特表 2017-537092 クロロゲン酸結晶形を含む製剤およびその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-537092(P2017-537092A)

(43)【公表日】2017年12月14日

(54)【発明の名称】クロロゲン酸結晶形を含む製剤およびその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/222 20060101AFI20171117BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20171117BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20171117BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20171117BHJP

   C07C 69/732 20060101ALN20171117BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/222

   A61K9/19

   A61K9/20

   A61P39/06

   A61P37/02

   A61P35/00

   A61P1/16

   A61P9/00

   A61P31/12

   A61P17/06

   C07C69/732 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2017-527880(P2017-527880)

(86)(22)【出願日】2015年11月18日

(85)【翻訳文提出日】2017年7月21日

(86)【国際出願番号】CN2015094869

(87)【国際公開番号】WO2016082703

(87)【国際公開日】20160602

(31)【優先権主張番号】201410680646.9

(32)【優先日】2014年11月24日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】516331498

【氏名又は名称】スーチョアン チウチャン バイオロジカル サイエンス アンド テクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001427

【氏名又は名称】特許業務法人前田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チャン チエ

(72)【発明者】

【氏名】チュー リナ

(72)【発明者】

【氏名】ホアン ワン

(72)【発明者】

【氏名】チャン リャン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C076AA30

4C076AA36

4C076BB01

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC16

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC35

4C076CC40

4C076DD24A

4C076DD24S

4C076DD26A

4C076DD38A

4C076DD67A

4C076EE16B

4C076EE31A

4C076EE32B

4C076EE38A

4C076FF02

4C076FF04

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4C076FF06

4C076FF13

4C076FF51

4C206AA02

4C206AA10

4C206DB20

4C206DB56

4C206KA01

4C206KA16

4C206KA17

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4C206MA01

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA05

4C206MA55

4C206MA64

4C206MA72

4C206MA86

4C206NA11

4C206ZA36

4C206ZA75

4C206ZB07

4C206ZB26

4C206ZB33

4C206ZC37

4H006AA03

4H006AB20

4H006BJ50

4H006BN20

4H006BN30

4H006BS20

4H006KC14

(57)【要約】

クロロゲン酸結晶形を含む製剤であって、前記結晶形は斜方晶系であり、空間群はＰ２_１２_１２_１であり、単位格子パラメータはａ＝７．７２９１（２）Å、ｂ＝１０．９８０８（２）Å、ｃ＝３６．５３３４（７）Å、α＝β＝γ＝９０．００°、Ｚ＝８であり、単位格子の体積は３１００．６５（１１）Å^３である。前記製剤中のクロロゲン酸結晶形の含有量は、１０〜５０００ｍｇ／ｇである。前記製剤は、バイオアベイラビリティに有益であり、腫瘍や乾癬等の免疫系疾患の治療、抗酸化、肝臓保護と利胆、心血管疾患の治療、抗ウィルスの薬物に用いることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロロゲン酸結晶形を含む製剤であって、
前記クロロゲン酸結晶形が斜方晶系であり、空間群がＰ２_１２_１２_１であり、単位格子パラメータがａ＝７．７２９１（２）Å、ｂ＝１０．９８０８（２）Å、ｃ＝３６．５３３４（７）Å、α＝β＝γ＝９０．００°、Ｚ＝８であり、単位格子の体積が３１００．６５（１１）Å^３であり、
前記製剤の臨床用量が１日あたり１．０〜２０ｍｇ／ｋｇである、製剤。

【請求項2】

製剤が経口製剤または注射剤であり、前記注射剤が凍結乾燥粉末注射剤であることが好ましい、請求項１の製剤。

【請求項3】

前記注射製剤の臨床用量が、１日あたり１．０〜６．０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは２〜４ｍｇ／ｋｇである、請求項２の製剤。

【請求項4】

前記経口製剤の臨床用量が、１日あたり２ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは５〜１４ｍｇ／ｋｇである、請求項２の製剤。

