特表 2017-533255 ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体、ワクチンの組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-533255(P2017-533255A)

(43)【公表日】2017年11月9日

(54)【発明の名称】ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体、ワクチンの組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20171013BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20171013BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171013BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20171013BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20171013BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20171013BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20171013BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171013BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20171013BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 T

   A61K39/00 H

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 E

   A61P35/00

   A61P37/04

   A61P17/00

   A61P11/00

   A61K35/17 Z

   A61P43/00 121

   A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2017-531443(P2017-531443)

(86)(22)【出願日】2015年8月28日

(85)【翻訳文提出日】2017年3月23日

(86)【国際出願番号】NL2015050600

(87)【国際公開番号】WO2016032334

(87)【国際公開日】20160303

(31)【優先権主張番号】14182708.9

(32)【優先日】2014年8月28日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517065965

【氏名又は名称】アカデミス・ジーケンハイス・ライデン・ハー・オー・デー・エヌ・エルユーエムセー

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＳＣＨ ＺＩＥＫＥＮＨＵＩＳ ＬＥＩＤＥＮ Ｈ．Ｏ．Ｄ．Ｎ． ＬＵＭＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】シュールト・ファン・デル・ブルフ

(72)【発明者】

【氏名】トルバルト・ファン・ハール

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA591

4C084ZA891

4C084ZB021

4C084ZB091

4C084ZB261

4C084ZC751

4C085AA03

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB36

4C085CC01

4C085CC23

4C085EE03

4C087AA01

4C087BB37

4C087CA04

4C087MA02

4C087NA05

4C087ZA59

4C087ZA89

4C087ZB02

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体、ワクチンの組み合わせ。本開示は、特に、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体との組み合わせであって、それを必要とする被験者の治療において使用するためのものであり、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、組み合わせを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせであって、それを必要とする被験者の治療において使用するためのものであり、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、組み合わせ。

【請求項2】

前記免疫原は、腫瘍抗原である、請求項１に記載の組み合わせ。

【請求項3】

前記免疫原は、腫瘍特異的抗原である、請求項１または２に記載の組み合わせ。

【請求項4】

前記ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂを発現するＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に結合すると、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂのシグナル伝達を減少させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項5】

前記ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂを発現するＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞へのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２ＢリガンドＨＬＡ−Ｅの結合を遮断する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項6】

前記ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ヒトもしくはヒト化抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分、好ましくはサブクラスＩｇＧ４の抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項7】

ＣＬＴＡ４結合抗体、ＰＤ−１結合抗体；ＰＤ−Ｌ１結合抗体；ＬＡＧ−３結合抗体；ＶＩＳＴＡ抗体およびＴＩＭ３結合抗体から選択されるか、または前記抗体のＣＴＬＡ４結合、ＰＤ−Ｌ１結合、ＬＡＧ−３結合、ＶＩＳＴＡ結合もしくはＴＩＭ３結合部分から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項8】

前記被験者は、癌患者である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項9】

前記被験者の癌は、癌、好ましくは卵巣癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、前立腺癌、ウイルス誘発癌および結腸直腸癌から選択される固形癌である、請求項８に記載の組み合わせ。

【請求項10】

前記被験者には、免疫細胞移植片がさらに提供される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組み合わせ。

【請求項11】

ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを含む医薬組成物であって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、医薬組成物。

【請求項12】

前記免疫原は、腫瘍抗原である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

ワクチン組成物とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分を含む組成物とを含むパーツのキットであって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、パーツのキット。

【請求項14】

移植用の細胞産物を含有する免疫細胞の製造における、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分と免疫原との使用。

【請求項15】

被験者における免疫応答を刺激するための方法であって、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを、それを必要とする前記被験者に投与する工程を含み、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含み、前記被験者には、好ましくは免疫細胞移植片がさらに提供される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法の分野に関する。本発明は、特に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂアンタゴニスト、好ましくは免疫応答を刺激するためにワクチンまたは免疫原と組み合わせたアンタゴニストＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体に関する。本発明は、特に、ただし排他的にではなく、癌の治療において有用である。

【背景技術】

【0002】

腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対する免疫チェックポイント遮断抗体は、末期癌患者において有意な臨床応答を生じさせてきた。ＣＴＬＡ−４は、負のフィードバックループの証拠として、いくつかのＴ細胞サブセット上および活性化細胞上で発現する。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、画期的に新しい治療薬の一例を表す。抗ＰＤ１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた臨床試験も臨床結果を証明している。

【0003】

本発明において、本発明者らは、活性化ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現することを観察した。そのリガンドは、保存されたＨＬＡ−Ｅ分子である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの固有の特徴は、いずれも直接的腫瘍管理に関係しているＣＴＬおよびＮＫ細胞上の負の調節因子であることである。本発明者らはさらに、腫瘍によるＨＬＡ−Ｅ発現が、他の場合には良好な生存率を示すＣＤ８細胞浸潤性腫瘍における不良な生存率と相関することも観察した。

【0004】

実験の項において、本発明者らは、特に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの遮断が腫瘍に対する腫瘍内ＣＴＬおよびＮＫ細胞による良好な応答を可能にする証拠を提供する。高いＮＫＧ２Ａ陽性ＣＴＬ数を有するＶＩＮ患者は、より良好な無増悪生存率を有する。頭頸部癌、卵巣癌および子宮頸癌の腫瘍浸潤性ＣＴＬの５０％までがＮＫＧ２Ａを発現する。これらのＮＫＧ２Ａ陽性ＣＴＬのおよそ３０％は、他の共阻害性受容体ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１を発現しない。腫瘍内のＮＫＧ２Ａ陽性ＣＴＬの頻度は、治療的ワクチン接種後に増加する。腫瘍細胞上のＮＫＧ２Ａリガンドの発現レベルは、治療的ワクチン接種後に増加する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせであって、それを必要とする被験者の治療において使用するためのものであり、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、組み合わせを提供する。

【0006】

本発明はさらに、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを含む医薬組成物であって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、医薬組成物を提供する。

【0007】

本発明はさらに、ワクチン組成物とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分を含む組成物とを含むパーツのキットであって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、パーツのキットを提供する。

【0008】

さらに、移植用の細胞産物を含有する免疫細胞の製造における、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分と免疫原との使用も提供される。

【0009】

さらに、細胞産物を含有する免疫細胞を調製するための方法であって、免疫原とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との存在下でＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含み、前記培養する工程後にＴ細胞および／またはＮＫ細胞を収集する工程をさらに含む、方法も提供される。

【0010】

本発明はさらに、被験者における免疫応答を刺激するための方法であって、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを、それを必要とする被験者に投与する工程を含み、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、方法を提供する。

【0011】

本発明は、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせであって、それを必要とする被験者の治療において使用するためのものであり、前記ワクチンは、抗腫瘍リンパ球；抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原；前記免疫原をコードする核酸分子またはそれらの組み合わせを含む、組み合わせを提供する。

【0012】

本発明はさらに、癌を有する個人を治療するための方法であって、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを、それを必要とする個人に投与する工程を含み、そのワクチンは、抗腫瘍リンパ球；抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原；前記免疫原をコードする核酸分子またはそれらの組み合わせを含む、方法を提供する。

【0013】

ワクチンは、タンパク質もしくはそのタンパク質をコードする核酸分子、炭水化物、脂質またはそれらの組み合わせなどの生体分子を含み、その生体分子および／またはその生体分子を含有する細胞に対する免疫応答を改善する調製物である。ワクチンは、必然的にではないが典型的には特定疾患に対する免疫を改善する。ワクチンは、典型的には、疾患を引き起こす病原菌、タンパク質、細胞またはそれらの部分に類似している、免疫原またはその免疫原をコードする核酸分子を含有する。免疫原は、身体の免疫機構が疾患を誘発する物質を異物として認識し、それを破壊してその記録を維持するように刺激するため、免疫系は、身体が後に遭遇するあらゆる同一疾患を誘発する物質をより容易に認識して破壊または不活性化することができる。

【0014】

予防用ワクチンおよび治療用ワクチンがある。用語「ワクチン」は、典型的には被験者に投与される、すなわち、アジュバント（存在する場合）、担体タンパク質（存在する場合）、安定剤または他の賦形剤を含む生成物を意味する。本発明において、用語「ワクチン」には上記の生成物が含まれるが、さらにまた本質的に、免疫原および／またはその免疫原をコードする核酸分子を含有する調製物も含まれる。本明細書で使用する用語「ワクチン」は、市販で入手できるワクチンに限定されない。本明細書で使用する用語「ワクチン」は、その調製物が疾患を予防する、または疾患を治癒させることに有効であることを意味するものではない。用語「ワクチン」には、免疫原および／またはその免疫原をコードする核酸分子を含有する全ての調製物が含まれる。

【0015】

抗原は、免疫系の構成成分（抗体、リンパ球）によって特異的に結合され得るあらゆる物質である。全ての抗原は特定のリンパ球または抗体によって認識されるという事実にもかかわらず、あらゆる抗原が免疫応答を惹起するとは限らない。免疫応答を誘導できるそれらの抗原は免疫原性であると言われ、本発明では免疫原と呼ばれる。

【0016】

免疫原は、免疫寛容ではなくむしろ体液媒介性および／または細胞媒介性免疫応答を誘導できるあらゆる抗原である。この能力は免疫原性と呼ばれる。免疫原は、投与されると被験者が免疫原に対する体液性または細胞性応答を発現する場合に、被験者における抗原に対する免疫応答を誘発すると言われる。

【0017】

用語「免疫原」は、本明細書では、免疫応答を誘導できる高分子担体および１つ以上のエピトープ（決定因子）から構成される完全抗原であると規定される。

【0018】

高分子担体および１つ以上のエピトープは、タンパク質などの単一分子中に含有されていてよく、細胞などの粒子、またはそれらの一部もしくは断片中に存在していてよい。エピトープは、さらに別個の担体に提供されてもよい。非限定的な例は、ハプテンである。ハプテンは、抗体によって結合され得るが免疫応答を誘発することはできない低分子量化合物である。その結果として、ハプテン自体は非免疫原性であり、それらはより大きい担体である免疫原性分子と結合するまで免疫応答を惹起することはできない。ハプテン−担体複合体は、遊離ハプテンとは異なり、免疫原として機能することができ、免疫応答を誘導することができる。

【0019】

本発明は、本明細書に記載した手段、方法および使用を提供し、このとき、用語「ワクチン」は、語句「免疫原または免疫原をコードする核酸分子」と置換される。

【0020】

ＮＫＧ２Ａ、Ｃ、ＤおよびＥと指名されたＮＫＧ２ファミリーの遺伝子は、最初はＮＫ細胞およびＴ細胞特異的転写産物が豊富なサブトラクティブライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。ＮＫＧ２Ａ遺伝子は、２つのアイソフォームＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｂをコードし、後者のＮＫＧ２Ｂにはステム領域が欠如している。ｃＤＮＡ配列の染色体マッピングおよび解析は、ＣＤ９４と同様に、ＮＫＧ２遺伝子がＮＫ複合体内で１２番染色体上に位置すること、およびこれらの遺伝子によってコードされたタンパク質がＣ型レクチンファミリーのメンバーであることを証明した。ＮＫＧ２Ａは、ＣＤ９４のパートナーである。ＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４は、ＮＫ細胞および他の免疫細胞の細胞表面上で発現するヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２ＢもＣＤ９４とのヘテロ二量体を形成する。ＣＤ９４架橋結合後の阻害シグナルの伝播は、ＮＫ細胞クローンによるＮＫＧ２Ａの発現と相関する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体およびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂヘテロ二量体は、おそらくＮＫＧ２Ａ／Ｂの細胞質ドメインによって媒介されるＮＫならびにその他のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂを発現する免疫細胞へ阻害シグナルを送達することができる（Ａ．Ｇ．Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌｕｍｅ １８５，ｐｐ：７９５−８００）。用語「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ」は、ヒトにおけるヘテロ二量体および他の哺乳動物種におけるオルトログのヘテロ二量体を意味する。特異的哺乳動物オルトログは、様々な特定の名称下で公知の可能性がある。本明細書で使用するこの用語は、そのようなオルトログを含む。ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体およびそのヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体に結合する抗体が好ましい。ヒトでは、ＣＤ９４は、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＤメンバー１としても公知である（ＫＬＲＤ１；ＵｎｉＧｅｎｅ １７７７９９６）。ＮＫＧ２Ａ／Ｂもキラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＣメンバー１として公知である（ＫＬＲＣ１；ＵｎｉＧｅｎｅ ９０３３２３）。用語「ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ」は、ヒトにおけるヘテロ二量体および他の哺乳動物種におけるオルトログのヘテロ二量体を意味する。特異的哺乳動物オルトログは、様々な特定の名称下で公知の可能性がある。本明細書で使用するこの用語は、そのようなオルトログを含む。ヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂヘテロ二量体およびヒトＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂヘテロ二量体に結合する抗体が好ましい。

