特表 2017-532979 ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-532979(P2017-532979A)

(43)【公表日】2017年11月9日

(54)【発明の名称】ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞へのペプチド媒介輸送

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171013BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20171013BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20171013BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20171013BHJP

   C07K 14/05 20060101ALI20171013BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20171013BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20171013BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20171013BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20171013BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171013BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20171013BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12P21/02 C

   C07K19/00

   C12N9/22

   C07K14/05

   C07K7/08

   C07K14/47

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N1/15

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】114

(21)【出願番号】特願2017-524407(P2017-524407)

(86)(22)【出願日】2015年11月3日

(85)【翻訳文提出日】2017年7月6日

(86)【国際出願番号】US2015058760

(87)【国際公開番号】WO2016073433

(87)【国際公開日】20160512

(31)【優先権主張番号】62/075,999

(32)【優先日】2014年11月6日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】390023674

【氏名又は名称】イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ライアン・エル・フリッシュ

(72)【発明者】

【氏名】シャオチュン・ファン

(72)【発明者】

【氏名】ソン−ピョ・ホン

(72)【発明者】

【氏名】エセル・ノーランド・ジャクソン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC07

4B050CC10

4B050DD02

4B050GG06

4B050LL05

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA26X

4B065AA49Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AB01

4B065AB10

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA30

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA60

4H045EA65

4H045FA74

(57)【要約】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成している組成物を開示する。ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる。ある実施形態のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素は適切なＲＮＡ構成要素と結合して、特異的ＤＮＡターゲッティングが可能なＲＧＥＮを提供することができる。さらに、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つのＣＰＰを含む組成物、ＲＧＥＮタンパク質を微生物細胞に輸送する方法、ならびにＤＮＡをＲＧＥＮでターゲッティングする方法を開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。

【請求項2】

前記ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、前記微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合し、前記ＲＧＥＮは前記標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的部位配列で切断することができる請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＲＧＥＮは、ＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的部位配列で切断することができる請求項２に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質−９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合している請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは非共有結合的に結合している請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＣＰＰはカチオン性または両親媒性である請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

ＣＰＰは、
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、または
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ
を含む請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は微生物細胞の細胞壁および細胞膜を横断することができる請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

請求項１に記載の組成物を含む細胞。

【請求項12】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法であって、
前記微生物細胞を、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の前記タンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程
を含み、
前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、
前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、前記細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより前記微生物細胞に侵入する方法。

【請求項13】

（ｉ）前記組成物は、さらに、少なくとも１つの、前記ＲＧＥＮの前記タンパク質構成要素と結合するＲＮＡ構成要素を含む、または
（ｉｉ）前記微生物細胞は、前記ＲＮＡ構成要素を含み、ここで、前記ＲＮＡ構成要素は、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が前記微生物細胞に侵入した後、前記ＲＧＥＮの前記タンパク質構成要素と結合し、
前記ＲＮＡ構成要素は、前記細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み、前記ＲＧＥＮは前記標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を前記標的部位配列で切断することができる請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＧＥＮは、前記標的部位配列でＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断することができる請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記微生物細胞は、前記標的部位配列または前記標的部位配列近傍の配列と相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、かつ前記ドナーポリヌクレオチドは相同組み換えによって前記標的部位配列または前記標的部位配列近傍でインテグレートされる請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、前記ヌクレオチド配列はプロモータ配列に機能可能なように結合されるポリヌクレオチド配列。

【請求項17】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質の産生方法であって、
（ａ）請求項１６に記載のポリヌクレオチド配列を供給する工程；
（ｂ）前記ポリヌクレオチド配列から前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を発現させて、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を産生する工程であって、前記発現は、場合により、細胞内で行われる工程；および
（ｃ）任意選択により、工程（ｂ）で産生された前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を単離する工程
を含む方法。

【請求項18】

ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素と、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物であって、前記タンパク質組成物とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。

【請求項19】

細胞のゲノムの標的部位を修飾する方法であって、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に供給する工程を含み、前記ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰの複合体を形成しており、かつ前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１４年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／０７５９９９号明細書の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、分子生物学の分野に属する。詳しくは、本発明は、細胞透過ペプチドを用いたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのタンパク質構成要素の細胞への輸送に関する。

【0003】

電子的手段によって提出された配列表の参照
配列表の認証謄本が、２０１５年１０月１３日作成の２０１５１０１３＿ＣＬ６２７３ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名の、３８４キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

生物における遺伝子の機能を理解する方法が、その発現を阻害することである。遺伝子発現の阻害は、例えば、遺伝子のＤＮＡ配列を分断して、または欠失させて、遺伝子の「ノックアウト」をもたらすことによって達成され得る（非特許文献１）。遺伝子ノックアウトは殆どの場合、相同組換え（ＨＲ）を介して実行され、この技術は、細菌から哺乳類まで広範囲の生物にわたって適用可能である。遺伝子機能を研究するための別の方式が、遺伝的「ノックイン」を介してなされ得、これもまた通常、ＨＲによって実行される。遺伝子ターゲティング（ノックアウトまたはノックイン）を目的とするＨＲは、標的部位との相同性を有する、外因的に供給されるＤＮＡの存在を利用することができる（「ドナーＤＮＡ」）。

【0005】

遺伝子ターゲティング用のＨＲは、標的とされるＤＮＡ部位が二本鎖切断を含有する場合に高められることが示された（非特許文献２；非特許文献３）。したがって、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングを促進するように二本鎖切断を導入する戦略が開発されてきた。例えば、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼが、特定のＤＮＡ部位を切断するように操作されて、ドナーＤＮＡが存在する場合に、当該部位にてＨＲのレベルが高められた（非特許文献４；非特許文献５）。同様に、人工メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）および転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼもまた、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングで用いるために開発された（非特許文献６；非特許文献７）。

【0006】

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）ＤＮＡ切断系をコードする遺伝子座が、細菌ゲノムの約４０％、そして古細菌ゲノムの大半で排他的に見出されている（非特許文献８；非特許文献９）。特に、ＩＩ型ＣＲＩＰＳＲ系のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、Ｃａｓ９が、ドナーＤＮＡでＨＲを刺激する部位特異的ＤＮＡ鎖切断を導入する手段として開発された（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）。Ｃａｓ９のＲＮＡ構成要素の配列は、Ｃａｓ９が、（ｉ）ＲＮＡ構成要素の一部と相補的な配列、および（ｉｉ）プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含有するＤＮＡを認識して切断するように設計し得る。

【0007】

天然のＣａｓ９／ＲＮＡ複合体は、２つのＲＮＡ配列、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、標的ＤＮＡ部位と相補的なユニーク配列、および、ｃｒＲＮＡが由来したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる配列の一部を含有する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、およびステムループ含有部分を含有する。最近の研究では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が開発され、これは、５’から３’の方向に、ｃｒＲＮＡ、およびこれに結合するｔｒａｃｒＲＮＡを含有するキメラ配列である（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）。

【0008】

いくつかの研究では、細胞中でＣａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを実行するためのタンパク質およびＲＮＡ構成要素が、組み換えＤＮＡ発現戦略によって提供されている。例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、核酸に基づく発現系を用いて、細胞内で発現されている。ある細胞型においてｇＲＮＡなどのＲＮＡ構成要素を発現させる方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモータを用いるものであり、これは、正確に定義された、非修飾５’末端および３’末端を有するＲＮＡの転写を可能とする（非特許文献１０；非特許文献１１）。これらのタンパク質およびＲＮＡ発現技術は、トウモロコシおよびダイズ（米国仮特許出願第６１／８６８７０６号明細書、２０１３年８月２２日出願）、ならびにヒト、マウス、ゼブラフィッシュ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属およびサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含むいくつかの異なる種の細胞において利用されてきている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ａｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３６：９２１−９２４

【非特許文献2】Ｒｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２：５１９−５３４

【非特許文献3】Ｓｍｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：５０１２−５０１９

【非特許文献4】Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００：７６４

【非特許文献5】Ｂｉｂｉｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７

【非特許文献6】Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２

【非特許文献7】Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４３−１４８

【非特許文献8】Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０

【非特許文献9】Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３７：７−１９

【非特許文献10】ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３

【非特許文献11】Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

これらの利点があるにもかかわらず、微生物細胞などの細胞において、Ｃａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを媒介する、タンパク質およびＲＮＡ構成要素を供給する他の手段に関心がもたれている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

一実施形態では、本発明は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物に関する。

【0012】

第２の実施形態では、ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合し、ＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる。第３の実施形態では、ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。第４の実施形態では、ＲＧＥＮは、ＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる。

【0013】

第５の実施形態では、ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質−９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む。

【0014】

第６の実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合している。

【0015】

第７の実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは非共有結合的に結合している。

【0016】

第８の実施形態では、ＣＰＰはカチオン性または両親媒性である。

【0017】

第９の実施形態では、ＣＰＰは、（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、または（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰを含む。

【0018】

第１０の実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は微生物細胞の細胞壁および細胞膜を横断することができる。

【0019】

第１１の実施形態は、本明細書に記載の組成物を含む微生物細胞に関する。

【0020】

第１２の実施形態は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法に関する。この方法は、微生物細胞を、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程を含み、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成している。この接触工程の結果として、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより微生物細胞に侵入することができる。

【0021】

第１３の実施形態では、この方法に関し、（ｉ）組成物は、さらに、少なくとも１つの、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合するＲＮＡ構成要素を含む、または（ｉｉ）微生物細胞は、ＲＮＡ構成要素を含み、ここで、ＲＮＡ構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が微生物細胞に侵入した後、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合し、（ｉ）または（ｉｉ）のＲＮＡ構成要素は、微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み、かつＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる。第１４の実施形態では、ＲＧＥＮは、標的部位配列でＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断することができる。第１５の実施形態では、微生物細胞は、標的部位配列または標的部位配列近傍の配列と相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含み、ドナーポリヌクレオチドは相同組み換えによって標的部位配列、または標的部位配列近傍でインテグレートされる。

【0022】

第１６の実施形態は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により、ヌクレオチド配列はプロモータ配列に機能可能なように結合するポリヌクレオチド配列に関する。

【0023】

第１７の実施形態は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を産生する方法に関する。この方法は、（ａ）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、場合によりこのヌクレオチド配列はプロモータ配列に機能可能なように結合する、ポリヌクレオチド配列を供給する工程；（ｂ）ポリヌクレオチド配列からＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を発現させて、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を産生する工程であって、発現は、場合により、微生物細胞内で行われる工程；および（ｃ）任意選択により、工程（ｂ）で産生されたＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質を単離する工程を含む。

【0024】

第１８の実施形態は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素と、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物であって、タンパク質組成物とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物に関する。

【0025】

第１９の実施形態は、微生物細胞のゲノムの標的部位を修飾する方法に関する。この方法は、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを微生物細胞に供給する工程を含み、ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰの複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ｐＺＵＦＣａｓ９プラスミド（配列番号６）は、配列番号５に記載のヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセットを含む。複製開始点（ＡＲＳ １８、ｆ１ ｏｒｉ、ＣｏｌＥ１）をクロスハッチングで、選択可能マーカー（Ｕｒａ３、Ａｍｐ）を灰色で示す。実施例１を参照。

【図2A】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における異種タンパク質発現用ｐＢＡＤ／ＨｉｓＢプラスミド（配列番号１０）。ｐＢＡＤプロモータを白色で示す。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図2B】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣａｓ９−ＮＬＳ（図中、「Ｃａｓ９」）発現用ｐＲＦ４８プラスミド（配列番号１１）。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図3A】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における６ｘＨｉｓ−ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用ｐＲＦ１４４プラスミド（配列番号２０）。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図3B】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における６ｘＨｉｓ−ポリＲ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用ｐＲＦ１４５プラスミド（配列番号２１）。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図3C】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における６ｘＨｉｓ−ＴＰ１０ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用ｐＲＦ１４６プラスミド（配列番号２２）。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図3D】エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における６ｘＨｉｓ−ｐＶＥＣ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用ｐＲＦ１６２プラスミド（配列番号２３）。複製開始点をクロスハッチングで示す。実施例１を参照。

【図4】６ｘＨｉｓ−ゼブラ−Ｃａｓ９−ＮＬＳの精製フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離。溶解物、洗浄、溶出画分および分子量スタンダードを示す。実施例１を参照。

【図5】単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）などの単一ガイドポリヌクレオチドの構造モデル。可変ターゲティング（ＶＴ）ドメインを灰色で示す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを黒色で示す。

【図6】プラスミドｐＲＦ４６（配列番号３０）由来の鋳型のＲＧＲ ｓｇＲＮＡ（Ｃａｎ１−１遺伝子座のターゲティング）のインビトロでの転写。２、４、６および１８時間インキュベートしたインビトロ転写反応により、類似したレベルのｓｇＲＮＡが産生された。リボザイム自己触媒的切断産物もまた産生した。実施例２を参照。

【図7】Ｃａｎ１−１標的部位に特異的なｓｇＲＮＡを複合したゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９を用いたインビトロ切断アッセイ。各反応物にＣａｎ１−１標的部位を含むＤＮＡポリヌクレオチド（９８２ｂｐ）が含まれた。各反応物を１．２％ゲル上で電気泳動により分離した。「標的のみ」、「ｓｇＲＮＡのみ」、「ゼブラ−Ｃａｓ９のみ」、および「ゼブラ−Ｃａｓ９のみ（２×ＦＴ）」（ＦＴ、凍結融解）反応物は、標的を切断しなかった。「ゼブラ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ」、「ゼブラ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ（２×ＦＴ）」および「Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ」（野生型Ｃａｓ９）反応物は、得られた切断産物に示されるように、標的ポリヌクレオチド特異的に切断した。実施例３を参照。

【図8】ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）と接触後のゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９（ｓｇＲＮＡと結合なし）およびゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体のゲノム−ターゲティング効率の測定。単独で使用したゼブラ−Ｃａｓ９の最終濃度は５μＭであったが、一方、ｓｇＲＮＡ複合体中では、ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９の異なる最終濃度（１〜５μＭ）を使用した。突然変異頻度を、カルバニン含有培地にトランスファーした際、カルバニン耐性として記録した酵母コロニー（細胞をゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９およびゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡのいずれかと接触させた後、非選択培地で増殖）の割合として報告する。実施例４を参照。

【図9】ＣＰＰ−ｄｓＲＥＤ精製のＰＡＧＥゲル解析例。Ｓｉｍｐｌｙ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎで染色した１２．５％ＰＡＧＥゲル。レーン１：分子量スタンダード、レーン２：清澄細胞抽出物ｔｐ１０−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ、レーン３：ビーズ処理後の清澄細胞抽出物ｔｐ１０−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ、レーン４：最終タンパク質溶液ｔｐ１０−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ、レーン５：清澄細胞抽出物ＭＰＧ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ、レーン３：ビーズ処理後の清澄細胞抽出物ＭＰＧ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ、レーン４：最終タンパク質溶液ＭＰＧ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ。

【発明を実施するための形態】

【0027】

【表1】

【0028】

【表2】

【0029】

【表3】

【0030】

【表4】

【0031】

【表5】

【0032】

【表6】

【0033】

引用される全ての特許文献および非特許文献の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

【0034】

本明細書中で用いられる用語「本発明」または「開示される本発明」は、限定することが意味されるのではなく、全般的に、特許請求の範囲において定義される、または本明細書中に記載されるあらゆる発明に当てはまる。これらの用語は、本明細書中で互換的に用いられる。

【0035】

本明細書中の用語「細胞」は、原核細胞または真核細胞などのあらゆる種類の細胞を指す。真核細胞は、核および他の膜で包まれた構造体（細胞小器官）を有し、一方、原核細胞は核を持たない。ある実施形態の細胞は、哺乳類または非哺乳類の細胞であり得る。本明細書中の非哺乳類細胞は、真核細胞であっても原核細胞であってもよい。例えば、本明細書中の非哺乳類細胞は、微生物細胞、または植物、昆虫、線虫、鳥類、両生類、爬虫類もしくは魚類などの非哺乳動物多細胞生物細胞を指し得る。

【0036】

本明細書中の微生物細胞は、例えば、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原核細胞、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞、または卵菌細胞を指し得る。本明細書中の真核細胞は、例えば、細菌細胞または古細菌細胞を指し得る。真菌細胞（例えば、酵母細胞）、原生生物細胞（例えば、藻類細胞）、鞭毛虫細胞、黄色植物細胞、または卵菌細胞は、原核微生物細胞の例を示す。真核微生物細胞は、核および他の膜に包まれた構造体（細胞小器官）を有し、一方、原核細胞は核を持たない。

【0037】

本明細書中の用語「酵母」は、主に単細胞の形態で存在する真菌種を指す。酵母は、あるいは、「酵母細胞」とも呼ばれ得る。本明細書中の酵母は、例えば、従来型酵母および非従来型酵母のいずれかと見なし得る。

【0038】

本明細書中の用語「従来型酵母」（「モデル酵母」は、一般に、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種またはシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種を指す。ある実施形態の従来型酵母は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により媒介される修復プロセスより、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母である。

【0039】

本明細書中の用語「非従来型酵母」は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母種でもないあらゆる酵母を指す。非従来型酵母は、Ｎｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）、およびＳｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：１４７−１５６）に記載されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態の非従来型酵母は、さらに（あるいは）、ＨＲによって媒介される修復プロセスより、ＮＨＥＪ ＤＮＡ修復プロセスを優先する酵母であり得る。当該ライン（ＨＲよりＮＨＥＪを優先）に沿う非従来型酵母の定義が、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５７９５２）でさらに開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中で好ましい非従来型酵母は、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属のもの（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））である。

【0040】

本明細書中の用語「植物」は、全植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子、およびこれらの子孫を指す。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、新芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子由来の物細胞が挙げられる。植物部には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては、限定はされないが、根、茎、新芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物であっても、植物の器官、組織、もしくは細胞培養物であってもよい。用語「植物器官」は、植物組織、または植物の形態的にも機能的にも独立した部分を構成する一群の組織を指す。用語「ゲノム」は、生物の各細胞、またはウイルスもしくは細胞小器官に存在する遺伝的材料（遺伝子および非コード配列）の構成要素全体；ならびに／あるいは１つの親から（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を指す。「子孫」は、植物のその後の世代を含む。

【0041】

トランスジェニック植物としては、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物が挙げられる。異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが代々受け継がれるように、ゲノムに安定にインテグレートすることができる。ポリヌクレオチドは単独でゲノムに組み込まれてもよく、組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込まれてもよい。トランスジェニック植物はまた、ゲノム内に複数の異種ポリヌクレオチドを含み得る。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる特性を付与してもよい。異種ポリヌクレオチドとしては、例えば、外来種を起源とする配列を挙げることができ、同種からの配列であれば、その天然形態を実質的に改変することができる。トランスジェニック植物材料としては、その遺伝子型を異種核酸を存在させることによって変化させたあらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物部または植物（（初期にそのように改変されたトランスジェニック体、および初期のトランスジェニック体から有性交配（ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓ）または無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の植物育種方法、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集手順、またはランダム交配、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え置換もしくは自然突然変異などの自然に発生する事象による植物ゲノム（染色体または染色体外の）の変化を、形質転換と見なすことは意図されていない。

【0042】

稔性植物体は、生存可能な雄性配偶子および雌性配偶子を産生する植物であり、自家稔性である。そのような自家稔性植物は、他の植物の配偶子や、それに含まれる遺伝的材料の貢献によらずに子孫植物を作ることができる。雄性不稔植物としては、生育可能な、または受精可能な雄性配偶子を産生しない植物が挙げられる。雌性不稔植物としては、生育可能な、または受精可能な雌性配偶子を産生しない植物が挙げられる。雄性不稔植物および雌性不稔植物はそれぞれ、雌性稔性および雄性捻性であり得ると認められている。さらに、雄性稔性（雌性捻性以外）植物は、雌性稔性植物と交配されると、成長可能な子孫を産生することができ、また、雌性稔性（雄性捻性以外）植物は、雄性稔性植物と交配されると、成長可能な子孫を産生することができと認められている。

【0043】

本明細書中の用語「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」（ＲＧＥＮ）は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）関連（Ｃａｓ）タンパク質、および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む複合体を指す。用語「ＲＧＥＮのタンパク質構成要素」および「ＲＧＥＮタンパク質構成要素」は、本明細書中で互換的に用いられ、ＲＧＥＮのエンドヌクレアーゼ構成要素であるＣａｓタンパク質、またはその一部を形成するＣａｓタンパク質を指す。ある実施形態のタンパク質構成要素は、完全エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり、そのようなタンパク質構成要素は、それに代えて、ＲＧＥＮの「エンドヌクレアーゼ構成要素」と呼ぶことができる。本明細書中のＲＧＥＮは、通常、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と関連して与えられる、特定のＤＮＡターゲティング活性を有する。

【0044】

簡潔に、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、標的部位配列においてＤＮＡ配列と相補的である配列を含有する。この相補性に基づいて、ＲＧＥＮは、特定のＤＮＡ標的部位配列を特異的に認識し、かつ切断することができる。本明細書中でＲＧＥＮは、４つの既知のＣＲＩＳＰＲ系（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０）、例えばＩ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のいずれかのＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を含んでよい。好ましい実施形態におけるＲＧＥＮは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ系）および少なくとも１つのＲＮＡ構成要素（例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）を含む。

【0045】

用語「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化された、等間隔にスペーサが入った、短い回文リピート）は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌細胞および古細菌細胞によって用いられる、クラスＩ、ＩＩまたはＩＩＩ ＤＮＡ切断系の因子をコードする特定の遺伝子座を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７−１７０）。ＣＲＩＳＰＲ系の構成要素は、本明細書中で異種の方法において、細胞におけるＤＮＡターゲティングに利用される。

【0046】

用語「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系」および「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系」は、本明細書中で互換的に用いられ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを、少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合させて利用するＤＮＡ切断系を指す。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合させることができる。別の例において、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡと複合させることができる。ゆえに、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびガイドＲＮＡは、本明細書中で、ＲＮＡ構成要素の非限定的な例である。

【0047】

用語ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）エンドヌクレアーゼは、本明細書中で、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質を指す。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、適切なＲＮＡ構成要素と複合すると、ある実施形態において、特定のＤＮＡ標的配列の全て、または一部を切断することができる。例えば、特定のＤＮＡ標的配列中に一本鎖切断または二本鎖切断を導入することができる；これ以外にも、特定のＤＮＡ標的配列の一方の鎖または双方の鎖を切断することができると特徴付けられ得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓと複合したｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡによる標的配列の認識によって媒介されて、標的配列にてＤＮＡ二重鎖を解いて、少なくとも一本のＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識およびカットは典型的には、正確なプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置決めされれば、またはＤＮＡ標的配列の３’末端に隣接すれば、生じる。これ以外にも、Ｃａｓタンパク質は、本明細書中で、適切なＲＮＡ構成要素と複合化する場合、ＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠くかもしれないが、ＤＮＡ標的配列に依然として特異的に結合することができる。好ましいＣａｓタンパク質は、本明細書において、Ｃａｓ９である。

【0048】

本明細書に開示の方法では、任意の誘導型エンドヌクレアーゼを使用することができる。そのようなエンドヌクレアーゼとしては、限定はされないが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが挙げられる。特定のＰＡＭ配列を認識し、特定の位置で標的ＤＮＡを切断することができる多くのエンドヌクレアーゼが報告されている（例えば、２０１５年５月１５日に出願された米国特許出願第６２／１６２３７７号明細書、２０１５年５月１５日に出願された米国特許出願第６２／１６２３５３号明細書、およびＺｅｔｓｃｈｅ Ｂ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ １６３，１０１３を参照）。当然のことながら、誘導型Ｃａｓ系を使用する本明細書に記載の方法および実施形態に基づき、これらの方法が任意の誘導型エンドヌクレアーゼを使用することができるように適合可能である。

【0049】

「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、またはＣｓｘ１２と呼ばれた）は、本明細書中で、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとの、またはガイドＲＮＡとの複合体を形成して、ＤＮＡ標的配列の全てまたは一部を特異的に認識して切断する、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、およびＨＮＨ（Ｈ−Ｎ−Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列にて一本鎖ＤＮＡを切断する（双方のドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニックに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端近くに位置決めされ、そしてサブドメインＩＩおよびＩＩＩは、タンパク質の中央に位置決めされて、ＨＮＨドメインにフランキングする（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２−１２７８）。「Ａｐｏ−Ｃａｓ９」は、ＲＮＡ構成要素と複合化しないＣａｓ９を指す。Ａｐｏ−Ｃａｓ９は、ＤＮＡに結合することができるが、非特異的であり、そしてＤＮＡを切断することができない（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５０７：６２−６７）。

【0050】

本明細書中の用語「ＲＮＡ構成要素」は、ＤＮＡ標的配列の鎖と相補的なリボ核酸配列を含むＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素を指す。本明細書中では、この相補的配列を「ガイド配列」または「可変ターゲティングドメイン」配列と呼ぶ（図５）。本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素の例として、ｃｒＲＮＡおよびガイドＲＮＡが挙げられる。ある実施形態のＲＮＡ構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ単独、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、ＲＧＥＮを特異的ＤＮＡターゲティングに適したものとすることができる。

【0051】

用語「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」（ｃｒＲＮＡ）は、本明細書中で、１つまたは複数のＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）との複合体を形成することができるＲＮＡ配列を指し、複合体にＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡは、ＤＮＡ標的配列の鎖と相補的である「ガイド配列」（「可変ターゲティングドメイン」［ＶＴ］）を含有するので、ＤＮＡ結合特異性を付与する。ｃｒＲＮＡはさらに、ｃｒＲＮＡが由来するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のリピート領域によってコードされる「リピート配列」（「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列」）を含む。ｃｒＲＮＡのリピート配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列にアニールすることができる。本来のＣＲＩＳＰＲ系におけるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される「プレｃｒＲＮＡ」に由来する。プレｃｒＲＮＡは、スペーサ領域およびリピート領域を含む；スペーサ領域は、ＤＮＡ標的部位配列と相補的なユニーク配列を含有する。本来の系におけるプレｃｒＲＮＡは、複数の異なるｃｒＲＮＡにプロセシングされ、それぞれがガイド配列、およびリピート配列の一部を有する。ＣＲＩＳＰＲ系は、例えば、ＤＮＡターゲティング特異性のために、ｃｒＲＮＡを利用する。

【0052】

本明細書中で用語「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）」は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に用いられる非コードＲＮＡを指し、５’から３’の方向に、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型ｃｒＲＮＡのリピート領域とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含有する（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２−６０７）。

【0053】

用語「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）および「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）は、本明細書中で互換的に用いられる。ｇＲＮＡは、本明細書中で、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合するｃｒＲＮＡを含有するキメラ配列を指し得る。これ以外にも、ｇＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの合成融合体を指し得る。ｇＲＮＡはまた、ガイド配列（可変ターゲティングドメイン）に続いてＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを有する観点からも特徴付けられ得る。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列に続いてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むことができる。

【0054】

「ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡ」（ｃｒＲＮＡ）は、任意選択により、ＲＮＡ構成要素に代えて使用することができる。ｃｒＤＮＡは、本明細書中に開示のｃｒＲＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有する。ｃｒＤＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＤＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体として使用され得、その複合体は、次にＲＧＥＮタンパク質構成要素と関連付けられ得る。米国特許出願第６１／９５３，０９０号明細書は、ｃｒＤＮＡ、およびＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングでのその使用を開示している。したがって、ｃｒＲＮＡに関する本明細書中の開示は全て、ｃｒＤＮＡの使用に同様に適用することができる。ゆえに、ｃｒＤＮＡを組み込む本明細書中の実施形態は、それに代えて、「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」（ＲＧＥＮ）を、少なくとも１つのＣａｓタンパク質と少なくとも１つのｃｒＤＮＡを含む複合体と言うことができよう。

【0055】

本明細書で使用される用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列を指す。ガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列であっても、ＤＮＡ配列であっても、それらの組合せ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってもよい。任意選択により、ガイドポリヌクレオチドは、限定はされないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への結合、ポリエチレングリコール分子への結合、Ｓｐａｃｅｒ１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への結合、または環化をもたらす５’から３’への共有結合などの、少なくとも１つのヌクレオチド、リン酸ジエステル結合または結合修飾を含み得る。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドはまた、「ガイドＲＮＡ」と呼ばれる。

【0056】

ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補性領域とハイブリダイズする２つの別々の分子を含む。この２つの別々の分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＥＲドメインと、ＣＥＲドメインに結合したＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチド（「ｃｒヌクレオチド」）の第１の分子を、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、または「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組み合わせからなるとき）と呼ぶ。

【0057】

ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む一本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってもよい。「ドメイン」により、それは、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に結合したｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに結合したＶＴドメインを含む）を含み、その結合はＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチドおよびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列からなる一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチからなるとき）、または「一本鎖ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドの組み合わせからなるりとき）と呼ばれ得る。

【0058】

したがって、ある実施形態では、ガイドポリヌクレオチドとＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、互いに複合体を形成することができ（「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」と呼ばれ、あるいは、また、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系」と呼ばれる）、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体に細胞（例えば、植物細胞）のゲノム標的部位を標的とするよう指示し、場合により、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに、ゲノム標的部位へ一本鎖切断または二本鎖切断を導入させる。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、少なくとも１つのＣＰＰと結合することができ、そのような複合体は、細胞（例えば、植物細胞）のゲノム標的部位に結合し、場合により、一本鎖切断または二本鎖切断を行うことができる。

【0059】

用語「可変ターゲティングドメイン」または「ＶＴドメイン」は、本明細書中で互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的なヌクレオチド配列を指す。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性率は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、可変ターゲティングドメインは１２〜３００ヌクレオチドの隣接するストレッチを含む。可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に開示の修飾を参照）またはそれらの任意の組み合わせから構成され得る。

【0060】

ガイドポリヌクレオチドの「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）と相互に作用するヌクレオチド配列を指す。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、修飾ＤＮＡ配列、修飾ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に開示の修飾を参照）またはそれらの任意の組み合わせから構成され得る。

【0061】

用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「ＤＮＡ標的配列」、「標的遺伝子座」、「プロトスペーサ」などは、本明細書中で互換的に用いられる。標的部位配列は、本明細書中のＲＧＥＮが認識し、結合し、場合によってはニックを入れ、または切断することができる、細胞、エピソーム、またはゲノム中の他のあらゆるＤＮＡ分子上のポリヌクレオチド配列を指す。標的部位は、（ｉ）細胞中の内在部位／在来部位であってもよいし、（ｉｉ）ゲノム中に自然に生じ得ない、細胞とは異種起源であってもよいし、（ｉｉｉ）本来生じる場所に対して非相同ゲノム位置に見出されてもよい。

【0062】

本明細書中で標的部位配列は、長さが少なくとも１３ヌクレオチドであり、そして、（ある実施形態において、適切なＰＡＭが、標的配列に隣接するならば）（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）ガイド配列とハイブリダイズすることができ、かつ標的配列にＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体を配列特異的に直接結合することができるほど十分な、ガイド配列との相補性がある鎖を有する。切断／ニック部位（エンドヌクレオチド結合分解性ＣａｓまたはニッキングＣａｓが該当する）は、標的配列内であってもよいし（例えば、Ｃａｓ９が用いられる）、切断／ニック部位は、標的配列外であってもよい（例えば、非相同エンドヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩ酵素に由来するものに融合するＣａｓ９が用いられる）。標的部位配列をＲＧＥＮ欠失切断活性またはＲＧＥＮ欠失ニッキング活性により結合させることも可能である。

【0063】

本明細書中で「人工標的部位」または「人工標的配列」は、細胞のゲノム中に導入された標的配列を指す。一部の実施形態における人工標的配列は、細胞のゲノム中の本来の標的配列と配列が同じでありながら、ゲノム中の異なる位置（非相同位置）に位置決めされてもよいし、細胞のゲノム中の同じ位置に位置決めされるならば本来の標的配列と異なってもよい。

【0064】

本明細書中で「エピソーム」は、細胞の染色体は別として、細胞中に自律的に存在することができる（複製して娘細胞に進むことができる）ＤＮＡ分子を指す。エピソームＤＮＡは、在来であってもよいし、細胞とは異種起源であってもよい。明細書中の在来エピソームの例として、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）およびクロロプラストＤＮＡが挙げられる。本明細書中の異種起源エピソームの例として、プラスミドおよび酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。

【0065】

本明細書中で「プロトスペーサ隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短い配列を指す。本明細書中でＰＡＭの配列および長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて異なってよいが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。

【0066】

用語「５’キャップ」および「７−メチルグアニル酸（ｍ^７Ｇ）キャップ」は、本明細書中で互換的に用いられる。７−メチルグアニル酸残基は、真核生物においてＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）によって転写されたＲＮＡの５’末端に位置決めされる。本明細書中、キャップＲＮＡは５’キャップを有するが、未キャップＲＮＡはそのようなキャップを有さない。

【0067】

「キャップ離脱」、「５’キャップを有さない」などの用語は、本明細書中では互換的に使用され、５’キャップを欠失し、場合により、５’キャップの代わりに、例えば５’−水酸基を有するＲＮＡを指す。５’キャッピングされたＲＮＡは核外に搬出されるため、キャップ離脱ＲＮＡは、転写後、核内により十分に蓄積することができる。

