特表 2017-537649 多能性幹細胞の懸濁培養

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-537649(P2017-537649A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(54)【発明の名称】多能性幹細胞の懸濁培養

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20171124BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20171124BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20171124BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0735

   C12N1/00 B

   C12Q1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】117

(21)【出願番号】特願2017-532641(P2017-532641)

(86)(22)【出願日】2015年12月9日

(85)【翻訳文提出日】2017年8月10日

(86)【国際出願番号】US2015064713

(87)【国際公開番号】WO2016100035

(87)【国際公開日】20160623

(31)【優先権主張番号】62/094,509

(32)【優先日】2014年12月19日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100147131

【弁理士】

【氏名又は名称】今里 崇之

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】フライヤーズ，ベンジャミン

(72)【発明者】

【氏名】ラニアウスカス，ダイナ

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QQ61

4B063QR41

4B063QR77

4B063QS07

4B063QX01

4B065AA93X

4B065AC12

4B065AC20

4B065BB40

4B065BC02

4B065BC08

4B065BC13

4B065BC26

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、懸濁液のクラスタ化を使用して多能性細胞をβ細胞に分化する方法を提供する。発明の方法は、ｐＨ、細胞濃度、及びレチノイド濃度のうちの１つ又は２つ以上の制御を使用して、早期のＮＧＮ３発現を抑制すること及びＮＫＸ６．１発現を促進することによって、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞のほぼ均質の集団を生成する。また、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞のほぼ均質な集団を、生体外で更に分化させて、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡを共発現する膵内分泌細胞の集団を形成することができる。

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【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト多能性細胞の分化の方法であって、約７．２〜約７．０のｐＨで少なくとも約２４時間、動的懸濁培養において前腸内胚葉細胞を培養することによって、前腸内胚葉細胞を膵内胚葉細胞に分化させる工程を含む、方法。

【請求項2】

約１，５００，０００細胞／ｍＬ以上の細胞濃度を有する培養下で前記前腸内胚葉細胞を培養することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

約２，０００，０００細胞／ｍＬ以上の細胞濃度を有する培養下で前記前腸内胚葉細胞を培養することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記膵内胚葉細胞が、ＰＴＦ１Ａ及びＮＧＮ３の発現に対して実質的に陰性である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ＰＴＦ１Ａ及びＮＧＮ３の発現に対して実質的に陰性である前記膵内胚葉細胞を、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の共発現に対して陽性であり、かつＰＴＦ１Ａの発現に対して陽性である細胞を約９６％以上有する膵内胚葉細胞の集団に富化させる（enriching）ことを更に含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ＰＴＦ１Ａ及びＮＧＮ３の発現に対して実質的に陰性である前記膵内胚葉細胞を、ＰＴＦ１Ａ発現に対して陽性の細胞が産生される分化ステージがないときに膵内分泌腺に分化させることを更に含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

ヒト多能性細胞の分化の方法であって、約７．２〜約７．０のｐＨ、少なくとも約２４時間、約１，５００，０００細胞／ｍＬ以上の細胞濃度、及び約０．５〜約１．０μＭのレチノイド濃度で、動的懸濁培養において前腸内胚葉細胞を培養することによって、前記前腸内胚葉細胞を膵内胚葉細胞に分化させる工程を含み、
前記培養が、ＴＧＦ−βシグナル伝達及びＢＭＰシグナル伝達の阻害、ブロック、活性化、又は刺激のうち１つ又は２つ以上を行う成分がないとき、かつソニックヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤がないときに実行される、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年１２月１９日に出願された、米国特許仮出願第６２／０９４，５０９号の利益を主張するものであり、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、多能性細胞の、膵内分泌前駆細胞及び膵内分泌細胞への分化に関する。特に、本発明は、分化プロセスにおいてｐＨ、細胞濃度、及びレチノイド濃度の制御を使用して、膵内分泌前駆細胞を共発現するＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１の均質集団の生成を容易にする方法に関するものであり、膵内分泌前駆細胞は、生体外で更に分化させたとき、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡを共発現する膵内分泌細胞の、従来の分化方法と比べてより成熟した集団を生じさせる。

【背景技術】

【0003】

Ｉ型真性糖尿病の細胞補充療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞、すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、胚性幹細胞などの多能性幹細胞から機能的β細胞を生成するものがある。

【0004】

脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られるプロセスにおいて３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）から構成される細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。

【0005】

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２は内胚葉の前領域を特定し、ＣＤＸ１、２及び４は後老域を特定する。

【0006】

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、線維芽細胞増殖因子（「ＦＧＦ」）、ウィングレス型ＭＭＴＶ組込部位（「ＷＮＴＳ」）、形質転換増殖因子（「ＴＧＦ−β」）、レチノイン酸（「ＲＡ」）、及び骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）リガンド、並びにそれらのアンタゴニストなどの分泌因子の過多によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣＤＸ２の発現を促進し、前方の遺伝子ＨＨＥＸ及びＳＯＸ２の発現を阻害することが報告されている（２０００ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２ Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ、１２：１２１５〜１２２０）。

【0007】

特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳＯＸ２の非常に低い発現を示す。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、膵臓転写因子１サブユニットα（「ＰＴＦ１Ａ」）、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織で高く発現し、また、ＣＤＸ２の発現は腸組織で高い。

【0008】

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により生じる。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。

【0009】

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓の発達は、腹側芽及び背側芽の形成より先に進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を示している。成熟した膵臓は、膵臓内胚葉の分化から生じる外分泌組織及び内分泌組織の両方を含有する。

【0010】

Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の産生を記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、報告によると、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化させることができる（米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米国特許第７，５３４，６０８号）。

【0011】

Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−β受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１，１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、膵内分泌細胞の数を著しく増強するために使用されている。加えて、小分子活性化物質もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９，２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００９，５：２５８〜２６５）。

【0012】

多能性幹細胞などの前駆細胞を培養するためのプロトコルの改善において、大きな進歩がなされた。ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０２６３５３（Ａｍｉｔら）は、二次元培養系における未分化状態でのヒト胚性幹細胞の維持を開示する。Ｌｕｄｗｉｇら、２００６（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４：１８５〜７）は。マトリックス上でのヒト胚性幹細胞の培養のためのＴｅＳＲ１画定培地を開示する。米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号（Ａｋａｉｋｅら）は、多能性幹細胞に接着するキャリアを使用して、懸濁液で多能性幹細胞を成長させる方法を開示し、同第２００９／００２９４６２号（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙら）は、マイクロキャリア又は細胞のカプセル化を使用して、懸濁液で多能性幹細胞を増殖する方法を開示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ ２００８／０１５６８２号（Ａｍｉｔら）は、基質接着の欠ける培養状況下において、懸濁培養下でヒト胚性幹細胞を増殖させ、維持する方法を開示する。米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓら）は、三次元培養システムにおいてアルギン酸ビーズ内に封入されたヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示する。

【0013】

Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ．ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２：１１２１〜１１３３（２０１４））、Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ，１５９：４２８〜４３９（２０１４））及び米国特許第８，８５９，２８６号（Ａｇｕｌｎｉｃｋ）を含む技術は、ＢＭＰバインダー（例えばノギン）、若しくは（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン、塩酸塩などのＢＭＰ受容体阻害剤などの成分を使用することによるＢＭＰの直接ブロッキング、又はあるいは、ＴＧＦ−βファミリーメンバーを追加して受容体を占有し、ＢＭＰシグナル伝達を間接的にブロックすることのどちらかによって、ＴＧＦ−β又はＢＭＰのシグナル伝達を調節する成分の追加の必要性を教示する。最終的に、ソニックヘッジホッグのシグナル伝達の抑制はＰＤＸ１及びインスリンの発現を可能し得るため、ステージ３におけるＳＡＮＴ−１又はシクロパミンなどのソニックヘッジホッグ阻害剤の使用が有利であることが教示される（Ｈｅｂｒｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２：１７０５〜１７１３（１９９８））。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

これらの進歩にもかかわらず、機能的内分泌細胞に分化し得る多能性幹細胞を三次元培養系にて培養する改善された方法の必要性が、依然として残っている。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】実施例１の分化プロトコルの過程で時間（分化日数）に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからの酸素分圧のグラフである。

【図1B】実施例１の分化プロトコルの過程で時間（分化日数）に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからのグルコース濃度のグラフである。

【図1C】実施例１の分化プロトコルの過程で時間（分化日数）に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからの乳酸濃度のグラフである。

【図1D】実施例１の分化プロトコルの過程で時間（分化日数）に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからのｐＨ濃度のグラフである。

【図2A】ステージ１からステージ５．１の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＤＸ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2B】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2C】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ４の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2D】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2E】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2F】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＡＢＣＣ８の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2G】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2H】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2I】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2J】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2K】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＧＣ６の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2L】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＴＦ１Ａの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図2M】ステージ１からステージ５の１日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3A】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＤＸ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3B】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3C】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3D】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3E】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3F】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ２Ａ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3G】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ４の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3H】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ２の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3I】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3J】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢ（ＣＨＧＢ）の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3K】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程での膵臓ポリペプチドの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3L】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ１の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3M】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3N】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのグルカゴンの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図3O】ステージ５、３日目からステージ６の７日目までの実施例１の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図4】実施例１のプロトコルに従い分化され、ＣＤ９（Ｘ軸）と共染色されるＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）、及びＣＤ９９（Ｘ軸）と共染色されるＣＤ１８４／ＣＸＣＲ４（Ｙ軸）について染色された、ステージ１細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図5A】実施例１のプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、及びＫｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ４細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図5B】実施例１のプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ２．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、及びＡＰＣ−Ａ（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ４細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図6A】実施例１、条件Ａのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図6B】実施例１、条件Ａのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図7A】実施例１、条件Ｂのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ２．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図7B】実施例１、条件Ｂのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図8A】実施例１、条件Ｃのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ２．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びグルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図8B】実施例１、条件Ｃのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図9A】実施例１、条件Ａのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ２．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、グルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図9B】実施例１、条件Ａのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図10A】実施例１、条件Ｂのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、グルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図10B】実施例１、条件Ｂのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図11A】実施例１、条件Ｃのプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、ＮＫＸ．２（Ｙ軸）と共染色されるクロモグラニンＡ（Ｘ軸）、グルカゴン（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）、及びインスリン（Ｙ軸）と共染色されるＣペプチド（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図11B】実施例１、条件Ｃのプロトコルに従い分化され、Ｋｉ６７（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）、ＯＣＴ４（Ｙ軸）と共染色されるＰＡＸ６（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるインスリン（Ｘ軸）、及びＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ６細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図12】実施例１のプロトコルに従い分化された、ステージ４細胞（１５日目）、ステージ５細胞（１９及び２２日目）、及びステージ６細胞（２５及び２９日目）のＭＡＦＡの発現に関する定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）の結果のグラフである。

【図13】ステージ６細胞の７日目におけるＭＡＦＡの発現の顕微鏡写真である。

【図14】実施例２のステージ３から４のｐＨ、溶存酸素、及び細胞濃度の設定値のフローチャートである。

【図15A】実施例２に従い行われた分化について、ステージ３の開始からステージ４、３日目までのｐＨを連続監視する間のｐＨ濃度を示す２つのグラフを示す。

【図15B】実施例２に従い行われた分化について、ステージ３の開始からステージ４、３日目までのＤＯを連続監視する間の溶存酸素濃度を示す２つのグラフを示す。

【図16A】実施例２に従い行われた分化について、ステージ３の開始からステージ４、３日目まで時間に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからのグルコース濃度のグラフである。

【図16B】実施例２に従い行われた分化について、ステージ３の開始からステージ４、３日目まで時間に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからの乳酸濃度のグラフである。

【図17】実施例２に従い行われた分化について、ステージ３の開始からステージ４、３日目まで時間に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからの細胞カウントのグラフである。

【図18A】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＤＸ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18B】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18C】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ４の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18D】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18E】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18F】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＡＢＣＣ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18G】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18H】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18I】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＡＲＸの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18J】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのグレリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18K】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18L】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＴＦ１Ａの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18M】ステージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図18N】テージ３、１日目からステージ４の２日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ２．２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図19】ステージ３において７．０及び７．４のｐＨ設定値を用いて、実施例２のプロトコルに従い分化され、ＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｙ軸）について染色された、ステージ３細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフを示す。

【図20】ステージ３において７．０及び７．４のｐＨ設定値を用いて、実施例２のプロトコルに従い分化され、ＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｙ軸）について染色された、ステージ４細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフを示す。

【図21A】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21B】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21C】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ２．２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21D】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＡＲＸの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21E】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21F】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21G】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＡＢＣＣ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21H】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21I】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21J】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＩＳＬ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21K】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ２Ａ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21L】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ３０Ａ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21M】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21N】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＵＣＮ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21O】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＭＡＦＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21P】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＰＰＹの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21Q】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのグレリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21R】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＧＣＧの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図21S】ステージ４、２日目からステージ５の７日目までの実施例２の分化プロトコルの過程でのＳＳＴの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図22】ステージ６、７日目の細胞におけるインスリン及びＭＡＦＡの発現の顕微鏡写真を示す。

【図23】実施例２のプロトコルに従い分化され、ＮＥＵＲＯＤ１（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、細胞カウント（Ｙ軸）に対するＮＫＸ６．１（Ｘ軸）、及び細胞カウント（Ｙ軸）に対するＮＥＵＲＯＤ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５、６日目の細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフを示す。上のグラフは条件Ａに関連し、下は条件Ｃに関連する。

【図24A】実施例３に従いリアクターＢ、Ｃ、及びＤで行われる分化について、ステージ３の開始からステージ５までのｐＨを連続監視する間のｐＨ濃度のグラフを示す。

【図24B】実施例３に従いリアクターＢ、Ｃ、及びＤで行われる分化について、ステージ３の開始からステージ５までのＤＯを連続監視する間の溶存酸素濃度を表すグラフを示す。

【図25】実施例３に従いリアクターＢ、Ｃ、及びＤで行われる分化について、ステージ３の開始からステージ５まで時間に応じてプロットされた毎日の培地サンプルからの細胞カウントのグラフである。

【図26A】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＰＤＸ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26B】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26C】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ４の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26D】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26E】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26F】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＡＢＣＣ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26G】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26H】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26I】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＡＲＸの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26J】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのグレリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26K】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26L】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＰＦＴ１Ａの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26M】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図26N】ステージ３、１日目からステージ５の１日目までのリアクターＢ、Ｃ、及びＤにおける実施例３の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ２．２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27A】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27B】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27C】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27D】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27E】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＧＣＧの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27F】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27G】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＩＳＬ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27H】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＭＡＦＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27I】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程での膵臓ポリペプチドの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27J】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのソマトスタチンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27K】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27L】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27M】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27N】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27O】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ３０Ａ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27P】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27Q】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ２．２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27R】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＭＮＸ１（ＨＢ９）の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図27S】ステージ５、１日目からステージ６の７日目までの実施例４の分化プロトコルの過程でのＵＣＮ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28A】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28B】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28C】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28D】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28E】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28F】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＧＣＧの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28G】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28H】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＭＡＦＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28I】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28J】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのソマトスタチンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28K】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28L】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28M】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28N】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ３０Ａ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28O】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＭＮＸ１（ＨＢ９）の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図28P】ステージ５、１日目からステージ６の４日目までの実施例５の分化プロトコルの過程でのＵＣＮ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図29】ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植された実施例５、ステージ６、１日目の細胞の腹腔内グルコース注射に対するＣペプチド反応のグラフである。

【図30A】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＡＢＣＣ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30B】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＡＬＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30C】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＡＲＸの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30D】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＣＤＸ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30E】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＡの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30F】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのクロモグラニンＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30G】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＧ６ＰＣ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30H】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＧＣＧの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30I】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのグレリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30J】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＩＡＰＰの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30K】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのインスリンの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30L】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＩＳＬ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30M】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＭＡＦＢの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30N】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＭＮＸ１（ＨＢ９）の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30O】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＤ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30P】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＮＥＵＲＯＧ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30Q】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ２．２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30R】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＮＫＸ６．１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30S】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ４の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30T】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＡＸ６の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30U】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30V】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＣＳＫ２の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30W】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＤＸ１の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30X】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程での膵臓ポリペプチドの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30Y】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＰＴＦ１Ａの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30Z】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＳＬＣ３０Ａ８の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30A-1】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＳＳＴの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30B-1】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＵＣＮ３の発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図30C-1】ステージ３、１日目から分化プロトコルの終わりまでの実施例６の分化プロトコルの過程でのＷＮＴ４Ａの発現に関するリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果のグラフである。

【図31】分化のステージ５、７日目でＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植された実施例５の細胞（標準、Ｎ＝７、及びスキップ４、Ｎ＝７）の腹腔内グルコース注射に対する平均Ｃペプチド反応のグラフ（＋／−標準偏差）である。

【図32】実施例７のプロトコルに従い分化され、ＮＥＵＲＯＤ１（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５、７日目の細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図33】実施例７のプロトコルに従い分化され、ＮＫＸ６．１（Ｙ軸）と共染色されるＰＤＸ１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５、７日目の細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図34】実施例７のプロトコルに従い分化され、インスリン（Ｙ軸）と共染色されるＮＫＸ６．１（Ｘ軸）について染色された、ステージ５、７日目の細胞のＦＡＣＳプロファイルのグラフである。

【図35】ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植された実施例７のステージ５、８日目の細胞について、移植６週間後の腹腔内グルコース注射前後のＣペプチド反応のグラフである（Ｎ＝７）。

【図36】ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植された実施例７のステージ５、８日目の細胞について、移植１２週間後の腹腔内グルコース注射前後のＣペプチド反応のグラフである（Ｎ＝７）。

【図37A】実施例８のスピナーフラスコ内の培地のｐＨプロファイルのグラフである。

【図37B】実施例８のスピナーフラスコ内の培地のｐＨプロファイルのグラフである。

【図38】実施例８の細胞の乳酸産生のグラフである。

【図39】実施例８の細胞のライブ／デッド蛍光撮像を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本発明は、凝集細胞集団において、内分泌前駆細胞及び膵内分泌細胞への分化のための多能性を維持する、胚性幹細胞及び他の多能性細胞の調製を目的とする。特にＰＤＸ１及びＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞が産生される分化ステージの間に、ｐＨ、細胞濃度、及びレチノイド濃度のうちの１つ又は２つ以上を制御することによって、ほぼ均質な集団、つまり細胞集団の≧８０％、好ましくは、≧９０％のＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞を、早期のＮＧＮ３発現を抑制し、ＮＫＸ６．１発現を促進することにより生成することができることが発明の発見である。ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現細胞のほぼ均質な集団を生体外で更に分化させると、その集団は、成熟してＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、及びＭＡＦＡを共発現する膵内分泌細胞の集団を形成する。

【0017】

分化の１つ又は２つ以上のステージの間に、ｐＨ７．４の恒常性レベルを下回るｐＨ〜約７．２以下のレベル、好ましくは、約７．２〜約７．０、より好ましくは、約７．０を使用すると、更に約１，５００，０００細胞／ｍＬ以上〜約３，０００，０００細胞／ｍＬ、好ましくは、約１，８００，０００細胞／ｍＬ〜約３，０００，０００細胞／ｍＬ、より好ましくは、約２，０００，０００細胞／ｍＬ〜約３，０００，０００細胞／ｍＬの細胞密度も使用すると、ＴＧＦ−β又はＢＭＰのシグナル伝達を阻害する、ブロックする、活性化する、又は刺激する成分の追加、かつソニックヘッジホッグ阻害剤の使用の必要性を省略し得ることは、発明の更なる発見である。

