特表 2017-537616 インビトロ転写後のＲＮＡ精製のための方法及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-537616(P2017-537616A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(54)【発明の名称】インビトロ転写後のＲＮＡ精製のための方法及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171124BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20171124BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-525860(P2017-525860)

(86)(22)【出願日】2015年11月10日

(85)【翻訳文提出日】2017年7月11日

(86)【国際出願番号】US2015059867

(87)【国際公開番号】WO2016077294

(87)【国際公開日】20160519

(31)【優先権主張番号】62/079,854

(32)【優先日】2014年11月14日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】397068274

【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100175042

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 秀明

(72)【発明者】

【氏名】シェイ，イー−チォン

(72)【発明者】

【氏名】シュー，チォン−イー

(72)【発明者】

【氏名】ウー，チーア−リン

(72)【発明者】

【氏名】イエン，シアンジャン

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB20

4B029CC01

4B029HA05

(57)【要約】

本開示は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、少なくとも１つの磁性粒子を含み、かつ、約４〜約１０の範囲のｐＨを有する結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｂ）少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子と可逆的に結合させて、少なくとも１つの改質された磁性粒子を形成するのに十分な時間、試料を結合バッファとともにインキュベートする工程、（ｃ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶液から分離する工程、（ｄ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を少なくとも１つの洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程を含む、核酸精製のための方法に関する。これらのバッファ及び磁性粒子を含むキットもまた、本明細書に開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を約４〜約１０の範囲のｐＨを有する結合バッファと混合し、溶液を形成する工程であって；
前記結合バッファが、少なくとも１つの磁性粒子、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック試薬、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１の塩を含む、工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子と可逆的に結合させて、少なくとも１つの改質された磁性粒子を形成するのに十分な時間、前記溶液をインキュベートする工程；
（ｃ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を前記混合された溶液から分離する工程；
（ｄ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、少なくとも１つの第２のアルコール及び必要に応じて少なくとも１つの第２の塩を含む、少なくとも１つの洗浄バッファで洗浄する工程；及び
（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程
を含む、核酸精製のための方法。

【請求項2】

前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、ＲＮＡを含むインビトロ転写試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記少なくとも１つの第１のカオトロピック試薬が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、リチウム塩、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

（ａ）約４〜約１０の範囲のｐＨを有し、かつ、少なくとも１つの磁性粒子、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック試薬、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１の塩を含む、結合バッファ；
（ｂ）少なくとも１つの第２のアルコール及び必要に応じて少なくとも１つの第２の塩を含む、洗浄バッファ；及び
（ｃ）溶出バッファ
を含む、核酸精製のためのキット。

【請求項7】

前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、ＲＮＡを含むインビトロ転写試料であることを特徴とする、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

前記少なくとも１つのカオトロピック試薬が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、リチウム塩、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つのアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、請求項６又は７に記載のキット。

【請求項9】

前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。

【請求項10】

前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、２０１４年１１月１４日出願の米国仮特許出願第６２／０７９８５４号の米国法典第３５編特許法第１１９条に基づく優先権の利益を主張する。

【技術分野】

【0002】

本開示は、概略的には、核酸精製のための方法及びキットに関し、より詳細には、インビトロ転写後のＲＮＡを含む試料を精製するための磁性粒子をベースとしたキット及び方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ＤＮＡ又はＲＮＡの単離などの核酸精製は、さまざまな生化学的及び診断的手順における重要な工程でありうる。ＲＮＡは、遺伝子発現研究、分子研究、及び／又は、例えば、ＲＮＡ干渉、マイクロインジェクション、感染、インビトロ翻訳、及び／又はヌクレアーゼプロテクションアッセイの手順などの生化学研究など、多くの用途に使用されうる。転写は、相補的及び逆平行ＲＮＡ鎖がＲＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ鋳型から合成される、遺伝子発現における最初のステップである。インビトロ転写（ＩＶＴ）は、ＤＮＡから、キャッピング又は放射性標識などの所望の配列又は改変を有するヌクレオチドをインビトロで複写する方法を提供することができる。

【0004】

例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモータについての転写を推進するように設計された、さまざまなＩＶＴキットが存在する。しかしながら、下流用途に進む前に、塩、タンパク質、酵素、オリゴヌクレオチドなどの１つ以上の汚染物質を除去するために、ＩＶＴ後の試料の精製が必要とされうる。このような汚染物質の存在によって、多くの下流処理が妨げられ、阻まれうる。よって、所望の最終用途の機能性を確実にするために、核酸をＩＶＴ後混合物から効率的に単離することが重要でありうる。

【0005】

核酸を精製するために選択される方法は、幾つかの事例では、核酸試料の収率、品質、及び／又は純度を含む、単離された生成物のさまざまな特性に影響を与えうる。核酸精製のための多くの方法が開発されてきたが、これらの方法は、例えば、高コスト、高複雑性、低速度、低収率、低純度、汚染、毒性、及び／又は非効率性を含む、１つ以上の欠点を有しうる。比較的高純度のＲＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出などの従来の沈殿法を使用して、ＩＶＴ混合物から単離されうる；しかしながら、このような方法は、時間がかかり、かつ複雑でありうる。