【0068】

用語「リボザイム」、「リボ核酸酵素」および「自己切断リボザイム」は、本明細書中で互換的に用いられる。リボザイムは、特定の部位にてＲＮＡを切断することができる、二次、三次、および／または四次構造を形成する１つまたは複数のＲＮＡ配列、特にリボザイム配列に対するシス部位（すなわち、自己触媒的である、または自己切断する）を指す。リボザイム核酸分解活性の一般的な性質が解説されてきた（例えば、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）。「ハンマーヘッドリボザイム」（ＨＨＲ）は、本明細書中で、触媒反応に関与する３つの塩基対形成されたステム、および高度に保存された、非相補的ヌクレオチドのコアで構成される小さな触媒的ＲＮＡモチーフを含んでよい。Ｐｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３７２：６８−７４）、そしてＨａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ １８：８７１−８８５）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）が、ハンマーヘッドリボザイムの構造および活性を開示している。本明細書中でハンマーヘッドリボザイムは、例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ ８１：９９１−１００２（参照によって本明細書に組み込まれる））によって開示される「最小のハンマーヘッド」配列を含んでよい。

【0069】

用語「ターゲティング」、「遺伝子ターゲティング」、「ＤＮＡターゲティング」、「編集」、「遺伝子編集」、および「ＤＮＡ編集」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中でＤＮＡターゲティングは、例えば細胞の染色体またはエピソーム中の、特定のＤＮＡ配列でのｉｎｄｅｌ、ノックアウト、またはノックインの特異的な導入であってよい。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質が適切なＲＮＡ構成要素と関連して、細胞中の特定のＤＮＡ配列にて一方の鎖または双方の鎖を切断することによって、実行され得る。そのようなＤＮＡ切断は、二本鎖切断（ＤＳＢ）の場合、標的部位にてｉｎｄｅｌを形成することができるＮＨＥＪプロセスを促進することができる。また、切断が一本鎖切断（ＳＳＢ）であるかＤＳＢであるかを問わず、適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡニック部位またはＤＮＡ切断部位に提供される場合、ＨＲプロセスが促進され得る。そのようなＨＲプロセスは、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドの配列に応じて、標的部位にてノックアウトまたはノックインを導入するのに用いられ得る。これ以外にも、本明細書中でＤＮＡターゲティングは、標的ＤＮＡ配列に対する本明細書中のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素複合体の特異的な関連を指し得、Ｃａｓタンパク質は、（Ｃａｓタンパク質のエンドヌクレオチド結合分解性ドメインの状態に応じて）ＤＮＡ鎖をカットしたりカットしなかったりする。

【0070】

本明細書中で用語「ｉｎｄｅｌ」は、染色体またはエピソーム中の標的ＤＮＡ配列中の１つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。そのような挿入または欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基のものであってよい。ある実施形態におけるｉｎｄｅｌは、さらにより大きくてよく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００塩基である。ｉｎｄｅｌが遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入されれば、ｉｎｄｅｌは多くの場合、フレームシフト突然変異を生じさせることによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の野生型発現を分裂させる。

【0071】

用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」および「遺伝的ノックアウト」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックアウトは、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによって部分的に、または完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表す；ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしていてもよいし、例えば調節機能（例えばプロモータ）を有していてもよい。ノックアウトは、ターゲティング部位の配列、それに隣接する配列、もしくはその近傍の配列の機能を弱める、もしくは完全に破壊する、（Ｃａｓ媒介切断またはニッキングによって促進されるＮＨＥＪによる）ｉｎｄｅｌによって、または（適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列もまた使用される場合、Ｃａｓ媒介切断またはニッキングによって促進されるＨＲによる）配列の特異的な除去によってもたらされ得る。本明細書中では、代わりに、ノックアウトされたＤＮＡポリヌクレオチド配列が、例えば、部分的に、または全体として、分裂または下方制御されると見なすことができる。

【0072】

用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」および「遺伝的ノックイン」は、本明細書中で互換的に用いられる。ノックインは、（適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチド配列もまた使用される場合、Ｃａｓ媒介切断またはニッキングによって促進されるＨＲによる）Ｃａｓタンパク質によるターゲティングによる、細胞中の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換または挿入を表す。ノックインの例としては、遺伝子のコード領域中の異種アミノ酸コード配列の特異的な挿入、または遺伝子座中への転写調節要素の特異的な挿入がある。

【0073】

用語「ドナーポリヌクレオチド」、「ドナーＤＮＡ」、「ターゲティングポリヌクレオチド」、および「ターゲティングＤＮＡ」は、本明細書中で互換的に用いられる。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ標的部位（例えば、本明細書中で、Ｃａｓタンパク質によって特異的に標的とされる配列）の配列、またはその近傍の配列に相同である少なくとも１つの配列を含むＤＮＡ配列を指す。ＤＮＡ標的部位がＳＳＢまたはＤＳＢを含むなら、適切なドナーポリヌクレオチドはその標的部位とＨＲを行うことができる（例えば、適切なＲＮＡ構成要素と関連する本明細書中のＣａｓタンパク質を用いて導入することができる）。本明細書中で、ドナーポリヌクレオチド内の「相同配列」は、例えば、標的部位もしくはその近傍の配列と１００％の相同性を有する、または標的部位もしくはその近傍の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する、少なくとも約２５のヌクレオチドの配列を含んでもよく、またそのような配列からなってもよい。

【0074】

ある実施形態において、ドナーＤＮＡポリヌクレオチドは、標的部位の配列と非相同である配列（または塩基対）によって分離される２つの相同配列を有してよい。そのようなドナーポリヌクレオチドのこれら２つの相同配列は、「相同アーム」と呼ぶことができ、これらは非相同配列にフランキングする。標的部位と、２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドとのＨＲは典型的に、標的部位の配列の、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列との置換を生じさせる（ドナーポリヌクレオチドの相同アームに相同なＤＮＡ配列間に位置決めされる標的部位配列は、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列によって置換される）。２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドにおいて、アームは１つまたは複数のヌクレオチドによって分離されてよい（すなわち、ドナーポリヌクレオチド中の非相同配列は、少なくとも１ヌクレオチド長であってよい）。本明細書中で細胞において実行され得る種々のＨＲ手順が、例えば、ＤＮＡ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｈ．Ｔｓｕｂｏｕｃｈｉ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１１）に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0075】

用語「細胞透過ペプチド」（ＣＰＰ）および「タンパク質形質導入ドメイン」（ＰＴＤ）は、本明細書中で互換的に用いられる。ＣＰＰは、積み荷分子、特に、本明細書中の１つ以上のＲＧＥＮタンパク質構成要素（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）の細胞取り込みを促進し得る、長さが通常約５〜６０アミノ酸残基のペプチドを指す。そのような積み荷タンパク質は、１つ以上のＣＰＰと共有結合または非共有結合により結合することができる。ＣＰＰはまた、ある実施形態では、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、小胞膜または細胞壁の１つ以上を横断／貫通して積み荷分子の移動または横断を促進することができると見なすことができる。本明細書中のＣＰＰは、ある実施形態では、カチオン性、両親媒性または疎水性であり得る。本明細書中で有用なＣＰＰの例、および一般的なＣＰＰのさらなる説明は、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８４：１８０６−１８１３）、Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：１００１−１００５）、Ｙａｎｄｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９２：２４３４−２４４４）、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３−１１７６）および米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書に開示されており、それらは参照によって本明細書に組み込まれる。

【0076】

「カチオン性」ＣＰＰまたは「ポリカチオン性」ＣＰＰは、本明細書中では、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）および／またはヒスチジン（Ｈ）などの正電荷を有するアミノ酸の相対存在度が高い（少なくとも６０％）ＣＰＰを指す。

【0077】

「両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）」ＣＰＰまたは「両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）」ＣＰＰは、本明細書中では、極性／荷電残基と非極性の疎水性残基の交互パターンを含むアミノ酸配列を有するＣＰＰを指す。あるいは、両親媒性ＣＰＰは、親水性および親油性の両特性を有すると見なすことができる。

【0078】

本明細書中の「疎水性」ＣＰＰまたは「親油性」ＣＰＰは、大部分が正味電荷の少ない非極性残基および／または疎水性アミノ酸基であるか、またはそのような基のみを含む。

【0079】

用語「共有結合した」、「共有結合的に付着した」、「共有結合的に結び付いた」、「共有結合」、「共有結合的相互作用」などは、本明細書中では互換的に使用される。本明細書中では、共有結合は、例えば、ペプチド結合または化学架橋によって行われ得る。共有結合は、例えば、直接的であり得、そこでは、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとの間に直に共有結合がある（例えば、ＲＧＥＮタンパク質構成要素の原子とＣＰＰの原子との間に［電子を共有する］化学結合がある）。あるいは、共有結合は、例えば、間接的であり得、そこでは、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰが少なくとも１つの中間因子を介して結合している。そのような中間因子、またはそれら自身共有結合している一群の中間因子は、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰに共有結合している。したがって、中間因子、または中間因子群は、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとの間の橋であると見なすことができる。

【0080】

用語「融合タンパク質」、「タンパク質融合体」、「キメラタンパク質」などは、本明細書中で互換的に使用される。本明細書中の融合タンパク質は、単一ポリペプチド内で結合している少なくとも２つの異なる（非相同の）アミノ酸配列を含む。融合タンパク質は、一般に、遺伝子工学的プロセスによって作られる。そのプロセスでは、異なるアミノ酸配列を含む単一タンパク質をコードさせるため、異なるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を結合する。本明細書中の融合タンパク質の例としては、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体（１つ以上のＣＰＰアミノ酸配列に融合したＲＧＥＮタンパク質アミノ酸配列）が挙げられる。

【0081】

用語「非共有結合した」、「非共有結合的に付着した」、「非共有結合的に結合した」、「非共有結合」、「非共有結合的相互作用」などは、本明細書中では互換的に使用される。本明細書中では、非共有結合は、電子を共有していない原子間の相互作用を指す。このタイプの相互作用は、共有結合に比べ弱い。疎水性相互作用は、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と１つ以上のＣＰＰの間に起こり得る非共有結合の一例である。本明細書中で適用され得る非共有結合の他の例としては、静電力（例えば、イオン結合、水素結合）およびファン・デル・ワールス力（ロンドン分散力）が挙げられる。

【0082】

本明細書中で使用される「ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体」は、ＲＧＥＮのタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの複合体を指し、ＲＧＥＮとＣＰＰとは共有結合または非共有結合によって相互作用する。この複合体のＲＧＥＮ構成要素およびＣＰＰ構成要素は、通常、本明細書に開示されているようなそれぞれの活性／機能の全て、またはいくらか（例えば、少なくとも５０％）を保持している。例えば、ＲＧＥＮタンパク質構成要素はＣａｓ９である実施形態では、Ｃａｓ９−ＣＰＰ複合体中のＣａｓ９は、適切なＲＮＡ構成要素（例えば、ｇＲＮＡ）と結合し、細胞中のＤＮＡ標的部位にＣａｓ９−ＣＰＰ複合体をターゲティングすることができる。

【0083】

用語「横断する」、「〜を通って移動する」、「横切る」、「〜を越えて行く」などは、本明細書中では互換的に使用される。

【0084】

用語「細胞膜」、「プラズマ膜」および「細胞質膜」は、本明細書中では互換的に使用され、細胞の内部を外部から分離する生体膜を指す。細胞膜は、通常、その内部にタンパク質が埋め込まれたリン脂質二重層を含む。いくつかの他の機能のうち、細胞膜は、細胞壁または細胞外被構造などの細胞外構造の付着面として機能し得る。細胞膜脂質二重層に関する詳細な情報は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２）に示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0085】

本明細書中の用語「細胞壁」は、いくつかの種類の非哺乳類細胞（例えば、細菌、植物、藻類、酵母などの真菌）を取り囲む、高強度で可撓性がある（しかし、ときにかなり強直である）層を指す。それは、細胞間に外に位置し、細胞を構造的に支持し保護する。ある実施形態での細胞壁の主な機能は、細胞の浸透圧の維持を助けることである。真菌細胞（例えば、酵母細胞）壁は、一般に、キチンを含み、藻細胞壁、一般に、糖タンパク質および多糖類を含む。植物細胞壁は、一般に、多糖類が大半で、他の構成成分（例えば、フェノールエステル、構造タンパク質）を少量含む。「一次細胞壁」および／または「二次細胞壁」を特徴付けるために使用され得、その二次細胞壁は一次細胞壁の内部に位置する。リグニンは、二次細胞壁の主要な構成成分である。細菌細胞壁は、一般に、主な構成成分としてペプチドグリカンを含む。細胞などの、ある態様では、細胞壁は、さらに、外層に、細胞外被を含み、それは、一般に、多糖類からなる被膜である。

【0086】

本明細書中の用語「ロイシンジッパードメイン」は、約３５残基からなるストレッチの７残基毎にロイシン残基が存在することを特徴とする二量体ドメインを指す。ロイシンジッパードメインは、アルファヘリックスコイルドコイルによって一体に保たれたダイマーを形成する。コイルドコイルは１ターン当たり３．５個の残基を有し、これは、ヘリックス軸に対して、各７残基が等価の位置を占めることを意味している。コイルドコイル内のロイシンの規則的な配列は、疎水的相互作用およびファンデルワールス相互作用によってその構造を安定化させる。

【0087】

用語「容量パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ ｂｙ ｖｏｌｕｍｅ）」、「容量パーセント（ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒｃｅｎｔ）」、「ｖｏｌ％」、および「ｖ／ｖ％」は、本明細書中で互換的に用いられる。溶液中の溶質の容量パーセントは、式：［（溶質の容量）／（溶液の容量）］×１００％を用いて確定され得る。

【0088】

用語「重量パーセント」、「重量パーセンテージ（ｗｔ％）」、および「重量−重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）」は、本明細書中で互換的に用いられる。重量パーセントは、組成物、混合物、または溶液中に含まれるままの、質量ベースでの材料のパーセンテージを指す。

【0089】

用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は、本明細書中で互換的に用いられる。これらの用語は、ヌクレオチド配列等を包含する。ポリヌクレオチドは、場合によっては合成の、非天然の、または変更されたヌクレオチド塩基を含有する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーであってよい。ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１つまたは複数のセグメントで構成されてよい。ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）は、以下の一文字呼称によって呼ぶことができる：アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ａ」、シチジル酸またはデオキシチジル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ｃ」、グアニル酸またはデオキグアニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関する）について「Ｇ」、ウリジル酸（ＲＮＡに関する）について「Ｕ」、デオキシチミジル酸（ＤＮＡに関する）について「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）について「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）について「Ｙ」、ＧまたはＴについて「Ｋ」、Ａ、Ｃ、またはＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」、ＡまたはＴについて「Ｗ」、そしてあらゆるヌクレオチドについて「Ｎ」（例えば、ＤＮＡ配列に言及するならば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであり得；ＲＮＡ配列に言及するならば、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｕ、またはＧであり得る）。本明細書中に開示されるあらゆるＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、適切なＤＮＡ配列によってコードされ得る。

【0090】

本明細書中で用いられる用語「単離された」は、その本来の源から完全に、または部分的に精製されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を指す。場合によっては、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、より大きな組成物、バッファ系、または試薬混合物の一部である。例えば、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、細胞内または生物内に異種起源のものとして含まれてよい。ＲＧＥＮのタンパク質構成要素および細胞透過ペプチドを含む本明細書中の組成物は、単離された組成物と見なすことができる。これらの組成物は異種構成要素を含み、天然には生じない。

【0091】

本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、コード領域からＲＮＡを発現するＤＮＡポリヌクレオチド配列を指し（ＲＮＡは、ＤＮＡポリヌクレオチド配列から転写される）、当該ＲＮＡは、メッセンジャＲＮＡ（タンパク質をコードする）またはタンパク質非コードＲＮＡ（例えば、本明細書中でｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）であってよい。遺伝子は、コード領域のみを指してもよいし、コード領域の上流かつ／または下流に調節配列（例えば、プロモータ、５’非翻訳領域、３’転写ターミネータ領域）を含んでもよい。タンパク質をコードするコード領域は代わりに、本明細書中で「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）と呼ぶことができる。「在来の」または「内在性の」遺伝子は、自然界で見出されるような、自己調節配列を有する遺伝子を指す；そのような遺伝子は、宿主細胞のゲノム中の、その本来の位置に位置決めされている。「キメラ」遺伝子は、在来遺伝子でなく、自然界では一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む（すなわち、調節領域およびコード領域が互いに異種起源である）あらゆる遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、様々な源に由来する調節配列およびコード配列を含んでもよいし、同じ源に由来するが、自然界で見出されるものとは異なるようにして配置される調節配列およびコード配列を含んでもよい。「外来の」または「異種起源」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来／異種起源遺伝子は、非在来生物中に挿入される在来遺伝子、在来宿主内の新しい位置に導入される在来遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでよい。本明細書中に開示されるある実施形態におけるポリヌクレオチド配列は、異種起源である。「トランスジーン」は、遺伝子導入手順（例えば、形質転換）によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化」オープンリーディングフレームは、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されている。

【0092】

「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変された遺伝子である。そのような「変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、対応する非変異遺伝子と異なる配列を有する。本開示のある実施形態では、変異遺伝子は、本明細書に開示のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系を使用してなされた改変を含む。変異植物は、少なくとも１つの変異遺伝子を含む植物である。

【0093】

本明細書中の細胞または生物に含まれる「非天然」のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、そのような細胞または生物の天然の（自然の）対応物では生じない。

【0094】

本明細書中で用いられる「調節配列」は、遺伝子の転写開始部位（例えばプロモータ）、５’非翻訳領域、および３’非コード領域の上流に位置決めされるヌクレオチド配列を指し、転写、プロセシングもしくは安定性、または遺伝子から転写されるＲＮＡの翻訳に影響し得る。本明細書中の調節配列として、プロモータ、エンハンサ、サイレンサ、５’非翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクタ結合部位、ステム−ループ構造、および遺伝子発現の調節に関与する他の要素が挙げられ得る。本明細書中で１つまたは複数の調節要素は、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。

【0095】

本明細書中で用いられる「プロモータ」は、遺伝子からのＲＮＡの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、プロモータ配列は、遺伝子の転写開始部位の上流にある。プロモータは、その全体が在来遺伝子に由来してもよいし、自然界に見出される様々なプロモータに由来する様々な要素から構成されてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。遺伝子を細胞においてあらゆる状況下において殆どの時点で発現させるプロモータは一般に、「構成プロモータ」と呼ばれる。本明細書中で１つまたは複数のプロモータは、本明細書中のコード領域とは異種起源であってよい。

【0096】

本明細書中で用いられる「強プロモータ」は、単位時間あたりに比較的多数の生産開始を導くことができるプロモータを指し得、かつ／または、細胞における遺伝子の平均転写レベルよりも高い遺伝子転写レベルを駆動するプロモータである。

【0097】

植物プロモータは、植物細胞において転写を開始することができるプロモータであり、植物プロモータについては、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ４０：１−２２を参照されたい。構成プロモータとしては、例えば、国際公開第９９／４３８３８号パンフレットおよび米国特許第６０７２０５０号明細書に開示されたＲｓｙｎ７プロモータおよび他の構成プロモータのコアプロモータ、コアＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−２）；ライスアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １２：６１９−３２；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １８：６７５−８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８１：５８１−８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７２３−３０）；ＡＬＳプロモータ（米国特許第５６５９０２６号明細書）などが挙げられる。他の構成プロモータは、例えば、米国特許第５６０８１４９号明細書、同第５６０８１４４号明細書、同第５６０４１２１号明細書、同第５５６９５９７号明細書、同第５４６６７８５号明細書、同第５３９９６８０号明細書、同第５２６８４６３号明細書、同第５６０８１４２号明細書および同第６１７７６１１号明細書に記載されている。いくつかの例では、誘導性プロモータが使用され得る。病原体の感染後に誘導される病原体誘導性プロモータとしては、限定はされないが、ＰＲタンパク質、ＳＡタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなどの発現を調節するものが挙げられる。

【0098】

外因性の化学調節剤の適用によって植物の遺伝子発現を調節するために、化学調節プロモータを使用することができる。プロモータは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学誘導性プロモータであっても、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学抑制性プロモータであってもよい。化学誘導性プロモータとしては、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤によって活性化されたトウモロコシＩｎ２−２プロモータ（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８−７７）、発芽前除草剤として使用されている疎水性親電性化合物によって活性化されたトウモロコシＧＳＴプロモータ（ＧＳＴ−ＩＩ−２７、国際公開第９３／０１２９４号パンフレット）、およびサリチル酸によって活性化されたタバコＰＲ−１ａプロモータ（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３−７）が挙げられる。他の化学調節プロモータとしては、ステロイド応答性プロモータ（例えば、グルココルチコイド誘導プロモータ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１−５；ＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ １４：２４７−２５７）；テトラサイクリン誘導およびテトラサイクリン抑制プロモータ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９−３７；米国特許第５８１４６１８号明細書および同第５７８９１５６号明細書）を参照）。

【0099】

特定の植物組織内での増強発現のため、組織好適プロモータを使用することができる。組織好適プロモータとしては、例えば、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２−８０３；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２５４：３３７−４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ ６：１５７−６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：１３３１−４１；Ｖａｎ Ｃａｍｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：５２５−３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １１２：５１３−５２４；Ｌａｍ，（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１８１−９６；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ ４：４９５−５０５が挙げられる。葉好適プロモータとしては、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５−６５；Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０５：３５７−６７；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３５：７７３−８；Ｇｏｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｊ ３：５０９−１８；Ｏｒｏｚｃｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３：１１２９−３８；Ｍａｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９５８６−９０；Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９５８）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２７２３−９；Ｔｉｍｋｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５７−８が挙げられる。根好適プロモータとしては、例えば、Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７−１８（ダイズ根特異的グルタミン合成酵素遺伝子）；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１１−２２（サイトゾルグルタミン合成酵素（ＧＳ））；Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：１０５１−６１（インゲンマメのＧＲＰ １．８遺伝子における根特異的調節要素）；Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４：４３３−４３（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）マンノピン合成酵素（ＭＡＳ）の根特異的プロモータ）；Ｂｏｇｕｓｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６３３−４１（パラスポニア・アンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）およびトレマ・トメントサ（Ｔｒｅｍａ ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）から単離された根特異的プロモータ）；Ｌｅａｃｈ ａｎｄ Ａｏｙａｇｉ，（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ ７９：６９−７６（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ｒｏｌＣおよびｒｏｌＤ根誘導遺伝子）；Ｔｅｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：３４３− ５０（アグロバクテリウム創傷誘導（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｕｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ）ＴＲ１’およびＴＲ２’遺伝子）；ＶｆＥＮＯＤ−ＧＲＰ３遺伝子プロモータ（Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９−７２）；およびｒｏｌＢプロモータ（Ｃａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１−９１；ファゼオリン遺伝子（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ ｇｅｎｅ）（Ｍｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３：４７６−８２；Ｓｅｎｇｏｐｔａ−Ｇｏｐａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３３２０−４）が挙げられる。米国特許第５８３７８７６号明細書、同第５７５０３８６号明細書、同第５６３３３６３号明細書、同第５４５９２５２号明細書、同第５４０１８３６号明細書、同第５１１０７３２号明細書および同第５０２３１７９号明細書も参照されたい。

【0100】

種子好適プロモータには、種子発育中活性な種子特異的プロモータ、および種子発芽中活性な種子発芽プロモータの両プロモータが含まれる。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０：１０８を参照されたい。種子好適プロモータとしては、限定はされないが、Ｃｉｍ１（サイトカイニン誘導メッセージ）、ｃＺ１９Ｂ１（トウモロコシ１９ｋＤａゼイン）およびｍｉｌｐｓ（ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ）（国際公開第００／１１１７７号パンフレットおよび米国特許第６２２５５２９号明細書）が挙げられる。双子葉植物用の種子好適プロモータとしては、限定はされないが、インゲンマメ−ベータ−ファセオリン、ナピン（ｎａｐｉｎ）、ベータ−コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリンなどが挙げられる。単子葉植物用の種子好適プロモータとしては、限定はされないが、トウモロコシ１５ｋＤａゼイン、２２ｋＤａゼイン、２７ｋＤａガンマゼイン、ワキシー（ｗａｘｙ）、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）１、シュランケン（ｓｈｒｕｎｋｅｎ）２、グロブリン１、オレオシンおよびｎｕｃ１が挙げられる。国際公開第００／１２７３３号パンフレットも参照されたい。この文献には、ＥＮＤ１およびＥＮＤ２遺伝子由来の種子好適プロモータが開示されている。

【0101】

本明細書中で用いられる用語「３’非コード配列」、「転写ターミネータ」、および「ターミネータ」は、コード配列の下流に位置決めされるＤＮＡ配列を指す。これには、ポリアデニル化認識配列、および、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列が挙げられる。

【0102】

本明細書中で用いられる用語「カセット」は、タンパク質コードＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に機能可能なように結合したプロモータを指す。カセットは場合によっては、３’非コード配列に機能可能なように結合してよい。

【0103】

ポリヌクレオチドに関して本明細書中で用いられる用語「上流」および「下流」はそれぞれ、「５’」および「３’」を指す。

【0104】

本明細書中で用いられる用語「発現」は、（ｉ）コード領域からのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質非コードＲＮＡ、例えばｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡ）の転写、または（ｉｉ）ｍＲＮＡからのポリペプチドの翻訳を指す。

【0105】

遺伝子またはポリヌクレオチド配列の発現を記載するのに用いられる場合、用語「下方制御」、「分裂」、「阻害」、「不活化」、および「サイレンシング」は、ポリヌクレオチド配列の転写が引き下げられる、または除外される例に言及するために、本明細書中で互換的に用いられる。これにより、ポリヌクレオチド配列からのＲＮＡ転写産物の引下げまたは除外がもたらされ、結果として（遺伝子がＯＲＦを含むならば）ポリヌクレオチド配列に由来するタンパク質発現の引下げまたは除外がもたらされる。これ以外にも、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって生じる転写産物からのタンパク質の翻訳が引き下げられる、または除外される例に言及し得る。さらにこれ以外にも、下方制御は、ポリヌクレオチド配列によって発現されるタンパク質の活性が低下する例に言及し得る。細胞における上記プロセス（転写、翻訳、タンパク質活性）のいずれかの引下げは、適切なコントロール細胞の転写、翻訳、またはタンパク質活性に対して約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％であり得る。下方制御は、例えば、本明細書中に開示されるターゲティング事象（例えば、ｉｎｄｅｌ、ノックアウト）の結果であり得る。

【0106】

用語「コントロール細胞」および「適切なコントロール細胞」は、本明細書中で互換的に用いられ、特定の修飾（例えば、ポリヌクレオチドの過剰発現、ポリヌクレオチドの下方制御）がなされた細胞（すなわち、「実験細胞」）に対して参照され得る。コントロール細胞は、実験細胞の特定の修飾を有しもしなければ、これを発現もしないあらゆる細胞であり得る。ゆえに、コントロール細胞は、非形質転換野生型細胞であってもよいし、遺伝的に形質転換されているが、遺伝的形質転換を発現しないものであってもよい。例えば、コントロール細胞は、実験細胞の直接の親であってよく、この直接の親細胞は、実験細胞中に存在する特定の修飾を有していない。これ以外にも、コントロール細胞は、一世代または複数世代によって除かれる、実験細胞の親であってよい。さらにこれ以外にも、コントロール細胞は、実験細胞のきょうだいであってよく、このきょうだいは、実験細胞中に存在する特定の修飾を含まない。

【0107】

本明細書中で用いられる用語「増大」は、量または活性の増大が比較されることになる量または活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％、または２００％超える量または活性に言及し得る。用語「増大」、「上昇」、「強化」、「超」、および「向上」は、本明細書中で互換的に用いられる。用語「増大」は、例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を特徴付けるために用いられ得、「発現の増大」は、「過剰発現」を意味することもある。

【0108】

本明細書中で用いられる用語「機能可能なように結合」は、２つ以上の核酸配列について、一方の機能が他方によって影響されるような関連を指す。例えば、プロモータが、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、そのコード配列と機能可能なように結合している。すなわち、コード配列は、プロモータの転写制御下にある。コード配列は、例えば、調節配列に機能可能なように結合し得る。また、例えば、ｃｒＲＮＡは、本明細書中で、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列が、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’配列とアニールするように、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合（融合）し得る。そのような機能可能な結合は、適切なループ形成配列、例えばＧＡＡＡ（配列番号３６）、ＣＡＡＡ（配列番号３７）、またはＡＡＡＧ（配列番号３８）を含んでよい。また、例えば、ＲＧＥＮは、１つ以上のＣＰＰに機能可能なように結合（融合）し得る。

【0109】

本明細書中で用いられる用語「組換え」は、例えば化学合成による、または、遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作による、配列の２つの、通常であれば分離しているセグメントの人工的な組合せを指す。

【0110】

本明細書中の組換え構築体／ベクター（例えば、本明細書中のＲＮＡ構成要素カセットをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、または本明細書中のＣａｓタンパク質またはＣａｓ−ＣＰＰ融合タンパク質をコードするＤＮＡポリヌクレオチド）を調製する方法は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｄ．Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）；Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８４）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００２）によって記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技術および分子クローニング技術に従ってよい。

【0111】

本明細書中で用いられる用語「形質転換」は、任意の方法による宿主生物中または宿主細胞中への核酸分子の運搬を指す。生物／細胞の形質転換された核酸分子は、生物／細胞中で自律的に複製するもの、生物／細胞のゲノムにインテグレートされるもの、または、複製もしくはインテグレートされずに細胞中に一時的に存在するものであり得る。形質転換に適した核酸分子の非限定的な例は、プラスミドおよび直鎖状ＤＮＡ分子など、本明細書に開示されている。

【0112】

本明細書中の「トランスジェニック植物」としては、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物が挙げられる。異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが代々受け継がれるように、ゲノムに安定に組み込むことができる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノムに単独で、または組み換えＤＮＡ構築体の一部として組み込むことができる。トランスジェニック植物はまた、ゲノム内に複数の異種ポリヌクレオチドを含み得る。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる特性を付与してもよい。トランスジェニック植物材料としては、その遺伝子型を異種核酸を存在させることによって変化させたあらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物部または植物（初期にそのように改変されたトランスジェニック体、および初期のトランスジェニック体から有性交配（ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓ）または無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の植物育種方法、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集手順、またはランダム交配、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え置換もしくは自然突然変異などの自然に発生する事象による植物ゲノム（染色体または染色体外の）の変化を、形質転換と見なすことは意図されていない。

【0113】

「表現型マーカー」は、可視マーカー、および陽性選択マーカーであるか陰性選択マーカーであるかを選択可能なマーカーを含む、スクリーニングマーカーまたは選択マーカーである。任意の表現型マーカーを使用することができる。具体的には、スクリーニングマーカーまたは選択マーカーは、多くの場合、特定の条件下で、分子または分子を含む細胞を特定、またはそれに有利にもしくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、限定はされないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質などの活性をコードすることができ、あるいはまた、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機または有機の化合物または組成物などの結合部位を提供することができる。

【0114】

選択マーカーの例としては、限定はされないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；抗生物質（スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）など）などの他の毒性化合物に耐性を示す産生物をコードするＤＮＡセグメント；受容細胞において別に欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定することができる産生物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ、などの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質；および細胞表面タンパク質など）；新しいＰＣＲ用部位の世代（例えば、前に並置されていない２つのＤＮＡ配列の並列）；制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質などの作用を受けていない、または受けたＤＮＡ配列の含有物、ならびに、同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）に要求されるＤＮＡ配列の含有物が挙げられる。

【0115】

選択マーカーのさらなる例としては、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノンおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）などの除草化合物に耐性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３：５０６−１１；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６３１４−８；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７１：６３−７２；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：２４１９−２２；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：５５５−６６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ ４９：６０３−１２；Ｆｉｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｃｅｌｌ ５２：７１３−２２；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４００−４；Ｆｕｅｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２５４９−５３；Ｄｅｕｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：４８０−３；Ｇｏｓｓｅｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｒｅｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１９１７−２１；Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０：３３４３−５６；Ｚａｍｂｒｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９５２−６；Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：５０７２−６；Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：４６４７−５３；Ｈｉｌｌｅｎ ａｎｄ Ｗｉｓｓｍａｎ，（１９８９）Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｏｌ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ １０：１４３−６２；Ｄｅｇｅｎｋｏｌｂ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３５：１５９１−５；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｎｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：１０９４−１０４；Ｂｏｎｉｎ，（１９９３）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５１；Ｏｌｉｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３６：９１３−９；Ｈｌａｖｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７８（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）；Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：７２１−４を参照されたい。

【0116】

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して本明細書中で用いられる用語「配列同一性」または「同一性」は、指定された比較ウィンドウ上で最大に一致するようにアラインされた場合に、２つの配列中の同じである核酸残基またはアミノ酸残基を指す。ゆえに、「配列同一性のパーセンテージ」または「パーセント同一性」は、比較ウィンドウ上の２つの最適にアラインされた配列を比較することによって確定される値を指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適アラインメントについて、付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでよい。パーセンテージは、双方の配列において、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が起こる位置の数を判定して、マッチする位置の数を得て、マッチする位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって除して、結果に１００を乗じることで配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出される。ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列との間で配列同一性を算出する場合、ＤＮＡ配列のＴ残基が、ＲＮＡ配列のＵ残基とアラインすると「同一である」と考えられ得ることが理解されるであろう。第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとのパーセント相補性を確定する目的で、例えば、（ｉ）第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの相補体配列（またはその反対）との間のパーセント同一性、および／または（ｉｉ）規範的なワトソンおよびクリックの塩基対を生じさせることになる第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとの間の塩基のパーセンテージを確定することによって、当該パーセント相補性を得ることができる。

【0117】

Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにてオンラインで利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムが、例えば、本明細書中に開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列間の（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）、またはポリペプチド配列間の（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）パーセント同一性を測定するのに用いられてよい。これ以外にも、配列間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌＶ）を用いて実行されてもよい。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法を用いるマルチプルアラインメントについて、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、そしてＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応してよい。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いた、ペアワイズアラインメント、およびタンパク質配列のパーセント同一性の計算についてのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、そしてＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であってよい。核酸について、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、そしてＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４であってよい。さらにこれ以外にも、配列間のパーセント同一性は、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えばｎｅｅｄｌｅ）を用いて実行されてよく、パラメータは例えば、ＢＬＯＳＵＭ ｍａｔｒｉｘ（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて、ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５である。