【請求項5】

前記注射剤が、
クロロゲン酸結晶体 １０〜４０重量部
酸化防止剤 １〜５重量部
スキャホールド ６０〜１００重量部
を含み、
好ましくは、クロロゲン酸結晶体が３０〜４０重量部、酸化防止剤が２〜５重量部、スキャホールドが８０〜９０重量部であり、好ましくは、前記酸化防止剤が亜硫酸水素ナトリウム、スキャホールドがマンニトールである、請求項２または３の製剤。

【請求項6】

前記注射剤が、１０００製剤単位あたり、
クロロゲン酸結晶体 ３０ｇ
酸化防止剤 ２ｇ
スキャホールド ８０ｇ
を含み、
注射用水を２０００ｍｌまで加える、請求項５の製剤。

【請求項7】

前記経口製剤が、
クロロゲン酸結晶体 ８０〜１５０重量部
充填剤 ７００〜９００重量部
結合剤 ２０〜２２０重量部
を含み、
好ましくは、前記クロロゲン酸結晶体が８０〜１００重量部、充填剤が８００〜９００重量部、結合剤が１００〜２２０重量部であり、好ましくは、前記充填剤がデンプン、粉糖、デキストリン、乳糖、圧縮性デンプン、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、マンニトールから１つ又は複数を選んだものであり、前記結合剤がカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンから１つ又は複数を選んだものである、請求項２または３の製剤。

【請求項8】

前記経口製剤が、１０００製剤単位あたり、
クロロゲン酸結晶体 １００ｇ
充填剤 ８００ｇ
結合剤 １００ｇ
を含む、請求項７の製剤。

【請求項9】

免疫系疾患の治療、抗酸化、肝臓保護と利胆、心血管疾患の治療、抗ウィルス等の薬物の調製に用いられる、請求項１〜８のいずれか１つの製剤の用途。

【請求項10】

前記免疫系疾患が、腫瘍、乾癬等であり、前記腫瘍には、小細胞肺癌、肝臓癌、乳癌または脳腫瘍が含まれるがこれに限定されない、請求項９の用途。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はクロロゲン酸結晶形を含む製剤およびその用途に関し、薬物製剤の分野に属する。

【背景技術】

【0002】

クロロゲン酸は、カフェ酸とキナ酸から生成されるデプシドであり、植物体の好気呼吸の過程で、シキミ酸経路で生成されるフェニルプロパノイド化合物である。

【0003】

クロロゲン酸の生物活性の範囲は広く、現代科学では、食品、ヘルスケア、医薬、日用化学品等の複数の分野において、クロロゲン酸の生物活性に関する研究が進められている。クロロゲン酸は重要な生物活性物質であり、抗菌、抗ウィルス、白血球増加、肝臓保護と利胆、抗腫瘍、血圧降下、血中脂質降下、フリーラジカルの除去、中枢神経系の興奮等の効果をもたらす。

【0004】

しかしながら、従来技術におけるクロロゲン酸製剤は、ほとんどが不確定なものであって、それを使用した場合の効果には有意差が見られる。

【0005】

従来の文献では、クロロゲン酸には複数種の結晶形があるという報告がなされているものの、クロロゲン酸結晶形製剤の治療効果について比較研究した報告はまだない。同じ薬物の製剤であっても、結晶形の違いによって、薬物の外観、溶解度、融点、密度等の物理的・化学的性質、薬物溶出度、生物的有効性等において有意差が発生するため、薬物の安定性やバイオアベイラビリティ等、治療効果を発揮するにあたって影響が出てしまう。