【0021】

ＮＫＧ２Ａ／Ｂと言及する場合、その言及にはＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂまたはその両方が含まれる。

【0022】

ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂヘテロ二量体受容体の細胞外部分に結合する。抗体は、典型的にはその抗体の抗原結合部位を介して標的に結合する。抗原結合部位は、典型的には抗体の可変ドメインによって形成され、抗体の可変ドメイン内に存在する。可変ドメインは、抗原結合部位を含有する。抗原に結合する可変ドメインは、その抗原に結合する抗原結合部位を含む可変ドメインである。

【0023】

１つの実施形態では、本発明の抗体可変ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合部位は、結合ＶＨ／ＶＬ可変ドメイン内に存在してよいか、またはＶＨ領域内のみもしくはＶＬ領域内のみに存在してよい。抗原結合部位が可変ドメインの２つの領域のうちの１つ内にのみ存在する場合、対応する可変領域は結合可変領域のフォールディングおよび／または安定性に寄与できるが、抗原自体の結合には有意に寄与しない。

【0024】

本明細書で使用する「抗原結合」は、抗体のその抗原への典型的な結合能力を意味する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂに結合する抗体はＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂに結合するが、他の点では同一条件下で同一種のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ受容体またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｄ受容体に少なくとも１００分の１で結合する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体のエピトープは、典型的にはヘテロ二量体のＮＫＧ２Ａ部分上に存在する。そのエピトープは、部分的にはＣＤ９４上に存在する場合もある。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ抗体のエピトープは、典型的にはヘテロ二量体のＮＫＧ２Ｂ結合部分上に存在する。そのエピトープも部分的にＣＤ９４上に存在する場合がある。ＮＫＧ２Ａに結合する抗体はさらにＮＫＧ２Ｂに結合することができ、その逆もあり得る。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂが細胞表面受容体であることを考えると、この結合は、典型的にはこれらの受容体を発現する細胞上で評価される。本発明の抗体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂヘテロ二量体の細胞外部分に結合する。抗体の抗原への結合は、様々な方法で評価することができる。抗体を抗原（好ましくは抗原を発現する細胞）とともにインキュベートする１つの方法は、未結合抗体を（好ましくは洗浄工程によって）除去する工程および結合抗体に結合する標識抗体によって結合抗体を検出する工程である。

【0025】

抗体による抗原結合は、典型的には、これら２つの構造が抗体の無作為の非特異的接着とは対照的に、正確に（錠と鍵とに類似する相互作用で）結合することを可能にする抗体の相補領域と、抗原および可変ドメインの両方の特異的三次元構造とを通して媒介される。抗体は典型的には抗原のエピトープを認識するため、およびそのようなエピトープは他の化合物中にも同様に存在する場合があるため、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合する本発明による抗体は、そのような他の化合物が同一エピトープを含有する場合、他のタンパク質を同様に認識する可能性がある。そこで、用語「結合」は、抗体の同一エピトープを含有する別の１種以上のタンパク質への結合を排除しない。本発明に規定したＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体は、典型的には出生後の、好ましくは成人における細胞膜上の他のタンパク質に結合しない。本発明による抗体は、典型的には、下記でより詳細に説明するように、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍの結合親和性でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合することができる。

【0026】

本明細書で使用する用語「結合を妨害する」は、抗体またはそのＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合部分がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ上のエピトープに向けられること、および抗体またはそのＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合部分がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂに結合するためのリガンドと競合することを意味する。ＨＬＡ−Ｅは、ヒトにおけるＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂヘテロ二量体に対する認識されたリガンドである。マウスオルトログは、一般に名称Ｑａ１の下で公知である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、好ましくはＨＬＡ−ＥのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ受容体への結合を妨害する。抗体またはその結合部分は、リガンド結合を減少させ、これが既にＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂに結合している場合、リガンドに置換することができるか、または例えば立体障害を通して、リガンドがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂに結合できることを少なくとも部分的に防止し得る。

【0027】

本明細書で使用する用語「抗体」は、好ましくは免疫グロブリンクラスのタンパク質に属する、抗原上のエピトープに結合する１つ以上の可変ドメインを含有するタンパク性分子を意味し、このとき、そのようなドメインは抗体の可変ドメインとの配列相同性に由来するか、または抗体の可変ドメインとの配列相同性を共有する。治療使用のための抗体は、好ましくは可能な限り治療対象の被験者の自然抗体（例えば、ヒト被験者のためのヒト抗体）に近い。抗体結合は、特異性および親和性によって表現することができる。特異性は、いずれの抗原またはそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されるかを決定する。親和性は、特定抗原またはエピトープへの結合の強度についての尺度である。結合または特異的結合は、少なくとも１×１０ｅ−６Ｍ、より好ましくは１×１０ｅ−７Ｍ、より好ましくは１×１０ｅ−９Ｍ超の親和性（ＫＤ）を備える結合であると規定される。典型的には、治療適用のための抗体は、１×１０ｅ−１０Ｍ以上までの親和性を有する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体は、単一特異性抗体または二重特異性抗体であってよい。二重特異性抗体では、ＶＨ／ＶＬ組み合わせの少なくとも１つはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂに結合する。本発明の二重特異性抗体のような抗体は、典型的には自然抗体の定常ドメインを含んでいる。本発明の抗体は、典型的には、好ましくはヒトＩｇＧサブクラスの全長抗体である。本発明のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ１サブクラスの抗体である。本発明のそのような抗体は、優れたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣＣ特性を有する。そのような抗体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ発現細胞を殺滅するために使用することができ、それにより系からこれらの細胞の作用を抑制する免疫応答を除去することができる。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣＣを提示しないＩｇＧ２などのヒトＩｇＧ４サブクラスまたはさらなるＩｇＧサブクラスの抗体である。さらに、減少したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣＣを備えるＩｇＧ１の誘導体も利用できる。そのような抗体は、破壊するための結合細胞を効率的には標識しない。そのような抗体は、典型的には、本発明において、結合するとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのシグナル伝達を少なくとも減少させるため、好ましい。

【0028】

１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するナチュラルキラー細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのシグナル伝達を減少させる。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するナチュラルキラー細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのリガンド誘導性シグナル伝達を減少させる。ヒトに関連して、好ましいリガンドはＨＬＡ−Ｅであり、好ましくは、これに関連して、ＨＬＡ−Ｅ発現細胞である。リガンド誘導性受容体シグナル伝達は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０、４０、５０ ６０または少なくとも７０％減少させられ、特に好ましい実施形態では、リガンド誘導性受容体シグナル伝達は、８０％、より好ましくは９０％減少させられる。この減少は、好ましくは本明細書で言及したようなＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体の存在下でリガンド誘導性受容体シグナル伝達を決定することによって決定される。シグナル伝達は、好ましくは他の点では同一条件下で、抗体の非存在下のシグナル伝達と比較される。これらの条件は、少なくともＨＬＡ−Ｅリガンドの存在、または適用できる場合にはそれのオルトログを含んでいる。存在するリガンドの量は、好ましくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ陽性細胞系内で最大シグナル伝達の半分を誘導する量である。シグナル伝達は、好ましくは細胞活性化を決定することによって決定される。細胞活性化は、ＩＦＮ−γを含むサイトカイン類の増殖、産生、またはＣＤ６９もしくはＣＤ１３７を含む表面表示マーカーを用いて測定できる。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するナチュラルキラー細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのシグナル伝達を阻害する。シグナル伝達の阻害は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％までのシグナル伝達の減少を意味する。シグナル伝達の減少は、好ましくは抗体の活性についての尺度としてＮＫ細胞上で測定される。ＮＫ細胞上のシグナル伝達を減少させる抗体は、さらに他のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現する免疫細胞上のシグナル伝達も減少させる。

【0029】

１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのシグナル伝達を減少させる。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／またはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのリガンド誘導性シグナル伝達を減少させる。ヒトに関連して、好ましいリガンドは、好ましくは、ＨＬＡ−Ｅ発現細胞に関連してＨＬＡ−Ｅである。リガンド誘導性受容体シグナル伝達は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０％、または少なくとも７０％減少させられ、特に好ましい実施形態では、リガンド誘導性受容体シグナル伝達は、８０％、より好ましくは９０％減少させられる。この減少は、好ましくは本明細書で言及したようなＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体の存在下でリガンド誘導性受容体シグナル伝達を決定することによって決定される。シグナル伝達は、好ましくは他の点では同一条件下で、抗体の非存在下のシグナル伝達と比較される。これらの条件は、少なくともＨＬＡ−Ｅリガンドの存在、または適用できる場合にはそれのオルトログを含んでいる。存在するリガンドの量は、好ましくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ陽性細胞系内で最大シグナル伝達の半分を誘導する量である。シグナル伝達は、好ましくは細胞活性化を決定することによって決定される。細胞活性化は、ＩＦＮ−γを含むサイトカイン類の増殖、産生、またはＣＤ６９もしくはＣＤ１３７を含む表面表示マーカーを用いて測定できる。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するＴ細胞上のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂのシグナル伝達を阻害する。シグナル伝達の阻害は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％のシグナル伝達の減少を意味する。シグナル伝達の減少は、好ましくは抗体の活性についての尺度としてＴ細胞上で測定される。Ｔ細胞上のシグナル伝達を減少させる抗体は、さらにＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現する他の免疫細胞上のシグナル伝達も減少させる。

【0030】

シグナル伝達を減少および／または阻害するＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体に結合することについてリガンドと競合できるか、または競合できない。１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂヘテロ二量体に結合することについてリガンドと有意には競合しない。結合の競合は、リガンドの存在下または非存在下で抗体の結合試験によって決定することができる。

【0031】

１つの好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、欧州特許第２６２８７５３号明細書（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ ＡＳ）に記載されたようにＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合について抗体Ｚ１９９と競合する。１つの好ましい実施形態では、抗体は、上述のＺ１９９もしくはそのヒト化バージョンまたはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分である。さらなる好ましい実施形態では、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロ二量体に結合することについてリガンドと競合しない。１つの好ましい実施形態では、抗体またはそれの結合部分は、欧州特許第２６２８７５３号明細書（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ ＡＳ）に記載されたように、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへの結合について抗体Ｚ２７０と競合する。１つの実施形態では、抗体は、上述のＺ２７０またはそのヒト化バージョンである。

【0032】

本発明の手段、方法および使用においては、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに結合する抗体またはそのような抗体のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ結合部分が好ましい。ＣＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａに、好ましくは他の点では同一条件下でＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａへ結合する抗体またはそのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ結合部分は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂへ少なくとも１００分の１で結合する。