【0018】

発明の方法では、前腸内胚葉細胞は、ＰＴＦ１Ａ又はＮＧＮ３の発現のない膵内胚葉細胞に分化され得る。低ｐＨ、つまり約７．２以下〜約７．０の使用は、ＮＧＮ３の発現をブロックすると考えられる。ＰＴＦ１Ａ又はＮＧＮ３陰性細胞は、後続のステージにおいて、高濃度のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１（９６％以上陽性）を有し、かついくつかのＰＴＦ１Ａを発現するが、ＮＧＮ３発現がないままである膵内胚葉細胞集団に更に富化させることができる。細胞は、ＰＴＦ１Ａ又はＮＧＮ３の発現のない膵内胚葉のステージからそのまま、高いＮＧＮ３の発現により膵内分泌前駆細胞がステージの終わりまでに膵内分泌細胞へ転換するステージに直接変化され得る。更に、ＰＴＦ１Ａ又はＮＧＮ３ｎ細胞の発現のない膵内胚葉細胞が、膵内分泌細胞が形成されるこのステージに変化するとすぐに、細胞は、（ＰＣＲによって）ＭＡＦＡの発現を示し始め、この発現は、ステージの終わりまでにタンパク質として検出可能である。

【0019】

発明において有用な幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々細胞系統の機能的細胞へと生体外で分化する能力を特徴とする。幹細胞はまた、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。

【0020】

幹細胞は、それらの発生上の潜在性によって分類される。「細胞培養」又は「培養」とは、全般的には、生体から取得され、制御条件下で増殖される（「培養下の」又は「培養される」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、最初の継代培養の前に、生物から直接取得された細胞、組織、又は器官の培養である。細胞は、細胞成長及び細胞分裂のいずれか又は両方を促進する条件下で成長培地内に定置される場合に、培養下で増殖して、より大きな細胞の集団を生じさせる。細胞を培養下で増殖させる場合、細胞増殖の速度は、その細胞の数が倍加するために必要な時間量によって測定される場合がある（「倍加時間」と称する）。

【0021】

「増殖」は、本明細書で使用される場合、培養によって多能性幹細胞の数を、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上など、及びこれらのパーセンテージ以内のレベルの分、増加させるプロセスである。単一の多能性幹細胞から得ることのできる多能性幹細胞の数は、多能性幹細胞の増殖能力に依存することが理解される。多能性幹細胞の増殖能力は、細胞の倍加時間、すなわち、細胞が培養下で有糸分裂を受けるために必要とされる時間、及び多能性幹細胞が未分化の状態で維持され得る期間（継代数に、それぞれの継代間の日数を掛けた数に等しい）によって計算され得る。

【0022】

分化は、特殊化されていない（「未拘束の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化誘導された細胞とは、細胞の系統内でより特化した（「拘束された」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞の系統内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞の系統は、その細胞の遺伝性、すなわち、その細胞がどの細胞に由来するか、またその細胞がどのような細胞を生じさせ得るかを規定する。細胞の系統は、発達及び分化の遺伝スキームの範囲内で、その細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

【0023】

本明細書で使用するとき「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞と比べて、陽性マーカーについては増殖したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出限界は、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

【0024】

本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で十分に検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。とりわけ、ＦＡＣＳによる陽性は通常２％を超えるが、ＦＡＣＳによる陰性閾値は通常１％を下回る。ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ＰＣＲシステムを使用した、ＰＣＲによる陽性は通常３０周期（Ｃｔｓ）を下回り、陰性は通常３０周期以上である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを使用した、ＰＣＲによる陽性は通常３４周期（Ｃｔｓ）を下回り、ＰＣＲによる陰性は通常３４．５周期を超える。

【0025】

本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、互換的に使用され、固体又は半固体平面又は湾曲基質の単位面積あたりに播種された細胞の数を指す。

【0026】

「細胞濃度」は、所与の体積単位当たりの細胞の数を指すのに使用される。

【0027】

本明細書で使用するとき、「懸濁培養」は、表面に接着するよりもむしろ、培地内で懸濁された細胞、単一細胞、集団、又は単一細胞及び集団の混合物の培養を指す。

【0028】

本明細書で使用するとき、「無血清」は、ヒト又は動物血清を欠くことを指す。したがって、無血清培養培地は、血清又は血清の部分を含まない。

【0029】

細胞培養での多能性幹細胞の機能的膵内分泌細胞への分化を複製する試みにおいて、分化プロセスは、しばしばいくつかの連続したステージを通して進行していると見なされる。本明細書で使用するとき、様々なステージは、培養時間、及び本明細書に含まれる実施例において説明される試薬によって定義される。

【0030】

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する。ＦＯＸＡ２（肝細胞核因子３−β（ＨＮＦ３β）としても知られる）、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＮＸ１、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、短尾奇形、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。胚体内胚葉細胞に特徴的なマーカーには、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７が挙げられる。したがって、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、及びＳＯＸ１７の発現で特徴付けられ得る。加えて、細胞を分化の第１のステージに留めさせる時間の長さに応じて、ＨＮＦ４αにおける増加が観察され得る。

【0031】

「前腸内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、膀胱、及び十二指腸の一部分を生じる内胚葉細胞を指す。前腸内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを発現する。前腸内胚葉細胞は、腸管細胞と比較してＰＤＸ１の発現の増加で特徴付けられ得る。

【0032】

「膵前腸前駆細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＮＧＮ３、ＳＯＸ９、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＩＳＬ１、ガストリン、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１Ａ、ＰＲＯＸ１、及びＨＮＦ４αのうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵前腸前駆細胞は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＳＯＸ９の発現について陽性であることで特徴付けられ得る。

【0033】

「膵内胚葉細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１β、ＰＴＦ１Ａ、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４α、ＳＯＸ９、ＮＧＮ３；ガストリン；ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵内胚葉細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２の実質的発現の欠失で特徴付けられ得る。

【0034】

「膵内分泌前駆細胞」は、本明細書で使用するとき、膵ホルモン発現細胞になることが可能な膵内胚葉細胞を指す。膵内分泌前駆細胞は、以下のマーカー、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、又はＡＲＸのうちの少なくとも１つを発現する。膵内分泌前駆細胞は、ＮＫＸ２．２及びＮＥＵＲＯＤ１の発現で特徴付けられ得る。

【0035】

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」とは、以下のホルモンのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、グレリン、及び膵臓ポリペプチド。これらのホルモンに加え、膵内分泌細胞に得直的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６のうちの１つ又は２つ以上を含む。β細胞に特徴的なマーカーを発現する膵内分泌細胞は、インスリン及び以下の転写因子の少なくとも１つによって特徴付けられ得る。ＰＤＸ１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６。

【0036】

「レチノイド」によってレチノイン酸又はレチノイン酸受容体アゴニストである化合物が意味される。

【0037】

本明細書では、「ｄ１」、「ｄ １」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ ２」、及び「２日目」、「ｄ３」、「ｄ ３」、及び「３日目」などが互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの特定の日を指す。

【0038】

「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖、デキストロースを指す。

【0039】

多能性幹細胞は、指定されたＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１抗体の１つ又は２つ以上を発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５〜１１４７）。生体外での多能性幹細胞の分化は、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１の発現の喪失をもたらす。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。

【0040】

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれらの３胚葉由来の細胞型の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉層に関連したマーカーの存在に対して評価することにより決定することができる。

【0041】

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定し、次いで確立された、対応する霊長類種の核型と比較することができる。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、様々なフィーダー層を用いて、又はマトリックスたんぱく質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。あるいは、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）のような明確な培地との組み合わせで、化学的に明確な表面を、細胞の常用増殖のために使用してよい。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った懸濁培養下での培養は、細胞の生存及び増殖を促進するが分化を制限する細胞濃度で、培養容器内に多能性幹細胞を播種することによって達成される。典型的には、多能性で、未分化の状態に細胞を維持するのに十分な播種密度が使用される。幹細胞の単一細胞懸濁液も播種され得るが、細胞の小さな集団が有利であり得ることが理解されよう。

【0043】

懸濁培養下にある間、栄養素及び成長因子の十分かつ一定の供給を多能性幹細胞に提供するために、培養培地は、毎日、又は１〜５日毎といった所定のスケジュールで交換又は補充され得る。多能性幹細胞の大きな集団は、細胞分化を引き起こし得るため、大きな多能性幹細胞凝集体を回避するための手段が取られ得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、形成された多能性幹細胞集団は、例えば、２〜７日毎に分離され、単一細胞又は細胞の小さな塊は追加の培養容器内に分割される（すなわち、継代される）か、又は同一の培養容器内に保持され、交換又は追加の培養培地で処理される。

【0044】

遠心分離から生じる多能性幹細胞のペレットを含む、大きな多能性幹細胞の塊は、酵素消化及び機械的分離のいずれか又は両方を受け得る。多能性幹細胞の塊の酵素消化は、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）などの酵素に塊をさらすことによって実行され得る。大きな多能性幹細胞の塊の機械的分離は、塊を所定のサイズに破断するように設計されたデバイスを使用して実行され得る。加えて、又は別の方法として、機械的分離は、針又はピペットを使用して手動で実行され得る。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態の方法に従った、懸濁において多能性幹細胞を培養するために使用される培養容器は、その中で培養される多能性幹細胞が、そのような表面に接着又は結合することができないように設計された内部表面を有する任意の組織培養容器（例えば、多能性幹細胞を培養するために好適な純度等級を有するもの）であり得る（例えば、表面への結合又は接着を防ぐために非組織培養処理した容器）。好ましくは、計測可能な培養を得るために、本発明のいくつかの実施形態に従った培養は、温度、撹拌、ｐＨ、及び酸素などの培養パラメーターが、好適なデバイスを使用して自動的に監視及び制御される、制御下の培養系（好ましくは、コンピュータで制御される培養系）を使用して達成される。所望の培養パラメーターが決定されると、系は、多能性幹細胞の増殖及び分化を増すために必要とされる培養パラメーターの自動調整のために設定され得る。

【0046】

多能性幹細胞は、複数の継代に渡ってそれらの増殖性、多能性能力、及び核型安定性を維持しながら、動的条件下（すなわち、多能性幹細胞が懸濁培養内にある間、一定の運動（を受ける条件下（例えば、撹拌懸濁培養系））、又は非動的条件下（すなわち、静的培養）で培養され得る。

【0047】

多能性幹細胞の非動的培養について、多能性幹細胞は、コーティングされた又はされていない、ペトリ皿、Ｔフラスコ、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、ＣｅｌｌＳｔａｃｋｓ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、又はＣｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ（ＮＵＮＣ（商標）Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ））内で培養され得る。多能性幹細胞の動的培養について、多能性幹細胞は、スピナーフラスコ又は三角フラスコ、ステンレス鋼、ガラス又は単一使用プラスチック振とう器又は撹拌槽などの好適な容器内で培養され得る。培養容器は、制御ユニットに接続され、それにより制御された培養系を提供し得る。培養容器（例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコ）は、連続的又は断続的に撹拌され得る。好ましくは、培養容器は、多能性幹細胞を懸濁状態に維持するために十分に撹拌される。

【0048】

多能性幹細胞は、成長及び増殖を促進するために十分な栄養素及び環境的刺激を提供する、任意の培地内で培養され得る。好適な培地には、Ｅ８（商標）、ＩＨ３、及びｍＴｅＳＲ（登録商標）１、又はＴｅＳＲ（登録商標）２が挙げられる。培地は、栄養素供給を補充し、細胞の副産物を除去するために、定期的に変更され得る。本発明のいくつかの実施形態に従って、培養培地は毎日変更される。

【0049】

本発明の方法では、任意の多能性幹細胞が使用され得る。使用が可能な多能性幹細胞の例示の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（「ｈＥＳＣｓ」）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などである。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。

【0050】

また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳｏＸ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（「ＩＰＳ」）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞もまた、Ｔｈｏｍｓｏｎらによって記載されるように調製され得る（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）。また、例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）などの変異体ヒト胚性幹細胞株、又は例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １３１：１〜１２（２００７）に開示されている細胞などの成人ヒト体性細胞に由来する細胞も好適である。本発明での使用に好適な多能性幹細胞は、Ｌｉｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４：１６〜１９，２００９）；Ｍａｈｅｒａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １：５５〜７０，２００７）；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：２３０〜２４０）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：１０１〜１０６，２００８）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ １３１：８６１〜８７２，２００７）；及び米国特許出願公開第２０１１−０１０４８０５号に記載された方法に従って誘導され得る。多能性幹細胞の他の供給源は、誘導された多能性細胞（ＩＰＳ，Ｃｅｌｌ，１２６（４）：６６３〜６７６）を含む。本発明の方法における使用のために好適な細胞の他の供給源には、ヒト臍帯組織由来細胞、ヒト羊水由来細胞、ヒト胎盤由来細胞、及びヒト単為生殖生物が挙げられる。一実施形態において、臍帯組織由来細胞は米国特許第７，５１０，８７３号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、胎盤組織由来細胞は、米国出願公開第２００５／００５８６３１号の方法を使用して得られ得、その開示は、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。別の実施形態において、羊水由来細胞は、米国出願公開第２００７／０１２２９０３号の方法を使用して得られ得、それが細胞の隔離及び特性評価に関連するために、参照によりその全体が組み込まれる。

【0051】

多能性幹細胞の特性は当業者には周知であり、多能性幹細胞の更なる特性が引き続き同定されている。多能性幹細胞マーカーとして、例えば、以下のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は全て）の発現が挙げられる。ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１。一実施形態において、本発明の方法での使用に好適な多能性幹細胞は、フローサイトメトリーによって検出される、ＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化のマーカーＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４としても知られる）の発現を欠く。別の実施形態において、本発明の方法における使用のために好適な多能性幹細胞は、ＲＴ−ＰＣＲによって検出される、ＣＤ９、ＮＡＮＯＧ、及びＰＯＵ５Ｆ１／ＯＣＴ４のうちの１つ又は２つ以上（例えば、１、２、又は全て）を発現する。

【0052】

例示的な多能性幹細胞として、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。一実施形態では、多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞、例えば、Ｈ１ ｈＥＳ細胞である。代替の実施形態において、非胚性起源の多能性幹細胞が使用され得る。

【0053】

本発明は、以下に記載される実施形態のいくつかにおいて、幹細胞の隔離及び培養、特に動的懸濁培養系において多能性を保持する幹細胞集団の培養に関する。多能性細胞集団は、機能的β細胞を産生するように分化され得る。

【0054】

本発明の方法で使用される多能性幹細胞は、好ましくは、所望の終点に向けた分化の前に、動的懸濁培養下で増殖される。有利なことに、多能性幹細胞は、多能性を損失することなく、好適な培地内に懸濁状態で細胞の集団として培養され、増殖され得ることが発見されている。そのような培養は、多能性の損失を防ぐために、細胞又は細胞集団が十分に移植させられ続ける、動的懸濁培養系内で生じ得る。有用な動的懸濁培養系は、撹拌、振とう、再循環、又は培地を通したガスのバブリングなどを介して、培養内容物を撹拌するための手段を備えた系を含む。そのような撹拌は、増殖を促進し、早期分化を防ぐための細胞集団の十分な運動が維持される限り、断続的又は連続的であってよい。好ましくは、撹拌は、特定の速度で回転する羽根車などを介する連続的撹拌を含む。羽根車は、円形又は平坦な底部を有してよい。羽根車の撹拌速度は、集団が懸濁状態に維持され、沈降が最小化されるようなものであるべきである。更に、羽根車ブレードの角度は、沈降を回避するための細胞及び集団の上方運動を補助するために、調整され得る。また、羽根車の型、角度、及び回転速度は全て、細胞及び集団が均一なコロイド懸濁液のようなものにあるように調整され得る。

【0055】

多能性幹細胞集団の懸濁培養及び増殖は、使い捨て可能なプラスチック、再利用可能なプラスチック、ステンレス鋼又はガラス容器、例えば、スピナーフラスコ又は三角フラスコなどの適した動的培養系に、静的培養した幹細胞を移植することによって達成され得る。例えば、接着性静的環境、すなわち、プレート又は皿表面で培養した幹細胞は、まずキレート剤又は酵素で処理することによって表面から除去され得る。好適な酵素として、限定するものではないが、Ｉ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＬＬＣ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ）の商標名で販売される商業的に入手可能な製剤が挙げられる。Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）は、コラーゲン分解性又はたんぱく分解酵素（甲殻類から隔離される）を含み、哺乳類又は細菌由来の産物を含有しない、細胞剥離液である。したがって、一実施形態において、酵素は、コラーゲン分解酵素若しくはたんぱく分解酵素、又はコラーゲン分解及びたんぱく質分解酵素を含む細胞剥離液である。好適なキレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）が挙げられる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞培養は、好ましくは、群体の縁部が丸まって持ち上がり始めるまで、ただし培養表面からの群体の完全な剥離の前に、酵素又はキレート剤と共にインキュベートされる。一実施形態において、細胞培養は室温でインキュベートされる。一実施形態では、細胞は、２０℃超、２５℃超、３０℃超又は３５℃超の温度で、例えば、約２０℃〜約４０℃、約２５℃〜約４０℃、約３０℃〜約４０℃の温度、例えば約３７℃でインキュベートされる。一実施形態では、細胞は、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０分間、例えば、約１〜約３０分間、約５〜約３０分間、約１０〜約２５分間、約１５〜約２５分間、例えば約２０分間インキュベートされる。一実施形態において、この方法は、処理の後に細胞培養から酵素又はキレート剤を除去する工程を含む。一実施形態において、細胞培養は、酵素又はキレート剤の除去の後、１度又は２度以上洗浄される。一実施形態において、細胞培養は、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）などの適切な培養培地で洗浄される。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２，Ａｘｘｏｒａカタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、約１〜約１００μＭ、約１〜９０μＭ、約１〜約８０μＭ、約１〜約７０μＭ、約１〜約６０μＭ、約１〜約５０μＭ、約１〜約４０μＭ、約１〜約３０μＭ、約１〜約２０μＭ、約１〜約１５μＭ、約１〜約１０μＭ、又は約１０μＭの濃度であってよい。一実施形態において、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、少なくとも１μＭ、少なくとも５μＭ、又は少なくとも１０μＭ添加される。細胞は、スクレーパ又はゴム製ポリスマンで静的培養系の表面から剥離され得る。培地及び細胞は、ガラスピペット又は他の好適な手段を使用して動的培養系に移植され得る。好ましい実施形態において、動的培養系内の培地は、毎日変更される。

【0056】

本発明は、一実施形態において、三次元の懸濁培養内で多能性幹細胞を培養し、増殖させる方法を提供する。とりわけ、この方法は、これらの多能性幹細胞の凝集細胞集団を形成することによって、多能性幹細胞の培養及び増殖をもたらす。細胞集団は、細胞を培養する前に、酵素（例えば、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）などの中性プロテアーゼ）又はキレート剤で多能性幹細胞培養を処理した結果として形成し得る。細胞は、好ましくは、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養され得る。一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞のそのような集団から、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を更に提供する。

【0057】

好ましくは、細胞集団は、凝集多能性幹細胞である。凝集幹細胞は、多能性の１つ又は２つ以上のマーカー、例えば、マーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、又は全て）を発現し、分化に関する１つ又は２つ以上のマーカーの発現を欠く（例えば、ＣＸＣＲ４の発現を欠く）。一実施形態において、凝集幹細胞は、多能性のマーカーＣＤ９、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を発現し、分化に関するマーカーＣＸＣＲ４の発現を欠く。

【0058】

一実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法である。細胞集団は、動的撹拌又は振とうされる懸濁培養系において培養された、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、中性プロテアーゼ、例えば、Ｄｉｓｐａｓｅなどの酵素を細胞の剥離剤として使用して、平面接着培養から撹拌又は振とうされる懸濁培養系へ移植され得る。例示的な好適な酵素としては、限定されるものではないが、ＩＶ型コラゲナーゼ、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）、又はＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）が挙げられる。細胞は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系において、特に撹拌される懸濁培養系において、多能性を維持する。

【0059】

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、撹拌又は振とうされる懸濁培養系、特に撹拌される（動的に撹拌される）懸濁培養系で多能性を維持する。

【0060】

本発明の別の実施形態は、懸濁培養内で多能性幹細胞を細胞集団として培養する方法であって、細胞集団は、酵素Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を使用して平面接着培養から移植され、撹拌又は振とうされる懸濁培養系内で培養される、凝集多能性幹細胞である。細胞集団は、動的に撹拌される懸濁培養系で多能性を維持する。