【0006】

結晶形が薬物の効果を左右することは、現在の薬学界において関心を集めている問題であり、同じ薬物であっても治療効果に差が見られる原因としては、生産工程の違いによる品質のばらつき以外に、別の要素として薬物の結晶形が影響している可能性がある。薬物の結晶形によって溶解度および溶出速度が異なるため、バイオアベイラビリティに影響を及ぼし、ひいては臨床治療の効果にばらつきが出てしまうことになる。文献では、シメチジンにはＡ、Ｂ、Ｃ等複数種の結晶形が存在し、最も有効なものはＡ型のみであるが、国産シメチジンは一般に不完全なＡ型であり、それが治療効果に影響していると報告されている。抗潰瘍薬のファモチジンには４種類の結晶形があり、融点、赤外線分光分析および物理化学的性質において有意差が見られるが、胃酸分泌を抑制する活性はＡ型よりもＢ型が大きい。薬物の中には、無定形ネオマイシン懸濁液のように、非結晶形のものが結晶状態のものより治療効果が高いものがある。

【発明の概要】

【0007】

上記の技術的課題に対し、本発明の目的は、特定のクロロゲン酸を含む製剤および特定のクロロゲン酸の用量を提供することにある。

【0008】

本発明の上記目的は、以下の技術的手段によって達成される。
クロロゲン酸結晶形を含む製剤であって、前記結晶形が斜方晶系であり、空間群がＰ２_１２_１２_１であり、単位格子のパラメータがａ＝７．７２９１（２）Å、ｂ＝１０．９８０８（２）Å、ｃ＝３６．５３３４（７）Å、α＝β＝γ＝９０．００°、Ｚ＝８であり、単位格子の体積が３１００．６５（１１）Å^３であり、前記製剤の臨床用量が１日あたり１．０〜２０ｍｇ／ｋｇである。
本発明では、前記製剤中のクロロゲン酸結晶形の含有量は、剤形に応じて１０〜５００ｍｇ／ｇであることが好ましい。

【0009】

本発明において、前記製剤の剤形は、当分野の通常の剤形とすることができ、経口製剤、注射剤、気道投与製剤、皮膚投与製剤、粘膜投与製剤などを含むが、これらに限定されない。

【0010】

出願人は研究によって、クロロゲン酸製剤中のクロロゲン酸結晶形をコントロールすることで、その使用効果が著しく改善されることを見出した。さらに、出願人は、前記注射製剤において、クロロゲン酸結晶形の含有量が１０〜６０ｍｇ／ｋｇである場合、前記製剤が有する、ヒト神経膠腫、肝臓癌、肺癌、乳癌等の腫瘍のマウス移植腫瘍に対する著しい抑制作用がさらに優れた効果を発揮し、２０〜４０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい、ということを見出した。クロロゲン酸凍結乾燥粉末注射剤の臨床使用用量は、動物とヒトとの用量換算の関係から、１日あたり１．０〜６．０ｍｇ／ｋｇであり、２〜４ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。

【0011】

さらに出願人は、前記経口製剤中のクロロゲン酸結晶形の含有量が２０〜２００ｍｇ／ｋｇである場合、前記製剤の著しい肝臓保護作用がより優れた効果を発揮し、５０〜１４０ｍｇ／ｋｇが好ましいことを見出した。クロロゲン酸経口製剤の臨床使用用量の範囲は、動物とヒトとの用量換算の関係から、１日あたり２ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、５〜１４ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。

【0012】

本発明では、前記経口製剤および注射剤は、クロロゲン酸、又は、クロロゲン酸と薬学的に許容可能な医薬補助材料とにより調製される。

【0013】

本発明では、前記クロロゲン酸の結晶形は中国特許出願ＣＮ２０１４１０１９３６９９．８に記載される方法により調製することができ、前記凍結乾燥粉末注射剤も中国特許出願ＣＮ２０１３１０３６６９４５．０に記載される方式により実施することができる。

【0014】

さらに本発明では、前記凍結乾燥粉末注射剤は、以下の成分を含む。
クロロゲン酸結晶体 １０〜４０重量部
酸化防止剤 １〜５重量部
スキャホールド ６０〜１００重量部。

【0015】

上記凍結乾燥粉末注射剤中のクロロゲン酸結晶体は、３０〜４０重量部が好ましく、酸化防止剤は２〜５重量部が好ましく、スキャホールドは８０〜９０重量部が好ましい。前記酸化防止剤は亜硫酸水素ナトリウムであり、スキャホールドはマンニトールである。