【0033】

結合分子は、抗体であってよい。本発明では、抗体は全長抗体またはその部分である。好適な部分は、必ずしも完全にではないが本質的に抗体の抗原結合能力を維持している。好適な抗体部分は、一本鎖Ｆｖ断片、モノボディ、ＶＨＨおよびＦａｂ断片である。そのような特異的結合分子に共通する特徴は、重鎖可変ドメインの存在と、多数についてはさらに対応する軽鎖可変ドメインの存在とである。抗体の一部分は、例えばそれに限定されないが、血流からそのような部分のさもなければ迅速な除去を減少させるための配列などのさらなるアミノ酸配列を含有する場合がある。一本鎖Ｆｖ断片のための好適な担体は、特にヒト血清アルブミンである。本発明の抗体は、好ましくは「全長」抗体である。本発明による用語「全長」は、本質的に完全であるが必ずしも無傷抗体の全機能は有していない抗体を含むと規定される。疑義を回避するため、全長抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含有している。各鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＨおよびＣＬ、ＶＬと指定されたドメインに分解できる定常（Ｃ）領域および可変（Ｖ）領域を含有している。抗体は抗原にＦａｂ部分に含有される可変ドメインを介して結合し、結合後には、定常ドメインを通して、大部分はＦｃ部分を通して免疫系の分子および細胞と相互作用することができる。用語「可変ドメイン」、「ＶＨ／ＶＬ対」、「ＶＨ／ＶＬ」は、本明細書では互換的に使用される。本発明による全長抗体は、所望の特性を提供する突然変異が存在する可能性がある抗体を含んでいる。そのような突然変異は、領域のいずれかの実質的な部分の欠失であってはならない。しかし、結果として生じる抗体の結合特性を本質的に変化させることなく１個または数個のアミノ酸残基が欠失している抗体は、用語「全長抗体」の範囲内に含まれる。例えば、ＩｇＧ抗体は、定常領域内に１〜２０個のアミノ酸残基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせを有することができる。例えば、抗体のＡＤＣＣ活性は、抗体自体が低ＡＤＣＣ活性を有する場合に、その抗体の定常領域をわずかに修飾することによって改善することができる（Ｊｕｎｔｔｉｌａ，Ｔ．Ｔ．，Ｋ．Ｐａｒｓｏｎｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．“Ｓｕｐｅｒｉｏｒ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ａ ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２−Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７０（１１）：４４８１−４４８９）。一方、ＡＤＣＣ活性は、その抗体の定常領域を修飾することによって減少させることができる。

【0034】

全長ＩｇＧ抗体は、それらの好都合な半減期および免疫原性のために完全に自己（ヒト）分子にできるだけ接近して留まる必要があるために好ましい。ヒトにおけるあらゆる免疫原性を防止するために、本発明によるＩｇＧ抗体はヒトＩｇＧ４であることが好ましい。１つの好ましい実施形態では、ＩｇＧ４は、減少したジスルフィド結合異種性および／または増加したＦａｂドメイン熱安定性を有するように設計される（Ｓ．Ｊ Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ（２０１２）．Ｔｈｅ Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８７：ｐｐ．２４５２５−２４５３３）。

【0035】

抗体は、様々な動物種に由来してよい。一部の抗体は、少なくとも重鎖可変領域に関してマウスのバックグラウンドを有する。そのような例えばマウス重鎖可変領域をヒト化することは一般的な方法である。これを達成できる様々な方法がある。マウス重鎖可変領域の３Ｄ構造に適合する３Ｄ構造を備えるヒト重鎖可変領域内にＣＤＲを移植することが可能である。好ましくは、公知または疑わしいＴ細胞またはＢ細胞エピトープをマウス重鎖可変領域から除去することによって、マウス重鎖可変領域を脱免疫することができる。この除去は、典型的には、エピトープ内の１つ以上のアミノ酸を他の（典型的には保存）アミノ酸と置換し、それにより、そのエピトープの配列がもはやＴ細胞またはＢ細胞エピトープではなくなるようにすることによる。

【0036】

そのような脱免疫マウス重鎖可変領域は、最初のマウス重鎖可変領域よりもヒトでは低免疫原性である。好ましくは、本発明の可変領域またはドメインは、例えば化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）などのようにさらにヒト化される。化粧張り技術を使用することによって、免疫系が容易に遭遇する外部残基は、弱免疫原性化粧張り表面または実質的に非免疫原性化粧張り表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供するためにヒト残基と選択的に置換される。本発明において使用する動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。

【0037】

ワクチン中の免疫原の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｃｇ／ｍＬ、例えば１ｍｃｇ／ｍＬ〜１００ｍｃｇ／ｍＬである。この濃度は、個人に投与された場合にタンパク質がその治療効果を発揮するために十分な濃度であることを保証するために、好ましくは少なくとも１ｎｇ／ｍＬである。しかし、この濃度は、前記タンパク質の被験者への投与に関連する可能性のある副作用の発生を防止または減少させるために、好ましくは１０ｍｇ／ｍＬを超えてはならない。

【0038】

ワクチン中の免疫原をコードする核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのアナログであってよい。核酸分子は、細胞へ核酸分子を効率的に送達するために、ウイルスタンパク質、典型的には例えばウイルスカプシドと関連している可能性がある。

【0039】

ワクチンとＣＤ９５／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせは、被験者に一緒に投与される１つの配合剤中に存在してよい。１つの実施形態では、このため本発明は、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを含む医薬組成物であって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、医薬組成物をさらに提供する。この医薬組成物は、好ましくはアジュバントおよび／または１種以上の好適な賦形剤、例えば安定剤、バッファー、塩などを含んでいる。１つの好ましい実施形態では、医薬組成物中の免疫原は腫瘍抗原である。

【0040】

１つの好ましい実施形態では、ワクチンおよび抗体は、別個の容器内にあり、被験者に別個に投与される。ワクチンおよび抗体は、本質的に同時にまたは連続的に投与されてよい。抗体は、ワクチンの前にまたは本質的に同時に投与されるのが好ましい。このため、本発明はさらに、ワクチン組成物とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分を含む組成物とを含むパーツのキットであって、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、パーツのキットを提供する。ワクチン組成物の場合、この組成物はさらにアジュバントを含むことができる。両方の組成物は、１種以上の好適な賦形剤、例えば安定剤、バッファー、塩などをさらに含むことができる。

【0041】

治療対象の被験者は、好ましくはヒト被験者である。

【0042】

治療は癌治療を含むのが好ましい。この実施形態では、ワクチンが癌ワクチンであるのが好ましい。この実施形態では、免疫原が腫瘍抗原、好ましくは腫瘍特異的抗原であるのが好ましい。

【0043】

腫瘍抗原は、腫瘍細胞内で生成される抗原性物質である。腫瘍を含む宿主は、抗原に対する免疫応答を誘発することができるか、または抗原は、好ましくは本発明の方法によって宿主のワクチン接種後に免疫原性である可能性がある。腫瘍抗原は、診断テストを用いて腫瘍細胞を同定する際の有用な腫瘍マーカーであり、癌療法に使用される。最初の腫瘍抗原が発見されて以降、多数の様々なさらなる抗原が同定されてきた。腫瘍細胞による腫瘍抗原の産生を生じさせることのできる数種の機序が同定されている。身体内の正常タンパク質は、典型的には、必ずではないが、自己反応性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）および自己抗体産生性リンパ組織（ＢＭ）が一次リンパ組織内では「中枢性」で、および二次リンパ組織内では「末梢性」で淘汰されるプロセスである自己免疫寛容のために、抗原性ではない（Ｔ細胞については大部分が胸腺およびＢ細胞については脾臓／リンパ節）。そこで、免疫系に曝露させないあらゆるタンパク質は免疫応答を始動させる。これには、免疫系から明確に隔離される正常タンパク質、通常は極めて少量で生成されるタンパク質、通常は特定の発達段階でのみ生成されるタンパク質、またはその構造が突然変異、様々なプロセッシング、様々なフォールディングなどのために修飾されているタンパク質を含む可能性がある。

【0044】

腫瘍抗原は、この発現パターンに基づいて大まかに２つのカテゴリー：腫瘍細胞中にのみ存在し、被験者が腫瘍を有する時点で被験者のいずれかの他の細胞上に存在しない腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、ならびに腫瘍細胞上およびさらに一部の正常細胞上に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に分類することができる。腫瘍特異的抗原は、腫瘍を有している時点とは異なる時点で被験者において発現する（していた）可能性がある。例えば、一部の腫瘍特異的抗原は、胚形成中に発現する。現在、様々なクラスの腫瘍抗原が認識されている。変異腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の産物；他の変異遺伝子過剰発現または異常発現細胞タンパク質の産物；発癌性ウイルスにより産生した腫瘍抗原；腫瘍胎児抗原；変化した細胞表面糖脂質および糖タンパク質；細胞タイプ特異的分化抗原。このリストは、限定的であることを意図していない。

【0045】

突然変異；；様々な翻訳後修飾；フォールディングなどのために異常な構造を有する腫瘍細胞内で産生したあらゆるタンパク質は、腫瘍抗原として機能する可能性がある。そのような異常なタンパク質は、関係する遺伝子の突然変異または様々な産生量もしくは様々なプロセッシングの結果として産生する可能性がある。異常なタンパク質産生をもたらす原腫瘍遺伝子および腫瘍抑制因子の突然変異は、腫瘍の原因である可能性があり、そのような異常なタンパク質は腫瘍特異的抗原と呼ばれる。腫瘍特異的抗原の例には、ｒａｓおよびｐ５３遺伝子の異常産物が含まれる。その他の例には、組織分化抗原、変異タンパク質抗原、発癌性ウイルス抗原、癌−精巣抗原および血管または間質特異的抗原が含まれる。組織分化抗原は、所定タイプの組織に対して特異的である抗原である。変異タンパク質抗原は、正常細胞がこれらのタンパク質を含有しているはずはないため、癌細胞に対してより特異的である可能性が高い。正常細胞はそれらのＭＨＣ分子上で正常タンパク質抗原を提示し、一方で、癌細胞は変異バージョンを提示するであろう。一部のウイルスタンパク質は、癌の形成に関係しており（腫瘍形成）、一部のウイルス抗原も癌抗原である。癌−精巣抗原は精巣の胚細胞上で主として発現する抗原であるが、胎児卵巣および栄養芽細胞内でも発現する。一部の癌細胞はこれらのタンパク質を異所性で発現するため、従って、これらの抗原を提示し、これらの抗原に特異的なＴ細胞による攻撃を許容する。このタイプの代表的な抗原は、ＣＴＡＧ１ＢおよびＭＡＧＥＡ１である。

【0046】

通常は極めて少量で産生されるが、腫瘍細胞中では劇的に増加するタンパク質は、免疫応答を始動させる。そのようなタンパク質の１つの例は、メラニン産生のために必要とされる酵素チロシナーゼである。通常、チロシナーゼはごくわずかな量で産生するが、そのレベルは黒色腫細胞中では非常に高く上昇する。

【0047】

腫瘍胎児抗原は、さらなる重要なクラスの腫瘍抗原である。例は、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。これらのタンパク質は、通常、胚発生の初期に産生するが、免疫系が十分に発達する時点までに消失する。そこで、これらの抗原に対して自己寛容は発生しない。

【0048】

異常なタンパク質は、腫瘍ウイルス、例えばＥＢＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＰＶによって感染および形質転換された細胞によっても産生する。これらのウイルスにより感染した細胞は、転写されるウイルスＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含有しており、結果として生じるタンパク質は免疫応答を起こす。

【0049】

タンパク質に加えて、細胞表面糖脂質および糖タンパク質のような他の物質も腫瘍細胞内では異常な構造を有する可能性があるため、そこで免疫系の標的となるであろう。

【0050】

癌を治療するためのワクチン内の腫瘍抗原およびそれらの使用は、特にＭｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ（Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１５；Ｖｏｌ ９：ｐｐ３４０１−３４１２）およびＬａｍｐｅｎ ａｎｄ ｖａｎ Ｈａｌｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１；Ｖｏｌ ２３：ｐｐ２９３−２９８）において概説されている。腫瘍抗原を調製および使用するために記載された手段および方法は、本明細書に参照により含まれる。

