特表 2017-534296 ＨＩＶ‐１エンベロープ標的化アームを備える二重特異性分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-534296(P2017-534296A)

(43)【公表日】2017年11月24日

(54)【発明の名称】ＨＩＶ‐１エンベロープ標的化アームを備える二重特異性分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171027BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20171027BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20171027BHJP

   C07K 14/155 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20171027BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20171027BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 31/167 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 31/4045 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 31/145 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20171027BHJP

   A61K 31/137 20060101ALI20171027BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20171027BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171027BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K16/10ZNA

   C07K19/00

   C07K14/155

   A61K39/395 D

   A61K39/395 S

   A61K35/761

   A61K35/76

   A61K31/365

   A61K31/167

   A61K38/07

   A61K31/4045

   A61K31/145

   A61K31/551

   A61K31/137

   A61P31/18

   A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2017-536234(P2017-536234)

(86)(22)【出願日】2015年9月29日

(85)【翻訳文提出日】2017年5月19日

(86)【国際出願番号】US2015053027

(87)【国際公開番号】WO2016054101

(87)【国際公開日】20160407

(31)【優先権主張番号】62/206,586

(32)【優先日】2015年8月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/056,834

(32)【優先日】2014年9月29日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】507189666

【氏名又は名称】デューク ユニバーシティ

(71)【出願人】

【識別番号】504438727

【氏名又は名称】マクロジェニクス，インコーポレーテッド

(71)【出願人】

【識別番号】509110851

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティー オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】100123858

【弁理士】

【氏名又は名称】磯田 志郎

(72)【発明者】

【氏名】ヘインズ バートン エフ．

(72)【発明者】

【氏名】フェラーリ グイド

(72)【発明者】

【氏名】ケーニヒ スコット

(72)【発明者】

【氏名】ジョンソン レスリー エス．

(72)【発明者】

【氏名】ラム チャーイン カオ

(72)【発明者】

【氏名】スング ジュリア エー．

(72)【発明者】

【氏名】マーゴリス デイヴィッド エム．

(72)【発明者】

【氏名】リュウ リキン

(72)【発明者】

【氏名】ノードストローム ジェフリー リー．

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C087

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA16

4C084BA26

4C084BA27

4C084CA04

4C084DA27

4C084MA05

4C084MA16

4C084MA28

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC551

4C084ZC552

4C084ZC751

4C084ZC752

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA38

4C085BA69

4C085BB11

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB43

4C085CC01

4C085CC03

4C085CC05

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF12

4C085FF17

4C085FF18

4C085GG02

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC13

4C086CA03

4C086CB30

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086MA16

4C086MA28

4C086MA56

4C086MA59

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB33

4C086ZC55

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA05

4C087MA16

4C087MA28

4C087MA56

4C087MA59

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB33

4C087ZC55

4C087ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA13

4C206CA31

4C206FA11

4C206JA72

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA05

4C206MA36

4C206MA48

4C206MA76

4C206MA79

4C206MA83

4C206MA86

4C206NA14

4C206ZB33

4C206ZC55

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA05

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は：ＨＩＶ‐１エンベロープ標的化アームと、エフェクタ細胞を標的化するアームとを備える、二重特異性分子；これらの二重特異性分子を含む組成物；及びその使用方法を対象とする。特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、２つの異なる細胞上の２つの異なる標的又はエピトープに結合でき、ここで第１のエピトープは、第２のエピトープとは異なる細胞タイプにおいて発現し、これにより上記二重特異性分子は、これら２つの細胞を一体とすることができる。特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、２つの異なる細胞に結合でき、ここで上記二重特異性分子は、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８又はＣＨ４４の結合特異性を有するアームを備える。
【選択図】図８Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

互いに対して共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備える、二重特異性分子であって：
（Ｉ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；並びに
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
を備え、
（ＩＩ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）前記エピトープ（２）に対して特異的な前記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）前記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する前記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；並びに
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような前記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
前記ドメイン（Ｂ）及び前記ドメイン（Ｄ）は連結して、前記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成する、二重特異性分子。

【請求項2】

第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を備える、二重特異性分子であって、
前記ポリペプチドは共有結合し：
（Ｉ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであって、前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記ドメイン（Ｃ）は、ペプチドリンカー３又はスペーサリンカー３によって隔てられている、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
（ＩＩ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）前記エピトープ（２）に対して特異的な前記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）前記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する前記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
（ＩＩＩ）前記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ペプチドリンカー３；
（ｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような前記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
前記ドメイン（Ｂ）及び前記ドメイン（Ｄ）は連結して、前記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し；
前記第１のポリペプチド及び前記第３のポリペプチドの前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ鎖を形成する、二重特異性分子。

【請求項3】

第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を備える二重特異性分子であって、
前記ポリペプチドは共有結合し：
（Ｉ）前記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが続くペプチドリンカー３；
（ｉｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）であって、前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び前記ドメイン（Ａ）は、ペプチドリンカー４によって隔てられている、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；
（ｉｖ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
を備え、
（ＩＩ）前記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）前記エピトープ（２）に対して特異的な前記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）前記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する前記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、前記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
（ＩＩＩ）前記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ペプチドリンカー３；
（ｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ｄ）及び前記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
前記ドメイン（Ａ）及び前記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような前記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
前記ドメイン（Ｂ）及び前記ドメイン（Ｄ）は連結して、前記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し；
前記第１のポリペプチド及び前記第３のポリペプチドの前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ鎖を形成する、二重特異性分子。

【請求項4】

前記第１のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは「ノブ」設計であり、前記第３のポリペプチド鎖の前記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは「ホール」設計であるか、又はその逆である、請求項２又は３に記載の二重特異性分子。

【請求項5】

前記エピトープ（２）は、ＣＤ３エピトープ又はＣＤ１６エピトープである、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項6】

前記二重特異性分子は、Ａ３２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３又はＣＤ１６にも結合する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項7】

前記二重特異性分子は、７Ｂ２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３又はＣＤ１６にも結合する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項8】

前記二重特異性分子は、ＣＨ２８抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３又はＣＤ１６にも結合する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項9】

前記二重特異性分子は、ＣＨ４４抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３又はＣＤ１６にも結合する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項10】

Ａ３２イムノグロブリンの前記ドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐Ａ３２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項11】

Ａ３２イムノグロブリンの前記ドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐Ａ３２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項12】

７Ｂ２イムノグロブリンの前記ドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐７Ｂ２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項13】

７Ｂ２イムノグロブリンの前記ドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐７Ｂ２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項14】

ＣＨ２８イムノグロブリンの前記ドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐ＣＨ２８ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項15】

ＣＨ２８イムノグロブリンの前記ドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐ＣＨ２８ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項16】

ＣＨ４４イムノグロブリンの前記ドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐ＣＨ４４ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項17】

ＣＨ４４イムノグロブリンの前記ドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐ＣＨ４４ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項18】

前記ドメイン（Ａ）は、ＶＬ‐Ａ３２、ＶＬ‐７Ｂ２、ＶＬ‐ＣＨ２８又はＶＬ‐ＣＨ４４を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項19】

前記ドメイン（Ｅ）は、ＶＨ‐Ａ３２、ＶＨ‐７Ｂ２、ＶＨ‐ＣＨ２８、ＶＨ‐ＣＨ４４を備える、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の二重特異性分子。

【請求項20】

前記第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、又は配列番号４４を備える、請求項１に記載の二重特異性分子。

【請求項21】

前記第２のポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、又は配列番号４５を備える、請求項１に記載の二重特異性分子。

【請求項22】

配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５又は配列番号４４の前記第１のポリペプチドと、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７又は配列番号４５の前記第２のポリペプチドとを備える、請求項１に記載の二重特異性分子。

【請求項23】

配列番号４６の前記第１のポリペプチドと、配列番号４７の前記第２のポリペプチドと、配列番号４８の前記第３のポリペプチドとを備える、請求項２に記載の二重特異性分子。

【請求項24】

請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の二重特異性分子、又は前記二重特異性分子のいずれの組み合わせを含む、組成物。

【請求項25】

ＨＩＶ‐１抗体Ａ３２、ＨＩＶ‐１抗体７Ｂ２、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ２８又はＨＩＶ‐１抗体ＣＨ４４の結合特異性を有する第１のアームと、ＣＤ３又はＣＤ１６を標的化する第２のアームとを備える二重特異性分子を含む、組成物。

【請求項26】

前記二重特異性分子は、Ｆｃ部分を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

ＨＩＶ‐１抗体Ａ３２、ＨＩＶ‐１抗体７Ｂ２、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ２８、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ４４の結合特異性を有する第１のアームと、ＣＤ３又はＣＤ１６を標的化する第２のアームとを備える第２の二重特異性分子を更に含み、
前記第１の二重特異性分子と前記第２の二重特異性分子とは異なる、請求項２４に記載の組成物。

【請求項28】

必要とする被験者においてＨＩＶ‐１感染を治療又は予防するための方法であって、
前記方法は、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の二重特異性分子又は前記二重特異性分子のいずれの組み合わせを治療的有効量で含む組成物を、前記被験者に投与するステップを含む、方法。

【請求項29】

潜伏活性化剤を投与するステップを更に含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記潜伏活性化剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イノモマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせである、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の二重特異性分子をエンコードするヌクレオチドを含む核酸を含む、ベクター。

【請求項32】

請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の二重特異性分子をエンコードする核酸を含むベクターを含む、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２０１４年９月２９日出願の米国特許第６２／０５６，８３４号、２０１５年８月１８日出願の米国特許第６２／２０６，５８６号の利益、及びこれらに対する優先権を主張するものであり、これらの特許の内容は、その全体が参照により本出願に援用される。

【0002】

本特許開示は、著作権保護を受けている内容を含む。著作権所有者は、いずれの人物による、米国特許商標庁の特許ファイル又は記録にあるままの本特許文書又は本特許開示のファクシミリ複製に対して、一切の異論を唱えないが、それ以外についてはいずれのあらゆる著作権を留保する。

【0003】

本出願に引用される全ての特許、特許出願及び刊行物は、その全体が参照により本出願に援用される。これらの刊行物の開示は、本出願に記載の発明の時点において当業者に公知である最新技術をより完全に説明するために、その全体が参照により本出願に援用される。

【0004】

政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号Ｕ１９ ＡＩ０６７８５４及びＵＭ１ ＡＩ１００６４５の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

【0005】

本発明は、ＨＩＶ‐１結合ドメイン及びエフェクタ細胞結合ドメインを備えるＨＩＶ‐１抗体及び二重特異性分子、並びにこれらの使用を対象とする。

【背景技術】

【0006】

高活性抗レトロウイルス療法（Highly Active Antiretroviral Therapy：ＨＡＡＲＴ）は、感染した個体におけるウイルス量の低減及びＨＩＶ‐１感染の影響の改善に有効であった。しかしながら、この治療にもかかわらず、ＨＩＶ感染細胞の潜伏残存がこの治療を逃れるため、ウイルスは上記個体内に存続する。従って、ＨＩＶ‐１感染個体の治療のための治療剤、及びウイルス感染細胞を標的とし、ＨＩＶ‐１感染細胞の潜伏残存を減少させる可能性のある薬剤に対する需要が存在する。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、二重特異性分子、例えば抗体、共有結合性ダイアボディ及び／又は共有結合性ダイアボディ分子を形成するための共有結合したポリペプチド鎖、並びにＨＩＶ‐１の治療におけるその使用を対象とする。特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、２つの異なる標的、又は２つの異なる細胞上のエピトープに結合でき、ここで第１のエピトープは、第２のエピトープとは異なる細胞タイプ上に発現し、これにより上記二重特異性分子は、これら２つの細胞を一体とすることができる。特定の態様では、本発明の二重特異性分子は、２つの異なる細胞に結合でき、ここで上記二重特異性分子は、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８又はＣＨ４４の結合特異性を有するアームを備え、上記アームは、例えばＨＩＶ感染細胞である第１の細胞上に発現するＨＩＶ‐１エンベロープに結合でき、また上記二重特異性分子は、上記第１の細胞とは異なる細胞タイプ上に発現するエピトープに対する結合特異性を有する第２のアームを備え、これにより上記二重特異性分子は、これら２つの細胞を一体とすることができる。特定の実施形態では、上記第２の細胞は、ＣＤ３又はＣＤ１６を発現するエフェクタ細胞である。

【0008】

特定の実施形態では、ある抗体はある特定の標的に対して、この特異的エピトープが公知のペプチド又は多糖（例えば病原体の表面に存在する抗原、例えばｇｐｌ２０、ｇｐ４１又はＣＤ３）でない場合であっても、特異的に結合し、試料又は被験者中に存在する他のタンパク質又は多糖には有意量では結合しない。特異的結合は、当該技術分野において公知の方法で決定できる。様々な競合的結合アッセイが当該技術分野において公知である。抗体抗原複合体に関して、特定の実施形態では、抗原及び抗体の特異的結合は、約１０⁶モル未満、例えば約１０⁶モル、１０⁷モル、１０⁸モル、１０⁹モル未満、又は更に約１０¹⁰モル未満のＫＤを有する。

【0009】

特定の態様では、本発明は、互いに対して共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備える、二重特異性分子を提供し：
（Ｉ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；並びに
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
を備え、
（ＩＩ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）上記エピトープ（２）に対して特異的な上記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）上記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する上記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；並びに
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような上記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
上記ドメイン（Ｂ）及び上記ドメイン（Ｄ）は連結して、上記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成する。

【0010】

特定の態様では、本発明は、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を備える、二重特異性分子を提供し、ここで上記ポリペプチドのうちのいくつかは共有結合し（図８参照）：
（Ｉ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインであって、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び上記ドメイン（Ｃ）は、ペプチドリンカー３又はスペーサリンカー３によって隔てられている、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
（ＩＩ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）上記エピトープ（２）に対して特異的な上記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）上記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する上記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
（ＩＩＩ）上記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ペプチドリンカー３；
（ｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような上記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
上記ドメイン（Ｂ）及び上記ドメイン（Ｄ）は連結して、上記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し；
上記第１のポリペプチド及び上記第３のポリペプチドの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ鎖を形成する。

【0011】

第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖及び第３のポリペプチド鎖を備える二重特異性分子であって、ここで上記ポリペプチドのうちのいくつかは共有結合し（図８参照）：
（Ｉ）上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが続くペプチドリンカー３
（ｉｉ）Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）であって、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び上記ドメイン（Ａ）は、ペプチドリンカー４によって隔てられている、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉｉ）エピトープ（２）に対して特異的な第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；
（ｉｖ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｃ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｃ）；
を備え、
（ＩＩ）上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）上記エピトープ（２）に対して特異的な上記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）上記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の結合特異性を有する上記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー１によって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；
（ｉｉｉ）Ｋコイル又はＥコイルを含むヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）であって、上記ヘテロ二量体促進ドメイン（Ｆ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカー２によって隔てられている、ドメイン（Ｆ）；
を備え、
（ＩＩＩ）上記第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（ｉ）ペプチドリンカー３；
（ｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン；
を備え、
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８、又はＣＨ４４抗体のような上記ＨＩＶ‐１エンベロープ（１）に結合する結合部位を形成し；
上記ドメイン（Ｂ）及び上記ドメイン（Ｄ）は連結して、上記エピトープ（２）に結合する結合部位を形成し；
上記第１のポリペプチド及び上記第３のポリペプチドの上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｆｃ鎖を形成する、二重特異性分子。

【0012】

特定の実施形態では、上記第１のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは「ノブ」設計であり、上記第３のポリペプチド鎖の上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは「ホール」設計であるか、又はその逆である。

【0013】

特定の実施形態では、上記エピトープ（２）は、ＣＤ３エピトープ又はＣＤ１６エピトープである。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、Ａ３２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、７Ｂ２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ２８抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ４４抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ３にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、Ａ３２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ１６にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、７Ｂ２抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ１６にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ２８抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ１６にも結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ４４抗体の特異性を有するＨＩＶエンベロープに結合し、またＣＤ１６にも結合する。

【0014】

特定の実施形態では、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８又はＣＨ４４抗体の結合特異性を有するＨＩＶ‐１エンベロープに結合する結合部位を形成する。特定の実施形態では、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２８又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体エピトープに結合する結合部位を形成する。

【0015】

特定の実施形態では、Ａ３２イムノグロブリンのドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐Ａ３２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、Ａ３２イムノグロブリンのドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐Ａ３２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、７Ｂ２イムノグロブリンのドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐７Ｂ２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、７Ｂ２イムノグロブリンのドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐７Ｂ２ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、ＣＨ２８イムノグロブリンのドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐ＣＨ２８ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、ＣＨ２８イムノグロブリンのドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐ＣＨ２８ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、ＣＨ４４イムノグロブリンのドメイン（Ａ）結合領域（ＶＬ１）は、ＶＬ‐ＣＨ４４ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。特定の実施形態では、ＣＨ４４イムノグロブリンのドメイン（Ｅ）結合領域（ＶＨ１）は、ＶＨ‐ＣＨ４４ＣＤＲ３、ＣＤＲ２及びＣＤＲ１を備える。

【0016】

特定の実施形態では、上記ドメイン（Ａ）は、ＶＬ‐Ａ３２、ＶＬ‐７Ｂ２、ＶＬ‐ＣＨ２８又はＶＬ‐ＣＨ４４を備える。特定の実施形態では、上記ドメイン（Ｅ）は、ＶＨ‐Ａ３２、ＶＨ‐７Ｂ２、ＶＨ‐ＣＨ２８、ＶＨ‐ＣＨ４４を備える。

【0017】

特定の実施形態では、上記第１のポリペプチドは、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、又は配列番号４４を備える。特定の実施形態では、上記第２のポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、又は配列番号４５を備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は相補的な第２のポリペプチドを備え、上記第２のポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、又は配列番号４５を備える。

【0018】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５又は配列番号４４の上記第１のポリペプチドと、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７又は配列番号４５の上記第２のポリペプチドとを備える。

【0019】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号９の上記第１のポリペプチドと、配列番号１１の上記相補的な第２のポリペプチドとを備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号１３の上記第１のポリペプチドと、配列番号１５の上記相補的な第２のポリペプチドとを備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号１７の上記第１のポリペプチドと、配列番号１９の上記相補的な第２のポリペプチドとを備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号２１の上記第１のポリペプチドと、配列番号２３の上記相補的な第２のポリペプチドとを備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号２５の上記第１のポリペプチドと、配列番号２７の上記相補的な第２のポリペプチドとを備える。

【0020】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、又は配列番号４４の上記第１のポリペプチドと、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、又は配列番号４５の上記第２のポリペプチドとで本質的に構成される。

【0021】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、又は配列番号４４の上記第１のポリペプチドと、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２３、配列番号２７、又は配列番号４５の上記第２のポリペプチドとで構成される。

【0022】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号４６、４７及び４８を備える。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号４６、４７及び４８で本質的に構成される。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、配列番号４６、４７及び４８で構成される。特定の実施形態では、上記二重特異性分子の上記第１のポリペプチドは配列番号４６を備え、上記二重特異性分子の上記第２のポリペプチドは配列番号４７を備え、上記二重特異性分子の上記第３のポリペプチドは配列番号４８を備える。

【0023】

特定の態様では、本発明は、上記二重特異性分子のいずれか１つ、又は上記二重特異性分子のいずれの組み合わせを含む、組成物を提供する。特定の実施形態では、上記組成物は、ＨＩＶ‐１抗体Ａ３２、ＨＩＶ‐１抗体７Ｂ２、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ２８、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ４４の結合特異性を有する第１のアームと、ＣＤ３又はＣＤ１６を標的化する第２のアームとを備える二重特異性分子を含む、組成物を含む。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、Ｆｃ部分、又は血清半減期を延長する他のいずれの修飾を含む。特定の実施形態では、上記組成物は更に、ＨＩＶ‐１抗体Ａ３２、ＨＩＶ‐１抗体７Ｂ２、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ２８、ＨＩＶ‐１抗体ＣＨ４４の結合特異性を有する第１のアームと、ＣＤ３又はＣＤ１６を標的化する第２のアームとを備える第２の二重特異性分子を含み、ここで上記第１の二重特異性分子と上記第２の二重特異性分子とは異なる。

【0024】

特定の態様では、本発明は、必要とする被験者においてＨＩＶ‐１感染を治療又は予防するための方法を提供し、上記方法は：本発明の二重特異性分子のうちのいずれか１つ又は上記二重特異性分子のいずれの組み合わせを治療的有効量で含む組成物を、上記被験者に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法は、潜伏活性化剤を投与するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、上記潜伏活性化剤は、ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イノモマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせである。

【0025】

特定の態様では、本発明は、本発明の二重特異性分子をエンコードするヌクレオチドを含む核酸を提供する。特定の態様では、本発明は、本発明の二重特異性分子をエンコードするヌクレオチドを含む核酸を含むベクターを提供する。また、上記二重特異性分子をエンコードする核酸を含むベクターを含む組成物も提供される。特定の態様では、本発明は、本発明の二重特異性分子をエンコードするベクター又は核酸を含む細胞株を提供し、上記ベクターは、本発明の二重特異性分子の発現のためのポリペプチド鎖、例えばポリペプチド鎖１及びポリペプチド鎖２、又はポリペプチド鎖１、ポリペプチド鎖２及びポリペプチド鎖３をエンコードする。特定の実施形態では、上記ベクターは、遺伝子送達及び発現に好適である。特定の実施形態では、上記ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス系ベクター、又はこれらの組み合わせである。

【0026】

特定の態様では、本発明は、二重親和性標的転換試薬（dual affinity retargeting reagent：ＤＡＲＴ）を有するポリペプチドを含む、二重特異性分子を提供し、上記ＤＡＲＴは、互いに対して共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備えるダイアボディ分子を含み：
（Ａ）上記第１のポリペプチド鎖は：
（ｉ）第１のエピトープ（１）に対して特異的な第１のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ１）を備える、ドメイン（Ａ）であって、上記第１のＶＬ１は、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体からのＶＬ若しくはＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなる、ドメイン（Ａ）；
（ｉｉ）第２の標的、例えばエピトープ（２）に対して特異的な、第２のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ２）を備える、ドメイン（Ｂ）であって、上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン（Ｂ）；並びに
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｃ）；
を備え；
（Ｂ）上記第２のポリペプチド鎖は：
（ｉ）上記エピトープ（２）に対して特異的な、上記第２のイムノグロブリンの軽鎖可変ドメインの結合領域（ＶＬ２）を備える、ドメイン（Ｄ）；
（ｉｉ）上記第１のエピトープ（１）に対して特異的な、上記第１のイムノグロブリンの重鎖可変ドメインの結合領域（ＶＨ１）を備える、ドメイン（Ｅ）であって、上記第１のＶＨ１は、Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体からのＶＨ若しくはＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を含むか、これらから本質的になるか、又はこれらからなり、上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、ペプチドリンカーによって互いから隔てられている、ドメイン（Ｅ）；並びに
（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを備える、ドメイン（Ｆ）；
を備え；
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｂ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ｄ）及び上記ドメイン（Ｅ）は、互いと連結してエピトープ結合部位を形成せず；
上記ドメイン（Ａ）及び上記ドメイン（Ｅ）は連結して、上記Ａ３２、７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８、又はＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体エピトープ（１）に結合する結合部位を形成し；
上記ドメイン（Ｂ）及び上記ドメイン（Ｄ）は連結して、上記第２の標的、例えばエピトープ（２）に結合する結合部位を形成する。