【0006】

磁性ビーズ、スピンカラム、及び／又は濾過システムを使用する方法など、固相系の方法は、代替的な解決策として提示されている。これらの方法の中でもとりわけ、磁性粒子をベースとした精製システムは、遠心分離及び／又は真空工程がないことによる簡便性の向上など、さまざまな利点を有しうる。しかしながら、磁性粒子を使用する方法は、今もなお、低速度、高複雑性、及び／又は全体の収率の乏しさなどのさまざまな不利点に悩まされうる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、より速く、複雑性が低下した、より安価な、及び／又は生成物の純度及び／又は収率に関して改善されうる、核酸精製のための磁性粒子をベースとした方法及びキットを提供することは有益であろう。結果的に得られる精製された核酸は、多種多様の遺伝子発現、分子、及び／又は生化学的用途に使用されうる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、さまざまな実施形態において、核酸を精製するための方法に関し、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、少なくとも１つの磁性粒子を含み、かつ、約４〜約１０の範囲のｐＨを有する結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｂ）少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子と可逆的に結合させて、少なくとも１つの改質された磁性粒子を形成するのに十分な時間、試料を結合バッファとともにインキュベートする工程、（ｃ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶液から分離する工程、（ｄ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を少なくとも１つの洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程を含む。

【0009】

さまざまな実施形態によれば、結合バッファは、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック試薬、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのアルコール、及び、必要に応じて、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの塩を含みうる。他の実施形態では、洗浄バッファは、少なくとも１つのアルコール及び、必要に応じて、少なくとも１つの塩を含みうる。さらなる実施形態によれば、溶出バッファは、水、並びに、例えば、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つのイオンキレート剤及び／又は約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの少なくとも１つのバッファ化合物を含む低塩溶液から選択されうる。磁性粒子は、例えば、カルボキシルコーティングされた磁性粒子、シリカ系磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されうる。これらのバッファ及び磁性粒子を含む核酸精製キットもまた、本明細書に開示される。

【0010】

本発明の追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載されており、一部には、その説明から当業者にとって容易に明らかとなり、あるいは、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付の図面を含む、本明細書に記載される本発明を実施することによって認識されよう。

【0011】

前述の概要及び以下の詳細な説明は、両方とも本開示のさまざまな実施形態を提示しており、特許請求の範囲の本質及び特性を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されているものと解されたい。添付の図面は、本開示のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書内に取り込まれてその一部を構成する。図面は、本開示のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに、本発明の原理及び動作を説明する役目をする。

【0012】

以下の詳細な説明は、同様の構造が同様の参照番号で示される、以下の図面と併せて読まれた場合に、最もよく理解されうる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】本開示の一実施形態に従った核酸精製方法を示す流れ図

【図2】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのＲＮＡ収率を示すグラフ

【図3】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分析

【図4】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのＲＮＡ収率を示すグラフ

【図5A】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分析

【図5B】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製されたＲＮＡのアガロースゲル電気泳動分析

【図6】先行技術の方法と比較した、本開示のさまざまな実施形態に従った方法についてのＲＮＡ収率を示すグラフ

【図7】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製された核酸のアガロースゲル電気泳動分析

【図8】本開示のさまざまな実施形態に従った方法を使用して、及び、先行技術の方法を使用して精製された小さい核酸断片のアガロースゲル電気泳動分析

【発明を実施するための形態】

【0014】

方法
核酸精製のための方法が、本明細書に開示され、該方法は、（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を、少なくとも１つの磁性粒子を含み、かつ、約４〜約１０の範囲のｐＨを有する結合バッファと混合し、溶液を形成する工程；（ｂ）少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子と可逆的に結合させて、少なくとも１つの改質された磁性粒子を形成するのに十分な時間、試料を結合バッファとともにインキュベートする工程、（ｃ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶液から分離する工程、（ｄ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を少なくとも１つの洗浄バッファで洗浄する工程；及び、（ｅ）少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程を含む。

【0015】

本開示の実施形態は、本開示の非限定的な実施形態に従った核酸精製方法の流れ図を示す図１に関して論じられる。以下の概要は、特許請求の範囲に記載される本方法の概観を提供することが意図されており、さまざまな態様は、非限定的な実施形態に関して、本開示全体にわたってさらに詳細に論じられ、これらの実施形態は、以下に論じられる概略的な方法の文脈において互いに置き換え可能である。

