、Ｅ_２２またはＤ_２３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つおよびＫ_２８、Ｇ_２９、Ａ_３０、Ｉ_３１、Ｉ_３２、Ｇ_３３、Ｌ_３４、Ｍ_３５、Ｖ_３６、Ｇ_３７、Ｇ_３８、Ｖ_３９に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つが、互いに共有結合している、請求項５１または５２に記載の産物。

【請求項54】

アミノ酸残基が、直接共有結合によりまたはリンカーを介して共有結合している、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の産物。

【請求項55】

Ｖ_１８に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から５４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項56】

Ｆ_１９に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１から５５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項57】

Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１から５６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項58】

Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から５７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項59】

Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択される、請求項１から５８のいずれか一項に記載の産物。

【請求項60】

Ｄ_２３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択される、請求項１から５９のいずれか一項に記載の産物。

【請求項61】

Ｖ_２４に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から６０のいずれか一項に記載の産物。

【請求項62】

Ｇ_２５に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１から６１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項63】

Ｓ_２６に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンからなる群から選択される、請求項１から６２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項64】

Ｎ_２７に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１から６３のいずれか一項に記載の産物。

【請求項65】

Ｋ_２８に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択される、請求項１から６４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項66】

Ｇ_２９に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項１から６５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項67】

Ａ_３０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項１から６６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項68】

Ｉ_３１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から６７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項69】

Ｉ_３２に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から６８のいずれか一項に記載の産物。

【請求項70】

Ｇ_３３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択される、請求項１から６９のいずれか一項に記載の産物。

【請求項71】

Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシンおよびロイシンからなる群から選択される、請求項１から７０のいずれか一項に記載の産物。

【請求項72】

Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、グリシンであり、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニンである、請求項１から７１のいずれか一項に記載の産物。

【請求項73】

Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｉ_３１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１から７２のいずれか一項に記載の産物。

【請求項74】

Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシンおよびロイシンからなる群から選択される、請求項１から７３のいずれか一項に記載の産物。

【請求項75】

Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、Ｄ_２３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択される、請求項１から７４のいずれか一項に記載の産物。

【請求項76】

Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｇ_２５に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択される、請求項１から７５のいずれか一項に記載の産物。

【請求項77】

Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｓ_２６に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンからなる群から選択される、請求項１から７６のいずれか一項に記載の産物。

【請求項78】

請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物を含む組成物。

【請求項79】

ワクチンである、請求項７８に記載の組成物。

【請求項80】

医薬として許容される賦形剤をさらに含む、請求項７８または７９に記載の組成物。

【請求項81】

医薬として許容される賦形剤が、アジュバントである、請求項８０に記載の組成物。

【請求項82】

アジュバントが、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）である、またはアルミニウム塩を含むアジュバントである、請求項８１に記載の組成物。

【請求項83】

アミロイド症の治療または防止に使用する、請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項84】

能動免疫用である、請求項８３に記載の使用のための組成物。

【請求項85】

アミロイド症が、アルツハイマー病である、請求項８３または８４に記載の使用のための産物。

【請求項86】

アミロイド症が、ダウン症候群のアミロイド症である、請求項８３または８４に記載の使用のための産物。

【請求項87】

請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるアミロイド症を治療または防止する方法。

【請求項88】

産物を投与することが、能動免疫のためである、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

アミロイド症が、アルツハイマー病である、請求項８７または８８に記載の方法。

【請求項90】

アミロイド症が、ダウン症候群のアミロイド症である、請求項８７または８８に記載の方法。

【請求項91】

アミロイド症の診断に使用する、請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物。

【請求項92】

アミロイド症が、アルツハイマー病である、請求項９１に記載の使用のための産物。

【請求項93】

アミロイド症が、ダウン症候群のアミロイド症である、請求項９１に記載の使用のための産物。

【請求項94】

アミロイド症を有すると疑われる対象からの試料を準備すること、試料を請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物と、産物および抗体を含む複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させることを含み、複合体の存在が、対象がアミロイド症を有することを示す、アミロイド症を診断する方法。

【請求項95】

アミロイド症が、アルツハイマー病である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

アミロイド症が、ダウン症候群のアミロイド症である、請求項９４に記載の方法。

【請求項97】

請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物に結合することができる作用物を同定する方法であって、ａ）目的の１つ以上の作用物を、１つ以上の作用物が産物に結合するのに十分な時間および条件下で、産物に曝露するステップならびにｂ）産物に結合する作用物を同定するステップを含む方法。

【請求項98】

作用物が、抗体、非抗体結合分子、アプタマーまたは低分子量化合物である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

請求項１から７７のいずれか一項に記載の産物に結合することができる抗体を得る方法であって、
ｉ）産物を含む抗原を準備すること、
ｉｉ）抗体レパートリーを抗原に曝露すること、および
ｉｉｉ）レパートリーから産物に結合する抗体を選択すること
を含む方法。

【請求項100】

【化2】

からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部（Ｘ−Ｙ）と同じアミノ酸配列を含み、Ｘが数１．．１８からなる群から選択され、Ｙが数３３．．４３からなる群から選択される分子、または前記アミノ酸配列の少なくとも２つの非隣接残基が互いに共有結合している、そのクロスリンクされた誘導体。

【請求項101】

Ｘが、数１．．１８、４．．１８、１２．．１８からなる群から選択される、または１８である、請求項１００に記載の分子またはそのクロスリンクされた誘導体。

【請求項102】

Ｙが、数３３．．４３、３３．．４２、３３．．４１または３３．．４０からなる群から選択される、請求項１００または１０１に記載の分子またはそのクロスリンクされた誘導体。

【請求項103】

（Ｘ−Ｙ）が、（１−４２）、（４−４２）、（１２−４２）または（１８−４２）からなる群から選択される、請求項１００から１０２のいずれか一項に記載の分子またはそのクロスリンクされた誘導体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子ファイルで提出し、その全体を参照により組み込む配列表を含む。２０１５年８月２７日に作成した、前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＢＶ１２０７５ＷＯＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１４０９５バイトである。

【0002】

本発明は、突然変異タンパク質アミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列に基づく免疫原性産物に関し、とりわけＡβ突然変異タンパク質のオリゴマーに関し、またアミロイド症のような状態の診断、治療および防止における、ならびに前記産物に結合することができる作用物を同定するための前記産物の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知能力の進行性喪失により、また脳のいくつかの領域におけるアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドの沈着、神経原線維変化および神経細胞脱落を含む特徴的な神経病理学的特徴により特徴付けられる神経変性障害である（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７巻、３５３頁、２００２年；Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１巻、７００４頁、２００４年）。アルツハイマー病に認められるものと非常に類似した脳アミロイド沈着および認知障害は、出生８００例に約１例の頻度で発生するダウン症候群（２１トリソミー）の顕著な特徴でもある。

【0004】

Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解プロセシングにより生じる。このプロセシングは、α−、β−およびγ−セクレターゼと名付けられたいくつかのプロテアーゼの協同活動により達成され、異なる長さのいくつかの特異的断片をもたらす。Ａβペプチド沈着物は、主として４０または４２アミノ酸の長さを有するペプチド（Ａβ（１−４０）、Ａβ（１−４２））からなる。このタンパク質は、水性環境中で重合する傾向があり、Ａβフィブリルのような不溶性の形態、ならびにＡβオリゴマーのような可溶性の形態を含む、非常に異なる分子形態で存在し得る。

【0005】

不溶性タンパク質の沈着と、例えばアルツハイマー病のような認知症の発症または進行との単純な相関は、疑わしいことが証明された（Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３０巻、５７２−５８０頁、１９９１年；Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６巻、２８５−２９８頁、１９９５年）。これと対照的に、シナプスおよび認知的知覚の喪失は、可溶Ａβ型とより良好な相関を示すようである（Ｌｕｅら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１５５巻、８５３−８６２頁、１９９９年；ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、４６巻、８６０−８６６頁、１９９９年）。

【0006】

可溶性Ａβオリゴマーは、合成により生成し（Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５巻、８３４−８４７頁、２００５年）、ＡＰＰトランスフェクト細胞培養から収集され（Ｗａｌｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６巻、５３５−５３９頁、２００２年）、ＡＰＰトランスジェニックマウスの脳から単離された（Ｌｅｓｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻、３５２−３５７頁、２００６年）。国際公開第２００４／０６７５６１号は、Ａβ（１−４２）ペプチドの球状オリゴマー（「グロブロマー」）およびそれらを調製する方法に言及している。国際公開第２００６／０９４７２４号は、Ｘが数１．．２４からなる群から選択される非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）に関する。国際公開第２００４／０６７５６１号および国際公開第２００６／０９４７２４号は、グロブロマーの限定的タンパク質分解により、Ａβ（２０−４２）またはＡβ（１２−４２）グロブロマーのような切断型の前記グロブロマーが生じることをさらに記載している。国際公開第２００７／０６４９１７号は、アミロイドβペプチドの組換え型（以後Ｎ−ＭｅｔＡβ（１−４２）と呼ぶ）ならびにそのグロブロマー型のクローニング、発現および単離を記載している。

【0007】

データから、Ａβフォールディングおよび１つ以上のエピトープ（以後グロブロマーエピトープと呼ぶ）を示すＡβオリゴマーへのアセンブリーのアミロイドフィブリル非依存性経路の存在が示唆される。前記グロブロマーエピトープは、ＡＤ患者およびＡＰＰトランスジェニックマウスの脳において検出され、Ａβグロブロマーは、ニューロンに特異的に結合し、海馬の長期増強をブロックすることが見いだされた。可溶性Ａβグロブロマーが本質的にはＰ／Ｑ型シナプス前カルシウムチャンネルとの相互作用によりその有害効果をもたらし、したがって、この相互作用の阻害がアルツハイマー病のようなアミロイド症の治療に有用であることが見いだされた（国際公開第２００８／１０４３８５号）。

【0008】

可溶性Ａβグロブロマーとモノマーおよびフィブリルのような他のＡβ種とを区別することができるモノクローナル抗体が例えば、国際公開第２００７／０６２８５２号に以前に記載された。Ａβグロブロマーに対して選択的なモノクローナル抗体がインビトロおよびインビボでＡβオリゴマーの病理学的作用を妨げることが示された（Ｈｉｌｌｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻（３１号）、１０３６９−１０３７９頁、２０１０年）。これらの結果は、Ａβグロブロマーの抗体によってもたらされる中和が前臨床ＡＤモデルにおいて有効であり、したがって、ＡＤおよび他のアミロイド症の治療および防止においても有効であり得ることを示すものである。

【0009】

受動免疫のためのモノクローナル抗Ａβ抗体の他に、能動免疫のためのＡβ調製物の使用は、ＡＤ研究の問題であった。そのような研究の結果は、Ａβオリゴマーワクチンの治療指数が病原性Ａβ種に特異的である免疫応答を誘発するその能力に依存することを裏付けるものである。特異性の重要性は、以前のワクチン接種試験の結果により裏付けられる。アルツハイマー病患者における能動免疫の臨床試験における前凝集Ａβ（１−４２）の使用により、例えば、生成した抗体が、細胞の裏打ちのために恐らく必要なＡβ（１−４２）形態も認識し、炎症反応をもたらしたので、患者の一部における著しい副作用（髄膜脳炎、出血）がもたらされた（Ｄ．Ｓｃｈｅｎｋ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３巻、８２４−８２８頁（２００２年））。

【0010】

Ａβオリゴマーワクチンは、もちろん、病原性Ａβ形態以外への自己抗体結合を誘発することを回避するべきであるだけでなく、一般的に病原性交差反応の能力のある自己抗体の形成を誘発するべきでもない。しかし、特定の事例において、野生型Ａβオリゴマーの調製物を用いて同定されたモノクローナル抗体が血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を示し得ることが見いだされた。ＰＦ−４は、ヘパリンに結合し、それによりネオエピトープを形成する。これは、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）として公知の避けられない血栓疾患をもたらす免疫反応を誘発し得る。ＨＩＴは、ヘパリンの投与により引き起こされることが公知である。それにもかかわらず、ＨＩＴ、血小板減少症および血栓症の症状、ならびに抗ＰＦ−４自己抗体がヘパリンの事前の投与を受けなかった患者においても認められた（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ、１２１巻（７号）、６３２−６頁、２００８年）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２００４／０６７５６１号

【特許文献2】国際公開第２００６／０９４７２４号

【特許文献3】国際公開第２００７／０６４９１７号

【特許文献4】国際公開第２００８／１０４３８５号

【特許文献5】国際公開第２００７／０６２８５２号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７巻、３５３頁、２００２年

【非特許文献2】Ｍａｔｔｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、４３１巻、７００４頁、２００４年

【非特許文献3】Ｔｅｒｒｙら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、３０巻、５７２−５８０頁、１９９１年

【非特許文献4】Ｄｉｃｋｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６巻、２８５−２９８頁、１９９５年

【非特許文献5】Ｌｕｅら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ、１５５巻、８５３−８６２頁、１９９９年

【非特許文献6】ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、４６巻、８６０−８６６頁、１９９９年

【非特許文献7】Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５巻、８３４−８４７頁、２００５年

【非特許文献8】Ｗａｌｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４１６巻、５３５−５３９頁、２００２年

【非特許文献9】Ｌｅｓｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、４４０巻、３５２−３５７頁、２００６年

【非特許文献10】Ｈｉｌｌｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、３０巻（３１号）、１０３６９−１０３７９頁、２０１０年

【非特許文献11】Ｄ．Ｓｃｈｅｎｋ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３巻、８２４−８２８頁（２００２年）

【非特許文献12】ＷａｒｋｅｎｔｉｎらＡｍ Ｊ Ｍｅｄ、１２１巻（７号）、６３２−６頁、２００８年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

患者の身体に対する病的自己免疫反応のような負のおよび致命的であり得る副作用をもたらさずに、アルツハイマー病および関連障害に対して有効であるＡβオリゴマーワクチンの開発のための多大な、満たされていない療法の必要性がある。一般集団の寿命の延び、ならびにこの延びによる、アルツハイマー病または関連障害と年間に診断される患者数の随伴する増加を考慮すると、そのような必要性は、とりわけ明らかである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

（発明の要旨）
本発明は、Ａβグロブロマーエピトープに特異的に結合するが、血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有する抗血清を誘導することができる新規免疫原性産物を提供することによって前記必要性を満たす。したがって、新規免疫原性産物は、グロブロマー特異的抗体により認識される１つ以上のエピトープを含む。そのようなエピトープに結合するモノクローナル抗体は、国際公開第２００７／０６２８５２号に記載され、それぞれＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４０、ＰＴＡ−７４０５およびＰＴＡ−７２４１によって示されるハイブリドーマから得られる７Ｃ６、４Ｄ１０および５Ｆ７を含む。

【0015】

したがって、本発明は、以下のアミノ酸配列との６２．５％以上の同一性を有するアミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列を含む免疫原性産物であって、

【0016】

【化1】

【0017】

ｉ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４０により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体７Ｃ６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７４０５により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体４Ｄ１０またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４１により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体５Ｆ７からなる群から選択されるモノクローナル抗体と反応性であり、
ｉｉ）血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる免疫原性産物を提供する。

【0018】

本発明はまた、本明細書で開示する免疫原性産物を含む組成物に関する。

【0019】

本発明はさらに、本明細書で開示する免疫原性産物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるアミロイド症を治療または防止する方法に関する。関連態様において、本発明は、アミロイド症を治療または防止するのに使用する本明細書で開示した免疫原性産物に関する。

【0020】

本発明はまた、アミロイド症を有すると疑われる対象からの試料を準備すること、試料を本明細書で開示した免疫原性産物と、該産物および抗体を含む複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させることを含み、該複合体の存在が、対象がアミロイド症を有することを示す、アミロイド症を診断する方法に関する。関連態様において、本発明は、アミロイド症を診断するのに用いる本明細書で開示した免疫原性産物に関する。

【0021】

本発明はまた、本明細書で開示した免疫原性産物に結合することができる作用物を同定する方法であって、ａ）目的の１つ以上の作用物を、１つ以上の作用物が産物に結合するのに十分な時間および条件下で、産物に曝露するステップならびにｂ）産物に結合する作用物を同定するステップを含む方法に関する。

【0022】

関連態様において、本発明は、
ｉ）免疫原性産物を含む抗原を準備すること、
ｉｉ）抗体レパートリーを前記抗原に曝露すること、および
ｉｉｉ）前記レパートリーから産物に結合する抗体を選択すること
を含む、本明細書で開示した免疫原性産物に結合することができる抗体を得る方法を提供する。

【0023】

本発明はさらに、

【0024】

【化2】

からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部（Ｘ−Ｙ）と同じアミノ酸配列を含み、Ｘが数１．．1８、４．．１８、１２．．１８からなる群から選択されもしくは１８であり、Ｙが数３３．．４３、３３．．４２、３３．．４１もしくは３３．．４０からなる群から選択される分子、またはアミノ酸配列の少なくとも２つの非隣接残基が互いに共有結合している、そのクロスリンクされた誘導体に関する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマーのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ＨＲ１０／３００ＧＬ上サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す図である。

【図1B】切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ＨＲ１０／３００ＧＬ上サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す図である。

【図1C】切断型Ａβ Ｆ２０Ｇ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ＨＲ１０／３００ＧＬ上サイズ排除クロマトグラム（ＳＥＣ）を示す図である。

【図2】ＥＬＩＳＡにおいて、列挙したＡβ突然変異タンパク質オリゴマーの切断型が、マウスＡβ（２０−４２）グロブロマー反応性モノクローナル抗体ｍ７Ｃ６およびｍ４Ｄ１０と反応性であることが認められたかどうかを示す表である（＋＋＋：強い反応性；＋＋：良好な反応性；＋：中等度の反応性；＋／−：全くまたはほとんど反応性がない）。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本明細書で特に定義しない限り、本発明に関連して使用される科学および技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。用語の意味および範囲は、明確であるべきであるが、潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書に示す定義は、辞書または外部のいかなる定義に対しても優先される。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は、複数状態を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。本願において、「または」の使用は、特に述べない限り、「および／または」を意味する。さらに、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」のような他の形の使用は、非限定的である。また、「要素」または「成分」のような用語は、特に具体的に述べない限り、１つのユニットを含む要素および成分ならびに２つ以上のサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。

【0027】

一般的に、本明細書で述べる細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いる術語およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられているものである。本発明の方法および技術は、特に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法に従って、また本明細書を通して引用し、述べる様々な一般的およびより個別的参考文献に記載されている通りに一般的に実施される。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に遂行されているようにまたは本明細書で述べるように、製造業者の仕様書に従って実施される。本明細書で述べる分析化学、合成有機化学ならびに医薬および薬化学に関連して用いる術語ならびにそれらの実験室での手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、医薬品、製剤および送達ならびに患者の治療に標準的技術が用いられる。

【0028】

本発明は、一方でモノクローナル抗体７Ｃ６、モノクローナル抗体４Ｄ１０またはモノクローナル抗体５Ｆ７のようなグログロマーエピトープに結合する抗体と反応性であり、他方でＰＦ−４に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる免疫原性産物を提供する。

【0029】

ＰＦ−４は、ＣＸＣケモカインファミリーに属し、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド４（ＣＸＣＬ４）としても公知である小さい７０アミノ酸サイトカインである。ＰＦ−４は、血小板凝集中の活性化血小板のアルファ顆粒から放出され、ヘパリン様分子の作用を調節することにより血液凝固を促進する。これらの機能により、創傷修復および炎症に関与することが予測されている（Ｅｉｓｍａｎｎら、Ｂｌｏｏｄ、７６巻（２号）、３３６−４４頁、１９９０年）。ＰＦ−４は、通常プロテオグリカンとの複合体に見いだされ、血栓症の薬物治療として用いられている抗凝固剤ヘパリンと複合体を形成し得る。ＰＦ−４は、抗凝固剤ヘパリンの投与に対する特質体質性自己免疫反応である、ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）における十分に記載された病理学機能を有し（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎ Ｎ．、Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５６巻（９号）８９１−３頁、２００７年）、この場合、ヘパリン：ＰＦ−４複合体が抗原である。ＰＦ−４自己抗体は、血栓症およびＨＩＴと類似した特徴を有するが、ヘパリンの事前の投与のない患者にも認められた（Ｗａｒｋｅｎｔｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１２１巻（７号）、６３２−６頁、２００８年）。ヘパリン誘発性血小板減少症は、血小板減少症（低血小板数）の発生を特徴とし、さらにＨＩＴは、血栓症に罹患しやすくする。病理学的過程におけるＰＦ−４のこれらの機能および関与を考慮すると、対象に存在するＰＦ−４に対する結合（例えば、交差反応性）を示すポリクローナル抗血清を誘導する抗原（例えば、ワクチン）の投与は、前記ＰＦ−４機能に影響を及ぼし、ひいては有害（副）作用をもたらし得ると結論することができる。そのような有害作用の程度および性質は、ＰＦ−４上のエピトープの場所およびサイズ、それぞれの抗血清の結合強度および性質のようなパラメーターによって異なり得る。

【0030】

本発明の免疫原性産物は、血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる。したがって、ＰＦ−４交差反応性を有する産物による免疫化に起因し得るＨＩＴのような有害反応の発生は、対象の能動免疫のために本発明の免疫原性産物を用いる場合に避けることができる。

【0031】

本発明の一態様において、本明細書で述べた免疫原性産物により誘導されるＰＦ−４に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清は、マウスまたはウサギに由来するポリクローナル抗血清である。好ましくは、ポリクローナル抗血清は、該産物に結合する抗体が富化された親和性精製抗血清である。

【0032】

本発明の異なる態様において、ＰＦ−４は、カニクイザル血漿中のＰＦ−４およびヒト血漿中のＰＦ−４から選択される。

【0033】

血小板因子４（ＰＦ−４）に対する交差反応性を全く有さないまたは低い交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導する免疫原性産物の能力は、当技術分野で周知の標準的方法を用いて試験することができる。例えば、後にそのポリクローナル抗血清を得るために免疫原性産物を用いてマウスまたはウサギを免疫化することができる。一般的に公知のように、個々の抗血清において免疫化に用いられる免疫原性産物に対する抗体の量に関する変動があり得る。ＰＦ−４反応性に関するアッセイにおける偽陰性結果を避けるために、ポリクローナル抗血清は、したがって免疫原性産物に結合する抗体について富化することができる。そのような富化は、例えば、固体担体（例えば、セファロースビーズ）上に免疫原性産物を固定化すること、固定化免疫原性産物への抗体の結合を可能にするように担体を抗血清と接触させること、および担体から結合した抗体を溶出すること（例えば、酸性溶出緩衝液を用いて）を含む親和性精製の標準的方法を用いて達成することができ、その場合、溶出液は、免疫原性産物に結合する抗体が富化された親和性精製抗血清である。固定化産物が（切断型）Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーである場合、モノマーまたは繊維状形態のような非オリゴマーＡβ形態にも結合し得るすべての抗Ａβ抗体が親和性精製されることを保証するために、免疫原性産物に含まれるＡβ突然変異タンパク質は、モノマー形で担体上にさらに固定化してもよい。

【0034】

本発明の特定の態様において、交差反応性は、血漿ＰＦ−４に対する、固定化されているポリクローナル抗血清の結合として決定され、ポリクローナル抗血清は、例えば、固定化抗ＩｇＧ抗体に結合することにより固定化される。結合ＰＦ−４は、前記ＰＦ−４に結合した抗ＰＦ−４抗体として検出することができる。抗ＰＦ−４抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清であってよく、とりわけアミノ酸配列ＥＡＥＥＤＧＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰＲＨＩＴＳＬＥＶＩＫＡＧＰＨＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号１２）を有するＰＦ−４と反応性である。抗ＰＦ−４抗体は、標識抗体であってよく、検出は、標識によって発せられたシグナルを測定することである。あるいは、結合抗ＰＦ−４抗体は、抗ＰＦ−４抗体に結合した標識抗ＩｇＧ抗体として検出することができ、検出は、標識によって発せられたシグナルを測定することである。

【0035】

別の特定の実施形態によれば、本発明の免疫原性産物により誘導された抗血清のＰＦ−４に対する交差反応は、（ｉ）ヒトまたはカニクイザル血漿ならびに結合タンパク質および参照抗ＰＦ−４抗体の希釈系列を用いた整列化サンドイッチＥＬＩＳＡを実施し、（ｉｉ）検出シグナル（ｙ軸）を抗血清または参照抗ＰＦ−４抗体の対数変換濃度（ｘ軸）に対してプロットし、（ｉｉｉ）測定範囲内のこれらの非曲線当てはめデータから曲線下面積（ＡＵＣまたは総ピーク面積）を決定することによって得られる前記抗血清および参照抗ＰＦ−４抗体のＡＵＣ値の比を指す。

【0036】

「参照抗ＰＦ−４抗体」は、本明細書で用いているように、ＰＦ−４、とりわけヒト（ＨＰＦ４）と特異的に反応性である、抗体、とりわけモノクローナル抗体である。そのような抗体は、ヒトＰＦ−４、例えば、アミノ酸配列ＥＡＥＥＤＧＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰＲＨＩＴＳＬＥＶＩＫＡＰＨＣＰＴＡＱＬＩＡＴＬＫＮＧＲＫＩＣＬＤＬＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ（配列番号１２）を有するヒトＰＦ−４を含む抗原を準備し、抗体レパートリーを前記抗原に曝露し、前記抗体レパートリーからヒトＰＦ−４に特異的に結合する抗体を選択することによって得られる。抗体は、免疫原（ヒトＰＦ−４）を用いて親和性精製してもよい。そのような参照抗ＰＦ−４抗体は、市販されており、例えば、Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ４９７３５のモノクローナル抗ＨＰＦ４抗体である。