【0027】

特定の実施形態では、本発明は二重特異性分子を提供し、ここでＨＩＶ抗体ＶＨ及びＶＬドメインと、ＣＤ３及びＣＤ１６ ＶＨ及びＶＬドメインとは、配向が異なっている。例えば非限定的な実施形態では、ポリペプチド鎖１のＶＬ１ドメインはＣＤ３からのものであり、ＶＨ２ドメインはＨＩＶエンベロープ結合抗体からのものである。この実施形態では、ポリペプチド２のＶＨ１ドメインはＣＤ３からのものであり、ＶＬ２ドメインはＨＩＶエンベロープ結合抗体からのものである。

【0028】

特定の態様では、本発明は、ＨＩＶ‐１エンベロープ及びＣＤ３のエピトープに対して特異的に結合できる二重特異性分子を提供し、上記二重特異性分子は、互いに対して共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備え：
Ａ．上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬＣＤ３）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＨＩＶ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨＨＩＶ‐１）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を備え、
上記サブドメイン１Ａ及び１Ｂは、ペプチドリンカー（例えば配列番号１）によって互いから隔てられている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、上記ドメイン２は、Ｅコイルドメイン（例えば配列番号７）又はＫコイルドメイン（例えば配列番号８）であり、上記ドメイン２は、ペプチドリンカー（配列番号２）によって上記ドメイン１から隔てられている、ドメイン２
を備え；
Ｂ．上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＨＩＶ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬＨＩＶ‐１）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨＣＤ３）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を備え、
上記サブドメイン１Ａ及び１Ｂは、ペプチドリンカー（例えば配列番号１）によって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
ｉｉ．ドメイン２であって、上記ドメイン２は、Ｋコイルドメイン（例えば配列番号８）又はＥコイルドメイン（配列番号７）であり、上記ドメイン２は、ペプチドリンカー（配列番号２）によって上記ドメイン１から隔てられており、また上記第１のポリペプチド鎖の上記ドメイン２及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ドメイン２は、両方ともＥコイルドメイン、又は両方ともＫコイルドメインではない、ドメイン２
を備え：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ３のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＨＩＶ‐１エンベロープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。

【0029】

ＨＩＶ‐１エンベロープ及びＣＤ１６のエピトープに対して特異的に結合できる二重特異性分子であって、上記二重特異性分子は、互いに対して共有結合した第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を備え：
Ａ．上記第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＣＤ１６に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬＣＤ１６）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＨＩＶ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨＨＩＶ‐１）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を備え、
上記サブドメイン１Ａ及び１Ｂは、ペプチドリンカー（例えば配列番号１）によって互いから隔てられている、ドメイン１；
ｉｉ．ドメイン２であって、上記ドメイン２は、Ｅコイルドメイン（配列番号７）又はＫコイルドメイン（例えば配列番号８）であり、上記ドメイン２は、ペプチドリンカー（配列番号２）によって上記ドメイン１から隔てられている、ドメイン２
を備え；
Ｂ．上記第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
ｉ．ドメイン１であって：
（１）ＨＩＶ‐１に結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（ＶＬＨＩＶ‐１）を含む、サブドメイン（１Ａ）；及び
（２）ＣＤ１６に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン（ＶＨＣＤ１６）を含む、サブドメイン（１Ｂ）
を備え、
上記サブドメイン１Ａ及び１Ｂは、ペプチドリンカー（例えば配列番号１）によって互いから隔てられている、ドメイン１；並びに
ｉｉ．ドメイン２であって、上記ドメイン２は、Ｋコイルドメイン（例えば配列番号８）又はＥコイルドメイン（例えば配列番号７）であり、上記ドメイン２は、ペプチドリンカー（配列番号２）によって上記ドメイン１から隔てられており、また上記第１のポリペプチド鎖の上記ドメイン２及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ドメイン２は、両方ともＥコイルドメイン、又は両方ともＫコイルドメインではない、ドメイン２
を備え：
（ａ）上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＣＤ１６のエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成し；
（ｂ）上記第２のポリペプチド鎖の上記ＶＬドメイン及び上記第１のポリペプチド鎖の上記ＶＨドメインは、ＨＩＶ‐１エンベロープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを形成する。

【0030】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、そのＨＩＶ‐１エンベロープが由来するＨＩＶ抗体のようなＨＩＶ‐１エンベロープに結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子はＡ３２‐ＨＩＶ‐１エンベロープエピトープに結合し、即ち上記二重特異性分子は、Ａ３２抗体のようなＨＩＶ‐１エンベロープ、及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、７Ｂ２‐ＨＩＶ１エンベロープエピトープ、及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ２７‐ＨＩＶ‐１エンベロープエピトープ、及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ２８‐ＨＩＶ‐１エンベロープエピトープ、及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ４４‐ＨＩＶ‐１エンベロープエピトープ、及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合する。

【0031】

特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、Ａ３２ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、７Ｂ２ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する。上記二重特異性分子は、ＣＨ２７ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する。上記二重特異性分子は、ＣＨ２８ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する。特定の実施形態では、上記二重特異性分子は、ＣＨ４４ ＨＩＶ‐１エンベロープ抗体の結合特異性を有する。

【0032】

特定の実施形態では、本発明の二重特異性分子は、本明細書（例えば表２及び表３）に記載の配列を含むか、上記配列から本質的になるか、又は上記配列からなる。

【0033】

特定の実施形態では、本発明の二重特異性分子は配列番号９及び１１；配列番号１３及び１５；配列番号１７及び１９；配列番号２１及び２３；配列番号２５及び２７；配列番号４４及び４５（表２及び表３参照）を含むか、上記配列から本質的になるか、又は上記配列からなる。

【0034】

特定の態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性分子のうちのいずれか、又は上記二重特異性分子の組み合わせを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、これらの組成物は、治療的使用のための医薬組成物として処方される。

【0035】

特定の態様では、本発明は、本発明の二重特異性分子をエンコードする核酸を対象とする。特定の実施形態では、これらの核酸はベクターに含まれ、プロモータに作用可能に連結する。特定の態様では、本発明は、本発明の二重特異性分子の発現のための核酸を含む細胞株又は単離された細胞を提供する。

【0036】

特定の態様では、本発明は、ＨＩＶ感染を治療又は予防する方法において使用するための、本発明の二重特異性分子又は上記二重特異性分子をエンコードする核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、これらの方法は更に、潜伏活性化試薬を投与するステップを含む。上記潜伏活性化試薬の非限定的な例としては、例えばボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イノモマイシン、又はこれらのいずれの組み合わせといった、ＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、この併用療法は、潜伏的に感染しているＨＩＶ細胞のプールを標的とする。

【0037】

特定の態様では、本発明は、被験者のＨＩＶ感染を治療又は予防する方法を提供し、上記方法は、本発明の二重特異性分子のうちのいずれか１つ、又は上記二重特異性分子の組み合わせを含む組成物を、治療的に十分な量で、上記被験者に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法は更に、潜伏活性化剤を投与するステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１は、ＡＤＣＣ仲介型ｍＡｂの効力を示す。２２個のＨＩＶ‐１ ＩＭＣに対する５つのＣＨＡＶＩ ｍＡｂのＡＤＣＣ活性を、特異的殺滅の最大パーセンテージとして報告している。各点は、個々のＩＭＣに対する、ｍＡｂの各群に関する全ての陽性結果の平均活性を表す。線は、平均±標準偏差を表す。黒色の線は、陽性応答に関するカットオフを表す。

【図2】図２は、抗ＨＩＶ‐１‐ＤＡＲＴ仲介型細胞毒性活性を示す。ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬ、ＡＥ ＣＭ２３５及びＣ １０８６．ｃ ＩＭＣ（上から下）を感染させた。これらの細胞を、エフェクタ：標的細胞比３３：１において、６、２４及び４８時間にわたって、６つの濃度の抗ＨＩＶ‐１（Ａ３２ｘＣＤ３◆及び７Ｂ２ｘＣＤ３■）並びに対照（４４２０×ＣＤ３●）ＤＡＲＴの存在下で、自己休止ＣＤ８Ｔ細胞を用いてインキュベートした。その結果を、各時点において観察される特異的殺滅の最大パーセンテージとして報告している。

【図3】図３は、抗ＨＩＶ‐１ ＢａＬ ＤＡＲＴ仲介型細胞毒性活性の用量依存を示す。ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬを感染させた。これらの細胞を、エフェクタ：標的細胞比３３、１１及び３：１（上から下）において、４８時間にわたって、６つの濃度の抗ＨＩＶ‐１（Ａ３２ｘＣＤ３◆及び７Ｂ２ｘＣＤ３■）並びに対照（４４２０×ＣＤ３●）ＤＡＲＴの存在下で、自己休止ＣＤ８Ｔ細胞を用いてインキュベートした。その結果を、特異的殺滅のパーセンテージとして報告している。

【図4】図４は、５０％特異的殺滅に到達するためのＤＡＲＴ濃度を示す。ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬ、ＡＥ ＣＭ２３５及びＣ １０８６．ｃ ＩＭＣを感染させた。これらの細胞を、エフェクタ：標的細胞比３３：１において、４８時間にわたって、６つの濃度の抗ＨＩＶ（Ａ３２ｘＣＤ３：赤色及び７Ｂ２ｘＣＤ３：青色）並びに対照（４４２０×ＣＤ３：黒色）ＤＡＲＴの存在下で、自己休止ＣＤ８Ｔ細胞を用いてインキュベートした。各バーは、各感染標的集団に対する５０％特異的殺滅を検出するために必要な濃度を表す。

【図5】図５は、ＣＨ２７、ＣＨ２８及びＣＨ４４ ＨＩＶ‐１抗体の配列を示す。ＣＤＲがこれらの配列（配列番号５７〜７４）中に示されている。

【図6】図６は、Ａ３２抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をエンコードするヌクレオチド配列、並びにＡ３２のＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列（順に配列番号７５〜７８）を示す。

【図7】図７は、７Ｂ２抗体のＶＨ及びＶＬ鎖をエンコードするヌクレオチド配列、並びに７Ｂ２のＶＨ及びＶＬ鎖のアミノ酸配列（順に配列番号７９〜８２）を示す。

【図8】図８Ａ‐Ｃは、本発明の二重特異性分子の構造及びドメインを示す。図８Ａは、２つのポリペプチド鎖からなる二重特異性分子の構造を示す。図８Ｂ及び８Ｃは、Ｆｃドメインを有する３鎖二重特異性分子の第１、第２及び第３のポリペプチド鎖の２つのバージョンの構造を示す（バージョン１、図８Ｂ；バージョン２、図８Ｃ）。

【図9】図９は、様々な配列：リンカー１（配列番号１）；リンカー２（配列番号２）；ヘテロ二量体促進ドメイン並びにＫコイル及びＥコイル配列（配列番号３‐６、７及び８）；リンカー３（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号４９））；リンカー４‐‐配列番号３９、４０；ＣＨ２‐ＣＨ３断片‐‐配列番号４１‐４３；ＣＨ３ＶＨ鎖-配列番号５１；ＣＤ３ＶＬ鎖‐‐配列番号５２、ＣＤ１６ＶＨ鎖‐配列番号５３；ＣＨ１６ＶＬ鎖‐配列番号５４；７Ｂ２ＶＬ鎖‐配列番号５５；７ｂ２ＶＨ鎖‐配列番号５６を示す。配列番号９‐３８、４４‐４８は、様々な二重特異性抗体を示す（表２参照）。

【図10】図１０Ａ‐１０Ｃは、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ構造を示す。（図１０Ａ‐１０Ｂ）これらのＤＡＲＴ分子は、抗ＣＤ３結合アーム（ｈＸＲ３２）と組み合わさった、抗ＨＩＶ‐１結合アーム（Ａ３２又は７Ｂ２）を含有する。これらは２つのポリペプチド鎖：抗ＨＩＶのＶＨに連結した抗ＣＤ３のＶＬを有する第１のもの；抗ＣＤ３のＶＨに連結した抗ＨＩＶのＶＬを有する第２のものからなる。これらの鎖のカルボキシ末端は、鎖間ジスルフィド結合と、対になった、反対の電荷を有するＥコイル／Ｋコイル二量体化ドメインとを有する。対照ＤＡＲＴは、上記アームのうちの１つを、抗ＦＩＴＣ抗体（４４２０）又は抗ＲＳＶ抗体パリビズマブ（ＲＳＶ）配列由来の無関係のもので置換されている。（図１０Ｃ）２つの別個の抗原への同時のＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴの結合、及びＥｎｖ発現ＨＩＶ‐１感染細胞（標的）の溶解のための細胞毒性Ｔ細胞（エフェクタ）の標的転換の概略図。

【図11】図１１Ａ‐１１Ｆは、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ結合特性を示す。図１１Ａ‐１１Ｃは、ＥＬＩＳＡによって、抗原結合を示す。ヒトＣＤ３タンパク質（図１１Ａ）、ＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０タンパク質（図１１Ｂ）、又は同時にＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０及びＣＤ３タンパク質両方（図１１Ｃ）に対する、ＤＡＲＴ結合。図１１Ｄ‐１１Ｆは、ＦＡＣＳによって、細胞表面結合を示す。ＣＤ３を発現する初代ヒトＴ細胞（図１１Ｄ）、ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ、ＣＭ２４４、サブタイプＡＥを発現するＨＥＫ２９３‐Ｄ３７１細胞（図１１Ｅ）、又はＣＤ３及びＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ、ＨＸＢＣ２、サブタイプＢを発現するＪｕｒｋａｔ５２２‐Ｆ／Ｙ細胞（図１１Ｆ）に対するＤＡＲＴ結合。データを、平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）として報告する。細胞のＣＤ３及びＥｎｖ発現特性は丸括弧内で報告されている。Ａ３２及び７Ｂ２はそれぞれＨＩＶ‐１ ｇｐ１２０及びｇｐ４１を認識する標的化アームであり；ＣＤ３はＣＤ３εを認識するエフェクタアームであり；４４２０は無関係な陰性対照アームである。

【図12】図１２Ａ‐１２Ｈは、Ｅｎｖ⁺標的細胞のＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞殺滅を示す。図１２Ａは、ＬＤＨ放出アッセイによって測定された細胞溶解を用いた、４８時間にわたるＥ：Ｔ比１０：１におけるヒトＴ細胞の存在下でのＥｎｖ⁺ Ｊｕｒｋａｔ５２２‐Ｆ／Ｙ細胞のＤＡＲＴ濃度依存性殺滅を示し、ＥＣ₅₀値は、Ａ３２ｘＣＤ３及び７Ｂ２ｘＣＤ３それぞれに関して２３０及び１６０ｐｇ／ｍＬであった。対照ＤＡＲＴ（Ａ３２×４４２０、７Ｂ２×４４２０、４４２０×ＣＤ３）は不活性であった。図１２Ｂは、ＬＤＨ放出アッセイによって測定された細胞溶解を用いた、エフェクタＴ細胞の不在下でのＥｎｖ⁺ Ｊｕｒｋａｔ５２２‐Ｆ／Ｙ細胞のＤＡＲＴ仲介型殺滅の欠如を示す。図１２Ｃは、ＬＤＨ放出アッセイによって測定された細胞溶解を用いた、４８時間にわたるＥ：Ｔ比１０：１における、Ｅｎｖ^‐ ＪｕｒｋａｔΔＫＳ細胞のＤＡＲＴ標的転換殺滅の欠如を示す。図１２Ｄは、ＬＵＭアッセイによって測定された細胞溶解を用いた、４８時間にわたるＥ：Ｔ比１０：１におけるヒトＴ細胞の存在下でのＥｎｖ⁺ Ｊｕｒｋａｔ５２２‐Ｆ／Ｙ ＧＦ細胞のＤＡＲＴ濃度依存性殺滅を示し；ＥＣ₅₀値は、Ａ３２ｘＣＤ３及び７Ｂ２ｘＣＤ３それぞれに関して１７２及び１４７ｐｇ／ｍＬであった。図１２Ｅ‐１２Ｇは、ＬＵＭアッセイによって測定された細胞溶解を用いた、異なるＥ：Ｔ比（１０：１、５：１、１：１）及びインキュベーション時間（２４、４８、７２時間）におけるＥｎｖ⁺ Ｊｕｒｋａｔ５２２‐Ｆ／Ｙ ＧＦ細胞の７Ｂ２ｘＣＤ３ ＤＡＲＴ濃度依存性標的転換Ｔ細胞殺滅を示す。図１２Ｈは、異なるＥ：Ｔ比における７Ｂ２ｘＣＤ３（図１２Ｅ‐１２Ｇからのデータ）による、最大細胞溶解活性の時間経過を示す。

【図13】図１３Ａ‐１３Ｆは、異なる複数のＨＩＶ‐１ ＩＭＣサブタイプに感染したＣＤ４＋細胞に対する、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞の細胞毒性を示す。図１３Ａ‐１３Ｃは、ＤＡＲＴ濃度依存性を示す。ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬ（図１３Ａ）、サブタイプＡＥ ＣＭ２３５（図１３Ｂ）又はサブタイプＣ １０８６．Ｃ（図１３Ｃ）ＩＭＣを感染させ、Ｅ：Ｔ比３３：１（中実の記号）又はエフェクタ細胞の不在下（Ｅ：Ｔ比０：１）（中空の記号）において、自己休止ＣＤ８⁺Ｔ細胞の存在下で、Ａ３２ｘＣＤ３（赤色の円）、７Ｂ２ｘＣＤ３（青色の正方形）又は４４２０×ＣＤ３（黒色の菱形）を用いて４８時間インキュベートした。データを、特異的溶解のパーセンテージ（％ＳＬ）として報告する。ＤＡＲＴ濃度は、０．００１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲であった。図１３Ｄ‐１３Ｆは時間経過を示す。データは、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬ（図１３Ｄ）、サブタイプＡＥ ＣＭ２３５（図１３Ｅ）又はサブタイプＣ １０８６．Ｃ（図１３Ｆ）ＩＭＣに感染させ、Ｅ：Ｔ比３３：１で自己休止ＣＤ８Ｔ⁺細胞を用いてインキュベートしたＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、各ＤＡＲＴに関して６、２４及び４８時間において観察された最大％ＳＬを表す。

【図14】図１４Ａ‐１４Ｈは、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的脱顆粒化を誘発することを示す。図１４Ａ‐１４Ｄは、６時間にわたるＤＡＲＴの存在下でのＨＩＶ‐１ ＢａＬ感染標的細胞を用いたインキュベーション後に、生存／ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ１０７＋Ｔ細胞を識別するための、ゲート戦略の概略図を示す。（図１４Ｅ‐１４Ｇ）点によるプロットは、１ｎｇ／ｍＬの４４２０×ＣＤ３（図１４Ｅ）、７Ｂ２ｘＣＤ３（図１４Ｆ）又はＡ３２ｘＣＤ３（図１４Ｇ）の存在下において観察された生存／ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ＣＤ１０７⁺細胞のパーセンテージを表す。図１４Ｈは、Ｅ：Ｔ比３３：１を用いた、自己感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞を用いた６時間のインキュベーション後に、５体のＨＩＶ‐１血清陰性の健康なドナーそれぞれにおいて観察された、ＣＤ３⁺ＣＤ４^‐ＣＤ８⁺ＣＤ１０７⁺Ｔ細胞の頻度を示す。各記号は、各ドナーに関して実施した二重刺激の平均を表す。線は、平均±標準偏差を表す。＊は、ダネットの多重比較検定後のｐ＜０．０５を示す。

【図15】図１５Ａ‐１５Ｃは、健康なＨＩＶ血清陰性ドナーからの自己ＪＲ‐ＣＳＦ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換ＣＤ８＋Ｔ細胞殺滅を評価するための、ウイルスクリアランスアッセイを示す。ＨＩＶ血清陰性ドナーからの活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞に、ＨＩＶ‐１クローンＪＲ‐ＣＳＦを感染させた後、７日間にわたり、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＨＩＶｘＣＤ３又は対照ＤＡＲＴの不在下（ＤＡＲＴなし）、又は存在下で、Ｅ：Ｔ比１：１において、自己休止ＣＤ８⁺Ｔ細胞を用いてインキュベートした。結果を、２体の健康なドナーに関して（図１５Ａ‐１５Ｂ）、並びにウイルス複製を阻害するための共培養期間中のインテグラーゼ及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤の存在下の健康なドナー２に関して（図１５Ｃ）、示す。各バーは、培養上清中で検出された絶対ｐ２４濃度を表す。エラーバーは、ｎ＝３の標準誤差平均（ＳＥＭ）を表す。＊は、ダネットの多重比較検定によるｐ＜０．０５を示す。