【0016】

図１に実証されるように、工程ＩＶＴでは、ＲＮＡ分子１１０及び望ましくない汚染物質１０５（例えば、塩、タンパク質、酵素、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ＤＮＡ鋳型、及びヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ））を含む試料が生成されうる。工程Ｉでは、試料は、とりわけ、少なくとも１つの磁性粒子１１５を含む結合バッファと混合され、かつ、インキュベートされうる。インキュベーションの間、試料中のＲＮＡ分子１１０は、磁性粒子１１５の表面に可逆的に結合されうる。次に、工程Ｓにおいて、磁石１２０を使用して、磁性粒子１１５を引き寄せ、残りの溶液からそれらを分離する。結合していない汚染物質１０５は、工程Ｗにおいて１つ以上の洗浄バッファを使用して磁性粒子１１５を洗浄することによって除去されうる。次に、ＲＮＡ１１０は、工程Ｅにおいて、１つ以上の溶出バッファを使用して、磁性ビーズから溶出かつ解放されうる。最後に、磁性粒子１１５は、工程ＰにおいてＲＮＡ１１０から分離されて、次にさまざまな用途に使用されうる精製された生成物を生じうる。

【0017】

本明細書で用いられる場合、用語「少なくとも１つの核酸を含む試料」及びその変形物は、例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子など、少なくとも１つの核酸を含みうる任意の材料を意味することが意図されている。少なくとも１つの核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、トータルＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、及び／又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドが挙げられうる。さまざまな実施形態において、試料は、ＲＮＡを含むＩＶＴ後混合物でありうる。追加の実施形態によれば、精製される少なくとも１つの核酸は、例えばトータルＲＮＡなどのＲＮＡでありうる。

【0018】

本明細書に開示されるさまざまな方法によれば、例えば、ＲＮＡを含むＩＶＴ後の試料など、少なくとも１つの核酸を含む試料は、結合バッファ（Ｂ１）（例えば、図１の工程Ｂを参照）と混合されうる。結合バッファＢ１は、少なくとも１つのカオトロピック試薬（Ｃ１）、少なくとも１つのアルコール（Ａ１）、及び、必要に応じて、少なくとも１つの塩（Ｚ１）を含みうる。試料と結合バッファＢ１との体積比は、例えば、約１：１．８〜約１：２．５、又は約１：２〜約１：２．２など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１：１．５〜約１：３の範囲でありうる。ある特定の実施形態では、試料と結合バッファとの体積比は、約１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、又は１：３であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。

【0019】

試料及び結合バッファＢ１は、当技術分野で知られたいずれかの方式で混合してよく、例えば、結合バッファＢ１は、試料に加えられて、例えば反転によって、混合されうる。ある特定の実施形態では、混合物は、少なくとも５回、少なくとも１０回、又はそれ以上などの複数回、反転されうる。試料は、少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子に結合させるのに十分な時間、結合バッファＢ１中でインキュベートされうる。この時間は、例えば、約２分〜約２５分、約３分〜約２０分、約４分〜約１５分、又は約５分〜約１０分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約３０分の範囲でありうる。

【0020】

少なくとも１つのカオトロピック試薬Ｃ１は、例えば、約０．３Ｍ〜約５Ｍ、約０．５Ｍ〜約４Ｍ、約０．７Ｍ〜約３．５Ｍ、約１Ｍ〜約３Ｍ、約１．２Ｍ〜約２．５Ｍ、又は約１．５Ｍ〜約２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で結合バッファＢ１中に存在しうる。例えば、Ｃ１の濃度は、約０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、３Ｍ、３．１Ｍ、３．２Ｍ、３．３Ｍ、３．４Ｍ、３．５Ｍ、３．６Ｍ、３．７Ｍ、３．８Ｍ、３．９Ｍ、４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、又は６Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのカオトロピック試薬Ｃ１は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）及びチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）などのグアニジン塩；酢酸リチウム及び過塩素酸リチウムなどのリチウム塩；及び、それらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのカオトロピック試薬Ｃ１は、ＧｕＨＣｌ及びＧｕＳＣＮから選択されうる。少なくとも１つのカオトロピック試薬Ｃ１は、さまざまな実施形態において、少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの磁性粒子への結合を促進するために用いられうる。

【0021】

少なくとも１つのアルコールＡ１は、例えば、約０．３Ｍ〜約４．５Ｍ、約０．５Ｍ〜約４Ｍ、約０．７Ｍ〜約３．５Ｍ、約１Ｍ〜約３Ｍ、約１．２Ｍ〜約２．５ Ｍ、又は約１．５Ｍ〜約２Ｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で結合バッファＢ１中に存在しうる。例えば、Ａ１の濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、３Ｍ、３．１Ｍ、３．２Ｍ、３．３Ｍ、３．４Ｍ、３．５Ｍ、３．６Ｍ、３．７Ｍ、３．８Ｍ、３．９Ｍ、４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、又は５Ｍであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。

【0022】

非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ１は、例えば、約２５体積％〜約４５体積％、又は約３０体積％〜約４０体積％など、結合バッファＢ１の全体積の約２０体積％〜約５０体積％を構成してよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ１は、イソプロパノールでありうる。少なくとも１つのアルコールＡ１は、さまざまな実施形態において、カオトロピックであってよく、試料中のタンパク質を変性させるのに用いられうる。