【0037】

本発明の特定の態様において、本明細書で述べた免疫原性産物は、ＰＦ−４に対する参照抗ＰＦ−４抗体の交差反応性より少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍小さいＰＦ−４に対する交差反応性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる。

【0038】

さらに、本発明の免疫原性産物は、特定の抗体とのそれらの反応性を特徴とする。そのような抗体は、とりわけグロブロマーエピトープに結合する抗体、とりわけＡβ（１−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体を含む。

【0039】

Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より大きいＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体は、参照により本明細書に組み込む、国際公開第２００７／０６２８５２号に記載されており、例えば、７Ｃ６、４Ｄ１０および５Ｆ７からなる群から選択されるモノクローナル抗体を含む。

【0040】

したがって、本発明の一実施形態によれば、本発明の免疫原性産物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４０により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体７Ｃ６またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７４０５により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体４Ｄ１０またはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ寄託番号ＰＴＡ−７２４１により示されるハイブリドーマから得られるモノクローナル抗体５Ｆ７からなる群から選択されるモノクローナル抗体と反応性である。

【0041】

本発明の一態様において、モノクローナル抗体７Ｃ６は、本明細書で述べた免疫原性産物に高い親和性で、例えば、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性でまたは１×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、または１×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で結合する。

【0042】

本発明の別の態様において、モノクローナル抗体４Ｄ１０は、本明細書で述べた免疫原性産物に高い親和性で、例えば、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性でまたは１×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、または１×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で結合する。

【0043】

本発明のさらなる別別の態様において、モノクローナル抗体５Ｆ７は、本明細書で述べた免疫原性産物に高い親和性で、例えば、１×１０^−６ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性でまたは１×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−９ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、１×１０^−１０ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、例えば、３×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で、または１×１０^−１１ＭのＫ_Ｄもしくはより大きい親和性で結合する。

【0044】

グロブロマー特異的抗体と反応する本発明の免疫原性産物は、少なくとも１つのグロブロマーエピトープを示すと考えられる。したがって、本発明の免疫原性産物は、Ａβ（２０−４２）グロブロマーまたは他の切断型グロブロマーを免疫原として用いた場合に誘導される免疫反応と同様なプロファイルを有する免疫反応を誘導することができる。

【0045】

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に対する特異的結合の能力のあるあらゆるポリペプチド抗原決定基（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を含む。特定の実施形態において、エピトープ決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルのような分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の実施形態において、特異的３次元構造特性および／または特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、結合タンパク質、とりわけ抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施形態において、結合タンパク質または抗体は、それがタンパク質および／または巨大分子の複雑混合物中のその標的抗原に優先的に結合する場合に抗原に特異的に結合すると言われる。

【0046】

特定の実施形態によれば、本発明の免疫原性産物は、例えば、哺乳動物、例えば、ウサギまたはマウスを本発明の免疫原性産物により免疫化した場合にそのような特定の免疫応答を誘発するそれらの能力を特徴とする。

【0047】

免疫応答は、抗原（免疫原）により宿主をチャレンジすること（免疫化すること）により生じる抗体の混合とみなすことができる。抗体の前記混合は、宿主から得ることができ、本明細書でポリクローナル抗血清と呼ぶ。

【0048】

一態様において、そのような特定の免疫応答、すなわち、対応するポリクローナル抗血清は、モノマーＡβ（１−４２）、モノマーＡβ（１−４０）、モノマーＡβ（２０−４２）、フィブリロマーＡβ（１−４２）およびフィブリロマーＡβ（１−４０）からなる群から選択される少なくとも１つのＡβ形態、好ましくは前記Ａβ形態のすべてに対する抗体の結合親和性より大きい本発明の免疫原性産物またはＡβグロブロマーに対する結合親和性を有する抗体を含むことを特徴とする。

【0049】

特定の実施形態によれば、免疫応答、すなわち、対応するポリクローナル抗血清は、モノマーＡβ（１−４２）、モノマーＡβ（１−４０）、モノマーＡβ（２０−４２）、フィブリロマーＡβ（１−４２）およびフィブリロマーＡβ（１−４０）からなる群から選択される少なくとも１つのＡβ形態、好ましくは前記Ａβ形態のすべてに対する抗血清の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい本発明の免疫原性産物またはＡβグロブロマーに対する親和性を有することを特徴とする。

【0050】

本発明の関連態様において、前記Ａβグロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーからなる群から選択される。

【0051】

本明細書で用いているように、省略記号Ａ．．Ｂは、両方を含め、ＡからＢまでのすべての自然数を含むセットを意味し、したがって、例えば、「１７．．２０」は、１７、１８、１９および２０という数の群を意味する。ハイフンは、アミノ酸の連続した配列を意味する。すなわち、「Ｘ−Ｙ」は、両方を含めて、アミノ酸Ｘからアミノ酸Ｙまでの配列を含む。したがって、「Ａ．．Ｂ−Ｃ．．Ｄ」は、これらの２つのセットのメンバーの間のすべての可能な組合せを含む。例えば、「１７．．２０−４０．．４２」は、以下のすべてを含む：１７−４０、１７−４１、１７−４２、１８−４０、１８−４１、１８−４２、１９−４０、１９−４１、１９−４２、２０−４０、２０−４１および２０−４２。特に述べない限り、すべての数は、成熟ペプチドの開始を指し、１は、Ｎ末端アミノ酸を示す。

【0052】

「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、本明細書で用いているようにＸおよびＹの両方を含むヒトアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列を有するポリペプチド、とりわけアミノ酸配列Ｄ_１Ａ_２Ｅ_３Ｆ_４Ｒ_５Ｈ_６Ｄ_７Ｓ_８Ｇ_９Ｙ_１０Ｅ_１１Ｖ_１２Ｈ_１３Ｈ_１４Ｑ_１５Ｋ_１６Ｌ_１７Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９Ｖ_４０Ｉ_４１Ａ_４２Ｔ_４３（配列番号１）（ヒトＡβタンパク質のアミノ酸位置１から４３に対応する）のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその突然変異タンパク質を指す。

【0053】

本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー」または「モノマーＡβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、単離された形態のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド、好ましくは他のＡβペプチドとの本質的に非共有結合性相互作用に関与していない形態のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドを指す。実際に、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマーは、通常水溶液の形態で提供される。本発明の特に好ましい実施形態において、水性モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％ＮＨ_４ＯＨを含有する。本発明の別の特に好ましい実施形態において、水性モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％ＮａＯＨを含有する。用いる（例えば、本発明の結合親和性を決定するために）場合、前記溶液を適切な方法で希釈することが好都合であり得る。さらに、前記溶液を、その調製後２時間以内、とりわけ１時間以内、とりわけ３０分以内に使用することが通常好都合である。

【0054】

より具体的には、ここにおける「Ａβ（１−４０）モノマー」という用語は、本明細書における参照例１に記載されているＡβ（１−４０）モノマー調製物を指し、本明細書における「Ａβ（１−４２）モノマー」という用語は、本明細書における参照例２に記載されているＡβ（１−４２）調製物を指す。

【0055】

ここにおける「フィブリル」という用語は、電子顕微鏡下で繊維状構造を示し、コンゴレッドに結合し、偏光下で複屈折を示し、そのＸ線回折パターンがクロスβ構造である、非共有結合の個別Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドのアセンブリーを含む分子構造を指す。

【0056】

本発明の別別の態様において、フィブリルは、２４単位を超える、好ましくは１００単位を超える凝集体の形成をもたらす、例えば、０．１Ｍ ＨＣｌ中の界面活性剤の非存在下での適切なＡβペプチドの自己誘導性ポリマー凝集を含む方法により得られる分子構造である。この方法は、当技術分野で周知である。便宜上、Ａβ（Ｘ−Ｙ）フィブリルは、水溶液の形で用いられる。本発明の特に好ましい実施形態において、水性フィブリル溶液は、Ａβペプチドを０．１％ＮＨ_４ＯＨに溶解し、それを２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：４に希釈し、その後、ｐＨを７．４に再調整し、溶液を３７℃で２０時間インキュベートした後、１００００ｇで１０分間遠心分離し、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に再懸濁することによって作製される。

【0057】

ここにおける「Ａβ（Ｘ−Ｙ）フィブリル」という用語は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）サブユニットから本質的になるフィブリルを指し、サブユニットの平均で少なくとも９０％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものである場合、より好ましくはサブユニットの少なくとも９８％がＡβ（Ｘ−Ｙ）型のものである場合、最も好ましくは非Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの含量が検出閾値を下回る場合にそれが好ましい。

【0058】

より具体的には、ここにおける「Ａβ（１−４２）フィブリル」という用語は、本明細書における参照例６で述べるＡβ（１−４２）フィブリル調製物を指す。

【0059】

別の態様において、そのような免疫応答は、Ａβ（１−４２）グロブロマーまたはＡβ（１２−４２）グロブロマーに対する抗体の結合親和性より大きい本発明の免疫原性産物またはＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する結合親和性を有する抗体を含むことを特徴とする。

【0060】

したがって、本発明のさらなる態様において、本明細書で述べた免疫原性産物は、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（１２−４２）グロブロマーからなる群から選択される少なくとも１つのＡβグロブロマーに対する抗血清の親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい本発明の免疫原性産物またはＡβ（２０−４２）グロブロマーに対する親和性を有するポリクローナル抗血清を誘導することができる。

【0061】

所定の抗原（本発明の免疫原性産物など）に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ドットブロットのような標準化インビトロイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴解析を用いて評価することができる。「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で用いているように、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いるバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により実時間生物特異性相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。さらなる説明については、Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１巻、１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｕ．ら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻、６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻、１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｓｓｏｎ Ｂ．ら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８、２６８−２７７を参照のこと。

【0062】

特定の実施形態によれば、本明細書で定義する親和性は、本明細書で述べるドットブロットを実施し、それを濃度測定により評価することにより得られる値を意味する。本発明の特定の実施形態によれば、ドットブロットによる結合親和性の決定は、以下の手順を含む：一定量の抗原（例えば、本発明の免疫原性産物；上で定義した、Ａβ（Ｘ−Ｙ）オリゴマー、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマーまたはＡβ（Ｘ−Ｙ）フィブリル）または好都合には、例えば、１００ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、０．１ｐｍｏｌ／μｌおよび０．０１ｐｍｏｌ／μｌの抗原濃度への例えば、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡによる中その適切な希釈物をニトロセルロース膜上に滴下し、次いで非特異的結合を防ぐためにミルクで膜をブロックし、洗浄し、次いで目的の抗体または抗血清と接触させた後、酵素コンジュゲート二次抗体および比色反応により後者の検出を行い、規定の抗体濃度において、結合した抗体の量により親和性の決定が可能となる。したがって、１つの抗原に対する２つの異なる抗体もしくは抗血清の、または２つの異なる抗原に対する１つの抗体もしくは抗血清の相対親和性は、他の点では同じドットブロット条件下で２つの抗体／抗血清−抗原の組合せについて観測される抗原に結合した抗体のそれぞれの量の関係と本明細書で定義する。ウエスタンブロッティングに基づく同様のアプローチとは異なって、ドットブロットアプローチは、所定の抗原の自然立体配座における所定の抗原に対する抗体の親和性を決定し、またＥＬＩＳＡアプローチとは異なって、ドットブロットアプローチは、異なる標的とマトリックスとの間の親和性の差の影響を受けず、それにより、異なる抗原の間のより精密な比較が可能となる。

【0063】

ここにおける「より大きい親和性」という用語は、一方で非結合抗体および非結合免疫原性産物またはグロブロマーと他方で抗体−免疫原性産物／グロブロマー複合体との間の平衡が複合体にさらに有利である、相互作用の程度を指す。同様に、ここにおける「より小さい親和性」という用語は、一方で非結合抗体および非結合免疫原性産物またはグロブロマーと他方で抗体−免疫原性産物／グロブロマー複合体との間の平衡が非結合抗体および非結合免疫原性産物／グロブロマーにさらに有利である、相互作用の程度を指す。「より大きい親和性」という用語は、「より高い親和性」という用語と同義であり、「より小さい親和性」という用語は、「より低い親和性」という用語と同義である。

【0064】

「Ｋ_Ｄ」（また「Ｋ_ｄ」または「ＫＤ」）という用語は、本明細書で用いているように、「平衡解離定数」を指すものとし、平衡状態における滴定測定で、または解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を会合速度定数（ｋ_ｏｎ）で割ることにより得られる値を指す。会合速度定数（ｋ_ｏｎ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）および平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、抗原に対する結合タンパク質（例えば、抗体）の結合親和性を表すために用いられる。会合および解離速度定数を決定する方法は、当技術分野で周知である。蛍光ベースの技術を用いることは、平衡状態における生理的緩衝液中の試料を調べる高い感度および能力をもたらす。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（生体分子相互作用解析）アッセイのような他の実験アプローチおよび機器を用いることができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎから入手できる機器）。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手できるＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイも用いることができる。

【0065】

特定の実施形態によれば、本発明の免疫原性産物は、可溶性、とりわけ水性媒体（例えば、５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および３５ｍＭ ＮａＣｌの水溶液、より具体的には下記のような濃度の両親媒性物質を含む５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および３５ｍＭ ＮａＣｌの水溶液または８から１０、８．０から９．５もしくは８．０から９．０のｐＨを有する５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および３５ｍＭ ＮａＣｌの水溶液）に可溶性である。１ｍＬの溶液当たり少なくとも０．１、１または５ｍｇタンパク質の溶解度が好都合である。溶解度は、遠心分離により確認することができる。１００００×ｇおよび１０から４０℃、例えば、３７℃の温度での遠心分離により沈殿しない場合、免疫原性産物は可溶性である。

【0066】

さらに、本発明の免疫原性産物が、例えば、２から２８種の本明細書で述べたＡβアミノ酸配列を複数有することが好ましい。

【0067】

したがって、本発明の免疫原性産物は、切断および／またはクロスリンク結合していてもよい、とりわけ、Ａβ突然変異タンパク質のオリゴマーである。

【0068】

「Ａβオリゴマー」または「Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー」という用語は、本明細書で用いているように、上で定義したＡβポリペプチドおよびＡβ突然変異タンパク質の可溶性の、（意図的クロスリンク結合の非存在下）非共有結合性会合を指す。一態様によれば、Ａβオリゴマーは、イオン性界面活性剤とのインキュベーションにより得られるＡβ（突然変異タンパク質）ポリペプチドの安定な非繊維状アセンブリーである。「Ａβグロブロマー」という用語は、本明細書で用いているように、３次元球状構造（「モルテングロビュール」、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、９５巻、８３４−８４７頁、２００５年参照）を有するＡβオリゴマーを指す。Ａβ（突然変異タンパク質）オリゴマーは、以下の構造の１つ以上を特徴とし得る。

【0069】

・切断型のＡβ（突然変異タンパク質）オリゴマーを生じる乱交雑プロテアーゼ（サーモリシンまたはエンドプロテイナーゼＧｌｕＣのような）によるＮ−末端アミノ酸Ｘ−２４の少なくとも部分的切断性；
・乱交雑プロテアーゼおよび抗体によるＣ末端アミノ酸２５−Ｙの非接近性；
・これらのオリゴマーの切断型は、コアエピトープＡβ（１８−３３）のより十分な接近性を有する前記オリゴマーの３次元コア構造を維持する。

【0070】

「切断型Ａβオリゴマー」または「切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー」という用語は、本明細書で用いているように、Ａβオリゴマーを限定的タンパク質分解消化にかけることによって得ることができる切断された形態のＡβ（突然変異タンパク質）オリゴマーを指す。より具体的には、切断型Ａβ（Ｘ−Ｙ）（突然変異タンパク質）オリゴマーは、適切なプロテアーゼによる処理によってＡβ（１−Ｙ）（突然変異タンパク質）オリゴマーを切断することにより得られる、Ｘが数２．．２４からなる群から選択され、Ｙが本明細書で定義した通りであるＮ末端が切断された形態を含む。例えば、Ａβ（２０−４２）オリゴマーは、Ａβ（１−４２）オリゴマーをサーモリシンタンパク質分解にかけることにより得ることができ、Ａβ（１２−４２）オリゴマーは、Ａβ（１−４２）オリゴマーをエンドプロテイナーゼＧｌｕＣタンパク質分解にかけることにより得ることができる。タンパク質分解の所望の程度に到達したとき、一般的に公知の方法でプロテアーゼを不活性化する。得られたオリゴマーは、本明細書で既に述べた手順に従って単離し、必要な場合、さらなる後処理および精製ステップによりさらに処理することができる。

【0071】

本発明のオリゴマーは、Ａβアミノ酸配列を含む対応するＡβ突然変異タンパク質ペプチドのオリゴマー化により得られる。オリゴマー化は、本発明のオリゴマーが複数のＡβ突然変異タンパク質ペプチドからなると推測することができるようにモノマーＡβ突然変異タンパク質ペプチドの非共有結合性凝集を含む。

【0072】

出発物質、すなわち、Ａβ突然変異タンパク質ペプチドは、公知のペプチド合成方法によりまたは組換えにより調製することができる。さらに、これらのタンパク質のいくつかは、市販されている。特定の実施形態において、Ａβ突然変異タンパク質ペプチドは、合成Ａβ突然変異タンパク質ペプチドである。

【0073】

前記ペプチドは、Ｇ．ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ」；Ｖｏｌｕｍｅ ２−「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ Ａ」、３−２８４頁、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０年ならびにＪ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９８４年に記載されているような様々な固相技術を用いる化学合成により生産することができる。この戦略は、アミノ酸側鎖の一時的保護のためのｔｅｒｔ−ブチル基と組み合わされた、α−アミノ基の一時的保護のためのＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルメチル−オキシカルボニル）基に基づいている（例えば、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、「Ｔｈｅ Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ」「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ」；９巻−「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ Ｃ」、１−３８頁、Ｓ．ＵｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９８７年参照）。

【0074】

ペプチドは、ペプチドのＣ末端から開始して不溶性ポリマー担体（「樹脂」とも呼ぶ）上で段階的に合成することができる。合成は、アミドまたはエステル結合の形成により樹脂にペプチドのＣ末端アミノ酸を付加することによって開始させる。これは、得られたペプチドのそれぞれＣ末端アミドまたはカルボン酸としての最終的放出を可能にする。あるいは、Ｃ末端アミノアルコールが存在する場合、本明細書で述べるようにＣ末端残基を２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール樹脂（ＳＡＳＲＩＮ（商標）、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）に結合させ、ペプチド配列アセンブリーの完結後に、得られたペプチドアルコールをＴＨＦ中でＬｉＢＨ_４により放出させる（Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、前出、９２頁参照）。

【0075】

合成に用いられるＣ末端アミノ酸およびすべての他のアミノ酸は、α−アミノ保護基を合成中に選択的に除去することができるように示唆的に保護されたそれらのα−アミノ基および側鎖官能基（存在する場合）を有することが要求される。アミノ酸のカップリングは、そのカルボキシル基の活性化エステルおよび樹脂に付加されたＮ末端アミノ酸の非保護α−アミノ基とのその反応により行われる。全配列がアセンブルされるまで、α−アミノ基脱保護およびカップリングのシーケンスが反復される。次いでペプチドは、通常、副反応を制限するための適切な捕捉剤の存在下で、側鎖官能基の同時脱保護により樹脂から放出される。得られたペプチドは、逆相ＨＰＬＣにより最終的に精製される。

【0076】

最終ペプチドの前駆体として必要なペプチジル樹脂の合成では、市販のクロスリンクポリスチレンポリマー樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を利用する。好ましい固体担体は、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセチル−ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂）；９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂）；Ｃ末端カルボキサミド用４−（９−Ｆｍｏｃ）アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）バレリル−アミノメチル−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（ＰＡＬ樹脂）を含む。最初およびその後のアミノ酸のカップリングは、それぞれＤＩＣ／ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰからまたはＤＩＣ／ＨＯＡＴ、ＨＡＴＵ／ＨＯＡＴから生産したＨＯＢＴまたはＨＯＡＴ活性化エステルを用いて達成することができる。好ましい固体担体は、保護ペプチド断片用の２−クロロトリチルクロリド樹脂および９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂）である。２−クロロトリチルクロリド樹脂上への最初のアミノ酸の負荷は、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸をジクロロメタンおよびＤＩＥＡ中で樹脂と反応させることによって最も良く達成される。必要な場合、アミノ酸の溶解を促進するために少量のＤＭＦを加えることができる。

【0077】

合成は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＭＰＳ３９６）またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．ペプチド合成装置（ＡＢＩ４３３ａ）のようなペプチド合成装置を用いて実施することができる。

【0078】

あるいは、１）所望のペプチドをもたらす、ペプチド結合の酵素的または化学的切断のための適切な切断部位によって分離された所望のペプチドの複数のコピーの合成、２）当業者に公知で、アミノ酸配列を含む任意のシステムにおけるＡＰＰの組換え発現とそれに続く所望のペプチドを生み出すための酵素的または化学的処理、３）当業者に公知の任意のシステムにおける融合タンパク質としての所望のペプチドの組換え発現、４）当業者に公知の任意のシステムにおける直接的な所望のペプチドの組換え発現を含む、当業者に公知の任意の他の適切な方法論を用いることもあり得る。

【0079】

アミロイドβペプチドの組換え発現は、国際公開第２００７／０６４９１７号に記載されている。さらに、組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学合成およびインビトロ翻訳の一般的方法は、当技術分野で周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９年）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｊ．（１９６９年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９１巻、５０１頁；Ｃｈａｉｋｅｎ１．Ｍ．（１９８１年）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１巻、２５５頁；Ｋａｉｓｅｒら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、１８７頁；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｂ．（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、３４２頁；Ｋｅｎｔ．Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８年）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７巻、９５７頁；ならびにＯｆｆｏｒｄ Ｒ．Ｅ．（１９８０年）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにさらに記載されている。

【0080】

得られたペプチドは、次いでオリゴマーが生成することを可能にする条件にさらされる。オリゴマー形成に適する条件は、参照により本明細書に組み込む、例えば、国際公開第２００４／０６７５６１号；国際公開第２００６／０９４７２４号；Ｓ．Ｂａｒｇｈｏｒｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、９５巻、８３４頁（２００５年）および国際公開第２００７／０６４９１７号に記載されている。

【0081】

第１のステップにおいて、モノマーＡβ突然変異タンパク質ペプチドを溶媒に溶解する。好ましくは、溶媒は、水素結合切断剤である。この処理の目的は、折りたたまれていないペプチドを得ることである。

【0082】

適切な水素結合切断剤は、当技術分野で公知である。これらは、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）のような有機化合物ならびに水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのような塩基、ギ酸、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、尿素および塩化グアニジニウムの水溶液を含む。

【0083】

特定の実施形態によれば、水素結合切断剤は、ＨＦＩＰである。

【0084】

Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの水素結合切断剤への溶解を促進するために、混合物を掻き混ぜることができる、例えば、振とうにかけることができる。温度が２２から５０℃である場合、溶解の時間は、数分から数時間まで、例えば、１５分から５時間までで十分である。例えば、ペプチドは、それをＨＦＩＰ中で約３７℃で約２．５時間振とうすることによって好都合に溶解することができる。

【0085】

Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの量は、２ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬから４０ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬから３０ｍｇ／ｍＬのペプチドが水素結合切断剤に溶解するような量である。例えば、水素結合切断剤に溶解したＡβ突然変異タンパク質ペプチドの濃度は、ＨＦＩＰ中約６ｍｇ／ｍＬに好都合に調整することができる。

【0086】

Ａβ突然変異タンパク質ペプチドを水素結合切断剤に溶解することにより透明な溶液が得られる場合、それは好都合である。

【0087】

次いで水素結合切断剤を例えば、蒸発により除去し、残留物を適切な溶媒、例えば、ＤＭＳＯに再懸濁する。Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの量は、１ｍＭから１０ｍＭ、２ｍＭから８ｍＭまたは４ｍＭから６ｍＭのペプチドが溶媒に再懸濁されるようなものである。例えば、再懸濁Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの濃度は、ＤＭＳＯ中約５ｍＭに好都合に調整することができる。

【0088】

さらなるステップにおいて、両親媒性物質をＡβ突然変異タンパク質ペプチドの水素結合切断剤中溶液に加える。両親媒性物質の添加により、ペプチドのオリゴマー化が誘導されてオリゴマーが生じる。

【0089】

両親媒性物質は、脂肪酸または界面活性剤を含み、それらの一部は、参照により本明細書に組み込む、国際公開第２００７０６４９１７号に示されている。

【0090】

例えば、硫酸塩、とりわけアルキル硫酸塩およびアルキルエーテル硫酸塩；スルホネート、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、脂肪酸、例えば、ラウリン酸のようなカルボン酸、サルコシン、例えば、Ｎ−ラウロイルサルコシン（サルコシルＮＬ−３０またはＧａｒｄｏｌ（登録商標）としても公知）、オクチルフェノールポリオキシエチレンエーテル、例えば、ｔｅｒｔ−オクチルフェノールｘ９−１０ＥＯ（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００としても公知）のようなアルキルアリールアルコールポリオキシエチレンエーテルまたはアルキルアリールノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル、例えば、ノニルフェノールｘ２０ＥＯ（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−４０としても公知）、３−（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰ）ならびにアミン、とりわけアルキルアミン、例えば、ドデシルアミンを本発明の方法に両親媒性物質として好都合に用いることができる。また、糖界面活性剤、とりわけ例えば、ポリエトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ８０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０としても公知）のようなポリエトキシル化ソルビトールエステルを本発明の方法に両親媒性物質として好都合に用いることができる。