【図16】図１６Ａ‐１６Ｈは、ウイルスクリアランスアッセイが、ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者からのリンパ球を用いて、ＪＲ‐ＣＳＦ又は自己残存（autologous reservoir：ＡＲ）ウイルス感染ＣＤ４＋細胞のＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換ＣＤ８＋Ｔ細胞クリアランスを検出することを示す。ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者からのＣＤ４⁺欠失Ｔ細胞をＰＨＡで活性化し、ＨＩＶ‐１サブタイプＢクローンＪＲ‐ＣＳＦ（図１６Ａ‐１６Ｃ）又は自己残存（ＡＲ）ウイルス単離株（図１６Ｄ‐１６Ｆ）に感染させた後、７日間にわたり、１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＨＩＶｘＣＤ３（Ａ３２ｘＣＤ３、７Ｂ２ｘＣＤ３）又は対照（７Ｂ２×４４２０、４４２０×ＣＤ３）ＤＡＲＴの不在下（ＤＡＲＴなし）又は存在下で、自己ＣＤ８⁺Ｔエフェクタ細胞を用いずに（図１６Ａ、１６Ｄ）、又はＥ：Ｔ比１：１０（図１６Ｂ、１６Ｅ）若しくは１：１（図１６Ｃ、１６Ｆ）の自己ＣＤ８⁺Ｔエフェクタ細胞を用いて、インキュベートした。「コンボ（ｃｏｍｂｏ）」は、合計濃度１００ｎｇ／ｍＬの７Ｂ２ｘＣＤ３及びＡ３２ｘＣＤ３の１：１混合を示す。各バーは、対数（感染標的細胞のみの対照のｐ２４を試験条件のｐ２４で除算）として計算された、培養上清中で検出されたｐ２４のログ倍減少を示す。図１６Ｇは、６時間にわたるＤＡＲＴの存在下でのＨＩＶ‐１ ＪＲ‐ＣＳＦ感染標的細胞を用いたインキュベーション後に、生存／ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１０７＋エフェクタ（ＴＦＬ４‐）Ｔ細胞を識別するための、ゲート戦略の概略図を示す。図１６Ｈは、ｎ＝４患者における、示されているＤＡＲＴ及びＪＲ‐ＣＳＦ感染標的を用いた６時間のインキュベーション後の生存／エフェクタ細胞（ＴＦＬ４陰性）／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／１０７ａ＋細胞の％を示す。エラーバーは、ｎ＝８（図１６Ａ‐１６Ｃ、ただしコンボ：ｎ＝５及び７Ｂ２×４４２０：ｎ＝６を除く）、ｎ＝５（図１６Ｄ‐１６Ｆ）、及びｎ＝４（図１６Ｇ‐１６Ｈ）のＳＥＭを表す。＊は、ダネットの多重比較検定によるｐ＜０．０５を示す。

【図17】図１７Ａ‐１７Ｂは、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換ＣＤ８⁺Ｔ細胞活性を評価するための、潜伏クリアランスアッセイを示す。ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者からの休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＰＨＡ（図１７Ａ）又はボリノスタット（図１７Ｂ）を用いてインキュベートし、患者の潜伏残存のサイズに応じて１２‐３６個の複製ウェルに播種し、２４時間（又は指示されている場合は最大９６時間）にわたり、１００ｎｇ／ｍＬのＨＩＶｘＣＤ３又は対照ＤＡＲＴの不在下又は存在下において、Ｅ：Ｔ比１：１０の自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞を用いて共培養した後、ＤＡＲＴを洗い流し、血清陰性ドナーからのＣＤ８‐欠失ＰＢＭＣを添加して、残留ウイルスを増幅した。１５日目に、ＥＬＩＳＡによって、ｐ２４の存在又は不在に関してウェルを評価した。「コンボ」は、合計濃度１００ｎｇ／ｍＬの７Ｂ２ｘＣＤ３及びＡ３２ｘＣＤ３の１：１混合を示す。結果を、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を添加しなかった対照に対して平準化された％ウイルス回復（陽性ウェルの数／播種した数の合計）として示す。ＮＴは、図２１に示す表による細胞の可用性の低さにより、試験を実施しなった条件を示す。

【図18】図１８は、ＨＩＶ‐１サブタイプ及び中和ＴｉｅｒによるＩＭＣのリストを示す。

【図19】図１９は、Ａ３２ｘＣＤ３及び７Ｂ２ｘＣＤ３と組み換えＥｎｖ及びＣＤ３タンパク質との結合に関する平衡解離定数（Ｋ_D）を示す。

【図20】図２０は、臨床的特徴を示す。

【図21】図２１は、ＤＡＲＴが、ＪＲ‐ＣＳＦ感染自己標的細胞に対して患者Ｔ細胞を標的転換すること、及び絶対ｐ２４濃度を示す。

【図22】図２２は、ＤＡＲＴを用いた潜伏クリアランスアッセイにおける陽性ウェルの絶対数を示す。

【図23】図２３は、ＡＤＣＣ仲介型ｍＡｂの効力及び幅広さを示す。Ａ３２（抗ｇｐ１２０ Ｃ１／Ｃ２）ｍＡｂ（◆）及び７Ｂ２（抗ｇｐ４１クラスタＩ）ｍＡｂ（■）のＡＤＣＣ活性を、２２個のＨＩＶ‐１ ＩＭＣそれぞれに対する特異的溶解の最大パーセンテージ（％ＳＬ）として報告する。各点は１つのＨＩＶ‐１ ＩＭＣを表す。１体のＨＩＶ‐１血清陽性（陽性対照：ｐｏｓ ｃｔｒｌ）及び１体の血清陰性（陰性対照；ｎｅｇ ｃｔｒｌ）ドナーからの血漿から得られた結果も報告する。線は、平均±標準偏差を表す。黒色の線は、陽性応答に関するカットオフを表す。

【図24】図２４は、７Ｂ２及びＡ３２ ｍＡｂの結合に影響を及ぼすことが公知であるＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ残基の保存を示す。ｇｐ４１（ｇｐ１６０、５９８‐６０４位；免疫優性クラスタＩ）の７残基の直鎖配列は、７Ｂ２ ｍＡｂに対する結合部位を含有することが報告されている（２８、２９）。（点突然変異誘発研究に基づいて）Ａ３２ ｍＡｂ結合に影響を及ぼすことが公知であるｇｐ１２０ Ｃ１‐Ｃ４中の不連続残基は、５２、５３、６６、６９、８３、８６、９６、１００、１０３、１０７、１１２、２１５、２１７、２５２、２５６、２６２、４２７及び４７９位に発生する（３７、３９、６８）。ロスアラモス国立研究所（Los Alamos National Laboratory：ＬＡＮＬ）ＨＩＶ１ Ｅｎｖアミノ酸選別ウェブアラインメント（amino acid filtered web alignment）（全てのサブタイプの表現を伴う４５５６個のＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ配列からなるデータベース）におけるこれらの残基の保存を、ＱｕｉｃｋＡｌｉｇｎ分析（http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/QUICK_ALIGNv2/QuickAlign.html）によって評価した。Ｅｎｖの各位における残基の高さは、ＨＩＶ‐１単離株間における上記残基の分布頻度に比例する。残基は、疎水性に応じて着色される：黒色、親水性；緑、中性；青、疎水性。Ｎ５‐ｉ５のＦａｂ断片（Ａ３２様ｍＡｂ）と複合体化したＣＤ４安定化ｇｐ１２０コアの結晶構造に基づいて、（Ｃ１‐Ｃ２内に位置する）５２、５３、６９、１０３、１０７及び２１７位の残基は、直接エピトープ接点である（２７）。

【図25】図２５は、Ａ３２×４４２０及び７Ｂ２×４４２０対照ＤＡＲＴの細胞表面Ｅｎｖ結合を示す。ＨＩＶ‐１Ｅｎｖ、ＣＭ２４４、サブタイプＡＥを発現するＨＥＫ２９３‐Ｄ３７１細胞に結合するＤＡＲＴを測定し、データを、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告する。Ａ３２及び７Ｂ２は、それぞれＨＩＶ‐１ ｇｐ１２０及びｇｐ４１を認識する標的化アームであり；４４２０は、無関係な陰性対照アームである。

【図26】図２６Ａ‐２６Ｄは、ＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴ仲介型Ｔ細胞活性化が、標的細胞との共会合に左右されることを示す。健康な血清陰性ドナーからの未刺激ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞を、４８時間にわたり、４０、０．３２、及び０ｎｇ／ｍＬの対照（ＲＳＶｘＣＤ３）又はＨＩＶｘＣＤ３（Ａ３２ｘＣＤ３、７Ｂ２ｘＣＤ３）ＤＡＲＴの不在下又は存在下において、Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ細胞株を発現するＥｎｖを用いて（図２６Ａ、２６Ｃ）及び用いずに（図２６Ｂ、２６Ｄ）、インキュベートした。ＣＤ８⁺（図２６Ａ‐２６Ｂ）及びＣＤ４⁺（図２６Ｃ‐２６Ｄ）Ｔ細胞活性化を、ＣＤ２５ Ａｂ細胞による染色によって評価した。データを、活性化（ＣＤ２５⁺）Ｔ細胞の頻度（％）として報告する。各バーは、２体の異なるドナーから得られた結果の平均を表す。

【図27】図２７は、ＨＩＶ ＤＡＲＴがＨＩＶ‐１ ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞に特異的に結合することを示す。「方法」のセクションにおいて報告するように、健康なＨＩＶ‐１血清陰性ドナーから得られた活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、４８時間にわたり、ＨＩＶ‐１サブタイプＢ ＢａＬ、ＡＥ ＣＭ２３５、及びＣ １０８６．Ｃを示すＨＩＶ‐１ ＩＭＣに感染させた。非感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞（模擬）を陰性対照として利用した。これらの細胞を、７Ｂ２×４４２０及びＡ３２×４４２０ ＤＡＲＴを用いて染色し、ここではＣＤ３受容体への結合を回避するために、ＣＤ３アームが無関係な４４２０タンパク質に置換された。ＤＡＲＴを用いたインキュベーション後、これらの細胞を、二次抗ＥＫ‐ＩｇＧ２ａ‐ビオチン化複合体で染色することにより、ＤＡＲＴの結合を明らかにした。二次マウス抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂを用いた間接染色技術を利用した、７Ｂ２及びＡ３２ ｍＡｂによる染色を、対照として実施した。二次蛍光標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂ及びパリビズマブｍＡｂを、陰性対照として利用した。「方法」のセクションにおいて報告するように、感染細胞の頻度を、抗ｐ２４ ｍＡｂを用いた細胞内染色によって決定した。各バーは、上でグラフで示したようなＩＭＣに感染したＣＤ４⁺Ｔ細胞及び対照を表す。結果を、ｘ軸上に列挙された、ＤＡＲＴ、ｍＡｂ及び対照のそれぞれによって染色された生存可能な（ｐ２４⁺）ＣＤ４⁺Ｔ細胞の頻度（％）として報告する。

【図28】図２８Ａ‐２８Ｄは、ＨＩＶ‐１感染ドナーからのＰＢＭＣを用いた、追加の標的細胞の不在下における、Ｔ細胞生存率又は活性化状態に対するＨＩＶｘＣＤ３ ＤＡＲＴの影響の欠如を示す。ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者からの未刺激ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞を、７日にわたり、１００ｎｇ／ｍＬの対照（４４２０×ＣＤ３、７Ｂ２×４４２０、Ａ３２×４４２０）又は活性（Ａ３２ｘＣＤ３、７Ｂ２ｘＣＤ３）ＤＡＲＴの不在下又は存在下でインキュベートした。（図２８Ａ‐２８Ｂ）Ｔ細胞生存率を、アネキシンＶ／７‐ＡＡＤに関して細胞を染色することによって評価した。生存細胞は、アネキシンＶ及び７‐ＡＡＤ陰性の細胞として識別した。（図２８Ｃ‐２８Ｄ）Ｔ細胞活性化を、ＨＬＡ‐ＤＲ及びＣＤ２５発現に関して細胞を染色することによって評価した。両分析に関するデータ点は、３回の別個の機会に実施された、ｎ＝３患者からのものである。エラーバーは、標準誤差平均を表す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

単独の、又は潜伏逆転剤と組み合わせた高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）は、潜伏感染細胞のプールを減少させることはできない。これは、ＨＩＶ‐１潜伏感染細胞を排除するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力が限られているためである。二重親和性再標的化タンパク質（ＤＡＲＴ）は、２つの別個の抗原に同時に結合できる、二重特異性の抗体ベースの分子である。ＨＩＶ‐１ ＤＡＲＴは、エフェクタ細胞結合アームと組み合わされたＨＩＶ‐１結合アームを含有し、細胞毒性ＣＤ３＋Ｔ細胞を標的転換して、ＨＩＶ感染細胞に会合してこれを殺滅させるように設計されている。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のパネルを研究して、上記モノクローナル抗体が、２２個の異なる単離株に対してＡＤＣＣを仲介する大きさ及び幅広さを決定した。目標は：１）ＤＡＲＴのＨＩＶ‐１結合アームとして使用できるｍＡｂを同定すること；２）ＨＩＶ‐１感染細胞の殺滅を仲介する能力に関して、得られたＤＡＲＴを試験することである。本明細書では、ＨＩＶ‐１感染性分子クローン（Infectious Molecular Clone：ＩＭＣ）感染標的細胞に対する、ＡＤＣＣ仲介ｍＡｂ及び得られたＤＡＲＴの異なる複数の群の効力に関連するデータを提供する。

【0040】

抗体及び他の結合分子
抗体
本発明は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体、変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を提供する。本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、非特許文献１８中のもののようなＥＵインデックスに従ったものである。いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの抗原認識部位を有する抗体の一部分である。断片は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂Ｆｖ及び単鎖ｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない。

【0041】

モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。モノクローナル抗体は、抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定されていない。

【0042】

モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。特定の実施形態では、上記抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の二重特異性分子及びキメラ抗体、ヒト化抗体又はイヌ化抗体を生成して、抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第4,816,567号;米国特許第5,807,715号;米国特許第5,866,692号;及び米国特許第6,331,415号を参照。

【0043】

二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
非単一特異性「ダイアボディ（diabody）の提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（co‐ligate）して共存させることができる能力という、抗体に対する有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び操作の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305）。

【0044】

ダイアボディエピトープ結合ドメインはまた、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ４０及びＣＤ７４といったＢ細胞の表面決定基を指向してよい（Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) “Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768）。多くの研究において、エフェクタ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916;国際公開第２００６／１１３６６５号；国際公開第２００８／１５７３７９号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１２／１６２０６８号）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えばCao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197参照）。

【0045】

このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で（即ちホモ二量体化を防止するように）達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。

【0046】

本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672参照）。

【0047】

この課題をものともせず、本発明は、ＤＡＲＴ（商標）と呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディを提供する（例えば米国公開特許第２０１４-００９９３１８号；米国公開特許第２０１３-０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０-０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９-００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号、欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１５／０２６８９４号；国際公開第２０１５／０２６８９２号；国際公開第２０１５／０２１０８９号；国際公開第２０１４／１５９９４０号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号；Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449参照（以上の刊行物の内容は、その全体が参照によって本出願に援用される））。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、採用した各ポリペプチド種中に組み込むステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＤＡＲＴ（商標）の２つのポリペプチドはそれぞれ３つのドメインを備える（図８Ａ）。第１のポリペプチドは：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備えるドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える、第２のドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記第２のポリペプチドとのヘテロ二量体化を促進する役割、及びダイアボディの第２のポリペプチドに対する第１のポリペプチドの共有結合を促進する役割を果たす、第３のドメインを備える。第２のポリペプチドは：相補的な第１のドメイン（ＶＬ２ドメイン）；相補的な第２のドメイン（ＶＨ１ドメイン）；並びに第１のポリペプチド鎖の第３のドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進する、第３のドメインを含有する。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。これらの分子は、標的抗原を発現する細胞の標的転換Ｔ細胞（ＣＤ３）又はＮＫ（ＣＤ１６）細胞仲介型殺滅を促進できる。

【0049】

特定の態様では、本発明は、ＨＩＶ‐１及びＣＤ３、又はＨＩＶ‐１及びＣＤ１６に同時に結合できる、ＨＩＶ‐１×ＣＤ３及びＨＩＶ‐１×ＣＤ１６二重特異性１価ダイアボディ、並びにＨＩＶ‐１感染の治療におけるこのような分子の使用を対象とする。

【0050】

特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ‐１×ＣＤ３及びＨＩＶ‐１×ＣＤ１６二重特異性１価ダイアボディは、２つの異なるポリペプチド鎖からなり、上記２つの異なるポリペプチド鎖は互いに関連して、ＨＩＶ‐１のエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３又はＣＤ１６のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する（図８参照）ことにより、ＨＩＶ‐１とＣＤ３又はＣＤ１６とに同時に結合できる。従ってこれらのダイアボディは、ＣＤ３又はＨＩＶ‐１であってよい「第１の抗原（first antigen）」と、上記第１の抗原がＣＤ３である場合はＨＩＶ‐１、上記第１の抗原がＨＩＶ‐１である場合はＣＤ３である、「第２の抗原（second antigen）」とに結合する。あるいはこれらのダイアボディは、ＣＤ１６又はＨＩＶ‐１であってよい「第１の抗原」と、上記第１の抗原がＣＤ１６である場合はＨＩＶ‐１、上記第１の抗原がＨＩＶ‐１である場合はＣＤ１６である、「第２の抗原」とに結合する。

【0051】

特定の実施形態では、図８に示すように、これら２つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、「第１の」抗原（ＣＤ３又はＨＩＶ‐１エンベロープ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第２の抗原（上記第１の抗原がＣＤ３であった場合はＨＩＶ‐１、上記第１の抗原がＨＩＶ‐１であった場合はＣＤ３）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体化促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体化促進ドメインに連結される。特定の実施形態では、上記２つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ_{第1の抗原}‐リンカー１‐ＶＨ_{第2の抗原}‐リンカー２‐ヘテロ二量体化促進ドメインを含有する。

【0052】

特定の実施形態では、これら２つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、Ｎ末端、第２の抗原の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第１の抗原の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体化促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。特定の実施形態では、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体化促進ドメインに連結される。特定の実施形態では、上記２つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ_{第2の抗原}‐リンカー１‐ＶＨ_{第1の抗原}‐リンカー２-ヘテロ二量体化促進ドメインを含有する。

【0053】

第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＨＩＶ‐１エンベロープ又はＣＤ３／ＣＤ１６）に対して特異的な機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ３／１６又はＨＩＶ‐１エンベロープ）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、目的とする標的、特定の実施形態では例えばＨＩＶ‐１エンベロープ及びＣＤ３又はＣＤ１６に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。

【0054】

特定の実施形態では、ポリペプチド鎖の上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てるリンカー１の長さは、上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合するのを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。特定の実施形態では、これはＶＨドメインとＶＬドメインとを隔てるリンカーが原因である。特定の実施形態では、リンカーは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、ただし１５個を超えないアミノ酸である。特定の実施形態では、介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号１）：GGGSGGGGを有する。

【0055】

リンカー２は、ポリペプチド鎖のＶＨドメインを、上記ポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインから隔てる。リンカー２の目的のために、多様なリンカーのうちのいずれを使用できる。特定の実施形態では、このようなリンカー２に関する配列は、アミノ酸配列： GGCGGG（配列番号２）を有し、これは、ジスルフィド結合を介して第１及び第２のポリペプチド鎖を互いに対して共有結合させるために使用できるシステイン残基を有する。

【0056】

第１及び第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体の形成は、ヘテロ二量体化促進ドメインを含むことによって開始させることができる。このようなドメインは、一方のポリペプチド鎖上にGVEPKSC（配列番号３）又はVEPKSC（配列番号４）、及び他方のポリペプチド鎖上にGFNRGEC（配列番号５）又はFNRGEC（配列番号６）を含む（その全体が参照によって本出願に援用される米国特許第２００７／０００４９０９号を参照）。

【0057】

特定の実施形態では、本発明のヘテロ二量体化促進ドメインは、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つの荷電アミノ酸残基を含む、反対の極の１つ、２つ、３つ又は４つのタンデム反復コイルドメインから形成される（Apostolovic, B. et al. (2008) “pH‐Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil,” Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) “Helix‐stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled‐coil Domain,” J. Molec. Biol. 312:221‐228; Arndt, K.M. et al. (2002) “Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils,” Structure 10:1235‐1248; Boucher, C. et al. (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions,” Analytical Biochemistry 399:138‐140; Cachia, P.J. et al. (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross‐Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,” J. Mol. Recognit. 17:540‐557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) “Real‐Time Monitoring of the Interactions of Two‐Stranded de novo Designed Coiled‐Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding,” Biochemistry 42:1754‐1763; Fernandez‐Rodriquez, J. et al. (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled‐Coil Tag,” Protein Science 21:511‐519; Ghosh, T.S. et al. (2009) “End‐To‐End And End‐To‐Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,” Acta Crystallographica D65:1032‐1041; Grigoryan, G. et al. (2008) “Structural Specificity In Coiled‐Coil Interactions,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477‐483; Litowski, J.R. et al. (2002) “Designing Heterodimeric Two‐Stranded α‐Helical Coiled‐Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α‐Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity,” J. Biol. Chem. 277:37272‐37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) “The d′‐‐d‐‐d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′‐‐a‐‐a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled‐coil Dimer Motif,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5): 2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) “Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled‐coil Interface,” J. Molec. Biol. 366:1232‐1242; Tripet, B. et al. (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C‐terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,” J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled‐Coil Structures And Assemblies,” Adv. Prot. Chem. 70:79‐112; Zeng, Y. et al. (2008) “A Ligand‐Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism,” J. Gene Med. 10:355‐367）。

【0058】

このような反復コイルドメインは、完全な反復であってよく、又は置換を有してよい。例えば、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化促進ドメインは、８つの負荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよく、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化促進ドメインは、８つの負荷電アミノ酸残基のシーケンスを含んでよい。反対の電荷のコイルを他方のポリペプチド鎖に対して使用する場合、第１又は第２のポリペプチド鎖にどちらのコイルを設けるかは重要ではない。

【0059】

特定の実施形態では、本発明のＨＩＶ‐１×ＣＤ３二重特異性１価ダイアボディは、負荷電コイルを有する第１のポリペプチド鎖を有する。正荷電アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジン等であってよく、及び／又は負荷電アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸等であってよい。特定の実施形態では、正荷電アミノ酸はリジンであり、及び／又は負荷電アミノ酸はグルタミン酸である。（このようなドメインはホモ二量体化を阻害し、これによってヘテロ二量体化を促進するため）単一のヘテロ二量体促進ドメインしか採用できない。特定の実施形態では、本発明のダイアボディの第１及び第２のポリペプチド鎖両方が、ヘテロ二量体化促進ドメインを含有することが好ましい。

【0060】

特定の実施形態では、ヘテロ二量体化促進ドメインのうちの１つは、４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号７：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）を備え、そのグルタミン酸残基は、ｐＨ７において負の電荷を形成し、またその一方で、ヘテロ二量体化促進ドメインのうちのもう一方は、４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号８：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を備え、そのリジン残基は、ｐＨ７において正の電荷を形成する。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結が促進され、従ってヘテロ二量体化が促進される。いくつかの実施形態では、Ｋコイル及びＥコイルドメインの数は変更でき、当業者は、異なる数のＫコイル又はＥコイルドメインがヘテロ二量体化につながるかどうかを容易に判定できる。

【0061】

本発明のＨＩＶ‐１×ＣＤ３又はＨＩＶ‐ＣＤ１６二重特異性１価ダイアボディは、その第１及び第２のポリペプチド鎖が、その長さに沿って位置決めされた１つ又は複数のシステイン残基を介して互いに対して共有結合するよう、操作されている。このようなシステイン残基は、上記ポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインを隔てる介在リンカーに導入され得る。あるいはリンカー２はシステイン残基を含有してよい。