【0118】

本明細書中で、第２の配列と「相補的な」第１の配列を、代わりに、第２の配列と「アンチセンス」の向きにあると呼ぶことができる。

【0119】

種々のポリペプチドアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が、開示される本発明のある実施形態の特徴として、本明細書中に開示される。本明細書中に開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％、または９０％〜９５％同一である配列の変異体が用いられてよい。これ以外にも、種々のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書中に開示される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有し得る。種々のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示される配列と同じ機能／活性、または開示される配列の、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の機能／活性を有する。

【0120】

本明細書中のＣａｓ９タンパク質の各アミノ酸位置の、本明細書中に開示される全てのアミノ酸残基は、例である。あるアミノ酸が互いに類似した構造的特徴および／または電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）ならば、Ｃａｓ９中の各位置のアミノ酸は、開示される配列に与えられるそのものであってもよいし、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．以下の小さな、無極性の、または僅かに極性のある脂肪族残基は、互いに置換し得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．以下の極性のある、負に帯電する残基、およびそれらのアミドは、互いに置換し得る：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．以下の極性のある、正に帯電する残基は、互いに置換し得る：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．以下の無極性の脂肪族残基は、互いに置換し得る：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；そして
５．以下の大きな芳香族残基は、互いに置換し得る：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。

【0121】

細胞内でＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングを行うための、細胞内のタンパク質構成要素およびＲＮＡ構成要素の発現が進歩してきている（例えば、米国仮特許出願第６１／８６８，７０６号明細書および同第６２／０３６，６５２号明細書）。そのような戦略では、一般に、標的細胞における組み換えＤＮＡ発現が必要である。ＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングを媒介するため、細胞内でタンパク質構成要素およびＲＮＡ構成要素を提供するさらなる手段に関心が集まっている。

【0122】

開示する本発明の実施形態は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成している組成物に関する。ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる。

【0123】

重要なことに、開示される本発明のある実施形態は、ＲＮＡ構成要素に既に結合している（前結合している）ＲＧＥＮを細胞に輸送するために使用され得る。そのような実施形態は、ＲＧＥＮ ＲＮＡ構成要素を発現させるために、細胞にＤＮＡ構築体を輸送する必要を回避することができ、それ故、細胞に外因性のＤＮＡを導入することにより被るおそれのある影響を免れることができる。しかしながら、開示される本発明は柔軟性があり、他のある実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を輸送する細胞内で、ＲＮＡ構成要素を提供する（例えば、発現させる）ことができる。このように提供されるＲＮＡ構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の細胞への輸送／侵入後に、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合し得る。ＲＮＡ構成要素の輸送モードにかかわらず、本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、ＲＮＡ酵素要素と結合し、細胞内の特定のＤＮＡ配列をターゲティングし得るＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を形成することができる。それ故、開示される本発明は、ＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングを実行するために細胞内でＲＧＥＮを提供する実質的柔軟性を提供する。

【0124】

ある実施形態で開示される組成物は、ＲＧＥＮの少なくとも１つのタンパク質構成要素を含む。本明細書中のＲＧＥＮは、少なくとも１つのＣａｓタンパク質と少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む複合体を指す。したがって、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質を指し得る。適切なＣａｓタンパク質の例として、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたは複数のＣａｓエンドヌクレアーゼが挙げられる（Ｂｈａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．４５：２７３−２９７（参照によって本明細書に組み込まれる））。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ３タンパク質またはＣａｓ４タンパク質であってよい。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ９タンパク質であってよい。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１０タンパク質であってよい。特定の好ましい実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質が用いられる。ある実施形態におけるＣａｓタンパク質は、細菌タンパク質または古細菌タンパク質であってよい。本明細書中でＩ〜ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は典型的に、起源が原核生物である；例えば、Ｉ型およびＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌種または古細菌種に由来し得るが、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓ９）は、細菌種に由来し得る。他の実施形態において、適切なＣａｓタンパク質として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、またはそれらの修飾型の１つまたは複数が挙げられる。

【0125】

開示される本発明の他の態様において、本明細書中でＣａｓタンパク質は、以下の属のいずれに由来してもよい：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）属、ピロバキュラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）属、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、アルカエオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）属、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メタノサルシーナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノピラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）属、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）属、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属、フゾバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アザーカス（Ａｚａｒｃｕｓ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、デサルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）属、マイクロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、またはテルモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属。これ以外にも、本明細書中のＣａｓタンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される配列番号４６２〜４６５、４６７〜４７２、４７４〜４７７、４７９〜４８７、４８９〜４９２、４９４〜４９７、４９９〜５０３、５０５〜５０８、５１０〜５１６、または５１７〜５２１のいずれによってコードされてもよい。

【0126】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、例えば、Ｃａｓ９アミノ酸配列を含み得る。この型のタンパク質構成要素を含むＲＧＥＮは、通常、ＲＧＥＮのエンドヌクレアーゼ構成要素としてＣａｓ９を有すると見なされ得る。本明細書中でＣａｓ９タンパク質、および本明細書中で他のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、ストレプトコッカス・プセウドポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属種（例えばリステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）属種（例えばスピロプラズマ・アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科種、アトポビウム（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）属種、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属種（例えばポルフィロモナス・カトニアエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属種（例えばプレボテラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属種（例えば、トレポネーマ・ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属種、フィネゴルディア（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）属種（例えばフィネゴルディア・マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科種（例えばＣ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属種（例えばオルセネラ・プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属種（例えば、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘモフィルス・ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属種（例えばパスツレラ・ベッティアエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えばオリビバクター・シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）属種（例えばエピリソニモナス・テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属種（例えばメソニア・モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種（例えばセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）属種（例えばアクイマリーナ・ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えばクリセオバクテリウム・パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属種（例えばバクテロイデス・グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属種（例えば髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属種（例えばフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、またはフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、フラボバクテリウム・フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム・ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））に由来してよい。本明細書中のある態様において、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９が好ましい。別の例として、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６−７３７）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されるＣａｓ９タンパク質のいずれであってもよい。

【0127】

したがって、本明細書中でＣａｓ９タンパク質の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｇ３ＥＣＲ１（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（ストレプトコッカス・プセウドポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（ストレプトコッカス・コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（ストレプトコッカス・パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、またはＱ９９ＺＷ２（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））（これらは参照によって組み込まれる）に開示されるＣａｓ９アミノ酸配列のいずれを含んでもよい。これらのＣａｓ９タンパク質配列のいずれの変異体が用いられてもよいが、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた、特異的な結合活性を、そして場合によっては切断またはニッキング分解活性を有するべきである。そのような変異体は、基準Ｃａｓ９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。

【0128】

これ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示される、配列番号４６２（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４７４（サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４８９（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９４（ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９９（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、５０５（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、または５１８（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））のいずれによってコードされてもよい。さらにこれ以外にも、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３の残基１〜１３６８、２〜１３６８または２〜１３７９を含んでよい。さらにこれ以外にも、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよい。そのような変異体Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書中のＲＮＡ構成要素と関連する場合に、ＤＮＡに向けた特異的な結合活性を、そして場合によっては、切断またはニッキング活性を有するべきである。

【0129】

本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来する同じ種であってもよいし、異なる種であってもよい。例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来するＣａｓ９タンパク質を含むＲＧＥＮは、同じ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種に由来する配列（例えば、ｃｒＲＮＡ反復配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）を有する少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と複合化されてよい。これ以外にも、本明細書中で用いられるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の起源は、ＲＮＡ構成要素が由来するのとは異なる種であってよい（Ｃａｓタンパク質およびＲＮＡ構成要素は、互いに異種起源であってよい）；そのような異種起源のＣａｓ／ＲＮＡ構成要素ＲＧＥＮは、ＤＮＡターゲティング活性を有するはずである。

【0130】

特定の標的ＤＮＡ配列に向けた、本明細書中のＣａｓタンパク質の結合活性および／またはエンドヌクレオチド結合分解活性の判定は、例えば米国特許第８６９７３５９号明細書（この文献は参照によって本明細書に開示される）に開示されるような、当該技術分野において知られているあらゆる適切なアッセイによって評価されてよい。判定は、例えば、細胞中でＣａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を発現させてから、ｉｎｄｅｌの存在が予測されるＤＮＡ標的部位を調査することによってなされてよい（Ｃａｓタンパク質は、この特定のアッセイにおいて、典型的に完全なエンドヌクレオチド結合分解活性［二本鎖切断活性］を有することになる）。予測される標的部位での改変／修飾（例えば、ｉｎｄｅｌ）の存在についての調査は、例えば、ＤＮＡ配列決定法を介して、または標的配列の機能の欠如についてアッセイすることにより改変／修飾形成を推測することによって、なされ得る。別の例において、Ｃａｓタンパク質活性は、標的部位中の配列、またはその近くの配列に相同である配列を含むドナーＤＮＡが提供された細胞において、Ｃａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を発現させることによって判定され得る。標的部位でのドナーＤＮＡ配列の存在（例えば、ドナーと標的配列との首尾良いＨＲによって予測されるであろう）により、ターゲティングが起こったことが示されることになる。さらに別の例において、Ｃａｓタンパク質活性は、Ｃａｓタンパク質および適切なＲＮＡ構成要素を適切な標的配列を含有するＤＮＡポリヌクレオチドと混合するインビトロアッセイにより決定し得る。このアッセイは、切断活性が欠失したＣａｓタンパク質による結合（例えば、ゲルシフト）、またはポリヌクレオチド鎖切断能のあるＣａｓタンパク質による切断を検出するために使用することができる。

【0131】

本明細書中のＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９は、ある態様では、さらに、異種の核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。本明細書中の異種ＮＬＳアミノ酸配列は、例えば、本明細書中の細胞の核内で検出可能な量のＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質−ＣＰＰ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシンおよび／またはアルギニン）の１つ（一分節）または複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２〜２０残基）を含んでよく、そして、タンパク質表面上に曝されるのであれば、Ｃａｓアミノ酸配列中のどこに位置決めされてもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端またはＣ末端に機能可能なように結合してよい。例えば、２つ以上のＮＬＳ配列が、Ｃａｓタンパク質に、例えばＣａｓタンパク質のＮ末端およびＣ末端に結合してよい。本明細書中の適切なＮＬＳ配列の非限定的な例としては、米国特許第６６６０８３０号明細書および同第７３０９５７６号明細書（例えば、その中の表１）に開示されるものが挙げられる（これらの文献はいずれも参照によって本明細書に組み込まれる）。本明細書中の有用なＮＬＳの別の例としては、配列番号３のアミノ酸残基１３７３〜１３７９が挙げられる。本明細書中に開示されるＣａｓタンパク質は、例えば、ＣＰＰと結合させることができる（ＣＰＰに共有結合したＣａｓタンパク質の例）。そのようなＣａｓ−ＣＰＰ融合タンパク質がまた上記のようなＮＬＳを含むことができることは理解されよう。Ｃａｓタンパク質が、異なる細胞小器官（例えば、ミトコンドリア）をターゲティングするアミノ酸配列と融合する実施形態においては、そのようなＣａｓタンパク質が、通常、ＮＬＳを含まないこともまた理解されよう。

【0132】

ある実施形態において、Ｃａｓタンパク質、およびその、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ特異的ターゲティングを導く各ＲＮＡ構成要素（例えばｃｒＲＮＡ）は、細胞、特に非原核細胞と異種である。これらのＲＧＥＮ構成要素の異種の本質は、Ｃａｓタンパク質とそれらの各ＲＮＡ構成要素が、原核生物（細菌および古細菌）中に存在することしか知られていないという事実によるものである。

【0133】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓタンパク質に加えて１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。これらの実施形態は、例えば、ＣＰＰに共有結合するＣａｓタンパク質と、１つ以上のさらなる異種アミノ酸配列を包含する。他の実施形態は、ＣＰＰを含まない１つ以上のさらなる異種アミノ酸配列に共有結合するＣａｓタンパク質を包含し得る（そのような実施形態では、ＣＰＰは、Ｃａｓ融合タンパク質に非共有結合的に結合するであろう）。Ｃａｓタンパク質を含む融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、そして場合によっては任意の２つのドメイン間に、例えばＣａｓと第１の異種ドメインとの間にリンカー配列を含み得る。本明細書中でＣａｓタンパク質に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ、ポリ−ヒスチジン］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、リポータ（例えば、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、および以下の活性の１つまたは複数を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６またはＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終止因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、および核酸結合活性。他の実施形態におけるＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ分子または他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、および単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。本明細書中でＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質の一部であってよい付加的なドメインが、米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃａｓタンパク質が異種起源のタンパク質（例えば転写因子）に融合する実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、（本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素と複合した場合に）ＤＮＡ認識および結合活性を有するが、ＤＮＡニッキング活性も切断活性も有していない。本明細書中に開示されるＣａｓタンパク質は、例えば、ＣＰＰと融合することができる（ＣＰＰに共有結合したＣａｓタンパク質の例）。そのようなＣａｓ−ＣＰＰ融合タンパク質はまた、必要に応じて、上記のような異種ドメインの１つ以上と融合し得ることは理解されよう。

【0134】

本明細書中のＣａｓタンパク質に結合することができる異種ドメインの他の例としては、特定の細胞小器官にタンパク質をターゲティングするアミノ酸配列（すなわち、局在化シグナル）が挙げられる。ターゲティングされ得る細胞小器官の例としては、ミトコンドリアおよびクロロプラストが挙げられる。通常、そのようなターゲティングドメインは、エキストラ核ＤＮＡ部位をターゲティングする場合、ＮＬＳに代えて使用される。ミトコンドリアターゲティング配列（ＭＴＳ）は、例えば、Ｃａｓタンパク質のＮ末端またはその近傍に位置し得る。ＭＴＳの例は、米国特許出願公開第２００７／００１１７５９号明細書および同第２０１４／０１３５２７５号明細書に開示されている（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。クロロプラストターゲティング配列は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１９２２６２号明細書および同第２０１２／００４２４１２号明細書に開示されているものであり得る（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0135】

ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、例えば、細胞の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合することができる（これにより、完全なＲＧＥＮを構成する）。そのような実施形態のＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができ、場合により、標的部位配列のＤＮＡ一本鎖または二本鎖を切断することができる。ＲＧＥＮは、例えば、ＤＮＡ標的配列の一本鎖または二本鎖を切断することができる。他の例では、ＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的配列の二本鎖を切断することができる。これらの全ての実施形態において、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体中の少なくとも１つのＣＰＰに共有結合的に、または非共有結合的に結合することができることは理解されよう。本明細書中でのＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体とＲＮＡ構成要素との結合は、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の形成と見なされ得る。同様に、ＲＧＥＮに関する本明細書中の開示は、特に断らない限り、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮ構成要素に適用することができる。

【0136】

ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは典型的に、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメインまたはその変異体）を含む。ゆえに、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部または全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓ９タンパク質）またはその変異体が、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮの適切な例である。機能的なＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインを含むＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＣａｓタンパク質の例である。本明細書中でＤＮＡ標的配列の双方の鎖を切断することができるＲＧＥＮは典型的に、カット部位にて平滑末端（すなわち、ヌクレオチド突出部がない）が形成されるように、双方の鎖を同じ位置にてカットする。

【0137】

ＤＮＡ標的配列の一本鎖を切断することができる本明細書中のＲＧＥＮは、本明細書中で、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。本明細書中でＣａｓニッカーゼ（例えばＣａｓ９ニッカーゼ）は典型的に、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の一本鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする一機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば野生型ＨＮＨドメイン）を含んでよい。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば野生型ＲｕｖＣドメイン）、および（ｉｉ）突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含んでよい。

【0138】

本明細書中での使用に適したＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例が、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９−Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１），Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：９２７５−９２８２）、および米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−３１置換（例えば、Ａｓｐ−３１−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８６５置換（例えばＨｉｓ−８６５−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８８２置換（例えばＡｓｎ−８８２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８９１置換（例えばＡｓｎ−８９１−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有するサーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。また例えば、本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）、Ｇｌｕ−７６２置換（例えばＧｌｕ−７６２−Ａｌａ）、もしくはＡｓｐ−９８６置換（例えばＡｓｐ−９８６−Ａｌａ）（突然変異したＲｕｖＣドメインの例）、またはＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）、Ａｓｎ−８５４置換（例えば、Ａｓｎ−８５４−Ａｌａ）、もしくはＡｓｎ−８６３置換（例えばＡｓｎ−８６３−Ａｌａ）（突然変異したＨＮＨドメインの例）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含んでよい。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に関して、３つのＲｕｖＣサブドメインは概して、アミノ酸残基１〜５９、７１８〜７６９、および９０９〜１０９８にそれぞれ位置決めされ、ＨＮＨドメインは、アミノ酸残基７７５〜９０８に位置決めされる（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６：９３５−９４９）。

【0139】

本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、必要に応じて、細胞において種々の目的で用いられ得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、適切なドナーポリヌクレオチドとの、ＤＮＡ標的部位配列での、またはその近くでのＨＲを誘発するのに用いられてよい。ニックが入ったＤＮＡは、ＮＨＥＪプロセス用の担体ではなく、ＨＲプロセスによって認識されるので、特定の標的部位のニッキングＤＮＡにより、部位は、適切なドナーポリヌクレオチドとのＨＲをより受け入れ易くなるはずである。

【0140】

別の例として、一対のＣａｓ９ニッカーゼが、ＤＮＡターゲティングの特異度を高めるのに用いられてよい。一般にこれは、２つのＣａｓ９ニッカーゼを与えることによってなされ得、これらが、ガイド配列が様々なＲＮＡ構成要素との関連により、所望のターゲティング領域における反対側の鎖のＤＮＡ配列近くを標的とし、かつそこにニックを入れる。各ＤＮＡ鎖のそのような近くでの切断により、ＤＳＢ（すなわち、一本鎖突出部を有するＤＳＢ）が生じ、これはその後、ＮＨＥＪ（ｉｎｄｅｌ形成の原因となる）またはＨＲ（提供されるならば、適切なドナーポリヌクレオチドとの組換えの原因となる）用の担体として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００（または５から１００までのあらゆる整数）塩基離れてよい。先に記載されるように、本明細書中で１つまたは２つのＣａｓ９ニッカーゼタンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ対に用いられてよい。例えば、突然変異したＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインのないＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９ ＨＮＨ^＋／ＲｕｖＣ⁻）が用いられてよい（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＨＮＨ^＋／ＲｕｖＣ⁻）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨ^＋／ＲｕｖＣ⁻）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれることになる。

【0141】

ある実施形態におけるＲＧＥＮは、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない。そのようなＲＧＥＮは、全ヌクレアーゼドメインが、突然変異した、機能不全であるＣａｓタンパク質を含んでよい。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列にていかなる鎖も切断しない本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、突然変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、および突然変異した、機能不全ＨＮＨドメインの双方を含んでよい。そのようなＣａｓ９タンパク質の非限定的な例は、先に開示されるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン突然変異およびＨＮＨヌクレアーゼドメイン突然変異（例えば、Ａｓｐ−１０置換、例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ、およびＨｉｓ−８４０置換、例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａを有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）のいずれかを含む。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いられてよく、例えば、その場合には、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（またはその一部）（例えば、リプレッサまたは活性化因子、例えば本明細書中で開示されるもののいずれか）と融合し得る。例えば、Ａｓｐ−１０置換（例えばＡｓｐ−１０−Ａｌａ）およびＨｉｓ−８４０置換（例えばＨｉｓ−８４０−Ａｌａ）を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むＣａｓ９は、ＶＰ１６転写活性化因子ドメインまたはＶＰ６４転写活性化因子ドメインに融合し得る。そのようなＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素に用いられるガイド配列は、例えば、遺伝子プロモータまたは他の調節要素（例えばイントロン）中のＤＮＡ配列と相補的であることになる。

【0142】

本明細書中のＲＧＥＮは、標的部位配列、および非従来型酵母の染色体、エピソーム、またはゲノム中の他のあらゆるＤＮＡ分子における標的部位配列の１本鎖または２本鎖に結合することができ、そして場合によってはこれを切断することができる。標的配列のこの認識および結合は、ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素が、標的配列の鎖と相補的である配列（ガイド配列）を含むならば、特異的である。ある実施形態における標的部位は、固有であってよい（すなわち、対象ゲノム中に標的部位配列が１つ存在する）。

【0143】

本明細書中で標的配列の長さは、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０ヌクレオチド；１３から３０ヌクレオチド；１７から２５ヌクレオチド；または１７から２０ヌクレオチドであってよい。この長さは、ＰＡＭ配列を含んでも除いてもよい。また、本明細書中で標的配列の鎖は、ガイド配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、（ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡの）ガイド配列との相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合、以下参照）。ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列の鎖との相補性の程度は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。本明細書中で標的部位は、例えば、遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）をコードする配列中に位置決めされてもよいし、非コード配列（例えば、調節配列または「ジャンク」配列）中に位置決めされてもよい。

【0144】

ＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）配列が、標的部位配列に隣接してよい。ＰＡＭ配列は、本明細書中のＲＧＥＮによって認識される短いＤＮＡ配列である。関連するＰＡＭ、およびＤＮＡ標的配列の最初の１１のヌクレオチドは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡターゲティングおよび切断にとっておそらく重要である（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３１：２３３−２３９）。本明細書中でＰＡＭ配列の長さは、用いられるＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体に応じて変動し得るが、典型的には、例えば、２、３、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。ＰＡＭ配列は、例えば、標的部位中で、ＲＮＡ構成要素のガイド配列と相補的である鎖と相補的である標的部位配列から直ぐ下流にあり、またはその下流２または３ヌクレオチド以内にある。ＲＧＥＮが、ＲＮＡ構成要素と複合化した、エンドヌクレオチド結合分解活性のあるＣａｓ９タンパク質である本明細書中の実施形態において、Ｃａｓ９は、ＲＮＡ構成要素によって導かれて標的配列に結合し、ＰＡＭ配列の上流にある第３のヌクレオチド位置の直ぐ５’側の双方の鎖を切断する。標的部位の以下の例を考える：ＰＡＭ配列：

【化1】

Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよく、Ｘは、この例の配列において、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい（Ｘは、Ｎ_ＰＡＭと呼ぶこともできる）。ＰＡＭ配列は、この例において、ＸＧＧである（下線が引かれている）。適切なＣａｓ９／ＲＮＡ構成要素複合体は、この標的を、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側で切断することになる。配列番号４３におけるＮのストリングは、例えば、本明細書中のＲＮＡ構成要素中のガイド配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の標的配列を表す（ＤＮＡ標的配列のどのＴも、ＲＮＡガイド配列の全てのＵとアラインすることになる）。Ｃａｓ９複合体のＲＮＡ構成要素のガイド配列は、この標的配列（本明細書中の標的部位を代表する）での認識および結合の際に、Ｎのストリングの相補体配列とアニールすることになる；ガイド配列と標的部位相補体とのパーセント相補性は、例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。Ｃａｓ９ニッカーゼがゲノム中の配列番号４３を標的とするのに用いられる場合、ニッカーゼは、ニッカーゼ中のどのエンドヌクレアーゼドメインが機能不全であるかに応じて、相補鎖の、二重下線が引かれたＮの直ぐ５’側、または同じ位置にニックを入れることになる。核酸分解活性を有していないＣａｓ９（ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの双方が機能不全）がゲノム中の配列番号４３を標的とするのに用いられる場合、標的配列を認識してこれに結合することになるが、配列にいかなるカットも入れることはない。

【0145】

本明細書中でＰＡＭは典型的に、利用されることになるＲＧＥＮのタイプを考慮して選択される。本明細書中でＰＡＭ配列は、Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓが由来し得る、本明細書中に開示されるあらゆる種に由来する、例えばＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。ある実施形態において、ＰＡＭ配列は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来するＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであってよい。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する適切なＣａｓ９は、ＮＧＧのＰＡＭ配列（配列番号４４；Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧであってよい）を有するゲノム配列を標的とするのに用いられ得る。他の例として、以下のＰＡＭ配列を有するＤＮＡ配列を標的とする場合、適切なＣａｓ９が、以下の種のいずれかに由来してよい：サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ［配列番号４５］）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＧＧ［配列番号４４］）、ＮＮＡＧＡＡＷ［配列番号４６、Ｗは、ＡまたはＴである］、ＮＧＧＮＧ［配列番号４７］）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ［配列番号４８］）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＮＡＡＡＡＣ［配列番号４９］）、またはフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＮＧ［配列番号５０］）（これらの特定の全ＰＡＭ配列中のＮは、Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＧである）。本明細書中の有用なＣａｓ９／ＰＡＭの他の例として、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：８９１−８９９）およびＥｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６−１１２１）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の標的配列の例は、配列番号４３に従うが、「ＸＧＧ」ＰＡＭは、前述のＰＡＭのいずれか１つによって置換されている。

【0146】

本明細書中のＲＮＡ構成要素は、細胞の染色体またはエピソームの標的部位配列に相補的な配列を含み得る。ＲＧＥＮは標的部位配列に特異的に結合することができ、そして場合によっては、その標的部位配列の一本鎖または二本鎖を、この配列相補体に基づいて切断することができる。したがって、開示される発明のある実施形態では、ＲＮＡ構成要素の相補配列は、ガイド配列または可変ターゲティングドメインと呼ぶこともできる。

【0147】

本明細書中のＲＮＡ構成要素のガイド配列（例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡ）は、例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０リボヌクレオチド長；１３〜３０リボヌクレオチド長；１７〜２５リボヌクレオチド長；または１７〜２０リボヌクレオチド長であってよい。一般に、本明細書中のガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、かつＣａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質複合体の、標的配列への配列特異的結合を導くのに十分な、標的ＤＮＡ配列の鎖との相補性を有する（適切なＰＡＭが標的配列に隣接する場合）。例えば、ガイド配列と、その対応するＤＮＡ標的配列との相補性の程度は、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ガイド配列は、細胞中のＤＮＡ標的配列にＲＧＥＮを標的として向けるように、然るべく操作されてよい。

【0148】

本明細書中のＲＮＡ構成要素は、例えば、ガイド配列およびリピート（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト）配列を含むｃｒＲＮＡを含んでよい。ガイド配列は典型的に、ｃｒＲＮＡの５’末端に、またはその近く（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基以内）に位置決めされる。ｃｒＲＮＡのガイド配列の下流には、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の配列と相補的であり、かつこれとハイブリダイズすることができる「リピート」配列または「ｔｒａｃｒＲＮＡメイト」配列がある。ガイド配列およびｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、直接隣接してもよいし、例えば、１、２、３、４、またはそれ以上の塩基によって分離されてもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に対する配列相補性が、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。一般に、相補性の程度は、２つの配列のうちのより短い方の全長に沿う、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列の５’末端の最適アラインメントに関するものであってよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列の長さは、例えば、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８リボヌクレオチド長であってよく、そしてｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端の同じ、または類似した長さ（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）の配列とハイブリダイズする。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列の適切な例が、配列番号５１（ｇｕｕｕｕｕｇｕａｃｕｃｕｃａａｇａｕｕｕａ）、配列番号５２（ｇｕｕｕｕｕｇｕａｃｕｃｕｃａ）、配列番号５３（ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａ）、もしくは配列番号５４（ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇ）、またはその変異体を含み、これらは、（ｉ）少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、かつ（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列とアニールすることができる。本明細書中のｃｒＲＮＡの長さは、例えば、少なくとも約１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、もしくは４８リボヌクレオチド；約１８〜４８リボヌクレオチド；または約２５〜５０リボヌクレオチドであってよい。

【0149】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓ９タンパク質がＲＧＥＮ中に含まれる実施形態において、ｃｒＲＮＡと共に含むことができる。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、５’から３’の方向に、（ｉ）ｃｒＲＮＡのリピート領域（ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列）とアニールする配列、および（ｉｉ）ステムループ含有部分を含む。（ｉ）の配列の長さは、例えば、先に開示されるｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列長のいずれかと同じであってもよいし、類似（例えば、プラスマイナス１、２、３、４、または５塩基）であってもよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡ（すなわち、配列構成要素［ｉ］および［ｉｉ］）の全長は、例えば、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０（または３０から９０までのあらゆる整数）リボヌクレオチドであってよい。ｔｒａｃｒＲＮＡはさらに、３’末端に１、２、３、４、５、またはそれ以上のウラシル残基を含んでよく、これは、転写ターミネータ配列によるｔｒａｃｒＲＮＡの発現によって存在し得る。

【0150】

本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、Ｃａｓ９配列が由来してよい、先に記載されるいずれの細菌種に由来してもよい。適切なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例として、米国特許第８６９７３５９号明細書、およびＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６−７３７）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書中の好ましいｔｒａｃｒＲＮＡは、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種のｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））に由来してよい。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡの他の適切な例は、以下を含んでよく：
配列番号５５：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃ、
配列番号５６：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇ、または
配列番号５７：
ｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａ、
これらは化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｔｒａｃｒＲＮＡに由来する。本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡの他の適切な例は、以下：
配列番号５８：
ｕａａａｕｃｕｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕｕｕｕｃｇｕｕａｕｕｕａａ、
配列番号５９：
ｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕｕｕｕｃｇｕｕａｕｕｕａ、または
配列番号６０：
ｕｇｃａｇａａｇｃｕａｃａａａｇａｕａａｇｇｃｕｕｃａｕｇｃｃｇａａａｕｃａａｃａｃｃｃｕｇｕｃａｕｕｕｕａｕｇｇｃａｇｇｇｕｇｕ、
を含んでよく、これらは、サーモフィルス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｔｒａｃｒＲＮＡに由来する。

【0151】

本明細書中のｔｒａｃｒＲＮＡのさらに他の例は、これらのｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号の変異体であって、（ｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列番号と少なくとも約８０％、８５％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し、かつ（ｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡとして機能することができる変異体である（例えば、５’末端配列は、ｃｒＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列にアニールすることができ、５’末端配列から下流の配列は、１つまたは複数のヘアピンを形成することができ、変異体ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と複合体を形成することができる）。

【0152】

本明細書中に開示されるＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素（または、別の言い方をすれば、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合し得るＲＮＡ構成要素）は、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合する、またはこれに融合するｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。ある好ましい実施形態のｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素は、ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の上流にある（すなわち、例えばｇＲＮＡは、５’から３’の方向に、ｔｒａｃｒＲＮＡに機能可能なように結合するｃｒＲＮＡを含む）。本明細書（例えば、先の実施形態）中に開示されるあらゆるｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒａｃｒＲＮＡ（および／またはその一部、例えば、ｃｒＲＮＡリピート配列、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列、またはｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列）は、例えば、ｇＲＮＡ中に含まれてよい。

【0153】

本明細書中のｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の５’末端とアニールすることによって、ヘアピン構造を形成することができるべきである。（ｃｒＲＮＡ構成要素の）ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列と、（ｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の）５’末端配列との長さ、およびパーセント相補性に関する先の開示はいずれも、例えば、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素を特徴付けることができる。このアニーリングを促進するために、ｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の機能可能な結合または融合は好ましくは、適切なループ形成リボヌクレオチド配列を含む（すなわち、ループ形成配列が、ｃｒＲＮＡ構成要素およびｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素をまとめて結合して、ｇＲＮＡを形成し得る）。ＲＮＡループ形成配列の適切な例として、ＧＡＡＡ（配列番号３６）、ＣＡＡＡ（配列番号３７）、およびＡＡＡＧ（配列番号３８）が挙げられる。しかしながら、代わりのループ配列として、より長い、またはより短いループ配列が用いられてもよい。ループ配列は好ましくは、リボヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）を、そしてトリプレットのどちらかの末端に付加的なリボヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含む。

【0154】

本明細書中のｇＲＮＡは、その（ｃｒＲＮＡ構成要素の）ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列部分およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端配列部分のアニーリングにより、ヘアピン（「第１のヘアピン」）を形成する。１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４つ）の付加的なヘアピン構造が、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成要素の配列に応じて、この第１のヘアピンから下流に形成されてよい。したがって、ｇＲＮＡは、例えば、最大５つのヘアピン構造を有し得る。ｇＲＮＡはさらに、例えば、ｇＲＮＡ配列の末端に続く、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の残基を含んでよく、これは、転写ターミネータ配列によるｇＲＮＡの発現によって存在し得る。これらの付加的な残基は、例えば、ターミネータ配列の選択に応じて、全てがＵ残基であってもよいし、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＵ残基であってもよい。

【0155】

開示される本発明に有用な、適切なｇＲＮＡの非限定的な例は、以下を含んでよい：

【化2】

【0156】

配列番号６１〜６７のそれぞれにおいて、一重下線が引かれた配列は、ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を表す。各「Ｎ」は、適切なガイド配列のリボヌクレオチド塩基（Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣ）を表す。小文字の第１のブロックは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列を表す。小文字の第２のブロックは、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分を表す。二重下線が引かれた配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列とアニールして、第１のヘアピンを形成するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の部分に接近する。ループ配列（ＧＡＡＡ、配列番号３６）は大文字で示され、これは、各ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分およびｔｒａｃｒＲＮＡ部分と機能可能なように結合する。本明細書中のｇＲＮＡの他の例として、前述のｇＲＮＡの変異体であって、（ｉ）前述のｇＲＮＡの配列と少なくとも約８０％、８５％、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有し（この計算において、ガイド配列は除外する）、かつ（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質を特異的に標的として、標的ＤＮＡ配列と結合し、場合によってはこれにニックを入れ、またはこれを切断するｇＲＮＡとして機能し得る変異体が挙げられる。