【0016】

本発明の具体的な実施例では、前記凍結乾燥粉末注射剤は、１０００製剤単位あたり以下の成分を含む。
クロロゲン酸結晶体 ３０ｇ
酸化防止剤 ２ｇ
スキャホールド ８０ｇ、
注射用水を２０００ｍｌまで加える。

【0017】

さらに、本発明の前記経口製剤は、以下の成分を含む。
クロロゲン酸結晶体 ８０〜１５０重量部
充填剤 ７００〜９００重量部
結合剤 ２０〜２２０重量部。

【0018】

前記クロロゲン酸結晶体は、８０〜１００重量部が好ましく、充填剤は８００〜９００重量部が好ましく、結合剤は１００〜２２０重量部が好ましい。

【0019】

上記経口製剤中の、前記充填剤にはデンプン、粉糖、デキストリン、乳糖、圧縮性デンプン、微結晶セルロース、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、マンニトールのうちの１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない。結合剤にはカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンのうちの１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない。

【0020】

本発明の具体的な実施例では、前記経口製剤は、１０００製剤単位あたり以下の成分を含む。
クロロゲン酸結晶体 １００ｇ
充填剤 ８００ｇ
結合剤 １００ｇ。

【0021】

本発明のもう１つの目的は、上記製剤を、腫瘍、乾癬等の免疫系疾患の治療、抗酸化、肝臓保護と利胆、心血管疾患の治療、抗ウィルス等の分野における薬物の調製に使用することであり、具体的には、小細胞肺癌、肝臓癌、乳癌、脳腫瘍、乾癬が含まれるが、これらに限定されない。

【0022】

本発明の有益な効果は、以下の通りである。本発明のクロロゲン酸結晶形製剤は、薬物のバイオアベイラビリティ等、治療効果を発揮するのにより効果的であり、クロロゲン酸に治療効果を発揮させるための優れた結晶形であるとともに、腫瘍や乾癬等の免疫系疾患の治療、抗酸化、肝臓保護と利胆、心血管疾患の治療、抗ウィルス等の分野における薬物への使用においても、より優れた臨床治療効果を発揮する。さらに、本発明は、該クロロゲン酸結晶形製剤について、臨床のための効果的な用量を提供し、該クロロゲン酸結晶形製剤が臨床使用において安全且つ効果的であることの根拠となる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、ルイス肺癌のＣ５７ＢＬ／６マウス移植腫瘍の腫瘍抑制率に与える影響について、本発明のクロロゲン酸と市販のクロロゲン酸とを比較したグラフである。

【図2】図２は、Ｈ２２肝臓癌のＫＭマウス移植腫瘍の腫瘍抑制率に与える影響について、本発明のクロロゲン酸と市販のクロロゲン酸とを比較したグラフである。

【図3】図３は、ＥＭＴ−６乳癌のＢＡＢＬｃマウス移植腫瘍の腫瘍抑制率に与える影響について、本発明のクロロゲン酸と市販のクロロゲン酸とを比較したグラフである。

【図4】図４は、ヒト神経膠腫のマウスの腫瘍抑制率に与える影響について、本発明のクロロゲン酸と市販のクロロゲン酸とを比較したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

実施例１
凍結乾燥粉末注射剤の調製
１０００製剤単位（３０ｍｇ／本）あたりの確定処方は以下の通りである。
クロロゲン酸結晶体 ３０ｇ
酸化防止剤 ２ｇ
スキャホールド ８０ｇ
注射用水を２０００ｍｌまで加えた。
上記処方に従って原料を秤量し、注射用水を用意して、酸化防止剤（例えば亜硫酸水素ナトリウム）、クロロゲン酸結晶体、スキャホールド（例えばマンニトール）の順に加え、攪拌して十分に溶解させ、ｐＨを２〜４に制御した。注射用水の温度は４５〜５０℃とし、０．０３％の活性炭を添加して、３０分間攪拌した後、活性炭をろ過により除去した。さらに０．２２ミクロンの親水性微多孔膜を用いて、ろ液が清澄になるまでろ過し、無菌充填して、凍結乾燥させた。