【0062】

本発明はまた、組み換えＥｎｖタンパク質に結合する能力、ウイルス感染細胞の表面に結合する能力、及び／又は具体的に開示されている抗体のＡＤＣＣ仲介特性を保持する変異体を含む、本明細書において開示されている抗体（及び断片）の変異体、並びに例えばＨＩＶ‐１感染リスクを低減するための上記変異体の使用方法を含む。本明細書において開示されている抗体又はその断片の組み合わせも、本発明の方法において使用できる。

【0063】

特定の実施形態では、本発明は二重特異性抗体を提供する。二重特異性又は二重官能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖のペアと、２つの異なる結合部位とを有する、人工的なハイブリッド抗体である（例えばRomain Rouet & Daniel Christ “Bispecific antibodies with native chain structure” Nature Biotechnology 32, 136-137 (2014); Byrne et al. “A tale of two specificities: bispecific antibodies for therapeutic and diagnostic applications” Trends in Biotechnology, Volume 31, Issue 11, November 2013, Pages 621-632 Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)（及びその中の参考文献）を参照）。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、いずれのアイソタイプの全抗体である。他の実施形態では、上記二重特異性断片は、限定するものではないが例えばＦ（ａｂ）₂断片である。いくつかの実施形態では、上記二重特異性抗体はＦｃ部分を含まず、これにより、これらのダイアボディは比較的サイズが小さくなり、組織に容易に貫入できる。

【0064】

特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、Ｆｃ領域を含んでよい。例えばＦｃ担持ＤＡＲＴであるがこれに限定されないＦｃ担持ダイアボディは比較的重く、新生児Ｆｃ受容体に結合でき、これによって上記Ｆｃ担持ダイアボディの循環半減期が増大する。Garber “Bispecific antibodies rise again” Nature Reviews Drug Discovery 13, 799-801 (2014), Figure 1a；米国公開特許第20130295121号、米国公開特許第20140099318号（これらはその全体が参照によって本出願に援用される）を参照。特定の実施形態では、本発明は、Ｆｃドメイン又はその一部分（例えばＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。Ｆｃドメイン又はその一部分は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されない、いずれの免疫グロブリンアイソタイプ又はアロタイプに由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン（又はその一部分）は、ＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態では、ＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はそのアロタイプである。いくつかの実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃドメインを含み、このＦｃドメインは、いずれの免疫グロブリンアイソタイプから独立して選択されたＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む（即ち、ＩｇＧに由来するＣＨ２ドメイン及びＩｇＥに由来するＣＨ３ドメイン、又はＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ２に由来するＣＨ３ドメイン等を含むＦｃドメイン）。いくつかの実施形態では、上記Ｆｃドメインは、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチド鎖に、上記ポリペプチド鎖の他のドメイン又は部分に対していずれの位置において組み込むことができる（例えば上記Ｆｃドメイン又はその一部分は、鎖のポリペプチドのＶＬ及びＶＨドメインに対するＣ末端であってよく、又は一方のドメインに対するＮ末端及び他方のドメインに対するＣ‐末端（即ちポリペプチド鎖の２つのドメインの間）であってよい）。

【0065】

上記二重特異性分子の半減期を増大させるために、上記二重特異性分子の他の修飾が考えられる。いくつかの実施形態では、これらの修飾は、血清結合タンパク質のポリペプチド部分の添加を含む。参照により援用される米国特許第２０１００１７４０５３Ａ１号を参照。

【0066】

いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性分子のＦｃ変異体は、非Ｆｃ変異体に比べて増大した半減期を有することが期待される。当業者は、これらの分子の半減期を決定するために、薬物動態研究を含む様々なアッセイを容易に実施できる。

【0067】

いくつかの実施形態では、本発明はポリペプチド鎖を含み、これらのポリペプチド鎖はそれぞれ、本明細書に記載されているようにＣＤＲを含むＶＨ及びＶＬドメインを備える。特定の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬ及びＶＨドメインは同一の特異性を有し、多量体分子は２価かつ単一特異性である。他の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬ及びＶＨドメインは異なる特異性を有し、多量体は２価かつ二重特異性である。

【0068】

いくつかの実施形態では、多量体中の上記ポリペプチド鎖は更に、Ｆｃドメインを備える。上記Ｆｃドメインの二量体化は、イムノグロブリン様機能性、即ちＦｃ仲介型機能（例えばＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用、補体結合等）を呈するダイアボディ分子の形成につながる。

【0069】

上述のような二重特異性ダイアボディ分子の形成は、異なる複数のポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。このような相互作用は潜在的に発生し得る鎖の誤ったペアリングの様々な変形例により、単一細胞組み換え産生系内で効率的に達成するのが困難である。誤ったペアリングの蓋然性を増大させる１つの解決策は、「ノブ・イントゥ・ホール（knobs‐into‐holes）」タイプの突然変異を所望のポリペプチド鎖ペアに組み込むことである。このような突然変異は、ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進する。例えばＦｃ‐Ｆｃ間相互作用に関して、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に突然変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した突然変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」とペアにすることができる。このような一連の変化は、上記ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本出願に援用される））。

【0070】

本発明はまた、変異型Ｆｃ又はその一部分）を含むダイアボディ分子も包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、同等の野生型Ｆｃドメイン又はヒンジＦｃドメイン（又はその一部分）に対する少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば置換、挿入、欠失）を含む。変異型Ｆｃ又は変異型ヒンジＦｃドメイン（又はその一部分）を含む分子（例えば抗体）は通常、野生型Ｆｃドメイン又はヒンジＦｃドメイン又はその一部分を含む分子に対して変化した表現型を有する。この変異型表現型は、変化した血清半減期、変化した安定性、細胞酵素に対する変化した感受性、又はＮＫ依存性若しくはマクロファージ依存性アッセイで測定されるような変化したエフェクタ機能として表現され得る。変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン変異体については、当該技術分野において公知である。例えば国際公開第０４／０６３３５１号、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号、米国特許出願公開第２００５／００６４５１４号。

【0071】

本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの分離した別個のエピトープに同時に結合できる。特定の実施形態では、上記エピトープは同一の抗原に由来する。他の実施形態では、上記エピトープは異なる抗原に由来する。非限定的な実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する、免疫エフェクタ細胞上に発現する決定因子（例えばＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等）に対して特異的である。一実施形態では、上記ダイアボディ分子は、上記エフェクタ細胞決定因子に結合し、また上記エフェクタ細胞を活性化させる。この点に関して、本発明のダイアボディ分子は、これらがＦｃドメインを更に備えるかどうかにかかわらず、（例えば当該技術分野において公知のいずれのエフェクタ機能アッセイにおいてアッセイされるような、又は本明細書に例示されるような）Ｉｇ‐様機能性を呈し得る。

【0072】

特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、例えば本明細書に開示されている抗体のいずれかに由来するＨＩＶエンベロープ結合断片であるがこれに限定されない、ＨＩＶエンベロープ結合断片を含む。他の実施形態では、上記二重特異性抗体は更に、第２の抗原相互作用部位／断片を含む。他の実施形態では、上記二重特異性抗体は更に、少なくとも１つのエフェクタドメインを備える。

【0073】

特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（Antibody‐Dependent Cell‐mediated Cytotoxicity：ＡＤＣＣ）のために、細胞と会合する。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体はナチュラルキラー細胞、好中球多形核白血球、単球及びマクロファージと会合する。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体はＴ細胞エンゲージャである。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、ＨＩＶエンベロープ結合断片及びＣＤ３結合断片を含む。様々なＣＤ３抗体が当該技術分野において公知である。例えば、様々なＣＤ３抗体に関する様々な開示を提供する米国特許第８，７８４，８２１号、及び米国公開特許第２０１４‐００９９３１８号（これらの開示はその全体が参照によって本出願に援用される）を参照。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、ＨＩＶエンベロープ結合断片及びＣＤ１６結合断片を含む。

【0074】

特定の実施形態では、本発明は、二重標的化特異性を有する抗体を提供する。特定の態様では、本発明は、免疫エフェクタ細胞ＨＩＶ‐１エンベロープ発現細胞に対して局在化することによって上記ＨＩＶ‐１エンベロープ発現細胞の殺滅を促進できる、二重特異性分子を提供する。この点に関して、二重特異性抗体は、１つの「アーム」を用いて標的細胞の表面抗原に結合し、第２の「アーム」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の、活性化不変異体構成要素に結合する。このような抗体の、両方の標的に対する同時結合は、標的細胞とＴ細胞との間の一時的な相互作用を生み、これにより、いずれの細胞毒性Ｔ細胞の活性化及びこれに続く標的細胞の溶解が引き起こされる。従って免疫応答は標的細胞に対して標的転換され、ＣＴＬの正常なＭＨＣ制限活性化に関連するような標的細胞によるペプチド抗原提示、又はＴ細胞の特異性とは無関係となる。この文脈において、ＣＴＬが、標的細胞がＣＴＬに対して二重特異性抗体を提示する場合、即ち免疫学的シナプスを模倣する場合にのみ活性化されることが重要である。特に望ましいのは、標的細胞の効率的な溶解を誘発するためにリンパ球の予備的調整又は共刺激を必要としない二重特異性抗体である。

【0075】

特定の実施形態では、本発明は、例えばＤＡＲＴであるがこれに限定されない二重特異性分子の１つ若しくは複数のＨＩＶ‐１結合アーム、又は毒素標識ＨＩＶ‐１結合分子として、ＶＨ及び／若しくはＶＬ鎖の１つ若しくは複数のＣＤＲ、又は本発明の抗体のＶＨ及び／若しくはＶＬ鎖を含む、抗体又は断片を提供する。

【0076】

特定の実施形態では、このような二重特異性分子は、ＨＩＶ‐１エンベロープを標的とする１つの部分と、第２の標的に結合する第２の部分とを備える。特定の実施形態では、上記第１の部分は、本明細書に記載の抗体に由来するＶＨ及びＶＬ配列又はＣＤＲを含む。特定の実施形態では、上記第２の標的は例えばエフェクタ細胞であってよいが、これに限定されない。特定の実施形態では、上記第２の部分はＴ細胞エンゲージャである。特定の実施形態では、上記第２の部分は、ＣＤ３を標的とする配列／パラトープを備える。特定の実施形態では、上記第２の部分は、ＣＤ３抗体、任意に公知のＣＤ３抗体に由来する抗原結合領域である。特定の実施形態では、上記抗ＣＤ抗体は、Ｔ細胞仲介型殺滅を誘発する。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は全抗体である。他の実施形態では、この二重標的化抗体は本質的にＦａｂ断片からなる。他の実施形態では、上記二重標的化抗体は、重鎖定常領域（ＣＨ１）を備える。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体はＦｃ領域を備えない。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、改善されたエフェクタ機能を有する。特定の実施形態では、上記二重特異性抗体は、改善された細胞殺滅活性を有する。二重特異性抗体の設計のための様々な方法及びプラットフォームが当該技術分野において公知である。例えば米国公開特許第２０１４０２０６８４６号、米国公開特許第２０１４０１７０１４９号、米国公開特許第２０１００１７４０５３号、米国公開特許第２００９００６０９１０号、米国公開特許第２０１３０２９５１２１号、米国公開特許第２０１４００９９３１８号、米国公開特許第２０１４００８８２９５号（これらの内容はその全体が参照によって本出願に援用される）を参照。

【0077】

特定の実施形態では、本発明は、ヒト、ヒト化及び／又はキメラ抗体を提供する。このような抗体を構築する方法は、当該技術分野において公知である。

【0078】

特定の態様では、本発明は、個体におけるＨＩＶ‐１感染を治療及び予防する方法における、二重特異性抗体を含む本発明の抗体の使用を提供し、上記方法は、治療的有効量の、本発明の抗体を含む組成物を、薬学的に許容可能な形態で、上記個体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法は、２つ以上のＨＩＶ‐１標的化抗体を含む組成物を含む。特定の実施形態では、上述のような組み合わせ中の上記ＨＩＶ‐１標的化抗体は、ＨＩＶ‐１エンベロープ上の異なるエピトープに結合する。特定の実施形態では、２つ以上のＨＩＶ‐１エピトープを標的とする二重特異性抗体の上述のような組み合わせは、ＨＩＶ‐１感染細胞の殺滅の増大を提供する。他の実施形態では、２つ以上のＨＩＶ‐１エピトープを標的とする二重特異性抗体の上述のような組み合わせは、異なる複数のＨＩＶ‐１サブタイプの認識における幅広さの増大を提供する。

【0079】

本発明はまた、組み換えＥｎｖタンパク質に結合する能力、ウイルス感染細胞の表面に結合する能力、及び／又は具体的に開示されている抗体のＡＤＣＣ仲介特性を保持する変異体を含む、本明細書において開示されている抗体（及び断片）の変異体、並びに例えばＨＩＶ‐１感染リスクを低減するための上記変異体の使用方法を含む。本明細書において開示されている抗体又はその断片の組み合わせも、本発明の方法において使用できる。

【0080】

ポリペプチドに特異的に結合する抗体のＶＬ又はＶＨの相同体及び変異体は典型的には、少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の、関心対象のアミノ酸配列との全長に及ぶ整列全体にわたって計数された配列同一性を有することを特徴とする。基準配列に対して更に高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性といった、上昇したパーセンテージ同一性を示す。配列同一性に関して、全配列未満の配列を比較する場合、相同体及び変異体は典型的には、アミノ酸１０〜２０個の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、また基準配列との類似性に応じて、少なくとも８５％又は少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する場合がある。このような短いウィンドウにわたって配列同一性を決定する方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにおいて入手可能である。当業者は、これらの配列同一性範囲が単に指針としてのみ提供されていることを理解するであろう。ここで提供した範囲外の非常に有意な相同体が得られることは大いにあり得る。

【0081】

特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％同一であり、かつエピトープ結合の幅広さ及び／又は効力を依然として維持している、抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ１、２及び／又は３並びにＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ１、２及び／３と９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％同一であり、かつエピトープ結合の幅広さ及び／又は効力を依然として維持している、抗体を提供する。

【0082】

別の態様では、本発明はＦｃ担持二重特異性分子を提供する。いくつかの実施形態では、一方又は両方のポリペプチドの第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される（図８Ｂ‐８Ｃ）。このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば米国特許公開第２０１４‐００９９３８１号；米国特許公開第２０１３‐０２９５１２１号；米国特許公開第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国特許公開第２００９‐００６０９１０号；欧州特許公開第２７１４０７９号；欧州特許公開第２６０１２１６号；欧州特許公開第２３７６１０９号；欧州特許公開第２１５８２２１号；及び国際公開第２０１５／０２６８９４号；国際公開第２０１５／０２６８９２号：国際公開第２０１５／０２１０８９号；国際公開第２０１４／１５９９４０号；国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号（これらの各刊行物の内容はその全体が参照によって本出願に援用される）参照）。

【0083】

いくつかの実施形態では、これらのＦｃ担持ＤＡＲＴは、３つのポリペプチド鎖を備えてよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）上記第１ボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を備える。従って、このようなＤＡＲＴ（商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体として連結して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。このようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（商標）は、２つの配向（表１）のうちのいずれを有してよい：

【0084】

【表1】

【0085】

ＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、３つの異なるポリペプチド鎖からなり、上記３つの異なるポリペプチド鎖は互いに関連して、ＨＩＶのエピトープに対して特異的な１つの結合部位、及びＣＤ３のエピトープに対して特異的な１つの結合部位を形成する（図８Ｂ‐８Ｃ参照）ことにより、ＨＩＶとＣＤ３とに同時に結合できる。従ってこれらのダイアボディは、ＣＤ３又はＨＩＶであってよい「第１の抗原」と、上記第１の抗原がＣＤ３である場合はＨＩＶ、上記第１の抗原がＨＩＶである場合はＣＤ３である、「第２の抗原」とに結合する。

【0086】

図８Ｂに示すように、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、「第１の」抗原（ＣＤ３又はＨＩＶ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第２の抗原（上記第１の抗原がＣＤ３であった場合はＨＩＶ、上記第１の抗原がＨＩＶであった場合はＣＤ３）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体化促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。非限定的な実施形態では、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体化促進ドメインに連結される。ＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの場合、ヘテロ二量体化促進ドメインのＣ末端は、介在リンカーペプチド（リンカー３）によって、又は介在スペーサリンカーペプチド（スペーサリンカー３）によって、Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）に連結される。非限定的な実施形態では、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ_{第1の抗原}‐リンカー１‐ＶＨ_{第2の抗原}‐リンカー２‐ヘテロ二量体化促進ドメイン‐スペーサリンカー３‐Ｆｃドメインを含有する。

【0087】

あるいは、図８Ｃに示すように、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向に、Ｎ末端、リンカー３、Ｆｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）、例えばアミノ酸配列APSSS（配列番号３９）又はアミノ酸配列APSSSPME（配列番号４０）を有する介在スペーサペプチド（リンカー４）、第１の抗原（ＣＤ３又はＨＩＶ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第２の抗原（上記第１の抗原がＣＤ３であった場合はＨＩＶ、上記第１の抗原がＨＩＶであった場合はＣＤ３）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体化促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。非限定的な実施形態では、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によってヘテロ二量体化促進ドメインに連結される。非限定的な実施形態では、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第１のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：リンカー３‐Ｆｃドメイン‐リンカー４‐ＶＬ_{第1の抗原}‐リンカー１‐ＶＨ_{第2の抗原}‐リンカー２‐ヘテロ二量体化促進ドメインを含有する。

【0088】

非限定的な実施形態では、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、Ｎ末端、第２の抗原の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の抗原結合ドメイン、第１の抗原の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の抗原結合ドメイン、ヘテロ二量体化促進ドメイン、及びＣ末端を含有する。介在リンカーペプチド（リンカー１）は、軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインから隔てる。非限定的な実施形態では、重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、介在リンカーペプチド（リンカー２）によって、ヘテロ二量体化促進ドメインに連結される。非限定的な実施形態では、上記３つのポリペプチド鎖のうちの第２のものは、Ｎ末端からＣ末端への方向において：ＶＬ_{第2の抗原}‐リンカー１‐ＶＨ_{第1の抗原}‐リンカー２-ヘテロ二量体化促進ドメインを含有する。

【0089】

非限定的な実施形態では、これら３つのポリペプチド鎖のうちの第３のものは、リンカーペプチド（リンカー３）、及びＦｃ領域のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（「Ｆｃドメイン」）を含有することになる。

【0090】

本発明の二重特異性分子は、上記ポリペプチド鎖が備える異なるドメインを様々なリンカーが隔てる設計を考えている。上記リンカーの非限定的な具体例を、本明細書において開示している。他のリンカーを容易に決定できる。リンカーのいくつかの更なる例は、米国公開特許第２０１００１７４０５３号（その全体が参照によって本出願に援用される）に開示されている。

【0091】

第１のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第２のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＨＩＶ又はＣＤ３／ＣＤ）に対して特異的な機能性抗原結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメインは、第１のポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第１の抗原の種別に応じてＣＤ３又はＨＩＶ）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。このように、第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインの抗原結合ドメイン及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインの選択は、２つのポリペプチド鎖が全体として、ＨＩＶ及びＣＤ３に結合できる軽鎖及び重鎖可変ドメインの抗原結合ドメインを含むように、整合される。

【0092】

本発明のＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域（例えば完全ＩｇＧ Ｆｃ領域）であってよく、又は完全Ｆｃ領域の断片でしかなくてもよい。本発明の二重特異性１価ＦｃダイアボディのＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、非限定的な実施形態では、上記Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃ領域が示す結合に比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合の低下を引き起こし、又は上記Ｆｃドメインの、１つ若しくは複数の上記受容体に結合する能力を有意に低減する。本発明の二重特異性１価FcダイアボディのＦｃドメインは、完全Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全Ｆｃ領域のＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を備えてよい。本発明の二重特異性１価FcダイアボディのＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を備えてよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃ領域の部分を備えてよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を備えてよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。

【0093】

非限定的な実施形態では、本発明のＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖はそれぞれＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備え、これらは一体に複合体化して免疫グロブリン（ＩｇＧ）Ｆｃドメインを形成する。ヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４１）：
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
である。

【0094】

従って、上記第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインはいずれも、配列番号４１又はその変異型からなってよい。

【0095】

非限定的な実施形態では、本発明のＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号４１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下する（又は結合を実質的に示さない）。このような変化した結合を仲介できるＦｃ変異型及び突然変異型は当該技術分野において公知であり、２３４位及び２３５位におけるアミノ酸置換、２６５位における置換、又は２９７位におけるアミノ酸置換を含む（例えば米国特許第５，６２４，８２１号（これは参照により本出願に援用される）参照）。非限定的な実施形態では、本発明のＨＩＶ×ＣＤ３二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１及び／又は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、２３４位におけるアラニンによる置換、及び２３５位におけるアラニンによる置換を含む。

【0096】

第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の錯体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（例えば「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」とペアにすることができる。このような一連の変化は、二重特異性１価Ｆｃ二重特異性１価Ｆｃダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs‐Into‐Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617‐621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26‐35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95‐101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。非限定的な実施形態では、「ノブ」は第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工され、「ホール」は第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに加工される。従って「ノブ」は、第１のポリペプチド鎖がそのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを介してホモ二量体化するのを防止する役割を果たすことになる。非限定的な実施形態では、第３のポリペプチド鎖は「ホール」置換基を含有するため、第１のポリペプチド鎖とヘテロ二量体化し、かつそれ自体とホモ二量体化する。非限定的な実施形態では、ノブは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。非限定的な実施形態では、ホールは、天然ＩｇＧ Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、第１、第２及び第３のポリペプチド鎖を含む最終的な二重特異性１価Ｆｃダイアボディから精製するのを補助するために、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性１価Ｆｃダイアボディは、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。

【0097】

非限定的な実施形態では、本発明のＨＩＶ×エフェクタ（例えばＣＤ３）二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する配列は、「ノブ担持」配列（配列番号４２）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
を有する。

【0098】

非限定的な実施形態では、本発明のＨＩＶ×エフェクタ（例えばＣＤ３）二重特異性１価Ｆｃダイアボディの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する配列は、「ホール担持」配列（配列番号４３）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。

【0099】

上述のように、配列番号４２及び配列番号４３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃ領域（配列番号４１）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。

【0100】

非限定的な実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号４２のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有する。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４３）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号４２）は、第３のポリペプチド鎖中に採用される。