【0061】

本発明の細胞集団は、心性細胞などの中胚葉細胞、神経細胞などの外胚葉細胞、単一ホルモン陽性細胞、又は膵臓内胚葉細胞に分化し得る。この方法は、分化、例えば、膵臓内胚葉細胞の膵臓前駆細胞及び膵臓ホルモン発現細胞への分化を更に含み得る。別の実施形態において、膵臓前駆細胞は、β細胞転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現によって特性化される。

【0062】

一実施形態において、分化の工程は、懸濁培養系において少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、少なくとも１６８時間、少なくとも１９６時間以上、好ましくは約４８時間〜約７２時間後に実行される。分化は、実施例又は下の表Ａに記載されるもののような、培地成分のステージ式の進行を使用して実行され得る。

【0063】

一実施形態において、三次元の細胞集団は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、によって産生される。更なる実施形態は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、によって、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖及び分化させる方法である。

【0064】

別の実施形態は、膵臓前駆細胞へと分化された、増殖した多能性幹細胞集団の懸濁から調製された、分化した幹細胞を含む、移植可能な幹細胞由来の細胞産物である。より具体的には、移植可能な幹細胞由来の産物は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、多能性幹細胞を凝集細胞集団に増殖させることと、酵素又はキレート剤を使用して、多能性幹細胞の集団を平面接着培養から動的懸濁培養へ移植することと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞集団を分化させることと、によって産生される。移植可能な幹細胞由来の細胞産物は、好ましくは、糖尿病を治療するために使用される。

【0065】

別の実施形態において、この方法は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のための、糖尿病の動物内への移植を含む。

【0066】

別の実施形態は、平面接着培養下で多能性幹細胞を成長させることと、酵素を使用して平面接着培養から多能性幹細胞を取り外すことと、静的培養下で多能性幹細胞をマイクロキャリアに接着させることと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を増殖させることと、動的に撹拌される懸濁培養系内で多能性細胞を分化させて、膵臓前駆細胞集団を生成することと、を含む、懸濁培養系内で多能性幹細胞を増殖及び分化させる方法である。

【0067】

マイクロキャリアは、接着細胞について当該技術分野において既知の任意の形態であり得、とりわけ、マイクロキャリアはビーズであり得る。マイクロキャリアは、天然又は合成的に由来する材料からなり得る。例としては、コラーゲンベースのマイクロキャリア、デキストランベースのマイクロキャリア、又はセルロースベースのマイクロキャリアが挙げられる。例えば、マイクロキャリアビーズは、表面に結合して、マイクロキャリアに対して正に帯電している表面を提供するカチオントリメチルアンモニウムを有する、改質ポリスチレンビーズであり得る。ビーズ直径は、約９０〜約２００μｍ、あるいは約１００〜約１９０μｍ、あるいは約１１０〜約１８０μｍ、あるいは約１２５〜１７５μｍの範囲であり得る。マイクロキャリアビーズはまた、架橋デキストランのマトリックスに化学的に連結した変性コラーゲンの薄層であり得る。マイクロキャリアビーズは、ガラス、セラミックス、ポリマー（ポリスチレンなど）、又は金属であり得る。更に、マイクロキャリアは、シリコン、又はコラーゲンなどのたんぱく質などでコーティングされても、又はコーティングされなくてもよい。更なる態様では、マイクロキャリアは、マイクロキャリアへの細胞の結合性を高める、及びマイクロキャリアからの細胞の放出を高める化合物（限定するものではないが、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリ（モノステアロイルグリセリドココハク酸）、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、リジン、ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ビトロネクチン、及びコラーゲンが挙げられる）で構成されるか、又はコーティングされてもよい。実施例は、低レベルの生物学的に関連する電気を産生する、亜鉛及び銅の微粒子ガルバーニ電気連結を有するマイクロキャリア、又は常磁性カルシウムアルギン酸マイクロキャリアなどの常磁性のマイクロキャリアといった、微小電流を有するマイクロキャリアを更に含む。

【0068】

いくつかの実施形態において、膵臓内胚葉細胞集団は、多能性細胞集団の段階的分化によって取得される。いくつかの実施形態において、多能性細胞は、ヒト胚性多能性幹細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。

【0069】

いくつかの実施形態において、本発明は、動的懸濁培養でステージ３〜５の細胞を培養することを含む、多能性細胞を分化させる段階的な方法に関する。いくつかの実施形態において、生成される膵臓内胚葉集団は、機能的膵内分泌細胞への更なる生体内での成熟のために、糖尿病の動物内に移植される。本発明はまた、本発明の方法で使用する系又はキットを提供する。

【0070】

本発明はまた、本発明の方法によって取得可能な細胞、又は細胞の集団を提供する。本発明はまた、本発明の方法によって取得される細胞、又は細胞の集団を提供する。

【0071】

本発明は、治療法を提供する。とりわけ、本発明は糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。

【0072】

本発明はまた、治療法で使用するために、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。とりわけ、本発明は、糖尿病に罹患しているか、又は糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法で使用する、本発明の方法によって取得可能な、又は得られる、細胞又は細胞の集団を提供する。糖尿病は、１型又は２型糖尿病であり得る。

【0073】

一実施形態において、治療法は、本発明の方法によって得られるか、又は取得可能な細胞を患者に埋め込むことを含む。

【0074】

一実施形態において、治療法は、生体外で多能性幹細胞をステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５、又はステージ６の細胞に分化させることと、例えば、本明細書に記載するように、分化した細胞を患者内に埋め込むこととを含む。

【0075】

一実施形態において、この方法は、例えば、本明細書に記載するように、多能性幹細胞を分化させる工程の前に、多能性幹細胞を培養する工程を更に含む。

【0076】

一実施形態において、この方法は、埋め込みの工程の後に、生体内で細胞を分化させる工程を更に含む。

【0077】

一実施形態において、患者は哺乳類、好ましくはヒトである。

【0078】

一実施形態において、細胞は、分散した細胞として埋め込まれてもよく、又は肝門脈内に移植あるいは注入され得る集団として形成されてもよい。あるいは、細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の任意の適切な部位内に移植されてもよい。埋め込み部位としては、例えば、肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。

【0079】

生体内で埋め込まれた細胞の更なる分化、生存、又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞に原位置で曝露されてもよい。埋め込まれた細胞は、当該技術分野において既知の内因性の成長因子、及び当該技術分野において既知の外因性の成長因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導され得る。

【0080】

埋め込みに使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。

【0081】

一実施形態において、治療法は、埋め込み前に、細胞を三次元の支持体内に取り込むことを更に含む。細胞は、患者に埋め込む前に、生体外でこの支持体上に維持されてもよい。あるいは、細胞を含む支持体は、更に生体外で培養することなく、直接患者に埋め込んでもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を促進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。

【0082】

本発明の特定の実施形態において、表Ａに列挙された成分のうち１つ又は２つ以上が本発明の方法で使用され得る。

【0083】

【表1】

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【0084】

本明細書で使用するとおり、「ＭＣＸ化合物」は、１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６−〜．１〜８，１２．〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンであり、以下の式（式１）を有する。

【0085】

【化1】

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【0086】

上記のＭＣＸ化合物の代わりに、他の環式アニリンピリジノトリアジンもまた使用され得る。かかる化合物としては、限定されるものではないが、１４−メチル−３，５，７，１４，１８，２４，２８−ヘプタアザテトラシクロ［２０．３．１．１〜２，６〜．−１〜８，１２〜］オクタコサ−１（２６），２（２８），３，５，８（２７），９，１１，２２，２４−ノナエン−１７−ｏｎ−ｅ、及び５−クロロ−１，８，１０，１２，１６，２２，２６，３２−オクタアザペンタシクロ［２４．２．２．１〜３，７〜−１〜９，１３〜．１〜１４，１８〜］トリトリアコンタ−３（３３），４，６，９（３２），１０−，１２，１４（３１），１５，１７−ノナエン−２３−オンが挙げられる。これらの配合物を以下に示す（式２及び式３）。

【0087】

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

【0088】

例示の好適な化合物は、米国特許出願公開第２０１０／００１５７１１号に開示され、その開示は、ＭＣＸ化合物、関連する環式アニリンピリジノトリアジン、及びそれらの合成に関連するため、その全体が組み込まれる。

【0089】

本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0090】

本発明を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。

【0091】

（実施例１）
本実施例は、０．５リットルのスピナーフラスコを使用して撹拌される懸濁培養系内でインスリン発現細胞の形成を実証する。培地及び気体を、取り外し可能なサイドアームキャップを通じて交換した。インスリン陽性細胞は、細胞がＰＤＸ１を最初に発現し、次に膵β細胞の形成及び機能に必要なタンパク質転写因子であるＮＫＸ６．１も共発現した段階的なプロセスで形成された。これらの共発現細胞は、次に、懸濁培養内にある間にＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１と組み合わせて、インスリン及びその後ＭＡＦＡの発現を得た。この細胞の集団を、免疫力が低下したマウスの腎臓被膜の中に移植したとき、生着の４週間以内にヒトＣペプチドの検出可能血中濃度を産生した。

【0092】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、脂肪酸フリーウシ血清アルブミン（「ＦＡＦ−ＢＳＡ」）（Ｐｒｏｌｉａｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｏｎｅ，Ｉｄａｈｏ）；カタログ番号６８７００）を０．５重量対体積％（「ｗ／ｖ」）補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）（「Ｅ８（商標）」）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；カタログ番号Ａ１５１６９−０１）で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。凝集集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ，ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃａｌｃｉｕｍ ｏｒ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（「ＤＰＳ−／−」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１４１９０−１４４）を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１１１０５−０１）を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）；カタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３）及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；カタログ番号Ｃ２８７４−１００ｍＬ）を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）；カタログ番号４３０４８８）に小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートフリーザー（ＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒａｔｅ Ｆｒｅｅｚｅｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）；カタログ番号７４５２）を使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高濃度で凍結保存した単一細胞を中間／処理中の種材（「ＩＳＭ」）として次に使用した。

【0093】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧＭＢＨ（Ｊｕｅｌｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、安全キャビネット（「ＢＳＣ」）に移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｏｒｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0094】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、細胞をバイオリアクターから汲み出し、分化のために３つの０．５Ｌ使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３１５３）の中に移した。全てのスピナーフラスコは、５％ＣＯ_２を補充した３７℃加湿インキュベータ内で、かつ６０ＲＰＭ（５５〜６５ＲＰＭ）の一定の撹拌速度で維持された。分化プロトコルは、条件Ａ、Ｂ、及びＣとして以下に説明される。

【0095】

分化プロセスを通じて、培地交換のためにスピナーをインキュベータ内の動的撹拌からＢＳＣへ移動した。スピナーを撹拌せずに６分間保持して、細胞集団の大多数を容器の底部に沈降させた。６分後、スピナーフラスコのサイドアームキャップを取り外し、使用済み培地の９０％以上を吸引によって取り除いた。使用済み培地を取り除くとすぐに、開いているサイドアームを通じてスピナーフラスコに３００ｍＬの新鮮培地を足し戻した。スピナーキャップはその後取り換えられ、前述の条件下でインキュベータ内の動的懸濁に戻された。

【0096】

ステージ１（３日間）：
条件Ａについては、基本培地（「ステージ１基本培地」）を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｓ３１８７）、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号３５０５０−０７９）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｇ８７６９）；及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム−エタノールアミン（「ＩＴＳ−Ｘ」）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号５１５０００５６）の１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１０３７２−０１９）を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬの増殖分化因子８（「ＧＤＦ８」）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；カタログ番号１２０−００）；及び２μＭの１４−プロパ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン（「ＭＣＸ化合物」）を補充した３００ｍＬのステージ１基本培地で１日培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した（ただしＭＣＸ化合物は補充しない）新鮮な３００ｍＬのステージ１基本培地をフラスコに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0097】

条件Ｂでは、３μＭのＭＣＸ化合物を１日目に使用したことを除き、条件Ａについて記載したように細胞を培養した。

【0098】

条件Ｃでは、ＧＤＦ８の代わりに１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを使用したこと、及びＭＣＸ化合物の代わりに３０μＭのグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β阻害剤（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル（pyridinecarbonitirile）（「ＣＨＩＲ９９０２１」）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）カタログ番号０４００４−１０）を使用したことを除き、条件Ａについて記載したように細胞を培養した。

【0099】

ステージ２（３日間）：
条件Ａについては、基本培地（「ステージ２基本培地」）を、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有し、追加の１．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、５０ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子７（「ＦＧＦ７」）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）；カタログ番号２５１−ＫＧ）を補充した３００ｍＬのステージ２基本培地と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した３００ｍＬの新鮮なステージ２基本培地と置換した。

【0100】

条件Ｂでは、条件Ａのように細胞を培養した。

【0101】

条件Ｃでは、２５０μＬの１Ｍアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；水中に再構成された、カタログ番号Ａ４５４４）を１Ｌのステージ２基本培地に更に追加して、条件Ａ及びＢのように細胞を培養した。

【0102】

ステージ３（条件Ａ及びＢで３日間、並びに条件Ｃで２日間）：
条件Ａについては、基本培地（「ステージ３〜４基本培地」）を、追加の１．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。ステージ２の完了後、培地交換を完了して、使用済み培地を、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭの骨形成（「ＢＭＰ」）受容体阻害剤（（６−（４−（２−（ピペリジン−１−イル）エトキシ）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン塩酸塩））（「ＬＤＮ−１９３１８９」，Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ Ｃｏ Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ））；２μＭのレチノイン酸（「ＲＡ」）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｒ２６２５）；０．２５μＭのＮ−［（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール（prazol）−４−イル）メチレン］−４−（フェニルメチル）−１−ピペラジンアミン（「ＳＡＮＴ−１」）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｓ４５７２）；及び４００ｎＭのＰＫＣ活性剤（（２Ｓ，５Ｓ−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−トリフルオロメチル）フェニル−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム（「ＴＰＢ」）（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ Ｃｏ Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ））を補充した３００ｍＬのステージ３〜４基本培地と置換した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、ＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む３００ｍＬの新鮮なステージ３〜４基本培地と再度置換した。その培地で４８時間細胞を培養した。

【0103】

条件Ｂでは、条件Ａのように細胞を培養した。

【0104】

条件Ｃでは、ステージ３〜４基本培地に２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸溶液を更に追加して条件Ａ及びＢのように細胞を培養した。更に、ステージ３の開始の４８時間後、以下に説明したように細胞をステージ４培地に移植した。

【0105】

ステージ４（条件Ａ及びＢで３日間、並びに条件Ｃで４日間）：
条件Ａについては、ステージ３の完了後、使用済み培地を取り除き、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した３００ｍＬのステージ３〜４基本培地と置換した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）をフラスコに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0106】

条件Ｂでは、条件Ａのように細胞を培養した。

【0107】

条件Ｃでは、ステージ３〜４基本培地に０．１μＭのＲＡ、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、及び２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸溶液を更に補充したことを除いて、条件Ａ及びＢのように細胞を培養した。４８時間後、使用済み培地を同じ新鮮培地（条件Ｃの培地添加剤を使用して）と交換し、細胞を更に４８時間培養した。

【0108】

ステージ５（７日間）：
条件Ａ、Ｂ、及びＣについては、基本培地（「ステージ５＋基本培地」）を、追加の１．７５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；１０ｍｇ／Ｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｈ３１４９−１００ＫＵ）を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地ベースを使用して調製した。ステージ４の完了後、培地交換を完了し、３００ｍＬのステージ５＋基本培地に１μＭのＴ３（３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として）（「Ｔ３」）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｔ６３９７）、１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（nathyridine）（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」）（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号ＡＬＸ−２７０−４４５）、１００ｎＭのγセクレターゼ阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、カタログ番号５６５７８９）；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６１−ＣＥ−０５０）；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、３００ｍＬの同じ培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５＋基本培地と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５＋基本培地と置換した。

【0109】

ステージ６（７日間）：
最後のステージ５の培地交換の２４時間後、条件Ａ、Ｂ、及びＣ用の培地を、１μＭのＴ３及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補充したステージ５＋基本培地と交換した。ステージ６の２、４、及び６日目の最後にこの補充された培地と培地交換を行った。

【0110】

分化プロセスを通じて、懸濁培養から毎日サンプルを収集した。毎日の細胞サンプルをｍＲＮＡについて分離し（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、使用済み培地を代謝分析のために収集した。選択したステージの最後で、タンパク質の発現をフローサイトメトリー又は蛍光免疫組織化学によって測定した。ＮＯＶＡ（登録商標）ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（登録商標）ＦＬＥＸ ｂｉｏ−ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を使用して、使用済み培地を分析した。

【0111】

図１Ａ〜Ｄは、分化の毎日の終わりに使用済み培地サンプルから得られたＮＯＶＡ（登録商標）ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒからのデータを示している（図１Ａ−ｐＯ２／酸素分圧；図１Ｂ−グルコース濃度；図１Ｃ−乳酸濃度；図１Ｄ−培地ｐＨ）。これらのデータは、分化細胞のステージ１の最初の３日間が、分化の後のステージと比べると最も酸素を消費することを実証している。ステージ１で細胞は、ＮＯＶＡ（登録商標）アナライザー（図１Ａ）によって検出されるように飽和濃度の１９＋ｋＰａから１３ｋＰａ未満（１４０＋ｍｍＨｇ〜１００ｍｍＨｇ未満）までｐＯ_２濃度を減少させる。更に、ステージ１細胞は、培地中のほとんど全てのグルコースを消費し（図１Ｂ）、プロセスの最初の３日間でリットルあたり１グラム超の乳酸を生成した（図１Ｃ）。

【0112】

細胞が分化のステージ２及び３に移動したとき、酸素及びグルコースの消費及び乳酸の産生は、ステージ１と比較して変化した。ステージ１においてＧＤＦ８及びＭＣＸ化合物（条件Ａ又はＢ）で処理された細胞は、ステージ１においてアクチビンＡ及びＣＨＩＲ９９０２１（条件Ｃ）で処理された細胞よりも、ステージ２においてより多く酸素を消費した（図１Ａ）。この増加した酸素消費の観察結果は、条件Ａ又はＢを条件Ｃと比較すると、使用済み培地におけるより低いｐＨ（図１Ｄ及び表１）、増加した乳酸産生（図１Ｃ）、及びより高いグルコース消費（図１Ｂ）と相関があった。

【0113】

細胞がステージ４（条件Ａ及びＢの１０、１１、及び１２日目；条件Ｃの９、１０、１１、及び１２日目）まで進行したとき、条件Ａ及びＢで処理した細胞は、条件Ｃで処理した細胞と比較して、増加したグルコース消費のレベル及びより低い培地ｐＨを保持した（図１Ｂ及び表１）。しかしながら、１４日目（ステージ５の第２日目）から１９日目（ステージ５の最後）まで、グルコース濃度が、全ての処理条件においてリットルあたり３グラムより低くならなかったことが観察された。ステージ６が開始するとすぐに、３条件全てにおいて（図１Ｂ、２０日目以後）使用済み培地のグルコース濃度は、リットルあたり２．４グラムより低い傾向を示した。グルコース消費におけるこの増加は、全乳酸産生量においてリットルあたり０．５グラム超の増加も（図１Ｃ）使用済み培地の酸性化（図１Ｄ）も伴わず、細胞が、より少ない糖分解及びより成熟した代謝機能に変わり、膵島の内分泌ホルモン細胞集団と一致することを示唆した。

【0114】

毎日のサンプリングを通じて使用済み培地の代謝プロファイルを監視することに加え、細胞の代表的なサンプルを、分化プロセスを通じて得て、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって遺伝子の集団のｍＲＮＡ発現について試験し、実験の開始から培養下で２４時間後の多能性ＩＳＭ細胞と比較した発現の倍差として計算した。図２Ａ〜Ｍは、ステージ５の第１日目までに分化した細胞における次の遺伝子の発現に関するデータを示す。ＰＤＸ１（図２Ａ）；ＮＫＸ６．１（図２Ｂ）；ＰＡＸ４（図２Ｃ）；ＰＡＸ６（図２Ｄ）、ＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）（図２Ｅ）；ＡＢＣＣ８（図２Ｆ）；クロモグラニン−Ａ（「ＣＨＧＡ」）（図２Ｇ）；Ｇ６ＰＣ２（図２Ｈ）；ＩＡＰＰ（図２Ｉ）；インスリン（「ＩＮＳ」）（図２Ｊ）；グルカゴン（「ＧＣＧ」）（図２Ｋ）；ＰＴＦ１ａ（図２Ｌ）；及びＮＥＵＲＯＤ１（図２Ｍ）。