【0051】

１つの実施形態では、ワクチンは、免疫原を含む細胞を含む。１つの好ましい実施形態では、細胞は、腫瘍抗原、好ましくは腫瘍特異的抗原を含む。１つの実施形態では、ワクチンは、腫瘍細胞を含む。ワクチン内の細胞は、生細胞であってよいが、より一般的には、細胞はワクチン内に組み込まれる前に、または被験者に投与する前に不活化される。例えばホルムアルデヒドまたは照射などであるがそれらに限定されない、細胞を不活化する様々な方法が存在する。

【0052】

腫瘍ワクチン接種に関連して、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現する細胞数がワクチンの提供後に腫瘍内で増加することが見いだされた。Ｃ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の数が増加する。特に、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＴ細胞の数が増加する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＴ細胞の実質的画分はＣＴＬＡ４、ＰＤ−１またはＴＩＭ３を発現しないことが見いだされた。ＮＫＧ２ＡリガンドＱａ−１の発現レベルは、ワクチン接種後には腫瘍内で増加することが見いだされた。１つの好ましい実施形態では、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ結合抗体との組み合わせは、ＣＴＬＡ４結合抗体、ＰＤ−１結合抗体、ＰＤ−Ｌ１結合抗体；ＬＡＧ−３結合抗体；ＶＩＳＴＡ抗体およびＴＩＭ３結合抗体または前記抗体の抗原結合部分から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む。抗体またはその抗原結合部分は、好ましくはＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ、ＶＩＳＴＡおよび／またはＴＩＭ３のシグナル伝達を阻害する。様々なＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ、ＶＩＳＴＡおよび／またはＴＩＭ３シグナル伝達阻害抗体は、当技術分野において公知である。１つの好ましい実施形態では、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせは、ＣＴＬＡ４結合抗体、ＰＤ−１結合抗体およびＴＩＭ３結合抗体または前記抗体の抗原結合部分から選択される少なくとも１つの抗体をさらに含む。本明細書に記載したそのような抗体またはそれらの抗原結合部分の１つ以上とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせは、改善された作用を示す。理論によって拘束されることなく、これはＣＴＬＡ４、ＰＤ−１またはＴＩＭ３を有意には発現しない有意な数のＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂを発現するＴ細胞に起因すると考えられる。

【0053】

被験者は、病原菌で感染した被験者であってよい。被験者は、特に、癌を有する被験者であってもよい。１つの好ましい実施形態では、被験者は、癌患者である。被験者の癌は、好ましくは固形癌である。癌は、好ましくは卵巣癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、膵臓癌、腎細胞癌、肺癌、前立腺癌、ウイルス誘発癌または結腸直腸癌である。これには、原発腫瘍および／または上述の癌の転移または前段階過形成の両方が含まれる。ウイルス誘発癌は、特に、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびエプスタイン・バー・ウイルス（各々、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ）によって誘発される癌を含む。

【0054】

本発明は、移植用の細胞産物を含有する免疫細胞の製造における、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分と免疫原との使用も提供する。さらに、細胞産物を含有する免疫細胞を調製するための方法であって、免疫原とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との存在下でＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む細胞集団を培養する工程を含み、さらに前記培養する工程後にＴ細胞および／またはＮＫ細胞を収集する工程をさらに含む、方法も提供される。免疫細胞は、抗原提示細胞および免疫原と一緒にＴ細胞および／またはＮＫ細胞の培養中でｉｎ ｖｉｔｒｏで製造することができる。免疫原は、それ自体で提供することができる。免疫原の抗原は、抗原提示細胞によって提示されるであろう。１つの好ましい実施形態では、培養は、癌細胞または免疫原を含むその部分を含む。好適な免疫細胞製造法は、特に以下の文献およびその中の参考文献に記載されている：Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｕｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ＣＳ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊａｎ；２５７（１）：５６−７１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３２、Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ，Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＰ，Ｙａｎｇ ＪＣ，Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００８ Ａｐｒ；８（４）：２９９−３０８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ２３５５、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＭｃＫｅｎｎａ ＤＨ，Ｋａｄｉｄｌｏ ＤＭ，Ｃｏｏｌｅｙ Ｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ＪＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２；８８２：４９１−５０７．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−８４２−９＿２８。

【0055】

本発明はさらに、被験者における免疫応答を刺激するための方法であって、ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とを、それを必要とする被験者に投与する工程を含み、前記ワクチンは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含む、方法を提供する。ワクチンとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ／Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分とは、本質的に同時に提供／投与される。

【0056】

本発明は、免疫細胞移植片とＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合抗体またはそれらのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａおよび／もしくはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｂ結合部分との組み合わせであって、それを必要とする被験者の治療において使用するためのものである、組み合わせをさらに提供する。この組み合わせは、好ましくは、抗原に対する免疫応答を誘発するための免疫原または前記免疫原をコードする核酸分子を含むワクチンをさらに含む。免疫細胞移植片は、好ましくは本明細書で上述した細胞産物を含有する免疫細胞である。免疫細胞移植片は、現在は癌を有する被験者の治療において主に使用されている。免疫細胞移植片は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む細胞集団を含むことができる。Ｔ細胞移植片を調製するための手段および方法ならびにそれを用いた被験者の治療は、特にＲｏｓｅｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ（２０１５；Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ ３４８：ｐｐ６２−６８）に記載されている。この参考文献およびその中で言及された参考文献は、本明細書に参照により組み込まれる。免疫細胞移植片中の細胞は、好ましくは腫瘍応答性リンパ球、好ましくはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。そのような細胞は、自然に腫瘍応答性である可能性があるか、または遺伝子組換えを通して（追加の）腫瘍応答性を備えることができる。この遺伝子組換えは、典型的には、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体または本明細書の上記で言及したＲｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｒｅｓｔｉｆｏの参考文献に記載されたいわゆるキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）の異種発現を含んでいる。免疫細胞移植片は、さらに養子細胞療法とも呼ばれる。本発明における養子細胞療法は、好ましくは、癌の治療に使用される。好ましくは黒色腫、ウイルス誘発癌、卵巣癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、胆管癌および神経芽細胞腫の治療におけるものである。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】ＶＩＮ病変では、ＮＫＧ２Ａにはより良好な臨床転帰が結び付いている。Ａ．ＣＤ３（赤色）およびＮＫＧ２Ａ（緑色）の免疫蛍光組織切片の染色。ＶＩＮ病変内のＣＤ８ Ｔ細胞上およびＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ａ発現が可視化されている。Ｂ．ＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞の数を組織切片染色により決定し、全Ｔ細胞数（「ＣＤ３^＋ＮＫＧ２Ａ⁻」）で割った。この比率は、無再発生存期間についてのこのＶＩＮ患者集団の予後予測の価値を有していた。悪性腫瘍におけるＴ細胞上の阻害性受容体の発現には予後予測の価値があり、局所Ｔ細胞の活性化状態を示すと思われる。

【図2】頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の腫瘍浸潤性リンパ球由来のＣＤ８ Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ａの発現。Ａ．健常被験者の血液中のＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａを発現するＣＤ８ Ｔ細胞の頻度はおよそ５％である。この頻度は、ＨＮＳＣＣサンプルのＴＩＬ中でははるかに高い。Ｂ．リンパ球サブセット上の阻害性受容体共発現のプロファイルを決定するために設計された８色染色パネルのフローサイトメトリープロット。ＣＤ９４^＋ＮＫＧ２Ａ^＋ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は、他の阻害性受容体ＴＩＭ−３およびＰＤ−１細胞の発現を解析するためのさらなる入口である。阻害性受容体はリンパ球上でモザイク状で発現し、増加した数の受容体を備える数種の異なるサブセットを作り出す。Ｃ．ＨＮＳＣＣ患者サンプルのＴＩＬ（右の円グラフ）または健常被験者のＰＢＭＣ（左の円グラフ）中の、阻害性受容体を発現しないか、または単一もしくは複数の阻害性受容体を発現するＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を示している、図Ｂからのデータの提示。これらの癌におけるＮＫＧ２Ａ^＋ＣＤ８ Ｔ細胞のおよそ３０％は、ＴＩＭ−３、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を共発現しない。

【図3】ＮＫＧ２ＡおよびＱａ−１（＝マウスＨＬＡ−Ｅ）は免疫療法後に強度に増加する。Ａ．Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の治療スキーム。ｇｐ１００に対するトランスジェニックＴＣＲを備える腫瘍特異的ｐｍｅｌ Ｔ細胞を注入し、合成長鎖ペプチドを用いる２回のワクチン接種によりｉｎ ｖｉｖｏ活性化した。Ｂ．担癌マウスの非処置群および免疫療法処置群についての腫瘍増殖曲線および生存率曲線を示した。Ｃ．マウスから除去し、フローサイトメトリーのために分散させて染色したＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞上のＱａ−１（＝マウスＨＬＡ−Ｅ）の発現レベル。免疫療法は強度に増加したレベルのＱａ−１をもたらした。Ｄ．阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの発現についての腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞のフローサイトメトリー。脾臓由来リンパ球は、コントロール染色と一緒に採取した。平均すると、マウスが免疫療法により処置されていた場合に６０％のＣＴＬは阻害性受容体を発現した。腫瘍は最大サイズに増殖した後に切除した。

【図4】ＮＫＧ２ＡおよびＱａ−１（＝マウスＨＬＡ−Ｅ）は免疫療法後に強度に増加する。Ａ．ＨＰＶ誘導性ＴＣ−１癌の治療スキーム。担癌マウスを鉱油中に合成長鎖ペプチドを含むＨＰＶにより１回ワクチン接種した。Ｂ．担癌マウスの非処置群および免疫療法処置群についての腫瘍増殖曲線および生存率曲線を示した。Ｃ．マウスから除去し、フローサイトメトリーのために分散および染色したＴＣ−１癌細胞上のＱａ−１（＝マウスＨＬＡ−Ｅ）の発現レベル。免疫療法は、強度に増加したレベルのＱａ−１をもたらした。Ｄ．パネルＣに示したデータの定量化。平均蛍光値は、平均値の標準誤差とともに描出した。Ｅ．阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの発現についての腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＴＬ）およびＮＫ細胞のフローサイトメトリー。脾臓由来リンパ球は、コントロール染色と一緒に採取した。平均すると、マウスが免疫療法により処置されていた場合に７５％のＣＴＬは阻害性受容体を発現した。腫瘍は、腫瘍接種の第１９日に切除した。Ｆ．パネルＥに示したデータの定量化。全ＣＴＬおよび全ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ａ^＋細胞の頻度。Ｇ．ＣＴＬ上のＮＫＧ２Ａの発現は、ＨＰＶ１６ Ｅ７四量体（「ＨＰＶ ＴＭ」）を用いて測定された腫瘍特異性に結び付いている。Ｈ．合成長鎖ペプチドを用いた治療的ワクチン接種は、ＣＴＬおよびＮＫ細胞を腫瘍部位へ動員する。

【図5】ＣＤ８ Ｔ細胞クローン上の阻害性受容体ＮＫＧ２Ａの遮断はｉｎ ｖｉｔｒｏ応答性を増加させる。Ａ．実験の構成。抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞クローンを抗ＮＫＧ２Ａ抗体（マウスについては２０ｄ５；ヒトについてはＺ１９９）とともにインキュベートし、高レベルのＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａリガンド（マウスについてはＬＰＳ芽細胞；ヒトについてはＢ−ＬＣＬ細胞）を発現するペプチド負荷抗原提示細胞とともにインキュベートした。応答性は２０時間のインキュベーション時間後に測定した（マウスについてはＩＦＮｙ遊離；ヒトについてはＣＤ１３７の提示）。Ｂ．マウスＣＤ８ Ｔ細胞クローンはＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａ鎖を一様に発現するため、濃度を増加させながら遮断性ＮＫＧ２Ａ抗体の存在下でコントロールペプチドまたは同種刺激ペプチドとともにインキュベートした。Ｔ細胞応答性は、ＥＬＩＳＡによって決定されるＩＦＮｙ遊離によって測定した。強力に増加したＣＴＬ応答性は、ＮＫＧ２Ａを遮断することによって観察できる。Ｃ．ヒトＣＤ８ Ｔ細胞クローンは、ＣＤ９４およびＮＫＧ２Ａの異種発現を提示した。この混合集団をペプチド負荷Ｂ−ＬＣＬ細胞とともにインキュベートし、細胞１個ずつベースでのＣＴＬの応答性を細胞表面でのＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の誘導によりフローサイトメトリーで測定した。ＮＫＧ２Ａを発現するＣＴＬの応答性は、遮断抗体によって増強できるが、ＮＫＧ２Ａ陰性ＣＴＬの応答性は増強できない。