【0101】

非限定的な実施形態では、上記Ｆｃドメインをアミノ酸置換によって修飾することにより、新生児Ｆｃ受容体に対する結合、及びこれに伴って被験者に投与した場合の上記抗体の半減期を増大させることができる。上記Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＧ Ｆｃドメインとすることができる。上記Ｆｃドメインは、参照によって本出願に援用される米国特許出願第２０１０００９３９７９号に記載されているような、最適化されたＦｃドメインとすることができる。特定の実施形態では、上記抗体は、例えばエピトープ結合の外側のＦｃ領域におけるアミノ酸改変又はその組み合わせを含み、上記改変は抗体の特性を改善できる。様々なＦｃ修飾が当該技術分野において公知である。アミノ酸の番号付与は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスに従ったものである。いくつかの実施形態では、本発明は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合、抗体半減期、並びに粘膜部位における抗体の局在化及び持続性に影響を及ぼす突然変異を含む抗体について考える。例えばKo SY et al., Nature 514: 642-45, 2014,図１ａ及びその中の引用文献; Kuo, T. and Averson, V., mAbs 3(5): 422-430, 2011, 表１：米国公開特許第２０１１００８１３４７号（Ｋａｂａｔ残基２８８のアスパラギン酸及び／又はＫａｂａｔ残基４３５のリジン）、様々なＦｃ領域突然変異に関する米国公開特許第２０１５０１５２１８３号（これらはその全体が参照によって本出願に援用される）を参照。

【0102】

特定の実施形態では、上記抗体は、上記抗体のＦｃ領域又はその周囲にＡＡＡＡ置換を含み、これは、Ｓ２９８Ａ並びにＥ３３３Ａ及びＫ３３３ＡのＦｃ領域ａａを含有するＮＫ細胞によってＡＤＣＣを増強する（ＡＡＡ突然変異）ことが報告されており（Shields RI et al JBC , 276: 6591-6604, 2001）、また４番目のＡ（Ｎ４３４Ａ）は、粘膜部位へのＩｇＧのＦｃＲ新生児仲介型輸送を増強する（Sields RI et al、同上）。抗体の半減期又は機能又はこれら両方を改善する他の抗体突然変異も報告されており、抗体の配列に組み込むことができる。これらは：ＤＬＥ突然変異セット（Romain G, et al. Blood 124: 3241, 2014）；単独の、又は他のＦｃ領域突然変異と組み合わせた、ＬＳ突然変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（Ko SY et al. Nature 514: 642‐45, 2014,図１ａ及びその中の引用文献; Zlevsky et al., Nature Biotechnology, 28(2): 157‐159, 2010; 米国特許公開第20150152183号）；ＹＴＥ Ｆｃ突然変異（Robbie G et al Antimicrobial Agents and Chemotherapy 12: 6147‐53, 2013）；並びにＱＬ突然変異、ＩＨＨ突然変異等の上記抗体に対する他の操作された突然変異（Ko SY et al. Nature 514: 642‐45, 2014,図１ａ及び引用文献；Rudicell R et al. J. Virol 88: 12669‐82, 201も参照）を含む。いくつかの実施形態では、限定するものではないが抗体のフコース化等の修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用に影響を及ぼし得る（例えばMoldt, et al. JVI 86(11): 66189‐6196, 2012参照）。いくつかの実施形態では、上記抗体は、限定するものではないが例えばグリコシル化等の修飾を含むことができ、これは、抗体の多応答性を低減又は排除する。例えばChuang, et al. Protein Science 24: 1019‐1030, 2015参照。いくつかの実施形態では、上記抗体は、Ｆｃドメインが、未修飾Ｆｃドメインに比べて：抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）の増強；ＦｃγＲＩＩＡ若しくはＦｃγＲＩＩＩＡに対する結合の増大；ＦｃγＲＩＩＢに対する結合の低下；又はＦｃγＲＩＩＢに対する結合の増大を呈するように、Ｆｃドメインに修飾を含むことができる。例えば米国公開特許第２０１４０３２８８３６号参照。

【0103】

上述の抗体及びその断片は、組成物（例えば医薬組成物）として処方できる。好適な組成物は、薬学的に許容可能なキャリア（例えば水性媒体）中に溶解又は分散されたＡＤＣＣ仲介型抗体（又は抗体断片）を含むことができる。上記組成物は無菌とすることができ、また注射可能な形態とすることができる（ただし例えば皮内注射又は筋肉内注射に好適な形態に限定されない）。上記抗体（及びその断片）はまた、皮膚又は粘膜への局所投与に適切な組成物として処方できる。このような組成物は、液体、軟膏、クリーム、ゲル及びペーストの形態を取ることができる。上記抗体（及びその断片）はまた、鼻腔内投与に適切な組成物として処方できる。上記抗体（及びその断片）はまた、性交後の洗浄液として又はコンドームと共に投与できるように処方できる。標準的な処方技法を用いて、好適な組成物を調製できる。

【0104】

本明細書に記載の上記抗体（及びその断片）、例えばＡＤＣＣ仲介型抗体は、例えば以下のものを含むがこれらに限定されない状況において有用性を有する：
ｉ）ＨＩＶ‐１感染への予想される既知の曝露の状況において、本明細書に記載の抗体（又はその切断片）を殺菌剤として予防的に（例えば、ＩＶ、局所又は鼻腔内）投与できる；
ｉｉ）強姦の犠牲者、又は商業的なセックスワーカー、又はコンドームの保護のない同性間若しくは異性間接触の状況において発生するような、既知の曝露の又は曝露が疑われる状況において、本明細書に記載の抗体（又はその断片）を、曝露後の予防として、例えばＩＶ又は局所投与できる；
ｉｉｉ）急性ＨＩＶ‐１感染（ＡＨＩ）の状況において、本明細書に記載の抗体（又はその断片）を、初期ウイルス量を制限するためのＡＨＩの治療として、又はウイルス感染ＣＤ４ Ｔ細胞の除去のために投与できる。

【0105】

本発明によると、本明細書に記載のＡＤＣＣ仲介型抗体（又は抗体断片）は、被験者若しくは被験者の免疫系／細胞がＨＩＶ‐１と接触する前、又は上記接触の約４８時間以内に、投与できる。この時間枠内での投与は、被験者の脆弱な細胞のＨＩＶ‐１による感染の阻害を最大化できる。更に、本明細書に記載の抗体の様々な形態を、慢性又は急性感染ＨＩＶ‐１患者に投与でき、またこれらの抗体がウイルス感染細胞の表面に結合して、これらの残存細胞に毒素を送達できるため、残存するウイルス感染細胞を殺滅するために使用できる。特定の実施形態では、本発明の抗体は、ＨＩＶ感染細胞の潜伏残存を活性化するために、潜伏活性化剤と共に投与できる。予想されるのは、休止細胞中の潜伏プロウイルスＨＩＶ ＤＮＡを活性化することによって、不活性細胞が新規のウイルスを産生し始め、免疫系によって認識されて排除されることである。潜伏活性化剤の非限定的な例は、ＨＤＡＣ阻害剤、例えばボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、ジスルフィラム、ＪＱ１、ブリオスタチン、ＰＭＡ、イオノマイシン、又はこれらの組み合わせである。Bullen et al. Nature Medicine 20, 425-429 (2014)参照。

【0106】

好適な用量範囲は、抗体（又は断片）、並びに処方の特性及び投与経路に左右され得る。最適な用量は、過度の実験を行わずに当業者が決定できる。例えば、（毒素又は放射性部分を有する）非標識又は標識抗体の、１‐５０ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体用量を使用できる。毒素を有する又は有しない抗体断片を用いる場合、又は特異的ＣＤ４感染Ｔ細胞に対して標的化できる抗体を使用する場合、より少ない抗体（例えば５ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ）を使用することができる。

【0107】

本発明の抗体及びその断片は、図及び実施例に示されているものから選択されたＶＨ及びＶＬ配列をエンコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて、組み換えによって産生できる。

【0108】

特定の実施形態では、本発明は、完全な抗体／全抗体を提供する。特定の実施形態では、本発明は、その抗体結合断片を提供する。典型的には、断片は、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’)₂、Ｆ（ａｂ）ｃ、ダイアボディ、Ｄａｂ、ナノボディ及びＦｖを含む標的への特異的結合に関して、上記断片が由来する完全な抗体と競合する。断片は、組み換えＤＮＡ技術によって、又は完全なイムノグロブリンの酵素若しくは化学的分割によって、産生できる。

【0109】

本明細書に記載の特異性を有する二重特異性抗体の産生のための、ポリペプチドをエンコードする核酸配列を用いて、組み換え抗体の安定した発現のためのプラスミドを産生できる。組み換え発現及び精製のための方法は、当該技術分野において公知である。Ｆｃの特定の実施形態では、上記プラスミドはまた、本明細書に記載のＦｃ部分に対する変化のいずれを含む。いくつかの実施形態では、上記変化は、上記抗体のＦｃ領域及びその周辺におけるＡＡＡＡ置換であり、これは、Ｓ２９８Ａ並びにＥ３３３Ａ及びＫ３３３ＡのＦｃ領域ａａを含有するＮＫ細胞によってＡＤＣＣを増強する（ＡＡＡ突然変異）ことが報告されており（Shields RI et al JBC , 276: 6591-6604, 2001）、また４番目のＡ（Ｎ４３４Ａ）は、粘膜部位へのＩｇＧのＦｃＲ新生児仲介型輸送を増強する（Sields RI et al、同上）。

【0110】

特定の実施形態では、上記核酸は、好適な宿主細胞における組み換え発現のために最適化されている。特定の実施形態では、ベクターは、遺伝子送達及び発現に好適である。大腸菌、他の微生物宿主、酵母、並びにＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及び骨髄腫細胞株等の様々な高等真核細胞を含む、タンパク質の発現のために使用できる多数の発現系が存在する。

【0111】

ＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞を含むがこれらに限定されないいずれの好適な細胞株を、本発明のポリペプチドの発現のために使用できる。いくつかの態様では、本発明は、これらの抗体をエンコードする核酸、これらの核酸を含む発現カセット及びベクターを提供し、また本発明の抗体をエンコードする上記核酸を発現する単離株細胞も提供される。本発明のポリペプチドは、ポリペプチド及び／又は抗体の精製のためのいずれの好適な方法で精製できる。

【0112】

本明細書全体を通して引用されている様々な刊行物の内容は、その全体が参照により援用される。

【実施例】

【0113】

実施例１Ａ：ＨＩＶ‐１ｘＣＤ３又はＨＩＶ‐１ｘＣＤ１６二重特異性分子及び対照二重特異性分子の構築
表２は、設計、発現及び精製された二重特異性ダイアボディのリストを含む。上記二重特異性ダイアボディは、列挙したアミノ酸配列のヘテロ二量体又ヘテロ三量体である。二重特異性ダイアボディの形成方法は、国際公開第２００６／１１３６６５号、国際公開第２００８／１５７３７９号、国際公開第２０１０／０８０５３８号、国際公開第２０１２／０１８６８７号、国際公開第２０１２／１６２０６８号、国際公開第２０１２／１６２０６７号、国際公開第２０１４／１５９９４０号、国際公開第２０１５／０２１０８９号、国際公開第２０１５／０２６８９２号及び国際公開第２０１５／０２６８９４号において提供されている。

【0114】

【表2】

【0115】

ＨＩＶ‐１×ＣＤ３二重特異性ダイアボディは、ＨＩＶ‐１及びＣＤ３に同時に結合できる。ＨＩＶ‐１×ＣＤ１６二重特異性ダイアボディは、ＨＩＶ‐１及びＣＤ１６に同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（４４２０×ＣＤ３）は、ＦＩＴＣ及びＣＤ３に同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（４４２０×ＣＤ１６）は、ＦＩＴＣ及びＣＤ１６に同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（７Ｂ２×４４２０）は、ＨＩＶ‐１及びＦＩＴＣに同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（Ａ３２×４４２０）は、ＨＩＶ‐１及びＦＩＴＣに同時に結合できる。対照二重特異性ダイアボディ（パリビズマブ×ＣＤ３）は、ＲＳＶ及びＣＤ３に同時に結合できる。

【0116】

表３は、二重特異性分子のいくつかの実施形態の概要を示す。本明細書中の情報は、列挙した二重特異性分子の代替設計のため、並びにこれらの分子からの、ＣＤＲ又はＶＨ及びＶＬ鎖を用いた、他の二重特異性分子、例えば７Ｂ２、ＣＨ２７、ＣＨ２８、ＣＨ４４の設計のために、容易に使用できる。

【0117】

【表3】

【0118】

実施例１Ｃ：ＡＤＣＣ活性を有するＨＩＶ‐１抗体
モノクローナル抗体。ＨＩＶ‐１ ｅｎｖ ｇｐ１２０定常領域１（Ｃ１；ｎ＝１）、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ；ｎ＝３）、及びｇｐ４１クラスタ１［Pollara J. Curr. HIV Res.2013; 11(8):378-3870］を指向するものを表す、５つのｍＡｂ。全てのｍＡｂは表１に列挙されている。ほとんどのｍＡｂは、Ｆｃγ受容体（Ｆｃγ‐Ｒ）ＩＩＩａへの結合を最適化するためのShields et alに従ったアミノ酸置換を含むＦｃ領域のための配列を用いて産生された［Shields RL J Biol Chem 2001; 276(9): 6591-6604］。

【0119】

Ａ３２ ｍＡｂは、ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ ｇｐ１２０のＣ１領域において立体配座的なエピトープを認識し（Wyatt et al, J. Virol. 69:5723‐5733 (1995)）、強力なＡＤＣＣ活性を仲介でき、ＨＩＶ‐１感染個体において検出可能なＡＤＣＣ仲介型Ａｂ活性の大部分をブロックできた（Ferrari et al, J. Virol. 85:7029‐7036 (2011)）。

【0120】

ＣＨ２８又はＣＨ４４は、ＨＩＶ‐１ ＣＤ４ ｂｓ中和抗体である。

【0121】

【表4】

【0122】

感染性分子クローン（ＩＭＣ）。ＨＩＶ‐１ ＩＭＣは、Ａ３Ｒ５細胞株を用いた試験に基づいて、様々な程度の中和感受性を有するものを代表する２２種の分離株を示した。ＩＭＣのリストは表５に報告されている。

【0123】

【表5】

【0124】

全てのＩＭＣは、既に記載されているように、ＮＨＬ４‐３単離株由来の骨格上に生成された［Edmonds TG. Virology. 2010;408(1):1-13; Adachi A. J Virol. 1986;59(2):284-291］が、サブタイプＡＥ９２ＴＨ０２３については、ＩＭＣは、４００２１ＡＥ ＨＩＶ‐１単離株からの骨格を利用して生成された。全てのＩＭＣはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポータ遺伝子を発現し、９つのウイルスオープンリーディングフレーム全てを保持した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポータ遺伝子は、ＨＩＶ‐１ Ｔａｔ遺伝子の制御下で発現した。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＨＩＶ‐１に感染すると、ＨＩＶ‐１複製中のＴａｔの発現は、ルシフェラーゼの発現を誘発し、感染細胞は相対発光単位の測定によって容易に定量化できる。

【0125】

抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイ。このアッセイは、ｍＡｂによって仲介される細胞毒性に関する読み出し値として、ルシフェラーゼベースのプラットフォームを用いて、本出願人らが以前に公開した方法に従って実施した［Pollara J. J Virol。 2014; 88（14）：7715‐7726］。エフェクタ細胞集団は全て、Ｆｃγ‐Ｒ ＩＩＩａの１５８位のアミノ酸に特徴的なヘテロ接合表現型Ｆ／Ｖを有する単一のドナーから得られた。エフェクタ対標的比は、各アッセイにおいて３０：１であった。ＨＩＶ‐１感染個体（Ａ３００）由来の血漿、及びパリビズマブ（抗ＲＳＶ）ｍＡｂを、各アッセイにおいて陽性対照及び陰性対照として使用した。全てのｍＡｂを、各ＩＭＣに対して共に試験した。特異的殺滅のパーセンテージ（％ＳＫ）を、既に報告したように計算した。％ＳＫが＞２０％であれば、結果を陽性とみなした。

【0126】

ＡＤＣＣ仲介型ｍＡｂの効力及び幅。表１に列挙した各ｍＡｂを、表２に列挙した２２個のＩＭＣそれぞれに対して個別に試験した。結果を評価し、活性が観察された濃度とは無関係に、最大ＡＤＣＣ活性を％ＳＫとして識別した。ｍＡｂを、認識されたｅｎｖ ｇｐ１２０及びｇｐ４１領域に基づいてグループ化した。各ｍＡｂの陽性応答の平均を図１で報告する。ｍＡｂの大きさ及び幅を表３にまとめる。ｇｐ１２０ Ｃ１及びｇｐ４１クラスタ１に対する非中和Ａｂは、それぞれ２１個（９５％）及び２０個（９１％）のＨＩＶ‐１分離株を認識することにより、最も広いＡＤＣＣスペクトルを提供した。特異的殺滅の平均％（％ＳＫ）は、Ｃ１ ｍＡｂに関して３７％、ｇｐ４１クラスタＩ ｍＡｂに関して３４％であった。Ａ３２及び７Ｂ２の最大％ＳＫの平均は、それぞれ４５及び４２であった。累積的に、ＣＨ４４ ｍＡｂは、２１〜６０％ＳＫの活性範囲で試験した単離株の＜６０％を認識した。

【0127】

【表6】

【0128】

実施例２：二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子Ａ３２／ＣＤ３及び７Ｂ２／ＣＤ３による細胞殺滅
二重親和性再標的化分子Ａ３２／ＣＤ３（配列番号９及び１１）並びに７Ｂ２／ＣＤ３（配列番号１３及び１５）を設計し、発現させた。これらの分子は、抗ＨＩＶ‐１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ｔｉｅｒ２伝染／始祖（transmitted/founder：Ｔ／Ｆ）ウイルス感染ＣＤ４Ｔ細胞の表面に結合する特性を有するｍＡｂ（即ちＡ３２又は７Ｂ２）［Ferrari G, J Virol. 2011; 85(14):7029-7036; Pollara J. Curr. HIV Res. 2013; 11(8):378-3870］のＦａｂをベースとして生成されたＨＩＶ‐１結合アームと、ＣＤ３（αＣＤ３εアーム）又はＣＤ１６（αＣＤ１６ ｈ３Ｇ８アーム）レポータに結合できるエフェクタ細胞結合アームとを含む。ＨＩＶ‐１又はエフェクタアームの代わりに無関係な結合アーム［αフルオレセイン（４４２０）又はαＲＳＶ］を有する適切な陰性対照も開発した。この実施例において提示される結果は、ＣＤ３‐ＤＡＲＴを用いた実験によるものである。

【0129】

ルシフェラーゼベース細胞毒性アッセイ。本発明者らは、既に報告されている最終的な読み取り値として、ルシフェラーゼ活性の検出に基づいて、ＤＡＲＴによって動員された細胞毒性ＣＤ８ Ｔ細胞によるＨＩＶ‐１感染細胞の排除を定量化するための方法を最適化した［Pollara J. J Virol. 2014; 88(14):7715‐7726］。正常かつ健康なＨＩＶ‐１血清陰性ドナー由来の、凍結保存した休止ＰＢＭＣを、抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）／抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、７２時間活性化した。続いて、磁気ビーズを用いてＣＤ４＋富化細胞集団を得、ＨＩＶ‐１サブタイプＡＥ（ＣＭ２３５）、Ｂ（ＢａＬ）及びＣ（１０８６．ｃ）を提示するＩＭＣの存在下でスピノキュレート（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｅ）し、７２時間培養した。ＣＤ４＋感染標的細胞を、３３：１、１１：１、３：１及び０：１のエフェクタ対標的比で、休止ＣＤ８＋エフェクタ細胞と共に播種した。組み合わせた細胞に、ＤＡＲＴ（４４２０×ＣＤ３、７Ｂ２×ＣＤ３又はＡ３２×ＣＤ３）を０．００１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、６時間、２４時間及び４８時間の時点までインキュベートした。ＤＡＲＴを有しない組み合わせたエフェクタ及び標的細胞、非感染細胞、並びに標的細胞単独を、対照条件として各プレートに含めた。各インキュベーション時間の終わりに、Ｖｉｖｉｒｅｎ基質を各ウェルに添加し、細胞をルミノメータで分析し、ルシフェラーゼ読み取り値によってＲＬＵ値を測定した。目的の細胞毒性細胞の存在下で、感染標的細胞の排除を、既に公表された適切な処方［Pollara J. J Virol. 2014; 88(14):7715‐7726］を用いて評価した。結果を、ＡＤＣＣアッセイに関して記載したように、％ＳＫとして報告する。

【0130】

抗ＨＩＶ‐１ ＤＡＲＴ仲介型細胞毒性活性。上述の結果に基づいて、抗ＨＩＶ‐１アームがＡ３２及び７Ｂ２ Ｆａｂ領域であり、エフェクタ細胞結合アームがαＣＤ３εアームである、２つのＤＡＲＴを生成した。本発明者らはこれら２つのＤＡＲＴ分子を、感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を認識してこれらの殺滅を仲介する能力に関して研究した。ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーから得られた白血球搬出試料をインビトロで感染させて、既に説明したＡＤＣＣルシフェラーゼベースアッセイを用いて、「材料及び方法」のセクションにおいて記載したような標的細胞を生成し、これにより、ＤＡＲＴの細胞毒性効果を検出した。本発明者らは、上記２つのＣＤ３‐ＤＡＲＴ分子（７Ｂ２×ＣＤ３及びＡ３２×ＣＤ３）を、休止ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性をサブタイプＢ ＢａＬ、ＡＥ ＣＭ２３５及びＣ １０８６．ｃ ＨＩＶ‐１ ＩＭＣ感染自己ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して標的転換する能力に関して試験した。本発明者らは、エフェクタ：標的比３３、１１及び３：１におけるエフェクタ及び標的細胞のインキュベーションの６、２４及び４８時間後に、ＤＡＲＴ仲介型細胞毒性を評価した。細胞毒性活性はインキュベーションの６時間後に既に観察されたが、各ＨＩＶ‐１ ＩＭＣに対して３３：１のＥ：Ｔ比を用いると、４８時間においてピーク細胞毒性活性（＞７０％ＳＫ）が検出された（図２）。上記２つのＨＩＶ‐１ ＤＡＲＴの活性は、４４２０×ＣＤ３対照ＤＡＲＴを用いて観察されたバックグラウンドの最大殺滅よりも常に大きかった。本発明者らはまた、ＢａＬ ＩＭＣ（図３）に関して図示されているように、各ＨＩＶ‐１ ＩＭＣ感染標的細胞集団（これもまた各Ｅ：Ｔ比のレベルにおいて考察される）に対する上記２つのＤＡＲＴの用量依存性効力も観察した。