【0091】

特定の実施形態によれば、両親媒性物質は、両親媒性物質を含む水溶液の形で加える。前記溶液は、緩衝されていてよい。６．０から１０．０、６．５から９．５または７．０から９．０の範囲のｐＨ値が好都合であることがわかっている。例えば、約７．４のｐＨ値を有する緩衝水溶液は、好都合に用いることができる。適切な緩衝水溶液は当技術分野で公知である。例えば、５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および３５ｍＭ ＮａＣｌを含む水溶液を好都合に用いることができる。

【0092】

水溶液を加えることによりＡβ突然変異タンパク質ペプチドを希釈する。再懸濁Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの体積の５から５０、７から３０または８から２５倍の範囲の加える水溶液の量が好都合であることがわかっている。例えば、加える水溶液の量は、好都合には再懸濁Ａβ突然変異タンパク質ペプチドの体積の約１０倍であり得る。

【0093】

選択される両親媒性物質の濃度は、用いられる作用物に依存する。ＳＤＳを用いる場合、インキュベーション混合物中０．０５から０．７重量％、０．０７５から０．４重量％または０．１から０．３重量％の範囲の濃度が好都合であることがわかっている。例えば、約０．２重量％のＳＤＳを含む緩衝水溶液を好都合に用いることができる。ラウリン酸またはＮ−ラウロイルサルコシンを用いる場合、例えば、０．１から１．０重量％、０．２５から０．７５重量％または０．４から０．６重量％の範囲の多少より高い濃度が好都合である。例えば、約０．５重量％のラウリン酸またはＮ−ラウロイルサルコシンを含む緩衝水溶液を好都合に用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）を用いる場合、インキュベーション混合物中０．０５から１重量％、０．０７５から０．５重量％または０．１から０．３重量％の範囲の濃度が好都合であることがわかっている。

【0094】

通常、再懸濁Ａβ突然変異タンパク質ペプチドおよび緩衝水溶液を好都合には掻き混ぜながら、例えば、ボルテックスしながら混合する。

【0095】

混合物をインキュベートしてオリゴマー形成を完結する前に、混合物から固体を除去することが好都合であり得る。

【0096】

オリゴマー形成のためのインキュベーションの時間は、数分から数時間までの範囲であり得る。インキュベーションの温度が１５から５０℃、１８から４５℃または２０から４０℃である場合、１時間から４８時間まで、２時間から３６時間までまたは５時間から２４時間までが十分である。例えば、オリゴマー形成は、混合物を約３７℃で約２４時間インキュベートする場合、完結する。

【0097】

便宜上、インキュベーションを２段階で行う。すなわち、インキュベーションの第１の期間の後に調製物を希釈し（例えば、水で）、インキュベーションの第２の期間を後続させる。

【0098】

第１の期間におけるインキュベーションの時間は、数分から数時間までの範囲であり得る。インキュベーションの温度が１５から５０℃、１８から４５℃または２０から４０℃である場合、１時間から２４時間まで、２時間から１２時間までまたは４時間から８時間までが十分である。例えば、混合物を約３７℃で約６時間インキュベートする。

【0099】

インキュベーション混合物の希釈は、それ自体が公知の方法で実施することができる。特定の実施形態によれば、希釈は、水を加えることを含む。便宜上、インキュベーション混合物は、約２倍から２０倍、３倍から１５倍または４倍から１０倍、例えば、４倍（１：３）希釈する。

【0100】

オリゴマー形成を完結するための第２の期間におけるインキュベーションの時間は、数分から数時間までの範囲であり得る。インキュベーションの温度が１５から５０℃、１８から４５℃または２０から４０℃である場合、１時間から３６時間まで、２時間から２４時間までまたは４時間から１８時間までが十分である。例えば、オリゴマー形成は、混合物を約３７℃で約１８時間インキュベートする場合、完結する。

【0101】

オリゴマー形成が完結すると、インキュベーション混合物を遠心分離し、遠心分離インキュベーション混合物の上清を得ることが好都合であり得る。例えば、約３０００ｘｇで約２０分間の遠心分離が好都合であることがわかっている。

【0102】

特定の実施形態によれば、遠心分離インキュベーション混合物の上清は、次に凍結することができる。例えば、遠心分離インキュベーション混合物の上清は、好都合には−３０℃で３０分間凍結することができる。凍結上清を次に解凍することができ、解凍上清を再び遠心分離し（例えば、１００００ｘｇで１０分間）、遠心分離混合物の上清を得てもよい。

【0103】

この方法により得られるオリゴマー調製物は、そのまま用いるまたは例えば、オリゴマーを濃縮し、および／もしくは精製するためにさらなる後処理にかけることができる。

【0104】

特定の実施形態によれば、本発明の方法は、インキュベーション混合物を濃縮するステップを含む。

【0105】

インキュベーション混合物を濃縮することは、本質的に公知の方法で実施することができる。特定の実施形態によれば、濃縮は、超遠心分離により行われる。超遠心分離は、当技術分野で周知の方法である。１０から１００、２０から８０または２５から５０ｋＤａカットオフを含む超遠心分離は、好都合であることがわかっている。例えば、本発明のオリゴマーは、約３０ｋＤａカットオフを含む超遠心分離により好都合に濃縮することができる。

【0106】

超遠心分離は、インキュベーション混合物中に存在するオリゴマーの量を維持しながらインキュベーション混合物の体積を減少させる。したがって、体積を１から４０％、２から３５または４から３３％に減少させることは、好都合である。例えば、インキュベーション混合物の体積を超遠心分離により約３２％、１０％または５％に好都合に減少させることができる。

【0107】

特定の実施形態によれば、本発明の方法は、インキュベーション混合物または濃縮インキュベーション混合物の塩濃度を減少させるステップを含む。

【0108】

塩濃度（および両親媒性物質、その減少は、能動免疫に用いるのにとりわけ重要である）の減少は、本質的に公知の方法で実施することができる。特定の実施形態によれば、塩濃度は、インキュベーション混合物または濃縮インキュベーション混合物を透析にかけることによって減少させる。透析は、当技術分野で周知の方法である。例えば、インキュベーション混合物または濃縮インキュベーション混合物の透析は、５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および３５ｍＭ ＮａＣｌを含む溶液に対して好都合に実施することができる。溶液は、適量の両親媒性物質も含み得る。透析中に溶液を新たなものに置き換えることが好都合であり得る。

【0109】

透析は、塩の減少が完全になるまで実施する。例えば、約２２℃で約２．５時間が好都合であることがわかっている。

【0110】

透析物を遠心分離し、遠心分離透析物の上清を得ることがさらに好都合であり得る。例えば、約１００００ｘｇで約１０分間の遠心分離が好都合であることがわかっている。

【0111】

したがって、特定の実施形態によれば、本発明は、Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを調製する方法であって、
（ｉ）モノマーＡβ突然変異タンパク質ペプチドを水素結合切断剤に溶解すること、
（ｉｉ）両親媒性物質を加え、混合し、インキュベートすること、
（ｉｉｉ）希釈し、インキュベートすること、ならびに
（ｉｖ）任意選択的に、遠心分離すること、透析により塩および／または両親媒性物質濃度を減少させること、超遠心分離により濃縮することのうちの１つ以上、ならびに
（ｖ）上清を得ること
を含む方法に関する。

【0112】

特定の実施形態によれば、免疫原性産物は、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーである。

【0113】

そのような切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーは、Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを調製する方法であって、（ｄ）オリゴマーをタンパク質分解的に切断するステップをさらに含む方法により得られる。エンドペプチダーゼが優先され、例えば、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、エラスターゼ、パパインおよびエンドプロテイナーゼＧｌｕＣからなる群から選択される酵素を用いる。オリゴマーをタンパク質分解的に切断するのに適する条件は、参照により本明細書に組み込む、例えば、国際公開第２００４／０６７５６１号、国際公開第２００６／０９４７２４号および国際公開第２００７／０６４９１７号に記載されている。本発明の特定の切断型オリゴマーは、サーモリシンの作用により得られるものである。

【0114】

本発明の免疫原性産物は、配列番号１に示すアミノ酸配列Ａβ（１８−３３）と６２．５％以上の同一性を有するＡβアミノ酸配列を含む。したがって、本明細書で述べる免疫原性産物は、アミノ酸配列Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３［配列番号２；Ａβ（１８−３３）］と６２．６％以上、６８．７５％以上、７５％以上、８１．２５以上、８７．５％以上または９３．７５％の同一性を有するＡβアミノ酸配列を含む。

【0115】

「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウまたはセグメントにわたるアミノ酸ごとの２つの配列の近縁性を指す。したがって、同一性は、２つのアミノ酸配列の間の同一性、一致または同等性の程度と定義される。「配列同一性の百分率」は、特定の領域にわたる２つの最適に整列させた配列を比較し、一致した位置の数を得るために同一のアミノ酸が両配列に存在する位置の数を決定し、そのような位置の数を比較しているセグメントにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けることによって計算される。配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁、１９８１年のアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年のアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８５巻、２４４４頁、１９８８年の方法により、および関連アルゴリズムを実行するコンピュータプログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３、１９８９年）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻、３３８９−３４０２頁、１９９７年）、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））により行うことができる。

【0116】

本発明の一実施形態によれば、本発明の免疫原性産物により含まれるアミノ酸配列は、ループ（同義語：ターン）を含む特定の二次構造を特徴とする。ループ（またはターン）は、本明細書で用いているように、少なくとも２つのＣα原子の近距離接近（通常＜７Å）を定義することを意味する。

【0117】

適切なループは、α、β、γおよびπループである。本発明の一実施形態によれば、ループは、βループである。βループは、本明細書で用いているように、ドナーおよびアクセプター残基が３つの残基により分離されている水素結合（複数可）（ｉ→ｉ＋／−３Ｈ結合）を特徴とするループを定義することを意味する。

【0118】

本発明の特定の実施形態によれば、ループは、βヘアピンループである。βヘアピンループは、本明細書で用いているように、ペプチド主鎖の方向が逆であり、側面にある二次構造要素が相互作用する、ループを定義することを意味する。

【0119】

本発明の特定の実施形態によれば、好ましくはβヘアピンループであり得る、ループは、Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７［配列番号１０；Ａβ（２４−２７）］およびＤ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８［配列番号１１；Ａβ（２３−２８）］から選択される配列を含む。

【0120】

特に、本明細書で述べた免疫原性産物のアミノ酸配列は、分子内逆平行βシートを形成する。逆平行βシートは、本明細書で用いているように、一般的にねじれたひだ折れシートを形成する、３つ以上の水素結合により横方向に連結された少なくとも２つのβストランドのアセンブリーを定義することを意味する。βストランドは、ペプチド主鎖がほぼ完全に伸びた一般的に３−１０アミノ酸を含むアミノ酸の連なりである。

【0121】

本発明の関連態様において、本明細書で述べた免疫原性産物は、逆平行βシートを形成するβストランドが、ループ、好ましくは本明細書で定義したβヘアピンループを介して連結されているアミノ酸配列を含む。

【0122】

前記態様の特定の実施形態によれば、Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１［配列番号８；Ａβ（１９−２１）］およびＡ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２［配列番号９；Ａβ（３０−３２）］に対応する産物のアミノ酸配列部分は、逆平行に配向している。

【0123】

突然変異タンパク質Ａβペプチドのオリゴマーはさらに、２つ以上の突然変異タンパク質Ａβペプチドの間の固有の相互作用を特徴とする。

【0124】

本発明の一態様において、本明細書で述べた免疫原性産物は、アミノ酸配列Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９［配列番号３；Ａβ（１８−３９）］と７２％以上、７７％以上、８１％以上、８６％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有するＡβアミノ酸配列を含む。

【0125】

本発明の関連態様において、前記免疫原性産物は、第２のアミノ酸配列Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８（配列番号５）と平行に配向している第１のアミノ酸配列Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８［配列番号５；Ａβ（３４−３８）］を含む。この場合、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＮＨ）、Ｇ^Ａ_３７（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３８（ＮＨ）、Ｌ^Ａ_３４（ＮＨ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＣγＨ_３）からなる群から選択される少なくとも１つの原子対のプロトン間距離は、１．８から６．５オングストロームであり得る。

【0126】

本発明のさらなる関連態様において、前記免疫原性産物は、第２のアミノ酸配列Ｇ^Ｂ_３３Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８Ｖ^Ｂ_３９（配列番号６）と平行に配向している第１のアミノ酸配列Ｇ^Ａ_３３Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８Ｖ^Ａ_３９［配列番号６；Ａβ（３３−３８）］）を含む。この場合、Ｇ^Ａ_３３（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３４（ＮＨ）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＮＨ）、Ｇ^Ａ_３７（ＮＨ）−Ｇ^Ｂ_３８（ＮＨ）、Ｌ^Ａ_３４（ＮＨ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｃ_δＨ_３）、Ｍ^Ａ_３５（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３６（ＣγＨ_３）、Ｇ^Ａ_３８（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３９（ＣγＨ_３）およびＶ^Ａ_３９（ＮＨ）−Ｖ^Ｂ_３９（ＣγＨ_３）からなる群から選択される少なくとも１つの原子対のプロトン間距離は、１．８から６．５オングストロームであり得る。

【0127】

本発明のさらなる関連態様において、前記免疫原性産物は、２つのＡβアミノ酸配列の間の分子間平行βシートを含む。本発明の特定の態様において、前記分子間平行βシートは、第１のアミノ酸配列Ｇ^Ａ_３３Ｌ^Ａ_３４Ｍ^Ａ_３５Ｖ^Ａ_３６Ｇ^Ａ_３７Ｇ^Ａ_３８Ｖ^Ａ_３９［配列番号７；Ａβ（３３−３９）］および第２のアミノ酸配列Ｇ^Ｂ_３３Ｌ^Ｂ_３４Ｍ^Ｂ_３５Ｖ^Ｂ_３６Ｇ^Ｂ_３７Ｇ^Ｂ_３８Ｖ^Ｂ_３９（配列番号７）を含む。この場合、原子対Ｇ^Ａ_３３（ＣＯ）−Ｌ^Ｂ_３４（Ｎ）、Ｌ^Ｂ_３４（ＣＯ）−Ｍ^Ａ_３５（Ｎ）、Ｍ^Ａ_３５（ＣＯ）−Ｖ^Ｂ_３６（Ｎ）、Ｖ^Ｂ_３６（ＣＯ）−Ｇ^Ａ_３７（Ｎ）およびＧ^Ｂ_３７（ＣＯ）−Ｇ^Ａ_３８（Ｎ）は、３．３±０．５Åの距離にあり得る。ＣＯは、主鎖酸素原子を示し、残基のファイ（φ）角度は、−１８０から−３０の範囲にあり、残基のプサイ（ψ）角度は、約６０から１８０までまたは約−１８０から−１５０までの範囲にある。

【0128】

逆平行βシートの構造を定めるプロトン間距離は、主鎖アミド間ならびに主鎖アミドおよび側鎖間の分子内核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）により決定することができる。

【0129】

平行βシートの構造を定めるプロトン間距離は、主鎖ＮＨ−ＮＨ間ならびに主鎖ＮＨおよび側鎖のメチル基間の分子間ＮＯＥにより決定することができる。

【0130】

分子内ＮＯＥと分子間ＮＯＥは、例えば、参照により本明細書に組み込む、国際公開第２００７／０６４９１７号、とりわけ実施例Ｖ、ｐａｒｔ Ｇ、ＮＭＲ図に記載されているように、異なる同位体標識試料を用いて区別することができる。

【0131】

ＮＭＲデータの解析によるＮＯＥ由来の距離拘束を用いて、例えば、模擬アニーリングプロトコール［Ｍ．Ｎｉｌｇｅｓら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２９巻、３１７−３２４頁、（１９８８年）］を用いることによりプログラムＣＮＸ［Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４（Ｐｔ５）、９０５−２１頁、（１９９８年）］を用いて構造を計算し、それにより、さらに２つの原子間の分子内および／または分子間距離を得ることができる。

【0132】

本発明の一態様において、本明細書で述べた免疫原性産物は、アミノ酸配列Ｖ_１２Ｈ_１３Ｈ_１４Ｑ_１５Ｋ_１６Ｌ_１７Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３Ｌ_３４Ｍ_３５Ｖ_３６Ｇ_３７Ｇ_３８Ｖ_３９［配列番号４；Ａβ（１２−３９）］の一部（Ｘ−Ｙ）と６２．５％以上、６４％以上、６７％以上、７１％以上、７５％以上、７８％以上、８２％以上、８５％以上、８９％以上、９２％以上または９６％以上の同一性を有するＡβアミノ酸配列を含み、Ｘは、数１２．．１８からなる群から選択され、Ｙは、数３３．．３９からなる群から選択される。

【0133】

本発明の関連態様において、前記アミノ酸配列の少なくとも２つの非隣接残基は、例えば、直接共有結合によりまたはリンカーを介して互いに共有結合している。特に、［配列番号４の残基２−１２；Ａβ（１２−３９）］のＶ_１２、Ｈ_１３、Ｈ_１４、Ｑ_１５、Ｋ_１６、Ｌ_１７、Ｖ_１８、Ｆ_１９、Ｆ_２０、Ａ_２１、Ｅ_２２またはＤ_２３に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つおよび［配列番号４の残基１７−２８；Ａβ（１２−３９）］のＫ_２８、Ｇ_２９、Ａ_３０、Ｉ_３１、Ｉ_３２、Ｇ_３３、Ｌ_３４、Ｍ_３５、Ｖ_３６、Ｇ_３７、Ｇ_３８、Ｖ_３９に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つが互いに共有結合している。

【0134】

２つのアミノ酸残基の間の共有結合は、当技術分野で周知の様々な手段により、例えば、ジスルフィド架橋形成またはクロスリンク技術により確立することができる。とりわけ、アミノ酸残基の側鎖を互いに結合させることができる。とりわけ官能基、例えば、チオール、アミノ、カルボキシルまたはヒドロキシル基を有する側鎖は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基のように、直接的に、またはリンカーを介して間接的に互いに結合させることができる。したがって、他のアミノ酸残基に共有結合するアミノ酸残基は、とりわけシステイン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸残基であり得る。

【0135】

タンパク質のクロスリンク結合は、長く、網羅的歴史を有し、大量の文献先例がある。特異的な共有結合性クロスリンクが天然または非天然アミノ酸側鎖間に作製されることを可能にする当業者に公知のあらゆる方法論は、本発明で想定される位置特異的クロスリンクを形成するために用いることができる。この方法論のいくつかの例を下に示す。

【0136】

当業者に公知である多数の化学クロスリンク剤が存在する。本発明のために、好ましいクロスリンク剤は、ホモ二官能性およびヘテロ二官能性クロスリンク剤を含み、段階的にアミノ酸を連結する適切性のためヘテロ二官能性クロスリンク剤が好ましい。

【0137】

また、ヘテロ二官能性クロスリンク剤は、より特異的結合を確立し、それにより、望ましくない副反応の発生を低減させる能力を備えている。

【0138】

様々なヘテロ二官能性クロスリンク剤が当技術分野で公知である。

【0139】

これらは、２つのアミノ（−ＮＨ_２）基、１つのアミノおよび１つのチオール（もしくはスルフヒドリル、すなわち、−ＳＨ）基または２つのチオール基間の結合を形成するためのヘテロ二官能性クロスリンク剤を含む。

【0140】

ヘテロ二官能性クロスリンク剤の一部として有用な１つの反応性基は、アミン反応性基である。一般的なアミン反応性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む。ＮＨＳエステルは、わずかに酸性から中性（ｐＨ６．５−７．５）条件下で遊離アミン（例えば、リシン残基）と数分で特異的に反応する。

【0141】

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有するクロスリンク剤は、一般的により大きい水溶解度を有する、それらのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体の形でも用いることもできることを注目されたい。

【0142】

ヘテロ二官能性クロスリンク剤の一部として有用な別の反応性基は、チオール反応性基である。一般的なチオール反応性基は、マレイミド、ハロゲンおよびピリジルジスルフィドを含む。マレイミドは、好ましくはわずかに酸性から中性（ｐＨ６．５−７．５）条件下で、遊離チオール基（例えば、システイン残基における）と数分で特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル官能基）は、−ＳＨ基と生理的ｐＨで反応する。これらの反応性基の両方は、安定なチオエーテル結合の形成をもたらす。

【0143】

例えば、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはスルホ−ＳＭＣＣは、例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと例えば、Ｃｙｓ側鎖の遊離−ＳＨとの間のクロスリンクを形成するために用いることができる。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のアミノ基）と反応して、安定なアミド結合を形成する。得られるマレイミド活性化ペプチドは、次に同じペプチドのスルフヒドリル基（例えば、Ｃｙｓ残基のそれ）と反応して、ジスルフィド結合を形成し、それにより共有結合を確立する。この化学は、文献に十分に記載されている。例えば、以下を参照のこと。Ｕｔｏ Ｉ．ら（１９９１年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１３８巻、８７−９４頁；Ｂｉｅｎｉａｒｚ Ｃ．ら（１９９６年）、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｌｅｎｇｔｈ Ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、７巻、８８−９５頁；Ｃｈｒｉｓｅｙ Ｌ．Ａ．ら（１９９６年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４巻（１５号）、３０３１−３０３９頁；Ｋｕｉｊｐｅｒｓ Ｗ．Ｈ．ら（１９９３年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、４巻（１号）、９４−１０２頁；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ Ｍ．Ａ．（１９９２年）、Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｙｅｓ、ｈａｐｔｅｎｓ ａｎｄ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、３巻、２−１３頁；Ｈａｓｈｉｄａ Ｓ．ら（１９８４年）、Ｍｏｒｅ ｕｓｅｆｕｌ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆａｂ ｔｏ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｉｏｌ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｎｇｅ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６巻、５６−６３頁；Ｍａｔｔｓｏｎ Ｇ．ら（１９９３年）、Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ、１７巻、１６７−１８３頁；Ｐａｒｔｉｓ Ｍ．Ｄ．（１９８３年）、Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｏｍｅｇａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ａｌｋａｎｏｙｌ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒｓ、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｃｈｅｍ．、２巻、２６３−２７７頁；Ｓａｍｏｓｚｕｋ Ｍ．Ｋ．ら（１９８９年）、Ａ ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔｏ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２巻、３７−４５頁；Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ Ｓ．ら（１９８２年）、Ｍｉｌｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔ Ｆａｂ ａｎｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９２巻、１４１３−１４２４頁。

【0144】

さらなるヘテロ二官能性クロスリンク剤、例えば、［Ｎ−ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル、Ｎ−［κ−マレイミドウンデカノイルオキシ］スクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）またはそれらのスルホスクシンイミド類似体（例えば、スルホ−ＭＢＳ）を同様な方法で用いることができる。

【0145】

例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと例えば、Ｃｙｓ側鎖の遊離−ＳＨとの間のクロスリンクを形成するために用いることができるヘテロ二官能性クロスリンク剤のさらなる例は、スクシンイミジル−６−［（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）−ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）またはスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰである。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、安定なアミド結合を形成する。得られるペプチドは、次に同じペプチドのスルフヒドリル基（例えば、Ｃｙｓ残基のそれ）と反応して、ジスルフィド結合を形成し、それにより共有結合を確立するピリジルジスルフィド基を有する。この化学は、文献に十分に記載されている。例えば、以下を参照のこと。Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ．ら（１９７８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１７３巻、７２３−７３７頁；Ｓｔａｎ Ｒ．Ｖ．（２００４年）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２８６巻、Ｈ１３４７−Ｈ１３５３頁；Ｍａｄｅｒ Ｃ．ら（２００４年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８６巻、１７５８−１７６８頁。

【0146】

さらなるヘテロ二官能性クロスリンク剤、例えば、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）またはスルホ−ＳＭＰＴ、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはスルホ−ＳＰＤＰを同様な方法で用いることができる。

【0147】

例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと例えば、Ｃｙｓ側鎖の遊離−ＳＨとの間のクロスリンクを形成するために用いることができるヘテロ二官能性クロスリンク剤のさらなる例は、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）またはスルホ−ＳＡＴＡである。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、安定なアミド結合を形成する。得られるペプチドの保護−ＳＨ基は、次にヒドロキシルアミンによる処理により脱保護され、得られる遊離−ＳＨは、次に同じペプチドのスルフヒドリル基（例えば、Ｃｙｓ残基のそれ）と反応して、ジスルフィド結合を形成し、それにより共有結合を確立する。

【0148】

さらなるヘテロ二官能性クロスリンク剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネートまたはそのスルホスクシンイミド類似体を同様な方法で用いることができる。

【0149】

さらなる適切なヘテロ二官能性クロスリンク剤は、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）またはスルホ−ＳＩＡＢを含む。