【0157】

本明細書中のｇＲＮＡはまた、ガイド配列（ＶＴドメイン）に続いてＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインを有する観点から特徴付けられ得る。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列に続いてｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。本明細書中の有用なＣＥＲドメインの例として、先の配列番号６１〜６７に含まれるものが挙げられる（それぞれにおけるＣＥＲドメインは、ＶＴドメインのＮに続く配列である）。ＣＥＲドメインの別の適切な例が、配列番号２４であり（実施例参照）、これは、５’から３’の方向に、配列番号５３のｔｒａｃｒＲＮＡメイト配列、配列番号３６のループ形成配列（ＧＡＡＡ）、および配列番号５５のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。

【0158】

ＲＧＥＮのＲＮＡ構成要素は、場合により、５’キャップ（７−メチルグアニル酸［ｍ^７Ｇ］キャップ）を有していない（すなわち、例えば、ＲＮＡ構成要素は、その５’末端にｍ^７Ｇキャップを有していない）。本明細書中のＲＮＡ構成要素の、５’キャップの代わりに、例えば、５’水酸基を有してよい。あるいは、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、例えば、５’キャップの代わりに、５’リン酸を有してよい。これらの実施形態では、ＲＮＡ構成要素は、（例えば、核内での転写後、または、核内へのＲＧＥＮ媒介移行後、本明細書中でのＲＮＡ構成要素の提供の仕方に応じて）核中により十分に蓄積し得ると考えられる、というのも、５’キャッピングされたＲＮＡ（すなわち、５’ｍ^７Ｇキャップを有するＲＮＡ）は、核外移行を受けるからである。本明細書中のキャップ離脱ＲＮＡ構成要素の好ましい例としては、適切なｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡが挙げられる。ある実施形態において、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、５’キャップを欠き、場合によっては、ＲＮＡ構成要素の前駆体の５’末端でのリボザイム配列によるＲＮＡ自動プロセシングによって、代わりとして５’水酸基を有する（すなわち、ｇＲＮＡなどのＲＮＡ構成要素の上流にリボザイム配列を含む前駆体ＲＮＡは、リボザイム配列を除去するリボザイム媒介自動プロセシングを受け、それによって、ＲＮＡ構成要素の下流は、５’キャップを欠いたままとなる）。ある他の実施形態において、本明細書中のＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモータからの転写によって生じない。

【0159】

本明細書中の細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）の長さは、例えば、約５〜３０、５〜２５、５〜２０、１０〜３０、１０〜２５または１０〜２０アミノ酸残基であり得る。他の例としては、ＣＰＰの長さは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基であり得る。さらに、本明細書中のさらなる態様では、ＣＰＰの長さは、約３５、４０、４５、５０、５５または６０以下のアミノ酸残基であり得る。

【0160】

本明細書中に開示されるＣＰＰは、例えば、カチオン性または両親媒性であり得る。本明細書中のカチオン性ＣＰＰは、通常、正電荷を持つアミノ酸、例えば、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）および／またはヒスチジン（Ｈ）を少なくとも約６０％含む。あるいは、カチオン性ＣＰＰは、例えば、正電荷を持つアミノ酸（例えば、Ｒ残基；Ｋ残基；ＫおよびＲ残基；Ｋ、ＲおよびＨ残基）を少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％含み得る。ある実施形態では、カチオン性ＣＰＰは、アルギニンリッチ（例えば、Ｒ残基を少なくとも７０％または８０％含む）、またはリシンリッチ（例えば、Ｌ残基を少なくとも７０％または８０％含む）であると特徴付けることができる。本明細書中で有用なカチオン性ＣＰＰの例は、Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８４：１８０６−１８１３）およびＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８）に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。カチオン性ＣＰＰの他の例は、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６８）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６９）またはＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号７０）（これらは、もとは、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質に由来した）およびペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号７１）（これは、もとは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）属のアンテナペディアホメオドメインタンパク質に由来した）。

【0161】

カチオン性ＣＰＰの他の例は、ＣＰＰおよびその積み荷（例えば、ＲＧＥＮタンパク質構成要素またはＲＧＥＮ）の細胞へ侵入させるのに十分な、隣接する多くのアルギニンを有するポリアルギニン配列を含む。そのようなポリアルギニン配列における隣接するアルギニン残基の数は、たとえば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０または１０〜５０のアルギニンであり得る。本明細書中のある態様では、ＣＰＰは６個以上の隣接するアルギニン残基（例えば、６〜７、６〜８、６〜９または６〜１０のアルギニン残基）を有し得る。「ＰｏｌｙＲ」（ＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＬＬＬＬ、配列番号１５）は、必要なら、ポリアルギニンＣＰＰに含まれ得る。他のポリアルギニンＣＰＰの例には、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号７２）またはＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号７３）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは活性化ＣＰＰ（「ＡＣＰＰ」）（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）１：３７１−３８１；参照によって本明細書に組み込まれる）である。ＡＣＰＰは、通常、マッチングポリアニオン（例えば、９個の隣接するグルタミン酸）に切断可能なリンカーにより結合したポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、９個の隣接するアルギニン）を含む。これは、正味荷電をほぼゼロにまで低下させ、それによって、ＣＰＰの細胞への接着および取り込みを阻害する。リンカーを切断すると、ポリアニオンは解放され、ポリカチオン部が部分的に露出し、本来の接着性が現れ、ＣＰＰの細胞への侵入が可能になる。本明細書中の他の例は、ポリリシンＣＰＰであり、ポリアルギニンの上記実施形態はいずれも、ＲがＫと置き換えられるが、本明細書中では、ポリリシンの例となる。

【0162】

本明細書中の両親媒性のＣＰＰは、極性／荷電残基と非極性の疎水性残基の交互パターンを含むアミノ酸配列を含む。以下のＣＰＰは、（両親媒性の用語が完全に該当するか否かにかかわらず）両親媒性であると考えられ、ある態様では有用である：トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ペプチド（例えば、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＣＡＡＣＡＫＫＩＬ、配列番号１４）、血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ、例えば、ｐＶＥＣペプチド（例えば、ＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列番号７４；ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列版号１３）を含むＣＰＰ；エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、例えば、ゼブラペプチド（例えば、ＥＣＤＳＥＬＥＩＫＲＹＫＲＶＲＶＡＳＲＫＣＲＡＫＦＫＱＬＬＱＨＹＲＥＶＡＡＡＫＳＳＥＮＤＲＬＲＬＬＬＫＱＭＣ、配列番号１２）を含むＣＰＰ；（ＫＦＦ）_３Ｋペプチド（例えば、ＫＦＦＫＦＦＫＦＦＫ、配列番号７５）を含むＣＰＰ；ＭＡＰペプチド（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、配列番号７６）を含むＣＰＰ；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号７７）を含むＣＰＰ；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号７８）を含むＣＰＰ。本明細書中で適切な他の両親媒性ＣＰＰとしては、プロリンリッチＣＰＰ、例えば、ＶＨＬＰＰＰ（配列番号７９）またはＶＲＬＰＰＰ（配列番号８０）の少なくとも３、４、５、６、７または８リピートを含むものが挙げられる。

【0163】

他の例としては、本明細書中のＣＰＰは、ＭＰＧペプチド（例えば、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ、配列番号８１）；Ｐｅｐ−１ペプチド（例えば、ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号８２）；またはヒトカルシトニンタンパク質由来のＣＰＰ、例えば、ｈＣＴペプチド（例えば、ＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰ、配列番号８３；ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫ、配列番号８４）を含み得る。本明細書中のＣＰＰのさらに他の例としては、Ｒｅｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４６４：１１１−１１６）に開示されるものが挙げられる。この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0164】

あるいは、本明細書中で適切なＣＰＰは、例えば、本明細書に開示されるＣＰＰアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み得る。そのような変異体ＣＰＰタンパク質は、ＣＰＰ活性、例えば、分子積み荷（例えば、１つ以上のＲＧＥＮタンパク質構成要素［例えば、Ｃａｓ９］を含むアミノ酸配列、またはＲＮＡ構成要素と結合した１つ以上のＲＧＥＮタンパク質構成要素［例えば、Ｃａｓ９］を含むアミノ酸配列）の細胞内への取り込みを媒介する能力を有するであろう。

【0165】

本明細書中のＣＰＰは、必要に応じ、修飾して、細胞外から細胞内へＲＧＥＮタンパク質積み荷をより一層効率的に運搬できるようにすることができる。例えば、Ｎ末端またはＣ末端に脂質基を有するように修飾することができる。本明細書中の適切な脂質基としては、ステアリル基、ミリスチル基などのアシル基が挙げられる。脂質基の他の例は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個の炭素原子を有するアシル基である。ペプチドを本明細書中で有用な脂質基で修飾する条件は、例えば、Ｒｅｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．４６４：１１１−１１６）およびＡｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ １８１８：９１５−９２４）に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0166】

本明細書中のＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとは、本明細書中のある態様では、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成している。例えば、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとは、融合して、単一のアミノ酸配列を形成することができる（すなわち、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとは、融合タンパク質内に含まれ得る）。したがって、本明細書中の共有結合の例は、ペプチド結合によるものであり、そこでは、ＲＧＥＮタンパク質構成要素のアミノ酸配列がＣＰＰのアミノ酸配列と、これらのアミノ酸配列の双方が単一のアミノ酸配列に含まれるように融合する。そのような融合タンパク質（または「キメラタンパク質」）は、本明細書中では、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体と見なすことができる。ＲＮＡ構成要素がＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合している実施形態では、そのような融合タンパク質はＲＧＥＮ−ＣＰＰ融合体と見なすことができる。

【0167】

１つ以上のＣＰＰは、例えば、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体のＮ末端またはＣ末端に位置させることができる。あるいは、１つ以上のＣＰＰは、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体のＮ末端およびＣ末端の双方に位置させることができる。あるいはさらに、１つ以上のＣＰＰは、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体のアミノ酸配列内に位置させることができる。複数のＣＰＰを含む本明細書中の実施形態は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のＣＰＰ、または５〜１０、５〜２０もしくは１０〜２０のＣＰＰを含み得る。ＲＧＥＮタンパク質構成要素に融合したＣＰＰは、同じであっても異なっていてもよい（例えば、２、３、４もしくはそれ以上の異なるタイプのＣＰＰ）。１つ以上のＣＰＰは、ＲＧＥＮタンパク質のアミノ酸配列に直接融合することができ、かつ／または、ＲＧＥＮタンパク質と融合している異種ドメイン（例えば、ＮＬＳ、または、ＭＴＳなどの他の細胞小器官ターゲティング配列）に融合することができる。

【0168】

本明細書中のＣＰＰおよびＲＧＥＮタンパク質構成要素間の融合は直接的であり得る（すなわち、ＣＰＰアミノ酸配列は、ＲＧＥＮアミノ酸配列にペプチド結合によって直接結合する）。あるいは、本明細書中のＣＰＰおよびＲＧＥＮタンパク質構成要素間の融合は、中間アミノ酸配列を介してあり得る（これは、ＣＰＰとＲＧＥＮタンパク質構成要素が間接的に結合している一例である）。中間アミノ酸配列の例としては、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００のアミノ酸残基、例えば、グリシン、セリン、アラニンおよび／またはプロリンを含む適切なリンカー配列が挙げられる。適切なアミノ酸リンカーは、例えば、米国特許第８８２８６９０号明細書、同第８５８０９２２号明細書、および同第５９９０２７５号明細書に開示されており、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。他の中間アミノ酸配列の例は、１つ以上の他のタイプのタンパク質および／またはドメインを含み得る。例えば、マーカータンパク質（例えば、本明細書中に開示されている任意のものなどの蛍光タンパク質）は、中間アミノ酸配列に含まれ得る。

【0169】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの共有結合性複合体、例えば、融合体タンパク質の形態のものを含む組成物は、本明細書中に開示される任意の細胞型で使用することができる。しかしながら、任意選択により、この組成物は、酵母、真菌および植物などの非哺乳類細胞で使用することができる。しかし、哺乳類細胞での使用は除く。

【0170】

本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質の例は、配列番号３９（ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合タンパク質）、４０（ＰｏｌｙＲ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合タンパク質）、４１（ＴＰ１０ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合タンパク質）、または４２（ｐＶＥＣ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合タンパク質）を含み得る。配列番号３９〜４２は、Ｃａｓ９−ＣＰＰ融合タンパク質の例である。ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合タンパク質の他の例は、配列番号３９〜４２のいずれかに、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む。そのような変異体融合タンパク質は、（ｉ）融合タンパク質の細胞内取り込み媒介することができるＣＰＰドメイン、および（ｉｉ）ＲＮＡ構成要素と結合している場合、ＤＮＡに対し、特異的結合活性を有し、かつ場合により、切断またはニッキング活性を有するＣａｓ９タンパク質を有するであろう。配列番号３９、４０、４１および４２はそれぞれ、ゼブラＣＰＰ（配列番号１２）、ＰｏｌｙＲ ＣＰＰ（配列番号１５）、ＴＰ１０ ＣＰＰ（配列番号１４）およびｐＶＥＣ ＣＰＰ（配列番号１３）を含み、場合により、Ｃａｓ９（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）−ＮＬＳタンパク質（配列番号３の残基２〜１３７９）に結合する。

【0171】

ある実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系のタンパク質構成要素はＣＰＰに結合することができ、ＣＰＰは、
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ、または
（ｖｉ）合成ノナ−アルギニンＣＰＰ、ヒスチジンリッチノナ−アルギニンＣＰＰおよびＰａｓノナ−アルギニンＣＰＰからなる群から選択されるＣＰＰ。

【0172】

合成ノナ−アルギニンＣＰＰ、ヒスチジンリッチノナ−アルギニンＣＰＰおよびＰａｓノナ−アルギニンＣＰＰの例は、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２）：７１−８８，ＨＩＫＡＲＩ Ｌｔｄ）に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0173】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰが共有結合し得る方法の他の例は、架橋（化学架橋）である。それ故、本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、少なくとも１つのＣＰＰに架橋したＲＧＥＮタンパク質を含み得る。本明細書中の架橋は、２以上の分子（この事例では、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰ）を共有結合によって化学的に結合するプロセスを指す。架橋はこの分野で知られた多くの方法、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１９０８１３号明細書、米国特許第８６４２７４４号明細書、およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）に開示された方法で行うことができる。これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0174】

通常、ＣＰＰは、ＣＰＰをＲＧＥＮタンパク質構成要素に架橋させるため、適切なタンパク質結合基を、そのＮ末端、Ｃ末端、および／またはアミノ酸側鎖基に含有するよう、修飾および／または合成することができる。「タンパク質結合基」は、ＲＧＥＮタンパク質構成要素のアクセス可能な側鎖官能基と、適切な条件（例えば、水性条件）下で、自然にまたは活性化後（例えば、光に）に直接反応して、ＣＰＰ−ＲＧＥＮタンパク質の共有結合を生成し得る基を指す。タンパク質結合基は、例えば、ＲＧＥＮタンパク質中のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＡｒｇアミノ酸残基の側鎖官能基と反応して、タンパク質に共有結合し得る。例えば、ホモ二官能性（例えば、アミンをアミンに結合することができる）またはヘテロ二官能性（例えば、アミンをチオールに結合することができる）のタンパク質結合基を使用することができる。ある実施形態では、ＣＰＰのタンパク質結合基はまた、ＲＧＥＮタンパク質の末端基（例えば、Ｎ末端）と反応することができる。本明細書中の適切なタンパク質結合基としては、アミノ反応性基（例えば、ＮＨＳエステルまたはイミドエステル）、チオール（スルフヒドリル）反応性基（例えば、ＢＭＯＥ、ＢＭＢまたはＢＭＨなどのマレイミド）、ヒドロキシル反応性基、イミダゾリル反応性基、またはグアニジニル反応性基が挙げられる。本明細書中で有用なさらなる代表的なタンパク質結合基、およびそれらの使用方法は、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）に記載されている。

【0175】

本明細書中のタンパク質結合基は、通常、長さが２０原子以下の骨格を有するＣＰＰとＲＧＥＮタンパク質との間で結合を形成することができる。例えば、そのような結合は、長さが１原子と２０原子との間、または約１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０炭素原子の間の結合であり得る。ある実施形態では、結合は、直鎖状、分岐状、環状または単一原子であってよい。ある事例では、リンカー骨格の１、２、３、４もしくは５、またはそれ以上の炭素原子が、硫黄、窒素子または酸素のヘテロ原子で置換されていてもよい。骨格原子間の結合は、飽和または不飽和であってよい（通常、リンカーの骨格に、１、２または３個を超える不飽和結合はない）。リンカーとしては、限定はされないが、オリゴ（エチレングリコール）、エーテル、チオエーテル、三級アミン、またはアルキル基が挙げられる。アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチル）。他のリンカー骨格の例としては、アリール基、ヘテロ環またはシクロアルキル基などの環状基（但し、環状基の２以上の原子（例えば、２、３または４原子）は骨格に含まれる）が挙げられ得る。

【0176】

ある実施形態では、２種以上のＣＰＰ（例えば、２、３、４またはそれ以上の異なる種類のＣＰＰ）を、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と架橋させることができる。架橋時、使用し得るＣＰＰ：ＲＧＥＮタンパク質の比（モル比）は、例えば、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１または５０：１であり得る。他の態様では、ＲＧＥＮタンパク質に架橋したＣＰＰの平均数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５、または少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０もしくは５〜２５であり得る。

【0177】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素および少なくとも１つのＣＰＰは、必要に応じて、さらに１つ以上の他のタンパク質／ペプチド／ドメインを含む複合体に架橋させることができる。そのような他の要素は、場合により、ＲＧＥＮタンパク質構成要素をＣＰＰと架橋させるために使用することができ、そしてそのような他の要素として、前述したような中間アミノ酸配列を上げることができる。

【0178】

本明細書中のある対応では、本明細書中のＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとは、非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成することができる。特定の理論や機構に縛られることを意図するものではないが、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの間の非共有結合的な結合が、静電気力、ファンデルワールス力および／または疎水性力によると考えられる。ＲＮＡ構成要素がＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合するそれらの実施形態では、そのような実施形態は、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の少なくとも１つのＣＰＰに非共有結合的に結合するＲＧＥＮを含むと見なされ得る。非共有結合的に結合するＲＧＥＮタンパク質構成要素およびＣＰＰを含む組成物は、場合により、これらの構成要素の混合物と見なされ得る。

【0179】

ある実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、少なくとも１つの、ＣＰＰアミノ酸配列のみからなるアミノ酸配列を有するＣＰＰと非共有結合的に結合する。そのようなＣＰＰは、いかなる「非ＣＰＰ」アミノ酸配列を有しないが、場合により、本明細書中に開示の脂質基などの修飾を含み得る。

【0180】

あるいは、ＲＧＥＮタンパク質構成要素に非共有結合的に結合するＣＰＰは、ＣＰＰアミノ酸と１つ以上の異種アミノ酸配列（非ＲＧＥＮタンパク質配列）を有する融合タンパク質に含まれ得る。そのような実施形態の異種配列はドメインまたはタンパク質（例えば、本明細書に開示されているものなどの蛍光タンパク質、または、Ｃａｓ融合体に関する上の開示の中で挙げられているドメイン／タンパク質の配列であり得る。他の例は、ＣＰＰに二量化ドメインを融合させている。その二量化ドメインはＲＧＥＮタンパク質構成要素に結合または融合した二量化ドメインに結合することができる。

【0181】

ロイシンジッパードメインは、本明細書の二量化ドメインの例である。ロイシンジッパードメインは、そのようなドメイン（例えば、転写因子）を含むと知られている天然タンパク質由来のものであり得、または合成的に設計することができる。ＣＰＰに結合したロイシンジッパードメインは、ＲＧＥＮタンパク質構成要素のロイシンジッパードメインと結合（「ジップ結合」）することによって、非共有結合的複合体としてＣＰＰとＲＧＥＮタンパク質構成要素を結合することができる。ＣＰＰとＲＧＥＮタンパク質構成要素を非共有結合的に結合する１対のロイシンジッパードメインは、同じであっても（そのようなドメイン対はホモ二量体化ロイシンジッパーを形成する）、異なっていてもよい（そのようなドメイン対はヘテロ二量体化ロイシンジッパーを形成する）。ロイシンジッパードメインはの例としては、米国特許出願公開第２００３／０１０８８６９号明細書および同第２００４／０１４７７２１号明細書に開示されたものが挙げられる。ある態様では、ホモ二量体化ロイシンジッパーは、ＧＣＮ４ 転写因子由来のロイシンジッパードメインにより形成することができ、他の態様では、それぞれｆｏｓおよびｊｕｎ転写因子由来のロイシンジッパードメインを用いてヘテロ二量体化ロイシンジッパーを形成することができる。

【0182】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの非共有結合的複合体は、必要に応じて、さらに、１つ以上の他のタンパク質／ペプチド／ドメインを含むことができる。そのような他の要素は、場合により、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとの架橋に使用することができ、そのような他の要素として、前に記載の中間アミノ酸配列を挙げることができる。

【0183】

ある実施形態では、２種以上のＣＰＰ（例えば、２、３、４またはそれ以上の異なる種類のＣＰＰ）を、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と非共有結合的に結合させることができる。そのような複合体の調製に使用し得るＣＰＰ：ＲＧＥＮタンパク質の比（モル比）は、例えば、少なくとも約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１または５０：１であり得る。他の態様では、ＲＧＥＮタンパク質に結合したＣＰＰの平均数は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５、または少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０もしくは５〜２５であり得る。

【0184】

ある実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの非共有結合的複合体は、（例えば、上に開示したＣＰＰとＲＧＥＮタンパク質との比が得られるなどの）適切な量の各構成要素を水性媒体中で混合することによって調製することができる。適切な水性媒体は、例えば、ＰＢＳなどの緩衝液、またはＤＭＥＭなどの血清フリーの培地を含み得る。混合物を、例えば、約４〜４５℃の温度で約３０、６０、９０または１２０分間インキュベートして、非共有結合的ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成することができる。この複合体を含む、適切な量（例えば、処理する細胞を十分に覆う／浸す最小量）のこの溶液を細胞の種類に適した方法で細胞に適用することができる。ＲＮＡ構成要素がＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合する実施形態では、そのようなＲＧＥＮの形成は、ＣＰＰをＲＧＥＮタンパク質構成要素と共にインキュベートする前、インキュベートと同時に、またはインキュベート後に、ＲＮＡ構成要素を加える工程を含むことができる。

【0185】

ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つのＣＰＰとの非共有結合的複合体を含む組成物は、本明細書中に開示される任意の細胞型で使用することができる。しかしながら、任意選択により、この組成物は、酵母、真菌および植物などの非哺乳類細胞で使用することができる。しかし、哺乳類細胞での使用は除く。

【0186】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞に適用する前に組成物中に含まれ得るため、たとえば、約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であり得る。そのような純度は、ある実施形態では、タンパク質基準であり得る。一例として、複合体の純度が少なくとも８０％であれば、これは、組成物中の全タンパク質の少なくとも８０％が複合体によって構成されることを意味する。あるいは、複合体の純度は、タンパク質基準の純度のみならず、他の生体分子（例えば、脂質、糖、および／または核酸）もまた考慮することができる。一例として、複合体の純度が少なくとも８０％であれば、これは、本明細書中の組成物における全生体分子の少なくとも８０％が複合体によって構成されることを意味する。ある実施形態では、炭水化物、塩および／または脂質などの化合物は、本明細書中、パーセント純度の決定に影響しない。純度に関するこれらの開示は全て、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体（すなわち、複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素がＲＮＡ構成要素に結合している）にも適用することができる。

【0187】

本明細書中の組成物は、水性であって、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体が溶解している溶媒の少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９ｗｔ％が水であることが好ましい。組成物中の複合体の濃度は、例えば、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０もしくは１０．０μＭ、または約０．５〜５．０μＭ、０．５〜２．５μＭ、１．０〜５．０μＭ、１．０〜２．５μＭもしくは２．５〜５．０μＭであり得る。そのような組成物が液体状態であり得ることは理解されよう。

【0188】

ある実施形態の組成物のｐＨは、約４．０〜約１０．０であり得る。あるいは、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０．０であり得る。ｐＨは適切なバッファの添加または導入によって調節または制御することができ、バッファとしては、限定はされないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩（例えば、ＰＢＳ）、トリス、トリス−ＨＣｌ、クエン酸、またはこれらの組み合わせが挙げられる。本明細書中の組成物のバッファ濃度は、例えば、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約１０、２０、もしくは５０ｍＭであり得る。ある態様では、ＨＥＰＥＳバッファ（例えば〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、例えば２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）が使用され得る。

【0189】

本明細書中の組成物は、任意選択により、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体に加えて、他の構成要素を含むことができる。例えば、ナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４）などの１種以上の塩を含むことができる。他の非限定的な塩の例としては、（ｉ）アルミニウム、アンモニウム、バリウム、カルシウム、クロム（ＩＩもしくはＩＩＩ）、銅（ＩもしくはＩＩ）、鉄（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水素、鉛（ＩＩ）、リチウム、マグネシウム、マンガン（ＩＩもしくはＩＩＩ）、水銀（ＩもしくはＩＩ）、カリウム、銀、ナトリウム、ストロンチウム、スズ（ＩＩもしくはＩＶ）、または亜鉛カチオン、および（ｉｉ）酢酸塩、ホウ酸塩、臭素酸塩、臭化物、炭酸塩、塩素酸塩、塩化物、亜塩素酸塩、クロム酸塩、重クロム酸塩、リン酸二水素塩、ヘキサシアノ鉄酸塩、フェロシアン化物、フッ化物、炭酸水素塩、リン酸水素塩、硫酸水素塩、硫化水素、亜硫酸水素塩、水素化物、水酸化物、次亜塩素酸塩、ヨード酸塩、ヨウ化物、硝酸塩、亜硝酸塩、シュウ酸塩、酸化物、過塩素酸塩、過マンガン酸塩、過酸化物、リン酸塩、リン化物、亜リン酸塩、ケイ酸塩、スズ酸塩、硫錫石、硫酸塩、硫化物、亜硫酸塩、酒石酸塩、またはチオシアン酸塩アニオンを含むものが挙げられる。したがって、例えば、上記（ｉ）のカチオンおよび上記（ｉｉ）のアニオンを有する任意の塩が本明細書中の組成物に含まれ得る。塩は、例えば、約０．０１〜約１０．００ｗｔ％（または、０．０１〜１０．００の間で１００分の１ずつ増加した任意の値）含まれ得る。

【0190】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる。ＲＧＥＮタンパク質構成要素がＲＮＡ構成要素と結合している（これによって、完全ＲＧＥＮを構築する）実施形態では、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体は同様に、この細胞膜／細胞壁横断能力を有する。ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体は、本明細書中のある態様においては、細胞壁および細胞膜を横断することができる。

【0191】

本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体は、場合により、グリコカリックス（被膜）を含む細胞壁を横断することができる。これらの実施形態は、典型的には、原核細胞（例えば、細菌）に関係しており、原核細胞の中には種および成長条件によってグリコカリックスを有するものがある。

【0192】

特定の理論や機構に縛られることを意図するものではないが、本明細書中のＣＰＰは、エンドサイトーシスプロセスを経てＲＧＥＮタンパク質構成要素を細胞内へ輸送すると考えられる。そのようなプロセスの例としては、マクロピノサイトーシス、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ／脂質ラフト媒介エンドサイトーシス、および／または得レセプター媒介エンドサイトーシス機構（例えば、スカベンジャーレセプター媒介取り込み、プロテオグリカン媒介取り込み）を挙げ得るであろう。

【0193】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体が細胞内に入ると、例えば、核膜またはミトコンドリア膜などのオルガネラ膜を横断することができる。この能力は、ある実施形態では、ＲＧＥＮタンパク質に付随する少なくとも１つのオルガネラを標的とする配列（例えば、ＮＬＳ、ＭＴＳ）の存在に依存する。さらに、他の実施形態では、核膜またはミトコンドリア膜などのオルガネラ膜を横断する能力は、オルガネラを標的とする配列の存在に依存しない（すなわち、そのような実施形態のＣＰＰは、ＲＧＥＮの核またはミトコンドリアなどの細胞小器官への横断に関与し得る）。

【0194】

本明細書中の細胞は、哺乳類細胞であっても、非哺乳類細胞であってもよい。ある好ましい実施形態では、後者が使用される。ある他の態様では、本明細書中の細胞は、（ｉ）インビボの生物／組織内、（ｉｉ）エクスビボの細胞組織もしくは細胞群内、または（ｉｉｉ）インビトロ状態に存在し得る。

【0195】

本明細書中の微生物細胞は、単離された状態（例えば、インビトロ細胞、培養細胞）、または単離されていない状態で存在し得る。

【0196】

ある実施形態の微生物細胞は酵母細胞のような真菌細胞である。本明細書中のある実施形態の酵母は、無性生殖で増殖する（アナモルフィック）ものであっても、有性生殖で増殖する（テレオモルフィック）ものであってもよい。本明細書中の酵母は、典型的には、単細胞の形態で存在し、これらの酵母のある型は、場合により、仮性菌糸（出芽細胞が連結した糸）を形成することができる。さらに他の態様では、酵母は１媒体もしくは２媒体であり得、かつ／またはこれらの倍数性のいずれの形態でも存在する能力を有し得る。

【0197】

本明細書中の酵母の例としては、従来型酵母および非従来型酵母が挙げられる。ある実施形態の従来型酵母は、相同組み換え（ＨＲ）ＤＮＡ修復プロセスを非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介される修復プロセスより好む酵母である。本明細書中の従来型酵母の例としては、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、出芽酵母、パン酵母、および／または醸造酵母としても知られるサッカロミケス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；サッカロミケス・ボウルアルディ（Ｓ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）；サッカロミケス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）；サッカロミケス・カリオカヌス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃａｎｕｓ）；サッカロミケス・カリオクス（Ｓ．ｃａｒｉｏｃｕｓ）；サッカロミケス・ケバリエリ（Ｓ．ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）；サッカロミケス・ダイレネンシス（Ｓ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）；サッカロミケス・エリプソイデウス（Ｓ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）；サッカロミケス・エウバヤヌス（Ｓ．ｅｕｂａｙａｎｕｓ）；サッカロミケス・エクシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）；サッカロミケス・フロレンティヌス）；サッカロミケス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）；サッカロミケス・マルチニアエ（Ｓ．ｍａｒｔｉｎｉａｅ）；サッカロミケス・モナケンシス（Ｓ．ｍｏｎａｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミケス・ノルベンシス（Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）；サッカロミケス・パラドクスス（Ｓ．Ｐａｒａｄｏｘｕｓ）；サッカロミケス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）；サッカロミケス・スペンケロルム（Ｓ．ｓｐｅｎｃｅｒｏｒｕｍ）；サッカロミケス・トゥリケンシス（Ｓ．ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）；サッカロミケス・ウニスポルス（Ｓ．ｕｎｉｓｐｏｒｕｓ）；サッカロミケス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）；サッカロミケス・ゾナツス（Ｓ．ｚｏｎａｔｕｓ）およびシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種（例えば、分裂酵母としても知られるシゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；シゾサッカロミケス・クリオフィルス（Ｓ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）；シゾサッカロミケス・ヤポニクス（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；シゾサッカロミケス・オクトスポルス（Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ））が挙げられる。

【0198】

本明細書中の非従来型酵母は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））またはシゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、シゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））などの従来型酵母ではない。ある実施形態における従来型酵母は、ＨＲによって媒介される修復プロセスよりもＮＨＥＪ ＤＮＡ修復プロセスを好む酵母であり得る。サッカロミケス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびシゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）などの従来型酵母は、通常、短フランキング相同アーム（３０〜５０ｂｐ）を有するドナーＤＮＡの特異的な組み込みを示すが、効率はルーチン的に７０％を超える。一方、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）などの非従来型酵母は、通常、類似した構造のドナーＤＮＡによる特異的組み込みを示すが、効率は１％未満である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ５７９５２）。したがって、ＨＲプロセスの優先度は、例えば、酵母を適切なドナーＤＮＡで形質転換して、ドナーＤＮＡによって標的とされると予測されるゲノム部位と特異的に組み換えられる程度を判定することによって、測定され得る。例えば、そのようなアッセイにより、酵母ゲノムにおけるドナーＤＮＡのランダムな組み込みの高い程度が得られるならば、ＮＨＥＪの優先度（すなわちＨＲの低い優先度）は顕在化するであろう。酵母におけるＤＮＡの特異的な（ＨＲ媒介）、かつ／またはランダムな（ＮＨＥＪ媒介）組み込み率を判定するためのアッセイが、当該技術分野において知られている（例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１８：２２４９−２２５４；Ｃｏｒｒｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ６９６２８；Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６３５４−６３５８；Ｋｅｅｎｅｙ ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３６：８４９−８５６）。

【0199】

低いレベルのＨＲ活性を考えると、本明細書中の非従来型酵母は、（ｉ）３０〜５０ｂｐのフランキング相同アームを有する適切なドナーＤＮＡによる、例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、もしくは８％未満の特異的なターゲティング率を示し得、かつ／または（ｉｉ）前述のドナーＤＮＡの、例えば、約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、もしくは７５％超のランダムな組み込み率を示し得る。適切なドナーＤＮＡのこれらの（ｉ）特異的なターゲティング率、および／または（ｉｉ）ランダムな組み込み率は、本明細書中に開示されるＲＧＥＮが提供されるよりも前から存在するため、非従来型酵母を特徴付けることができる。ある実施形態において、ＲＧＥＮを非従来型酵母に提供する目的は、酵母を特定の部位でのＨＲに偏らせるための部位特異的ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることである。したがって、本明細書中で適切なＲＧＥＮを含む非従来型酵母は、通常、特定のドナーＤＮＡとのＨＲ率の増大を示すであろう。そのような率の増大は、適切なコントロール（例えば、適切なＲＧＥＮを欠く以外は同じドナーＤＮＡで形質転換した同じ非従来型酵母）のＨＲ率よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高くなり得る。