【0115】

図２Ａに示されるように、３つの分化条件全てにおいて、ステージ２の３日目（「Ｓ２Ｄ３」）の終わりまでに細胞は、ＰＤＸ１を発現し始め、膵臓運命を示す。細胞がステージ３に入ると、細胞は、膵内分泌腺の特異化を示す遺伝子（ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＣＨＧＡ；図２Ｅ、２Ｍ、及び２Ｇ）を発現し始め、ステージ３の終わり及びステージ４の開始までにβ細胞形成に必要な遺伝子（ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、及びＮＫＸ６．１；図２Ｃ、２Ｄ、及び２Ｂ）を発現し始めた。ステージ５の開始までに、細胞は、島及びβ細胞の形成及び機能に必要なマーカー（ＧＣＧ、ＩＮＳ、ＩＡＰＰ、Ｇ６ＰＣ２、及びＡＢＣＣ８；図２Ｋ、２Ｊ、２Ｉ、２Ｈ、及び２Ｆ）を発現し始めた。

【0116】

サンプルは、ステージ５及び６を通じても収集され、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ分析によって以下の遺伝子発現について分析した。ＰＤＸ１（図３Ａ）；ＮＫＸ６．１（図３Ｂ）；ＰＡＸ６（図３Ｃ）；ＮＥＵＲＯＤ１（図３Ｄ）、ＮＥＵＲＯＧ３（ＮＧＮ３）（図３Ｅ）；ＳＬＣ２Ａ１（図３Ｆ）；ＰＡＸ４（図３Ｇ）、ＰＣＳＫ２（図３Ｈ）、クロモグラニン−Ａ（図３Ｉ）；クロモグラニン−Ｂ（図３Ｊ）；ＰＰＹ（図３Ｋ）；ＰＣＳＫ１（図３Ｌ）；Ｇ６ＰＣ２（図３Ｍ）、グルカゴン（図３Ｎ）；及びインスリン（図３Ｏ）。図３Ａ〜３Ｄに示されるように、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ６、及びＮＥＵＲＯＤ１発現濃度は、ステージ５の３日目（「Ｓ５Ｄ３」）からステージ６の７日目（Ｓ６Ｄ７）の終わりまで安定していたことが観察された。ＮＧＮ３、ＳＬＣ２Ａ１、及びＰＡＸ４のｍＲＮＡ発現濃度は、細胞がγセクレターゼ阻害剤（ステージ５の１〜４日目）にさらされた間最高濃度であり、また発現濃度はγセクレターゼ阻害剤（図３Ｅ〜３Ｇ）の除去を受けて低下した。遺伝子ＰＣＳＫ２、ＣＨＧＡ、及びＣＨＧＢは、ステージ５の最後に発現の増加を示したが（図３Ｍ〜３Ｏ）、遺伝子ＰＰＹ、ＰＣＳＫ１、Ｇ６ＰＣ２、ＧＣＧ、及びＩＮＳは、ステージ５の開始からステージ６の最後まで連続的に上がった（図３Ｋ、３Ｌ、３Ｍ、３Ｎ、３Ｏ）。

【0117】

様々なステージの追加的な特徴付けのために、細胞をステージ１、４、５、及び６の最後で採取し、フローサイトメトリーによって解析した。手短に言えば、細胞凝集体は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１２６０４）を３７℃で３〜５分間使用して、単一細胞に分解された。表面染色については、遊離した単一細胞を、２，０００，０００細胞／ｍＬの最終濃度で染色緩衝液に１：４に希釈した０．５％ヒトγグロブリンに再懸濁させた。１：２０の最終希釈で細胞に、直接共役一次抗体を添加し、続いて４℃で３０分間インキュベーションした。染色した細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、続いて３００μＬ染色緩衝液中に再懸濁した後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ上のフローサイトメトリー解析の前に、生／死区別のために、１０μＬの７−ＡＡＤ中でインキュベートした。細胞内抗体染色では、単一細胞は、最初にＶｉｏｌｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ｃｅｌｌ ｄｙｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ｌ３４９５５）を用いて４℃で２０〜３０分間インキュベートし、続いて冷たいＰＢＳ^−／−で単回洗浄した。次いで、洗浄した細胞を４℃で３０分間、２８０μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤカタログ番号５５４７２２）中で固定した。次に細胞を、２，０００，０００細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁される前に、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤカタログ番号５１−２０９１ＫＺ）で２回洗浄した。固定した細胞懸濁液を、次に２０％正常ヤギ血清を１０〜１５分間室温で使用してブロックした。細胞を、実験的に事前決定された希釈で一次抗体と４℃で３０分間培養し、続いてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で２回洗浄した。次いで細胞を、適切な抗体と４℃で３０分間インキュベートした後、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ上の解析前に２回洗浄した。使用した抗体の濃度を表ＩＩに示す。膵臓マーカーのための抗体は、ヒト膵島又は未分化Ｈ１細胞を陽性対照として使用し、特異性について試験した。二次抗体については、次のように、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（１：４，０００で）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１２３５）又はｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＰＥ（１：１００、１：２００若しくは１：８００で）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ１０５４２）を追加して４℃で３０分間インキュベートし、続いてＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中での最終洗浄、及び取得された少なくとも３０，０００イベントによりＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩで解析を行った。

【0118】

図４は、表面マーカーＣＤ１８４及びＣＤ９；又はＣＤ１８４及びＣＤ９９（表ＩＩＩＡに要約される）に関して共染色されたステージ１の終わりに得られる生細胞についてのフローサイトメトリードットプロットを示す。図５は、次の対の細胞内マーカーに関して共染色されたステージ４の終わりからの、固定され、透過処理された細胞についてのフローサイトメトリードットプロットを示す。ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａ；Ｋｉ６７及びＰＤＸ１；並びにＮＫＸ２．２及びＰＤＸ１（表ＩＩＩＡに要約される）。図６Ａ及びＢ（条件Ａ）、７Ａ及びＢ（条件Ｂ）、並びに８Ａ及びＢ（条件Ｃ）は、次の対の細胞内マーカーに関して共染色されたステージ５の終わりからの、固定され、透過処理された細胞についてのフローサイトメトリードットプロットを示す。ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａ；ＮＫＸ２．２及びクロモグラニン−Ａ；ＮＫＸ６．１及びＣペプチド；グルカゴン及びインスリン；Ｋｉ６７及びＰＤＸ１；ＯＣＴ４及びＰＡＸ６；ＮＫＸ６．１及びＮＥＵＲＯＤ１；ＮＫＸ６．１及びインスリン；並びにＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１。図９Ａ及びＢ（条件Ａ）、１０Ａ及びＢ（条件Ｂ）、並びに１１Ａ及びＢ（条件Ｃ）は、共染色された、対となる細胞内マーカーのフローサイトメトリーによって染色され、測定されたステージ６の終わりからの、固定され、透過処理された細胞を示す。ＮＫＸ６．１及びクロモグラニン−Ａ；ＮＫＸ２．２及びクロモグラニン−Ａ；グルカゴン及びインスリン；ＮＫＸ６．１及びＣペプチド；インスリン及びＣペプチド；Ｋｉ６７及びＰＤＸ１；ＯＣＴ４及びＰＡＸ６；ＮＫＸ６．１及びＮＥＵＲＯＤ１；ＮＫＸ６．１及びインスリン；並びにＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１。

【0119】

ステージ５の終わりで、図６Ａ、７Ａ、及び８Ａに示され、表ＩＩＩＢに要約されるように、条件Ａ、Ｂ、又はＣで分化された細胞の１７％、１２％、又は１０％は、インスリン及びＮＫＸ６．１をそれぞれ共発現した。ステージ６の完了時に、ＮＫＸ６．１及びインスリン共発現細胞の数において増加が観察された（３１％（条件Ａ）、１５％（条件Ｂ）、１４％（条件Ｃ））。更に、細胞のほぼ大半がステージ６の終わりにβ細胞前駆マーカーＮＫＸ６．１、内分泌前駆マーカーＮＫＸ２．２、及び内分泌腺前駆マーカーＮＥＵＲＯＤ１（条件Ａ−７４％ＮＫＸ６．１、８２％ＮＫＸ２．２、７４％ＮＥＵＲＯＤ１；条件Ｂ−７５％ＮＫＸ６．１、７６％ＮＫＸ２．２、６７％ＮＥＵＲＯＤ１；条件Ｃ−６０％ＮＫＸ６．１、６４％ＮＫＸ２．２、５３％ＮＥＵＲＯＤ１）を発現したことが留意された。

【0120】

β細胞の成熟及び機能に必要なマーカーの増加した発現に加えて、ＰＤＸ１及びＫｉ−６７の共発現で測定される活性細胞周期内のＰＤＸ１陽性細胞の割合は、ステージ５からステージ６で低下したことが観察された（２６％から９％に低下、条件Ａ；２２％から１０％に低下、条件Ｂ；４３％から１９％に低下、条件Ｃ）。更に、フローサイトメトリーによって測定されたＫｉ−６７の発現が、３つの試験した条件全てにおいてステージ５及び６の過程で低下するとき、出願者らは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲによって、β−細胞特異的転写因子ＭＡＦＡの濃度の増加を検出した。ステージ６の終わりでのＭＡＦＡ発現は、未分化の多能性幹細胞より４０＋倍高く、またヒト島組織で観察される発現の約２５％である濃度に達した（図１２）。ＭＡＦＡのタンパク質発現は、免疫蛍光核ＭＡＦＡ染色、免疫蛍光細胞質インスリン染色、及び汎核染色（「ＤＡＰＩ」）の２０倍対物レンズによって得られる顕微鏡写真を示している図１３に示されるように免疫蛍光細胞化学によって確認された。

【0121】

上述されたこれらの結果は、ステージ５からステージ６に移動する細胞が、増殖性膵内分泌前駆細胞から内分泌細胞に変化したことを示す。これらの内分泌組織、及び具体的にインスリン陽性細胞は、機能性β細胞に関連する、かつ機能性β細胞に必要なキーマーカーを発現した。ステージ３及び４に関して、条件Ｃにおけるよりも、細胞が著しく低いｐＨで培養された条件Ａ及びＢは、条件Ｃに比べて６ステージ目の分化プロセスの終わりまでにクロモグラニン陽性、Ｃペプチド／ＮＫＸ６．１共陽性細胞、及びＮＥＵＲＯＤ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞をより多く生成した。条件Ｃは、当該技術分野において既知であり、かつＣｅｌｌ，１５９：４２８〜４３９（２０１４）に開示された方法である。

【0122】

ステージ６を通して条件Ａ及びＣによって分化された細胞を、培地から５０ｍＬ円錐に分離し、次いで追加の１．２ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び０．２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地で２回洗浄した。細胞を次に洗浄培地に再懸濁させ、ＮＳＧマウス（Ｎ＝７）の腎臓被膜下への移植前に室温にて約５時間保持した。動物は、血糖及びＣペプチドレベルについて、生着の４、８、１０、及び１４週間後に監視された。動物は、一晩絶食し、グルコースの腹腔内注射を与えられ、ＩＰグルコースボーラス注射の６０分後（「ポスト」）に血液が眼窩後方出血により採血された（表ＩＩＩ）。最も早く測定した時点（生着後４週間）で、検出可能な濃度のＣペプチドの分泌で測定したところ移植片は機能した（表ＩＶ）。更に、Ｃペプチド濃度は、４週目から１４週目まで上昇した。

【0123】

移植１０週間後に、それぞれの動物は、グルコースボーラス注射の直前（「プレ」）及びグルコースボーラス注射の直後（「ポスト」）に採血された。参考までに、「プレ」濃度より高かった「ポスト」Ｃペプチド濃度は、グルコースがインスリン分泌を刺激したことを示す。出願者らは、条件Ｃによって分化された移植片で処理された７匹の動物のうち６匹は、より高いＣペプチドの「ポスト」濃度を示し、条件Ａによって分化された移植片で処理された７匹の動物のうち３匹は、より高いＣペプチドの「ポスト」濃度を有したことに留意した。

【0124】

【表2】

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【0125】

【表3】

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【0126】

【表4】

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【0127】

【表5】

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【0128】

【表6】

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【0129】

（実施例２）
この実施例は、リアクター内のフィードバックｐＨ及びＤＯセンサーによる培地ｐＨ及び溶存酸素濃度の直接コンピュータ制御を可能にした、撹拌タンクの閉じたループ内でＰＤＸ１を発現する細胞の集団からのインスリン発現細胞の形成を実証する。このプロセスから生成されたインスリン陽性細胞は、ＰＤＸ１発現を保持し、ＮＫＸ６．１を共発現した。インスリン陽性細胞は、ステージ３〜５において４つの異なる条件（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）にさらされた細胞から生成された（表Ｖ）。条件Ｃ（ステージ３の開始時にｐＨ７．０及び２，０００，０００／ｍＬの細胞濃度）に従って分化された細胞を、免疫力が低下したマウスの腎臓被膜の中に移植したとき、移植片が検出可能な血中濃度のヒトＣペプチドを生着の４週間以内に産生したことが観察された。

【0130】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充したＥ８（商標）で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。凝集集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）；カタログ番号ＡＬＸ−２７０−３３３）及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアルに小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートフリーザー（ＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒａｔｅ Ｆｒｅｅｚｅｒ）を使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高濃度で凍結保存した単一細胞を中間／処理中の種材ＩＳＭとして次に使用した。

【0131】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクＤＡＳＧＩＰバイオリアクターに播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８）内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0132】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、分化誘導が開始された。分化を開始するために、使用済み培地を取り出し、分化培地をバイオリアクター内にポンプで注入し、以下に説明したように培地０の交換及び分化プロトコルを使用したプロセスの過程で交換した。

【0133】

ステージ１（３日間）：
基本培地を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び３μＭのＭＣＸ化合物を補充した１．５Ｌの基本培地で１日間培養した。２４時間後、使用済み培地を取り除き、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．５Ｌの基本培地をリアクターに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0134】

ステージ２（３日間）：
基本培地を、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有し、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、ＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．５Ｌのステージ２基本培地と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．５Ｌの新鮮なステージ２基本培地と置換した。

【0135】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時、かつ培地交換の直前に、無菌溶接及び蠕動ポンプを介して、３リットルリアクターから９００，０００，０００細胞を取り出した。３リットルリアクター内の培地を次に前述のように交換し、以下のステージ３培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９；２μＭのＲＡ；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。取り出した細胞を次に無菌円錐管内で遠心沈殿させ、使用済み培地を取り除き、細胞をステージ３培地及び添加剤に再懸濁させた。これらの細胞を次に、無菌溶接及び蠕動ポンプを介して４つの別個のＤＡＳＧＩＰ（商標）より提供される０．２リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（リアクターＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）に移した。０．２リットルのバイオリアクター及び３リットルの対照バイオリアクター内の細胞を、ステージ３〜５に関して図１４及び表Ｖに示されるように、細胞濃度及び培地ｐＨの異なる組み合わせにさらした。培地交換２４時間後、使用済み培地を、対照及びリアクターＡ〜ＤのそれぞれにおいてＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む３００ｍＬの新鮮なステージ３培地と再度置換した。その培地で４８時間細胞を培養した。

【0136】

【表7】

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【0137】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了後、使用済み培地を取り除き、１５０ｍＬの以下のステージ４培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１５０ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地。培地に０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）をバイオリアクターのそれぞれに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0138】

ステージ５（７日間）：
ステージ５基本培地を、追加の１．７５４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；及び１０ｍｇ／Ｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｈ３１４９−１００ＫＵ）を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１５０ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地ベースを使用して各バイオリアクター用に調製した。ステージ４の完了後、各バイオリアクター内の使用済み培地を、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭのγセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号５６５７９０）；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した、１５０ｍＬのステージ５基本培地と交換した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、１５０ｍＬの同じ新鮮培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、１μＭのＴ３、１０μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換した。２４時間後ステージ５の終わりを示し、生成された細胞を特徴付け及び解析のために処理した。

【0139】

分化プロセスを通じて、ｐＨ及び溶存酸素（「ＤＯ」）についてのリアルタイム連続監視に加えて、培地サンプルを毎日リアクターから収集した。毎日の終わりに使用済み培地をＮＯＶＡ ｂｉｏ−ａｎａｌｙｚｅｒによって解析した。サンプルを、細胞数（Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ １００）、ｍＲＮＡ発現（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、及びタンパク質発現（フローサイトメトリー及び蛍光（florescent）免疫組織化学）についても解析した。

【0140】

図１５Ａ及びＢは、ステージ３及び４の過程でリアクター１、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの培地におけるｐＨ（図１５Ａ）及び溶存酸素濃度（図１５Ｂ）の連続監視グラフを示す。図１６Ａ及びＢは、ステージ３及び４における分化の毎日の終わりに使用済み培地サンプルから得られるＮＯＶＡ（登録商標）ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒからのデータを示している（図１６Ａ−グルコース濃度；図１６Ｂ−乳酸濃度）。図１７は、リアクター及び条件Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤについて細胞カウントの傾向線を示している（Ｂ×Ａ、Ｂ×Ｂ、Ｂ×Ｃ、及びＢ×Ｄとしても列挙される）。これらのデータは、ｐＨ７．０に設定されるリアクターにおいて、ステージ３の過程で細胞損失が存在することを実証し、これは低いｐＨ（バイオリアクターＣ及びＤ）設定値と相関している。しかしながら、ｍＬあたり２×１０^６細胞で播種されたリアクターＣは、ステージ４の終わりまでに細胞集団を回復した一方、７．０のｐＨを有するがｍＬあたり１．０×１０^６細胞の細胞播種を有したリアクターＤは回復しなかった。また、７．４のｐＨ、かつｍＬあたり２×１０^６及び１．０×１０^６細胞で播種された、リアクターＡ及びＢは、両方ともステージ３を通して細胞濃度を維持していたがそれぞれステージ４で著しい細胞損失を呈した（図１７）。これらのデータは、ステージ３でのｍＬあたり約１．５×１０^６細胞以上、好ましくは、ｍＬあたり約２．０×１０^６細胞以上の濃度と組み合わせた７．０のｐＨ設定値の使用が、ステージ３においてｐＨ７．４で維持された細胞と比較して、後続の分化ステージを通してより高い細胞濃度を促進することを示す。

【0141】

細胞濃度への効果は、グルコース及び乳酸の毎日の使用済み培地濃度に反映される。リアクターＣ及びＤの両方は、ｐＨ７．４対照群、Ａ及びＢそれぞれと対になるその濃度より毎日の終わりに残量の多いグルコース及び少ない乳酸を有した。これらの結果は、リアクターＣ及びＤがステージ３の間、低い代謝活性を有したことを示した。しかしながら、リアクターＣがステージ４を通して進行したとき、乳酸濃度は、リアクターＣにおいて低いままであったが、残留グルコース濃度は、ステージ４の第１及び第２日目の終わりまでリアクターＡ内のものと同程度であった。これらのデータから、出願者らは、リアクターＣ内の細胞がリアクターＡ内のものよりも、分化され、成熟した、かつ少ない糖分解の表現型をとり始めたと推論することができる。