【0150】

特異的で、段階的なクロスリンクもアミノ（−ＮＨ_２）およびカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基間に形成させることができる。

【0151】

例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）は、例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと酸側鎖の遊離ＣＯＯＨとのクロスリンクを形成するために用いることができる。カルボキシ反応性カルボジイミドは、カルボキシ基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｄａｂ（２，４−ジアミノ酪酸）、Ｄａｐ（２，４−ジアミノプロピオン酸）またはオルニチン残基のそれ）と反応して、不安定ｏ−アシルイソ尿素エステルを生成する。反応性ｏ−アシルイソ尿素エステルは、次に同じペプチドのアミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、アミド結合を形成し、それにより共有結合を確立する。あるいは、反応性ｏ−アシルイソ尿素エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドと反応させて、準安定性アミン反応性ＮＨＳエステルを得ることができ、これは、次に同じペプチドのアミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、アミド結合を形成し、それにより共有結合を確立する。この化学は、文献に十分に記載されている。例えば、以下を参照のこと。ＤｅＳｉｌｖａ Ｎ．Ｓ．（２００３年）、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｗｉｔｈ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９巻、７５７−７７０頁；Ｇｒａｂａｒｅｋ Ｚ．およびＧｅｒｇｅｌｙ、Ｊ．（１９９０年）、Ｚｅｒｏｌｅｎｇｔｈ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｅｓｔｅｒｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１８５巻、１３１−１３５頁；Ｓｉｎｚ Ａ．（２００３年）、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ．、３８巻、１２２５−１２３７頁；Ｓｔａｒｏｓ Ｊ．Ｖ．、Ｗｒｉｇｈｔ Ｒ．Ｗ．およびＳｗｉｎｇｌｅ Ｄ．Ｍ．（１９８６年）、Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｂｙ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５６巻、２２０−２２２頁；Ｔａｎｉｕｃｈｉ Ｍ．ら（１９８６年）、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ Ｓｃｈｗａｎｎ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ａｘｏｔｏｍｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３巻、４０９４−４０９８頁。

【0152】

ヘテロ二官能性クロスリンク剤は、Ｌｙｓ（Ｎ３）およびプロパギルグリシンアミノ酸の反応も含む。この反応は、溶液中または樹脂上で行わせることができる（例えば、Ｊｉａｎｇ Ｓ．、（２００８年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１２巻、１５０２−１５４２頁およびその中における参考文献に記載されているように）。

【0153】

特定のクラスのクロスリンク剤、とりわけヘテロ二官能性クロスリンク剤は、光反応性クロスリンク剤を含む。

【0154】

例えば、（ＳＤＡ）は、例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと例えば、別のＬｙｓ側鎖のアミンとの間のクロスリンクを形成するために用いることができる。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、安定なアミド結合を形成する。得られるペプチドは、ＵＶ光への曝露により、同じペプチドのアミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、安定な結合を形成し、それにより共有結合を確立する、感光性ジアジリン部分を有する。

【0155】

さらなる適切な光反応性クロスリンク剤は。ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）−エチル］−ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）およびＮ−スクシンイミジル−６−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）−ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）を含む。

【0156】

ヘテロ二官能性クロスリンク剤に加えて、ホモ二官能性クロスリンク剤を含むいくつかの他のクロスリンク剤が存在する。

【0157】

これらは、２つのアミノ（−ＮＨ_２）基の間の結合を形成するためのホモ二官能性クロスリンク剤を含む。

【0158】

例えば、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）は、例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミンと例えば、別のＬｙｓ側鎖のアミンとの間のクロスリンクを形成するために用いることができる。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、安定なアミド基を形成する。得られるペプチドは、次に同じペプチドの別のアミノ基（例えば、Ｌｙｓ残基のそれ）と反応して、さらなる安定なアミド基を形成し、それにより共有結合を確立する。

【0159】

さらなる適切なホモ二官能性クロスリンク剤は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）およびピメルイミド酸ジメチル（ＤＭＰ）を含む。

【0160】

さらなる適切なホモ二官能性クロスリンク剤は、２つのシステイン間のメチレンジチオエーテル結合を含む。ペプチドとＴＢＡＦ（テトラブチルアンモニウムフルオリド）との反応は、部分的に脱保護されたペプチドを含有する樹脂上で行わせ、その後、切断することができる（例えば、Ｕｅｋｉら、（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、９巻、１７６７−１７７２頁およびＵｅｋｉら、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９、５３９−５４１頁を参照）。

【0161】

さらなる適切なホモ二官能性クロスリンクシステムは、アリルグリシン（例えば、Ｗｅｌｓ Ｂ．ら、（２００５年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１３巻、４２２１−４２２７頁参照）または修飾アミノ酸、例えば、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−α（２’ペンテニル）アラニン（例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ Ｌ．Ｄ．ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５巻、１４６６−１４７０頁；Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ Ｃ．Ｅ．ら、（２０００年）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２巻、５８９１−５８９２頁；Ｑｉｕ Ｗ．ら、（２０００年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６巻、２５７７−２５８２頁；Ｂｅｌｏｋｏｎ Ｙ．Ｎ．ら、（１９９８年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、９巻、４２４９−４２５２頁；Ｑｉｕ Ｗ．、（２００８年）Ａｎａｓｐｅｃ ｐｏｓｔｅｒ ａｔ ２０ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇを参照）の間の閉環メタセシス反応を含む。これらの反応は、それぞれ保護ペプチド断片上または樹脂上で、溶液中で行わせることができる。

【0162】

ホモおよびヘテロ二官能性クロスリンク剤は、スペーサーアームまたは架橋を含み得る。架橋は、２つの反応性末端を連結する構造である。架橋の最も明らかな特性は、立体障害に対するその効果である。いくつかの場合に、より長い架橋は、２つのアミノ酸残基を連結するのに必要な距離により容易に橋架けすることができる。

【0163】

２つの非隣接アミノ酸残基の間の１つの共有結合は、十分な安定化をもたらし得るが、本発明の免疫原性産物は、２つ以上の共有結合を含み得る。

【0164】

結合が形成することを可能にする条件は、当然、形成する結合の種類に依存し、当業者により容易に決定され得る。本明細書に示す結合およびそれらの化学の説明に言及する。

【0165】

本発明の免疫原性産物が所望の二次構造を有することを保証するためにオリゴマーおよび結合の形成を独立に用いることができる。したがって、本発明は、そのような結合を含むＡβ突然変異タンパク質オリゴマーおよびそのような結合を有するモノマーＡβ突然変異タンパク質ペプチドを提供する。

【0166】

さらに、本発明の免疫原性産物が所望の二次構造を有することを保証するためにオリゴマーおよび結合の形成を用いることができる。例えば、結合形成は、適切なオリゴマー形成を促進する助けとなり、また逆の場合も同様であり得る。

【0167】

原則として、オリゴマー形成が結合形成に先行し得る。あらかじめ形成されたオリゴマーが、結合が形成されることを誘導または促進する場合、これは、有利である。あるいは、結合形成がオリゴマー形成に先行し得る。あらかじめ形成された結合がオリゴマー形成を誘導または促進する場合、これは、有利である。オリゴマー形成および結合形成は、同時にも起こり得る。

【0168】

Ａβ突然変異タンパク質ペプチドおよびオリゴマーの両方は、最終免疫原性産物により含まれるアミノ酸配列と異なるペプチドを用いて調製することができる。例えば、出発ペプチドは、その後、合成中に例えば、タンパク質分解的切断により除去されるそのＣおよび／またはＮ末端における付加的なアミノ酸を含み得る。

【0169】

本発明の一実施形態において、オリゴマーは、ペプチドにより形成され、その後１つ以上のペプチド内共有結合（複数可）により安定化される。

【0170】

本発明の別の実施形態において、オリゴマーは、ペプチドにより形成され、１つ以上のペプチド内共有結合（複数可）により安定化され、その後化学的または酵素的手段によって関連構造要素をより十分に示す切断型に処理される。あるいは、オリゴマーは、ペプチドにより形成され、化学的または酵素的手段によって関連構造要素をより十分に示す切断型に処理され、その後、１つ以上のペプチド内共有結合（複数可）により安定化される。

【0171】

本発明のさらなる別の実施形態において、ペプチドを用いて、関連構造要素を形成する。ここで、ペプチドは、オリゴマーにおける隣接するペプチドとの相互作用によるのではなく、１つ以上のペプチド内共有結合によって適切な立体配座に保持されることとなる。適切なペプチド内共有結合（複数可）により安定化された、これらの免疫原性産物は、関連構造要素をモノマーとして示すことが想定される。

【0172】

「Ａβ突然変異タンパク質」という用語は、本明細書で用いているように、１つ以上のアミノ酸置換によりヒトアミロイドベータ（Ａβ）タンパク質と異なる変異型Ａβポリペプチドを指す。とりわけ、Ａβ突然変異タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の点突然変異により配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドと異なるＡβである。前記点突然変異は、好ましくはＡβ（１８−３３）、Ａβ（１８−２５）、Ａβ（１９−２４）内、最も好ましくはＡβ（２０−２２）内のホットスポットに位置する。

【0173】

本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列に存在し得る例示的なアミノ酸置換を表１に要約する。

【0174】

【表1】

【0175】

本発明の一態様において、本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されていることにより配列番号２に示すアミノ酸配列と異なっているＡβ（１８−３３）の変異体である。前記アミノ酸置換は、表１に示す点突然変異から選択することができる。例えば、本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列が２つのアミノ酸置換を有することにより配列番号２のアミノ酸配列と異なっている場合、これらのアミノ酸置換の１つまたは両方を表１に示す点突然変異から選択することができる。前記２つのアミノ酸置換は、好ましくは配列２のアミノ酸位置Ｅ２２／Ｇ２５、Ｆ２０／Ｅ２２、Ｆ２０／Ｉ３１、Ａ２１／Ｅ２２、Ａ２１／Ｄ２３およびＥ２２／Ｓ２６に対応するホットスポットに、とりわけアミノ酸位置Ｅ２２／Ｇ２５およびＦ２０／Ｅ２２に対応するホットスポット存在する。本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列が３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸置換を有することにより配列番号２のアミノ酸配列と異なっている場合、これらのアミノ酸置換の１つ、２つ以上またはすべてを表１に示す点突然変異から選択することができる。

【0176】

本発明の特定の実施形態において、本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列は、Ｅ２２ＡおよびＥ２２Ｖから選択される１つのアミノ酸置換を有することにより配列番号２のアミノ酸配列と異なっている。

【0177】

本発明のさらなる特定の実施形態において、本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列は、二重突然変異Ｆ２０Ｇ／Ｅ２２ＡおよびＥ２２Ａ／Ｇ２５Ａから選択される２つのアミノ酸置換を有することにより配列番号２のアミノ酸配列と異なっている。

【0178】

本発明の関連態様において、本明細書で述べた免疫原性産物により含まれるＡβアミノ酸配列は、異なるアミノ酸によって置換されている１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸によりアミノ酸配列Ｖ_１８Ｆ_１９Ｆ_２０Ａ_２１Ｅ_２２Ｄ_２３Ｖ_２４Ｇ_２５Ｓ_２６Ｎ_２７Ｋ_２８Ｇ_２９Ａ_３０Ｉ_３１Ｉ_３２Ｇ_３３（配列番号２；Ａβ（１８−３３））と異なっている。前記アミノ酸配列の例は、
Ｖ_１８に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ｆ_１９に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、アラニン、グリシン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、
Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、
Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択され、
Ｄ_２３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択され、
Ｖ_２４に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ｇ_２５に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｓ_２６に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンからなる群から選択され、
Ｎ_２７に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｋ_２８に対応するアミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択され、
Ｇ_２９に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択され、
Ａ_３０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択され、
Ｉ_３１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ｉ_３２に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ｇ_３３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびプロリンからなる群から選択され、
Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシンおよびロイシンからなる群から選択され、
Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、グリシンであり、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニンであり、
Ｆ_２０に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンからなる群から選択され、Ｉ_３１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、
Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシンおよびロイシンからなる群から選択され、
Ａ_２１に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、Ｄ_２３に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニンおよびグルタミンからなる群から選択され、
Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｇ_２５に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｅ_２２に対応するアミノ酸が、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、システイン、アスパラギン、セリン、トレオニン、プロリンおよびグルタミンからなる群から選択され、Ｓ_２６に対応するアミノ酸が、ヒスチジン、アルギニン、リシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンからなる群から選択される
アミノ酸配列を含む。

【0179】

より具体的には、本発明の免疫原性産物は、

【0180】

【化3】

からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部（Ｘ−Ｙ）と同一であるアミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列を含み、Ｘは、数１．．１８、４．．１８、１２．．１８からなる群から選択されまたは１８であり、Ｙは、数３３．．４３、３３．．４２、３３．．４１または３３．．４０からなる群から選択される。特定の実施形態において、（Ｘ−Ｙ）は、（１−４２）、（４−４２）、（１２−４２）または（１８−４２）からなる群から選択される。

【0181】

本発明の免疫原性産物は、とりわけ、上で定義した複数の特定のアミロイドβ（Ａβ）アミノ酸配列を含むオリゴマーである。

【0182】

本発明はまた、本発明の精製免疫原性産物に関する。本発明の一実施形態によれば、精製免疫原性産物は、総Ａβペプチドの８０重量％を超える、好ましくは総Ａβペプチドの９０重量％を超える、好ましくは総Ａβペプチドの９５重量％を超える純度を有するものである。

【0183】

本発明の免疫原性産物は、アミロイドβ由来のアミノ酸配列に加えて、１つ以上のさらなる部分を含むことが好都合であり得る。例えば、診断応用は、免疫原性産物を標識することを必要とし得る。また、能動免疫において、能動免疫応用において好都合であることがわかっている部分を結合させることは、有利であり得る。

【0184】

したがって、本発明はまた、検出を促進する共有結合した基、好ましくは蛍光色素分子、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、Ａｌｅｘａ−４８８、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）蛍光タンパク質、ダイナンギンボ属（Ｄｉｃｔｙｏｓｏｍａ）蛍光タンパク質またはいずれかの組合せもしくはその蛍光活性誘導体；発色団；化学発光団、例えば、ルシフェラーゼ、好ましくはホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）ルシフェラーゼまたはいずれかの組合せもしくはその蛍光活性誘導体；酵素的に活性な基、例えば、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはそのあらゆる酵素的に活性な誘導体；高電子密度基、例えば、重金属含有基、例えば、金含有基；ハプテン、例えば、フェノール由来ハプテン；強抗原性構造、例えば、抗原性であると予測されるペプチド配列、例えば、ＫｏｌａｓｋａｒおよびＴｏｎｇａｏｎｋａｒのアルゴリズムにより抗原性であると予測される；免疫原性産物に対する免疫応答を誘発することを促進する分子、例えば、血清アルブミン、オボアルブミン、スカシガイヘモシアニン、サイログロブリン、破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドのような細菌由来のトキソイド、天然に存在するＴ細胞エピトープ、天然に存在するＴヘルパー細胞エピトープ；ｐａｎ ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」；国際公開第９５／０７７０７号）のような人工Ｔ細胞エピトープまたは別の免疫刺激作用物、例えば、マンナン、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステインおよび同類のもの；別の分子に対するアプタマー；キレート基、例えば、ヘキサヒスチジニル；さらなる特異的タンパク質間相互作用を媒介する天然または天然由来タンパク質構造、例えば、ｆｏｓ／ｊｕｎ対のメンバー；磁性基、例えば、強磁性基；または放射性基、例えば、１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉまたはそのいずれかの組合せを含む基を含む、本明細書で定義した、免疫原性産物に関する。不都合な炎症誘発免疫応答Ｔｈ１経路を避けることを視野に入れて、抗炎症経路（Ｔｈ２経路）に対する免疫応答を誘導することができる分子、例えば、ＰＡＤＲＥのようなＢ細胞エピトープを含む分子を含む免疫原性産物は、能動免疫における特別な利点をもたらすと予想される（Ｐｅｔｒｕｓｈｉｎａ Ｉ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００７年、２７巻（４６号）、１２７２１−１２７３１頁、Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ Ａ．ら、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ、２００７年、２４巻（２号）１０７−１１９頁も参照）。

【0185】

そのような基およびそれらを免疫原性産物に結合させる方法は、当技術分野で公知である。

【0186】

本発明の免疫原性産物は、多くの有用性を有する。例えば、それらは、１）免疫化に基づく介入療法（例えば、免疫原性産物は、アミロイド症を治療または防止するための能動免疫に使用することができる。）、２）診断検査（例えば、免疫原性産物は、アミロイド症を診断するために用いることができる。）、３）免疫原性産物に結合する抗体およびアプタマーのような作用物を得ること、ならびに４）免疫原性産物に結合する抗体およびアプタマーのような作用物を開発するための結晶学またはＮＭＲに基づく構造ベースの設計研究に用いることができる。

【0187】

能動免疫において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、アルツハイマー病トランスジェニックマウスにおける認知障害を反転させるのに有効であることが示された。本発明の免疫原性産物は、そのプロファイルがＡβ（２０−４２）グロブロマーにより誘導される免疫応答のプロファイルと同様である免疫応答を誘導することができる。

【0188】

したがって、本発明はまた、治療用の本明細書で定義した免疫原性産物に関する。

【0189】

一態様において、本発明は、本明細書で開示した免疫原性産物を含む組成物、とりわけ、ワクチンである、すなわち、能動免疫に用いることができる組成物に関する。特定の実施形態によれば、前記組成物は、医薬として許容される担体をさらに含む医薬組成物である。組成物は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）またはアルミニウム塩を含むアジュバントのような医薬として許容されるアジュバントをさらに含み得る。

【0190】

本発明はまた、有効量の本明細書で開示した免疫原性産物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるアミロイド症を治療または防止する方法に関する。好ましくは、該産物は、能動免疫用である。

【0191】

関連態様において、本発明は、アミロイド症を治療または防止するのに、またとりわけ能動免疫のために使用する本明細書で開示した免疫原性産物に関する。

【0192】

ここにおける「アミロイド症」という用語は、身体の種々の組織における特定のタンパク質（アミロイド、線維状タンパク質およびそれらの前駆体）の異常なフォールディング、クランピング、凝集および／または蓄積を特徴とするいくつかの障害を意味する。アルツハイマー病およびダウン症候群では、神経組織が侵され、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）では、血管が侵される。本発明の特定の実施形態によれば、アミロイド症は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびダウン症候群のアミロイド症からなる群から選択される。

【0193】

能動免疫に関連して、免疫原性産物が患者のＣＮＳにかなりの量で入ることができないならば、それはとりわけ好ましい。

【0194】

免疫原性産物を含む医薬組成物がＡβオリゴマーに対する強い免疫反応、好ましくはＡβオリゴマーのみに対する強い免疫反応、より好ましくはＡβオリゴマーのみに対する強い非炎症性抗体ベースの免疫反応を誘導することができるならば、それもとりわけ好ましい。したがって、本発明の一実施形態において、医薬組成物は、免疫学的アジュバント、好ましくは免疫反応を非炎症性で、抗体ベースの型に向けて導くアジュバントおよびシグナル伝達分子、例えば、サイトカインを含む。そのようなアジュバントおよびシグナル伝達分子は、当業者に周知である。

【0195】

能動免疫用の医薬組成物が静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、鼻腔内経路および吸入からなる群から選択される経路を経て投与されるならば、それはとりわけ好ましい。組成物が、それぞれが１回、反復してまたは定期的に実施され得る、注射、ボーラス注入および連続注入から選択される方法により投与されるならば、それもとりわけ好ましい。

【0196】

本発明の特定の実施形態において、長期連続注入は、埋め込み型装置を用いることによって達成される。本発明のさらなる特定の実施形態において、組成物は、埋め込み型持続放出または制御放出デポ製剤として適用される。適切な製剤および装置は、当業者に公知である。任意の所定の経路に用いられる方法の詳細は、対象の疾患の病期および重症度ならびに総合医療パラメーターに依存し、好ましくは主治医または獣医の裁量で個別に決定される。

【0197】

本発明のとりわけ好ましい実施形態において、能動免疫用の医薬組成物は、医薬として許容される保存剤、医薬として許容される着色剤、医薬として許容される保護コロイド、医薬として許容されるｐＨ調整剤および医薬として許容される浸透圧調節剤からなる群から選択される１つ以上の作用物を含む。そのような作用物は、当技術分野で記載されている。

【0198】

本明細書で用いているように、「有効量」という用語は、障害の重症度および／もしくは持続期間もしくはその１つ以上の症状を低減もしくは改善するのに、障害の進展を防止するのに、障害の退行をもたらすのに、障害に伴う１つ以上の症状の再発、発現、発症もしくは進行を防止するのに、障害を検出するのに、または別の療法（例えば、予防もしくは治療剤）の予防もしくは治療効果（複数可）を増強もしくは改善するのに十分である療法の量を指す。

【0199】

グロブロマー仮説に沿って、アミロイド症に罹患している対象は、内因性グロブロマーエピトープに対する免疫反応を発現すると考えられる。本発明の免疫原性産物は、前記エピトープと特異的に反応性である抗体と反応するので、オリゴマーは、同一である、または非常に類似したエピトープを示すと考えられる。

【0200】

したがって、本発明はまた、診断用の本明細書で定義した免疫原性産物に関する。

【0201】

一態様において、本発明は、アミロイド症を有すると疑われる対象からの試料を準備すること、試料を本明細書で開示した免疫原性産物と、該産物および抗体を含む複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させることを含み、複合体の存在が、対象がアミロイド症を有することを示す、アミロイド症を診断する方法に関する。特定の実施形態によれば、少なくとも試料を接触させるステップは、エクスビボで、とりわけインビトロで行う。

【0202】

関連実施態様において、本発明は、アミロイド症を診断するのに用いる本明細書で開示した免疫原性産物に関する。

【0203】

したがって、本発明の免疫原性産物は、様々な診断方法およびアッセイに用いることができる。

【0204】

一実施形態において、この疾患を有すると疑われた患者におけるアミロイド症を診断する方法は、ａ）患者からの生体試料を単離するステップ、ｂ）生体試料を本発明の免疫原性産物と、抗体／産物複合体の形成に十分な時間および条件下で接触させるステップ、ｃ）得られた抗体／産物複合体にコンジュゲートを加え、コンジュゲートが結合抗体に結合することを可能にするのに十分な時間および条件下で置くステップであって、コンジュゲートが、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル発生化合物に結合した抗体を含む、ステップ、ならびにｄ）シグナル発生化合物により発生されるシグナルを検出することによって生体試料に存在し得る抗体の存在を検出するステップを含み、シグナルは、患者におけるアミロイド症の診断を示す。特定の実施形態によれば、ステップｂ）、ｃ）およびｄ）の少なくとも１つは、エクスビボで、とりわけインビトロで行う。さらなる特定の実施形態によれば、方法は、ステップａ）を含まない。

【0205】

さらなる実施形態によれば、この疾患を有すると疑われた患者におけるアミロイド症を診断する方法は、ａ）患者からの生体試料を単離するステップ、ｂ）生体試料を試料中の抗体に対して特異的な抗抗体と、抗抗体／抗体複合体の形成を可能にするのに十分な時間および条件下で接触させるステップ、ｃ）得られた抗抗体／抗体複合体にコンジュゲートを加え、コンジュゲートが結合抗体に結合することを可能にするのに十分な時間および条件下で置くステップであって、コンジュゲートが、検出可能なシグナルを発生することができるシグナル発生化合物に結合した本発明の免疫原性産物を含む、ステップ、ならびにｄ）シグナル発生化合物により発生されるシグナルを検出するステップを含み、シグナルは、患者におけるアミロイド症の診断を示す。特定の実施形態によれば、前記ステップｂ）およびｃ）の少なくとも１つは、エクスビボで、とりわけインビトロで行う。さらなる特定の実施形態によれば、方法は、ステップａ）を含まない。

【0206】

より具体的には、本発明の免疫原性産物は、グロブロマーエピトープを示し、グロブロマーエピトープは、内因性免疫反応を生じさせる内因性抗体であると考えられるので、アミロイド症の診断は、本発明の免疫原性産物に特異的に結合する自己抗体の存在の判定に関連付けることができる。

【0207】

したがって、本発明はまた、免疫原性産物に結合する自己抗体を対象において検出するための組成物を調製するための本明細書で定義した免疫原性産物の使用に関する。したがって、本発明はまた、対象における自己抗体を検出する方法であって、対象に本明細書で定義した免疫原性産物を投与し、抗体および免疫原性産物により形成される複合体を検出することを含み、複合体の存在が自己抗体の存在を示す、方法に関する。特定の実施形態によれば、少なくとも試料を接触させるステップは、エクスビボで、とりわけインビトロで行う。本発明の特定の実施形態において、対象は、いずれかの形のアミロイド症、例えば、アルツハイマー病を有すると疑われ、自己抗体を検出することは、対象におけるいずれかの形のアミロイド症、例えば、アルツハイマー病の存在または非存在を診断するためである。

【0208】

「試料」という用語は、本明細書で用いているように、その最も広い意味で用いられる。「生体試料」は、本明細書で用いているように、生物または以前に生存していたものからの任意の量の物質を含むが、それに限定されない。そのような生物は、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の動物を含むが、それらに限定されない。そのような物質は、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓を含むが、それらに限定されない。