【0200】

本明細書中で非従来型酵母は、例えばＮｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）、Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｈａｂｉｔａｔｓ（Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９７）、および／またはＹｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｔ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｇ．Ｋｕｎｚｅ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００９）（これらの文献は全て、参照によって本明細書に組み込まれる）に記載される、当該技術分野において知られるあらゆる手段にしたがって培養することができる。

【0201】

本明細書中の非従来型酵母の非限定的な例としては、以下の属の酵母が挙げられる：ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シュワニオミケス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、チゴサッカロミケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、スポロボロミケス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属種の適切な例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属種の適切な例としては、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）、およびピキア・アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオミケス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例としては、シュワニオミケス・カステリィ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、シュワニオミケス・アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シュワニオミケス・ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、シュワニオミケス・オキシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、シュワニオミケス・カプリオッティ（Ｓ．ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、シュワニオミケス・エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、シュワニオミケス・ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミケス・プセウドポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、シュワニオミケス・バンリジエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）、およびシュワニオミケス・ヤマダエ（Ｓ．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロミケス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例としては、クルイベロミケス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミケス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロミケス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミケス・ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、クルイベロミケス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、クルイベロミケス・ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、クルイベロミケス・バヌデニィ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、クルイベロミケス・ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、クルイベロミケス・アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、およびクルイベロミケス・ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ（Ａｒｘｕｌａ）属種の適切な例としては、アルクスラ・アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）およびアルクスラ・テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属種の適切な例としては、トリコスポロン・クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、トリコスポロン・キャピタトゥム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、トリコスポロン・インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）、およびトリコスポロン・ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属種の適切な例としては、カンディダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンディダ・アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・アムフィキシエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、カンディダ・アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、カンディダ・アピコーラ（Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ）、カンディダ・アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、カンディダ・アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ）、カンディダ・アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、カンディダ・ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、カンディダ・ブロメリアセアルム（Ｃ．ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、カンディダ・カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、カンディダ・セラムビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、カンディダ・チャウリオデス（Ｃ．ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、カンディダ・コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、カンディダ・ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、カンディダ・デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンディダ・エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、カンディダ・フルクトゥス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、カンディダ・グラブラタ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンディダ・フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、カンディダ・ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンディダ・ハエムロニィ（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、カンディダ・インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、カンディダ・インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、カンディダ・インテルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、カンディダ・イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、カンディダ・ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、カンディダ・ケロセニエ（Ｃ．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、カンディダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンディダ・ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンディダ・リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、カンディダ・マリーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、カンディダ・メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、カンディダ・ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、カンディダ・モギィ（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、カンディダ・オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、カンディダ・オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、カンディダ・パラシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンディダ・クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、カンディダ・ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、カンディダ・サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）、カンディダ・シャハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、カンディダ・テムノキラエ（Ｃ．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、カンディダ・テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、カンディダ・テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、カンディダ・トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンディダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンディダ・ツチヤエ（Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、カンディダ・シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、カンディダ・ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、カンディダ・サブハシィ（Ｃ．ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、カンディダ・ビスワナシィ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、カンディダ・ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、カンディダ・ウバトゥベンシス（Ｃ．ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）、およびカンディダ・ゼプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属種の適切な例としては、ウスティラゴ・アヴェナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、ウスティラゴ・エスクレンタ（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ウスティラゴ・ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、ウスティラゴ・マイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）、ウスティラゴ・ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）、およびウスティラゴ・トリティク（Ｕ．ｔｒｉｔｉｃ）が挙げられる。トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属種の適切な例としては、トルロプシス・ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、トルロプシス・アジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、トルロプシス・グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）、およびトルロプシス・カンディダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。
チゴサッカロミケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例としては、チゴサッカロミケス・バイリィ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロミケス・ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、チゴサッカロミケス・シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、チゴサッカロミケス・フェルメンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、チゴサッカロミケス・フロレンティヌス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、チゴサッカロミケス・コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、チゴサッカロミケス・レントゥス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、チゴサッカロミケス・メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、チゴサッカロミケス・ミクロエリプソイデス（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、チゴサッカロミケス・ムラキィ（Ｚ．ｍｒａｋｉｉ）、チゴサッカロミケス・プセウドルーキシィ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、およびチゴサッカロミケス・ルーキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）属種の適切な例としては、トリゴノプシス・バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属種の適切な例としては、クリプトコッカス・ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、クリプトコッカス・ユニグトゥラトゥス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、クリプトコッカス・アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・アエリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、クリプトコッカス・アルビドシミリス（Ｃ．ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、クリプトコッカス・アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、クリプトコッカス・ブータネンシス（Ｃ．ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、クリプトコッカス・コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、クリプトコッカス・カルバトゥス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、クリプトコッカス・フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、クリプトコッカス・スキンネリ（Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、クリプトコッカス・テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、およびクリプトコッカス・ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種の適切な例としては、ロドトルラ・アケニオルム（Ｒ．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、ロドトルラ・アクタ（Ｒ．ａｃｕｔａ）、ロドトルラ・アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ロドトルラ・アラウカリエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、ロドトルラ・アークティカ（Ｒ．ａｒｃｔｉｃａ）、ロドトルラ・アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、ロドトルラ・アウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・アウリクラリエ（Ｒ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、ロドトルラ・バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、ロドトルラ・ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、ロドトルラ・ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ブロンキアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、ロドトルラ・カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、ロドトルラ・チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・クラディエンシス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、ロドトルラ・クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・クロセア（Ｒ．ｃｒｏｃｅａ）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、ロドトルラ・ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ディフルエンス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、ロドトルラ・フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、ロドトルラ・フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉａ）、ロドトルラ・フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・フトロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、ロドトルラ・グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ロドトルラ・グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、ロドトルラ・グリンベルグシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、ロドトルラ・ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、ロドトルラ・ヒストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・インカルナタ（Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、ロドトルラ・インゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、ロドトルラ・ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃａ）、ロドトルラ・コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、ロドトルラ・ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、ロドトルラ・ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、ロドトルラ・リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）、ロドトルラ・ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、ロドトルラ・ルドウィギィ（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、ロドトルラ・リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、ロドトルラ・マルチニエ−フラガンティス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ−ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、ロドトルラ・マトリテンシス（Ｒ．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、ロドトルラ・ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、ロドトルラ・オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、ロドトルラ・パシフィカ（Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、ロドトルラ・パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、ロドトルラ・ペネウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、ロドトルラ・フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、ロドトルラ・フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、ロドトルラ・ピラティ（Ｒ．ｐｉｌａｔｉｉ）、ロドトルラ・ピリマネ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、ロドトルラ・ピニコラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・ピリカタ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ、）、ロドトルラ・ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ロドトルラ・サイクロフェノリカ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、ロドトルラ・サイクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、ロドトルラ・レティノフィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、ロドトルラ・ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）、ロドトルラ・ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、ロドトルラ・ルベファシエンス（Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロドトルラ・ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、ロドトルラ・ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、ロドトルラ・ルフラ（Ｒ．ｒｕｆｕｌａ）、ロドトルラ・ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、ロドトルラ・サングイネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、ロドトルラ・サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、ロドトルラ・サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、ロドトルラ・シルベストリス（Ｒ．ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ロドトルラ・シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロドトルラ・シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・スルーフィエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、ロドトルラ・ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、ロドトルラ・ストラミネア（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、ロドトルラ・スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、ロドトルラ・スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、ロドトルラ・タイワネンシス（Ｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、ロドトルラ・テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、ロドトルラ・テッレア（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、ロドトルラ・テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ウルザメ（Ｒ．ｕｌｚａｍａｅ）、ロドトルラ・バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、ロドトルラ・ブイレミニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）、ロドトルラ・ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、およびロドトルラ・ゾルティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属種の適切な例としては、ファフィア・ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。
スポロボロミケス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）属種の適切な例としては、スポロボロミケス・アルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、スポロボロミケス・バナエンシス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、スポロボロミケス・ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、スポロボロミケス・ビスフォフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、スポロボロミケス・クラバトゥス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、スポロボロミケス・コプロスメ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、スポロボロミケス・コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、スポロボロミケス・コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、スポロボロミケス・ディメネ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、スポロボロミケス・ドラコフィリィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、スポロボロミケス・エロンガトゥス（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、スポロボロミケス・グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、スポロボロミケス・イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、スポロボロミケス・ジョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポロボロミケス・コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａｅ）、スポロボロミケス・マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、スポロボロミケス・ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、スポロボロミケス・オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、スポロボロミケス・パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、スポロボロミケス・プロダクトゥス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、スポロボロミケス・ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、スポロボロミケス・サシコーラ（Ｓ．ｓａｓｉｃｏｌａ）、スポロボロミケス・シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、スポロボロミケス・シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、スポロボロミケス・スブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、スポロボロミケス・シンメトリカス（Ｓ．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、スポロボロミケス・シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、スポロボロミケス・タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、スポロボロミケス・ツガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、スポロボロミケス・キサンツス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、およびスポロボロミケス・ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属種およびモニリエラ（Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａ）属種の適切な例としてはそれぞれ、パキソレン・タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）およびモニリエラ・ポリニス（Ｍ．ｐｏｌｌｉｎｉｓ）が挙げられる。本明細書中の非従来型酵母のさらに他の例としては、プセウドジーマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属種（例えば、プセウドジーマ・アンタルクティカ（Ｐ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ））、トドトルラ（Ｔｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属種（例えば、トドトルラ・ボゴリエンシス（Ｔ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ））、ヴィッケルハミエラ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ）属種（例えば、ヴィッケルハミエラ・ドメルクキアエ（Ｗ．ｄｏｍｅｒｃｑｉａｅ））、およびスタルメレラ（Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ）属種（例えば、ボムビコラスタルメレラ・ボムビコラ（Ｓ．ｂｏｍｂｉｃｏｌａ））が挙げられる。

【0202】

ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、本明細書中に開示されるある実施形態において、好ましい。適切なヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の例としては、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な、以下の単離物が挙げられる：株名称ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃８８６２、＃８６６１、＃８６６２、＃９７７３、＃１５５８６、＃１６６１７、＃１６６１８、＃１８９４２、＃１８９４３、＃１８９４４、＃１８９４５、＃２０１１４、＃２０１７７、＃２０１８２、＃２０２２５、＃２０２２６、＃２０２２８、＃２０３２７、＃２０２５５、＃２０２８７、＃２０２９７、＃２０３１５、＃２０３２０、＃２０３２４、＃２０３３６、＃２０３４１、＃２０３４６、＃２０３４８、＃２０３６３、＃２０３６４、＃２０３７２、＃２０３７３、＃２０３８３、＃２０３９０、＃２０４００、＃２０４６０、＃２０４６１、＃２０４６２、＃２０４９６、＃２０５１０、＃２０６２８、＃２０６８８、＃２０７７４、＃２０７７５、＃２０７７６、＃２０７７７、＃２０７７８、＃２０７７９、＃２０７８０、＃２０７８１、＃２０７９４、＃２０７９５、＃２０８７５、＃２０２４１、＃２０４２２、＃２０４２３、＃３２３３８、＃３２３３９、＃３２３４０、＃３２３４１、＃３４３４２、＃３２３４３、＃３２９３５、＃３４０１７、＃３４０１８、＃３４０８８、＃３４９２２、＃３４９２２、＃３８２９５、＃４２２８１、＃４４６０１、＃４６０２５、＃４６０２６、＃４６０２７、＃４６０２８、＃４６０６７、＃４６０６８、＃４６０６９、＃４６０７０、＃４６３３０、＃４６４８２、＃４６４８３、＃４６４８４、＃４６４３６、＃６０５９４、＃６２３８５、＃６４０４２、＃７４２３４、＃７６５９８、＃７６８６１、＃７６８６２、＃７６９８２、＃９０７１６、＃９０８１１、＃９０８１２、＃９０８１３、＃９０８１４、＃９０９０３、＃９０９０４、＃９０９０５、＃９６０２８、＃２０１２４１、＃２０１２４２、＃２０１２４３、＃２０１２４４、＃２０１２４５、＃２０１２４６、＃２０１２４７、＃２０１２４９、および／または＃２０１８４７。

【0203】

本明細書中の真菌細胞は、酵母（例えば、上記されるような）、または、糸状菌などの他の真菌型の細胞であり得る。例えば、本明細書中の真菌は、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ツボカビ菌（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）があり得る。本明細書中の糸状菌の例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属（例えば、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ネウロスポラ・シトフィラ（Ｎ．ｓｉｔｏｐｈｉｌａ）属、クリオネクトリア（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）属（例えば、クリオネクトリア・パラシチカ（Ｃ．ｐａｒａｓｉｔｉｃａ））、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属（例えば、アウレオバシジウム・プルランス（Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）属、ピロミケス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクレモモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）属、スキタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）属、スキゾフィルム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属（例えば、ペニシリウム・ビライアエ（Ｐ．ｂｉｌａｉａｅ）、ペニシリウム・カメムベルチ（Ｐ．ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディヅム（Ｐ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・エクスパンスム（Ｐ．ｅｘｐａｎｓｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐ．ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ）、ペニシリウム・マルネフェイ（Ｐ．ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・ベルコスム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、ペニシリウム・ヴリジカツム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ））、ギベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属（例えば、ギベレラ・アクミナタ（Ｇ．ａｃｕｍｉｎａｔａ）、ギベレラ・アベナケア（Ｇ．ａｖｅｎａｃｅａ）、ギベレラ・バカタ（Ｇ．ｂａｃｃａｔａ）、ギベレラ・キルキナタ（Ｇ．ｃｉｒｃｉｎａｔａ）、ギベレラ・キアノゲナ（Ｇ．ｃｙａｎｏｇｅｎａ）、ギベレラ・フジクロイ（Ｇ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ギベレラ・イントリカンス（Ｇ．ｉｎｔｒｉｃａｎｓ）、ギベレラ・プリカリス（Ｇ．ｐｕｌｉｃａｒｉｓ）、ギベレラ・スティボイデス（Ｇ．ｓｔｉｌｂｏｉｄｅｓ）、ギベレラ・トリキンクタ（Ｇ．ｔｒｉｃｉｎｃｔａ）、ギベレラ・ゼアエ（Ｇ．ｚｅａｅ））、ミケリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属（例えば、ムコール・ロウキシイ（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ，）、ムコール・キルキネロイデス（Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、アスペルギルス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）アスペルギルス・フラヴス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・レンツルス（Ａ．ｌｅｎｔｕｌｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ））、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属（例えば、フサリウム・グラミネアルム（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ブディゲヌム（Ｆ．ｂｕｂｉｇｅｎｕｍ）、フサリウム・ソラニ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ベルチキルリオイデス（Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・プロリフェラツム（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、およびフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ならびに、そのアナモルフおよびテレモルフのものが挙げられる。本明細書中の真菌の属および種は、必要なら、Ｂａｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ（Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａ ｏｆ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｕｎｇｉ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９７２）に開示される形態学によって定義することができる。ある実施形態では、真菌は、場合によって、植物または動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体と見なされ得る。

【0204】

本明細書中のある態様におけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種としては、トリコデルマ・アグレッシバム（Ｔ．ａｇｇｒｅｓｓｉｖｕｍ）、トリコデルマ・アマゾニクム（Ｔ．ａｍａｚｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・アスペレルム（Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウレオビリデ（Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・アウストロコニンギィ（Ｔ．ａｕｓｔｒｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ブレビコンパクトゥム（Ｔ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、トリコデルマ・カンディドゥム（Ｔ．ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トリコデルマ・カリッベウム（Ｔ．ｃａｒｉｂｂａｅｕｍ）、トリコデルマ・カトプトロン（Ｔ．ｃａｔｏｐｔｒｏｎ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・セラミクム（Ｔ．ｃｅｒａｍｉｃｕｍ）、トリコデルマ・セリヌム（Ｔ．ｃｅｒｉｎｕｍ）、トリコデルマ・クロロスポルム（Ｔ．ｃｈｌｏｒｏｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・クロロスペルマム（Ｔ．ｃｈｒｏｍｏｓｐｅｒｍｕｍ）、トリコデルマ・シナモメウム（Ｔ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｍ）、トリコデルマ・シトリノビリデ（Ｔ．ｃｉｔｒｉｎｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・クラッスム（Ｔ．ｃｒａｓｓｕｍ）、トリコデルマ・クレメウム（Ｔ．ｃｒｅｍｅｕｍ）、トリコデルマ・ジングレエアエ（Ｔ．ｄｉｎｇｌｅｙｅａｅ）、トリコデルマ・ドロテアエ（Ｔ．ｄｏｒｏｔｈｅａｅ）、トリコデルマ・エフスム（Ｔ．ｅｆｆｕｓｕｍ）、トリコデルマ・エリナセウム（Ｔ．ｅｒｉｎａｃｅｕｍ）、トリコデルマ・エストニクム（Ｔ．ｅｓｔｏｎｉｃｕｍ）、トリコデルマ・フェルティル（Ｔ．ｆｅｒｔｉｌｅ）、トリコデルマ・ゲラティノサス（Ｔ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ）、トリコデルマ・グハネンセ（Ｔ．ｇｈａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・ハマトゥム（Ｔ．ｈａｍａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・ヘリクム（Ｔ．ｈｅｌｉｃｕｍ）、トリコデルマ・イントリカトゥム（Ｔ．ｉｎｔｒｉｃａｔｕｍ）、トリコデルマ・コニラングブラ（Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、トリコデルマ・コニンギィ（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・コニンギオプシス（Ｔ．ｋｏｎｉｎｇｉｏｐｓｉｓ）、トリコデルマ・ロンギブラチアトゥム（Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ロンギピレ（Ｔ．ｌｏｎｇｉｐｉｌｅ）、トリコデルマ・ミヌティスポルム（Ｔ．ｍｉｎｕｔｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オブロギスポルム（Ｔ．ｏｂｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・オバリスポルム（Ｔ．ｏｖａｌｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・ペテルセニィ（Ｔ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、トリコデルマ・フィロスタヒディス（Ｔ．ｐｈｙｌｌｏｓｔａｈｙｄｉｓ）、トリコデルマ・ピルリフェルム（Ｔ．ｐｉｌｕｌｉｆｅｒｕｍ）、トリコデルマ・プレウロティコラ（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・プレウロトゥム（Ｔ．ｐｌｅｕｒｏｔｕｍ）、トリコデルマ・ポリスポルム（Ｔ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・プセウドコニンギィ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・プベスセンス（Ｔ．ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロゲルソニィ（Ｔ．ｒｏｇｅｒｓｏｎｉｉ）、トリコデルマ・ロシクム（Ｔ．ｒｏｓｓｉｃｕｍ）、トリコデルマ・サトゥルニスポルム（Ｔ．ｓａｔｕｒｎｉｓｐｏｒｕｍ）、トリコデルマ・シネンシス（Ｔ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、トリコデルマ・シヌオスム（Ｔ．ｓｉｎｕｏｓｕｍ）、トリコデルマ・スピラレ（Ｔ．ｓｐｉｒａｌｅ）、トリコデルマ・ストラミネウム（Ｔ．ｓｔｒａｍｉｎｅｕｍ）、トリコデルマ・ストリゴスム（Ｔ．ｓｔｒｉｇｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ストロマティクム（Ｔ．ｓｔｒｏｍａｔｉｃｕｍ）、トリコデルマ・スロトゥンドゥム（Ｔ．ｓｕｒｒｏｔｕｎｄｕｍ）、トリコデルマ・タイワネンセ（Ｔ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、トリコデルマ・タイランディクム（Ｔ．ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｍ）、トリコデルマ・テレフォリコルム（Ｔ．ｔｈｅｌｅｐｈｏｒｉｃｏｌｕｍ）、トリコデルマ・セオブロミコラ（Ｔ．ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ・トメントスム（Ｔ．ｔｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）、トリコデルマ・ベルティヌム（Ｔ．ｖｅｌｕｔｉｎｕｍ）、トリコデルマ・ビレンス（Ｔ．ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）、およびトリコデルマ・ビリデスセンス（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎｓ）が挙げられる。本明細書中でトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種は、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐ．Ｋ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＣＡＢＩ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ，２０１３）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得る。

【0205】

ある実施形態における微生物細胞は、藻類細胞である。例えば、藻類細胞は、以下のいずれに由来してもよい：緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門（緑藻類）、紅藻植物（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）門（紅藻類）、褐藻植物（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）綱（褐藻類）、珪藻植物（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃａｅａｅ）綱（珪藻類）、および渦鞭毛虫（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔａ）門（渦鞭毛虫類）。藻類細胞は、他の態様において、微細藻類（例えば、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類）の細胞であっても大型藻類（ケルプ、海草）の細胞であってもよい。さらなる例として、本明細書中で藻類細胞は、アマノリ（Ｐｏｒｐｈｙｒａ）属（アサクサノリ）、ダルス（Ｐａｌｍａｒｉａ）属種、例えばダルス（Ｐ．ｐａｌｍａｔａ）、アルトロスピラ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ）属種、例えばスピルリナ（Ａ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（例えばクロレラ（Ｃ．ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ））、ツノマタ（Ｃｈｏｎｄｒｕｓ）属種、例えばトチャカ（Ｃ．ｃｒｉｓｐｕｓ）、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ホンダワラ（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ）属、コチャユヨ（Ｃｏｃｈａｙｕｙｏ）属、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばボツリオコッカス・ブラウニィ（Ｂ．ｂｒａｕｎｉｉ））、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（例えばドナリエラ・テルティオレクタ（Ｄ．ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ））、グラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属（例えばプレウロクリシス・カルテレ（Ｐ．ｃａｒｔｅｒａｅ））、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチルム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（例えばフェオダクチルム・トリコルヌトゥム（Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ））、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スティココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属（例えばテトラセルミス・スエシカ（Ｔ．ｓｕｅｃｉｃａ））、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属（例えばタラシオシラ・プセウドナナ（Ｔ．ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ））、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属（例えばクリプテコディニウム・コーニィ（Ｃ．ｃｏｈｎｉｉ））、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属（例えばネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎ．ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ））、またはシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のものであってよい。本明細書中で藻類種は、例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（Ａｌｇａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＯＬＳＳ），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １、ｅｏｌｓｓ．ｎｅｔ／ｓａｍｐｌｅ−ｃｈａｐｔｅｒｓインターネットサイトにて入手可能）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得る。

【0206】

一実施形態において、本方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法であって、微生物細胞を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程を含み、前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより微生物細胞に侵入する方法を含む。本明細書中に記載される方法および組成物に有用な微生物細胞は、フィトフトーラ・カプシキ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）などのフィトフトーラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ）属種（Ｌａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｔｈｅ ｏｏｍｙｃｅｔｅ ｂｒｏａｄ−ｈｏｓｔ−ｒａｎｇｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．Ｍａｙ１３（４）：３２９−３３７）、セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）などのジーモセプトリア（Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ）属種（Ｔｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ．Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．Ｊｕｎ．７９：１３−１６）、およびボトゥリチス・キネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）などのボトゥリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）属種（Ｈａｈｎ Ｍ．２０１４．Ｔｈｅ ｒｉｓｉｎｇ ｔｈｒｅａｔ ｏｆ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ：Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｓ ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ ７：１３３−１４１）から選択される細胞が挙げられる。

【0207】

本明細書中の原生生物細胞は、例えば、繊毛虫（Ｃｉｌｉａｔａ）綱（例えば、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）属、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）属、コルピディウム（Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ）属、コルポダ（Ｃｏｌｐｏｄａ）属、グラウコマ（Ｇｌａｕｃｏｍａ）属、プラティオフリア（Ｐｌａｔｙｏｐｈｒｙａ）属、ボルチセラ（Ｖｏｒｔｉｃｅｌｌａ）属、ポトマカス（Ｐｏｔｏｍａｃｕｓ）属、プセウドコニレンブス（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｈｎｉｌｅｍｂｕｓ）属、エウプロテス（Ｅｕｐｌｏｔｅｓ）属、エンゲルマニエラ（Ｅｎｇｅｌｍａｎｉｅｌｌａ）属、およびスチロニキア（Ｓｔｙｌｏｎｉｃｈｉａ）属、マスチゴフォラ（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）亜門（フラゲラーテ（ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ））、フィトマスチゴフォラ（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱（例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、アスタシア（Ａｓｔａｓｉａ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびクリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ））、鞭毛虫（Ｚｏｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）綱、リゾポーザ（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）上綱、ロボセア（Ｌｏｂｏｓｅａ）綱（例えば、アメーバ（Ａｍｏｅｂａ）属、ならびにエウミケトゾエア（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｚｏｅａ）綱（例えば、ディクティオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）属およびフィサルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ）属）から選択することができる。本明細書中のある原生生物種は、例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｇｕｉｄｅ：ｔｉｐｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｏｚｏａ ａｎｄ ａｌｇａｅ（２０１３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｎｅｔ ｓｉｔｅで入手可能）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるようにして培養および／または操作することができる。ある実施形態では、原生生物は、場合によって、植物または動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体と見なされ得る。

【0208】

ある実施形態の細菌細胞は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどの形態のものであり得る。細菌の他の非限定的な例としては、グラム陰性菌およびグラム陽性菌が挙げられる。細菌のさらに他の非限定的な例としては、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属（例えば、サルモネラ・ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテティジス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属（例えば、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ））、エケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エドワードシエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、エウインゲラ（Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ）属、クライベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ）属、モルガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストマトコッカス（Ｓｔｏｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ））、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属（例えば、ビブリオ・コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、プレシオモナス（Ｐｌｅｓｓｉｏｍｏｎａｓ）属、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属（例えば、マイコプラズマ・ニューモニア（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属、コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）属、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）属、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））、アエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ゲメラ（Ｇｅｍｅｌｌａ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）（例えば、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、ペディコッカス（Ｐｅｄｉｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、バチルス・セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、コリネバクテリウム・ジフテリアエ（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、アルカノバクテリウム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクチノミケス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属（例えば、リステリア・モノシトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、エリシペロリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ガードネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属（例えば、ナイセリア・メニングギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノルホエアエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロバクター（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ）属、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）属（例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アキネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、アグロバクテリウム・ツメファキエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、クリセオモナス（Ｃｈｒｙｓｅｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、フラビモナス（Ｆｌａｖｉｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）属、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）属、プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、プセウドモナス・アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、ウエークセラ（Ｗｅｅｋｓｅｌｌａ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）属、フランシエセラ（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、アフピア（Ａｆｉｐｉａ）属、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カルディオバクテリウム（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、サルキニア（Ｓａｒｃｉｎｉａ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、ラクトバチルス・ラクチス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ））、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ペルフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ビロフィリア（Ｂｉｌｏｐｈｉｌａ）、レプトトリキア（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）属、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メガスフェラ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ）属、ヴェイロネラ（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）属、ノルカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）属、アクチノマドゥラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属、ノルカルディオプシス（Ｎｏｒｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）属、ストレプトミケス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ミクロポリスポラス（Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｓ）属、テルモアクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム・ボヴィス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、ミコバクテリウム・レプラエ（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、トレポネマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属（例えば、ボレリア・ブルグドｒフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびクラミジアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）属が挙げられる。細菌は、場合によって、植物または動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体と見なされ得る。ある実施形態では、細菌は、混合微生物集団（例えば、他の細菌を含有、または酵母および／もしくは他の細菌を含有）に含まれ得る。

【0209】

ある実施形態では、古細菌細胞は、ユリ古細菌門、クレン古細菌門、ナノ古細菌門、コル古細菌門、アイガー古細菌門、タウム古細菌門など、任意の古細菌門に由来するものであってよい。本明細書中の古細菌は、例えば、好極限性（例えば、殆どの生命にとって有害となる、物理的または地球化学的に過酷な条件で成長および／または増殖することができる）であってよい。好極限性古細菌の例としては、好熱性（例えば、４５〜１２２℃の温度で成長できる）、超好熱性（例えば、８０〜１２２℃の温度で成長できる）、好酸性（例えば、３以下のｐＨレベルで成長できる）、好アルカリ性（例えば、９以下のｐＨレベルで成長できる）および／または好塩性（例えば、高塩濃度［２０〜３０％ ＮａＣｌ］で成長できる）のものが挙げられる。古細菌種の例としては、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種（例えば、ハロバクテリウム・ウォルカニイ（Ｈ．ｖｏｌｃａｎｉｉ））、スルフォロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属種（例えば、スルフォロブス・ソルファタリクス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウス（Ｓ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ））、テルモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、テルモコッカス・アルカリフィルス（Ｔ．ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・セレール（Ｔ．ｃｅｌｅｒ）、テルモコッカス・キトノファグス（Ｔ．ｃｈｉｔｏｎｏｐｈａｇｕｓ）、テルモコッカス・ガンマトレランス（Ｔ．ｇａｍｍａｔｏｌｅｒａｎｓ）、テルモコッカス・ヒドロテルマリス（Ｔ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、テルモコッカス・コダカレンシス（Ｔ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、テルモコッカス・ペプトノフィルス（Ｔ．ｐｅｐｔｏｎｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモコッカス・プロフンドゥス（Ｔ．ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、テルモコッカス・ステッテリ（Ｔ．ｓｔｅｔｔｅｒｉ））、メタノカルドコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、メタノカルドコッカス・テルモリトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、メタノカルドコッカス・ヤナシイ（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ））、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属種（例えば、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）、メタノテルモバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、メタノテルモバクター・マルブルゲンシス（Ｍ．ａｒｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、メタノテルモバクター・テルマウトトロフィクス（Ｍ．ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ））、アーケオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属種（例えば、アーケオグロブス・フルギドゥス（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ））、ニトロソプミルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属種（例えば、ニトロソプミルス・マリティムス（Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ））、メタロスファエラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、メタロスファエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ））、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）属種、テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）属種、メタノブレビバクター（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ）属種（例えば、メタノブレビバクター・スミチイ（Ｍ．ｓｍｉｔｈｉｉ））、およびメタノスフェラ（Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ）属種（例えば、メタノスフェラ・スタットマナエ（Ｍ．ｓｔａｄｔｍａｎａｅ））が挙げられる。

【0210】

本明細書中の昆虫細胞の例としては、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）細胞などが挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞としては、例えば、Ｓｆ９およびＳｆ２１が挙げられる。イラクサギンウワバ（Ｔ．ｎｉ）子房細胞としては、例えば、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞（別名 ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）が挙げられる。カイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）細胞としては、例えば、Ｎ４が挙げられる。本明細書中のある昆虫細胞は、例えば、Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ（２０１０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｎｕａｌ ｐａｒｔ ｎｏ．２５−０１２７，ＭＡＮ０００００３０）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように培養され、かつ／または操作され得る。他の態様において、昆虫細胞は、ヨトウムシ、タマナヤガ、アメリカタバコガの幼虫、トウモロコシノミハムシ、トウモロコシアブラムシ、トウモロコシ根アブラムシ、ヨーロッパアワノメイガ、ヨトウガ、グラニュレートカットワーム、マメコガネ、モロコシマダラメイガ、トウモロコシゾウムシ、メラノータス・コムニス（ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ）、ツトガ、ソルガムミッジ、ソルガムウェブワーム（ｓｏｒｇｈｕｍ ｗｅｂｗｏｒｍ）、サザーンコーンビルバグ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｉｌｌｂｕｇ）、サザーンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）、サザーンコーンストークボーラー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、サザーンポテトワイアーワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｐｏｔａｔｏ ｗｉｒｅｗｏｒｍ）、ハダニ、ストークボーラー（ｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）、シュガーケーンビートル（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｅｅｔｌｅ）、タバコワイアワーム（ｔｏｂａｃｃｏ ｗｉｒｅｗｏｒｍ）、ホワイトグラブ（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ）、アブラムシ、ワタミゾウムシ、ボールワームコンプレックス（ｂｏｌｌｗｏｒｍ ｃｏｍｐｌｅｘ）、キャベッジルーパー（ｃａｂｂａｇｅ ｌｏｏｐｅｒ）、ターニシュドプラントバグ（ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）、アザミウマ、ナミハダニ、イエローストライプトアーミーワーム（ｙｅｌｌｏｗ ｓｔｒｉｐｅｄ ａｒｍｙｗｏｒｍ）、アルファルファタコゾウムシ、クローバーゾウムシ、クローバールートカーキュリオ（ｃｌｏｖｅｒ ｒｏｏｔ ｃｕｒｃｕｌｉｏ）、モロコシマダラメイガ、バッタ、ホソアワフキ、エンドウヒゲナガアブラムシ、ジャガイモヒメヨコバイ、ツトガ、ニセタマナヤガ、モロコシマダラメイガ、タバコアザミウマ、ハリガネムシ、穀類のハムシ、チンチバグ、イングリッシュグレインアフィド（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ）、ムギミドリアブラムシ、ヘシアンバエ、ビーンリーフビートル（ｂｅａｎ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）、シロイチモジヨトウ、ツチハンミョウ、グレープコラスピス（ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）、グリーンクローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）、インゲンテントウ、アオムシ類、ソイビーンステムボーラー（ｓｏｙｂｅａｎ ｓｔｅｍ ｂｏｒｅｒ）、スティングバグ（ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）、スリーコーナードアルファルファホッパー（ｔｈｒｅｅ−ｃｏｒｎｅｒｅｄ ａｌｆａｌｆａ ｈｏｐｐｅｒ）、ベルベットビーンケーターピラー（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）、バドワーム（Ｂｕｄｗｏｒｍ）、イラクサキンウワバ、カットワーム（Ｃｕｔｗｏｒｍ）、グリーンジューンビートル（ｇｒｅｅｎ ｊｕｎｅ ｂｅｅｔｌｅ）、モモアカアブラムシ、ホーンワーム（ｈｏｒｎｗｏｒｍ）、ポテトチューバーワーム（ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒｗｏｒｍ）、サザーンモールクリケット（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍｏｌｅ ｃｒｉｃｋｅｔ）、サックフライ（ｓｕｃｋｆｌｙ）、タバコフリービートル（ｔｏｂａｃｃｏ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）、ベジタブルウィービル（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｗｅｅｖｉｌ）またはホワイトフリンジドビートル（ｗｈｉｔｅｆｒｉｎｇｅｄ ｂｅｅｔｌｅ）などの植物の有害生物／病原体の細胞であり得る。あるいは、昆虫細胞は、動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体の細胞であり得る。