【0131】

３３：１のＥ：Ｔにおいて４８時間で５０％の特異的殺滅が検出されたＤＡＲＴ濃度（殺滅濃度₅₀又はＫＣ₅₀）として、上記２つのＤＡＲＴの効力の違いも分析した。Ａ３２×ＣＤ３ ＤＡＲＴ ＫＣ₅₀は、各ＨＩＶ‐１ ＩＭＣに対して、７Ｂ２×ＣＤ３ ＤＡＲＴ ＫＣ₅₀よりも対数でおよそ１桁小さかった（図４）。

【0132】

これらの結果は、ＤＡＲＴが効果的にＣＤ８＋Ｔ細胞を動員でき、またＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性活性をＨＩＶ‐１感染細胞に向けることができることを示している。

【0133】

実施例３：Ａ３２／ＣＤ１６及び７Ｂ２／ＣＤ１６ ＤＡＲＴ
二重親和性再標的化分子Ａ３２／ＣＤ１６（配列番号４４及び４５）並びに７Ｂ２／ＣＤ１６（配列番号２５及び２７、表２参照）を、実施例６に記載されているように、ルシフェラーゼベース細胞毒性アッセイ、及び休止エフェクタ細胞と共にＣＤ４＋感染標的細胞を用いて、分析する。ＣＤ１６‐ＤＡＲＴアッセイに関しては、エフェクタ細胞はＣＤ１６＋細胞であり、これは全ＰＢＭＣからＣＤ３＋ＣＤ２０＋細胞を除去することによって精製できる。

【0134】

実施例２に記載のルシフェラーゼベース殺滅アッセイを用いて、ＣＤ３‐ＤＡＲＴに関して既に提案したように、増殖性感染のＣＤ１６‐ＤＡＲＴ増強クリアランスの効力及び動態を検査及び比較する。手順は同一であるが、エフェクタ細胞の陰性選択により、ＣＤ１６＋細胞の富化集団が提供される。

【0135】

実施例４：ＣＨ２８及びＣＨ４４ ＤＡＲＴ
ＣＨ２８又はＣＨ４４の結合特異性を有するＨＩＶ‐１アームと、ＣＤ３又はＣＤ１６を標的とするエフェクタ細胞アームとを有するＤＡＲＴ分子を作製し、基本的に実施例２及び３に記載したようなルシフェラーゼベース殺滅アッセイにおいて試験する。ＣＨ２８又はＣＨ４４は、ＨＩＶ‐１ ＣＤ４ ｂｓ中和抗体である。２０１３年９月２７日出願の米国仮特許出願第６１／８８３，２２０号、及びそれに対応するＰＣＴ出願を参照。ＣＨ２８／ＣＤ３は配列番号１７及び１９を備える。ＣＨ４４／ＣＤ３は配列番号２１及び２３を備える。

【0136】

実施例５：ＣＤ１３‐及びＣＤ１６‐ＤＡＲＴの組み合わせ
上記ルシフェラーゼベース殺滅アッセイを用いて、併用処方中のＣＤ１３‐ＤＡＲＴ及びＣＤ１６‐ＤＡＲＴが増強された便益を提供するかどうかを試験する。ＤＡＲＴの組み合わせそれぞれに関して、本発明者らは、３つの異なるＦｃγ‐Ｒ ＩＩＩａ（ＣＤ１６）表現型を発現する細胞と、確立されたＩＭＣのパネルとを利用して、ＣＤ３＋及びＣＤ１６＋エフェクタ細胞を同時に動員するＤＡＲＴの能力を試験する。これらの評価は、ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーから回収された白血球搬出試料を用いて実施する。

【0137】

本明細書中に引用される全ての文献及び他の情報源は、その全体が参照によって本出願に援用される。

【0138】

実施例６：二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）タンパク質は、潜伏ＨＩＶ感染細胞のＴ細胞仲介型細胞溶解を指示する
ＨＩＶ特異性免疫の増強は、潜伏ＨＩＶ感染を排除するために必要であると思われる。この目的のために、新規の免疫治療モダリティ、即ち２つの異なる細胞表面分子に同時に結合できる二重特異性抗体ベースの分子である、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）タンパク質が開発されている。ここで説明されるのは、ＨＩＶ感染標的細胞に結合することが公知である、幅広く結合するＡＤＣＣ仲介型抗体に由来する１価ＨＩＶ‐１エンベロープ（Ｅｎｖ）結合アームを用いて設計された、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴであり、これは、細胞溶解性エフェクタＴ細胞に会合するよう設計された１価ＣＤ３結合アームに連結する。従ってＤＡＲＴはポリクローナルＴ細胞を、異なるＨＩＶ‐１サブタイプに感染したＣＤ４⁺Ｔ細胞を含むＥｎｖ発現細胞に特異的に会合してこれを殺滅するよう、標的転換させ、これにより、ＨＩＶ特異的免疫の必要性を取り除く。抑制性抗レトロウイルス療法（ａｎｔｉ‐ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ：ＡＲＴ）を受けている患者からのリンパ球を用いて、ＤＡＲＴは、ＨＩＶ‐１株ＪＲ‐ＣＳＦに重感染した、又はＨＩＶ感染患者の休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞から単離された自己残存ウイルスに感染した、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の、インビトロでのＣＤ８⁺Ｔ細胞クリアランスを仲介した。重要なことには、ＤＡＲＴは、潜伏ウイルスの発現の誘発後に、休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞培養物からのＨＩＶのＣＤ８⁺Ｔ細胞クリアランスも仲介した。ＨＩＶ潜伏逆転剤と組み合わせると、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、ＨＩＶ感染個体の潜伏ＨＩＶ‐１残存をクリアする、効果的な免疫治療剤となる潜在能力を有する。

【0139】

抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）がＨＩＶを根絶できないことは、まず、休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞の潜伏感染の実証（１）によって示唆され、次に、強力なＡＲＴを受けている患者の休止ＣＤ４⁺記憶Ｔ細胞からの、珍しい完全な自律増殖性（replication‐competent）ＨＩＶの回復（２‐４）によって示唆された。現行のＡＲＴはＨＩＶ感染を根絶できないというのは、これらの長寿命のＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＨＩＶ遺伝子又はタンパク質を最小限しか発現しない状態で、持続的に感染したままとなり、また免疫系によって認識されないままとなるためである（１、５、６）。主に中枢記憶Ｔ細胞内における、休止状態のＨＩＶ感染の持続性は、ＨＩＶ感染の根絶の主要な障害である（２‐４、７‐９）。

【0140】

ウイルスの持続性は、効果的な一連の新規複製のないウイルス粒子の発現を示し、薬物耐性又は治療の失敗をもたらさないように思われる（１２、１３）ような、非常に低いレベルの検出可能なウイルスＲＮＡによって、治療された患者のかなりの割合で現れる（１０、１１）。しかしながら、持続性ウイルス血症は、免疫応答によってＨＩＶ‐１感染細胞を認識及びクリアすることができないことを実証している。

【0141】

慢性的に感染した個体は一般に、ＡＲＴを撤退させると急速なウイルスのリバウンドを有する（１４‐１６）。この観察は、患者の免疫系が、更なる介入によって補強されない限り、ウイルス血症を制御できないことを示唆している。従って、治療上の免疫付与は、ＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺細胞性免疫応答が比較的保存されたままであるときにＡＲＴを開始した個体においてさえも、ＡＲＴの不在下でウイルス血症を抑制できる増強された抗ＨＩＶ免疫の誘発には現在まで成功していない（１７）。従って、ＡＲＴにもかかわらず持続するＨＩＶ感染細胞、及び同様にＡＲＴにもかかわらずほとんどの患者に見られる低レベルのウイルス血症の原因である未知の細胞の潜伏プールの除去は、新規で革新的な戦略を必要とする。１つの初期段階、即ち潜伏期の破壊及び潜伏感染した細胞におけるウイルス抗原発現の誘導が、集中的に調査されている（１８、１９）。しかしながら、潜伏逆転剤（ＬＲＡ）の開発において早期の進歩が得られているため、持続性感染をクリアする能力の改善も探求する必要がある。

【0142】

潜伏感染細胞は非常に稀であり、たとえ潜在残存が、休止中枢記憶ＣＤ４⁺細胞１０⁶個あたり感染細胞約１個という典型的な推定値の６０倍も多い場合（２０）であっても、現在のＬＲＡは、この集団のごく一部分においてしかプロウイルス転写を誘発し得ず、また提示されるウイルス抗原の量も少なくなり得る（２１、２２）。従って、低レベルのウイルス血症を産生する細胞及び潜伏状態を離れるよう誘導された休止状態の感染細胞の両方を検出及びクリアするために、新規かつロバストな免疫応答が必要となり得る。

【0143】

潜伏ＨＩＶの再活性化後、ウイルス抗原が細胞の表面に提示され、従って抗体又は抗体由来分子によって標的とされ得る。このアプローチの実証概念は、免疫毒素、即ち毒素エフェクタドメインに連結した抗体又はリガンド等の標的化ドメインからなる二重官能性キメラタンパク質によって提供されている（２３）。ＨＩＶ感染個体における、免疫毒素を用いた初期臨床試験は、免疫学的又は臨床的マーカに対して持続的な影響を与えることができなかった（２４）が、免疫毒素３Ｂ３‐ＰＥ３８（２５）は、ＢＬＴヒト化マウスモデルにおいて、ＡＲＴにもかかわらず持続するＨＩＶ感染細胞のレベルを低下させることが報告されている（２６）。

【0144】

いくつかのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＨＩＶ‐１感染細胞を認識でき、Ｆｃγ受容体担持細胞に会合して、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介できるものとして報告されており（２７）、例えばＡ３２及び７Ｂ２は、それぞれｇｐ１２０（２８）及びｇｐ４１（２９、３０）中の保存された残基に結合する非中和ｍＡｂである。これらの特性に基づいて、２つの二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）タンパク質（３１、３２）が生成され、上記タンパク質中では、Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂに由来するＨＩＶエンベロープ標的化アームを、ヒト化抗ＣＤ３ε ｍＡｂであるｈＸＲ３２に由来するＣＤ３エフェクタアームと組み合わせることによって、２つのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ、即ちＡ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３が生成された（図１０）。

【0145】

Ｔ細胞とＤＡＲＴ等の抗原発現標的細胞及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャタンパク質（ＢｉＴＥ）とを共会合させる二重特異性分子は、主に腫瘍学における使用のために特性決定され、開発されている（３１‐３４）。これらは、両方の結合アームの会合に依存し、これにより、主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）とは独立した様式で、標的細胞を発現する抗原に対して、ポリクローナルＴ細胞の細胞溶解活性を活性化及び標的転換する（３１‐３４）。このクラスの二重特異性分子は、ｍＡｂに関して典型的に採用されるものよりも何倍も低い用量においてインビボで有効であり（３３、３４）、また上記二重特異性分子は、再発性又は難治性Ｂ前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療のための、ＣＤ１９×ＣＤ３ ＢｉＴＥであるブリナツムマブの承認によって証明されているように、許容可能な安全性を有しながら臨床的に強力かつ効果的であることが示されている（３５、３６）。Ｃ末端に鎖間ジスルフィド結合を有し、構造的にコンパクトであることによって、標的とエフェクタ細胞との間の安定した細胞間接触を形成するのに非常に好適となったＤＡＲＴは、並列比較においてＢｉＴＥよりも高い効力を示す（３２、３７）。

【0146】

本明細書において開示されるのは、潜在的な臨床ＨＩＶ根絶戦略を模倣するために設計されたモデル系において、ＨＩＶ感染患者の細胞から発生した真正潜伏ウイルス単離株に感染したものを含む、ＨＩＶ‐１に感染したＣＤ４⁺細胞に対してＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換する、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの能力である。感染細胞上の保存されたＨＩＶ‐１抗原を認識し、同時にポリクローナルエフェクタＴ細胞上の受容体と会合する、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの能力は、既存のＨＩＶ特異的細胞毒性エフェクタ細胞を活性化する必要を克服し（３８）、従ってＣＤ４⁺Ｔ細胞の残存の効果的な排除を妨げる大きなハードルを乗り越える。

【0147】

ＤＡＲＴに関するＨＩＶアーム選択。Ａ３２ ｍＡｂは、（エピトープクラスタＡ内の）ｇｐ１２０ Ｃ１／Ｃ２立体構造のＣＤ４誘発性エピトープに結合し（２８、３９‐４１）、また７Ｂ２ ｍＡｂは、ｇｐ４１クラスタＩの線形エピトープに結合する（２９、３０、４２）。上記２つのｍＡｂを、サブタイプＡ、ＡＥ、Ｂ及びＣの２２個の代表的なＨＩＶ‐１感染分子クローン（infectious molecular clone：ＩＭＣ）のパネルに対して、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）を仲介する能力に関して試験した（図１８）。Ａ３２ ｍＡｂは、平均パーセント特異的溶解（％ＳＬ）４３．６９％（１２‐８６％の範囲；図２３）で、ＨＩＶ‐１単離株のうちの２１個（９５％）を認識した。７Ｂ２ ｍＡｂは、平均％ＳＬ３９．５８％（１５‐７４％の範囲；図２３）で、ＨＩＶ‐１単離株のうちの２０個（９１％）を認識した。ＡＤＣＣの仲介の幅広さ及び効率性を有すること、即ちＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴに必須の特性である、ＨＩＶ感染細胞の表面におけるエピトープアクセス可能性を示すことに加えて、Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂは、これらのｍＡｂによる結合に影響を及ぼすＥｎｖ中の残基が全てのＨＩＶ‐１サブタイプにわたって良好に保存されているため、ＤＡＲＴのためのＥｎｖ結合ドメインの魅力的な源となる（図２４）。これらの特性に基づき、Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂに由来するＨＩＶ標的化アームが、ヒト化抗ＣＤ３ε ｍＡｂであるｈＸＲ３２に由来するＣＤエフェクタアームと組み合わせられた、２つのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴが生成された（図１０Ａ‐１０Ｃ）。これらのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３と名付けられる。ＨＩＶアーム（４４２０×ＣＤ３、ＲＳＶ×ＣＤ３）又はＣＤ３アーム（Ａ３２×４４２０、７Ｂ２×４４２０）の代わりに、抗ＦＩＴＣ抗体（４４２０）由来、又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合タンパク質抗体に対する抗体であるパリビズマブ由来の無関係なアームを有する、対照ＤＡＲＴも生成した。ＨＩＶアーム（４４２０×ＣＤ３、ＲＳＶ×ＣＤ３）又はＣＤ３アーム（Ａ３２×４４２０、７Ｂ２×４４２０）の代わりに、抗ＦＩＴＣ抗体（４４２０）由来、又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合タンパク質抗体に対する抗体であるパリビズマブ由来の無関係なアームを有する、対照ＤＡＲＴも生成した。

【0148】

ＨＩＶ ＤＡＲＴ結合特性。Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３はそれぞれ、ＥＬＩＳＡによって示されるように、組み換えヒトＣＤ３及びＨＩＶ‐１ Ｅｎｖタンパク質に対する結合を、別個にかつ同時に示した（図１１Ａ‐１１Ｃ）。ＣＤ３タンパク質への結合は両方のＤＡＲＴに関して同様であるが、ＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０ ＣＦに対する結合の大きさは、７Ｂ２×ＣＤ３に関しての方がＡ３２×ＣＤ３に関してより大きく、これは恐らく、立体構造のＡ３２エピトープがより高度にＣＤ４依存性であるという事実によるものである（４１‐４４）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づき、ＣＤ３アーム結合に関する平衡解離定数（Ｋ_D）は、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３に関してそれぞれ３．６及び６．１ｎＭであり、ＨＩＶアーム結合に関するＫ_Dは、Ｍ．ＣｏｎＳ ｇｐ１４０ ＣＦＩを用いてＡ３２×ＣＤ３に関して４７．７ｎＭ、そしてＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０ ＣＦを用いて７Ｂ２×ＣＤ３に関して１５．１ｎＭであった（図１９）。ＳＰＲ研究において、これら２つのＤＡＲＴに対して異なるＥｎｖタンパク質を利用したが、これは、ＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０ ＣＦに対するＡ３２×ＣＤ３結合は不十分であり、またＭ．ＣｏｎＳ ｇｐ１４０ ＣＦＩに対する７Ｂ２×ＣＤ３結合は、ｇｐ４１クラスタＩ配列の欠如を理由として排除されるためである。

【0149】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、その細胞表面抗原に特異的に結合する。ＣＤ３エフェクタアームを有するＤＡＲＴ（Ａ３２×ＣＤ３、７Ｂ２×ＣＤ３、４４２０×ＣＤ３）は、ヒトＣＤ３⁺Ｔ細胞に同様の効率で結合するが、ＣＤ３アームを無関係なアームで置換されたＤＡＲＴ（Ａ３２×４４２０、７Ｂ２×４４２０）又は２つの無関係なアームを有するＤＡＲＴ（４４２０×４４２０）は結合しない（図１１Ｄ）。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ（Ａ３２×ＣＤ３、７Ｂ２×ＣＤ３）は、サブタイプＡＥ ＣＭ２４４ Ｅｎｖを発現するＨＥＫ２９３‐Ｄ３７１細胞に効率的に結合し（図１１Ｅ）、Ａ３２×４４２０及び７Ｂ２×４４２０対照ＤＡＲＴでも同様の結合活性が観察される（図２５）。予想されるように、４４２０×ＣＤ３対照ＤＡＲＴはこれらの細胞には結合しない（図１１Ｅ）。Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３は、Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ細胞に結合し、これはＣＤ３及びサブタイプＢ ＨＸＢｃ２ Ｅｎｖの両方を発現し（４５）、ＣＤ３アームを介した結合は、４４２０×ＣＤ３、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３結合の等価性によって示されるように、支配的である。ＣＤ３アームを無関係な４４２０アームで置換してＣＤ３結合を切除した場合、細胞表面Ｅｎｖに対する低レベルの結合が、Ａ３２×４４２０を用いると検出されるが、７Ｂ２×４４２０を用いると検出されない（図１１Ｆ）。

【0150】

Ｅｎｖ発現細胞株のＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞殺滅、及び付随するＴ細胞活性化。Ｊｕｒｋａｔ ５２２‐Ｆ／Ｙは、Ｅｎｖを発現し、かつＨＩＶ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞のためのモデルとして機能する、ヒトＣＤ４⁺細胞株であり、Ｊｕｒｋａｔ‐ΔＫＳは、Ｅｎｖ遺伝子の発現を排除するＥｎｖ遺伝子中の欠失／フレームシフト突然変異を除いて同一の、対照細胞株である（４５）。これらの細胞株を利用して、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの、Ｅｎｖ⁺標的細胞の標的転換Ｔ細胞殺滅を仲介する能力を評価した。標的細胞の細胞溶解は、乳酸デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase：ＬＤＨ）放出を標準的なアッセイで測定することによって決定し、その結果を、ルミネッセンス（luminescence：ＬＵＭ）アッセイによって確認した。ＬＤＨ放出アッセイによって測定されるように、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３は、健康なドナー由来のヒトＴ細胞を標的転換させて、Ｅ：Ｔ比１０：１において濃度依存的な様式でＪｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ細胞を殺滅し、これら２つのＨＩＶ×ＤＡＲＴは、インキュベーションの４８時間後に、５０パーセント有効濃度（ＥＣ₅₀）が１６０‐２３０ｐｇ／ｍＬであるという、同様の効力を示した（図１２Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ細胞のＤＡＲＴ仲介型標的転換Ｔ細胞殺滅は、ＨＩＶアーム又はＣＤ３アームが無関係なアームで置換された対照ＤＡＲＴ（４４２０×ＣＤ３、Ａ３２×４４２０、７Ｂ２×４４２０）を用いると発生しなかった（図１２Ａ）。Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、エフェクタＴ細胞を省略した場合（図１２Ｂ）又は標的細胞がＥｎＶ発現を欠いていた場合（図１２Ｃ）、標的細胞殺滅を仲介しなかった。これらのデータは、Ｅｎｖ発現標的細胞及びＥｎｖ発現標的細胞とＣＤ３発現エフェクタ細胞の共会合が、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ仲介型細胞溶解活性のために厳密に必要であることを実証している。

【0151】

ＬＵＭアッセイによって測定されるように、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３は、Ｊｕｒｋａｔ ５２２‐Ｆ／Ｙ ＧＦ細胞の標的転換Ｔ細胞殺滅に関して、ＥＣ₅₀値１４０‐１７０ｐｇ／ｍＬという同様の効力を示し（図１２Ｄ）、これはＬＤＨ放出アッセイによって測定されたものに近く、これは２つの異なるアッセイのモダリティ間に一貫性があることを示している。更に、ＬＵＭアッセイの感受性及び特異性によると、Ｅｎｖ⁺標的細胞のＤＡＲＴ依存性の排除は略完璧であり（＞９８％）、その一方で４４２０×ＣＤ３対照ＤＡＲＴは細胞毒性を仲介しなかった（図１２Ｄ）。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞殺滅活性は、Ｅ：Ｔ比依存性であった。７Ｂ２×ＣＤ３による略完全な細胞溶解は、Ｅ：Ｔ比１０：１及び５：１において、４８時間の時点で達成されたが、Ｅ：Ｔ比１：１における高レベルの細胞溶解（＞８０％）は７２時間まで遅れ（図１２Ｅ‐１２Ｈ）、これは、比較的低いＥ：Ｔ細胞比において、時間が、標的細胞の効率的な排除のための制限因子となることを示唆している。

【0152】

Ｔ細胞殺滅活性の標的転換に付随して、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、Ｅｎｖ⁺標的細胞の存在下で（活性化マーカＣＤ２５の上方制御によって測定される）Ｔ細胞活性化を誘発し、ここでＣＤ２５はＣＤ８⁺Ｔ細胞において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞よりも大きく上方制御された（図２６Ａ‐２６Ｄ）。データ全体は、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３がＴ細胞、特にＣＤ８⁺Ｔ細胞を強力に活性化及び標的転換し、Ｅｎｖ発現標的細胞を特異的に殺滅させることを実証している。更に上記殺滅のデータは、ＦＡＣＳ分析によるＥｎｖ結合の検出が無視できる程度のものであっても、両方のＤＡＲＴがＣＤ４⁺細胞株の表面上のＥｎｖ抗原を認識してこれに結合できることを確認するものである（図１３Ｆ）。