【0209】

適切な試料は、特に、本明細書で述べる方法で試験することができる生体液を含む。これらは、血漿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液または組織および細胞の水性もしくは有機水性抽出液を含む。

【0210】

アミロイド症を有すると疑われる対象がアミロイド症を有するまたはアミロイド症になる高いリスクを有する対象であるならば、それはとりわけ好ましい。

【0211】

本発明の特定の実施形態によれば、本明細書で述べた自己抗体を検出することは、自己抗体／抗原複合体の解離をもたらす調製物（試料）の前処理をさらに含む。抗原に依然として結合し得る自己抗体の量を決定するために前記前処理を含まない方法を用いることができるが、そのような前処理を含む方法は、したがって、調製物（試料）に存在する自己抗体の総量を決定するために用いることができる。さらに、両方法は、複合体化自己抗体の量を間接的に決定することを可能にする。

【0212】

自己抗体／抗原複合体の解離を誘発するのに適する条件は、当業者に公知である。例えば、例えば、得られる調製物（試料）のｐＨが１から５の範囲、好ましくは２から４の範囲、とりわけ２から３の範囲にあるような緩衝液を用いて、調製物（試料）を酸で処理することが好都合であり得る。適切な緩衝液は、生理的濃度の塩、例えば、ＮａＣｌおよび酢酸を含む。抗体／抗原複合体の分離の方法は、その全体を本明細書に組み込む、国際公開第２００５／０３７２０９号に記載された。

【0213】

手短に述べると、抗体／抗原複合体における抗原から抗体を解離することは、抗体／抗原複合体を含有する試料を解離緩衝液と接触させるステップ、試料をインキュベートするステップ、および試料を任意選択的に濃縮するステップを含む。

【0214】

解離緩衝液は、本明細書で示した範囲のｐＨを有するＰＢＳ緩衝液であり得る。例えば、約１．５％ＢＳＡおよび０．２Ｍグリシン−アセテートｐＨ２．５または１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５８％酢酸を含有するＰＢＳ緩衝液が適切である。

【0215】

２０から４０℃の範囲の温度における例えば、１０から３０、例えば、２０分間のような数分間のインキュベーションが十分であることがわかった。

【0216】

濃縮は、それ自体が公知の方法で、例えば、試料をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ３０（Ａｍｉｎｃｏｎ Ｉｎｃ．）上に通すことによって達成することができる。

【0217】

本発明の一実施形態において、本発明の免疫原性産物を固相上に被覆する。次いで試料（例えば、全血、脳脊髄液、血清等）を固相と接触させる。抗体、例えば、自己抗体が試料中に存在する場合、そのような抗体は、固相上の免疫原性産物に結合し、次いで直接的または間接的方法により検出される。直接的方法は、複合体自体の存在、ひいては抗体の存在を単に検出することを含む。間接的方法において、コンジュゲートを結合抗体に加える。コンジュゲートは、シグナル発生化合物または標識に結合させた、一次結合抗体に結合する、二次抗体を含む。二次抗体が、結合一次抗体に結合した場合、シグナル発生化合物は、測定可能シグナルを発生する。そのようなシグナルは、試料中の一次抗体の存在を示す。

【0218】

診断イムノアッセイに用いられる固相の例は、多孔性および非多孔性材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウエルおよびプラスチックチューブである。固相材料およびコンジュゲートに存在する抗原または抗体の標識の方法の選択は、所望の場合、所望のアッセイ方式の性能特性に基づいて決定される。

【0219】

本明細書で述べたように、コンジュゲート（またはインジケータ試薬）は、シグナル発生化合物または「標識」に結合させた、抗体（またはアッセイによって、おそらく抗抗体）を含む。このシグナル発生化合物または標識は、それ自体検出可能である、または１つ以上の追加の化合物と反応して検出可能な生成物を生成し得る。シグナル発生化合物の例は、本明細書に記載されており、とりわけ発色団、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯化剤または酵素のような触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）を用いる場合、色素原、蛍光原または発光原基質の添加は、検出可能シグナルの発生をもたらす。時間分解蛍光法、内部反射蛍光法、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマン分光法のような他の検出システムも有用である。

【0220】

キットも本発明の範囲内に含まれる。より具体的には、本発明は、対象における自己抗体のような抗体の存在を判定するためのキットを含む。とりわけ、試料中の前記抗体の存在を判定するためのキットは、ａ）本明細書で定義した免疫原性産物、および任意選択的にｂ）検出可能シグナルを発生することができるシグナル発生化合物に結合させた抗体を含むコンジュゲートを含む。キットは、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレーターも含有し得る。

【0221】

本発明はまた、試料中の自己抗体のような抗体を検出するための別の種類のキットを含む。キットは、ａ）目的の抗体に対して特異的な抗抗体およびｂ）本明細書で定義した免疫原性産物を含み得る。免疫原性産物に結合する試薬を含む対照またはキャリブレーターも含有し得る。より具体的には、キットは、ａ）自己抗体に対して特異的な抗抗体およびｂ）免疫原性産物を含むコンジュゲートを含み得る。コンジュゲートは、検出可能シグナルを発生することができるシグナル発生化合物に結合されている。さらに、キットは、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレーターも含有し得る。

【0222】

キットは、それぞれの容器があらかじめ固定された固相を含む、バイアル、ビンまたはストリップのような１つの容器およびそれぞれのコンジュゲートを含有する他の容器も含み得る。これらのキットは、洗浄、処理およびインジケータ試薬のような、アッセイを実施するために必要な他の試薬のバイアルまたは容器も含有し得る。

【0223】

本発明の免疫原性産物は、免疫原性産物に結合することができる作用物を得るのにも有用である。そのような作用物は、例えば、抗体（以後、抗産物抗体とも呼ぶ）、非抗体結合分子（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｓｔｅｆａｎ Ｄｕｂｅｌ編、ＩＩ巻、７章、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、２００７年に記載されている、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン分子、ＡｄＮｅｃｔｉｎｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ドメイン抗体、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ）、ノチン（ｋｎｏｔｉｎｓ）、Ｋｕｎｉｔｚ型ドメイン、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、テトラネクチン、トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ）およびＶ（ＮＡＲ）ｓのような）、アプタマーまたは低分子量化合物を含む。

【0224】

一態様において、本発明は、したがって、免疫原性産物に結合することができる作用物をスクリーニングするための免疫原性産物の使用に関する。したがって、本発明はまた、本明細書で開示した免疫原性産物に結合することができる作用物を同定する方法であって、ａ）目的の１つ以上の作用物を、１つ以上の作用物が産物に結合するのに十分な時間および条件下で、産物に曝露するステップならびにｂ）産物に結合する作用物を同定するステップを含む方法に関する。

【0225】

前記作用物は、抗体、非抗体結合分子、アプタマーまたは低分子量化合物からなる群から選択することができる。

【0226】

別の態様において、本発明は、作用物を含む調製物中の免疫原性産物に結合することができる前記作用物を富化するための免疫原性産物の使用に関する。したがって、本発明はまた、前記作用物を含む調製物中のそのような作用物を富化する方法であって、ａ）免疫原性産物に結合することができる作用物を含む調製物を、作用物が免疫原性産物に結合するのに十分な時間および条件下で、免疫原性産物に曝露するステップならびにｂ）富化された形の作用物を得るステップを含む方法に関する。より具体的には、免疫原性産物を固定化することができ（例えば、樹脂上に）、これにより作用物が捕捉されることが可能となる。富化された形の作用物を得ることは、好ましくは捕捉剤を脱離させることが捕捉剤を高塩緩衝液または酸性溶液と接触させることを含むような方法で、捕捉剤を脱離させることを含み得る。この方法は、例えば、ＩＶＩＧまたはＯｃｔａｇａｍ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ Ｉｎｃ．、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）のような市販の免疫グロブリン調製物をこの方法にかけることによって本明細書で述べた自己抗体を富化するために用いることができる。これらの免疫グロブリン調製物は、Ａβに対する自己抗体を含有するので、対象を処置することによって、それらの体内の抗Ａβ抗体のレベルが上昇すると考えられる。前記自己抗体が富化されている調製物は、より有効であると予想される。

【0227】

さらなる態様において、本発明は、免疫原性産物に結合する抗体を得るための免疫原性産物の使用に関する。したがって、本発明は、
ｉ）産物を含む抗原を準備すること、
ｉｉ）抗体レパートリーを前記抗原に曝露すること、および
ｉｉｉ）前記レパートリーから産物に結合する抗体を選択すること
を含む、本発明の免疫原性産物に結合することができる抗体を得る方法を提供する。

【0228】

ここで「潜在的抗体レパートリー」は、アミノ酸もしくは対応する核酸配列の任意のライブラリー、コレクション、アセンブリーもしくはセットを、またはインビボもしくはインビトロで抗体レパートリーを生産するために用いることができるアミノ酸配列のそのようなライブラリー、コレクション、アセンブリーもしくはセットの任意のジェネレーターを指すことを理解すべきである。本発明の好ましい実施形態において、ジェネレーターは、動物の適応免疫系、とりわけ当業者に周知の組換え過程により抗体多様性を発生する哺乳動物の免疫系の抗原産生部である。本発明の別の好ましい実施形態において、ジェネレーターは、その後、適切な抗体フレームワークへの挿入により、インビトロで抗体レパートリーを生産するために用いることができるランダム核酸配列の生産のためのシステムである。

【0229】

本発明の好ましい実施形態において、抗原により生物体を免疫化することにより、抗体レパートリーまたは潜在的抗体レパートリーをインビボで抗原に曝露する。本発明の別の好ましい実施形態において、潜在的抗体レパートリーは、当技術分野で記載されているインビトロアフィニティースクリーニング、例えば、ファージディスプレイおよびパンニングシステムにより抗体に曝露される適切な核酸のライブラリーである。

【0230】

別の態様において、本発明はまた、本明細書で定義した免疫原性産物に結合する抗体を提供する。

【0231】

本発明の好ましい実施形態において、抗体は、本明細書で述べたレパートリーまたは潜在的レパートリーから抗体を選択することを含む方法により得られる。

【0232】

とりわけ好ましい実施形態によれば、本発明は、免疫原性産物特異的抗体を提供する。これらは、とりわけ、本発明の免疫原性産物に対するよりもモノマーおよびフィブリロマー型のＡβペプチドの両方に対する比較的、より小さい親和性を有する抗体を含む。特定の実施形態において、抗体がタンパク質および／または巨大分子の複雑混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合、抗体は、抗原に特異的に結合すると言われる。

【0233】

本発明の好ましい実施形態において、免疫原性産物に対する抗体の親和性は、モノマーＡβ（１−４２）に対する抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい。

【0234】

本発明の好ましい実施形態において、免疫原性産物に対する抗体の親和性は、モノマーＡβ（１−４０）に対する抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい。

【0235】

好都合には、本発明の抗体は、１つのまたはより好ましくは、両方のモノマーに低い親和性で、最も好ましくは１×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、１×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、または１×１０^−６ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−５ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、または１×１０^−５ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で結合する。

【0236】

本発明の好ましい実施形態において、免疫原性産物に対する抗体の親和性は、フィブリロマーＡβ（１−４２）に対する抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい。

【0237】

本発明の好ましい実施形態において、免疫原性産物に対する抗体の親和性は、フィブリロマーＡβ（１−４０）に対する抗体の結合親和性より少なくとも２倍、例えば、少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍、例えば、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらにより好ましくは少なくとも１００００倍、例えば、少なくとも２００００倍、少なくとも３００００倍または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍大きい。

【0238】

好都合には、本発明の抗体は、１つのまたはより好ましくは、両方のフィブリルに低い親和性で、最も好ましくは１×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−８ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、１×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−７ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、または１×１０^−６ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、例えば、３×１０^−５ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で、または１×１０^−５ＭのＫ_Ｄもしくはより小さい親和性で結合する。

【0239】

「抗体」という用語は、本明細書で用いているように、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖からなるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特性を保持している、そのあらゆる機能性断片、突然変異体、変異体もしくは誘導体を広く指す。そのような機能性断片、突然変異体、変異体もしくは誘導体型抗体は、当技術分野で公知である。その非限定的な実施形態を下文で述べる。「全長抗体」は、本明細書で用いているように、２つの重鎖および２つの軽鎖という４つのポリペプチド鎖を含むＩｇ分子を指す。鎖は、通常ジスルフィド結合により互いに連結されている。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書で「可変重鎖」とも呼ぶ、または本明細書でＨＣＶＲもしくはＶＨと短縮する）および重鎖定常領域からなっている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなっている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書で「可変軽鎖」とも呼ぶ、または本明細書でＬＣＶＲもしくはＶＬと短縮する）および軽鎖定常領域からなっている。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインからなっている。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的である領域によって散在させられた相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなっている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、あらゆる種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。

【0240】

抗体の「抗原結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」（または単に「抗体部分」）、「抗原結合部分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書で用いているように、抗原（すなわち、本発明の免疫原性産物）に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片を指すものであり、すなわち、抗体の機能的断片である。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の１つ以上の断片によって果たされ得ることが示された。そのような抗体実施形態はまた、二特異性、二重特異性、または多重特異性であり、２つ以上の異なる抗原に特異的に結合し得る。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＨおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）可変ドメインを含むｄＡｂ断片（参照により本明細書に組み込む、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４−５４６頁、１９８９年；Ｗｉｎｔｅｒら、ＷＯ９０／０５１４４Ａ１；ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域が一対となって一価分子を形成している単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３−４２６頁、１９８８年；およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９−５８８３頁、１９８８年を参照）としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーにより、組換え法を用いて結合させることができる。そのような単鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される。ダイアボディのような、他の形の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現するが、短すぎて、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にすることができず、それにより、ドメインが別の鎖の相補的ドメインと対を形成することを余儀なくさせ、２つの抗原結合部位を生じさせるリンカーを用いる二価二特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁、１９９４を参照）。そのような抗体結合部分は、当技術分野で公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７９０頁、２００１年、ＩＳＢＮ ３−５４０−４１３５４−５）。

【0241】

「抗体」という用語は、本明細書で用いているように、抗体構築物も含む。「抗体構築物」という用語は、本明細書で用いているように、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の１つ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により結合した２つ以上のアミノ酸残基を含み、１つ以上の抗原結合部分を連結するために用いられる。そのような抗体結合部分は当技術分野で公知である。（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁、１９９３年；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁、１９９４を参照）。

【0242】

免疫グロブリン定常ドメインは、重または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野で公知である。

【0243】

またさらに、本発明の結合性タンパク質（例えば、抗体）は、本発明の結合性タンパク質と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性会合により形成されたより大きい免疫接着分子の一部であり得る。そのような免疫接着分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６巻、９３−１０１頁、１９９５年）ならびに二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１０４７−１０５８頁、１９９４年）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片のような抗体部分は、全抗体のそれぞれパパインまたはペプシン消化のような、従来の技術を用いて全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書で述べる標準的組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。

【0244】

「単離抗体」は、本明細書で用いているように、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする。しかし、本発明の免疫原性産物に特異的に結合する単離抗体は、Ａβグロブロマー、例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーまたは他のＡβ形態のような、他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質および／または他の標的Ａβ形態を実質的に含まないことがあり得る。

【0245】

「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いているように、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を意味するものとする。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、とりわけＣＤＲ３におけるヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によりまたはインビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いているように、マウスのような別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲがヒトフレーム配列上にグラフトされた抗体を含むものではない。

【0246】

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で用いているように、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体（下文のＢ項でさらに述べる）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．、１５巻、６２−７０頁、１９９７年；ＡｚｚａｚｙおよびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３５巻、４２５−４４５頁、２００２年；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ Ｊ．Ｖ．およびＬａｒｒｉｃｋ Ｊ．Ｗ．（２００２年）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２９巻、１２８−１４５頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．およびＣｈａｍｅｓ Ｐ．（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、２１巻、３７１−３７８頁）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．Ｄ．ら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻、６２８７−６２９５頁；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ Ｓ−Ａ．およびＧｒｅｅｎ Ｌ．Ｌ．（２００２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３巻、５９３−５９７頁； Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ．ら、（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、２１巻、３６４−３７０頁を参照）のような、組換え手段により調製され、発現させ、作製されもしくは単離されたすべてのヒト抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含むあらゆる他の手段により調製され、発現させ、作製されもしくは単離された抗体を含むものとする。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロで突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を用いる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在し得ない配列である。

【0247】

「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重および軽鎖可変領域を有する抗体のような、１つの種に由来する重および軽鎖可変領域配列ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を指す。

【0248】

「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、マウス可変重および軽鎖領域の１つ以上がヒト可変重および軽鎖配列で置き換えられたマウスＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を有する抗体のような、１つの種に由来する重および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つ以上の配列が別の種のＣＤＲ配列で置き換えられている抗体を指す。

【0249】

「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。当技術分野で認識されている、これらの用語は、抗体の重および軽鎖可変領域またはその抗原結合部分における他のアミノ酸残基より可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔら（１９７１年）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９０巻、３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２））。重鎖可変領域については、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０から６５およびＣＤＲ３のアミノ酸位置９５から１０２の範囲にある。軽鎖可変領域については、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２のアミノ酸位置５０から５６およびＣＤＲ３のアミノ酸位置８９から９７の範囲にある。

【0250】

本明細書で用いているように、「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を備えたまたはコードする抗体または核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域（複数可）を備えたまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。また別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域および定常領域（複数可）を備えたまたはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。特定の実施形態において、「アクセプター」という用語は、１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を備えたまたはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の１つ以上の特定の位置において存在しない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域（複数可）は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、発達過程における抗体または市販の抗体）に由来し得るまたはから得ることができる。

【0251】

本明細書で用いているように、「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。可変領域のそれぞれについて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれている、重鎖および軽鎖の可変領域のそれぞれに３つのＣＤＲが存在する。「ＣＤＲセット」という用語は、本明細書で用いているように、抗原に結合することができる単一可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムによって異なって定義された。Ｋａｂａｔにより記載されたシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年）および（１９９１年））は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な一義的な残基番号付けシステムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを定義する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと呼ぶことができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同研究者ら（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１−９１７頁（１９８７年）ならびにＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７７−８８３頁（１９８９年））は、アミノ酸配列のレベルで大きい多様性を有するのにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の特定の下位部分がほぼ同じペプチド主鎖立体配座をとることを見いだした。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれ、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ軽鎖および重鎖領域を意味する。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと呼ぶことができる。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．、９巻、１３３−１３９頁（１９９５年））およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２６２巻（５号）、７３２−４５頁（１９９６年））により記載された。さらなる他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに厳密に従わないことがあり得るが、特定の残基または残基の群または全ＣＤＲさえも抗原結合に著しく影響を及ぼさないという予測または実験所見に照らして、それらが短縮または延長され得るが、それにもかかわらずＫａｂａｔ ＣＤＲと重複する。本明細書で用いた方法は、これらのシステムのいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用し得るものであり、特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ定義のＣＤＲを使用する。

【0252】

本明細書で用いているように、「規定」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１−９０７頁（１９８７年）；ＣｈｏｔｈｉａらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７９９頁（１９９２年）、両方を参照により本明細書に組み込む）により定義された特定の規定ＣＤＲ構造を定義するＣＤＲまたはフレームワークにおける残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによれば、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルで大きい多様性を有するのにもかかわらず、ほぼ同じペプチド主鎖立体配座（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎｓ）を有する。各規定構造は、ループを形成するアミノ酸残基の連続的セグメントの一連のペプチド主鎖ねじれ角を主として規定する。

【0253】

本明細書で用いているように、「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを備えている抗体を指す。一実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるまたは由来する抗体と異なる種からの抗体である。ヒト化抗体に関連して、「ドナー抗体」という用語は、１つ以上のＣＤＲを備えている非ヒト抗体を指す。

【0254】

本明細書で用いているように、「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域マイナスＣＤＲの残存する配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、種々のシステムにより確定することができるので、フレームワーク配列の意味は、それに応じて異なる解釈を受ける。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）も軽鎖および重鎖上のフレームワークを各鎖上の４つの亜領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分割し、ＣＤＲ１は、ＦＲ１とＦＲ２との間に、ＣＤＲ２は、ＦＲ２とＦＲ３との間に、ＣＤＲ３は、ＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。個々の亜領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４と規定しない場合、他者により言及された、フレームワーク領域は、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の統合されたＦＲ’ｓを表す。本明細書で用いているように、ＦＲは、４つの亜領域の１つを表し、ＦＲは、フレームワーク領域を構成する４つの亜領域の２つ以上を表す。

【0255】

ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列は、当技術分野で公知である。

【0256】

本明細書で用いているように、「生殖系列抗体遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現のための遺伝子再配列および突然変異につながる成熟過程を受けなかった非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２巻（３号）、１８３−２００頁（２０００年）；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ、４８４巻、１３−３０頁（２００１年）を参照）。本発明の種々の実施形態によってもたらされる利点の１つは、生殖系列抗体遺伝子が成熟抗体遺伝子よりも当該種における個体に特有な必須アミノ酸配列構造を保存する可能性が高く、したがって、当該種において治療的に使用される場合に外来源に由来すると認識される可能性がより低いという認識から生じる。

【0257】

本明細書で用いているように、「基本（ｋｅｙ）」残基という用語は、抗体、とりわけヒト化抗体の結合特異性および／または親和性に対するより大きい影響を有する可変領域内の特定の残基を指す。基本残基は、以下のものの１つ以上を含むが、それらに限定されない：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位（Ｎ−またはＯ−グリコシル化部位であり得る）、希（ｒａｒｅ）残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、規定残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、および可変重鎖ＣＤＲ１のＣｈｏｔｈｉａ定義と第１の重鎖フレームワークのＫａｂａｔ定義との間で重複する領域における残基。

【0258】

本明細書で用いているように、「ヒト化抗体」という用語は、目的の抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域および非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくは一部である。本明細書で用いているように、ＣＤＲに関連する「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同じアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のそれらに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれらである少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含む。一態様によれば、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的にヒト免疫グロブリンのそれも含む。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域も含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含有する。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖および／または重鎖のヒト化可変ドメインのみを含有する。

【0259】

ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む免疫グロブリンのいずれかのクラス、ならびに制限なくＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むいずれかのアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１つを超えるクラスまたはアイソタイプの配列を含み得るものであり、特定の定常ドメインは、当技術分野で周知の技術を用いて所望のエフェクター機能を最適化するために選択することができる。

【0260】

ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列に正確に一致する必要はない。例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、当該部位におけるＣＤＲまたはフレームワーク残基がドナー抗体またはコンセンサスフレームワークに一致しないように少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入および／または欠失により突然変異を起こさせることができる。一実施形態において、そのような突然変異は、しかしながら、広範囲に及ぶものでない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％は、親ＦＲおよびＣＤＲ配列のそれらに一致するものとする。本明細書で用いているように、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。本明細書で用いているように、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおける最も高頻度で存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７年）参照）。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置は、ファミリーにおける当該位置に最も高頻度で存在するアミノ酸により占有されている。２つのアミン酸が同等の頻度で存在する場合、いずれかをコンセンサス配列に含めることができる。

【0261】

本明細書で用いているように、「バーニア」ゾーンは、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻、４８７−４９９頁；参照により本明細書に組み込む）により記載されたようにＣＤＲ構造を調整し、抗原への適合を微調節し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、ＣＤＲに内在する層を形成し、ＣＤＲの構造および抗体の親和性に影響を及ぼし得る。

【0262】

「抗体」という用語は、本明細書で用いているように、多価結合タンパク質も含む。「多価結合タンパク質」という用語は、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質を表すために本明細書で用いる。多価結合タンパク質は、３つ以上の抗原結合部位を有するように遺伝子操作され、一般的に天然に存在する抗体でない。「多重特異性結合タンパク質」という用語は、２つ以上の関連または非関連標的に結合することができる結合タンパク質を指す。二重可変ドメイン（ＤＶＤ）結合タンパク質は、本明細書で用いているように、２つ以上の抗原結合部位を含む結合タンパク質であり、四価または多価結合タンパク質である。そのようなＤＶＤは、単一特異性であり、すなわち、１つの抗原に結合する能力があり、または多重特異性であり、すなわち、２つ以上の抗原に結合する能力があり得る。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合タンパク質は、ＤＶＤ Ｉｇを指す。ＤＶＤ Ｉｇの各半分は、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチドならびに２つの抗原結合部位を含む。各結合部位は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、抗原結合部位当たり抗原結合に関与する合計６つのＣＤＲを有する。ＤＶＤ結合タンパク質およびＤＶＤ結合タンパク質を作製する方法は、米国特許出願第１１／５０７，０５０号に開示されており、参照により本明細書に組み込む。

【0263】

「標識結合タンパク質」という用語は、本明細書で用いているように、結合タンパク質の同定を可能にする組み込まれた標識を有する結合タンパク質を指す。同様に、「標識抗体」という用語は、本明細書で用いているように、抗体の同定を可能にする組み込まれた標識を有する抗体を指す。一態様において、標識は、検出可能マーカーであり、例えば、放射性標識アミノ酸の組込みまたは標示アビジンにより検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの結合である（例えば、光学的または比色法により検出することができる蛍光マーカーを含有するストレプトアビジンまたは酵素活性）。ポリペプチドの標識の例は、以下のものを含むが、それらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏまたは^１５３Ｓｍ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ドーダミン、ランタニドりん光体）；酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチニル基；二次リポーターにより認識されるあらかじめ決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）；およびガドリニウムキレートのような磁性物質。