【0142】

ステージ３の完了時、１Ｍ（リアクターＢ）又は２Ｍ（リアクターＡ）の開始密度でｐＨ７．４に維持された細胞は、低ｐＨ処理細胞が膵内胚葉の特異化を保持することを示すことを観察されたが、１×１０^６（リアクターＤ）又は２×１０^６（リアクターＣ）細胞／ｍＬの開始濃度でｐＨ７．０に維持されたほとんど全ての細胞は、内胚葉転写因子（ＦＯＸＡ２）及び膵特異的転写因子（ＰＤＸ１）の両方を発現することが観察された。更に、５つ全ての試験した条件において、ＮＫＸ６．１を発現する細胞の割合は、ステージ３の終わりで同様に低かった（範囲：５．４〜１３．６％）。ｐＨ７．４に維持された細胞（リアクターＡ及びＢ、並びに対照リアクター、「１」）は、ステージ３の終わりでＮＥＵＲＯＤ１を発現し始めたが、ｐＨ７．０（リアクターＣ及びＤ）で維持された細胞は、フローサイトメトリーによって測定した場合ＮＥＵＲＯＤ１発現のレベルの減少を示した（表Ｖｉ）。ステージ４の開始時、リアクターＣ及びＤのｐＨ設定値を、７．４に戻した（図１４及び１５Ａ）。３日後、ステージ４の終わりに、リアクターのそれぞれからのサンプルを、フローサイトメトリーによってＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、及びＫｉ６７の発現について解析した。ステージ３においてｐＨ７．０に維持された細胞（リアクターＣ及びＤ）は、表ＶＩに要約されるように７．４のｐＨに設定されたリアクター（バイオリアクター１、Ａ、及びＢ）で維持された細胞と比較すると、細胞内フローサイトメトリーによって検出されるようにステージ４の終わりに、実質的により多くのＮＫＸ６．１陽性細胞及び活性細胞周期にある細胞（Ｋｉ６７陽性）を有したことが観察された。

【0143】

フローサイトメトリーによって細胞タンパク質発現を判定することに加えて、分化プロセスのステージ３及び４を通してサンプルを、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子パネルのｍＲＮＡ発現について試験した。図１８Ａ〜Ｎは、分化させてからステージ４の第２日目までヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞における以下の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析のデータを示す。ＰＤＸ１（図１８Ａ）、ＮＫＸ６．１（図１８Ｂ）、ＰＡＸ４（図１８Ｃ）、ＰＡＸ６（図１８Ｄ）、ＮｅｕｒｏＧ３（ＮＧＮ３）（図１８Ｅ）、ＡＢＣＣ８（図１８Ｆ）、クロモグラニン−Ａ（図１８Ｇ）、クロモグラニン−Ｂ（図１８Ｈ）、ＡＲＸ（図１８Ｉ）、グレリン（図１８Ｊ）、ＩＡＰＰ（図１８Ｋ）、ＰＴＦ１ａ（図１８Ｌ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図１８Ｍ）、及びＮＫＸ２．２（図１８Ｎ）。

【0144】

図１８Ａに示されるように、低（７．０）又は標準（７．４）ｐＨの両方の分化条件下で、細胞は、ステージ３を通して膵臓運命をとる細胞と類似のレベルのＰＤＸ１を発現した。ｐＨ７．４リアクターからの細胞が、ステージ３を通して進行したとき（リアクターＢＸ Ａ及びＢＸ Ｂ）、ＮＫＸ６．１の発現が相対的に無い状態では（図１８Ｂ）、細胞は早期の膵内分泌細胞の発達に必要かつ特徴的な複数の遺伝子を発現し始めた。図１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、１８Ｍ、１８Ｎ、１８Ｉ、１８Ｊ、１８Ｇ、及び１８Ｈに示されるようにＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＡＲＸ、グレリン、ＣＨＧＡ及びＣＨＧＢ。低いＮＫＸ６．１の発現と組み合わせたこの遺伝子発現のパターンは、いくつかの早期の（非β細胞）膵内分泌腺の特異化を示した。

【0145】

対照的に、リアクターＣ及びＤからの細胞（ステージ３、ｐＨ７．０）は、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲで測定すると、ステージ３において、リアクターＡ及びＢと比較して著しく低い濃度の、内分泌腺発達に必要な転写因子（ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、及びＡＲＸ）を発現した（図１８Ｃ、１８Ｄ、１８Ｅ、１８Ｍ、１８Ｎ、及び１８Ｉ）。更に、リアクターＣ及びＤからの細胞は、ステージ４の１日目にＮＫＸ６．１（β細胞形成に必要な転写因子）が増加し、その後ステージ４の２日目にＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＮＫＸ２．２の発現が増加した（図１８Ｄ、１８Ｍ、１８Ｎ、及び１８Ｂ）ことが観察された。これらのｑＲＴ−ＰＣＲデータは、ステージ３において７．０ｐＨで維持された細胞について、ステージ３及び４の終わりにＮＥＵＲＯＤ１を発現する細胞の割合が減少し、ＮＫＸ６．１を発現する細胞数が増加したことを実証したフローサイトメトリー結果に相関した（表ＶＩ、図１９、及び図２０）。これらのデータは、ステージ３における低ｐＨ（７．０）が早期の（非β細胞）膵内分泌腺の特異化を阻害し、β細胞を形成するのに必要な転写因子発現シーケンスを活性化することを示唆した。

【0146】

遺伝子の発現の遅延又は低下の効果は、非β細胞膵内分泌腺の特異化に関与し、ステージ３で減少した培地ｐＨを通じ、分化のステージ５を通して持続した。ＮＧＮ３遺伝子発現は、発達中の膵臓において適切な内分泌ホルモン細胞の発達のために必要とされ、条件Ａ（ｐＨ７．４）及びＣ（ステージ３にてｐＨ７．０）の両方において、ＮＧＮ３の発現は、γセクレターゼ阻害剤を含有するステージ５培地を用いた細胞の処理に反応して誘導された。しかしながら、条件Ｃ細胞に従って分化された細胞について、ピークのＮＧＮ３発現に１日の遅れが認められた（図２１Ａ）。更に、ＮＧＮ３発現によって誘導又は調節された複数の遺伝子もまた、条件Ｃによって分化された細胞（ステージ３にてｐＨ７．０）において遅れがあった。ＮＥＵＲＯＤ１（図２１Ｂ）、ＮＫＸ２．２（図２１Ｃ）、ＡＲＸ（図２１Ｄ）、クロモグラニンＡ／ＣＨＧＡ（図２１Ｅ）、及びＰＣＳＫ２（図２１Ｆ）などの内分泌腺特異的な遺伝子は全て、ＮＧＮ３と同様に発現において遅れを示した。しかしながら、β細胞と特異的に関連する遺伝子であるＡＢＣＣ８（図２１Ｇ）、Ｇ６ＣＰ２／グルコース６ホスファターゼ（図２１Ｈ）、インスリン／ＩＮＳ（図２１Ｉ）、Ｉｓｌｅｔ１／ＩＳＬ１（図２１Ｊ）、グルコース輸送体１／ＳＬＣ２Ａ１（図２１Ｋ）、亜鉛輸送体／ＳＬＣ３０Ａ８（図２１Ｌ）、及びＮＫＸ６．１（図２１Ｍ）は、条件Ａ及びＣからの細胞において同時にかつ同規模で現れる。更に、機能的β細胞の適切な成熟に関連する遺伝子であるＵＣＮ３の発現は、ステージ３におけるｐＨ７．０への曝露がこのプロセスにおいてβ様（lie）細胞への後期の成熟を促進することを示す図２１Ｎに示されるように、ｐＨ７．４（リアクターＡ）で維持された細胞と比較すると、リアクターＣ（ステージ３にてｐＨ７．０）で分化された細胞においてステージ５を通じて増加した。

【0147】

ＵＣＮ３発現における増加に加えて、ｑＲＴ−ＰＣＲによってβ細胞特異的転写因子であるＭＡＦＡの発現における増加もまた観察された。ＭＡＦＡ発現は、γセクレターゼ阻害剤の追加の後、ステージ５の１日目（図２１Ｏ）に単一のプライマープローブｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって試験された３つの条件全てにおいて（Ａ、Ｂ、及びＣ）最初に検出可能であった。ステージ４の３日目からステージ５の５日目まで、検出可能なＭＡＦＡのｍＲＮＡ発現は、条件Ａ又はＢにおいてより条件Ｃにおいて高かった。ＭＡＦＡのタンパク質発現は、免疫蛍光細胞化学によってステージ６の終わりに確認された。図２２に示されるように、２０倍対物レンズによって得られる顕微鏡写真は、核のＭＡＦＡ及び細胞質のインスリン染色に関する免疫蛍光染色を示す。

【0148】

これらの遺伝子発現パターンは、ステージ３での低ｐＨへの曝露による早期の内分泌腺の特異化の抑制は、β細胞特異的転写因子の発現前に、早期の非β細胞運命の選択を低減することによってβ細胞様運命への後期の分化を促進することができることを示唆する。フローサイトメトリーの結果は、リアクターＣで分化された細胞は、ＮＫＸ６．１／インスリン共陽性細胞（２１．３％、条件Ｃ対１５．６％、条件Ａ）での増加と共に、条件Ａ細胞（２０．３％、表ＶＩ）と比較するとインスリン陽性細胞の割合（２７．３％、表ＶＩ）が増加したので、この仮説を支持した。

【0149】

興味深いことに、ステージ３における低ｐＨ及びβ細胞様運命への後期の分化は、その他の膵内分泌腺運命に特徴的な遺伝子発現を抑制しなかった。ｑＲＴ−ＰＣＲによって、ステージ５（図２１Ｐ−ＰＰＹ、２１Ｑ−グレリン、２１Ｒ−ＧＣＧ、及び２１Ｓ−ＳＳＴ）の終わりに分析されたサンプル中の内分泌ホルモン膵臓ポリペプチド（「ＰＰＹ」）、グレリン、グルカゴン（「ＧＣＧ」）、及びソマトスタチン（「ＳＳＴ」）について、遺伝子発現を観察した。この観察結果は、分化された細胞が表ＶＩＩ及び図２３に示されるように汎内分泌系転写因子、ＮＥＵＲＯＤ１に対して陽性であった（条件Ｃに対してＮＥＵＲＯＤ１陽性が６３．１％、及びＮＥＵＲＯＤ１／ＮＫＸ６．１共陽性の細胞が５６．１％；条件Ａに対してＮＥＵＲＯＤ１陽性が５１．６％、及びＮＥＵＲＯＤ１／ＮＫＸ６．１共陽性の細胞が４３％）ことを示すフローサイトメトリーのデータによって更に支持された。

【0150】

ステージ５の第７日目の終わりに、ステージ３にてｐＨ７．０の設定値（条件Ｃ）で分化された５×１０^６細胞を５０ｍＬ円錐内の培地から分離し、次いで合計２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び０．２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ−１３１３培地で２回洗浄した。細胞を洗浄培地に再懸濁させ、ＮＳＧマウスの腎臓被膜下への移植前に室温にて約５時間保持した。最も早く測定した時点、移植４週間後、夜間絶食、腹腔内グルコース注射、及びＩＰグルコースボーラス６０分後の眼窩後方採血の後に平均ヒトＣペプチド血中濃度の０．３ｎｇ／ｍＬが観察された（Ｎ＝７動物）。

【0151】

【表8】

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【0152】

【表9】

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【0153】

（実施例３）
この実施例は、撹拌タンクの無菌で閉じたバイオリアクター内で、ＰＤＸ１を発現する細胞の集団からのインスリン発現細胞の形成を実証する。インスリン陽性細胞を、ステージ３の間に３つの条件のうちの１つにさらされた細胞から生成した。３つの条件：リアクターＢ−ステージ３を通じてｐＨ７．０（レチノイン酸で処理）、リアクターＣ−ステージ３の第１日目にｐＨ７．４、次いでステージ３の２及び３日目にｐＨ７．０、又はリアクターＤ−ステージ３を通じてｐＨ７．４。ステージ３にてｐＨ７．０に長く曝露することは分化プロセスの後半で、Ｋｉ６７を低減し、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ６．１と共陽性であるＮＥＵＲＯＤ１、ＰＡＸ６、Ｉｓｌｅｔ１、及びＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１といったタンパク質の発現を増加させたことが観察された。

【0154】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖ脂肪酸フリーウシ血清アルブミンを補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。凝集集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌフリーザーを使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高濃度で凍結保存した単一細胞をＩＳＭとして次に使用した。

【0155】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ）にｍＬあたり２９５，０００生細胞の播種濃度で播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標））内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0156】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、使用済みＥ８（商標）培地を取り除き、分化培地を追加することによって３リットルリアクター内の分化が開始された。分化プロトコルを以下に説明する。

【0157】

ステージ１（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを１０％の溶存酸素設定値（調節された空気、酸素、及び窒素）に設定し、ＣＯ_２調節によってｐＨを７．４に設定した。基本培地を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び３μＭのＭＣＸ化合物を補充した１．５Ｌの基本培地で１日間培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．５Ｌの基本培地をリアクターに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0158】

ステージ２（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、酸素、及び窒素）に設定し、ＣＯ_２調節によってｐＨを７．４に設定した。基本培地を、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有し、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．５Ｌのステージ２基本培地と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．５Ｌの新鮮なステージ２基本培地と置換した。

【0159】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時、かつ培地交換の直前に、無菌溶接及び蠕動ポンプを介して、３リットルリアクターから全ての細胞を取り出した。細胞を、カウントし、重力沈降させ、２，０００，０００細胞／ｍＬの正常に戻した分布状態で以下のステージ３培地に再懸濁させた。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９；２μＭのＲＡ；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。細胞は、２，０００，０００細胞／ｍＬの細胞濃度の正常に戻した分布状態で、３つの０．２リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクＤＡＳＧＩＰ（商標）バイオリアクターＢ、Ｃ、及びＤ（ＢｘＢ、ＢｘＣ、及びＢｘＤとも呼ばれる）の中に無菌溶接及び蠕動ポンプを介して播種された。リアクターを、３７℃の温度に設定し、５５ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、酸素、及び窒素）に設定し、ステージ３のｐＨを表ＶＩＩＩに列挙されるように３つの異なる培地ｐＨ変数に設定した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、リアクターＢ〜ＤのそれぞれにおいてＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む１５０ｍＬの新鮮なステージ３培地と再度置換した。細胞をその後、この培地でステージ３の終わりまで４８時間培養した。

【0160】

【表10】

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【0161】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了時、使用済み培地を取り除き、各バイオリアクター内で１５０ｍＬの以下のステージ４培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１５０ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地。培地に０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃で維持し、５５ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、酸素、及び窒素）に、及びＣＯ_２調節によって７．４のｐＨ設定値に調節した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）を各バイオリアクターに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0162】

ステージ５（７日間）：
ステージ５基本培地を、追加の１．７５４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；及び１０ｍｇ／Ｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｈ３１４９−１００ＫＵ）を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１５０ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地ベースを使用して各バイオリアクター用に調製した。ステージ４の完了後、各バイオリアクター内の使用済み培地を、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭのγセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した、１５０ｍＬのステージ５培地と置換した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、同じ新鮮な基本培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、γセクレターゼＸＸＩ及びＳＡＮＴが除外されたことを除いて、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換し、ステージ５の終わりまで更に２４時間細胞を培養した。ステージ５を通して、３０％ＤＯ及び７．４ｐＨを維持した。

【0163】

分化プロセスを通じて、ｐＨ及びＤＯについてのリアルタイム連続監視に加えて、培地サンプルを毎日リアクターから収集した。サンプルを、細胞数、ｍＲＮＡ発現、及びタンパク質発現について解析した。

【0164】

図２４Ａ及びＢは、ステージ３、４及び５の過程でリアクターＢ、Ｃ、及びＤの培地におけるｐＨ（図２４Ａ）及び溶存酸素濃度（図２４Ｂ）の連続監視グラフを示す。これらのデータは、ステージ３を通じてｐＨ７．０に設定されたリアクターＢ内の細胞は、リアクターＣ及びＤと比較してより低い濃度の溶存酸素によって測定されるように、ステージ４及び５で酸素消費の増加を示したことを実証する（図２４Ｂ）。更に、リアクターＢ、Ｃ、及びＤ内の細胞濃度は、ステージ５を通じて同程度であった（図２５及び表ＶＩＩＩ）ので、酸素消費の差は、細胞密度の有意差のためではなかった。これは、ステージ３の間ｐＨ７．０で処理されたリアクターＢ内の細胞が、ステージ４の終わりまでにリアクターＣ又はＤからの細胞（ステージ３の間ｐＨ７．４にそれぞれ１又は３日間曝露された）より成熟した、かつ酸素を消費する表現型を取り始めたことを示唆する。

【0165】

ステージ３の完了時、及び３日後のステージ４の終わりに再び、リアクターのそれぞれからのサンプルをフローサイトメトリーによってタンパク質発現について分析した。ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＤＸ１、及びＣＤＸ２の発現を実証するデータは、表ＩＸに示される。ステージ３を通じて、又はステージ３の最後の２日間ｐＨ７．０で維持された細胞（それぞれリアクターＢ及びＣ）が、リアクターＤ（ステージ３を通して７．４のｐＨに設定された）内で維持された細胞と比較したとき、ステージ４の終わりに比例的に多くのＮＫＸ６．１陽性細胞及び少ないＮＥＵＲＯＤ１陽性細胞を有したことが、細胞内フローサイトメトリーによって観察された。これらのデータは、ステージ３におけるｐＨ７．０への部分的な曝露であってもＮＥＵＲＯＤ１発現を抑制するのに十分であることを示す。

【0166】

フローサイトメトリーによって細胞タンパク質発現を判定することに加えて、出願者らは、分化プロセスのステージ３及び４を通してサンプルを、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して遺伝子パネルのｍＲＮＡ発現について試験した。図２６Ａ〜Ｎは、分化させてからステージ５の第１日目までヒト胚性幹細胞株Ｈ１の細胞における以下の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ解析のデータを示す。ＰＤＸ１（図２６Ａ）、ＮＫＸ６．１（図２６Ｂ）、ＰＡＸ４（図２６Ｃ）、ＰＡＸ６（図２６Ｄ）、ＮｅｕｒｏＧ３（ＮＧＮ３）（図２６Ｅ）、ＡＢＣＣ８（図２６Ｆ）、クロモグラニン−Ａ（図２６Ｇ）、クロモグラニン−Ｂ（図２６Ｈ）、ＡＲＸ（図２６Ｉ）、グレリン（図２６Ｊ）、ＩＡＰＰ（図２６Ｋ）、ＰＴＦ１ａ（図２６Ｌ）、ＮＥＵＲＯＤ１（図２６Ｍ）、及びＮＫＸ２．２（図２６Ｎ）。

【0167】

図２６Ａに示されるように、低いステージ３のｐＨ（７．０）又は標準のステージ３のｐＨ（７．４）の両方の分化条件下で、細胞は、ステージ３で膵臓運命をとる細胞を示す類似のレベルのＰＤＸ１を発現した。しかしながら、リアクターＢ及びＣ（ｐＨ７．０曝露）からの細胞がステージ４に入ったとき、ＰＤＸ発現は、一貫してｐＨ７．４で維持された細胞（リアクターＤ）と比較して増加した。ＰＤＸ発現におけるこの増加は、ＮＫＸ６．１発現における誘導と一致した（図２６Ｂ）。興味深いことに、ステージ３及び４におけるリアクターＤからの細胞は、早期の膵内分泌細胞の発達に必要かつ特徴的な複数の遺伝子を発現し始めた。図２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｅ、２６Ｍ、２６Ｎ、２６Ｉ、２６Ｊ、２６Ｇ、及び２６Ｈに示されるようにＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＡＲＸ、グレリン、ＣＨＧＡ、及びＣＨＧＢ。相対的に低いＮＫＸ６．１の発現と組み合わせたこの遺伝子発現のパターンは、リアクターＢ及びＣと比較して、リアクターＤにおいて増加した早期の（非β細胞）膵内分泌腺の特異化を示した。

【0168】

対照的に、リアクターＢ及びＣからの細胞は、ｑＲＴ−ＰＣＲで測定すると、ステージ３において、リアクターＤと比較して著しく低い濃度の、早期の内分泌腺発達に特徴的な転写因子（ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、及びＡＲＸ）を発現した（図２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｅ、２６Ｍ、２６Ｎ、及び２６Ｉ）。更に、出願者らは、リアクターＢ及びＣからの細胞は、ステージ４の１日目にβ細胞形成に必要な転写因子のＮＫＸ６．１メッセージが増加し（図２６Ｂ）、その後ステージ４の２日目にＰＡＸ６、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＮＫＸ２．２のｍＲＮＡ発現が増加した（図２６Ｄ、２６Ｍ、及び２６Ｎ）ことを観察した。これらのＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲデータは、ステージ３にて７．０ｐＨで２又は３日間維持された細胞が、ステージ３及び４の終わりにＮＥＵＲＯＤ１を発現しにくく、ＮＫＸ６．１を発現しやすかったことを実証したフローサイトメトリー結果に相関した（表ＸＩ）。これらの結果は、ステージ３の全ての間又は一部の間であっても低ｐＨ（７．０）への曝露が早期の（非β細胞）膵内分泌腺の特異化を阻害し、β細胞を形成するのに必要な転写因子発現シーケンスを活性化したことを示す。