【0023】

少なくとも１つの塩Ｚ１は、存在する場合には、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で結合バッファＢ１中に存在しうる。例えば、Ｚ１の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ１は、リン酸一ナトリウム（ＮａＨ_２ＰＯ_４）、リン酸二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、及びそれらの組合せなどのリン酸塩から選択されうる。

【0024】

さまざまな実施形態によれば、結合バッファＢ１は、約４．５〜約９．５、約５〜約９、約５．５〜約８．５、約６〜約８、又は約６．５〜約７．５など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約１０の範囲のｐＨを有しうる。例えば、結合バッファＢ１のｐＨは、約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。

【0025】

本明細書で用いられる場合、用語「磁性粒子」及びその変形物は、例えば、核酸が可逆的に結合可能な表面を有する少なくとも１つの材料でコーティングされた、常磁性又は超常磁性などの磁性を有するコアを有する粒子を意味することが意図されている。適切な磁性粒子としては、例えば、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子などが挙げられうる。シリカ系磁性粒子は、幾つかの実施形態では、ケイ質酸化物（siliceous oxide）でコーティングされ、したがって核酸が結合可能な水和したケイ質酸化物吸着性表面（例えば、シラノール基を含む表面）を提供する、常磁性のコアを含みうる。磁性粒子は、追加的な実施形態において、２、３例を挙げると、弱く又は強く正に荷電した表面、弱く又は強く負に荷電した表面、若しくは疎水性の表面などの機能化された表面を生成するように表面改質されうる。

【0026】

市販の磁性粒子の非限定的な例としては、ＭａｇＱｕ Ｃｏ．Ｌｔｄ．社製のＱｂｅａｄｓ、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ＆Ｃｏ．社製のＧｒａｃｅビーズなどが挙げられる。磁性粒子は、例えば、直径約０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０μｍなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、直径約０．３μｍ〜約１０μｍの範囲の直径などの市販の寸法を含む、核酸を結合するのに適した任意の寸法を有しうる。Ｑｂｅａｄｓは、例えば、約４μｍ〜約５μｍの範囲の平均直径、Ｇｒａｃｅビーズは約５μｍ〜約１０μｍの範囲の平均直径を有しうる。

【0027】

少なくとも１つの磁性粒子は、例えば、約０．７５μｇ／μｌ〜約５５μｇ／μｌ、約１μｇ／μｌ〜約５０μｇ／μｌ、約２μｇ／μｌ〜約４５μｇ／μｌ、約３μｇ／μｌ〜約４０μｇ／μｌ、約４μｇ／μｌ〜約３５μｇ／μｌ、約５μｇ／μｌ〜約３０μｇ／μｌ、約６μｇ／μｌ〜約２５μｇ／μｌ、約７μｇ／μｌ〜約２０μｇ／μｌ、約８μｇ／μｌ〜約１５μｇ／μｌ、又は約９μｇ／μｌ〜約１０μｇ／μｌなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約０．５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の濃度で結合バッファ中に存在しうる。非限定的な実施形態の例として、少なくとも１つの磁性粒子は、Ｑｂｅａｄｓから選択されて差し支えなく、約０．５μｇ／μｌ〜約５μｇ／μｌの範囲の濃度で結合バッファＢ１中に存在しうる。代替的な実施形態では、少なくとも１つの磁性粒子は、Ｇｒａｃｅビーズから選択されて差し支えなく、約２μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の濃度で結合バッファＢ１中に存在しうる。

【0028】

理論に縛られることは望まないが、結合バッファＢ１によって取り込まれた、比較的高濃度のカオトロピック試薬、アルコール、及び／又は塩は、ＲＮＡなどの核酸が、シリカ表面などの磁性粒子の表面に可逆的に（例えば、非共有的に）結合する能力を高めることができると考えられる。よって、例えば可逆的に結合された核酸を含む、改質された磁性粒子は、次に、結合していない汚染物質から分離されうる（例えば、図１の工程Ｓを参照）。例えば、磁石は、改質された磁性粒子に近接して配置され、粒子を引き寄せて、例えば、凝集体又はペレットを形成しうる。ある特定の実施形態では、改質された磁性粒子を含む混合溶液を含有する管のような容器は、残留溶液を除去するとともに粒子を寄せ集めいくらか固定することが可能な磁気スタンド上に、配置されうる。

【0029】

核酸を磁性粒子に結合する際、及び、磁石を用いて、改質された磁性粒子を分離した後、粒子を混合し、濯がれ、又は、１つ以上の洗浄バッファで洗浄されうる（例えば、図１の工程Ｗを参照）。洗浄バッファ（Ｗ１）は、例えば、少なくとも１つのアルコール（Ａ２）及び、必要に応じて、少なくとも１つの塩（Ｚ２）を含みうる。改質された磁性粒子は、洗浄バッファＷ１で１回又は複数回、濯がれてよく、追加的な洗浄には、同一又は異なる組成、濃度、及び／又は容積量を使用することができる。