【図6】肺腺癌における腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、β２−マイクログロブリン、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ／ＣおよびＨＬＡ−Ｅの染色。高い（Ａ）および低い（Ｂ）間質および上皮内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の例；高いβ２−マイクログロブリン発現を備える腫瘍（Ｃ）；ＨＬＡ−Ａ（Ｄ）、ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ（Ｅ）およびＨＬＡ−Ｅ（Ｆ）染色の例。オリジナル倍率×２００。

【図7】ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤およびＨＬＡ発現とＯＳとの関連。低いまたは高い上皮内ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ａ）；間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｂ）および全ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｃ）を有する患者の生存率曲線。生存率曲線は、ＨＬＡ−Ａ（Ｄ）、ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ（Ｅ）およびＨＬＡ−Ｅ（Ｆ）の機能的（すなわち、ＨＬＡおよびβ２−Ｍ両方についての陽性染色）発現について提示した。低いＨＬＡ−Ｅ発現と改善された生存率（Ｆ）との間で有意な相関（ｐ＝０．０４２）が観察された。

【図8】伝統的ＨＬＡクラスＩ発現およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤がＯＳに及ぼす作用。（Ａ、Ｂ）ＨＬＡ−Ａ発現に関連して、全ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤は予後予測的影響を有していなかった。（Ｃ、Ｄ）高い全ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤を備えるＨＬＡ−Ｂ／Ｃ陽性腫瘍はより良好なＯＳを示したが（Ｄ）、一方で、この作用は低いＨＬＡ−Ｂ／Ｃ発現を備える腫瘍では観察されなかった（Ｃ）。（Ｅ、Ｆ）改善されたＯＳは、高い全ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤が存在した場合にＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃの両方について高発現を備える腫瘍に対して確定されたが（Ｆ）、これとは反対に、この作用は低いＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃを発現する腫瘍では見られなかった（Ｅ）。

【図9】高いＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤を備えるＨＬＡ−Ｅ陰性腫瘍における予後予測的有益性。（Ａ、Ｂ）低いＨＬＡ−Ｅ発現を備える腫瘍では、高い間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤には良好なＯＳが強度に結び付いていた（Ａ）。興味深いことに、高い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤物の臨床的有益性は高いＨＬＡ−Ｅ発現により無効にされた（Ｂ）。（Ｃ、Ｄ）これとは逆に、高い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞流入を備える患者では、高いＨＬＡ−Ｅ発現はより不良なＯＳをもたらした（Ｃ）。低存在の間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を有する患者では、ＨＬＡ−Ｅ発現はＯＳに作用を及ぼさなかった（Ｄ）。

【図10】間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞の三分位数に基づく分類およびＯＳに及ぼす影響。単一決定因子としての間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤は臨床転帰に正の大きい影響を及ぼしたが、統計的有意性はほぼ有していなかった（図７Ｂ、ログランク検定、ｐ＝０．０６８）。しかし、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞数／ｍｍ２（腫瘍）は平均値の代わりに三分位数に基づいて二分化した場合に、原発腫瘍における間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞の（すなわち、中および高い三分位数に分類して）高い存在を備える患者について有意な作用が観察された（ログランク検定、ｐ＝０．０４６）。

【図11】原発腫瘍におけるＨＬＡ発現およびＨＬＡ発現と全ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤の関連。有意な関連（マン・ホイットニーＵ検定、ｐ＜０．０５）は、多数のＣＤ８^＋ Ｔ細胞と伝統的ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃとの間には存在するが、非伝統的ＨＬＡ−Ｅとの間には存在しない。

【発明を実施するための形態】

【0058】

実施例１
材料および方法
腫瘍浸潤性リンパ球のフローサイトメトリー
切除した原発ヒト腫瘍を細かく刻み、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳを用いて消化した。腫瘍浸潤性リンパ球を７日間にわたりＩＬ−２を用いて増殖させ、その後にフローサイトメトリーによって免疫表現型検査を実施した。次の抗ヒト抗体：抗ＣＤ３（ＤＡＫＯ；クローンＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４（ＢＤ；クローンＲＰＡ−Ｔ４）、抗ＣＤ８（ＢＤ；ＳＫ１）、抗ＣＤ５６（ＢＤ；クローンＢ１５９）、抗ＣＤ９４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ；クローン１３１４１２）、抗ＮＫＧ２Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；クローンｚ１９９）、抗ＣＴＬＡ−４（ＢＤ；クローンＢＮ１３）、抗ＰＤ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローンＥＨ１２．２Ｈ７）、抗ＴＩＭ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローンＦ３８−２Ｅ２）、抗ＣＤ６９（ＢＤ；クローンＬ７８）および抗ＣＤ１３７（ＢＤ；４Ｂ４−１）を使用した。サンプルはＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析した。多変量解析のために、ＦｌｏｗｊｏソフトウエアからのマルチパラメーターフローサイトメトリーデータをＳＰＩＣＥソフトウエア内にインポートした（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ ２０１１ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ）。

【0059】

マウス腫瘍細胞および浸潤性リンパ球は、腫瘍が１，０００ｍｍ^３を超えた時点（Ｂ１６黒色腫）および腫瘍接種後の第１９日（ＴＣ−１）に原発腫瘍から単離した。ＴＣ−１腫瘍は、消化前にフラッシュした。続いて、切除した腫瘍を切り刻み、Ｌｉｂｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて消化した。脾臓細胞は、赤血球溶解後に入手した。表面抗原は、Ｆｃ塊（ＢＤ；クローン２．４ｇ２）後に蛍光標識抗体抗ＣＤ４５．２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローン１０４）、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローン１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；クローンＧＫ１．５）、抗ＣＤ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；クローン５３−６．７）、抗ＮＫ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローンＰＫ１３６）、抗ＣＤ９４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；クローン１８Ｄ３）、抗ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ（ＢＤ；クローン２０Ｄ５）、抗ＮＫＧ２Ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；クローン１６Ａ１１）および抗Ｑａ１（ＢＤ；クローン６Ａ８．６Ｆ１０．１Ａ６）を使用して染色した。ＨＰＶ１６ Ｅ７（ａａ４９−５７）由来の免疫決定因子ペプチドを含有するＭＨＣ−Ｉ四量体は社内で製造した。サンプルはＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析した。

【0060】

ＮＫＧ２Ａ遮断アッセイ
ヒト免疫細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体を遮断するために、インフルエンザＭ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞は、Ｍ１由来ペプチドＧＩＬＧＦＶＦＴＦを含有するＰＥ標識ＨＬＡ−Ａ２四量体を使用する磁気活性化細胞選別を使用して、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから単離した。これらのインフルエンザ特異的ＣＤ８系は、以前に記載されたようにｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖させた（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｍａｔｒｉｘ １−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＤ４^＋ ＦＯＸＰ３^＋ ａｎｄ ＦＯＸＰ３（−）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃａｎ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｌｏｎｇ ａｆｔｅｒ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｐｉｅｒｓｍａ ＳＪ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｕｌｓｔ ＪＭ，Ｋｗａｐｐｅｎｂｅｒｇ ＫＭ，Ｇｏｅｄｅｍａｎｓ Ｒ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｉｎｎｅ ＣＥ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ；４０（１１）：３０６４−７４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２００９４０１７７）。ＮＫＧ２Ａ遮断実験のために、１００，０００個のＭ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を、１０，０００個のＨＬＡ−Ａ２^＋ Ｂ−ＬＣＬおよび濃度を増加させながらｚ１９９抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）と共培養した。２時間のプレインキュベーション後、Ｍ１ペプチドを加え、一晩共インキュベートした。続いて細胞を蛍光標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって測定し、Ｔ細胞活性化のマーカーとしてのＣＤ１３７の発現について解析した。

【0061】

マウス免疫細胞上のＮＫＧ２Ａ受容体を遮断するために、Ｔｒｈ４抗原に対して特異的なＣＴＬクローンを以前に記載されたように培養した（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＴＡＰ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｒｆａｃｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＣＣ，Ｑｕｅｒｉｄｏ Ｂ，Ｓｌｕｉｊｔｅｒ Ｍ，Ｄｅｒｂｉｎｓｋｉ Ｊ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ，ｖａｎ Ｈａｌｌ Ｔ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｎｏｖ；４１（１１）：３１１４−２４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２０１１４１８３６）。抗体遮断のために、１ウエル当たり２，０００個のＣＴＬを１時間にわたり２０Ｄ５ハイブリドーマ上清により前処理し、その後に５，０００細胞／ウエルのペプチド負荷ＬＰＳ芽細胞を標的細胞として加えた。２４時間のインキュベーション後に培養上清を収集した。培養上清上でＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡを以前に記載されたように実施した（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＴＡＰ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｒｆａｃｅ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｏｌｉｖｅｉｒａ ＣＣ，Ｑｕｅｒｉｄｏ Ｂ，Ｓｌｕｉｊｔｅｒ Ｍ，Ｄｅｒｂｉｎｓｋｉ Ｊ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ，ｖａｎ Ｈａｌｌ Ｔ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１ Ｎｏｖ；４１（１１）：３１１４−２４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｊｉ．２０１１４１８３６）。示したデータは、３つずつの試験ウエルから入手し、エラーバーはこれらの数値の標準偏差を表している。

【0062】

マウス、細胞系および試薬類
Ｃ５７ＢＬ／６ｊｉｃｏマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、８週齢時に使用した。Ｐｍｅｌ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｔｈｙ１．１バックグラウンド）はｇｐ１００_{２５−３３}／Ｄ^ｂ特異的受容体を有しており、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの動物飼養施設に特定病原菌除去条件下で飼養および収容した。実験は、大学実験動物飼養実行委員会（ｌｏｃａｌ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ（Ｄｉｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｅ））により承認され、米国立衛生研究所の指針に従っていた。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞系は、最初はアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃａｕｓｅｓ ｍａｓｓｉｖｅ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍａｎａｇｅａｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍＬｙ ＬＶ，Ｓｌｕｉｊｔｅｒ Ｍ，Ｖｅｒｓｌｕｉｓ Ｍ，Ｌｕｙｔｅｎ ＧＰ，ｖａｎ Ｓｔｉｐｄｏｎｋ ＭＪ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ ＣＪ，Ｊａｇｅｒ ＭＪ，ｖａｎ Ｈａｌｌ Ｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｎｏｖ １；７０（２１）：８３３９−４６．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１０−２２８８）に記載されたように組織培養中で維持した。ＴＣ−１癌細胞系はＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７癌遺伝子を含有しており、ＴＣ Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）から入手した。