【0211】

線虫細胞は、例えば、以下の属のいずれか由来の線虫の細胞であり得る：
メロイドギネ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）（ネコブセンチュウ）、プラティレンチュス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）（リージョンネマトーダ（ｌｅｓｉｏｎ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）（シストセンチュウ）、グローボデラ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ）（シストセンチュウ）、ジチレンチュス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）（ステムアンドバルブネマトーダ（ｓｔｅｍ ａｎｄ ｂｕｌｂ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ティレンチュルス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）（シトラスネマトーダ（ｃｉｔｒｕｓ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、シピネーマ（Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ）（オオハリセンチュウ）、ラドフォルス（Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ）（ネモグリセンチュウ）、ロチレンチュルス（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ）（レニフォームネマトーダ（ｒｅｎｉｆｏｒｍ ｎｅｍａｔｏｄｅ））、ヘリコティレンチュス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）（スパイラルネマトーダ（ｓｐｉｒａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅ））またはベロノライムス（Ｂｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓ）（スティングネマトーダ（ｓｔｉｎｇ ｎｅｍａｔｏｄｅ））。ある実施形態では、線虫は、場合によって、植物または動物（例えば、ヒト）の有害生物／病原体と見なされ得る。他の態様では、線虫は、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）であり得る。

【0212】

魚類細胞は、例えば、米国特許第７４０８０９５号明細書および同第７２１７５６４号明細書、ならびにＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ（Ｔ．Ｏｔｔ，ＮＷＦＨＳ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｍａｎｕａｌ−Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，２００４）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている細胞の任意のものであり得る。これらの文献は、また、魚類細胞の培養および／または操作に関する情報を開示している。魚類細胞の非限定的な例は、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアントレリオ（Ｇｉａｎｔ ｒｅｒｉｏ）またはフグなどの真骨魚類由来のものであり得る。

【0213】

本明細書の植物細胞は、例えば、単子葉植物細胞または双子葉植物細胞であり得る。本明細書中の単子葉植物の例としては、トウモロコシ（ゼアマイズ（Ｚｅａ・ｍａｙｓ））、アジアイネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、トウジンビエ（例えばトウジンビエ、ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニクム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、コムギ（トリティクム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、サトウキビ（サッカルム属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．））、カラスムギ（アヴィーナ（Ａｖｅｎａ属））、オオムギ（ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ））、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．））、ヤシ、観賞植物および芝草が挙げられる。明細書中の双子葉植物の例としては、ダイズ（グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、キャノーラ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）およびブラシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンツス・アナス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ワタ（ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ））、ラッカセイ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、トマト（ソラヌム・リコペルシクム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））およびジャガイモ（ソラヌム・チューベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））が挙げられる。植物細胞は、植物のいかなる部分から、かつ／または植物の生育のいかなる段階からのものであってよい。

【0214】

本明細書中の植物細胞は、従来の条件で植物に生育または再生させてもよい（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ５：８１−４を参照）。再生植物をその後に生育してもよく、また同じ株で受粉させても異なる株で受粉させてもよく、そして得られる子孫は所望の特性（例えば、改変）を有し、かつ／または特定された導入ポリヌクレオチドまたはポリぺプチド含む。２代以上生育して、改変が安定に維持され、かつ受け継がれたことを確認して、種子を収穫してもよい。

【0215】

ある実施形態において、哺乳類細胞は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、さる、類人猿）、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギまたはヒツジの細胞であり得る。本明細書中の哺乳類細胞の他の例としては、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、網膜上皮細胞）；樹立細胞株（例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞、ＰＥＲ−Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ、ＣＲＦＫ、ＭＤＣＫ、ＣＨＯ、ＢｅＷｏ、チャン細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２、Ｈｅｐ−２、ＫＢ、ＬＳ １８０、ＬＳ １７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ−５４８、ＲＰＭＩ ２６５０、ＳＷ−１３、Ｔ２４、ＷＩ−２８ ＶＡ１３、２ＲＡ、ＷＩＳＨ、ＢＳ−Ｃ−Ｉ、ＬＬＣ−ＭＫ２、Ｃｌｏｎｅ Ｍ−３、ＲＡＧ、ＴＣＭＫ−１、ＬＬＣ−ＰＫ１、ＰＫ−１５、ＧＨ１、ＧＨ３、Ｌ２、ＬＬＣ−ＲＣ ２５６、ＭＨ１Ｃ１、ＸＣ、ＭＤＯＫ、ＶＳＷ、ＴＨ−Ｉ、Ｂ１細胞）；任意の組織または器官からの任意の上皮、間葉（例えば、線維芽細胞）、神経、または筋肉細胞（例えば、皮膚、心臓；肝臓；腎臓；結腸；腸；食道；胃；脳または脊髄などの神経組織；肺；維管束組織；リンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄または血液などのリンパ系組織；脾臓）；および線維芽細胞または線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ−２、ＩＭＲ−３３、ドン細胞、ＧＨＫ−２１、シトルリン細胞、デンプシー細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５１０、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２５、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５２９、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３２、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５３９、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５４８、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３、ＨＥＬ ２９９、ＩＭＲ−９０、ＭＲＣ−５、ＷＩ−３８、ＷＩ−２６、ＭｉＣｌ１、ＣＶ−１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−３、ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、ＤＢＳ−ＦｒｈＬ−２、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｆ９、ＳＶ−Ｔ２、Ｍ−ＭＳＶ− ＢＡＬＢ／３Ｔ３、Ｋ−ＢＡＬＢ、ＢＬＯ−１１、ＮＯＲ−１０、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２、ＨＳＤＭ１Ｃ３、ＫＬＮ２０５、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、ＳＣＣ−ＰＳＡ１、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドホエジカ細胞、ＳＩＲ、ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）細胞が挙げられる。哺乳類細胞株の培養および操作方法は当該技術分野で知られている。

【0216】

ある実施形態では、微生物細胞は、動物または植物の病原体および／または有害生物であり得る。そのような病原体および／または有害生物の例としては、様々な種類の細菌、真菌、酵母、原生生物、線虫および昆虫が挙げられる。当業者であれば、上に開示したそのような病原体および／または有害生物の例を認識しているであろう。

【0217】

本明細書中に開示されているように（実施例１０を参照）、細胞透過ペプチドは、フィトフトーラ・カプシキ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）、セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）およびボトゥリチス・キネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）を含む種々に真核種に積み荷を輸送することができた。

【0218】

一実施形態において、本明細書中に記載の方法は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を、フィトフトーラ・カプシキ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）、セプトリア・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ）およびボトゥリチス・キネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）からなる群か選択される微生物細胞へ輸送する方法であって、微生物細胞を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程を含み、前記タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、前記ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより微生物細胞に侵入する方法である。

【0219】

本明細書中のある実施形態における組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素と、少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含み得、タンパク質組成物とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつポリヌクレオチド／エンドヌクレアーゼタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞（例えば、微生物細胞）の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる。ガイドポリヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼのＤＮＡ標的部位での二重鎖切断を可能にする複合体（「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」と呼ぶ）を形成することができる。

【0220】

開示される発明はまた、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を細胞（例えば、微生物細胞）に輸送する方法に関する。この方法は、細胞を、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程を含み、ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成している。この工程の結果として、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより細胞への侵入を獲得することができる。ＲＧＥＮタンパク質構成要素がＲＮＡ構成要素と結合する（これによって、ＲＧＥＮを形成する）ある実施形態では、開示される方法は、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の細胞への輸送に関する。さらに、ＲＧＥＮはＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングに使用することができるため、この方法は、場合によって、細胞内でＤＮＡをターゲティングする方法と見なすことができる。

【0221】

この方法は、方法の各特徴（例えば、細胞の種類、ＲＧＥＮタンパク質構成要素、ＣＰＰ、細胞小器官を標的とする配列など，）に関し、上記実施形態または下記の実施例を使用して行うことができる。したがって、上に開示された特徴もしくは実施例中の特徴、またはこれらの特徴の任意の組み合わせを適切に使用して、本明細書中の輸送方法の実施形態を特徴付けることができる。以下の輸送方法の特徴は、例である。

【0222】

本明細書中の輸送方法の実施形態は、細胞（例えば、微生物細胞）をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物と接触させる工程を含む。そのような接触により、複合体と細胞外表面（例えば、細胞膜、細胞壁）との相互作用が生じ、それによって複合体のＣＰＰ構成要素に複合体の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜の横断を開始させると考えられる。

【0223】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物の細胞（例えば、微生物細胞）との接触は、複合体を細胞に侵入させることができる温度で行われ得る。そのような接触は、例えば、約４〜４５℃の間の任意の温度で行うことができる。非限定的な実施形態において、接触温度は約４、１５、２０、３０、３７または４２℃であり得る。接触工程中、同じ温度または温度範囲を維持してもよく、適切に変化（例えば、２以上の異なる温度）させてもよい。

【0224】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物の細胞との接触は、複合体を細胞へ侵入させるのに適した時間、行われ得る。例えば、細胞をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体と、少なくとも約１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１６５、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００、６６０または７２０分間インキュベートすることができる。

【0225】

接触を行わせる環境（例えば、バッファ、水および塩の濃度、ｐＨ、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の純度）は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物について、上で記載された条件のいずれであってもよい。例えば、細胞を複合体と、ＨＥＰＥＳバッファ（例えば、〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、例えば、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）、またはＰＢＳ（例えば、１×ＰＢＳ、ｐＨ７）中で、インキュベートすることができる。

【0226】

１種以上の細胞（例えば、微生物細胞）をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物と接触させてもよい。本明細書中の細胞は、（ｉ）インビボの生物／組織内、（ｉｉ）エクスビボの細胞組織もしくは細胞群内、または（ｉｉｉ）インビトロ状態（例えば、培養細胞）に存在させ得る。

【0227】

本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の細胞への侵入は、通常、細胞が（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を完全に横断し、少なくとも細胞の細胞質内に含まれる時を指す。特定の理論や機構に縛られることを意図するものではないが、非共有結合的結合により保持されたＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、完全複合体または部分的複合体で残るか、またはＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体への侵入を獲得した後、複合体のＣＰＰ構成要素からＲＧＥＮタンパク質構成要素が分離すると考えられる。いずれの場合も、ＲＧＥＮタンパク質構成要素は、本明細書中の適切なＲＮＡ構成要素と結合することができる。そのような結合は、例えば、細胞質、核またはミトコンドリアで起こり得る。この能力は、共有結合によって保持されたＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体にも当てはまる。

【0228】

ＲＧＥＮタンパク質輸送方法のある実施形態では、本明細書中の組成物は、さらに、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合する少なくとも１つのＲＮＡ構成要素を含む（すなわち、組成物はＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を含む）。この実施形態のＲＮＡ構成要素は、本明細書中に開示されている通りであり、微生物細胞の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む。ＲＧＥＮは標的部位配列に結合することができ、そして、場合により、標的部位配列でＤＮＡの一本鎖または二本鎖を切断することができる。そのような実施形態はまた、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の微生物細胞への輸送方法、あるいはＲＮＡの微生物細胞への輸送方法と見なすことができる。

【0229】

この実施形態で使用するＲＮＡ構成要素（例えば、ｇＲＮＡ）は、当該技術分野で知られている多くの手段を用いて調製することができる。例えば、インビトロ転写プロセスを使用して、本明細書中のＲＮＡ構成要素を調製することができる。ある非限定的な実施形態においては、細菌ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６）を使用して、ＲＮＡ構成要素をコードする適切なＤＮＡ構築体からＲＮＡ構成要素を転写すことができる。必要に応じて、他の生体分子（例えば、タンパク質、糖、脂質）に対する純度が少なくとも約 ７０％、８０％、９０％または９５％にまでＲＮＡ構成要素にプロセッシングを行ってもよい。

【0230】

ＲＮＡ構成要素およびＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物を調製するために、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を既に溶解した組成物にＲＮＡ構成要素を溶解させる、またはその逆を行うことができる（あるいは、これらの構成要素を同時に溶解させることができる。ＲＮＡ構成要素とＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の、これらの要素を混合する際のモル比には、例えば、少なくとも約０．５：１、１．０：１、１．５：１、２．０：１、２．５：１、３．０：１、３．５：１または４．０：１を使用することができる。これらおよび他の態様において、ＲＮＡ構成要素と混合する際のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の濃度は、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０もしくは１０．０μＭ、または約０．５〜５．０μＭ、０．５〜２．５μＭ、１．０〜５．０μＭ、１．０〜２．５μＭ、または２．５〜５．０μＭであり得る。ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を形成するために、ＲＮＡをＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体に結合させる時間は、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４５または６０分であり得る。ＲＮＡ構成要素をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体と結合させることができる他の条件（例えば、温度、バッファ、水および塩の濃度、ｐＨ、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の濃度）は、（ｉ）ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を含む組成物、または（ｉｉ）ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の細胞との接触について上に開示した任意の条件であり得る。例えば、ｇＲＮＡなどのＲＮＡ構成要素をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体と、ＨＥＰＥＳバッファ（例えば、〜２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、例えば、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）、またはＰＢＳ（例えば、１×ＰＢＳ、ｐＨ７）中、室温（例えば、約２０〜２５℃）で約１５分間接触させることができる。ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が非共有結合によって保持されている実施形態では、ＲＮＡ構成要素のＲＧＥＮタンパク質への結合は、ＣＰＰをＲＧＥＮタンパク質構成要素とインキュベートする前、同時または後にＲＮＡ構成要素を加えることを含む。

【0231】

例えば、ＲＮＡ構成要素をＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体と結合させた後、得られたＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体（例えば、ＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ）を含む組成物を細胞に直ちに接触させることができる。接触は、ＲＮＡ構成要素とＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が結合している環境下で（例えば、上記を参照）行うことができる。ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体 を含む組成物は、必要に応じて、後の使用のために、略室温で、４℃で、また凍結（例えば、−２０℃もしくは−８０℃）して保存することができる。ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の安定性、および／または細胞へ侵入し、ＤＮＡターゲティングを行う能力は、たとえ複合体が１サイクル、２サイクルもしくはそれ以上の凍結融解サイクルを受けたとしても、変わらず維持されるか、または各活性の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％を有することができる。

【0232】

ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体またはＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を含む組成物には、細胞との接触のために、場合により、１種以上の、細胞と複合体の接触点を増大させる体積排除剤を含有させることができる。本明細書中の適切な体積排除剤の例としては、グリセロールおよびポエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。他の例としては、ポリアクリル酸塩、ポリメチルアクリ酸塩またはアニオン性多糖ポリマー（例えば、硫酸デキストラン）などのアニオン性ポリマーが挙げられる。体積排除剤のさらに他の例は、米国特許第４８８６７４１号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0233】

ＲＧＥＮタンパク質輸送方法のある実施形態では、細胞（例えば、微生物細胞）は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が細胞に侵入後、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合する（すなわち、それによって、細胞内にＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を形成する）ＲＮＡ構成要素を含む。この実施形態のＲＮＡ構成要素は、本明細書中に開示されるように、細胞の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み得る。ＲＧＥＮは、標的部位配列に結合することができ、そして、場合により、標的部位配列でＤＮＡの一本鎖または二本鎖を切断することができる。

【0234】

本明細書中の１つ以上のＲＮＡ構成要素は、例えば、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が導入される細胞（例えば、微生物細胞）で安定にまたは一時的に発現させることができる。一時的発現の例として、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を、（ｉ）ＲＮＡ構成要素を一時的に発現するように予め修飾した細胞に輸送、（ｉｉ）ＲＮＡ構成要素と共に細胞に同時輸送、または（ｉｉｉ）細胞へ輸送後にＲＮＡの一時的発現のために細胞を改変することができる。

【0235】

（ｉ）プロモータ、および（ｉｉ）それが機能可能なように結合する、ＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド配列は、典型的には、本明細書中の、ＲＮＡ構成要素の安定した、かつ／また一時的な発現のために使用することができる。そのようなポリヌクレオチド配列は、例えば、プラスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウイルスまたは直鎖ＤＮＡ（例えば、直鎖ＰＣＲ産物）、あるいはポリヌクレオチド配列の細胞への運搬に有用な他のタイプのベクターまたは構築体に含まれ得る。このポリヌクレオチド配列は、細胞に一時的に（すなわち、ゲノムに組み込まれない）、または安定に（すなわち、ゲノムに組み込まれる）存在することができる。また、このポリヌクレオチド配列は、１つ以上の適切なマーカー（例えば、選択マーカ―または表現型マーカー）を含有または欠失することができる。

【0236】

本明細書中で、ＲＮＡ構成要素発現用のポリヌクレオチド配列に含まれる適切なプロモータは、例えば、構成的であっても誘導可能であってもよい。ある態様におけるプロモータは、強プロモータを含んでよく、これは、単位時間あたり比較的多数の生産開始を導くことができるプロモータであり、かつ／または、この強プロモータを含む細胞の遺伝子の平均転写レベルよりも高い転写レベルを駆動するプロモータである。

【0237】

本明細書中のある態様（例えば、真菌細胞および／または酵母細胞）における有用な強プロモータの例としては、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０７９号明細書（ＤＧＡＴ２）、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０９３号明細書（ＥＬ１）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１０号明細書（ＡＬＫ２）、米国特許出願公開第２０１３／００８９９１１号明細書（ＳＰＳ１９）、米国特許出願公開第２００６／００１９２９７号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２０１１／００５９４９６号明細書（ＧＰＤおよびＧＰＭ）、米国特許出願公開第２００５／０１３０２８０号明細書（ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ）、米国特許出願公開第２００６／００５７６９０号明細書（ＧＰＡＴ）、および米国特許出願公開第２０１０／００６８７８９号明細書（ＹＡＴ１）に開示されるものが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。強プロモータの他の例としては、例えば、表２に記載されるものが挙げられ、これらもまた真菌細胞および／または酵母細胞に有用であり得る。

【0238】

【表7】

【0239】

本明細書中のある実施形態に有用な強プロモータの他の例としては、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＨＯ５、ＬＥＵ２およびＧＡＬ１プロモータ、ならびに、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ ８８：２４３−２５１）（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に開示の強酵母プロモータが挙げられる。

【0240】

本明細書中で、ＲＮＡ構成要素の安定で、かつ／または瞬時の発現のためのプロモータは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）プロモータであり得る。上に列挙した全ての強プロモータは、適切なＰｏｌ ＩＩプロモータの例であると考えられる。Ｐｏｌ ＩＩプロモータからの転写は、例えば、少なくとも約１２のタンパク質（例えば、ＲＰＢ１−ＲＰＮ１２タンパク質）のＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の形成を含んでよい。例えば、本明細書中でＰｏｌ ＩＩプロモータから転写されるＲＮＡは、通常、５’キャッピングされ（例えば、５’末端にｍ^７Ｇ基を含有する）、かつ／またはポリアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）鎖を有する。Ｐｏｌ ＩＩプロモータからＲＮＡ構成要素を発現する場合、必要なら、ＲＮＡ構成要素から５’キャップおよび／またはｐｏｌｙＡ鎖を除く手段を用いることができる。本明細書中でＰｏｌ ＩＩ転写ＲＮＡ構成要素から５’キャップおよび／またはｐｏｌｙＡ鎖を効率よく除去する適切な手段としては、例えば、１つまたは複数のリボザイム（下記を参照）、グループ１自己スプライシングイントロン、およびグループ２自己スプライシングイントロンの適切な使用が挙げられる。

【0241】

あるいは、本明細書中で、ＲＮＡ構成要素の安定で、かつ／または瞬時の発現のためのプロモータは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写の開始と終止は制御が可能であることから、そのようなプロモータは、通常、所定の５’末端および３’末端を有するＲＮＡ構成要素を発現させることができる。本明細書中で有用なＰｏｌ ＩＩＩプロモータの例としては、Ｕ６およびＨ１プロモータが挙げられる。他の適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモータは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１６０４１６号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0242】

例えば、細胞内でＲＮＡ構成要素を発現させるためにＰｏｌ ＩＩプロモータが使用される実施形態では、１つまたは複数のリボザイム配列が、所定の５’末端および／または３’末端を作るために使用され得る。例えば、ＲＮＡ構成要素をコードする本明細書中のヌクレオチド配列は、ＲＮＡ構成要素をコードする配列の上流にあるリボザイムをさらにコードすることができる。それ故、ある実施形態では、細胞は、さらに、（ｉ）プロモータ、そして（ｉｉ）このプロモータが機能可能なように結合する、５’から３’の方向にリボザイムおよびＲＮＡ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチド配列から発現する転写産物は、自己触媒的にリボザイム配列を除去して所定の５’末端を有する（５’キャップは有していない）が、ＲＮＡ構成要素配列を含むＲＮＡを得る。この「自己プロセッシングされた」ＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを含み得、そして、Ｃａｓ９などのＲＧＥＮタンパク質構成要素と複合化することによって、ＲＧＥＮを形成することができる。

【0243】

本明細書中のリボザイムは、例えば、ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイム、デルタ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）リボザイム、グループＩイントロンリボザイム、ＲｎａｓｅＰリボザイム、またはヘアピンリボザイムであってよい。本明細書中のリボザイムの他の非限定的な例として、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム、グルコサミン−６−リン酸活性化リボザイム（ｇｌｍＳ）、およびＣＰＥＢ３リボザイムが挙げられる。Ｌｉｌｌｅｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３９：６４１−６４６）は、リボザイムの構造および活性に関する情報を開示している。本明細書中で用いるのに適しているはずであるリボザイムの例として、ＥＰ０７０７６３８号明細書、ならびに米国特許第６０６３５６６号明細書、米国特許第５５８０９６７号明細書、米国特許第５６１６４５９号明細書および米国特許第５６８８６７０号明細書に開示されるリボザイムが挙げられ、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。さらに、所定の５’末端および／または３’末端を有するＲＮＡ構成要素を発現するためのリボザイムの使用に関する情報は、米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（２０１４年８月１３日に出願）に開示されている。

【0244】

ある実施形態において、ＲＮＡ構成要素を発現するカセットを含むＤＮＡポリヌクレオチドは、ＲＮＡ構成要素配列の下流に、適切な転写終止配列を含む。本明細書中で有用な転写終止配列の例は、米国特許出願公開第２０１４／０１８６９０６号明細書に開示されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。そのような実施形態は、通常、ターミネータ配列の選択に応じて、ＲＮＡ構成要素配列の末端の後ろに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上の残基を含む。これらの付加的な残基は、例えば、ターミネータ配列の選択に応じて、全てＵ残基であってもよいし、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％がＵ残基であってもよい。あるいは、リボザイム配列（例えば、ハンマーヘッドまたはＨＤＶリボザイム）は、ＲＮＡ構成要素配列の（下流の、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド）３’側にあってよい。３’リボザイム配列は、それ自体をＲＮＡ構成要素配列から切断するように然るべく位置が定められ得る。そのような切断により、転写産物は、例えば、ＲＮＡ構成要素配列の末端にて正確に終止するか、または、ＲＮＡ構成要素配列の末端に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくはそれ以上の残基が続くことになる。

【0245】

他の実施例では、ＲＮＡ構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が輸送される細胞の核および／または細胞質に提供され得る。例えば、５’に位置するリボザイム配列を使用せずにＰｏｌＩＩプロモータから発現したＲＮＡ構成要素は、核および細胞質の双方に存在すると予想される。他の実施形態では、任意のタイプのプロモータ（例えば、Ｐｏｌ ＩＩまたはＰｏｌ ＩＩＩプロモータ）から、５’に位置するリボザイム配列を使用して発現されたＲＮＡ構成要素は、その大半が核に存在すると予想される。ある態様では、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモータから発現されたＲＮＡ構成要素は、その大半が核に存在すると予想される。ある態様では、ＲＮＡ構成要素は、キャッピングされておらず（例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモータからの発現、および／またはリボザイムの自己プロセッシングのため）、かつ通常、核内に存在するが、他の態様では、ＲＮＡ構成要素は、キャッピングされ、かつ核および細胞質に存在する。一般に、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素は、一旦、細胞に輸送されると、細胞質および／または核において（ＲＮＡ構成要素の位置に依る）、ＲＮＡ構成要素と結合し得る（それによってＲＧＥＮを形成する）。そのような核内における結合は、一般に、本明細書中のＲＧＥＮタンパク質構成要素の、ＮＬＳに指示される核に局在する能力による。

【0246】

本明細書中のＲＧＥＮは、ＲＧＥＮ媒介ＤＮＡターゲティングに有用である。ＲＧＥＮタンパク質構成要素の細胞への輸送に関する上記実施形態はいずれも、ＤＮＡターゲティング方法に適用することができる。例えば、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の外で少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と接触し、細胞内でのＤＮＡターゲティングのため、細胞への輸送用のＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を形成することができる。他の例では、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞内へ輸送後、微生物細胞内で少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と接触して、その後にＤＮＡターゲティングを媒介し得るＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を細胞内で形成することができる。ターゲティング方法に関する以下の開示は、「ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体」の言及に対立するものとして「ＲＧＥＮ」に言及する。共有結合的または非共有結合的ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体が本明細書中のＲＧＥＮ輸送に使用するか否かによって（また、非共有結合的ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を使用する実施形態における非共有結合の結合強さによって）、下記のＲＧＥＮへの言及が然るべくそのようなＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体への言及になることは理解されよう。

【0247】

ＤＮＡターゲティング配列のＤＮＡ一本鎖または二本鎖を切断することができる本明細書におけるＲＧＥＮは、例えば、ＤＮＡターゲティング法に使用することができる。そのようなＤＮＡターゲティング法は、適切なドナーＤＮＡが提供されるなら、ＨＲ媒介ＤＮＡターゲティングを含み得る。したがって、ある実施形態では、本明細書中のターゲティング法における微生物細胞は、標的部位配列の、またはその近傍の配列（本明細書中のＲＧＥＮに特異的に標的とされる配列）に相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドを含み得る。そのような実施形態は、場合によって、ターゲティング法がさらに微生物細胞に適切なドナーポリヌクレオチドを供給する工程を含むという特徴を有することができる。

【0248】

本明細書中のドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ標的部位がＳＳＢまたはＤＳＢを含むなら、その標的部位の配列、またはその近傍の配列とＨＲを行うことができる（例えば、本明細書中のＲＧＥＮを用いて導入することができる）。本明細書中のドナーポリヌクレオチド内の「相同配列」は、例えば、標的部位もしくはその近傍の配列と１００％の相同性を有する、または標的部位もしくはその近傍の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の相同性を有する、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００もしくは１００００のヌクレオチド、または約５０〜５００、５０〜５５０、５０〜６００、５０〜６５０もしくは５０〜７００のヌクレオチドの配列を含んでもよく、またそのような配列からなってもよい。

【0249】

本明細書中のドナーポリヌクレオチドは、例えば、標的部位配列の配列、またはその近傍の配列に非相同である配列によって分離される、２つの相同配列（相同アーム）を有してよい。そのようなドナーポリヌクレオチドと標的部位配列とのＨＲにより、通常、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列との、標的部位の配列の置換が生じる（すなわち、ドナーポリヌクレオチドの相同アームに相同である標的部位配列間に位置する標的部位配列は、ドナーポリヌクレオチドの非相同配列によって置換される）。２本の相同アームを有するドナーポリヌクレオチドにおいて、アームは、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、または３００００ヌクレオチドによって分離されてよい（すなわち、ドナーポリヌクレオチド中の非相同配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２５０００、または３００００ヌクレオチド長である）。各相同アームの長さ（例えば、相同配列について先に開示される長さのいずれか）は、同じであっても異なってもよい。標的部位の各相同配列、またはその近傍の各相同配列との各アームのパーセント同一性（例えば、相同配列について先に開示される％同一性のいずれか）は、同じであっても異なってもよい。

【0250】

ドナーポリヌクレオチド中の対応する相同配列に相同である標的部位配列の、またはその近傍の（あるいは、その場所にある、またはそれに近接する）ＤＮＡ配列は、標的配列中の予測されるＲＧＥＮカット部位（ＤＳＢまたはニック）から、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、もしくは６００００（または、１〜６００００の任意の整数）ヌクレオチド（例えば、約１〜１０００、１００〜１０００、５００〜１０００、１〜５００、まもしく１００〜５００ヌクレオチド）以内にあってよい。これらのヌクレオチド距離は、カット部位から上流方向に、または下流方向に進む、カット部位から相同配列の第１のヌクレオチドまでで評価されてよい。例えば、ドナーポリヌクレオチド中の対応する配列に相同である標的配列近傍の配列は、標的配列中の予測されるＲＧＥＮカット部位の下流５００ヌクレオチド塩基対から開始してよい。本明細書中の、２本の相同アーム（例えば、非相同配列によって分離される第１および第２の相同アーム）を有するドナーポリヌクレオチドを利用する実施形態において、相同配列（相同性においてドナーの第１の相同アームと対応する）は、例えば、予測されるＲＧＥＮカット部位の上流にあってよく、相同配列（相同性においてドナーの第２の相同アームと対応する）は、予測されるＲＧＥＮカット部位の下流にあってよい。これらの上流の相同配列および下流の相同配列のそれぞれの、予測されるカット部位からのヌクレオチド距離は、同じであっても異なってもよく、例えば、上で開示したヌクレオチド距離のいずれであってもよい。例えば、相同配列（相同性においてドナーの第１の相同アームと対応する）の３’末端は、予測されるＲＧＥＮカット部位の上流６００ヌクレオチド塩基対に位置してよく、相同配列（相同性においてドナーの第２の相同アームと対応する）の５’末端は、予測されるＲＧＥＮカット部位の下流４００ヌクレオチド塩基対に位置してよい。

【0251】

種々の態様において、ドナーポリヌクレオチドは、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が細胞（例えば、微生物細胞）に輸送される時、またはそれに近い時（例えば、１時間、２時間、３時間またはそれ以上の時間内）に、細胞に輸送され得る。そのような輸送は、使用される特定の細胞のタイプに適した、この技術分野で知られた手段によって行われてよい。これらの技術としては、例えば、形質転換（例えば、酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８６−１８７）、トランスフェクション、バイオリスティックインパクト、エレクトロポーレーション、およびマイクロインジェクションが挙げられる。例として、米国特許第４８８０７４１号明細書および同第５０７１７６４号明細書、ならびにＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：２３２−２３５）（これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる）が、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためのＤＮＡ運搬技術を記載している。植物に有用な運搬モードの例としては、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属媒介形質転換およびパーティクル・ガン法が挙げられる。

【0252】

本明細書中のＤＮＡターゲティング法の他の非限定的な実施形態においては、ＤＮＡ標的配列のＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断するＲＧＥＮがｉｎｄｅｌを生じさせるために使用され得る。細胞でｉｎｄｅｌを形成する方法は、標的ＤＮＡ部位にて、またはその近傍でＨＲを受け得るドナーＤＮＡポリヌクレオチドをさらに提供することなく、ＨＲ媒介ターゲティングについて先に開示したようにして実行され得る。（すなわち、ＮＨＥＪが当該方法において誘導される）。
生じ得るｉｎｄｅｌの例が、本明細書中に開示されている。ｉｎｄｅｌのサイズは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基であってよい。ある実施形態におけるｉｎｄｅｌは、さらに大きくてよく、例えば少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０塩基であってよい。さらに他の実施形態において、挿入または欠失は、少なくとも約５００、７５０、１０００、または１５００塩基であってよい。ある実施形態においてｉｎｄｅｌを生じさせようとする場合、その代わりとして単一の塩基置換が、標的部位配列中に形成されてよい。ゆえに、本明細書中のターゲティング法は、例えば、単一の塩基置換を生じさせる目的で実行されてよい。

【0253】

ｉｎｄｅｌ形成を意図する本明細書中のターゲティング法のある実施形態において、非従来型酵母（例えば、酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるｉｎｄｅｌ形成の頻度は、従来型酵母、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において同じ、または類似のターゲティング戦略を用いて観察されるであろう頻度よりも、有意に高い。例えば、従来型酵母におけるｉｎｄｅｌ形成の頻度は、約０．０００１から０．００１であり得（ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６−４３４３）、非従来型酵母における頻度は本明細書中で、少なくとも約０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、または０．８０であり得る。ゆえに、非従来型酵母のｉｎｄｅｌ形成の頻度は本明細書中で、例えば、従来型酵母において同じ、または類似のＲＧＥＮ媒介ターゲティング戦略を用いて観察されるであろう頻度よりも、少なくとも約５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、４０００、または８０００倍高くなり得る。