【0030】

少なくとも１つのアルコールＡ２は、例えば、約７５体積％〜約９５体積％、又は約８０体積％〜約９０体積％など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約７０体積％〜１００体積％の範囲の濃度で洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ａ２の濃度は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％であってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つのアルコールＡ２は、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つのアルコールＡ２は、エタノールでありうる。

【0031】

少なくとも１つの塩Ｚ２は、存在する場合には、例えば、約２０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約７０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭなど、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で洗浄バッファＷ１中に存在しうる。例えば、Ｚ２の濃度は、約１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭであってよく、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む。さまざまな実施形態によれば、少なくとも１つの塩Ｚ２は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択されうる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも１つの塩Ｚ２は、ＮａＡＣ及びＮＨ_４ＡＣから選択されうる。

【0032】

さまざまな実施形態によれば、洗浄バッファＷ１のｐＨは、例えば、約５〜約７、約６〜約６．５、又は約６．４〜約６．８など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約４〜約８の範囲でありうる。洗浄バッファＷ１のｐＨは、アルコール及び／又は塩の量を変化させることによって調整されてよく、あるいは、本明細書に開示されるように、氷酢酸又はＮａＯＨなどの１つ以上のバッファ化合物を使用して調整されてもよい。

【0033】

洗浄バッファＷ１の添加及び除去の後に、塩、タンパク質、酵素等の汚染物質を含まない、又は実質的に含まない、表面に可逆的に結合された核酸を有する、改質された磁性粒子がもたらされうる。さまざまな実施形態によれば、このように生成された、改質された磁性粒子は、次に、１つ以上の溶出バッファ（Ｅ１）と混合され、結合した核酸を放出し、磁性粒子から分離することができる（例えば、図１の工程Ｅを参照）。改質された磁性粒子は、例えば、約４５秒〜約９分、約１分〜約８分、約２分〜約７分、約３分〜約６分、又は約４分〜約５分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約３０秒〜約１０分などの核酸を放出するのに十分な時間、溶出バッファＥ１中でインキュベートされうる。溶出バッファＥ１は、例えば、水、若しくは、例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つのバッファ（例えばＴｒｉｓなど）、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つの塩、及び／又は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの少なくとも１つのイオンキレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）を含む、比較的低塩の溶液を含みうる。非限定的な実施形態によれば、溶出バッファＥ１は、約１ｍＭのＥＤＴＡ及び約１０ｍＭのＴｒｉｓを含みうる。

【0034】

磁性粒子（もはや核酸には付着していない）は、その後、例えば、磁石を使用して分離され、溶液から除去されてよく、最終生成物として溶液中の精製された核酸を生じうる（例えば、図１の工程Ｐを参照）。例えば、本明細書に開示される方法及びキットは、精製されたＲＮＡ生成物を提供するために用いられうる。さまざまな実施形態によれば、本明細書に開示される方法及びキットは、精製されたＲＮＡを短時間で効率的に生成するために用いられうる。例えば、非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、約２０分未満など、約３０分未満の時間で行われうる。本明細書に開示される方法は、ある特定の実施形態では、およそ２０分間で少なくとも約９０％の相対的なＲＮＡ収率をもたらす。

【0035】

さまざまなバッファ溶液の成分は、幾つかの実施形態では、例えば、互いに同一であっても異なっていてもよいなど、互いに置換可能に用いられうるものと解されたい。例えば、アルコールＡ１及びＡ２並びに塩Ｚ１及びＺ２は、それぞれ、同一であっても異なっていてもよい。同様に、これらの成分の濃度は可変であり、幾つかの事例では、所望の用途に応じて、同一であるか又は類似していてもよい。

【0036】

本明細書に開示される方法はさらに、遠心分離、濾過など、当技術分野で知られている追加の工程を含みうるものと解されたい。他の非限定的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、遠心分離又は濾過の工程を含まず、それによって、処理を自動化する能力が高まりうる。他の必要に応じた工程は、空気乾燥を含んでもよく、例えば、改質された磁性粒子を洗浄バッファＷ１で濯いだ後に、粒子は、約２分〜約９分、約３分〜約８分、約４分〜約７分、又は約５分〜約６分など、これらの間のすべての範囲及び部分的範囲を含む、約１分〜約１０分の範囲の時間、空気乾燥されうる。さまざまな試料、溶液、若しくは、試料又は溶液の一部を管などの新しい容器へと除去又は移動することもまた、所望されるように又は必要に応じて、本明細書に開示される方法の間に行われうる。

【0037】

キット
本開示はまた、核酸精製のためのキットにも関し、該キットは、結合バッファ、洗浄バッファ、及び溶出バッファを含む。バッファは、さまざまな実施形態において、精製方法に関して先に開示されたバッファＢ１、Ｗ１、及びＥ１に対応しうる。各バッファに関して上述したさまざまな実施形態は、本明細書に開示されるキットを形成するために、限定されることなく、いずれかの方式で組み合わせることができるものと解されたい。