【0063】

腫瘍モデル
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデル。致死量の３×１０^４個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を同一遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞の移送および２０マーの長鎖ｇｐ１００ペプチドによるワクチン接種については、以前に確立されたプロトコルを適用した（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ Ｔ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃａｕｓｅｓ ｍａｓｓｉｖｅ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，ｔｕｍｏｒ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍａｎａｇｅａｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ．Ｌｙ ＬＶ，Ｓｌｕｉｊｔｅｒ Ｍ，Ｖｅｒｓｌｕｉｓ Ｍ，Ｌｕｙｔｅｎ ＧＰ，ｖａｎ Ｓｔｉｐｄｏｎｋ ＭＪ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ ＣＪ，Ｊａｇｅｒ ＭＪ，ｖａｎ Ｈａｌｌ Ｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０ Ｎｏｖ １；７０（２１）：８３３９−４６．ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１０−２２８８）。ＨＰＶ１６陽性ＴＣ−１モデル。腫瘍細胞は、同一遺伝子型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下（１×１０^５）注射した。ＩＦＡ中に乳化した長鎖合成ペプチドを用いたワクチン接種は、以前に記載されたように腫瘍接種後の第８日に実施した（Ｖａｃｃｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８^＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒｓ．ｖａｎ Ｄｕｉｋｅｒｅｎ Ｓ，Ｆｒａｎｓｅｎ ＭＦ，Ｒｅｄｅｋｅｒ Ａ，Ｗｉｅｌｅｓ Ｂ，Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ Ｇ，Ｋｒｅｂｂｅｒ ＷＪ，Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ Ｆ，Ｍｅｌｉｅｆ ＣＪ，Ａｒｅｎｓ Ｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｏｃｔ １；１８９（７）：３３９７−４０３）。１回のみのワクチン接種を適用した。腫瘍増殖は、三次元カリパスを用いる測定により週２回監視した。

【0064】

結果および考察
活性化Ｔ細胞のマーカーとしての阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ。
当初、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３を含む阻害性受容体のＴ細胞による発現は機能的に「疲弊した」Ｔ細胞を同定すると考えられた。しかし、この概念は、そのような阻害性マーカーが正常免疫調節の一部として活性化ＣＴＬ上で主として発現することを証明している研究によって反証されてきた（Ｇｒｏｓ Ａ，Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ，Ｙａｏ Ｘ，Ｌｉ ＹＦ，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ Ｓ，Ｔｒａｎ Ｅ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ＪＲ，Ｍｉｘｏｎ Ａ，Ｆａｒｉｄ Ｓ，Ｄｕｄｌｅｙ ＭＥ ｅｔ ａｌ：ＰＤ−１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８^＋ ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４．Ｌｅｇａｔ Ａ，Ｓｐｅｉｓｅｒ ＤＥ，Ｐｉｒｃｈｅｒ Ｈ，Ｚｅｈｎ Ｄ，Ｆｕｅｒｔｅｓ Ｍａｒｒａｃｏ ＳＡ：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｅｎｄｓ Ｍｏｒｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｏｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｈａｎ ‘Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ’ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ：Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｖｏｌ．４；２０１３：４５５）。そこで活性化Ｔ細胞上の阻害性受容体は、慢性刺激の状態に限定されず、単に抗原を経験した状態を反映するものである。これらの受容体は、養子Ｔ細胞療法を成功させるために、効果的な腫瘍特異的ＣＴＬを富化させるためにさえ使用可能である（Ｉｎｏｚｕｍｅ Ｔ，Ｈａｎａｄａ Ｋ−Ｉ，Ｗａｎｇ ＱＪ，Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ Ｍ，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ ＪＲ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ，Ｙａｎｇ ＪＣ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８^＋ＰＤ−１^＋ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｆｒｅｓｈ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａｓ ｅｎｒｉｃｈｅｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ：Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．ｖｏｌ．３３；２０１０：９５６−９６４）。ＮＫＧ２ＡはＴＣＲ係合後にＣＴＬ上で発現するようになることが証明されており（Ｊａｂｒｉ Ｂ，Ｓｅｌｂｙ ＪＭ，Ｎｅｇｕｌｅｓｃｕ Ｈ，Ｌｅｅ Ｌ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＩ，Ｂｅａｖｉｓ Ａ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔ Ｍ，Ｅｂｅｒｔ ＥＣ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ ＲＪ：ＴＣＲ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｉｃｔａｔｅｓ ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ＣＴＬ．Ｉｎ：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｖｏｌ．１７；２００２：４８７−４９９）、これは、この受容体が真正ＣＴＬの正常調節フィードバック機序の一部であることを強調している。本発明者らは、４３例のＶＩＮ病変内のＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞の浸潤をＣＤ３^＋に対する抗体（抗ＣＤ３、ウサギ、クローンａｂ８２８；Ａｂｃａｍ １：１００）およびＮＫＧ２Ａに対する抗体（抗ＮＫＧ２Ａ、ヤギ、クローンＮ１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ １：５０）を使用する免疫蛍光法によって決定した（図１Ａ）。これらの悪性腫瘍内では、ＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞の相当に大きい上皮内および間質浸潤が観察された。重要なことに、全浸潤性Ｔ細胞に占める割合としてのＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞の列挙は、臨床転帰との関連を解明した。より高頻度のＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞を備えるそれらの病変については延長された無再発生存期間が観察され、これは、この阻害性受容体が活性化Ｔ細胞を反映するという考えを支持している（図１Ｂ）。ＴＩＭ−３発現の決定は、極めて同等のプロファイルをもたらした（図示せず）。このため、ＮＫＧ２Ａは、活性化Ｔ細胞上で見いだされ、遮断抗体を用いて腫瘍応答性Ｔ細胞の全出力を遊離させるための標的とすることができる、阻害性受容体ファミリーの絶対的に重要なメンバーである。

【0065】

続いて、本発明者らは、腫瘍浸潤性リンパ球上のＮＫＧ２Ａを含む阻害性受容体の分布について解析した。中咽頭癌の１４〜２１日齢ＴＩＬ培養中での共阻害性受容体のＣＤ８ Ｔ細胞サブセットを発現するコンビナトリアルプロファイルの頻度を決定するために、９種の抗体および生／死マーカーのフローサイトメトリーパネルを設計した。阻害性受容体ＮＫＧ２Ａの発現は腫瘍内ＣＤ８ Ｔ細胞の５〜６０％（平均２５％）の範囲に及んだが、一方で、血液頻度が５％を超えるのはまれである（図２Ａ）。これらのリンパ球は、全てパートナーＣＤ９４を共発現して機能的受容体を生じさせた。これらの頻度は、子宮頸癌において本発明者らが以前に実施した試験において見いだされた頻度と極めて同等であった（Ｇｏｏｄｅｎ ＭＪＭ，Ｌａｍｐｅｎ Ｍ，Ｊｏｒｄａｎｏｖａ ＥＳ，Ｌｅｆｆｅｒｓ Ｎ，Ｔｒｉｍｂｏｓ ＪＢ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ＳＨ，Ｎｉｊｍａｎ Ｈ，ｖａｎ Ｈａｌｌ Ｔ：ＨＬＡ−Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｓｔｒａｉｎｓ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８^＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．ｖｏｌ．１０８；２０１１：１０６５６−１０６６１）。マルチカラーフローサイトメトリー解析は、ＮＫＧ２Ａ^＋ ＣＤ８ Ｔ細胞集団内でおよそ３５％が阻害性受容体ＣＴＬ−Ａ４、ＰＤ−１またはＴＩＭ３を発現しないことを明らかにし（図２ＢおよびＣ）、これは、これらの細胞がＮＫＧ２Ａのチェックポイント遮断によってのみ標的とすることができ、試験された公知の他の免疫チェックポイントの標的にはできないことを示唆している。当然ながら、チェックポイント遮断薬の組み合わせは、高い可能性で代償機構に起因して、優れた臨床作用を媒介することが証明されている（Ｃｕｒｒａｎ ＭＡ，Ｍｏｎｔａｌｖｏ Ｗ，Ｙａｇｉｔａ Ｈ，Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ：ＰＤ−１ ａｎｄ ＣＴＬＡ−４ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｘｐａｎｄｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．ｖｏｌ．１０７；２０１０：４２７５−４２８０．Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ，Ｋｌｕｇｅｒ Ｈ，Ｃａｌｌａｈａｎ ＭＫ，Ｐｏｓｔｏｗ ＭＡ，Ｒｉｚｖｉ ＮＡ，Ｌｅｓｏｋｈｉｎ ＡＭ，Ｓｅｇａｌ ＮＨ，Ａｒｉｙａｎ ＣＥ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｒ−Ａ，Ｒｅｅｄ Ｋ ｅｔ ａｌ：Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｐｌｕｓ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｉｎ：Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．ｖｏｌ．３６９；２０１３：１２２−１３３）。このため、ＴＩＬサブセットに関する本発明者らの予備データ解析は、抗腫瘍免疫の主要な負の調節因子としてＮＫＧ２Ａ−ＨＬＡ−Ｅ軸を適格と判定しており、癌クリニックのためのＮＫＧ２Ａ遮断抗体を開発するための基礎である。

【0066】

ＨＬＡ−ＥおよびＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞は、様々なマウス腫瘍モデルにおける免疫療法後に強力に増大した。
本発明者らの学部における免疫療法の臨床適用は、ＨＰＶ誘発癌である子宮頸癌および中咽頭癌ならびに転移性黒色腫を対象とする。ＨＰＶ誘発癌（ＴＣ−１）および黒色腫（Ｂ１６Ｆ１０）についてのマウスモデルは、これらの臨床イニシアチブの開発に貢献してきた。両方のマウスモデルにおいて、本発明者らは、ここで、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＡがＴ細胞免疫および療法誘導性腫瘍管理において果たす役割について研究した。確定されたＢ１６Ｆ１０黒色腫は、ＴＣＲトランスジェニックｐｍｅｌ Ｔ細胞の養子免疫伝達により処置し、これらのＴ細胞は続いてペプチドワクチン接種によってｉｎ ｖｉｖｏ活性化した（図３Ａ、Ｂ）。このプロトコルは、一部の動物において完全な腫瘍管理および他の動物では腫瘍増殖における明確な遅延を生じさせる。一方で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養Ｂ１６Ｆ１０細胞およびｉｎ ｖｉｖｏ増殖腫瘍由来のＢ１６Ｆ１０細胞上のＱａ−１（マウスＨＬＡ−Ｅホモログ）の発現を検出するのは困難であるが（図３Ｃ）、免疫療法により処置されていたマウス由来の腫瘍細胞は、明白に強化されたレベルのＱａ−１を提示した。これは、免疫活性化がＰＤ−Ｌ１について見いだされるものに極めて類似するＱａ−１のアップレギュレーションを生じさせることを示した。そのような阻害性リガンドの増加は、免疫病理学のために組織を保護するための負のフィードバックの手段としてＩＦＮｇにより媒介される可能性が極めて高い。全く同一の腫瘍において、本発明者らは、浸潤性ＣＴＬ上のＮＫＧ２ＡおよびＣＤ９４の発現について解析した。未処置コントロール腫瘍は、ヒトの癌において見いだされる範囲内のパーセンテージである１０〜２０％のＮＫＧ２Ａ^＋ ＣＤ８ Ｔ細胞を含有していた（図３Ｄ）。しかし、免疫療法は、この頻度を６５％まで強度に増加させた。ＮＫＧ２Ａ^＋ ＮＫ細胞の頻度は、免疫療法によっては変化しなかったが、既に５０％を超えていた。注目すべきことに、これらの染色は、ＮＫＧ２ファミリーの他のファミリーメンバーも検出する周知の「２０ｄ５」抗体を用いて実施したが、より多くのＮＫＧ２Ａ特異性抗体１６Ａ１１を用いて確証した。

【0067】

極めて同等のデータが、免疫療法の形態として合成長鎖ペプチドを用いたワクチン接種が適用されるＨＰＶ誘導性ＴＣ１腫瘍モデルにおいて得られた（図４）。ＴＣ１腫瘍細胞の表面上のＱａ−１のレベルは、免疫療法によって明白に増加し、ＮＫＧ２Ａ^＋ Ｔ細胞の頻度もこのモデルにおいて強度に増加した（図４Ａ〜Ｆ）。治療的ワクチン接種は、腫瘍浸潤性ＣＤ８ Ｔ細胞の数を増加させただけではなく、大多数の腫瘍浸潤性ＣＤ８ Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ａの発現も生じさせ（図４Ｆ）、これは局所的免疫活性化および前炎症性サイトカインの遊離が抑制的フィードバック機序、その中でも特にＮＫＧ２Ａを始動させることを示している。ＴＣ１腫瘍モデルにおいて、本発明者らはさらに、バイスタンダー活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に比較して腫瘍特異的ＣＤ８ Ｔ細胞がＮＫＧ２Ａを誘導する優先性、および最後に、治療的ワクチン接種が積極的に極めて多数のＮＫＧ２Ａ^＋ ＮＫ細胞を腫瘍部位に動員することを観察した（図４Ｇ〜Ｈ）。