【0264】

「抗体」という用語は、本明細書で用いているように、抗体コンジュゲートも含む。「抗体コンジュゲート」という用語は、治療剤のような第２の化学的部分に化学的に連結された抗体のような、結合タンパク質を指す。

【0265】

本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかにより作製することができる。

【0266】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術またはそれらの組合せを含む当技術分野で公知の様々な技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（前記参考文献は、それらの全体を参照により組み込む）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて生産することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で用いているように、ハイブリドーマ技術により生産される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指し、それが生産される方法を指さない。

【0267】

ハイブリドーマ技術を用いる特異的抗体を生産し、スクリーニングする方法は、当技術分野で常用され、周知である。一実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を生成する方法ならびに本発明の抗体を分泌するハイブリドーマを培養することを含む方法により産生される抗体であって、例えば、ハイブリドーマは、本発明の抗原により免疫化したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いで、融合により得られたハイブリドーマを、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることによって生成する、方法ならびに抗体を提供する。手短に述べると、マウスは、本発明の免疫原性産物により免疫化することができる。特定の実施形態において、抗原をアジュバントとともに投与して、免疫応答を刺激する。そのようなアジュバントは、完全もしくは不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）を含む。そのようなアジュバントは、ポリペプチドを局所沈着物中に隔離することによって急速な分散からポリペプチドを保護し得る。またはそれらは、宿主がマクロファージおよび免疫系の他のコンポーネントに対して化学走性である因子を分泌することを刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合、免疫化スケジュールは、数週間にわたるポリペプチドの２回以上の投与を含むものとする。

【0268】

本発明の免疫原性産物による動物の免疫化の後、抗体および／または抗体産生細胞を動物から得ることができる。抗産物抗体含有血清は、採血または動物を屠殺することによって得られる。血清は、それが動物から得られるときに用いることができ、免疫グロブリン画分は、血清から得ることができる。または抗産物抗体を血清から精製することができる。この方法で得られた血清または免疫グロブリンは、ポリクローナルであり、したがって、特性の異種アレイを有する。

【0269】

免疫応答が検出されたならば、例えば、本発明の免疫原性産物に対して特異的な抗体がマウス血清において検出されたならば、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで脾細を、任意の適切な骨髄腫細胞、例えば、ＡＴＣＣから入手できる細胞系ＳＰ２０からの細胞に周知の技術により融合させる。ハイブリドーマを限界希釈により選択し、クローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、当技術分野で公知の方法により本発明の免疫原性産物に結合することができる抗体を分泌する細胞についてアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含有する、腹水は、陽性ハイブリドーマクローンによりマウスを免疫化することによって発生させることができる。

【0270】

別の実施形態において、抗体産生不死化ハイブリドーマは、免疫化動物から調製することができる。免疫化の後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように脾Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照）。特定の実施形態において、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞系）。融合および抗生物質分泌の後、本発明の免疫原性産物もしくはその一部、または本発明の免疫原性産物を発現する細胞を用いてハイブリドーマをスクリーニングする。特定の実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて実施する。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み込む、国際公開第００／３７５０４に提供されている。

【0271】

下文でさらに述べるように、抗産物抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、頑健なハイブリドーマの成長、高い抗体産生および望ましい抗体の特性を含む、望ましい特性についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、培養し、同遺伝子型動物において、免疫系を欠く動物、例えば、ヌードマウスにおいてインビボで、または細胞培養においてインビトロで拡大する。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、拡大する方法は、当業者に周知である。

【0272】

特定の実施形態において、ハイブリドーマは、上述のようにマウスハイブリドーマである。別の特定の実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマのような非ヒト、非マウス種において生産する。別別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌骨髄腫を抗産物抗体を発現するヒト細胞と融合させる、ヒトハイブリドーマである。

【0273】

特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により生成することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生産するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を生産するため）のような酵素を用いて免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により生産させることができる。Ｆ（ａｂ’）_２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。

【0274】

本発明の別の態様において、組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号、ＰＣＴ国際公開第９２／０２５５１号およびＢａｂｃｏｃｋ Ｊ．Ｓ．ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、７８４３−７８４８頁に記載されているように、選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）と当技術分野で呼ばれている手順を用いて単一の単離リンパ球から生成する。この方法において、目的の抗体を分泌する単一細胞、例えば、１項に記載された免疫化動物のいずれか１つに由来するリンパ球を抗原特異的溶血プラークアッセイを用いてスクリーニングする。その場合、本発明の免疫原性産物またはそのサブユニットをビオチンのようなリンカーを用いてヒツジ赤血球に結合させ、本発明の免疫原性産物に対する特異性を有する抗体を分泌する単一細胞を同定するために用いる。目的の抗体分泌細胞の同定の後、重および軽鎖可変領域ｃＤＮＡを逆転写酵素ＰＣＲにより細胞から救出し、次いで、これらの可変領域を、ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）との関連において、発現させることができる。選択されるリンパ球からインビボで得られた、増幅免疫グロブリン配列をトランスフェクトした宿主細胞は、次に、例えば、トランスフェクト細胞をパンニングして、Ａβ（２０−４２）グロブロマーに対する抗体を発現する細胞を単離することにより、インビトロでのさらなる解析および選択にかけることができる。増幅免疫グロブリン配列は、ＰＣＴ国際公開第９７／２９１３１号およびＰＣＴ国際公開第００／５６７７２号に記載されているようなインビトロ親和性成熟法によるなどのように、インビトロでさらに操作することができる。

【0275】

本発明の別の実施形態において、抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部またはすべてを含む非ヒト動物を免疫原性産物抗原により免疫化することによって産生される。特定の実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大断片を含み、マウス抗体産生に欠けている遺伝子操作されたマウス系統である、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスである。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻、１３−２１頁（１９９４年）ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第５，９８５，６１５号、第５，９９８，２０９号、第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、第６，１１４，５９８号および第６，１３０，３６４号を参照のこと。１９９１年７月２５日に公開された国際公開第９１／１０７４１号、１９９４年２月３日に公開された国際公開第９４／０２６０２号、両方が１９９６年１０月３１日に公開された国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号、１９９８年４月２３日に公開された国際公開第９８／１６６５４号、１９９８年６月１１日に公開された国際公開第９８／２４８９３号、１９９８年１１月１２日に公開された国際公開第９８／５０４３３号、１９９９年９月１０日に公開された国際公開第９９／４５０３１号、１９９９年１０月２１日に公開された国際公開第９９／５３０４９号、２０００年２月２４日に公開された国際公開第００／０９５６０号ならびに２０００年６月２９日に公開された国際公開第００／０３７５０４号も参照のこと。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、完全にヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座およびｘ軽鎖遺伝子座のメガ塩基サイズの生殖系列コンフィギュレーションＹＡＣ断片の導入によりヒト抗体レパートリーの約８０％を含有する。参照によりそれらの開示を組み込む、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻、１４６−１５６頁（１９９７年）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８巻、４８３−４９５頁（１９９８年）を参照のこと。

【0276】

インビトロでの方法は、本発明の抗体を作製するためにも用いることができ、抗体ライブラリーをスクリーニングして、所望の結合特異性を有する抗体を同定する。組換え抗体ライブラリーのそのようなスクリーニングの方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照によりそれらの内容を本明細書に組み込む、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開第９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開第９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開第９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開第９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開第９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｄら、ＰＣＴ国際公開第９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３巻、８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０年）３４８巻、５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ Ｊ、１２巻、７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２２６巻、８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻、６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２年）ＰＮＡＳ、８９巻、３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｄら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１年）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、１９巻、４１３３−４１３７頁；およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ、８８巻、７９７８−７９８２頁、米国特許出願公開第２００３０１８６３７４ならびにＰＣＴ国際公開第９７／２９１３１号に記載された方法を含む。

【0277】

組換え抗体ライブラリーは、本発明の免疫原性産物または本発明の免疫原性産物の一部により免疫化された対象に由来し得る。あるいは、組換え抗体ライブラリーは、本発明の免疫原性産物により免疫化されなかったヒト対象に由来するヒト抗体ライブラリーのような、ナイーブ対象、すなわち、本発明の免疫原性産物により免疫化されなかった対象に由来し得る。本発明の抗体は、本発明の免疫原性産物を含むペプチドにより組換え抗体ライブラリーをスクリーニングし、それにより本発明の免疫原性産物を認識し、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマー、ＡβフィブリルおよびｓＡＰＰαのような他のＡβ形態を識別する抗体を選択することによって選択される。そのようなスクリーニングおよび選択を行う方法は、先行するパラグラフにおける参考文献に記載されているなど、当技術分野で周知である。

【0278】

一態様において、本発明は、本発明の免疫原性産物に結合し、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマー、ＡβフィブリルおよびｓＡＰＰαを識別する単離抗体またはその抗原結合部分に関する。一態様によれば、抗体は、中和抗体である。様々な実施形態において、抗体は、組換え抗体またはモノクローナル抗体である。

【0279】

例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて発生させることもできる。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上にディスプレイされる。とりわけ、そのようなファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現させた抗原結合ドメインをディスプレイするために利用することができる。目的の抗原を結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原により、例えば、固体表面またはビーズに結合させたまたは捕捉させた標識抗原もしくは抗原を用いて選択または同定することができる。これらの方法に用いられるファージは、一般的に、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換えにより融合させたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するために用いることができるファージディスプレイ法の例は、それぞれをその全体を参照により本明細書に組み込む、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻、４１−５０頁（１９９５年）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻、１７７−１８６頁（１９９５年）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｎｏｌ．、２４巻、９５２−９５８頁（１９９４年）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７巻、９−１８頁（１９９７年）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７巻、１９１−２８０頁（１９９４年）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９１／１０７３７号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第９５／１５９８２号；国際公開第９５／２０４０１号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されているものを含む。

【0280】

上記の参考文献に記載されているように、ファージの選択の後、ファージから抗体コーディング領域を単離し、ヒト抗体または任意の他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成するために用い、また例えば、下文で詳細に述べるように、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２巻（６号）、８６４−８６９頁（１９９２年）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４巻、２６−３４頁（１９９５年）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０４１−１０４３頁（１９８８年）（前記参考文献はそれらの全体を参照により組み込む）に開示されている方法のような当技術分野で公知の方法を用いてＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより生産する技術も用いることができる。単鎖Ｆｖｓおよび抗体を生産するために用いることができる技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３巻、４６−８８頁（１９９１年）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ、９０巻、７９９５−７９９９頁（１９９３年）およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８−１０４０頁（１９８８年）に記載されているものを含む。

【0281】

ファージディスプレイによる組換え抗体ライブラリーのスクリーニングの代替法、大コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする当技術分野で公知の他の方法論は、本発明の二重特異性抗体の同定に適用することができる。１つの類型の代替発現システムは、ＳｚｏｓｔａｋおよびＲｏｂｅｒｔｓによるＰＣＴ国際公開第９８／３１７００号ならびにＲｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．（１９９７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４巻、１２２９７−１２３０２頁に記載されているように、組換え抗体ライブラリーをＲＮＡ−タンパク質融合体として発現させるものである。このシステムにおいて、それらの３’末端にペプチジルアクセプター抗生物質であるピューロマイシンを有する合成ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳により、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチドまたはタンパク質との間の共有結合性融合体が生成する。したがって、特定のｍＲＮＡは、二重特異性抗原に対する抗体またはその一部の結合のような、コード化ペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体またはその一部の特性に基づいてｍＲＮＡの複雑混合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）から富化することができる。そのようなライブラリーのスクリーニングにより回収された、抗体またはその一部をコードする核酸配列は、上述のような組換え手段により発現させることができ（例えば、哺乳類宿主細胞において）、さらに、突然変異が最初に選択された配列（複数可）に導入されたｍＲＮＡ−ペプチド融合体の追加のラウンドのスクリーニングにより、または上述のように、組換え抗体のインビトロでの親和性成熟の他の方法により、さらなる親和性成熟にかけることができる。

【0282】

別のアプローチにおいて、本発明の抗体は、当技術分野で公知の酵母ディスプレイ法を用いて生成することもできる。酵母ディスプレイ法において、遺伝的方法を用いて、抗体ドメインを酵母細胞壁にテザーし、それらを酵母の表面上にディスプレイする。とりわけ、そのような酵素は、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した抗原結合ドメインをディスプレイするために用いることができる。本発明の抗体を作製するために用いることができる酵母ディスプレイ法の例は、参照により本明細書に組み込む、Ｗｉｔｔｒｕｐら、米国特許第６，６９９，６５８号に開示されているものを含む。

【0283】

本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかのいずれかにより生産することができる。例えば、重および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）を標準的技術により宿主細胞にトランスフェクトする、宿主細胞からの発現。様々な形の「トランスフェクション」という用語は、原核または真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に用いられる様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含するものとする。本発明の抗体を原核または真核宿主細胞で発現させることも可能である。本発明の特定の態様によれば、抗体の発現は、真核細胞、例えば、哺乳類宿主細胞を用いて実施する。その理由は、そのような真核細胞（およびとりわけ哺乳類細胞）は、原核細胞より、アセンブルし、適切に折りたたまれ、免疫学的に活性な抗体を分泌する可能性が高いからである。

【0284】

一態様によれば、本発明の組換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９巻、６０１−６２１頁に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６−４２２０頁の記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現または宿主細胞が成長している培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。

【0285】

宿主細胞は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ分子のような機能的抗体断片を産生させるためにも用いることができる。上記の手順の変形形態が本発明の範囲内にあることが理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖の機能的断片をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることは、望ましいことであり得る。組換えＤＮＡ技術は、目的の抗原に結合するために必要でない軽および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡの一部またはすべてを除去するためにも用いることができる。切断型ＤＮＡ分子から発現された分子も本発明の抗体に包含される。さらに、１つの重鎖および１つの軽鎖が本発明の抗体であり、本発明の抗体を標準的化学的クロスリンク結合法により第２の抗体にクロスリンク結合させることによって、他の重および軽鎖が目的の抗原以外の抗原に対して特異的である、二官能性抗体を生産させることができる。

【0286】

本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための特定のシステムにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重および軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素にそれぞれ作動可能に連結されて、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の選択を可能にする、ＤＨＦＲ遺伝子も保有する。選択された形質転換宿主細胞を培養して、抗体重および軽鎖の発現を可能にし、完全な抗体を培地から回収する。標準的分子生物学技術を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。またさらに本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで本発明の宿主細胞を適切な培地中で培養することによって本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。該方法は、培地から組換え抗体を単離することをさらに含み得る。

【0287】

キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のような、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を生産させる方法は、当技術分野で公知であり、本明細書で詳細に述べる。それらの全体を参照により本明細書に組み込む、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻、１２０２頁（１９８５年）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻、２１４頁（１９８６年）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５巻、１９１−２０２頁；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号および第４，８１６，３９７号を参照のこと。さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（それらの全体を参照により本明細書に組み込む、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻、８５１−８５５頁；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４年、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻、６０４−６０８頁；Ｔａｋｅｄａら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻、４５２−４５４頁）が使用され得る。

【0288】

本発明のＣＤＲグラフト抗体は、ヒト抗体の重および軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨおよび／またはＶＬの１つ以上のＣＤＲ領域が本発明のマウス抗体のＣＤＲ配列で置き換えられている。任意のヒト抗体のフレームワーク配列は、ＣＤＲ移植のための鋳型としての役割を果たし得る。しかし、そのようなフレームワーク上への直鎖置き換えは、抗原に対する結合親和性のある程度の損失をしばしばもたらす。最初のマウス抗体に対するヒト抗体の相同性が高いほど、マウスＣＤＲとヒトフレームワークとの組合せが、親和性を低下させ得るＣＤＲにおける歪みを導入する可能性が低くなり得る。したがって、ＣＤＲから離れたマウス可変フレームワークを置き換えるために選択されるヒト可変フレームワークは、マウス抗体可変領域フレームワークとの例えば、少なくとも６５％の配列同一性を有する。ＣＤＲから離れたヒトおよびマウス可変領域は、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性を有する。キメラ抗体を生産する方法は、当技術分野で公知であり、本明細書で詳細に述べる。（例えば、欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号も参照）、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５号）、４８９−４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６号）、８０５−８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ、９１巻、９６９−９７３頁（１９９４年））および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３５２号）。

【0289】

ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体分子である。

【0290】

公知のヒトＩｇ配列は、開示されている。例えば、

【0291】

【表2】

【0292】

ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは改善するためにＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換することができる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される（例えば、それらの全体を参照により組み込む、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３頁（１９８８年）を参照）。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用でき、当業者によく知られている。選択される候補免疫グロブリン配列の推定３次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが入手できる。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の解析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の解析が可能となる。この方法で、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大のような所望の抗体の特性が達成されるように、コンセンサスおよび移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に、そして最も実質的に関与する。抗体は、本明細書で引用した参考文献を含めた、それぞれを参照により本明細書に完全に組み込む、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻、５２２頁（１９８６年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４頁（１９８８年）；Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、２２９６頁（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１頁（１９８７年）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９巻、４２８５頁（１９９２年）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻、２６２３頁（１９９３年）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８巻（４／５号）、４８９−４９８頁（１９９１年）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７巻（６号）、８０５−８１４頁（１９９４年）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ、９１巻、９６９−９７３頁（１９９４）；ＰＣＴ国際公開第９１／０９９６７号；ＰＣＴ／：米国特許出願公開第９８／１６２８０号、米国特許出願公開第９６／１８９７８号、米国特許出願公開第９１／０９６３０号、米国特許出願公開第９１／０５９３９号、米国特許出願公開第９４／０１２３４号、英国特許出願公開第８９／０１３３４号、英国特許出願公開第９１／０１１３４号、英国特許出願公開第９２／０１７５５号、国際公開第９０／１４４４３号、国際公開第９０／１４４２４号、国際公開第９０／１４４３０号、欧州特許第２２９，２４６号、欧州特許第５９２，１０６号、欧州特許第５１９，５９６号、欧州特許第２３９，４００号、米国特許第５，５６５，３３２号、第５，７２３，３２３号、第５，９７６，８６２号、第５，８２４，５１４号、第５，８１７，４８３号、第５，８１４，４７６号、第５，７６３，１９２号、第５，７２３，３２３号、第５，７６６，８８６号、第５，７１４，３５２号、第６，２０４，０２３号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，２２５，５３９号、第４，８１６，５６７号に記載されているもののような、ただし、それらに限定されない、当技術分野で公知の様々な技術を用いてヒト化することができる。

【0293】

特定の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭのような重鎖定常領域またはＩｇＤ定常領域を含む。一態様によれば、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらなる態様によれば、抗体は、軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域を含む。一態様によれば、抗体は、カッパ軽鎖定常領域を含む。抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片または単鎖Ｆｖ断片であり得る。

【0294】

抗体エフェクター機能を変化させるためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置き換えは、当技術分野で公知である（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。ある場合には、これらのエフェクター機能は、治療用抗体について望ましいが、別の場合には、治療の目的によって不必要または有害でさえあり得る。特定のヒトＩｇＧアイソタイプ、とりわけＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲｓおよび補体Ｃ１ｑへの結合によりＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する重要なコンポーネントである。さらなる別の実施形態において、抗体のエフェクター機能が変化するように、抗体の定常領域、例えば、抗体のＦｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸残基が置き換えられている。

【0295】

一実施形態は、本発明の抗体が誘導体化されているまたは別の機能的分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に連結されている、標識抗体を提供する。例えば、本発明の標識抗体は、別の抗体（例えば、二特異性もしくはダイアボディ）、検出可能物質、医薬剤および／または抗体と別の分子（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドのような、１つ以上の分子実体に本発明の抗体を機能的に連結することによって（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはその他によって）誘導体化することができる。

【0296】

本発明の抗体を誘導体化することができる有用な検出可能物質は、蛍光化合物を含む。例示的な蛍光検出可能物質は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリンなどを含む。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどのような検出可能酵素によっても誘導体化することができる。抗体を検出可能酵素により誘導体化する場合、それは、検出可能な反応生成物を生産するために酵素が用いる追加の試薬を加えることにより検出される。例えば、検出可能物質である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、検出可能である着色反応生成物がもたらされる。抗体をビオチンで誘導体化して、間接的にアビジンまたはストレプトアビジンの結合を測定することによって検出することもできる。

【0297】

本発明の別の実施形態は、結晶化抗体を提供する。一態様によれば、本発明は、本明細書で開示した全抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体およびその断片の結晶ならびにそのような結晶を含む製剤および組成物に関する。さらなる態様によれば、結晶化抗体は、該抗体の可溶性カウンターパートよりインビトロで大きい半減期を有する。さらなる態様によれば、抗体は、結晶化後に生物学的活性を保持している。

【0298】

本発明の結晶化抗体は、当技術分野で公知であり、参照により本明細書に組み込む、国際公開第０２／０７２６３６号に開示されている方法により生産することができる。

【0299】

本発明の別の実施形態は、抗体が１つ以上の炭水化物残基を含む、グリコシル化抗体を提供する。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として公知のさらなるプロセシングを受け得る。とりわけ、糖（グリコシル）残基は、グリコシル化として公知の過程であり、酵素的に加えることができる。共有結合オリゴ糖側鎖を担持する得られるタンパク質は、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として公知である。

【0300】

抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインにおける１つ以上の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインにおける炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対する重要な効果を有し、抗体の抗原結合または半減期に対しては軽微な効果を有する（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２１巻（２００５年）、１１−１６頁）。これと対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に対する効果を有し得る。可変ドメインのグリコシル化は、おそらく立体障害に起因して（Ｃｏ Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）、３０巻、１３６１−１３６７頁）、抗体結合親和性に対する負の効果を有し得る、または抗原に対する親和性の増大をもたらす（Ｗａｌｌｉｃｋ Ｓ．Ｃ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８年）、１６８巻、１０９９−１１０９頁；Ｗｒｉｇｈｔ Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９１年）、１０巻、２７１７−２７２３頁）。

【0301】

本発明の一態様は、抗体のＯまたはＮ結合型グリコシル化部位が突然変異したグリコシル化部位突然変異体の生成を対象とする。当業者は、標準的な周知の技術を用いてそのような突然変異体を生成することができる。生物学的活性を保持しているが、結合活性の増大または低下を有するグリコシル化部位突然変異体の作製は、本発明の別の目的である。

【0302】

さらなる別の実施形態において、本発明の抗体のグリコシル化を改変する。例えば、脱グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、抗体がグリコシル化を欠いている）。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるためにグリコシル化を変更することができる。そのような炭水化物の改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変更することによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域グリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行い、それにより、当該部位におけるグリコシル化を消失させることができる。そのような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのようなアプローチは、それらのそれぞれをその全体を参照により本明細書に組み込む、国際出願公開番号ＷＯ０３／０１６４６６Ａ２ならびに米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。

【0303】

さらにまたはあるいは、本発明の改変抗体フコシル残基量の低下を有する低フコシル化抗体またはバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造の増加を有する抗体のような、異なる種類のグリコシル化を有する本発明の改変抗体を作製することができる。そのような変更されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示された。そのような炭水化物の改変は、例えば、グリコシル化機構の変化を有する宿主細胞における抗体の発現によって達成することができる。グリコシル化機構の変化を有する細胞は、当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それによりグリコシル化の変化を有する抗体を産生する宿主細胞として用いることができる。例えば、それらのそれぞれをその全体を参照により本明細書に組み込む、Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら、（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７巻、２６７３３−２６７４０頁；Ｕｍａｎａら、（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、１７６−１頁、ならびに欧州特許番号ＥＰ１，１７６，１９５；国際出願公開番号ＷＯ０３／０３５８３５およびＷＯ９９／５４３４２８０を参照のこと。

【0304】

タンパク質のグリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列ならびにタンパク質が発現する宿主細胞に依存する。異なる生物体は、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を産生し、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有する。そのような因子に起因して、タンパク質グリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現する宿主系によって異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸を含み得るが、これらに限定されない。一態様によれば、グリコシル化抗体は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。

【0305】

異なるタンパク質グリコシル化が異なるタンパク質特性をもたらし得ることは、当業者に公知である。例えば、酵母のような微生物宿主において産生され、酵母内因性経路を用いてグリコシル化された治療用タンパク質の有効性は、ＣＨＯ細胞系のような哺乳類細胞において発現した同じタンパク質の有効性と比較して低いことがあり得る。そのような糖タンパク質は、ヒトにおいて免疫原性でもあり、投与後にインビボで半減期の低下を示し得る。ヒトおよび他の動物における特異的受容体は、特異的グリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の速やかなクリアランスを促進し得る。他の有害な作用は、タンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、コンパートメント化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性またはアレルゲン性の変化、を含み得る。したがって、開業医は、グリコシル化の特定の組成およびパターン、例えば、ヒト細胞においてまたは意図した対象動物の種特異的細胞において産生されたそれと同一である、または少なくとも類似したグリコシル化の組成およびパターンを有する治療用タンパク質を好み得る。

【0306】

宿主細胞のそれと異なるグリコシル化タンパク質を発現させることは、異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子操作することによって達成することができる。当技術分野で公知の技術を用いて、開業医は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体を生成することができる。例えば、酵母株において産生されたグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が動物細胞、とりわけヒト細胞のそれと同じタンパク質グリコシル化を示すように酵素株を遺伝子操作して、非天然グリコシル化酵素を発現させる（米国特許出願公開第２００４００１８５９０号および第２００２０１３７１３４号ならびに国際公開第０５／１００５８４号）。