【0038】

さまざまな実施形態によれば、即時使用可能な、各成分について所定の濃度を有する各バッファが、キットに提供されうる。あるいは、末端利用者によって、適切な種類及び量の溶媒で希釈されて、即時使用可能なバッファを生成するために、１つ以上の濃縮溶液が提供されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、使用者によって例えばイソプロパノールなどのアルコールで体積比１：１まで希釈可能な、濃縮された結合バッファがキット内に提供されてもよい。さらなる実施形態によれば、使用者によってエタノールなどのアルコールで、例えば、エタノールの７０体積％以上の最終濃度まで希釈可能な、濃縮された洗浄バッファＷ１が提供されてもよい。キットは、幾つかの実施形態では、末端利用者への精製プロトコルに関する指示書及び／又は希釈指示書をさらに含みうる。他の実施形態によれば、キットはさらに、磁気スタンド、管、遠心分離機、及び／又は溶媒などのさまざまな追加の構成要素又は設備を含みうる。

【0039】

さまざまな開示される実施形態は、その特定の実施形態に関して説明される特定の特徴、要素又は工程を包含しうるものと認識されよう。特定の特徴、要素又は工程は、１つの特定の実施形態に関して説明されるが、さまざまな例証されていない組合せ又は置換における代替的な実施形態と差し替える又は組み合わせることができることもまた認識されよう。

【0040】

本明細書で用いられる場合、名詞は、「少なくとも１つ」の対象を指し、そうでないことが明確に示されない限り、「１つのみ」の対象に限定されるべきではないこともまた理解されたい。よって、例えば、「バッファ」についての言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、このような「バッファ」を２つ以上有する例を含む。

【0041】

範囲は、ここでは、「約」１つの特定の値から、及び／又は、「約」別の特定の値までとして表されうる。このような範囲が表される場合、例には、１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までが含まれる。同様に、値が先行詞「約」を使用して近似的に表される場合、その特定の値は、別の態様を形成するものと解されたい。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び、他の端点とは独立して、の両方の意味を表すこともさらに理解されよう。

【0042】

実施例以外において、本明細書に表されるすべての数値は、他に明確に示されない限り、そのように記載されているかどうかにかかわらず、「約」を含むものと解釈されるべきである。しかしながら、列挙される各数値は、「約」その値として表されているかどうかにかかわらず、正確を予定されているものとも解されたい。よって、「２Ｍより大きい濃度」及び「約２Ｍより大きい濃度」は、両方とも、「約２Ｍより大きい濃度」と「２Ｍより大きい濃度」の実施形態を含む。

【0043】

他に明記されない限り、本明細書に記載されるいずれの方法も、その工程が特定の順番で行われる必要があると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項が、その工程が従うべき順番について実際に記述していない場合、又はその工程がある特定の順番に限定されるべきであることが、特許請求の範囲又は説明において他に明示されていない場合、任意の特定の順番が推測されることは、決して意図されていない。

【0044】

特定の実施形態のさまざまな特徴、要素又は工程は、移行句「含む（comprising）」を使用して開示されうると同時に、移行句「〜からなる（consisting）」又は「〜から実質的になる（consisting essentially of）」を使用して記載されうるものを含む、代替的な実施形態が含蓄されるものと解されたい。よって、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含むバッファに含蓄される代替的な実施形態は、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態と、バッファがＡ＋Ｂ＋Ｃから実質的になる実施形態を含む。

【0045】

本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変形が本開示になされうることは、当業者にとって明白であろう。本開示の精神および実体を取り込む開示される実施形態の修正、組合せ、部分的組合せ及び変形は、当業者に想起されうることから、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にあるすべてを含むものと解釈されたい。

【0046】

以下の実施例は、非限定的かつ単なる例証であることが意図されており、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定められる。

【実施例】

【0047】

例示的な精製プロトコル
単なる論述の目的で、例えばＩＶＴ試料などの試料からＲＮＡを精製するための例となるプロトコルが、以下に提供される。当然ながら、このプロトコルは、添付の特許請求の範囲を限定することは意図されておらず、そのように解釈されるべきではない。