【0153】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、ＨＩＶ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞の表面に結合し、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換して、ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからのリンパ球を用いてＨＩＶ‐１感染ＣＤ４⁺細胞を殺滅させる。Ａ３２×４４２０及び７Ｂ２×４４２０ ＤＡＲＴを、サブタイプＡＥ ＣＭ２３５、サブタイプＢ ＢａＬ、及びサブタイプＣ １０８６．Ｃ ＨＩＶ‐１単離株を提示するＨＩＶ‐１感染性分子クローンに感染したＣＤ４⁺Ｔ細胞に結合してその殺滅を標的転換する能力に関して評価した。各ＩＭＣは、感染標的細胞の細胞溶解を定量的に測定するために、ルシフェラーゼレポータ遺伝子を用いて操作した。感染細胞表面Ｅｎｖへの結合を評価するために、（ＣＤ３エフェクタアームを欠いた）Ａ３２×４４２０及び７Ｂ２×４４２０ ＤＡＲＴを、親Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂと比較した。感染のために用いたＨＩＶ‐１ ＩＭＣに独立して由来する両方のＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴによる、ｐ２４⁺（感染）ＣＤ４⁺Ｔ細胞の同様の染色（図２７）が観察された。興味深いことに、Ａ３２×４４２０ ＤＡＲＴによる染色は、Ａ３２ ｍＡｂによる染色を略再現し；対照的に、７Ｂ２×４４２０ ＤＡＲＴは、７Ｂ２ ｍＡｂによる＞２４％（２４‐３８の範囲）の認識に比べて、ＨＩＶ‐１感染細胞の＞６６％（６６‐７８％の範囲）を認識し、これは上記ＤＡＲＴが上記ｍＡｂに比べて、クラスタＩ ｇｐ４１エピトープに対するより良好なアクセス可能性を有していることを示唆している（図２７）。対照として利用した二次コンジュゲートＡｂ及びパリビズマブｍＡｂは、ＨＩＶ‐１感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞の＜５％未満を認識した。

【0154】

次に、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３の、ＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからのＣＤ８⁺Ｔ細胞を３つのＨＩＶ‐１ ＩＭＣに感染した自己ＣＤ４⁺Ｔ細胞に対して標的転換する能力を調査した。上記２つのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、自己ＣＤ８⁺Ｔエフェクタ細胞を標的転換して、サブタイプＢ ＢａＬ（図１３Ａ）、サブタイプＡＥ ＣＭ２３５（図１３Ｂ）及びサブタイプＣ １０８６．Ｃ（図１３Ｃ）ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺標的細胞を、濃度依存的な様式で殺滅させたが、その一方で対照ＤＡＲＴ（４４２０×ＣＤ３）は不活性であった。ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺細胞を用いたこれらの研究において、７Ｂ２×ＣＤ３（ＥＣ₅₀〜１０ｎｇ／ｍＬ）に比べてＡ３２×ＣＤ３（ＥＣ₅₀≦１ｎｇ／ｍＬ）がより高い効力を示したことは、Ｅｎｖ⁺細胞株を用いた研究において同様の効力が観察されたこと（図１２Ａ‐１２Ｃ）と対照的である。ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞のＤＡＲＴ仲介型殺滅は、ＣＤ８⁺エフェクタ細胞の存在に依存しており、これらが存在していない場合、細胞溶解活性は観察されなかった（図１３Ａ‐１３Ｃ）。時間経過研究では、ＤＡＲＴ依存性細胞溶解活性は、６時間において明らかであり、４８時間において最大活性（＞７０％の細胞溶解）であった（図１３Ｄ‐１３Ｆ）。

【0155】

ＤＡＲＴによって動員されたエフェクタＴ細胞がＨＩＶ‐１感染標的細胞を殺滅する頻度に関する洞察を得るために、ＤＡＲＴの、細胞溶解活性を検出するために使用したものと同一の条件下で自己ＨＩＶ‐１ ＢａＬ ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺細胞とコインキュベートした場合に、５体のＨＩＶ‐１血清陰性ドナーから得たＣＤ８⁺Ｔ細胞の脱顆粒化を誘発する能力を評価した。データ分析に採用したゲート戦略の例を図１４Ａ‐１４Ｇに示す。対照条件（ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの不在又は対照ＤＡＲＴの存在）下での生存／ＣＤ３⁺／ＣＤ８⁺／ＣＤ１０７⁺細胞の平均頻度（図１４Ｈ）は、０．３８％（標準偏差０．１０％；０．２４‐０．５１の範囲）であり、これは、１ｎｇ／ｍＬの７Ｂ２×ＣＤ３又はＡ３２×ＣＤ３の存在下ではそれぞれ平均３．５３％（１．５‐６．９％の範囲）又は１８．２３％（１２．３０‐２３．３５％の範囲）まで上昇した。このデータは、ＨＩＶ×ＣＤ３ＤＡＲＴが、Ｅｎｖ発現標的細胞（自己ＨＩＶ‐１感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞）の存在下で、休止ＣＤ８⁺Ｔ細胞の脱顆粒化を特異的に誘発できることを実証している。

【0156】

血清陰性ドナーからのＪＲ‐ＣＳＦ感染細胞に対するＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換ＣＤ８⁺Ｔ細胞殺滅活性。
ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４抗原産生を測定するウイルスクリアランスアッセイを、ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞殺滅活性を評価するための代替的な方法として利用した。健康なドナーからのＣＤ４⁺細胞に、ＨＩＶ‐１クレードＢクローンＪＲ‐ＣＳＦを重感染させ、１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴの不在下又は存在下において、Ｅ：Ｔ比１：１で自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞を用いて７日間インキュベートした。２体の異なるドナーを用いた実験では、対照ＤＡＲＴ（４４２０×ＣＤ３）の添加は、ＤＡＲＴの不在下で実施したインキュベーションに比べてｐ２４産生を有意には低減しなかったが、Ａ３２×ＣＤ３又は７Ｂ２×ＣＤ３の添加は、ｐ２４産生を同様の程度で有意に低減した（それぞれ７２‐９６％又は８７‐９９％；ｐ＜０．０１ステューデントＴ検定；図１５Ａ‐１５Ｂ）。上記ウイルスクリアランスアッセイを、インテグラーゼ及び非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤の存在下でも、感染が確立された後、エフェクタ細胞及びＤＡＲＴの添加時に、更なる一連の感染をブロックするために実施した。抗レトロウイルス薬（ＡＲＶ）がアッセイに含まれる場合、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３は依然として、ｐ２４産生の低減への傾向を仲介するが、これは、抗レトロウイルスによるベースラインｐ２４産生のレベルが低いことを恐らく原因として、統計的に有意なものとはならず（図１５Ｃ）、これは、上記ＤＡＲＴがウイルス拡散の阻害によってではなく、感染細胞のクリアランスによって作用していることを示唆している。

【0157】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、抑制性ＡＲＴを受けている患者のリンパ球を使用して、ＪＲ‐ＣＳＦ‐重感染ＣＤ４⁺細胞をクリアするよう、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換させる。慢性ＡＲＴは、機能不全及び消耗したＴ細胞応答を特徴とし（４６、４７）、従って、生体外での患者試料における強力なＤＡＲＴ仲介型Ｔ細胞標的転換クリアランス活性の確認が重要である。抑制性ＡＲＴを受けている８人のＨＩＶ感染個体からのリンパ球を用いたウイルスクリアランスアッセイにおける、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの活性を評価した。全ての参加者は、ウイルス量＜５０コピー／ｍＬの研究の時点で少なくとも６ヶ月間ＡＲＴを受けていたが、それ以外は多様な臨床的背景を示した（図２０）。

【0158】

ＨＩＶ‐１血清陽性被験者からのＴ細胞は、血清陰性被験者からのものに比べてアポトーシスに対する感受性が高い場合があるため、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴが、標的細胞の不在下において、Ｔ細胞生存率に影響を及ぼし得るかどうか（これは患者の細胞を用いたＤＡＲＴ活性の分析を混乱させ得る）を評価した。ウイルスクリアランスアッセイ条件を模倣した、１００ｎｇ／ｍＬＤＡＲＴの存在下での、ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者からのＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞の７日間の培養の後、アネキシンＶ／７ＡＡＤ染色に基づくＴ細胞生存率の低下（図２８Ａ‐２８Ｂ）は観察されなかった。更に、ＨＩＶ×ＣＤ３又は対照ＤＡＲＴを用いた培養後、未刺激ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞上の活性化マーカ（ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ２５）の変化は観察されず（図２８Ｃ‐２８Ｄ）、これは、ＣＤ３アームの会合単独では、生体外の患者のＣＤ８⁺又はＣＤ４⁺Ｔ細胞を活性化させないことを示唆している。

【0159】

抑制性ＡＲＴを受けている８人のＨＩＶ患者からのリンパ球を用いて、ウイルスクリアランスアッセイを実施した。このウイルスクリアランスアッセイでは、ＣＤ４⁺細胞にＨＩＶ‐１ ＪＲ‐ＣＳＦ（標的細胞）を重感染させ、１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴの不在下又は存在下において、Ｅ：Ｔ比０：１、１：１０又は１：１で自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞（エフェクタ）を用いて７日間インキュベートした。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ活性は、追加のＣＤ８⁺Ｔ細胞の不在下でさえ発生し、これは、これらの実験条件下において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞をエフェクタ細胞として動員できることを示し；対照と比べて、ｐ２４産生は、７Ｂ２×ＣＤ３（ｐ＜０．０５）を用いた場合０．８９ログ、Ａ３２×ＣＤ３を用いた場合０．３２ログ（ｐ＝ＮＳ）、及び両方のＤＡＲＴの１：１混合を用いた場合０．８１ログ（ｐ＜０．０５）だけ低下した（図１６Ａ）。実際のところ、完全に活性のＤＡＲＴの添加は、感染標的細胞の存在時、ＣＤ４＋Ｔ細胞の脱顆粒化の有意な増大につながった（図１６Ｇ、１６Ｈ）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞をエフェクタとして添加すると、１：１０のＥ：ＴにおいてＣＤ８⁺Ｔ細胞単独時に見られた０．１３ログの低減と比べて更なるｐ２４レベルの低減がもたらされ、ｐ２４産生は、７Ｂ２×ＣＤ３を用いた場合１．２ログ（ｐ＜０．０５）、Ａ３２×ＣＤ３を用いた場合０．６ログ（ｐ＝ＮＳ）、及び２つのＤＡＲＴの混合を用いた場合１．８ログ（ｐ＜０．０５）だけ低下した（図１６Ｂ）。１：１というより高いＥ：Ｔ非の場合は更に顕著な低減が見られ、ＣＤ８単独では０．７ログの低下をもたらすが、ｐ２４産生は、７Ｂ２×ＣＤ３を用いた場合２．８ログ（ｐ＜０．０５）、Ａ３２×ＣＤ３を用いた場合１．６ログ（ｐ＝ＮＳ）、及び２つのＤＡＲＴの混合を用いた場合２．８ログ（ｐ＜０．０５）だけ低下した（図１６Ｃ）。有意な低減は、いずれの検出可能なベースラインＣＤ８Ｔ細胞抗ウイルス活性の不在下でさえ見られ、３つのケースにおいて、ＤＡＲＴを用いたインキュベーション後に、ウイルスは回復できなかった（患者７４９に対して完全活性ＤＡＲＴ、並びに患者７２０及び７２５に対して７Ｂ２×ＣＤ３）。ＨＩＶ ｇａｇ ｐ２４抗原の絶対値を図２１中で提供する。

【0160】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴはＣＤ８⁺Ｔ細胞を、抑制性ＡＲＴを受けている患者からのリンパ球を用いて自己残存（autologous reservoir：ＡＲ）ウイルス重感染ＣＤ４⁺細胞をクリアするよう、標的転換する。５人の患者からの自己残存（ＡＲ）ウイルス感染ＣＤ４⁺標的細胞を用いたウイルスクリアランスアッセイを用いて、潜伏残存から発生したＥｎｖ配列を発現する標的細胞に対してＴ細胞を標的転換するＤＡＲＴの能力を評価した（図１６Ｄ‐１６Ｆ）。潜伏ウイルスの再活性化後にインビボで発生し得るウイルスの多様性を考察するために、患者のＡＲウイルス単離株を、マイトジェン刺激休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞の限定希釈培養物のプールされた上清から生成した。ＡＲ ウイルス単離株の多様性にもかかわらず、ＪＲ‐ＣＳＦ感染標的細胞を用いた場合に見られるＤＡＲＴ活性が反映された。ＣＤ８⁺エフェクタの不在下においてＡＲは感染標的細胞を用いると、中程度の活性が観察され（従ってＣＤ４⁺Ｔ細胞に属する；図１６Ｄ）、ｐ２４産生は、７Ｂ２×ＣＤ３を用いた場合０．３２ログ、Ａ３２×ＣＤ３を用いた場合０．２０ログ（ｐ＝Ｎ．Ｓ：７Ｂ２×ＣＤ３に対する応答の変動が比較的大きいため）、両方のＤＡＲＴの１：１混合を用いた場合０．５１ログ（ｐ＜０．０５）だけ低減され、その一方で、対照ＤＡＲＴを用いると活性は観察されなかった（図１６Ｄ）。ＡＲウイルス感染ＣＤ４＋標的細胞と自己ＣＤ８＋エフェクタ細胞との混合物にＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴを添加すると、ｐ２４産生の低減は大幅に増強された。Ｅ：Ｔ比１：１０では、ｐ２４産生は、ＣＤ８⁺細胞を単独で使用した場合のわずか０．０２ログの低減と比較して、７Ｂ２×ＣＤ３を用いた場合０．５１ログ（ｐ＜０．０５）、Ａ３２×ＣＤ３を用いた場合０．３７ログ、これら２つのＤＡＲＴの１：１混合を用いた場合０．７９ログ（ｐ＜０．０５）だけ低減された（図１６Ｅ）。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの存在下におけるｐ２４産生の低減への傾向は、１：１というより高いＥ：Ｔ比においても見られるが、効果の大きさは、ＤＡＲＴの不在下で見られる可変ベースラインＣＤ８⁺活性だけ低減される（図１６Ｆ）。特に生体外ＤＡＲＴ活性は、２つのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴのうちの少なくとも一方を用いて評価した５人の患者全てからのリンパ球を用いて、及び１：１ＤＡＲＴ混合を用いた全ての場合において、観察された。

【0161】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、潜在ウイルス発現の誘発後に休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞からのウイルスをクリアするよう、抑制性ＡＲＴを受けているＨＩＶ感染個体からのＴ細胞を標的転換する。最終的に、「衝撃及び殺滅（shock and kill）」ＨＩＶ根絶戦略において使用される試薬は、潜伏状態から出現する際に低レベルの抗原を発現する可能性がある稀な感染細胞を認識及びクリアしなければならない。既に説明されている潜伏状態クリアランスアッセイ（４９）を採用した。このアッセイは、抑制性ＡＲＴを受けているＨＩＶ感染個体の休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞の誘発後のウイルス回復を低減するよう、自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換する、ＤＡＲＴの能力を測定することを目指している。完全活性ＤＡＲＴ、又はＡ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３の１：１混合を、ＣＤ８⁺Ｔ細胞とＰＨＡ刺激休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞とのＥ：Ｔ比１：１０での共培養物に添加すると、６人の患者のうち６人全てにおいてウイルス回復が低減されたが、低減の大きさは患者によって異なっていた（図１７Ａ、２２）。

【0162】

インビボでの最大マイトジェン刺激を用いたＨＩＶ潜伏の逆転は臨床的に現実的ではない（５０）。しかしながら、全体的なＴ細胞活性化をもたらさない作用剤、例えばボリノスタット（ＶＯＲ）を用いた潜伏の逆転後のウイルス抗原の提示は、最大マイトジェン刺激後に比べて小さくなり得る。臨床的に関連する文脈でＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴを評価するために、潜伏ウイルスエンベロープ発現を誘発するためのインビボでの４００ｍｇの単回投薬後に得られたものをモデル化する、ＶＯＲへの生理学的に関連する曝露（１８）を用いた。この設定では、Ｅ：Ｔ比１：１０でのＣＤ８⁺細胞及び完全活性ＤＡＲＴの添加は、試験した５人の患者のうち４人において、対照ＤＡＲＴを用いない又は用いる場合のＣＤ８⁺細胞と比較して、２４時間の共培養期間後のウイルス回復の低減につながった。２４時間の共培養期間後にＤＡＲＴに応答しなかった１人の患者（患者７９５）においては、共培養期間を２４時間から９６時間に延長することにより、ウイルス回復の完全な排除が得られた（図１７Ｂ、２２）。

【0163】

議論
潜在ＨＩＶ‐１残存の排除における大きなハードルとしては：１）潜伏逆転剤（ＬＲＡ）による誘発の前又は後における、中程度のＨＩＶ抗原レベルを提示する稀なＨＩＶ‐１感染細胞を認識する、免疫系の限定された能力（３８、５１）；２）ＨＩＶ‐１潜伏残存中の、ＣＤ８⁺細胞毒性Ｔリンパ球エスケープ突然変異体の存在（５２）；並びに３）感染細胞が提供する刺激が不十分であることによる、ＡＲＴを受けている患者の循環性ＨＩＶ特異性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度の低さ、及び上記循環性ＨＩＶ特異性ＣＤ８⁺Ｔ細胞を活性化する必要性（３８）が挙げられる。本明細書において記載されるのは、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴがこれらの主要な障害のそれぞれを克服し得るというデータである。

【0164】

非中和ｍＡｂであるＡ３２及び７Ｂ２に由来するＨＩＶアームを有するＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、細胞表面Ｅｎｖ発現が低いように思われる場合であっても、ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ発現細胞株の認識、及び標的転換Ｔ細胞殺滅活性の誘発が可能であった。更にＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、ＶＯＲへの曝露後のウイルス非保有（aviremic）ＡＲＴ治療患者から得られた休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞をクリアするようにＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換するにあたって、生体外において有効であった。

【0165】

潜伏残存中に現れるＨＩＶ‐１単離株は、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答によって生成されるエスケープ突然変異体を含むことが報告されており（５２）、これは、ＨＩＶ‐１感染細胞をクリアするために自然感染によって誘発されるＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８⁺ＣＴＬ応答を制限し得る。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴのＡ３２及び７Ｂ２アームは、それぞれｇｐ１２０及びｇｐ４１の良好に保存された残基と相互作用して、様々なサブタイプのＨＩＶ‐１単離株に感染した細胞に対するＡＤＣＣ活性を効率的に仲介する、幅広い応答性を有する非中和抗ＨＩＶ ｍＡｂをベースとしている。なお、Ａ３２ ｍＡｂエピトープは、シンシチウム形成プロセス中（５３）又はｔｉｅｒ ２ウイルス感染後（５４）に感染細胞の表面上に発現することが知られている最も早いものであり、７Ｂ２ ｍＡｂエピトープはｇｐ４１スタンプにアクセス可能であり、これは、出芽中に感染細胞の表面上に発現して、ｇｐ１２０サブユニットが解離する際に膜表面に保持される（２９、５５）。これらの特性は、感染細胞の表面に対するＡ３２及び７Ｂ２エピトープのアクセス可能性の指標となる。重要なことには、ＣＴＬエピトープはＤＡＲＴ仲介型標的転換殺滅活性には無関係であるため、ＣＴＬ突然変異体の存在は制約にはならない。更に、ＤＡＲＴのような二重特異性分子によって動員されるエフェクタＴ細胞はポリクローナルであり、ＭＨＣ制限を受けない（３３）。これらの主張と矛盾することなく、Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３は、療法の開始前に蓄積され得るいずれのエスケープ突然変異体の存在にもかかわらず、自身の自己残存（ＡＲ）ウイルスに感染したＣＤ４⁺細胞をクリアするように、患者からのＣＤ８⁺Ｔ細胞を標的転換させるにあたって、有効であった（５２）。興味深いことに、標的細胞として使用されるＣＤ４⁺Ｔ細胞をインビトロで活性化させると、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の不在下でのウイルス回復の特異的低減が観察され、これは、ＤＡＲＴがこれらの特定の実験条件下において、細胞毒性ＣＤ４⁺Ｔ細胞も動員し得ることを示唆している。これらと矛盾することなく、ＤＡＲＴが、Ｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ細胞の存在下においてＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化を誘発し、ＨＩＶ陽性個体からの感染自己標的細胞と共培養した場合に、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の脱顆粒化を増大させることができることが分かった。細胞毒性ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＨＩＶ‐１（５６）及びサイトメガロウイルス（５７）への応答の文脈において過去に報告されている。有効なＤＡＲＴ動員及び細胞毒性ＣＤ４⁺Ｔ細胞の標的転換がインビボ設定で発生するかどうかを決定するために、更なる研究が必要である。

【0166】

Ａ３２×ＣＤ３及び７Ｂ２×ＣＤ３ ＤＡＲＴの相対的な効力は、本発明者らの研究において採用した異なる複数の試験系にわたって変化したが、これはＥｎｖ発現標的細胞及び／又はエフェクタＴ細胞の特徴の変化によるものである可能性が最も高い。しかしながら、ＤＡＲＴのうちの一方が他方よりも高い活性を示した場合は常に、感染患者の細胞を用いた研究において２つのＤＡＲＴの組み合わせを利用した場合（図１６Ａ‐１６Ｈ及び１７Ａ‐１７Ｂ）におけるより強力なＤＡＲＴの活性と同様の活性が、一貫して観察された。従って、異なるＨＩＶエピトープを標的とするＤＡＲＴの組み合わせは、ＡＤＣＣ仲介型（５８）又は幅広く中和された抗ＨＩＶ‐１ ｍＡｂ（５９、６０）の組み合わせに関して説明したものと同様に、活性のレベル及び幅広さの両方を最大化するための有利な戦略となり得る。

【0167】

ＨＩＶ‐１特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答による潜伏感染細胞のプールの排除は、感染個体におけるこれらの細胞の頻度の低さ、及びこれらの細胞を休止状態から活性化させる必要によって制限される（３８）。過去にＨＩＶ‐１抗原に曝露されていないＨＩＶ‐１血清陰性個体からの休止ＣＤ８⁺Ｔ細胞を用いると、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、殺滅されることになる自己ＨＩＶ‐１感染標的細胞と共にインキュベートした場合に、これらの休止ＣＤ８⁺Ｔ細胞の最大２３％の脱顆粒化を誘発した。またＤＡＲＴは、ウイルスクリアランスアッセイにおいて抗レトロウイルス療法を受けたＨＩＶ‐１血清陽性個体からのＣＤ８⁺Ｔ細胞も標的転換できた。従ってＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴタンパク質は、ＨＩＶ抗原に対する過去の曝露に関係なく、及び慢性ＨＩＶ‐１感染において存在し続ける場合があるいずれの機能障害にかかわらず、ＣＤ８⁺Ｔ細胞毒性細胞を効果的に動員及び標的転換できる（４６、４７、６１）。