【0068】

これらのデータは、Ｂ１６Ｆ１０およびＴＣ−１腫瘍モデルが、単剤としての、または数種の他の形態の（免疫）療法と併用してのＮＫＧ２Ａ遮断の免疫療法としての潜在能力を試験するために適していることを証明している。一緒に、マウスモデルからのこれらのデータは、ＮＫおよびＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害力を解放するために、特に強力なワクチンと併用して、ＮＫＧ２Ａへの遮断抗体の大きい治療潜在力を確固として強調している。

【0069】

ＮＫＧ２Ａ受容体の遮断は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＴＬ機能を増加させる
阻害性受容体ＮＫＧ２Ａの遮断が実際にＣＤ８ Ｔ細胞活性化からのブレーキを外すかどうかの最初の徴候として、本発明者らは、公知の特異性を備えるマウスおよびヒトＣＴＬクローンを選択した。これらのＴ細胞は、ＮＫＧ２Ａに対する遮断抗体の存在下または非存在下でＴＣＲ媒介性活性化のためのペプチド負荷標的細胞とともにｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベートした（マウスに対しては２０ｄ５およびヒトに対してはＺ１９９）。抗体２０Ｄ５を用いたＮＫＧ２Ａの遮断は、用量依存法でマウスＣＴＬ応答性を増加させた（図５Ａ〜Ｂ）。最高濃度の遮断抗体は、ＩＦＮｇの３倍の遊離を生じさせた。同様に、同種ペプチドを備えるヒトＣＴＬクローンとＮＫＧ２Ａに対する遮断抗体とのインキュベーションは、増加した応答性をもたらした。興味深いことに、ヒトＣＴＬクローンはＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを均一に発現せず、フローサイトメトリーを用いた単一細胞レベルでのＴ細胞活性化の測定は、ＮＫＧ２Ａが遮断された時点で阻害性受容体を提示するＣＴＬの応答性のみが増加できたことを証明した。この培養内のＮＫＧ２Ａ陰性Ｔ細胞サブセットはこの系では影響を受けなかったが、これは抗体の適格な特異性を証明している（図５Ｃ）。そこで、これらのデータは、ＮＫＧ２Ａ^＋ ＣＴＬがＮＫＧ２Ａ−ＣＴＬと比較して優れた活性化潜在能力を有することを示唆している。

【0070】

実施例２
ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣならびにＨＬＡ−Ｅに関連して、ＣＤ８^＋腫瘍浸潤性Ｔ細胞の予後予測およびそれと全生存率（ＯＳ）との関連を調査するために、本発明者らは、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者１９７例の群を対象に遡及的に研究した。本発明者らは、肺腺癌がＮＳＣＬＣにおける主要組織学的サブタイプであるためだけではなく（Ｈｅｒｂｓｔ ２００８，Ａｌｂｅｒｇ ２００５）、ＨＬＡ消失がＮＳＣＬＣの他の主要サブタイプである扁平上皮癌より低頻度であり（Ｂａｂａ ２０１３，Ｈａｎａｇｉｒｉ ２０１３ａ，Ｈａｎａｇｉｒｉ ２０１３ｂ，Ｋｉｋｕｃｈｉ ２００７，Ｋｏｒｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ １９９６）、このため活性Ｔ細胞媒介性免疫療法から最も利益が得られると予想されると報告されてきたために、肺腺癌に重点的に取り組んできた。本発明者らのデータは、腫瘍細胞によるＨＬＡ−Ｅの発現は、ＯＳにとっての独立予後因子であることを明らかにした。ＨＬＡ−Ｅの高発現は、ＮＳＣＬＣにおける高い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の陽性予後予測を無効化した。

【0071】

材料および方法
試験集団
本発明者らは、Ｌｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＵＭＣ）において２０００年〜２０１３年にかけて非小細胞性肺癌のサブタイプ腺癌であると診断された患者１９７例を遡及的に同定した。全患者は術前病期診断を受け、第Ｉ／ＩＩ期ＮＳＣＬＣとして分類され、引き続いて全身性リンパ節切除を伴う原発腫瘍の外科的切除術を受けた。腫瘍およびその流入領域リンパ節の外科的切除術後、患者は無病状態であると考えられた。腫瘍組織、臨床データおよびフォローアップデータは、全患者から収集した。ＮＳＣＬＣの病期は、肺癌研究のための国際協会（ＩＡＳＬＣ）の更新された指針を使用してＴＮＭ（腫瘍、結節、転移）分類に従って決定した（Ｔａｎｏｕｅ ２００９）。保存用の腫瘍塊の使用は、Ｄｕｔｃｈ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎからの指針に従っていた。この遡及的試験はヒトを含む医学研究に関する法律（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ａｃｔ：ＷＭＯ）には該当しないため、医学倫理委員会による優先検討事項ではなく、文書によるインフォームドコンセントは入手されなかった。しかし、患者データは匿名扱いにした。

【0072】

抗体
ＨＬＡクラスＩ分子の遊離重鎖の発現を検出するために、マウスモノクローナル抗体ＨＣＡ−２（抗ＨＬＡ−Ａ、１：１，０００）およびＨＣ−１０（抗ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ、１：５００）を使用した。軽鎖および非伝統的ＨＬＡ−Ｅ重鎖各々を検出するため、ウサギ抗ヒトβ２−マイクログロブリン（抗β２Ｍ；クローンＡ−０７２、ＤＡＫＯ、１：２，０００）抗体およびマウス抗ヒトＨＬＡ−Ｅ（クローンＭＥＭ−Ｅ／０２；Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ［１：２００］）抗体を使用した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞を検出するため、マウスモノクローナルＣＤ８抗体（クローンＩＡ５、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ［１：５００］）を使用した。

【0073】

免疫化学
ホルマリン固定してパラフィン包埋した腫瘍塊は、ミクロトームを使用して４μｍの切片に切削し、キシレン中で脱パラフィンした。内因性ペルオキシダーゼ活性は、０．３％の過酸化水素／メタノールを使用して２０分間遮断した。サンプルを続いて７０％および５０％エタノール中で再水和させ、抗原回復はサンプルをクエン酸バッファー（ｐＨ９．０またはｐＨ６．０のいずれか、ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で１０分間にわたり９７℃へ加熱することにより実施した。抗体は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ Ｂａｄ Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に希釈し、室温で一晩インキュベートした。スライドは、室温で３０分間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ ｅｎｖｉｓｉｏｎ）と免疫組織化学的に染色した。ＮｏｖａＲｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）を色原体として適用し、その後にマイヤーのヘマトキシリン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ）を用いて対染色した。全洗浄工程はＰＢＳを用いて実施した。全スライドにはＰｅｒｔｅｘ封入剤（ＨｉｓｔｏＬａｂ，Ｓｗｅｄｅｎ）を載荷した。

【0074】

ＨＣＡ２、ＨＣ１０、β２ＭおよびＨＬＡ−Ｅ染色の微視的評価および解析は、事前に臨床的パラメーターまたは組織病理学的パラメーターに関する知識を与えずに２名の独立観察者（第１観察者がコホートの１００％、第２観察者がコホートの２０％）によって実施された。観察者間一致は、実質的な観察者間一致を示している全染色に対して＞０．７０の係数を生じさせるコーエンのカッパ係数を計算することによって評価した。

【0075】

腫瘍の分化度は、免疫組織化学的染色スライドに基づいて決定し、低分化度、中分化度または高分化度のいずれかに分類した。以前に言及した抗体の発現パターンは、Ｒｕｉｔｅｒ ｅｔ ａ（Ｒｕｉｔｅｒ １９９８）により提案されたスコアリングシステムに従って評価した。この方法を使用して全スライドをスクリーニングし、陽性腫瘍細胞のパーセンテージを非存在０％、散在性１〜５％、局所性６〜２５％、時折２５〜５０％、多数５１〜７５％および大多数７６〜１００％に分類した（１〜６）。さらに、このスコアは、陰性、低、中および高と分類される染色強度を含んでいる（０〜３）。この強度は、高強度が常に観察されたＣＤ８を除いて全抗体について記録した。最終スコアは強度およびパーセンテージに基づき、１〜４（低発現）および５〜９（高発現）に分類した。

【0076】

浸潤性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の定量化
ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤は、各スライドの５枚の無作為に取り込んだ高分解能（２００Ｘ）画像をスクリーニングすることによって評価した。腫瘍巣の領域および間質領域をマーキングし、ＮＩＨ−ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ｖ１．４８）を使用して計算した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は面積によって計数し、上皮内および間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞間を区別した腫瘍領域１ｍｍ２当たりの細胞数として表示した。上皮内、間質および総数の腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の平均数を計算し、患者は、全患者についての平均ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤に基づいて、高いまたは低いＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤について二分した。

【0077】

統計解析
ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定を使用して、患者群間の連続変量を比較し、両側χ二乗検定によってカテゴリーデータの群比較を実施した。全生存期間（ＯＳ）は、手術日から何らかの原因に起因する死亡日または５年間の最高フォローアップ期間を含む最終フォローアップ日までと規定した。ＨＬＡ発現に基づいて生存期間を評価すると、ＨＬＡの低および高発現は、機能的ＨＬＡ分子の存在、すなわちβ２ＭならびにＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ／ＣおよびＨＬＡ−ＥのＨＬＡ重鎖各々の両方の高発現を示している。生存率は、カプラン・マイヤー法を使用して推定し、ログランク検定を使用して２本の曲線を比較した。単変量コックス比例ハザードモデルを使用して、単一決定因子のＯＳへの作用を試験した。多変量コックス回帰解析は、単変量解析において統計的有意性に達する変量を用いて実施した。段階的回帰を使用して最終モデルを推定した。＜０．０５の両側Ｐ値は統計的有意と見なされた。複数の試験のためにボンフェローニ補正を適用した。データ解析のために統計ソフトウエアパッケージＳＰＳＳ ２０．０（ＳＰＳＳ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用した。生存率曲線を推定するため、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０２（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＬＡ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用した。

【0078】

結果および考察
間質ＣＤ８ Ｔ細胞浸潤は、全生存率と最高に相関する。
肺腺癌を有する患者１９７例のコホートを評価した。腫瘍による分化度は、低（５０％）、中（３３％）または高分化度（１７％）のいずれかに分類した。３１％の症例では、患者は、術前診断様式に基づいて第Ｉ／ＩＩ病期と分類されたにもかかわらず、進行性疾患（第ＩＩＩ／ＩＶ病期）を有していた（表１）。平均年齢は６６歳（範囲、３７〜９０歳）であり、男性（ｎ＝９９）および女性（ｎ＝９８）の数は均一に分布していた。

【0079】

ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の程度は、腫瘍切片中での上皮内および間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の列挙によって試験した。ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の代表的な免疫組織化学的染色は、図６に提示した。全上皮内ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤は７〜１，４６０ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２（腫瘍）（平均１９４；メジアン１５０）、間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞は３５〜１，３３２ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２（腫瘍）（平均３４８；メジアン３２０）および全ＣＤ８^＋ Ｔ細胞、３２〜１，００８ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２（腫瘍）（平均２７１；メジアン２４６）の範囲に及んだ。男性と女性との間で全ＣＤ８^＋ Ｔ腫瘍細胞浸潤に差は見られなかった（χ二乗検定、ｐ＝０．２６７）。患者は、全患者について平均ＣＤ８^＋ Ｔ細胞数に基づいて、低いまたは高いＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤を備える２群に分割し、ＯＳとの関連をプロットした。相当に強力な間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤は、有益な臨床転帰との最良の関連を提示した（ログランク検定、ｐ＝０．０６８；図７Ａ〜Ｃ）。低い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の負の効果は、患者を三分位数に基づいて分割した時点で拡大され、低い三分位数にある患者は低ＣＤ８^＋間質Ｔ細胞浸潤を有すると規定され、以前に報告されたものと同様に、他の患者は高い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤を有すると規定された（ｐ＝０．０４６、図１０）（Ａｌ−Ｓｈｉｂｌｉ ２００８，Ｂｒｅｍｎｅｓ ２０１１，Ｄｊｅｎｉｄｉ ２０１５，Ｄｏｎｎｅｍ ２０１５，Ｈｉｒａｏｋａ ２００６）。