【0048】

ａ）結合バッファの調製：濃縮された結合バッファＢ１をアルコール中に、１：１の体積比を用いて、再懸濁する；
ｂ）洗浄バッファの調製：濃縮された洗浄バッファに、アルコールを、７０％の最終体積濃度まで加える；
ｃ）ＲＮＡ結合：体積Ｘの試料に対し、体積３Ｘの結合バッファＢ１を加え、よく混合し、５分間インキュベートする；
ｄ）ＲＮＡが結合した磁性粒子の分離：可逆的に結合したＲＮＡを有する磁性粒子を、磁気スタンドを使用して、液体が実質的に透明になるまで磁気的に分離し、透明な液体を除去する；
ｅ）ＲＮＡが結合した磁性粒子の洗浄：可逆的に結合したＲＮＡを含む磁性粒子を、７００μｌの洗浄バッファＷ１で１回、洗浄する；
ｆ）洗浄バッファの除去：可逆的に結合したＲＮＡを有する磁性粒子を、磁気スタンドを使用して、液体が実質的に透明になるまで磁気的に分離し、透明な液体を除去する；
ｇ）繰り返し：４００μｌの洗浄バッファＷ１を用いた、工程ｅ）；
ｈ）繰り返し：工程ｆ）；
ｉ）乾燥：可逆的に結合したＲＮＡを有する磁性粒子を磁気スタンド上で５〜１０分間、空気乾燥させる；
ｊ）ＲＮＡの溶出：磁気スタンドから管を取り外し、所望の体積の溶出バッファＥ１を（大体、所望の試料濃度を生じるまで）加え、室温で少なくとも２分間、インキュベートする；及び
ｋ）ＲＮＡの精製：管を磁気スタンド上に置き、液体が実質的に透明になるまで磁性粒子を分離し、透明な液体を取り出し、保存する。

【0049】

比較実施例１
ＲＮＡを含む試料を、Ｑｂｅａｄｓ（６２．５μｇ）又はＧｒａｃｅビーズ（１８０、３６０、１０８０、３２４０μｇ）を用いる上記プロトコルを使用して精製した。同じ試料を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰキットも使用して精製した。各方法について平均全ＲＮＡ収率を定量し、図２に示した。Ｑｂｅａｄｓを使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は８８．４％であった。Ｇｒａｃｅビーズを使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は、７３．３％（３２４０μｇ）〜８２．０％（３６０μｇ）の範囲であった。比較例の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」キットは、８１．５％のＲＮＡを生じた。

【0050】

図３は、各方法によって生成したＲＮＡの品質が同等であったことを示す、さまざまな方法についてのＲＮＡ試料のアガロースゲル電気泳動分析を実証している。したがって、図２〜３は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」キットのものに匹敵するＲＮＡ収率及び品質を提供することを実証している。

【0051】

比較実施例２
可変のｐＨ（４．３及び６．３）並びに可変のＲＮＡ濃度（２０μｇのＲＮＡを２０μｌ又は２００μｇの溶液中に溶解）で、結合バッファＢ１を用いた上記例となるプロトコルを使用して、ＲＮＡを精製した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰキットも使用して、同じ試料を精製した。各方法について相対的な全ＲＮＡ収率を定量し、図４に示した。結合バッファをｐＨ４．３で使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は、結合バッファをｐＨ６．３で使用する方法と比較して、改善された。加えて、２０μｇ／２０μｌのＲＮＡを使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は、２０μｇ／２００μｌのＲＮＡを使用する方法と比較して、改善された。

【0052】

図５は、結合バッファをｐＨ４．３で使用する本発明の方法によって生成されたＲＮＡの品質が、結合バッファをｐＨ６．３で使用する本発明の方法と比較して、低下したことを示す、さまざまな方法についてのＲＮＡ試料のアガロースゲル電気泳動分析を実証している。よって、図４〜５は、約２０分で行われた本発明の方法が、ベンチマーク比較例の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」キットのものと同等又はそれに対して改善されたＲＮＡ収率及び／又は品質を提供することを実証している。

【0053】

比較実施例３
Ｑｂｅａｄｓ（６２．５μｇ）又はＧｒａｃｅビーズ（３６０μｇ）を用いた上記例となるプロトコルを使用して、ＩＶＴ試料からＲＮＡを精製した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰキットも使用して、同じ試料を精製した。各方法についてＲＮＡ収率を定量し、「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」の収率に対して正規化した結果とともに、図６に示した。Ｑｂｅａｄｓを使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は９６．０％であった。Ｇｒａｃｅビーズを使用する本発明の方法についての相対的な全ＲＮＡ収率は９１．２％であった。

【0054】

図７は、各方法によって生成した核酸の品質が同等であることを示す、さまざまな方法についての核酸試料のアガロースゲル電気泳動分析を実証している。図８は、本発明の方法の小断片核酸に結合する能力が、比較例の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」の方法のものに対して改善されることを示す、オリゴヌクレオチド（３０ｎｔ）についてのアガロースゲル電気泳動分析を実証している。

【0055】

したがって、図６〜８は、約２０分で行われた本発明の方法が、小さい核酸断片の結合性の向上ももたらすとともに、ベンチマーク比較例の「Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ」キットのものに匹敵するＲＮＡ収率及び品質を提供することを実証している。