【0025】

実施例２
経口製剤の調製
１０００製剤単位（１００ｍｇ／錠）あたりの確定処方は以下の通りである。
クロロゲン酸結晶体 １００ｇ
充填剤 ８００ｇ
結合剤 １００ｇ
クロロゲン酸結晶形に適量の充填剤を加えた後、結合剤を加え、ふるいにかけて混合し、造粒、整粒を行って適量の潤滑剤を添加し、打錠した。

【0026】

実施例３ 肺癌の治療に用いた。
動物 Ｃ５７ＢＬ／６マウス、体重１３〜２０ｇ、雄、雌各半数。

【0027】

細胞系 ルイス細胞をマウスの肺癌細胞株とし、１０％の子ウシ血清、１００Ｕ・ｍｌ^−１のペニシリン、１００μｇ・ｍｌ^−１のストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に付着させて成長させ、３７℃、Ｃ０_２５％のインキュベータ内で培養し、２〜３日ごとに液を交換して継代を行った。

【0028】

細胞の培養 細胞を通常通り蘇生させて継代し、対数増殖期のルイス細胞を０．２５％のトリプシンで消化解離させた後、消化を終了させてＲＰＭＩ−１６４０培養液を加えた。細胞をピペッティングして懸濁液を作り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。そして２回洗浄し、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約１×１０^７個の細胞を含む）の割合で、マウスの左前肢腋窩にそれぞれ皮下注射し、腫瘍が１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍまで成長したところで、実験用マウスとした。マウスの腫瘍を無菌剥離し、ハンクス液で３回洗浄して血液や脂肪、壊死組織を除去した。腫瘍を１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍの断片に切断し、ハンクス液で２回洗浄し、比率に応じて生理食塩水（１ｇ：３ｍｌ）を加え、ガラスホモジナイザーですりつぶした。それを８０〜１００メッシュのスクリーンでろ過して単細胞懸濁液を作り、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。

【0029】

（４）投与実験
調製された細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約１×１０^７個の細胞を含む）の割合で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左前腋窩下に接種して、体重別に１群１０匹として無作為に群分けし、それぞれクロロゲン酸投与用量群１００ｍｇ・ｋｇ^−１、９０ｍｇ・ｋｇ^−１、８０ｍｇ・ｋｇ^−１、７０ｍｇ・ｋｇ^−１、６０ｍｇ・ｋｇ^−１、５０ｍｇ・ｋｇ^−１、４０ｍｇ・ｋｇ^−１、３０ｍｇ・ｋｇ^−１、２０ｍｇ・ｋｇ^−１、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、５ｍｇ・ｋｇ^−１、１ｍｇ・ｋｇ^−１および陰性群（Ｎ．Ｓ生理食塩水）とした。接種後２日目に、各群全てに腹腔注射（ｉｐ）にて投与を行った。容量は０．２ｍｌ・１０ｇ^−１、１日１回、連続１２回投与した。陰性群の平均腫瘍重量が１．０ｇ（腫瘍の体積が約０．５ｃｍ^３）を超えたところで実験を止め、マウスを頸椎脱臼により死なせて秤量し、腫瘍を切り取って腫瘍抑制率を算出した。

【0030】

腫瘍抑制率％＝［１−（投与群平均腫瘍重量／陰性群平均腫瘍重量）］×１００％。

【0031】

（５）実験結果
表１および図１から、本発明のクロロゲン酸は、ルイス肺癌のＣ５７ＢＬ／６マウス移植腫瘍に対していずれも著しい抑制効果があり、陰性の対照群と比較すると、統計学的な差異があることがわかる。しかも１０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇの用量群において、腫瘍抑制効果が顕著である。