【0168】

ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ発現標的に対するＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞活性は、ＨＩＶ×ＣＤ３ＤＡＲＴ濃度、エフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比及びインキュベーション時間に対して依存性であった。上記ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ分子の各結合アームの１価性によって、標的細胞殺滅が、ＣＤ１９×ＣＤ３及び他のＤＡＲＴを用いて観察されたように（３１、３２、３４）、エフェクタ／標的細胞の共会合のみに依存することが保証される。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ仲介型Ｔ細胞活性又は標的転換殺滅活性は、標的細胞上のＥｎｖ発現の不在下では観察されなかった。同様に、抑制性ＡＲＴを受けているＨＩＶ感染患者からのＴ細胞を用いると、ウイルス感染標的細胞の不在下ではＴ細胞活性化は観察されなかった。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、ＨＩＶ‐１感染Ｅｎｖ発現標的細胞の近傍においてのみ、循環Ｔ細胞からの細胞毒性活性を誘発するため、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴは、Ｅｎｖ発現標的細胞が稀であることを理由として、ＡＲＴを受けているＨＩＶ感染患者において、炎症性サイトカイン放出等の広範な全身性効果を誘発することは期待されない。ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴが誘発するＴ細胞標的転換応答の特異性は、ＨＩＶ感染が、疾患の急性期及び慢性期の両方において、ＨＩＶ‐１特異的Ｔ細胞サブセット及び一般的なＣＤ８＋Ｔ細胞集団において免疫系の非特異的活性化を誘発することを考慮すると、臨床的に極めて重要である（６２‐６４）。

【0169】

細胞表面Ｅｎｖを発現するＨＩＶ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ標的転換Ｔ細胞殺滅活性の主要なインビボ標的である。これらの標的細胞はＣＤ３も発現するため、上記ＤＡＲＴ分子は、感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞と非感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞との間のシナプスを仲介でき、これは、感染細胞の殺滅の標的転換ではなく、又は感染細胞の殺滅の標的転換に加えて、未感染細胞へのウイルスの拡散を恐らく促進し得る。しかしながら、ＤＡＲＴはＣＤ８＋Ｔ細胞の不在下であってもｐ２４産生を低減した（図１６Ａ及び１６Ｄ）ため、ＤＡＲＴがウイルスの拡散を増強したことを示唆するエビデンスは観察されなかった。

【0170】

要約すると、本明細書に記載の実験は、非中和Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂ由来のＨＩＶアームを有するＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴが、細胞溶解Ｔ細胞を：１）ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ発現ＣＤ４⁺細胞株；２）異なる複数のサブタイプのＨＩＶ‐１ ＩＭＶに感染した血清陰性個体からの活性化ＣＤ４⁺細胞；３）ＪＲ‐ＣＳＦ若しくは自己残存ウイルスに感染した、抑制性ＡＲＴを受けている血清陽性患者からの活性化ＣＤ４⁺細胞；又は４）Ｔ細胞マイトジェン（フィトヘマグルチニン、ＰＨＡ）若しくは潜伏逆転剤（ボリノスタット、ＶＯＲ）に生体外曝露されたＨＩＶ感染患者からの休止ＣＤ４⁺細胞からなる標的細胞に対して標的転換させる特異的かつ強力な作用剤であることを実証した。重要なことには、本研究は、抑制性ＡＲＴを受けているＨＩＶ感染患者からの自己ＣＤ８⁺Ｔ細胞が、ＤＡＲＴの存在下においてエフェクタ細胞として有効であることを実証した。ボリノスタットの存在下でのＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴ仲介型Ｔ細胞殺滅活性の実証は特に注目に値する。というのは、これは、生体外拡張ＣＴＬを用いた以前の発見（４９）と同様に、見込みのある臨床的ＨＩＶ根絶戦略を模倣するために設計されたモデル系において、ＨＩＶ感染患者の細胞から発現される真正潜伏ウイルス単離株に対する活性のエビデンスを提供するためである。従って、開示されているデータは、ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴが、「衝撃及び殺滅」ＨＩＶ根絶戦略における、ＬＲＡと組み合わせたインビボでの試験のために、好適な作用剤であることを示している。

【0171】

方法
本発明者らは、本研究の試料の数が比較的限られていることから適切であると見做されたダネットの多重比較検定を用いて、データを再分析した。ここでは、計算されたｐ値を本文中（１４ページ）、及び図５〜７に関する説明文中に示している。統計的分析のための「方法」のセクションも再び参照した。

【0172】

患者集団。示されているように、白血球搬出試料を、ＨＩＶ血清陰性ドナー、又は少なくとも６ヶ月にわたって安定したＡＲＴを受けている、検出不可能な血漿ウイルス血症（＜５０コピー／ｍＬ）を有するＨＩＶ感染ドナーから得た。各患者からは文書によるインフォームドコンセントが得られており、研究はDuke and UNC Biomedical Institutional Review Boardsによって承認された。

【0173】

感染性分子クローン（Infectious Molecular Clones：ＩＭＣ）。サブタイプＢ ＢａＬ、サブタイプＡＥ ＣＭ２３５及びサブタイプＣ １０８６．ＣのためのＨＩＶ‐１ ＩＭＣを、既に説明されているように（６５、６６）、ＮＨＬ４‐３単離株由来の骨格を用いて生成した。全てのＩＭＣはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポータ遺伝子を発現し、９つのウイルスオープンリーディングフレーム全てを保持した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポータ遺伝子は、ＨＩＶ‐１ Ｔａｔ遺伝子の制御下で発現した。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＨＩＶ‐１に感染すると、ＨＩＶ‐１複製中のＴａｔの発現は、ルシフェラーゼの発現を誘発し、これにより、相対発光単位（ＲＬＵ）の測定による感染細胞の定量化が可能となる。

【0174】

ＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴの構築、発現及び精製。このＤＡＲＴは、２つのポリペプチド鎖：抗ＣＤ３のＶＬが抗ＨＩＶのＶＨに連結した第１のもの；抗ＨＩＶのＶＬが抗ＣＤ３のＶＨに連結した第２のものを共発現するプラスミドから産生された。これら２つのポリペプチド鎖のカルボキシ末端は、ペアになった反対の電荷を有するＥコイル／Ｋコイル二量体化ドメインからなり、これは鎖間ジスルフィド結合を含む（図１０Ａ‐１０Ｃ）。ＨＩＶアーム配列は、非中和ｍＡｂであるＡ３２［Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号３ＴＮＭ＿Ｈ及び３ＴＮＭ＿Ｌ］並びに７Ｂ２［Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦＱ３１５０２及びＡＦＱ３１５０３］に由来し、またＣＤ３アーム配列は、ｈＸＲ３２、ヒト化マウス抗ヒトＣＤ３εｍＡｂに由来した（L. Huang, L. S. Johnson, CD3‐binding molecules capable of binding to human and nonhuman CD3，米国特許第２０１４００９９３１８号（２０１４））。対照ＤＡＲＴは同様に、ＨＩＶ又はＣＤ３特異性を、抗フルオレセインｍＡｂ（４４２０）（６７）又は抗ＲＳＶ ｍＡｂ（パリビズマブ）（６８）からの無関係な特異性によって置換することによって構築された。ＤＡＲＴエンコード配列は、ＣＥＴ１０１９ＡＤ ＵＣＯＥベクター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にクローニングされ、既に説明したように（３１）精製されたＣＨＯ細胞及びタンパク質にトランスフェクトされた。精製されたタンパク質を（NuPAGE Bis‐Tris gel system, Invitrogen）及び分析用ＳＥＣ（TSK GS3000SWxL SE‐HPLC,Tosoh Bioscience）で分析した。

【0175】

ＥＬＩＳＡ。単一特異的結合アッセイのために、重炭酸塩緩衝液中において組み換えタンパク質（ヒトＣＤ３ε／δヘテロ二量体、ＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０DＣＦ；（６９））でコーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、３％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ‐２０でブロックした。ＤＡＲＴタンパク質を塗布した後、ビオチン化抗ＥＫコイル抗体及びストレプトアビジン‐ＨＲＰ（BD Biosciences）を順次添加した。二重特異性結合アッセイのために、上記プレートをＪＲＦＬ ｇｐ１４０ΔＣＦでコーティングし、ＤＡＲＴ塗布後、ビオチン化ＣＤ３ε／δ及びストレプトアビジン‐ＨＲＰを順次添加した。ＨＲＰ活性を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡピコ化学発光基質（Thermo Scientific）を用いて検出した。

【0176】

ＳＰＲ分析。抗原に結合するＨＩＶ×ＣＤ３ ＤＡＲＴを、既に説明したように（３１、３２）ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（GE,Healthcare）で分析した。ヒトＣＤ３ε／δを、製造元の手順に従ってＣＭ５センサチップ上で不動化した。不動化されたＣＤ３に対するＤＡＲＴ結合を分析して、ＣＤ３アームの特性を評価し、また不動化されたＣＤ３上で捕捉されたＨＩＶ ＤＡＲＴに結合するＨＩＶ‐１ Ｅｎｖタンパク質を分析して、ＨＩＶアームの特性を評価した。ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ΔＣＦを用いて７Ｂ２×ＣＤ３結合を評価し、Ｍ．ＣｏｎＳ ｇｐ１４０ΔＣＦＩ（６９）を用いてＡ３２×ＣＤ３結合を評価した。Ａ３２×ＣＤ３はＪＲ‐ＦＬ ｇｐ１４０ΔＣＦに効率的に結合せず、またＭ．ＣｏｎＳ ｇｐ１４０ΔＣＦＩは７Ｂ２×ＣＤ３に対するｇｐ４１結合部位を有しないため、異なる複数のＥｎｖタンパク質を利用した。結合実験は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．００５％Ｐ２０界面活性剤中で実施した。不動化された受容体表面の再生成を、ｐＨ１．５の１０ｍＭグリシンのパルス注入によって実施した。Ｋ_D値を、Ｌａｎｇｍｕｉｒ１：１結合モデルに対する結合曲線のグローバルフィットによって決定した（ＢＩＡ評価ソフトウェアｖ４．１）。

【0177】

細胞株。カイアシ類緑色蛍光タンパク質（Copepod Green Fluorescent Protein：ｃｏｐＧＦＰ）及びホタルルシフェラーゼ（System Biosciences）の融合タンパク質を構成的に発現するＪｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ ＧＦ細胞を、形質導入及びクローン選択によって、Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／ＹからＭａｃｒｏｇｅｎｉｃｓにおいて生成した。ＨＩＶ‐１ ＣＭ２４４（サブタイプＡＥ）ｇｐ１４０のドキシサイクリン誘発性発現を有するＨＥＫ２９３‐Ｄ３７１細胞を、Dr. John Kappes（University of Alabama、Birmingham）から得た。

【0178】

細胞に対するＤＡＲＴ又はｍＡｂ結合のフローサイトメトリー分析。４μｇ／ｍＬのＤＡＲＴを、１０％ヒトＡＢ血清を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で、１０⁵細胞を用いて、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、１００μＬの１μｇ／ｍＬビオチンコンジュゲートマウス抗ＥＫ抗体（これはＤＡＲＴタンパク質のＥ／Ｋヘテロ二量体化領域を認識する）中に再懸濁し、１：５００希釈ストレプトアビジンＰＥと混合し、２‐８度において暗所で４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて再懸濁し、ＢＤ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータ及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（TreeStar,Ashland OR）で分析した。正常なヒトドナーからのＩＭＣ感染ＣＤ４⁺Ｔ細胞に対する結合は、Ａ３２及び７Ｂ２ ｍＡｂに関して既に説明したように（５４）、ＨＩＶ×４４２０ ＤＡＲＴに関してビオチンコンジュゲートマウス抗ＥＫ抗体及び１：５００希釈ストレプトアビジン‐ＰＥを用いて実施した。

【0179】

ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ発現細胞株に対する標的転換Ｔ細胞細胞毒性アッセイ及びＴ細胞活性化の評価。ＰａｎＴ細胞を、健康なヒトＰＢＭＣから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ（商標）ヒトＴ細胞キット（Invitrogen）を用いて単離した。ＨＩＶ‐１ Ｅｎｖ発現細胞株（１‐４×１０⁵細胞／ｍＬ）を、エフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比＝１０：１、又は示されているような可変Ｅ：Ｔ比においてヒトＴ細胞と合わせて、ＤＡＲＴの連続希釈によって処理し、３７℃、５％ＣＯ₂において一晩インキュベートした。細胞毒性を、既に説明したように（３２）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出によって測定した（ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。Ｊｕｒｋａｔ‐５２２ Ｆ／Ｙ ＧＦ細胞株の場合、細胞毒性を、ルシフェラーゼ‐Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルミネッセンスによっても測定した。特異的溶解を、ルミネッセンス計数（ＲＬＵ）から算出した：細胞毒性（％）＝１００×（１‐（試料のＲＬＵ÷対照のＲＬＵ））、ここで対照＝ＤＡＲＴの不在下でエフェクタ細胞を用いてインキュベートした標的細胞の平均ＲＬＵである。データをシグモイド用量応答関数にフィットさせて、５０％有効濃度（ＥＣ₅₀）及びパーセント最大特異的溶解値を得た。アッセイプレート中の細胞をＣＤ８‐ＦＩＴＣ、ＣＤ４‐ＡＰＣ及びＣＤ２５‐ＰＥ抗体（BD Biosciences）を用いて標識し、それに続く取得ソフトウェアＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．２．１（BD Biosciences）を備えたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータによる細胞回収の後、Ｔ細胞活性化をＦＡＣＳ分析によって測定した。データ分析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Treestar, Inc）を用いて実施した。

【0180】

ＨＩＶ‐１ ＩＭＣ感染ＣＤ４⁺細胞に対する標的転換Ｔ細胞の細胞毒性アッセイ。正常かつ健康なＨＩＶ‐１血清陰性ドナーからの凍結保存休止ＰＢＭＣを、抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて７２時間活性化させた。続いて、ＣＤ４⁺富化細胞集団（純度＞９２．３％；平均±標準偏差９５．７３±２．６％）を、磁気ビーズ（Miltenyi Biosciences）を用いたＣＤ８⁺Ｔ細胞の欠失によって得て、ＨＩＶ‐１サブタイプＡＥ（ＣＭ２３５）、Ｂ（ＢａＬ）又はＣ（１０８６．Ｃ）を提示するルシフェラーゼ発現ＩＭＣの存在下でスピノキュレートし、７２時間培養した。ＣＤ４⁺感染標的細胞を、１０００〜０．０００１ｎｇ／ｍＬの濃度において、ＤＡＲＴの不在下又は存在下で、Ｅ：Ｔ比３３：１、１１：１、３：１及び０：１で、休止ＣＤ８⁺エフェクタ細胞（自己ＰＢＭＣからの陰性選択によって単離、ＣＤ８⁺Ｔ細胞単離キット、Miltenyi Biosciences）を用いて６‐４８時間インキュベートした。単独の未感染及び感染標的細胞を追加の対照として含めた。各条件を二重試験した。インキュベーション後、ＶｉｖｉＲｅｎ（商標）生存細胞基質（Promega）を添加し、標的細胞の、ルミノメータで測定されたＲＬＵ；パーセンテージ特異的溶解（％ＳＬ）を、既に説明したように決定した（５８）。

【0181】

Ｔ細胞脱顆粒化（ＣＤ１０７）アッセイ。ＨＩＶ‐１ ＩＭＣ感染細胞を標的として用いた細胞毒性アッセイに関して記載したように、ＨＩＶ‐１ ＢａＬ ＩＭＣに感染したＣＤ４⁺細胞を、１ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴの不在下又は存在下において、Ｅ：Ｔ比３３：１で休止ＣＤ８⁺エフェクタ細胞と共に播種し、６時間インキュベートした。ＣＤ４Ｔ細胞の脱顆粒化に関して、活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を、ＪＲ‐ＣＳＦに感染させて、本発明者らのＡＤＣＣアッセイにおいて通常利用される（７０）生存率（ＮＦＬ１）及び標的特異性（ＴＦＬ４）マーカを用いて標識するか、又はＤＡＲＴの添加前に１０：１の比でエフェクタとして標的に添加した。各条件を二重試験した。ＣＤ１０７ ＰＥ‐Ｃｙ５（クローンＨ４Ａ３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を滴定し、インキュベーションの最後の６時間の間に、モネンシン溶液（BD GolgiStop）と共に添加した（７１）。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ染色、抗ＣＤ３ ＡＰＣ‐Ｈ７（クローンＳＫ７；BD Pharmingen）、抗ＣＤ４ ＢＶ６０５（クローンＯＫＴ４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ８ ＢＶ６５０（クローンＲＰＡ‐Ｔ８；Biolegend）からなる抗体のパネルを用いて、ＣＤ１０７⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞を検出した。洗浄及び固定後、続く２４時間以内に、カスタムメイドのＬＳＲＩＩ（BD Bioscience,San Jose,CA）上で試料を得た。各試験に関して、合計最低３００，０００件の有望なイベントを取得した。データの分析を、Ｆｌｏｗ‐Ｊｏソフトウェア（Treestar,Ashland,OR）を用いて実施した。

【0182】

Ｔ細胞生存率及び活性化アッセイ。ＨＩＶ感染ＡＲＴ抑制患者から得られたＣＤ８⁺Ｔ細胞及びＣＤ８欠失ＰＢＭＣを、示されている１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴと共に、９６ウェルプレートに５×１０⁴細胞／ウェルで播種した。細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び５Ｕ／ｍＬのＩＬ‐２を補充したｃＩＭＤＭ媒体０．２ｍＬ中で７日間培養した後、以下の抗体を用いて染色した：ＨＬＡ‐ＤＲ‐ＰｅｒＣＰ（クローンＬ２４３）、ＣＤ２５‐ＰＥ（クローンＭ‐Ａ２５１）、ＣＤ８‐ＦＩＴＣ（クローンＨＩＴ８ａ）、ＣＤ８‐ＰＥ（クローンＨＩＴ８ａ）、ＣＤ４‐ＦＩＴＣ（クローンＲＰＡ‐Ｔ４）、並びにアネキシンＶ‐ＰＥ及び７‐ＡＡＤ（全てBD biosciences,San Jose,CA）。

【0183】

標的転換Ｔ細胞ウイルスクリアランスアッセイ。ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、陽性選択（ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ８⁺選択キット、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）によって、ＰＢＭＣから単離した。まず、ＣＤ８欠失ＰＢＭＣを、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ（Remel,Lenexa,KS）及び６０Ｕ／ｍＬのＩＬ‐２を用いて活性化し、次に９０分間の１２００ｘｇにおけるスピノキュレーションによって、既に説明したように（４７）ＭＯＩ＝０．０１において、ＪＲ‐ＣＳＦ又は自己残存ウイルス（ＡＲ）に感染させた。ＡＲウイルスは、既に説明したように（７２）実施した、各患者に対する休止ＣＤ４＋Ｔ細胞の増生（outgrowth）アッセイからの複製ウェルの、プールされた上清から得た。５万（５×１０⁴）標的／ウェルを、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシ及び５Ｕ／ｍＬのＩＬ‐２を補充したｃＩＭＤＭ媒体０．２ｍＬ中で１００ｎｇ／ｍＬのＤＡＲＴの不在下又は存在下において、示されているＥ：Ｔ比で、ＣＤ８⁺Ｔ細胞と共に３重に共培養した。抗レトロウイルス薬（ＡＲＶ）の存在下で実施した実験に関しては、接種の２４時間後に細胞を洗浄し、１μＭのラルテグラビル及び４μＭのアバカビル、続いてＤＡＲＴ及びＣＤ８⁺Ｔ細胞を、培養物に添加した。７日目に、上清をｐ２４ＥＬＩＳＡ（ABL,Rockville,MD）によってアッセイした、結果を、対数（単に対照としての感染標的細胞のｐ２４を、試験条件のｐ２４で除算する）として算出する。

【0184】

潜伏クリアランスアッセイ（Latency Clearance Assay：ＬＣＡ）。ＣＤ４⁺感染細胞からのウイルス回復の低減を、過去に説明されているように（４９）、抗ウイルスエフェクタ細胞及び／又は分子の添加後のウイルス非保有（aviremic）ＡＲＴ治療患者の休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞を用いた、標準的な定量的ウイルス増生（outgrowth）アッセイによって評価した。この場合、ＬＣＡは、臨床的かつ薬理学的に関連する条件下で潜伏残存から出現するウイルスをクリアするＤＡＲＴの能力をモデル化するために使用された。既に説明されているように（７２）、休止ＣＤ４⁺Ｔ細胞を白血球搬出産物から単離して、ＰＨＡ（４μｇ／ｍＬ）及びＩＬ‐２（６０Ｕ／ｍＬ）に２４時間、又はボリノスタット（ＶＯＲ）（３３５ｎＭ，６時間）（Merck Research Laboratories）に曝露し、０．５〜１×１０⁶細胞／ウェルで、上記残存の大きさに応じて１２〜３６個の複製ウェルに播種した。続いてＶＯＲを洗い落とし、ＣＤ８を１：１０のＥ：Ｔで、及び指示されたＤＡＲＴを１００ｎｇ／ｍＬ添加した。細胞を（他の時間を指定されていない限りは）２４時間にわたって共培養し、その後、ＤＡＲＴタンパク質を洗い落とし、ＨＩＶ陰性ドナーからの同種異系ＣＤ８欠失ＰＢＭＣを添加して、残留ウイルスを増幅した。各ウェルに関して、１５日目のｐ２４抗原の存在に関して上清をアッセイした。結果を、ＣＤ８⁺Ｔ細胞を添加していない対照に対して平準化された％ウイルス回復［（陽性ウェルの数／播種した合計数）×１００］として算出する。

【0185】

統計的分析。グループ間の統計的比較を、GraphPad Prism Softward（La Jolla、CA）を用いたダネットの多重比較検定を用いて分析した。ダネットの多重比較補正を用いて算出されたｐ値＜０．０５は、有意であると考えた。ダネットの多重比較検定は、本研究の試料の数が比較的限られていることから、適切であると見做された。

【0186】

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【配列表フリーテキスト】

【0187】

配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は、以下のとおりである。
配列番号１乃至８、３９、４０、４９及び５０：「人工配列の説明：合成ペプチド」
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９乃至３８、４２乃至４８、５１乃至５４、６１、６２、６７、６８、７３、７４、７７、７８、８０及び８１：「人工配列の説明：合成ポリペプチド」
配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、５７乃至６０、６３乃至６６、６９乃至７２、７５、７６、７９及び８２：「人工配列の説明：合成ポリヌクレオチド」

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図9J】

【図9K】

【図9L】

【図9M】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

2017534296000001.app

【国際調査報告】