【0080】

伝統的ＨＬＡクラスＩ発現とＣＤ８^＋ Ｔ細胞との相互作用。
ａ）４０％を超えるＮＳＣＬＣ患者はチェックポイント阻害剤療法に応答する（Ｇａｒｏｎ ２０１５，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ ２０１５，Ｊｉａ ２０１５）；およびｂ）特に腫瘍がＣＤ８^＋ Ｔ細胞に対する新規抗原を生成しているそれらの患者は応答する可能性が高い（Ｒｉｚｖｉ ２０１５）という事実によって例示されたように、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞によるＮＳＣＬＣの攻撃の成功を支配する因子を同定することは極めて興味深い可能性がある。このプロセスにおいて重要な分子の１つは、Ｔ細胞に腫瘍特異的ペプチドを提示するために必要とされるＨＬＡ分子の発現である。汎ＨＬＡクラスＩ抗体を用いて測定すると、ＨＬＡの消失は肺腺癌を有する患者のほぼ半数で観察される（Ｂａｂａ ２０１３，Ｈａｎａｇｉｒｉ ２０１３ａ，Ｈａｎａｇｉｒｉ ２０１３ｂ，Ｋｉｋｕｃｈｉ ２００７，Ｋｉｋｕｃｈｉ ２００８）。本発明者らは、ＨＬＡ消失をより詳細に図表化する目的で、抗体を使用してＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃの発現を識別した。伝統的ＨＬＡクラスＩ分子の発現の評価は、β２−Ｍ、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃに対する抗体を用いて実施した（図６）。β２−Ｍは症例の７６％において発現したが、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃは症例の各々５６％および２５％のみで発現した（表１）。そこで、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａが患者の約４０％において減少するが、一方で、ＨＬＡ−Ｂ／Ｃ発現の減少は、ＮＳＣＬＣにおけるＨＬＡ−Ｂ／Ｃの消失に関して詳細に報告している唯一の他の試験（Ｒａｍｎａｔｈ ２００６）と一致している７５％という高さであることを見いだした。

【0081】

続いて、腫瘍病期、ＨＬＡクラスＩ分子およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の間の関連を評価した（表３）。ＨＬＡ−Ａの高発現は高発現のＨＬＡ−Ｂ／Ｃと強度に相関していた（ｐ＝０．０００１）。機能的ＨＬＡクラスＩ発現の存在または非存在と腫瘍浸潤性ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の総数との間には明白な相関が存在した。ＨＬＡ−Ａ（ｐ＝０．０１２）またはＨＬＡ−Ｂ／Ｃ（ｐ＝０．０１８）のダウンレギュレーションを備える腫瘍は平均するとより少数の全腫瘍浸潤性Ｔ細胞を提示した（表３および図１１）。

【0082】

患者をＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ／Ｃの低または高発現に従って群分類すると、カプラン・マイヤー曲線は臨床転帰に伝統的ＨＬＡクラスＩ発現が及ぼす直接的影響を全く明らかにしなかった（図７Ｄおよび７Ｅ）。しかし、腫瘍組織内の伝統的ＨＬＡ発現と全ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤との間の相互作用解析は、ＯＳに関してＨＬＡ−Ｂ／Ｃ陽性腫瘍（ＨＲ０．２１２、９５％ ＣＩ：０．０７４−０．６０６、ｐ＝０．００４）またはＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ／Ｃ陽性腫瘍（ＨＲ０．２１５、９５％ ＣＩ：０．０６９−０．６７３、ｐ＝０．００８）における高密度のＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の明白に有益な作用を明らかにした（表２および図８）。これは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤をＨＬＡ−Ａ発現単独に関連して解析した場合には該当しなかった。そこで、ＨＬＡ発現およびＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤間の相互作用解析は、高密度ＣＤ８^＋ Ｔ細胞腫瘍浸潤の予後予測作用が、腫瘍が高発現の伝統的ＨＬＡクラスＩ、特にＨＬＡ−Ｂ／Ｃの高発現を提示する場合にのみ保持されているという新規な観察をもたらした（図８）。

【0083】

ＨＬＡ−Ｅの発現はＯＳに対する強力な負の決定因子である。
ＮＳＣＬＣにおけるＴ細胞の攻撃の成功を支配する他の重要な分子は、いわゆるチェックポイントである（Ｐａｎ ２０１５）。非伝統的ＨＬＡ−Ｅ分子は、阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａにとってのリガンドであり、重要な免疫学的チェックポイントを表す（Ｋｏｃｈａｎ ２０１３，ｖａｎ Ｈａｌｌ ２０１０）。肺腺癌症例の７０％超では、ＨＬＡ−Ｅの高発現が観察された（図６Ｆおよび表１）。ＨＬＡ−Ｅの高発現にはより不良なＯＳが結び付いていた（ＨＲ０．６３２、９５％ ＣＩ：０．４０６−０．９８４、ｐ＝０．０４２；表２および図７Ｆ）。この試験は、非伝統的ＨＬＡ−Ｅ分子の高発現がＮＳＣＬＣにおける全生存率に影響を及ぼすことを証明するために最初にすべき試験である。

【0084】

間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤およびＨＬＡ−Ｅの発現の両方が単一決定因子としての全生存率に最強の影響を提示したため（図７Ｂおよび７Ｆ、図１０）、これら２つの因子間の相互作用を試験するためにその後の解析を実施した。明白に、高密度間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤はＨＬＡ−Ｅ陰性腫瘍における強力な正の予後予測値であることを証明した（ＨＲ０．３０３、９５％ ＣＩ：０．１２４−０．７４１、ｐ＝０．００９；図９Ａおよび９Ｂ）。しかし、高密度間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤の有益な作用はＨＬＡ−Ｅの高発現を備える患者では消失する（ＨＲ１．００４、９５％ ＣＩ：０．５５０−１．８３５、ｐ＝０．９８９；図９Ｃおよび９Ｄ）。結論として、腫瘍浸潤性間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞により提示される有益な作用は、ＨＬＡ−Ｅが腫瘍によって高度に発現した場合に妨害される。ＨＬＡ−Ｅの発現は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａと係合した場合にＴリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能を阻害することができ（Ｋｏｃｈａｎ ２０１３，ｖａｎ Ｈａｌｌ ２０１０，Ｕｌｂｒｅｃｈｔ １９９９）、ならびにＨＬＡ−ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃと係合した場合にこれらの細胞を活性化することができる（Ｇｕｍａ ２００５）。乳癌および子宮頸部腺癌における少数の研究は、ＨＬＡ−Ｅを発現する腫瘍についての生存率有益性を報告しているが（ｄｅ Ｋｒｕｉｊｆ ２０１０，Ｓｐａａｎｓ ２０１２）、一方で、他の研究者は、本発明者らと同様に、卵巣癌、結腸直腸癌および胃癌におけるＯＳへのＨＬＡ−Ｅの負の効果を報告した（Ｇｏｏｄｅｎ ２０１１，Ｂｏｓｓａｒｄ ２０１２，Ｉｓｈｉｇａｍｉ ２０１５，Ｚｈｅｎ ２０１３）。潜在的に、ＣＤ８ Ｔ細胞によって発現したＨＬＡ−Ｅに対する受容体のタイプは、この差異の根底にある。卵巣癌および結腸直腸癌では、Ｔ細胞は阻害性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現することが証明された（Ｇｏｏｄｅｎ ２０１１，Ｂｏｓｓａｒｄ ２０１２）。ＮＳＣＬＣにおける以前の研究と一致して、高密度間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤物は、より長いＯＳと関連していた（図７および図１０）（Ａｌ−Ｓｈｉｂｌｉ ２００８，Ｂｒｅｍｎｅｓ ２０１１，Ｄｊｅｎｉｄｉ ２０１５，Ｄｏｎｎｅｍ ２０１５，Ｈｉｒａｏｋａ ２００６，Ｓｃｈａｌｐｅｒ ２０１５）。本発明者らの研究では、腫瘍細胞によるＨＬＡ−Ｅの高発現は、明白にＣＤ８^＋ Ｔ細胞への負の効果を有していた。ＯＳへの間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が及ぼす正の予後予測作用は、それらの腫瘍細胞上でＨＬＡ−Ｅの低発現を備える患者においてのみ明白であった。ＨＬＡ−Ｅの抗腫瘍発現は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞浸潤物の予後予測作用を完全に無効にした（表２および図９）。

【0085】

ＨＬＡ−Ｅ発現は、肺腺癌におけるＯＳの独立決定因子である。
相対死亡リスクに各単一変量が及ぼす効果を評価するために、生存率差を定量するために単変量および多変量コックス比率ハザード解析を実施した（表２）。腫瘍病期および男性は、以前に肺腺癌におけるＯＳにとって負のリスク因子であると報告されており［３２］、実際に本発明者らのコホートにおいても高病期腫瘍（第Ｉ／ＩＩ病期対第ＩＩＩ／ＩＶ病期、ＨＲ０．６１９、９５％ ＣＩ：０．３９９−０．９６１、ｐ＝０．０３３）ならびに男性（ＨＲ１．８３４、９５％ ＣＩ；１．１８４−２．８３９、ｐ＝０．００７）にはより不良なＯＳが結び付いていた。単変量解析では、腫瘍細胞による非伝統的ＨＬＡ−Ｅの低発現にはこのコホート内の強度に減少した死亡リスクが結び付いていた（ＨＲ０．６３２、９５％ ＣＩ：０．４０６−０．９８４、ｐ＝０．０４２）。高い間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の存在は改善されたＯＳと相関して近有意性に達したため（ＨＲ１．５６０、９５％ ＣＩ：０．９６２−２．５３０、ｐ＝０．０７２）、そこで腫瘍病期、性別およびＨＬＡ−Ｅ発現と一緒に多変量解析に含めた。

【0086】

単変量解析に類似して、間質ＣＤ８^＋ Ｔ細胞がＯＳに及ぼす正の効果は、多変量解析において統計的有意性（ＨＲ１．６１３、９５％ ＣＩ：０．９９３−２．６２０、ｐ＝０．０５４）に近付いた。腫瘍病期および性別に加えて、ＨＬＡ−Ｅの増加した発現はＯＳと有意に関連しており（ＨＲ０．６１２、９５％ ＣＩ：０．３９２−０．９５６、ｐ＝０．０３１）、これは低いＨＬＡ−Ｅ発現が肺腺癌においてＯＳのための独立した正の予後予測因子であることを示している。

【0087】

本発明者らの結果は、肺腺癌の約７０％がＨＬＡ−Ｅの高発原を提示することを証明した（表１）。Ｔ細胞およびＮＫ細胞療法に及ぼすその作用を考慮すると、ＨＬＡ−Ｅおよび／またはそのＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ阻害性受容体を遮断する工程は、ＮＳＣＬＣの免疫療法についての重要な標的を形成する可能性がある。抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体を用いた治療は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍細胞傷害性のＨＬＡ−Ｅ媒介性抑制を告白することが証明されており（Ｌｅｖｙ ２００９，Ｄｅｒｒｅ ２００６）、これは進行性頭頸部癌を有する患者が抗ＮＫＧ２Ａモノクローナル抗体を用いて治療される現在進行中の第Ｉ／ＩＩ臨床試験を生じさせた（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２３３１８７５）。

【0088】

【表1】

【0089】

【表2】

【0090】

【表3】

【0091】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】