【0169】

遺伝子の発現の遅延又は低下の効果は、非β細胞膵内分泌腺の特異化に関与し、ステージ３で減少した培地ｐＨを通じ、分化のステージ５の終わりまで持続した。リアクターＢ（ステージ３の全てでｐＨ７．０）で分化された細胞は、ＮＫＸ６．１／インスリン共陽性細胞（１７．９％、条件Ｂ、対１４％、条件Ｄ）での増加と共に、リアクターＤ細胞（１９．５％、表ＸＩＶ）と比較するとインスリン陽性細胞の割合（２５．４％、表ＸＩＶ）が増加した。これらの結果は、リアクターＤの４４．９％ＰＡＸ６及び２４．７％Ｉｓｌｅｔ１陽性細胞と比較して、リアクターＢが５３．８％ＰＡＸ６及び３１％ｉｓｌｅｔ１陽性細胞を産生したように、ＰＡＸ６及びＩｓｌｅｔ１発現などの適切な内分泌島の形成に必要なマーカーの増加に反映された（表ＸＩＶ）。増殖の尺度であるＫｉ６７発現もまた、リアクターＤからの細胞と比較すると、ステージ３にてｐＨ７．０で処理された細胞において減少したが（表ＸＩＶ）、これは成長中かつ分化の程度が少ない集団から、より最終分化した組織への遷移を示す。

【0170】

興味深いことに、ステージ３における低ｐＨは、早期の内分泌腺分化を抑制したが、リアクターＢ及びＣからの細胞は、ステージ４及び５において汎膵転写因子、ＰＤＸ１の高発現を保持した。更に、リアクターＢ及びＣ細胞は、リアクターＤと比較してステージ３及び４において低いＮＥＵＲＯＤ１発現（汎内分泌系転写因子）を有したが（表ＸＩ）、これらはステージ５の終わりまでに、より高い割合のＮＥＵＲＯＤ１及びＮＥＵＲＯＤ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞（表Ｘ）を示した。これらの結果は、ステージ３における低ｐＨが、早い段階での内分泌腺運命への初期分化を抑制したこと、その後適切なβ細胞特異化に必要な転写因子の共発現の増加を促進したこと、並びにステージ５の終わりまでに島組織及びβ細胞に特徴的なマーカー及び転写因子の全体の発現を増加させたことを示す。

【0171】

【表11】

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【0172】

【表12】

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【0173】

（実施例４）
この実施例は、３リットル撹拌タンクの無菌で閉じたバイオリアクター内で、ＰＤＸ１を発現する細胞の集団からのインスリン発現細胞の形成を実証する。インスリン陽性細胞は、ＰＤＸ１発現を保持し、ＮＫＸ６．１を共発現したこのプロセスから生成された。ステージ５の終わりに、インスリン陽性細胞を５５ＲＰＭで撹拌される５００ｍＬスピナーフラスコに移し、ステージ６の間高グルコース（２５．５ｍＭ）又は低グルコース（５．５ｍＭ）を含有する培地のどちらかで、５％ＣＯ２加湿３７℃インキュベータに保持した。ステージ６でどちらのグルコース濃度を使用する細胞も大半は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１又はＮＥＵＲＯＤ１陽性であり、リアクター内の全ての細胞のほぼ半分は、ＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１／インスリン共陽性であった。

【0174】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充したＥ８（商標）培地で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００の凝集細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアルに小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートフリーザーＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒａｔｅ Ｆｒｅｅｚｅｒを使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高密度で凍結保存した単一細胞をＩＳＭとして次に使用した。

【0175】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ）にｍＬあたり２９５，０００生細胞の播種濃度で播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容するＣａｐ２Ｖ８（登録商標）培地移動ボトル内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0176】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、集団を沈降させるために羽根車及び電熱ジャケットを５〜２０分間停止し、培地を取り除き、閉鎖システムを維持するためにＴｅｒｕｍｏ（商標）チューブウェルダーを使用してＣ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービングに結合された浸漬管を通して蠕動ポンプによって置換した。羽根車を浸らせるのに十分な培地を添加した後で、電熱ジャケットに再び電圧を加えた。分化プロトコルを以下に説明する。

【0177】

ステージ１（３日間）：
ステージ１基本培地を、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有し、追加の３．６ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された１００ｍＬの２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１０ｍＬの１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１ｍＬの２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、９００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び３μＭのＭＣＸ化合物を補充した基本培地で１日間培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な基本培地をフラスコに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。ステージ１を通して、溶存酸素含量を１０％で、かつｐＨを７．４で維持した。

【0178】

ステージ２（３日間）：
ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、ステージ１の基本培地（ただし５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した）と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した新鮮な基本培地と置換した。ステージ２を通して、ＤＯを３０％ＤＯで、かつｐＨを７．４で維持した。

【0179】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ２培地を取り除き、以下の基本培地と置換した。１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有し、追加の３．６ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された１００ｍＬの２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１０ｍＬの１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；１ｍＬの２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、９００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３基本培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９；２μＭのＲＡ；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、ＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む新鮮な培地と再度置換した。その培地で４８時間細胞を培養した。ステージ３を通して、３０％ＤＯ及び７．０のｐＨを維持した。

【0180】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ３培地を取り除き、ステージ３で使用されるのと同じ基本培地（ただし０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した）と置換した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）を各バイオリアクターに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。ステージ４を通して、３０％ＤＯ及び７．４のｐＨを維持した。

【0181】

ステージ５（７日間）：
ステージ４の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ４培地を取り除き、以下のステージ５基本培地と置換した。追加の１．７５４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された１００ｍＬの２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；８ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；及び１ｍＬの１０ｍｇ／Ｌヘパリン溶液を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する９００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地ベース。ステージ５基本培地に１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭのγセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、同じ新鮮な基本培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、γセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ及びＳＡＮＴが除外されたことを除いて、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換した。４８時間後、使用済み培地を取り除き、同じ新鮮な培地及び添加剤と置換した。細胞をステージ５の終わりまで更に２４時間培養した。ステージ５を通して、３０％ＤＯ及びｐＨ７．４を維持した。

【0182】

ステージ６（７日間）：
ステージ５の終わりに（分化の１９日目）、細胞を無菌溶接及び蠕動ポンプを介して３リットルリアクターから取り出した。次に細胞をカウントし、重力沈降させ、５００，０００細胞／ｍＬの正常に戻した分布状態でステージ６培地（以下に詳述される）に再懸濁させ、５５ＲＰＭで撹拌される２つの０．５リットル使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に追加し、高グルコース（２５．５ｍＭ）又は低グルコース（５．５ｍＭ）を含有する培地のどちらかで、５％ＣＯ２加湿３７℃インキュベータにドリフト条件下で７日間維持した。１つのフラスコは、以下の培地及び添加剤を含有した。追加の１．７５４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された１００ｍＬの２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；８ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（２５．５ｍＭの最終グルコース濃度）；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；及び１ｍＬの１０ｍｇ／Ｌヘパリン；及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する３００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地ベース。第２のフラスコは、以下の培地及び添加剤を含有した。追加の１．７５４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された１００ｍＬの２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；及び１ｍＬの１０ｍｇ／Ｌヘパリン；及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び５．５ｍＭの基礎グルコース濃度を含有する３００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地ベース。ステージ５の開始の４８時間、９６時間、及び１２０時間後、使用済み培地を取り除き、同じ新鮮な基本培地及び添加剤と置換した。ステージ６を、開始から１４４時間後に終了した（分化２６日目）。

【0183】

分化プロセスを通じて、サンプルをリアクターから収集し、表Ｘに示されるように全細胞数、及び図２７に示されるようにｍＲＮＡ発現（ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ）について解析した。ステージ３、４、５、及び６の終わりに、サンプルを、フローサイトメトリー（表ＸＩＩ）を使用してタンパク質発現について分析した。

【0184】

ステージ３の完了時、ほとんど全ての細胞が内胚葉転写因子（ＦＯＸＡ２）及び膵特異的転写因子（ＰＤＸ１）の両方を発現したことが観察された。フローサイトメトリーによって、ＮＫＸ６．１（〜２０％）を発現した少数の細胞が検出され、ＮＥＵＲＯＤ１発現細胞はほとんど検出されなかった（表ＸＩＩ）。ステージ４の終わりに、サンプルを、フローサイトメトリーによってＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、及びＫｉ６７の発現について再度解析した（表ＸＩＩ）。興味深いことに、ステージ３の終わりからステージ４の終わりまで、ＮＫＸ６．１発現集団は、細胞の９１％を超えるまで増加し、これらの細胞は、内胚葉及び膵臓の特異化を保持した（ＰＤＸ１及びＦＯＸＡ２発現細胞が＞９９％）。しかしながら、細胞の限定された集団（＜８％）だけが、内分泌ホルモン細胞に特徴的なマーカー（Ｉｓｌｅｔ１、ＣＨＧＡ、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＮＫＸ２．２）を発現した。ステージ５の完了時に、内分泌ホルモン細胞に特徴的なマーカーに対して陽性である細胞の割合は実質的に増加し、ステージ４の終わりの１０％未満から、ＮＥＵＲＯＤ１に対して陽性である細胞７６％及びインスリンに対して陽性５７％まで上がった。更に、細胞の全集団は、大部分がＮＫＸ６．１（８１％）及びＰＤＸ１（＞９７％）発現をし続けた。Ｋｉ６７に対して陽性である細胞の割合によって測定される増殖のレベルは、約１８％であり、内胚葉系腸細胞に対するマーカー、ＣＤＸ２は、＜３．０％で非常に低かった。これらのデータは、島様の、及び特にβ細胞様の集団が、リアクター内で生じていたことを示す。

【0185】

ステージ５の完了時に、細胞を３リットルの撹拌タンクリアクターから取り出し、５％ＣＯ２、３７℃、加湿インキュベータに維持された５００ｍＬスピナーフラスコに分割した。スピナーフラスコを、基本培地のグルコース濃度を除いて同様の条件下で処理した。試験された２つのグルコース条件は以下のとおりであった。低グルコース−５．５ｍＭ初期基礎グルコース濃度（「ＬＧ」）、又は高グルコース−２５．５ｍＭ初期基礎グルコース濃度（「ＨＧ」）（表ＸＩＶ）。どの条件においても７日間ステージ６で処理した細胞は、内分泌ホルモン細胞、及び特に膵β島細胞に特徴的なマーカーにおいてほぼ増加を示した。ステージ６の７日目の終わりに、細胞のほぼ半分は、ＰＡＸ６に対して陽性であり、更に６０％は、ＮＥＵＲＯＤ１ ＆ ＮＫＸ６．１、又はインスリン＆ ＮＫＸ６．１に対して共陽性であった（表ＸＩＩＩ）。加えて、この系で生成された細胞は、高濃度のＰＤＸ１（＞８１％）を保持し、Ｋｉ６７に対して陽性である細胞の割合によって測定される増殖のレベルの減少を実証した（表ＸＩＶで約１２％）。

【0186】

これらの結果は、細胞がステージ５に入ると、劇的かつ一過性のＮＧＮ３の誘導があることを示すＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲデータによって支持された（図２７Ａ）。この後に、ＮＥＵＲＯＤ１発現（図２７Ｂ）、並びにそれぞれ図２７Ｃ〜Ｊに示されるクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＨＧＢ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、島関連ポリペプチド（ＩＡＰＰ）、Ｉｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）、ＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、及びソマトスタチン（ＳＳＴ）などの島形成及び内分泌ホルモン細胞に関連する他の遺伝子での持続的誘導が続く。島特異的遺伝子の誘導に加えて、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、ＭＮＸ１／ＨＢ９、及びＵＣＮ３（それぞれ図２７Ｐ〜Ｓ）などのβ細胞の形成及び機能に必要な転写因子と同様に、インスリン（ＩＮＳ；図２７Ｋ）、グルコース６ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２；図２７Ｌ）、ＰＣＳＫ１及び２（図２７Ｍ及びＮ）、亜鉛輸送体（ＳＬＣ３０Ａ８；図２７Ｏ）で観察されるように、β細胞特異的遺伝子もまたステージ５で誘導され、ステージ６に至るまで持続された。他に取り得る運命の形成を示すＣＤＸ２及びＺＩＣ１などの遺伝子の発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲによる検出の限界に近いか又は限界を下回った（データは示さず）。

【0187】

【表13】

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【0188】

【表14】

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【0189】

【表15】

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【0190】

【表16】

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【0191】

（実施例５）
この実施例は、撹拌タンクの無菌で閉じたバイオリアクター内で、転写因子、ＰＤＸ１を発現する細胞の集団からのインスリン発現細胞の形成を実証する。このプロセスから生成されたインスリン陽性細胞は、ＰＤＸ１発現を保持し、ＮＫＸ６．１を共発現した。この細胞の集団を、免疫力が低下したマウスの腎臓被膜の中に移植したとき、生着の４週間以内にヒトＣペプチドの検出可能血中濃度を産生した。

【0192】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充したＥ８（商標）培地で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００の凝集細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌフリーザーを使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高密度で凍結保存した単一細胞をＩＳＭとして次に使用した。

【0193】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ）にｍＬあたり２９５，０００生細胞の播種濃度で播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｉｎｃ）内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0194】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、使用済みＥ８（商標）培地を取り除き、分化培地を追加することによって３リットルリアクター内の分化が開始された。分化プロトコルを以下に説明する。

【0195】

ステージ１（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを１０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１基本培地を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び３μＭのＭＣＸ化合物を補充した１．５Ｌの基本培地で１日間培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．５Ｌの基本培地をリアクターに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0196】

ステージ２（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、１．５Ｌの同じ培地（ただし５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した）と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した３００ｍＬの新鮮なステージ２基本培地と置換した。

【0197】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時、かつ培地交換の直前に、細胞を、カウントし、重力沈降させ、１．５リットル中に２，０００，０００細胞／ｍＬの正常に戻した分布状態で以下のステージ３基本培地に再懸濁させた。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３基本培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９；２μＭのＲＡ；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．０ｐＨに設定した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、ＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む１．５Ｌの新鮮なステージ３培地と再度置換した。細胞をその後、この培地でステージ３の終わりまで４８時間培養した。

【0198】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了時、使用済み培地を取り除き、各バイオリアクター内で以下からなる１．５Ｌのステージ４基本培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ４基本培地に０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃で維持し、７０ｒｐｍで撹拌した。気体及びｐＨを、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．４のｐＨ設定値に調節した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）をバイオリアクターに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0199】

ステージ５及び６：
ステージ４の３日目の終わりに、丸い凝集集団をバイオリアクターから汲み出し、５５ＲＰＭで撹拌される２つの別個の０．５リットルのＣｏｒｎｉｎｇ使い捨てスピナーフラスコに移し、５％ＣＯ２を補充した３７℃加湿インキュベータ内で維持した。その後、各容器内の細胞を、以下からなる３００ｍＬの作業体積のステージ５基本培地で維持した。追加の１．７５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；１０ｍｇ／Ｌヘパリン；３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として１μＭのＴ３、及び１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する３００ｍＬのＭＣＤＢ−１３１培地。

【0200】

使用されるステージ５基本培地を、以下のような２つの異なる条件Ａ又はＢに従って補充した。
ａ．条件Ａについては、１００ｎＭのＬＤＮ、１００ｎＭのＳＡＮＴ、及び１０μＭの硫酸亜鉛を補充したステージ５＋基本培地を利用することによってステージ５を開始した。この培地を、ステージを開始して２４及び４８時間後に交換した。ステージ５を開始して７２時間後に、使用済み培地を取り除き、１００ｎＭのＸＸ γセクレターゼ阻害剤、１００ｎＭのＬＤＮ、及び１０μＭの硫酸亜鉛を補充したステージ５基本培地で細胞を処理することによって、ステージ６を開始した。この培地をその後、８、９、及び１１日目の開始時を除き１１日間２４時間ごとに置換した。
ｂ．条件Ｂについては、１００ｎＭのγセクレターゼ阻害剤、ＸＸ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地を利用することによってステージ５を開始した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、３００ｍＬの同じ培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、同じ培地と置換した。

【0201】

分化プロセスを通じて、解析のために懸濁培養から細胞サンプルを収集した。サンプルを、ｍＲＮＡ発現（ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ）、及びタンパク質発現（フローサイトメトリー及び蛍光免疫組織化学）について解析した。

【0202】

ステージ４の終わりから６日後（条件Ａ−ステージ６、３日目；条件Ｂ−ステージ５、６日目）、両方の処理からの細胞が、膵内分泌腺及びβ細胞の形成と一致するフローサイトメトリーによって検出可能なタンパク質の集団を発現した（表ＸＶ）ことが観察された。両方の処理が、高い割合のＰＤＸ１（＞９１％）発現細胞を生成し、細胞は、インスリン及びＮＫＸ６．１（表示せず）を共発現し始めた。興味深いことに、条件Ａに従って処理された細胞は、増殖のレベルが低下したことが観察された。すなわちＡでは細胞の１５．５％及びＢでは２７．３％がＫｉ６７を発現した（表ＸＶ）。更に、条件Ａで処理された細胞は、条件Ｂより多くのＮＫＸ６．１発現細胞、ＮＥＵＲＯＤ１発現細胞、及びＮＫＸ６．１／ＮＥＵＲＯＤ１共発現細胞を有し（表ＸＶ）、条件Ａでの処理が、膵内分泌腺に特徴的かつβ細胞を形成することができる遺伝子を発現する細胞の、より大きな集団を生成したことを示した。

【0203】

これらのフローサイトメトリーデータは、細胞がステージ５に入ると、ＮＥＵＲＯＤ１発現の持続的誘導（図２８Ｂ）と相関している両方の条件下でＮＧＮ３の誘導（図２８Ａ）があったことを示したＯｐｅｎＡｒｒａｙ ｑＲＴ−ＰＣＲデータによって支持された。条件Ａでは、ステージ５でのＮＧＮ３の初期誘導後、γセクレターゼ阻害剤、ＸＸでの処理に対応したステージ６の開始時にＮＧＮ３の第２の誘導があった。条件Ａに関するＮＧＮ３発現のこの二重のピークは、ＮＫＸ６．１の持続的発現と同時に発生し（図２８Ｃ）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、クロモグラニンＢ（ＣＨＧＢ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、島関連ポリペプチド（ＩＡＰＰ）、ＭＡＦＢ、ＰＡＸ６、及びソマトスタチン（ＳＳＴ）（それぞれ図２８Ｄ〜Ｊ）などの島形成及び内分泌ホルモン細胞と関連する複数の遺伝子の発現と相関した。更に、β細胞の形成、成熟、及び機能に必要なＭＮＸ１／ＨＢ９、及びＵＣＮ３転写因子（それぞれ図２８Ｏ及びＰ）と同様に、β細胞の機能に必要な遺伝子もまた、インスリン（ＩＮＳ；図２８Ｋ）、グルコース６ホスファターゼ２（Ｇ６ＰＣ２；図２８Ｌ）、ＰＣＳＫ１（図２８Ｍ）、及び亜鉛輸送体（ＳＬＣ３０Ａ８；図２８Ｎ）について観察されるように、ステージ５で誘導され、ステージ６に至るまで持続された。

【0204】

ステージ６の１１日目の終わりに、条件Ａからの５×１０^７分化細胞を、５０ｍＬ円錐内の培地から分離し、その後１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び０．２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ−１３１３培地で２回洗浄した。細胞を洗浄（was）培地に再懸濁させ、ＮＳＧマウスの腎臓被膜下への移植前に室温にて約５時間保持した。各動物は、５×１０^６細胞の投与を受けた。移植の前に、これらの細胞は、膵内分泌腺及びβ細胞と一致するタンパク質を発現した（表ＸＶＩ）。また最も早く測定した時点、移植４週間後に、及び１８週間の実験の過程の間中、夜間絶食及びＩＰグルコースボーラス６０分後の眼窩後方採血の後に、腹腔内グルコース注射に応じてヒトＣペプチドが検出された（Ｎ＝７動物、図２９）。