【0032】

【表1】

【0033】

陰性群との比較 ^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0034】

実施例４ 肝臓癌の治療に用いた。
（１）動物 昆明マウス、雄、雌各半数、体重１６〜２７ｇ。

【0035】

細胞系 Ｈ２２細胞株をマウスの肝臓癌細胞とし、１０％の子ウシ血清、１００Ｕ・ｍｌ^−１のペニシリン、１００μｇ・ｍｌ^−１のストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させて成長させ、３７℃、Ｃ０_２５％のインキュベータ内で培養し、２〜３日ごとに液を交換して継代を行った。

【0036】

細胞の培養 対数増殖期のＨ２２細胞を取って、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、２回洗浄して、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。そしてできるだけ早くＫＭマウスの腹腔内に接種し、７〜１０ｄ後に腹水を吸引して、腹水細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約２×１０^７個の細胞を含む）の割合でマウスの左前肢腋窩に皮下注射した。腫瘍が１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍまで成長したところで、実験用マウスとした。マウスの腫瘍を無菌剥離し、ハンクス液で３回洗浄して血液や脂肪、壊死組織を除去した。腫瘍を１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍの断片に切断し、ハンクス液で２回洗浄し、比率に応じて生理食塩水（１ｇ：３ｍｌ）を加え、ガラスホモジナイザーですりつぶした。それを８０〜１００メッシュのスクリーンでろ過して単細胞懸濁液を作り、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。

【0037】

（４）投与実験
調製された細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約１×１０^６個の細胞を含む）の割合で、ＫＭマウスの左前腋窩下に接種して、体重別に１群１０匹として無作為に群分けし、それぞれクロロゲン酸投与用量群１００ｍｇ・ｋｇ^−１、９０ｍｇ・ｋｇ^−１、８０ｍｇ・ｋｇ^−１、７０ｍｇ・ｋｇ^−１、６０ｍｇ・ｋｇ^−１、５０ｍｇ・ｋｇ^−１、４０ｍｇ・ｋｇ^−１、３０ｍｇ・ｋｇ^−１、２０ｍｇ・ｋｇ^−１、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、５ｍｇ・ｋｇ^−１、１ｍｇ・ｋｇ^−１および陰性群（Ｎ．Ｓ生理食塩水）とした。接種後２日目より静脈（ｉｖ）投与を開始した。容量は０．２ｍｌ・１０ｇ^−１、１日１回とした。陰性群の平均腫瘍重量が１．０ｇ（腫瘍の体積が約０．５ｃｍ^３）を超えたところで実験を止め、マウスを頸椎脱臼により死なせて秤量し、腫瘍を切り取って腫瘍抑制率を算出した。

【0038】

（５）試験結果
表２および図２から、本発明のクロロゲン酸は、Ｈ２２肝臓癌のＫＭマウス移植腫瘍に対していずれも著しい抑制効果があり、陰性の対照群と比較すると、統計学的な差異があることがわかる。しかも１０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇの用量群において、腫瘍抑制効果が顕著である。

【0039】

【表2】

【0040】

陰性群との比較 ^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。

【0041】

実施例５ ＢＡＢＬｃマウス移植腫瘍に対する抑制効果の体内研究
実験材料
（１）動物 ＢＡＢＬｃマウス、雌、体重１７〜２１ｇ。

【0042】

細胞系 ＥＭＴ−６細胞株をマウスの乳癌細胞とし、１０％の子ウシ血清、１ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１００Ｕ・ｍｌ^−１のペニシリン、１００μｇ・ｍｌ^−１のを含むＲＰＭＩ−１６４０完全培地に付着させて成長させ、３７℃、Ｃ０_２５％のインキュベータ内で培養し、２〜３日ごとに液を交換して継代を行った。

【0043】

細胞の培養 細胞を通常通り蘇生させて継代し、対数増殖期のＥＭＴ−６細胞を０．２５％のトリプシンで消化解離させた後、消化を終了させてＲＰＭＩ−１６４０培養液を加えた。細胞をピペッティングして懸濁液を作り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。そして２回洗浄し、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約１×１０^７個の細胞を含む）の割合で、できるだけ早くマウスの左前肢腋窩にそれぞれ皮下注射し、腫瘍が１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍまで成長したところで、実験用マウスとした。マウスの腫瘍を無菌剥離し、ハンクス液で３回洗浄して血液や脂肪、壊死組織を除去した。腫瘍を１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍの断片に切断し、ハンクス液で２回洗浄し、比率に応じて生理食塩水（１ｇ：３ｍｌ）を加え、ガラスホモジナイザーですりつぶした。それを８０〜１００メッシュのスクリーンでろ過して単細胞懸濁液を作り、トリパンブルー染色により生存細胞数を計数した。