【0254】

ある実施形態におけるターゲティング法は、タンパク質または非コードＲＮＡをコードする１つまたは複数のＤＮＡポリヌクレオチド配列を分裂させるために実行されてよい。分裂のために標的とされてよいそのような配列の例が、マーカーをコードする配列（すなわち、マーカー遺伝子）である。本明細書中のマーカーの非限定的な例として、スクリーニング可能なマーカーおよび選択可能なマーカーが挙げられる。本明細書中のスクリーニング可能なマーカーとして、適切な条件下で細胞を視覚的に異ならせるものであってよい。スクリーニング可能なマーカーの例として、ベータ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、および蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書中の選択可能なマーカーは、細胞を、選択剤または選択環境に対して耐性にするものであってよい。選択可能なマーカーの例として、栄養要求性マーカー、例えばＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＭＥＴ１５、またはＵＲＡ３があり、これらにより細胞、例えば、酵母細胞は、外因的に提供されるヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、またはウラシルの不在下でそれぞれ生存することができる。選択可能なマーカーの他の例として、抗生物質または抗真菌耐性マーカー、例えば、細胞を、アンピシリン、クロラムフェニコール、ハイグロマイシンＢ、ノウルセオスリシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン（例えばＧ４１８）に対して耐性にするものがある。これらの方法の例は、場合により、マーカーリサイクル法と見なすことができる。

【0255】

ある実施形態においてマーカーを分裂させる少なくとも１つの目的は、マーカーリサイクルのためであってよい。マーカーリサイクルは、例えば、（ｉ）細胞をマーカーおよび非相同ＤＮＡ配列で形質転換する工程と、（ｉｉ）マーカーおよび非相同ＤＮＡ配列を含む形質転換された細胞を選択する工程（マーカー選択可能な細胞は典型的に、非相同ＤＮＡ配列を含有する見込みがより高い）と、（ｉｉｉ）マーカーを分裂させる工程と、その後、細胞を、複数の非相同ＤＮＡ配列で形質転換するために、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を必要なだけ繰り返す（同じ［または異なる］マーカーを用いるが、各サイクルで、異なる非相同ＤＮＡ配列を用いる）工程を含むプロセスである。当該プロセスの１つまたは複数の非相同配列は、ドナーポリヌクレオチドの形態のマーカーそれ自体（例えば、特定の遺伝子座を標的とする相同アームがフランキングするマーカー）を含んでよい。本明細書中のマーカーリサイクルプロセスの例として、酵母（例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの非従来型酵母）におけるような、ＵＲＡ３をマーカーとして用いるものが挙げられる。

【0256】

ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列の任意の鎖を切断することができない、本明細書中のＲＧＥＮは、他の実施形態におけるＤＮＡターゲティング法で使用することができる。機能不全ヌクレアーゼドメインのみを有するが、特異的なＤＮＡ結合活性を保持している、本明細書で開示する任意のＲＧＥＮはこの種のターゲティング法で使用することができる。

【0257】

機能性ヌクレアーゼドメインを有しないＲＧＥＮＮを用いるＤＮＡターゲティングのある実施形態では、ＲＧＥＮは標的部位に結合することができ、ポリヌクレオチド配列の転写（すなわち、遺伝子の転写）を調節することができる。通常、ＲＧＥＮは、ポリヌクレオチド配列の転写調節を行うために、プロモータ（転写開始点の上流側に、例えば、１〜１０００、１〜５００、１〜２５０、１〜１２５または１〜５０以内の塩基）、５’−非翻訳ＲＮＡ配列または第１イントロンなどの調節配列の標的にされる。

【0258】

一例を挙げれば、リプレッサー転写因子またはそのレプレッサードメインと結合または融合したＲＧＥＮは、１つ以上のポリヌクレオチド配列の発現を抑制またはサイレンシングするために使用することができるが、これに限定されるものではない。ある代替実施形態におけるＲＧＥＮは、それ自体（リプレッサーまたはそのドメインを有しない）が遺伝子発現を抑止することができ；そうしたＲＧＥＮは標的にされることができ、そうして転写に必要なＲＮＡ転写装置の結合および／または移動を抑止する。任意の抑止ＲＧＥＮを組み込んだ方法は、任意選択により遺伝子サイレンシング法または転写サイレンシング法と特徴づけることができる。サイレンシング法における転写下方調節のレベルは、例えば、抑止ＲＧＥＮを適用する前の転写レベルと比べて、約１００％（遺伝子は完全にサイレンシングされる）または少なくとも約３０％（遺伝子は適度にサイレンシングされる）、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％（遺伝子は実質的にサイレンシングされる）にすることができる。

【0259】

アクチベーター転写因子またはそのアクチベータードメインに結合または溶融したＲＧＥＮは、１つ以上のポリヌクレオチド配列の発現を上方調節するために使用することができる。そのような活性化ＲＧＥＮを組み込んだ方法は、任意選択により転写上方調節法または活性化法と特徴づけることができる。そうした方法における転写上方調節のレベルは、例えば、活性化ＲＧＥＮを適用する前の転写レベルと比べて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、２５０％、５００％または１０００％にすることができる。

【0260】

ある実施形態では、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、適合部位配列のどの鎖も好ましくは切断しないＲＧＥＮは、診断具（例えば、ＤＮＡ配列を検出するプローブ）として使用することができる。ＤＮＡプローブにおけるＲＧＥＮタンパク質構成要素は、例えば、リポータータンパク質（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク）などのリポーター試薬に結合されることができる。ＲＧＥＮのＲＮＡ成分により規定される、ＲＧＥＮリポータータンパクの特異的なＤＮＡ結合は、したがって、リポーター試薬の活性を利用して検出システムに組み込まれることができる。フローサイトメトリー（例えば流れ活性化細胞選別［ＦＡＣＳ］）および蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション［ＦＩＳＨ］は、蛍光リポーターを使用する本明細書の適切な検出システムである。

【0261】

本明細書中のターゲティング法は、例えば、この方法で２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的にされるような方法で行われることができる。そのような方法は、任意選択により、多重法として特徴づけられる。ある実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれより多くの標的部位が同時に標的にされることができる。多重法は、通常、複数の異なるＲＮＡ成分（その各々がＲＧＥＮを固有のＤＮＡ標的部位に導く）が提供される、本明細書中のターゲティング法により行われる。例えば、インビトロでＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合混合物を調製する（例えば、ＲＮＡ成分をＲＧＥＮタンパク−ＣＰＰ複合体に結合させるために、本明細書で開示された手順にしたがって）ために、２種以上の異なるＲＮＡ成分が使用され、その後この混合物は細胞と接触させられる。

【0262】

本明細書による多重ターゲティングの他の態様は、細胞に入り込んできたＲＧＥＮタンパク−ＣＰＰ複合体のＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合する、２種以上の異なるＲＮＡ成分を細胞内に提供することを含むことができる。そのような方法は、例えば、（ｉ）特定のＲＮＡ成分を発現する個別のＤＮＡポリヌクレオチド、および／または２つ以上のＲＮＡ成分をエンコードする少なくとも１つのＤＮＡポリヌクレオチドを細胞に提供することを含むことができる（例えば、タンデムのリボザイム−ＲＮＡ成分カセットについて開示した下記を参照）。

【0263】

多重法は任意選択により同一配列に極めて近いＤＮＡ部位（例えば、プロモーターまたはオープン・リーディング・フレーム）および／または互いに隔たっている部位（例えば、異なる遺伝子および／またはクロモソームで）を標的にすることができる。他の実施形態における多重法は、求められるターゲッティングの成果に応じて（エンドヌクレアーゼ−またはニッカーゼ−コンピテンとＲＧＥＮが使われるならば）、適切なドナーＤＮＡポリヌクレオチドを用いて（ＨＲ用）または用いずに（インデルおよび／または塩基置換を導くＮＨＥＪ用）行われることができる。さらに他の実施形態では、多重法は、本明細書中に開示したように、抑止または活性化ＲＧＥＮを用いて行われることができる。例えば、特定の代謝経路で関与する遺伝子などの遺伝子セットを下方調節する多重抑止ＲＧＥＮが提供されることができる。

【0264】

ある実施形態では、多重法は、１つより多くのリボザイム−ＲＮＡ成分カセットを含む配列（ｉｉ）に結合することが可能なプロモーター（ｉ）を含むＤＮＡポリヌクレオチド（すなわちタンデムカセット）を細胞に提供することを含むことができる。そのようなＤＮＡポリヌクレオチドから発現した転写産物は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはこれより多くのカセットを有することができる。Ａ３’リボザイムは、下流の転写産物配列からのＲＮＡ成分の開裂および分離を可能にするため、全てのまたは一部のＲＮＡ成分配列の後に、任意選択により含まれることができる（すなわち、タンデムカセットは１つ以上のリボザイム−ＲＮＡ成分−リボザイムカセットを含み得る）。タンデムのリボザイム−ＲＮＡ成分−リボザイムカセットを発現する、本明細書のＤＮＡポリヌクレオチドは、各カセット間に約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれより多くのヌクレオチドが存在するよう設計されることができる（例えば、非コードスペーサ配列）。各カセット間の距離は同じであってもよく、異なってもよい。

【0265】

ＲＮＡ成分をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含む、本明細書に記載の任意のコンストラクトまたはベクターは、当該技術分野で知られており、使用される特定の型の細胞に適切な任意の手段によって細胞に導入されることができる。例えば、ドナーＤＮＡを細胞内に送達するために先に開示した手段の任意のものが使用されることができる。

【0266】

本明細書中のある実施形態は、微生物細胞のゲノム中の標的部位を修飾または変更する方法に関し、この方法は、微生物細胞をガイドポリヌクレオチド、および共有結合的に、または非共有結合的にＣＰＰと結合させたＣａｓエンドヌクレアーゼと接触させることを含み、ガイドポリヌクレオチドおよびＣＰＰ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが微生物細胞のゲノム中の標的部位に二本鎖切断を導入することができる複合体を生成することができる。標的部位の修飾または変更は、（ｉ）少なくとも１個のヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを含むことができる。

【0267】

本明細書のある実施形態は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質成分および少なくとも１つの細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む融合タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に関する。例えば、本明細書で開示する任意の融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によりコードされることができる。ヌクレオチド配列は、任意選択によりプロモーター配列との可能な結合部に存在し得る。ある実施形態は、例えば、本明細書で開示する任意のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体をコードする、少なくとも１つのオープン・リーディング・フレームを含むポリヌクレオチド（例えばベクターまたはコンストラクト）を含む。そうしたコード領域は、任意選択により、例えば、細胞中（例えば、細菌細胞；酵母、昆虫または哺乳類などの真核細胞）またはインビトロのタンパク質発現システムにおけるＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体の発現に対して適切な、プロモーター配列に結合されることができる。ベクターまたはコンストラクトの例としては、環状（例えば、プラスミド）および非環状（例えば、増幅ＤＮＡ配列などの直鎖ＤＮＡ）ポリヌクレオチド分子が挙げられる。

【0268】

本明細書のある実施形態は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質をコードし、ポリヌクレオチド配列からＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質を発現させるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列を提供する工程を含むＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質を生成する方法に関し、これによりＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質を生成させる。そうした方法の中で発現工程は、任意選択により、細胞（例えば、大腸菌などの細菌；酵母などの真核細胞［例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］、昆虫または哺乳類の細胞）中で行われることができる。あるいは、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質の発現は、インビトロ・タンパク質発現システム（例えば、ウサギの網状赤血球溶血液またはコムギの胚芽抽出物を用いるものなどの無細胞タンパク質発現システム）中で行われることができる。さらにまた、発現工程で生成したＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ融合体タンパク質は、任意選択により、単離されることができる。そのような単離は、例えば、先に開示した特徴（例えば、純度、ｐＨ、緩衝液および／または塩レベル）のうちの任意のものを有する構成を生み出すような仕方で行われることができる。

【0269】

本明細書中に開示される組成物および方法の非限定的な例としては以下のものが挙げられる：
１．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
２．ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合し、ＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる実施形態１の組成物。
３．ＲＮＡ構成要素は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に機能可能なように結合したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む実施形態２の組成物。
４．ＲＧＥＮは、ＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる実施形態２の組成物。
５．ＲＧＥＮは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質−９（Ｃａｓ９）アミノ酸配列を含む実施形態１の組成物。
６．ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合している実施形態１の組成物。
７．ＲＧＥＮタンパク質構成要素とＣＰＰとは非共有結合的に結合している実施形態１の組成物。
８．ＣＰＰはカチオン性または両親媒性である実施形態１の組成物。
９．ＣＰＰは、
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、または
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ
を含む実施形態１の組成物。
１０．ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は細胞の細胞壁および細胞膜を横断することができる実施形態１の組成物。
１１．実施形態１の組成物を含む細胞。
１２．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を細胞へ輸送する方法であって、
細胞を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程
を含み、
タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、
ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより細胞に侵入する方法。
１３．（ｉ）組成物は、さらに、少なくとも１つの、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合するＲＮＡ構成要素を含む、または
（ｉｉ）細胞は、ＲＮＡ構成要素を含み、ここで、ＲＮＡ構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が細胞に侵入した後、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合し、
ＲＮＡ構成要素は、細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる実施形態１２の方法。
１４．ＲＧＥＮは、標的部位配列でＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断することができる実施形態１３の方法。
１５．細胞は、標的部位配列または標的部位配列近傍の配列と相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含む実施形態１４の方法。
１６．細胞は、非哺乳類細胞である実施形態１２の方法。
１７．ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含み、タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができ、ここで、細胞は、場合により植物細胞である組成物。
１８．Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、植物用に最適化されたＣａｓ９エンドヌクレアーゼである実施形態１７の組成物。
１９．ガイドポリヌクレオチドは、
（ｉ）標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン、および
（ｉｉ）Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン
を含み、
第１のヌクレオチド配列ドメインと第２のヌクレオチド配列ドメインは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはこれらの組み合わせからなる実施形態１７の組成物。
２０．ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、植物細胞の細胞壁を横断することができる実施形態１７の組成物。
２１．ＣＰＰは、
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ、または
（ｖｉ）合成ノナ−アルギニンＣＰＰ、ヒスチジン−リッチノナ−アルギニンＣＰＰおよびＰａｓノナ−アルギニンＣＰＰからなる群より選択されるＣＰＰ
を含む実施形態１７の組成物。
２２．植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物の細胞である実施形態２０の組成物。
２３．単子葉植物は、トウモロコシ、イネ、モロコシ、ライムギ、オオムギ、コムギ、キビ、カラスムギ、サトウキビ、シバおよびスイッチグラスからなる群より選択される実施形態２２の組成物。
２４．双子葉植物は、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、タバコ、ピーナッツ、ジャガイモ、タバコ、シロイヌナズナおよびベニバナからなる群より選択される実施形態２２の組成物。
２５．細胞のゲノム中の標的部位を修飾する方法であって、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に供給する工程を含み、ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができ、ここで、細胞は、任意選択により植物細胞である方法。
２６．標的部位に修飾を有する少なくとも１つの植物細胞を同定する工程をさらに含み、標的部位の修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群より選択される実施形態２５の方法。
２７．植物細胞は、単子葉植物または双子葉植物の細胞である実施形態２５の方法。
２８．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む組成物であって、タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
２９．ＲＧＥＮのタンパク質構成要素は、微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含む少なくとも１つのＲＮＡ構成要素と結合し、ＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる実施形態２８の組成物。
３０．ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の細胞壁および細胞膜を横断することができる実施形態２８の組成物。
３１．実施形態２８の組成物を含む微生物細胞。
３２．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素を微生物細胞へ輸送する方法であって、
微生物細胞を、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）のタンパク質構成要素と少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）とを含む組成物と接触させる工程を含み、
タンパク質構成要素とＣＰＰとは共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体を形成しており、
ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断し、それにより微生物細胞に侵入することができる方法。
３３．（ｉ）組成物は、さらに、少なくとも１つの、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合するＲＮＡ構成要素を含む、または
（ｉｉ）微生物細胞は、ＲＮＡ構成要素を含み、ここで、ＲＮＡ構成要素は、ＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体が微生物細胞に侵入した後、ＲＧＥＮタンパク質構成要素と結合し、
ＲＮＡ構成要素は、微生物細胞中の染色体またはエピソーム上の標的部位配列に相補的な配列を含み、ＲＧＥＮは標的部位配列に結合し、場合によりＤＮＡ１本鎖または２本鎖を標的部位配列で切断することができる実施形態３２の方法。
３４．ＲＧＥＮは、標的部位配列でＤＮＡ１本鎖または２本鎖を切断することができる実施形態３３の方法。
３４．微生物細胞は、標的部位配列または標的部位配列近傍の配列と相同の少なくとも１つの配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含む実施形態３４の方法。
３６．微生物細胞は、酵母細胞である実施形態３２の方法。
３７．ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の少なくとも１つのタンパク質構成要素、および少なくとも１つの細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含み、タンパク質構成要素とＣＰＰとは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる組成物。
３８．ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の細胞壁を横断することができる実施形態３７の方法。
３９．微生物細胞のゲノム中の標的部位を修飾する方法であって、ガイドポリヌクレオチド、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）およびＣａｓエンドヌクレアーゼを細胞に供給する工程を含み、ガイドポリヌクレオチド、ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＣＰＰは、共有結合的に、または非共有結合的に互いに結合して、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体を形成しており、かつガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ−ＣＰＰ複合体は、微生物細胞の（ｉ）細胞膜、または（ｉｉ）細胞壁および細胞膜を横断することができる方法。
２３．標的部位に修飾を有する少なくとも１つの微生物細胞を同定する工程をさらに含み、標的部位の修飾は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、および（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群より選択される実施形態３９の方法。

【実施例】

【0270】

開示される本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。これらの実施例が、本発明のある好ましい態様を示す一方、単に説明の目的で示されていることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、そして、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、本発明の種々の変更および改変を行なって、種々の用途および条件に適合させることができる。

【0271】

実施例１
エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣａｓ９−ＣＰＰ（細胞透過ペプチド）融合タンパク質発現用ベクター
この実施例においては、Ｃａｓ９タンパク質および細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）を含む翻訳融合タンパク質の誘導発現用に設計されたベクターを生成し、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現を試験した。Ｃａｓ９−ＣＰＰ融合タンパク質がエケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において予想通り発現することがわかり、その後、精製した。

【0272】

化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１ ＧＡＳ（ＳＦ３７０）由来のＣａｓ９遺伝子のオープンリーディングフレームを、標準的な技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属における発現用にコドン最適化して、配列番号１を生成した。シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）一分節核局在化シグナル（ＮＬＳ）プラス短リンカー（４アミノ酸）をコードするＤＮＡ配列を、配列番号１の最後のセンスコドンの後ろに組み込んで、配列番号２とした。配列番号２は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする。配列番号３の最後の７つのアミノ酸は、加えたＮＬＳをコードする一方、配列番号３の位置１３６９〜１３７２の残基は、加えたリンカーをコードする。ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９−ＮＬＳ配列（配列番号２）を、標準的な分子生物学技術によって、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属構成プロモータ、ＦＢＡ１（配列番号４）に融合した。ＦＢＡ１構成プロモータ、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９、およびＳＶ４０ ＮＬＳが含有されるヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット
が配列番号５に示される。このＣａｓ９発現カセット（配列番号１３）を、プラスミドｐＺＵＦ中にクローニングして、構築体ｐＺＵＦＣａｓ９とした（図１、配列番号６）。

【0273】

ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属コドン最適化Ｃａｓ９−ＮＬＳ配列を、標準的な分子生物学技術によって、ｐＺＵＦＣａｓ９（配列番号６）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応用プライマーは配列番号７（フォワード）および配列番号８（リバース）であり、それぞれ増幅ＤＮＡ産物に５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を加えた。加えられた５’ＥｃｏＲＩ部位は、増幅産物において、Ｃａｓ９−ＮＬＳのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンと置き換わった。増幅産物（配列番号９）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その後、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ^ＴＭおよび濃縮カラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて精製した。精製したＤＮＡ断片を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手したプラスミドｐＢＡＤ／ＨｉｓＢ（図２Ａ、配列番号１０）にクローニングして、プラスミド構築体ｐＲＦ４８（図２Ｂ、配列番号１１）を生成した。プラスミドｐＲＦ４８は、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、Ｎ末端にヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）タグを含むＣａｓ９−ＮＬＳを発現させることができる。

【0274】

細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）配列をＣａｓ９−ＮＬＳに融合させるため、それぞれエケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現用にコドン最適化され、以下の特定のＣＰＰアミノ酸配列に結合する６×Ｈｉｓタグをコードする配列を含む個々のＤＮＡポリヌクレオチド配列を調製した：エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のゼブラペプチド（ＥＣＤＳＥＬＥＩＫＲＹＫＲＶＲＶＡＳＲＫＣＲＡＫＦＫＱＬＬＱＨＹＲＥＶＡＡＡＫＳＳＥＮＤＲＬＲＬＬＬＫＱＭＣ、配列番号１２）、マウス内皮カドヘリンタンパク質由来のｐＶＥＣタンパク質（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列番号：１３）、神経ペプチドガラニンタンパク質由来のＴＰ１０ペプチド（ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＣＡＡＣＡＫＫＩＬ、配列番号１４）、および合成アルギニンリッチ「ＰｏｌｙＲ」タンパク質（ＧＧＧＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＬＬＬＬ、配列番号１５）。各ＤＮＡポリヌクレオチド配列は、以下のような構造のクローニング配列を生成する５’末端ＮｃｏＩ制限部位および３’末端ＥｃｏＲＩ部位を含んだ：ＮｃｏＩ−６ｘＨｉｓ−ＣＰＰ−ＥｃｏＲＩ（配列番号１６〜１９）。各配列番号１６〜１９は、個々にｐＲＦ４８のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされ、それによって、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ある６×Ｈｉｓ−ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合タンパク質を発現することができるプラスミド構築体を生成した、特に、６×Ｈｉｓ−ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用にプラスミド構築体ｐＲＦ１４４（図３Ａ、配列番号２０）を調製し、６×Ｈｉｓ−ＰｏｌｙＲ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用にプラスミド構築体ｐＲＦ１４５（図３Ｂ、配列番号２１）を調製し、６×Ｈｉｓ−ＴＰ１０ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用にプラスミド構築体ｐＲＦ１４６（図３Ｃ、配列番号２２）を調製し、そして６×Ｈｉｓ−ｐＶＥＣ ＣＰＰ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ融合体発現用にプラスミド構築体ｐＲＦ１６２（図３Ｄ、配列番号２３）を調製した。

【0275】

プラスミドｐＲＦ４８、ｐＲＦ１４４、ｐＲＦ１４５、ｐＲＦ１４６およびｐＲＦ１６２をそれぞれ個々にＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフォームした。グルコース０．４％（ｗ／ｖ）およびアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有するＬブロス（Ｍｉｌｌｅｒ）中、振盪しながら（２２０ｒｐｍ）、３７℃で一晩増殖させた。各前培養物をアンピシリン１００μｇ／ｍＬを含有する２Ｘ ＹＴ培地で１：１００に希釈し、振盪しながら（２２０ｒｐｍ）、３７℃でさらに増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．５に達したところで、０．２％（ｗ／ｖ）の最終濃度までＬ−アラビノースを加えることによって、各プラスミドからのタンパク質発現を誘導した。培養物を振盪しながら（２００ｒｐｍ）、１８℃でさらに１８時間増殖させた。細胞を、５０００×ｇで１５分間、４℃でペレット化した。培地を棄て、細胞ペレットを−８０℃で少なくとも４時間冷却し凍らせた。細胞ペレットを氷上で１５分間解凍し、元の培養物１リットル当たり１５ｍＬの溶解バッファ（２０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ イミダゾール、１２０単位／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を大型フレンチプレッシャーセルに１６０００ｐｓｉで２回通して溶解させた。細胞破砕物を、２００００×ｇで３０分間、４℃でペレット化した。上清を５０ｍｌのコニカルチューブに移し、発現した各融合タンパク質の６×Ｈｉｓタグを結合させるため、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）の５０％スラリーを２ｍｌ加えた。各チューブを４℃で１時間ゆっくり回転させた後、空のグラビティカラムを使用して上清を流出させた。各洗浄からサンプル（７５μＬ）を取り、２５μＬの４×希釈Ｌａｅｍｍｅｌｉバッファに加え、氷上で貯蔵した。各カラム中の樹脂を洗浄バッファ（２０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）５ｍｌで４回洗浄した。１ｍｌアリコートの溶出バッファ（２０ｍＭ トリス ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５００ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ）を各カラムの樹脂に適用し、１０分間インキュベートした。タンパク質の溶出を２８０ｎｍの吸光度で監視した。各溶出液からサンプル（７５ＰＬ）を取り、２５μＬの４×希釈Ｌａｅｍｍｅｌｉバッファに加え、氷上で貯蔵した。各プラスミド発現実験では、溶出したタンパク質を含む画分をカラムから集め、１００００ ＭＷＣＯ透析膜にロードし、４℃で少なくとも１４時間、透析バッファ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＫＣｌ、２０％ グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）で透析した。各透析液のタンパク質濃度を、ブラッドフォード法、および５６５ｎｍの吸光度により測定した。精製タンパク質を２アリコートに分け、その一方を−８０℃で凍らせ、他方を４℃で、氷上で貯蔵した。各プラスミド発現実験では、カラム精製プロセス中に取り出したサンプルを９５℃で５分間加熱し、４％（ｗ／ｖ）の濃縮ゲルを含む８％（ｗ／ｖ）のトリス−グリシンポリアクリルアミド分離ゲル上にロードした。タンパク質を電気泳動（２００ボルト、３０分間）で分離し、クマシーブルーで染色した。６×Ｈｉｓ−ゼブラ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ精製プロセス用のゲルの一例を図４に示す。

【0276】

このように、４つの異なるＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質が発現し、単離された。これらの融合タンパク質は、本明細書中のＲＧＥＮタンパク質−ＣＰＰ複合体の例である。

【0277】

実施例２
インビトロ転写による短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の発現
この実施例では、リボザイムにそれぞれ５’末端および３’末端で融合するｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（「ＲＧＲ」と呼ぶ）を設計した。このＲＧＲ配列により、正確に定義された末端を有するｓｇＲＮＡのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写が可能になった。

【0278】

図５は、ｓｇＲＮＡ分子を示す。それは、２つの領域、可変ターゲティングドメイン（ＶＴ）（ガイド配列）とＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメイン（配列番号２４はＣＥＲの一例である）とを含む単一ＲＮＡ分子である。ＶＴ領域は、例えば、標的とされる核酸分子と同一である２０マーのＲＮＡポリヌクレオチドであり得る。ＶＴドメインは、ＰＡＭモチーフの５’側に存在する標的部位中の切断標的部位を特定する。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用して、ＶＴドメインを相互作用させ、Ｃａｓ９タンパク質切断を導くことができる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１）。ＶＴおよびＣＥＲドメインはいずれも、ｓｇＲＮＡの機能に必要とされる。

【0279】

５’ハンマーヘッド（ＨＨ）リボザイムおよび３’デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイムがｓｇＲＮＡ配列へ付加することによって、一部のＲＮＡポリメラーゼの転写の要件を考慮せずとも、任意のプロモータからのｓｇＲＮＡの発現が可能となる（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写開始後、直接、１つの転写されたＧ残基を要求するが３つの転写されたＧ残基で最もよく機能する）。そのようなｓｇＲＮＡが発現される場合、プレｓｇＲＮＡ転写産物中に存在するリボザイムをオートクレーブ処理することによって、転写産物から分離して、未修飾ｓｇＲＮＡにする。

【0280】

ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、Ｃａｎ１−１遺伝子座（配列番号２５）を標的とするｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を調製した。このｓｇＲＮＡは、そのＣＥＲドメインに配列番号２４を含む。ｓｇＲＮＡをコードする配列を、その５’末端でＨＨリボザイム（配列番号２６）をコードする配列に結合し、その３’末端でＨＤＶリボザイム（配列番号２７）をコードする配列に結合して、ＨＨリボザイムの最初の６塩基がｓｇＲＮＡのＶＴ領域の最初の６塩基の逆相補体であるようにした。この特定のＲＧＲ ｓｇＲＮＡは、配列番号２８によってコードされる。配列番号２８のＲＧＲ ｓｇＲＮＡを、その後、標準的な分子生物学技術によって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ（配列番号２９）に結合して、プラスミドｐＲＦ４６（配列番号３０）を生成した。

【0281】

Ｔ７−ＲＧＲ ｓｇＲＮＡをコードする配列を、標準的な技術によって、プラスミドｐＲＦ４６（配列番号３０）からＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応用プライマーは、配列番号３１（Ｔ７ フォワードプライマー）および配列番号３２（ｇＲＮＡｒｅｖ１リバースプライマー）であった。ＰＣＲ産物をエタノール沈澱によって精製しｄｄＨ_２Ｏに再懸濁し、このＤＮＡをインビトロ転写反応の鋳型として使用した。鋳型ＤＮＡを、２０μＬのインビトロ転写反応液（ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ Ｔ７ Ｋｉｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に、最終濃度１５０ｎＭとなるまで添加した。種々の時間（２時間、４時間、６時間、および一晩）反応を進行させ、インビトロ転写の適切な条件を決定した（図６）。その後、反応液を１０単位のＤＮａｓｅＩにより１５分間、３７℃で処理して、鋳型ＤＮＡを除去した。エタノールおよび標準的なプロトコールを使用してＲＮＡを沈澱させた。各２０μｌのインビトロ反応液により、６０〜１００μｇのＲＮＡが得られた。

【0282】

このように、所定の５’末端および３’末端を有するｓｇＲＮＡがインビトロで合成された。下記の実施例３で示すように、インビトロで転写されたｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９−ＣＰＰ融合タンパク質に結合し、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体を形成することができる。

【0283】

実施例３
ｓｇＲＮＡ複合Ｃａｓ９−ＣＰＰ融合タンパク質を用いる標的ＤＮＡ配列の特異的インビトロ切断
この実施例では、ｓｇＲＮＡと複合したゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（配列番号３９を含む）を試験して、ＣＰＰを有する複合体がＣａｓ９エンドヌクレアーゼ活性を阻害しないことを確認した。

【0284】

標準的な技術を用いて、配列番号２５のＣａｎ１−１標的配列を含むインビトロＣａｎ１切断解析ＤＮＡポリヌクレオチド（配列番号３５）をヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞（ＡＴＣＣ ２０３６２）からＰＣＲ増幅し、精製した。ＰＣＲ反応用プライマーは配列番号３３（ＩＶ−ｕｐフォワードプライマー）および配列番号３４（ＩＶ−ｄｏｗｎリバースプライマー）であった。

【0285】

精製したゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（６００ｎｇ、実施例１で調製）、Ｃａｎ１−１標的部位を標的とするｓｇＲＮＡ（２５０ｎｇ、実施例２で調製）、ＮＥＢｕｆｆｅｒ ３．１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）、およびＣａｎ１切断解析ＤＮＡ（１５０ｎｇ、配列番号３５）を混合して、１０μＬ反応液とした（ｄｄＨ_２Ｏにより体積を最終体積となるようにした）。また、陰性対照として、ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質またはｓｇＲＮＡを欠いた反応液を調製した。陽性対照として、ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９の代わりに、反応液に野生型Ｃａｓ９タンパク質（ＰＮＡ Ｂｉｏ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）を使用した。反応液を３７℃で６０分間インキュベートした。その後、各反応液にＲＮａｓｅＩ（４μｇ）を加え、３７℃で１５分間インキュベートして、ｓｇＲＮＡを分解した。停止液（１μＬ；３０％［ｗ／ｖ］グリセロール、１．２％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ、２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加して反応を停止させた。その後、この反応液を３７℃で１５分間さらにインキュベートした。各反応液を１．２％ＦｌａｓｈＧｅｌ^ＴＭ（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にロードし、２００ボルトで１０分間電気泳動させた（図７）。ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９による標的ＤＮＡ切断パターンは、野生型Ｃａｓ９による切断パターンと一致しており（図７）、それによりゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９はインビトロにおいて正常に機能することが示された。さらに、この活性は２回の凍結融解サイクルを受けたゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡによっても阻害されなかった。

【0286】

このように、適切なｓｇＲＮＡと複合したＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（すなわち、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の例）は特異的ＤＮＡ切断活性を有していた。この活性が野生型Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の活性と類似していることが示され、それにより、ＣＰＰ融合体がＣａｓ９−ｓｇＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を阻害しないことが示された。この例のＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質は配列番号３９（ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９）を含むが、例えば、配列番号４０、４１または４２を含むＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質もまた、ＲＮＡ構成要素としての適切なｓｇＲＮＡに結合した場合に、切断活性を有すると考えられる。

【0287】

実施例４
酵母細胞へのＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の輸送、および酵母細胞内での標的ＤＮＡの切断
この実施例では、ｓｇＲＮＡと複合したゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（配列番号３９を含む）（ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ）を酵母細胞と単に接触させた後の細胞への侵入能力を試験した。Ｃａｎ１−１に特異的なゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡは、細胞に侵入し、Ｃａｎ１遺伝子を切断することによって細胞をカナバニン耐性とすることができた。

【0288】

ヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）酵母細胞（ＡＴＣＣ２０３６２）を、ＹＰＤ（２％グルコース、２％ペプトン、１％酵母エキス）液体培地中、振盪（２２０ｒｐｍ）させながら３０℃で、ＯＤ６００＝０．５（培地１ｍＬ当たり、約５×１０^６個の細胞）になるまで増殖させた。精製ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（実施例１で調製）およびＣａｎ１−１標的部位を標的とするｓｇＲＮＡ（実施例２で調製）をそれぞれ、実施例１で使用した溶解バッファ中、１：３のモル比で混合し、室温で１５分間、プレインキュベートして、ｓｇＲＮＡをゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９と結合させた。５×１０^５のヤロウイア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を、ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ調製物に、ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９の最終濃度が１μＭ、２．５μＭまたは５μＭになるように混合した。また、陰性対照として、細胞を最終濃度５μＭのゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９単独（ＲＮＡ構成成分としてのｓｇＲＮＡを含まない）と混合した。全ての細胞−Ｃａｓ９調製物を振盪（２２０ｒｐｍ）しながら３０℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を１０００倍および１００００倍に順次希釈した。一連の各希釈液（１００μＬ）をアルギニンを欠いた完全培地（ＣＭ−Ａｒｇ）上に入れ、３０℃で４８時間回復させた。