【0056】

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

【0057】

実施形態１
（ａ）少なくとも１つの核酸を含む試料を約４〜約１０の範囲のｐＨを有する結合バッファと混合し、溶液を形成する工程であって、
前記結合バッファが、少なくとも１つの磁性粒子、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック試薬、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び、必要に応じて、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１の塩を含む、工程；
（ｂ）少なくとも１つの核酸を少なくとも１つの磁性粒子と可逆的に結合させて、少なくとも１つの改質された磁性粒子を形成するのに十分な時間、前記溶液をインキュベートする工程；
（ｃ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、前記混合された溶液から分離する工程；
（ｄ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を、少なくとも１つの第２のアルコール及び必要に応じて少なくとも１つの第２の塩を含む、少なくとも１つの洗浄バッファで洗浄する工程；及び
（ｅ）前記少なくとも１つの改質された磁性粒子を溶出バッファと混合する工程
を含む、核酸精製のための方法。

【0058】

実施形態２
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、ＲＮＡを含むインビトロ転写試料であることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。

【0059】

実施形態３
前記少なくとも１つの第１のカオトロピック試薬が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、リチウム塩、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１のアルコールが、イソプロパノール、メタノール エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、実施形態１又は２に記載の方法。

【0060】

実施形態４
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。

【0061】

実施形態５
前記洗浄バッファが、少なくとも約７０体積％の前記少なくとも１つの第２のアルコールを含むことを特徴とする、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。

【0062】

実施形態６
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。

【0063】

実施形態７
前記少なくとも１つの磁性粒子が、約０．５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の濃度で前記結合バッファ中に存在することを特徴とする、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。

【0064】

実施形態８
前記インキュベーション時間が、約１分〜約３０分の範囲であることを特徴とする、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。

【0065】

実施形態９
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料の前記結合バッファに対する体積比が、約１：１．５〜約１：３の範囲であることを特徴とする、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。

【0066】

実施形態１０
前記溶出バッファが、水、並びに、少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。

【0067】

実施形態１１
前記少なくとも１つの改質された磁性粒子が、前記溶出バッファとともに約３０秒〜約１０分の範囲の時間、インキュベートされることを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。

【0068】

実施形態１２
（ａ）約４〜約１０の範囲のｐＨを有し、かつ、少なくとも１つの磁性粒子、約０．２Ｍ〜約６Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのカオトロピック試薬、約０．１Ｍ〜約５Ｍの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１のアルコール、及び、必要に応じて、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つの第１の塩を含む、結合バッファ；
（ｂ）少なくとも１つの第２のアルコール及び必要に応じて少なくとも１つの第２の塩を含む、洗浄バッファ；及び
（ｃ）溶出バッファ
を含む、核酸精製のためのキット。

【0069】

実施形態１３
前記少なくとも１つの核酸を含む前記試料が、ＲＮＡを含むインビトロ転写試料であることを特徴とする実施形態１２に記載のキット。

【0070】

実施形態１４
前記少なくとも１つのカオトロピック試薬が、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）、チオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）、リチウム塩、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つのアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第１の塩が、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、実施形態１２又は１３に記載のキット。

【0071】

実施形態１５
前記少なくとも１つの第２のアルコールが、イソプロパノール、メタノール、エタノール、ブタノール、及びそれらの組合せから選択され、
前記少なくとも１つの第２の塩が、硫酸アンモニウム（（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４Ａｃ）、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、酢酸カリウム（ＫＡｃ）、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びそれらの組合せから選択される
ことを特徴とする、実施形態１２〜１４のいずれかに記載のキット。

【0072】

実施形態１６
前記洗浄バッファが、少なくとも約７０体積％の前記少なくとも１つの第２のアルコールを含むことを特徴とする、実施形態１２〜１５のいずれかに記載のキット。

【0073】

実施形態１７
前記少なくとも１つの磁性粒子が、カルボキシルコーティングされた常磁性粒子、シリカ系常磁性粒子、及びそれらの組合せから選択されることを特徴とする、実施形態１２〜１６のいずれかに記載のキット。

【0074】

実施形態１８
前記少なくとも１つの磁性粒子が、約０．５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の濃度で前記結合バッファ中に存在することを特徴とする、実施形態１２〜１７のいずれかに記載のキット。

【0075】

実施形態１９
前記溶出バッファが、水、並びに、少なくとも１つのバッファ化合物及び／又は少なくとも１つのイオンキレート剤を含む溶液から選択されることを特徴とする、実施形態１２〜１８のいずれかに記載のキット。

【0076】

実施形態２０
（ａ）約４〜約７の範囲のｐＨを有し、かつ、少なくとも１つシリカ系磁性粒子；約０．３Ｍ〜約２．５Ｍの範囲の濃度で存在する、ＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、及びそれらの組合せから選択される、少なくとも１つのカオトロピック試薬；約２Ｍ〜約５Ｍのイソプロパノール；並びに、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つの第１の塩を含む、結合バッファ；
（ｂ）少なくとも７０体積％のエタノール、及び、必要に応じて、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つの第２の塩を含む、洗浄バッファ；及び
（ｃ）水、並びに、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのバッファ化合物及び約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲の濃度で存在する少なくとも１つのイオンキレート化合物を含む溶液から選択される溶出バッファ
を含む、核酸精製のためのキット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】