【0044】

実験方法
調製された細胞懸濁液を、マウス１匹あたり０．２ｍｌ（約１×１０^６個の細胞を含む）の割合で、７０匹のＢＡＢＬｃマウスの左前腋窩下に接種した。そして体重別に１群１０匹として無作為に群分けし、それぞれクロロゲン酸投与用量群１００ｍｇ・ｋｇ^−１、９０ｍｇ・ｋｇ^−１、８０ｍｇ・ｋｇ^−１、７０ｍｇ・ｋｇ^−１、６０ｍｇ・ｋｇ^−１、５０ｍｇ・ｋｇ^−１、４０ｍｇ・ｋｇ^−１、３０ｍｇ・ｋｇ^−１、２０ｍｇ・ｋｇ^−１、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、５ｍｇ・ｋｇ^−１、１ｍｇ・ｋｇ^−１および陰性群（Ｎ．Ｓ生理食塩水）とした。接種後２日目に、各群全てに筋肉注射（ｉｐ）によって投与を行った。容量は０．２ｍｌ・１０ｇ^−１、１日１回、９日間連続投与した。陰性群の平均腫瘍重量が１．０ｇ（腫瘍の体積が約０．５ｃｍ^３）を超えたところで実験を止め、マウスを頸椎脱臼により死なせて秤量し、腫瘍を切り取って腫瘍抑制率を算出した。

【0045】

腫瘍抑制率％＝［１−（投与群平均腫瘍重量／陰性群平均腫瘍重量）］×１００％。

【0046】

実験結果
クロロゲン酸が、ＥＭＴ−６乳癌のＢＡＢＬｃマウス移植腫瘍の重量および腫瘍抑制率に与える影響については、表３および図３を参照。

【0047】

【表3】

【0048】

陰性群との比較 ^＊＊＊ｐ＜０．００１。

【0049】

表３および図３から、本発明のクロロゲン酸は、ＥＭＴ−６乳癌のＢＡＢＬｃマウス移植腫瘍に対していずれも著しい抑制効果があり、陰性の対照群と比較すると、統計学的な差異があることがわかる。しかも１０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇの用量群において、腫瘍抑制効果が顕著である。

【0050】

実施例６ クロロゲン酸の、移植性神経膠腫に対する腫瘍抑制効果に関する研究
１．材料
四川大学華西医院衛生部移植工程および移植免疫重点実験室より提供されたヒト神経膠腫細胞株。四川九章生物科技有限公司から提供された本発明のクロロゲン酸。市販のクロロゲン酸。

【0051】

方法
（１）モデル作成 マウスを１群１０匹として無作為に群分けした。神経膠腫芽細胞の腫瘍細胞株と適切な希釈液とを配合して、マウスの左側頭葉皮質内にそれぞれ接種した。

【0052】

投与と介入 接種の２４ｈ後、各群のマウスにそれぞれ腹腔注射にて投与を行った。それぞれクロロゲン酸が１００ｍｇ・ｋｇ^−１、９０ｍｇ・ｋｇ^−１、８０ｍｇ・ｋｇ^−１、７０ｍｇ・ｋｇ^−１、６０ｍｇ・ｋｇ^−１、５０ｍｇ・ｋｇ^−１、４０ｍｇ・ｋｇ^−１、３０ｍｇ・ｋｇ^−１、２０ｍｇ・ｋｇ^−１、１０ｍｇ・ｋｇ^−１、５ｍｇ・ｋｇ^−１、１ｍｇ・ｋｇ^−１の用量群とし、陰性対照群には同体積の生理食塩水を投与した。連続１５ｄ投与を行った。