【0289】

１０^−３希釈プレートのコロニーを計数し、播かれた細胞総数を求めた。レプリカプレーティング技術によって、カナバニン（６０μｇ／ｍＬ）を含むＣＭ−Ａｒｇプレートにコロニーを移した。カナバニン耐性コロニーの数を計数し、（カナバニンを含まないプレートからの）コロニー総数で除して、各例の変異頻度を求めた。コロニーは３０℃で４８時間増殖させた。細胞のゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体との接触により、全コロニーの約２％〜１０％の頻度で、カナバニンに耐性のコロニーを得た（図８）。このカナバニン耐性は、Ｃａｎ１遺伝子コード配列中の予測されたＣａｓ９切断部位／Ｃａｓ９切断部位近傍でのｉｎｄｅｌ形成によるＣａｎ１の欠失によるものと考えられる。しかしながら、細胞のゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９単独（ｓｇＲＮＡを含まない）との接触では、カナバニンに耐性コロニーは得られず（図８）、実験細胞におけるカナバニン耐性が、ＣＰＰ−Ｃａｓ９タンパク質に与えられたｓｇＲＮＡに基づく特異性に依存することを示した。酵母細胞の特性を考慮すると、特異的なＤＮＡターゲティングを媒介するためには、おそらく細胞壁および細胞膜の両構造を横断する必要があったであろう。

【0290】

このように、適切なｓｇＲＮＡを複合したＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質（すなわち、ＲＧＥＮ−ＣＰＰ複合体の一例）は、酵母細胞に侵入（細胞壁および細胞膜を横断）し、その中で特定のＤＮＡ配列を標的とすることができる。この例のＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質は配列番号３９（ゼブラＣＰＰ−Ｃａｓ９）を含むが、例えば、配列番号４０、４１または４２を含むＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質もまた、ＲＮＡ構成要素としての適切なｓｇＲＮＡに結合した場合に、細胞侵入活性、および細胞での特異的ＤＮＡターゲティング活性を有すると考えられる。

【0291】

実施例５
植物細胞へのＣＰＰ促進Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡの輸送、および植物細胞内での標的ＤＮＡの切断
ダイズ細胞へのＣＰＰ促進タンパク質輸送を、ＣＰＰに融合したＤＳ−ＲＥＤ 蛍光タンパク質を含むダイズカルス細胞をインキュベートすることによって試験した。蛍光シグナルがＣＰＰ−ＤＳ−ＲＥＤ処理物では予期されるが、ＤＳ−ＲＥＤタンパク質単独でインキュベートした対照では予期されない。このようにして各種のＣＰＰを試験することにより、積み荷タンパク質の植物細胞の透過および輸送に最も効果的なＣＰＰの特定を進めることができる。試験することができるＣＰＰの例としては、以下のものが挙げられる：
（ｉ）エプスタイン・バールウイルスのゼブラトランスアクチベータタンパク質由来のＣＰＰ、
（ｉｉ）６個以上の隣接するアルギニン残基を有するＣＰＰ、
（ｉｉｉ）トランスポータン−１０（ＴＰ１０）ＣＰＰ、
（ｉｖ）血管内皮カドヘリンタンパク質由来のＣＰＰ、または
（ｖｉ）合成ノナ−アルギニンＣＰＰ、ヒスチジンリッチノナ−アルギニンＣＰＰおよびＰａｓノナ−アルギニンＣＰＰからなる群から選択されるＣＰＰ。合成ノナ−アルギニンＣＰＰ、ヒスチジンリッチノナ−アルギニンＣＰＰおよびＰａｓノナ−アルギニンＣＰＰの例は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２）：７１−８８，ＨＩＫＡＲＩ Ｌｔｄ）に開示されている。

【0292】

インビトロで翻訳されたＣａｓ９タンパク質および合成ｓｇＲＮＡは、それら自身で、または融合体（例えば、上記ＣＰＰ−ＤＳ−ＲＥＤ）でＣＰＰと混合し、ダイズカルスとインキュベートして、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを細胞へ輸送することができるか否かを試験することができる。一旦細胞内に入ると、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体は、ｓｇＲＮＡターゲティング配列によって特定されるゲノム標的を認識して、ＤＮＡ二本鎖を切断（ＤＳＢ）することができる。細胞機構による自然修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による変異、または、適切なドナーＤＮＡが存在するなら、相同組み換えによる遺伝子の組み込みをもたらし得る。ＣＰＰはまた、潜在的により高い効率を得るために、Ｃａｓ９タンパク質に共有結合させることができる。ダイズ細胞へのＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡの輸送の成功、ひいてはＣＰＰ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の植物細胞壁および植物細胞膜を横断した運搬の成功は、例えば、ＰＣＲ分析により、特定の標的部位での変異または遺伝子組み込みを検出することによって確認することができる。

【0293】

実施例６
エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質の発現および精製
所与の細胞透過ペプチドの特定の細胞型への侵入能力を迅速に評価するために、ＣＰＰとｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質（配列番号８５）との融合体を生成し、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、精製した。ＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質融合体は、所与のＣＰＰによる所与の細胞型への積み荷輸送の迅速な評価を可能にするツールである。これにより、細胞の蛍光を顕微鏡またはフローサイトメトリにより分析して評価することによって、積み荷の迅速かつハイスループットな輸送を最大にする、種、細胞型、または株特異性ＣＰＰ分子を選択することが可能になる。

【0294】

エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ遺伝子（配列番号８６）を合成し（ＩＤＴ ＤＮＡ）、ｐＢＡＤ／ＨｉｓＢ（配列番号８７）のＮｃｏＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ部位にクローニングして、ｐＲＦ１６１（配列番号８８）を得た。エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ遺伝子は、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩを有するプラスミドの消化が、種々のｈｉｓタグ−ＣＰＰ配列によりｈｉｓタグを置換させてｈｉｓタグ−ＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合発現プラスミドを形成するように、内在のＲｃｏＲＩを含んだ。種々のｈｉｓタグ−ＣＰＰ融合体；ＴＡＴ（配列番号８９）、ＴＬＭ（配列番号９０）、ＭＰＧ１（配列番号９１）、ｐｅｐ１（配列番号９２）、およびＣＦＦＫＤＥＬ（配列番号９３）を、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）用にコドン最適化し、インフレーム５’ＮｃｏＩおよび３’ＥｃｏＲＩ部位（それぞれ、配列番号９４〜９８）にフランキングし、標準的な技術によって、ｐＲＦ１６１（配列番号８８）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ｈｉｓタグ配列を対応するｈｉｓタグ−ＣＰＰ融合体で置き換え、プラスミドｐＲＦ２２４（ｈｉｓ−ＴＡＴ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号９９）、ｐＲＦ２１４（ｈｉｓ−ＴＬＭ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１００）、ｐＲＦ２１３（ｈｉｓ−ＭＰＧ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１０１）、ｐＲＦ２１７（ｈｉｓ−ｐｅｐ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１０２）、ｐＲＦ２１６（ｈｉｓ−ＣＦＦＫＤＥＬ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１０３）を生成した。挿入された断片の配列を、標準的な配列決定法およびｏｌｉｇｏ ３６（配列番号１０４）を用いて確認した。

【0295】

エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）コドン最適化Ｈｉｓ−ゼブラ（配列番号１０５）、Ｈｉｓ−ｔｐ１０（配列番号１０６）、およびＨｉｓ−ｐＶＥＣ（配列番号１０７）を、それぞれｐＲＦ１４４（配列番号１０８）、ｐＲＦ１６２（配列番号１０９）、およびｐＲＦ１４６（配列番号１１０）から、標準的なＰＣＲ技術によりｏｌｉｇｏ ３６（配列番号１０４）およびｏｌｉｇｏ １５３（配列番号１１１）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をｐＲＦ１６１（配列番号８８）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＲＦ１８６（ｈｉｓ−ゼブラ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１１２）、ｐＲＦ１９２（ｈｉｓ−ｔｐ１０−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１１３）、およびｐＲＦ１９０（ｈｉｓ−ｐＶＥＣ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ 配列番号１１４）を得た。配列をｏｌｉｇｏ ３６（配列番号１０４）を用いて確認した。

【0296】

Ｈｉｓタグ付きＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質を標準的な技術によって発現させた。要約すると、細胞を、１２５ｍｌフラスコ中の１０ｍｌのＺＹＭ−５０５（１％Ｎ−Ｚアミン、０．５％酵母エキス、５％グリセロール、１．０％デキストロース、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１×微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、５×１０^−５％チアミン、２ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）、または溶原培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．４％デキストロース）で、３７℃および２２０ＲＰＭで１２〜１６時間予備培養した。予備培養物を、５００ｍｌのＺＹＭ−５０５２（１％Ｎ−Ｚアミン、０．５％酵母エキス、５％グリセロール、０．５％デキストロース、２％Ｌ−アラビノース、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１×微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、５×１０^−５％チアミン、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で１：１０００（ＺＹＭ−５０５）に希釈、または５００ｍｌの２ｘＹＴ溶原培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で１：１００（溶解培地）に希釈し、２．９Ｌのフェルンバッハフラスコ内で、３７℃、２２０ＲＰＭで、ＯＤ_６００が約０．５になるまで増殖させた。タンパク質を発現させるため、２ｘＹＴ培養物にＬ−アラビノースを最終濃度が０．１％になるまで添加し、かつ全ての培養物を１８℃、２２０ＲＰＭに２０〜３０時間シフトした。５０００ＲＰＭ、１０分間で細胞を集め、使用した培地を棄て、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。

【0297】

細胞ペレットを解凍し、変性溶解バッファ（５０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、２０ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、フレンチプレッシャーセルに１６，０００ＰＳＩで２回通して溶解させた。固形沈殿物を、１０，０００ｇ、４℃、１５分間の遠心分離により固形沈殿物を上清から除き、精製した抽出物２０μｌを、２０μｌの２×Ｌａｅｍｍｌｉバッファ（４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１００ｍＭ ＤＴＴ、０．００４％ブロモフェノールブルー、１２５ｍＭトリス ｐＨ６．８）と混合し、９５℃まで５分間加熱し、−２０℃で凍結させて、分析に備えた。精製した抽出物を、６ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）ニッケル−ＮＴＡ−アガローススラリーと１時間、室温で混合した。２０００ＲＰＭ、５分間で混合物からビーズをペレット化した。上清を除き、精製抽出物について２０μｌのサンプルを採取した。ペレット化したビーズを１０ｍｌの変性溶解バッファに再懸濁し、グラビティフロークロマトグラフィカラムに適用した。液体を流出させ、詰めたビーズ床を残した。ビーズ床を、洗浄バッファ１（５０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素 ２０ｍＭイミダゾール）および洗浄バッファ２（５０ｍＭトリス ｐＨ ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）をイナル割合で使用した一連の洗浄液で洗浄して、変性剤（尿素）の濃度を低下させ、ＮａＣｌの濃度を上げて、カラムにタンパク質をリフォールディングした。要約すると、カラムを、（Ｂｕｆｆｅｒ１：Ｂｕｆｆｅｒ２）で、１：０（８Ｍ尿素 １５０ｍＭ ＮａＣｌ）を１０ｍｌ、７：１（７Ｍ尿素、１９４ｍＭ ＮａＣｌ）を１０ｍｌ、３：１（６Ｍ尿素、２３８ｍＭ ＮａＣｌ）を１０ｍｌ、５：３（５Ｍ尿素、２８１ｍＭ ＮａＣｌ）を１０ｍｌ、１：１（４Ｍ尿素、３２５ｍＭ ＮａＣｌ）を１０ｍｌ、３：５（３Ｍ尿素、３６９ｍＭ ＮａＣｌ）を２０ｍｌ、１：３（２Ｍ尿素、４１３ｍＭ ＮａＣｌ）を２０ｍｌ、３：１３（１．５Ｍ尿素、４３４ｍＭ ＮａＣｌ）を２０ｍｌ、１：５（１Ｍ尿素、４５６ｍＭ ＮａＣｌ）を２０ｍｌ、１：１５（０．５Ｍ尿素、４７８ｍＭ ＮａＣｌ）を２０ｍｌ、および ０：１（０Ｍ尿素、５００ｍＭ ＮａＣｌ）を３０ｍｌで洗浄した。タンパク質を、１０×１ｍｌ画分で、ネイティブ溶出バッファ（５０ｍＭトリス ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール）により溶出した。溶出されたｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓまたはＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質を含む画分は赤色を呈していた。赤色の画分を集め、ＭＷＣＯが１０，０００の再生セルロース透析膜で、１０００倍体積の容積バッファ（５０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１０％グリセロール）に対して、一晩、室温で透析した。タンパク質溶液を透析膜から除去し、０．２２μＭの Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）膜を用いてフィルター滅菌した。精製細胞抽出物について、２０μｌのタンパク質溶液を処理した。

【0298】

Ｌａｅｍｍｅｌｉバッファで精製中に採取したサンプルを９５℃まで５分間加熱し、１２．５％ＰＡＧＥゲル上にロードした。ゲル上を一定の２００ボルトで１時間ランさせ、ブルー染料のみで染色した。タグ付きのＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質の精製での代表的なＰＡＧＥゲルの一例を図９に示す。各精製タンパク質の全タンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭクーマシープラスアッセイにより、ウシ血清アルブミンを基準として用いて測定した。各精製ＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合体の濃度を表３に示す。

【0299】

【表8】

【0300】

実施例７
エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の付加的ＣＰＰ−Ｃａｓ９タンパク質の発現および精製
異なる細胞型へのＣａｓ９の輸送は、異なるＣＰＰのタグを付したＣａｓ９を必要とし得る。様々なＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質を単離するために、異なるＣＰＰをエケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターにおいてＣａｓ９に融合させた。Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体のＣＰＰを媒介とした細胞への輸送に使用するため、これらのタンパク質を発現させ、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から精製した。

【0301】

Ｈｉｓ−ＣＦＦＫＤＥＬ−Ｃａｓ９（配列番号１１５）融合発現カセットおよびＨｉｓ−ＭＰＧ１−Ｃａｓ９（配列番号１１６）融合発現カセットを作るため、標準的な技術を使用して、ｐＲＦ２１６（ＣＦＦＫＤＥＬ 配列番号１０３）またはｒｐＲＦ２１３（ＭＰＧ１ 配列番号１０１）のＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ 断片を、Ｃａｓ９タンパク質発現プラスミドｐＲＦ４８（配列番号１１７）の同じ部位にクローニングして、それぞれプラスミドｐＲＦ２４３（ｈｉｓ−ＣＦＦＫＤＥＬ−Ｃａｓ９ 配列番号１１８）およびプラスミドｐＲＦ２３８（ｈｉｓ−ＭＰＧ１−Ｃａｓ９、配列番号１１９）を生成した。ＭＰＧ１−Ｃａｓ９融合カセットまたはＣＦＦＫＤＥＬ−Ｃａｓ９融合カセットの正確な構築を、サンガー法シークエンシングによりｏｌｉｇｏ３６（配列番号１０４）を用いて確認した。

【0302】

Ｈｉｓタグ付きＣＰＰ−Ｃａｓ９融合タンパク質を標準的な技術によって発現させた。要約すると、細胞を、１２５ｍｌフラスコ中の１０ｍｌのＺＹＭ−５０５（１％Ｎ−Ｚアミン、０．５％酵母エキス、５％グリセロール、１．０％デキストロース、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１×微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、５×１０^−５％チアミン、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）、または溶原培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．４％デキストロース）で、３７℃および２２０ＲＰＭで１２〜１６時間予備培養した。予備培養物を、５００ｍｌのＺＹＭ−５０５２（１％Ｎ−Ｚアミン、０．５％酵母エキス、５％グリセロール、０．５％デキストロース、２％Ｌ−アラビノース、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、５０ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ、５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、１×微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、５×１０^−５％チアミン、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で１：１０００（ＺＹＭ−５０５）に希釈、または５００ｍｌの２ｘＹＴ溶原培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で１：１００（溶解培地）に希釈し、２．９Ｌのフェルンバッハフラスコ内で、３７℃、２２０ＲＰＭで、ＯＤ_６００が約０．５になるまで増殖させた。タンパク質を発現させるため、２ｘＹＴ培養物にＬ−アラビノースを最終濃度が０．１％になるまで添加し、かつ全ての培養物を１８℃、２２０ＲＰＭに２０〜３０時間シフトした。５０００ＲＰＭ、１０分間で細胞を集め、使用した培地を棄て、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。タンパク質を実施例１に記載のように精製した。クーマシープラスアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭ）により測定した精製ＣＰＰ−Ｃａｓ９タンパク質の最終濃度を表４に列挙する。

【0303】

【表9】

【0304】

実施例８
エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ媒介遺伝子ターゲティング
この実施例は、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の、ｓｇＲＮＡを有するＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体により処理により、エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子がターゲティングされるのを示す。ＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡの細胞への侵入により、ｇａｌＫ遺伝子でターゲティングおよび切断が起こり、誤りがちなＤＮＡ修復メカニズムにより遺伝子が不活性化する。これはガラクトースに対する耐性として表現型的に監視することができる。この方法は、ＣＰＰ媒介輸送による細胞へのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ積み荷の輸送に依存する。

【0305】

エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇａｌＫ遺伝子（配列番号１２０）は、糖ガラクトースの存在下、ｇａｌＥ突然変異体に見られるガラクトース感受性表現型に関与している。ガラクトースが細胞に入ると、ｇａｌＫ遺伝子（配列番号１２０）の産物であるガラクトキナーゼによってリン酸化される。リン酸ガラクトースは細胞に毒性がある。野生型細胞では、リン酸ガラクトースはｇａｌｅ（配列番号１２１）遺伝子およびｇａｌＴ（配列番号１２２）遺伝子の産物によって代謝され、炭素源として使用される。ｇａｌＥまたはｇａｌＴ機能喪失型突然変異体では、リン酸ガラクトースが蓄積し、細胞を死に至らしめる。したがって、ｇａｌＫ遺伝子の機能喪失型突然変異体はガラクトースの存在下でコロニーを形成するため、ｇａｌＥ変異体のバックグラウンドにおいて選択することができる。

【0306】

ｇａｌＫ２−１標的部位（配列番号１３４）でｇａｌＫ遺伝子（配列番号１２０）を標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１３５）を生成するため、インビトロ転写鋳型（配列番号１３１）を生成した。まず、標準的なＰＣＲ反応で、ＣＥＲドメイン（配列番号１２３）をコードするＤＮＡのＰＣＲ産物を、ｐＲＦ２９１（配列番号１２５）から、ＣＥＲフォワードプライマー（配列番号１２６）およびユニバーサルリバースプライマー（配列番号１２７）を用いて増幅した（配列番号１２４）。ＣＥＲコードＰＣＲ産物（配列番号１２４）をＺｙｍｏ^ＴＭｃｌｅａｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ２５カラムを用いて精製し、３５μｌのｄｄＨ_２Ｏに溶出した。ｓｇＲＮＡインビトロ転写鋳型の増幅に、４つのプライマー、Ｔ７プロモータを含むユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１２８）、Ｔ７プロモータの一部および標的部位の一部を含む標的特異性フォワードプライマー（配列番号１２９）、標的部位およびＣＥＲドメインとの重複部の一部を含む標的リバースプライマー（配列番号１３０）、ならびにユニバーサルリバースプライマー（配列番号１２７）を含むマルチプレックスＰＣＲを使用した。１５ｎＭ ＣＥＲドメインＰＣＲ産物（配列番号１２４）、それぞれ１μＭのユニバーサルフォワードプライマー（配列番号１２８）およびユニバーサルリバースプライマー（配列番号１２７）、ならびにそれぞれ３００ｎＭの標的フォワードプライマー（配列番号１２９）および標的リバースプライマー（配列番号１３０）を含むＰｈｕｓｉｏｎ ｆｌａｓｈ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを使用して、ＰＣＲ反応を行った。標準的な反応に関して、ＰＣＲ反応を循環させた。ｓｇＲＮＡインビトロ転写鋳型（配列番号１３１）を、Ｚｙｍｏ^ＴＭｃｌｅａｎ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ２５カラムを用いて精製し、３５μｌのｄｄＨ_２Ｏに溶出した。ｓｇＲＮＡインビトロ転写鋳型（配列番号１３１）は、Ｔ７プロモータ（配列番号１３２）、可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１３３）、およびＣＥＲドメインをコードするＤＮＡ（配列番号１２５）を含有した。ｇａｌＫ２−１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１３５）を生成するインビトロ転写反応を実施例２に記載のようにして行った。

【0307】

ｇａｌＥを欠失したエケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、溶原培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮＡＣｌ）で、３７℃、２２０ＲＰＭで一晩増殖させることによって、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ核タンパク質複合体のＣＰＰ輸送を行った。培養物を新しい溶原培地で１：１００に希釈し、３７℃、２２０ＲＰＭで２時間増殖させて、指数増殖期の細胞を得た。５０μｌ体積中、１０μＭのｇａｌＫ２−１ ｓｇＲＮＡ（配列番号１３５）の存在下または非存在下、ＣＰＰ−Ｃａｓ９（ｐｖＥＣ−Ｃａｓ９（配列番号１４４）、ゼブラ−Ｃａｓ９（配列番号１４３）、ＭＰＧ１−Ｃａｓ９（配列番号１１６）、ＣＦＦＫＤＥＬ−Ｃａｓ９（配列番号１１５））を、１０μＭの最終濃度にて、室温で３０分間インキュベートした。この処理後、１．２ｍｌの細胞を、３０００ＲＰＭ、３分間の条件でペレット化し、上清を棄て、細胞を、２×ヌクレアーゼバッファ（２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ｐＨ７．９）を含有する６００μｌのＬＢに再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁液を、各反応液、ならびにｇＲＮＡのみの対照および処理なしに混合した。試料を３７℃、２２０ＲＰＭで４時間インキュベートした。処理終了時の生細胞数を計数するため、試料の１０^−３、１０^−４および１０^−５希釈液１００μｌを溶原培地プレート上にプレーティングし、反応液の残りを溶原培地プレート上にプレーティングして、一晩３７℃でインキュベートした。生細胞を１０^−５希釈液で計数して、試料溶原培地プレートにプレーティングされた生存コロニー単位（ＣＦＵ）の数を決定した。試料プレートを、標準的な技術によって、０．２％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび０．２％（ｗ／ｖ）ガラクトースを炭素源として含有する１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ ａｇａｒで固化した最小Ａ培地（１ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１０．５ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ クエン酸ナトリウム・２Ｈ_２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５×１０^−５％チアミン）にレプリカプレーティングした。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、その後、コロニーの形成を計数した。ガラクトースを含有するプレート上のｇａｌＥ株の各ＣＦＵは、ｇａｌＫ遺伝子の遺伝子不活性化事象を示す。レプリカプレーティングの結果を表５に示す。

【0308】

【表10】

【0309】

エケリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体による処理により、いくつかの事例では、ｇａｌＫ不活性化の頻度が、未処理の細胞のバックグラウンドの約４倍に高まった。この上昇は、ＣＰＰ−Ｃａｓ９のみ、またはｓｇＲＮＡのみでは見られず、このことは、ｇａｌＫ遺伝子の不活化の増大が、細胞に侵入して、ｇａｌＫ遺伝子のｇａｌＫ２−１標的部位でのＤＮＡの二本鎖切断をしたＣＰＰ−Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体によるものであることを示唆している。

【0310】

実施例９
古細菌細胞へのＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質の輸送
細胞透過ペプチドによる積み荷の古細菌への輸送を試験し、そして、細菌や真核生物の細胞壁（例えば、リン脂質）および細胞膜、ならびに明らかに古細菌である要素（例えば、Ｓ層）に類似した要素を含む、古細菌の細胞壁を横切るＣＰＰ候補を決定するために、古細菌をＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質融合体で処理した。このスクリーニングで同定されたＣＰＰは、他の積み荷（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体）の古細菌への輸送にも使用できるであろう。

【0311】

古細菌ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１９７００を、１．５％（ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ ａｇａｒで固化した培地２１３（２５０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、５ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２．５ｇ／Ｌトリプトン）上、３７℃で、コロニーが形成されるまで（４日）増殖させた。２５０ｍｌフラスコ中の５０ｍｌの培地２１３に植菌するために単一コロニーを使用した。培養物を、３７℃、２２０ＲＰＭで、ＯＤ_６００が、指数増殖期を示す約０．５に到達するまで増殖させた。１００μｌの細胞を、２４ウエルブロックにおいて、タンパク質なし、５μＭ ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号８５）、５μＭ ＭＰＧ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１３６）、５μＭ ｐＶＥＣ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１３７）、５μＭ ＣＦＦＫＤＥＬ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１３８）、５μＭ ＴＬＭ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１３９）５μＭ ｐｅｐ１−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１４１）または５μＭ ｔｐ１０ ｄｓＲＥＤ−ｅｘｐｒｅｓｓ（配列番号１４２）と混合した。混合物を３７℃、２２０ＲＰＭで、４時間インキュベートした。細胞を、トリプトンおよび酵母エキスを欠いた培地２１３で２回洗浄し、１００μｌのトリプトンおよび酵母エキスを欠いた培地２１３に再懸濁した。細胞を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ５ フローサイトメーターの赤色チャネルの蛍光で解析して、どのＣＰＰタグがｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ積み荷をハロバクテリウム・サリナルム（Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｕｍ）に輸送したかを調べた。未処理の細胞を使用して、フローサイトメトリーデータの非赤色細胞と赤色細胞の間の解析ゲートを、赤色ゲートに入る未処理の細胞が０．２％という偽陽性頻度を得るように作成した（表６）。

【0312】

【表11】

【0313】

古細菌へのｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ積み荷の輸送は、少なくとも３つの細胞透過ペプチド（ｐＶＥＣ、ＴＬＭ、ｔｐ１０）が、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質単独の５０倍の効率で、古細菌へタンパク質積み荷を輸送できることを示し、これにより、これらの３つのＣＰＰモチーフが他の積み荷（例えば、Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質複合体）の古細菌への輸送に使用することができることが示唆される。さらに、ＣＰＰモチーフは全細胞集団の１６％に積み荷を輸送しており、これにより、ＣＰＰによる古細菌へ積み荷輸送が効率的なプロセスであることが示唆される。

【0314】

実施例１０
真核細胞へのＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓタンパク質の輸送
異なる真核生物種へ積み荷を輸送する細胞透過ペプチドの能力を試験するために、３種、フィトフトーラ・カプシキ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ）（卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ））、セプトリ・トリチキ（Ｓｅｐｔｏｒｉ ｔｒｉｔｉｃｉ）（真菌類）およびボトゥリチス・キネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（真菌類）を種々のＣＰＰ−ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合体で処理した。ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ積み荷の輸送をＦＡＣＳ解析により種々のＣＰＰ部分で監視して、積み荷が輸送された細胞の割合を求めた。ＣＰＰはｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ積み荷をこれらの細胞に輸送することができ、このことは、ＣＰＰがこれらの分類の真核細胞に他の積み荷（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体）を輸送することができるであろうことを示唆している。

【0315】

フィトフトーラ・カプシキ（Ｐ．ｃａｐｓｉｃｉ）を、１．８％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒで固化したＶ８培地（２０％ Ｖ８ジュース、４．５ｇ／Ｌ ＣａＣＯ_３）上、２３℃、暗所で、３日間増殖させた。その後、プレートを、２３℃の明るい場所に、さらに７日間置いた。プレートを４℃で３０分間冷却した。水をプレートに撒き、表面を覆い、３０分間、室温でインキュベートした。液体を除き、遊走子を得た。遊走子を顕微鏡による分析で確認した。等体積の２×シスト化培地（４０ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、２００ｍｌ／Ｌ １０×ＳＯＣ塩［５．８４ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．８６ｇ／Ｌ ＫＣｌ、２０．３ｇ／Ｌ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、２４．６ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３６ｇ／Ｌ デキストロース］、３６．４ｇ／Ｌ ソルビトール、１．４７ｇ／Ｌ ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ）を遊走子に加え、静かに混合した。シスト化培地中の遊走子を２０分間室温でインキュベートした。シスト化を顕微鏡によって確認した。胞子をペレット化し、等体積のＹＭＡ培地（２ｇ／Ｌ 酵母エキス、４ｇ／Ｌ 麦芽エキス）に再懸濁し、血球計数器により計数した。遊走子をＹＭＡで３×１０^７胞子／ｍｌにまで希釈した。１００μｌの遊走子を含むＹＭＡを種々のｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質（新実施例５、表Ｎ１）と混合して、タンパク質の最終濃度を５μＭとした。混合物を２５℃、４００ＲＰＭで２時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ６．８）で２回洗浄し、最終体積２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）について、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質の摂取を フローサイトメトリーにより監視した（実施例９）。積み荷が首尾よく輸送された細胞の割合を、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ処理細胞に任意のゲートを、集団の０．１％が偽陽性赤色事象として記録されるよう（１：１０００細胞）ドローすることによって求めた。この処理の結果を表７に示す。ｐＶＥＣ、ｐｅｐ１およびｔｐ１０は、赤色細胞がｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ処理細胞単独の５．８倍、５．５倍および１．８倍あり、これらのＣＰＰ部が卵菌（Ｏｏｍｙｃｅｔｅ）への他の積み荷（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体）を輸送する候補になる得ることを示唆している。

【0316】

【表12】

【0317】

ボトゥリチス・キネレア（Ｂ．ｃｉｎｅｒｅａ）を、１．８％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒで固化したＰＤＡ培地（２４ｇ／Ｌ ポテトデキストロースブロス）上、暗所で、５〜１０日間増殖させた。滅菌プラスチックスプレッダーで分生子を水に取り、２層のチーズクロスで濾過した。分生子を血球計数器で計数し、ＹＭＡ培地に１ｍｌ当たり３×１０^７個の分生子が含まれるように希釈した。分生子を含むＹＭＡ１００μｌを種々のｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質（新実施例５、表Ｎ１）と混合して、タンパク質の最終濃度を５μＭとした。混合物を２５℃、４００ＲＰＭで２時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ６．８）で２回洗浄し、最終体積２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）について、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質の摂取を フローサイトメトリーにより監視した（実施例８）。積み荷が首尾よく輸送された細胞の割合を、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ処理細胞に任意のゲートを、集団の０．１％が偽陽性赤色事象として記録されるよう（１：１０００細胞）ドローすることによって求めた。この処理の結果を表８に示す。

【0318】

【表13】

【0319】

セプトリ・トリチキ（Ｓ．ｔｒｉｔｉｃｉ）を、１．８％Ｂａｃｔｏ ａｇａｒで固化したＹＭＡ培地上、２３℃、明るい所で増殖させた。５〜１０日後、滅菌プラスチックスプレッダーおよび水で分生子を採取した。分生子を血球計数器で計数し、ＹＭＡ培地に３×１０^７個の分生子が含まれるように希釈した。分生子を含むＹＭＡ１００μｌを種々のｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質（新実施例５、表Ｎ１）と混合して、タンパク質の最終濃度を５μＭとした。混合物を２５℃、４００ＲＰＭで２時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ６．８）で２回洗浄し、最終体積２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｉｕｍ）について、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質の摂取をフローサイトメトリーにより監視した（実施例９）。積み荷が首尾よく輸送された細胞の割合を、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ処理細胞に任意のゲートを、集団の０．１％が偽陽性赤色事象として記録されるよう（１：１０００細胞）ドローすることによって求めた。この処理の結果を表９に示す。ｐＶＥＣ、ｐｅｐ１およびｔｐ１０は、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ２５の輸送を、ｄｓＲＥＤｅｘｐｒｅｓｓ単独の場合よりそれぞれ４倍、３倍および５倍上昇させた。このことは、これらのＣＰＰが真菌類への他の積み荷（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体）を輸送する良好な候補になるであろうことを示唆している。

【0320】

【表14】

【0321】

実施例１１
７つの腸内細菌への７つのＣＰＰｓ−ｄｓＲＥＤおよび２つのＣＰＰｓ−ｔａｇＲＦＰの輸送
この実施例では、２つの積み荷タンパク質、ｄｓＲＥＤおよびｔａｇＲＦＰの７つの腸内細菌（これらの宿主生理機能に対する有益な効果が明らかになっている）へのＣＰＰの輸送効率を試験した。

【0322】

嫌気性テント（８０％Ｎ_２、１５％ＣＯ_２、および５％Ｈ_２）内で、細菌細胞をロータリーシェーカー（１５０ｒｐｍ）により適切な培地（表１０を参照）で、３７℃で一晩増殖させた。分析のために、１×１０^８個の細菌細胞を、最終濃度が５ｕＭのＣＰＰｓ−ｄｓＲＥＤおよびＣＰＰｓ−ｔａｇＲＦＰタンパク質を、９６ウエルプレートで混合し、３７℃で２時間増殖させた。細胞におけるｄｓＲＥＤおよびＲＦＰ蛍光シグナルを測定するために、遠心分離（３，５００×ｇ、４℃、２０分）により細菌細胞を得、リン酸緩衝生理食塩水（１ウエル当たり１００μ）で２回洗浄した。バンド幅１０ｎｍの５５４ｎｍの励起および５８６ｎｍの放出フィルターを備えたＴｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で蛍光強度を定量した。生の蛍光値を未処理の細胞の値（バックグラウンド）から差し引いた。蛍光強度値７０００を細胞内のＣＰＰの輸送の最小カットオフとした。

【0323】

【表15】

【0324】

表１１に示すように、これらの結果は、ＭＰＧ、ｐＶＥＣ、ＴＬＭ、ゼブラおよびｐｅｐ１を含む５つのＣＰＰが、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）門に属する嫌気性腸内細菌へ効率的に輸送し、それにより、ＣＰＰがこれらの細胞膜を横断することができることを示すことを示している。

【0325】

【表16】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】