【0307】

別の実施形態は、本発明のそのような抗体に特異的な抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄ）抗体を対象とする。ａｎｔｉ−ｉｄ抗体は、別の抗体の抗原結合領域に一般的に関連する固有の決定基を認識する抗体である。ａｎｔｉ−ｉｄは、抗体またはそのＣＤＲ含有領域により動物を免疫化することによって生産することができる。免疫化動物は、免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、応答し、ａｎｔｉ−ｉｄ抗体を産生する。ａｎｔｉ−ｉｄ抗体は、また別の動物における免疫応答を誘導し、いわゆるａｎｔｉ−ｉｄ抗体を産生する「免疫源」としても用いることができる。

【0308】

さらに、ライブラリーのメンバー宿主細胞が変異型グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生するように、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーを用いて目的のタンパク質を発現させることができることは、当業者により十分に理解される。開業医は、特定の新規なグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択し、単離することができる。さらなる態様によれば、特別に選択された新規なグリコシル化パターンを有するタンパク質は、改善または変更された生物学的特性を示す。

【0309】

さらなる態様において、本発明はまた、免疫原性産物に結合するアプタマー（下文で抗産物アプタマーとも呼ぶ）を得るための本発明の免疫原性産物の使用に関する。したがって、本発明はまた、本明細書で定義した免疫原性産物に対する特異性を有するアプタマーを得るための方法であって、
ａ）免疫原性産物を含む結合標的を準備するステップ、
ｂ）アプタマーレパートリーまたは潜在的アプタマーレパートリーを前記結合標的に曝露するステップ、および
ｃ）前記レパートリーから前記免疫原性産物に特異的に結合するアプタマーを選択するステップ
を少なくとも含む方法に関する。

【0310】

「アプタマー」は、本明細書では、その標的に対する特異的な非共有結合性結合の能力のあるオリゴ核酸またはペプチド分子を指す。アプタマーは、１つの末端または両末端において、より大きい分子に、好ましくは生化学的機能を媒介するより大きい分子に、より好ましくは不活性化および／または分解を誘導するより大きい分子に、最も好ましくはユビキチンに、または好ましくは破壊を促進するより大きい分子に、より好ましくは酵素または蛍光タンパク質に結合し得る、好ましくはペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、より好ましくは約３から１００個のモノマーのペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。

【0311】

ここで「潜在的アプタマーレパートリー」は、アミノ酸配列または核酸配列の任意のライブラリー、コレクション、アセンブリーもしくはセットを、またはインビボもしくはインビトロでアプタマーレパートリーを生産するために用いることができるアミノ酸配列のそのようなライブラリー、コレクション、アセンブリーもしくはセットの任意のジェネレーターを指すことを理解すべきである。

【0312】

別の態様において、本発明はまた、本明細書で定義した免疫原性産物に結合するアプタマーを提供する。

【0313】

本発明の好ましい実施形態において、アプタマーは、本明細書で述べたレパートリーまたは潜在的レパートリーからアプタマーを選択することを含む方法により得られる。

【0314】

特に好ましい実施形態によれば、本発明は、免疫原性産物特異的アプタマーを提供する。これらは、とりわけ、本発明の免疫原性産物に対するよりもモノマーおよびフィブリロマー型のＡβペプチドの両方に対して比較的、より小さい親和性を有するアプタマーを含む。

【0315】

本発明の免疫原性産物に結合することができる作用物も多くの潜在的な応用分野を有し、その一部を以下に述べる。それらは、治療および診断の目的のために特に有用である。

【0316】

本発明はさらに、

【0317】

【化4】

からなる群から選択されるアミノ酸配列の一部（Ｘ−Ｙ）と同一のアミノ酸配列を含み、Ｘは、数１．．１８、４．．１８、１２．．１８からなる群から選択されまたは１８であり、Ｙは数３３．．４３、３３．．４２、３３．．４１または３３．．４０からなる群から選択される分子、またはアミノ酸配列の少なくとも２つの非隣接残基が互いに共有結合している、そのクロスリンクされた誘導体に関する。

【0318】

前記分子またはそのクロスリンクされた誘導体の特定の実施形態において、（Ｘ−Ｙ）は、（１−４２）、（４−４２）、（１２−４２）または（１８−４２）からなる群から選択される。

【実施例】

【0319】

Ａβ突然変異タンパク質ペプチドは、標準的な方法を用いて合成した。

【0320】

［実施例１］
Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの調製
ａ）Ａβ（１−４２）Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマー：
ペプチド合成により得られたＡβ（１−４２）Ｅ２２Ａペプチド（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を６ｍｇ／ｍｌで１００％１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に懸濁し、完全な可溶化のために３７℃で２．５時間振とうしながらインキュベートした。ＨＦＩＰは、水素結合切断剤として作用するので、Ａβペプチドにおける先在性の構造的不均一性を解消するために用いられる。ＨＦＩＰをＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発により除去し、Ａβ（１−４２）Ｅ２２Ａをジメチルスルホキシドに５ｍＭの濃度で再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰ前処理Ａβ（１−４２）Ｅ２２Ａをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で４００μＭに希釈し、１／１０容積の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｈ_２Ｏ中）を加えた（０．２％ＳＤＳの最終濃度）。溶液を３７℃で６時間インキュベートした。次に、溶液を３容積のＨ_２Ｏでさらに希釈し、３７℃で１８時間インキュベートした。これにより、Ａβ（１−４２）Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーの生成がもたらされる。３０００ｇで２０分間の遠心分離の後、試料を透析管中で０．５ｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して室温で２．５時間にわたり２回透析した。透析物を限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）により１５倍濃縮し、１００００ｇで５分間遠心分離し、Ａβ（１−４２）Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーを含む上清を抜き取った。

【0321】

ｂ）切断型ＡβＥ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマー：
３０μｌの１ｍｇ／ｍｌサーモリシンのＨ_２Ｏ中溶液（Ｓｉｇｍａ）を実施例１ａに従って調製した０．８ｍｌのＡβ（１−４２）Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーに加えた。反応混合物を３０℃で２０時間振とうした。次いで、ｐＨ７．４の４μｌの１００ｍＭ ＥＤＴＡの水中溶液を加え、混合物を、８μｌの１０％濃度のＳＤＳ溶液を用いて０．１％のＳＤＳ含量にさらに調整した。反応混合物を室温で１０分間振とうし、次いで透析管中で０．５ｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）に対して室温で６時間、透析緩衝液の交換後にさらに２０時間透析した。透析物を除去し、さらなる使用に備えて−８０℃で保存した。

【0322】

ｃ）エタノール沈殿切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマー：
能動免疫における抗原の使用のために、実施例１ｂの切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーをエタノール沈殿させた。この目的のために、０．５−１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する１部（容積／容積；例えば、１ｍｌ）の切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを室温で解凍した。次いで８部（容積／容積；例えば、８ｍｌ）の氷冷エタノールを試料に加えた。試料を短時間混合し、１部（容積／容積、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの最初の容積に基づく；例えば、１ｍｌ）の１０ｘ−ＰＢＳ（Ｆａ．Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４２００−０６７）を加えた。その後、試料を再び短時間混合し、氷浴中で３０分間インキュベートした。試料を３０００ｇで２０分間遠心分離し、上清を捨てた。残存するペレットを適切な容積の５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に懸濁した。氷浴中で１０分間冷却した後、試料を超音波処理器（ＵＰ２００ｓ Ｄｒ．Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ ＧｍｂＨ）で最大出力の５０％で氷浴中で０℃で５×３秒間（氷上１０秒間の中間冷却を含む）超音波処理した。このステップの後、試料を分割し、さらなる使用時まで−８０℃で凍結した。

【0323】

実施例１ａ、１ｂおよび１ｃの手順を用いて、下の表２に示すＡβ突然変異タンパク質オリゴマーを調製し、タンパク質分解消化にかけ、エタノールから沈殿させた。

【0324】

［実施例２］
切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーのＡβペプチド組成物の表面増強レーザー脱離イオン化質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）半定量的判定
実施例１ｂからの１μｌの切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーを２４９μｌの５０％アセトニトリル：０．５％ＴＦＡ（５００μｌのアセトニトリル＋５００μｌの１％ＴＦＡ）で希釈した。１μｌの試料をＨ４タンパク質チップアレイ（ＢｉｏＲａｄ；カタログ番号Ｃ５７−３００２８）上にスポットした。スポットを４０℃の温インキュベータープレート上で乾燥させた。ＣＨＣＡ溶液を次のように調製した。５ｍｇのＣＨＣＡ（ＢｉｏＲａｄ；カタログ番号Ｃ３０−００００１）を１５０μｌのアセトニトリル＋１５０μｌの１％ＴＦＡに溶解した＝保存溶液（−２０℃で保存）。１０μｌの保存溶液を２０μｌのアセトニトリルおよび２０μｌの１％ＴＦＡで希釈して、作業ＣＨＣＡ溶液を得た。２μｌの作業ＣＨＣＡ溶液をスポット上に加えた。スポットを４０℃の温インキュベータープレート上で乾燥させ、以下のパラメーターを用いてＳＥＬＤＩ−ＭＳ（表面増強レーザー脱離イオン化質量分析；ＢｉｏＲａｄ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｉｐ ＳＥＬＤＩ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ ｅｄｉｔｉｏｎ）により分析した。質量範囲：５００から１００００Ｄａ；フォーカス質量：２２２０Ｄａ；マトリックス減衰：５００Ｄａ；サンプリング速度：４００ＭＨｚ；ウォーミングショット：エネルギー１１００ｎｊによる２；データショット：エネルギー１０００ｎｊによる１０；分割１／３。表２に示す切断型の他のＡβ突然変異タンパク質オリゴマーを同じ処置に供した。

【0325】

切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーのＡβペプチド組成が異なることが認められた。表２に、各切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの特徴的なＡβペプチド断片の量を示す。

【0326】

【表3】

【0327】

［実施例３］
切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーのサイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーは、ＳＥＣカラムＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ＨＲ １０／３００ＧＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、カタログ番号１７−５１７３−０１）および０．５ｍｌ／分の流量を用いて実施した。移動相は、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、ｐＨ７．４であった。実施例１ｂからの３０μｇの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを移動相で希釈して、２００μｇ／ｍｌの濃度を有する１５０μｌを得た。１００μｌのこの混合物をカラム上に負荷した。２１５ｎｍにおける消光を有するペプチドが検出された。

【0328】

切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーの得られたサイズ排除クロマトグラム（図１Ｂ）は、２６ｋＤａに対応する１１．３７ｍｌにおける主ピークならびに４５ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび４ｋＤａの微小ピークを示している。切断型Ａβ Ｆ２０Ｇ、Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマー（図１Ｃ）は、３２ｋＤａに対応する１０．８３ｍｌにおける主ピークおよび５ｋＤａの小ピークのみを有するより均一なサイズ分布を示す。参考として、それぞれ３０ｋＤａおよび２１ｋＤａに対応する１１．０４ｍｌおよび１１．８５ｍｌにおける主二重ピークならびに１５０ｋＤａおよび４ｋＤａの微小ピークを有する野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマー（図１Ａ）のサイズ排除クロマトグラムを示す。総合すれば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーのオリゴマーとしての本質は、野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマーと類似していることが確認された。

【0329】

［実施例４］
切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの直接ＥＬＩＳＡ
切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーがＰＦ−４に対する望ましくないポリクローナル交差反応性を誘発する傾向を予測するためにマウスＡβ（２０−４２）グロブロマー反応性モノクローナル抗体であるｍ７Ｃ６およびｍ４Ｄ１０を用いることによって実施例１ｂからの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの免疫反応性をさらに特徴付けた。抗体ｍ７Ｃ６は、ＰＦ−４と交差反応することが示されたが、ｍ４Ｄ１０は、ＰＦ−４と交差反応しないことが証明された。

【0330】

切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー認識の判定のために用いた直接ＥＬＩＳＡプロトコール：
試薬：
１． Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏプレート カタログ番号：４３９４５４
２． 抗原：実施例１ｂからの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー
３． コーティング緩衝液：１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム；ｐＨ８．２
４． ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ カタログ番号：１１１２５８９
５． ＰＢＳＴ緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．４
６． ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．４＋０．５％ＢＳＡ；Ｓｅｒｖａカタログ１１９２６
７． 一次抗体：
抗Ａβ ｍＡｂクローン７Ｃ６；濃度：２．８３ｍｇ／ｍｌ ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃で保存
抗Ａβ ｍＡｂクローン４Ｄ１０；濃度：８．６０ｍｇ／ｍｌ ＯＤ２８０ｎｍ；−８０℃で保存
８． 標識試薬：抗マウスＰＯＤコンジュゲート；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ． カタログ番号：７１５−０３５−１５０
９． 染色：ＴＭＢ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ カタログ番号：９２８１７０６０；ＤＭＳＯ中４２ｍＭ；水中３％Ｈ_２Ｏ_２；１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
１０． 停止溶液：２Ｍスルホン酸

【0331】

試薬の調製に用いた方法
１． 抗原溶液：
１２μｇの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを１２ｍｌのコーティング緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈した。

【0332】

２． ブロッキング試薬：
ブロッキング試薬を１００ｍｌの水に溶解して、ブロッキング保存溶液を調製し、１０ｍｌのアリコートを−２０℃で保存した。各プレートをブロックするために３ｍｌのブロッキング保存溶液を２７ｍｌの水で希釈した。

【0333】

３． 一次抗体の希釈：
Ａ）抗Ａβ ｍＡｂクローン７Ｃ６をＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡで１００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した（＝保存溶液Ａ）。

【0334】

Ｂ）抗Ａβ ｍＡｂクローン４Ｄ１０をＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡで１００ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した（＝保存溶液Ｂ）。

【0335】

【表4】

【0336】

４． 標識試薬
抗マウスＰＯＤコンジュゲート凍結乾燥物を０．５ｍｌの水で再構成した。５００μｌのグリセロールを加え、１００μｌのアリコートをさらなる使用に備えて−２０℃で保存した。濃縮標識試薬をＰＢＳＴ緩衝液で１／１００００に希釈した。試薬は、直ちに用いた。

【0337】

５． ＴＭＢ溶液：
２０ｍｌの１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．９を２００μｌのＴＭＢ溶液および２９．５μｌの３％Ｈ_２Ｏ_２溶液と混合した。溶液は、直ちに用いた。

【0338】

標準プレート設定：数は、ｎｇ／ｍｌ単位の最終抗体濃度を示す。各抗体の標準を２連で扱った。

【0339】

【表5】

【0340】

手順：
１． １ウエル当たり１００μｌの抗原溶液を加え、４℃で一夜インキュベートした。

【0341】

２． 抗原溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0342】

３． １ウエル当たり２６５μｌのブロック溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。

【0343】

４． ブロック溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0344】

５． 抗体曲線の作成の後、１ウエル当たり１００μｌの希釈系列をプレートに適用した。プレートを室温で２時間インキュベートした。

【0345】

６． 抗体溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0346】

７． １ウエル当たり２００μｌの標識溶液を加え、室温で１時間インキュベートした。

【0347】

８． 標識溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0348】

９． １００μｌのＴＭＢ溶液を各ウエルに加え、室温で５−１５分インキュベートした。

【0349】

１０． 色染色を観察し、１ウエル当たり５０μｌの停止溶液を加えた。

【0350】

１１． ４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0351】

結果：
アミノ酸位置２０−２３の領域に単一または二重アミノ酸点突然変異を導入することにより、抗体ｍ７Ｃ６による得られた切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの認識は、低下したのに対して、ｍ４Ｄ１０による認識は、低下しないまたは限定された程度に低下したに過ぎない（図２参照）。これと対照的に、エピトープをさほど正確にマッピングできないが、非ＰＦ−４交差反応性抗体４Ｄ１０によるＡβ（２０−４２）オリゴマーの認識は、主としてアミノ酸位置２７−３０の領域における点突然変異により低下する。ｍ７Ｃ６認識が低下しているが、ｍ４Ｄ１０認識は維持されている領域は、ＰＦ−４交差反応性を付随して誘発しないそれぞれのＡβ（２０−４２）突然変異オリゴマーによる免疫化によりポリクローナル免疫応答を誘発するのに関係するホットスポットを含むと解釈することができる。

【0352】

［実施例５］
切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーは、Ａβグロブロマー特異的免疫応答を誘導する
反応性Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの抗原性をげっ歯類（ウサギ、マウス）の能動免疫により試験した。前記動物から得られたポリクローナル抗血清を親和性精製し、その後、ドットブロット法を用いて異なる型のＡβに対するそれらの特異性について試験した。個々の型のＡβを連続希釈でブロットし、免疫反応で産生された抗Ａβ抗体を含有する対応する親和性精製マウス抗血清とともにインキュベートした。個々のドットブロットは、免疫化げっ歯類の異なる個体に対応する。

【0353】

［実施例５Ａ］
切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーによるマウスの能動免疫
実施例１ｃに従って調製し、完全フロイントアジュバント、アラムアジュバントと混合したまたはアジュバントと混合していない、３０μｇのエタノール沈殿切断型Ａβ Ｅ２２Ａ突然変異タンパク質オリゴマーを、マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス）に、０日目に皮下に投与した。マウスを次のスキームに従って追加抗原刺激した。ブースト１：１７日目、ブースト２：３５日目およびブースト３：５２日目。力価の決定のために、ブースト２および／または３の７−１０日後に血漿を抜き取った。

【0354】

アジュバントの調製：
アラムアジュバントの調製：
ｐＨ７．４の１ｍｌの１．４Ｍ ＮａＣｌ溶液を９ｍｌの水酸化アルミニウムゲル（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号Ａ８２２２−２５０ｍｌ）に加えた。混合物を使用前に室温で２４時間インキュベートした。

【0355】

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）：
ＣＦＡは、既製のアジュバント溶液として入手し、最初の免疫化のために用いた。すべてのその後の追加免疫のために不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いた。

【0356】

アジュバント無し：
アジュバントを用いなかった場合、１／４ＰＢＳ緩衝液（５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）を代わりに用いた。

【0357】

能動免疫の前に、１００μｌの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー（抗原）を等容積の各アジュバントと混合した。抗原／アジュバント混合物を室温で１時間インキュベートし、短時間振とうした。次いで、２００μｌの全量をマウスの頸部の皮下に注射した。ＣＦＡまたはＩＦＡをアジュバントとして用いた場合、抗原およびＣＦＡまたはＩＦＡアジュバント溶液を、懸濁液が形成されるまで混合し、それを直ちに注射に用いた。

【0358】

［実施例５Ｂ−１］
セファロースビーズによるマウス血漿試料からのポリクローナル抗体の親和性精製
セファロースビーズ上へのＡβ（２０−４２）突然変異タンパク質オリゴマーの固定化
試薬：
Ｈ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ中３０％イソプロパノール（氷浴中０℃で予冷）
Ｈ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ（氷浴中０℃で予冷）
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；ｐＨ７．５（氷浴中０℃で予冷）
１／４ＰＢＳ（５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）
１００％イソプロパノール中ＮＨＳ活性化セファロースビーズ（Ｆａ．ＧＥ＃１７−０９０６−０１）
ＴＢＳ：（２５ｍＭトリス；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）

【0359】

手順：
２ｍｌのＮＨＳ活性化セファロースビーズ（＝２．８ｍｌイソプロパノール中懸濁液）を１０ｍｌのＨ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ中３０％イソプロパノール（氷浴中０℃で予冷）で４回、１０ｍｌのＨ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ（氷浴中０℃で予冷）で４回および１０ｍｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；ｐＨ７．５（氷浴中０℃で予冷）で４回洗浄した。実施例１ｂからの０．２ｍｇの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３ｐＨ７．５＋０．１％ＳＤＳで希釈して、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマー溶液を０．２ｇの洗浄済みＮＨＳ活性化セファロースビーズに加え、混合物を室温で２時間振とうした。３０００ｇで５分間の遠心分離の後、１ｍｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／２５０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７．５＋０．１％ＳＤＳをセファロースビーズに加え、混合物を室温で１時間振とうした。試料をＰｏｌｙＰｒｅｐクロマトグラフィーカラム（Ｆａ．Ｂｉｏｒａｄ＃７３１−１５５０）中に移し、１ｍｌのＰＢＳ（５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）＋０．１％ＳＤＳで５回、次いで１ｍｌのＴＢＳで５回洗浄した。最終洗浄ステップの後、固定化Ａβ（２０−４２）突然変異タンパク質オリゴマーを有するセファロースビーズを１．５ｍｌチューブ中に移し、さらなる使用に備えて６℃で保存した。

【0360】

セファロースビーズ上へのＡβ（１−４２）モノマーの固定化
試薬：
上記を参照のこと。

【0361】

手順：
２ｍｌのＮＨＳ活性化セファロースビーズ（＝２．８ｍｌイソプロパノール中懸濁液）を１０ｍｌのＨ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ中３０％イソプロパノール（氷浴中０℃で予冷）で４回、１０ｍｌのＨ_２Ｏ中１ｍＭ ＨＣｌ（氷浴中０℃で予冷）で４回および１０ｍｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；ｐＨ７．５（氷浴中０℃で予冷）で４回洗浄した。０．８１ｍｇのＡβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を８０μｌのＨ_２Ｏ中０．１％ＮａＯＨに溶解した。５０μｌのこの１０ｍｇ／ｍｌ Ａβ（１−４２）モノマー溶液を９５０μｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３；ｐＨ７．５で希釈して、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。Ａβ（１−４２）モノマー溶液を０．５ｇの洗浄済みＮＨＳ活性化セファロースビーズに加え、混合物を室温で２時間振とうした。３０００ｇで５分間の遠心分離の後、１ｍｌの５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３／２５０ｍＭエタノールアミン、ｐＨ７．５をセファロースビーズに加え、混合物を室温で１時間振とうした。試料をＰｏｌｙＰｒｅｐクロマトグラフィーカラム中に満たし、１ｍｌのＰＢＳ（５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；３５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）で５回、次いで１ｍｌのＴＢＳで５回洗浄した。最終洗浄ステップの後、Ａβ（１−４２）モノマーを有するセファロースビーズを１．５ｍｌチューブ中に移し、さらなる使用に備えて６℃で保存した。

【0362】

マウス血漿試料からのポリクローナル抗体の親和性精製：
試薬：
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤；Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１６９７４９８００１
１／１０ＴＢＳ（２．５ｍＭトリス；１５ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）
溶出緩衝液：０．５８％ＣＨ_３ＣＯＯＨ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ
中和緩衝液：２Ｍトリス／ＨＣｌ；ｐＨ８．５
固定化切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有するセファロースビーズ
Ａβ（１−４２）モノマーを有するセファロースビーズ
切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによるマウスの免疫化により生成された抗原特異的抗体を、親和性捕捉タンパク質としてのそれぞれの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーおよびモノマーＡβ（１−４２）ペプチドの混合物を用いて親和性精製した。モノマーＡβ（１−４２）ペプチドは、抗血清中に存在する可能性がある、非グロブロマーエピトープに、例えば、ｓＡＰＰα、モノマーまたは繊維状Ａβペプチドに結合する抗体を含む、すべての抗Ａβ抗体が親和性精製されることを保証するために用いた。

【0363】

手順：
２５０μｌの各マウス血漿試料を２５０μｌのＴＢＳ＋１／５０ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（１ｍｌのＨ_２Ｏに溶解した１錠剤）と混合し、溶液を１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清を除去し、マウスの免疫化に用いた抗原に対応する切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有する５０μｌのセファロースビーズを加えた。室温で５分間振とうした後、Ａβ（１−４２）モノマーを有する１２．５μｌのセファロースビーズを加えた。混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｆｏｒｔ中で室温で１１００ｒｐｍで２０時間振とうした。次いで、セファロースビーズを２×１００μｌ ＴＢＳを用いて、ＰｏｌｙＰｒｅｐクロマトグラフィーカラム中に移し、２５０μｌのＴＢＳで４回、２５０μｌの１／１０ＴＢＳで２回洗浄した。最終洗浄ステップの後、ビーズを１００μｌの０．５８％ＣＨ_３ＣＯＯＨ／１４０ｍＭ ＮａＣｌで２回、次いで１２０μｌの０．５８％ＣＨ_３ＣＯＯＨ／１４０ｍＭ ＨＣｌで１回溶出した。溶出液（約２５０−２７０μｌ）を、２２μｌの２Ｍトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．５を前負荷した１．７ｍｌチューブに収集した。溶出ステップの後、試料を直ちに混合し、次いでさらなる使用に備えて−８０℃で保存した。マウス血漿からの親和性精製ポリクローナル抗体のタンパク質濃度は、ＴＢＳのみの参照ブランクと対照して２８０ｎｍにおける各親和性精製溶出液の吸収を測定することによって決定した。Ａβグロブロマーに対する親和性精製ポリクローナル抗体の結合は、直接ＥＬＩＳＡにより確認した。

【0364】

［実施例５Ｂ−２］
磁性ダイナビーズによるマウス血漿試料からのポリクローナル抗体の親和性精製
トシル活性化ダイナビーズ上への切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーの固定化：
試薬：
ダイナビーズＭ−２８０トシル活性化、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１４２−０４；２×１Ｅ０９ビーズ／ｍｌ
１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５
１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５＋０．５％ＢＳＡ
ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）
ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）＋０．１ＢＳＡ
ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）＋０．１ＢＳＡ＋０．０２％アジ化ナトリウム