【0205】

【表17】

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【0206】

【表18】

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【0207】

（実施例６）
この実施例は、撹拌タンクの無菌で閉じたバイオリアクター内で、ＰＤＸ１を発現する細胞の集団からのインスリン発現細胞の形成を実証する。このプロセスから生成されたインスリン陽性細胞は、ＰＤＸ１発現を保持し、ＮＫＸ６．１を共発現した。この細胞の集団を、免疫力が低下したマウスの腎臓被膜の中に移植したとき、生着の２週間以内にヒトＣペプチドの検出可能血中濃度を産生した。

【0208】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充したＥ８（商標）培地で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００の凝集細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌフリーザーを使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高密度で凍結保存した単一細胞をＩＳＭとして次に使用した。

【0209】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ）にｍＬあたり２９５，０００生細胞の播種濃度で播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｉｎｃ）内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0210】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、使用済みＥ８（商標）培地を取り除き、分化培地を追加することによって３リットルリアクター内の分化が開始された。分化プロトコルを以下に説明する。

【0211】

ステージ１（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを１０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１基本培地を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び３μＭのＭＣＸ化合物を補充した１．５Ｌの基本培地で１日間培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．５Ｌの基本培地をリアクターに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0212】

ステージ２（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、１．５Ｌのステージ１基本培地として使用される同じ培地（ただし５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した）と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した３００ｍＬの新鮮な基本培地と置換した。

【0213】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時、かつ培地交換の直前に、細胞を、カウントし、重力沈降させ、１．５リットル中に２，０００，０００細胞／ｍＬの正常に戻した濃度で以下のステージ３基本培地に再懸濁させた。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３基本培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９；２μＭのＲＡ；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．０ｐＨに設定した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、ＬＤＮ−１９３１８９を除いて、上記添加剤を含む１．５Ｌの新鮮なステージ３基本培地と再度置換した。細胞をその後、この培地でステージ３の終わりまで４８時間培養した。

【0214】

ステージの終わりに、１５０ｍＬの細胞（１．０５×１０^６生細胞／ｍＬ）を元の３リットルリアクターから取り出し、無菌で０．２Ｌリアクターに移した。残りの１．３５Ｌのリアクター容量を以下に説明されるステージ４に従って更に分化した。また、このプロセス及び細胞を、以下、「標準プロセス」及び「標準細胞」と称する。また一方、０．２Ｌリアクターに移された細胞は、そうしないで、以下のステージ４に従い分化するのではなく、むしろ以下に説明されるようにステージ５に従い更に分化された。また、このプロセス及び細胞を、以下、「スキップ４プロセス」及びスキップ４細胞」と称する。スキップ４プロセスについては、凝集細胞集団を、ステージ３の後に無菌溶接及び蠕動ポンプを使用して０．２Ｌバイオリアクター（「スキップ４」とラベル付けされた）に取り出して、１．０５×１０^６細胞／ｍＬでステージ５培地曝露を開始した。

【0215】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了時、使用済み培地を取り除き、各バイオリアクター内で以下からなる１．５Ｌのステージ４基本培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ４基本培地に０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃で維持し、７０ｒｐｍで撹拌した。気体及びｐＨを、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．４のｐＨ設定値に調節した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）をバイオリアクターに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0216】

凝集細胞集団（１５０ｍＬ、０．９×１０^６生細胞／ｍＬ）を、ステージ４の３日目の終わりに標準プロセス用に無菌溶接及び蠕動ポンプを使用して取り出し、０．２Ｌバイオリアクター（「標準」とラベル付けされた）に移してステージ５培地曝露を開始した。加えて、いくつかのステージ４、３日目細胞（４５×１０^６細胞／ｍＬ）を、５０ｍＬ円錐内の培地から分離し、次に１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び０．２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ−１３１３培地で２回洗浄した。細胞を、洗浄培地に再懸濁させ、室温で約５時間保持し、その後夜間絶食及びＩＰグルコースボーラス６０分後の眼窩後方採血の後に、腹腔内グルコース注射に応じてヒトＣペプチド検出を使用した生体内機能のアッセイのために、動物ごとに５×１０^６細胞にて、ＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植した（Ｎ＝７動物）。

【0217】

ステージ５（７日間）：
標準及びスキップ４の０．２Ｌバイオリアクターの中への細胞の播種に続いて、使用済み培地を取り除き、追加の１．７５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；１０ｍｇ／Ｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｈ３１４９−１００ＫＵ）を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ−１３１培地ベースからなる１５０ｍＬのステージ５＋基本培地と置換した。このステージ５基本培地に、１μＭのＴ３、１０μＭの２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（「ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ」）、１μＭのγセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６１−ＣＥ−０５０）；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した。ステージ５の開始の４８時間後、使用済み培地を取り除き、１５０ｍＬの同じ培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５＋基本培地と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５＋基本培地と置換し、ステージ５の終わりまで２４時間培養した。ステージ５の７日間の終わりに、標準及びスキップ４プロセスのそれぞれからの細胞を、上述の方法によって生体内機能について分析するために、ＮＳＧマウスの腎臓被膜の中に移植した。

【0218】

分化プロセスを通じて、解析のために懸濁培養から細胞サンプルを収集した。サンプルを、ｍＲＮＡ発現（ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ）について、及びフローサイトメトリーによってタンパク質発現について解析した。ステージ３培地からステージ５培地へ分化を直接移動する、スキップ４プロセスは、標準プロセスに従って分化された細胞と比較して、島細胞、内分泌ホルモン発現細胞、及びβ細胞と関連する遺伝子の発現の増加をもたらしたことが観察された。スキップ４プロセスを使用すると、他に取り得る腸の運命と関連する遺伝子は、より低い発現を示したが（ＡＬＢ及びＣＤＸ２；図３０Ｂ及びＤ）、一方内分泌ホルモン細胞の形成及び機能に必要な遺伝子は、標準プロセスに見られるより多くの発現を有した（図３０Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｍ、Ｏ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｘ、及びＡ’に示されるようなＡＢＣＣ８、ＡＲＸ、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、Ｇ６ＰＣ２、ＧＣＧ、ＩＡＰＰ、ＭＡＦＢ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＰＰＹ、及びＳＳＴ）。更に、β細胞形成に必要な遺伝子（ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１；図３０Ｒ及びＷ）は、スキップ４及び標準プロセスの細胞の両方について、ステージ５の６日目までに同様の濃度で発現した。β細胞の機能及び維持に必要な遺伝子（ＩＡＰＰ、ＩＮＳ、ＩＳＬ１、ＨＢ９、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＳＬＣ３０Ａ８、及びＵＮＣ３；図３０Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｕ、Ｖ、Ｚ、及びＢ’）又はβ細胞増殖に必要な遺伝子（ＷＮＴ４Ａ、図３０Ｃ’）は、ステージ５培地で処理されたスキップ４細胞において同様又はより高い濃度で発現した。

【0219】

これらのデータは、スキップ４細胞において、より早い時点で、かつより長い期間、より高い濃度のＮＧＮ３誘導（内分泌腺特異化に必要とされる）を示したデータと相関したが、一方ＰＴＦ１Ａ発現（膵外分泌腺に必要とされる）は、最高で標準プロセスによって生成される濃度の１／２０に達するだけであった。これらの結果は、スキップ４リアクター内の細胞は、ＰＴＦ１Ａの短い誘導さえもないときに膵内分泌腺の運命にロバストに特定されたことを示し、ＰＴＦ１Ａがβ細胞を生体外で形成するのに必要とされないことを示唆する。この観察結果は、ＰＴＦ１Ａが更に分化する前にステージ４で発現された当該技術分野において見られる結果、又はステージ４細胞が、ステージ４でＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１／ＰＴＦ１Ａのシグネチャによって特徴付けられ、次にβ様細胞に生体外で更に発達される米国特許公報第２０１４／０２７１５６６（Ａ１）号に記載された発達の想定されたモデルと異なるので重要である。

【0220】

ステージ４、３日目に存在するＰＴＦ１Ａ発現（図３０Ｙ）細胞集団は、ほぼ均質なＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共発現集団を有し、ＮＥＵＲＯＤ１陽性細胞（フローサイトメトリーでＫＸ６．１が９６．２％、ＰＤＸ１が９９．６％、及びＮＥＵＲＯＤ１が２．４％）をほとんど有しなかった。細胞は、ＮＳＧマウスの腎臓被膜の中に挿入され（５，０００，０００細胞／動物；Ｎ＝７）、それから１６週間に渡って、血液サンプル中にヒトＣペプチドは検出されなかった（データ表示せず）。４つのステージ分化プロセス中に誘導される富化させたＮＸＫ６．１／ＰＤＸ１／ＰＴＦ１Ａ発現細胞集団は、生着の３か月以内に糖尿病を逆転させることができたことが、当該技術分野において以前に実証されていたので、この結果は、予想外であった。

【0221】

ステージ４、３日目（ＰＴＦ１Ａ発現）細胞が、標準プロセスに従ってステージ５を通して更に分化されると、移植片は、２週目で検出可能な血中濃度のヒトＣペプチドを分泌し（図３１）、スキップ４プロセスの細胞（低／無ＰＴＦ１Ａ）と同様に移植後１２週目で＞０．５ｎｇ／ｍＬのヒトＣペプチドに達した。これらのデータは、ＰＴＦ１Ａ発現が、機能的β細胞への更なる成熟を確実にするために必要でも十分でもないことを示す。むしろ、ＰＴＦ１Ａ発現の上昇は、標準ステージ４をスキップし、≧０．５μＭのレチノイン酸、ＦＧＦ７、及びＰＫＣアゴニスト（ＴＰＰＢ）を含有する培地からγセクレターゼ阻害剤、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、及びＡＬＫ５阻害剤あり又はなしを含有する培地へ直接細胞を移動することによって回避され得る代替細胞集団の出現を恐らく示している。

【0222】

これらの結果は実証する。ステージ３でのｐＨの≦７．２への調節は、ＮＧＮ３発現を少なくとも８０％（図２６Ｅ参照：Ｂ×Ｂ及びＢ×Ｃ、対Ｂ×Ｄ）に抑制し、ＰＴＦ１Ａ陽性ステージ４細胞集団を経ることなく、ＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１／インスリン陽性β様細胞を含有する島様細胞集団に更に直接分化され得るＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１共陽性、ＰＴＦ１Ａ陰性細胞を発展させることができる。

【0223】

（実施例７）
この実施例は、低培地ｐＨ（＜７．２）、ＦＧＦ７、レチノイン酸、及びＰＫＣアンタゴニスト（ＴＰＰＢ）を使用して、撹拌タンクの無菌で閉じたバイオリアクター内で、５ステージの分化プロセスを介しインスリン発現細胞の形成を実証する。ステージ３での低ｐＨの使用は、ステージ３での任意のソニックヘッジホッグ阻害剤（ＳＡＮＴ０１又はシクロパミンなど）又はＴＧＦ−β／ＢＭＰシグナル伝達阻害剤又は活性化物質を使用する必要性を省略し、ステージ４の終わりにＰＤＸ１（９４％）及びＮＫＸ６．１（８７％）発現細胞の集団を生じたことがわかった。これらの細胞から生成されたステージ５リアクター集団は、高い割合のＮＥＵＲＯＤ１／ＮＫＸ６．１共陽性細胞、及びＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現を伴うインスリン陽性細胞を有し、この３つ（ＮＥＵＲＯＤ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６，１）は、適切な膵β細胞機能に対してインスリンと共発現されるはずである。一致して、この細胞のステージ５集団が、凍結保存され、解凍され、免疫力が低下したマウスの腎臓被膜の中に移植されたとき、移植片は、生着の２週間以内に検出可能な血中濃度のヒトＣペプチド、及び平均で生着４週目で＞１ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを産生した。

【0224】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、動的懸濁液の状態の、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充したＥ８（商標）培地で、丸い凝集集団として≧４の継代の間増殖させた。この集団をそれから、次の方法を通じて単一細胞及び２〜１０細胞の集団として凍結した。集団内の約６００，０００，０００〜１，０００，０００，０００の凝集細胞を、遠心管に移し、１００ｍＬの１Ｘ ＤＰＳ−／−を使用して洗浄した。洗浄後、ほぐれた細胞凝集体のペレットにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）酵素を５０体積％、及びＤＰＢＳ−／−を５０体積％の溶液３０ｍＬを添加することによって、次に細胞凝集体を酵素的に分解した。細胞集団をピペットで１〜３度上下させてから、断続的に室温で約４分間旋回させ、その後８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。次いで、細胞ペレットを撹乱させることなく、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）の上澄を可能な限り完全に吸引した。遠心管を硬質面に約４分間軽くたたきつけて、この集団を単一細胞及び２〜１０細胞からなる集団にほぐした。４分後、細胞を、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１００ｍＬのＥ８（商標）培地に再懸濁させ、８０〜２００ｒｃｆで５〜１２分間遠心分離した。上澄を次に吸引し、ｍＬあたり１００，０００，０００〜１５０，０００，０００細胞の最終濃度を得るために冷たい（≦４℃）Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ ＣＳ１０を滴加した。この細胞溶液を、２ｍＬの極低温バイアル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に小分けにしている間氷浴中において保持し、その後次のようにコントロールレートＣｒｙｏＭｅｄ（商標）３４Ｌフリーザーを使用して細胞を凍結した。チャンバを４℃に冷却し、この温度を試料バイアルの温度が６℃に達するまで保持し、次に試料が−７℃に達するまでチャンバの温度を毎分２℃下げ、その時点でチャンバが−４５℃に達するまでチャンバを２０℃／分冷却した。次にチャンバの温度を、温度が−２５℃に達するまで１０℃／分で短時間に上昇させ、その後チャンバを試料バイアルが−４０℃に達するまで０．８℃／分で更に冷却した。次にチャンバの温度を、チャンバが−１００℃に達するまで１０℃／分で冷却し、その時点で、次にチャンバが−１６０℃に達するまでチャンバを３５℃／分冷却した。チャンバの温度を、次に−１６０℃で少なくとも１０分間保持し、その後バイアルをガス相液体窒素保存庫に移動した。これらの高密度で凍結保存した単一細胞をＩＳＭとして次に使用した。

【0225】

ＩＳＭのバイアルを液体窒素保管庫から取り出し、解凍し、３リットルのガラスの撹拌懸濁液タンクバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ）にｍＬあたり２９５，０００生細胞の播種密度で播種するために使用した。バイアルを液体窒素保管庫から取り出し、３７℃の水浴に１２０秒間迅速に移して解凍した。バイアルを、ＢＳＣに移動させ、解凍された内容物を、２ｍＬガラスピペットを介して５０ｍＬ円錐管に移した。次に、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を補充した１０ｍＬのＥ８（商標）培地を、その管に滴下方式で添加した。細胞を、８０〜２００ｒｃｆで５分間遠心分離した。管からの上澄を吸引し、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０ｍＬの新鮮なＥ８（商標）培地を添加し、細胞を含む体積を、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した４５０ｍＬのＥ８（商標）培地を収容する培地移動ボトル（Ｃａｐ２Ｖ８（登録商標），Ｓａｎｉｓｕｒｅ，Ｉｎｃ）内にピペットで移した。その後、蠕動ポンプによって、無菌Ｃ−Ｆｌｅｘ（登録商標）チュービング溶接を介して、ボトル内容物をバイオリアクター内に直接ポンプで注入した。３７℃に予熱し、７０ｒｐｍで撹拌した、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した１０００ｍＬのＥ８（商標）培地で、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ_２、及びＮ_２）、及び５％の制御されたＣＯ_２分圧によって、バイオリアクターを調製した。０．２２５×１０^６細胞／ｍＬ（濃度範囲：０．２〜０．５×１０^６細胞／ｍＬ）の目標濃度を得るために、リアクターに播種した。

【0226】

ひとたびリアクターに播種すると、細胞は、撹拌リアクター内で丸い凝集集団を形成した。培養下で２４時間後、元の体積の８０％超を取り除き、０．５％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡを補充した１．５ＬのＥ８（商標）培地を足し戻したように（新鮮培地）、培地は部分的に交換された。この培地交換プロセスを、播種から４８時間後に繰り返した。丸い凝集集団として懸濁培養下で３日後、使用済みＥ８（商標）培地を取り除き、分化培地を追加することによって３リットルリアクター内の分化が開始された。分化プロトコルを以下に説明する。

【0227】

ステージ１（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを１０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１基本培地を、追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を使用して調製した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８及び２μＭのＭＣＸ化合物を補充した１．５Ｌのステージ１基本培地で１日間培養した。２４時間後、培地交換を上述のように完了し、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．５Ｌの基本培地をリアクターに追加した。更なる培地交換をしないで、細胞を４８時間維持した。

【0228】

ステージ２（３日間）：
リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に設定し、ＣＯ２調節によってｐＨを７．４に設定した。ステージ１の完了後、培地交換を上述のように完了し、それによって使用済みステージ１培地を取り除き、１．５Ｌのステージ１基本培地として使用される同じ培地（ただし５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した）と置換した。培地交換から４８時間後、使用済み培地を再度取り除き、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．５Ｌの新鮮な基本培地と置換した。

【0229】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時、かつ培地交換の直前に、細胞を、カウントし、重力沈降させ、１．５リットル中に２，０００，０００細胞／ｍＬの正常に戻した濃度で以下のステージ３基本培地に再懸濁させた。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３基本培地に５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−７；１μＭのＲＡ；及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃の温度に設定し、７０ｒｐｍで連続的に撹拌した。気体及びｐＨコントロールを３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．０ｐＨに設定した。培地交換２４時間後、使用済み培地を、上記添加剤を含む１．５Ｌの新鮮なステージ３基本培地と再度置換した。細胞をその後、この培地でステージ３の終わりまで４８時間培養した。

【0230】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了時、使用済み培地を取り除き、各バイオリアクター内で以下からなる１．５Ｌのステージ４基本培地と置換した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ４基本培地に０．２５μＭのＳＡＮＴ−１及び４００ｎＭのＴＰＢを補充した。リアクターを、３７℃で維持し、７０ｒｐｍで撹拌した。気体及びｐＨを、３０％の溶存酸素設定値（調節された空気、Ｏ２、及びＮ２）に、及びＣＯ２調節により７．４のｐＨ設定値に調節した。ステージ４の開始の４８時間後、３．２ｍＬ／Ｌの４５％グルコース溶液（８ｍＭグルコースボーラス）をバイオリアクターに追加し、その培地で更に２４時間細胞を培養した。

【0231】

ステージ５（８日間）：
ステージ４の３日目の終わりに、使用済み培地を取り除き、以下からなる１．５Ｌのステージ５基本培地と置換した。追加の１．７５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；１０ｍｇ／Ｌヘパリンを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。最初の供給では、ステージ５基本培地に３，３′，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭのγセクレターゼ阻害剤、ＸＸＩ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した。ステージ５の開始４８時間後、使用済み培地を取り除き、１．５Ｌの同じ新鮮培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地と置換した。４８時間後、培地を再度交換し、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地と置換し、ステージ５の終わりまで４８時間培養した。

【0232】

ステージ５の８日目の終わりに（最後の供給から４８時間後）、凝集細胞集団を無菌溶接及び蠕動ポンプを介しリアクターから取り出し、ペレットの中に遠心分離した。細胞を冷凍保存するため、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる冷凍保存培地に、細胞を移植した。細胞集団を周囲温度で冷凍保存培地内に懸濁した後で、クライオバイアルを自動凍結保存装置（ＣＲＴ）に１５分以内で移植した。次いで、チャンバ温度を４５分間４℃に下げ、２．００℃／分でー７．０℃（試料）まで更に下げた。サンプルを次に急速に冷却し、２５．０℃／分の速度でチャンバの温度を−４５．０℃まで下げた。次いで補正上昇が、チャンバ温度を−２５．０℃（チャンバ）まで１０．０℃／分、上昇させることによって提供された。サンプルを次に、温度が−４０．０℃に達するまで０．２℃／分で冷却した。チャンバを次に、−１６０℃まで３５．０℃／分の速度で冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0233】