【0053】

腫瘍抑制率の測定 最終日に投与を止め、全てのマウスを死なせて解剖し、腫瘍組織を取り出して秤量した。抑制率＝（対照群の平均腫瘍重量−治療群の平均腫瘍重量）／腫瘍重量対照群平均腫瘍重量×１００％。

【0054】

統計学的方法 データ分析は、統計プログラムパッケージソフト（ＳＰＳＳ １３．０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ）を用いて分散分析を行った。Ｐ＜０．０５をもって有意差ありとした。

【0055】

結果 分析結果から、投与群はブランク群に対して、腫瘍抑制率が著しく向上していることがわかり、クロロゲン酸には腫瘍の成長を阻害する効果があることが証明された。その腫瘍抑制効果は、用量が中程度の群において最も顕著であり、用量が多い群がそれに続く。具体的なデータは表４を参照。

【0056】

【表4】

【0057】

表４および図４から、本発明のクロロゲン酸は、ヒト神経膠腫のマウス移植腫瘍に対して著しい抑制効果があり、陰性の対照群と比較すると、統計学的な差異があることがわかる。しかも１０ｍｇ／ｋｇ〜６０ｍｇ／ｋｇの用量群における腫瘍抑制効果が顕著である。

【0058】

実施例７ クロロゲン酸の化学的肝障害（アルコール性脂肪肝ラットモデル）に対する保護効果
１．材料および方法
薬物 四川九章生物科技有限公司より提供された本発明のクロロゲン酸。市販のクロロゲン酸。

【0059】

動物 雌のＳＤラット、体重１５６〜１９３ｇ、ＳＰＦグレード。

【0060】

試験の群分けと用量設計 雌のＳＤラットを、１群１０匹として無作為に群分けした。試験は、２０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇの用量群を設け、別途陰性の対照群と、５０％エタノールのモデル対照群とを設けた。エタノール（分析グレード）によって肝障害モデルを作った。

【0061】

試験方法 アルコール肝障害モデル法を用いた。クロロゲン酸群には、異なる用量の試験薬物をガバージュにて投与し、陰性対照群およびモデル対照群には、生理食塩水を１０ｍｌ／ｋｇの割合で１日１回、経口にて連続３０日間与えた。
２．検出指標
ラット血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧの測定、肝ホモジネートＳＯＤ、ＭＤＡ、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の測定。

【0062】

試験データの統計 試験データの統計は、ＳＰＳＳ １９．０ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓパッケージソフトを用いて処理を行った。

【0063】

実験結果
ラットの肝ホモジネート中のＳＯＤ、ＭＤＡ、還元型ＧＳＨおよび血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ含有量に対するクロロゲン酸の影響は、表５、表６及び表７を参照。

【0064】

表５、表６及び表７から、モデル対照群のラットの肝ホモジネートにおけるＭＤＡ、ＧＳＨ、ＴＧ含有量は、陰性対照群よりもＭＤＡ、ＴＧの含有量が著しく高く（Ｐ＜０．０１）、還元型ＧＳＨの含有量が著しく低い（Ｐ＜０．０１）ことから、該モデルは成功しており、信頼できる実験システムであるということがわかる。一方、本発明のクロロゲン酸群では、いずれも異なる度合いでラットの血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧ、ＭＤＡの含有量が下がり、ＳＯＤ、ＧＳＨレベルが上がっている。しかも、５０ｍｇ／ｋｇ〜１４０ｍｇ／ｋｇの用量群は、非常に重要な統計学的有意性を備えている。

【0065】

従って、本発明のクロロゲン酸は、化学的肝障害に対して明らかな抑制効果があり、用量が５０〜１４０ｍｇ／ｋｇにおいて最も効果が顕著である。

【0066】

【表5】

【0067】

【表6】

【0068】

【表7】

【0069】

注：陰性対照群との比較：^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊Ｐ＜０．０５。モデル対照群との比較：＃＃Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】