【0365】

手順：
ダイナビーズの保存懸濁液を発泡を防ぐために注意深く振とうすることによって均一化した。６６μｌの懸濁液を除去し、１．５ｍｌ反応バイアルに移した。ダイナビーズを２００μｌの１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５で２×２分洗浄した。洗浄手順において、磁気セパレータスタンド（ＭＳＳ）を用いて反応バイアルの壁にダイナビーズを固定化すると同時に上清を注意深く除去した。洗浄済みダイナビーズを１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５中で１００μｇの切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーとともにインキュベートした。試料を３７℃で２０分間振とうした。次いで、試料を１００ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．５＋０．５％ＢＳＡで１：２に希釈し、３７℃で一夜振とうした。固定化切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有するダイナビーズを２００μｌのＰＢＳで２×５分（再びＭＳＳを用いて）、２００μｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで２×５分洗浄し、最後に０．２ｍｌのＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウムに再懸濁し、短時間遠心分離した。固定化切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有する洗浄済みダイナビーズをさらなる使用まで４℃で保存した。

【0366】

マウス血漿試料からのｐＭＡｂの親和性精製：
試薬：
ＰＢＳ（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）
ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）
ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ
溶出緩衝液：０．５８％ＣＨ_３ＣＯＯＨ／１４０ｍＭ ＮａＣｌ
中和緩衝液：２Ｍトリス／ＨＣｌ；ｐＨ８．５
固定化切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有するダイナビーズ

【0367】

手順：
１０μｌのマウス血漿試料を８０μｌのＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡで希釈した。固定化切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーを有する、１０μｌのダイナビーズを加えた。室温で一夜（約２０時間）振とうすることによって免疫沈降を行った。ＭＳＳを用いてダイナビーズを固定化した。上清を注意深く除去し、捨て、ダイナビーズを５００μｌのＰＢＳＴで１×５分、５００μｌのＰＢＳで１×５分および５００μｌの２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５で１×３分洗浄した。洗浄緩衝液の最終除去の後、反応バイアルを再度遠心分離し、残存する液体を注意深く、完全に除去した。ダイナビーズを２５μｌの溶出緩衝液に懸濁し、室温で２分間振とうした。反応バイアル４０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、ＭＳＳに戻し、上清（すなわち、溶出液）を注意深く除去し、９７５μｌのＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡに加えた。１μｌの中和緩衝液を加え、試料を直ちに約２−３秒間混合した。Ａβグロブロマーに対する親和性精製ポリクローナル抗体の結合は、ＥＬＩＳＡにより確認した。

【0368】

［実施例５Ｃ］
ドットブロットによる抗体選択性の解析
Ａβ（２０−４２）突然変異タンパク質グロブロマー誘導性免疫応答の選択性を特徴付けるために、親和性精製ポリクローナル抗血清を種々のＡβ形態に対する結合について試験した。この目的のために、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したＰＢＳ中１００ｐｍｏｌ／μｌから０．００００１ｐｍｏｌ／μｌの範囲の個々のＡβ形態の連続希釈物を調製した。各希釈物１μｌをニトロセルロース膜上にブロットした。検出は、対応する親和性精製ポリクローナル抗体（０．２μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした後、ペルオキシダーゼ−（ＰＯＤ−）コンジュゲートＩｇＧ（マウスの抗血清については抗マウス−ＰＯＤ、ウサギ抗血清については抗ウサギ−ＰＯＤ）およびＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ）で免疫染色することによって行った。

【0369】

ドットブロット用のＡβ標準
１． Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１２−４２）グロブロマーは、参照例４に記載されている通りに調製した。

【0370】

２． Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）グロブロマーは、参照例３に記載されている通りに調製した。

【0371】

３． Ａβ（２０−４２）グロブロマー
Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、参照例５に記載されている通りに調製した。

【0372】

４． Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮａＯＨ
Ａβ（１−４０）モノマーは、参照例１に記載されている通りに調製した。

【0373】

５． Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨ
Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨは、参照例２に記載されている通りに調製した。

【0374】

６． Ａβ（１−４２）フィブリル
Ａβ（１−４２）フィブリルは、参照例６に記載されている通りに調製した。

【0375】

７． ｓＡＰＰα
ｓＡＰＰαは、参照例７に記載されている通りに調製した。

【0376】

ドットブロット用の材料
１００ｐｍｏｌ／μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌ、１ｐｍｏｌ／μｌ、０．１ｐｍｏｌ／μｌ、０．０１ｐｍｏｌ／μｌ、０．００１ｐｍｏｌ／μｌ、０．０００１ｐｍｏｌ／μｌおよび０．００００１ｐｍｏｌ／μｌの濃度を得るための２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中Ａβ標準（上記の１．から７．参照）の連続希釈物

【0377】

ニトロセルロース：Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ転写媒体、純ニトロセルロース膜（０．２μｍ）；ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウス−ＰＯＤ：カタログ番号：７１５−０３５−１５０（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
検出試薬：ＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質、沈殿、カタログ番号：１１４４２０６６００１（Ｒｏｃｈｅ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）：カタログ番号：１１９２６（Ｓｅｒｖａ）
ブロッキング試薬：ＴＢＳ中５％低脂肪乳
緩衝溶液：
ＴＢＳ：２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ
ＴＴＢＳ：２５ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４緩衝液ｐＨ７．４＋１４０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ：２０ｍｌのＴＢＳ中１％低脂肪乳中０．２μｇ／ｍｌ抗体
抗体：
抗Ａβマウスモノクローナル抗体クローン６Ｅ１０；濃度：１ｍｇ／ｍｌ；カタログ番号：ＳＩＧ３９３２０（Ｃｏｖａｎｃｅ）；−８０℃で保存
実施例５Ｂ−１からの親和性精製マウスポリクローナル抗Ａβ抗体、−８０℃で保存
抗体溶液ＩＩ：マウス抗体の検出用：ＴＢＳ中１％低脂肪乳中抗マウスＰＯＤの１：５０００希釈物
ドットブロットの手順：
１） ８つの濃度の異なるＡβ標準（連続希釈により得られた）のそれぞれの１μｌをニトロセルロース膜上の互いから約１ｃｍの距離の箇所に滴下した。

【0378】

２） Ａβ標準のドットをニトロセルロース膜上で室温で少なくとも１０分間風乾した（＝ドットブロット）。

【0379】

３） ブロッキング：ドットブロットを３０ｍｌのＴＢＳ中５％低脂肪乳とともに室温で１．５時間インキュベートした。

【0380】

４） 洗浄：ブロッキング溶液を捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。

【0381】

５） 抗体溶液Ｉ：洗浄緩衝液を捨て、ドットブロットを抗体溶液Ｉとともに室温で２時間インキュベートした。

【0382】

６） 洗浄：抗体溶液Ｉを捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。洗浄溶液を捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。洗浄溶液を捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。

【0383】

７） 抗体溶液ＩＩ：洗浄緩衝液を捨て、ドットブロットを抗体溶液ＩＩとともに室温で１時間インキュベートした。

【0384】

８） 洗浄：抗体溶液ＩＩを捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。洗浄溶液を捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。洗浄溶液を捨て、ドットブロットを２０ｍｌのＴＢＳとともに振とうしながら室温で１０分間インキュベートした。

【0385】

９） 展開：洗浄溶液を捨てた。ドットブロットを７．５ｍｌのＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質により５分間展開した。展開は、Ｈ_２Ｏ ｐＨ５．３（ｐＨはリン酸二水素ナトリウム結晶で調整）によるドットブロットの強い洗浄により停止した。

【0386】

１０） 定量的評価は、ＧＳ８００濃度計（ＢｉｏＲａｄ）およびソフトウエアパッケージＱｕａｎｔｉｔｙ ｏｎｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．５．０（ＢｉｏＲａｄ）を用いてドット強度の濃度測定解析に基づいて行った。最後の光学的に明確に同定されたＡβ（２０−４２）グロブロマーのドットの相対密度の２０％を超える相対密度を有するドットのみを評価した。この閾値は、すべてのドットブロットについて独立に決定した。計算値は、所定の抗体についてのＡβ（２０−４２）グロブロマーおよびそれぞれのＡβ形態の認識の間の関係を示す。

【0387】

ドットブロット分析は、異なるマウスモノクローナル（ｍ６Ｅ１０）およびポリクローナル抗Ａβ抗体を用いて行った。ポリクローナル抗Ａβ抗体は、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによるマウスの能動免疫とその後の親和性精製によって得た（実施例５参照）。個々のＡβ形態を連続希釈に適用し、免疫反応のために各抗体とともにインキュベートした（１＝Ａβ（１−４２）グロブロマー；２＝Ａβ（２０−４２）グロブロマー；３＝Ａβ（１−４０）モノマー、０．１％ＮａＯＨ；４＝Ａβ（１−４２）モノマー、０．１％ＮａＯＨ；５＝Ａβ（１−４２）フィブリル調製物；６＝ｓＡＲＰα（Ｓｉｇｍａ）（第１のドット：１ｐｍｏｌ）；７＝Ａβ（１２−４２）グロブロマー）。結果を表３に示す。

【0388】

【表6】

【0389】

【表7】

【0390】

【表8】

【0391】

【表9】

【0392】

【表10】

【0393】

【表11】

【0394】

【表12】

【0395】

【表13】

【0396】

ドットブロット結果から、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによるマウスの免疫化により、野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマーについても以前に示された、Ａβグロブロマーエピトープに対する高度に選択的な免疫応答が誘導されることがわかる。ドットブロットにおいて、ポリクローナル免疫応答の認識を、アルツハイマー病患者の脳に存在するグロブロマーエピトープを提示する野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマーと対照して試験した。我々は、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーは、ヒト体内で生じないと推測している。しかし、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによる免疫化により、所望の通りに、野生型Ａβグロブロマーエピトープをまだ認識することができた免疫応答が誘導された。したがって、切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによる能動免疫は、アルツハイマー病トランスジェニックマウスモデルにおける認知障害を反転するのに有効であると予期することができる。その理由は、誘発された抗体反応のポリクローナル抗血清ドットブロットプロファイルが、インビボでのグロブロマーエピトープの認識に関して野生型Ａβ（２０−４２）グロブロマーによる能動免疫により誘発された反応のそれと同等であるからである。後者は、物体認識課題における認知障害を反転することが証明された。

【0397】

［実施例６］
整列化サンドイッチＥＬＩＳＡによるカニクイザル血漿中のＰＦ−４との交差反応の判定

【0398】

［実施例６Ａ］
セファロースビーズにより親和性精製したポリクローナルマウス抗体のＰＦ−４交差反応性
材料：
Ｆ９６ Ｃｅｒｔ．Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ−Ｉｍｍｕｎｏプレート：カタログ番号４３９４５４
実験における結合抗体：
・実施例５Ｂ−１からの種々の切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによる免疫化後のマウス血漿試料からセファロースビーズにより親和性精製したポリクローナル抗体
・市販の参照抗ＰＦ−４抗体：モノクローナル抗ＨＰＦ４抗体（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ４９７３５）
コーティング緩衝液：１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム：ｐＨ９．６
ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ カタログ番号：１１１２５８９
ＰＢＳＴ緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．４
ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液：２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０；ｐＨ７．４＋０．５％ＢＳＡ；Ｓｅｒｖａカタログ番号１１９２６
カニクイザル血漿：１３匹の異なるドナーからのカニクイザルＥＤＴＡ血漿プール；−３０℃で保存
トリプシン阻害剤：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｔ７９０２
整列化抗体：抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的；ヤギにおいて産生；Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｍ３５３４；２．３ｍｇ／ｍｌ；−２０℃で保存
検出抗体：ポリクローナルウサギ抗ＰＦ−４抗体ｐＲＡｂ−ＨＰＦ４；０．５ｍｇ／ｍｌ；Ａｂｃａｍカタログ番号：ａｂ９５６１
標識試薬：抗ウサギＰＯＤコンジュゲート；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ． カタログ番号：１１１−０３６−０４５
染色溶液：ＤＭＳＯ中４２ｍＭ ＴＭＢ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ カタログ番号：９２８１７０６０）；水中３％Ｈ_２Ｏ_２；１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
停止溶液：２Ｍスルホン酸
試薬の調製：
整列化抗体：整列化抗体をコーティング緩衝液で１０μｇ／ｍｌに希釈した。

【0399】

ブロッキング溶液：ブロッキング試薬を１００ｍｌの水に溶解して、ブロッキング保存溶液を調製し、１０ｍｌのアリコートを−２０℃で保存した。ブロックする各プレートについて３ｍｌのブロッキング保存溶液を２７ｍｌの水で希釈した。

【0400】

各結合抗体をＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液で３．１６μｇ／ｍｌに希釈した（保存溶液）。各親和性精製ポリクローナル抗体調製物の希釈系列を以下のように調製した。

【0401】

【表14】

【0402】

カニクイザル血漿：
５ｍｌのカニクイザル血漿プールを１００００ｇで１０分間遠心分離した。４．５ｍｌの上清を除去し、４０．５ｍｌのＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡで希釈した（＝１：１０希釈）。次いで４５０μｌのＨ_２Ｏ中１０ｍｇ／ｍｌトリプシン阻害剤を加えた。室温で１０分間のインキュベーションの後、試料を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＳＬＧＳ０２５０Ｓ）を通して濾過した。

【0403】

標識試薬：
凍結乾燥された抗ウサギＰＯＤコンジュゲートを０．５ｍｌの水で再構成した。５００μｌのグリセロールを加え、１００μｌのアリコートをさらなる使用に備えて２０℃で保存した。濃縮標識試薬をＰＢＳＴ緩衝液で希釈した。希釈係数は、１：５０００であった。試薬は、直ちに使用した。

【0404】

結合抗体プレートの設定：数は、結合抗体の最終濃度をｎｇ／ｍｌの単位で示す。各結合抗体の各濃度を２連で扱った。

【0405】

【表15】

【0406】

手順：
１． １ウエル当たり１００μｌの整列化抗体溶液を加え、６℃で一夜インキュベートした。

【0407】

２． 抗体溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0408】

３． １ウエル当たり２６５μｌのブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートした。

【0409】

４． ブロッキング溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0410】

５． 各結合抗体の希釈系列の調製の後、１ウエル当たり１００μｌのこれらの抗体希釈物をプレートに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。

【0411】

６． 抗体溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0412】

７． １ウエル当たりカニクイザル血漿の１：１０希釈物１００μｌを加え、室温で２時間インキュベートした。

【0413】

８． 血漿溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0414】

９． １ウエル当たり１００μｌの一次抗体溶液を加え、室温で１時間インキュベートした。

【0415】

１０． 一次抗体溶液を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0416】

１１． １ウエル当たり２００μｌの標識試薬を加え、室温で１時間インキュベートした。

【0417】

１２． 標識試薬を捨て、ウエルを２５０μｌのＰＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。

【0418】

１３． １００μｌのＴＭＢ溶液を各ウエルに加えた。

【0419】

１４． 展開中（周囲温度で５−１５分）プレートの色をモニターし、適切な色が発現した場合に５０μｌ／ウエルの停止溶液を加えることにより反応を終結させた。

【0420】

１５． ４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0421】

データ解析：
結合抗体濃度（Ｘ値）を式Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）を用いて対数変換した。データは、抗体の量（ｎｇ／ｍｌで表した）として表したＸ軸上に対数変換Ｘ値を用いてプロットした。行ＨにおけるそれぞれのＰＢＳＴブランクのＯＤ（４５０ｎｍ）値を行Ａ−Ｇにおける各縦列のポリクローナルマウス抗体希釈系列の値から差し引いた。得られたバックグラウンド補正ＯＤ（４５０ｎｍ）値をＹ軸上にプロットした。濃度効果曲線は、データ解析ソフトウエアパッケージＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、「最小二乗（通常）適合」適合法（「Ｓ字形用量反応（可変勾配）適合法」に等しい）による非線形回帰「四パラメーターロジスティック式」を用いた曲線当てはめによりこれらのデータポイントから計算した。曲線当てはめは、データの視覚化の目的のためにのみ実施したのであって、さらなる計算、すなわち、曲線下面積の計算のための基礎としては一切用いていない。曲線下面積（ＡＵＣ、または総ピーク面積）は、測定範囲（３．１６ｎｇ／ｍｌから３１６０ｎｇ／ｍｌの最終血漿希釈物）における非曲線当てはめデータである対数変換Ｘ値およびＯＤ（４５０ｎｍ）値に基づいて決定した。以下の計算設定をデータ解析ソフトウエアパッケージＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）内で用いた。

【0422】

・ベースラインをＹ＝０．０に設定した。

【0423】

・最小ピーク高：最小値から最大値Ｙまでの距離の１０％未満であるピークを無視する。

【0424】

・ピークの方向：定義により、すべてのピークは、ベースラインより上に行かなければならない。

【0425】

各抗体について、ＰＦ４認識についての参照抗体としての市販の抗ＨＰＦ４抗体（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ４９７３５）を用いてＰＦ４識別係数（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を計算した。

【0426】

【数1】

【0427】

実施例６Ａの結果を表４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示す。

【0428】

【表16】

【0429】

【表17】

【0430】

【表18】

【0431】

［実施例６Ｂ］
磁性ダイナビーズにより親和性精製したポリクローナルマウス抗体のＰＦ−４交差反応性
材料および試薬の調製は、以下の実験における結合抗体を除いて、実施例６Ａにおけるものに対応している。

【0432】

・実施例５Ｂ−２からの各種切断型Ａβ突然変異タンパク質オリゴマーによる免疫化後のマウス血漿試料から活性化ダイナビーズにより親和性精製したポリクローナル抗体
・市販の参照抗ＰＦ−４抗体：モノクローナル抗ＨＰＦ４抗体（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ４９７３５）
磁性ダイナビーズによるマウス血漿の親和性精製後に実施例５Ｂ−２で得られた試料は、１：１００の前希釈を有していた。この親和性精製血漿保存溶液は、ここでさらなる希釈系列に用いた。各親和性精製ポリクローナル抗体調製物の希釈系列は、以下のように調製した。

【0433】

【表19】

【0434】

カニクイザル血漿および標識試薬は、実施例６Ａと同様に調製した。

【0435】

結合抗体プレートの設定：数は、結合抗体の希釈度を示す。各結合抗体の各濃度を２連で扱った。

【0436】

【表20】

【0437】

手順は、実施例６Ａの手順に対応している。

【0438】

データ解析：
結合抗体の希釈係数（Ｘ値）を式Ｘ＝ｌｏｇ（Ｘ）を用いて対数変換した。データは、血漿の希釈度（１：Ｘ）として表したＸ軸上に対数変換Ｘ値を用いてプロットした。それぞれのＰＢＳＴブランクのＯＤ（４５０ｎｍ）値を各縦列の血漿希釈系列の値から差し引いた。得られたバックグラウンド補正ＯＤ（４５０ｎｍ）値をＹ軸上にプロットした。希釈度効果曲線は、データ解析ソフトウエアパッケージＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、「最小二乗（通常）適合」適合法（「Ｓ字形用量反応（可変勾配）適合法」に等しい）による非線形回帰「四パラメーターロジスティック式」を用いた曲線当てはめによりこれらのデータポイントから計算した。曲線当てはめは、データの視覚化の目的のためにのみ実施したのであって、さらなる計算、すなわち、曲線下面積の計算のための基礎としては一切用いていない。曲線下面積（ＡＵＣ、または総ピーク面積）は、測定範囲（１：１００から１：１２５００の最終血漿希釈係数）における非曲線当てはめデータである対数変換Ｘ値およびＯＤ（４５０ｎｍ）値に基づいて決定した。以下の計算設定をデータ解析ソフトウエアパッケージＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）内で用いた。

【0439】

・ベースラインをＹ＝０．０に設定した。

【0440】

・最小ピーク高：最小値から最大値Ｙまでの距離の１０％未満であるピークを無視する。

【0441】

・ピークの方向：定義により、すべてのピークは、ベースラインより上に行かなければならない。

【0442】

［参照例１］
Ａβ（１−４０）モノマー（０．１％ＮａＯＨ）
１ｍｇのＡβ（１−４０）（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１１９４）を２３２．６μｌのＨ_２Ｏ中０．１％ＮａＯＨ（新たに調製した）に溶解し（＝４．３ｍｇ／ｍｌ＝１ｎｍｏｌ／１μｌ）、直ちに室温で３０秒間振とうして、透明な溶液を得た。試料をさらなる使用に備えて−２０℃で保存した。

【0443】

［参照例２］
Ａβ（１−４２）モノマー（０．１％ＮａＯＨ）
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を２２２．２μｌのＨ_２Ｏ中０．１％ＮａＯＨ（新たに調製した）に溶解し（＝４．５ｍｇ／ｍｌ＝１ｎｍｏｌ／１μｌ）、直ちに室温で３０秒間振とうして、透明な溶液を得た。試料をさらなる使用に備えて−２０℃で保存した。

【0444】

［参照例３］
Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）合成ペプチド（Ｈ−１３６８、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１００％１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に６ｍｇ／ｍｌで懸濁し、完全な可溶化のために振とうしながら３７℃で１．５時間インキュベートした。ＨＦＩＰは、水素結合切断剤として作用するので、Ａβペプチドにおける先在性の構造的不均一性を解消するために用いられる。ＨＦＩＰをＳｐｅｅｄＶａｃで蒸発により除去し、Ａβ（１−４２）をジメチルスルホキシドに５ｍＭの濃度で再懸濁し、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰ前処理Ａβ（１−４２）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で４００μＭに希釈し、１／１０容積の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（Ｈ_２Ｏ中）を加えた（０．２％ＳＤＳの最終濃度）。３７℃での６時間のインキュベーションにより１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー中間体がもたらされた。３容積のＨ_２Ｏでさらに希釈し、３７℃で１８時間インキュベートすることによって３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーが生成された。３０００ｇで２０分間の遠心分離の後に試料を限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮し、５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００ｇで１０分間遠心分離し、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を抜き取った。

【0445】

［参照例４］
Ａβ（１２−４２）グロブロマー
参照例３の２ｍｌのＡβ（１−４２）グロブロマー調製物を３８ｍｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）および１５０μｌの水中１ｍｇ／ｍｌ ＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と混ぜ合わせた。反応混合物を室温で６時間撹拌し、続いてさらなる１５０μｌの水中１ｍｇ／ｍｌ ＧｌｕＣエンドプロテイナーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。反応混合物を室温でさらに１６時間撹拌した後、８μｌの５Ｍ ＤＩＦＰ溶液を加えた。反応混合物を１５ｍｌの３０ｋＤａ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブにより約１ｍｌに濃縮した。濃縮物を９ｍｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）と混ぜ合わせ、再び１ｍｌに濃縮した。濃縮物を透析管中で１ｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ ＮａＣｌ）に対して６℃で１６時間透析した。透析物は、１％濃度のＳＤＳの水中溶液を用いて０．１％のＳＤＳ含量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（１２−４２）グロブロマー上清を抜き取った。

【0446】

［参照例５］
Ａβ（２０−４２）グロブロマー
参照例３の１．５９ｍｌのＡβ（１−４２）グロブロマー調製物を３８ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４）および２００μｌの１ｍｇ／ｍｌサーモリシン水中溶液（Ｒｏｃｈｅ）と混ぜ合わせた。反応混合物を室温で２０時間撹拌した。次いで８０μｌの１００ｍＭ ＥＤＴＡ水中溶液、ｐＨ７．４を加え、混合物を４００μｌの１％濃度のＳＤＳ溶液を用いて０．０１％のＳＤＳ含量にさらに調整した。反応混合物を１５ｍｌの３０ｋＤｓ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐチューブにより約１ｍｌに濃縮した。濃縮物を９ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ、０．０２％ＳＤＳ、ｐＨ７．４）と混ぜ合わせ、再び１ｍｌに濃縮した。濃縮物を透析管中で１ｌの緩衝液（５ｍＭリン酸ナトリウム、３５ｍＭ ＮａＣｌ）に対して６℃で１６時間透析した。透析物は、２％濃度のＳＤＳの水中溶液を用いて０．１％のＳＤＳ含量に調整した。試料を１００００ｇで１０分間遠心分離し、Ａβ（２０−４２）グロブロマー上清を抜き取った。

【0447】

［参照例６］
Ａβフィブリル
１ｍｇのＡβ（１−４２）（Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｈ−１３６８）を５００μｌの水性０．１％ＮＨ_４ＯＨ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ管）に溶解し、試料を室温で１分間撹拌した。試料を１００００×ｇで５分間遠心分離し、上清を抜き取った。１００μｌのこの新たに調製したＡβ（１−４２）溶液を３００μｌの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。ｐＨを１％ＨＣｌでｐＨ７．４に調整した。試料を３７℃で２４時間インキュベートし、遠心分離した（１００００ｇで１０分）。上清を捨て、フィブリルペレットを４００μｌの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で２回洗浄し、次いで最後に４００μｌの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて１分間ボルテックス混合することによって再懸濁した。

【0448】

［参照例７］
ｓＡＰＰα
Ｓｉｇｍａから供給された（カタログ番号Ｓ９５６４；２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中２５μｇ）。ｓＡＰＰαは、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡで０．１ｍｇ／ｍｌ（＝１ｐｍｏｌ／μｌ）に希釈した。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【配列表】

2017532289000001.app

【国際調査報告】