細胞をガス相液体窒素で保存した後、保管場所から除去することによって細胞を解凍し、３７℃の水浴に移植した。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。次いで、バイアル内容物を５０ｍＬの円錐に移植し、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び２％のＢＳＡを有するＭＣＤＢ１３１培地を使用して、合計２０ｍＬの最終体積になるまで、滴下式で２分以上希釈した。全細胞数を、次にＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）によって測定した。細胞は、次に、５０ｍＬ円錐内の培地から分離され、上澄は除去され、細胞は２．４３ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び２％ＢＳＡを含む新鮮なＭＣＤＢ１３１培地に再懸濁され、ｍＬあたり１，０００，０００細胞の細胞濃度で７５ｍＬの容量にて満たされた１２５ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）スピナーフラスコに移動された。細胞を、５５ＲＰＭで撹拌される加湿、５％ＣＯ２インキュベータ内で一晩維持し、翌日細胞を、フローサイトメトリーによって解析した。細胞は、３回の反復でＮＫＸ６．１／ＮＥＵＲＯＤ１共陽性が５０％超（図３２）、ＮＫＸ６．１／ＮＥＵＲＯＤ１共陽性が８０％超（図３３）、及び解凍後ＮＫＸ６．１／インスリン共陽性が少なくとも３５％（図３４）であった。更に、これらの細胞をＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植したとき（投与あたり５，０００，０００細胞；Ｎ＝７）、全ての動物は、検出可能な濃度のＣペプチドを有し、またそれらの動物は、移植の４週間以内に算術平均（mean average）で＞１ｎｇ／ｍＬのＣペプチドを分泌した。移植６週間後に、移植された７匹の動物のうち５匹が、グルコース応答性インスリン（ヒトＣペプチド）の非刺激レベルを超える分泌を示し（図３５）、１２週目で７匹の動物全てが、グルコース応答性インスリン（ヒトＣペプチド）の分泌を示した（図３６）。

【0234】

これらのデータは、ＮＫＸ６．１／インスリン共発現細胞は、ステージ３でｐＨ及び溶存酸素調節を使用して生成されて、撹拌タンクリアクター内の５番目のステージを介しＮＥＵＯＲＤ１／ＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１／インスリン共発現へと更に分化され得るステージ４でＮＫＸ６．１／ＰＤＸ１陽性細胞の収率もまた最大にしながら、ＴＧＦ−β／ＢＭＰ又はソニックヘッジホッグシグナル伝達をブロックするために、タンパク質又は小分子の必要性を省略することができることを示す。細胞は、冷凍保存し、解凍し、移植することができ、移植の４週間以内にグルコース誘発性インスリン分泌（＞１ｎｇ／ｍＬのＣペプチド）によって測定されるように生体内で機能し、移植後１２週目でグルコース応答性を実証するだろう。

【0235】

（実施例８）
本実施例は、３Ｌの使い捨てスピナーフラスコを使用して撹拌される懸濁培養内でインスリン発現細胞の形成を実証する。培地及び気体を、取り外し可能な通気式サイドアームキャップを通じて交換した。インスリン陽性細胞は、細胞がＰＤＸ１を最初に発現し、次にＮＫＸ６．１も共発現した段階的なプロセスで形成された。これらの共発現細胞は、次に、懸濁培養内にある間にＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１と組み合わせて、インスリン及びその後ＭＡＦＡの発現を得た。

【0236】

ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＷＡ０１ ｃｅｌｌｓ，ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））の細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を付着マトリックスとして使用してｍＴｅＳＲ１（商標）培地で接着培養条件において４継代の間増殖させ、より大きな容器の中に持続的に拡大した。細胞は、第４の継代で複数の５層の細胞スタック（「ＣＳ５」）の中に播種された。継代７２時間後、各ＣＳ５内の細胞密集度は、７０〜８０％に達した。使用済み培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。３７℃に予熱した３００ｍＬのＶｅｒｓｅｎｅ（商標）を次いで細胞に追加し、細胞を次に３７℃（５％ＣＯ_２）で８．５分間インキュベートした。インキュベーション時間後、フラスコ内に約５０ｍＬの残留Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）を残してＥＤＴＡを注意深くフラスコから取り出した。細胞層を、それから細胞集団を除去するために容器の断続的なタップを受けながら、残留Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）で３分間インキュベートし続けさせた。この残留インキュベーションの３分後、１０μＭのＹ−２７６３２（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有する２５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１（商標）をフラスコに追加して、細胞分離プロセスをクエンチし、浮き上がった細胞集団を収集した。洗浄培地を次に丸型ボトルに移し、ＣＳ５を、１５０μＭのＹ−２７６３２を含有する追加の１５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１（商標）で洗浄し、第１の洗浄液をためた。２００，０００，０００細胞を次に未塗装であるが、組織培養処理したＣＳ１に移し、追加の培地を補充して、ｍＬあたりの１，０００，０００細胞の細胞密度で２００ｍＬの最終体積を得た。

【0237】

浮き上がった細胞を含有するＣＳ１を３７℃で２時間インキュベートした。２つのＣＥＬＩスタックポート間に結合された、ポンプチュービングを有する、閉ループのＣ−ｆｌｅｘチュービングを使用して、細胞懸濁液を蠕動ポンプによって７５ｒｐｍで５分間微粉化して、凝集体を均質化した。ポンプチュービングアセンブリを次に、０．２μＭの通気式キャップと置換し、１２〜２２時間の夜間インキュベーション用に３７℃インキュベータに戻した。インキュベーション後、細胞は、多能性細胞の丸い球状凝集集団を形成した。

【0238】

新しく形成された集団を含有する６００ｍＬの３つのＣＳ１容器を、次にそれぞれ、結果として得られるｍＬあたり約３００，０００細胞の細胞密度で１０μＭのＹ−２７６３２を含有する追加の１２００ｍＬの新鮮な予熱されたｍＴｅＳＲ１（商標）と共に３Ｌ使い捨てスピナーフラスコに移した。スピナーフラスコを次に３７℃及び４０ｒｐｍの撹拌速度でインキュベートした。インキュベーションの２４時間後、細胞を撹拌から取り出し、集団をフラスコの底部に８分間沈降させた。その後１．５Ｌの使用済み培地を、容器の底部に止まっている集団を回避して上部から吸引した。１．５ｍＬの新鮮なｍＴｅＳＲ１（商標）培地を細胞に追加し、それらを４０ｒｐｍで更に２４時間増殖させるためインキュベータ内に戻した。７２時間の終わりに、多能性集団は、分化培地に遷移された。分化プロトコルを以下に説明する。

【0239】

ステージ１（３日間）：
４つのスピナーフラスコのそれぞれを、動的懸濁液から撹拌なしでＢＳＣ内のインキュベータに移した。以下に説明されるように完全培地交換を実行して、残留の使用済み培地だけが新しい培地に持ち越されるようにした。完全培地交換を実行するために、集団を、フラスコの底部まで８分間沈降させた。使用済み培地を、次に３００ｍＬだけが残るまで液体の上部から真空吸引を使用して取り除いた。残りの細胞体積を１５０ｍＬ円錐管に移し、８００ｒｐｍで３分間遠心分離した。真空吸引システムを使用して、残りの使用済み培地を、細胞集団ペレットの破壊なしに取り除いた。ペレットを、次に追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース（４５％水溶液）；及びＩＴＳ−Ｘの１：５０，０００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地を含有する１．８Ｌの基本培地に再懸濁させた。細胞を、１．８ｍＬのＧＤＦ８及び５４０μＬのＭＣＸ化合物を補充した１．８Ｌのステージ１基本培地で１日間培養した。細胞カウントを計数して、分化の開始時にｍＬあたり５００，０００細胞の開始密度を確認した。フラスコを次に、下表ＸＶＩＩに示されるように条件ごとに２種類の速度でスピナープレート上のインキュベータに戻した。スピナーフラスコを、夜間インキュベートした。

【0240】

【表19】

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【0241】

約２４時間後、培地交換を完了して、使用済み培地から約９０％を取り除き、１．８ｍＬのＧＤＦ８を補充した新鮮な１．８Ｌの基本培地と置換した。培地交換を実行するために、集団を、フラスコ底部に８分間沈降させ、使用済み培地を３００ｍＬだけが残るまで真空吸引を使用して取り除いた。残りの細胞を２５０ｍＬ円形ボトルの中に移し、集団を６分間沈降させ、その後残留使用済み培地の１０％以下が次の供給へ移されることを確実にするために、ピペットを使用して培地を取り出して細胞を含有する１８０ｍＬの培地だけが残されるようにした。残りの細胞及び培地を、次に１．８Ｌの新鮮培地と共にスピナーフラスコに戻し、４８時間インキュベートさせた。

【0242】

ステージ２（３日間）：
上述のように完全培地交換を実行して、ステージ１使用済み培地を全て取り除き、細胞を１．８Ｌのステージ１基本培地として使用される同じ培地（ただし１．８ｍＬのＦＧＦ７を補充した）の中に移した。フラスコを次にインキュベータに戻して、４８時間培地交換をしないで動的撹拌を維持した。その後１８０ｍＬの使用済み培地を残して、使用済み培地を再度取り除き、１．８ｍＬのＦＧＦ７を補充した１．８Ｌの新鮮な基本培地を追加した。細胞を次に２４時間インキュベートした。

【0243】

ステージ３（３日間）：
ステージ２の完了時に、完全培地交換を実行して、ステージ２培地を全て取り出し、細胞を以下の１．５Ｌの培地に移した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ３基本培地に、１．５ｍＬのＦＧＦ−７；７５μＬのＲＡ；及び１２０μＬのＴＰＢを補充した。培地は、「暗条件」下で調製された。フラスコの全容量を１．８〜２．０Ｌから１．５〜１．６５Ｌに減少させて、ｍＬあたり約１，５００，０００〜２，０００，０００細胞の細胞密度を標的にした。フラスコを２４時間インキュベートした。その後１５０ｍＬの使用済み培地を後に残し、上述の添加剤を含有する１．５Ｌの新鮮なステージ３基本培地を追加して培地交換を実行した。細胞をその後、この培地でステージ３の終わりまで４８時間培養した。

【0244】

ステージ４（３日間）：
ステージ３の完了時、完全培地交換を実行して、細胞を以下からなる１．５Ｌのステージ４基本培地の中に移した。追加の２．４ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２．５ｍＭグルコース；及びＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物を補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ４基本培地に１５０μＬのＳＡＮＴ−１及び１２０μＬのＴＰＢを補充した。フラスコを次にインキュベータに戻して、４８時間培地交換をしないで動的撹拌を維持した。４８時間の終わりに、５．２８ｍＬの４５％Ｄ−グルコース溶液をスピナーに追加し、フラスコを更に２４時間に戻した。

【0245】

ステージ５（３日間）：
ステージ４の３日目の終わりに、使用済み培地を取り除き、以下からなる１．５Ｌのステージ５基本培地と置換した。追加の１．７５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム；ＭＣＤＢ−１３１に予め再構成された２％ｗ／ｖのＦＡＦ−ＢＳＡ；１Ｘ濃度のＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）；２０ｍＭグルコース；ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈物；２５０μＬ／Ｌの１Ｍアスコルビン酸；１０ｍｇ／Ｌヘパリンを補充した、１．１８ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有する１．５ＬのＭＣＤＢ−１３１培地。ステージ５基本培地に３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンナトリウム塩として１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１μＭのγセクレターゼ阻害剤、ＸＸＩ；２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン；０．２５μＭのＳＡＮＴ−１；及び１００ｎＭのＲＡを補充した。ステージ５の開始４８時間後、使用済み培地を取り除き、１．５Ｌの同じ新鮮培地及び添加剤と置換した。４８時間後、培地を取り除き、１μＭのＴ３、１０μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン、及び１００ｎＭのＲＡを補充したステージ５基本培地と置換した。それから分化を、ステージ５の終わりまで４８時間継続した。

【0246】

ステージ５の終わりに、凝集細胞集団を、フラスコの底部に８分間沈降させ、培地を約３００ｍＬの液体が残るまで真空吸引を使用して取り除いた。残りの細胞体積を１５０ｍＬ円錐管に移し、８００ｒｐｍで３分間遠心分離し、続いて残りの使用済み培地を除去した。細胞ペレットを、洗浄培地、基本ＭＣＤＢ１３１３に再懸濁させた。細胞を再度、８００ｒｐｍで５分間遠心沈殿させた。細胞を冷凍保存するため、２．４３ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、２０％のゼノフリーＫＳＲ、１０％のＤＭＳＯ、及び２．５％のＨＥＰＥＳ（最終濃度２５ｍＭ）を有する５７．５％のＭＣＤＢ１３１からなる冷凍保存培地に、細胞を移植した。細胞集団を周囲温度で冷凍保存培地内に懸濁した後で、クライオバイアルを自動凍結保存装置（ＣＲＴ）に１５分以内で移植した。次いで、チャンバ温度を４５分間４℃に下げ、２．００℃／分でー７．０℃（試料）まで更に下げた。サンプルを次に急速に冷却し、２５．０℃／分の速度でチャンバの温度を−４５．０℃まで下げた。次いで補正上昇が、チャンバ温度を−２５．０℃（チャンバ）まで１０．０℃／分、上昇させることによって提供された。サンプルを次に、温度が−４０．０℃に達するまで０．２℃／分で冷却した。チャンバを次に、−１６０℃まで３５．０℃／分の速度で冷却し、その温度で１５分間保持した。ＣＲＦ運転の終了時に、試料をガス相液体窒素保管容器に移植した。

【0247】

細胞をガス相液体窒素で保存した後、保管場所から除去することによって３つのバイアルの細胞を解凍し、３７℃の水浴に移植した。小さい氷晶がバイアルに残るまで、バイアルを２分未満水浴内で静かに渦流した。バイアル内容を次にスピナーフラスコに移し、１．６ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、８ｍＭグルコース、１ｘのＩＴＳ−Ｘ、及び２％ＢＳＡの最終濃度に達するように補充されたＭＣＤＢ１３１培地を使用して、手でスピナーを連続的に混合しながら１０ｍＬの解凍培地を滴下方式で添加した。３つのバイアル全てを解凍した後、追加の解凍培地を約８０ｍＬの目標体積に達するように追加した。スピナーフラスコを次いで加湿インキュベータにおいて５％ＣＯ_２で一晩（１６〜２４時間）、及び３８〜４０ｒｐｍの穏やかな撹拌の下インキュベートした。翌日、細胞以下のように洗浄した。スピナーをフード内で６分間沈降させ、約７５ｍＬの使用済み培地を吸引し、同時に残りの細胞懸濁液を、１０ｍＬガラスピペットを使用して５０ｍＬ円錐管に移し、続いて６００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄を吸引し、細胞ペレットを１０ｍＬ洗浄培地に再懸濁させ、その後細胞を６００ｒｐｍで３分間再度遠心分離した。吸引、及び１０ｍＬの洗浄培地における細胞ペレットの再懸濁後、ペレットを６０ｍＬの洗浄培地が追加されたスピナーフラスコに移し戻した。解析及び移送のために細胞を収集するだけでなく細胞回復を得るために、フラスコを次にＢＳＣ内のスピンプレート上に置き、均質のよく混合されたスピナーからサンプルを収集した。

【0248】

図３７Ａ及び３７Ｂは、スピナーフラスコ内の培養培地のｐＨプロファイルを示す。培地のｐＨは、インキュベータ（設定値、５％）内のＣＯ_２及び代謝活性、具体的には図３８に示される細胞の乳酸産生によって調節される。最低ｐＨ環境による培地、具体的には条件Ａは、最高の乳酸濃度も有したことが示される。図３７Ａ及びＢに見られるように、全てのスピナーのｐＨは、ステージ２の間、約６．８〜７．２、及びステージ３を通じて約７．０〜７．２の範囲に及んだ。ステージ３の完了後、ほとんど全ての細胞が内胚葉転写因子ＦＯＸＡ２及び膵特異的転写因子ＰＤＸ１の両方を発現したことが観察された。少なくとも５０％は、ＮＥＵＯＤ１陽性である小さな集団と共にＮＫＸ６．１を発現することが検出された。ステージ３の更に４８時間後（ステージ４、２日目の終了）、ＮＫＸ６．１集団は、表ＸＶＩＩＩに示されるようにＡｃｃｕｔａｓｅで元々浮き上がっていた集団が約６５％に増加し（条件Ｃ及びＤ）、ＥＤＴＡで元々浮き上がっていた細胞の集団が約７０〜７５％に増加した。

【0249】

【表20】

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【0250】

ステージ５の６日目の終了時に、冷凍保存される前にフローサイトメトリーによって細胞を再度解析した。

【0251】

【表21】

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【0252】

表ＸＸに示されるように未使用の（予め凍結保存した）解析との比較のために、解凍した細胞を、フローサイトメトリーによって評価した。細胞回復は、最終細胞集団を、解凍に際し（ｔ＝０）元の集団と比較することによって評価された。細胞の生存性は、図３９に示されるようにライブ／デッド蛍光撮像によって定性的に評価され、ｔ＝０のものと比較した。

【0253】

【表22】

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^＊「２４ＨＡＴ」は、解凍から２４時間後を意味し、上付き文字は試験番号を指す。

【0254】

以上、本発明を、様々な特定の材料、手順及び実施例を参照しながら本明細書に説明及び例示したが、本発明は、その目的のために選択された特定の材料及び手順の組み合わせに限定されない点は理解されるであろう。当業者には認識されるように、このような細部には多くの変更を行い得ることが示唆される。本明細書及び実施例はあくまで例示的なものとしてみなされるべきものであり、発明の真の範囲及び趣旨は以下の「特許請求の範囲」によって示されるものである。本出願において引用される参照文献、特許及び特許出願は、いずれもそれらの全容を参照により本明細書に援用するものとする。

【図1A】

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【図1B】

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【図1C】

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【図1D】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図2D】

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【図2E】

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【図2F】

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【図2G】

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【図2H】

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【図2I】

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【図2J】

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【図2K】

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【図2L】

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【図2M】

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【図3A】

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【図3B】

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【図3C】

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【図3D】

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【図3E】

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【図3F】

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【図3H】

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【図3I】

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【図3J】

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【図3K】

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【図3L】

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【図3M】

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【図3N】

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【図3O】

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【図4】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6A】

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【図6B】

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【図7A】

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【図7B】

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【図8A】

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【図8B】

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【図9A】

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【図9B】

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【図10A】

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【図10B】

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【図11A】

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【図11B】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15A】

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【図15B】

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【図16A】

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【図16B】

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【図17】

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【図18A】

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【図18B】

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【図18C】

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【図18D】

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【図18E】

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【図18F】

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【図18G】

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【図18H】

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【図18I】

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【図18J】

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【図18K】

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【図18L】

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【図18M】

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【図18N】

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【図19】

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【図20】

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【図21A】

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【図21B】

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【図21C】

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【図21E】

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【図21F】

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【図21I】

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【図21N】

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【図21O】

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【図21P】

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【図21Q】

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【図21R】

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【図21S】

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【図22】

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【図23】

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【図24A】

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【図24B】

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【図25】

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【図26A】

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【図26B】

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【図26C】

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【図26E】

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【図26G】

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【図26K】

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【図26N】

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【図27A】

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【図27O】

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【図27P】

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【図27Q】

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【図27R】

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【図27S】

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【図28A】

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【図28B】

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【図28C】

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【図28D】

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【図28E】

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【図28F】

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【図28H】

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【図28I】

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【図28J】

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【図28K】

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【図28L】

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【図28M】

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【図28N】

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【図28O】

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【図28P】

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【図29】

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【図30A】

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【図30B】

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【図30C】

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【図30D】

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【図30E】

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【図30F】

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【図30I】

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【図30L】

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【図30M】

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【図30N】

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【図30O】

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【図30P】

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【図30Q】

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【図30R】

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【図30S】

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【図30T】

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【図30U】

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【図30V】

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【図30W】

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【図30X】

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【図30Y】

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【図30Z】

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【図30A-1】

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【図30B-1】

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【図30C-1】

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【図31】

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【図32】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【図36】

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【図37A】

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【図37B】

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【図38】

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【図39】

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【国際調査報告】

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